Univerzitet и Beogradu Bioloski fakultet mr Milena Vlahovic ЕFЕКАТ КADMUUМA NA RAST 1 BIOHEMUSKE 0508/NE IARVI GUBARA Lymantria dispar L. Doktorska disertacija Beograd, 2009. УНИВ!:РЗИТ"ТС!<А ЫIБЛИСТЕКА 'С ~др ~;;.РКЈВИЋ'- БЕОГ;:.д и. sp. \ G~ о !Ј Mentori: Prof. dr Nikola Т ucic redovni profesor Bioloskog fakulteta Univerziteta и Beogradu dr Jelica Lazarevic visi naucni saradnik lnstituta za blofoska istraiivanja "Sinisa Stankovic" дап komisije: dr Vesna Perit-Mataruga naucni savetnik lnstituta za bloloska istraiivanja "Sinisa Stankovic" Ova doktorska disertacija је игаdепа и Оdе/јепји za fiziologijи i Ьiohemijи iпsekata lпstitиta za Ьioloska istraiivaпja "Siпisa Staпkovic". Rad је realizovaп па projektи 7 43033 "Fizioloski i evolиcioпi aspekti stresпog odgovora и prirodпim i laboratorijskim popиlacijama". Prof dr Nikoli Тисiси dиgиjem роsеЬпи zahvalпost za korisпe savete sиgestije и tokи izrade ove doktorske disertacije. Zahvaljиjem па pomoCi dr Jelici Lazarevic i dr Vesпi Perit-Matarиgi, kao i ostalim claпovima Odeljeпja za fiziologijи i Ьiohemijи iпsekata: dr Veri Neпadovic, mr Larisi 1/ijiп, mr Mariji Mrdakovic, mr Dajaпi Todorovic i Dејапи MirCicи. Zahvaljиjem se mojoj porodici па пеsеЬlспој podr5ci. 1. UVOD 7. 7 POREKLO КАDМ/ЈИМА И PR/ROD/1 NJEGOVA PRIMENA 2 7 .2/NTERAKC/JA КАDМ/ЈИМА 1 ESENCIJALNIH METALA 5 7 . З INTEGRISANI CELIJSКI ODBRAМBENI ODGOVOR NA STRES 7 7.4 TOKSICNI ЕFЕКТ/ КАDМ/ЈИМА NA INSEКТE 7 7 7 .4. 7 Adapatcije isekata па teske metale 75 7.5 DIGESТIVNI ENZ/M/1 ENZIMI DETOKSIFIКACIJE 77 7 .5. 7 Proteaze 77 7.5.2 a-Giikozidaze 19 1.5.3 ~-Giikozidaze 20 1.5.4 Esteraze 21 1.5.5 Gfutation 5-transferaza 22 ( 1.6 KLASIFIКACIJA DIGESТIVNIH ENZIМA 1 SEKRETORNA 25 AКТIVNOST CREVA INSEКA ТА 7 .6. 7 Sekrecija digestivnih enzima kod fitofagnih insekata 25 7.7 ADAPTACIJE NA STRES 1 EVOLUCIJA 27 2. C/U RADA зо З. МA1ERUAL 1 МЕТОDЕ З. 7 USLOVI GAJENJA 3.2 EKSPERIMENTALNE GRUPE 3.3 ODREDIVANJE KOMPONENТI ADAPТIVNE VREDNOSТ/ 3.4 8/0HEM/JSKE METODE 3.4. 7 Odredivanje aktivnosti ukupnih proteaza 3.4.2 Odredivanje aktivnosti tripsina 3.4.3 Odredivanje aktivnosti leucin aminopeptidaza 3.4.4 Odredivanje aktivnosti a -glikozidaze 3.4.5 Odredivanje aktivnosti p-g/ikozidaze 3.4.6 Odredivanje aktivnosti esteraza 3.4.7 Odredivanje aktivnosti glutation 5-transferaze r 3.4.8 Odredivanje proteina 3.5 ELEКТROFORETSКA DETEKCIJA ENZIМA 3.5. 7 Proteaze 3.5.2 Leucin aminopeptidaza 3.5.3 Tripsin 37 37 33 34 35 35 36 37 38 38 39 39 4 1 4 1 42 43 3.5.4 Glikozidaze 43 3.5.4. 7 p-glikozidaza 43 3.5.4.2. а·- glikozidaza 43 3.5.5 Esteraze 44 3.5.6 Alkalne fosfataze 44 3.6 PROCENAT МА5Е 5REDNJEG CREVA 44 3.7 5ТАТ15Т/СКЕ METODE 45 4. REZULTAТI 4. 7 KOMPONENTE ADAPТIVNE VREDN05ТI 46 4. 7. 7 Mortalitet 46 4. 7.2 Trajanje prvog larvenog stupnja 48 4. 7. З Trajanje razvica larvi do ulaska и cetvrti larveni stupanj 52 4. 7 .4 Masa larvi 56 4. 7.5 Relativna brzina rasta 63 4.2 KORELAC/JE IZМEDU RAZLICIТIH 0508/NA ADAPТIVNE 70 VREDN05Т/ 4.3 POREDENJE KORELAC/JA 0508/NA ADAPТIVNE VREDN05Т/ 77 IZМEDU RAZLICIТIH ТRЕТМАNА 4.4 ENZIMI UKUUCENI И VARENJE PROTEINA 78 4.4. 7 Ukupna aktivnost proteaza 78 4.4.2 Tripsin 84 4.4.3 Leucin aminopeptidaza 90 4 .5 ALКALNE FOSFATAZE 96 4 .6 ENZIMI UKUUCENI И VARENJE UGUENIH HIDRATA 97 4 .6. 1 а- glikozidaza 97 4.6.2 Р- glikozidaza 104 4.7 ENZIMI DETOKSIFIКACIJE 11 О 4.7. 1 Esteraze 11 О 4.7.2 Gfutation 5-transferaza 116 4. 8 PROCENAT МАSЕ SREDNJEG CREVA 122 4. 9 KORELACIJE IZМEDU ENZIМA 130 4 . 9. 1 Korefacije izmedu procenta mase creva i enzima 132 4. 1 О POREDENJE KORELACIJA IZМEDU AКТIVNOSТI ENZIМA 137 4. 11 KORELACIJE IZМEDU OSOBINA ADAPТIVNE VREDNOSТ/1 140 AКТIVNOSТ/ ENZIМA 4. 12 POREDENJE KORELACIJA IZМEDU OSOBINA ADAPТIVNE 146 VREDNOSТ/1 AКТIVNOSТI ENZIМA 5. DISKUSUA 5. 1 DEJSТVO КАDМ/ЈИМА NA ENZIME SREDNJEG CREVA 150 5.2 DEJSТVO КАDМ/ЈИМА NA OSOBINE ADAPТIVNE VREDNOSТI 158 5.3 VARIJABILNOST 164 5.4 VARIJABILNOST ENZIMSКIH IZOFORMI 7 67 5.5 PLASТICNOST 171 5.6 KORELACIJE 176 5.7 BIOМARKERI Ј MOGUCNOST KORISCENJA ENZIМA SREDNJEG 7 84 CREVA И MONITORINGU ZAGADENJA ZJVOTNE SREDINE у 6. ZAKUUCCI 788 7. REFERENCE 7 92 ЕFЕКА Т КАDМЈЈИМА NA RAST 1 B/OHEMIJSKE OSOBINE LARVI GUBARA Lymaпtria dispar L. Gиbar {Lymaпtria dispar L.) spada и red пajiпvazivпijjh po/jfagпjh vrsta jпsekata, koja пaseljava sите, vocпjake ј иrЬапа staпjsta. Veoma је otporaп па stetпe иtјсаје ijvotпe sredjпe. И ovom radи је kod larvj gиbara treceg dапа cetvrtog larveпog stирпја, jspjtjvaп аkиtпј ј hrопјсап иtјсај dve koпceпtracjje kadтjjиma { 1 О ј 30 119Cd/ g sиve hraпe), kao ј oporavak od jstjh, па razliCite osoblпe larvj gиbara IV stирпја: kompoпeпte adaptjvпe vredпostj {mortafjtet, trajaпje prvog stирпја, trajaпje razvjca do иlaska и cetvrtj larveпj stирапј, masa ј relatjvпa brzjпa rasta larvj), aktjvпostj епzјта sredпjeg creva {proteaza, trjpsiп, lеисјп aтjпopeptidaza, а i p-glikozjdaza, esteraza ј glиtatjoп-5-traпsferaza), kao ј proceпat mase sredпjeg creva и оdпоsи па masи larve. Kod svih ispitivaпjh епzјта, оsјт kod GST а, prjsиtaп је treпd pada aktjvпosti па kаdтјјити и оdпоsи па koпtrolи. Нrопјспа jzfoieпost kadmijиmи пiје pokazala zпасајап иtјсај па mortafjtet prvog stирпја, kao ј иkирап mortalitet, masa larvj se sтапјије pri dиgotrajпjт tretmaпima, dok se и tokи akиtпog tretmaпa brzjпa rasta larvj povecava. Aпafjze varijaпse sи pokazale da se kod proteofjtjckih епzјта aktivпost тепја и zavjsпosfj od koпceпtracjje metala. Na аkиtпјт tretmaпjтa heritabllпost mase је statjsfjckj zпасајпа. lzmedи proteofjtjckih епzјта па svjт tretmaпima пajverovatпjje postojj пеkа vrsta zajedпicke regиlacjje siпteze i/i sekrecjje и prjsиstvи kadmijиma. Regиlacioпj mehaпjzтj p-gfjkozjdaze ј GSTa se razfjkиjи и оdпоsи па ostale рrоисаvапе eпzime. Zbog ograпjceпjh eпergetskjh resиrsa postoji veliki broj пegatjvпjh korelacjja јzтеdи mase i епzјта. Zпak korelacjja јzтеdи а ј p-g/jkozidaza se тепја па stresи и оdпоsи па koпtrolи. Na razliCitjт tretmaпjтa kadтjjиmom plasfjcпost епzјта se тепја. Na jstom tretmaпи se jzoforme jedпog eпzima razlikиjи јzтеdи fи/J-sjb familija, dok se, takode, jzoforme jstog епzјта jedпog legla razlikиjи јzтеdи vise razliCitih tretmaпa. Posto se jпdeks feпotjpske plasticпosti пе тепја и tokи delovaпja kadтjjиma, promeпa osoblпa adaptjvпe vredпostj jfj пjjhova plasticпost, se пе mogи иzetj kao dobrj jпdikatorj prisиstva kadтjjиma. Zbog vefjke oset/jjvosfj lеисјп aтjпopeptjdaze ј esteraze и tokи akиtпog stresa, postojaпja korelacjja sa velikjт brojem djgestjvпih eпzima, velike plasfjcпostj odgovora и stresпjт иslovjтa, ova dva епzјта Ьi se, иz dalja jstraijvaпja, mogla иzeti kao poteпcijalпi blomarkerj па prjsиstvo kadтjjиma. Кlјиспе reej: Lymaпtrja dispar L., kаdтјјит, аkиtпј, hrопјспј stres, oporavak, osoblпe adaptjvпe vredпostj, епziтј sredпjeg creva, korelacjje, plastjcпost, eпzjтske jzoforme CADMIUM EFFECТ ON GROWТH AND 8/0CHEM/CAL TRAITS OF GYPSY МОТН LARVAE {Lymantria dispar L.) The Gypsy moth {Lymantria dispar L.) represents one of the most invasive pofyphagous insect species, which inhablts forests, orchards and even urban habltats. lt is very resistant to environmental stress . We investigated the acute and chronic effects of two cadmium concentrations { 7 О and 30 ~gCd/ g dry food), as we/1 as the recovery from chronic stress оп various traits of 4'h instar gypsy moth larvae: fitness components {mortality, duration of devefopment of the first larval instar, duration of development from hatching to molting into the 4'h instar, larval mass and relative growth rate), midgut enzyme activities {activity of protease, trypsin, feucine aminopeptidase, а and p-glucosidase, esterase and glutathione s- transferase), as weff as the percentage of the midgut mass in relation to the larval mass. During the cadmium treatments, а/1 examined enzymes, with the exception of the glutathione 5- _transferase, showed а decrease of activity in relation to controf. Chronic exposure to cadmium did not indicate significant inffuence оп the mortality of the first instar as we/1 as overa/1 mortality. Larval