UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Ana P. Kolaković Genetičko-epidemiološka analiza i analiza ekspresije gena renin-angiotenzin sistema (RAS) u karotidnoj aterosklerozi kod čoveka doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Ana P. Kolaković Genetic-epidemiological analysis and analysis of gene expression of the renin- angiotensin system (RAS) in carotid atherosclerosis in humans Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Mentori Dr Aleksandra Stanković, viši naučni saradnik Instituta za nuklearne nauke “Vinča“ Dr Goran Brajušković, vanredni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu Članovi komisije Dr Tamara Đurić Delić, naučni saradnik Instituta za nuklearne nauke “Vinča“ Datum odbrane: _____________________ ZAHVALNICA Ova doktorska disertacija je osmišljena i urađena u Laboratoriji za radiobioloiju i molekularnu genetiku Instituta za nuklearne nauke “Vinča“ u okviru projekata : "Genetska epidemiologija i farmakogenomika vaskularnih oboljenja", uz finansijsku podršku Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije tokom projekta ev.br 145023 i projekata ev. Br. IO175085 i ev. Br. III 41028 Ministarstva prosveta i Nauke Republike Srbije. Glavnom mentoru dr Aleksandri Stanković se veoma zahvaljujem na rukovođenju doktorske teze, na svim projektnim zadacima koji su me usmeravali ka njenoj realizaciji. Takođe joj se zahvaljujem na pregledu i oceni rada, konstruktivnim diskusijama koje su doprinele kvalitetu konačne verzije ove disertacije. Veliku zahvalnost dugujem mentoru dr Goranu Brajuškoviću, vanrednom profesoru Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu na stručnoj pomoći, korisnim savetima, podršci i razumevanju tokom izrade disertacije. Dr Draganu Alavantiću i dr Maji Živković se zahvaljujem na rukovođenju delova projektnih zadataka u kojima sam bila angažovana u periodu tokom izrade teze. Posebnu zahvalnost dugujem dr Tamari Đurić, naučnom saradniku, INN Vinča, na pregledu teze, oceni rada, stručnim, praktičnim i savetima prilikom izrade teze. Želim da se zahvalim svim kolegama iz naše Laboratorija, 080 : Ivanu Životiću, Ivanu Jovanoviću, Maji Bundalo, Jovani Kuveljić, Ani Đorđević, Ivani Kolić, Ljiljani Stojković, Nini Petrović, Vesni Mandušić, Rajku Davidoviću, Ani Božović, Mileni Krajnović, Snežani Jovanović-Ćupić, Koviljki Krtolici, Nasti Tanić, Tanji Dramićanin, Lidiji Todorović, Sanji Soskić, Emini Sudar, a posebno Branislavi Dobutović na prijateljskoj atmosferi i svakodnevnoj podršci. Institutu za kardiovaskularne bolesti Kliničkog centra Srbije, Institutu za kardiovaskularne bolesti „Dedinje“ i Vojnomedicinskoj Akademiji u Beogradu zahvaljujem se na saradnji, prikupljanju i kliničkoj karakterizaciji uzaraka tkiva plakova koji su obrađivani u jednom od eksperimentalnih delova izrade ove disertacije. Poštovanim kolegama iz laboratorije za molekularnu biologiju i endokrinologiju 090, Dr Goranu Korićancu, Snežani Tepavčević, Tijani Ćulafić, Snježani Romić se najtoplije zahvaljujem na stručnoj pomoći, predusretljivosti u realizaciji jednog dela doktorske disertacije vezanih za ekspresiju proteina. Genetičko-epidemiološka analiza i analiza ekspresije gena renin-angiotenzin sistema (RAS) u karotidnoj aterosklerozi kod čoveka Karotidna ateroskleroza (KA) je hronična bolest koja započinje aktivacijom i nakupljanjem inflamatornih ćelija koje se pune lipidima u zidu arterijskog krvnog suda. Aterosklerotski plak sadrži lipidno jezgro, fibroznu kapu, akumulira glatke mišićne ćelije (GMĆ) i proteine ekstraćelijskog matriksa (EĆM). Renin-angiotensin system (RAS) ima ključnu ulogu u aktivaciji inflamacije u zidu krvnog suda. Glavni molekuli RAS su: angiotenzin-konvertujući enzim (ACE), angiotenzin-konvertujući enzim-homolog (ACE2), angiotenzin II receptori tipa 1 (ATR1) i tipa 2 (ATR2), ACE2 homolog (TMEM 27) i regulatorna RNK (miR-155). Angiotenzin II (Ang II) je glavni efektorni molekul RAS koji se sintetiše aktivnošću ACE, a razgrađuje aktivnošću ACE2. Ang II ostvaruje svoje efekte vezujuću se za ATR1 i ATR2. Efekti Ang II imaju važnu ulogu u regulaciji vaskularne homeostaze i to su: vazokonstrikcija, migracija, proliferacija i hipertrofija GMĆ, povećana sinteza EĆM i povećana produkcija matriks-metaloproteinaza (MMPs). Ekspresija ATR1 regulisana je sa miR-155. Balans između aktivacije i represije RAS može biti odlučujući u patološkom remodelovanju zida krvnog suda i patogenezi KA. Zato je važno ispitati funkcionalnu aktivaciju RAS sistema na lokalnom (tkivnom) nivou u karotidama i to na nivou ekspresije gena koji kodiraju za komponente RAS, enzime i receptore. Ekspresija gena je regulisana preko prisustva/odsustva različitih alelnih varijanti funkcionalnih polimorfizama u genima za RAS. Genetičko-epidemiološka studija gena RAS je urađena po pacijenti - kontrole dizajnu, na tri gena i tri polimorfizma. Ova studija obuhvatila je 750 ispitanika oba pola iz populacije Srbije, 505 pacijenata i 246 kontrola iste etničke pripadnosti. Urađena je studija asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE, polimorfizma A1166C u genu za ATR1 i polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 sa nastankom KA, kliničkim parametrima KA, fenotipom plaka (stabilni (SAP) i nestabilni (NAP)), kliničkim događajima (prolazni ishemijski događaj (TIA) i cerebrovaskularni insult (CVI)) u Srbiji. Isti polimorfizmi su asocirani i sa ekspresijom gena u tkivu plaku KA. Analiza ekspresije gena RAS na nivou iRNK je urađena po istom dizajnu, na šest gena. To su ACE, ACE2, TMEM 27, ATR1, ATR2 i miR-155. Ova studija obuhvatila je tkivo KA od 61 pacijenta po tipu SAP (45) i po tipu NAP (16). Studija ekspresije na nivou proteina na tkivu KA plakova obuhvatila je (8) pacijenata, po tipu SAP (3) i po tipu NAP (5) za ATR1, ATR2 i ACE2. U genotipizaciji ispitivanih polimorfizama korišćena je reakcija amplifikacije DNK in vitro PCR i restrikciona analiza sintetisanih fragmenata (RFLP). Relativna kvantifikacija iRNK za ACE, ACE2, ATR1, ATR2, kolektrin (TMEM27) i miR-155 urađena je Real-time PCR metodom. Analiza ekspresije gena RAS i miR-155 urađena je u programu REST (REST Software, QIAGEN), kao i metodom 2 -ΔΔCt i 2 -ΔCt u GraphPad programu. Relativna kvantifikacija proteina urađena je Western blot metodom i densinometrijom. Statistička obrada podataka urađena je korišćenjem programskog paketa STATISTICA 8.0. Ispitani polimorfizmi: I/D u genu za ACE, A1166C u genu za ATR1 i A/G - 1332 u genu za ATR2 nisu bili nezavisni faktori rizika za nastanak KA u ispitanom uzorku u populaciji Srbije. Polimorfizam I/D u genu za ACE bio je nazavistan faktor rizika za formiranje NAP u grupi pacijenata muškog pola. Nosioci genotipa II imali su 2.52 puta veći korigovani rizik za formiranje NAP od nosilaca genotipova koji sadrže alel D. Utvrđena je statistički značajna razlika u distribuciji alela i genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1 između pacijenata sa SAP i NAP. Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 je nezavistan faktor rizik za formiranje NAP. Nosioci alela C, po dominantnom modelu nasleđivanja, imaju 1.94 puta veći korigovani rizik za formiranje NAP od nosilaca genotipa AA. Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 nije asociran sa rizikom za formiranje NAP. Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 je značajan nezavistan faktor rizika za nastanak CVI u grupi pacijenata muškog pola. Hemizigot G/- je asociran sa 2.67 većim korigovanim rizikom za nastanak CVI u odnosu na hemizigot A/-. Polimorfizam I/D u genu za ACE je asociran sa nastankom TIA u grupi pacijenata muškog pola. Genotip DD, po recesivnom modelu nasleđiovanja asociran je sa 2.2 puta većim korigovanim rizikom za nastanak TIA nego genotipovi koji sadrže alel I. U tkivu KA plaka iRNK za ACE, ACE2, TMEM 27, ATR1 i miR-155 se eksprimiraju, a iRNK za ATR2 se ne eksprimira. U ovoj studiji relativni odnos ekspresije gena za ACE/ACE2 u KA plaku čoveka je bio statistički značajno smanjen u poređenju sa kontrolnim tkivom arterije bez znakova aterosklerozei u muškom (3.4 puta) i u ženskom (2.7 puta) polu. Relativni nivo ekspresije iRNK za ACE u poređenju sa nivoom iRNK za ACE2 bio je statistički značajno niži. Nivo ekspresije iRNK za ACE i ATR1 se nisu statistički značajno razlikovale po genotipovima polimorfizama I/D i A1166C. Nivo ekspresije miR-155 se statistički značajno razlikovao u odnosu na genotipove polimorfizma 1166 A/C u genu za ATR1 u grupi pacijenata ženskog pola. Genotip CC je po recesivnom modelu nasleđivanja statistički značajno asociran sa višim nivoom ekspresije miR-155. Nivo ekspresije iRNK za ACE, ACE2, ATR1 i TMEM27 se nije statistički značajno razlikovao između SAP i NAP. Nivo ekspresije proteina ATR1 bio je statistički značajno viši u NAP u odnosu na SAP, dok se nivoi proteina ACE2 i ATR2 nisu statistički značajno razlikovali između SAP i NAP. Nivoi ekspresije proteina ATR1 i ATR2 nisu se statistički značajno razlikovali po genotipovima ispitivanih polimorfizama A1166C i A/G -1332. Ispitani genetički markeri RAS u KA bi mogli biti od kliničkog značaja kao faktori modulacije nastanka i toka bolesti, za koje se do sada nije znalo. U različitim podgrupama pacijenata sa KA asocijacija genetičkih faktora sa kliničkim parametrima može imati potencijalnu primenu u prevenciji i terapiji KA u bliskoj budućnosti. Ključne reči : karotidna ateroskleroza (KA), renin-angiotenzin sistem (RAS), ACE, ACE2, ATR1, ATR2, TMEM27, miR-155, polimorfizam u genu, ekspresija gena Naučna oblast: Molekularna biologija Uža naučna oblast: Molekularna genetika ateroskleroze UDK broj: 577.21: [616-004.6 : 611.13] (043.3) Genetic-epidemiological analysis and analysis of gene expression of the renin- angiotensin system (RAS) in carotid atherosclerosis in humans The carotid atherosclerosis (CA) is chronic disease, which begins with activation inflammatory cells and accumulation lipid in these cells within blood vessel wall. Atherosclerotic plaque containing a lipid core, fibrous cap, accumulates smooth muscle cells (GMC) and proteins of the extracellular matrix (ECM). The renin-angiotensin system (RAS) has a key role in activation of inflammation within blood vessel wall. The main components of the system are: angiotensin I-converting enzyme (ACE), angiotensin converting enzyme homolog (ACE2), angiotensin II receptor type 1 (ATR1), angiotensin II receptor type 2 (ATR2), ACE2 homolog (TMEM27) and regulatory RNA (miR-155). Angiotensin II (Ang II) is the main effector molecule of the RAS, which is synthesized by the activity of ACE and is cleaved by ACE2. Ang II achieves its effects by binding to ATR1 and ATR2. These effects has an important role in the regulation of vascular homeostasis and include the following: vasoconstriction, vascular smooth muscle cells (SMC) migration, proliferation and hypertrophy, increased synthesis of extracellular matrix (ECM) and enhanced production of matrix metalloproteinases (MMPs). The expression of ATR1 is regulated by the miR-155. The balance between activation and repression of RAS can be decisive in pathological remodeling of the vessel wall and the pathogenesis CA. It is therefore important to examine the functional activation of RAS at the local (tissue) level in carotid vessel wall at level of expression genes encoding for components of the RAS, enzymes and receptors. The gene expression of components of RAS is regulated through the presence/absence of different allelic variants of functional polymorphisms in these genes. The genetic epidemiological study for RAS genes was performed by case-control design and consisted of three genes and three polymorphisms within these genes. This study included 750 subjects of both sexes from the Serbian population, 505 patients and 246 controls of the same ethnic background. It is done genetic association study the ACE I/D, ATR1 A1166C and ATR2 A/G -1332 polymorphisms with occurrence of CA, clinical parameters of CA, (phenotypes of plaques (stable (SP) and unstable (USP)), clinical events of disease (transient ischemic attack (TIA) and cerebrovascular insult (CVI)) in Serbia. The same polymorphisms are associated with the with the expression of genes in the tissue of carotid atherosclerotic plaques. Analysis of gene expression at the level RAS mRNA is performed according to the same design, for the all six genes. These genes were ACE, ACE2, TMEM27, ATR1, ATR2 and miR-155. This study involved carotid atherosclerotic tissue of 61 patients, 45 patients with stable carotid plaque characteristics and 16 patients with USP plaques. The study expression at the level of proteins in carotid atherosclerotic tissue included 8 patients, 3 SP and 5 USP plaques for ATR1, ATR2 and ACE2. Genotyping of examined polymorphisms is done by reaction of amplification DNA in vitro (PCR) and restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP). Relative quantification of mRNA for ACE, ACE2, ATR1, ATR2, collectrin (TMEM27) and miR-155 was performed by real-time PCR. Analysis of the gene expression of RAS and miR-155 was performed by REST softwere (REST Software, QIAGEN) and by 2 -ΔΔCt and 2 -ΔCt method in GraphPad softewere. Relative quantification of protein was done by Western blot and densitometry. The statistical analysis was performed using the software package STATISTICA 8.0. The investigated polymorphisms in the human genes of the RAS: the ACE I/D polymorphism, the ATR1 A1166C and ATR2 A/G -1332 were not independent risk factors for the occurrence of CA in examined sample in population of Serbia. The ACE I/D gene polymorphism was an independent risk factor for the formation of USP plaques in group of male patients. The carriers of II genotype had 2.52 fold higher adjusted OR for formation of USP plaques compared to those carriers containing allele D. There was a significant statistical difference in the distribution of genotypes and alleles of the ATR1 A1166C gene polymorphism between patients with SP and USP carotid plaques. The ATR1 A1166C gene polymorphism was an independent risk factor for the formation of USP plaques. The carriers of allele C according to the dominant model inheritance had a 1.94 fold higher adjusted OR for the formation of USP plaques compared to AA genotype carriers. The ATR2 A/G -1332 gene polymorphism is not associated with the risk of the formation of USP plaques. The ATR2 A/G -1332 gene polymorphism was a significant independent risk factor for CVI in the group of male patients. The hemizygote G/- was associated with 2.67 fold gigher adjusted OR for CVI compared to those carriers of hemizygote A/-. The ACE I/D polymorphism is associated with an increased risk for the occurrence of TIA in male group of patients. The genotype DD, according to the recessive model of inheritance is associated with 2.2 fold higher adjusted OR for the occurrence of TIA compared to those genotypes which containing allele I. In the tissue of carotid atherosclerotic plaques the mRNA expression level of ACE, ACE2, TMEM27, ATR1 and miR-155 is determined whilst ATR2 is not. In this study, the relative ratio of mRNA expression of ACE and ACE2 (ACE/ACE2) in human CA plaques was significantly reduced compared with control tissue arteries without any signs of atherosclerosis, 3.4 fold in males and 2.7 fold in female patients. The relative mRNA expression level of ACE compared to the level of ACE2 was significantly decreased. The relative mRNA expression levels of ACE and ATR1 were not significantly different between genotypes of the gene polymorphisms, I/D and A1166C. The relative expression level of miR-155 was significantly different in regard to genotypes of polymorphism A1166C in female group in patients. The genotype CC according to the recessive model of inheritance is significantly associated with r level of miR-155. The relative level of ACE, ACE2, ATR1 and TMEM27 mRNA expression were not significantly different betwereen stable and unstable carotid plaques. The ATR1 protein expression level was significantly higher within unstable carotid plaque in comparison to stable plaques, whereas protein levels of ACE2 and ATR2 did not significantly differ between these phenotypes. The expression levels of proteins ATR1 and ATR2 are not significantly different between the investigated polymorphisms, A1166C and A/G -1332. The examined genetic markers of RAS in CA could have clinical importance as factors that modulate the origin and course of the disease, which hitherto unknown so far. The association of genetic markers with clinical parameters in various subgroups of patients with CA could have potential application in the prevention and treatment of disease in the near future. Key words: carotid atherosclerosis (CA), renin-angiotensin system (RAS), ACE, ACE2, ATR1, ATR2, TMEM27, miR-155, gene polymorphism, mRNA exspression Scientific field: Molecular biology Special topic: Molecular genetics of atherosclerosis UDC Number: 577.21 : [616-004.6 : 611.13] (043.3) LISTA SKRAĆENICA: 3'UTR -3'-netranslatujući region LDLR - LDL receptor 5'UTR -5'-netranslatujući region LDLR -/-- transgeni miševi sa izbačenim genom za LDLR A-adenin LD-neslučajna asocijacija polimorfizama u istom genu ACE2- homolog angiotenzin- konvertujućeg enzima LOX-1- lektinu sličan receptor za oxLDL 1 ACE2 -/- -transgeni miševi sa izbačenim genom za ACE2 LDLR - LDL receptor ACE-angiotenzin-I konvertujući enzm Lp (a)-lipoprotein (a) ACEI-inhibitori ACE enzima MCP-1-protein koji privlači monocite ADAM17-metaloproteaza ADAM17 M-CSF-faktor stimulacije kolonija makrofaga AFs-adventicijalni fibroblasta pacova MHC II-proteini glavnog histokompatibilnog kompleksa klase II AK-aminokiseline Lp (a)-lipoprotein (a) Ang (1-7)- angiotenzin (1-7) MCP-1-protein koji privlači monocite Ang I- angiotenzin I mikroRNK-male nekodirajuće RNK Ang II- angiotenzin II miRSNPs -polimorfizmi u vezujućim mestima za mikroRNK ANG-angiotenzinogen MMP-1 -metaloproteinaza matriksa 1 APĆ-antigen prezentujuće ćelije MMP-2- metaloproteinaza matriksa 2 ApoB- lipoprotein LDL partikula MMP-8- metaloproteinaza matriksa 8 ApoE -/- -transgeni miševi sa izbačenim genom za ApoE MMP-9- metaloproteinaza matriksa 9 ARBS-blokatori receptora ATR1 MMPs- familija metaloproteinaza matriksa ATR1-angiotenzin II receptor tipa 1 MW- molekulska težina ATR2 -/- -transgeni miševi sa izbačenim genom za ATR2 NADP(H) oksidaza- nikotinamid- adenindinukleotid-fosfat oksidaza ATR2- angiotenzin II receptor tipa 2 NAP-nestabilan karotidni aterosklerotski plak B1R -bradikininski receptor tipa I NEP-neutralna endopeptidaza B2R- bradikininski receptor tipa II NF-κB-nuklearni faktor κB BMI-indeks telesne mase NO-azotoksid CAKUT-kongenitalne anomalije urinarnog trakta oxLDL-oksidovani LDL CCA-zajedničke karotidne arterije PAI-1- inhibitor aktivacije plazminogena C-citozin PAOB -periferna arterijska okluzivna bolest CNS-centralni nervni sistem PCR -lančana reakcija polimeraze CRP-C-reaktivni protein PDGF -trombocitni faktor rasta CVI-cerebrovaskularni insult PKC-protein kinaza C DBP-dijastolni krvni pritisak PLS3-plastin 3 DDIM-D dimer PPARs-familija peroksizomalnih proliferativnih aktiviranih receptora DNK-dezoksiribonukleinska kiselina RAS-renin angiotenzin sistem EC-van ćelijska petlja REN-renin EĆM-vanćelijski matriks PLS3-plastin 3 eNOS -endotelijalna NO sintaza RFLP- restrikciona analiza sintetisanih fragmenata ERK1/2-protein kinaza regulisana ekstraćelijskim signalima RNK-ribonukleinska kiselina gACE-germinalna forma ACE enzima ROS-reaktivne vrste kiseonika GAPDH -gliceraldehid trifosfat dehidrogenaza sACE -somatska forma ACE enzima G-guanin SAP-stabilan aterosklerotski plak GIPs -GPVR intergujući proteini SBP- sistolni krvni pritisak GMĆ-glatke mišićne ćelije SDS-natrijum-dodecil sulfat SDS-PAGE- SDS elektroforeza na poliakrilamidnom gelu GPVR -familija G protein vezujućih receptora SHRSP- transgeni model pacova sa hipertenzijom sklonih šlogu H2O2- vodonik peroksid SLC6A14- član familije proteina kojii učestvuju u transportu neurotransmitera zavisnih od Na+ i Cl- i transportu AK HDL- lipoproteini visoke gustine SNAP-25- sinaptozomalni vezani protein od 25 kDa HMEC-1-ćelijska linija mikrovaskularnih endotelnih ćelija SNARE-solubilni proteinski kompleks HNF1-α -hepatocitni nuklearnim faktorom-α snoRNK-mala nukleolarne RNK hnRNPA1-heterogeni nuklearni SNP-tačkasti polimorfizam ribonukleoprotein A1 HO-1-hem-oksigenaza-1 SS -ukupan stepen stenoze HT-hipertenzija TF-tkivni faktor HuR- humani antigen R THP-1-ćelijska linija monocita čoveka HUVEC-kultura venskih endotelnih ćelija izolovana iz pupčane vrpce čoveka TIA-prolazni ishemijski događaj HWE- Hardy-Weinberg-ova ravnoteža TMEM27-kolektrin HuR- humani antigen R TM-transmembranski domen I/D -insercija/delecija TNF-α-faktor nekroze tumora-alfa ICA - interna karotidna arterija T-timin IC-unutar ćelijska petlja U-uracil IFN-γ-interferon-γ VCAM-1-vaskularni adhezioni molekul IGF-1- insulinu sličan faktor rasta 1 VEGF -vaskularni endotelijalni faktor rasta IL-1-α- interleukin-1α VIIF- faktor koagulacije VII IL-1-β- interleukin-1β vWF-von Vilebrandov faktor IL-6-intereukin 6 IL-8- interleukin 8 IM-infarkt miokarda IMZ-zadebljanje intima medije IRES -inicijacija translacije unutrašnjim ulazom ribozoma iRNK-informaciona RNK KA-karotidna ateroskleroza KVB-kardiovaskularne bolesti LDL-lipoproteini niske gustine Sadrţaj 1. UVOD ............................................................................................................... 1 1.1. ATEROSKLEROZA ....................................................................................... 1 1.1.1. Nastanak i progresija ateroskleroze ................................................................ 2 1.1.1.1. Disfunkcija endotela ............................................................................... 2 1.1.1.2. Formiranje masnih pruga ........................................................................ 2 1.1.1.3. Formiranje uznapredovale lezije, plaka ................................................... 2 1.1.1.4. Fenotip nestabilnog (vulnerabilnog) aterosklerotskog plaka .................... 4 1.2. TKIVNI (LOKALNI) RAS .............................................................................. 8 1.3. RAS U INFLAMATORNOJ OSNOVI ATEROSKLEROZE ........................ 9 1.3.1. Efekti RAS na nastanak ateroskleroze .......................................................... 10 1.3.2. Efekti RAS na povećanje oksidativnog stresa i remodelovanje unutar zida krvnog suda ................................................................................................. 12 1.3.3. Uloga ATR2 u aterosklerozi i remodelovanju zida krvnog suda ................... 14 1.4. MOLEKULI RAS SISTEMA ........................................................................ 15 1.4.1. Angiotenzin I-konvertujući enzim (ACE) i njegova funkcija ........................ 15 1.4.1.1. Molekulska struktura sACE .................................................................. 16 1.4.1.2. Struktura gena za ACE.......................................................................... 17 1.4.1.3. Polimorfizam insercija/delecija (I/D) u genu za ACE ............................ 17 1.4.1.4. Regulacija ekspresije gena za ACE polimorfizmom I/D ........................ 18 1.4.1.5. Studije asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE u karotidnoj aterosklerozi ......................................................................................... 19 1.4.2. Angiotenzin konvertujući enzim homolog (ACE2) i njegova funkcija .......... 20 1.4.2.1. Molekulska struktura ACE2 .................................................................. 20 1.4.2.2. Struktura gena za ACE2 ........................................................................ 21 1.4.2.3. Tkivna distribucija ACE2 ..................................................................... 22 1.4.2.4. Model sistemi za ispitivanje funkcije ACE2 u kardiovaskularnim bolestima i aterosklerozi ....................................................................... 23 1.4.3. Kolektrin, tkivna distribucija i funkcija ........................................................ 24 1.4.3.1. Molekulska struktura kolektrina ............................................................ 25 1.4.3.2. Struktura gena za kolektrin ................................................................... 26 1.4.4. Angiotenzin II receptor tipa 1 (ATR1) ......................................................... 26 1.4.4.1. Molekulska struktura ATR1 .................................................................. 26 1.4.4.2. Struktura gena za ATR1 ........................................................................ 26 1.4.4.3. Regulacija ekspresije gena za ATR1 preko alternativnog iskrajanja ...... 27 1.4.4.4. Regulacija ekspresije ATR1 razliĉitim faktorima .................................. 28 1.4.4.5. Postranskripciona regulacija iRNK za ATR1 ........................................ 30 1.4.4.5.1 Regulacija ekspresije gena za ATR1 preko vezivanja regulatornih proteina ................................................................................................ 30 1.4.4.5.2 Regulacija ekspresije gena za ATR1 malim nekodirajućim mikroRNK . 31 1.4.4.6. Znaĉaj genetiĉkih varijanti u regulatornom 3' UTR u procesima regulacije ekspresije gena za ATR1 ...................................................... 31 1.4.4.6.1 MikroRNK (miR-155) i postranskripciona regulacija ekspresije ATR1 sa miR-155 u kardiovaskularnim bolestima ............................................... 32 1.4.4.7. Polimorfizam A166C u genu za ATR1 i regulacija ekspresije gena za ATR1 u funkcionalnim studijama i kardiovaskularnim bolestima.......... 33 1.4.4.8. Studije asocijacije genetiĉke varijante A1666C gena za ATR1 u kardiovaskularnim bolestima ................................................................ 34 1.4.5. Аngiotenzin II receptor tipa 2 (ATR2) ......................................................... 35 1.4.5.1. Molekulska struktura ATR2 .................................................................. 35 1.4.5.2. Struktura gena za ATR2 ........................................................................ 36 1.4.5.3. Regulacija ekspresije ATR2 razliĉitim faktorima .................................. 37 1.4.5.4. Alternativne transkripcione varijante iRNK za ATR2 ĉoveka i njihova tkivna distribucija ................................................................................. 37 1.4.5.5. Regulacija ekspresije gena za ATR2 preko alternativnog iskrajanja ...... 38 1.4.5.6. Polimorfizam A/G -1332 (rs1403543) u genu za ATR2 i regulacija ekspresije .............................................................................................. 38 1.4.5.7. Regulacija alternativnog iskrajanja preko polimorfizma A/G u intronu gena za ATR2 ....................................................................................... 39 1.4.5.8. Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 i asocijacija sa kardiovaskularnim bolestima ................................................................ 39 2. HIPOTEZA I CILJEVI ISTRAŢIVANJA ................................................... 40 3. MATERIJAL I METODE ............................................................................. 42 3.1. MATERIJAL ................................................................................................. 42 3.2. METODE ....................................................................................................... 44 3.2.1. Ultrazvuĉna karakterizacija plaka ................................................................ 44 3.2.2. Izolacija i merenje koncentracije DNK iz ćelija krvi .................................... 46 3.2.3. Genotipizacija polimorfizama DNK in vitro (PCR) ...................................... 47 3.2.3.1. Genotipizacija polimorfizma I/D u genu za ACE reakcijom amplifikacije DNK in vitro......................................................................................... 47 3.2.3.2. Genotipizacija polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2 u jednoj tubi reakcijom amplifikacije DNK in vitro ....... 48 3.2.4. Restrikciona analiza sintetisanih fragmenata (RFLP) ................................... 50 3.2.5. Izolacija, merenje i provera kvaliteta ukupne ćelijske RNK ......................... 51 3.2.5.1. Izolacija ukupne ćelijske RNK iz karotidnog aterosklerotskog plaka ..... 51 3.2.6. Obrada uorka RNK i reverzna transkripcija ................................................. 51 3.2.7. Detekcija iRNK za ACE, ACE2, ATR1, ATR2, kolektrin (TMEM27) i miR- 155 amplifikacijom odreĊenih molekula cDNK (Real-time PCR) ................ 52 3.2.8. Western blot ................................................................................................ 53 3.2.8.1. Priprema uzoraka tkiva karotidnog aterosklerotskog plaka za izolaciju proteina ................................................................................................ 53 3.2.8.2. Natrijum dodecil sulfat elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (SDS- PAGE) .................................................................................................. 54 3.2.9. Statistiĉka obrada podataka ......................................................................... 56 4. REZULTATI .................................................................................................. 58 4.1. OSNOVNE KARAKTERISTIKE KONTROLNOG UZORKA UZORKA PACIJENATA SA KAROTIDNOM ATEROSKLEROZOM (KA) ............ 58 4.2. GENETIČKO-EPIDEMIOLOŠKA ANALIZA ........................................... 65 4.2.1. Polimorfizmi DNK u genima za ACE (I/D), ATR1 (A1166C) i ATR2 (A/G - 1332) u kontrolnoj grupi i grupi pacijenata sa KA ........................................ 65 4.2.1.1. Detekcija polimorfizma I/D u genu za ACE .......................................... 65 4.2.1.2. Detekcija polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i polimorfizma A/G - 1332 u genu za ATR2 ........................................................................... 66 4.2.1.3. Distribucija genotipova u kontrolnoj grupi i grupi pacijenata sa karotidnom aterosklerozom i njihov efekat na nastanak bolesti ............. 67 4.2.2. Polimorfizmi DNK u genima za ACE (I/D), ATR1 (A1166C) i ATR2 (A/G - 1332) u odnosu na tip aterosklerotskog plaka i kliniĉki dogaĊaj ................... 69 4.2.2.1. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na tip plaka ................................................. 69 4.2.2.2. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na cerebrovaskularni insult (šlog) ............... 70 4.2.2.3. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja (TIA) .................................................................................................... 71 4.2.2.4. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku..................................................................................................... 72 4.2.2.5. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) ............................ 73 4.2.2.6. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na cerebrovaskularni insult (šlog) ............... 77 4.2.2.7. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja (TIA) .................................................................................................... 77 4.2.2.8. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku..................................................................................................... 77 4.2.2.9. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) ..... 78 4.2.2.10. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na cerebrovaskularni insult (šlog) .................................................................................................... 79 4.2.2.11. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja (TIA) .................................................................. 80 4.2.2.12. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku ......................................................................... 81 4.3. ANALIZA EKSPRESIJE iRNK ZA KOMPONENTE RAS I REGULATORNE MIR-155 U TKIVU KAROTIDNOG ATEROSKLEROTSKOG PLAKA ............................................................... 83 4.3.1. Ekspresija iRNK za angiotenzin-konvertujući enzim (ACE) u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka....................................................... 85 4.3.1.1. Relativni nivoi iRNK za ACE .............................................................. 85 4.3.1.2. Ekspresija iRNK za ACE u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) ........................................... 88 4.3.1.3. Ekspresija iRNK za ACE u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka u odnosu na genotip polimorfizma I/D u genu za ACE .............. 88 4.3.2. Ekspresija iRNK za angiotenzin-konvertujući enzim homolog (ACE2) u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka ..................................... 89 4.3.2.1. Relativna kvantifikacija ekspresije gena za ACE2 ................................. 89 4.3.2.2. Ekspresija iRNK za ACE2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) .......................................................... 91 4.3.3. Relativni odnos eskpresije iRNK za ACE i ACE2 u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka ................................................................................. 94 4.3.4. Ekspresija iRNK za kolektrin (TMEM27) u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka ................................................................................. 95 4.3.4.1. Relativni nivoi iRNK za kolektrin (TMEM27) u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) ......................................................................................... 95 4.3.5. Ekspresija iRNK za ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima ......... 95 4.3.5.1. Relativni nivoi iRNK za ATR1 u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) ..... 95 4.3.5.2. Ekspresija iRNK za ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 .................. 95 4.3.6. Ekspresija miikroRNK miR-155 u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka .................................................................................................. 96 4.3.6.1. Relativni nivoi miR-155 u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) ................ 96 4.3.6.2. Ekspresija miR-155 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 ............................... 97 4.3.7. Ekspresija iRNK za ATR2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka ......................................................................................................... 99 4.4. EKSPRESIJA PROTEINA RAS ................................................................. 100 4.4.1. Ekspresija proteina ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima ......... 100 4.4.1.1. Detekcija proteina ATR1 Western Blot-metodom ............................... 100 4.4.2. Ekspresija proteina ATR2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ĉoveka ....................................................................................................... 102 4.4.2.1. Detekcija proteina ATR2 Western Blot-metodom ............................... 102 4.4.3. Ekspresija proteina ACE2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima ......... 103 4.4.3.1. Detekcija proteina ACE2 Western Blot-metodom ............................... 103 4.4.4. Ekspresija proteina ACE u karotidnim aterosklerotskim plakovima ........... 103 4.4.4.1. Detekcija proteina ACE Western Blot-metodom ................................ 103 5. DISKUSIJA .................................................................................................. 105 6. ZAKLJUČCI ................................................................................................ 128 7. LITERATURA ............................................................................................. 130 Uvod 1 1. UVOD 1.1. ATEROSKLEROZA Ateroskleroza je sistemska, kompleksna, multifaktorijalna, hroniĉna inflamatorna bolest zida arterijskih krvnih sudova (Ludewig i sar., 2002; Hansson GK, 2005). Karakteriše se disfunkcijom endotela usled povrede zida krvnog suda, proliferacijom glatkih mišićnih ćelija (GMĆ), akumulacijom lipida, sintezom vanćelijskog matriksa (Libby P, 2002), hroniĉnom inflamacijom; infiltracijom, diferencijacijom inflamatornih ćelija (monocita, makrofaga) i aktivacijom ćelija imunskog odgovora (T-limfocita) (Hansson GK, 2009). To za posledicu ima remodelovanje zida krvnog suda, stvaranje aterosklerotskog plaka, akutnu ili hroniĉnu obstrukciju lumena, poremećaj protoka krvi i smanjeno snabdevanje ciljnih organa kiseonikom (ishemija) (Libby i Ridker, 2006). Progresija bolesti doprinosi patogenezi vrlo ozbiljnih kardiovaskularnih oboljenja ĉiji krajnji ishod moţe biti srĉani udar (infarkt miokarda) (IM) ili šlog (cerebralna ishemija) (Libby i sar., 2011). Prema podacima svetske zdravstvene organizaacije (eng. World Health Organization, WHO) broj umrlih od kardiovaskularnih bolesti (KVB) u koje se ubrajaju: bolesti srca (poremećaji nastali u koronarnim krvnim sudovima; IM, reumatske bolesti srca, kongenitalne bolesti srca), cerebrovaskularne bolesti (šlog), povišeni krvni pritisak hipertenzija (HT) i periferna arterijska bolest, je do 2008. godine procenjen na 17.3 miliona ljudi, što je 30 % od ukupnog broja smrtnih sluĉajeva u svetu. Od tog broja 7.3 miliona je umrlo od koronarnih bolesti srca, a 6.2 miliona od šloga. Preko 80 % umrlih od KVB u svetu je iz zemalja sa niskim i vrlo niskim ţivotnim standardom, sa pribliţno istom zastupljenošću smrtnih sluĉajeva kod oba pola (http://www.who.int/cardiovascular_diseases/en/). Uvod 2 1.1.1. Nastanak i progresija ateroskleroze 1.1.1.1. Disfunkcija endotela Disfunkcija endotela je prvi korak u nastanku ateroskleroze. Dva kljuĉna signala u tom procesu su gubitak endetelijum-zavisne vazodilatacije i povećanje ekspresije endotelnih i leukocitnih adhezionih molekula (Newby i sar., 2000). Moţe biti izazvana razliĉitim faktorima kao što su: bakterijske i virusne infekcije; oksidativni stres- usled povećane sinteze reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) kod npr., pušenja; mehaniĉkih sila (turbulentni tok krvi i sila trenja); povišeni nivo lipoproteina niske gustine holesterola (LDL) i homocisteina; HT i šećerne bolesti (Ross R, 1999). Gubitak biološke aktivnosti endotela narušava sintezu azotoksda (NO) i udruţen je sa povećanjem ekspresije protrombotskih faktora, proinflamatornih adhezionih molekula, citokina i faktora hemostaze. Citokini mogu smanjiti dostupnost NO i povećati sintezu ROS (Stocker i Keaney, 2004.). 1.1.1.2. Formiranje masnih pruga Pojava prvih aterosklerotskih lezija je udruţena sa pojavom masnih pruga (eng. feat streak). Tokom ţivota masne pruge se javljaju već u detinjstvu i adolescenciji. Inicijalni dogaĊaj u njihovom nastajanju je akumulacija lipida (zadrţavanje Apo-B – lipoproteina LDL partikula) u subendotelijalnom prostoru vezivanjem za komponente vanćelijskog matriksa (Williams i sar., 2001; Tabas i sar., 2007). 1.1.1.3. Formiranje uznapredovale lezije, plaka Tranzicija relativno jednostavnih masnih pruga u daleko komplikovanije, kompleksnije, aterosklerotske lezije se karakteriše imigracijom GMĆ iz medijalnog sloja kroz internu elastiĉnu laminu u intimalni sloj ili u subendotelni prostor (Glass i Witztum, 2001). U odgovoru na povredu, citokine i faktore rasta GMĆ menjaju fenotip, naime prelaze iz stanja mirovanja tkz., "kontraktilnog fenotipa" u aktivni "sintetiĉki proliferativni fenotip" tip ćelija koji migriraju i proliferišu (Frid i sar., 1997; Uvod 3 Gittenberger-de Groot i sar., 1999; Schaper i Ito, 1996). Kontraktilni fenotip GMĆ zdravog krvnog suda reguliše njegov dijametar (vazokonstrikcijom ili vazodilatacijom) (Schaper i Ito, 1996). Za razliku od kontraktilnog sintetiĉki fenotip u aterosklerozi je odgovoran za remodelovanje zida krvnog suda. GMĆ sintetišu komponente vanćelijskog matriksa (intersticijalni kolagen, elastin, glikozaminoglikane) (Ross i sar., 1999; Schwartz i sar., 2000). Na taj naĉin, tokom progresije bolesti, aterosklerotske lezije zadobijaju karakteristiĉnu formu ateroma (plaka) sa fibroznom kapom (slika 1.1.). Slika 1.1. Sazrevanje aterosklerotskih lezija. Uznapredovale aterosklerotske lezije sadrţe fibroznu kapu koja se sastoji od gustog vanćelijskog matriksa, od kolagena i elastina. Ispod fibrozne kape nalazi se lipidno jezgro sa mnoštvom makrofaga i GMĆ u procesu ćelijskog umiranja po tipu apoptoze, ostataka apoptotskih tela i lipida. Proinflamatorni medijatori iz endotelnih ćelija, limfocita i GMĆ dodatno favorizuju ćelijsku smrt apoptozom. Fibrozna kapa plaka slabi usled aktivnosti intersticijalnih kolagenaza koje degraduju komponente vanćelijskog matriksa. Elastaze dodatno degraduju elastin koji je neophodan za migraciju ćelija unutar lezija. Tokom ove faze aterogeneze formiraju se novi krvni sudovi nastali Uvod 4 ekstenzijom postojećih vasa vasorum poreklom iz adventicijalnog sloja IEL- interna elastiĉna lamina; MPĆ-makrofagi, penušave ćelije; ROS-reaktivne vrste kiseonika) (modifikovano Libby i Ridker, 2006). Tokom formiranja ateroma mononuklearni fagociti (makrofagi) kontinuirano fagocituju lipidne depozite (oxLDL) putem receptora ĉistaĉa i zadobijaju karakteristiĉnu formu penušavih ćelija (Glass i Witztum, 2001; Libby P, 2002). Makrofagi sekretuju proinflamatorne citokine (hemokine), faktore rasta, metaloproteinaze matriksa (MMPs), ROS i tkivni faktor (TF). Tkivni faktor amplifikuje lokalni imunski odgovor unutar lezija i doprinose komplikaciji aterosklerotskih lezija odnosno trombozi. Privuĉeni hemokinima interleukinom-8 (IL-8) i proteinom koji privlaĉi monocite (MCP-1), limfociti se vezuju za adhezione molekule eksprimirane na endotelnim ćelijama kao što je vaskularni adhezioni molekul (VCAM-1) i P-selektin (Hansson i Libby, 2006). 1.1.1.4. Fenotip nestabilnog (vulnerabilnog) aterosklerotskog plaka Pojam "vulnerabilan plak" oznaĉava leziju koja je odgovorna za nastanak akutnog koronarnog sindroma (Muller i sar., 1994). Oznaĉava aterosklerotski plak sa velikim lipidnim jezgrom, visokim sadrţajem makrofaga, malim udelom GMĆ i tankom fibroznom kapom sklonom rupturi (Davies MJ, 1996). Glavni mehanizmi koji dovode do rupture plaka su ekspresija faktora koji slabe fibroznu kapu, fiziĉka sila koju trpi usled pritiska lipidnog jezgra i novo formirani krvni sudovi (vasa vasorum) unutar plaka koji predstavljaju rizik za nastanak tromba (Shah PK, 2003). Tromboza u arterijskim krvnim sudovima smatra se dogaĊajem koji je neposredno odgovoran za najveći deo ishemijskih sindroma (incidenata) koji nastaju kao posledica ateroskleroze (Spagnoli i sar., 2004; Van der Wall i sar., 1994; Virmani i sar., 2006; Mauriello i sar., 2005). Veći deo trombova (60 %-80%) nastaje usled rupture- istanjene fibrozne kape, dok se ostatak formira preko mesta površinske erozije plaka (Farb i sar., 1996). Šematska ilustracija stanovišta stabilnih i nestabilnih aterosklerotskih plakova prikazana je na slici 1.2. (W van Lammeren i sar., 2011). Uvod 5 Slika 1.2. Šematski prikaz stabilnih i nestabilnih aterosklerotskih plakova (modifikovano W van Lammeren i sar., 2011) Lipidno jezgro Formiranje lipidnog jezgra glavna je karakteristika u razvoju vulnerabilnih plakova. Kako ćelijska smrt po tipu nekroze ima ulogu u formiranju lipidnog jezgra, ono se oznaĉava i kao nekrotiĉno jezgro. Pretpostavlja se da lipidno jezgro nastaje kao rezultat spajanja (kombinovanja) manjih pulova akumuliranih lipida u veće, koje postaje acelularno usled apoptoze i nekroze GMĆ i makrofaga-penušavih ćelija (Glass i Witztum, 2001; Libby P, 2002; Hansson GK, 2005). Rezultati studija koje su za temu imale ispitivanje uloge komponenata aterosklerotskih lezija u trombozi, pokazale su da je lipidno jezgro do šest puta više doprinelo rupturi plaka u odnosu na ostale delove (Fernandez-Ortiz i sar., 1994). U vulnerabilnim plakovima koronarnih arterija lipidno jezgro ĉini 29 %-34 % površine plaka (Virmani i sar., 2000; Cheruvu i sar., 2007). U karotidnim arterijama simptomatskih pacijenata pred endarterektomiju lipidno jezgro ĉini 40 % površine plaka (Grønholdt i sar., 2002). Uvod 6 Tanka fibrozna kapa Fibrozna kapa je vezivno tkivo koje prekriva lipidno jezgro. U njenom formiranju uĉestvuju GMĆ koje sintetišu komponente vanćelijskog matriksa (kolagen i proteoglikane) (Virmani i sar., 2000). Sadrţi i inflamatorne ćelije meĊu kojima dominiraju makrofagi-penušave ćelije (Thim i sar., 2008). Kljuĉnu ulogu u stabilnosti fibrozne kape odreĊuje balans izmeĊu sinteze kolagena od strane GMĆ (sintetiĉki fenotip) i razlaganje kolagena usled aktivnosti MMPs. Neke studije sugerišu da su inflamatorni citokini odgovorni za regulaciju ovog balansa. Pored toga što indukuju apoptozu GMĆ i aktiviraju endotelne ćelije i makrofage, takoĊe povećavaju ekspresiju MMPs u ovim ćelijama (Galis i sar., 1994; Walsh i sar., 2000). Ruptura plaka se upravo javlja na mestima stanjene fibrozne kape (Van der Wal i sar., 1994). Inflamacija Inflamacija kontinuirano prati aterosklerozu, a stepen inflamacije unutar plaka moţe ukazivati na rizik za rupturu (Libby P, 2002). MeĊutim, nisu svi delovi nestabilnog plaka podjednako izloţeni inflamaciji. Lipidno jezgro je acelularno, a veliki deo regiona plaka ĉini fibrozno i kalcifikovano tkivo. Analiza endarterektomisanih uzoraka plakova iz koronarnih krvnih sudova pacijenata sa anginom pektoris i akutnim koronarnim sindromom pokazala je da makrofagi ĉine 12 % (Moreno i sar., 2000), odnosno 26 % površine plaka (Virmani i sar., 2000). Ultrazvukom je utvrĊeno da u karotidnim plakovima pacijenata pred endarteroktomiju taj procenat iznosi 1 % (Grønholdt i sar., 2002). Za razliku od lipidnog jezgra ruptuirana fibrozna kapa je zahvaćena inflamacijom (Badimon i sar., 2012). Uvod 7 Angiogeneza Angiogeneza unutar plaka igra vaţnu ulogu u nastanku komplikacija tokom aterogeneze. Vasa vasorum zdravog krvnog suda obezbeĊuje neophodne nutritijente za ishranu intima medije, dok u aterosklerozi usled hipoksije moţe doprineti rastu lezija (Moreno i sar., 2006). U uznapredovalim aterosklerotskim plakovima kontinuirana aktivacija pro-angiogenih citokina rezultuje formiranjem novih nezrelih (fragilnih) krvnih sudova ili penetracije postojećih iz adventicije u intimu koji mogu dovesti do hemoragije (Kolodgie i sar., 2003; Virmani i sar., 2005). Hemoragija unutar plaka uzrokuje iznenadno povećanje volumena plaka i pritiska u njemu, što uzrokuje njegovu nestabilnost. Angiogeneza je dvostruko do ĉetvorostruko veća u plakovima sklonim rupturi (nestabilnim) u poreĊenju sa stabilnim lezijama u koronarnim krvnim sudovima (Von Birgelen i sar., 2001; Schoenhagen i sar., 2000). Sliĉno je uoĉeno i u karotidnim aterosklerotskim plakovima gde hemoragija doprinosi progresiji lezija (Takaya i sar., 2005; Saam i sar., 2006). Uvod 8 1.2. TKIVNI (LOKALNI) RAS Klasiĉan koncept "cirkulišućeg" renin-angiotenzin sistema (RAS) proširen je saznanjima njegovog delovanja na tkivnom (lokalnom) nivou (Re RN, 2004). Cirkulišući RAS samo je jedan od entiteta sveobuhvatnog RAS sistema i tkivnih RAS koji mogu da funkcionišu nazavisno od cirkulišućeg (Paul i sar., 2006) (slika 1.3.). Tkivni RAS karakteriše se prisustvom svih komponenti sistema, renin (REN), angiotenzinogen (ANG), angiotenzin konvertujući enzim (ACE), angiotenzin I (Ang I), angiotenzin II (Ang II) i angiotenzinskih receptora u srcu, krvnim sudovima, bubrezima, adrenalnim ţlezdama, pankreasu, centralnom nervnom sistemu (CNS), reproduktivnom sistemu, limfnom i adipoznom tkivu, hematopoeznim tkivima (Baltatu i sar., 2011; Pérez-Díaz i sar., 2011; Siragy i Carey, 2010; Thatcher i sar., 2009; Fukuda i Sata, 2008; Cassis i sar., 2008; Park i Zambidis, 2009). Iako je ustanovljeno da se tkivni Ang II sintetiše od lokalno dostupnog Ang I, i dalje nije jasno da li se tkivni REN sintetiše lokalno i da li tkiva preuzimaju REN iz cirkulacije poreklom iz bubrega. REN moţe lokalno da se sekretuje u bubregu, adrenalnim ţlezdama i mozgu, ali se smatra da je u krvnim sudovima i srcu uglavnom primarno poreklom iz bubrega (Nguyen Dinh Cat i Touyz., 2011). Lokalni RAS funkcioniše na endokrini, parakrini i autokrini/intrakrini naĉin. Povišeni tkivni nivoi komponenata RAS javljaju se u KVB nezavisno od povišenog nivoa krvnog pritiska, u aterosklerozi, infarktu miokarda, u srcu ĉiji je rad poremećen, dijabetesu, bolestima bubrega (Raizada i sar., 2007). Do sada su dobro okarakterisani tkivni RAS sistemi u mozgu, bubregu, srcu (Re RN, 2004; Bader i Ganten, 2008; Beyazit i sar., 2010; De Mello i sar., 2011; Zhuo i Li, 2011). Uvod 9 Slika 1.3. Šematski prikaz sistemskih i lokalnih efekata RAS sistema. RAS sistem ima kljuĉnu ulogu u regulaciji krvnog pritiska, volumenu telesnih teĉnosti i balansu elektrolita. Pored toga što ima sistemske efekte, lokalno, RAS doprinosi adaptaciji ćelija na stimuluse, obnovi organa posle povrede i tkivnom remodelovanju (modifikovano Fukuda i Sata, 2008). 