mass decreased during the fong-term treatment, while the acute treatment resufted in the growth rate increase. The analysis of variance showed that the activity of proteolytic enzymes depended оп metal concentration. Significant broad-sense heritabllity was discovered after short-term exposure to cadmium. Among the proteofytic enzymes, there is рrоЬаЬ/у some kind of common regulation of synthesis and secretion during the cadmium treatments. Regulation mechanisms of p-gfucosidase and glutathione 5- transferase differ in relation to the rest of the examined enzymes. There is а large number of negative correlations between larval mass and enzymes due to the limited energy resources. The correlation sign between а and р- glucosidases changes during the stress conditions in relation to the controf. During different cadmium treatments pfasticity of enzymes is changed. During the same cadmium treatment the isozyme patterns of one enzyme vary among fu/1-siЬ families, while the isoforms of the same enzyme of the same egg-hatch differ among treatments. As the index of phenotypic pfasticity does not change during the cadmium treatments, changes of life history traits ог their plasticity cannot Ье good indicators of cadmium presence. Due to а great sensitivity of feucine aminopeptidase and esterase during the acute stress, correlated response to а large number of digestive enzymes, great plasticity in stressfu/ conditions, these two enzymes, with further research, coufd Ье potential Ьiomarkers for cadmium presence. Кеу words: Lymantria dispar L., cadmium, acute, chronic stress, recovery, life history traits, midgut enzymes, correlation, plasticity, enzyme isoforms 1 vo Uvod Stres је staпje огgапјzта koje је jzazvaпo јеdпјт jfj vetjт Ьгојет faktora zjvotпe sredjпe kojj dovode orgaпjzam па sam kraj (jfj cak jzvaп} graпjca ekoloske пјsе (Korsloot et а/. 2004}. Oksjdaпtj, te5kj metafj ј orgaпske supstaпce predstavljaju heтjjske stresore jz zjvotпe sredjпe. Heтjjskj polutaпtj, utjcuti па kompetjcjju opstaпak vrsta, p redstavljaju роtепсјјаlпи "pretпju" evofucjoпjт procesjтa kao blodjveгzjtetu ј fипkсјопјsапји ekosistema. Lokafпj jf j globafп j efektj zagacleпja atmosfere, hjdгosfere jfj blosfere djгektпo utjcu па ijve sjsteme, ра usfed toga modjfjkuju balaпs metala, remete reprodukcjju, jzazjvaju osteceпja пukfejпskjh kjsefjпa ј protejпa. И zavjsпostj od vremeпa jzfoieпostj stresoru ј jпteпzjteta samog stresa, moiemo rezfjkovatj tгј пјvоа osteceпja и zјујт огgапјzтјта: 7. Ргјтагпј efektj kojj se javljaju па mofekularnom пjvou. Qvj efektj mogu obuhvatatj sjпtezu аЬегапtпјh pofjpeptjda, oksjdacjju ј deпaturacjju struktuгпjh protejпa ј fjpjda, kao ј рготепе kovafeпtпjh veza епzјта ј strukture пukfeotjda. 2. Sеkипdагпј efektj, podrazumevaju osteceпja DNK, cefjjskjh тетЬгапа ј fjfameпata sto utjce па cefjjske procese kao sto su respjгacjja ј produkcjja епегgјје. З. Тегсјјагпј efektj se odпose па posledjce osteceпja tj. пjjhov utjcaj па procese kao sto su: jпhjblcjja metabofjckjh procesa, gиЬ/јепје jпtegгjteta pojedjпjh struktura, jtd. {Korsfoot et а/. 2004). Zagac/jvaCi m"ogu bltj jakj sefektjvпj faktoгj kojj utjcu па geпetjcku vaгjjabllпost, vefjCiпu ј brojпost jedjпkj, fипkсјопаlпи vaгjjabllпost, adaptabllпost ј opstaпak budutih geпeraciJa . Нгопјспа jzfoieпost heтjjskjт pofutaпtjтa dovodj do kumulatjvпog stresa ј deluje па jпdjvjdue, пarusava fjzjofoske procese ј heтjjskj status cefjje ј cefog orgaпjzтa. ZЬog toga predstavlja pretпju djveгzjtetu ј opstaпku razfjCitjh orgaпjzama {Fox 7 995}. 1 Uvod Osпova stabllпosti Ьilo kog ekosistema је sposobпost popиlacije da se adaptira па пepredvidljive иslove iivotпe srediпe. Јеdап od prvih efekata zagadeпja па iivotiпjski svet, koji је istovremeпo predstavljao еvоlисiопи рrотепи, zabeleieп и Velikoj Britaпф, је pojava melaпizпa kod vrste Bistoп betиlaria иsled роvесапја cadi и vazdиhи {Howlett & Majerиs 7 987). lstraiivaпja selektivпe toksicпosti i otpornosti па pesticide i drиge toksicпe materije иkаzији da sи рготепе па пivои metabolizma пajvaiпiji pokaiatelj oset/iivosti {Walker & Oesch 7 983). Kadmijиm је kиmиlativaп toksikaпt i dиgotrajпa izloieпost ovom metalи, kao i пjegovo prisиstvo и hraпi predstavlja velikи рrеtпји za razliCite orgaпizme. Bez obzira па hemijskи formи {hlorid, karboпat, oksid, sиlfid, sиlfat .. . ), ovaj metal se moie ипеti и orgaпizam iпhalacijom, preko hraпe i koie, ima teratogeпe efekte i иtice па embrioпalпo razvice orgaпizama. Kadmijиm иtice па sastav lipida и ce/iiskoj membraпi i dovodi do peroksidacije lipida (Gi/1 et а/. 7 989). Takode иtice па metabolizam ciпka, gvoida, bakra {Peteriпg et а/. 7 979) i seleпa {Jama/1 & Smith 7 985). Х и i saradпici { 7 995) sи иoCili da па pocetkи toksicпog delovaпja kadmijиma и testisima, metal prvo delиje па Zп-proteiпske komplekse koji koпtrolosи DNK traпskripcijи sto dalje vodi ka apoptozi. 7. 7 IOREKLO КАDМ/ЈИМА И PR/ROD/1 NJEGOVA PRIMENA Prema Svetskoj zdravstveпoj orgaпizaciii kadmijиm spada и velike zagadivace iivotпe srediпe {WHO 7 992а,Ь}. lako пета пikakvи fizioloskи fипkсiји, detektovaп је и vise od 7 000 vrsta vodeпe i kорпепе flore i fаипе. Kadmijиm se иglavпom koristi za proizvodпjи Ni-Cd baterija {70%), za pravljeпje pigmeпata za Ьоје { 7 3%), kao 1 aпtikorozivпi premaz za metale {8%}, stabllizator za plastikи {7%), kao dodatak legиrama i za elektroпske kompoпeпte {2%}. И prirodi se пalazi и zemljiпoj kori, zemljistи, steпama, иglји. Erozije steпa, sиmski poiari, vиlkaпske erиpcije sи prirodпi 2 Uvod procesi koji emitиjи Cd и iivotnи sredinи. Njegova koncentracija и vazdиhи је О, 1-5 ng/m3, zemljinoj kori О, 7-5 ~g/g, morskim sedimentima oko 1 ~g/g i и morskoj vodi oko 0,1 ~g/L (ATSDR 1999). lnteresantno је da је apsorpcija kadmijиma iz cigara veca nego IZ kadmijиmovih aerosola (Nordberg et al. 1985). Hemijska forma kadmijиma IZ dиvanskog dima је jako slicna onoj koja se proizvodi и tokи sagorevan1a и indиstrijski postrojenjima, а to sи prvenstveno aerosoli kadmijиm oksida. з Uvod Primena kadmijuma {lnternational Cadmium Association} Prehosiva i industri ј ska elektricna i elektronska oprema v elike masine Osvetljeџje · Kлcni aparati А vioni/sine Bezicni telefoni Rudnici Plastika Keramika i staklo Umetnicke Ьоје Glazure i emajl Primene u inZenjerstvu Dekoracija Prozorski okviri Elektricni prov9dnici Toplotni provodnici Elektricne legure. Solame celije Poluprovodnici Recikliranje 4 Elektropremazi Mehanicki premazi Vakum Sjrok opsegprimena u inZenjerstvu:elektronici, vazduhoplovstvu, vojnoj industriji Uvod 1.2 INTERAKCIJA КАDМ/ЈИМА 1 ESENCIJALNIH МЕТАIА Toksicпost teskih metala se zasпiva i па kompeticiji eseпcijalпih пeeseпcijalпih metala. Utvrc!eпo је da sи ро vefiCiпi јопi kadmijиma sficпi joпima kalcijиma, tako da јопi kadmijиma иlaze и celijи pиtem kalcijиmovih kaпala {Braeckmaп et а/. 1999). Ovaj fепотеп је demoпstriraп kod velikog broja orgaпizama korisceпjem ageпasa koji Ьlokirajи Ccl+ kaпale {Borowitz & McLaиghliп 1992; Roesijadi & Uпger 1993; Zaroogiaп & Aпdersoп 1995; Епdо et а/. 1996}. Роtрипо Ьlokiraпje иlaska kadmijиma и celijи moie se postiCi ипоsепјет verapamila, koji је specificaп iпhibltor Ccl+ kaпala {Roesijadi & Uпger 1993). Mпogi istraiivaCi smatrajи da osпova toksicпosti kadmijиma potice od пjegovog пegativпog иticaja па eпzimske sisteme и celiji. Naime, kadmijиm ima sposobпost zameпe metalпih јопа и metaloeпzimima, иglavпom Zп2+, Cif+ i Ccl+, kao i veliki afiпitet za strиktиre koje sadrie -SH grиpe, kao sto sи proteiпi, eпzimi i пиkleiпske kisefiпe {ЈасоЬsоп & Т иrner 1980; Stohs & Bagchi 1995). lпterakcija kadmijиma sa eseпcijalпim metalima moie se odvijati и razliCitim Fazama apsorpcije, distriЬиcije i ekskrecije Ьioefemeпta i kadmijиma, kao i и tokи Ьiofoske fипkcije eseпcijalпih efemeпata {Brzoska & Moпiиszko-Jakoпiиk 2001 ). Metal-metal iпterakcije и orgaпizmи sи vaiaп Faktor akиmиlacije kadmijиma i пjegovog toksicпog defovaпja, а пagomilavaпje metala и razliCitim orgпizmima kao i sam proces detoksifikacije i ekskrecije se razlikиjи izmec!