1.3. RAS U INFLAMATORNOJ OSNOVI ATEROSKLEROZE RAS ima kljuĉnu ulogu u inicijaciji i progresiji ateroskleroze, kroz aktivaciju inflamacije i proliferacije ćelija (Phillips i Kagiyama, 2002; Grote i sar., 2004; Petnehazy i sar., 2006). Pošto je ateroskleroza hroniĉna, inflamatorna bolest, multifaktorijalne etio logije, kontinuirano regrutovanje imunih ćelija iz cirkulacije igra kljuĉnu ulogu tokom aterogeneze. Inflamatorni odgovor se odvija u tri koraka: 1) povećanje vaskularne propustljivosti 2) infiltraciju leukocita i 3) tkivno remodelovanje (Cheng i sar., 2005). Brojne studije su pokazale da Ang II kao inflamatorni medijator RAS, moduliše imunski odgovor odgovor na svakom od ovih koraka i posreduje u nekoliko kljuĉnih Uvod 10 dogaĊaja tokom procesa inflamacije (Cheng i sar., 2005; Marchesi i sar., 2008) (slika 1.4.). Pored hemodinamskih efekata na zid krvnog suda, Ang II ispoljava znaĉajne efekte na ćelije zida krvnog suda što ima za posledicu poremećenu homeostazu i nastanak ateroskleroze (Brasier i sar., 2002). Slika 1.4. Uloga Ang II posredovana njegovim vezivanjem za ATR1 u tkivnoj inflamaciji. Ang II vezivanjem za receptor ATR1, aktivira signalne puteve u ćelijama imunskog sistema i doprinosi lokalizovanoj aktivaciji imunog sistema (modifikovano Benigni i sar., 2010) 1.3.1. Efekti RAS na nastanak ateroskleroze Za Ang II, glavni efektorski peptd RAS, utvrĊeno je da uĉestvuje u svim fazama tokom aterogenog procesa. Unutar zida krvnog suda Ang II povećava vaskularnu propustljivost aktivacijom vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) (Suzuki i sar., 2003; Cheng i sar., 2005). Regrutovanjem monocita iz krvi dodatno promoviše inflamaciju (Touyz RM, 2005). Pored monocita aktivira i druge imunokompetentne ćelije iz krvi kao što su T limfociti i visoko specijalizovane antigen prezentujuće ćelije (APĆ) (Lapteva i sar., 2001; Nahmod i sar., 2003). T limfociti poseduju endogeni RAS Uvod 11 koji dalje moţe da moduliše inflamatorni odgovor (Jurewicz i sar., 2007; Hoch i sar., 2009). Konstantnu inflamaciju unutar zida krvnog suda Ang II promoviše aktivacijom nekoliko pro-inflamatornih transkripcionih faktora. To su nuklearni faktor κB (NF-κB), jedan od glavnih transkripcionih faktora za koji je utvrĊeno da pojaĉava ekspresiju brojnih gena u hroniĉnim inflamatornim bolestima (Barnes i Karin, 1997). S druge strane Ang II indukovana inflamacija je smanjila ekspresiju transkripcionih faktora iz familije peroksizomalnih proliferativnih aktiviranih receptora (PPARs) (eng. peroxisome proliferator-activated receptors, PPAR), koji za razliku od NF-κB imaju protektivne efekte (Tham i sar., 2002). Ang II indukovana inflamacija i remodelovanje zida krvnog suda kontrolisana je i aktivacijom transkripcionih faktora iz familije ETS transkripcionih faktora (Ets-1) (Zhan i sar., 2005). Dokazi da Ang II promoviše nastanak aterosklerotskih lezija pokazani su u animalnim modelima bolesti kod miševa deficijentnih za ApoE (ApoE -/-) i receptor za LDL (LDLR -/- ), u kojima je hiperholesterolemija stimulisala sintezu angiotenzinskih peptida (Daugherty i sar., 2004). U uznapredovalim aterosklerotskim lezijama Ang II je stimulisao ekspresiju MMPs (Galis i Khatri, 2002; Luchtefeld i sar., 2005) i inhibitora aktivacije plazminogena (PAI-1) koji su destabilizovale aterosklerotski plak i dovele do promene balansa fibrinolize (Vaughan i sar., 1995). Aktivacijom VEGF Ang II je promovisao adventicijalnu angiogenezu (Cheng i sar., 2005; Moreno i sar., 2006) (slika 1.5). Svoje efekte u aterosklerozi Ang II ispoljava vezivanjem za Ang II receptore tipa 1 (ATR1) i tipa 2 (ATR2) (Sayeski i Bernstain, 2001; Nouet i Nahmias, 2000). Aterogena funkcija Ang II u zidu krvnog suda u najvećoj meri je posredovana aktivacijom ATR1 (Braiser i sar., 2002). Rezultati farmakoloških studija inhibicije ATR1 u animalnim modelima ateroskleroze pokazali su niţi stepen razvoja bolesti (Li i sar., 2004; Wassmann i sar., 2004a). Smatra se da protektivni efekti blokade ATR1 posreduju u smanjenju oksidativnog stresa, smanjenju stepena inflamacije i poboljašanju funkcije endotelijuma (Wassmann i sar., 2004a). Farmakološka blokada ATR1 je smanjila akumulaciju lipida i povećala nivo kolagena unutar ateroma i samim tim stabilizovala aterosklerotske plakove u animalnim modelima ateroskleroze kod miševa kod kojih je gen za ApoE izbaĉen (Fukuda i sar., 2008). Uvod 12 Slika 1.5. Uloga Ang II-ATR1 puta u aterosklerozi. Receptor ATR1 eksprimiran je u vaskularnim i inflamatornim ćelijama. Indukcijom sinteze rekativnih vrsta kiseonika (ROS), stimulacijom ekspresije adhezionih molekula i hemokina Ang II dovodi do disfunkcije endotela, infiltracije inflamatornih ćelija i skladištenje lipida. Ang II takoĊe promoviše proces patološke angiogeneze u vasa vasorum putem povećane sinteze vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) (modifikovano Fukuda i Sata, 2008) 1.3.2. Efekti RAS na povećanje oksidativnog stresa i remodelovanje unutar zida krvnog suda Pokazano je da vezivanje Ang II za ATR1 unutar zida krvnog suda povećava oksidativni stres tako što indukuje aktivnost enzima nikotinamid-adenindinukleotid- fosfat oksidaze (NAD(P)H oksidaza) (Warnholtz i sar., 1999). Njenom aktivnošću nastaju ROS koje su aktivno ukljuĉene u transdukciju mnogobrojnih signala Ang II (Griendling i Ushio-Fukai, 2000). Pri tom nastaju superoksidni anjoni i vodonik peroksid (H2O2) koji u zidu krvnog suda deluju na dva naĉina : 1) ekstraćelijski tako što modulišu endotelijum zavisne promene vaskularnog tonusa i 2) intraćelijski kao sekundarni glasnici koji utiĉu na dugotrajne fenotipske promene ćelija (Griendling i Ushio-Fukai, 2000). Efekat oksidativnog stresa se ogleda već u prvim fazama aterogeneze tokom formiranja masnih pruga gde je Ang II favorizovao unos oxLDL-a u makrofage (Keidar i sar., 2001). U endotelnim ćelijama Ang II je povećao ekspresiju Uvod 13 lektinu sliĉnog receptora za oksidovani LDL (LOX-1), koji dalje potpomaţe unos oxLDL-a unutar lezija (Morawietz i sar., 1999). Kao deo odgovora na povredu, krvni sud teţi da se obnovi kroz procese vaskularnog remodelovanja (Touyz RM, 2005; Marchesi i sar., 2008). Ang II je imao ulogu faktora rasta tokom remodelovanja in vivo tako što je stimulisao hiperplaziju i hipertrofiju GMĆ, transaktivacijom receptora trombocitni faktor rasta (PDGF) (Kelly i sar., 2004). Zajedno sa faktorom nekroze tumora-α (TNF-α) u endotelnim ćelijama indukovao je sintezu MMP-2 (Arenas i sar., 2004). Zna se da je ekspresija MMP-2 i MMP-9 u aterosklerozi udruţena sa rupturom aterosklerotskog plaka (Heo i sar., 2011). Povećan nivo Ang II tokom remodelovanja zida krvnog suda posledica je i aktivnosti MMP-8 koja konvertuje Ang I u Ang II (Laxton i sar., 2009). Pokazano je da ATR1 i ATR2 imaju suprotne efekte u vaskularnom remodelovanju (Brassard i sar., 2005). Inhibicija ATR1 blokatorima (ARBS) imala je protektivni efekat na vaskularno remodelovanje kod transgenih miševa sa izbaĉenim genom za ATR2 (ATR2 -/-) u kojima je indukovana povreda (Wu i sar., 2001). Blokada ATR1 smanjila je oksidativni stres i imala antiaterosklerotske efekte kod miševa kod kojih su geni za ATR2 i ApoE izbaĉeni (Iwai i sar., 2005). Inhibicija ATR1 selektivnim antagonistima smanjila je hipertenziju, povećala ekspresiju ATR2 i favorizovala vaskularno remodelovanje u šećernoj bolesti (Savoia i sar., 2007). Najĉešće korišćena terapija u remodelovanja vaskularnog tkiva jesu ARBS, inhibitori ACE enzima (ACEI) u kombinaciji sa drugim medikamentima (Cipollone i sar., 2004; Koh i sar., 2010). Podatak da je ekspresija ACE registrovana u inflamatornim regionima karotidnih aterosklerotskih plakova (Fukuhara i sar., 2000), kao i eksperimentalni dokazi da tokom progresije bolesti u pojedinim regionima aterosklerotskog plaka karotida (makrofagi) gube sekretornu aktivnost sinteze ACE (Morioka i sar., 2004), ukazala je da RAS ima kritiĉnu ulogu u ovoj bolesti. Istovremeno otkriće novih komponenti sistema kao što je angiotenzin konvertujući enzim homolog (ACE2) suprotnog regulatora ACE, dovela su do preovlaĊujućeg koncepta o postojanju dva sistema koji imaju suprotne efekte u regulaciji vaskularne homeostaze i vaskularne funkcije (Rabelo i sar., 2011). To su aktivirajuća kaskada koju ĉine ACE/Ang II/ATR1 i deaktivarujuća kaskada koji ĉine ACE2, Angiotenzin (1-7) i Mas receptor (ACE2/Ang (1-7)/Mas) (Santos i sar., 2008; Rabelo i sar., 2011; Clarke i sar., 2013). Pitanje koje se Uvod 14 postavlja jeste da li patološko remodelovanje unutar zida krvnog suda u krajnjim fenotipovima ateroskleroze kod ĉoveka zavisi od aktivacije/deaktivacije RAS sistema kroz odnos ekspresije ACE/ACE2 i/ili aktivacije/deaktivacije ekspresionog nivoa receptora ATR1/ATR2. 1.3.3. Uloga ATR2 u aterosklerozi i remodelovanju zida krvnog suda Postoje opreĉni rezultati uloge ATR2 u aterosklerozi. Sugerisana je antiinflamatorna uloga ATR2 tokom progresije ateroskleroze (Savoia i sar., 2011). Direktna stimulacija ATR2 agonistom (supstanca 21) u kulturi fibroblasta je smanjila sintezu proinflamatornih citokina (Rompe i sar., 2010). Indukcija sinteze ATR2 je indukovala smanjenje nivoa ekspresije informacione RNK (iRNK) za MMP-2 koja ima ulogu u rastu neointime posle povrede (Jing i sar., 2009). U animalnim modelima ateroskleroze transgeni miševi sa izbaĉenim genom za LDLR u kojima je adenovirisnim vektorom uspostavljena ekspresija ATR2 pokazala je da ovi miševi imaju manji stepen aterogeneze u aorti, smanjenu akumulaciju kolagena, smanjeni ekspresioni nivo i aktivnost MMP-aza (MMP-2, MMP-9) u regionima aterosklerotskih lezija (Dandapat i sar., 2008). U istom modelu miševa pokazano je da prisustvo ATR2 moduliše oksidativni stres, povećava ekspresiju endotelijalne NO sintaze (eNOS) i hem- oksigenaze-1 (HO-1) i proinflamatorne procese putem fosforilacije Akt-1 kinaze (Hu i sar., 2008). Kod miševa sa izbaĉenim genom za ApoE polni hormoni su kod muţjaka imali ulogu u razvoju ateroskleroskih lezija (aneurizmi) indukovanu Ang II (Henriques i sar., 2004), dok su ţenke bile zaštićene (Daugherty i sar., 2001). Kod ţenki je infuzija Ang II i primena blokatora ATR2 menjala tok bolesti (Daugherty i sar., 2001). U istom modelu Ang II i ishrana bogata holesterolom, u aterosklerotskom plaku je dovela do povećanja ekspresije ATR2 na nivou iRNK i proteina (Johansson i sar., 2005). Blokada receptora ATR1 i inhibicija receptora ACE nije imala efekte na distribuciju i kompoziciju aterosklerotskih lezija kod ĉoveka (Johansson i sar., 2008). Miševi koji su dupli nokauti, deficijentni za ApoE i ATR2, na ishrani bogatoj holesterolom su razvili aterosklerozu (Sales i sar., 2005; Iwai i sar., 2005). ATR2 je modulisao oksidativni stres i imao kontraregulatornu ulogu u odnosu na ATR1 u uslovima kada je ATR1 blokiran (Sohn i Uvod 15 sar., 2000). Posle 16 nedelja ishrane bogate holesterolom sojevi miševa sa ATR2 genom imali su znaĉajno manji broj makrofaga, GMĆ, lipida i kolagena u plakovima usled apoptoze, dok ovaj efekat nije bio vidljiv posle 10 nedelja ove ishrane (Sales i sar., 2005). ATR2 ima funkciju glavnog antiinflamatornog medijatora u animalnim modelima povrede krvnih sudova (Wu i sar., 2001). U eksperimentalnom modelu povrede karotidne arterije (eng. balloon injury) pokazano je da indukovana ekspresija ATR2 inhibira hiperplaziju i proliferaciju GMĆ (Tang i sar., 2011) i reguliše formiranje nove intime (neointime) (Wu i sar., 2001). Ukoliko je u ovim modelima izbaĉen gen za ATR2 dolazilo je do zadebljanja medijalnog sloja usled smanjene apoptoze ćelija (Yamamoto i sar., 2008). Ekspresija ATR2 zabeleţena je u endotelnim ćelijama, makrofagama u aterosklerotskom plaku i ćelijama novoformirane intime (neointime) kod zeĉeva sa aterosklerozom (Zulli i sar., 2006). Postoje i opreĉni dokazi u kulturi monocita ĉoveka: stimulacija ATR2 Ang II je pojaĉala sintezu prostaglandina (PGE2) i MMP-1, za koju je pokazano da uĉestvuje u inflamatornom procesu u rupturi aterosklerotskih plakova (Kim i sar., 2005). U LDLR -/- modelu miševa deficijencija gena za ATR2 nije imala efekte na tok i veliĉinu aterosklerotskih lezija (Daugherty i sar., 2004). Pokazano je da je ATR2 eksprimiran u makrofagama aterosklerotskih plakova ĉoveka (Johansson i sar., 2008). To je jedina komponenta RAS sistema ĉiji nivo ekspresije (iRNK i protein) nije bio povišen u drugim tipovima aterosklerotskih lezija (aneurizme) zahvaćenih bolešću (Kaschina i sar., 2009). 1.4. MOLEKULI RAS SISTEMA 1.4.1. Angiotenzin I-konvertujući enzim (ACE) i njegova funkcija Kod ĉoveka ACE je peptidil dipeptidaza (karboksipeptidaza) koja uklanja po dve aminokiseline (AK) sa karboksilnog kraja proteina ĉiju hidrolizu katalizuje. Svojom aktivnošću, ACE vrši konverziju Ang I i tako generiše Ang II. Postoji u dve forme: somatska zastupljena u mnogim tkivima (sACE) i germinalna (testikularna) (gACE) forma prisutna samo u testisima. Obe izoforme pripadaju grupi transmembranskih ektoenzima (Corvol i sar., 1995a; Corvol i sar., 1995b) sa ekstraćelijskim Uvod 16 ektodomenom, hidrofobnim (transmembranskim) delom i kratkim citoplazmatiĉnim "repom" (slika 1.6). Obe forme enzima imaju signalnu sekvencu na N-kraju, potrebnu za prolaz u endoplazmatiĉni retikulum (Coates D, 2003). 1.4.1.1. Molekulska struktura sACE sACE enzima kod ĉoveka je peptid, koji ima molekulsku teţinu (eng.molecular weight, MW) 140 kDa (glokozilovana forma ima MW 150-180 kDa) (Coates D, 2003). Somatska forma ima 1306 AK (slika 1.8.) i sadrţi dva homologa katalitiĉka domena koji su 60 % identiĉni, oznaĉeni kao N- i -C, prema tome da li su bliţe N ili C kraju proteina (Danser i sar., 2007). gACE sadrţi samo jedan domen koji je identiĉan C domenu sACE. Funkcionalne jedinice svakog domena su Zn 2+ zavisni aktivni motivi (His-Glu-X-X-His). Joni Zn 2+ ĉine vaţnu katalitiĉku komponentu aktivnog centra za koju se vezuju ACEI (Natesh i sar., 2003). Slika 1.6. Struktura gena i proteina ACE. sACE nastala je tandemskom duplikacijom gena koji kodiraju informaciju za dva domena, –N i –C domen proteina i koji se traskribuje sa somatskog promotora (oznaka Spro u genu). gACE se transkribuje sa drugog specifiĉnog unutrašnjeg promotora (Gpro). Proteini u okviru osnovnog regiona pokazuju visok stepen homologije (oznaĉeno ruţiĉasto). Aktivna mesta za koja se vezuju joni Zn2+ su oznaĉena ţuto. Obe forme enzima sadrţe N terminalnu signalnu sekvencu (oznaĉeno zeleno). Kiĉmenjaci u proteinu sadrţe hidrofobnu (transmembransku) C-teminalnu sekvencu (oznaĉeno narandţasto), dok kod beskiĉmenjaka (AnCE) nedostaje transmembranski region i protein postoji samo u solubilnoj ektraćelijskoj formi (modifikovano Coates D, 2003). Uvod 17 1.4.1.2. Struktura gena za ACE Gen za humani ACE lociran je na hromozom.u 17 (Mattei i sar., 1989) u regionu q22-q24 (Jeunemaitre i sar., 1992). Gen je dug 21 kb i sadrţi 26 egzona. Informaciona RNK (iRNK) za sACE i gACE transkribuju se sa dva razliĉita promotora (Hubert i sar., 1991; Langford i sar., 1991). Somatski promotor je lokalizovan na 5'-kraju prvog egzona i kontroliše transkripciju svih egzona izuzev egzona broj 13. Egzon 13 kodira za 67 dugu AK sekvencu koja odgovara N-terminalnom kraju gACE. Primarni transkript se alternativno iskraja te postoje duţe i kraće forme iRNK (4.3 i 3.5 kb) (Hubert i sar., 1991; Sugimura i sar., 1998). Funkcionalna analiza promotora gena za ACE kod ĉoveka pokazala je da u promotoru postoje dva pozitivna i dva negativna regulatorna elementa (Testut i sar., 1993). Proksimalni pozitivni regulatorni element se nalazi 132 bp uzvodno od starta transkripcije, a negativni regulatorni elementi naĊeni su na poziciji -472 bp i izmeĊu - 343 bp i -132 bp (Testut i sar., 1993). Germinalni promotor nalazi se u intronu 12 (Langford i sar., 1991) te je iRNK za gACE kraća duga 3 000 nukleotida (Hubert i sar., 1991). 1.4.1.3. Polimorfizam insercija/delecija (I/D) u genu za ACE Polimorfizam insercija/delecija (I/D) ispoljava se kroz prisustvo (alel I) odnosno odsustvo (alel D) Alu-palindromske sekvence duge 287 bp u intronu 16 (slika 1.7.). Analiza strukture sekvence alela I i alela D gena u genu za ACE pokazala je identiĉnu palindromsku sekvencu od 14 bp na oba kraja insercije (Hunley i sar., 1996). Spajanje ova dva ponovka sugeriše mogući nastanak alela D. Tokom mejoze jedan od ta dva ponovka bi mogao da se postavi da bude komplementaran drugom i tako stvori petlju koja bi mogla da izbaci insercioni fragment (Yoshida i sar., 1996). Ovaj naĉin potencijalnog nastanka polimorfizma u lokusu gena za ACE sugeriše da je mutacioni dogaĊaj koji je doveo do nastanka polimorfizma delecija, a ne insercija (Yoshida i sar., 1996). Uvod 18 Slika 1.7. Šematski prikaz strukture genaza ACE. Polimorfizam I/D nalazi se u intronu 16 i manifestuje se prisustvom (insercija) ili odsustvom (delecija) sekvence duge 287 bp (modifikovano http://www.nieronline.org/uploads/5/53/Lely_Fig2.jpg) 1.4.1.4. Regulacija ekspresije gena za ACE polimorfizmom I/D Prisustvo polimorfizma I/D predstavlja genetiĉku determinantu koja odreĊuje koncentraciju solubilne forme ACE u serumu (Rigat i sar., 1990). Jasna veza izmeĊu polimorfizma I/D u genu za ACE i nivoa ACE enzima u serumu naĊena je u populaciji Kavkazoida i Pima Indijanaca. Subjekti sa alelom D su imali viši nivo ACE u plazmi nego subjekti sa alelom I (Rigat i sar., 1990; Foy i sar., 1996). U populaciji zdravih Kavkazoida, efekat polimorfizma I/D je kodominantan, što znaĉi da osobe sa genotipom II imaju najniţi nivo enzima ACE, a osobe sa genotipom DD najviši nivo, kod osoba sa genotipom ID ovaj nivo je intermedijalan. Polimorfizam I/D je povezan sa oko sa oko 47 % interindividualne varijabilnosti u nivou ACE enzima u plazmi (Rigat i sar., 1990). U populaciju Negroida, za razliku od Kavkazoida, polimorfizam nije u asocijaciji sa aktivnosti ACE u serumu u populaciji zdravih, kod dece i adolescenata (Bloem i sar., 1996). Ovi nalazi ukazuju da je regulacija serumske aktivnosti ACE asocirana sa polimorfizmom I/D i da je razliĉita u razliĉitim etniĉkim grupama. U T-limfocitima nosioci genotipa DD polimorfizma I/D u genu za ACE imali su najviši nivo intracelularnog ACE (Costerousse i sar., 1993). U leukocitima nivo ekspresije iRNK za ACE bio je povišen kod nosilaca alela D (Suehiro i sar., 2004). Ista relacija polimorfizma i ekspresije iRNK naĊena je u tkivu bubrega (Mizuiri i sar., 2001). U tkivu komore srca najveća aktivnost ACE enzima bila je zabeleţena kod nosilaca Uvod 19 genotipa DD (Danser i sar., 1995). U tkivu pretkomore srca ĉoveka sa ventrikularnom hipertrofijom nivo ekspresije iRNK po genotipu polimorfizma I/D se nije statistiĉki znaĉajno razlikovao (Spruth i sar., 1999). Ispitivanje asocijacije izmeĊu polimorfizma I/D i nivoa sACE enzima u semenoj teĉnosti i aktivnosti gACE u spermatozoidima nije naĊena (Williams i sar., 1995). Transkripcija iRNK za gACE nije modulisana polimorfizmom I/D već je pod kontrolom germinalnog promotora (Williams i sar., 1995). Ovi nalazi ukazuju da postoji tkivna specifiĉnost regulacije ekspresije ACE. Funkcionalnost ACE enzima se dugi niz godina unazad intezivno istraţivala u relaciji sa polimorfizmom I/D, naroĉito u KVB. MeĊutim, ispitivanja ekspresije ACE u tkivima i/ili polimorfizmom regulisane ekspresije su retka. U tkivu aterosklerotkog plaka ex vivo, naroĉito u karotidnoj aterosklerozi ova ispitivanja nisu izvršena. 1.4.1.5. Studije asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE u karotidnoj aterosklerozi Studije koje su bavile ispitivanjem potencijalne asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE sa karotidnom aterosklerozom su bile koncipirane na asocijaciju sa subkliniĉkim parametrima ateroskleroze kao što je zadebljanje intima medije (IMZ), fenotipom koji se manifestuje na poĉetku bolesti. Rezulatati ovih studija nisu konzistentni. Velika meta analiza koja je sprovedena 2003. i koja je obuhvatila više od 20 studija, od kojih je većina saĉinjena od populacija zdravih i bolesnih pokazala je umerenu asocijaciju alela D polimorfizma I/D sa IMZ (Sayed-Tabatabaei i sar., 2003). Studije koje su se bavile ispitivanjem asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE sa uznapredovalom aterosklerozom, sa fenotipom karotidnog aterosklerotskog plaka su retke (Kolaković i sar., 2012). Uvod 20 1.4.2. Angiotenzin konvertujući enzim homolog (ACE2) i njegova funkcija ACE2 ima sliĉnost sa ACE, ali drugaĉije hidrolizuje supstrate ĉime sintetiše i uklajanja drugaĉije efektorne molekule RAS. ACE2 ima ulogu negativnog enzimskog regulator RAS (Donoghue i sar., 2000; Tipnis i sar., 2000). ACE2 je cink metalopeptidaza kao i ACE koja ima jone Zn 2+ u katalitiĉkom domenu (Donoghue i sar., 2000; Tipnis i sar., 2000; Turner i Hooper, 2002). ACE2 ima jedno katalitiĉko mesto i funkcioniše kao karboksimonopeptidaza koja uklanja po jednu AK sa C-kraja supstrata (Vickers i sar., 2002). Sa ACE ima 61% sliĉnosti i 41.8 % identiĉnosti sekvence u katalitiĉkom domenu (Tipnis i sar., 2000; Donoghue i sar., 2000; Turner i Hooper, 2002). Enzim nije osetljiv na inhibitore ACE enzima (Rice i sar., 2004). C- terminalni domen ACE2 pokazuje 48% identiĉnosti sa kolektrinom (Zhang i sar., 2001), još jednim proteinom iz familije ACE. ACE2 hidrolizuje dekapeptid Ang I u Angiotenzin (1-9) (Ang (1-9)) (Donoghue i sar., 2000) i oktapeptid Ang II u Ang (1-7) (Vickers i sar., 2002; Imai i sar., 2010). Za ACE2 je ustanovljeno da ima ≈ 400 puta veći afinitet za katalizu Ang II nego za Ang I (Vickers i sar., 2002). 1.4.2.1. Molekulska struktura ACE2 ACE2 je transmembranski glikoprotein tipa I, koji ima 805 AK (slika 1.8.). Poput ACE ima dva domena, katalitiĉki domen na N-kraju proteina (pozicija 147-555) i C-terminalni domen. Na N-kraju proteina nalazi se signalna sekvenca duga 17 AK, potom sledi motiv HEMGH-katalitiĉki domen, hidrofobni transmembranski region od 22 AK i citosolni domen dug 42 AK (Tipnis i sar., 2000). Ekstraćelijski domen sadrţi sedam N-potencijalnih mesta glikozilacije. Solubilna forma, sekretovana forma enzima, kojoj nedostaje transmembranski i citosolni domen je glikozilovana na N-kraju i njena MW iznosi 120 kDa (Tipnis i sar., 2000; Eriksson i sar., 2002). Deglikozilacija smanjuje molekulsku teţinu proteina na 85 kDa. Uvod 21 Slika 1.8. Šematski prikaz strukturnih domena ACE, ACE2 i kolektrina. Svaki protein je integralni protein tipa I sa signalnom sekvencom (oznaĉeno sivom bojom) i transmembranskim regionom (oznaĉeno crno). ACE ima dva Zn2+ vezujuća (HEMGH) katalitiĉka domena, dok ACE2 ima jedan katalitiĉki domen (oznaĉeno ţuto). Homologi regioni izmeĊu ACE2 i kolektrina su oznaĉeni zeleno. Brojevima je oznaĉeno koliko AK sadrţi svaki protein. (modifikovano Kuba i sar., 2010). OslobaĊanje katalitiĉkog ektodomena (solubilne forme enzima) proteolitiĉko seĉenje je posredovano aktivnošću dezintegrina i metaloproteaze (ADAM17) (Lambert i sar., 2005; Iwata i sar., 2009). Ovaj proces dešava se konstitutivno u niskom stepenu, a moţe biti i indukovan forbil estrima. Mesto seĉenja ACE2 se nalazi u jukstamembranskoj sekvenci na poziciji izmeĊu Arg708 i Ser709(Jia i sar., 2009). Citoplazmatiĉni domen ACE2 kao i ACE sadrţi vezujuća mesta za kalmodulin koji ima efekte na regulaciju i seĉenje katalitiĉkog ektodomena (Lambert i sar., 2008). Pokazano je da ACE2 interaguje sa β-integrinom u lizatu srca i pretpostavlja se da ova interakcija predstavlja regulatorni mehanizam aktivnosti i kolokalizacije ACE2 (Lin i sar., 2004). 1.4.2.2. Struktura gena za ACE2 Gen ACE2 ĉoveka sadrţi 18 egzona od kojih neki imaju sliĉnosti sa prvih 17 egzona gena za ACE (Tipnis i sar., 2000). Mada su mnogi egzoni identiĉne veliĉine, egzoni 5 i 6 razlikuju se i odgovaraju egzonu 5 gena ACE. Egzon 9 u genu za ACE2 koji kodira za motiv His-Glu-X-X-His (gde je X bilo koja AK) odgovara egzonu 8 u genu za ACE (Turner i Hooper, 2002). Egzoni na 3' kraju koji kodiraju za jukstamembranske, transmembranske i citosolne domene proteina su sliĉni egzonima Uvod 22 kolektrina (Zhang i sar., 2001). Gen je mapiran na Xp22 hromozomu i prostire se na oko 40 kb genomske DNK. Komplementarna dezoksiribonukleinska kiselina (cDNK) za ACE2 se sastoji iz 3405 nukleotida od kojih je 103 nukleotida u 5'-nekodirajućoj sekvenci, 2418 nukleotida u otvorenom okviru ĉitanja i 884 nukleotida u 3'- regionu koji se ne prepisuje (Tipnis i sar., 2000). Northern blot analiza pokazala je da iRNK za ACE2 duga 3.400 nukleotida i da je ova transkripciona varijanta eksprimirana u najvišem nivou u srcu, bubregu i testisima od ukupno 23 tkiva ĉoveka gde je ispitivana njena ekspresija (Donoghue i sar., 2000). Prisustvo duţe transkripcione varijante od ≈8 kb je pokazano samo u bubregu (Donoghue i sar., 2000). Detektovana je i transkripciona varijanta duga 5.900 nukleotida zastupljena u bubregu i testisima (Tipnis i sar., 2000). Iz tkiva pluća je 2005. godine klonirana cDNK za ACE2 i utvrĊeno je da postoji alternativno iskrajanje. Pri tom je identifikovan alternativni 5' netranslatujući egzon u plućima, testisu, gastrointestinalnom traktu (Itoyama i sar., 2005). 1.4.2.3. Tkivna distribucija ACE2 Za razliku od ACE koji je široko eksprimiran u tkivima ĉoveka, ekspesija ACE2 je tkivno specifiĉna i imunohistohemijski potvrĊena u endotelnim ćelijama koronarnih arterija, arteriola i venula miokarda srca (Tipnis i sar., 2000). Pokazano je da je ACE2 eksprimiran u epitelijumu tubula bubrega, u GMĆ bubreţnih arterija (Donoghue i sar., 2000). U tkivu bubrega epitelijuma tubula (polarizovanih ćelija) utvrĊena je lokalizacija ACE2 u apikalnim membranama za razliku od ACE koji je distribuiran u bazolateralnim membranama (Warner i sar., 2005). Studija koja je ispitivala ekspresiju ACE2 u tkivima ĉoveka potvrdila je ekspresiju ACE2 u 72 tkiva sa najvišim nivoom ekspresije u srcu, bubrezima, testisima potom svim delovima gastrointestinalnog trakta naroĉito u ileumu. U centralnom nervnom sistemu i limfnim tkivima utvrĊen je relativno nizak nivo ekspresije ACE2 (Harmer i sar., 2002). Uvod 23 1.4.2.4. Model sistemi za ispitivanje funkcije ACE2 u kardiovaskularnim bolestima i aterosklerozi Prvo istraţivanje funkcije miolekula ACE2 molekula bilo je vršeno na transgenim miševima kojih je gen inaktiviran, transgeni miševi sa izbaĉenim genom (ACE2 -/- ) (Crackower i sar., 2002). Ovi miševi bez obzira na pol, imali su poremećenu funkciju srca, smanjenu kontraktilnost i povišen nivo Ang II. Kontraktilna disfunkija i dilatacija srca ovih miševa, odsustvo fibroze i hipertrofije, liĉilo je na srĉanu slabost kod ĉoveka. U srcu ovih miševa detektovana je povećana ekspresija inducibilnih markera hipoksije, BNIP3 i PAI-1 (Crackower i sar., 2002), pa se smatra da ACE2 ima ulogu u snabdevanju kiseonikom u vaskularnim endotelnim i GMĆ srca. U transgenim modelima hipertenzije kod pacova sklonih šlogu (eng. spontaneously hypertensive stroke-prone rats, SHRSP) koji eksprimiraju humani ACE2 u GMĆ (Rentzsch i sar., 2008) primećena je bolja funkcija endotelijuma i smanjena vazokonstrikcija u odgovoru na Ang II. Potencijalni mehanizam koji objašnjava ovu funkciju je smanjeni oksidativni stres i/ili povećanje nivoa Ang (1-7). U aterosklerozi ACE2 je štitio endotelne ćelije od Ang II posredovane infiltracije monocita i oksidativnog stresa tako što uklanjao Ang II, a generisao Ang (1-7) (Lovren i sar., 2008; Guo i sar., 2008). Kod transgenih miševa sa izbaĉenim genom za ApoE tretman Ang (1-7) imao je ateroprotektivne efekte (Tesanovic i sar., 2010). Deficijencija gena ACE2 kod transgenih miševa za ApoE je potpomogla formiranje aterosklerotskih plakova, što se manifestuje pojaĉanom ekspresijom medijatora aterogeneze, citokina i adhezionih molekula i adhezivnošću leukocita za endotelijum (Thomas i sar., 2010). U eksperimentima na zeĉevima u kojima je adenovurisom indukovana ekspresija gena ACE2 (rekombinantni ACE2) registrovana je pojava stabilnih aterosklerotskih plakova (Dong i sar., 2008). S druge strane u stabilnim karotidnim aterosklerotskim plakovima ĉoveka zabeleţena je smanjena ekspresija ACE2 u poreĊenju sa lezijama sklonih rupturi (Sluimer i sar., 2008). Transfekcija ACE2 u kulturi endotelnih ćelija (eng. human umbilical vein endothelial cell, HUVEC) i GMĆ ćelija ĉoveka, umanjuje TNF-α indukovanu adheziju monocita i migraciju i proliferaciju GMĆ, respektivno (Lovren i sar., 2008; Zhang i sar., 2010). Uvod 24 1.4.3. Kolektrin, tkivna distribucija i funkcija Kolektrin predstavlja još jedan novootkriveni molekul iz familije ACE kod ĉoveka. MeĊutim za razliku od ACE i ACE2 u kolektrinu odsustvuju katalitiĉki domeni, što ukazuje na to da nema enzimsku funkciju. Poseduje homologiju sa C- domenom ACE2, tako da se moţe nazvati homologom ACE2 (slika 1.9.) (Lambert i sar., 2008). Otkriven je 2001. godine i oznaĉen imenom (TMEM27) u tkivu bubrega (u citoplazmi i apikalnoj membrani endotelnih ćelija sabirnih kanalića i proksimalnih tubula) kod parcijalno nefrektomisanih pacova (Zhang i sar., 2001). Kolektrin je transmembranski glikoprotein koji ima kratak ekstraćelijski domen koji dimerizuje, glikoziluje i podleţe katalitiĉkoj obradi (Akpinar i sar., 2005). Kasnije je okarakterisan u nekoliko drugih tkiva i u srcu (Danilczyk i sar., 2006; Fukui i sar., 2005; Akpinar i sar., 2005). Studije ţivotinjskih modela kod kojih je izbaĉen gen za kolektrin su pokazale da miševi imaju poremećaj u transportu AK (Danilczyk i sar., 2006; Malakauskas i sar., 2007; Verrey i sar., 2009). Poremećen transport AK ima uticaja na promenu u metabolizmu AK, a svaka takva promena je kritiĉna za homeostazu kod sisara, u kojoj AK sluţe i kao signalni molekuli i kao supstrati za razliĉite metaboliĉke puteve (Marshall S, 2006). Kolektrin ima ulogu u hipertenziji indukovanoj visokim unosom NaCl, mehanizmom nezavisnim od aldosteronske regulacije, preko membranskih proteinskih kompleksa (Yasuhara i sar. 2008). Funkcija kolektrina je drugaĉija od ostalih njemu homologih molekula RAS i ostvaruje se nezavisno od njihovih enzimskih funkcija. Kolektrin se vezuje za snapin protein (eng. synaptosomal associated protein of 25 kDa, SNAP-25) ĉime uspostavlja formiranje solubilnog proteinskog kompleksa (eng. soluble N-ethylmaleiamide– sensitive factor attachment protein receptor, SNARE) (Fukui i sar., 2005; Yasuhara i sar. 2008; Zhang i sar., 2007). Preko ovog proteinskog kompleksa kolektrin posreduje u vezikularnom transportu apikalnih membranskih proteina, AK, transportu Na + i vode u hipertenziji (Yasuhara i sar. 2008). Pretpostavlja se da je njegova uloga u regulaciji homeostaze (Malakauskas i sar., 2009). Uvod 25 1.4.3.1. Molekulska struktura kolektrina Protein kolektrina kod ĉoveka ima 222 AK (slika 1.9.) i molekulsku masu od 25 kDa. Poseduje dva hidrofobna domena: hidrofobni domenna N-kraju proteina (AK 1- 14) koji ĉini signalnu sekvencu i transmembranski domen koji se pruţa od 142. do 164. AK. Potencijalno mesto proteolitiĉke obrade je na poziciji izmeĊu 14 i 15 AK. Ekstraćelijski domen sadrţi 127 AK sa dva mesta glikozilacije (Zhang i Wada, 2007; Zhang i sar., 2007). Sa C-krajem ACE2 deli 47.8 % identiĉnosti (Altschul i sar., 1997). Potencijalna kalmodulinska sekvenca nalazi se na C-kraju pored transmembranske sekvence i sugeriše na njegovo ektodomensko isecanje (Akpinar i sar., 2005). To ukazuje na moguću ulogu kalmodulina u regulaciji ekspresije kolektrina na ćelijskoj površini i njegovog vanćelijskog oslobaĊanja, sliĉno kao kod ACE2, gde interakcija sa kalmodulinom inhibira isecanje njegovog ektodomena (slika 1.9.) (Lambert i sar., 2008). Na osnovu homologije kolektrina i ACE2 moţe se pretpostaviti da kalmodulin reguliše oslobaĊanje ektodomena kolektrina (Lambert i sar., 2008). Slika 1.9. Kolektrin, homolog ACE2 sadrţi vezujuće mesto za kalmodulin. Poravnjanje peptidnih sekvenci ACE2 i kolektrina pokazuje da su ove sekvence konzervisane i predstavljaju potencijalne domene za vezivanje kalmodulina. Zvezdicama su obeleţeni katalitiĉki domeni, crni pravougaonici predstavljaju transmembranske domene, a beli pravougaonici oznaĉeni zvezdicom predstavljaju potencijalne domene za vezivanje kalmodulina (modifikovano Lambert i sar., 2008). Uvod 26 1.4.3.2. Struktura gena za kolektrin Gen koji kodira za kolektrin (TMEM27) nalazi se na Xp22 hromozomu, 26 kb udaljenosti od gena za ACE2. Gen sadrţi 4 egzona. iRNK za kolektrin je duga 1.800 nukleotida i prvo je detektovana u bubregu (Zhang i sar., 2001). In vitro studije su utvrdile da je gen za kolektrin transkripciono regulisan hepatocitnim nuklearnim faktorom-α (HNF1-α) u ćelijama pankreasa (Fukui i sar., 2005). 1.4.4. Angiotenzin II receptor tipa 1 (ATR1) 1.4.4.1. Molekulska struktura ATR1 ATR1 je protein molekulske teţine 41 kDa i sadrţi 359 aminokiselina (Bergsma i sar., 1992). Pripada familiji G protein vezujućih receptora (GPVR), sa 7 transmembranskih domena (TM-I–TM-VII) i aktivira G proteine (guanin nukleotid vezujući proteini). TM domeni su α-heliksima povezani sa tri vanćelijske (EC1, EC2, EC3) i tri unutarćelijske petlje (IC1, IC2, IC3). Svaki vanćelijski domen sadrţi ostatke AK cisteina koji meĊusobno formiraju disulfidne veze ĉime se stabilizuje tercijerna struktura receptora (Ohyama i sar., 1995). Vanćelijski domen na N-kraju proteina ima tri mesta N-glikozilacije i mutacije u ovim mestima nemaju efekta na vezivanje agonista (Jayadev i sar., 1999). Treća intraćelijska petlja receptora (IC3) ima bitnu ulogu u aktivaciji signalnih puteva (Daviet i sar., 2001). Domen na C-kraju sadrţi ostatke AK serina koje predstavlja regulatorno mesto molekula, mesto fosforilacije i regulacije signalnog puta receptora. Pokazano je da ovaj domen ATR1 interaguje sa GPVR intergujućim proteinima (GIPs) koji regulišu receptorsku funkciju (Mogi i sar., 2007). 1.4.4.2. Struktura gena za ATR1 Gen koji kodira za ATR1 u genomu ĉoveka mapiran je na hromozomu u regionu q21-3q25 hromozomu i zastupljen je samo u jednoj kopiji (Curnow i sar., 1992; Guo i sar., 1994). Gen se sastoji od najmanje 4 egzona (5'UTR) i 3 introna i ima duţinu veću od 60 kb. Kompletna kodirajuća sekvenca je u poslednjem egzonu, a egzoni koji mu Uvod 27 prethode se nalaze u 5'-netranslatujućem regionu (Curnow i sar., 1995; Martin i sar., 2001b; Elton i Martin., 2003). 1.4.4.3. Regulacija ekspresije gena za ATR1 preko alternativnog iskrajanja Transkripcioni faktori Sp1 i Sp3 odgovorni su za regulaciju bazalnog nivoa ekspresije ATR1 u in vitro ćelijskim linijama (Zhao i sar., 2000; Zhao i sar., 2001; Martin i sar., 2001a; Duffy i sar., 2004). Za ATR1 je identifikovano 4 transkripta koji potiĉu od istog gena (Su i sar., 1994; 1996). Transkripcione varijante iRNK za ATR1 nastaju kombinovanjem prva tri egzona sa ĉetvrtim. Izoforma oznaĉena kao “dugi” ATR1 duţa je za 32 AK na N-kraju proteina, moţe biti sintetisana sa transkripcione varijante C i D, a “kratki” ATR1 je receptorska izoforma koja je kodirana od strane varijante A i B (Elton i Martin, 2003). Egzon 1 u transkripcionim varijantama ATR1 je bogat GC-parovima (74.8 %) i obrazuje stabilnu sekundarnu strukturu (eng. stem loop structure). Smatra se da u in vitro uslovima inhibira translaciju ATR1 dok u in vivo aktivira sintezu proteina (Curnow i sar., 1995). UtvrĊeno je da 5'UTR transkripcionih varijanti sa egzonom 1 za ATR1, sadrţi sekvence IRES (inicijacija translacije unutrašnjim ulazom ribozoma) 40 bp proksimalno od prvog egzona (Curnow i sar., 1995; Martin i sar., 2003). Smatra se da su IRES sekvence bitne za odrţavanje sinteze krucijalnih proteina (u hipoksiji, apoptozi, gladovanju, infekciji virusima) (Hellen i Sarnow, 2001), kao što je ATR1 koji je ukljuĉen u procese rasta i proliferacije ćelija. Curnow i saradnici su pokazali da egzon 2 inhibira prepisivanje iRNK za ATR1 u protein (Curnow i sar., 1995). Studija na uzorcima srca sa srĉanom slabošću je pokazala da je ekspresija transkripcione varijante A (bez 2. egzona) povećana, a transkripcione varijante B i D smanjena (Warnecke i sar., 1999a). Transkripcione varijante C i D koje sadrţe egzon 3 imaju start kodon AUG koji je u okviru nizvodnog ORF u egzonu 4 (Curnow i sar., 1995; Martin i sar., 2001b). In vitro translacijom je pokazano da se duţa izoforma receptora sintetiše sa iRNK koja sadrţi 3. egzon i potvrĊena je i in vivo (Martin i sar., 2001b). Transkripciona varijanta C je dicistronska što znaĉi da kodira i za kraću i za duţu izoformu receptora. Jedno od mogućih objašnjenja ove dicistronske sinteze koja je atipiĉna kod eukariota moţe biti Uvod 28 kolinearna regulacija ekspresije gena i sinteza proteina koji interaguju jedan sa drugim. Za ATR1 je naĊeno da obrazuje homodimere i heterodimere (AbdAlla i sar., 2000; AbdAlla i sar., 2001a; AbdAlla i sar., 2001b). Formiranje heterodimera receptora moţe biti funkcionalno razliĉit od receptora monomera. Pokazano je da duţa izoforma receptora ima 3 puta manji afinitet vezivanja za Ang II u poreĊenju sa kraćom izoformom (Martin i sar., 2001b). Ovi rezultati su sugerisali da u zavisnosti od koncentracije Ang II zavisi procentualna zastupljenost i aktivacija izoformi, a samim tim i odgovor na Ang II moţe da varira (Elton i Martin, 2003; Elton i Martin, 2007). 1.4.4.4. Regulacija ekspresije ATR1 različitim faktorima Nivo ekspresije receptora regulisana je agonistom Ang II. U kulturi GMĆ ćelija pacova Ang II smanjuje ekspresioni nivo receptora (Lassegue i sar., 1995), dok hroniĉna infuzija Ang II povećava nivo iRNK i samog receptora na tkivno specifiĉan naĉin (Harrison-Bernard i sar., 1999). U hipertenziji ekspresija iRNK i proteina u vaskularnim GMĆ je pozitivno regulisana Ang II i u modelu pacova (Wang i Du, 1998). Kod ĉoveka senzitivnost krvnih sudova na nivo Ang II modulisana je aktivnošću RAS sistema (Gunther i sar., 1980). Pored Ang II je pokazano da i drugi agonisti u GMĆ modulišu ekspresiju ATR1 (Tabela 1.1.). Modulacija ekspresije ATR1 putem ovih homologih i heterologih puteva doprinosi u jednu ruku adaptaciji RAS sistema na hroniĉnu stimulaciju agonistima i sluţi kao objašnjenje za uloge RAS sistema i ATR1 u aterosklerozi i hipertenziji (Griendling i sar., 1993; Lassegue i sar., 1995). U kulturama GMĆ ćelija ĉoveka je pokazano da ciklosporin i CRP povećavaju ekspresioni nivo ATR1 (Avdonin i sar., 1999; Wang i sar., 2003). U kulturi endotelnih ćelija ĉoveka pokazano je da povišena sila trenja protoka krvi (eng. shear stress, SS) smanjuje ekspresiju receptora i broj vezujućih mesta za Ang II (Ramkhelawon i sar., 2009). Uvod 29 Tabela 1.1. Regulacija ATR1 u kardiovaskularnom sistemu (preuzeto i modifikovano Mehta i Griendling, 2007) Tip ćelija Agonisti koji povećavaju ekspresiju receptora Antagonisti koji smanjuju ekspresiju receptora GMĆ Insulin (Nickenig i Bohm, 1998*) Ang II (Gunther i sar, 1980; Lassegue i sar; 1995; Harrison- Bernard sar., 1999*) LDL (Nickenig i sar., 1997*) Estrogen (Nickenig i sar, 1998a, 2000*) Progesteron (Nickenig i sar, 2000*) Vitamin A (Takeda i sar., 2000*) Eritropoetin (Barrett i sar., 1998*) HMG CoA reduktaza inhibitori (statini) (Ishiki i sar., 2001*) Ciklosporin (Avdonin i sar., 1999) Faktori rasta (Ullian i sar.,1997; Nickenig i sar., 1994*) Faktori rasta (Guo i Inigami., 1994*) Tireoidni hormon (Fukuyama i sar., 2003*) CRP (Wang i sar., 2003) NO (Ichiki i sar, 1998*) IL-6 (Wassmann i sar., 2004b) Forskolin (Wang i sar., 1997) IGF-1 (Muller i sar., 2000*) Citokini (IL1-α, TNF-α, IFN-γ) (Sasamura i sar., 1997; Ikeda i sar., 1999*) NaCl (Wang i Du, 1998; Nickenig i sar., 1998b*) EĆ OxLDL (Li i sar., 2000) (*studije kod pacova) HMG-3-hidroxi-3-methil-glutaril;LDL-lipoproteini niske gustine;IL1-α-interleukin 1α, IFN-γ-interferon γ,CRP-C reaktivni protein, IGF-1-insulinu sliĉan faktor rasta-1, NaCl-natrijum-hlorid U tabeli 1.1 prikazana je regulacije ekspresije ATR1 razliĉitim faktorima u GMĆ i EĆ (preuzeto i modifikovano iz Mehta i Griendling, 2007) Uvod 30 1.4.4.5. Postranskripciona regulacija iRNK za ATR1 1.4.4.5.1 Regulacija ekspresije gena za ATR1 preko vezivanja regulatornih proteina U kulturi GMĆ stimulacija Ang II skraćuje poluţivot iRNK sa 6 h na 2 h (Nickenig i sar., 2001). Stimulacija Ang II znaĉajno povećava vezivanje proteina kalretikulina za 3' UTR iRNK. Sekvenca od 2175 bp do 2195 bp sadrţi heksamer AUUUA i odgovorna je za inducibilnu degradaciju iRNK. Stimualcija Ang II dovodi do fosforilacije kalretikulina (na AK serin/treonin) i vezivanja za taj region što indukuje povećanu razgradnju iRNK (Nickenig i sar., 2002; Mueller i sar., 2008). Pored kalretikulina identifikovano je da AUF-1 protein, koji se vezuje za distalnu sekvencu od 231 nukleotida iRNK za ATR1, destabilizuje iRNK i moduliše ekspresiju receptora (Pende i sar., 1999). Pored AUF-1 za 3'-netranslatirajućem regionu gena (3'UTR) vezuju se RNK vezujući proteini, humani antigen R (HuR) i heterogeni nuklearni ribonukleoprotein A1 (hnRNPA1) (Pende i sar., 2008). Multifunkcionalni protein p100 vezivanjem za 3' UTR region gena preko SN-nalik domena (stafilokoke nalik domena) skraćuje poluţivot iRNK za ATR1 i pozitivno reguliše ekspresiju receptora (Paukku i sar., 2008). UtvrĊeno je da postoji direktna interakcija 3' UTR regiona gena za ATR1 i gliceraldehid trifosfat dehidrogenaze (GAPDH), pri ĉemu ovaj protein interaguje sa endogenim iRNK za ATR1 (Backlund i sar., 2009). Kompjuterska analiza GAPDH vezujućih mesta za 3'UTR gena je pokazala da su ova mesta bogata AU ponovcima (Backlund i sar., 2009). Mapirano je vezujuće mesto za GAPDH (1-100 bp) 3'UTR regiona gena za ATR1. Ekspresija gena za ATR1 je pod kontrolom vezivanja GAPDH molekula. U in vitro esejima pokazano je da GAPDH dozno zavisno inhibira translaciju ATR1. Delecija GAPDH vezujućeg mesta za ATR1 povećava luciferaznu aktivnost (reporter gen eseja) (Backlund i sar., 2009). U uslovima oksidativnog stresa kada su koronarne GMĆ u kulturi tretirane sa H2O2 spreĉeno je vezivanje GAPDH za iRNK za ATR1 pa je povećana ekspresija receptora (Nakajima i sar., 2007). Pored uloge u odgovoru na oksidativni stres, GAPDH reguliše bazalnu ekspresiju ATR1. U tkivima ĉoveka postoji razlika u ekspresiji molekula GAPDH. Shodno tome postoji tkivno specifiĉna GAPDH indukovana ekspresija gena ATR1 (Barber i sar., 2005). Uvod 31 1.4.4.5.2 Regulacija ekspresije gena za ATR1 malim nekodirajućim mikroRNK Funkcionalna studije in vitro u kulturi endotelnih i GMĆ ĉoveka pokazala je da mikroRNK, miR-155 utišava ekspresiju ATR1 (Martin i sar., 2006). Pored toga in vivo je in situ hibridizacijom pokazana ekspresija ove mikroRNK na nivou GMĆ i endotelnih ćelija kod ĉoveka (Martin i sar., 2006). Transfekcija endotelnih ćelija ĉoveka sa miR-155 stimulisanih Ang II je smanjila ekspresiju ATR1 (Zhu i sar., 2011). U ćelijama adventicijalnih fibroblasta pacova (AFs) transfekcija sa miR-155 smanjila je endogenu ekspresiju ATR1 na proteinskom nivou (Zheng i sar., 2010). Pored mir-155 funkcionalne studije su pokazale da još neke mikroRNK regulišu ekspresiju ATR1. To je miR-802 za koju je pokazano da moţe da moduliše ekspresiju ATR1 ĉoveka u epitelijalnim intestinalnim ćelijama (Sansom i sar., 2010). Funkcionalne studije za miR-132 pokazale su ova mikroRNK prepoznaje sekvence u kodirajućem regionu gena za ATR1 i reguliše ekspresiju receptora (Elton i sar., 2008). In situ hibridizacijom u GMĆ ćelijama je pokazano da je miR-132 eksprimirana u GMĆ in vivo (Elton i sar., 2008). 