и vrsta. Ciпk је kofaktor и preko 300 razliCitih eпzima . Рrопас!еп је и gotovo svim tkivima {ЕРА 2005) i ima иlоgи и rastи, razvicи i fипkсiопisапји svih iivih celija {Bray & Bettger 1990, Nish i 1996}. Вrојпе stиdije sи pokazale da ciпk moie da smaпji toksicпost kadmijиma {Waalkes et а/. 1989; Сооgап et а/. 1992; Brzoska et а/. 2001 ). VeliCiпa јопа СсР+ је izmec!и јопа Zп2+ i Hif+ {ЈасоЬsоп & Tиrner 1980). Osim toga, Cd2+ i Zп2+ iтаји sficпи efektroпskи koпfigиracijи па пjihovim spoljпim orbltalama. Za razlikи od Cd, Zп је stabllaп и dvovafeпtпom stапји i пе podleie redoks promeпama. lako оЬа metala imajи visok afiпitet za Ьiofoske strиktиre koje sadrie sиffh idrilпe grиpe, afiпitet 5 Uvod kadтjjиma za 5-/jgaпde, kao ј za N-doпore је veCi пеgо сјпkа {ЈасоЬsоп & Tиrner 1980; Јопеs & Сhегјап 1990). S obzjгom da је сјпk cesto kofaktor епzјта иk/јисепјh и repfjkacjjи, traпskгjpcjjи ј traпslacjjи, пjegova zameпa kadтjjиmom moie zпасајпо иgrozjtj preiivljavaпje orgaпjzama {Bray & Bettger 1990; Lohmaпп & Веуегsтапп 1993). Toksjcпe kofjCiпe kadтjjиma mogи smaпjjfj apsorpcttи сјпkа {Loппerdal 2000). Stиdjje sprovedeпe па jzolovaпjт cefjjama jfj тетЬгапата proksjтafпjh tиЬиlа ЬиЬгеgа kao ј taпkom crevи иkаzији da сјпk ј kadтjjиm mogи da јтаји zajedпjckj traпsport j/jfj mehaпjzтe vezjvaпja и traп;portи kroz epjtel {Таспеt et а/. 1990; 1991; Prasad et а/. 1996}. lako se smatra se da је kod sjsara crevo јеdап od osпovпjh orgaпa gde se odvjja jпferakcjja јzтесfи ova dva metala postojj та/о podataka о пјјhоvјт dјгеktпјт efektjтa па sredпje crevo {Aпderseп et а/. 1994; Ohta & Сhегјап 1995}. Smatra se da иk/апјапје jfj premestaпje сјпkа jz slabo vezaпjh ekstracelиlarnjh protejпa, od straпe kadтjjиma jfj пekjh drиgjh dvovaleпtпjh metala, иtјсе па mehaпjzam kојјт se јпdиkије sjпteza metalotjoпejпa {Pafтjter 1994). Novjja karakteгjzacjja traпsportera dvovaleпtпjh metafпjh јопа и epjtelи, иkаzији da сјпk moida defj apsortjvпe mehaпjzтe sa vefjkjт Ьгојет dvovaleпtпjh katjoпa иk/јисијиСi kadтjjиm, bakar, gvoicfe ј olovo {Gипshјп et а/. 1997; Fleтjпg et а/. 1999}. б Uvod 1.3 INTEGRISANI CELUSКI ODBRAМBENI ODGOVOR NA STRES lnvertebrate роsеdији vefjkj . broj pиteva cefjjske detoksjfjkacjje kојјт se redиkиje kofjCiпa stetпjh metala kojj сјгkиfјsи и telesпjт tecnostjтa (Ahearn et а/. 2004). Меhапјzтј еfјтјпасјје metala sи sfedeti: • fjzjofoskj regиlatornj mehaпjzтj иsklaclиjи stepen ekskrecjje metala sa stepenom иnosa jz spoljasnje sredjпe. Neke vrste sa роvесапјт иnosom metala povecavajи ј stepen njegove ekskrecjje. • Меhапјzтј иnиtarce/ijske sekvestracjje иklјисији vjsoko-afjпjtetna mesta vezjvanja metala za protejпe sa malom molekиfskom masom, poznate kao metalotjoпejпj. Utvrcfeno је da mofekиfj kadтjjиma dovode do јпdиkсјје sjпteze metalotjoпejпa, glиtatjoпa ј protejпa toplotnog stresa. Na ovaj naCin vгsj se detoksjfjkacjja, ј smanjenje stetnog efekta metala do odrecfenog пјvоа {Магопј 1990; Roesjjadj 1992; Сhјп & Т empleton 1993; Ваитап et а/. 1993). Еfјтјпасјја ovjh kompleksa se obavlja preko fjzozomalnog sjstema. • lntracelиlarnj sekvestracjoпj procesj и kојјта se fогтјгаји specjfjcпe vakиofe sa fosfornjт jfj sитрогпјт granиlama za koje se vеzији metafj. Postoje trj fjpa granиla koje slиie za detoksjfjkacjjи ј ekskrecjjи {Норkјп 1989). Тјр В је ро sastavи organskog porekla ј иvek sadгij sиmpor za kojj sи vezaпj kаdтјјит, ofovo, bakar, сјпk, gvoicle zbog vefjkog afjпjteta ovjh metala za SH grиpe {Норkјп et а/. 1989; Норkјп 1990). Drиgj tjp granиla kojj sadгij teske metaie sи tzv. А granиle. S obzjrom da se sastoje od kafcjjиm ј magnezjjиm orto- ј pjгofosfata sa таfјт organskjт komponentama, za пјјh se vеzији metafj рориt сјпkа, mangana, ka/jjиma ј ofova {Howard et al. 1981; Masson & Sjтkjss 1982; Taylor et а/. 1986; Норkјп 1989). Каdтјјит пјје detektovan и А granиlama . Jos пјје tacno odreclena fиnkcjja С granиla, а/ј se smatra 7 Uvod da iтаји vezи sa metalotioпeiпima, а sam1m tim i depoпovaпjem kadmijиma (Hopkiп 1989). Svi tipovi graпиla sи detektovaпi и crevи iпsekata, sto иkаzије па тоgиси иlоgи ovog orgaпa и detoksifikaciji. Ove graпиfe se elimiпisи iz celije egzocitozom. Postavlja se pitaпje koje sи to specificпosti kod iпdividиe koje иsfovljavajи razliCitost odgovora svakog sistema па stres. Т akode је zпасајпо odredjtj пajvaiпije efekte stresora ·kojj dovode do zajedпjckih reakcija svih jfj vetiпe odbrambeпih sjstema. Kako ј do kog пјvоа ovj sistemi zajedпickj rеаgији, tako da se тоgи smatrati iпtegrjsaпjт sjstemom? Pod јпtеgгјsапјт оdЬгатЬепјт sjstemom podrazиmevajи se тапје jfj vjse пezavisпj sjsteтj od kojih је svakj odgovoraп za specjfjcaп "zadatak" {Korsloot et а/. 2004). Efekti stresora Najvaiпjji zajedпickj stresпi odgovori izazvaпj razliCitjт stresoгjтa sи sfedeti: 1. Osteceпje eпzima, proteiпa ifj fjpida {kako и cefjjskoj тетЬгапј tako ј jпtracefиlarno), гетесепјет пjjhove strиktиre. Копасап rezиltat је gиbltak strиktиrnog iпtegгjteta ј роvесапа propиstljivost cefjjske membraпe. Ovo dovodj do sтапјепе fипkсјје ј osteceпja joпskih ритрј ј kaпala. Na ovaj паСiп se remeti homeostaza eseпcjjalпih metala. Dokazaпo је da teskj metali remete homeostazи kalcijиma {Сhеипg 1984; Hjпkfe et а/. 1992). 2. Deпatиracjja, oksidacjja, zameпa metala {kofaktora} и aktivпom сепtги, а sатјт tјт i iпhiblcija епzјта. Na ovaj паСiп dolazj do пepravjfпog fипkсјопisапја eпzimskih sistema. З. Dva prethodпo ротепиtа efekta stresora иsfovljavajи iпhiblcijи disaпja ј sjпteze АТР-а oksjdatjvпom fosfoгjfacjjom. Zbog toga dofazj do prelaska па апаегоЬпi паСiп prodиkcije eпergjje, da Ьi se иspostavio fjzjofoski odпos NAlY /NADH. Na ovaj паСiп se sprecava prekidaпje gfjkolize. 8 Uvod 4. Oksjdacjja tjofпjh grиpa dovodj do sтапјепја redиktaпata kao sto је glиtatjoп. Т ako se cefjjsko redoks staпje pomera ka oksjdиjиcoj sredjпj. Ova pojava moie proиzrokovatj protejп-5-tjofacjjи troseпje NADPH. Zbog toga, cefjja па гасип g/jkofjze роvесапо Krebsovog cjkfиsa, aktjvjra peпtozofosfatпj saпt ј drиge povezaпe metabofjcke procese. Valle ј Иlmer { 7 972) smatrajи da vefjka toksjcпost zjve ј kadтjjиma potjce od пjjhovog vefjkog afjпjteta za fjofпe grиpe protejпa, dok sи Соггјgап ј Ниапg { 7 981} иstaпovjfj da se metafj vеzији za slobodпe fjofпe grиpe и рrоtејпјта cefjja оvагјјита kjпeskog hrcka, sto moie dovestj do sтапјепја пjjhovog kогј5tепја. 5. Svj ovj procesj dalje mogи da иtјси па fипkсјји osпovпjh sjgпafпjh sjsfema. И zavjsпostj od jпteпzjteta stresa, moie doti do aktjvacjje jfj jпhjblcjje cefjjske profjferacjje. Иtvrdeпo је da se kod celijske fјпјје jпsekata {Aedes а/Ьорјсtиs, С6/36}, posle tretmaпa CdC/2, javljajи cefjjske eksteпzjje. Ova пеоЬlспа pojava koja takode moie Ьiti iпdиkovaпa i molekиfjтa zjve, podseca па morfologjjи cefjja posle dejstva 2Q-hjdгoksjekdjzoпa kod drozofjfe {Peel & Mjfпer 1992) ј kod vrsta Malacosoma ј Chrjstoпeиra {Sohi et а/. 1995). Skoro svakj stresor moie da ostetj strиktиrne proteiпe, eпzime kojj исеstvији и metabofjckjт procesjтa, zafjm и DNK sjпtezj ј reparacijj, kao ј ezjme i protejпe odbrambeпog sjstema иk/јисијиСi aпtjoksjdatjvпj sjsfem ј metalotjoпejпe. И оvјт slиcajevjтa aktjvjrajи se protejпj stresa koj j исеstvији и reparacjjj osteceпjh protejпa ј/ј sprecavajи dalja osteceпja . Меdиtјт, ovakva sjtиacjja је samo ргјvгетепа zato sto se s jпtetj5и поvј proteiп j ј eпzjmj koji ропоvо иspostavljajи пагиsепј balaпs ро prestaпkи delovaпja stresora. 9 Uvod Egzogeni Ј-:•---1 ili ;pontani dogadaii Mutaciia gena ' ...._____. ' Mofekularni i celijski mehanizmi kadmijuma {Waisberg et а/. 2003) 10 Uvod 7.4 TOKSICNI ЕFЕКТ/ КАDМ/ЈИМА NA INSEКТE Мпоgе stиdjie sи proиcavale aktjvпost епzјта jz creva gиЬага {Vafajfjs 7 995, Peгjt-Matarиga et а/. 7 997, Lazarevjc et а/. 7 998, Lee et а/. 7 998; Lazarevjc et а/. 2004; Mrdakovjc et а/. 2008), dok sи podacj о иtјсаiи te5kjh metala па djgestjvпe епzјте ios иvek stигј (VIahovjc 2003; Vlahovjc et а/. 2009, јп press). Kadтjiиm иtјсе па metabofjzam, rast ј razvjce kod vrste Boettcheгjsca регеgгјпа {Wи et а/. 2006). Ortel ( 1 995а} ie иtvгdjfa da hгопјспа jzfoieпost kadтjiиmи, Ьаkги ј сјпkи smaпiиie иkирпе protejпe hemofjтfe, а/ј povecava иkирпе slobodпe атјпо kjsefjпe kao ј иkирпе protejпe и огgапјzти kod laгvj gиЬага cetvrtog stиpпia. lsta паиспјса ie takode otkгjfa (1996} da se prj koпceпtracjij kadmjiиma od 7 О ј 301-!g Cd/ g sиve hraпe zпасаiпо smaпiиie kofjCiп~ trehaloze, dok se koпceпtracjia glиkoze ј g/jkogeпa zпасаiпо povecava па 1 O!lg Cd. lпteresaпtпo ie da ie па pomeпиtoi kопсепtгасф kadтjiиma veCi porast ova dva parametra пеgо па koпceпtraciii od 30 j.!gCd/ g sиve hгапе. ОЬе koпceпtracjie kadтjiиma kod gиЬага takode иtјси па smaпieпie koпceпtracjie fjpjda kako и hemofjтfj tako ј и celom оrgапјzти (Ortel 7 995Ь). Njvo trehaloze и hemofjтfj gиЬага opada и tokи tretmaпa kadmjiиmom Bjschof { 7 995). Рготепа Ьioheтjiskjh parametara orgaпjzama ie detektovaпa ј па drиgjт jпsektjтa. Shjп ј saradпjcj sи (2001 ), korjsteCi razfjCite koпceпtracjie kadтjiиma {od 7.25 do 40 !lgCd/ g sveie hгапе}, иtvгdjfj da kod vrste Gallerja melloпella dolazj do pada sadriaia иkирпјh fjpjda sa povecaпiem koпceпtracjie metala. Ova poiava ie detektovaпa и razfjCitjт razvoiпjт stadjiитjтa vefjkog vostaпog molica: cetvrtog larveпog stиpпia, posledпieg larveпog stиpпia ј lиtke. Nakoп иbгjzgavaпia 5j.!gCd и Chrysocoгjs stofj иtvrdeпo ie da ie рготепа пјvоа fjpjda, protejпa ј иglieпjh hjdrata и hemofjтfj, masпom telи ј оvагјiитјта и tokи pomeпиtog akиtпog stresa tkjvпo specjfjcпa {lslam & Roy 7 983). lstraijvaпia па razfjCitjт vrstama lepjdoptera sи pokazala da · и tokи jzfoieпostj te5kjт metafjтa dolazj do smaпieпia rasta, kao ј итапiепа reprodиkcjie 11 Uvod {Zeleпayora 7986}. Ako se 2/lgCd/g sveie teiiпe иbrizga и vrstи Locиsta migratoria, celije masпog tela se пе difereпcirajи, а sтапјије se i prodиkcija јаја kod ieпki {Martoja et а/. 7 983). Kod larvi Oпcopeltиs faciatиs koje sи Ьile izloieпe razliCitim koпceпtracijama CdC/2 иtvrdeп је zпасајап mortalitet пimfi pri koпceпtraciji kadmijиma od 30mg/L (to је ијеdпо i LC50). Takode, sa porastom koпceпtracije kadmijиma prodиiava se i trajaпje stadijиrrю пimfe, dok teiiпa adиlta opada. Zпасајпо је i da је preiivljavaпje ieпki Ьilo sтапјепо vec па koпceпtracijama veCim od 7 О mgCd/L, dok је smrtпost mиijaka Ьila роvесепа па koпceпtracijama veCim . od 30 mgCd/L. Vec па 7 О mgCd/L fekипdjtet i ferti/itet ieпkj sи se smaпjivali {Cervera et а/. 2004}. Kod celija koje sи izloieпe stresи dolazi иglavпom do oksidativпih ili strиktиralпih osteceпja proteiпa. Mпogi osteceпj proteiпi пе mogи Ьiti 11popravljeпi" ра zato Ьivаји podvrgпиti proteolitjckoj degradaciji i/i se regeпerisи и de поvо siпtezi. Tri оsпоvпа procesa sи odgovorna za иklапјапје osteceпja kod proteiпa: а} reparacjja oksjdativпih osteceпja, Ь) ропоvпо иspostavljaпje pravilпe strиktиre proteiпa ј с) proteoliza {Kultz 2005). Јеdап od иniverzalпih cefjjskjh jпtegrisaпjh odgovora па stres је jпhiblcija rasta ј proliferacije. Braeckmaп ј saradпici { 7 997} sи иtvrdili da cak ; ekstremпo та/е koпceпtracije kadmijиma dovode do ozblljпe iпhiblcije profjferacije kod kиltиre celija Aedes a!Ьopictиs. Т akode, и tokи delovaпja stresora dolazi do modиlisaпja i preиsmeravaпja osпovпih eпergetskih pиteva metabolizma. Migиla ј saradпici { 7 997) sи иtvrdi/i da и svjт razvojпjт stadijитjтa crveпog sиmskog mrava kadтjjиm i zjva povecavajи koliCiпи АМР, dok se sтапјије sadriaj АТРа. Ovo је пajverovatпije posledica роvесапе potrosпje АТРа za odbramberie procese и tokи delovaпja stresora. Опi sи takode иtvrdi/j da kadmijиm stimиlise esteraze. Medиtim, Kramarz i Kafel (2003) sи иtvrdi/i da kod lиtkj vrste Spodoptera exigиa, паkоп visegeпeracjjskog izlagaпja сiпkи i kadmijиmи и hraпi, kadmijиm, za razfjkи od ciпka, пiје izazvao пikakve promeпe и iпteпzitetи respiracije. Relaxaпs i saradпici ( 7 988) isticи postojaпje dva mogиca 12 Uvod паСiпа metabofjckog odgovora па kаdтјјит, prj сети јеdап jskljиcиje drиgj. Prvj паСiп, иklјисије prjvremeпo (prolazпo) роvееапје jпteпziteta metabolizma, а drиgj podrazиmeva kasпjje sтапјепје metabofjzтa и skladи sa тоgиспоsси da zadovofjj potrebe za ATPom. Sjbfy ј Calow ( 7 989} smatrajи da mehaпizmi detoksifjkacjje mogи da korjste eпergijи koja se trosi па procese povezaпe sa adaptjvпom vredпoscи orgaпjzтa, ра zato пајсеsсе dolazi do jпhjblcjje rasta ifj reprodиkcjje. NajveCi broj jпsekata ипоsi teske metale и orgaпizam pиtem hraпe. Drozofila, и zavjsпosti od toga kojj metal ипеsе и orgaпjzam, posedиje specjfjcпa tkjva и kојјта jh dеропије. Т ako se bakar иglavпom apsorbиje и kиprofjfпjт celijama sredпjeg creva, сјпk i bakar и Malpigjjevjт tиЬиlата, а kadтjjиm и epite/jjafпjт cefjjama sredпjeg creva (Dиrfjat et а/. 7 995). Epitefпe cefjje preиzimajи teske metale ј sa ипиtrаsпје straпe ka lитепи creva, а/ј ј jz hemofjтfe {Dalliпger 7 993; Posthиma & vап Straaleп 7 993). И pocetkи роvесапа koпceпtracjja metala dovodj do јпdиkсјје sjпteze metalotjoпejпa za kojj se ј vеzији. Маrопј ј saradпjcj ( 7 987) sи иtvrdjfj da kod prjrodпih рориlасјја drozofjfe moie doCi do dиpfjkacije gепа za metalotioпejп, sto иslovljava Ьгiи геаkсјји cefjja и detoksjfjkacijj. Sjгoko је prihvaceпa hipoteza da је dиpfjkacija gепа prvj korak и evofиciji пovih gепа. Dиpfjcjraпi geпi mogи da јzЬеgпи prjtjsak ргјгоdпе sefekcjje ј da akиmиfjrajи mиtacjje koje sи пеорhоdпе da Ьi se stvorio gеп sa пovom fипkcijom. Beaty i saradпici (2002) smatrajи da epjtel sredпjeg creva kod vodeпih artropoda predstavlja toksjkofo5kj vaiaп orgaп za moпjtorjпg zagacleпostj ijvotпe sredjпe. Bakar i kadmijиm remete peritrofпi matriks vodeпih artropoda, koji sekretиjи cefjje epjtela sredпjeg creva. ldeпtjfjkovaпa sи ј okarakterisaпa dva gепа и sredпjem crevи koje iпdиkији teski metafj, dok drиgi geпi koje aktjvirajи metali {MRG-metal respoпsjve geпes) jos пisи okarakterisaпj. Јеdап MRG kodjra iпtestjпafпj тисјп kojj stiti crevo od toksjпa ј patogeпa. Drиgj MRG је gеп za tиЬиfјп ј иtјсе па odriavaпje strиktиre i fипkсјје celija sredпjeg creva. Metalotioпeiпi imajи оsпоvпи fипkсјји и detoksjfjkaciji kadmijиma. Vezjvaпje ovog metala za metalotjoпejп итапјије пjegovo 13 Uvod vezivпje za drиge celijske strиktиre . Siпteza metalotioпeiпa se iпdиkије и prisиtvи јопа teskih metala {Roesijadi 7 992). Јопi metala Ьivаји preиzeti od straпe metal- regиlisиceg faktora {MRF), koji se zatim vezиje za metal-regиlisиCi efemeпt па DNK i iпdиkије siпtezи metalotioпeiпa {Maroпi 7 990; Roesijadi 7 992). Kod iпsekatskih vrsta Peroпarcys californica i Locиsta migratoria detektovaпi sи g/ikoproteiпi koji пisи metaloproteiпske prirode, а роsеdији sposobпost vezivaпja јопа metala {Maroпi 7 990). Kod dгozofile dolazi do dиplikacije gепа za metalotioпeiп, pri сети sи te jediпke otpornije па јопе bakra i kadmijиma {Maroпi et а/. 7 987). Na larvama komarca, Aedes aegypti, је ргоисаvапа aпatomska osпova toksicпosti teskih metala {Rayms-Kelfer et а/. 7 998). Stepeп mortaliteta larvi treceg iпstara, koje sи Ьile izloieпe iivi, Ьаkги i kadmijиmи zavisi i od vrste metala i od doze. Gиbltak peritrofпe тетЬгапе и crevи је detektovaп и prisиstvи metala. Naime, mogи пastati greske и siпtezi i/ili sekreciji јеdпе i/i vise kompoпeпti peritrofпe тетЬгапе koje siпtetisи kardia celije kao rezиltat toksicпih efekata teskih metala па celijи i/i zbog ,,kompromisa" сеfоkирпе adaptivпe vredпosti orgaпizama izloieпih matalima. Nepostojaпje adekvatпe strиktиre peritrofпe тетЬгапе moie пastati i иsfed greske и polimerizaciji i meclиsobпom povezivaпjи {eпgl. crossliпkage} proteiпa i hitiпa тетЬгапе и fитепи sredпjeg creva. 5 obzirom da se metali пе mogи degradovati роtгеЬпо је da docle do пjihove izolacije и odrecleпim tkivima. Takva pojava se пaziva sekvestracija (i/i kompartmeпtalizacija} i јеdап је od паСiпа detoksifikacije. Sposobпost sekvestracije роsеdији i celije crevпog epitela. Т и se metali dеропији и gгапи/ата {tri tipa graпиla}, koje sи iпасе deo lizozomalпog sistema {Hopkiп 7 989; Dalliпger 7 993; Posthиma & vап Straaleп 7 993). Na ovaj паСiп se skladisti zпасајпа koliCiпa metala. Sadriaj gгапи/е se egzocitozom moie izbaciti iz orgaпizma {Dalliпger 7 993; Laиverjat et а/. 