1.4.4.6. Značaj genetičkih varijanti u regulatornom 3' UTR u procesima regulacije ekspresije gena za ATR1 Gen za ATR1 kod ĉoveka je vrlo polimorfan i do sada je u ovom genu opisano više od 50 taĉkastih polimorfizama (eng. single nucleotide polymorphism, SNPs) (Baudin B, 2005). U 3'-netranslatirajućem regionu gena na poziciji +1166 od start kodona dolazi do transverzije azotne baze adenina u citozin (dsSNP rs5186) (Bonnardeaux i sar., 1994). UtvrĊeno je da bazna zamena na poziciji +1255 u 3'UTR rezultuje 3 puta manjom ekspresijom iRNK, dok bazna zamena na poziciji +1166 (A→C) dovodi do 2.5 puta veće ekspresije iRNK (Lehtonen i sar., 2007). Funkcionalna karakterizacija pojedinih delova 3'UTR regiona gena je pokazala da se u 3'UTR regionu nalaze sekvence odgovorne za stabilnost iRNK. Polimorfizmi u vezujućim mestima za mikroRNK (miRSNPs) mogu da utiĉu na vezivanje mikroRNK i tako regulišu ekspresiju ciljnih gena i poslediĉno da na taj naĉin utiĉu na nastanak i progresiju bolesti (Abelson i sar., 2005; Mishra i sar., 2007; Adams i sar., 2007). Kompjuterski algoritmi Uvod 32 koji predviĊaju mesta u 3'UTR regionu gena koja potencijalno interaguju sa mikroRNK i eksperimentalna potvrda ovih interakcija su objedinjeni u bazi podataka (TaRBase 4.0) (Sethupathy i sar., 2006a; Sethupathy i sar., 2006b; Kuhn i sar., 2008a). Tako je predviĊeno da u 3'UTR regiona gena za ATR1 postoji 58 vezujućih mesta za mikroRNK (Sansom i sar., 2010). MeĊutim, jedna novija studija je po prvi put pokazala da i kodirajuće sekvence gena za ATR1 interaguju sa mikroRNK i da mogu da suprimiraju translaciju proteina (Elton i sar., 2008). 1.4.4.6.1 MikroRNK (miR-155) i postranskripciona regulacija ekspresije ATR1 sa miR-155 u kardiovaskularnim bolestima Gen koji kodira za miR-155 kod ĉoveka je inicijalno identifikovan u B ćelijskim limfomima (Tam W, 2001; Lagos-Quintana i sar., 2002). Gen je mapiran na hromozomu 21 (Tam W, 2001). Sastoji se od 3 egzona i ima duţinu od 13 kb. Povećana ekspresija miR-155 je zabeleţena u razliĉitim vrstama malignih tumora, viralnim infekcijama i kardiovaskularnim bolestima (Faraoni i sar., 2009). Povišen nivo miR- 155, uz smanjeni nivo ATR1 zabeleţen je u tkivima srca i mozgu fetusa sa Daunovim sindromom (trizomija 21. hromozoma, Ts21) (Kuhn i sar., 2008b; Kuhn i sar., 2010; Sethupathy i sar., 2007). Ekspresija proteina ATR1 (detektovana u mononuklearima) je u pozitivnoj korelaciji sa nivoom krvnog pritiska, a negativno sa ekspresijom miR-155 u grupi bolesnika sa esencijalnom hipertenzijom u ćelijama mononukleara (eng. PMNs) (Ceolotto i sar., 2011). MiR-155 je razliĉito eksprimirana u pojedinim tkivima ĉoveka što sugeriše da ova mikroRNK specifiĉno reguliše ekspresiju ATR1 na tkivno specifiĉan naĉin (Martin i sar., 2006). Uvod 33 1.4.4.7. Polimorfizam A166C u genu za ATR1 i regulacija ekspresije gena za ATR1 u funkcionalnim studijama i kardiovaskularnim bolestima U regionu 3'UTR gena za ATR1 detektovano je mesto za koje se vezuje miR- 155 (Saunders i sar., 2007; Sethupathy i sar., 2007). Na tom mestu nalazi se polimorfizam A1166C (slika 1.10.). Slika 1.10. Model molekularnog mehanizma asocijacije alela C polimorfizma A1166C sa hipertenzijom osoba sa Dunovim sinromom Alel C polimorfizma A1166C u 3'UTR regionu gena za ATR1 ukida vezivanje miR-155 što indukuje povišen nivo ATR1 proteina. (modifikovano Sethupathy i sar., 2007). Prisustvo alela A zadovoljava pravilo potpune komplementarnosti sa 5' krajem miR-155 (eng. seed sequences rule) u duţini od 7 bp. Suprotno tome, prisustvo alela C u genu prekida pravilan niz komplementarnih baza tako da se termodinamika formiranja dupleksa izmeĊu miR-155 i iRNK znaĉajno menja (Martin i sar., 2006). Funkcionalne studije su pokazale da transfekcija primarnih ćelija fibroblasta pluća ĉoveka sa miR-155 (eng. gain of function mutation) smanjuje endogenu ekspresiju ATR1 u poreĊenju sa netransfekovanim ćelijama (Martin i sar., 2006; Faraoni i sar., 2009). Kada su primarne GMĆ transfekovane sa inhibitorom miR-155 endogena ekspresija ATR1 i Ang II aktivacija ERK1/2 (ekstracelularnim signalom regulisane kinaze) je bila znaĉajno Uvod 34 povećana, što sugeriše da miR-155 ima fiziološku ulogu u regulaciji ekpresije ATR1 u ovim ćelijama (Martin i sar., 2006). U in vitro studiji raĊenoj na (embrionalnim ćelijama bubrega ĉoveka) gde su generisani konstrukti u koje su insertovani razliĉiti regioni 3'UTR gena za ATR1 najniţa luciferazna aktivnost je zabeleţena kod alela A u odnosu na alel C i diletirani fragment 3'UTR gena (Sethupathy i sar., 2007). Prisustvo alela C moţe imati efekte na ekspresiju receptora jer narušava pravilo potpune komplementarnosti izmeĊu miR-155 i 3'UTR tako da je tada nivo ekspresije receptora uvek bio veći nego kada je pravilo potpune komplementarnosti bilo ispoštovano (Martin i sar., 2006). Ekspresija miR-155 bila znaĉajno manja kod genotipa CC (Ceolotto i sar., 2011). Ovi rezultati pokazali su da miR-155 moţe smanjiti ekspresiju receptora inhibicijom translacije iRNK (Elton i sar., 2010). Povećanje ekspresije receptora ATR1 moţe biti udruţeno sa nastankom ili progresijom KVB (Elton i sar., 2010). 1.4.4.8. . Studije asocijacije genetičke varijante A1666C gena za ATR1 u kardiovaskularnim bolestima Brojne su studije koje su ispitivale asocijaciju polimorfizma A11666C u genu za ATR1 sa koronarnomj ili karotidnom aterosklerozom. Ove studije, meĊutim, nisu konzistentne, a rezultati koji divergiraju bi se mogli pripisati razlikama u dobi, polu, pripadnosti pojedinim populacijama ili etniĉkim grupacijama, ili razliĉitim negenomskim i drugim spoljašnjim ĉiniocima koji menjaju fiziološki efekat polimorfizma. Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 je asociran sa HT (Bonnardeaux i sar., 1994; Wang i sar.,1997; Kainulainen i sar., 1999; Wang i Staessen, 2000; Jiang i sar., 2001; Hindorff i sar., 2002; Ono i sar., 2003; Kobashi i sar., 2004; Palatini i sar., 2009). U našoj populaciji genotip CC bio je asociran sa hipertenzijom samo kod muškaraca (Stanković i sar., 2003). Meta analiza asocijacije polimorfizma A1166C sa hipertenzijom, koja je obuhvatila, 16 474 individua pokazala je da nosioci alela C imaju veći rizik za razvoj hipertenzije (Niu i Qi, 2010). U koronarnoj aterosklerozi ovaj polimorfizam je asociran sa hipertrofijom u srcu (Osterop i sar., 1998; Makeeva i sar., 2004; Smilde i sar., 2007), infarktom miokarda (Tiret i sar., 1998; Amir i sar., 2009) i povećanim oksidativnim stresom u srĉanoj Uvod 35 insuficijenciji (Cameron i sar., 2006). Meta analiza koja je obuhvatila 20 435 bolesnika sa koronarnom aterosklerozom koji su imali IM i 23 674 zdravih individua iz razliĉitih svetskih populacija pokazala je da je polimorfizama A1166C u genu za ATR1 negativno asociran sa nastankom koronarne bolesti (Xu i sar., 2010). Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 je asociran sa smanjenom elastiĉnošću arterija (eng. arterial stiffness) (Benetos i sar.,, 1996; Lajemi i sar., 2001; Díez i sar., 2003; Plat i sar., 2009) i povećanom vaskularnom reaktivnošću na Ang II (Amant i sar., 1997; Van Geel i sar., 2000; Lim i sar., 2007). Studije koje su analizirale polimorfizam A1166C u karotidnoj aterokslerozi ispitivale su asocijaciju sa zadebljanjem intima medije (IMT) (Castellano i sar., 1996; Girerd i sar., 1998; Tabara i sar., 2001; Chapman i sar., 2001), sa stenozom karotida (≥ 70 %) (Sticchi i sar., 2011) i šlogom (Zhang i sar., 2011). Rezultati ovih studija pokazali su da polimorfizam nije asociran sa aterosklerozom karotida. Meta analiza koja je objedinila sve studije asocijacije ovog polimorfizma sa šlogom do 2011. godine u razliĉitim populacijama Kavkazoida i Azijata je pokazala da u populaciji Kavkazoida nosioci reĊeg genotipa CC nemaju povećan rizik za nastanak šloga (Zhang i sar., 2011). Studije asocijacije polimorfizma A1166C u genu za ATR1 sa karotidnom aterosklerozom, komplikacijama u karotidnoj aterosklerozi i šlogom do sada nisu raĊene u populaciji Srbije. 1.4.5. Аngiotenzin II receptor tipa 2 (ATR2) 1.4.5.1. Molekulska struktura ATR2 ATR2 pripada superfamiliji GPVR sa hidrofobnim transmembranskim domenom i ekstracelularnim i intracelularnim domenima (Inagami T, 1999; Lazard i sar., 1994). ATR2 ima 7 transmembranskih domena, molekulsku teţinu od 41 kDa, sastoji se od 363 AK (Guthrie GP Jr., 1995; Unger i sar., 1996). To je glikoprotein koji ima 5 potencijalnih mesta glikozilacije u N-kraju, pri ĉemu je molekulska masa receptora povećana i nalazi se u rasponu od 60 do 113 kDa (Servant i sar., 1994). Zbog mogućih postranslacionih modifikacija za ATR2 je pokazano da neke ćelijske kulture eksprimiraju protein koji ima molekulsku masu 80 kDa koja se smanjuje na 40 kDa posle tretmana N-glikozidazom (Kambayashi i sar., 1993). Druga intraćelijska petlja Uvod 36 receptora sadrţi potencijalno mesto fosforilacije protein kinazom C (PKC), a na karboksilnom kraju tri konsenzus mesta fosforilacije PKC kinazom i jedno za fosforilaciju cAMP -zavisnom kinazom (Griendling i sar., 1996). U odnosu na receptor ATR1 razlikuje se po distribuciji, jer je tkivno specifiĉan, a vezivanjem liganda aktivira drugaĉije signalne puteve (De Gasparo i sar., 2000). Sa ATR1 deli 34 % sliĉnosti u strukturi aminokiselinske sekvence i sa sliĉnim afinitetom vezivanja za ligand Ang II (Wang i sar., 1995). Znaĉajna razlika u strukturi izmeĊu ova dva receptora je u trećoj intracelularnoj petlji i strukturi C-terminalnog repa (Wang i sar., 1995). U vezivanju za ligand uĉestvuje treća ekstracelularna petlja i transmembranski domeni (Volpe i sar., 2003). 1.4.5.2. Struktura gena za ATR2 Gen za ATR2 je mapiran na Xq22 hromozomu ĉoveka, dug je oko 5 kb i sadrţi dva kratka 5' nekodirajuća egzona, 152 bp dugi intron 1, 1208 bp dugi intron 2 i egzona 3 u kojem se nalazi kompletna kodirajuća sekvenca (Martin i Elton, 1995). Promotorski region gena za ATR2 je dug 1.5 kb i ima 90 % identiĉnosti nukleotidne sekvence sa promotorom gena kod miša (Ichiki i Inagami, 1995), pa se zbog te analogije mnoga regulatorna mesta opisana kod miševa i pacova, mogu primeniti kod ĉoveka. U cilju ispitivanja da li gen za ATR2 ĉoveka sadrţi potencijalnio cis regulatorne elemente koji regulišu transkripciju, generisani su konstrukti promotora (-271/+100) i promotora sa razliĉitom duţinom nizvodnih sekvenci gena: sa intronom 1, egzonom 2, intronom 2 i egzonom 3 do mesta translacionog starta (-271/+1593). Plazmid koji sadrţi promotor i kompletan region koji se transkribuje sa egzona 3 je imao veću luciferaznu aktivnost u odnosu na kontrolni plazmid promotora što je ukazalo da ukljuĉivanje introna 2 sugeriše na prisustvo pozitivnih cis regulatorinih elemenata (Warnecke i sar., 1999b). Uvod 37 1.4.5.3. Regulacija ekspresije ATR2 različitim faktorima Ekspresija ATR2 zavisi od stimulusa (faktora rasta) i statusa (aktivan rast ili konfluentan sloj) u kojem se ćelije nalaze (Dudley i sar., 1991; Dudley i Summerfelt, 1993). Dodavanje seruma ili faktora rasta u medijum ćelija u konfluentnom stanju rapidno smanjuje ekspresiju receptora (Dudley i Summerfelt, 1993). Brojni faktori modulišu ekspresiju ATR2 (Ichiki i sar., 1995). U promotoru gena za ATR2 se nalaze mnogobrojne cis sekvence, vezujuća mesta za ove faktore, CCAAT vezujuće mesto za interleukin-1β (IL-1β), insulin odgovorno mesto, forbil estar, AP-1, AP-2 vezujuća mesta, C/EBP, NF-1, NF-L6, NF-κB i vezujuća mesta za c-AMP (CRE-vezujuća mesta) (Martin i Elton, 1995). 1.4.5.4. Alternativne transkripcione varijante iRNK za ATR2 čoveka i njihova tkivna distribucija Alternativnim iskrajanjem gena za ATR2 dobijaju se dve transkripcione varijante: duţa koja sadrţi sve egzone (1/2/3) i kraća koja sadrţi egzon 1 i 3 (1/3). Tkivna distribucija alternativnih transkripcionih varijanti u tkivima ĉoveka do sada je opisana u tkivu srca sa infarktom miokarda i kardiomiopatijom (Wharton i sar., 1998; Warnecke i sar., 1999a), zatim u tkivu miometrijuma, miomu uterusa (Matsumoto i sar., 1996) i kongenitalnim anomalijama urinarnog trakta (eng. congenital anomalies of the kidney and urinary tract, CAKUT) (Stanković i sar., 2010). Transkripciona varijanta sa egzonima 1/2/3 je bila ĉešće zastupljena od transkripcione varijante sa egzonima 1/3 (Wharton i sar., 1998; Warnecke i sar., 1999a; Warnecke i sar., 2005; Stanković i sar., 2010). Uvod 38 1.4.5.5. Regulacija ekspresije gena za ATR2 preko alternativnog iskrajanja U eksperimentima funkcionalne karakterizacije transkripcionih varijanti ATR2, pokazano je da konstrukti sa sva tri egzona (1/2/3) imaju statistiĉki znaĉajno niţu luciferaznu aktivnost u odnosu na konstrukte sa egzonima 1 i 3 (Warnecke i sar., 1999a). Ovaj podatak se uzima u razmatranje kada se analizira ekspresija ATR2 u razliĉitim patološkim stanjima, u razliĉitim tkivima, kao mehanizam kojim se moduluše ekspresija receptora (Warnecke i sar., 2005). Sliĉno kao i u genu za ATR1 u egzonu 2 je identifikovan start triplet u minicistronu od 42 bp koji se proteţe i u 3. egzonu (Warnecke i sar., 1999a). Translacija sa ovog minicistrona rezultovala je peptidom od 14 AK koji bi mogao biti jedan od razloga inhibitornog efekta 2. egzona na ekspresiju transkripcionih varijanti ATR2 u reporter esejima (Warnecke i sar., 1999a). 1.4.5.6. Polimorfizam A/G -1332 (rs1403543) u genu za ATR2 i regulacija ekspresije Analizom sekvence gena za ATR2 ĉoveka, u regionu gena -1590 i -1139 bp uzvodno od mesta inicijacionog starta translacije, detektovan je polimorfizam odnosno tranzicija azotnih baza A → G (A/G) na poziciji -1332 u intronu 1, ako se start kodon translacije raĉuna poĉev od egzona 3 u kom se nalazi kompletan kodirajući region gena (Nishimura i sar., 1999). Sledeće godine isti polimorfizam opisan je ponovo samo sa drugom oznakom +1675 G/A, lociran na poziciji 29 bp pre poĉetka egzona 2 ukoliko se azotne baze broje od poĉetka egzona 1 (Erdmann i sar., 2000). Pretpostavka da polimorfizam reguliše razliĉito alternativno iskrajanje iRNK, a samim tim ekspresiju gena je ukazala na potencijalnu funkcionalnost polimorfizma (Nishimura i sar., 1999). Na osnovu povećane luciferazne aktivnosti u konstruktima sa alelom G koja je bila statistiĉki znaĉajno viša u odnosu na one sa alelom A u ćelijskim linijama izvedena je pretpostavka da bi nosioci alela G mogli imati viši nivo ekspresije proteina (Warnecke i sar., 2005). Jedna od pretpostavki je i efikasnije procesovanje iRNK kod nosilaca alela G (Balmforth AJ, 2010). Uvod 39 1.4.5.7. Regulacija alternativnog iskrajanja preko polimorfizma A/G u intronu gena za ATR2 Analiza sekvence gena je pokazala da se polimorfizam nalazi u okviru 7 nukleotida duge konsenzusne sekvence, locirane na mestu formiranja taĉke isecanja (eng. lariat branch point, BPS) u 1. intronu gena (Green MR, 1986; Nishimura i sar., 1999). U ćelijskim linijama, in vitro polimorfizam je imao efekte na alternativno iskrajanje iRNK za ATR2 i nivo ekspresije iRNK za ATR2 (Nishimura i sar., 1999), dok in vivo u nekim tkivima nije imao efekte ni na iskrajanje ni na ekspresiju gena (Warnecke i sar., 2005; Stanković i sar., 2010). 1.4.5.8. Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 i asocijacija sa kardiovaskularnim bolestima Kontradiktorni rezultati su dobijeni u vezi asocijacije razliĉitih alelnih oblika polimorfizma u patofiziološkim stanjima. Alel G je kod hipertenzivnih bio asociran sa hipertrofijom leve komore kod muškaraca (Alfakih i sar., 2004), sa pojavom HT kod prerane koronarne bolesti i HT (Alfakih i sar., 2005), sa remodelovanjem srca uz unos natrijumovih soli kod muškaraca sa familijarnom istorijom koronarne bolesti (Kuznetsova i sar., 2004) i sa infarktom miokarda i koronarnom aterosklerozom (Alfakih i sar., 2007). U drugim studijama alel A je kod hipertenzivnih muškaraca bio asociran sa remodelovanjem leve komore (Schmieder i sar., 2001; Ott i sar, 2007; Orlowska-Baranowska i sar., 2007), sa remodelovanjem srca kod starijih muškaraca (Herrmann i sar., 2002), sa HT i rizikom za rani nastanak bolesti srca (Jones i sar., 2003) i sa rizikom za koronarnu aterosklerozu i progresiju ateroskleroze (Tousoulis i sar., 2010). U nekim studijama kod osoba sa esencijalnom hipertenzijom i bolešću srca polimorfizam nije imao efekte na geometrijske parametre remodelovanja leve komore (Huber i sar., 2010). Studije asocijacije polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 sa karotidnom aterosklerozom, komplikacijama u karotidnoj aterosklerozi i šlogom do sada nisu uraĊene u populaciji Srbije. Ciljevi istraţivanja 40 2. HIPOTEZA I CILJEVI ISTRAŢIVANJA Studija obuhvata genetiĉko-epidemiološku analizu polimorfizama u genima RAS (ACE, ATR1, ATR2) i analizu ekspresije gena RAS (ACE, ACE2, ATR1, ATR2, TMEM27) i mikroRNK (miR-155), koja reguliše ekspresiju ATR1, u patogenezi karotidne ateroskleroze, u okviru ciljne grupe ispitanika iz Srbije. Studija se bazira na sledećoj hipotezi: geni RAS kod ĉoveka su ukljuĉeni u procese nastanka i progresije ateroskleroze i predstavljaju potencijalne pokazatelje nastanka i/ili komplikacije ateroskleroze (tip aterosklerotskog plaka i pojava i vrsta kliniĉkih simptoma bolesti). Hipoteza će biti proverena na tri naĉina: 1) analizom asocijacije polimorfizama u genima za RAS sa nastankom i komplikacijama karotidne ateroskleroze i 2) analizom asocijacije nivoa ekspresije gena RAS (na nivou iRNK i proteina) u tkivu aterosklerotskog plaka ĉoveka sa nastankom i kliniĉkim parametrima bolesti i 3) analizom asocijacije polimorfizama (I/D u genu za ACE, A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2) sa nivoom ekspresije gena i proteina RAS i polimorfizma A1166C u genu za ATR1 sa nivoom ekspresije regulatorne mikroRNK (miR-155)). Postavljeni su sledeći ciljevi: 1. Utvrditi uĉestalost alelnih formi i genotipova polimorfizama u genima RAS (I/D u genu za ACE, A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2) u grupi pacijenata sa karotidnom aterosklerozom (KA) 2. Utvrditi da li su ispitani polimorfizmi asociarani sa nastankom KA. 3. Utvrditi da li su polimorfizmi u asocijaciji sa kliniĉkim i biohemijskim parametrima karotidne ateroskleroze. 4. Utvrditi, kvantifikovati i analizirati ekspresioni nivo iRNK za ACE, ACE2, ATR1, ATR2, kolektrin (TMEM27) u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka i kontrolnom tkivu arterije, kao i u odnosu na razliĉite tipove aterosklerotskog plaka. 5. Kvantifikovati i analizirati ekspresioni nivo iRNK za ACE i ATR1 u odnosu na genotipove polimorfizama I/D u genu za ACE i A1166C u genu za ATR1. 6. Utvrditi i kvantifikovati ekspresioni nivo mikroRNK (miR-155), koja reguliše ekspresiju ATR1, u odnosu na genotipove polimorfizma A1166C u genu za ATR1 i razliĉite tipove plaka. Ciljevi istraţivanja 41 7. Utvrditi ekspresioni nivo proteina ATR1, ATR2, ACE i ACE2 u tkivu aterosklerotskog plaka i kvantifikovati ih u odnosu na razliĉite tipove aterosklerotskog plaka. 8. Kvantifikovati ekspresioni nivo proteina ATR1 u odnosu genotipove polimorfizma A1166C u genu za ATR1 i ekspresioni nivo proteina ATR2 u odnosu genotipove polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2. Materijal i metode 42 3. MATERIJAL I METODE 3.1. MATERIJAL Genetiĉko-epidemiološka studija analize uĉestalosti ispitivanih polimorfizama DNK u genima RAS sistema kod ĉoveka i njihove asocijacije sa nastankom i progresijom KA ukljuĉila je zdrave individue (kontrolna grupa) i pacijente ukupno (n=512), koji su prema kliniĉkim i laboratorijskim podacima klasifikovani od strane lekara kao pacijenti sa KA. Jedna grupa pacijenata je u periodu.od 2004. do 2005. godine leĉena na Klinici za vaskularnu hirurgiju, Instituta za kardiovaskularne bolesti Dedinje u Beogradu, Srbija (n=117). Druga grupa je u periodu od 2006. do 2007. godine leĉena na Vojnomedicinskoj Akademiji u Beogradu, Srbija (VMA) (n=79). Treća grupa pacijenata leĉena je na Institutu za kardiovaskularne bolesti Kliniĉkog centra Srbije (IKVB KCS) u Beogradu, Srbija (n=316). Od svih pacijenata uzeti su uzorci pune periferne krvi iz koje je izolovana DNK, a od njih 270 i tkivo aterosklerotskog plaka. Svi ispitivani pacijenti su Kavkazoidi, srpskog porekla. Kontrolna grupa za populacionu studiju ispitivanih polimorfizama DNK obuhvatila je zdrave pripadnike srpske populacije (n=285), nasumiĉno izabrane prilikom kontrolnog zdravstvenog pregleda na teritoriji Beograda, starosti od 18 do 80 godina. Od svake osobe ukljuĉene u ovu studiju dobijen je pristanak za uĉešće, uzeti su liĉni i anamnestiĉki podaci obuhvaćeni upitnikom i uzorci pune periferne krvi za izolaciju DNK. Biohemijske analize uraĊene su na medicinskim ustanovama u kojima su pacijenti leĉeni. Genetiĉko-epidemiološka studija analize uĉestalosti ispitivanih polimorfizama DNK u genima RAS sistema i njihove asocijacije sa nastankom i progresijom karotidne ateroskleroze izmeĊu kontrolne grupe i grupe pacijenata sa aterosklerozom karotida je za navedene polimorfizme ukljuĉila: za polimorfizam I/D u genu za ACE (246 genotipizovanih kontrola, za polimorfizam A1166C u genu za ATR1 212 i za polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 207 genotipizovanih kontrola) koje su poreĊene sa 505 pacijenata sa dijagnostikovanom KA. Genetiĉko-epidemiološka analiza uĉestalosti ispitivanih polimorfizama u odnosu na tip aterosklerotskog plaka je ukljuĉila Materijal i metode 43 298 pacijenata sa stabilnim aterosklerotskim plakom (SAP) i 113 pacijenata sa fenotipom nestabilnog aterosklerotskog plaka (NAP). U analizi ekspresionog nivoa iRNK za komponenete RAS, ACE i kolektrin (TMEM27) u tkivu karotidnog plaka obuhvaćeno je 61 pacijent sa dijagnostikovanom karotidnom aterosklerozom. Od toga, broj pacijenata muškog pola bio je 42 (68.85 %), a 19 (31.15 %). Analiza ekspresije iRNK za ATR1 obuhvatila je 23 pacijenta i to 13 pacijenata (56.52 %) i 8 pacijentkinja (34.78 %). Analiza ekspresije iRNK za ACE2, kao i relativnog nivoa odnosa ekspresije iRNK za ACE i ACE2 obuhvatila je 26 pacijenata sa KA, od togabroj pacijenata muškog pola bio je 17 (65.38 %), a ţena 9 (34.62 %). Za analizu ekspresije mikroRNK (miR-155) u tkivu karotidnog plaka obuhvaćeno je 27 pacijenata sa dijagnostikovanom karotidnom aterosklerozom. Od toga, broj pacijenata muškog pola bio je 14 (51.85 %) , a ţena 13 (48.15 %). Po tipu oboljenja podeljeni su na dve podgrupe: pacijenti sa fenotipom stabilnog aterosklerotskog plaka (SAP) i komplikovanim (nestabilnim) plakom (NAP). Uzorci tkiva aterosklerotskog plaka korišćeni u ovoj studiji dobijeni su tokom operacija karotidne endarterektomije u toku 2008. godine izvedenih na IKVB. Kao kontrola korišćena je komercijalna cDNK zdravog tkiva arterije bez znakova ateroskleroze, osobe muškog pola stare 68 godina, proizvedene od strane firme (BioChain, CA, SAD). Analiza ekpresije proteinskog nivoa komponenti RAS u lizatima tkiva aterosklerotskih plakova obuhvatila je 8 uzoraka sa KA. ACE2, ATR1 i ATR2 detekovani su i analizirani u odnosu na beta aktin. ACE je u ukupnom lizatu tkiva ateroslerotskog plaka detektovan, ali nije normalizovan u odnosu na beta aktin te stoga nije uzet u analizu. Genetiĉko-epidemiološka analiza polimorfizama DNK, kao i ekspresiona analiza RNK uraĊeni su u Laboratoriji za Radiobiologiju i Molekularnu Genetiku, Instituta "Vinĉa", Beograd, Srbija. Detekcija proteina RAS sistema (ACE2, ATR1, ATR2) u proteinskim lizatima aterosklerotskih plakova uraĊena je u Laboratoriji za Molekularnu biologiju i Endokrinologiju, Instituta "Vinĉa", Beograd, Srbija. Materijal i metode 44 3.2. METODE 3.2.1. Ultrazvučna karakterizacija plaka Karakterizacija karotidnih aterosklerotskih plakova vršena je ultrazvuĉnim pregledom, koji daje dvodimenzionalni slikovni prikaz tzv. B-mode, dopunjen kolorom i pulsnim doplerom, korišćenjem aparata Toshiba, Power Vision 6000, 7.5 Mhz (Riverside, CA). Doplersonografski pregled levih i desnih karotidnih arterija ima dva aspekta merenja: morfološki i funkcionalni. Ultrazvuĉni pregled omogućava ne samo kvantitativnu analizu plaka (duţina, širina, debljina, stepen stenoze lumena) već i kvalitativnu analizu plaka, graĊu plaka, površinu plaka, prisustvo tromba). Na osnovu ove analize moţe se procenti koliko je plak riziĉan za pojavu cerebrovaskularne bolesti i da li postoji indikacija za hirurško odstranjivanje (endarterektomiju). U funkcionalnom smislu pregled daje informacije o karakteristikama protoka krvi koji se moţe videti u sklopu analize spektra frekvencija i pulsnog talasa u odreĊenim delovima krvnog suda, u longitudinalnom i transferzalnom preseku. Morfološki aspekt podrazumeva utvrĊivanje osobina toka krvi i širine krvnog suda, osobine granjanja (bifurkacije), izgled intime, merenje zadebljanja intima-medije i utvrĊivanje eventualnog prisustva aterosklerotskih promena. Pored toga mogu se konstatovati poremećaji toka krvi usled elongacije, krivudavosti (tortuoznosti) ili angulacija (kinking) krvnih sudova. U sagledavanju morfologije aterosklerotskih promena unutar zida krvnog suda odnosno plaka bitno je da se utvrde njegove karakteristike i izmeri stepen stenoze istog. Aterosklerotska suţenja su najĉešće nalaze u podruĉju bifurkacije zajedniĉke karotidne arterije (CCA) i u poĉetnom segmentu unutrašnje karotidne arterije (ICA). Istraţivanje plakova je obuhvatalo distalni deo zajedniĉke karotidne arterije u duţini od 2 cm (CCA), karotidni bulbus i proksimalni deo unutrašnje karotidne arterije (ICA) u duţini od 2 cm na levoj i desnoj strani vrata. Plak je definisan kao lokalizovana eho-struktura koji zalazi u lumen krvnog suda i pravi suţenje protoka. Pri tom rastojanje izmeĊu spoja medija-adventicije i površine lezije okrenute lumenu iznosi više od 1.2 mm. Sa povećanjem stepena stenoze struktura plaka postaje više heterogena. Klasifikacija plakova vršena je na osnovu ultrazvuĉnog pregleda, prema stepenu ehogenosti, unutrašnjoj strukturi i mofologiji. Ehogenost plaka Materijal i metode 45 zavisi od njegovog sastava, usled nakupljanja depozita lipida, fibroznog tkiva, taloţenja kalcijuma (prisustva/odsustva kalcifikakata) i prisustva hemoragija. Anehogeni i hipoehogeni regioni plaka mogu predstavljati hemoragije, depozite lipida ili nekrotiĉne promene (meko tkivo). Plakove višeg stepena ehogenosti odlikuje veći stepen kalcifikacije. Plakovi mogu da budu homogeni (ujednaĉene homogene strukture, uniformne ćelijske strukture i glatke površine) ili heterogeni (neujednaĉne, heterogene eho strukture). Heterogeni plak odlikuje kompleksna ehogena struktura usled prisustva depozita lipida, kalcifikacije ili hemoragije unutar plaka. Lipidni plak je hipo- ili anehogen, fibrozni izo-/hiperehogen bez kalcifikacija, fibrokalcifikovan je hiperehogen sa punktiformnim kalcifikacijama, a kalcifikovani onaj kada je više od polovine ili cela površina prekrivena kalcifikatom (Savić i sar., 2010). Na osnovu morfologije plaka, njegove strukture, površine i stepena ehogenosti i/ili eholucentnosti procenjena je aktivnost unutar plaka odnosno njegova stabilnost (European Society of Vascular Surgeons, European Carotid Plaque Study Group, 1995, 2011; Montauban van Swijndregt i sar., 1998; Lammie i sar., 2000; Grønholdt i sar., 2001; Grønholdt i sar., 2002; Cho i sar, 2012). Stoga su plakovi podeljeni u dve podgrupe: nekomplikovane stabilne (ujednaĉene homogene eho strukture) (SAP) (Widder i sar, 1990) i komplikovane nestabilne (neujednaĉne, heterogene eho strukture) (NAP) (Gray-Weale i sar., 1988; European Carotid Plaque Study, 1995, 2011). Pored unutrašnje strukture, vaţan je i izgled površine plaka. Površina plaka moţe biti glatka, ili narušena ulceracijom (fokalnim depresijama). Kriterijum za ulceraciju plaka je defekt površine i strukture veći od 2 mm. Ulceracije (odvajanje delova plaka; lipidnog jezgra plaka toku krvi; engl. echoreflective surface of the plaque) mogu biti rizik za nastanak šloga. Plakovi glatke površine bez eholucentnog materijala su oznaĉeni kao stabilni (Widder i sar, 1990), dok su plakovi kod kojih je egzulcerisana površina (usled ulceracija na mestima gde je došlo do odvajanja lipidnog dela plaka) (European Society of Vascular Surgeons, European Carotid Plaque Study Group, 1995, 2011) ili preovlaĊuje eholucentni materijal usled hemoragije predstavljaju nestabilne plakove (Grønholdt ML, 1999). Procena stepena stenoze je uraĊena merenjem rezidualnog lumena krvnog suda na mestu stenoze i dijametra normalnog dela krvnog suda, po ECST kriterijumima (eng. European Carotid Surgery Trialists Collaborative Group, ECST) kod pacijenata Materijal i metode 46 leĉenih u IKVB Dedinje i NASCET kriterijumima (eng. North American Symptomatic Carotide Endaarterectomy Trial, NASCET) kod pacijenata leĉenih u IKVB KCS. Kriterijum za merenje stepena stenoze krvnog suda prema ECST je poreĊenje odnosa dijametra rezidualnog lumena sa procenjenim dijametrom karotidnog bulbusa, a prema NASCET se uzima u obzir odnos dijametra rezidualnog lumena i dijametra distalnog normalnog segmenta ICA (Wardlow i Lewis., 2005). U sluĉajevima kada distalni deo normalnog segmenta unutrašnje karotidne arterije nije oĉuvan arterija je okarakterisana sa stepenom stenoze od 95 %. Stepen stenoze od 70 % po NASCET je isto što i stepen stenoze od 85 % po ECST kriterijumima (Rothwell i sar., 1994). Uzumajući u obzir razliku u naĉinu procene stepena stenoze prema navedenim kriterijuma, radi adekvatne i korektne kvantifikacije stepena stenoze, kod svih pacijenata sa dijagnostikovanom aterosklerozom karotida, utvrĊene su ekvivalentne vrednosti ukupnog stepena stenoze, merene doplersonografom, prema formuli: % ECST= 0, 6 x % NASCET + 40 % (Rothwell i sar., 1994; Donnan i sar., 1998; Wadlaw i Lewis, 2005). 3.2.2. Izolacija i merenje koncentracije DNK iz ćelija krvi Izolacija DNK iz iz 5mL krvi ĉoveka, uzete sa antikoagulansom (Na-citrat ili EDTA), raĊena je na dva naĉina: metodom po Kunkel-u (Kunkel i sar., 1977) i po protokolu za izolaciju DNK na aparatu Abi Prism TM 6100 Nucleic Acid Prepstation (Applied Biosystems, SAD). Merenje koncentracije izolovane DNK Koncentracija DNK u µg/mL je izraĉunata iz odnosa: A260 x razblaţenje u kiveti (100) x duţina svetlosnog puta u kiveti u cm (1 cm) x faktor apsorpcije za dvolanaĉanu DNK (50) / 1000. Materijal i metode 47 3.2.3. Genotipizacija polimorfizama DNK in vitro (PCR) Lanĉana reakcija polimeraze (PCR) je metoda enzimske amplifikacije specifiĉnih segmenata DNK in vitro. Zahteva izuzetno male kolĉine poĉetnog materijala DNK, a reakcija se izvodi pomoću termostabilnog enzima, DNK polimeraze. Umnoţeni fragmenti se seku upotrebom komercijalno dostupnih restrikcionih endonukleaza, enzima koji prepoznaju specifiĉne sekvence DNK koje najĉešće obuhvataju polimorfno mesto, radi razlikovanja genotipova polimorfizama u genu od interesa (eng. restriction fragment length polymorphism, RFLP metoda). 3.2.3.1. Genotipizacija poliorfizma I/D u genu za ACE reakcijom amplifikacije DNK in vitro Protokol: OdreĊivanje inserciono/delecionog polimorfizma u genu za ACE raĊeno je po prethodno dizajniranoj metodi (Stanković i sar., 1999). Oligonukleotidi korišćeni pri detekciji ovog polimorfizma prikazani su u tabeli 3.1. Komponente PCR reakcije, raĊene u 20 μl smeše prikazane su u tabeli 3.2. Svaka serija uzoraka sadrţala je obaveznu negativnu (bez DNK) i pozitivnu kontrolu (DNK sa poznatim genotipom). Tabela 3.1 Oligonukleotidi upotrebljeni za genotipizaciju ACE I/D polimorfizma U tabeli 3.1 prikazane su sekvence amplimera korišćenih u genotipizaciji polimorfizma I/D u genu za ACE. Oznaka polimorfizma Sekvenca amplimera Oznaka amplimera Referenca ACE I/D 5'CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3' SA66 Stanković i sar., 1999 5'GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT-3 167 5'TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3' ACE3 Materijal i metode 48 Tabela 3.2 Komponente PCR-a za detekciju I/D polimorfizma u genu za ACE Komponente PCR-a Finalna koncentracija Zapremina (μL ) Pufer za PCR (10x) 1x 2 MgCl2 3.25mM 2.6 DMSO 5 % 1 dNTP 0.25mM 4 Amplimer SA66 0.35μM 1 (7pmol) Amplimer 167 1μM 2 (20pmol) Amplimer ACE3 0.075μM 1 (1.5pmol) Genomska DNK 0.6μL (200ng) Taq polimeraza (0.5U/μL) 1μL ddH2O 6.4 μL ukupno 20μL U tabeli 3.2 prikazane su komponente reakcione smeše PCR reakcije korišćenih u detekciji polimorfizma I/D u genu za ACE Temperaturni profil PCR reakcije bio je: inicijalna denaturacija 95 o C 3 min; u sledećih 30 ciklusa denaturacija 93 o C 1 min, hibridizacija 65 o C 1.5 min i ekstenzija 72 o C1.5 min i finalna ekstenzija 74 o C 4 min. 3.2.3.2. Genotipizacija polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2 u jednoj tubi reakcijom amplifikacije DNK in vitro Prethodno dizajnirana alel specifiĉna metoda za detekciju polimorfizma A1166C u genu za ATR1 je redizajnirana (Stanković i Alavantić, 2002). Ideja metode korišćene u ovoj studiji je bila da se oba polimorfizma, u genima za ATR1 i ATR2 detektuju u jednoj reakciji kako bi se smanjilo vreme i troškovi procesa genotipizacije. Metoda za genotipizaciju polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2 je osmišljena tako da se fragmenti DNK u kojima se nalaze polimorfna mesta u oba Materijal i metode 49 ispitivana gena amplifikuju u jednoj PCR reakciji u istoj tubi (Ţivkovic i sar., 2005). Oligonukleotidi korišćeni pri detekciji ovih polimorfizama prikazani su u tabeli 3.3. Komponente za PCR reakciju raĊenu u 25 μl smeše za detekciju oba polimorfizma prikazane su u tabeli 3.4. Tabela 3.3 Sekvence amplimera korišćenih za genotipizaciju polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2. Oznaka polimorfizma Sekvenca amplimera Referenca A1166C 5'-GCAGCACTTCACTACCAAATGGGC-3' AGTR1F 5'-CAGGACAAAAGCAGGCTAGGGAGA-3' AGTR1R Berge i Berg, 1998 A/G -1332 5'-GGA AGGTAGAACATACATTAAATG-3' AT2S1 5'-AGAGAAACAGCAGCTAAAGAATT-3' AT2AS Ţivkovic i sar., 2005 U tabeli 3.3 prikazane su sekvence amplimera korišćenih u genotipizaciji polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2 Materijal i metode 50 Tabela 3.4 Komponente PCR-a za detekciju A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2 Komponente PCR-a Finalna koncentracija Zapremina (μL) Pufer za PCR (10x) 1x 2.5 MgCl2 3.5 mM 3 dNTP 0.125 mM 4 Amplimer AGTR1F 0.44 μM 1.1 (11 pmol) Amplimer AGTR1 0.44 μM 1.1 (11 pmol) Amplimer AT2S1 0.8 μM 2 (20 pmol) Amplimer AT2AS 0.8 μM 2 (20 pmol) Genomska DNK 0.6 μL ~ (200 ng) Taq polimeraza (5U/ μL) 0.4 μL ddH2O 8.3 μL ukupno 25 μL U tabeli 3.4 prikazane su komponente reakcione smeše PCR reakcije korišćenih u detekciji polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2 Temperaturni profil PCR reakcije bio je: inicijalna denaturacija 94ºC 3 min; u sledećih 30 ciklusa denaturacija 94 ºC 45 s, hibridizacija 58 ºC 45 s, i ekstenzija 72 ºC 45 s i finalna ekstenzija 72ºC 5 min. Svaka serija uzoraka sadrţala je obaveznu negativnu kontrolu (bez DNK) i pozitivnu kontrolu (DNK sa poznatim genotipom). 3.2.4. Restrikciona analiza sintetisanih fragmenata (RFLP) Restrikcionom analizom sintetisanih fragmenata DNK, korišćenjem restrikcionih enzima HaeIII i EcoRI, utvrĊeni su genotipovi polimorfizama DNK A1166C u genu za ATR1 i A/G -1332 u genu za ATR2. ReĊi alel C polimorfizma A1166C uvodi restrikciono mesto koje prepoznaje enzim HaeIII. U sluĉaju prisustva alela C dobija se fragment od 233 bp, dok je neseĉeni fragment u sluĉaju prisustva alela A (255 bp). Za odreĊivanje genotipa polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 korišćen Materijal i metode 51 je restrikcioni enzim EcoRI koji u sluĉaju prisustva reĊeg alela G prepoznaje specifiĉno restrikciono mesto i seĉe sintetisani fragment DNK. U sluĉaju prisustva alela A ne dolazi do digestije PCR produkta od 120 bp, a u sluĉaju prisustva alela G dobijaju se fragmernti od 91 bp i 29 bp. Pošto su fragmenti DNK za oba polimorfizma sintetisani u istoj tubi jednom PCR reakcijom, radi daljeg pojednostavljivanja metode genotipizacije, uraĊena je i dupla restrikciona digestija u istoj tubi. Enzimi korišćeni za genotipizaciju imaju optimalnu aktivnost na 37 ºC, a digestioni pufer je odabran tako da oba enzima imaju maksimalnu efikasnost delovanja u reakciji. 3.2.5. Izolacija, merenje i provera kvaliteta ukupne ćelijske RNK 3.2.5.1. Izolacija ukupne ćelijske RNK iz karotidnog aterosklerotskog plaka Ukupna RNK izolovana je iz tkiva i pripremljena za RT-PCR. Protokol opisuje proceduru izolacije RNK iz tkiva korišćenjem metode sa TRI Reagent-om po protokolu proizvoĊaĉa (Ambion, SAD). Provera kvaliteta izolovane RNK uraĊena je po standardnoj proceduri na formaldehidnom gelu. 3.2.6. Obrada uzorka RNK i reverzna transkripcija Uzorci izolovane RNK tretirani su endonukleazom DNKaza I po protokolu proizvoĊaĉa (Fermentas, Lithuania), pre reakcije reverzne transkripcije, kako bi se uklonili jednolanĉani i dvolanĉani molekuli DNK. Reverzna transkripcija (RT-PCR) uraĊena je po protokolu proizvoĊaĉa (RevertAid first strand cDNA synthesis kit, Fermentas, Lithuania). Za RT-PCR korišćeni su oligo-dT amplimeri, zato što selektivno reverzno prevode poli (A)+RNK i minimizuju nespecifiĉne amplifikacije koje su asocirane sa RT-PCR-om u kojoj se koriste nasumiĉni amplimeri (Goswami i sar., 1997). Materijal i metode 52 3.2.7. Detekcija iRNK za ACE, ACE2, ATR1, ATR2, kolektrin (TMEM27) i miR-155 amplifikacijom odreĎenih molekula cDNK (Real-time PCR) Provera prisustva odreĊenog molekula cDNK vršena je umnoţavanjem cDNK ciljnog regiona pomoću, PCR sa amplimerima i probom specifiĉnom za spoj dva egzona u ciljnom genu. U ovoj studiji je za detekciju, kao i za relativnu kvantifikaciju transkripata u ispitivanim genima korišćena metoda PCR-a u realnom vremenu (eng. Real-time PCR). Komercijalni eseji koji su korišćeni u studiji za detekciju potencijalno eksprimiranih transkripata za ACE, ACE2, ATR2 i kolektrin (TMEM27) su: Hs00174179_m1, Hs00222343_m1, Hs00169126_m1, Hs00252907_m1 (Applied Biosystems, SAD) i za 18S Hs99999901_s1 (Applied Biosystems, SAD). Komercijalni eseji koji su korišćeni za detekciju potencijalno eksprimiranih transkripata za ATR1 su bili sledeći: Hs00259315_m1 (Varijanta 4), Hs00241341_m1 (Varijanta 2 i 3) i Hs01096942_m1 (Varijanta 1) (Applied Biosystems, SAD) (slika 3.1). Kao kontrola korišćena je komercijalna cDNK izolovana iz normalne arterije bez znakova ateroskleroze, Cat No. C1234013-10, BioChain, SAD. Komercijalni eseji korišćeni za detekciju mikroRNK u tkivu plaka su Hsa-mir-155 za miR-155 i endogena kontrola za malu nukleolarnu RNK (eng. small nucleolar RNK, snoRNK), RNU44 (Applied Biosystems, SAD). Materijal i metode 53 Slika 3.1 Šematski prikaz lokacija komercijalnih proba/prajmera u kodirajućoj sekvenci gena za ATR1 koji su korišćeni za detekciju potencijalno eksprimiranih transkripata iRNK za ATR1. Kataloški brojevi proba/prajmera korišćenih u reakciji: Hs00259315_m1, Hs00241341_m1 i Hs01096942_m1 (Applied Biosystems, SAD). Probe i prajmeri su dizajnirani od strane proizvoĊaĉa i nalaze se na granici egzona: i to sens prajmer je komplementaran 5' kraju egzona, a antisens 3' kraju egzona, dok je proba izmeĊu prajmera. 3.2.8. WESTERN BLOT 3.2.8.1. Priprema uzoraka tkiva karotidnog aterosklerotskog plaka za izolaciju proteina Uzorci tkiva aterosklerotskih plakova dobijenih neposredno sa operacija karotidne endarteroktomije su odloţeni u teĉni azot, a zatim na temperaturi od -70º C i tako ĉuvani do trenutka izolacije proteina. Otopljeni uzorci tkiva aterosklerotskih plakova (100 mg tkiva) su usitnjeni i homogenizovani na ledu u RIPA puferu (50 mM Tris HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 % natrijum-deoksiholat, 0.1 % natrijum-dodecil sulfat (SDS), 1% Triton X-100 ) u koji je dodat koktel proteaznih inhibitora (2 mM PMSF, 5 μg/ml aprotinin, 5 μg/ml leupeptin), neposredno pred rad korišćenjem Ultra- ORF 1 2 3 o 4 Hs01096942_m1 Hs00259315_m1 Hs00241341_m1 Varijanta 2 Varijanta 1 Varijanta 3 Alternativno iskrajanje Varijanta 4 ATG ATG ATG 5' 3' Materijal i metode 54 Turrax homogenizera (Dupont i sar., 1998). Zapremina RIPA pufera u kojoj je tkivo homogenizovano bila je 500 μl. Homogenati su centrifugirani 30 min na 13 000 g na temperaturim od 4ºC, a zatim su odliveni supernatanti centrifugirani još jedanput na 13 000 g 20 min na temperaturim od 4ºC. Višak lipida u vidu sloja na površini supernatanta je uklanjan nastavkom pipetora. Supernatanti, koji predstavljaju ukupni ćelijski lizat, korišćeni su za Western blot. Uzorci koji su spremljeni za Western Blot skuvani su 5 min na 100 ºC u jednakoj zapremini 2 x Laemmli pufera i ĉuvani u zamrzivaĉu na -20 ºC. OdreĎivanje koncentracije proteina Koncentracija proteina u uzorcima odreĊivana je kolorimetrijskom metodom, korišćenjem komercijalnog kompleta BCA (Smith i sar., 1985). Koncentracija ukupnih proteina oĉitavala se sa standardne krive, konstruisane na osnovu izmerenih vrednosti apsorbanci poznatih koncentracija BSA (0.2, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6 i 2 mg/ml). 3.2.8.2. Natrijum dodecil sulfat elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (SDS- PAGE) Kao prvi korak u imuno-blot proceduri primenjena je diskontinuirana poliakrilamid gel elektroforeza u prisustvu deterdţenta natrijum dodecil sulfata (eng. Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE). Ova specifiĉna elektroforetska tehnika obezbeĊuje razdvajanje proteinskih frakcija u uzorku na osnovu njihove molekulske mase (Laemmli UK, 1970). Kao molekulski marker korišćen je proteinski marker za elektroforezu ProteinPlus Prestained Ladder, koji sadrţi 6 proteina razliĉitih molekulskih masa (130 kDa, 100 kDa, 70 kDa, 55 kDa, 35 kDa, 25 kDa, 15 kDa i 10 kDa, Fermentas, Vilnius, Lithuania). Posle elektroforeze gelovi su korišćeni za Western blot analizu. Materijal i metode 55 Imuno blot (Western blot) Identifikacija ispitivanih proteina u uzorcima vršena je primenom specifiĉnih antitela. Membrane su inkubirane preko noći na 4º C, sa primarnim antitelima (kozjim poliklonskim antitelima) na epitop na C-terminusu za ACE- (C-20)-sc-12187 i C- terminusu za ACE2-(C-18) (sc-17720) (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, SAD) i (zeĉijim poliklonskim antitelima) za ATR1 i ATR2 i to: AT1-N-10-sc-1173 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, SAD) sa epitopom na N-terminus i AT2R-ab19134-(Abcam, Cambridge, GB) sa epitopom na poziciji poĉev od 349. do 363. aminokiseline koji odgovara receptoru pacova. Razblaţenja primarnih antitela su bila sledeća: ACE, ACE2, ATR1 (1:250), ATR2 (1:5000) u TBST-u. Po završenoj inkubaciji sa primarnim antitelom, membrane su ispirane 5 x 5 min TBST puferom na sobnoj tempearturi uz blago mešanje. Nakon ispiranja, membarane su inkubirane 1.5 h, uz mešanje, sa sekundarnim anti- zeĉijim odnosno anti-kozjim antitelom (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA, SAD) konjugovanim sa peroksidazom rena (eng. Horseradish Peroxidase, HRP) (razblaţenje 1: 10 000 TBST) ili alkalnom fosfatazom (eng. Alkaline Phosphatase, ALP) (razblaţenje 1: 5000, TBST). Nakon inkubacije, membrane su ispirane 5 x 5 min u TBST-u. Radi vizuelizacije traka, na membrane je nanošen supstrat za hemiluminiscenciju (eng. enhanced chemiluminescence, ECL) (Amersham Biotech, Pittsburgh, PA, SAD) ili supstrat za alkalnu fosfatazu (BCIP/NBT). Intenziteti signala, odnosno koncentracije ispitivanih proteina, odreĊivane su denzitometrijski. Filmovi su skenirani, a optiĉka gustina detektovanih proteinskih traka kvantifikovana je pomoću raĉunarskog program Image J 1.37 V. software (http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). Materijal i metode 56 3.2.9. Statistička obrada podataka Uĉestalosti genotipova i alela odreĊene su metodom prebrojavanja (eng. gene counting method). Za ispitivanje slaganja distribucija dobijenih uĉestalosti genotipova u populaciji sa oĉekivanim vrednostima, po Hardy-Weinberg-ovoj ravnoteţi (HWE), korišćen je χ2 test. Normalna distribucija parametara sa kontinualnim vrednostima testirana je Kolmogorov-Smirnov-im testom sa Lilliefors-ovom korekcijom. Za utvrĊivanje razlike srednjih vrednosti kontinualnih parametara izmeĊu dve grupe koji su u normalnoj raspodeli korišćen je Studentov t-test za nezavisne uzorke, ili neparametrijski Man-Vitni U test (eng. Mann-Whitney), za varijable ĉije vrednosti nisu u normalnoj raspodeli. Vrednosti fenotipskih varijabli su predstavljene brojĉano i procentualno, ili kao srednja vrednost sa standardnom devijacijom (SV±SD). Analiza razlike u distribuciji uĉestalosti genotipova izmeĊu posmatranih grupa raĊena je Pirsonovim χ2 testom. Analiza asocijacije genotipova i kombinacija genotipova sa fenotipom raĊena je univarijantnom regresionom analizom, praćena multivarijantnom regresijom. Mera asocijacije genotipova sa fenotipom od interesa izraţena je kao korigovani odnos šansi OR (eng. odds ratio) sa intervalom pouzdanosti 95 % (eng. confidence interval, ± 95% CI). Sve statistiĉke analize su uraĊene korišćenjem programskog paketa STATISTICA 8.0 Software (http://www.statsoft.com). Kvantitativna analiza genske ekspresije je raĊena u programu REST (REST Software, QIAGEN) (Pfaffl i sar., 2002) na osnovu odgovarajućih ulaznih vrednosti: Ct i efikasnosti PCR amplifikacije za svaki ispitivani gene i endogenu kontrolu u okviru ispitivanih grupa uzoraka. Cilj primene programa REST08 je da se utvrdi da li postoji znaĉajna razlika u ekpresiji odgovarajućeg gena izmeĊu grupe ispitivanih uzoraka i grupe kontrola, uzimajući u obzir efikasnost reakcije i normalizaciju na referentni gen- endogenu kontrolu. Testiranjem hipoteze provereno je da li je rezultat statistiĉki znaĉajan, na osnovu vrednosti p (p<0,05 predstavlja znaĉajnu razliku). U relativnoj kvantifikaciji genske ekspresije vrednosti su normalizovane na nivo ekspresije endogene kontrole RNU44, male nukleolarne RNK koja u tkivima ĉoveka ima relativno stabilnu ekspresiju (Kiss T, 2002) i u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka (Raitoharju i sar., 2011). Kvantitativna analiza ekspresije gena RAS i miR-155 uraĊena Materijal i metode 57 je u programu GraphPad (http://www.graphpad.com) metodom 2 -ΔΔCt i 2 -ΔCt (Schmittgen i Livak, 2008). Rezultati 58 4. REZULTATI 4.1. OSNOVNE KARAKTERISTIKE KONTROLNOG UZORKA UZORKA PACIJENATA SA KAROTIDNOM ATEROSKLEROZOM (KA) Tabela 4.1.Osnovne karakteristike kontrolnog uzorka i uzorka pacijenata sa karotidnom aterosklerozom (KA) Parametar Kontrolna grupa Pacijenti sa KA p Pol m/ţ n (%) 144 (50.53) /141(49.47) 322 (62.89) /190 (37.11) <0.001 Dob (godine) * 40.74±14.82 66.52±9.25 <0.001 Pušaĉki status n (%) 148 (51.93) 305 (59.58) <0.001 Hipertenzivni status 33 (11.58) 358 (69.92) <0.001 BMI (kg/m 2 )* 24.17 ± 3.56 26.26 ± 3.15 <0.001 Ukupni holesterol (mmol/L)* 5.85±1.37 5.82 ±1.53 ns LDL-C (mmol/L)* 3.69±1.11 3.74±1.09 ns HDL-C (mmol/L)* 1.32±0.36 1.20±0.35 <0.001 Trigliceridi (mmol/L)* 1.56±1.25 1.99±2.13 <0.001 Lp (a) mg/dL * 20.91±22.61 45.24±42.34 <0.001 Ukupno (n) 285 512 Vrednosti kontinualnih varijabli su prikazane kao srednje vrednosti±standardna devijacija (SD); diskretne varijable su prikazane brojĉano i procentualno (%); statistiĉka analiza distribucije kategorijskih parametara utvrĊena je Pearson χ2 testom; statistiĉki analiza srednjih vrednosti parametara koji su u normalnoj raspodeli utvrĊena je Studentovim t- testom, a kod parametara koji nisu u normalnoj raspodeli (*) neparametrijskim Mann-Whitney U testom. BMI-indeks telesne mase (eng. body mass index) SBP- sistolni krvni pritisak, DBP-dijastolni krvni pritisak, LDL-C-LDL holesterol, HDL-C-HDL holesterol, Lp (a)-lipoprotein (a). U tabeli 4.1. prikazane su osnovne biohemijske i kliniĉke odlike ispitivane kontrolne i grupe pacijenata sa KA, iz Srbije kod kojih su utvrĊene relativne frekvencije genotipova polimorfizama u genima za ACE (I/D), ATR1 (A1166C) i ATR2 (A/G -1332). Vrednosti standardnih biohemijskih parametara u kontrolnoj grupi bili su u granicama normalnih vrednosti. Kod pacijenata sa karotidnom aterosklerozom je uoĉen statistiĉki znaĉajno veći broj pušaĉa i hipertenzivnih osoba u poreĊenju sakontrolnom grupom. U odnosu na kontrolu pacijenti sa karotidnom aterosklerozom su se statistiĉki znaĉajno razlikovali po godinama starosti, imali su više vrednosti indeksa telesne teţine (BMI), Rezultati 59 veću koncentraciju triglicerida i lipoproteina i niţu koncentraciju HDL holesterola. U grupi pacijenata sa KA statistiĉki znaĉajno više ima muškaraca u odnosu na kontrolnu grupu. Tabela 4.2. Osnovne karakteristike uzorka pacijenata sa karotidnom aterosklerozom u odnosu na podtipove aterosklerotskog plaka, stabilni aterosklerotski plak (SAP) i nestabilni aterosklerotski plak (NAP) Parametar Stabilan plak (SAP) Nestabilan plak (NAP) p Pol M/Ţ n (%) 178 (59.33) /122(40.67) 81 (71.68) / 32 (28.32) p<0.05 Pušenje n (%) 213 (71.00) 82 (72.57) ns Hipertenzija n (%) 258 (86.00) 101 (89.38) ns Dob (godine)* 66.71 ± 9.21 67.57 ±7.54 ns BMI (kg/m 2 ) 26.04 ± 2.65 26.79 ±3.74 ns Ukupan holesterol (mmol/L) 5.79 ± 1.21 5.67 ±1.20 ns LDL-C (mmol/L) 3.76 ± 1.05 3.61 ±1.07 ns HDL-C (mmol/L) 1.22 ± 0.35 1.19 ±0.36 ns Trigliceridi (mmol/L)* 1.88 ± 0.94 1.85 ±1.12 ns Lp (a) (mg/dL)* 35.96 ±40.76 28.84 ±33.16 ns ApoA1 (g/L)* 1.59 ± 0.47 1.49 ±0.39 ns ApoA2 (mg/L) 333. 89 ± 73.31 332.05 ±64.79 ns ApoB (g/L)* 1.16 ± 0.30 2.20 ±10.42 ns VIIF (g/L) * 96.47 ± 41.38 98.93 ±34.43 ns vWF (IU/dL)* 159.98 ± 85.85 168.52 ± 73.73 ns DDIM (µg/L)* 179.16 ±163.69 221.74 ± 266.82 ns PAI (U/mL) 3.78 ±1.28 3.02 ± 1.38 p<0.001 Plazminogen (g/L) 130.27 ± 19.78 119.73± 26.84 p<0.001 CRP (mg/dL)* 7.83 ± 15.52 4.08 ± 5.63 ns IL-6 (pg/mL)* 5.72 ±11.25 5.20 ±10.84 ns Leukociti (10 9 /L) 7.60 ± 1.78 7.95 ±2.05 ns Trombociti (10 9 /L)* 265.45 ± 81.03 244.40 ± 68.70 p<0.05 Stepen stenoze (% )* 90.07 ±7.61 88.04 ±15.51 ns Ukupno 300 113 Vrednosti kategorijskih parametarau predstavljene su brojĉano i procentualno (%), a vrednosti kontinualnih varijabli kao srednja vrednost ±standardna devijacija (SD); statistiĉka analiza distribucije kategorijskih parametara utvrĊena je Pearson χ2 testom; statistiĉki analiza srednjih vrednosti parametara koji su u normalnoj raspodeli utvrĊena je Studentovim t-testom, a kod parametara koji nisu u normalnoj raspodeli (*) neparametrijskim Mann-Whitney-U testom; VIIF- faktor koagulacije VII; DDIM-D dimer; PAI-inhibitor aktivacije plazminogena; vWF-von Vilebrandov faktor; CRP-C reaktivni protein; IL-6- interleukin-6; ns-nije detektovana statistiĉki znaĉajna razlika Rezultati 60 U tabeli 4.2. predstavljene su osnovne odlike grupe pacijenata sa karotidnom aterosklerozom, podeljene prema fenotipu plaka na pacijente sa stabilnim (SAP) i nestabilnim (NAP) aterosklerotskim plakom. Analiza varijanse ukupnog stepena stenoze (SS) je uraĊena po ECST (eng. European Carotid Surgery Trialists Collaborative Group, ECST) kriterijumima. Svi pacijenti imaju visok stepen stenoze (>70 %). Registrvan je veći broj pacijenata sa fenotipom stabilnog aterosklerotskog plaka. Pacijenti sa nestabilnim plakom imali su statistiĉki znaĉajno niţe vrednosti koncentracije plazminogena i PAI i manji broj trombocita u plazmi. Nestabilan plak se ĉešće formirao kod muškaraca, nego kod ţena, pri ĉemu je ta razlika bila statistiĉki znaĉajna (p<0.05). Rezultati 61 Tabela 4.3. Osnovne karakteristike uzorka pacijenata sa karotidnom aterosklerozom u odnosu na podtipove aterosklerotskog plaka, stabilni aterosklerotski plak (SAP) i nestabilni aterosklerotski plak (NAP) kod muškaraca Muškarci n=259 Stabilan plak (SAP) Nestabilan plak (NAP) p n (%) 178 (68.73) 81 (31.27) Pušenje n (%) 136 (77.71) 61 (75.31) ns Hipertenzija n (%) 153 (87.43) 72 (88.89) ns Dob (godine)* 65.93 ±9.85 67.72±6.94 ns BMI (kg/m 2 ) 25.52 ±2.24 26.64 ± 3.93 ns Ukupan holesterol (mmol/L) 5.69 ± 1.27 5.53 ±1.08 ns LDL-C (mmol/L) 3.71 ±1.08 3.55 ±0.98 ns HDL-C (mmol/L) 1.16 ±0.29 1.15 ±0.36 ns Trigliceridi (mmol/L)* 1.91±1.04 1.78 ±1.19 ns Lp (a) (mg/dL) * 35.29 ±40.59 28.36 ±29.59 ns ApoA1 (g/L) 1.54 ±0.39 1.45±0.36 ns ApoA2 (mg/L) 328.27 ± 72.86 326.98 ±71.84 ns ApoB (g/L) 1.16 ± 0.32 1.09 ±0.25 ns VIIF (g/L)* 94.61 ±41.72 96.82 ± 39.18 ns vWF (IU/dL)* 165.90± 90.13 168.55 ± 78.20 ns PAI (U/mL) 3.59 ±1.23 2.99 ±1.32 p<0.05 Plazminogen (g/L) 127.78 ±19.19 119.95 ±30.02 p<0.05 CRP (mg/dL)* 6.47±11.93 4.47±6.47 ns IL-6 (pg/mL)* 6.22±13.28 6.22±12.68 ns Leukociti (10 9 /L) 7.59±1.80 7.95±2.25 ns Trombociti (10 9 /L)* 255.85±79.70 238.07±63.89 ns Stepen stenoze (% )* 90.57 ±7.04 90.38±9.08 ns Vrednosti kategorijskih parametara predstavljene su brojĉano i procentualno (%), a vrednosti kontinualnih varijabli kao srednja vrednost ±standardna devijacija (SD); statistiĉka analiza distribucije kategorijskih parametara utvrĊena je Pearson χ2 testom; statistiĉki analiza srednjih vrednosti parametara koji su u normalnoj raspodeli utvrĊena je Studentovim t-testom, a kod parametara koji nisu u normalnoj raspodeli (*) neparametrijskim Mann-Whitney-U testom; VIIF- faktor koagulacije VII; DDIM-D dimer; PAI-inhibitor aktivacije plazminogena; vWF-von Vilebrandov faktor; CRP-C reaktivni protein; IL-6- interleukin-6; ns-nije detektovana statistiĉki znaĉajna razlika U tabeli 4.3. predstavljene su osnovne odlike pacijenata sa KA, podeljeni prema fenotipu plaka kod muškaraca. Zabeleţen je veći broj pacijenata sa fenotipom stabilnog aterosklerotskog plaka. Kod muškaraca su uoĉene statististiĉki znaĉajno niţe vrednosti nivoa PAI i plazminogena u fenotipu nestabilnog aterosklerotskog plaka. Rezultati 62 Tabela 4.4. Osnovne karakteristike uzorka pacijenata sa karotidnom aterosklerozom u odnosu na podtipove aterosklerotskog plaka, stabilni aterosklerotski plak (SAP) i nestabilni aterosklerotski plak (NAP) kod ţena Ţene n=154 Stabilan plak (SAP) Nestabilan plak (NAP) p n (%) 122 (79.22) 32 (20.78) Pušenje n (%) 77 (63.11) 21 (65.63) ns Hipertenzija n (%) 105 (86.07) 29 (90.63) ns Dob (godine) 67.82 ± 8.12 67.19 ± 9.05 ns BMI (kg/m 2 ) 26.69 ± 3.00 27.21 ± 3.28 ns SBP (mmHg) * 139.58 ± 18.76 138.13 ±12.37 ns DBP (mmHg)* 86.11 ± 10.15 85.00 ± 9.66 ns Ukupan holesterol (mmol/L) 5.93 ± 1.12 5.97 ±1.40 ns LDL-C (mmol/L) 3.83 ±1.01 3.75 ±1.25 ns HDL-C (mmol/L) 1.30 ± 0.40 1.29 ±0.36 ns Trigliceridi (mmol/L)* 1.83 ± 0.80 2.04 ±0.93 ns Lp (a) (mg/dL)* 36.86 ± 41.17 30.01 ±41.14 ns ApoA1 (g/L)* 1.65 ± 0.54 1.56±0.44 ns ApoA2 (mg/L) 342.40 ±73.72 344.73 ±42.36 ns ApoB (g/L)* 1.15 ± 0.28 4.89 ±19.21 ns VIIF (g/L) 98.98 ±41.04 104.06 ±18.03 ns vWF (IU/dL)* 151.70 ± 79.29 168.45 ±62.30 ns DDIM (µg/L)* 179.17 ±170.13 212.85 ±365.92 ns PAI (U/mL) 4.06 ±1.32 3.07 ±1.35 p<0.05 Plazminogen (g/L) 133.75±20.16 119.20 ±17.48 p<0.05 CRP (mg/dL)* 9.63±19.19 3.08±2.08 ns IL-6 (pg/mL)* 5.00±7.27 2.61±1.60 ns Leukociti (10 9 /L) 7.63±1.76 7.94±1.49 ns Eritrociti (10 12 /L) 4.39±0.47 4.26±0.54 ns Hemoglobin (g/L) 131.90±11.05 129.86±15.49 ns Trombociti (10 9 /L)* 278.23±81.41 259.75±78.31 ns Stepen stenoze (% )* 89.30±8.42 82.28 ±24.47 ns Vrednosti kategorijskih parametara predstavljene su brojĉano i procentualno (%), a vrednosti kontinualnih varijabli kao srednja vrednost ± standardna devijacija (SD); statistiĉka analiza distribucije kategorijskih parametara utvrĊena je Pearson χ2 testom; statistiĉki analiza srednjih vrednosti parametara koji su u normalnoj raspodeli utvrĊena je Studentovim t-testom, a kod parametara koji nisu u normalnoj raspodeli (*) neparametrijskim Mann-Whitney-U testom; VIIF- faktor koagulacije VII; DDIM-D dimer; PAI-inhibitor aktivacije plazminogena; vWF-von Vilebrandov faktor; CRP-C reaktivni protein; IL-6- interleukin-6; ns-nije detektovana statistiĉki znaĉajna razlika Rezultati 63 U tabeli 4.4. predstavljene su osnovne karakteristike pacijenata sa KA, podeljenih prema fenotipu plaka kod ţena. Zabeleţen je veći broj pacijentkinja sa fenotipom stabilnog aterosklerotskog plaka. Pacijentkinje sa nestabilnim plakom imale su statistiĉki znaĉajno niţe vrednosti koncentracije plazminogena i PAI. Tabela 4.5. Osnovne karakteristike uzorka pacijenata sa karotidnom aterosklerozom u odnosu na cerebrovaskularni insult (šlog) Parametar Bez CVI n (%) sa CVI n (%) p Pol M/Ţ n (%) 227 (57.32)/ 171 (42.68) 74 (63.79) /42 (36.21) ns Pušenje n (%) 284 (71.54) 73 (62.93) ns Hipertenzija n (%) 339 (85.39) 102 (87.93) ns Dob (godine)* 65.88±8.48 67.63±9.74 ns BMI (kg/m 2 )* 26.47±3.12 27.96 ± 11.02 ns Ukupan holesterol (mmol/L)* 5.84±1.54 5.96± 1.35 ns LDL-C (mmol/L) 3.74±1.11 3.94±1.06 ns HDL-C (mmol/L)* 1.22±0.33 1.23±0.41 ns Trigliceridi (mmol/L)* 1.97±2.12 1.91±1.90 ns Lp (a) (mg/dL)* 36.35±40.71 34.10±38.28 ns ApoA1 (g/L)* 1.60±0.45 1.43±0.37 p<0.05 ApoA2 (mg/L) 332.17±72.76 341.62±81.48 ns ApoB (g/L)* 1.17 ±0.37 2.21±10.42 ns VIIF (g/L)* 99.74±33.16 85.79±55.76 p<0.05 vWF (IU/dL)* 162.72±76.88 130.05±93.91 p<0.05 DDIM (µg/L)* 188.53±200.03 209.96±154.01 p<0.05 PAI (U/mL) 3.57±1.27 3.39±1.56 ns Plazminogen (g/L) 127.86± 21.70 125.75±26.07 ns CRP (mg/dL)* 5.10±7.53 12.37±23.42 ns IL-6 (pg/mL)* 4.84±7.22 5.29±8.77 ns Leukociti (10 9 /L)* 7.43± 1.93 8.14±2.13 p<0.05 Trombociti (10 9 /L)* 256.45±77.41 259.59±77.79 ns Stepen stenoze (% )* 89.64±10.78 89.66±9.23 ns Ukupno 396 116 Vrednosti kategorijskih parametara predstavljene su brojĉano i procentualno n (%), a vrednosti kontinualnih varijabli kao srednja vrednost ±standardna devijacija (SD); statistiĉka analiza distribucije kategorijskih parametara utvrĊena je Pearson χ2 testom; statistiĉki analiza srednjih vrednosti parametara, koji su u normalnoj raspodeli utvrĊena je Studentovim t-testom, a kod parametara koji nisu u normalnoj raspodeli (*) neparametrijskim Mann-Whitney-U testom; VIIF- faktor koagulacije VII; DDIM-D dimer; PAI-inhibitor aktivacije plazminogena; vWF-von Vilebrandov faktor; CRP-C reaktivni protein; IL-6- interleukin-6; ns-nije detektovana statistiĉki znaĉajna razlika Rezultati 64 U tabeli 4.5. predstavljene su osnovne karakteristike grupe pacijenata sa KA, podeljenih u odnosu na to da li su imali cerebrovaskularni insult (šlog) ili ne. Pacijenti koji su imali šlog su u odnosu na pacijente koji nisu imali šlog, pokazali niţe vrednosti nivoa ApoA1, VIIF i vWF i više nivoe DDdimera i broja leukocita u plazmi i te vrednosti su bile statistiĉki znaĉajno razliĉite. Tabela 4.6. Kliniĉke karakteristike pacijenata sa karotidnom aterosklerozom Kliniĉki parametri (%) Bez simptoma bolesti 54.49 Prolazni ishemijski dogaĊaj 21.29 Šlog 22.66 Nestabilni aterosklerotski plakovi 22.07 Ulceracija 13.48 Tromboza 0.98 Komorbiditet Koronarna bolest 23.24 Istorija bolesti u porodici 9.18 Dijabetes tipa 2 22.46 Periferna arterijska okluzivna bolest (PAOB) 15.04 Terapija Upotreba statina 18.55 Antihipertenzivna terapija 28.71 Antikoagulaciona terapija 2.15 Antiagregaciona terapija 50.98 U tabeli 4.6. prikazana je procentualna zastupljenost kliniĉkih parametara pacijenata sa KA (n=512). Procentualna zastupljenost nestabilnog karotidnog plaka u grupi pacijenata bila je 22.07 %. Ukupan broj pacijenata koji su imali šlog bio je 116 (22.66 %). Procenat pacijenata koji su imali dijabetes tipa 2 je bio 22.46 %. Procentualni udeo pacijenata koji su zajedno sa KA imali i koronarnu aterosklerozu je bio 23.24 % Rezultati 65 4.2. GENETIČKO-EPIDEMIOLOŠKA ANALIZA 4.2.1. Polimorfizmi DNK u genima za ACE (I/D), ATR1 (A1166C) i ATR2 (A/G -1332) u kontrolnoj grupi i grupi pacijenata sa KA 4.2.1.1. Detekcija polimorfizma I/D u genu za ACE Slika 4.1 Prikaz genotipizacije polimorfizma I/D u genu za ACE na 1.8 % agaroznom gelu. M-DNK marker 100 bp Na slici 4.1 prikazan je izgled agaraznog gela u genotipizaciji polimorfizma I/D u genu za ACE. Rezultati 66 4.2.1.2. Detekcija polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i polimorfizma A/G - 1332 u genu za ATR2 Slika 4.2 Prikaz genotipizacije polimorfizama A1166C i A/G -1332 u genima za ATR1 i ATR2 na 8 % poliakrilamidnom gelu, M-DNK marker Φx174. Na slici 4.2 prikazan je izgled poliakrilamidnog gela u genotipizaciji polimorfizma A1166C u genu za ATR1 i polimorfizma A/G-1332 u genu za ATR2 Rezultati 67 4.2.1.3. Distribucija genotipova u kontrolnoj grupi i grupi pacijenata sa karotidnom aterosklerozom i njihov efekat na nastanak bolesti Tabela 4.7. Distribucija frekvencija genotipova i alela polimorfizama u genima za ACE (I/D), ATR1 (A1166C) kod kontrola i pacijenata sa KA ukupno i podeljenih po polu Polimorfizam Kontrole Pacijenti p ACE n (%) n (%) (χ2) I/D Polimorfizam Kontrole Pacijenti p ATR1 n (%) n (%) (χ2) A1166C Svi # Svi # II 48 (19.51) 93 (18.42) ID 127 (51.63) 255 (50.50) ns DD 71 (28.86) 157 (31.09) Ukupno 246 505 Alel I 0.45 0.44 ns Alel D 0.55 0.56 AA 120 (56.60) 275 (54.46) AC 78 (36.79) 185 (36.49) ns CC 14 (6.60) 45 (8.88) Ukupno 212 505 Alel A 0.75 0.73 ns Alel C 0.25 0.27 Muškarci § II 29 (20.28) 54 (16.67) ID 69 (48.25) 166 (51.23) ns DD 45 (31.47) 104 (32.10) Ukupno 143 324 Alel I 0.44 0.42 ns Alel D 0.56 0.58 Muškarci ψ AA 65 (59.63) 177 (54.46) AC 40 (36.70) 116 (35.69) ns CC 4 (3.67) 32 (9.85) Ukupno 109 325 Alel A 0.78 0.68 ns Alel C 0.22 0.32 Ţene * II 19 (18.45) 39 (21.79) ID 58 (56.31) 87 (48.60) ns DD 26 (25.24) 53 (29.61) Ukupno 103 179 Alel I 0.47 0.46 ns Alel D 0.53 0.54 Ţene * AA 55 (53.40) 98 (54.44) AC 38 (36.89) 69 (38.33) ns CC 10 (9.71) 13 (7.22) Ukupno 103 180 Alel A 0.72 0.74 ns Alel C 0.28 0.26 #, §, *-ispitivani uzorak je u Hardy-Weinberg-ovoj ravnoteži; ψ-ispitivani uzorak u grupi pacijenata nije u Hardy-Weinberg-ovoj ravnoteţi; p-Pearson χ2 test U tabeli 4.7. predstavljene su relativne uĉestalosti genotipova i alela polimorfizama u genima za ACE (I/D) i ATR1 (A1166C) kod kontrola i pacijenata sa KA ukupno i podeljenih po polu. Distribucija uĉestalosti genotipova nije odstupla od HWE u kontrolnoj populaciji (p>0.05), ali odstupala je od HWE u grupi pacijenata sa KA muškog pola za polimorfizam A1166C u genu za ATR1 (p<0.05). Nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u distribuciji genotipova i alela analiziranih polimorfizama izmeĊu kontrola i pacijenata sa KA ukupno i podeljenih po polu. Rezultati 68 Tabela 4.8. Distribucija frekvencija genotipova i alela polimorfizama u genu za ATR2 (A/G -1332) kod kontrola i pacijenata sa KA podeljenih po polu *-ispitivani uzorak je u Hardy-Weinberg-ovoj ravnoteži; #-pacijenti oba pola kao i muškarci u kontrolnoj grupi nisu u Hardy-Weinberg-ovoj ravnoteži U tabeli 4.8. predstavljene su relativne uĉestalosti genotipova i alela polimorfizama A/G -1332 u genu za ATR2 u kontrolnoj grupi i grupi pacijenata sa KA podeljenih po polu. Kod ţena nije zabeleţena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova i alela spomenutog polimorfizma. Uoĉena je veća uĉestalost genotipa GG polimorfizma A/G -1332 kod pacijentkinja sa KA u poreĊenju sa kontrolnom populacijom. Genotip Kontrole Pacijenti p ATR2 n (%) n (%) (χ2) A/G -1332 Genotip Kontrole Pacijenti p ATR2 n (%) n (%) (χ2) A/G -1332 Muškarci # Ţene *# (A/ _ ) 61 (57.55) 178 (54.94) ns ( G/ _ ) 45 (42.45) 146 (45.06) Ukupno 106 324 Alel A 0.58 0.55 ns Alel G 0.42 0.45 AA 31 (30.69) 58 (32.04) AG 53 (52.48) 76 (41.99) ns GG 17 (16.83) 47 (25.97) Ukupno 101 181 Alel A 0.57 0.53 ns Alel G 0.43 0.47 Rezultati 69 4.2.2. Polimorfizmi DNK u genima za ACE (I/D), ATR1 (A1166C) i ATR2 (A/G -1332) u odnosu na tip aterosklerotskog plaka i klinički dogaĎaj 4.2.2.1. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na tip plaka Razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma I/D u genu za ACE prema fenotipu plaka kod ukupnog broja pacijenata sa karotidnom aterosklerozom i kod ţena nije bila statistiĉki znaĉajna. Tabela 4.9. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE kod pacijenata muškog pola u odnosu na tip aterosklerotskog plaka (SAP i NAP) Polimorfizam SAP n (%) NAP n (%) p ACE (I/D) II 21 (11.93) 91 (51.70) 64 (36.36) 19 (23.46) 38 (46.91) 24 (29.63) ns ID DD Alel I 0.38 0.62 0.47 0.53 p<0.05 Alel D Ukupno (n) 176 81 Grupisani genotip II 21 (11.93) 19 (23.46) p<0.05 ID+DD 155 (88.07) 62 (76.54) Podela pacijenata je izvršena prema tipu aterosklerotskog plaka:SAP-stabilni aterosklerotski plak, NAP- nestabilni aterosklerotski plak. Vrednosti su predstavljene brojĉano i procentualno- n (%). Statistiĉka analiza distribucije genotipova izmeĊu podgrupa pacijenata analizirana je Pearson-ovim χ 2 testom. ns- nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika U tabeli 4.9. prikazana je distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA prema tipu aterosklerotskog plaka kod muškaraca. Nije bilo statistiĉki znaĉajne razlika u distribuciji genotipova polimorfizma prema tipu aterosklerotskog plaka, ali je uoĉen trend razlike u distribuciji (p=0.06). Razlika u distribucija alela navedenog polimorfizma prema tipu aterosklerotskog plaka bila je Rezultati 70 statistiĉki znaĉajna (p=0.02). Alel I je statistiĉki zanaĉajno ĉešći u grupi muškaraca sa nestabilnim tipom plaka u odnosu na muškarce sa stabilnim. Po dominantnom modelu za alel D (II vs ID+DD) uoĉena je statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova navedenog polimorfima (p=0.02). Po recesivnom modelu za alel D (II+ID vs DD) nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u distribuciji genotipova (rezultat nije prikazan). Tabela 4.10. Odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka kod pacijenata muškog pola sa karotidnom aterosklerozom u odnosu na genotipove polimorfizma I/D u genu za ACE Model polimorfizma Nekorigo vani OR 95 % CI p Korigo vani OR 95 % CI p ACE (I/D) ID+DD vs II 2.26 1.13-4.51 p< 0.05 2.52 1.23-5.16 p< 0.05 Vrednosti odnosa šansi prikazane su kao OR sa 95% CI U tabeli 4.10 prikazani su rezultati regresione analize koji ukazuju da su nosioci genotipa II polimorfizma I/D u genu za ACE imali 2.52 puta veći odnos šansi a formiranje nestabilnog plaka u odnosu na muškarce nosioce genotipova ID i DD nezavisno od faktora rizika: dob, pušenje i hipertenziju (p<0.05). 4.2.2.2. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na cerebrovaskularni insult (šlog) Nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u distribuciji genotipova i alela polimorfizma I/D u genu za ACE u odnosu na cerebrovaskularni insult kod ukupnog broja pacijenata sa KA, a ni kod pacijenata podeljenih po polu. Rezultati 71 4.2.2.3. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog događaja (TIA) Razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma I/D u genu za ACE u odnosu na prolazni ishemijski dogaĊaj nije bila statistiĉki znaĉajna kod ukupnog broja pacijenata i pacijenata ţenskog pola. Tabela 4.11. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE kod pacijenata muškog pola u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja Polimorfizam Bez prolaznog ishemijskog dogaĊaja n (%) Sa prolaznim ishemijskim dogaĊajem n (%) p ACE (I/D) II 41 (17.52) 124 (52.99) 69 (29.49) 8 (12.31) 27 (41.54) 30 (46.15) p<0.05 ID DD Alel I 0.44 0.56 0.33 0.67 p<0.05 Alel D Ukupno (n) 234 65 Grupisani genotip II+ID 165 (70.51) 69 (29.49) 35 (53.85) 30 (46.15) p<0.05 DD U tabeli 4.11. prikazane su relativne frekvencije genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE kod pacijenata muškog pola u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja. Razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma I/D u genu za ACE kod muškaraca bila je statistiĉki znaĉajna (p=0.04, p=0.01; prvo navedeno, drugo navedeno). Alel D bio je statistiĉki znaĉajno ĉešći u grupi muškaraca koji su imali prolazni ishemijski dogaĊaj u odnosu na muškarce koji nisu. Po recesivnom modelu za alel D (DD vs II+ID) uoĉena je statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova izmeĊu pacijenata koji nisu i koji jesu imali prolazni ishemijski dogaĊaj (p=0.01). Rezultati 72 Tabela 4.12. Odnos šansi za prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja kod pacijenata muškog pola sa karotidnom aterosklerozom, u odnosu na genotipove polimorfizma I/D u genu za ACE Model polimorfizma Nekorigova ni OR 95% CI p Korig ovani OR 95% CI p ACE (I/D) II+ID vs DD 2.05 1.16-3.61 p<0.05 2.22 1.24-4.00 p<0.05 Vrednosti odnosa šansi prikazane su kao OR sa 95% CI. U tabeli 4.12. prikazani su rezultati regresione analize koji pokazuju da su po recesivnom modelu za alel D nosioci DD genotipa imali 2.22 puta veći odnos šansi za nastanak prolaznog ishemijskog dogaĊaja nezavisno od faktora rizika: dob, pušenje i hipertenzija (p<0.05). 4.2.2.4. Distribucija genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku Nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma I/D u genu za ACE u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku. Rezultati 73 4.2.2.5. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) Tabela 4.13. Distribucija genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1 u grupi pacijenata u odnosu na tip aterosklerotskog plaka Polimorfizam SAP n (%) NAP n (%) p ATR1 (A1166C) AA 175 (58.72) 102 (34.23) 21 (7.05) 50 (44.25) 51 (45.13) 12 (10.62) p<0.05 AC CC Alel A 0.76 0.24 0.66 0.34 p<0.05 Alel C Ukupno (n) 298 113 Grupisani genotip AA 175 (58.72) 123 (41.28) 50 (44.25) 63 (55.75) p<0.05 AC+CC Podela pacijenata je izvršena prema tipu aterosklerotskog plaka: SAP-stabilni aterosklerotski plak, NAP- nestabilni aterosklerotski plak. Vrednosti su predstavljene brojĉano i procentualno- n (%); statistiĉka analiza distribucije genotipova izmeĊu podgrupa pacijenata utvrĊena je Pearson-ovim χ 2 testom. U tabeli 4.13. prikazana je distribucija genotipova i alela polimorfizma A1166C u genu za ATR1 kod pacijenata sa KA prema fenotipu plaka. Razlika u distribuciji genotipova polimorfizma A1166C bila je statistiĉki znaĉajna (p=0.03). UtvrĊena je znaĉajna razlika i u distribuciji alela polimorfizma A1166C u genu za ATR1. Alel C je statistiĉki znaĉajno ĉešći kod pacijenata sa nestabilnim plakom, u odnosu na pacijente sa stabilnim aterosklerotskim plakom (p=0.002). Rezultati 74 Tabela 4.14. Odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka kod pacijenata sa karotidnom aterosklerozom u odnosu na genotipove polimorfizma A1166C u genu za ATR1 Model polimorfizma Nekorigovan i OR 95% CI p Korigo vani OR 95% CI p ATR1 (A1166C) AA vs AC+CC 1.77 1.14-2.74 p<0.05 1.94 1.18- 3.20 p<0.0 5 Vrednosti odnosa šansi prikazane su kao OR sa 95% CI. U tabeli 4.14. prikazani su rezultati regresione analize gde je pokazano da su nosioci genotipova koji sadrţe alel C po dominatnom modelu za alel C (AC+CC vs AA) imali 1.77 puta veći odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka (p=0.01). Posle korekcije na faktore rizika i biohemijske parametre koji su se razlikovali izmeĊu fenotipa stabilnog i nestabilnog plaka (pol, dob, hipertenziju, pušenje, broj trombocita) ta vrednost ostala je statistiĉki znaĉajna (OR=1.94, CI 95 % (1.18-3.20), p=0.009). Tabela 4.15. Distribucija genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1 u grupi pacijenata muškog pola u odnosu na tip aterosklerotskog plaka Polimorfizam SAP n (%) NAP n (%) p ATR1 (A1166C) AA 103 (58.19) 59 (33.33 15 (8.47) 37 (45.68) 36 (44.44) 8 (9.88) ns AC CC Alel A 0.75 0.25 0.68 0.32 p<0.05 Alel C Ukupno (n) 177 81 Grupisani genotip AA 103 (58.19) 74 (41.81) 37 (45.68) 44 (54.32) ns AC+CC U tabeli 4.15. prikazana je distribucija genotipova kod pacijenata muškog pola prema fenotipu plaka kod muškaraca. Razlika u distribuciji genotipova polimorfizma A1166C nije bila statistiĉki znaĉajna, ali je ipak registrovana veća uĉestalost genotipa CC kod pacijenata sa nestabilnim plakom. Alel C bio je ĉešći kod pacijenata sa nestabilnim Rezultati 75 plakom, u odnosu na pacijente sa stabilnim aterosklerotskim plakom i ta vrednost je bila statistiĉki znaĉajna (p=0.04). Po dominantnom modelu za alel C (AA vs AC+CC) nije uoĉena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova izmeĊu pacijenata sa razliĉitim tipom aterosklerotskog plaka (p=0.06). Odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka po ovom modelu kod muškaraca bio je 1.66 puta veći, ali ta vrednost nije bila dostizala statistiĉku znaĉajnost (p=0.06). Po recesivnom modelu za alel C (AA vs AC+CC) nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova za nastanak nestabilnog aterosklerotskog plaka. Tabela 4.16. Distribucija genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1 u grupi pacijenata ţenskog pola u odnosu na tip aterosklerotskog plaka Polimorfizam SAP n (%) NAP n (%) p ATR1 (A1166C) AA 72 (59.50) 43 (35.54) 6 (4.96) 13 (40.63) 15 (46.88) 4 (12.50) ns AC CC Alel A 0.77 0.23 0.64 0.36 p<0.05 Alel C Ukupno (n) 121 32 Grupisani genotip AA 72 (59.50) 49 (40.50) 13 (40.63) 19 (59.38) ns AC+CC U tabeli 4.16. prikazana je distribucija genotipova kod pacijenata sa KA prema fenotipu plaka kod ţena. Razlika u distribuciji genotipova polimorfizma A1166C nije bila statistiĉki znaĉajna. Uoĉena je veća frekvencija alela C kod ţena pacijenata sa nestabilnim aterosklerotskim plakom (p=0.01). Po dominantnom modelu za alel C (AA vs AC+CC) registrovana je veća frekvencija alela C kod pacijentkinja sa nestabilnim plakom, ali ta vrednost nije dostigla statistiĉku znaĉajnost (p=0.055). Rezultati 76 Tabela 4.17. Odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka kod pacijenata ţenskog pola u odnosu na genotipove polimorfizma A1166C u genu za ATR1 U tabeli 4.17. prikazani su rezultati regresione analize gde je pokazano da su ţene nosioci heterozigota imali 1.9 veći odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka u odnosu na nosioce genotipa AA, a nosioci genotipa CC 3.7 puta veći odnos šansi za formiranje nestabilnog aterosklerotskog plaka AA (p=0.03). Posle korekcije na faktore rizika i biohemijske parametre koji su se razlikovali izmeĊu fenotipa stabilnog i nestabilnog plaka kod ţena (dob, hipertenziju, pušenje, nivo plazminogena i PAI) ta vrednost je ostala statistiĉki znaĉajna respektivno (OR=2.60 CI 95% (1.04-6.53); OR=6.78 CI 95% (1.07-42.66) (p=0.04). UtvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji alela analiziranog polimorfizma, tako da su nosioci alela C imali 1.9 puta veći odnos šansi za formiranje nestabilnog aterosklerotskog plaka (p=0.03). Po dominatnom modelu nasleĊivanja za alel C (AA vs AC+CC) nosioci genotipova koji sadrţe alel C imali su 2.15 puta veći odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka. Dobijna vrednost bila je na granici statistiĉke znaĉajnosti (p=0.056). Posle korekcije na faktore rizika i biohemijske parametre koji se razlikuju izmeĊu fenotipa stabilnog i nestabilnog plaka kod ţena (dob, hipertenziju, pušenje, nivo plazminogena i PAI) ta vrednost nije bila statistiĉki znaĉajna. Po recesivnom modelu za alel C nije utvrĊeno da postoji statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova. Polimorfizam Nekorigov ani OR 95% CI p Korigov ani OR 95% CI p ATR1 (A1166C) AA Referentni genotip AC 1.93 1.04-3.55 p<0 .05 2.60 1.04-6.53 p<0.0 5 CC 3.71 1.09-12.63 6.78 1.07-42.66 Alel A Referentni alel p<0 .05 Alel C 1.91 1.05-3.45 Grupisani genotip AA vs AC+CC 2.15 0.97-4.78 ns 3.27 0.94-11.37 ns Rezultati 77 4.2.2.6. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na cerebrovaskularni insult (šlog) Nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u distribuciji genotipova i alela polimorfizma A1166C u odnosu na šlog kod ukupnog broja pacijenata, a ni kod pacijenata podeljenjih po polu. 4.2.2.7. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog događaja (TIA) Razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma A1166C u genu za ATR1 u odnosu na prolazni ishemijski dogaĊaj nije bila statistiĉki znaĉajna ni u ukupnom broju pacijenata niti podeljenih po polu. 4.2.2.8. Distribucija genotipova polimorfizma A1666C u genu za ATR1 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku Tabela 4.18. Distribucija genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1 u grupi pacijenata u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku Polimorfizam Odsustvo ulceracije n (%) Prisustvo ulceracije n (%) p ATR1 (A1166C) AA 237 (55.63) 157 (36.85) 32 (7.51) 30 (43.48) 32 (46.38) 7 (10.14) ns AC CC Alel A 0.74 0.26 0.67 0.33 p<0.05 Alel C Ukupno (n) 426 69 Grupisani genotip AA 237 (55.63) 189 (44.37) 29 (43.48) 39 (56.52) ns AC+CC U tabeli 4.18. prikazane su relativne frekvencije genotipova DNK polimorfizma u A1166C u genu za ATR1 u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku. Nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova analiziranog polimorfizma u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku. Uoĉena je Rezultati 78 veća frekvencija alela C kod pacijenata sa ulceracijom i ta vrednost je bila statistiĉki znaĉajna (p=0.03). Po dominantnom modelu za alel C (AA vs AC+CC) nije primećena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova. 4.2.2.9. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) Podela grupe pacijenata je izvršena prema tipu aterosklerotskog plaka:SAP-stabilni aterosklerotski plak, NAP-nestabilni aterosklerotski plak. Vrednosti su predstavljene brojĉano i procentualno- n (%). Obzirom na to da ţene imaju dve kopije X hromozoma, one su nosioci G alela u homozigotnom i heterozigotnom stanju pa su u populaciji prisutna sva tri genotipa; AA, AG i GG. S druge strane kod muškaraca je prisutna samo jedna kopija X hromozoma, stoga su oni hemizigoti (A- ili G-navedeno u zagradi). Analiza distribucije genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na tip plaka nije utvrdila statistiĉki znaĉajnu razliku. Tabela 4.19. Relativne frekvencije genotipova polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na prisustvo/odsustvo/alela -1332 G u grupi pacijenata ATR2 (A/G-1332) Ţene Muškarci Ukupno n (%) n (%) n Alel A/ _ 45 (29.41) 139 (53.88) 184 Alel G/ _ 108 (70.59) 119 (46.12) 227 Ukupno 153 (100 %) 258 (100%) 411 U tabeli 4.19. prikazane su relativne frekvencije genotipova polimorfizma u genu za ATR2 u odnosu na prisustvo/odsustvo/alela -1332 G u grupi pacijenata ukupno i po polu. U grupi pacijenata sa KA alel G bio je ĉešći kod ţena (ţene su nosioci genotipova GG i AG) u poreĊenju sa muškarcima (muškarci su nosioci genotipaa GG). Rezultati 79 4.2.2.10. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na cerebrovaskularni insult (šlog) Nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 kod ţena koje su imale šlog u odnosu na one koje nisu. Tabela 4.20. Distribucija hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na cerebrovaskularni insult kod muškaraca Polimorfizam Bez CVI n (%) sa CVI n (%) p ATR2 (A/G -1332) AA (A/ _ ) GG (G/ _ ) 135 (60.00) 90 (40.00) 31 (42.47) 42 (57.53) p<0.05 Ukupno (n) 225 73 U tabeli 4.20. prikazane su distribucije genotipova i alela polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na cerebrovaskularni insult. Uoĉena je veća procentualna zastupljenost hemizigota G/ _ kod pacijenata koji su imali šlog. Razlika u uĉestalosti genotipova bila je statistiĉki znaĉajna (p=0.009). Tabela 4.21. Odnos šansi za cerebrovaskularni dogaĊaj kod pacijenata muškog pola sa KA u odnosu na hemizigote polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 Model polimorfizma Nekorigo vani OR 95% CI p Korigo vani OR 95% CI p ATR2 (A/G -1332) G/ _ 2.03 2.03 (1.19- 3.48) p<0.05 2.67 1.05- 6.76 p<0.0 5 Vrednosti odnosa šansi su predstavljene kao OR sa 95 % CI U tabeli 4.21. prikazan je odnos šansi za cerebrovaskularni dogaĊaj kod pacijenata sa KA u odnosu na hemizigote polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 genu. Muškarci hemizigotni nosioci G/ _ imali su 2.03 puta veći rizik za CVI (OR=2.03, CI 95 % 1.19- 3.48) (p=0.009). Posle korekcije na faktore rizika i biohemijske parametre koji odstupali izmeĊu pacijenata koji nisu i koji jesu imali šlog (dob, hipertenziju, pušenje, nivo Rezultati 80 ApoA1, nivo DDdimera, triglicerida i broj leukocita) muškarci su imali 2.7 puta veći odnos šansi za šlog (OR=2.67, CI 95 % 1.05- 6.76, p=0.04) 4.2.2.11. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog događaja (TIA) Tabela 4.22. Distribucija genotipova polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata ţenskog pola u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja Polimorfizam Bez prolaznog ishemijskog dogaĊaja n (%) Sa prolaznim ishemijskim dogaĊajem n (%) p ATR2 (A/G -1332) AA 49 (28.99) 73 (43.20) 47 (27.81) 14 (32.56) 21 (48.84) 8 (18.60) ns AG GG Alel A 0.51 0.49 0.57 0.43 ns Alel G Ukupno (n) 169 43 Grupisani genotip AA 49 (28.99) 120 (71.01) 14 (32.56) 29 (67.44) ns AG+GG U tabeli 4.22. prikazane su relativne frekvencije genotipova polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 kod pacijentkinja u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja. Razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 kod pacijentkinja nije bila statistiĉki znaĉajna. Nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova po dominantnom modelu za alel G (AA vs AG+GG) u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja, ni po recesivnom modelu za alel G (AA+AG vs GG) (rezultat nije prikazan). Rezultati 81 Tabela 4.23. Distribucija hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu AGTR2 u grupi pacijenata muškog pola u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja Polimorfizam Bez prolaznog ishemijskog dogaĊaja n (%) Sa prolaznim ishemijskim dogaĊajem n (%) p ATR2 (A/G -1332) AA (A/ _ ) GG (G/ _ ) 130 (56.03) 102 (43.97) 36 (54.55) 30 (45.45) ns Ukupno (n) 232 66 U tabeli 4.23. prikazane su relativne frekvencije hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu ATR2 kod pacijenata muškog pola u odnosu na prisustvo prolaznog ishemijskog dogaĊaja. Razlika u distribuciji polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u muškom polu nije bila statistiĉki znaĉajna. 4.2.2.12. Distribucija genotipova i hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata sa KA u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku Nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova i alela polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku kod ţena. Rezultati 82 Tabela 4.24. Distribucija hemizigota polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u grupi pacijenata muškog pola u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku Polimorfizam Odsustvo ulceracije n (%) Prisustvo ulceracije n (%) p ATR2 (A/G -1332) (A/ _ ) (G/ _ ) 130 (52.42) 118 (47.58) 34 (68.00) 16 (32.00) p<0.05 Ukupno (n) 248 50 U tabeli 4.24. prikazane su relativne frekvencije hemizigota DNK polimorfizma A/G - 1332 u genu za ATR2 u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku. UtvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova i alela ispitivanog polimorfizma u odnosu na prisustvo ulceracije u aterosklerotskom plaku kod muškaraca (p=0.04, p<0.05; prvo navedeno, drugo navedeno). Muškarci hemizigoti A/_ bili su statistiĉki znaĉajno ĉešći u grupi pacijenata sa ulceracijom u aterosklerotskom plaku. Tabela 4.25. Odnos šansi za prisustvo ulceracije kod muškaraca pacijenata sa karotidnom aterosklerozom, u odnosu na hemizigote polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 Model polimorfizma Nekori govani OR 95% CI p Korigova ni OR 95% CI p ATR2 (A/G -1332) A/ _ 1.93 1.01-3.68 0.0 5 2.03 1.02-4.03 p<0.05 Vrednosti odnosa šansi su predstavljene kao OR sa 95 % CI U tabeli 4.25. prikazan je odnos šansi za prisustvo ulceracije kod pacijenata sa aterosklerozom karotida, u odnosu na hemizigote polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2. Muškarci nosioci hemizigota A/_ imali su 1.9 puta veći odnos šansi za nastanak ulceracije (p=0.045). Posle korekcije na faktore rizika (dob, pušenje i hipertenziju) ta vrednost je ostala statistiĉki znaĉajna (p=0.04). Rezultati 83 4.3. ANALIZA EKSPRESIJE iRNK ZA KOMPONENTE RAS I REGULATORNE MIR-155 U TKIVU KAROTIDNOG ATEROSKLEROTSKOG PLAKA U analiziranom uzorku kao endogene kontrole analizirani su geni: gliceraldehid fosfat dehidrogenaza (GAPDH) i gen za 18S rRNK. Od dve analizirane, za normalizaciju rezulatata relativne ekspresije ciljnih gena, iskorišćena je ona endogena kontrola koja je stabilnije eksprimirana unutar i izmeĊu ispitivanih grupa pacijenata i kontrola. Za dalju analizu je odabrana 18S rRNK koja je korišćena u normalizaciji rezulatata za analizu ekspresije gena RAS sistema (ACE, ACE2, ATR1, ATR2, kolektrin (TMEM27). Tabela 4.26. Uzorci u kojima je uspešno detektovana iRNK za gene RAS kod pacijenata sa KA Ukupno n (100 %) ACE ACE2 ATR1 TMEM27 61 (100 %) 61 (100.00) 26 (42.62) 23 (37.70) * 61(100.00) Muškarci/ Ţene n (%) 42(68.85)/ 19 (31.15) 17(27.87)/ 9(14.75) 13 (21.31)/ 8 (13.11) 42(68.85)/19 (31.15) *U analizi ekspresije gena za ATR1 dva uzorka u kojima je detektovana iRNK za ATR1 su izbaĉeni jer su dobijene vrednosti ekspresije znaĉajno odstupale od ostalih dobijenih vrednosti ekspresije gena za ovaj receptor. U tabeli 4.26. prikazan je broj i procenat uzoraka u kojima je uspešno detektovan ekspresioni nivo gena RAS sistema. Ekspresioni nivo iRNK za ACE i TMEM27 je uspešno detektovan u svim uzorcima. Ekspresija iRNK za ACE2 je detektovana i analizirana u 26 uzoraka (42.62 %), a iRNK za ATR1 u 23 (37.70 %). Rezultati 84 Tabela 4.27. Broj i procenat uzoraka u kojima uspešno detektovana i analizirana iRNK za komponente RAS ukrštenih meĊusobno. n (%) ACE ACE2 ATR1 TMEM27 ACE - 26 (42.62) 21 (34.43) 61 (100.00) ACE2 26 (42.62) - 11 (42.31) 26 (100.00) ATR1 21 (34.43) 11 (47.83) - 21 (34.43) TMEM27 61 (100.00) 26 (42.62) 21 (34.43) - U tabeli 4.27. prikazan je broj i procenat uzoraka u kojima je uspešno detektovan i analiziran ekspresioni nivo gena RAS sistema. Za ACE i TMEM27 procentualni uĉinak analizirane ekspresije je bio 100 % i iRNK za ove gene je detektovana i analizirana u svim uzorcima (n=61), dok je za ACE2 i ATR1 taj broj, odnosno procenat iznosio 26 (42.62 %) za ACE2 i 21 (34.43%) za ATR1. Relativni odnos ekspresije iRNK za ACE i ACE2 (ACE/ACE2), je analiziran u uzorcima tkiva plaka u kojima je uspešno detektovan i analiziran ekspresioni nivo iRNK za ACE2. Rezultati 85 4.3.1. Ekspresija iRNK za angiotenzin-konvertujući enzim (ACE) u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka 4.3.1.1. Relativni nivoi iRNK za ACE Grafik 4.1. Ekspresija iRNK za ACE normalizovana na 18S RNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) u kontrolnom tkivu arterije (n=2) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka (n=61). Prikazana je srednja vrednost ±standardna greška; ***znaĉajna razlika (***p<0.05, REST Software, QIAGEN). Ekspresija iRNK za ACE 2 -  C T K on tr ol na a rt er ija P la k 0.0 0.5 1.0 1.5  Na grafiku 4.1. predstavljena je ekspresija iRNK za ACE u tkivu kontrolne arterije (komercijalno tkivo arterije bez znakova ateroskleroze) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka. Ekspresioni nivo iRNK za ACE bio je statistiĉki znaĉajno niţi u karotidnim karotidnom aterosklerotskom plaku u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije. Rezultati 86 Grafik 4.2. Ekspresija iRNK za ACE normalizovana na 18S rRNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) kod muškaraca u tkivu kontrolne arterije (n=2) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka (n=42). Prikazane su srednje vrednosti ±standardna greška; ** znaĉajna razlika (**p=0.001, REST Software, QIAGEN). Ekspresija iRNK za ACE Muškarci 2 -  C T K on tr ol na a rt er ija P la k 0.0 0.5 1.0 1.5  Na grafiku 4.2. predstavljena je ekspresija iRNK za ACE u tkivu kontrolne arterije (komercijalno tkivo arterije bez znakova ateroskleroze) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka kod muškaraca. Nivo ekspresije iRNK za ACE bio je statistiĉki znaĉajno manje eksprimiran u karotidnim karotidnom aterosklerotskom plaku u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije. Rezultati 87 Grafik 4.3. Ekspresija iRNK za ACE normalizovana na 18S rRNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) kod ţena u tkivu kontrolne arterije (n=2) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka (n=19). Prikazane su srednje vrednosti ±standardna greška. ** znaĉajna razlika) (**p=0.001, REST Software, QIAGEN). Ekspresija iRNK za ACE Žene 2 -  C T K on tr ol na a rt er ija P la k 0.0 0.5 1.0 1.5  Na grafiku 4.3. predstavljena je ekspresija iRNK za ACE u tkivu kontrolne arterije (komercijalno tkivo arterije bez znakova ateroskleroze) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka kod ţena. Nivo ekspresije iRNK za ACE bio je statistiĉki znaĉajno manje eksprimiran u karotidnim karotidnom aterosklerotskom plaku u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije. Rezultati 88 4.3.1.2. Ekspresija iRNK za ACE u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) Ekspresija iRNK za ACE normalizovana na 18S rRNK u stabilnim (SAP) i nestabilnim karotidnim plakovima (NAP) nije se statistiĉki znaĉajno razlikovala u celom ispitivanom uzorku (SAP, n=45 i NAP, n=16; p=0.53, Mann-Whitney U-test); ni podeljenom po polu (muškarci: SAP, n=29 i NAP, n=13; p=0.51, Mann-Whitney U- test; ţene: SAP, n=16 i NAP, n=3; p=0.29, Unpaired t test with Welch's correction). 