7 989). Pojediпe vrste, kao Orchesella ciпcta {Collembola}, elimiпisи metale и tokи presvlaceпja, оdЬасијиСi epitef и kome sи depoпovaпi metali {Posthиma 7 992). Zato se ovi iпsekti smatrajи dekoпceпtratorima teskih metala {Dalliпger 7 993). 14 Uvod Postoje razfjke јzтесlи vrsta и adaptacjjj па teske metale. Tako је dokazaпo da је Forтjca polycteпa bolje adaptjraпa па jпdиstrjjske polиtaпte ј lakse tolerj5e vj5ak jedпog metala пеgо vrsta Forтjca аqијfопја jz jako zagacleпjh sredjпa. Drиga vrsta pokazиje vеси korelacjjи јzтесlи аkитиlасјје kаdтјјита и tkjvjтa ј bloheтjjskjh markera (епzјта aпtjoksjdatjvпog stresa ј esteraza}. Afj, kod ove vrste vj5e eпergjje se tro5j па procese detoksjfjkacjje (Mjgиla et а/. 1993). Аkитиlасјја kаdтјјита kod vrste Projsotoma тјпиtа fjпearno raste sa роvесапјет koпceпtracjje metala и zemfjj5tи. Месlиtјт, koпceпtracjja kаdтјјита је пеzпаtпо sтапјепа kod ijvotjпja koje sи пekofjko mesecj bl/e jzfoieпe metalи, а zatjт рrеЬасепе па пekofjko dапа и пеzаgасlепи sredjпи. Najverovatпjje da је ova vrsta zahvaljиjиCi eksfofjjacjjj epjtela sredпjeg creva adapfjraпa па prjsиstvo metala и zemfjj5tи {Nиrsjta 2004). 1.4. 1 Adapatcije ~ata па te5ke metale Obzirom da sи jпsektj пajrasprostraпjeпjja vrsta ijvjh orgamzama пaseljavajи vefjkj broj staпj5ta, smatra se da јтаји dobro razvjjeпe теhапјzте . adaptacjja па prjsиstvo kseпoblotjka и ijvotпoj sredjпj. Adaptacjje sи пajverovatпjje specjes specjfjcпe. Utvrcleпo је da sи пеkе vrste јеdпе faтjfjje odsиtпe па zagacleпjт staпj5fjтa, dok drиge vrste koje prjpadajи jstoj faтjfjjj иsреsпо пaseljavajи jsto staпj5te {Hagvar & Abrahamseп 1990}. Рориlасјопа porecleпja kod vrste Orchesella сјпсtа otkrjfa sи da postoje razfjke и efjkasпostj ekskrecjje kаdтјјита {Posthиma et а/. 1992}, osoblпama ijvotпe jstorjje {Posthиma et а/. 1993), toleraпcjjj па kаdтјјит (Posthиma 1990), kao ј ravпoteij и оrgапјzти јzтесlи сјпkа ј kаdтјјита (Posthиma et а/. 1992}. Nasledпa toleraпcjja па arseп иtvrcleпa је kod pet od иkирпо osam vrsta jz faтjfjja lxodjdae {Matthewsoп & Baker 1975). Aпafjzom 22 alozjтa kod vrste Orchesella сјпсtа иtvrcleпa је korelacjja јzтесlи frekveпcjje alela za glиtamat 15 Uvod oksaloacetat trапsатјпаzи ј toleraпcjje па kadтjjиm (Fratj et а/. 7 992). Adaptacjje kod dгozofjfe иklјисији dиpfjkacjjи gепа za metalotjoпejп {Маrопј et а/. 7 987). Posto teskj metafj пе dеlији па јеdпо сјfјпо mesto и оrgапјzти, kod jпsekata је razvjjeпo vjse mehaпjzama kojj иtјси па otpornost jedjпke. И te mehaпjzтe se иЬrајаји kako Ьihejvjoralпe promeпe kојјта se jzbegava ипоsепје toksjkaпata, tako ј razfjCitj procesj detoksjfjkacjje: sekvestracjja, kompartmeпtafjzacjja ј ekskrecjja. Npr. karablde sи оzпасепе kao "dekoпceпtratorj" zato sto роsеdији mogиcпost detoksjfjkacjje ekskrecjjom vezjkиla jfj cefjja koje sadrie metale {Јапssеп et а/. 7 991 ). Sekvestracjja је proces akиmиlacjje metala и оrgапјта и kојјта пе dovode do stetпjh efekata. Tako se kod jпsekata, metafj mogи depoпovatj и egzoskeletи ј glavj {Vап Straaleп & Doпker 7 994), crevи {Норkјп & Магtјп 1 983), testjsjтa ј оvагјјитјта {Schтjdt & Њгаhјт 7 994}, dok sи kod Lepjdoptera sredпje crevo ј Mafpjgjjevj sиdovj mesta sa пajvecom koпceпtracjjom kadтjjиma {Sиzиkj et а/. 7 984). Kompartmeпtafjzacjja је иtvrdeпa и kиtjkиfj skakavaca ј karablda. Ova pojava је povezaпa sa procesom otvrdпjavaпja пekjh orgaпa, прг. maпdiЬиla {Hilfertoп & Vјпсепt 7 982) jfj detoksjfjkacjjom и tokи presvlaceпja preko egzиvjja {Liпdqvjst & Bfock 7 994; Liпdqvjst et а/. 7 995). Utvrdeпo је da se kod рори/асјја vrste Chjroпomиs npanиs (Djptera} adaptjraпjh ј пeadaptjraпjh па kadтjjиm, vjse od 80% kadтjjиma пalazjtj и crevи. Рориlасјје larvj С. гјрагјиs koje sи и prjrodj Ьife паsе/јепе и staпjstи sa vefjkom koпceпtracjjom kadтjjиma, јтаји mogиcпost skladjsteпja vefjke kofjCiпe metala, kao ј роvесапи efjkasпost ekskrecjje tj. veCi stepeп еfјтјпасјје kadтjjиma jz creva (Postma et а/. 7 996}. Vrste Dejfephjfa efpeпor {Nиorteva et а/. 7 992), Fofsoтja caпdjda {Fоипtајп & Норkјп 200n Fofsoтja fjтatarjojdes, lsotoтjeffa тјпоr (Beпgtssoп et а/. 7 994) ј Orcheseffa сјпсtа (Joosse & Verhoef 7 983) jzbegavajи ипоsепје hraпe и kojoj se пalaze teskj metafj. Ako је koпceпtracjja metala и zjvotпoj sredjпj veca moie doCi do gladovaпja. 16 Uvod 1.5 DIGESТIVNI ENZIM/1 ENZIMI DEТOKSIFIКACIJE 1.5. 1 Proteaze Digestivпi eпzimi sи hidrolaze. Peptidaze {peptidпe hidrolaze, ЕС 3.4) hidrolizиjи peptidпe veze. Dele se па eпdopeptidaze {ЕС 3.4.21-24} i egzopeptidaze {ЕС 3.2.4.11-19). И egzopeptidaze spadajи eпzimi koji hidrolizиjи peptidпи vezи, amiпo kiseliпи sa N-termiпalпog domeпa {amiпopeptidaze, ЕС 3.4. 11} i/j sa C- terтjпalпog domeпa {karboksipeptidaze, ЕС 3.4. 16-18), . а takocfe ј оп ј kojj sи specjficпj za djpeptjde (dipeptjdпe hjdrolaze, ЕС3.4. 1 3). Aтjпopeptjdaze {ЕС 3.4. 11 }, hjdrofjzиjи рерtјdпи vezи па N dотепи peptjdпog lапса. Klasjfjkovaпe sи и zavjsпostj od metafпjh јопа kojj sи пеорhоdпј za пјјhоvи aktjvпost. ОЬlспо se radj о јопјта Zп2+ jfj Мп2+. рН орtјтит је Ьаzап ј krece se пајсеsсе od 7.2-9, dok sи molekиlske mase и opsegи od 9Q-1 30 kDa (Т erra et а/. 1996). S obzjrom da је ova vrsta епzјта zavisпa od dvovaleпtпih metala, smatra se da sи опј smesteпj и пjjhovom aktivпom сепtги {Ferrejra & Terra 1986}. Aтjпopeptjdaze mogи hjdrofjzovatj vefjkj Ьгој sиpstrata. Mehaпjzam delovaпja атјпо ј karboksjpeptjdaza: 1 ft l:t R R 1\ I 1 1 1 .f f ~н ·~ C1f :::;>< ен ct~ 1\ ... .. 1\ . . 1\ . 1\ . 1\ / ·\ NM: СОТНК C<>-m« со-------ин CQ--NH ООТЮ. ООСн AМIN()PEPfiOAZE ~80КStl'fPTif)AZE И zavjsпostj katafjtickog mehaпjzтa, specjfjcпjh sиpstrata jfj vredпostj рН па kojoj је aktjvaп, protejпaze sи podeljeпe па potklase. Specjfjcпost se јеdјпо korjstj и jdeпtjfjkacjjj jпdjvjdиalпog епzјта ипиtаг potklase {Terra et а/. 1996}. Sегјп protejпaze јтаји serjп i hjstjdjп и aktjvпom mestи (ЕС 3.4.21 ). И оvи grиpu spada јеdап od пajvazпjjjh епzјта frjpsjп (ЕС 3.4.21.4) (Terra & Ferrejгa 1994). Оп сера 17 Uvod proteiпske lапсе па mestи L-amiпo kiseliпa kao sto sи argiпiп ili liziп . Tripsiп-like eпzimi sи proпacfeпi kod skoro svih iпsekatskih vrsta. VeCiпa tripsiпa ima molekиlskи masи od 2G-35kDa, а рН optimиm im је Ьаzап, иglavпom izmecfи 8 i 9. Mecfиtim, tripsiпi izofovaпi iz sredпjeg creva Lepidoptera imajи veCi рН optimиm koji је иsklacfeп sa veCim рН creva. Za razlikи od kicmeпjackih tripsiпa, iпsekatske пе aktivirajи i пе stabllizиjи kalcijиmovi јопi {Lemos & Terra 7 992). Takocfe је иtvrcfeпo da se obrada "pгekиrsora iпsekatskih tripsiпa odigrava drиgaCije и оdпоsи па vertebrate {Terra & Ferreira 7 994). Cisteiпske proteiпaze {ЕС 3.4.22} роsеdији cisteiп и aktivпom сепtги, а iпhiblrajи ih јеdiпјепја iive. Aktivпost cisteiпskih proteiпaza sи prvi риt demoпstriraпe kod hemiptera {Terra & Ferreira 7 994) i koleoptera {Mиrdock et а/. 7 987; Wolfsoп & Mиrdock 7 990). lпteresaпtпo је da sredпje crevo larve Scaptotrigoпa blpипctata {Hymeпoptera: Apidae} osim seriпskih proteiпaza posedиje i proteiпaze koje poticи iz poleпovih zrna {Schиmaker et а/. 7 993). Aspartatпim proteiпazama (ЕС 3.4.23) је potrebпa karboksilпa grиpa za aktivпost i iтаји рН optimиm ispod 5. Metaloproteiпaze {2.3.24) zahtevajи јопе metala za odvijaпje katalitickih procesa. Kod drozofile је иtvrcfeпo da tri izozima dipeptidaza kodirajи tri пezavisпa gепа koja sи geпeticki иdа/јепа od gепа za LAP (Voelker & Laпgley 7 978; Laиrie­ Ah/Ьerg 7 982). Kod drozofile sи okaгakterisaпe dve izoforme lеисiп amiпopeptidaza, LAP Р {рира/) i LAP G {gиt}, koje sи vezaпe za celijskи тетЬгапи i/i lokalizovaпe и iпtracelijskim vezikиlama {Hall 7 988а,Ь}. Lap izozimi sи kod drozofile mapiraпi па poziciji 98.3 па trecem hromozomи и тесfиsоЬпо evrstoj vezi (Beckmaп & Јоhпsоп 7 964; Falke & Maclпtyre 7 966}. Postoji misljeпje da је LAP primarna, а moida i jediпa peptidaza иk/јисепа и osmoregиlacijи amiпokiseliпskog i oligopeptidпog ри/а (Нiraizиmi et а/. 7 992}. Blahovec i saradпici {2006} sи иtvrdi/i sтапјепје peptidoliticke aktivпosti kod vrste Миsса domestica pod иticajem teskih metala, dok delimicпo preCisceпe 18 Uvod . aтjnopeptjdaze tz vrste Могјтиs fиnereиs јтаји man1и aktjvпost pod иtjcajem dvovalenfпjh jona kadтjjиma, сјпkа ј kobalta (Boijt et а/. 2003). 1.5.2 a-Giikozidaze a-Gfjkozidaze (ЕС 3.2. 1.20) sa razfjCitom efjkasnoscи h jdrofjzиjи а-1,4 vezи kod glиkoze koja иlazj и sastav arjf-gfjkozjda {и koje spada ј sjпtetjckj sиpstrat р­ пјtгоfеп ј/- a-D-glиkozjd), djsaharjda jfj ofjgosaharjda {Terra et а/. 1996). Mehanizam defovanja g/jkozjdaza: SAНAROZA Kod vrste Apjs mel/jfera a-glиkozjdaza јта molekи/skи masи od 82kDa posedиje ј transglиkozjdaznи aktjvпost, tj. mogиcnost fогтјгапја ofjgosaharjda transferom molekиla g/иkoze jfj maltoze. lпhjblra је Trjs, а ova forma se najverovafпjje sjпtetjse и hjpofarjпgealnoj ilezdj (НиЬег & Mathjson 1976}. Kod jste vrste и abdomenи је pronclena drиga jzoforma od 1 OOkDa, ра se smatra da Ьi njena иloga Ьila razlaganje a-glиkozjda и srednjem crevи {НиЬеr 1975}. Forma ovog епzјта vezana za perjтjkrovilarnи тетЬгапи и srednjem crevи vrste Dysdercиs реrиvјапиs {Heтjptera: Pyrrhocorjdae} јта molekиlskи masи 1 38kDa, katafjzиje hjdгofjzи razfjcjtjh a-glиkozjda samo јеdпјт aktjvпjт centrom ј posedиje pet maпjjh centara potrebпjh za pravjfпи aktjvпost епzјта (Sjfva & Terra 1995). Kod Abracrjs Flavofjпeata {Orthoptera: Acrjdjdae} detektovano је vj5e jzoforтj a-glиkozjdaza {Ferrejra et а/. 1999). Osnovtia forma od 112kDa је aktjvпa sa meloЬiozom ј rafjпozom, dok је manja forma od 70 kDa aktjvпa sa djgalaktozjf djgfjcerjdjтa. Hidrofjzи maltoze i fjпalnи djgestjjи skroba vrse jzoforme od 74 i 94kDa. Jos nije poznato koji је prjrodni sиpstrat za a-glиkozjdazи od 93 kDa. 19 Uvod a-Giikozidaze sredпieg creva iпsekata imaiи veliki broi zaiedпickih osoblпa, od koiih ie i vec ротепиtа iпhiblciia Tris-om. Molekиlske mase sи пaicesce и opsegи od 6Q-80kDa, sto иkazиie па postoiaпie oligomernih eпzima. Sиbiediпice sи ргопаdепе kod drozofile, gde ie detektovaпa forma eпzima od 200kDa (Т апiтига et а/. 7 979). lпteresaпtпo ie da ie рН optimиm za a-glikozidaze sredпieg creva iпsekata izmedи 5 i 6.5, bez obzira па рН creva {Terra et а/. 7 996}. 1.5.3. f3-G/ikozidaze f3-Giikozidaze katalizиiи hidrolizи termiпalпog пeredиkиiиceg f3-7 ,4-vezaпog moпosaharida iz odgovaraiиceg g/ikozida. Uzavisпosti od vrste moпosahrida koii ie ротегеп f3-g/ikozidaze mogи blti f3-glиkozidaze {odvaiaiи molekиl glиkoze}, f3- galaktozidaze (odvaiaiи molekиf galaktoze), f3-ksilozidaze (ksilozи}, itd. рН optimиm ovih eпzima ie od 6 .2-6.5, ali пezavisпo od рН creva, рН optimиm moie blti i veCi. Npr. kod Lepidoptera moie iCi do 7 (Terra et а/. 7 996}. lпsekatske f3-g/ikozidaze mogи blti podelieпe и tri grиpe и zavisпosti od пiihove specificпosti za sиpstrat (Terra & Ferreira 7 994). Кlasa 7 иkliиcиie eпzime koii imaiи g/ikozil f3-g/ikozidazпи i aril f3-g/ikozidazпи aktivпost. То sи eпzimi aktivпi sa p-пitrofeпil- f3-D-glиkozidima (NP f3Giи), p-пitrofeпil- f3-D-galaktopiraпozidom (NP f3Gal}, p-пitrofeпil- f3-D-fиkozidom (NP f3Fиc), laktozom itd. И klasи 2 se иbraiaiи samo опi eпzimi koii sa velikom efikasпoscи hidrolizиiи cefoblozи i laktozи . Eпzimi koii posedиiи aril (i/i alki/) f3-g/ikozidazпи aktivпost spadaiи и trecи klasи. Опi imaiи zпасаiпи aktivпost sa NP f3Giи i slicпim sиpstratima. lako klase 7 i 2 imaiи razliCitи specificпost za sиpstrate иbraiaiи se и tipicпe f3-glиkozidaze (ЕС 3.2. 7.2 1, Terra et а/. 7 996}. f3-glиkozidaza digestivпog trakta ima vаiпи иlоgи и iпterakciii izmedи iпsekta i bifike {Mattiacci et а/. 7 995; Магапа et а/. 2000). Do sada ie Spodoptera frиgiperda iediпa vrsta Lepidoptera kod koie ie kloпiraп ovai eпzim (Ма га па et а/. 200 7 ). Ekspresiia f3-glиkozidaze kod svileпe ЬиЬе па traпkripcioпom 20 Uvod пјvои pokazala је da је ekspresjja gепа za ovaj епzјт jskljиCivo и sredпjem crevи. ZпaCi da је sredпje crevo specjfjcпo mesto za sjпtezи p-glиkozjdaze {Вуеоп et а/. 2005). 1.5.4 Esteraz e Esteraze sи grиpa mиftjfипkcjoпafпjh ј vjsoko pofjтorfп jh h jdгofjtjckjh епzјта. Do sada sи detektovaпe сеtјгј оsпоvпе klase esteraza: aгjfesteraze1 acetjfesteraze1 karboksjfesteraze1 ј hofjпesteraze. Svaka klasa је defjпjsaпa specjfjcпoscи za odredeпj sиpstraf1 osetfjjvoscи па odredeпe jпhjbltore ј аmјпо kjsefjпama и aktjvп jт сепtгјта {Tavares et а/. 1998). Kod jпsekata је иtvrdeпo da esteraze иfјси па regиlacjjи јиvепјfпоg hormoпa (Kort & Graпger 198 7 }1 па djgesfjvпe procese {Карјп & Ahmad 1980; Јопеs & Braпcoft 1986}1 otpornost па jпsektjcjde {Fоигпјег et а/. 1993} ј reprodиkcjjи {Мапе et а/. 1983). lпteresaпtпo је da sи sиpstrafj па koje dе/ији ovj eпzjmj rastvorfjjvj и vodj. Uloga esteraza и djgestjjj jos пјје sasvjт јаsпа1 а/ј se smatra da Ьi јеdпа od fипkсјја mogla bltj hjdгofjza hofesterola ј vjfaтjпskjh estara {Terra et а/. 1996}. И zavjsпostj od lokafjzacjje razfjkиjи se ј jzoforme esteraza. fpak1 prava fипkсјја ovjh епzјта jos пјје razjasпjeпa. Tavares ј sradпjcj ( 1998) sи detektovafj sest jzoformj esteraza kod Тгјаtота jпfestaпs1 jz hemofjтfe ј Mafpjgjjevjh sиdova . lzmedи razfjCitjh pofova пјје Ьifo razfjke и jzoformama епzјта. Т akode је jspjfjvaпo ј dejstvo jпhjbltora. Najjace јzгаiепа efektroforetska traka је јпhјЬlгапа od straпe PMSF ј malatjoпa1 dok sиffhjdгjfпa јеdјпјепја ј eserjп sиlfat пјsи иfjcafj па aktjvпost. Zbog toga је zakljиceпo da је ova forma esteraza moida karboksjfesteraza1 koja sadrii и aktjvпom mestи sегјп . la razfjkи od ovog fjpa esteraza1 acetjftraпsferaze sи и тапјој тегј osetfjjve па PMSF1 dok sи hofjпesteraze јпhјЬlгапе od straпe orgaпofosfatпjh јеdјпјепја ј eserjп sиlfata . KarЬoksjfesteraze јтаји иfоgи и detoksjfjkacjjj sиpstaпcj jz iivotпe sredjпe kao sto sи прг. jпsektjcjdj (Zhи & Вгјпd/еу 1990; Prabhakaraп & КатЬ!е 1995}. Ovaj tjp esteraza јта пјskи specjfjcпost za sиpstrat te stoga moie hjdгofjzovatj ј estarske ј 21 Uvod атјdпе veze и kseпoblotjcjтa {Jokaпovjt et а/. 2001 ). Hofjпesteraza је target za orgaпofosfatпa ј karbamatпa јеdјпјепја, раје опа cesto јпhјЬlгаји (Хи & Ви// 1994). Chattopadhyay ј saradпjcj {200 1) sи kod svjfeпe ЬиЬе и sadriajи creva, efektroforetskj detektovafj иkирпо 5 jzoforтj пespecjfjcпjh esteraza {а ј f3} и zavjsпosfj od sиpstrata {а jfj f3 пaftilacetata). Utvrdeпo је da и sredпjem crevи svjfeпe ЬиЬе postoje termostabllпe esteraze {Liи et а/. 1984). Wи & Нои { 1993) sи do5fj do zakljиcka da soj·svjfeпe ЬиЬе kojj јта vеси aktjvпost odredeпe jzoforme a-esteraze и sredпjem crevи, posedиje vеси toferaпtпost па vjsoke temperatиre. Карјп & Ahmad (1980) sи па larvama gиbara иtvrdjfj da sи karboksjfesteraze рrеdотјпапfпј епzјтј и svjт tkjvjтa оsјт и mozgи ј пегvпот stаЬ!и. И sredпjem crevи је и пајvесој merj prjsиtпa karboksjfesteraza, zafjт arjf ј и пајтапјој merj hofjпesteraza. Мпоgј jsfraijvaCi smatrajи da sи esteraze иk/јисепе и procese apsorpcjje jfjfj djgestjje fjpjda {Egиchj & lwamato 1975; Тиrипеп & Chjppeпdale 1977). Kod Lepjdoptera koje sи pofjfagпj jпsektj vjsoka aktjvпost esteraza је и korelacjjj sa 5jrokjт opsegom domaCiпa {Тиrипеп & Chjppeпdale 1977). Za razfjkи od drиgjh jпsekata, kod Lepjdoptera cefo crevo moie bltj иk/јисепо и apsorpcjjи ј djgestjjи {Berrjdge 1970). Оsјт toga, predпje ј zadпje crevo sи zпаtпо тапјј od sredпjeg creva, tako da је оsпоvпа pretpostavka da se и sredпjem crevи odjgrava ј djgestjja ј apsorpcjja и kојјта исеstvији esteraze {Карјп & Ahmad 1980). 1.5.5 Gfиtatjoп 5-traпsferaza Gfиtafjoп 5-traпsferaze predstavljajи fатјfјји mиftjfипkcjoпafпjh епzјта kojj sи иklјисепј и detoksjfjkacjjи vefjkog broja kseпoblotjka иk/јисијиСi jпsektjcjde {Safjпas & Woпg 1999). Опа katafjzиje reakcjjи kопјиgасјје efektrofjfпjh molekиfa sa redиkovaпjт glиtatjoпom (GSH) stvarajиCi prodиkt kojj је rastvoraп и vodj ј moie se lako ekskretovafj {Hablg et а/. 1974). Копјиgасјјот se пеиtrа/ј5и elektrofjfпa mesta 22 Uvod fjpofjfпjh sиpstrata ј па taj паСiп od efektrofjfпog параdа 5tjfe cefjjske kompoпeпte, пиkleofjfпj kjseoпik i azot и DNK (Eпayati et а/. 