4.3.1.3. Ekspresija iRNK za ACE u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka u odnosu na genotip polimorfizma I/D u genu za ACE Ekspresija iRNK za ACE normalizovana na 18S rRNK u odnosu na genotip polimorfizma I/D u genu za ACE u karotidnim aterosklerotskim plakovima se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala u celom ispitivanom uzorku (II,n=16, ID, n=29, DD,n=16; p=0.91, Kruskal Waliss ANOVA), ni podeljenom po polu (muškaraci: II, n=11, ID, n=21, DD, n=10; p=0.74, Kruskal Waliss ANOVA; ţene: II, n=5, ID, n=8, DD, n=6; p=0.76, Kruskal Waliss ANOVA). Rezultati 89 4.3.2. Ekspresija iRNK za angiotenzin-konvertujući enzim homolog (ACE2) u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka 4.3.2.1. Relativna kvantifikacija ekspresije gena za ACE2 Grafik 4.4. Ekspresija iRNK za ACE2 normalizovana na 18S rRNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) kod muškaraca u kontrolnom tkivu arterije (n=2) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka (n=17). Prikazane su srednje vrednosti±standardna greška; * znaĉajna razlika (*p=0.046, REST Software, QIAGEN). Ekspresija iRNK za ACE2 Muškarci 2 -  C T K on tr ol na a rt er ija P la k 0.0 0.5 1.0 1.5  Na grafiku 4.4. predstavljena je ekspresija iRNK za ACE2 u tkivu kontrolne arterije (komercijalno tkivo arterije bez znakova ateroskleroze) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka kod muškaraca. Informaciona RNK za ACE2 je bila statistiĉki znaĉajno manje eksprimirana u karotidnim aterosklerotskim plakovima u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije. Rezultati 90 Grafik 4.5. Ekspresija iRNK za ACE2 normalizovana na 18S rRNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) kod ţena u tkivu kontrolne arterije (n=2) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka kod ţena (n=9). Prikazane su srednje vrednosti ±standardna greška. *znaĉajna razlika (*p=0.037, REST Software, QIAGEN) Ekspresija iRNK za ACE2 Žene 2 -  C T K on tr ol na a rt er ija P la k 0.0 0.5 1.0 1.5  Na grafiku 4.5. predstavljena je ekspresija iRNK za ACE2 u tkivu kontrolne arterije (komercijalno tkivo arterije bez znakova ateroskleroze) i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka kod ţena. Ekspresija iRNK za ACE2 bila je statistiĉki znaĉajno manje eksprimirana u karotidnim aterosklerotskim plakovima u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije. Rezultati 91 4.3.2.2. Ekspresija iRNK za ACE2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) Ekspresija iRNK za ACE2 normalizovana na 18S rRNK u stabilnim (SAP) i nestabilnim karotidnim aterosklerotskim plakovima (NAP) kod muškaraca se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala (SAP,n=11, NAP,n=6; p=0.88,Unpaired t-test with Welch's correction). Grafik 4.6. Ekspresija iRNK za ACE2 normalizovana na 18S rRNK u stabilnim (SAP) i nestabilnim karotidnim aterosklerotskim plakovima (NAP) kod ţena. SAP (n=8), NAP (n=1); prikazane su srednje vrednosti ±standardna greška *znaĉajna razlika (**p=0.011, REST Software, QIAGEN). Ekspresija iRNK za ACE2 Žene 2 - C T (* 1 0 0 0 0 0 0 0 ) S A P N A P 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0  Na grafiku 4.6. predstavljena je ekspresija iRNK za ACE2 u stabilnim (SAP) i nestabilnim (NAP) aterosklerotskim plakovima kod ţena. Nivo ekspresije iRNK za ACE2 bio je statistiĉki znaĉajno više eksprimiran u tkivu nestabilnog aterosklerotskog plaka u poreĊenju sa tkivom stabilnog aterosklerotskog plaka. Rezultati 92 Grafik 4.7. Ekspresija iRNK za ACE i ACE2 u tkivu karotidnog plaka normalizovana na 18S rRNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) kod muškaraca u uzorcima tkiva aterosklerotskog plaka u kojima je uspešno detektovana ekspresija iRNK za ACE2. (n=17); prikazane su srednje vrednosti ± standardna greška; *znaĉajna razlika (*p<0.05, Unpaired t test with Welch's correction). Ekspresija iRNK za ACE i ACE2 u tkivu plaka Muškarci A C E A C E 2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8  2 -  C T Na grafiku 4.7. predstavljen je relativni nivo ekspresije ACE i ACE2 u karotidnom aterosklerotskom plaku kod muškaraca. Nivo ekspresije iRNK za ACE i ACE2 u karotidnom aterosklerotskom plaku se u muškom polu statistiĉki znaĉajno razlikovao. Nivo ekspresije iRNK za ACE2 je u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka bio statistiĉki znaĉajno veći u poreĊenju sa nivoom ekspresije iRNK za ACE. Rezultati 93 Grafik 4.8. Ekspresija iRNK za ACE i ACE2 u tkivu karotidnog plaka normalizovana na 18S rRNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) kod ţena u uzorcima tkiva aterosklerotskog plaka u kojima je uspešno detektovana ekspresija iRNK za ACE2 (n=9); prikazane su srednje vrednosti ± standardna greška *znaĉajna razlika (*p=0.04, Unpaired t test with Welch's correction). Ekspresija iRNK za ACE i ACE2 u tkivu plaka Žene A C E A C E 2 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5  2 -  C T Na grafiku 4.8. predstavljen je relativni nivo ekspresije ACE i ACE2 u karotidnom aterosklerotskom plaku kod ţena. Nivo ekspresije iRNK za ACE2 u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka bio je statistiĉki znaĉajno veći u poreĊenju sa nivoom ekspresije iRNK za ACE. Rezultati 94 4.3.3. Relativni odnos eskpresije iRNK za ACE i ACE2 u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka Grafik 4.9. Relativni odnos eskpresije iRNK za ACE i ACE2 u tkivu plaka normalizovan na 18S rRNK i kalibrator (kontrolno tkivo arterije) kod muškaraca (n=17) i ţena (n=9) vs kontrolno tkivo arterije. Prikazane su srednje vrednosti±standardna greška; *znaĉajna razlika; ns– nije utvrĊena statistiĉki znaĉajne razlike (p<0.05, Bonferroni's Multiple Comparison Test). Relativni odnos eskpresije iRNK za ACE i ACE2 u tkivu plaka K on tr ol na a rt er ija M uš ka rc i Že ne 0.0 0.5 1.0 1.5   ns A C E /A C E 2 Na grafiku 4.9. predstavljen je relativni odnos ekspresije iRNK za ACE i ACE2 u tkivu karotidnog plaka. Relativni odnos ekspresije iRNK (ACE/ACE2) u odnosu na kontrolno tkivo arterije bio je statistiĉki znaĉajno niţi i to 3.4 kod muškaraca odnosno 2.7 puta kod ţena. Relativni odnos ekspresije iRNK za ACE/ACE2 je kod ţena u poreĊenju sa muškarcima bio viši, ali ta razlika nije bila statistiĉki znaĉajna. Rezultati 95 4.3.4. Ekspresija iRNK za kolektrin (TMEM27) u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka 4.3.4.1. Relativni nivoi iRNK za kolektrin (TMEM27) u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) Ekspresija iRNK za kolektrin normalizovana na 18S rRNK u stabilnim (SAP) i nestabilnim karotidnim aterosklerotskim plakovima (NAP) nije se statistiĉki znaĉajno razlikovala kod muškaraca (SAP, n=29 i NAP, n=13; p=0.24, Mann-Whitney U test), ni kod ţena (SAP, n=16 i NAP, n=3; p=1.00, Mann-Whitney U test). 4.3.5. Ekspresija iRNK za ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima 4.3.5.1. Relativni nivoi iRNK za ATR1 u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) Ekspresija iRNK za ATR1 normalizovana na 18S rRNK u stabilnim (SAP) i nestabilnim (NAP) karotidnim aterosklerotskim plakovima se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala u ukupnom ispitivanom uzorku (SAP,n=15, NAP,n=6; p=0.97, Mann- Whitney U test) ni podeljenom po polu (muškarci: SAP, n=8 i NAP, n=5; p=0.81, Unpaired t-test with Welch's correction; ţene: SAP, n=7 i NAP, n=1; p=1.00, Mann- Whitney U test). 4.3.5.2. Ekspresija iRNK za ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 Ekspresija iRNK za ATR1 normalizovana na 18S rRNK u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 (AA vs AC vs CC) nije se statistiĉki znaĉajno razlokovala u celom ispitivanom uzorku (AA, n=8, AC, n=11, CC n=2; p=0.62, Kruskal Waliss ANOVA) ni podeljenom po polu (muškaraci: AA Rezultati 96 n=4, AC n=7, CC n=2; p=0.69, One Way ANOVA-Bonferroni's Multiple Comparison Test; ţene: AA n=4, AC n=4, ekspresioni nivo iRNK za ATR1 kod genotipa CC nije utvrĊen - CC n=0; p=0.56, Mann-Whitney U test). 4.3.6. Ekspresija miikroRNK miR-155 u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka 4.3.6.1. Relativni nivoi miR-155 u odnosu na tip plaka (SAP i NAP) Ekspresija miR-155 normalizovana na RNU44 se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala izmeĊu ţena i muškaraca (ţene, n=13 i muškarci, n=14; p=0.72, Mann-Whitney U test). Ekspresija miR-155 normalizovana na RNU44 u stabilnim (SAP) i nestabilnim karotidnim plakovima (NAP) se takoĊe nije statistiĉki znaĉajno razlikovala kako u celom ispitivanom uzorku (SAP, n=20 i NAP, n=7; p=0.36,Mann-Whitney U test), tako i u uzorku podeljenom po polu (muškarci: SAP n=9 i NAP n=5; p=0.24, Mann-Whitney U test; ţene: SAP n=11 i NAP n=2; p=0.86, Unpaired t-test with Welch' correction). Rezultati 97 Grafik 4.10. Ekspresija miR-155 normalizovana na RNU44 u stabilnim (SAP) i nestabilnim karotidnim plakovima (NAP) kod muškaraca. SAP (n=9), NAP (n=5); prikazane su srednje vrednosti ±standardna greška; (p=0.24, Mann-Whitney U test). Ekspresija miR-155 Muškarci S A P N A P 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2 - C T Na grafiku 4.10. predstavljena je ekspresija miR-155 u stabilnim (SAP) i nestabilnim (NAP) aterosklerotskim plakovima, kod muškaraca. Ekspresioni nivo miR-155 nije se statistiĉki znaĉajno razlikovao u odnosu na tip aterosklerotskog plaka. 4.3.6.2. Ekspresija miR-155 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 Ekspresija miR-155 normalizovana na RNU44 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 (AA vs AC vs CC) se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala u celom ispitivanom uzorku (AA n=10, AC n=11, CC n=6; p=0.37, Kruskal Waliss ANOVA) i kod muškaraca (AA n=7, AC n=5, CC n=2; p=0.75, Kruskal Waliss ANOVA). Rezultati 98 Grafik 4.11. Ekspresija miR-155 normalizovana na RNU44 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 (AA vs AC vs CC) kod ţena AA (n=3), AC (n=6), CC (n=4); prikazane su srednje vrednosti ±standardna greška. *znaĉajna razlika; ns–nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika; (*p=0.0429, One Way ANOVA- Dunnett's Multiple Comparison test, test, za poređenje između grupa u odnosu na referentni genotip AA). Ekspresija miR-155 AA vs AC vs CC Žene A A A C C C 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5  ns 2 - C T Na grafiku 4.11. predstavljen je ekspresioni nivo miR-155 u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod ţena, po genotipu polimorfizma A1166C u genu za ATR1. Ekspresioni nivo miR-155 statistiĉki se znaĉajno razlikovao izmeĊu genotipova AA i CC polimorfizma A1166C u genu za ATR1. Statistiĉki znaĉajna razlika u ekspresionom nivou miR-155 izmeĊu genotipova AA i AC nije registrovana. Rezultati 99 Grafik 4.12. Ekspresija miR-155 normalizovana na RNU44 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 (AA+AC vs CC) kod ţena. AA+AC (n=9), CC (n=4); prikazane su srednje vrednost±standardna greška; *znaĉajna razlika; (*p=0.0125, Unpaired t-test-two tailed). Ekspresija miR-155 AA + AC vs CC Žene A A +A C C C 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 2 - C T  Na grafiku 4.12. predstavljen je ekspresioni nivo miR-155 u karotidnim aterosklerotskim plakovima, po genotipu polimorfizma A1166C u genu za ATR1 (AA +AC vs CC). Ekspresioni nivo miR-155 se statistiĉki znaĉajno razlikovao izmeĊu genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1. 4.3.7. Ekspresija iRNK za ATR2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka Ekspresioni nivo iRNK za ATR2 u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka nije utvrĊen. Rezultati 100 4.4. EKSPRESIJA PROTEINA RAS 4.4.1. Ekspresija proteina ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima 4.4.1.1. Detekcija proteina ATR1 Western Blot-metodom P N N N N N N S S M 55 kDa ATR1 43 kDa β aktin Slika 4.3. Detekcija proteina ATR1 Western Blot-metodom u karotidnim aterosklerotskim plakovima (S- stabilan plak, N-nestabilan plak), P-pozitivna kontrola za ATR1–miometrijum, M-proteinski marker (PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder, Fermentas). UtvrĊena ekspresija ATR1 u ispitivanim tkivima je detektovana alkalnom fosfatazom. Na slici 4.3. predstavljena je ekspresija proteina ATR1 u ispitivanom tkivu aterosklerotskog plaka detektovanog Western Blot metodom. Rezultati 101 Grafik 4.13. Ekspresija proteina ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na fenotip plaka. Ukupno SAP (n=3), NAP (n=5) prikazane su srednje vrednosti±standardna greška; *znaĉajna razlika; (*p=0.048, Unpaired t test with Welch's correction). S A P N A P 0.0 0.1 0.2 0.3  A T R 1 /  a k ti n Na grafiku 4.13. predstavljena je ekspresija proteina ATR1 u ispitivanom tkivu KA u stabilnim (SAP) i nestabilnim (NAP) aterosklerotskim plakovima. Ekspresija proteina ATR1 bila je statistiĉki znaĉajno više eksprimirana u tkivu nestabilnog aterosklerotskog plaka Ekspresija proteina ATR1 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 nije se statistiĉki znaĉajno razlikovala u celom ispitivanom uzorku (AA n=4, AC+CC n=4, p=0.23, T-test-two tailed). Rezultati 102 4.4.2. Ekspresija proteina ATR2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima kod čoveka 4.4.2.1. Detekcija proteina ATR2 Western Blot-metodom M S S S N N N N N P 55 kDa ATR2 43 kDa β aktin Slika 4.4. Detekcija proteina ATR2 Western Blot-metodom u karotidnim aterosklerotskim plakovima 1-2 -(SAP-M), 3-(SAP-Ţ), 4-8-(NAP-M), 9-pozitivna kontrola za ATR2 –miometrijum, M-proteinski marker (PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder, Fermentas). Na slici 4.4. predstavljena je ekspresija proteina ATR2 u ispitivanom tkivu aterosklerotskog plaka detektovanog Western Blot metodom. Ekspresija proteina ATR2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na fenotip plaka kod muškaraca se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala (SAP n=2 i NAP n=5; p=0.14, T-test-two tailed). Ekspresija proteina ATR2 u plakovima se u odnosu na hemizigote polimorfizma A/G - 1332 u genu za ATR2 kod muškaraca nije statistiĉki znaĉajno razlikovala (A/- n=3 i G/- n=4; p=0.71, T-test-two tailed). Rezultati 103 4.4.3. Ekspresija proteina ACE2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima 4.4.3.1. Detekcija proteina ACE2 Western Blot-metodom S S N N N S S S 130 kDa ACE2 43 kDa β aktin Slika 4.5. Detekcija proteina ACE2 Western Blot-metodom u karotidnim aterosklerotskim plakovima. 1- 2 (SAP-Ţ), 3-(NAP-Ţ), 4-5-(NAP-M), 6-8 (SAP-M) M-proteinski marker (PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder, Fermentas). Na slici 4.5. predstavljena je ekspresija proteina ACE2 u ispitivanom tkivu aterosklerotskog plka detektovanog Western Blot metodom. Ekspresija proteina ACE2 u karotidnim aterosklerotskim plakovima u odnosu na fenotip plaka kod muškaraca se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala (SAP n=3 i NAP n=2; p=0.32, T-test-two tailed). 4.4.4. Ekspresija proteina ACE u karotidnim aterosklerotskim plakovima 4.4.4.1. Detekcija proteina ACE Western Blot-metodom S S S N N N S S M 195 kDa ACE Slika 4.6. Detekcija proteina ACE Western Blot-metodom u karotidnim aterosklerotskim plakovima 1-3 (SAP-M), 4-5-(NAP-M), 6-(NAP-Ţ), 7-8 (SAP-Ţ) –M-proteinski marker (PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder, Fermentas). Rezultati 104 Na slici 4.6. predstavljena je ekspresija proteina ACE u ispitivanom tkivu aterosklerotskog plaka detektovanog Western Blot metodom. Diskusija 105 5. DISKUSIJA Ateroskleroza je kompleksna, multifaktorijalna, progresivna, hroniĉna inflamatorna bolest zida arterijskih krvnih sudova u ĉijoj je osnovi poremećena homeostaza ćelija endotelijuma zida krvnog suda. Poremećaj homeostaze endotelijuma, uz prisustvo faktora rizika, dovodi do kontinuirane inflamacije (aktivacije imunog odgovora). Inflamacija ima kljuĉnu ulogu u svim fazama formiranja i rasta aterosklerotskog plaka. Hroniĉna inflamacija dovodi do tranzicije jednostavnih lezija u kompleksne aterosklerotske lezije (plakove) koje mogu dovesti do vrlo teških akutnih stanja kao što su šlog ili infarkt miokarda (Libby i sar., 2011). Lokalno aktivirani RAS ima vaţnu ulogu u promociji inflamatornog procesa tokom ateroskleroze (Jacoby i Rader, 2003; Sata i Fukuda, 2010). Ang II kao glavni efektorski peptid sistema koji sintetiše glavna enzimska komponenta aktivirajuće kaskade (ACE), aktivira proinflamatorne transkripcione faktore (NF-κB, AP-1, HIF-1) (Pueyo i sar., 2000; Touyz RM, 2005). Kako RAS sistem funkcioniše na nivou tkiva nezavisno od cirkulacije, ekspresioni odnos njegovih enzimskih komponenti (ACE/ACE2) u tkivu plaka bi mogao da ukaţe koji udeo kaskade sistema dominira u fenotipovima lezija pred endarteroktomiju. S druge strane aktivacija ATR2 moţe imati sliĉne (Louis i sar., 2011) ili suprotne efekte od onih koje ima aktivacija ATR1, a to su inhibicija proliferacije i migracije ćelija i apoptoza (Carey RM, 2005). MeĊutim, malo se zna o razlikama aktiviranog RAS sistema i nivoima ekspresije njegovih komponenti izmeĊu razliĉitih fenotipova ateroskleroze kod ĉoveka tokom progresije bolesti (Kaschina i sar, 2009). Studija koje su se bavile ispitivanjem nivoa ekspresije komponenti RAS sistema izmeĊu fenotipova stabilnih i nestabilnih karotidnih aterosklerotskih plakova kod ĉoveka gotovo i da nema. Konvencionalni faktori rizika za nastanak karotidne ateroskleroze. Ateroskleroza kao sistemska bolest arterijskih krvnih sudova bilo da javlja u karotidama ili koronarnim krvnim sudovima, ima zajedniĉko (konvencionalne) faktore rizika koji kao faktori sredine znaĉajno utiĉu na tok bolesti. To su hipertenzija, pušenje, starija starosna dob, šećerna bolest, visok nivo triglicerida, LDL-a (Tendera i sar., 2011). U Diskusija 106 zavisnosti od tipa krvnog suda, klasiĉni faktori rizika razliĉito deluju krajnji tok bolesti (Kannel WB i sar., 1994; Kannel i Wolf, 2006; Tendera i sar., 2011). U poreĊenju sa kontrolnom grupom, kod pacijenata sa KA je uoĉen statistiĉki znaĉajno veći broj pušaĉa i hipertenzivnih osoba. Pacijenti su se u odnosu na kontrole statistiĉki znaĉajno razlikovali po godinama starosti, imali su veće vrednosti BMI, veću koncentraciju triglicerida i Lp (a) u plazmi i niţu koncentraciju HDL-a. To je ukazalo na delovanje faktora rizika koji doprinose razvoju lezija u grupi sa KA. Karotidni aterosklerotski plak javlja se ĉešće posle 65. godine ţivota, kada dolazi do znaĉajne stenoze arterije (Rundek i sar., 2008). Starosna dob kod pacijenata sa KA u našoj studiji bila je > 65 godine ţivota. U jednoj od studija novijeg datuma u populaciji Kavkazoida koja je pratila pacijente sa karotidnom aterosklerozom tokom 13 godina je pokazala da su starosna dob, pušenje, hipertenzivni status, kritiĉne vrednosti LDL znaĉajni markeri za progresiju karotidne ateroskleroze (Herder i sar., 2012). Klinički parametri i dogaĎaji u karotidnoj aterosklerozi. Karotidna ateroskleroza je poznati biomarker asociran sa nastankom budućih cerebrovaskularnih dogaĊaja kao što je cerebrovaskularni insult (CVI) (šlog/moţdani udar) (Rundek i sar., 2008). U našoj studiji u grupi pacijenata sa KA frekvencija pacijenata koji su imali CVI je bila 22.66 %. U našem uzorku pacijenata sa KA frekvencija TIA bila je 21.29 %. Visok procenat stenoze karotidne arterije (>70 %) vaţan je faktor rizika i moţe biti jedan od glavnih uzroĉnika za nastanak šloga (Rothwell i sar., 2000; Flaherty i sar., 2013). U grupi pacijenata sa dijagnostiokavanom aterosklerozom karotida stepen stenoze unutar karotidne arterije je bio (>70 %). Ftrekvencija pacijenata koji su imali CVI bila je 22.67 %. Progresija ateroskleroze unutar zida karotidne arterije moţe dovesti do formiranja fenotipova lezija koje nose rizik za rupturu plaka i nastanak tromba (Naghavi i sar., 2003a; Naghavi i sar., 2003b; Mathiesen i sar., 2001). U našoj studiji frekvenca ulceracija je bila 13.48 %. Genetičko-epidemiološka analiza gena RAS u karotidnoj aterosklerozi kojim se identifikuje prisustvo odreĊenih alelelnih varijanti polimorfizama u genima RAS kod ispitanika iz Srbije je imao za cilj da odgovori na pitanje koje su varijante gena RAS prisutne u našoj populaciji, kod zdravih i obolelih, da li su ove varijante gena asocirane sa nastankom bolesti, sa kliniĉkim parametrima karotidne ateroskleroze i da li njihovo prisustvo uticalo na ekspresioni nivo gena i proteina u tkivu karotidnog aterosklerotskog Diskusija 107 plaka. U ovoj studiji su analizirani sledeći (funkcionalni) polimorfizmi u genima RAS: polimorfizam I/D u genu za ACE, polimorfizam A1166C u genu za ATR1 i polimorfizam -1332 A/G u genu za ATR2 u grupi zdravih ispitanika i pacijenata obolelih od karotidne ateroskleroze sa teritorije Srbije. Polimorfizam I/D u genu za ACE. U karotidnoj aterosklerozi polimorfizam I/D u genu za ACE je do sada u najvećem broju studija ispitivan sa kliniĉkim parametrom bolesti, IMZ. Velika meta analiza koja je objedinila 23 studije u kojima je analiziran polimorfizam I/D u genu za ACE izmeĊu zdravih i obolelih sa dijagnostikovanom subkliniĉkom KA (»case-control» studije) pokazala je umerenu pozitivnu asocijaciju polimorfizma I/D u genu sa ACE sa IMZ karotidne arterije (Sayed-Tabatabaei i sar., 2003). Studije asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE sa kliniĉkim parametrima uznapredovale ateroskleroze (prisusvom uznapredovalih lezija u karotidnim krvnim sudu) su retke. U studiji 2008. u koronarnim krvnim sudovima je pokazano da je alel D polimorfizma I/D u genu za ACE statistiĉki znaĉajno uticao na povećanje broja stenoza u srcu, odnosno formiranje aterosklerotskih lezija unutar koronarnog stabla srca (Niemiec i sar., 2008). Studija asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE sa karotidnom aterosklerozom do sada nije raĊena u populaciji Srbije. Studija iz 2012. godine je pokazala da je polimorfizam I/D u genu za ACE statistiĉki znaĉajno asociran asociran sa nastankom karotidne ateroskleroze u našoj popuplaciji (Kolaković i sar., 2012). U našoj populaciji je utvrĊeno da je genotip DD statistiĉki znaĉajno ĉešĉi u grupi pacijenata sa KA, odnosno alel D bio statistiĉki znaĉajno asociran sa nastankom KA (Kolaković i sar., 2012). Posle korekcije na faktore rizika: dob, hipertenziju, pušenje i vrednosti HDL-a ta vrednost više nije bila statistiĉki znaĉajna (Kolaković i sar., 2012). Ranije sprovedene studije koje su bavile ispitivanjem asocijacije polimorfizma I/D u genu za ACE sa prisustvom plaka u karotidnim krvnim sudovima su raĊene u manjim populacijama u Švedskoj i Japanu (Kostulas i sar., 1999; Watanabe i sar., 1997). U populaciji Švedske alel D je bio statistiĉki znaĉajno asociran sa prisustvom aterosklerotskog plaka kod pacijenata sa KA u poreĊenju sa kontrolnom grupom (Kostulas i sar., 1999), dok je u grupi pacijenata iz Japana utvrĊeno da je formiranje plakova unutar karotidnog krvnog suda bilo statistiĉki znaĉajno ĉešće kod nosilaca genotipova ID+DD u poreĊenju sa genotipom II (Watanabe i sar., 1997). U našoj grupi pacijenata sa KA frekvencija alela D je bila sliĉna sa frekvencijama u grupi pacijenata Diskusija 108 sa KA iz populacije Italije (Dessi–Fulgheri i sar., 1995) i Švedske (Kostulas i sar., 1999). Studija novijeg datuma u kojoj su uporeĊivane kontrolna grupa i grupa pacijenata koji su imali visok stepen stenoze karotida (≥70 %), kao i naši pacijenti, je utvrdila statistiĉki znaĉajnu razliku u distribuciji alela i genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u populaciji Italije, nezavisno od delovanja tradicionalnih faktora rizika (Sticchi i sar., 2011). Naša prethodna studija iz 2002. godine pokazala je da je alel D polimorfizma I/D u genu za ACE u srpskoj populaciji asociran sa hipertenzijom (faktorom rizika) kod muškaraca (Stanković i sar., 2002). Stoga je jedan od ciljeva naše studije iz 2012. godine bio da spomenuti polimorfizam analiziramo, izmeĊu normotenzivne kontrolne grupe i normotenzivne grupe pacijenata. Analiza poreĊenja normotenzivne kontrolne grupe i normotenzivne grupe pacijenata, je otkrila, da prethodno dobijena asocijaciju polimorfizma I/D u genu za ACE sa karotidnom aterosklerozom izmeĊu kontrola i pacijenata nije bila pod uticajem moguće asocijacije polimorfizma I/D u za ACE sa hipertenzijom. Pri tom smo dobili da je polimorfizma I/D u genu za ACE još jaĉe, statistiĉki znaĉajno asociran sa nastankom karotidne ateroskleroze kod normotenzivnih nezavisno od faktora rizika: starosne dobi i nivoa HDL-a (Kolaković i sar., 2012). Dobijena asocijacija genotipa DD sa prisustvom plaka u karotidnom krvnom normotenzivnih moţe biti vezana za proinflamatornu ulogu Ang II nezavisno od regulacije krvnog pritiska (Kolaković i sar., 2012). Prisustvo DD genotipa moţe da ima znaĉajne efekte na viši nivo lokalno generisanog ACE u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka (Rigat i sar., 1990; Suehiro i sar., 2004). U doktorskoj tezi polimorfizam I/D u genu za ACE je ispitivan samo deo kontrolnog uzorka zdravih ispitanika u odnosu na spomenutu studiju iz 2012. godine. Uzorak je obuhvatio manju kontrolnu grupu zdravih ispitanika koja je poreĊena sa grupom pacijenata sa karotidnom aterosklerozom. To je jedan od razloga koji je verovatno uticao na razlike u dobijenim rezulatatima. U ispitivanom uzorku uĉestalost genotipova i alela polimorfizma I/D u genu za ACE se izmeĊu kontrolne grupe i grupe pacijenata sa KA se nije statistiĉki znaĉajno razlikovala. Relativne frekvencije alela u kontrolnoj grupi su za alel I bile 45 % i za alel D 55 %, a u grupi pacijenata sa KA, 44 % i 56 %. Dobijeni rezultati u studiji iz 2012. godine su ipak verodostojniji u odnosu na analizirani uzorak ispitivan u uzorku doktorske teze. Dobijeni rezulatati sugerišu da je Diskusija 109 polimorfizam I/D u genu za ACE znaĉajan nezavistan marker rizika za nastanak karotidne ateroskleroze u populaciji Srbije nezavisno od delovanja faktora rizika. Polimorfizam I/D u genu za ACE u odnosu na tip aterosklerotskog plaka (SAP/NAP). Do sada su mnogobrojne studije ispitivale asocijaciju ovog polimorfizma sa razliĉitim fenotipovima ateroskleroze. Ipak, mali je broj studija ispitivao asocijaciju polimorfizma sa kliniĉkim parametrima karotidne ateroskleroze: fenotipom uznapredovalih lezija, SAP/NAP plak. U grupi pacijenata sa KA, polimorfizam I/D u genu za ACE nije bio asociran sa formiranjem nestabilnog aterosklerotskog plaka. MeĊutim kada se grupa pacijenata podeli prema fenotipu plaka na SAP i NAP i po polu rezultati su drugaĉiji. U grupi pacijenata muškog pola je pokazano da je genotip II statistiĉki znaĉajno ĉešći u nestabilnom plaku u poreĊenju sa fenotipom stabilnog plaka. Nosioci ovog genotipa su imali 2.26 puta statistiĉki znaĉajno veći odnos šansi za formiranje nestabilnog plaka u odnosu na nosioce alela D (ID+DD). Posle korekcije na konvencionalne faktore rizika (dob, pušenje i hipertenziju) nosioci genotipa II, su i dalje imali znaĉajno veći odnos šansi za njegovo formiranje. Ovaj rezulatat je pokazao da je u grupi pacijenata sa KA sa teritorije Srbije, polimorfizam I/D u genu za ACE kod muškaraca snaţan nezavistan faktor rizika za nastanak nestabilnog aterosklerotskog plaka, odnosno genotip II spomenutog polimorfizma je asociran sa 2.5 puta većim odnosom šansi za njegovo formiranje. Samim tim genotip II polimorfizma I/D u genu za ACE bi mogao da reguliše odnosno da utiĉe na povećanje i/ ili smanjenje transkripcione aktivnosti ACE u plaku. Na taj naĉin polimorfizam I/D bi mogao da nosi rizik za nastanak budućih dogaĊaja u karotidnoj aterosklerozi kao što je prolazni ishemijski dogaĊaj ili šlog. Kod ţena je genotip II bio ĉešći u nestabilnom plaku, ali nije bilo statistiĉki znaĉajno razlike u frekvencijama genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE u poreĊenju sa stabilnim plakom. Kod ţena polimorfizam I/D i genu za ACE nije bio asociran sa formiranjem nestabilnog aterosklerotsog plaka. S obzirom da se strukturna anatomija karotidnih krvnih sudova razlikuje po polu (Goubergrits i sar., 2002), bolest bi mogla verovatno razliĉito da napreduje izmeĊu ţena i muškaraca (Iemolo i sar., 2004). U tom smislu nastanak KA se kod ţena odlaţe i pomera tako da sama bolest nastupa 10 do 15 godina kasnije tokom ţivota (Lorenzo i sar., 2007). Studija iz 2004. godine je sugerisala da polne razlike mogu biti vezane za efekat polnih hormona na remodelovanje zida krvnog suda tokom ateroskleroze (Iemolo i sar., 2004). Diskusija 110 Poznat je protektivan (antinflamatorni) efekat endogenog estrogena na zid krvnog suda, na biohemijske parametre krvi, a samim tim na nastanak ateroskleroze (Perez-Lopez i sar., 2010; Pappa i Alevizaki, 2012). Pored toga za RAS je pokazano da polne razlike mogu definisati nivo ACE i (pro)renina u cirkulaciji, a samim tim molarni odnos krajnjih efektorskih molekula, Ang II i Ang 1-7 (Lynch i sar., 2007; Danser i sar., 1998; Reyes-Engel i sar., 2006). Ove razlike (polni dimorfizam) bi mogle delom objasne zašto odreĊeni genotip RAS, utiĉe na koncentraciju ACE enzima i nivo Ang II u cirkulaciji i kako je regulacija gena RAS (gen za ACE, renin) pogoĊena delovanjem steroidnih hormona (testosteronom i estrogenom) (Reyes-Engel i sar., 2006; Danser i sar., 1998; Gallagher i sar., 1999). Polimorfizam I/D u genu za ACE u odnosu na prisustvo/odsustvo prolaznog ishemijskog dogaĎaja (TIA). U grupi pacijenata sa KA polimorfizam I/D u genu zu ACE nije bio statistiĉki znaĉajno asociran sa nastankom prolaznog ishemijskog dogaĊaja (TIA). MeĊutim, kada se grupa podeli po polu dobijeni su drugaĉiji rezultati. Nosioci DD genotipa po recesivnom modelu za alel D (II+ID vs DD) su imali 2.2 puta statistiĉki znaĉajno veći odnos šansi za nastanak prolaznog ishemijskog dogaĊaja kod muškaraca nezavisno od dobi, pušenje i hipertenzije. Rezulatati naše studije su ukazali da je u grupi pacijenata sa KA kod muškaraca polimorfizam I/D u genu za ACE statistiĉki znaĉajan marker rizika za nastanak ovog dogaĊaja. Ovaj rezultat treba prihvatiti sa rezervom jer je broj ispitanika muškog pola koji su imali TIA bio mali (65 ispitanika). Studija koja je ispitivala asocijaciju polimorfizma I/D u genu za ACE sa ovim kliniĉkim dogaĊajem karotidne ateroskleroze nije utvrdila statistiĉku znaĉajnu razliku u frekvencijama genotipova ovog polimorfizma (Del Ser i sar., 2001). S obzirom da je u našoj grupi pacijenata sa KA kod muškaraca polimorfizam I/D u genu za ACE statistiĉki znaĉajno asociran sa formiranjem nestabilnog aterosklerotskog plaka, a kako destabilizacija lezija moţe da nosi rizik za nastanak TIA, dobijena asocijacija sa nastankom TIA kod muškaraca je oĉekivana. Polimorfizam I/D u genu za ACE u odnosu na cerebrovaskularni insult (CVI). U našoj grupi pacijenata sa KA polimorfizam I/D nije bio faktor rizika za CVI. Naš rezultat je u saglasnosti sa rezulatima koje su bile uraĊene na većini populacija Kavkazoida, gde je pokazano da polimorfizam nije bio statistiĉki znaĉajno asociran sa rizikom za nastanak šloga (Zee i sar., 1999; Peterlin i sar., 2000; Szolnoki i sar., 2001; Diskusija 111 Karagiannis i sar., 2004; Pera i sar., 2006; Tuncer i sar., 2006). Ranije sprovedena meta analiza iz 1998. godine, koja je prikupila sve studije do tada, je ukazala da alel D po recesivnom modelu (DD genotip) umereni, nezavisni faktor rizika za nastanak šloga (Sharma P, 1998). Meta analiza novijeg datuma iz 2012. godine koja je objedinila 50 publikacija, pokazala je da su heterozigotni i homozigotni nosioci alela D imali 1.16 odnosno 1.54 puta veći rizik za nastanak šloga (Zhang i sar., 2012). Ova studija je obuhvatila pripadnike razliĉitih populacija (Azijate, Kavkazoide i jednu populacija sa afriĉkog kontinenta). Posle podele na grupe razliĉite etniĉke pripadnosti pokazano je da je kod Azijata polimorfizam I/D u genu za ACE asociran sa većim rizikom za nastanak šloga (Zhang i sar., 2012). U studiji iz Koreje je pokazano da je polimorfizam I/D bio znaĉajan marker rizika za nastanak šloga (Hong i sar., 2008). Ipak, dalja istraţivanja su neophodna (replikativne studije u populacijama sa većim rizikom; zatim kod Hispanoamerikanaca i pripadnika crnaĉke populacije) zbog delovanja razliĉitih sredinskih faktora koji u interakciji sa genom mogu da doprinesu riziku za nastanak šloga (Della-Morte i sar., 2013). Polimorfizama I/D u genu za ACE i analiza ekspresionog nivoa iRNK za ACE u odnosu na genotipove polimorfizma. Za polimorfizam I/D u genu za ACE je pokazano da determiniše nivo enzima u cirkulaciji i moţe imati efekte na ekspresiju gena za ACE (Rigat i sar., 1990; Tiret i sar., 1993; Suehiro i sar., 2004). Studije koje su se bavile ispitivanjem ekspresionog nivoa iRNK za ACE u tkivima, u odnosu na genotipove polimorfizma I/D raĊene su u nekoliko studija. U tkivu pretkomora srca pacijenata koji su imali infarkt miokarda nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u nivoima ekspresije iRNK za ACE izmeĊu genotipova polimorfizma I/D (Spruth i sar., 1999). MeĊutim u tkivu komore srca je izmeĊu genotipova polimorfizma I/D u genu za ACE pokazana statistiĉki znaĉajna razlika u aktivnosti ACE enzima, pri ĉemu je najveća aktivnost zabeleţena kod nosilaca DD genotipa u poreĊenju sa genotipovima ID i II (Danser i sar., 1995). U T limfocitima izolovanim iz mononukleara krvi je pokazano da se ekspresioni nivo/aktivnost enzima razlikovao po genotipu polimorfizma I/D pri ĉemu je najviši nivo uoĉen kod nosilaca DD genotipa u odnosu na ID i II genotip (Costerousse i sar., 1993). Studija novijeg datuma koja je ispitivala ekpresioni nivo iRNK po genotipovima polimorfizma I/D u genu za ACE u ćelijama mononukleara izolovanih iz krvi zdravih osoba je pokazala viši nivo iRNK gena za ACE kod nosilaca Diskusija 112 alela D u poreĊenju sa nosiocima alela I (Suehiro i sar., 2004). Ovim je sugerisano da razlika u ekspresiji iRNK za ACE da moţe biti imati vaţnu ulogu u patogenezi ateroskleroze. U našoj studiji u tkivu aterosklerotskog plaka u grupi pacijenata sa KA pred endarteroktomiju, ekspresioni nivo iRNK za ACE se po genotipu polimorfizma I/D se nije statistiĉki znaĉajno razlikovao. U tkivu nestabilnog aterosklerotskog plaka ekspresija iRNK za ACE se po genotipovima polimorfizma I/D u genu za ACE nije statistiĉki znaĉajno razlikovala. Polimorfizam A1166C u genu za ATR1. Asocijativne studije polimorfizma A1166C u genu za ATR1 sa KA i kliniĉkim parametrima bolesti do sada nisu bile uraĊene u populaciji Srbije. Do sada je u našoj populaciji raĊena studija asocijacije ovog polimorfizma sa hipertenzijom (faktorom rizika). U studiji iz 2003. godine smo pokazali da je polimorfizam A1166C u genu za ATR1 asociran sa nastankom esencijalne hipertenzije kod muškaraca (Stanković i sar., 2003). Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 nije bio asociran sa rizikom za formiranje karotidnih aterosklerotskih plakova u populaciji Srbije. Frekvencije genotipova i alela polimorfizma A1166C u genu za ATR1 se izmeĊu kontrolne grupe zdravih ispitanika i grupe pacijenata sa KA nisu statistiĉki znaĉajno razlikovale. Ovaj rezultat je u skladu sa studijom u populaciji Kavkazoida iz Australije (Chapman i sar., 2001). Studije novijeg datuma u drugim populacijama, iz Italije i Japana su takoĊe pokazale da polimorfizam A1166C u genu za ATR1 nije bio asociran sa rizikom za nastanak stenoze karotida (Sticchi i sar., 2011; Nakai i sar., 2009). S druge strane u populaciji Kineza je pokazano, da je genotip CC polimorfizma A1166C u genu za ATR1 asociran sa karotidnom aterosklerozom kod pacijenata sa esencijalnom hipertenzijom (Zhu i Meng, 2006). Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 u odnosu na tip aterosklerotskog plaka (SAP/NAP). U okviru grupe pacijenata sa KA je pokazano da je polimorfizam A1166C u genu za ATR1 asociran sa povećanim rizikom za formiranje nestabilnog aterosklerotskog plaka (Kolaković i sar., 2011). Kod pacijanata sa KA utvrĊena je statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova polimorfizma u odnosu na tip aterosklerotskog plaka. Nosioci genotipa AC i CC, su imali 1.5 i odnosno 2.3 puta veći odnos šansi za formiranje nestabilnog aterosklerotskog plaka nezavisno od pola, ţivotne dobi, hipertenzije, pušenja i broja trombocita. Posmatrano odvojeno po polu, u grupi ţena je pokazana još veća statistiĉki znaĉajna razlika u distribuciji genotipova i alela Diskusija 113 ispitivanog polimorfizma. Odnos šansi za formiranje nestabilnog aterosklerotskog plaka kod ţena je bio 1.9 kod nosilaca AC genotipa odnosno 3.7 kod nosilaca genotipa CC. Posle korekcije na faktore rizika (dob, hipertenziju, pušenje) i faktore fibrinolitiĉkog sistema koji su se razlikovali izmeĊu pacijenata sa stabilnim/nestabilnim aterosklerotskim plakom (plazminogen i PAI) odnos šansi je bio još veći i ostao je statistiĉki znaĉajan. Ovi rezulatati su ukazali da je polimorfizam A1166C u genu za ATR1 snaţan nezavistan genetiĉki faktor rizika za formiranje nestabilnog aterosklerotskog kod pacijenata sa KA pred endarteroktomiju. Verovatno da je u osnovi ovih rezulatata razliĉit odgovor krvnih sudova na faktore kao što je Ang II, a u odnosu na genotip polimorfizma 1166C u genu za ATR1. Ranije studije in vitro u krvnim krvnim sudovima ĉoveka, su pokazale da genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 znaĉajno utiĉe na odgovor krvnih sudova na vazokonstiktorne molekule (Ang II), odnosno na njegove vazomotorne osobine (Amant i sar., 1997; Henrion i sar., 1998; Steeds i sar., 1999; Van Geel i sar., 2000). Naime, in vitro studije u koronarnim krvnim sudovima pacijenata sa aterosklerozom su pokazale statistiĉki znaĉajnu razliku u odgovoru na stimulaciju Ang II u odnosu na genotipove polimorfizma A1166C u genu za ATR1 (Henrion i sar., 1998; Van Geel i sar., 2000). Statitistiĉki znaĉajno veći odgovor je naĊen kod genotipa CC u poreĊenju sa genotipovima AC i AA studija iz 1998 (Henrion i sar., 1998) i u poreĊenju sa nosiocima genotipova AC+AA (po recesivnom modelu nasleĊivanja AA+AC vs CC) u studiji iz 2000. godine (Van Geel i sar., 2000). Ovi nalazi mogu da ukaţu da genotip polimorfizma A1166C u genu za ATR1 moţe znaĉajno da utiĉe na odgovor krvnih sudova na Ang II, a samim tim na remodelovanje zida krvnog suda i nastanka ateroskleroze. Pored toga prisustvo polimorfizma A1166C u genu za ATR1 (alel C) remeti vezivanje miR-155 za 3 'UTR region gena što za posledicu moţe da ima povećanje ekspresije receptora (Martin i sar., 2006). Studija iz 2009. godine je pokazala pozitivnu asocijaciju alela C sa IMZ karotidne arterije kod ţena (Plat i sar., 2009). Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 u odnosu na cerebrovaskularni insult. U grupi pacijenata sa KA polimorfizam A1166C u genu za ATR1 nije bio asociran sa rizikom za nastanak cerebrovasularnog insulta ukupno, ni odvojeno po polu. To je u saglasnosti sa većinom studija koje su ispitivale asocijaciju polimorfizma sa šlogom. Diskusija 114 Velika meta analiza iz 2011. koja je objedinila sve (»case-control») studije koje su ispitivale asocijacije ovog polimorfizma sa šlogom je pokazala da u većini populacija ovaj polimorfizam nije bio asociran sa rizikom za nastanak šloga (Zhang i sar., 2011). Negativna asocijacija polimorfizma sa šlogom je potvrĊena u grupi Kavkazoida iz Sjedinjenih Ameriĉkih Drţava (Hindorff i sar., 2002). Pozitivna asocijacija alela C sa rizikom za nastanak šloga je pokazana u ostrvskoj populaciji Italije (Sardinija) (Rubattu i sar., 2004) i populaciji iz MaĊarske (Szolnoki i sar., 2006b). Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 je bio nezavisni faktor rizika za pojavu ranih lezija u beloj masi mozga u grupi pacijenata sa esencijalnom hipertenzijom u populaciji Holandije (Henskens i sar., 2005) i nastanak šloga u grupi hipertenzivnih pušaĉa iz MaĊarske (Szolnoki i sar., 2006a). Izgleda da se u osnovi pozitivne asocijacije polimorfizma A1166C u genu za ATR1 sa šlogom nalazi hipertenzija kao bitan faktor rizika koji doprinosi njegovom nastanku (Dichgans M, 2007). Pored hipertenzije, povećan rizik za nastanak šloga je naĊen u grupi pacijenata sa sećernom bolesti iz Kine (Zhang i sar., 2001). Studija novijeg datuma u Turskoj populaciji nije pokazala asocijaciju polimorfizma A1166C u genu za ATR1 sa rizikom za natanak šloga (Hulyam i sar., 2013). Razlike u dobijenim rezulatatima asocijacije polimorfizma A1166C u genu za ATR1 sa šlogom u populacijama, se mogu objasniti objasniti multifaktorijalnom etiologijom bolesti u kojoj faktori rizika u interakciji sa polimorfizmom mogu da doprinesu riziku za nastanak dogaĊaja. Polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i analiza ekspresionog nivoa iRNK za ATR1 u odnosu na genotipove polimorfizma. Funkcionalna karakterizacija 3'UTR regiona gena za ATR1 je utvrdila da ovaj netransirajući region sadrţi elemente koji stabilizuju odnosno destabilizuju (smanjuju/povećavaju) nivo ekspresije iRNK za ATR1 (Lehtonen i sar., 2007). Naime, pokazano je da uklanjanje 3'UTR regiona gena povaćava nivo ekspresije iRNK za receptor na taj naĉin što produţava njen poluţivot (Lehtonen i sar., 2007). Prisustvo polimorfizma A1166C (alel C) u ovom regionu dovodi do delimiĉnog gubitka efekta koji ovaj region ima na destabilizaciju iRNK za ATR1 jer produţava njen poluţivot (Lehtonen i sar., 2007). S druge strane u 3'UTR regionu gena se nalaze vezujuća mesta za proteine koji interaguju sa ovom iRNK, što je dovelo do spekulacija da bi promene u interakcijama RNK-protein mogle da objasne efekat koji polimorfizam A1166C moţe da ima na ekspresiju gena (Lehtonen i sar., Diskusija 115 2007). U ćelijama mononukleara kod ispitanika sa hipertenzijom mlaĊih od 40 godina nivo ekspresije iRNK za ATR1 se izmeĊu genotipova polimorfizma A1166C nije statistiĉki znaĉajno razlikovao (Ceolotto i sar., 2011). Naša studija je pokazala da se nivo iRNK za ATR1 u tkivu aterosklerotskog plaka nije statistiĉki znaĉajno razlikovao po genotipovima polimorfizma A1166C. MeĊutim, ukoliko grupišemo genotipove po dominantnom modelu za alel C (AA vs AC+CC), utvrĊen je trend većeg ekspresionog nivoa iRNK za ATR1 kod nosilaca alela C u poreĊenju sa nosiocima genotipa AA u celom ispitivanom uzorku i kod muškaraca, ali ta razlika u nivou ekspresije nije bila statistiĉki znaĉajna. Obzirom na to da ekspresija iRNK za ATR1 nije detektovanaa kod svih ispitivanih uzoraka već samo u 21 uzorku tkiva (34.43 %) dobijene rezulatate treba uzeti sa rezervom jer se cela grupa deljenjem na tri genotipa znaĉajno smanjuje, a samim tim se gubi i snaga testa da se utvrdi razlika. Polimorfizam A1166C u genu za ATR1 i analiza ekspresije proteina ATR1 u odnosu na genotipove polimorfizma. U lizatu tkiva aterosklerotskog plaka nivo ekspresije ATR1 (zrela forma proteina) po genotipu polimomorfizma A1166C u genu za ATR1 se nije statistiĉki znaĉajno razlikovao. Do sada je samo jedna studija ispitivala proteinski nivo ATR1 po genotipovima polimorfizma A1166C. U spomenutoj studiji iz 2011. godine koja je pored ekpresionog nivoa iRNK za ATR1 u lizatu mononukleara krvi hipertenzivnih ispitanika ispitivala i nivo ekspresije proteina je pokazala da je nivo proteina kod nosilaca genotipa AC i CC bio statistiĉki znaĉajno viši u odnosu na referentni genotip AA (Ceolotto i sar., 2011). Polimorfizama A1166C u genu za ATR1 i analiza ekspresionog nivoa miR-155 u odnosu na genotipove polimorfizma. Kako je u in vitro studiji pokazano da miR-155 umanjuje endogenu ekspresiju ATR1 i signalni put posredovan Ang II (Martin i sar., 2006), a s obzirom da je potpuno komplementarna 3'UTR regionu gena za ATR1 gde se nalazi polimorfizam A1166C, jedan od ciljeva naše studije je bio da utvrdi ekspresioni nivo ove mikroRNK ex vivo u tkivu aterosklerotskog plaka po genotipu polimorfizma A1166C. Prisustvo polimorfizma A1166C u genu za ATR1, utiĉe na komplementarno vezuje miR-155 za sekvencu iRNK i tako utiĉe na nivo ekpresije receptora. U našoj studiji nivo ekspresije miR-155 se izmeĊu genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1 nije statistiĉki znaĉajno razlikovao u tkivu aterosklerotskog plaka. Uoĉen je trend ka većoj ekspresiji miR-155 kod nosilaca genotipa CC u poreĊenju sa genotipom AA i Diskusija 116 AC, ali ta razlika nije bila statistiĉki znaĉajna. Kod ţena je potvrĊen statitistiĉki znaĉajno veći nivo miR-155 kod genotipa CC u poreĊenju sa genotipom AA ispitivanog polimorfizma. Po recesivnom modelu za alel C je kod ţena uoĉena statistiĉki znaĉajna razlika u nivou ekspresije miR-155 kod nosilaca genotipa CC u poreĊenju sa nosiocima AA+AC (p=0.034). Studije novijeg datuma u kojima je potvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u nivoima ekpresije miR-155 izmeĊu genotipova polimorfizma A1166C u genu za ATR1 dobili su Ceolotto i saradnici 2011. godine i Blanco i saradnici 2012. godine. Oni su u ćelijama mononukleara ispitanika sa esencijalnom hipertenzijom starosne dobi mlaĊih od 40 godina i u grupi ispitanika sa hroniĉnom bolešću srca (pacijenti sa ventrikularnom aritmijom) našli statistiĉki znaĉajno niţi ekspresioni nivo miR-155 kod nosilaca genotipa AC i CC u poreĊenju sa genotipom AA (Ceolotto i sar., 2011; Blanco i sar., 2012). S obzirom da je u ovim studijama ispitivan ekspresioni nivo miR-155 u cirkulaciji, u ćelijama mononukleara (cirkulišuće miR-155), a mi smo ispitivali sloţeni konglomerat ćelija u kojem su pored mononukleara prisutne i druge ćelije, delimiĉno neslaganje moţe da se objasni tkivnom specifiĉnošću. Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2. Studije asocijacije polimorfizma A/G - 1332 u genu za ATR2 u KA su retke. Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 nije bio asociran sa rizikom za formiranje karotidnih aterosklerotskih plakova u populaciji Srbije. Frekvencije genotipova polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 se izmeĊu kontrolne grupe i grupe pacijenata sa KA nisu statistiĉki znaĉajno razlikovale, ni u muškom ni u ţenskom polu. Prethodno uraĊena studija u našoj populaciji je pokazala da je polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 asociran sa esencijalnom hipertenzijom kod muškaraca starosne dobi > 40 godina (Ţivković i sar., 2007). U familijarnim studijama (509 familija) polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 je bio asociran sa nastankom prerane koronarne bolesti (Alfakih i sar., 2005). U sliĉnoj studiji koja je sprovedena u familijama (885 familija) je pokazano da je polimorfizam A/G -1332 bio statistiĉki znaĉajno asociran sa restenozom koronarnih krvnih sudova koji zahtevaju revaskularizaciju (premošćavanje koronarnih krvnih sudova) u poreĊenju sa kontrolnom grupom (Alfakih i sar., 2007). Autori ove studije sugerišu da prisustvo polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 moţe znaĉajno da utiĉe na ekspresioni ATR2 i tako doprinese nastanku aterosklerotskih plakova unutar zida krvnog suda (Alfakih i sar., 2007). Unutar gena za ATR2 je pored polimorfizma A/G -1332 identifikovano još Diskusija 117 nekoliko polimorfizama : A1818T u 2. intronu, G4303A i C4599A u 3'UTR regionu gena (Katsuya i sar., 1997; Jin i sar., 2003; Katsuya i Morishita, 2012). Za polimorfizam C4599A je pokazano da je bio asociran sa rizikom za nastanak hipertenzije kod ţena (Jin i sar., 2003). U ovoj studiji je pokazano da su polimorfizmi A/G -1332 i C4599A u interakciji odnosno snaţnom LD (eng. linkage diseequilibrium, LD) (Jin i sar., 2003). Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na tip aterosklerotskog plaka (SAP/NAP) i prisustvo ulceracije u plaku. Razlika u distribuciji genotipova polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na tip plaka, kod ţena i kod muškaraca nije bila statistiĉki znaĉajno razliĉita. MeĊutim kod muškaraca je uoĉen trend veće frekvence hemizigota A/- kod ispitanika sa nestabilnim plakom. MeĊutim, muškarci hemizigoti A/- su imali 1.9 puta znaĉajno veći odnos šansi za nastanak ulceracije i posle korekcije na faktore rizika (dob, pušenje i hipertenziju). Modulatorni efekat ovog polimorfizma je ispitivan do sada i u koronarnoj aterosklerozi, gde je pokazano da je alel A asociran sa povećanim rizikom za progresiju bolesti (Tousoulis i sar., 2010). Rezulatati iste studije su pokazali da polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 moduliše sistemsku inflamaciju tj. nivoe (IL-6, CRP, VCAM-1) kod hipertenzivnih ispitanika muškog pola (Tousoulis i sar., 2010). U prethodnoj studiji u našoj populaciji je pokazano da su mušakrci hemizigoti G/- imali povećan rizik za nastanak hipertenzije u starijoj starosnoj dobi preko 40 godina (Ţivković i sar. 2007), dok u sadašnjoj studiji, u grupi ispitanika sa KA, nije bilo uticaja polimorfizma A/G - 1332 u genu za ATR2 na nivo CRP i IL-6. Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 u odnosu na cerebrovaskularni insult. Studija asocijacije polimorfizma -1332 A/G u genu za ATR2 sa cerebrovaskularnim insultom kod ispitanika sa teritorije Srbije do sada nisu raĊene. U našoj grupi pacijenata je pokazano da su nosioci hemizigota G/ _ muškog pola imali 2.7 puta znaĉajno veći odnos šansi za nastanak cerebrovaskularnog insulta u mozgu korigovan na (dob, hipertenziju, pušenje, nivo ApoA1, nivo DDIM, triglicerida i broj leukocita) (Kolakovic i sar., 2013). Studije polimorfizma -1332 A/G u genu za ATR2 sa šlogom gotovo i da nema. S obzirom na modulatorni efekat polimorfizma -1332 A/G u genu za ATR2 koji ima na ekspresiju ATR2, mogući su efekti ovog polimorfizma na ekspresiju ATR2 u mozgu zahvaćenom ishemijom. Istraţivanja u ţivotinjskim modelima su ukazala na mogućnost aktivacije ATR2 u promovisanju diferencijacije i regeneracije nervnog tkiva Diskusija 118 (Reinecke i sar., 2003; Li i sar., 2007; Mogi i Horiuchi, 2013). U blizini lokusa gena za ATR2 nalazi se gen za plastin 3 (PLS3), aktin vezujući protein i gen za ĉlan familije proteina kojii uĉestvuju u transportu neurotransmitera zavisnih od Na+ i Cl- jona i transportu aminokiselina (SLC6A14) (Katsuya i Morishita, 2012). Moţda aktivacija ovih gena potpomaţe protektivne efekte ATR2 u reparaciji oštećenog tkiva mozga zahvaćenog ishemijom. Studija skorijeg datuma predlaţe primenu agonista receptora ATR2 u terapiji akutne ishemije mozga (Dorrance AM, 2012). Polimorfizam A/G -1332 u genu za ATR2 i analiza ekspresije iRNK za ATR2 i proteina ATR2 u odnosu na genotipove polimorfizma. In vitro studije koji su se bavile ispitivanjem funkcionalnih efekata polimorfizma A/G -1332 u genu za ATR2 su sugerisale modulatorni efekat ovog polimorfizma na ekspresiju receptora, na nivou iRNK i na nivou proteina (Nishimura i sar., 1999; Warnecke i sar., 2005). U tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka nije detektovana iRNK za ATR2. U ćelijskim linijama fibroblasta ĉoveka je utvrĊen obrazac ekspresije transkripcionih varijanti gena za ATR2 u odnosu na genotipove polimorfizma -1332 A/G (Nishimura i sar., 1999). Ipak ovaj obrazac ekspresije iRNK za ATR2 u odnosu na genotipove polimorfizma je tkivno zavisan. Naime, u tkivu uretera sa stenozom kod dece sa kongenitalnim anomalijama bubrega (CAKUT) je pokazano da ekspresija razliĉitih transkripcionih varijanti nije regulisana A/G -1332 polimorfizmom (Stanković i sar., 2010). Studija iz 2005. godine je ukazala da prisusvo polimorfizma A/G -1332 u kritiĉnom regionu gena (1. intronu) moduliše ekspresiju proteina, a ne alternativno iskrajanje iRNK za ATR2 (Warnecke i sar., 2005). Rezultati in vitro su utvrdili da je alel G imao statistiĉki znaĉajno veću luciferaznu akivnost u transfekovanim ćelijskim linijama (Warnecke i sar., 2005). MeĊutim, nijedna od navedenih studija koje su sugerisale modulatornu ulogu polimorfizma A/G -1332 na ekspresiju proteina (Nishimura i sar., 1999; Warnecke i sar., 2005) nije ispitivala nivo ekspresije ATR2 na proteinskom nivou (Balmforth AJ, 2010). Stoga je jedan od ciljeva našeg rada bio da utvrdi nivo ekspresije proteina ATR2 ex vivo u lizatu tkiva karotidnog aterosklerotskog plaka u odnosu na polimorfizam A/G -1332. Nivo ekspresije proteina je kod muškaraca hemizigota G/- bio niţi u poreĊenju sa hemizigotom A/-, ali ta vrednost nije bila statistiĉki znaĉajna. Analiza ekspresionog nivoa iRNK za ACE u karotidnoj aterosklerozi. U poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije ekspresioni nivo iRNK za ACE u tkivu karotidnog plaka Diskusija 119 je bio statistiĉki znaĉajno razliĉit. Jedina studija do sada koja se bavila utvrĊivanjem ekspresionog nivoa ACE enzima u karotidnim aterosklerotskim lezijama je ukazala na povećanu transkripciju i translaciju ACE enzima u inflamatornim regionima sloţenih karotidnih aterosklerotskih plakova (Fukuhara i sar., 2000). U ovoj studiji je po prvi put detektovana iRNK za ACE in situ hibridizacijom u regionima tkiva komplikovanih (nestabilnih) karotidnih aterosklerotskih plakova dostupnih sa endarteroktomija. U ćelijskom infiltratu ovih plakova iRNK za ACE detektovana je na nivou ćelija makrofaga, T limfocita i u intimi novo formiranih krvnih sudova (Fukuhara i sar., 2000). U našoj studiji razlika u ekspresionom nivou iRNK za ACE izmeĊu tkiva nestabilnog i stabilnog aterosklerotskog plaka nije bila statistiĉki znaĉajna. Pored ispitivanja nivoa iRNK za ACE u tkivu aterosklerotskog plaka jedan od ciljeva naše studije bio je utvrĊivanje ekpresionog nivoa proteina. Protein ACE u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka ĉoveka je detektovan imunoblot metodom. MeĊutim, korišćenje poliklonskog antitela nije omogućilo da se preciznije kvantifikuje njegov proteinski nivo u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka. Prethodno sprovedena studija iz 2008. godine koja je ispitivala aktivnost enzima sugerisala je na slabu aktivnost enzima u karotidnom aterosklerotskom plaku koja je bila ispod nivoa praga detekcije (Sluimer i sar., 2008). Suprotno tome u koronarnim krvnim sudovima ĉoveka pokazana je povećana aktivnost ACE enzima udruţena sa napredovanjem ateroskleroze (Diet i sar., 1996; Ohishi i sar., 1997; Ohishi i sar., 1999). Povećana akt ivnost ACE enzima zabeleţena u koronarnom aterosklerotskom plaku posle akutnih dogaĊaja (akutni koronarni sindrom) bi mogla biti posledica većeg broja inflamatornih ćelija u nestabilnom plaku i usko je vezanu za njegovu destabilizaciju (Hoshida i sar., 2001). Koronarni aterosklerotski plakovi pacijenata sa nestabilnom anginom pektoris su imali veći nivo ekspresije ACE enzima u odnosu na pacijente sa stabilnom plakovima na raĉun većih regiona zahvaćenih inflamacijom (makrofage) i proliferacije ćelija (GMĆ i endotelne ćelije) (Ribichini i sar., 2006). Nalazi u koronarnim aterosklerotskim plakovima su ukazali da interakcija izmeĊu RAS sistema i inflamatornog medijatora citokina (IL-6), moţe imati efekte na balans izmeĊu faktora koji utiĉu na stabilnost, odnosno, nestabilnost lezija (Schieffer i sar., 2000). MeĊutim, studija iz 2004. godine je sugerisala nešto drugaĉije rezultate. Naime, smanjena ekspresija ACE enzima u pojedinim regionima nestabilnog plaka moţe biti posledica gubitka sekrecije Ang Diskusija 120 II/ACE u ćelijama makrofaga koji moţe da utiĉe na smanjenje proliferacije EĆ i GMĆ, a samim tim na tanjenje fibrozne kape plaka. S jedne strane ACE moţe biti faktor rizik za formiranje aterosklerotskih plakova u karotidnim krvnim sudovima, s druge strane kritiĉan marker rizika u krajnjim fazama sazrevanja lezija (regioni tanjenja fibrozne kape plaka). Studija iz 2004. godine je sugerisla da ekspresioni nivo ACE enzima moţe biti jedan od finalnih faktora koji moţe dovesti do rupture plaka, odnosno, njegove destabilizacije (Morioka i sar., 2004). Da li je smanjenjenje i/ili povećanje ACE enzima, faktor rizika u aterosklerozi ostaje da se vidi ubuduće. Analiza ekspresionog nivoa iRNK za ATR1 i proteina ATR1 u karotidnoj aterosklerozi. U kontrolnom tkivu arterije i tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka ĉoveka TaqMan esejima smo ispitivali sledeće transkripcione varijante gena za ATR1koje obuhvataju egzone: 1-4, 1-2-4, 1-2-3-4 i 0-4. U kontrolnom tkivu zdrave arterije ekspresioni nivo ispitivanih transkripcionih varijanti za ATR1 nije utvrĊen. U tkivu aterosklerotskog plaka detektovali smo samo transkripcionu varijantu koja sadrţi egzone 1-4. U kulturama monocita ĉoveka (U937 i THP-1 ćelijske linije) nije detektovana nijedna od gore spomenutih ispitivanih transkripcionih varijanti gena za ATR1, meĊutim u ćelijskoj liniji mikrovaskularnih endotelnih ćelija (HMEC-1) detektovane su sve ispitivane transkripcione varijante ovog gena (Groeschel M, 2009). U ovoj ćelijskoj liniji je pored ispitivanih spomenutih varijanti detektovana i transkripciona varijanata gena koja sadrţi egzone 1-3-4 (Groeschel M, 2009). Ostaje da se vidi da li je ova varijanta gena eksprimirana u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka. Sugerisano je da ćelijske linije monocita u kojima nije detektovana nijedna od gore spomenutih transkripcionih varijanti iRNK za ATR1, verovatno eksprimiraju novu tranksripcionu varijantu gena koje se prepisuju sa poslednjeg egzona (protein kodirajućeg regiona gena) (Groeschel M, 2009). Ranije studije in vitro i ex vivo u tkivima ĉoveka su pokazale da relativni nivo ekspresije iRNK za ATR1 regulisan na tkivno specifiĉan naĉin i da se udeo pojedinih alternativnih transkripcionih varijanti funkcionalno razlikuje (Martin i sar. 2001b; Martin i sar. 2003). U tkivu srca ĉoveka je pokazano da 93-98 % ispitivanih transkripcionih varijanti ĉine varijanta koje sadrţe egzone 1-4 i 1-2-4 (Warnecke i sar., 1999a). Iz biblioteke cDNK tkiva jetre ĉoveka, je pokazano prisustvo dodatne transkripcione varijante 0-4, koja se prepisuje sa dodatnog egzona dugog 155 bp (oznaĉen kao egzon "0") 5'UTR regiona gena (Guo i sar., 1994). Diskusija 121 Za transktripcionu varijantu gena koja se prepisuje sa 1. i 4. egzona (1-4) je in vitro pokazano da u transfekovanim ćelijama negativno reguliše ATR1 na nivou translacije (Curnow i sar., 1995). S druge strane, smatra se da egzon 1 ima ulogu u regulaciji transkripcije tako što moţe da pojaĉa promotorsku funkciju gena za ATR1 (Elton i Martin, 2003). U našoj studiji nivo ekspresije detektovane transkripcione varijante koja sadrţi egzone 1-4 se nije statistiĉki znaĉajno razlikovao po tipu aterosklerotskog plaka. Obzirom na to da ekspresija iRNK za ATR1 nije detektovana kod svih ispitivanih uzoraka već samo kod 21 uzorka (34. 43 %) dobijene rezulatate treba uzeti sa dozom rezerve jer se snaga testa znaĉajno smanjuje deljenjem ispitivane grupe po tipu plaka. Imajući u vidu ĉinjenicu da u inflamatornom jezgru aterosklerotskog plaka monociti/makrofage predstavljaju dominantni tip ćelija, u ćelijskim linijima monocita (THP-1), a i u endotelnim ćelijama ĉoveka (HMEC-1) detektovana nova transkripciona varijanta koja se prepisuje sa poslednjeg egzona gena (Groeschel M, 2009) ostaje da se ispita da li je ova transkripciona varijanta eksprimirana ex vivo i u tkivu aterosklerotskog plaka. Treba napomenuti da odreĊeni faktori mogu da utiĉu odnosno da regulišu ekspresioni nivo transkripcionih varijati gena za ATR1, a samim tim i ekspresioni nivo receptora. U ćelijskoj liniji fibroblasta ĉoveka je pokazano da tretman sa TGFβ-1 pojaĉava ekspresiju gena za ATR1 (Martin i sar., 2007). Verovatno da u ćelijama tkiva aterosklerotskog plaka neki od faktora inflamacije regulišu ekspresioni nivo ATR1. Detekcija proteina ATR1 ex vivo u lizatu tkiva aterosklerotskog plaka je utvrĊena metodom Western blota. Analiza je pokazala da se proteinski nivo ATR1 u lizatu tkiva plaka statistiĉki znaĉajno razlikuje izmeĊu fenotipova, pri ĉemu je zabeleţen statistiĉki znaĉajno viši nivo ekspresije proteina u nestabilnom plaku (p=0.05). In vitro i in vivo studije su ukazale na interakcija RAS i tromboze. Veći proteinski nivo ATR1 u ćelijama inflamatornog jezgra nestabilnog plaka ukazuje na veću aktivacija ATR1 u ćelijama ovog fenotipa bi mogao da doprinese njegovoj destabilizaciji. Obimna studija analize ekspresije proteina u karotidnim aterosklerotskim plakovima je pokazala vremenske promene u ekspresiji proinflamatornog citokina IL-6 i ostalih inflamatornih molekula tokom progresije lezija posle akutnih dogaĊaja (TIA /šlog) (Peeters i sar., 2009). Kako inflamatorni proces dominira tokom progresije lezija, Diskusija 122 povišeni nivoi proinflamatornih molekula kao što je IL-6 u aterosklerotskom plakovima bi mogli da regulišu ekspresioni nivo ATR1. U studiji in vitro u kulturi GMĆ je pokazano da IL-6 pojaĉava ekspresioni nivo ATR1 na nivou iRNK i proteina (Wassmann i sar., 2004b). U kulturi GMĆ je pokazano da LDL povećava ekspresiju gena postranskripciono tako što stabilizuje nivo iRNK za ATR1 (Nickenig i sar., 1997). Pored toga pokazano je da ox-LDL povećava ekspresiju ATR1 u kulturi endotelijalnih ćelija ĉoveka (Li i sar., 1999; Li i sar., 2000). Nekoliko studija je ispitivao nivo ekspresije ATR1 u aterosklerotskim tkivima kod ĉoveka. U koronarnim aterosklerotskim plakovima pacijenata sa nestabilnom anginom pektoris je imunohistohemijom pokazana kolokalizacija IL-6 sa Ang II i ATR1 (Schieffer i sar., 2000). Kod pacijenata sa aterosklerozom u koronarnim krvnim sudovima poreklom sa autopsija pokazana je pozitivna korelacija ekspresije proteina ATR1 sa progresijom bolesti (Gross i sar., 2002). Nivo ATR1 je bio statistiĉki znaĉajno povišen u tkivu aorte zahvaćene aterosklerozom u poreĊenju sa zdravim tkivom arterije (Kaschina i sar., 2009). U ovoj studiji je pokazano da nivo ekspresije iRNK za ATR1 prati proteinski nivo receptora detektovan imunoblotom. U našoj studiji diskrepanca u nivou ekspresije ATR1 na proteinskom nivou i nivou iRNK u tkivu plaka, bi mogla da se pripiše specifiĉnostima transkripcione/postranskripcione regulacije receptora koji mogu da utiĉu na stabilnost iRNK, a koji mogu da utiĉu na nivo ekspresije proteina ATR1. Pored toga brojni faktori u tkivu plaka pored IL-6 i LDL mogu regulisati ekspresiju ATR1. Zakljuĉak iz ovih studija je da nivo ekspresije gena treba utvrditi na nivou iRNK i na nivou proteina. Analiza ekspresionog nivoa miR-155 u karotidnoj aterosklerozi. Studije utvrĊivanja ekspresije miR-155 u karotidnoj aterosklerozi kod ĉoveka su retke. Ispitivanje profila ekspresije mikroRNK u aterosklerozi kod ĉoveka (eng. MicroRNA expression profiling- Human miRNA Microarray) pokazali su da je miR-155 statistiĉki znaĉajno povišena u karotidnom plaku u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije bez znakove ateroskleroze (leva unutrašnja grudna arterija) (Raitoharju i sar., 2011). Ekspresija miR-155 je utvrĊena i u cirkulaciji, u ćelijama mononukleara, ispitanika sa koronarnom bolešću koja je bila statistiĉki znaĉajno niţa u poreĊenju sa zdravom (kontrolnom) grupom (Fichtlscherer i sar., 2010). Ipak, ekspresioni nivo miR-155 do sada nije ispitivan po fenotpu karotidnog plaka. U našoj studiji nismo dobili statistiĉki znaĉajnu razliku u Diskusija 123 nivou ekspresije miR-155 izmeĊu stabilnog i nestabilnog plaka. Treba napomenuti da broj uzoraka sa fenotipom nestabilnog plaka bio manji u poreĊenju sa fenotipom stabilnih lezija. Povećanje broja uzoraka je neophodno za preciznije utvrĊivanje moguće uloge miR-155 u progresiji bolesti. Za mir-155 je do sada u nekoliko in vitro studija pokazano da ima kritiĉnu ulogu u inflamatornim procesima u aterosklerozi. U odgovoru na stimulaciju Ang II transfekcija EĆ ĉoveka sa miR-155 je utišala ekspresiju ATR1, smanjila migraciju i adheziju Jurkatovih T limfocita za ove ćelije (Zhu i sar., 2011). Stimulacija ćelijske linije monocita ĉoveka (THP-1) oxLDL je dovela do dozno zavisnog povećanja ekspresije miR-155 (Chen i sar., 2009). MeĊutim, utišavanje miR- 155 sa antisense oligonukleotidima je dovelo do povećanja unosa ox-LDL u ove ćelije i formiranje penušavih ćelija (Huang i sar., 2010). Ekspresija miR-155 u cirkulaciji u ćelijama mononukleara ispitanika sa koronarnom bolešću je bila statistiĉki znaĉajno niţa u poreĊenju sa zdravom (kontrolnom grupom) (Fichtlscherer i sar., 2010). Detekcija mikroRNK u cirkulaciji (ekstraćelijski), a pored toga i u drugim telesnim teĉnostima (serumu, plazmi) je ukazala da bi ovi molekuli mogli biti znaĉajni prognostiĉki markeri (Gupta i sar., 2010; Fichtlscherer i sar., 2011). Jedan od ciljeva budućih istraţivanja bilo bi ispitivanje ekspresije miR-155 u tkivu plaka simultano sa ispitivanjem ekspresije u cirkulaciji. Analiza ekspresionog iRNK za ATR2 i proteina ATR2. Detektibilan nivo ekspresije iRNK za ATR2 Taq-Man esejima u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka i kontrolnom tkivu arterije nije utvrĊen. Ĉinjenica da je ATR2 in vitro eksprimiran samo u odreĊenim kulturama ćelija u odreĊenim uslovima (izvor ćelija za kulturu, tip ćelija, broj pasaţa, vreme diferencijacije ćelija) ukazala je na senzitivnost detekcije iRNK za ovaj receptor i oteţala ispitivanje njegove funkcije (Sohn i sar., 2000; De Gasparo i sar., 2000). Studija koje koje su ispitivale nivo ekspresije gena za ATR2 u aterosklerozi kod ĉoveka gotovo i da nema. Jedina studija u kojoj je detektovan ekspresioni nivo gena za ATR2 u aterosklerozi jeste u tkivu aorte. U ovoj studiji nivo ekspresije ATR2 u poreĊenju sa zdravim tkivom aorte bio je statistiĉki znaĉajno povišen (Kaschina i sar., 2009). Nedetektabilan nivo ekspresije gena za ATR2 u tkivu plaka ĉoveka bi mogao da bude posledica kratkog poluţivota molekula. S obzirom da je poluţivot iRNK u nekima kulturama ćelija, R3T3 ćelijska linija fibroblasta miša, kratkotrajan (maksimalno do 20 Diskusija 124 h) (Csikos i sar., 1998) usled pojaĉane degradacije iRNK, dobijen rezulatat u tkivu plaka nije iznenaĊujući. Aktivacija ATR2 na proteinskom nivou zabeleţena je u razliĉitim stanjima remodelovanja tkiva koja su udruţena sa inflamacijom: u zidu krvnog suda posle povrede, hipertrofiji leve komore srca (Akishita i sar., 2000; Yamamoto i sar., 2008; Steckelings i sar., 2010). U lizatu tkiva karotidnog aterosklerotskog plaka utvrĊen je detektabilni nivo ekspresije proteina ATR2. Ovim smo pokazali da je ATR2 aktiviran u karotidnom aterosklerotskom plaku pred endarterektomiju. U tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka ĉoveka ATR2 je detektovan imunohistohemijom (Johansson i sar., 2008). Imajući u vidu ĉinjenicu da inflamatorni citokini regulišu ekspresiju ATR2 (Horiuichi i sar., 2000) i njegovu reekspresiju posle povrede zida krvnog suda, nije iznenaĊujuća detekcija ATR2 u tkivu aterosklerotskog plaka. Proteinski nivo ATR2 u aterosklerozi je Western blot metodom in vitro pokazan u ćelijskoj liniji monocita koje su stimulisane Ang II, TNF-α, faktorom stimulacije kolnija makrofaga (M-CSF) (Kim i sar., 2005). Stimulacija ovih ćelija agonistom ATR2, CGP-42112A je dovela do sinteze MMP-1, matriks-metaloproteinaze koja moţe biti ukljuĉena u degradaciju fibrozne kapa plaka, a samim tim u njegovoj rupturi i remodelovanju (Kim i sar., 2005). Analiza ekspresionog nivoa iRNK za ACE2 i proteina ACE2. U poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije ekspresioni nivo iRNK za ACE2 u tkivu karotidnog plaka bio je statistiĉki znaĉajno smanjen. Studija novijeg datuma koja je ispitivala ekspresiju ACE2 u koronarnim aterosklerotskim plakovima u dijabetesu tipa II sugerisala je da je ekspresija gena ekstremno niska (Purushothaman i sar., 2013), što je u saglasnosti sa našim rezulatatom. U odnosu na fenotip plaka, stabilni i nestabilni, u našoj studiji ekspresioni nivo iRNK za ACE2 se nije statistiĉki znaĉajno razlikovao. U jedinoj do sada sprovedenoj studiji u karotidnoj aterosklerozi kod ĉoveka in situ hibridizacijom detektovana je iRNK za ACE2 u svim slojevima zida zdravih karotidnih arterija, u ranim lezijama kao i uznapredovalim, stabilnim i nestabilnim karotidnim aterosklerotskim plakovima (Sluimer i sar., 2008). Povećanjem broja uzoraka u našoj studiji i tehnološki savremenijoj karakterizaciji plakova biće omogućeno preciznije definisanje uloge ACE2 u progresiji KA. Diskusija 125 U našoj studiji je utvrĊen proteinski nivo enzima ACE2 u ukupnom lizatu tkiva aterosklerotskog plaka. Kvantifikovani nivo ekspresije ACE2 po fenotipu plaka kod muškaraca je bio viši u lizatu tkiva nestabilnog plaka u poreĊenju sa tkivom stabilnog plaka, ali s obzirom na mali broj uzoraka razlika nije dostigla znaĉajnost, ali bi trebalo ispitati ovaj trend na većem broju uzoraka. Studija iz 2008. godine koja je ispitivala tkivnu imunodetekciju proteina ACE2 u krvnim sudovima u srca pacijenata koji su imali operaciju premošćavanja krvnih sudova je ukazala na tkivnu specifiĉnost ekspresije ovog molekula shodno tipu krvnog suda i slojevima zida (Zulli i sar., 2008). U karotitidnom aterosklerotskom plaku je pored imunodetekcije ispitivana i detektovana funkcionalna aktivnost enzima ACE2 (Sluimer i sar., 2008). Zabeleţena niţa aktivnost ACE2 enzima u stabilnim aterosklerotskim lezijama u poreĊenju sa ranim lezijama i nestabilnim aterosklerotskim lezijama sklonih trombozi je ukazala da u razliĉitim stupnjevima bolesti postoji diferencijalna aktvnost enzima (Sluimer i sar., 2008). U budućim ispitivanjima treba uzeti u obzir i razliĉite faze nastanka i progresije bolesti. Odnos ekspresije iRNK ACE/ACE2. U tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka u kojima je utvrĊen nivo ekspresije iRNK za ACE i ACE2 je pokazano da je relativni nivo ekspresije iRNK za ACE2 u poreĊenju sa nivoom iRNK za ACE bio statistiĉki znaĉajno viši. Ovaj rezultat moţe ukazati da je u obolelom tkivu plaka balans ekspresije ova dva kljuĉna enzima RAS pomeren u smeru deaktivirajuće kaskade sistema koju ĉine ACE2/Ang (1-7)/ Mas. Relativni odnos ekspresije ACE/ACE2 u tkivu plaka je u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije bio statistiĉki znaĉajno niţi i to 3.4 puta u muškom polu, dok je kod ţena bio niţi 2.7 puta. UtvrĊeno smanjenje nivoa ekspresije ACE/ACE2 u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije bi moglo da ukaţe da u tkivu plaka mogu dominirati drugi enzimi koji uĉestvuju u generisanju Ang II. Naime u aorti ĉoveka zahvaćenoj aterosklerozom je pokazano da Ang II moţe da se generiše nezavisno od ACE enzimam, enzimom himazom (Ihara i sar., 1999). Sugerisano je da koekspresija ACE/ACE2 u tkivima ĉoveka moţe da predstavlja jedan od primarnih model sistema za izuĉavanje komparativne ćelijske biologije ACE i ACE2, odnosno njihove opozitne funkcije u remodelovanju tkiva kod ĉoveka (Guy i sar., 2008). Reciproĉna ekspresija ACE i ACE2 (povišen nivo jednog enzima, a smanjen nivo drugog enzima) u obolelom bubregu i srcu ispitanika sa hipertenzijom je u poreĊenju sa zdravim tkivom implicirala na disbalans ova dva enzima (Koka i sar. 2008). Povišen Diskusija 126 ekspresioni nivo jednog enzima u poreĊenju sa drugim a moţe da determiniše odnos angiotenzinskih peptida koju ovi enzimi generišu (Ang II/Ang (1-7)), a samim tim u ukaţe u kom je smeru pomeren balans RAS sistema u tkivu aterosklerotskog plaka. Analiza ekspresionog nivoa kolektrina (TMEM27). Ekspresija kolektrina u aterosklerotskom plaku do sada nije detektovana. U kontrolnim tkivu arterije zdravog ĉoveka ekspresioni nivo iRNK za TMEM27 nije detektovan. MeĊutim u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka je utvrĊen ekspresioni nivo TMEM27. S obzirom je uloga TMEM27 vezana za regulaciju homeostaze u tkivima nije iznenaĊujuća detekcija TMEM27 u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka. Nivo ekspresije iRNK za TMEM27 se izmeĊu fenotipova plaka nije statitistiĉki znaĉajno razlikovao. Nivo ekspresije kolektrina je pod kontrolom visokih koncentracija soli (Yasuhara i sar., 2008). Na taj naĉin bi mogao biti odgovoran u zadrţavanju soli i vode i nastanku HT osetljive na koliĉinu unete soli (Yasuhara i sar., 2008). Pacijenti sa KA u našoj studiji kod kojih je detektovan TMEM27 jesu u velikom procentu hipertenzivni (88.5 %). Genetiĉko-epidemiološka analiza zajedno sa analizom ekspresije gena RAS je imala za cilj da utvrdi da li je prisustvo alelelnih varijanti polimorfizamabu u genima za RAS asocirano sa predispozicijom za nastanak KA, njenim kliniĉkim karakteristikama i dogaĊajima i da li one utiĉu na nivo ekspresije iRNK za komponente RAS na tkivnom nivou, u aterosklerotskom plaku. Iako su GWAS studije (eng. genome wide association studies, GWAS) "mainstream" u otkrivanju genetiĉkih faktora rizika u bolesti, pristup izuĉavanja gena kandidata i dalje je aktuelan u genetiĉkoj epidemiologiji, jer direktno povezuje pojedinaĉne gene sa fenotipom u bolesti. Genetiĉko-epidemiološka analiza funkcionalnih polimorfizama u genima RAS u ispitanom uzorku u populaciji Srbije, izmeĊu kontrolne grupe zdravih ispitanika i pacijenata sa KA, za ispitivane polimorfizme u genima RAS nije pokazala statistiĉki znaĉajnu asocijaciju sa nastankom bolesti. MeĊutim, u grupi pacijenata sa KA polimorfizam I/D u genu za ACE i A1166C u genu za ATR1 bili su asocirani sa formiranjem NAP. U skladu sa tim ova dva polimorfizma bi se mogla izdvojiti kao znaĉajni prognostiĉki markeri za formiranje nestabilnih lezija. Polimorfizmi, I/D u genu za ACE i A/G -1332 u genu za ATR2 bi kod muškaraca mogli biti markeri koji modulišu tok bolesti u smeru nastanka TIA i CVI. Ipak treba imati u vidu da studije asocijacije pojedinaĉnih genotipova sa Diskusija 127 fenotipovima bolesti u velikom broju sluĉajeva otkrivaju mali deo totalnog, kombinovanog uticaja više gena ili više polimorfizama unutar istog gena. Stoga je jedan od naših budućih ciljeva u daljem istraţivanju da utvrdi kombinovani efekat ovih polimorfizama (epistatiĉke interakcije) sa fenotipom bolesti koji bi dodatno pomogao bolje definisanje genetiĉkog profila pacijenata sa KA. Otkrivanje genetiĉkih markera RAS u KA bi mogla biti od znaĉaja za bolju optimizaciji terapije ateroskleroze u bliskoj budućnosti. U tkivu plaka, polimorfizmi I/D u genu za ACE i A1166C u genu za ATR1 nisu modulisali ekspresiju iRNK za ove molekule. Pokazali smo da je u grupi ţena polimorfizam A1166C asociran sa povišenim nivoom miR-155. Nivo ekspresije proteina ATR1 je bio statistiĉki znaĉajno viši u NAP u odnosu na SAP. Interakcija izmeĊu polimorfizma A1166C u genu za ATR1, nivoa ekspresije miR-155 i proteinskog nivoa ATR1 bi mogla da ima kritiĉnu ulogu u progresiji karotidne ateroskleroze. Statistiĉki znaĉajno niţi odnos ekspresije ACE/ACE2 u tkivu plaka u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije sugeriše na veću ekspresiju ACE2 u odnosu na ACE u tkuvu aterosklerotskog plaka. To ukazuje na disbalans u sintezi ova dva enzimska molekula u karotidnom aterosklerotskom tkivu u odnosu na odnos koji postoji u kontrolnom tkivu. UtvrĊen viši nivo ekspresije ACE2 u tkivu nestabilnog plaka (kod ţena) moţe ukazati na kompezatornu ulogu ACE2 u procesu remodelovanja tkiva posle rupture u plaku. TMEM27 je prvi put detektovan u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka. S obzirom da ovaj molekul moţe da ukaţe na poremećaj metabolizma AK, jedan od ciljeva budućih istraţivanja bi bio da utvrdi kakva je korelacija ekspresionog nivoa TMEM27 sa nivoom homocistena, poznatog nezavisnog faktora rizika arteroskleroze. Zakljuĉci 128 6. ZAKLJUČCI 1. Polimorfizmi I/D u genu za ACE,A1166C u genu za ATR1 i -1332 A/G u genu za ATR2 nisu asocirani sa rizikom za nastanak karotidne ateroskleroze (KA) u ispitanom uzorku u populaciji Srbije. 2. Polimorfizam I/D u genu za ACE je nezavisni faktor rizika za formiranje nestabilnog aterosklerotskogplaka (NAP) u grupi pacijenata muškog pola. Nosioci genotipa II imaju 2.52 puta veći korigovani rizik za formiranje NAP od nosioca genotipova koji sadrţe alel D. 3. Polimorfizma A1166C u genu za ATR1 je nezavistan faktor rizika za formiranje nestabilnog aterosklerotskog plaka (NAP). Nosioci alela C, po dominantnom modelu nasleĊivanja, imaju 1.94 puta veći korigovani rizik za formiranje NAP od nosilaca genotipa AA. 4. Polimorfizam -1332 A/G u genu za ATR2 nije asociran sa rizikom za formiranje NAP kod pacijenata sa KA. 5. Polimorfizam -1332 A/G u genu za ATR2 je znaĉajan nezavistan faktor rizika za nastanak cerebrovaskularnog insulta (CVI) u grupi pacijenata muškog pola. Hemizigot G/- je asociran sa 2.67 većim korigovanim rizikom za nastanak CVI u odnosu na hemizigot A/-. 6. Polimorfizam I/D u genu za ACEje asociran sa nastankom prolaznog ishemijskog dogaĊaja (TIA) u grupi pacijenata muškog pola. Genotip DD, po recesivnom modelu nasleĊivanja, asociran je sa 2.2 puta većim korigovanim rizikom za nastanak TIA nego genotipovi koji sadrţe alel I. 7. U tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka iRNK za ACE, ACE2, TMEM27 i ATR1 se eksprimira, a iRNK za ATR2 se ne eksprimira. 8. UtvrĊeni ekspresioni nivoi iRNK za ACE i ACE2 subili znaĉajno sniţeni u plaku pacijenata oba pola u odnosu na kontrolno tkivo arterije.Relativni nivo ekspresije iRNK za ACE u poreĊenju sa nivoom iRNK za ACE2 bio je statistiĉki znaĉajno niţi. Zakljuĉci 129 9. Relativni odnos ekspresije ACE/ACE2 u tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka je u poreĊenju sa kontrolnim tkivom arterije bio 3.4 puta statistiĉki znaĉajno niţi kod muškaraca, a 2.7 puta kod ţena. 10. Nivoi ekspresije iRNK za ACE i ATR1 se nisu statistiĉki znaĉajno razlikovali po genotipovima ispitivanih polimorfizma I/D i A1166C. 11. U tkivu karotidnog aterosklerotskog plaka je utvrĊena ekspresija mikro- RNK, miR-155.UtvrĊeni nivo ekspresije miR-155 se po tipu plaka nije statistiĉki znaĉajno razlikovao. 12. Nivo ekspresije miR-155 se statistiĉki znaĉajno razlikovao u odnosu na genotipove polimorfizma A1166C u genu za ATR1 u grupi pacijenata ţenskog pola. Genotip CC je, po recesivnom modelu nasleĊivanja, statistiĉki znaĉajno asociran sa višim nivoom ekspresije miR-155. 13. Nivo ekspresije proteina ATR1 bio je statistiĉki znaĉajno viši u NAP u odnosu na stabilni aterosklerotski plak, dok se nivoi proteina ACE2 i ATR2 nisu statistiĉki znaĉajno razlikovali po tipu plaka. 14. Nivoi ekspresije proteinaATR1 i ATR2 nisuse statistiĉki znaĉajno razlikovali po genotipovima ispitivanih polimorfizama A1166C i -1332 A/G. Literatura 130 7. LITERATURA 1995. Carotid artery plaque composition--relationship to clinical presentation and ultrasound B-mode imaging. European Carotid Plaque Study Group. Eur J Vasc Endovasc Surg, 10, 23-30. 2011. Reprinted article "Carotid artery plaque composition--relationship to clinical presentation and ultrasound B-mode imaging". Eur J Vasc Endovasc Surg, 42, 022. ABDALLA, S., LOTHER, H. & QUITTERER, U. 2000. AT1-receptor heterodimers show enhanced G-protein activation and altered receptor sequestration. Nature, 407, 94-8. ABDALLA, S., LOTHER, H., ABDEL-TAWAB, A. M. & QUITTERER, U. 2001a. The angiotensin II AT2 receptor is an AT1 receptor antagonist. J Biol Chem, 276, 39721-6. ABDALLA, S., LOTHER, H., EL MASSIERY, A. & QUITTERER, U. 2001b. Increased AT(1) receptor heterodimers in preeclampsia mediate enhanced angiotensin II responsiveness. Nat Med, 7, 1003-9. ABELSON, J. F., KWAN, K. Y., O'ROAK, ABDALLA, S., LOTHER, H., EL MASSIERY, A. & QUITTERER, U. 2001. Increased AT(1) receptor heterodimers in preeclampsia mediate enhanced angiotensin II responsiveness. Nat Med, 7, 1003-9. ADAMS, B. D., FURNEAUX, H. & WHITE, B. A. 2007. The micro-ribonucleic acid (miRNA) miR-206 targets the human estrogen receptor-alpha (ERalpha) and represses ERalpha messenger RNA and protein expression in breast cancer cell lines. Mol Endocrinol, 21, 1132-47. AKISHITA, M., HORIUICHI, M., YAMADA, H., ZHANG, L., SHIRAKAMI, G., TAMURA, K., OUCHI, Y., DZAU, VJ. Inflammation influences vascular remodeling through AT2 receptor expression and signaling.Physiol Genomics. 2000 Jan 24;2(1):13-20. AKPINAR, P., KUWAJIMA, S., KRUTZFELDT, J. & STOFFEL, M. 2005. Tmem27: a cleaved and shed plasma membrane protein that stimulates pancreatic beta cell proliferation. Cell Metab, 2, 385-97. ALFAKIH, K., BROWN, B., LAWRANCE, R. A., WARBURTON, P., MAQBOOL, A., WALTERS, K., SAMANI, N. J., BALL, S. G., BALMFORTH, A. J. & HALL, A. S. 2007. Effect of a common X-linked angiotensin II type 2-receptor gene polymorphism (-1332 G/A) on the occurrence of premature myocardial infarction and stenotic atherosclerosis requiring revascularization. Atherosclerosis, 195, 6. ALFAKIH, K., LAWRANCE, R. A., MAQBOOL, A., WALTERS, K., BALL, S. G., BALMFORTH, A. J. & HALL, A. S. 2005. The clinical significance of a common, functional, X-linked angiotensin II type 2-receptor gene polymorphism (-1332 G/A) in a cohort of 509 families with premature coronary artery disease. Eur Heart J, 26, 584-9. ALFAKIH, K., MAQBOOL, A., SIVANANTHAN, M., WALTERS, K., BAINBRIDGE, G., RIDGWAY, J., BALMFORTH, A. J. & HALL, A. S. 2004. Left ventricle mass index and the common, functional, X-linked angiotensin II Literatura 131 type-2 receptor gene polymorphism (-1332 G/A) in patients with systemic hypertension. Hypertension, 43, 1189-94. ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAFFER, A. A., ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. & LIPMAN, D. J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25, 3389- 402. AMANT, C., HAMON, M., BAUTERS, C., RICHARD, F., HELBECQUE, N., MCFADDEN, E. P., ESCUDERO, X., LABLANCHE, J. M., AMOUYEL, P. & BERTRAND, M. E. 1997. The angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism is associated with coronary artery vasoconstriction. J Am Coll Cardiol, 29, 486-90. AMIR, O., AMIR, R. E., PAZ, H., ATTIAS, E., SAGIV, M. & LEWIS, B. S. 2009. Relation between AT1R gene polymorphism and long-term outcome in patients with heart failure. Cardiology, 112, 151-7. ARENAS, I. A., XU, Y., LOPEZ-JARAMILLO, P. & DAVIDGE, S. T. 2004. Angiotensin II-induced MMP-2 release from endothelial cells is mediated by TNF-alpha. Am J Physiol Cell Physiol, 286, 26. AVDONIN, P. V., COTTET-MAIRE, F., AFANASJEVA, G. V., LOKTIONOVA, S. A., LHOTE, P. & RUEGG, U. T. 1999. Cyclosporine A up-regulates angiotensin II receptors and calcium responses in human vascular smooth muscle cells. Kidney Int, 55, 2407-14. BACKLUND, M., PAUKKU, K., DAVIET, L., DE BOER, R. A., VALO, E., HAUTANIEMI, S., KALKKINEN, N., EHSAN, A., KONTULA, K. K. & LEHTONEN, J. Y. 2009. Posttranscriptional regulation of angiotensin II type 1 receptor expression by glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Nucleic Acids Res, 37, 2346-58. BADER, M. & GANTEN, D. 2008. Update on tissue renin-angiotensin systems. J Mol Med, 86, 615-21. BADIMON, L., PADRO, T. & VILAHUR, G. 2012. Atherosclerosis, platelets and thrombosis in acute ischaemic heart disease. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care, 1, 60-74 BALMFORTH, A. J. 2010. Angiotensin II type 2 receptor gene polymorphisms in cardiovascular disease. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 11, 79-85. BALTATU, O. C., CAMPOS, L. A. & BADER, M. 2011. Local renin-angiotensin system and the brain--a continuous quest for knowledge. Peptides, 32, 1083-6. BARBER, R. D., HARMER, D. W., COLEMAN, R. A. & CLARK, B. J. 2005. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiol Genomics, 21, 389-95. BARNES, P. J. & KARIN, M. 1997. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases. N Engl J Med, 336, 1066-71. BARRETT, J. D., ZHANG, Z., ZHU, J. H., LEE, D. B., WARD, H. J., JAMGOTCHIAN, N., HU, M. S., FREDAL, A., GIORDANI, M. & EGGENA, P. 1998. Erythropoietin upregulates angiotensin receptors in cultured rat vascular smooth muscle cells. J Hypertens, 16, 1749-57. BAUDIN, B. 2005. Polymorphism in angiotensin II receptor genes and hypertension. Exp Physiol, 90, 277-82. BENETOS, A., GAUTIER, S., RICARD, S., TOPOUCHIAN, J., ASMAR, R., POIRIER, O., LAROSA, E., GUIZE, L., SAFAR, M., SOUBRIER, F. & Literatura 132 CAMBIEN, F. 1996. Influence of angiotensin-converting enzyme and angiotensin II type 1 receptor gene polymorphisms on aortic stiffness in normotensive and hypertensive patients. Circulation, 94, 698-703. BENIGNI, A., CASSIS, P. & REMUZZI, G. 2010. Angiotensin II revisited: new roles in inflammation, immunology and aging. EMBO Mol Med, 2, 247-57. BERGE, K. E. & BERG, K. 1998. Polymorphisms at the angiotensinogen (AGT) and angiotensin II type 1 receptor (AT1R) loci and normal blood pressure. Clin Genet, 53, 214-9. BERGSMA, D. J., ELLIS, C., KUMAR, C., NUTHULAGANTI, P., KERSTEN, H., ELSHOURBAGY, N., GRIFFIN, E., STADEL, J. M. & AIYAR, N. 1992. Cloning and characterization of a human angiotensin II type 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 183, 989-95. BEYAZIT, Y., PURNAK, T., GUVEN, G. S. & HAZNEDAROGLU, I. C. 2010. Local bone marrow Renin-Angiotensin system and atherosclerosis. Cardiol Res Pract, 22, 714515. BLANCO, R. R., AUSTIN, H., VEST, R. N., 3RD, VALADRI, R., LI, W., LASSEGUE, B., SONG, Q., LONDON, B., DUDLEY, S. C., BLOOM, H. L., SEARLES, C. D. & ZAFARI, A. M. 2012. Angiotensin receptor type 1 single nucleotide polymorphism 1166A/C is associated with malignant arrhythmias and altered circulating miR-155 levels in patients with chronic heart failure. J Card Fail, 18, 717-23. BLOEM, L. J., MANATUNGA, A. K. & PRATT, J. H. 1996. Racial difference in the relationship of an angiotensin I-converting enzyme gene polymorphism to serum angiotensin I-converting enzyme activity. Hypertension, 27, 62-6. BONNARDEAUX, A., DAVIES, E., JEUNEMAITRE, X., FERY, I., CHARRU, A., CLAUSER, E., TIRET, L., CAMBIEN, F., CORVOL, P. & SOUBRIER, F. 1994. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphisms in human essential hypertension. Hypertension, 24, 63-9. BRASIER, A. R., RECINOS, A., 3RD & ELEDRISI, M. S. 2002. Vascular inflammation and the renin-angiotensin system. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 22, 1257-66. BRASSARD, P., AMIRI, F. & SCHIFFRIN, E. L. 2005. Combined angiotensin II type 1 and type 2 receptor blockade on vascular remodeling and matrix metalloproteinases in resistance arteries. Hypertension, 46, 598-606. CAMERON, V. A., MOCATTA, T. J., PILBROW, A. P., FRAMPTON, C. M., TROUGHTON, R. W., RICHARDS, A. M. & WINTERBOURN, C. C. 2006. Angiotensin type-1 receptor A1166C gene polymorphism correlates with oxidative stress levels in human heart failure. Hypertension, 47, 1155-61. CAREY, R. M. 2005. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension, 45, 840-4. CASSIS, L. A., POLICE, S. B., YIANNIKOURIS, F. & THATCHER, S. E. 2008. Local adipose tissue renin-angiotensin system. Curr Hypertens Rep, 10, 93-8. CASTELLANO, M., MUIESAN, M. L., BESCHI, M., RIZZONI, D., CINELLI, A., SALVETTI, M., PASINI, G., PORTERI, E., BETTONI, G., ZULLI, R. & AGABITI-ROSEI, E. 1996. Angiotensin II type 1 receptor A/C1166 polymorphism. Relationships with blood pressure and cardiovascular structure. Hypertension, 28, 1076-80. Literatura 133 CEOLOTTO, G., PAPPARELLA, I., BORTOLUZZI, A., STRAPAZZON, G., RAGAZZO, F., BRATTI, P., FABRICIO, A. S., SQUARCINA, E., GION, M., PALATINI, P. & SEMPLICINI, A. 2011. Interplay between miR-155, AT1R A1166C polymorphism, and AT1R expression in young untreated hypertensives. Am J Hypertens, 24, 241-6. CHAPMAN, C. M., PALMER, L. J., MCQUILLAN, B. M., HUNG, J., BURLEY, J., HUNT, C., THOMPSON, P. L. & BEILBY, J. P. 2001. Polymorphisms in the angiotensinogen gene are associated with carotid intimal-medial thickening in females from a community-based population. Atherosclerosis, 159, 209-17. CHEN, T., HUANG, Z., WANG, L., WANG, Y., WU, F., MENG, S. & WANG, C. 2009. MicroRNA-125a-5p partly regulates the inflammatory response, lipid uptake, and ORP9 expression in oxLDL-stimulated monocyte/macrophages. Cardiovasc Res, 83, 131-9. CHENG, Z. J., VAPAATALO, H. & MERVAALA, E. 2005. Angiotensin II and vascular inflammation. Med Sci Monit, 11, 25. CHERUVU, P. K., FINN, A. V., GARDNER, C., CAPLAN, J., GOLDSTEIN, J., STONE, G. W., VIRMANI, R. & MULLER, J. E. 2007. Frequency and distribution of thin-cap fibroatheroma and ruptured plaques in human coronary arteries: a pathologic study. J Am Coll Cardiol, 50, 940-9.. CHO, K. Y., MIYOSHI, H., KURODA, S., YASUDA, H., KAMIYAMA, K., NAKAGAWARA, J., TAKIGAMI, M., KONDO, T. & ATSUMI, T. 2012. The Phenotype of Infiltrating Macrophages Influences Arteriosclerotic Plaque Vulnerability in the Carotid Artery. J Stroke Cerebrovasc Dis, 26, 020. CIPOLLONE, F., FAZIA, M., IEZZI, A., PINI, B., CUCCURULLO, C., ZUCCHELLI, M., DE CESARE, D., UCCHINO, S., SPIGONARDO, F., DE LUCA, M., MURARO, R., BEI, R., BUCCI, M., CUCCURULLO, F. & MEZZETTI, A. 2004. Blockade of the angiotensin II type 1 receptor stabilizes atherosclerotic plaques in humans by inhibiting prostaglandin E2-dependent matrix metalloproteinase activity. Circulation, 109, 1482-8. CLARKE, C., FLORES-MUNOZ, M., MCKINNEY, C. A., MILLIGAN, G. & NICKLIN, S. A. 2013. Regulation of cardiovascular remodeling by the counter- regulatory axis of the renin-angiotensin system. Future Cardiol, 9, 23-38. COATES, D. 2003. The angiotensin converting enzyme (ACE). Int J Biochem Cell Biol, 35, 769-73. CORVOL, P., MICHAUD, A., SOUBRIER, F. & WILLIAMS, T. A. 1995a. Recent advances in knowledge of the structure and function of the angiotensin I converting enzyme. J Hypertens Suppl, 13, S3-10. CORVOL, P., WILLIAMS, T. A. & SOUBRIER, F. 1995b. Peptidyl dipeptidase A: angiotensin I-converting enzyme. Methods Enzymol, 248, 283-305. COSTEROUSSE, O., ALLEGRINI, J., LOPEZ, M. & ALHENC-GELAS, F. 1993. Angiotensin I-converting enzyme in human circulating mononuclear cells: genetic polymorphism of expression in T-lymphocytes. Biochem J, 290, 33-40. CRACKOWER, M. A., SARAO, R., OUDIT, G. Y., YAGIL, C., KOZIERADZKI, I., SCANGA, S. E., OLIVEIRA-DOS-SANTOS, A. J., DA COSTA, J., ZHANG, L., PEI, Y., SCHOLEY, J., FERRARIO, C. M., MANOUKIAN, A. S., CHAPPELL, M. C., BACKX, P. H., YAGIL, Y. & PENNINGER, J. M. 2002. Angiotensin-converting enzyme 2 is an essential regulator of heart function. Nature, 417, 822-8. Literatura 134 CSIKOS, T., BALMFORTH, A. J., GROJEC, M., GOHLKE, P., CULMAN, J. & UNGER, T. 1998. Angiotensin AT2 receptor degradation is prevented by ligand occupation. Biochem Biophys Res Commun, 243, 142-7. CURNOW, K. M., PASCOE, L. & WHITE, P. C. 1992. Genetic analysis of the human type-1 angiotensin II receptor. Mol Endocrinol, 6, 1113-8. CURNOW, K. M., PASCOE, L., DAVIES, E., WHITE, P. C., CORVOL, P. & CLAUSER, E. 1995. Alternatively spliced human type 1 angiotensin II receptor mRNAs are translated at different efficiencies and encode two receptor isoforms. Mol Endocrinol, 9, 1250-62. DANDAPAT, A., HU, C. P., CHEN, J., LIU, Y., KHAN, J. A., REMEO, F., CAREY, R. M., HERMONAT, P. L. & MEHTA, J. L. 2008. Over-expression of angiotensin II type 2 receptor (agtr2) decreases collagen accumulation in atherosclerotic plaque. Biochem Biophys Res Commun, 366, 871-7. DANILCZYK, U., SARAO, R., REMY, C., BENABBAS, C., STANGE, G., RICHTER, A., ARYA, S., POSPISILIK, J. A., SINGER, D., CAMARGO, S. M., MAKRIDES, V., RAMADAN, T., VERREY, F., WAGNER, C. A. & PENNINGER, J. M. 2006. Essential role for collectrin in renal amino acid transport. Nature, 444, 1088-91. DANSER, A. H., BATENBURG, W. W., VAN DEN MEIRACKER, A. H. & DANILOV, S. M. 2007. ACE phenotyping as a first step toward personalized medicine for ACE inhibitors. Why does ACE genotyping not predict the therapeutic efficacy of ACE inhibition? Pharmacol Ther, 113, 607-18. DANSER, A. H., DERKX, F. H., SCHALEKAMP, M. A., HENSE, H. W., RIEGGER, G. A. & SCHUNKERT, H. 1998. Determinants of interindividual variation of renin and prorenin concentrations: evidence for a sexual dimorphism of (pro)renin levels in humans. J Hypertens, 16, 853-62. DANSER, A. H., SCHALEKAMP, M. A., BAX, W. A., VAN DEN BRINK, A. M., SAXENA, P. R., RIEGGER, G. A. & SCHUNKERT, H. 1995. Angiotensin- converting enzyme in the human heart. Effect of the deletion/insertion polymorphism. Circulation, 92, 1387-8. DAUGHERTY, A., MANNING, M. W. & CASSIS, L. A. 2001. Antagonism of AT2 receptors augments angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysms and atherosclerosis. Br J Pharmacol, 134, 865-70. DAUGHERTY, A., RATERI, D. L., LU, H., INAGAMI, T. & CASSIS, L. A. 2004. Hypercholesterolemia stimulates angiotensin peptide synthesis and contributes to atherosclerosis through the AT1A receptor. Circulation, 110, 3849-57. DAVIES, M. J. Stability and instability: two faces of coronary atherosclerosis. The Paul Dudley White Lecture 1995, Circulation. 