2005). И zavisпosti od lokalizacije eпzima и ce fjjj, defe se па mikrozomalпe ј cjfosofпe. Kod drozofile postoji јеdап mikrozomalпi GST gеп и gепоти, dok komarac Aпophefes gamblae ima tri GST gепа {ТоЬа & A jgak j 2000; Rапsоп et а/. 2002). Mjkгozomalпe forme GST а sи trimernj, membraпskj vezaпi proteiп i. Dve иdаlјепе klase citosolп ih GSTa, kod kиспе mиve, sи оzпасепе kao klasa 1 i 11 (Foиrnier et al. 1992). Razlika izmec1и ove dve klase је и sfedecem: klasa 11 је kodiraпa jedпim geпom {Reiss & James 1993; Sпyder et al. 1995), dok klasи /, kod vrsta Aпopheles mosqиitoes, Drosophila melaпogaster i Миsса domestica, kodira mиftjgeпska faтjfjja {Тоипg et а/. 1993; Zhoи & Sуvапеп 1997; Rапsоп et а/. 2002). lпsekatska klasa 11 i tzv. sigma klasa GST а razliCitih orgaпizama, od пematoda do sjsara, imajи zajedпicko poreklo {Аgiапјап et а/. 2003). Klasa 1 је jediпstveпa kod jпsekata i doblla је пaziv Delta GST. Drиga velika klasa GST а, specjfjcпa za jпsekte, је Epsiloп klasa {Rапsоп et al. 2001 ). Ova klasa se пezavjsпo 5јгјfа kod drozofjfe ј komarca, ра se smatra da ovi eпzimi imajи vаiпи иlоgи и adaptaciji ovih vrsti па иsfove iivotпe srediпe {Rапsоп et а/. 2002). Veti deo ostatka citosolпih iпsekatskih GSTa pripadajи Zeta, Teta i Omega klasi {Board et а/. 2000; Rапsоп et а/. 2002). Molekиlske mase beskicmeпjackih glиtatioп 5-traпsferaza se kгеси и opsegи od 36- 50 kDa. Najcesce se sastoje jz dve sиbjediпice {koje mogи bltj jdeпticпe) ј koje imajи mofekиlske mase izmec1и 20 i 27 kDa {Ciark 1989Ь). Najvise podataka za aktivпost aпtioksidativпih eпz1ma postoji za holometabofпe iпsekte. Vaiпo је istati da kod ove vrste eпzima postoji velika varijabllпost и aktjvпosti и zavisпosti od vrste, stирпја razvica kao i starosti iпsekata и svakom stирпји razvjca {Ahmad & Pardiп i 1990; Ahmad et а/. 1995}. Tako је kod vrste Delia floralis пјvо GST а пajveti и tokи stadjjиma larve i lиtke, dok kod јтаgа aktivпost ovog eпzima opada za ро/оvјпи {Steпerseп et а/. 1987). Nasиprot tome, kod Triatoma iпfestaпs, aktivпost sa CDNBom progresivпo se povecava od jajeta, 23 Uvod preko пјтfе, а maksjтalпи aktjvпost GST postjie kod adиlta. Kod ove vrste mиijacj јтаји do 70% vеси aktjvпost GST пеgо ieпke (Wood et а/. 1986). Za razfjkи od pomeпиtjh jпsekata, vrsta Hyfobиcs aЬietjs pokazиje veoma та/о vагјгапја и aktjvпostj ovog епzјта и tokи пјепоg ijvotпog cjkfиsa (Steпerseп et а/. 7987). Utvrdeпo је da aktjvпost GST zavjsj ј od vrste tkjva jfj orgaпa . Tako је vjsoka aktjvпost detektovaпa и оrgапјта kojj јтаји fипkсјји и detoksjfjkacjjj kao sto sи crevo (Kotze & Rose 1987; Steпerseп et а/. 1987), kиtjkиla (Kotze & Rose 1987), Mafpjgjjevj sиdovj (Wood е а/. 1986), masпo tefo (Kotze & Rose 1987). Kod vrste Миsса domestjca, Trjchfopfиsja пј ј Spodoptera егјdапја koje sи Ьifje jzfoieпe razfjCitjт pro-oksjdaпtпjт alefoheтjkafjjama aktjvпost aпtjoksjdatjvпjh епzјта, иk/јисијиСi ј GST, raste {Zamaп et а/. 1995; Ahmad et а/. 1995; Mjgиla & Gfowacka 1996). Меdиtјт, и пеkјт drиgjт sfиcajevjтa tretmaпj пјsи иtjcafj па ove aktjvпostj {Zamaп et а/. 1995). Каdтјјит је pro-oksjdaпt kojj moie da prodиkиje ROS {reaktjvпe kјsеопјспе vrste) kao ј da dovede do osteceпja cefjjskjh fjpjda. И eksperjтeпtjтa sa vrstom Oпcopeftиs fascjatиs (Heteroptera: Lygaejdae), koпceпtracjja kadтjjиma od 200 mgCd/1 пе иtјсе па aktjvпostj katalaze ј GST а (Cervera et а/. 2003). Ро тјsfјепји Cervere ј saradпjka пе sme se jskljиCitj mogиcпost djrektпe jпhjblcjje епzјта (katalaze ј GST). Nајте, и eksperjтeпtjтa јп yjfro иtvrdeпo је da sи glиtatjoп redиktaza ј GST јпhјЬiгапј od straпe kadтjjиma kojj se vezиje za cjstejпske ostatke (Djeter et а/. 1982; Chresteпseп et а/. 2000). Копсепtrасјја kadтjjиma od 20 mgCd/1 пе иtјсе пј па fјрјdпи peroksjdacjjи пј па пјvо aпtjoksjdatjvпjh епzјта (Cervera et а/. 2003). Моgисе је da је bazafпj пјvо aпtjoksjdatjyпjh епzјта и stапји da odrij ROS homeostazи, jfj da dolazj do пekjh drиgjh vjdova detoksjfjkjacjje, прr. metalotjoпejпjтa, fjzozoтjтa, sekvestracjjom kojj zпасајпо итапјији kопсепtrасјји teskjh metala и оrgапјzти. 24 Uvod 1.6 KLASIFIКACIJA DIGESТIVNIH ENZIМA 1 SEKREТORNA AКТIVNOST CREVA INSEКATA 1.6. 1 Sekrecija digestivпih eпzima kod fitofagпih iпsekata Маrапа ј saradпjcj { 1996} sи proиCifj иltrastrиktиrи ј sekretornи aktjvпost creva ortoptera. Sаzпапја о kompartmeпtafjzacjjj {podeli creva па delove}, podriavajи hjpotezи da se djgestjvпj eпzjmj sjпtetjsи ј ekskretиjи и svjт ce/jjama sredпjeg creva {Fetrejra et а/. 1990). Т akocle, иglјепј hjdгatj ј protejпj se razgraclиjи и sredпjem crevи kao i па prelazи sredпjeg i zadпjeg creva. Јеdап тапјј deo jпtermedjjarne ј fiпalпe digestjje se vrsi па povrsjпj ceke ј veпtrjkиlarnjh cefjja. Najdomjпaпtпijj . eпzimi и cefjjama ј sadriajи sredпjeg creva Сiпе amjпopeptjdaze {solиbllпe ј membraпskj vezaпe) ј trjpsjп {Aпstee & Charnley 7 977, Ferrejra et а/. 7 990). Kod vrste ТепеЬгјо mofjtor djgestivпj eпzjmj, osjm ~-glиkozjdaze, se sjпtetjsи ј ekskretиjи egzocjtozom, kao odgovor па prjsиstvo hгапе. PRE.DNJE ZADNJE CREYO ~ ..............~ 1 S«in prot.C'Шa.zc Atninopcptidaz.a Alfa amila.za Alta ,elikozidaza __ _..,; ____ .. A1faglikoz~da.za ~ S«i.n protci.na.z.c ~Qtal~ Я~~_:~d~d. а. Alfa glik'ozida.za А . ........rid· .. -.. J.lil. }!lil..w..t\..J..07:1 aza . . .· .lik' . . 'd .. mmop...,:t-·~ aza Alf:a matlo.,.idaza Bct:a Б ~ozl а7;а Alfa amila.za "" Alfa galak:tozi.da.za Alfa вlikozidaza Alfa rnanozida.za Shemtskj prjkaz gracle creva ј mesta sjпteze епzјта kod Acromyrmex sиbterraпeиs (Milton et а/. 2004) 25 Uvod Na osnovи tehпjka ce/iiskog frakcjoпjsania ј transmjsjone efektronske тjkroskopjie, иtvrdeno ie da kod se gиsепјса Егјппујs ello {Santos et а/. 7 986}, karablda ј /arvj tепеЬгја {Ferrejra & Terra 7 989; Ferrejra et а/. 7 990), sekrecjia p-glиkozjdaze obavlia egzocjtozom. Sekretornj mehaпjzam zavjsj иglavnom od regjona srednieg creva. Т ako se kod adиlta komarca trjpsjп sekretиie egzocjtozom и posterjornom геgјопи srednieg creva {Graf et а/. 7 986}. Kod mиve и larvenom stadjiиmи {Lemos & Terra 7 992, Jordao et а/. 7 996} ј kod gиsепјса Еггјпујs ello {Santos et а/. 7 986} trjpsjп se sjпtetj5e и ce/iiama srednieg creva и aktjvпoi fогтј, а/ј ie spoien sa membranskjт vezjkиlama. Ove vezjkиle тјgгјгаiи do vrha ce/iie ј prekиrsorj trjpsjпa se pre sekrecjie prevode и solиbllnи formи. Апtегјогпе ce/iie srednieg creva sekretиiи атјfаzи ароkгјпјт теhапјzтот, dok se trjpsjп na/azj и sekretornom vezjkиlama ј sekretиie se и zadпij deo srednieg creva {Crjstofolletj et а/. 200 7 ). Kod laгvj Т епеЬгјо mofjtor naiveca kofjCiпa p-gfjkozjdaze ie ргјтесепа и sredj5tи ce/iia srednieg creva spoiena sa Goldij kompleksom ј ипиtаг mafjh sekretornjh vezjkиla и apjkalnom delи cjtoplazme. Ove vezjkиle se naiverovatпjie јzЬасиiи egzocjtozom (Ferrejra et а/. 2002). lako ie ve6 deo p-g/jkozjdaze sjпtetjsan и sredniem delи srednieg creva, iedan deo enzjma ie pronaden ј и апtегјогпот delи crevnog sadriaia. Ova poiava se obiasniava hjpotezom recjkfjraiи6h епzјта (ј/ј endo-ektoperjtгofjcпa cjгkиlaciia djgestjvпjh епzјта} (Terra 7 990, 2001 ). Smatra se da se enzjmj јzЬасиiи sekrecjiom ffиjda и роstегјогпј deo srednieg creva, а zafjт do/azj do ponovne apsorpcjie и niegovom predniem delи. {Crostofolettj et а/. 2001). Као posledjca toga ргјтесепо ie smanienie gradjienta djgetjvпjh enzjma и lитјпаlпот sadriaiи. 26 Uvod 1.7 ADAPТACIJE NA SТRES Ј EVOLИCIJA Рориlасјје mogи razfjCito regovatj па dejstvo toksjkaпata. Toksjkaпtj mogи јтаtј sиЬ/еtаlпе efekte kao sto sи redиkovaп rast ј razvjce orgaпjzтa. Osetfjjvost jпdjvjdиa и okvjrи јеdпе рориlасјје moie varjratj zbog razfjCitjh Ьiofoskjh иtјсаја (Forbes et а/. 1995; Calow et а/. 1997) kao sto sи stиpпjevj razvjca (Grjтe 1989) jfj vefjCiпa jedjпke (Кiffпey & Clemeпts 1996}. SиЬfetafпj toksjcпj efektj mogи Ьitj јzтеrепј eпergetskjт promeпama. Т ako se прr. posmatra redиkcjja eпergjje raspoloijve za rast {eпgl. scope for growth), tj. eпergjje koja se moie korjstjtj za rast ј reprodиkcjjи паkоп procesa detoksjfjkacjje. Моgисе је da и okvjrи јеdпе рориlасјје razfjCitj stиpпjevj razvjca јтаји razfjCitи osetfjjvost па teske metale. Иtvrdeпo је da рориlасјје koje јтаји пјiи stopи rasta јтаји ј sтапјепо preijvfjavaпje ј fekипdjtet (Liпgjrerde et а/. 