1996 Oct 15;94(8):2013-20. DAVIET, L., LEHTONEN, J. Y., HAYASHIDA, W., DZAU, V. J. & HORIUCHI, M. 2001. Intracellular third loops in AT1 and AT2 receptors determine subtype specificity. Life Sci, 69, 509-16. DE GASPARO, M., CATT, K. J., INAGAMI, T., WRIGHT, J. W. & UNGER, T. 2000. International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors. Pharmacol Rev, 52, 415-72. DE MELLO, W. C. & FROHLICH, E. D. 2011. On the local cardiac renin angiotensin system. Basic and clinical implications. Peptides, 32, 1774-9 Literatura 135 DEL SER, T., BORNSTEIN, B., BARBA, R. & CEMILLAN, C. 2001. Relationship of angiotensin converting enzyme genotype with serum triglyceride concentration in stroke patients. Neurosci Lett, 316, 21-4. DELLA-MORTE, D., GUADAGNI, F., PALMIROTTA, R., FERRONI, P. & RUNDEK, T. 2013. D allele of ACE gene insertion/deletion polymorphism: a marker for risk of ischemic stroke. Pharmacogenomics, 14, 16. DESSI-FULGHERI, P., CATALINI, R., SARZANI, R., STURBINI, S., SIRAGUSA, N., GUAZZAROTTI, F., OFFIDANI, M., TAMBURRINI, P., ZINGARETTI, O. & RAPPELLI, A. 1995. Angiotensin converting enzyme gene polymorphism and carotid atherosclerosis in a low-risk population. J Hypertens, 13, 1593-6. DICHGANS, M. 2007. Genetics of ischaemic stroke. Lancet Neurol, 6, 149-61. DIET, F., PRATT, R. E., BERRY, G. J., MOMOSE, N., GIBBONS, G. H. & DZAU, V. J. 1996. Increased accumulation of tissue ACE in human atherosclerotic coronary artery disease. Circulation, 94, 2756-67. DIEZ, J., LAVIADES, C., ORBE, J., ZALBA, G., LOPEZ, B., GONZALEZ, A., MAYOR, G., PARAMO, J. A. & BELOQUI, O. 2003. The A1166C polymorphism of the AT1 receptor gene is associated with collagen type I synthesis and myocardial stiffness in hypertensives. J Hypertens, 21, 2085-92. DONG, B., ZHANG, C., FENG, J. B., ZHAO, Y. X., LI, S. Y., YANG, Y. P., DONG, Q. L., DENG, B. P., ZHU, L., YU, Q. T., LIU, C. X., LIU, B., PAN, C. M., SONG, H. D., ZHANG, M. X. & ZHANG, Y. 2008. Overexpression of ACE2 enhances plaque stability in a rabbit model of atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 28, 1270-6. DONNAN, G. A., DAVIS, S. M., CHAMBERS, B. R. & GATES, P. C. 1998. Surgery for prevention of stroke. Lancet, 351, 1372-3. DONOGHUE, M., HSIEH, F., BARONAS, E., GODBOUT, K., GOSSELIN, M., STAGLIANO, N., DONOVAN, M., WOOLF, B., ROBISON, K., JEYASEELAN, R., BREITBART, R. E. & ACTON, S. 2000. A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase (ACE2) converts angiotensin I to angiotensin 1-9. Circ Res, 87, E1-9. DORRANCE, A. M. Angiotensin II type 2 receptor agonists as therapies for ishemic stroke, Hypertension. 2012 Dec; 60 (6): 1391-2. DUDLEY, D. T. & SUMMERFELT, R. M. 1993. Regulated expression of angiotensin II (AT2) binding sites in R3T3 cells. Regul Pept, 44, 199-206. DUDLEY, D. T., HUBBELL, S. E. & SUMMERFELT, R. M. 1991. Characterization of angiotensin II (AT2) binding sites in R3T3 cells. Mol Pharmacol, 40, 360-7. DUFFY, A. A., MARTIN, M. M. & ELTON, T. S. 2004. Transcriptional regulation of the AT1 receptor gene in immortalized human trophoblast cells. Biochim Biophys Acta, 5, 158-70. DUPONT, J., DEROUET, M., SIMON, J. & TAOUIS, M. 1998. Nutritional state regulates insulin receptor and IRS-1 phosphorylation and expression in chicken. Am J Physiol, 274, E309-16. ELTON, T. S. & MARTIN, M. M. 2003. Alternative splicing: a novel mechanism to fine-tune the expression and function of the human AT1 receptor. Trends Endocrinol Metab, 14, 66-71. ELTON, T. S. & MARTIN, M. M. 2007. Angiotensin II type 1 receptor gene regulation: transcriptional and posttranscriptional mechanisms. Hypertension, 49, 953-61. Literatura 136 ELTON, T. S., KUHN, D. E., MALANA, G. E., MARTIN, M. M., NUOVO, G. J., PLEISTER, A. P. & FELDMAN, D. S. 2008. Abstract 5247: MiR-132 Regulates Angiotensin II Type 1 Receptor Expression Through a Protein Coding Region Binding Site. Circulation, 118, S_513. ELTON, T. S., SANSOM, S. E. & MARTIN, M. M. 2010. Cardiovascular Disease, Single Nucleotide Polymorphisms; and the Renin Angiotensin System: Is There a MicroRNA Connection? Int J Hypertens, 4, 281692. ELTON, T.S., KUHN, D.E., MALANA, G.E., MARTIN, M.M., NUOVO, G.J., PLEISTER, A.P., FELDMAN, D.S. 2008. MiR-132 regulates angiotensin II type 1 receptor expression through a protein coding region binding site. Circulation, 18, S513. ERDMANN, J., GUSE, M., KALLISCH, H., FLECK, E. & REGITZ-ZAGROSEK, V. 2000. Novel intronic polymorphism (+1675G/A) in the human angiotensin II subtype 2 receptor gene. Hum Mutat, 15, 487. ERIKSSON, U., DANILCZYK, U. & PENNINGER, J. M. 2002. Just the beginning: novel functions for angiotensin-converting enzymes. Curr Biol, 12, R745-52. FARAONI, I., ANTONETTI, F. R., CARDONE, J. & BONMASSAR, E. 2009. miR- 155 gene: a typical multifunctional microRNA. Biochim Biophys Acta, 6, 497- 505. FARB, A., BURKE, A. P., TANG, A. L., LIANG, T. Y., MANNAN, P., SMIALEK, J. & VIRMANI, R. 1996. Coronary plaque erosion without rupture into a lipid core. A frequent cause of coronary thrombosis in sudden coronary death. Circulation, 93, 1354-63. FERNANDEZ-ORTIZ, A., BADIMON, J. J., FALK, E., FUSTER, V., MEYER, B., MAILHAC, A., WENG, D., SHAH, P. K. & BADIMON, L. 1994. Characterization of the relative thrombogenicity of atherosclerotic plaque components: implications for consequences of plaque rupture. J Am Coll Cardiol, 23, 1562-9. FICHTLSCHERER, S., DE ROSA, S., FOX, H., SCHWIETZ, T., FISCHER, A., LIEBETRAU, C., WEBER, M., HAMM, C. W., ROXE, T., MULLER- ARDOGAN, M., BONAUER, A., ZEIHER, A. M. & DIMMELER, S. 2010. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res, 107, 677-84. FICHTLSCHERER, S., ZEIHER, A. M. & DIMMELER, S. 2011. Circulating microRNAs: biomarkers or mediators of cardiovascular diseases? Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31, 2383-90. FLAHERTY, M. L., KISSELA, B., KHOURY, J. C., ALWELL, K., MOOMAW, C. J., WOO, D., KHATRI, P., FERIOLI, S., ADEOYE, O., BRODERICK, J. P. & KLEINDORFER, D. 2013. Carotid artery stenosis as a cause of stroke. Neuroepidemiology, 40, 36-41. FOY, C. A., MCCORMACK, L. J., KNOWLER, W. C., BARRETT, J. H., CATTO, A. & GRANT, P. J. 1996. The angiotensin-I converting enzyme (ACE) gene I/D polymorphism and ACE levels in Pima Indians. J Med Genet, 33, 336-7. FRID, M. G., DEMPSEY, E. C., DURMOWICZ, A. G. & STENMARK, K. R. 1997. Smooth muscle cell heterogeneity in pulmonary and systemic vessels. Importance in vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 17, 1203-9. FUKUDA, D. & SATA, M. 2008. Role of bone marrow renin-angiotensin system in the pathogenesis of atherosclerosis. Pharmacol Ther, 118, 268-76. Literatura 137 FUKUDA, D., SATA, M., ISHIZAKA, N. & NAGAI, R. 2008. Critical role of bone marrow angiotensin II type 1 receptor in the pathogenesis of atherosclerosis in apolipoprotein E deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 28, 90-6. FUKUHARA, M., GEARY, R. L., DIZ, D. I., GALLAGHER, P. E., WILSON, J. A., GLAZIER, S. S., DEAN, R. H. & FERRARIO, C. M. 2000. Angiotensin- converting enzyme expression in human carotid artery atherosclerosis. Hypertension, 35, 353-9. FUKUI, K., YANG, Q., CAO, Y., TAKAHASHI, N., HATAKEYAMA, H., WANG, H., WADA, J., ZHANG, Y., MARSELLI, L., NAMMO, T., YONEDA, K., ONISHI, M., HIGASHIYAMA, S., MATSUZAWA, Y., GONZALEZ, F. J., WEIR, G. C., KASAI, H., SHIMOMURA, I., MIYAGAWA, J., WOLLHEIM, C. B. & YAMAGATA, K. 2005. The HNF-1 target collectrin controls insulin exocytosis by SNARE complex formation. Cell Metab, 2, 373-84. FUKUYAMA, K., ICHIKI, T., TAKEDA, K., TOKUNOU, T., IINO, N., MASUDA, S., ISHIBASHI, M., EGASHIRA, K., SHIMOKAWA, H., HIRANO, K., KANAIDE, H. & TAKESHITA, A. 2003. Downregulation of vascular angiotensin II type 1 receptor by thyroid hormone. Hypertension, 41, 598-603. GALIS, Z. S. & KHATRI, J. J. 2002. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis: the good, the bad, and the ugly. Circ Res, 90, 251-62. GALIS, Z. S., SUKHOVA, G. K., LARK, M. W. & LIBBY, P. 1994. Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques. J Clin Invest, 94, 2493- 503. GALLAGHER, P. E., LI, P., LENHART, J. R., CHAPPELL, M. C. & BROSNIHAN, K. B. 1999. Estrogen regulation of angiotensin-converting enzyme mRNA. Hypertension, 33, 323-8. GENG, Y. J. & LIBBY, P. 2002. Progression of atheroma: a struggle between death and procreation. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 22, 1370-80. GIRERD, X., HANON, O., MOURAD, J. J., BOUTOUYRIE, P., LAURENT, S. & JEUNEMAITRE, X. 1998. Lack of association between renin-angiotensin system, gene polymorphisms, and wall thickness of the radial and carotid arteries. Hypertension, 32, 579-83. GITTENBERGER-DE GROOT, A. C., DERUITER, M. C., BERGWERFF, M. & POELMANN, R. E. 1999. Smooth muscle cell origin and its relation to heterogeneity in development and disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 19, 1589-94. GLASS, C. K. & WITZTUM, J. L. 2001. Atherosclerosis. the road ahead. Cell, 104, 503-16. GOSWAMI, P. C., ALBEE, L. D., SPITZ, D. R. & RIDNOUR, L. A. 1997. A polymerase chain reaction assay for simultaneous detection and quantitation of proto-oncogene and GAPD mRNAs in different cell growth rates. Cell Prolif, 30, 271-82. GOUBERGRITS, L., AFFELD, K., FERNANDEZ-BRITTO, J. & FALCON, L. 2002. Geometry of the human common carotid artery. A vessel cast study of 86 specimens. Pathol Res Pract, 198, 543-51. GRAY-WEALE, A. C., GRAHAM, J. C., BURNETT, J. R., BYRNE, K. & LUSBY, R. J. 1988. Carotid artery atheroma: comparison of preoperative B-mode ultrasound Literatura 138 appearance with carotid endarterectomy specimen pathology. J Cardiovasc Surg, 29, 676-81. GREEN, M. R. 1986. Pre-mRNA splicing. Annu Rev Genet, 20, 671-708. GRIENDLING, K. K. & USHIO-FUKAI, M. 2000. Reactive oxygen species as mediators of angiotensin II signaling. Regul Pept, 91, 21-7. GRIENDLING, K. K., LASSEGUE, B. & ALEXANDER, R. W. 1996. Angiotensin receptors and their therapeutic implications. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 36, 281-306. GRIENDLING, K. K., MURPHY, T. J. & ALEXANDER, R. W. 1993. Molecular biology of the renin-angiotensin system. Circulation, 87, 1816-28. GROESCHEL, M. The renin-angiotensin system and immune function, citation, The renin-angiotensin system and immune function, Master thesis. 2009. GRONHOLDT, M. L. 1999. Ultrasound and lipoproteins as predictors of lipid-rich, rupture-prone plaques in the carotid artery. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 19, 2-13. GRONHOLDT, M. L. 1999. Ultrasound and lipoproteins as predictors of lipid-rich, rupture-prone plaques in the carotid artery. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 19, 2-13. GRONHOLDT, M. L., NORDESTGAARD, B. G., BENTZON, J., WIEBE, B. M., ZHOU, J., FALK, E. & SILLESEN, H. 2002. Macrophages are associated with lipid-rich carotid artery plaques, echolucency on B-mode imaging, and elevated plasma lipid levels. J Vasc Surg, 35, 137-45. GRONHOLDT, M. L., NORDESTGAARD, B. G., SCHROEDER, T. V., VORSTRUP, S. & SILLESEN, H. 2001. Ultrasonic echolucent carotid plaques predict future strokes. Circulation, 104, 68-73. GROSS, C. M., GERBAULET, S., QUENSEL, C., KRAMER, J., MITTELMEIER, H. O., LUFT, F. C. & DIETZ, R. 2002. Angiotensin II type 1 receptor expression in human coronary arteries with variable degrees of atherosclerosis. Basic Res Cardiol, 97, 327-33. GROTE, K., DREXLER, H. & SCHIEFFER, B. Renin-angiotensin system and atherosclerosis, Nephrol Dial Transplant. 2004 Apr;19(4):770-3. GUNTHER, S., GIMBRONE, M. A., JR. & ALEXANDER, R. W. 1980. Regulation by angiotensin II of its receptors in resistance blood vessels. Nature, 287, 230-2. GUO, D. F. & INAGAMI, T. 1994. Epidermal growth factor-enhanced human angiotensin II type 1 receptor. Hypertension, 23, 1032-5. GUO, D. F., FURUTA, H., MIZUKOSHI, M. & INAGAMI, T. 1994. The genomic organization of human angiotensin II type 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 200, 313-9. GUO, Y. J., LI, W. H., WU, R., XIE, Q. & CUI, L. Q. 2008. ACE2 overexpression inhibits angiotensin II-induced monocyte chemoattractant protein-1 expression in macrophages. Arch Med Res, 39, 149-54. GUPTA, S. K., BANG, C. & THUM, T. 2010. Circulating microRNAs as biomarkers and potential paracrine mediators of cardiovascular disease. Circ Cardiovasc Genet, 3, 484-8. GUTHRIE, G. P., JR. 1995. Angiotensin receptors: physiology and pharmacology. Clin Cardiol, 18, 29-34. GUY, J. L., LAMBERT, D. W., TURNER, A. J. & PORTER, K. E. 2008. Functional angiotensin-converting enzyme 2 is expressed in human cardiac myofibroblasts. Exp Physiol, 93, 579-88. Literatura 139 HANSSON, G. K. & LIBBY, P. 2006. The immune response in atherosclerosis: a double-edged sword. Nat Rev Immunol, 6, 508-19. HANSSON, G. K. 2005. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. N Engl J Med, 352, 1685-95. HANSSON, G. K. 2009. Inflammatory mechanisms in atherosclerosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 7, 328-331. HARMER, D., GILBERT, M., BORMAN, R. & CLARK, K. L. 2002. Quantitative mRNA expression profiling of ACE 2, a novel homologue of angiotensin converting enzyme. FEBS Lett, 532, 107-10. HARRISON-BERNARD, L. M., EL-DAHR, S. S., O'LEARY, D. F. & NAVAR, L. G. 1999. Regulation of angiotensin II type 1 receptor mRNA and protein in angiotensin II-induced hypertension. Hypertension, 33, 340-6. HELLEN, C. U. & SARNOW, P. 2001. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev, 15, 1593-612. HENRION, D., AMANT, C., BENESSIANO, J., PHILIP, I., PLANTEFEVE, G., CHATEL, D., HWAS, U., DESMONT, J. M., DURAND, G., AMOUYEL, P. & LEVY, B. I. 1998. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism is associated with an increased vascular reactivity in the human mammary artery in vitro. J Vasc Res, 35, 356-62. HENRIQUES, T. A., HUANG, J., D'SOUZA, S. S., DAUGHERTY, A. & CASSIS, L. A. 2004. Orchidectomy, but not ovariectomy, regulates angiotensin II-induced vascular diseases in apolipoprotein E-deficient mice. Endocrinology, 145, 3866- 72. HENSKENS, L. H., KROON, A. A., VAN BOXTEL, M. P., HOFMAN, P. A. & DE LEEUW, P. W. 2005. Associations of the angiotensin II type 1 receptor A1166C and the endothelial NO synthase G894T gene polymorphisms with silent subcortical white matter lesions in essential hypertension. Stroke, 36, 1869-73. HEO, S. H., CHO, C. H., KIM, H. O., JO, Y. H., YOON, K. S., LEE, J. H., PARK, J. C., PARK, K. C., AHN, T. B., CHUNG, K. C., YOON, S. S. & CHANG, D. I. 2011. Plaque rupture is a determinant of vascular events in carotid artery atherosclerotic disease: involvement of matrix metalloproteinases 2 and 9. J Clin Neurol, 7, 69-76. HERDER, M., JOHNSEN, S. H., ARNTZEN, K. A. & MATHIESEN, E. B. 2012. Risk factors for progression of carotid intima-media thickness and total plaque area: a 13-year follow-up study: the Tromso Study. Stroke, 43, 1818-23. HERRMANN, S. M., NICAUD, V., SCHMIDT-PETERSEN, K., PFEIFER, J., ERDMANN, J., MCDONAGH, T., DARGIE, H. J., PAUL, M. & REGITZ- ZAGROSEK, V. 2002. Angiotensin II type 2 receptor gene polymorphism and cardiovascular phenotypes: the GLAECO and GLAOLD studies. Eur J Heart Fail, 4, 707-12. HINDORFF, L. A., HECKBERT, S. R., TRACY, R., TANG, Z., PSATY, B. M., EDWARDS, K. L., SISCOVICK, D. S., KRONMAL, R. A. & NAZAR- STEWART, V. 2002. Angiotensin II type 1 receptor polymorphisms in the cardiovascular health study: relation to blood pressure, ethnicity, and cardiovascular events. Am J Hypertens, 15, 1050-6. HOCH, N. E., GUZIK, T. J., CHEN, W., DEANS, T., MAALOUF, S. A., GRATZE, P., WEYAND, C. & HARRISON, D. G. 2009. Regulation of T-cell function by Literatura 140 endogenously produced angiotensin II. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 296, 10. HONG, S. H., PARK, H. M., AHN, J. Y., KIM, O. J., HWANG, T. S., OH, D. & KIM, N. K. 2008. ACE I/D polymorphism in Korean patients with ischemic stroke and silent brain infarction. Acta Neurol Scand, 117, 244-9. HORIUCHI, M., HAYASHIDA, W., AKISHITA, M., YAMADA, S., LEHTONEN, J. Y., TAMURA, K., DAVIET, L., CHEN, Y. E., HAMAI, M., CUI, T. X., IWAI, M. & MINOKOSHI, Y. 2000. Interferon-gamma induces AT(2) receptor expression in fibroblasts by Jak/STAT pathway and interferon regulatory factor- 1. Circ Res, 86, 233-40. HOSHIDA, S., KATO, J., NISHINO, M., EGAMI, Y., TAKEDA, T., KAWABATA, M., TANOUCHI, J., YAMADA, Y. & KAMADA, T. 2001. Increased angiotensin-converting enzyme activity in coronary artery specimens from patients with acute coronary syndrome. Circulation, 103, 630-3. HU, C., DANDAPAT, A., CHEN, J., LIU, Y., HERMONAT, P. L., CAREY, R. M. & MEHTA, J. L. 2008. Over-expression of angiotensin II type 2 receptor (agtr2) reduces atherogenesis and modulates LOX-1, endothelial nitric oxide synthase and heme-oxygenase-1 expression. Atherosclerosis, 199, 288-94. HUANG, R. S., HU, G. Q., LIN, B., LIN, Z. Y. & SUN, C. C. 2010. MicroRNA-155 silencing enhances inflammatory response and lipid uptake in oxidized low- density lipoprotein-stimulated human THP-1 macrophages. J Investig Med, 58, 961-7. HUBER, M., VOLLER, H., JAKOB, S., REIBIS, R., DO, V., BOLBRINKER, J., ZERGIBEL, I., SCHMIEDER, R. E., TRESZL, A., WEGSCHEIDER, K. & KREUTZ, R. 2010. Role of the angiotensin II type 2 receptor gene (+1675G/A) polymorphism on left ventricular hypertrophy and geometry in treated hypertensive patients. J Hypertens, 28, 1221-9. HUBERT, C., HOUOT, A. M., CORVOL, P. & SOUBRIER, F. 1991. Structure of the angiotensin I-converting enzyme gene. Two alternate promoters correspond to evolutionary steps of a duplicated gene. J Biol Chem, 266, 15377-83. HULYAM, K., AYSEGUL, B., VEYSI, G. H., DEMET, O., IRFAN, D., ERTUGRUL, C., DIDEM, C. T., BANU, B. & MIRIS, D. 2013. Frequency of angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism in Turkish acute stroke patients. J Cell Mol Med, 17, 475-81. HUNLEY, T. E., JULIAN, B. A., PHILLIPS, J. A., 3RD, SUMMAR, M. L., YOSHIDA, H., HORN, R. G., BROWN, N. J., FOGO, A., ICHIKAWA, I. & KON, V. 1996. Angiotensin converting enzyme gene polymorphism: potential silencer motif and impact on progression in IgA nephropathy. Kidney Int, 49, 571-7. ICHIKI, T. & INAGAMI, T. 1995. Expression, genomic organization, and transcription of the mouse angiotensin II type 2 receptor gene. Circ Res, 76, 693-700. ICHIKI, T., KAMBAYASHI, Y. & INAGAMI, T. 1995. Multiple growth factors modulate mRNA expression of angiotensin II type-2 receptor in R3T3 cells. Circ Res, 77, 1070-6. ICHIKI, T., TAKEDA, K., TOKUNOU, T., IINO, N., EGASHIRA, K., SHIMOKAWA, H., HIRANO, K., KANAIDE, H. & TAKESHITA, A. 2001. Downregulation of angiotensin II type 1 receptor by hydrophobic 3-hydroxy-3- Literatura 141 methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors in vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21, 1896-90 ICHIKI, T., USUI, M., KATO, M., FUNAKOSHI, Y., ITO, K., EGASHIRA, K. & TAKESHITA, A. 1998. Downregulation of angiotensin II type 1 receptor gene transcription by nitric oxide. Hypertension, 31, 342-8. IEMOLO, F., MARTINIUK, A., STEINMAN, D. A. & SPENCE, J. D. 2004. Sex differences in carotid plaque and stenosis. Stroke, 35, 477-81. IHARA, M., URATA, H., KINOSHITA, A., SUZUMIYA, J., SASAGURI, M., KIKUCHI, M., IDEISHI, M. & ARAKAWA, K. 1999. Increased chymase- dependent angiotensin II formation in human atherosclerotic aorta. Hypertension, 33, 1399-405. IKEDA, Y., TAKEUCHI, K., KATO, T., TANIYAMA, Y., SATO, K., TAKAHASHI, N., SUGAWARA, A. & ITO, S. 1999. Transcriptional suppression of rat angiotensin AT1a receptor gene expression by interferon-gamma in vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun, 262, 494-8 IMAI, Y., KUBA, K., OHTO-NAKANISHI, T. & PENNINGER, J. M. 2010. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) in disease pathogenesis. Circ J, 74, 405-10. INAGAMI, T. 1999. Molecular biology and signaling of angiotensin receptors: an overview. J Am Soc Nephrol, 10, S2-7. ITOYAMA, S., KEICHO, N., HIJIKATA, M., QUY, T., PHI, N. C., LONG, H. T., HA, L. D., BAN, V. V., MATSUSHITA, I., YANAI, H., KIRIKAE, F., KIRIKAE, T., KURATSUJI, T. & SASAZUKI, T. 2005. Identification of an alternative 5'- untranslated exon and new polymorphisms of angiotensin-converting enzyme 2 gene: lack of association with SARS in the Vietnamese population. Am J Med Genet A, 136, 52-7. IWAI, M., CHEN, R., LI, Z., SHIUCHI, T., SUZUKI, J., IDE, A., TSUDA, M., OKUMURA, M., MIN, L. J., MOGI, M. & HORIUCHI, M. 2005. Deletion of angiotensin II type 2 receptor exaggerated atherosclerosis in apolipoprotein E- null mice. Circulation, 112, 1636-43. IWATA, M., SILVA ENCISO, J. E. & GREENBERG, B. H. 2009. Selective and specific regulation of ectodomain shedding of angiotensin-converting enzyme 2 by tumor necrosis factor alpha-converting enzyme. Am J Physiol Cell Physiol, 297, 16. JACOBY, D. S. & RADER, D. J. 2003. Renin-angiotensin system and atherothrombotic disease: from genes to treatment. Arch Intern Med, 163, 1155-64. JAYADEV, S., SMITH, R. D., JAGADEESH, G., BAUKAL, A. J., HUNYADY, L. & CATT, K. J. 1999. N-linked glycosylation is required for optimal AT1a angiotensin receptor expression in COS-7 cells. Endocrinology, 140, 2010-7. JEUNEMAITRE, X., LIFTON, R. P., HUNT, S. C., WILLIAMS, R. R. & LALOUEL, J. M. 1992. Absence of linkage between the angiotensin converting enzyme locus and human essential hypertension. Nat Genet, 1, 72-5. JIA, H. P., LOOK, D. C., TAN, P., SHI, L., HICKEY, M., GAKHAR, L., CHAPPELL, M. C., WOHLFORD-LENANE, C. & MCCRAY, P. B., JR. 2009. Ectodomain shedding of angiotensin converting enzyme 2 in human airway epithelia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 297, 1. Literatura 142 JIANG, Z., ZHAO, W., YU, F. & XU, G. 2001. Association of angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism with essential hypertension. Chin Med J, 114, 1249-51. JIN, J. J., NAKURA, J., WU, Z., YAMAMOTO, M., ABE, M., CHEN, Y., TABARA, Y., YAMAMOTO, Y., IGASE, M., BO, X., KOHARA, K. & MIKI, T. 2003. Association of angiotensin II type 2 receptor gene variant with hypertension. Hypertens Res, 26, 547-52. JING, T., WANG, H., SRIVENUGOPAL, K. S., HE, G., LIU, J., MIAO, L. & HE, Y. 2009. Conditional expression of type 2 angiotensin II receptor in rat vascular smooth muscle cells reveals the interplay of the angiotensin system in matrix metalloproteinase 2 expression and vascular remodeling. Int J Mol Med, 24, 103-10. JOHANSSON, M. E., FAGERBERG, B. & BERGSTROM, G. 2008. Angiotensin type 2 receptor is expressed in human atherosclerotic lesions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 9, 17-21. JOHANSSON, M. E., WICKMAN, A., FITZGERALD, S. M., GAN, L. M. & BERGSTROM, G. 2005. Angiotensin II, type 2 receptor is not involved in the angiotensin II-mediated pro-atherogenic process in ApoE-/- mice. J Hypertens, 23, 1541-9. JONES, A., DHAMRAIT, S. S., PAYNE, J. R., HAWE, E., LI, P., TOOR, I. S., LUONG, L., WOOTTON, P. T., MILLER, G. J., HUMPHRIES, S. E. & MONTGOMERY, H. E. 2003. Genetic variants of angiotensin II receptors and cardiovascular risk in hypertension. Hypertension, 42, 500-6. JUREWICZ, M., MCDERMOTT, D. H., SECHLER, J. M., TINCKAM, K., TAKAKURA, A., CARPENTER, C. B., MILFORD, E. & ABDI, R. 2007. Human T and natural killer cells possess a functional renin-angiotensin system: further mechanisms of angiotensin II-induced inflammation. J Am Soc Nephrol, 18, 1093-102. KAINULAINEN, K., PEROLA, M., TERWILLIGER, J., KAPRIO, J., KOSKENVUO, M., SYVANEN, A. C., VARTIAINEN, E., PELTONEN, L. & KONTULA, K. 1999. Evidence for involvement of the type 1 angiotensin II receptor locus in essential hypertension. Hypertension, 33, 844-9. KAMBAYASHI, Y., BARDHAN, S. & INAGAMI, T. 1993. Peptide growth factors markedly decrease the ligand binding of angiotensin II type 2 receptor in rat cultured vascular smooth muscle cells. Biochem Biophys Res Commun, 194, 478-82. KANNEL, W. B. & WOLF, P. A. 2006. Peripheral and cerebral atherothrombosis and cardiovascular events in different vascular territories: insights from the Framingham Study. Curr Atheroscler Rep, 8, 317-23. KANNEL, W. B. 1994. Risk factors for atherosclerotic cardiovascular outcomes in different arterial territories. J Cardiovasc Risk, 1, 333-9. KARAGIANNIS, A., BALASKA, K., TZIOMALOS, K., TOKALAKI- NIKOLAIDOU, L., PAPAYEORYIOU, A. & ZAMBOULIS, C. 2004. Lack of an association between angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism and ischaemic stroke. Eur Neurol, 51, 148-52. KASCHINA, E., SCHOLZ, H., STECKELINGS, U. M., SOMMERFELD, M., KEMNITZ, U. R., ARTUC, M., SCHMIDT, S. & UNGER, T. 2009. Transition Literatura 143 from atherosclerosis to aortic aneurysm in humans coincides with an increased expression of RAS components. Atherosclerosis, 205, 396-403. KATSUYA, T. & MORISHITA, R. 2012. Gene polymorphism of angiotensin II type 1 and type 2 receptors. Curr Pharm Des, 21, 21. KATSUYA, T., HORIUCHI, M., MINAMI, S., KOIKE, G., SANTORO, N. F., HSUEH, A. J. & DZAU, V. J. 1997. Genomic organization and polymorphism of human angiotensin II type 2 receptor: no evidence for its gene mutation in two families of human premature ovarian failure syndrome. Mol Cell Endocrinol, 127, 221-8. KEIDAR, S., HEINRICH, R., KAPLAN, M., HAYEK, T. & AVIRAM, M. 2001. Angiotensin II administration to atherosclerotic mice increases macrophage uptake of oxidized ldl: a possible role for interleukin-6. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 21, 1464-9. KELLY, D. J., COX, A. J., GOW, R. M., ZHANG, Y., KEMP, B. E. & GILBERT, R. E. 2004. Platelet-derived growth factor receptor transactivation mediates the trophic effects of angiotensin II in vivo. Hypertension, 44, 195-202. KIM, M. P., ZHOU, M. & WAHL, L. M. 2005. Angiotensin II increases human monocyte matrix metalloproteinase-1 through the AT2 receptor and prostaglandin E2: implications for atherosclerotic plaque rupture. J Leukoc Biol, 78, 195-201. KISS, T. 2002. Small nucleolar RNAs: an abundant group of noncoding RNAs with diverse cellular functions. Cell, 109, 145-8. KOBASHI, G., HATA, A., OHTA, K., YAMADA, H., KATO, E. H., MINAKAMI, H., FUJIMOTO, S. & KONDO, K. 2004. A1166C variant of angiotensin II type 1 receptor gene is associated with severe hypertension in pregnancy independently of T235 variant of angiotensinogen gene. J Hum Genet, 49, 182-6. KOH, K. K., HAN, S. H., OH, P. C., SHIN, E. K. & QUON, M. J. 2010. Combination therapy for treatment or prevention of atherosclerosis: focus on the lipid-RAAS interaction. Atherosclerosis, 209, 307-13. KOKA, V., HUANG, X. R., CHUNG, A. C., WANG, W., TRUONG, L. D. & LAN, H. Y. 2008. Angiotensin II up-regulates angiotensin I-converting enzyme (ACE), but down-regulates ACE2 via the AT1-ERK/p38 MAP kinase pathway. Am J Pathol, 172, 1174-83. KOLAKOVIĆ A., ŢIVKOVIC M., KONĈAR I., JOVANOVIĆ I., ĐURIĆ T., STANKOVIĆ A. 2013. The angiotensin II type 2 receptor -1332 A/G gene polymorphism (rs1403543) is associated with stroke in males patients with carotid atherosclerosis. 22. European Stroke Conference 28-31 May 2013, London, United Kingdom, Cerebrovasc Dis 2013; (suppl 3) 1-854 ): p.536 KOLAKOVIĆ A., ŢIVKOVIĆ M., RADAK DJ., KONĈAR I., DJURIĆ T., DAVIDOVIĆ L., ALAVANTIĆ D. Association of Angiotensin II Type 1 receptor +1166 A/C gene polymorphism with human carotid plaque vulnerability. The 79th EAS Congress, 26th-29th June 2011, Gothenburg, Sweden, Atherosclerosis Supplements (Vol.12 No.1- June 2011): p.111. KOLAKOVIC, A., ZIVKOVIC, M., RADAK, D., DJURIC, T., KONCAR, I., DAVIDOVIC, L., DINCIC, D., ALAVANTIC, D. & STANKOVIC, A. 2012. The association of ACE I/D gene polymorphism with severe carotid atherosclerosis in patients undergoing carotid endarterectomy. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 13, 141-7. Literatura 144 KOLODGIE, F. D., GOLD, H. K., BURKE, A. P., FOWLER, D. R., KRUTH, H. S., WEBER, D. K., FARB, A., GUERRERO, L. J., HAYASE, M., KUTYS, R., NARULA, J., FINN, A. V. & VIRMANI, R. 2003. Intraplaque hemorrhage and progression of coronary atheroma. N Engl J Med, 349, 2316-25. KOSTULAS, K., HUANG, W. X., CRISBY, M., JIN, Y. P., HE, B., LANNFELT, L., EGGERTSEN, G., KOSTULAS, V. & HILLERT, J. 1999. An angiotensin- converting enzyme gene polymorphism suggests a genetic distinction between ischaemic stroke and carotid stenosis. Eur J Clin Invest, 29, 478-83. KUBA, K., IMAI, Y., OHTO-NAKANISHI, T. & PENNINGER, J. M. 2010. Trilogy of ACE2: a peptidase in the renin-angiotensin system, a SARS receptor, and a partner for amino acid transporters. Pharmacol Ther, 128, 119-28. KUHN, D. E., MARTIN, M. M., FELDMAN, D. S., TERRY, A. V., JR., NUOVO, G. J. & ELTON, T. S. 2008a. Experimental validation of miRNA targets. Methods, 44, 47-54. KUHN, D. E., NUOVO, G. J., MARTIN, M. M., MALANA, G. E., PLEISTER, A. P., JIANG, J., SCHMITTGEN, T. D., TERRY, A. V., JR., GARDINER, K., HEAD, E., FELDMAN, D. S. & ELTON, T. S. 2008b. Human chromosome 21- derived miRNAs are overexpressed in down syndrome brains and hearts. Biochem Biophys Res Commun, 370, 473-7. KUHN, D. E., NUOVO, G. J., TERRY, A. V., JR., MARTIN, M. M., MALANA, G. E., SANSOM, S. E., PLEISTER, A. P., BECK, W. D., HEAD, E., FELDMAN, D. S. & ELTON, T. S. 2010. Chromosome 21-derived microRNAs provide an etiological basis for aberrant protein expression in human Down syndrome brains. J Biol Chem, 285, 1529-43. KUNKEL, L. M., SMITH, K. D., BOYER, S. H., BORGAONKAR, D. S., WACHTEL, S. S., MILLER, O. J., BREG, W. R., JONES, H. W., JR. & RARY, J. M. 1977. Analysis of human Y-chromosome-specific reiterated DNA in chromosome variants. Proc Natl Acad Sci U S A, 74, 1245-9. KUZNETSOVA, T., STAESSEN, J. A., THIJS, L., KUNATH, C., OLSZANECKA, A., RYABIKOV, A., TIKHONOFF, V., STOLARZ, K., BIANCHI, G., CASIGLIA, E., FAGARD, R., BRAND-HERRMANN, S. M., KAWECKA-JASZCZ, K., MALYUTINA, S., NIKITIN, Y. & BRAND, E. 2004. Left ventricular mass in relation to genetic variation in angiotensin II receptors, renin system genes, and sodium excretion. Circulation, 110, 2644-50. LAEMMLI, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-5. LAGOS-QUINTANA, M., RAUHUT, R., YALCIN, A., MEYER, J., LENDECKEL, W. & TUSCHL, T. 2002. Identification of tissue-specific microRNAs from mouse. Curr Biol, 12, 735-9. LAJEMI, M., LABAT, C., GAUTIER, S., LACOLLEY, P., SAFAR, M., ASMAR, R., CAMBIEN, F. & BENETOS, A. 2001. Angiotensin II type 1 receptor-153A/G and 1166A/C gene polymorphisms and increase in aortic stiffness with age in hypertensive subjects. J Hypertens, 19, 407-13. LAMBERT, D. W., CLARKE, N. E., HOOPER, N. M. & TURNER, A. J. 2008. Calmodulin interacts with angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) and inhibits shedding of its ectodomain. FEBS Lett, 582, 385-90. LAMBERT, D. W., YARSKI, M., WARNER, F. J., THORNHILL, P., PARKIN, E. T., SMITH, A. I., HOOPER, N. M. & TURNER, A. J. 2005. Tumor necrosis factor- Literatura 145 alpha convertase (ADAM17) mediates regulated ectodomain shedding of the severe-acute respiratory syndrome-coronavirus (SARS-CoV) receptor, angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2). J Biol Chem, 280, 30113-9. LAMMIE, G. A., WARDLAW, J., ALLAN, P., RUCKLEY, C. V., PEEK, R. & SIGNORINI, D. F. 2000. What pathological components indicate carotid atheroma activity and can these be identified reliably using ultrasound? Eur J Ultrasound, 11, 77-86. LANGFORD, K. G., SHAI, S. Y., HOWARD, T. E., KOVAC, M. J., OVERBEEK, P. A. & BERNSTEIN, K. E. 1991. Transgenic mice demonstrate a testis-specific promoter for angiotensin-converting enzyme. J Biol Chem, 266, 15559-62. LAPTEVA, N., NIEDA, M., ANDO, Y., IDE, K., HATTA-OHASHI, Y., DYMSHITS, G., ISHIKAWA, Y., JUJI, T. & TOKUNAGA, K. 2001. Expression of renin- angiotensin system genes in immature and mature dendritic cells identified using human cDNA microarray. Biochem Biophys Res Commun, 285, 1059-65. LASSEGUE, B., ALEXANDER, R. W., NICKENIG, G., CLARK, M., MURPHY, T. J. & GRIENDLING, K. K. 1995. Angiotensin II down-regulates the vascular smooth muscle AT1 receptor by transcriptional and post-transcriptional mechanisms: evidence for homologous and heterologous regulation. Mol Pharmacol, 48, 601-9. LAXTON, R. C., HU, Y., DUCHENE, J., ZHANG, F., ZHANG, Z., LEUNG, K. Y., XIAO, Q., SCOTLAND, R. S., HODGKINSON, C. P., SMITH, K., WILLEIT, J., LOPEZ-OTIN, C., SIMPSON, I. A., KIECHL, S., AHLUWALIA, A., XU, Q. & YE, S. 2009. A role of matrix metalloproteinase-8 in atherosclerosis. Circ Res, 105, 921-9. LAZARD, D., BRIEND-SUTREN, M. M., VILLAGEOIS, P., MATTEI, M. G., STROSBERG, A. D. & NAHMIAS, C. 1994. Molecular characterization and chromosome localization of a human angiotensin II AT2 receptor gene highly expressed in fetal tissues. Receptors Channels, 2, 271-80. LEHTONEN, J., PAUKKU, K., DAVIET, L. & KONTULA, K. 2007. Abstract 1037: Angiotensin II Type 1 Receptor 1166 Polymorphism A -> C Increases mRNA Stability and Steady-State Levels. Circulation, 114, II_190. LI, D. Y., ZHANG, Y. C., PHILIPS, M. I., SAWAMURA, T. & MEHTA, J. L. 1999. Upregulation of endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein (LOX- 1) in cultured human coronary artery endothelial cells by angiotensin II type 1 receptor activation. Circ Res, 84, 1043-9. LI, D., SALDEEN, T., ROMEO, F. & MEHTA, J. L. 2000. Oxidized LDL upregulates angiotensin II type 1 receptor expression in cultured human coronary artery endothelial cells: the potential role of transcription factor NF-kappaB. Circulation, 102, 1970-6. LI, J. M., MOGI, M., TSUKUDA, K., TOMOCHIKA, H., IWANAMI, J., MIN, L. J., NAHMIAS, C., IWAI, M. & HORIUCHI, M. 2007. Angiotensin II-induced neural differentiation via angiotensin II type 2 (AT2) receptor-MMS2 cascade involving interaction between AT2 receptor-interacting protein and Src homology 2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase 1. Mol Endocrinol, 21, 499-511. LI, Z., IWAI, M., WU, L., LIU, H. W., CHEN, R., JINNO, T., SUZUKI, J., TSUDA, M., GAO, X. Y., OKUMURA, M., CUI, T. X. & HORIUCHI, M. 2004. Literatura 146 Fluvastatin enhances the inhibitory effects of a selective AT1 receptor blocker, valsartan, on atherosclerosis. Hypertension, 44, 758-63. LIBBY, P. & RIDKER, P. M. 2006. Inflammation and Atherothrombosis: From Population Biology and Bench Research to Clinical Practice. Journal of the American College of Cardiology, 48, A33-A46. LIBBY, P. 2002. Inflammation in atherosclerosis. Nature, 420, 868-74. LIBBY, P., RIDKER, P. M. & HANSSON, G. K. 2011. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature, 473, 317-25. LIM, H. S., CHO, J. Y., OH, D. S., CHUNG, J. Y., HONG, K. S., BAE, K. S., YU, K. S., LEE, K. H., JANG, I. J. & SHIN, S. G. 2007. Angiotensin II type 1 receptor 1166A/C polymorphism in association with blood pressure response to exogenous angiotensin II. Eur J Clin Pharmacol, 63, 17-26. LIN, Q., KELLER, R. S., WEAVER, B. & ZISMAN, L. S. 2004. Interaction of ACE2 and integrin beta1 in failing human heart. Biochim Biophys Acta, 4, 175-8. LORENZO, C., WILLIAMS, K., HUNT, K. J. & HAFFNER, S. M. 2007. The National Cholesterol Education Program - Adult Treatment Panel III, International Diabetes Federation, and World Health Organization definitions of the metabolic syndrome as predictors of incident cardiovascular disease and diabetes. Diabetes Care, 30, 8-13. LOUIS, S., SAWARD, L. & ZAHRADKA, P. 2011. Both AT(1) and AT(2) receptors mediate proliferation and migration of porcine vascular smooth muscle cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 301, 27. LOVREN, F., PAN, Y., QUAN, A., TEOH, H., WANG, G., SHUKLA, P. C., LEVITT, K. S., OUDIT, G. Y., AL-OMRAN, M., STEWART, D. J., SLUTSKY, A. S., PETERSON, M. D., BACKX, P. H., PENNINGER, J. M. & VERMA, S. 2008. Angiotensin converting enzyme-2 confers endothelial protection and attenuates atherosclerosis. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 295, 25. LUCHTEFELD, M., GROTE, K., GROTHUSEN, C., BLEY, S., BANDLOW, N., SELLE, T., STRUBER, M., HAVERICH, A., BAVENDIEK, U., DREXLER, H. & SCHIEFFER, B. 2005. Angiotensin II induces MMP-2 in a p47phox- dependent manner. Biochem Biophys Res Commun, 328, 183-8. LUDEWIG, B., ZINKERNAGEL, R. M. & HENGARTNER, H. 2002. Arterial inflammation and atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med, 12, 154-9 LYNCH, A. I., ARNETT, D. K., DAVIS, B. R., BOERWINKLE, E., FORD, C. E., ECKFELDT, J. H. & LEIENDECKER-FOSTER, C. 2007. Sex-specific effects of AGT-6 and ACE I/D on pulse pressure after 6 months on antihypertensive treatment: the GenHAT study. Ann Hum Genet, 71, 735-45. MAKEEVA, O. A., PUZYREV, K. V., PAVLIUKOVA, E. N., KOSHEL'SKAIA, O. A., GOLUBENKO, M. V., EFIMOVA, E. V., KUCHER, A. N., TSIMBALIUK, I. V., KARPOV, R. S. & PUZYREV, V. P. 2004. [ACE and AGTR1 genes polymorphisms in left ventricular hypertrophy pathogenesis in humans]. Mol Biol, 38, 990-6. MALAKAUSKAS, S. M., KOURANY, W. M., ZHANG, X. Y., LU, D., STEVENS, R. D., KOVES, T. R., HOHMEIER, H. E., MUOIO, D. M., NEWGARD, C. B. & LE, T. H. 2009. Increased insulin sensitivity in mice lacking collectrin, a downstream target of HNF-1alpha. Mol Endocrinol, 23, 881-92. MALAKAUSKAS, S. M., QUAN, H., FIELDS, T. A., MCCALL, S. J., YU, M. J., KOURANY, W. M., FREY, C. W. & LE, T. H. 2007. Aminoaciduria and Literatura 147 altered renal expression of luminal amino acid transporters in mice lacking novel gene collectrin. Am J Physiol Renal Physiol, 292, 19. MARCHESI, C., PARADIS, P. & SCHIFFRIN, E. L. 2008. Role of the renin- angiotensin system in vascular inflammation. Trends Pharmacol Sci, 29, 367-74. MARSHALL, S. 2006. Role of insulin, adipocyte hormones, and nutrient-sensing pathways in regulating fuel metabolism and energy homeostasis: a nutritional perspective of diabetes, obesity, and cancer. Sci STKE, 1. MARTIN, M. M. & ELTON, T. S. 1995. The sequence and genomic organization of the human type 2 angiotensin II receptor. Biochem Biophys Res Commun, 209, 554- 62. MARTIN, M. M., BUCKENBERGER, J. A., JIANG, J., MALANA, G. E., KNOELL, D. L., FELDMAN, D. S. & ELTON, T. S. 2007. TGF-beta1 stimulates human AT1 receptor expression in lung fibroblasts by cross talk between the Smad, p38 MAPK, JNK, and PI3K signaling pathways. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 293, 29. MARTIN, M. M., GARCIA, J. A., MCFARLAND, J. D., DUFFY, A. A., GREGSON, J. P. & ELTON, T. S. 2003. Translation of the human angiotensin II type 1 receptor mRNA is mediated by a highly efficient internal ribosome entry site. Mol Cell Endocrinol, 212, 51-61. MARTIN, M. M., LEE, E. J., BUCKENBERGER, J. A., SCHMITTGEN, T. D. & ELTON, T. S. 2006. MicroRNA-155 regulates human angiotensin II type 1 receptor expression in fibroblasts. J Biol Chem, 281, 18277-84.. MARTIN, M. M., VICTOR, X., ZHAO, X., MCDOUGALL, J. K. & ELTON, T. S. 2001a. Identification and characterization of functional angiotensin II type 1 receptors on immortalized human fetal aortic vascular smooth muscle cells. Mol Cell Endocrinol, 183, 81-91. MARTIN, M. M., WILLARDSON, B. M., BURTON, G. F., WHITE, C. R., MCLAUGHLIN, J. N., BRAY, S. M., OGILVIE, J. W., JR. & ELTON, T. S. 2001b. Human angiotensin II type 1 receptor isoforms encoded by messenger RNA splice variants are functionally distinct. Mol Endocrinol, 15, 281-93. MATHIESEN, E. B., BONAA, K. H. & JOAKIMSEN, O. 2001. Echolucent plaques are associated with high risk of ischemic cerebrovascular events in carotid stenosis: the tromso study. Circulation, 103, 2171-5. MATSUMOTO, T., SAGAWA, N., MUKOYAMA, M., TANAKA, I., ITOH, H., GOTO, M., HORIUCHI, M., DZAU, V. J., MORI, T. & NAKAO, K. 1996. Type 2 angiotensin II receptor is expressed in human myometrium and uterine leiomyoma and is down-regulated during pregnancy. J Clin Endocrinol Metab, 81, 4366-72. MATTEI, M.-G., HUBERT, C., ALHENC-GELAS, F., ROECKEL, N., CORVOL, P., SOUBRIER, F. Angiotensin-I converting enzyme gene is on chromosome 17. (Abstract) Cytogenet. Cell Genet. 51: 1041, 1989. MAURIELLO, A., SANGIORGI, G., FRATONI, S., PALMIERI, G., BONANNO, E., ANEMONA, L., SCHWARTZ, R. S. & SPAGNOLI, L. G. 2005. Diffuse and active inflammation occurs in both vulnerable and stable plaques of the entire coronary tree: a histopathologic study of patients dying of acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol, 45, 1585-93. Literatura 148 MEHTA, P. K. & GRIENDLING, K. K. 2007. Angiotensin II cell signaling: physiological and pathological effects in the cardiovascular system. Am J Physiol Cell Physiol, 292, 26. MISHRA, P. J., HUMENIUK, R., LONGO-SORBELLO, G. S., BANERJEE, D. & BERTINO, J. R. 2007. A miR-24 microRNA binding-site polymorphism in dihydrofolate reductase gene leads to methotrexate resistance. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 13513-8. MIZUIRI, S., HEMMI, H., KUMANOMIDOU, H., IWAMOTO, M., MIYAGI, M., SAKAI, K., AIKAWA, A., OHARA, T., YAMADA, K., SHIMATAKE, H. & HASEGAWA, A. 2001. Angiotensin-converting enzyme (ACE) I/D genotype and renal ACE gene expression. Kidney Int, 60, 1124-30. MOGI, M. & HORIUCHI, M. 2013. Effect of angiotensin II type 2 receptor on stroke, cognitive impairment and neurodegenerative diseases. Geriatr Gerontol Int, 13, 13-8. MOGI, M., IWAI, M. & HORIUCHI, M. 2007. Emerging concepts of regulation of angiotensin II receptors: new players and targets for traditional receptors. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 27, 2532-9. MONTAUBAN VAN SWIJNDREGT, A. D., ELBERS, H. R., MOLL, F. L., DE LETTER, J. & ACKERSTAFF, R. G. 1998. Ultrasonographic characterization of carotid plaques. Ultrasound Med Biol, 24, 489-93. MORAWIETZ, H., RUECKSCHLOSS, U., NIEMANN, B., DUERRSCHMIDT, N., GALLE, J., HAKIM, K., ZERKOWSKI, H. R., SAWAMURA, T. & HOLTZ, J. 1999. Angiotensin II induces LOX-1, the human endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein. Circulation, 100, 899-902. MORENO, P. R., MURCIA, A. M., PALACIOS, I. F., LEON, M. N., BERNARDI, V. H., FUSTER, V. & FALLON, J. T. 2000. Coronary composition and macrophage infiltration in atherectomy specimens from patients with diabetes mellitus. Circulation, 102, 2180-4. MORENO, P. R., PURUSHOTHAMAN, K. R., SIROL, M., LEVY, A. P. & FUSTER, V. 2006. Neovascularization in human atherosclerosis. Circulation, 113, 2245- 52. MORIOKA, M., HAMADA, J., HASHIGUCHI, A., HASEGAWA, Y., TODAKA, T., YANO, S., KAI, Y., MIURA, M., FUJIOKA, S. & USHIO, Y. 2004. Contribution of angiotensin-converting enzyme and angiotensin II to ischemic stroke: their role in the formation of stable and unstable carotid atherosclerotic plaques. Surg Neurol, 62, 292-301. MUELLER, C. F., WASSMANN, K., BERGER, A., HOLZ, S., WASSMANN, S. & NICKENIG, G. 2008. Differential phosphorylation of calreticulin affects AT1 receptor mRNA stability in VSMC. Biochem Biophys Res Commun, 370, 669- 74. MULLER, C., REDDERT, A., WASSMANN, S., STREHLOW, K., BOHM, M. & NICKENIG, G. 2000. Insulin-like growth factor induces up-regulation of AT(1)-receptor gene expression in vascular smooth muscle cells. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 1, 273-7. MULLER, J. E., ABELA, G. S., NESTO, R. W. & TOFLER, G. H. 1994. Triggers, acute risk factors and vulnerable plaques: the lexicon of a new frontier. J Am Coll Cardiol, 23, 809-13. Literatura 149 NAGHAVI, M., LIBBY, P., FALK, E., CASSCELLS, S. W., LITOVSKY, S., RUMBERGER, J., BADIMON, J. J., STEFANADIS, C., MORENO, P., PASTERKAMP, G., FAYAD, Z., STONE, P. H., WAXMAN, S., RAGGI, P., MADJID, M., ZARRABI, A., BURKE, A., YUAN, C., FITZGERALD, P. J., SISCOVICK, D. S., DE KORTE, C. L., AIKAWA, M., JUHANI AIRAKSINEN, K. E., ASSMANN, G., BECKER, C. R., CHESEBRO, J. H., FARB, A., GALIS, Z. S., JACKSON, C., JANG, I. K., KOENIG, W., LODDER, R. A., MARCH, K., DEMIROVIC, J., NAVAB, M., PRIORI, S. G., REKHTER, M. D., BAHR, R., GRUNDY, S. M., MEHRAN, R., COLOMBO, A., BOERWINKLE, E., BALLANTYNE, C., INSULL, W., JR., SCHWARTZ, R. S., VOGEL, R., SERRUYS, P. W., HANSSON, G. K., FAXON, D. P., KAUL, S., DREXLER, H., GREENLAND, P., MULLER, J. E., VIRMANI, R., RIDKER, P. M., ZIPES, D. P., SHAH, P. K. & WILLERSON, J. T. 2003a. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I. Circulation, 108, 1664-72. NAGHAVI, M., LIBBY, P., FALK, E., CASSCELLS, S. W., LITOVSKY, S., RUMBERGER, J., BADIMON, J. J., STEFANADIS, C., MORENO, P., PASTERKAMP, G., FAYAD, Z., STONE, P. H., WAXMAN, S., RAGGI, P., MADJID, M., ZARRABI, A., BURKE, A., YUAN, C., FITZGERALD, P. J., SISCOVICK, D. S., DE KORTE, C. L., AIKAWA, M., AIRAKSINEN, K. E., ASSMANN, G., BECKER, C. R., CHESEBRO, J. H., FARB, A., GALIS, Z. S., JACKSON, C., JANG, I. K., KOENIG, W., LODDER, R. A., MARCH, K., DEMIROVIC, J., NAVAB, M., PRIORI, S. G., REKHTER, M. D., BAHR, R., GRUNDY, S. M., MEHRAN, R., COLOMBO, A., BOERWINKLE, E., BALLANTYNE, C., INSULL, W., JR., SCHWARTZ, R. S., VOGEL, R., SERRUYS, P. W., HANSSON, G. K., FAXON, D. P., KAUL, S., DREXLER, H., GREENLAND, P., MULLER, J. E., VIRMANI, R., RIDKER, P. M., ZIPES, D. P., SHAH, P. K. & WILLERSON, J. T. 2003b. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part II. Circulation, 108, 1772-8 NAHMOD, K. A., VERMEULEN, M. E., RAIDEN, S., SALAMONE, G., GAMBERALE, R., FERNANDEZ-CALOTTI, P., ALVAREZ, A., NAHMOD, V., GIORDANO, M. & GEFFNER, J. R. 2003. Control of dendritic cell differentiation by angiotensin II. Faseb J, 17, 491-3. NAKAI, K., OYANAGI, M., HITOMI, J., OGASAWARA, K., INOUE, T., KOBAYASHI, M., SUWABE, A., HABANO, W., BABA, T., YOSHIDA, H. & OGAWA, A. 2009. Screening the single nucleotide polymorphisms in patients with internal carotid artery stenosis by oligonucleotide-based custom DNA array. Bioinform Biol Insights, 1, 63-9. NAKAJIMA, H., AMANO, W., FUJITA, A., FUKUHARA, A., AZUMA, Y. T., HATA, F., INUI, T. & TAKEUCHI, T. 2007. The active site cysteine of the proapoptotic protein glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is essential in oxidative stress-induced aggregation and cell death. J Biol Chem, 282, 26562- 74. NATESH, R., SCHWAGER, S. L., STURROCK, E. D. & ACHARYA, K. R. 2003. Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex. Nature, 421, 551-4. Literatura 150 NEWBY, A. C. 2000. An overview of the vascular response to injury: a tribute to the late Russell Ross. Toxicol Lett, 113, 519-29. NGUYEN DINH CAT, A. & TOUYZ, R. M. 2011. A new look at the renin-angiotensin system--focusing on the vascular system. Peptides, 32, 2141-50. NICKENIG, G. & BOHM, M. 1998. Interaction between insulin and AT1 receptor. Relevance for hypertension and arteriosclerosis. Basic Res Cardiol, 2, 135-9. NICKENIG, G. & MURPHY, T. J. 1994. Down-regulation by growth factors of vascular smooth muscle angiotensin receptor gene expression. Mol Pharmacol, 46, 653-9 NICKENIG, G., BAUMER, A. T., GROHE, C., KAHLERT, S., STREHLOW, K., ROSENKRANZ, S., STABLEIN, A., BECKERS, F., SMITS, J. F., DAEMEN, M. J., VETTER, H. & BOHM, M. 1998a. Estrogen modulates AT1 receptor gene expression in vitro and in vivo. Circulation, 97, 2197-201. NICKENIG, G., MICHAELSEN, F., MULLER, C., BERGER, A., VOGEL, T., SACHINIDIS, A., VETTER, H. & BOHM, M. 2002. Destabilization of AT(1) receptor mRNA by calreticulin. Circ Res, 90, 53-8. NICKENIG, G., MICHAELSEN, F., MULLER, C., VOGEL, T., STREHLOW, K. & BOHM, M. 2001. Post-transcriptional regulation of the AT1 receptor mRNA. Identification of the mRNA binding motif and functional characterization. Faseb J, 15, 1490-2. NICKENIG, G., SACHINIDIS, A., MICHAELSEN, F., BOHM, M., SEEWALD, S. & VETTER, H. 1997. Upregulation of vascular angiotensin II receptor gene expression by low-density lipoprotein in vascular smooth muscle cells. Circulation, 95, 473-8. NICKENIG, G., STREHLOW, K., ROELING, J., ZOLK, O., KNORR, A. & BOHM, M. 1998b. Salt induces vascular AT1 receptor overexpression in vitro and in vivo. Hypertension, 31, 1272-7. NICKENIG, G., STREHLOW, K., WASSMANN, S., BAUMER, A. T., ALBORY, K., SAUER, H. & BOHM, M. 2000. Differential effects of estrogen and progesterone on AT(1) receptor gene expression in vascular smooth muscle cells. Circulation, 102, 1828-33. NIEMIEC, P., ZAK, I. & WITA, K. 2008. The D allele of angiotensin I-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism is associated with the severity of atherosclerosis. Clin Chem Lab Med, 46, 446-52. NISHIMURA, H., YERKES, E., HOHENFELLNER, K., MIYAZAKI, Y., MA, J., HUNLEY, T. E., YOSHIDA, H., ICHIKI, T., THREADGILL, D., PHILLIPS, J. A., 3RD, HOGAN, B. M., FOGO, A., BROCK, J. W., 3RD, INAGAMI, T. & ICHIKAWA, I. 1999. Role of the angiotensin type 2 receptor gene in congenital anomalies of the kidney and urinary tract, CAKUT, of mice and men. Mol Cell, 3, 1-10. NIU, W. & QI, Y. 2010. Association of the angiotensin II type I receptor gene +1166 A>C polymorphism with hypertension risk: evidence from a meta-analysis of 16474 subjects. Hypertens Res, 33, 1137-43. NOUET, S. & NAHMIAS, C. 2000. Signal transduction from the angiotensin II AT2 receptor. Trends Endocrinol Metab, 11, 1-6. OHISHI, M., UEDA, M., RAKUGI, H., NARUKO, T., KOJIMA, A., OKAMURA, A., HIGAKI, J. & OGIHARA, T. 1997. Enhanced expression of angiotensin- Literatura 151 converting enzyme is associated with progression of coronary atherosclerosis in humans. J Hypertens, 15, 1295-302. OHISHI, M., UEDA, M., RAKUGI, H., NARUKO, T., KOJIMA, A., OKAMURA, A., HIGAKI, J. & OGIHARA, T. 1999. Relative localization of angiotensin- converting enzyme, chymase and angiotensin II in human coronary atherosclerotic lesions. J Hypertens, 17, 547-53. OHYAMA, K., YAMANO, Y., SANO, T., NAKAGOMI, Y., HAMAKUBO, T., MORISHIMA, I. & INAGAMI, T. 1995. Disulfide bridges in extracellular domains of angiotensin II receptor type IA. Regul Pept, 57, 141-7. ONO, K., MANNAMI, T., BABA, S., YASUI, N., OGIHARA, T. & IWAI, N. 2003. Lack of association between angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism and hypertension in Japanese. Hypertens Res, 26, 131-4. ORLOWSKA-BARANOWSKA, E., PLACHA, G., BARANOWSKI, R., MICHALEK, P., GORA, J., GACIONG, Z. & STEPINSKA, J. 2007. Can angiotensin II +1675 G/A type 2 receptor gene polymorphism be a marker of left ventricular hypertrophy in patients with aortic stenosis? J Heart Valve Dis, 16, 495-503. OSTEROP, A. P., KOFFLARD, M. J., SANDKUIJL, L. A., TEN CATE, F. J., KRAMS, R., SCHALEKAMP, M. A. & DANSER, A. H. 1998. AT1 receptor A/C1166 polymorphism contributes to cardiac hypertrophy in subjects with hypertrophic cardiomyopathy. Hypertension, 32, 825-30. OTT, C., TITZE, S. I., SCHWARZ, T. K., KREUTZ, R., HILGERS, K. F., SCHMIDT, B. M., SCHLAICH, M. P. & SCHMIEDER, R. E. 2007. High sodium intake modulates left ventricular mass in patients with G expression of +1675 G/A angiotensin II receptor type 2 gene. J Hypertens, 25, 1627-32. PALATINI, P., CEOLOTTO, G., DORIGATTI, F., MOS, L., SANTONASTASO, M., BRATTI, P., PAPPARELLA, I., PESSINA, A. C. & SEMPLICINI, A. 2009. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism predicts development of hypertension and metabolic syndrome. Am J Hypertens, 22, 208-14. PAPPA, T. & ALEVIZAKI, M. 2012. Endogenous sex steroids and cardio- and cerebro-vascular disease in the postmenopausal period. Eur J Endocrinol, 167, 145-56. PARK, T. S. & ZAMBIDIS, E. T. A role for the renin-angiotensin system in hematopoiesis, Haematologica. 2009 Jun;94(6):745-7. PARKIN, E. T., TURNER, A. J. & HOOPER, N. M. 2004. Secretase-mediated cell surface shedding of the angiotensin-converting enzyme. Protein Pept Lett, 11, 423-32. PAUKKU, K., KALKKINEN, N., SILVENNOINEN, O., KONTULA, K. K. & LEHTONEN, J. Y. 2008. p100 increases AT1R expression through interaction with AT1R 3'-UTR. Nucleic Acids Res, 36, 4474-87. PAUL, M., POYAN MEHR, A. & KREUTZ, R. 2006. Physiology of local renin- angiotensin systems. Physiol Rev, 86, 747-803. PEETERS, W., HELLINGS, W. E., DE KLEIJN, D. P., DE VRIES, J. P., MOLL, F. L., VINK, A. & PASTERKAMP, G. 2009. Carotid atherosclerotic plaques stabilize after stroke: insights into the natural process of atherosclerotic plaque stabilization. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 29, 128-33. PENDE, A., CONTINI, L., SALLO, R., PASSALACQUA, M., TANVEER, R., PORT, J. D. & LOTTI, G. 2008. Characterization of RNA-binding proteins possibly Literatura 152 involved in modulating human AT 1 receptor mRNA stability. Cell Biochem Funct, 26, 493-501. PENDE, A., GIACCHE, M., CASTIGLIOLA, L., CONTINI, L., PASSERONE, G., PATRONE, M., PORT, J. D. & LOTTI, G. 1999. Characterization of the binding of the RNA-binding protein AUF1 to the human AT(1) receptor mRNA. Biochem Biophys Res Commun, 266, 609-14. PERA, J., SLOWIK, A., DZIEDZIC, T., WLOCH, D. & SZCZUDLIK, A. 2006. ACE I/D polymorphism in different etiologies of ischemic stroke. Acta Neurol Scand, 114, 320-2. PEREZ-DIAZ, I., GUZMAN, C., OLIVARES-REYES, J. A., RAMIREZ, T., GUTIERREZ-REYES, G., HIRIART, M. & ROBLES-DIAZ, G. 2011. Evidence of an intracellular angiotensin-generating system and non-AT1, non- AT2 binding site in a human pancreatic cell line. Pancreas, 40, 701-7. PEREZ-LOPEZ, F. R., LARRAD-MUR, L., KALLEN, A., CHEDRAUI, P. & TAYLOR, H. S. 2010. Gender differences in cardiovascular disease: hormonal and biochemical influences. Reprod Sci, 17, 511-31. PETERLIN, B., MILANEZ, T., KOBAL, J., PETERLIN-POTISK, K., PETROVIC, D., GRAD, A. & POGACNIK, T. 2000. DD genotype of the angiotensin-converting enzyme gene and stroke in Slovenian population. Pflugers Arch, 439, R38-9. PETNEHAZY, T., STOKES, K. Y., WOOD, K. C., RUSSELL, J. & GRANGER, D. N. 2006. Role of blood cell-associated AT1 receptors in the microvascular responses to hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26, 313-8. PFAFFL, M. W., HORGAN, G. W. & DEMPFLE, L. 2002. Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res, 30. PHILLIPS, M. I. & KAGIYAMA, S. 2002. Angiotensin II as a pro-inflammatory mediator. Curr Opin Investig Drugs, 3, 569-77. PLAT, A. W., STOFFERS, H. E., DE LEEUW, P. W., VAN SCHAYCK, C. P., SOOMERS, F. L., KESTER, A. D., ARETZ, K. & KROON, A. A. 2009. Sex- specific effect of the alpha-adducin (G460W) and AGTR1 (A1166C) polymorphism on carotid intima-media thickness. J Hypertens, 27, 2165-73. PUEYO, M. E., GONZALEZ, W., NICOLETTI, A., SAVOIE, F., ARNAL, J. F. & MICHEL, J. B. 2000. Angiotensin II stimulates endothelial vascular cell adhesion molecule-1 via nuclear factor-kappaB activation induced by intracellular oxidative stress. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20, 645-51. PURUSHOTHAMAN, K. R., KRISHNAN, P., PURUSHOTHAMAN, M., WILEY, J., ALVIAR, C. L., RUIZ, F. J., ZUBATOV, Y., KINI, A. S., SHARMA, S. K., FUSTER, V. & MORENO, P. R. 2013. Expression of angiotensin-converting enzyme 2 and its end product angiotensin 1-7 is increased in diabetic atheroma: implications for inflammation and neovascularization. Cardiovasc Pathol, 22, 42-8. RABELO, L. A., ALENINA, N. & BADER, M. 2011. ACE2-angiotensin-(1-7)-Mas axis and oxidative stress in cardiovascular disease. Hypertens Res, 34, 154-60. RAITOHARJU, E., LYYTIKAINEN, L. P., LEVULA, M., OKSALA, N., MENNANDER, A., TARKKA, M., KLOPP, N., ILLIG, T., KAHONEN, M., KARHUNEN, P. J., LAAKSONEN, R. & LEHTIMAKI, T. 2011. miR-21, miR- 210, miR-34a, and miR-146a/b are up-regulated in human atherosclerotic plaques in the Tampere Vascular Study. Atherosclerosis, 219, 211-7. Literatura 153 RAIZADA, V., SKIPPER, B., LUO, W. & GRIFFITH, J. 2007. Intracardiac and intrarenal renin-angiotensin systems: mechanisms of cardiovascular and renal effects. J Investig Med, 55, 341-59. RAMKHELAWON, B., VILAR, J., RIVAS, D., MEES, B., DE CROM, R., TEDGUI, A. & LEHOUX, S. 2009. Shear stress regulates angiotensin type 1 receptor expression in endothelial cells. Circ Res, 105, 869-75. RE, R. N. 2004. Tissue renin angiotensin systems. Med Clin North Am, 88, 19-38. REINECKE, K., LUCIUS, R., REINECKE, A., RICKERT, U., HERDEGEN, T. & UNGER, T. 2003. Angiotensin II accelerates functional recovery in the rat sciatic nerve in vivo: role of the AT2 receptor and the transcription factor NF- kappaB. Faseb J, 17, 2094-6. RENTZSCH, B., TODIRAS, M., ILIESCU, R., POPOVA, E., CAMPOS, L. A., OLIVEIRA, M. L., BALTATU, O. C., SANTOS, R. A. & BADER, M. 2008. Transgenic angiotensin-converting enzyme 2 overexpression in vessels of SHRSP rats reduces blood pressure and improves endothelial function. Hypertension, 52, 967-73. REYES-ENGEL, A., MORCILLO, L., ARANDA, F. J., RUIZ, M., GAITAN, M. J., MAYOR-OLEA, A., ARANDA, P. & FERRARIO, C. M. 2006. Influence of gender and genetic variability on plasma angiotensin peptides. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 7, 92-7. RIBICHINI, F., PUGNO, F., FERRERO, V., BUSSOLATI, G., FEOLA, M., RUSSO, P., DI MARIO, C., COLOMBO, A. & VASSANELLI, C. 2006. Cellular immunostaining of angiotensin-converting enzyme in human coronary atherosclerotic plaques. J Am Coll Cardiol, 47, 1143-9. RICE, G. I., THOMAS, D. A., GRANT, P. J., TURNER, A. J. & HOOPER, N. M. 2004. Evaluation of angiotensin-converting enzyme (ACE), its homologue ACE2 and neprilysin in angiotensin peptide metabolism. Biochem J, 383, 45-51. RIGAT, B., HUBERT, C., ALHENC-GELAS, F., CAMBIEN, F., CORVOL, P. & SOUBRIER, F. 1990. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I- converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest, 86, 1343-6. ROMPE, F., ARTUC, M., HALLBERG, A., ALTERMAN, M., STRODER, K., THONE-REINEKE, C., REICHENBACH, A., SCHACHERL, J., DAHLOF, B., BADER, M., ALENINA, N., SCHWANINGER, M., ZUBERBIER, T., FUNKE-KAISER, H., SCHMIDT, C., SCHUNCK, W. H., UNGER, T. & STECKELINGS, U. M. 2010. Direct angiotensin II type 2 receptor stimulation acts anti-inflammatory through epoxyeicosatrienoic acid and inhibition of nuclear factor kappaB. Hypertension, 55, 924-31. ROSS, R. 1999. Atherosclerosis--an inflammatory disease. N Engl J Med, 340, 115-26. ROTHWELL, P. M., GIBSON, R. & WARLOW, C. P. 2000. Interrelation between plaque surface morphology and degree of stenosis on carotid angiograms and the risk of ischemic stroke in patients with symptomatic carotid stenosis. On behalf of the European Carotid Surgery Trialists' Collaborative Group. Stroke, 31, 615- 21. ROTHWELL, P. M., GIBSON, R. J., SLATTERY, J., SELLAR, R. J. & WARLOW, C. P. 1994. Equivalence of measurements of carotid stenosis. A comparison of three methods on 1001 angiograms. European Carotid Surgery Trialists' Collaborative Group. Stroke, 25, 2435-9. Literatura 154 RUBATTU, S., DI ANGELANTONIO, E., STANZIONE, R., ZANDA, B., EVANGELISTA, A., PIRISI, A., DE PAOLIS, P., COTA, L., BRUNETTI, E. & VOLPE, M. 2004. Gene polymorphisms of the renin-angiotensin-aldosterone system and the risk of ischemic stroke: a role of the A1166C/AT1 gene variant. J Hypertens, 22, 2129-34. RUNDEK, T., ARIF, H., BODEN-ALBALA, B., ELKIND, M. S., PAIK, M. C. & SACCO, R. L. 2008. Carotid plaque, a subclinical precursor of vascular events: the Northern Manhattan Study. Neurology, 70, 1200-7. SAAM, T., CAI, J., MA, L., CAI, Y. Q., FERGUSON, M. S., POLISSAR, N. L., HATSUKAMI, T. S. & YUAN, C. 2006. Comparison of symptomatic and asymptomatic atherosclerotic carotid plaque features with in vivo MR imaging. Radiology, 240, 464-72. SALES, V. L., SUKHOVA, G. K., LOPEZ-ILASACA, M. A., LIBBY, P., DZAU, V. J. & PRATT, R. E. 2005. Angiotensin type 2 receptor is expressed in murine atherosclerotic lesions and modulates lesion evolution. Circulation, 112, 3328- 36. SANSOM, S. E., NUOVO, G. J., MARTIN, M. M., KOTHA, S. R., PARINANDI, N. L. & ELTON, T. S. 2010. miR-802 regulates human angiotensin II type 1 receptor expression in intestinal epithelial C2BBe1 cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 299, 17. SANTOS, R. A., FERREIRA, A. J. & SIMOES, E. S. A. C. 2008. Recent advances in the angiotensin-converting enzyme 2-angiotensin(1-7)-Mas axis. Exp Physiol, 93, 519-27. SASAMURA, H., NAKAZATO, Y., HAYASHIDA, T., KITAMURA, Y., HAYASHI, M. & SARUTA, T. 1997. Regulation of vascular type 1 angiotensin receptors by cytokines. Hypertension, 30, 35-41. SATA, M. & FUKUDA, D. 2010. Crucial role of renin-angiotensin system in the pathogenesis of atherosclerosis. J Med Invest, 57, 12-25. SAUNDERS, M. A., LIANG, H. & LI, W. H. 2007. Human polymorphism at microRNAs and microRNA target sites. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 3300-5. SAVIC, Z. N., DAVIDOVIC, L., SAGIC, D., BRAJOVIC, M. D., POPOVIC, S. S. & MIJAILOVIC, M. 2010. [Correlation between morphologic carotid plaque findings based on color-Doppler and CT multidetector angiography with intraopertive findings in carotid artery stenosis]. Vojnosanit Pregl, 67, 449-52. SAVOIA, C., BURGER, D., NISHIGAKI, N., MONTEZANO, A. & TOUYZ, R. M. 2011. Angiotensin II and the vascular phenotype in hypertension. Expert Rev Mol Med, 30. SAVOIA, C., TOUYZ, R. M., VOLPE, M. & SCHIFFRIN, E. L. 2007. Angiotensin type 2 receptor in resistance arteries of type 2 diabetic hypertensive patients. Hypertension, 49, 341-6. SAYED-TABATABAEI, F. A., HOUWING-DUISTERMAAT, J. J., VAN DUIJN, C. M. & WITTEMAN, J. C. 2003. Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism and carotid artery wall thickness: a meta-analysis. Stroke, 34, 1634-9. SAYESKI, P. P. & BERNSTEIN, K. E. 2001. Signal transduction mechanisms of the angiotensin II type AT(1)-receptor: looking beyond the heterotrimeric G protein paradigm. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2, 4-10. Literatura 155 SCHAPER, W. & ITO, W. D. 1996. Molecular mechanisms of coronary collateral vessel growth. Circ Res, 79, 911-9. SCHIEFFER, B., SCHIEFFER, E., HILFIKER-KLEINER, D., HILFIKER, A., KOVANEN, P. T., KAARTINEN, M., NUSSBERGER, J., HARRINGER, W. & DREXLER, H. 2000. Expression of angiotensin II and interleukin 6 in human coronary atherosclerotic plaques: potential implications for inflammation and plaque instability. Circulation, 101, 1372-8. SCHMIEDER, R. E., ERDMANN, J., DELLES, C., JACOBI, J., FLECK, E., HILGERS, K. & REGITZ-ZAGROSEK, V. 2001. Effect of the angiotensin II type 2-receptor gene (+1675 G/A) on left ventricular structure in humans. J Am Coll Cardiol, 37, 175-82. SCHMITTGEN, T. D. & LIVAK, K. J. 2008. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc, 3, 1101-8. SCHOENHAGEN, P., ZIADA, K. M., KAPADIA, S. R., CROWE, T. D., NISSEN, S. E. & TUZCU, E. M. 2000. Extent and direction of arterial remodeling in stable versus unstable coronary syndromes : an intravascular ultrasound study. Circulation, 101, 598-603. SCHWARTZ, S. M., VIRMANI, R. & ROSENFELD, M. E. 2000. The good smooth muscle cells in atherosclerosis. Curr Atheroscler Rep, 2, 422-9. SERVANT, G., DUDLEY, D. T., ESCHER, E. & GUILLEMETTE, G. 1994. The marked disparity between the sizes of angiotensin type 2 receptors from different tissues is related to different degrees of N-glycosylation. Mol Pharmacol, 45, 1112-8. SETHUPATHY, P., BOREL, C., GAGNEBIN, M., GRANT, G. R., DEUTSCH, S., ELTON, T. S., HATZIGEORGIOU, A. G. & ANTONARAKIS, S. E. 2007. Human microRNA-155 on chromosome 21 differentially interacts with its polymorphic target in the AGTR1 3' untranslated region: a mechanism for functional single-nucleotide polymorphisms related to phenotypes. Am J Hum Genet, 81, 405-13. SETHUPATHY, P., CORDA, B. & HATZIGEORGIOU, A. G. 2006a. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. Rna, 12, 192-7. SETHUPATHY, P., MEGRAW, M. & HATZIGEORGIOU, A. G. 2006b. A guide through present computational approaches for the identification of mammalian microRNA targets. Nat Methods, 3, 881-6. SHAH, P. K. 2003. Mechanisms of plaque vulnerability and rupture. J Am Coll Cardiol, 41, 15S-22S. SHARMA, P. 1998. Meta-analysis of the ACE gene in ischaemic stroke. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 64, 227-30. SIRAGY, H. M. & CAREY, R. M. 2010. Role of the intrarenal renin-angiotensin- aldosterone system in chronic kidney disease. Am J Nephrol, 31, 541-50. SLUIMER, J. C., GASC, J. M., HAMMING, I., VAN GOOR, H., MICHAUD, A., VAN DEN AKKER, L. H., JUTTEN, B., CLEUTJENS, J., BIJNENS, A. P., CORVOL, P., DAEMEN, M. J. & HEENEMAN, S. 2008. Angiotensin- converting enzyme 2 (ACE2) expression and activity in human carotid atherosclerotic lesions. J Pathol, 215, 273-9. SMILDE, T. D., ZUURMAN, M. W., HILLEGE, H. L., VAN VELDHUISEN, D. J., VAN GILST, W. H., VAN DER STEEGE, G., VOORS, A. A., KORS, J. A., Literatura 156 DE JONG, P. E. & NAVIS, G. 2007. Renal function dependent association of AGTR1 polymorphism (A1166C) and electrocardiographic left-ventricular hypertrophy. Am J Hypertens, 20, 1097-103. SMITH, P. K., KROHN, R. I., HERMANSON, G. T., MALLIA, A. K., GARTNER, F. H., PROVENZANO, M. D., FUJIMOTO, E. K., GOEKE, N. M., OLSON, B. J. & KLENK, D. C. 1985. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem, 150, 76-85. SOHN, H. Y., RAFF, U., HOFFMANN, A., GLOE, T., HEERMEIER, K., GALLE, J. & POHL, U. 2000. Differential role of angiotensin II receptor subtypes on endothelial superoxide formation. Br J Pharmacol, 131, 667-72. SPAGNOLI, L. G., MAURIELLO, A., SANGIORGI, G., FRATONI, S., BONANNO, E., SCHWARTZ, R. S., PIEPGRAS, D. G., PISTOLESE, R., IPPOLITI, A. & HOLMES, D. R., JR. 2004. Extracranial thrombotically active carotid plaque as a risk factor for ischemic stroke. Jama, 292, 1845-52. SPRUTH, E., ZURBRUGG, H. R., WARNECKE, C., ERDMANN, J., PREGLA, R., PFAUTSCH, P., HETZER, R., FLECK, E. & REGITZ-ZAGROSEK, V. 1999. Expression of ACE mRNA in the human atrial myocardium is not dependent on left ventricular function, ACE inhibitor therapy, or the ACE I/D genotype. J Mol Med, 77, 804-10. STANKOVIC, A. & ALAVANTIC, D. 2002. Rapid detection of the hypertension- associated A1166C polymorphism of the angiotensin II type 1 receptor (AGTR1). Genet Test, 6, 133-4. STANKOVIĆ, A., ILIĆ N., ŢUNIĆ Z., GLIŠIĆ S., ALAVANTIĆ D.1999. Association of the insertion/deletion polymorphism at the angiotensin I-converting enzyme locus with arterial blood pressure:population-based study.Jugoslav Med Biohem 18:141-147. STANKOVIC, A., ZIVKOVIC, M. & ALAVANTIC, D. 2002. Angiotensin I- converting enzyme gene polymorphism in a Serbian population: a gender- specific association with hypertension. Scand J Clin Lab Invest, 62, 469-75. STANKOVIC, A., ZIVKOVIC, M., GLISIC, S. & ALAVANTIC, D. 2003. Angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism and essential hypertension in Serbian population. Clin Chim Acta, 327, 181-5. STANKOVIC, A., ZIVKOVIC, M., KOSTIC, M., ATANACKOVIC, J., KRSTIC, Z. & ALAVANTIC, D. 2010. Expression profiling of the AT2R mRNA in affected tissue from children with CAKUT. Clin Biochem, 43, 71-5. STANKOVIC, A., ZIVKOVIC, M., KOSTIC, M., ATANACKOVIC, J., KRSTIC, Z. & ALAVANTIC, D. 2010. Expression profiling of the AT2R mRNA in affected tissue from children with CAKUT. Clin Biochem, 43, 71-5. STECKELINGS, U. M., WIDDOP, R. E., PAULIS, L. & UNGER, T. 2010. The angiotensin AT2 receptor in left ventricular hypertrophy. J Hypertens, 28, S50- 5. STEEDS, R. P., TOOLE, L. O., CHANNER, K. S. & MORICE, A. H. 1999. Human vascular reactivity and polymorphisms of the angiotensin-converting enzyme and the angiotensin type 1 receptor genes. J Vasc Res, 36, 445-55. STICCHI, E., ROMAGNUOLO, I., SOFI, F., PRATESI, G., PULLI, R., PRATESI, C., ABBATE, R. & FATINI, C. 2011. Association between polymorphisms of the renin angiotensin system and carotid stenosis. J Vasc Surg, 54, 467-73. Literatura 157 STOCKER, R. & KEANEY, J. F., JR. 2004. Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev, 84, 1381-478. SU, B., MARTIN, M. M. & ELTON, T. S. 1996. Human AT1 receptor gene regulation. Adv Exp Med Biol, 396, 11-21. SU, B., MARTIN, M. M., BEASON, K. B., MILLER, P. J. & ELTON, T. S. 1994. The genomic organization and functional analysis of the promoter for the human angiotensin II type 1 receptor. Biochem Biophys Res Commun, 204, 1039-46. SUEHIRO, T., MORITA, T., INOUE, M., KUMON, Y., IKEDA, Y. & HASHIMOTO, K. 2004. Increased amount of the angiotensin-converting enzyme (ACE) mRNA originating from the ACE allele with deletion. Hum Genet, 115, 91-6. SUGIMURA, K., TIAN, X. L., HOFFMANN, S., GANTEN, D. & BADER, M. 1998. Alternative splicing of the mRNA coding for the human endothelial angiotensin- converting enzyme: a new mechanism for solubilization. Biochem Biophys Res Commun, 247, 466-72. SUZUKI, Y., RUIZ-ORTEGA, M., LORENZO, O., RUPEREZ, M., ESTEBAN, V. & EGIDO, J. 2003. Inflammation and angiotensin II. Int J Biochem Cell Biol, 35, 881-900. SZOLNOKI, Z., HAVASI, V., TALIAN, G., BENE, J., KOMLOSI, K., SOMOGYVARI, F., KONDACS, A., SZABO, M., FODOR, L., BODOR, A. & MELEGH, B. 2006a. Angiotensin II type-1 receptor A1166C polymorphism is associated with increased risk of ischemic stroke in hypertensive smokers. J Mol Neurosci, 28, 285-90. SZOLNOKI, Z., MAASZ, A., MAGYARI, L., HORVATOVICH, K., FARAGO, B., SOMOGYVARI, F., KONDACS, A., SZABO, M., FODOR, L., BODOR, A., HADARITS, F. & MELEGH, B. 2006b. Coexistence of angiotensin II type-1 receptor A1166C and angiotensin-converting enzyme D/D polymorphism suggests susceptibility for small-vessel-associated ischemic stroke. Neuromolecular Med, 8, 353-60. SZOLNOKI, Z., SOMOGYVARI, F., KONDACS, A., SZABO, M. & FODOR, L. 2001. Evaluation of the roles of the Leiden V mutation and ACE I/D polymorphism in subtypes of ischaemic stroke. J Neurol, 248, 756-61. TABARA, Y., KOHARA, K., NAKURA, J. & MIKI, T. 2001. Risk factor-gene interaction in carotid atherosclerosis: effect of gene polymorphisms of renin- angiotensin system. J Hum Genet, 46, 278-84. TABAS, I. 2009. Macrophage apoptosis in atherosclerosis: consequences on plaque progression and the role of endoplasmic reticulum stress. Antioxid Redox Signal, 11, 2333-9. TABAS, I. 2010. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat Rev Immunol, 10, 36-46. TABAS, I., WILLIAMS, K. J. & BOREN, J. 2007. Subendothelial lipoprotein retention as the initiating process in atherosclerosis: update and therapeutic implications. Circulation, 116, 1832-44. TAKAYA, N., YUAN, C., CHU, B., SAAM, T., POLISSAR, N. L., JARVIK, G. P., ISAAC, C., MCDONOUGH, J., NATIELLO, C., SMALL, R., FERGUSON, M. S. & HATSUKAMI, T. S. 2005. Presence of intraplaque hemorrhage stimulates progression of carotid atherosclerotic plaques: a high-resolution magnetic resonance imaging study. Circulation, 111, 2768-75. Literatura 158 TAKEDA, K., ICHIKI, T., FUNAKOSHI, Y., ITO, K. & TAKESHITA, A. 2000. Downregulation of angiotensin II type 1 receptor by all-trans retinoic acid in vascular smooth muscle cells. Hypertension, 35, 297-302. TAM, W. 2001. Identification and characterization of human BIC, a gene on chromosome 21 that encodes a noncoding RNA. Gene, 274, 157-67. TANG, B., MA, S., YANG, Y., YANG, D., CHEN, J., SU, X., TAN, Y., SUN, M. & LI, D. 2011. Overexpression of angiotensin II type 2 receptor suppresses neointimal hyperplasia in a rat carotid arterial balloon injury model. Mol Med Report, 4, 249-54. TENDERA, M., ABOYANS, V., BARTELINK, M. L., BAUMGARTNER, I., CLEMENT, D., COLLET, J. P., CREMONESI, A., DE CARLO, M., ERBEL, R., FOWKES, F. G., HERAS, M., KOWNATOR, S., MINAR, E., OSTERGREN, J., POLDERMANS, D., RIAMBAU, V., ROFFI, M., ROTHER, J., SIEVERT, H., VAN SAMBEEK, M. & ZELLER, T. 2011. ESC Guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral artery diseases: Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteries: the Task Force on the Diagnosis and Treatment of Peripheral Artery Diseases of the European Society of Cardiology (ESC). Eur Heart J, 32, 2851-906. TESANOVIC, S., VINH, A., GASPARI, T. A., CASLEY, D. & WIDDOP, R. E. 2010. Vasoprotective and atheroprotective effects of angiotensin (1-7) in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 30, 1606-13. TESTUT, P., SOUBRIER, F., CORVOL, P. & HUBERT, C. 1993. Functional analysis of the human somatic angiotensin I-converting enzyme gene promoter. Biochem J, 293, 843-8. THAM, D. M., MARTIN-MCNULTY, B., WANG, Y. X., WILSON, D. W., VERGONA, R., SULLIVAN, M. E., DOLE, W. & RUTLEDGE, J. C. 2002. Angiotensin II is associated with activation of NF-kappaB-mediated genes and downregulation of PPARs. Physiol Genomics, 11, 21-30. THATCHER, S., YIANNIKOURIS, F., GUPTE, M. & CASSIS, L. 2009. The adipose renin-angiotensin system: role in cardiovascular disease. Mol Cell Endocrinol, 302, 111-7. THIM, T., HAGENSEN, M. K., BENTZON, J. F. & FALK, E. 2008. From vulnerable plaque to atherothrombosis. J Intern Med, 263, 506-16. THOMAS, M. C., PICKERING, R. J., TSOROTES, D., KOITKA, A., SHEEHY, K., BERNARDI, S., TOFFOLI, B., NGUYEN-HUU, T. P., HEAD, G. A., FU, Y., CHIN-DUSTING, J., COOPER, M. E. & TIKELLIS, C. 2010. Genetic Ace2 deficiency accentuates vascular inflammation and atherosclerosis in the ApoE knockout mouse. Circ Res, 107, 888-97. THORP, E. & TABAS, I. 2009. Mechanisms and consequences of efferocytosis in advanced atherosclerosis. J Leukoc Biol, 86, 1089-95. TIPNIS, S. R., HOOPER, N. M., HYDE, R., KARRAN, E., CHRISTIE, G. & TURNER, A. J. 2000. A human homolog of angiotensin-converting enzyme. Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase. J Biol Chem, 275, 33238-43. TIRET, L., BLANC, H., RUIDAVETS, J. B., ARVEILER, D., LUC, G., JEUNEMAITRE, X., TICHET, J., MALLET, C., POIRIER, O., PLOUIN, P. F. & CAMBIEN, F. 1998. Gene polymorphisms of the renin-angiotensin system in Literatura 159 relation to hypertension and parental history of myocardial infarction and stroke: the PEGASE study. Projet d'Etude des Genes de l'Hypertension Arterielle Severe a moderee Essentielle. J Hypertens, 16, 37-44. TIRET, L., KEE, F., POIRIER, O., NICAUD, V., LECERF, L., EVANS, A., CAMBOU, J. P., ARVEILER, D., LUC, G., AMOUYEL, P. & ET AL. 1993. Deletion polymorphism in angiotensin-converting enzyme gene associated with parental history of myocardial infarction. Lancet, 341, 991-2. TOUSOULIS, D., KOUMALLOS, N., ANTONIADES, C., ANTONOPOULOS, A. S., BAKOGIANNIS, C., MILLIOU, A., MARINOU, K., KALLIKAZAROU, E., STEFANADI, E., MENTZIKOF, D. & STEFANADIS, C. 2010. Genetic polymorphism on type 2 receptor of angiotensin II, modifies cardiovascular risk and systemic inflammation in hypertensive males. Am J Hypertens, 23, 237-42. TOUYZ, R. M. 2005. Molecular and cellular mechanisms in vascular injury in hypertension: role of angiotensin II. Curr Opin Nephrol Hypertens, 14, 125-31. TUNCER, N., TUGLULAR, S., KILIC, G., SAZCI, A., US, O. & KARA, I. 2006. Evaluation of the angiotensin-converting enzyme insertion/deletion polymorphism and the risk of ischaemic stroke. J Clin Neurosci, 13, 224-7. TURNER, A. J. & HOOPER, N. M. 2002. The angiotensin-converting enzyme gene family: genomics and pharmacology. Trends Pharmacol Sci, 23, 177-83. ULLIAN, M. E., RAYMOND, J. R., WILLINGHAM, M. C. & PAUL, R. V. 1997. Regulation of vascular angiotensin II receptors by EGF. Am J Physiol, 273, C1241-9. UNGER, T., CHUNG, O., CSIKOS, T., CULMAN, J., GALLINAT, S., GOHLKE, P., HOHLE, S., MEFFERT, S., STOLL, M., STROTH, U. & ZHU, Y. Z. 1996. Angiotensin receptors. J Hypertens Suppl, 14, S95-103. VAN DER WAL, A. C., BECKER, A. E., VAN DER LOOS, C. M. & DAS, P. K. 1994. Site of intimal rupture or erosion of thrombosed coronary atherosclerotic plaques is characterized by an inflammatory process irrespective of the dominant plaque morphology. Circulation, 89, 36-44. VAN GEEL, P. P., PINTO, Y. M., VOORS, A. A., BUIKEMA, H., OOSTERGA, M., CRIJNS, H. J. & VAN GILST, W. H. 2000. Angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphism is associated with an increased response to angiotensin II in human arteries. Hypertension, 35, 717-21. VAUGHAN, D. E., LAZOS, S. A. & TONG, K. 1995. Angiotensin II regulates the expression of plasminogen activator inhibitor-1 in cultured endothelial cells. A potential link between the renin-angiotensin system and thrombosis. J Clin Invest, 95, 995-1001. VERREY, F., SINGER, D., RAMADAN, T., VUILLE-DIT-BILLE, R. N., MARIOTTA, L. & CAMARGO, S. M. 2009. Kidney amino acid transport. Pflugers Arch, 458, 53-60. VICKERS, C., HALES, P., KAUSHIK, V., DICK, L., GAVIN, J., TANG, J., GODBOUT, K., PARSONS, T., BARONAS, E., HSIEH, F., ACTON, S., PATANE, M., NICHOLS, A. & TUMMINO, P. 2002. Hydrolysis of biological peptides by human angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase. J Biol Chem, 277, 14838-43. VIRMANI, R., BURKE, A. P., FARB, A. & KOLODGIE, F. D. 2006. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol, 47, C13-8. Literatura 160 VIRMANI, R., KOLODGIE, F. D., BURKE, A. P., FARB, A. & SCHWARTZ, S. M. 2000. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 20, 1262-75. VIRMANI, R., KOLODGIE, F. D., BURKE, A. P., FINN, A. V., GOLD, H. K., TULENKO, T. N., WRENN, S. P. & NARULA, J. 2005. Atherosclerotic plaque progression and vulnerability to rupture: angiogenesis as a source of intraplaque hemorrhage. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 25, 2054-61. VOLPE, M., MUSUMECI, B., DE PAOLIS, P., SAVOIA, C. & MORGANTI, A. 2003. Angiotensin II AT2 receptor subtype: an uprising frontier in cardiovascular disease? J Hypertens, 21, 1429-43. VON BIRGELEN, C., KLINKHART, W., MINTZ, G. S., PAPATHEODOROU, A., HERRMANN, J., BAUMGART, D., HAUDE, M., WIENEKE, H., GE, J. & ERBEL, R. 2001. Plaque distribution and vascular remodeling of ruptured and nonruptured coronary plaques in the same vessel: an intravascular ultrasound study in vivo. J Am Coll Cardiol, 37, 1864-70. W VAN LAMMEREN G., MOLL, L. F., BORST, G.J., DE KLEJIN DP, DE VRIES JP,P.M., PASTERKAMP, G. Atherosclerotic plaque biomarkers: beyond the horizon of the vulnerable plaque.Curr Cardiol Rev, 7, 22-7. WALSH, K., SMITH, R. C. & KIM, H. S. 2000. Vascular cell apoptosis in remodeling, restenosis, and plaque rupture. Circ Res, 87, 184-8. WANG, C. H., LI, S. H., WEISEL, R. D., FEDAK, P. W., DUMONT, A. S., SZMITKO, P., LI, R. K., MICKLE, D. A. & VERMA, S. 2003. C-reactive protein upregulates angiotensin type 1 receptors in vascular smooth muscle. Circulation, 107, 1783-90. WANG, C., JAYADEV, S. & ESCOBEDO, J. A. 1995. Identification of a domain in the angiotensin II type 1 receptor determining Gq coupling by the use of receptor chimeras. J Biol Chem, 270, 16677-82. WANG, D. H. & DU, Y. 1998. Regulation of vascular type 1 angiotensin II receptor in hypertension and sodium loading: role of angiotensin II. J Hypertens, 16, 467- 75. WANG, J. G. & STAESSEN, J. A. 2000. Genetic polymorphisms in the renin- angiotensin system: relevance for susceptibility to cardiovascular disease. Eur J Pharmacol, 410, 289-302. WANG, W. Y., ZEE, R. Y. & MORRIS, B. J. 1997. Association of angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism with essential hypertension. Clin Genet, 51, 31-4. WANG, X., NICKENIG, G. & MURPHY, T. J. 1997. The vascular smooth muscle type I angiotensin II receptor mRNA is destabilized by cyclic AMP-elevating agents. Mol Pharmacol, 52, 781-7. WARDLAW, J. M. & LEWIS, S. 2005. Carotid stenosis measurement on colour Doppler ultrasound: agreement of ECST, NASCET and CCA methods applied to ultrasound with intra-arterial angiographic stenosis measurement. Eur J Radiol, 56, 205-11. WARNECKE, C., MUGRAUER, P., SURDER, D., ERDMANN, J., SCHUBERT, C. & REGITZ-ZAGROSEK, V. 2005. Intronic ANG II type 2 receptor gene polymorphism 1675 G/A modulates receptor protein expression but not mRNA splicing. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 289, 18.. Literatura 161 WARNECKE, C., SURDER, D., CURTH, R., FLECK, E. & REGITZ-ZAGROSEK, V. 1999a. Analysis and functional characterization of alternatively spliced angiotensin II type 1 and 2 receptor transcripts in the human heart. J Mol Med, 77, 718-27. WARNECKE, C., WILLICH, T., HOLZMEISTER, J., BOTTARI, S. P., FLECK, E. & REGITZ-ZAGROSEK, V. 1999b. Efficient transcription of the human angiotensin II type 2 receptor gene requires intronic sequence elements. Biochem J, 340, 17-24. WARNER, F. J., LEW, R. A., SMITH, A. I., LAMBERT, D. W., HOOPER, N. M. & TURNER, A. J. 2005. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), but not ACE, is preferentially localized to the apical surface of polarized kidney cells. J Biol Chem, 280, 39353-62. WARNHOLTZ, A., NICKENIG, G., SCHULZ, E., MACHARZINA, R., BRASEN, J. H., SKATCHKOV, M., HEITZER, T., STASCH, J. P., GRIENDLING, K. K., HARRISON, D. G., BOHM, M., MEINERTZ, T. & MUNZEL, T. 1999. Increased NADH-oxidase-mediated superoxide production in the early stages of atherosclerosis: evidence for involvement of the renin-angiotensin system. Circulation, 99, 2027-33. WASSMANN, S., CZECH, T., VAN EICKELS, M., FLEMING, I., BOHM, M. & NICKENIG, G. 2004a. Inhibition of diet-induced atherosclerosis and endothelial dysfunction in apolipoprotein E/angiotensin II type 1A receptor double- knockout mice. Circulation, 110, 3062-7. WASSMANN, S., STUMPF, M., STREHLOW, K., SCHMID, A., SCHIEFFER, B., BOHM, M. & NICKENIG, G. 2004b. Interleukin-6 induces oxidative stress and endothelial dysfunction by overexpression of the angiotensin II type 1 receptor. Circ Res, 94, 534-41. WATANABE, Y., ISHIGAMI, T., KAWANO, Y., UMAHARA, T., NAKAMORI, A., MIZUSHIMA, S., HIBI, K., KOBAYASHI, I., TAMURA, K., OCHIAI, H., UMEMURA, S. & ISHII, M. 1997. Angiotensin-converting enzyme gene I/D polymorphism and carotid plaques in Japanese. Hypertension, 30, 569-73. WHARTON, J., MORGAN, K., RUTHERFORD, R. A., CATRAVAS, J. D., CHESTER, A., WHITEHEAD, B. F., DE LEVAL, M. R., YACOUB, M. H. & POLAK, J. M. 1998. Differential distribution of angiotensin AT2 receptors in the normal and failing human heart. J Pharmacol Exp Ther, 284, 323-36. WIDDER, B., PAULAT, K., HACKSPACHER, J., HAMANN, H., HUTSCHENREITER, S., KREUTZER, C., OTT, F. & VOLLMAR, J. 1990. Morphological characterization of carotid artery stenoses by ultrasound duplex scanning. Ultrasound Med Biol, 16, 349-54. WILLIAMS, K. J. 2001. Arterial wall chondroitin sulfate proteoglycans: diverse molecules with distinct roles in lipoprotein retention and atherogenesis. Curr Opin Lipidol, 12, 477-87. WILLIAMS, T. A., VILLARD, E., PRIGENT, Y., DADOUNE, J. P. & SOUBRIER, F. 1995. A genetic study of angiotensin I-converting enzyme levels in human semen. Mol Cell Endocrinol, 107, 215-9. WU, L., IWAI, M., NAKAGAMI, H., LI, Z., CHEN, R., SUZUKI, J., AKISHITA, M., DE GASPARO, M. & HORIUCHI, M. 2001. Roles of angiotensin II type 2 receptor stimulation associated with selective angiotensin II type 1 receptor Literatura 162 blockade with valsartan in the improvement of inflammation-induced vascular injury. Circulation, 104, 2716-21. WU, L., IWAI, M., NAKAGAMI, H., LI, Z., CHEN, R., SUZUKI, J., AKISHITA, M., DE GASPARO, M. & HORIUCHI, M. 2001. Roles of angiotensin II type 2 receptor stimulation associated with selective angiotensin II type 1 receptor blockade with valsartan in the improvement of inflammation-induced vascular injury. Circulation, 104, 2716-21. XU, M., SHAM, P., YE, Z., LINDPAINTNER, K. & HE, L. 2010. A1166C genetic variation of the angiotensin II type I receptor gene and susceptibility to coronary heart disease: collaborative of 53 studies with 20,435 cases and 23,674 controls. Atherosclerosis, 213, 191-9. YAMAMOTO, Y., WATARI, Y., BRYDUN, A., YOSHIZUMI, M., AKISHITA, M., HORIUCHI, M., CHAYAMA, K., OSHIMA, T. & OZONO, R. 2008. Role of the angiotensin II type 2 receptor in arterial remodeling after wire injury in mice. Hypertens Res, 31, 1241-9. YASUHARA, A., WADA, J., MALAKAUSKAS, S. M., ZHANG, Y., EGUCHI, J., NAKATSUKA, A., MURAKAMI, K., KANZAKI, M., TESHIGAWARA, S., YAMAGATA, K., LE, T. H. & MAKINO, H. 2008. Collectrin is involved in the development of salt-sensitive hypertension by facilitating the membrane trafficking of apical membrane proteins via interaction with soluble N- ethylmaleiamide-sensitive factor attachment protein receptor complex. Circulation, 118, 2146-55. YOSHIDA, H., KON, V. & ICHIKAWA, I. Polymorphisms of the renin-angiotensin system genes in progressive renal diseases, Kidney Int. 1996 Sep;50(3):732-44. ZEE, R. Y., RIDKER, P. M., STAMPFER, M. J., HENNEKENS, C. H. & LINDPAINTNER, K. 1999. Prospective evaluation of the angiotensin- converting enzyme insertion/deletion polymorphism and the risk of stroke. Circulation, 99, 340-3. ZHAN, Y., BROWN, C., MAYNARD, E., ANSHELEVICH, A., NI, W., HO, I. C. & OETTGEN, P. 2005. Ets-1 is a critical regulator of Ang II-mediated vascular inflammation and remodeling. J Clin Invest, 115, 2508-16. ZHANG, C., ZHAO, Y. X., ZHANG, Y. H., ZHU, L., DENG, B. P., ZHOU, Z. L., LI, S. Y., LU, X. T., SONG, L. L., LEI, X. M., TANG, W. B., WANG, N., PAN, C. M., SONG, H. D., LIU, C. X., DONG, B., ZHANG, Y. & CAO, Y. 2010. Angiotensin-converting enzyme 2 attenuates atherosclerotic lesions by targeting vascular cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 107, 15886-91. ZHANG, H., SUN, M., SUN, T., ZHANG, C., MENG, X., ZHANG, Y. & YANG, J. 2011. Association between angiotensin II type 1 receptor gene polymorphisms and ischemic stroke: a meta-analysis. Cerebrovasc Dis, 32, 431-8. ZHANG, H., WADA, J., HIDA, K., TSUCHIYAMA, Y., HIRAGUSHI, K., SHIKATA, K., WANG, H., LIN, S., KANWAR, Y. S. & MAKINO, H. 2001. Collectrin, a collecting duct-specific transmembrane glycoprotein, is a novel homolog of ACE2 and is developmentally regulated in embryonic kidneys. J Biol Chem, 276, 17132-9. ZHANG, X., WANG, D., XU, L., MA, Y. & ZHANG, S. 2001. [Association between renin-angiotensin system gene polymorphism and type 2 diabetics with stroke in China]. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 18, 462-6. Literatura 163 ZHANG, Y. & WADA, J. 2007. Collectrin, a homologue of ACE2, its transcriptional control and functional perspectives. Biochem Biophys Res Commun, 363, 1-5. ZHANG, Y., WADA, J., YASUHARA, A., ISEDA, I., EGUCHI, J., FUKUI, K., YANG, Q., YAMAGATA, K., HIESBERGER, T., IGARASHI, P., ZHANG, H., WANG, H., AKAGI, S., KANWAR, Y. S. & MAKINO, H. 2007. The role for HNF-1beta-targeted collectrin in maintenance of primary cilia and cell polarity in collecting duct cells. PLoS One, 2. ZHANG, Z., XU, G., LIU, D., FAN, X., ZHU, W. & LIU, X. 2012. Angiotensin- converting enzyme insertion/deletion polymorphism contributes to ischemic stroke risk: a meta-analysis of 50 case-control studies. PLoS One, 7, 1. ZHAO, X., MARTIN, M. M. & ELTON, T. S. 2000. Basal level transcriptional regulation of the human angiotensin II type 1 receptor gene. Biochim Biophys Acta, 15, 1-2. ZHAO, X., MARTIN, M. M. & ELTON, T. S. 2001. The transcription factors Sp1 and Sp3 are required for human angiotensin II type 1 receptor gene expression in H295-R cells. Biochim Biophys Acta, 30, 195-206. ZHENG, L., XU, C. C., CHEN, W. D., SHEN, W. L., RUAN, C. C., ZHU, L. M., ZHU, D. L. & GAO, P. J. 2010. MicroRNA-155 regulates angiotensin II type 1 receptor expression and phenotypic differentiation in vascular adventitial fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun, 400, 483-8. ZHU, N., ZHANG, D., CHEN, S., LIU, X., LIN, L., HUANG, X., GUO, Z., LIU, J., WANG, Y., YUAN, W. & QIN, Y. 2011. Endothelial enriched microRNAs regulate angiotensin II-induced endothelial inflammation and migration. Atherosclerosis, 215, 286-93. ZHU, S. & MENG, Q. H. 2006. Association of angiotensin II type 1 receptor gene polymorphism with carotid atherosclerosis. Clin Chem Lab Med, 44, 282-4. ZHUO, J. L. & LI, X. C. 2011. New insights and perspectives on intrarenal renin- angiotensin system: focus on intracrine/intracellular angiotensin II. Peptides, 32, 1551-65. ZIVKOVIC, M., DJURIC, T., STANCIC, O., ALAVANTIC, D. & STANKOVIC, A. 2007. X-linked angiotensin II type 2 receptor gene polymorphism -1332A/G in male patients with essential hypertension. Clin Chim Acta, 386, 110-3. ZIVKOVIC, M., STANKOVIC, A. & ALAVANTIC, D. 2005. AT1 receptor A1166C and AT2 receptor -1332A/G gene polymorphisms: efficient genotyping by single-tube PCR. J Clin Lab Anal, 19, 84-6. ZULLI, A., BURRELL, L. M., BUXTON, B. F. & HARE, D. L. 2008. ACE2 and AT4R are present in diseased human blood vessels. Eur J Histochem, 52, 39-44. ZULLI, A., BURRELL, L. M., WIDDOP, R. E., BLACK, M. J., BUXTON, B. F. & HARE, D. L. 2006. Immunolocalization of ACE2 and AT2 receptors in rabbit atherosclerotic plaques. J Histochem Cytochem, 54, 147-50. Web stranice : http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html http://www.graphpad.com http://www.nieronline.org/uploads/5/53/Lely_Fig2.jpg http://www.statsoft.com http://www.who.int/cardiovascular_diseases/en/ PRILOZI a ) b) Prilog A. Profili amplifikacije iRNK (cDNK) ciljnih gena za a) ACE b) ACE2 u tkivu aterosklerotskog plaka pacijenata sa karotidnom aterosklerozom (KA). Na graficima je logaritamski prikaz amplifikacije u vidu zavisnosti delta RN od broja ciklusa PCR. Zelena horizontalna linija predstavlja automatski podešen "treshold". Presek ove linije sa eksponencijalnom fazom krive amplifikacije ciljne sekvence u analiziranom uzorku definiše Ct vrednost (Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR System SDS Softwere). c) d) Prilog B. Profili amplifikacije malih nekodirajućih RNK c) miR-155 d) RNU-44 u tkivu aterosklerotskog plaka pacijenata sa karotidnom aterosklerozom (KA). Na graficima je logaritamski prikaz amplifikacije u vidu zavisnosti deltaRN od brorizontalna ciklusa PCR. Zelena horizontalan linija predstavlja automatski podešen "treshold". Presek ove linije sa eksponencijalnom fazom krive amplifikacije ciljne sekvence u analiziranom uzorku definiše Ct vrednost (Applied Biosystems, 7500 Real Time PCR System SDS Softwere). Stručna biografija Ana Kolaković je roĎena 01.06.1982. godine u Čačku. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu, studijska grupa biologija, je upisala školske 2001/2002 godine. Diplomirala je 20.07.2007. godine sa prosečnom ocenom 8.97 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Školske 2007/2008 je upisala doktorske studije na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, smer Molekularna biologija, modul Molekularna biologija eukariota. Od februara 2008. do juna 2010. godine je bila stipendista doktorant Ministarstva za Nauku i Tehnološki razvoj Republike Srbije. Od 01.06. 2010. godine je zaposlena u Laboratoriji za Radiobiologiju i Molekularnu Genetiku Instituta za nuklearne nauke “Vinča“. U zvanje istraživač-saradnik izabrana je 17.11.2010. godine. Do sada je bila angažovana na nekoliko naučnih projekata: od 2008. do 2010. godine na projektu pod nazivom „Genetska epidemiologija i farmakogenomika vaskularnih oboljenja“ i od 2008. do 2009. godine na projektu „Primena parametara genetske i radijacione epidemiologije u procesu rizika hroničnih nezaraznih oboljenja u populaciji opštine Obrenovac“. Trenutno je angažovana na projektima: „Genetska osnova humanih vaskularnih i inflamatornih bolesti“ (br. IO175085) i „Integralna studija identifikacije regionalnih genetskih faktora rizika životne sredine za masovne nezarazne bolesti humane populacije- INGEMA_S (br. III41028), Ministarstva za Prosvetu i Nauku, Republike Srbije. Ana Kolaković je do sada bila autor i koator 4 naučne publikacije iz uže naučne oblasti u istaknutim meĎunarodnom časopisima, 1 rada sa skupova od meĎunarodnog značaja štampan u celini i 11 saopštenja sa naučnih skupova od meĎunarodnog značaja štampanih u izvodu. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Aнa Колаковић број уписа ИО 070006 Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Генетичко-епидемиолошка анализа и анализа експресије гена ренин-ангиотензин система (RАS) у каротидној атеросклерози од човека  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, _29.11.2013__ Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора _Ана Колаковић Број уписа _ ИО 070006______________________________________________ Студијски програм Молекуларна биологија ______________________ Наслов рада Генетичко-епидемиолошка анализа и анализа експресије гена ренин-ангиотензин система (RAS) у каротидној атеросклерози код човека Ментор др Александра Станковић, виши научни сарадник Института за нуклеарне науке „Винча“ др Горан Брајушковић, ванредни професор , Биолошког факултета, Универзитета у Београду________________________ Потписани Ана Колаковић изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, _29.11.2013.____ Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Генетичко-епидемиолошка анализа и анализа експресије гена ренин-ангиотензин система (RAS) у каротидној атеросклерози код човека која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, _29.12.2013._____ 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.