2001 ). Postavlja se рјtапје da fj је adaptjvпa vredпost kod adиlta иsfovljeпa toksjkaпtjтa ипеtјт od straпe adиlta jfj је posfedjca ипоsепја toksjkaпata и tokи larveпog razvjca (Мое et al. 2001 ). Nepovoljпj faktorj zjvotпe sredjпe rеdиkији adaptjvпи vredпost orgaпjzтa jfj рориlасјје. Da Ьi prevazj5fj ovakvo sтапјепје adaptjvпe vredпostj orgaпjzтj jfj рориlасјје odgovarajи feпotjpskj jfj geпetjckj ј razvjjajи mehaпjzтe da Ьi smaпjjfj stetaп иtјсај stresa (Bjjfsma & Loeschcke 2005). И opstem sтjsfи adaptacjje sи promeпe и оrgапјzти koje паstаји и skfadи sa поvјт иsfovjтa sredjпe prj kојјта orgaпjzтj (jfj grиpa orgaпjzama} stjcи karakterjstjke иk/јисијиСi promeпe и morfologjjj, fjzjofogjjj jfj ропаsапји. Ovakve promeпe se mogи desjtj feпotjpskj ипиtаr jedпog geпotjpa. И tom sfисаји sи feпotjpske adaptacjje rezиltat tzv. feпotjpske plastjcпostj. То је sposobпost geпotjpa da · promeпj feпotjp и skladи sa иsfovjтa spoljasпje sredjпe (Bjjfsma & Loeschcke 2005). Feпotjpske adaptacjje mogи Ьitj morfofoske promeпe {Gabrje/2005; Refyea 2005}, jfj прr. иtјсај maternafпjh efekata {Aпderseп et а/. 2005). Каdтјјит dovodj do smaпjeпog fekипdjteta ј preijvfjavaпja kod vrste Lиcjfja serjcata, dok larve jste vrste, koje sи jzfoieпe kаdтјјити, lmйЈи 27 Uvod sтапјепи stopи rasta {Siтkiss et а/. 7 993). Adaptacije тоgи obиhvatati рrотепе и okvirи frekveпcije alela, koje sи rezиltat selekcioпog pritiska {Liпdgreп & Laиrila 2005; David et а/. 2005; S0reпseп et а/. 2005}. Ovakav tip рrотепа је pozпat kao geпeticka adaptacija i/i evolиcioпa adaptacija {Bijlsтa & Loeschcke 2005). Adaptivпa svojstva тоgи takocle Ьiti rezиltat koпtrolisaпih odgovora и kojiтa selekcija пе delиje direktпo па posтatraпo svojstvo {Ноffтапп et а/. 2005; Malherbe et а/. 2005). Vaiпo је istaCi da sи пeki, ako пе i veCiпa korelisaпih odgovora i/ili иzајатпih ograпiceпja {епg/. trade--off) geпotipski {рориlасiопо} i/ili srediпski specificпi {Bijlsтa & Loeschcke 2005). lako se та/о zпа о diпaтici adaptivпih procesa иtvrcleпo је da se тпоgi orgaпizтi brzo prilagoclavajи па рrотепе и iivotпoj srediпi koje је izazvao covek: pesticide, zagacleпje, terтalпi stres, itd. {Woods 7 98 7; Macпair 7 997; Ноffтапп et а/. 2003). Рrета Roпaldи Fiserи evolиcija па geпetickoт пivои tece zahvaljиjиCi velikoт Ьгоји пezavisпih alelskih zатепа па lokиsiтa, pri сети svaka zатепа iта та/о иticaja па adaptivпи vredпost {Fisher 7 930). Sa drиge straпe Wright { 7 93 7) је sтatrao da sи popиlacije okarakterisaпe koadaptiraпiт kотЬiпасiјата а/е/а па iпteragиjиCiт lokиsiтa. Wrightova teorija тоiе objasпiti {пegativпe) epistaticke iпterakcije, сепи otpornosti па пeki stresor i koтpeпzatornи evolиcijи. Ро Fiserи prirodпa selekcija се и osпovi иvek Ьiti и тogиcпosti da poboljsa adaptaЬilпost popиlacije иkoliko postoji dovoljaп broj geпetickih varijacija. fpak, ро Fiserи, kada sи popиlacije та/е i evolиtivпi poteпcijal za adaptivпи evolиcijи postaje ograпiceп, verovatпoca се igrati оsпоvпи иlоgи za dalji opstaпak popиlacije, bez obzira da li се опа iCi и sтеrи evolиtivпih рrотепа i/i се izитreti. fпicijalпi odgovor па рrотепи иslova srediпe prveпstveпo zavisi od пivoa geпeticke varijabllпosti popиlacije. Jos пiје јаsпо koliko је ograпiceп Ьгој adaptivпih varijacija и prirodпoj popиlaciji. Kvaпtitativпi тode/i пastali и eksperiтeпtiтa sa prirodпoт selekcijoт {Kristeпseп et а/. 2005), kao i brzi odgovor тпogih orgaпizaтa па pesticide, sиgerisи da postoji vise пеgо dovoljaп broj geпetickih 28 Uvod varjjacjja koje sи и тоgиспоsfј da kod тпоgјh рориlасјја dovedи do evofиtjvпog odgovora. Меdиtјт, postojj та/о podataka о tоте da fj је ovaj пјvо vагјјасјја dovoljaп da ипаргеdј dиgotrajпe adapfjvпe procese jfj dиgotrajпa evofиcjja ј adaptacjja vеСiпот zavjse od fjksacija koгjsпjh тиtасјја (Bjjfsтa & Loeschcke 2005). Npr.evofиcjja otpornosfj па pesfjcjde sиgerj5e da је иklјисепо пekofjko gепа sa јаkјт {velikjт) иfјсајет, dok kvaпtjtatjvпo geпefjckj eksperjтeпfj иkаzији da vj5e gепа, sa тапјјт efektoт, иpravlja veCiт Ьгојет osoblпa. Pretpostavka da росеfпј kratkotrajпj odgovor orgaпjzaтa zavjsj иglаvпот od geпetjcke varjjabllпosfj ипиtаг рориlасјја је od vefjkog zпасаја za рогетесепј ekosjsfeт gde је ргјгоdа vjsoko fragтeпfjsaпa. Ти sи рориlасјје оЬlспо та/е ј jzofovaпe, te podleiи geпefjckoт dгjftи (i јпЬгјdјпgи}. Usfed toga dolazj do sтапјјvапја geпefjcke varjjabllпost, te рориlасјје sи osetfjjvjje па srediпskj stres (Bjjfsтa & Loeschcke 2005) ј dolazj do sтапјепоg evofиtjvпog poteпcjjala (Krjsteпseп et а/. 2005). 29 Cilj rada Cilj rada је ispitivaпje geпeticke i plasticпe feпotipske kompoпeпte, kao i detektovaпje izoformi digestivпih i detoksifikacioпih eпzima и tokи akиtпog, hroпicпog stresa i oporavka. Aпaliziraпe sи osoblпe adaptivпe vredпosti {mortalitet, trajaпje prvog stирпја, trajaпje razvica do иlaska и cetvrti larveпi stирапј, masa larvi i relativпa brziпa rasta), aktivпost eпzima sredпjeg creva larvi gиbara {aktivпosti proteaza, trips iпa, lеисiп amiпopeptidaza, а i p-g/ikozidaza, esteraza i glиtatioп 5- traпsferaze), detekcija izoformi alkalп ih fosfataza, kao i odrec!ivaпje proceпta mase sredпjeg creva и оdпоsи па masи cele larve pri razliCitim tretmaпima kadmijиmom. Ciljevi ove teze sи s/edeCi: 1. Utvrditi efekat razliCitih koпceпtracija kadmijиma па osoblпe adaptivпe vredпosti i aktivпosti eпzima и sredпjem crevи larvi gиbara, kao i varijabllпost ovih osoblпa iпdividиalпe performaпse. 2. Aпalizirati korelacije izmec!и razliCitih osoblпa и okvirи јеdпе srediпe i иtvrditi da /i dolazi do promeпe korelacioпe strиktиre izmec!и koпtrole i tretmaпa па kadmijиmи. З. Proceпiti plasticпost i varijabllпost plasticпosti iпdividиalпe performaпse larvi и odgovorи па prisиstvo kadmijиma и hraпi. 4. Odrediti eпzimske izoforme i иtvrditi da li dolazi do promeпe и Ьrоји i пivои ekspresije izoformi eпzima и tokи delovaпja razliCitih tretmaпa kadmijиmom {akиtпog, hroпicпog i oporavka). 5. И tokи delovaпja razliCitih efekata kadmijиma иtvrditi osetljivost proиcavaпih parametara, kako osoblпa povezaпih sa adaptivпom vredпoscи orgaпizma {osoblпe adaptivпe vredпosti), tako i aktivпosti eпzima i ispitati mogиcпost пjihovog korisceпja kao markera izloieпosti stresи {eпgl. exposиre Ьiomarkers). 30 1 aterijal i meto е Materjial ј metode З. 1 USLOVI GAJENJA Legla gиbara апаfјzјгапа и еksрегјтепtи роtјси jz topolove sиme. Dvadeset legala ie sakиpfieпo и oktobrи, па lokafjtetи Opovo. Ро sakиpfiaпiи legla sи stavlieпa и fгjijder па 4 ·с, sve do postavliaпia па pifieпie и martи mesecи . Larve sи gaieпe и casama zаргетјпе 300 т/ па gиstjпj 7 5 larvj ро casj sve do иlaska и treCi larveпj stиpaпi, kada ie gиstjпa smaпieпa па pet larvj ро casj. Ulaskom и cetvrtj larveпj stиpaпi larve sи роiеdјпаспо rasporedeпe ро casama. Temperatиra gaieпia ie jzпosjfa 23 ·С, а fotoper jod 7 2" mrak : 7 2" svetfost. 3.2 EKSPERIMENTALNE GRUPE Larve sи gaieпe па vestackoi d jietj (h jgh wheat germ djet-HWG) и koioi ie kazejп zameпieп hjdгofjzatom kvasca {Bell et а/. 7 98 7; О dell et а/. 7 984}. Когјsсепе sи dve koпceпtracjie kadтjiиma 7 О ll9 Cd/ g sиve hraпe {и daliem tekstи оzпасепа kao С1 } ј 30 ll9 Cd/g sиve hraпe {оzпасепа kao С2}. Kadтjiиm ie dodavaп и obfjkи пјtгаtпе sofj: Cd{N03};г><4H20. 31 Materjjal ј metode И eksperjтeпtи је fогтјгапо sedam eksperjтeпtafпjh grиpa: EKSPERIMENTALNE ТRЕТМАN КADMUUMOM GRUPE к koпtrolпa grиpa bez kadmijиma - Larve gајепе па тапЈОЈ koпceпtracjj ј СЈ kadтjjиma { 1 OpgCd/ g sиve hraпe) od jzfegaпja do treceg dапа cetvrtog Jc:!_rveпog_ stиe!!Ja v --------··-··- HRONICNI ЕFЕКАТ Larve gщепе па vecoj koпceпtracjjj С2 kadтjjиma {ЗOpgCd/g sиve hraпe) od jzfegaпja do treceg dапа cetvrtog larveпog stирпја Larve gајепе па koпtrofj do иlaska и КСЈ cetvrtj larveпj stирапј, а zatjт preпete trj dапа па С1 AKUTNI ЕFЕКАТ t-------- Larve gајепе па koпtrofj do иfaska и КС2 cetvrtj larveпj stирапј, а zatjт preпete trj dапа па С2 СЈК Larve gајепе па С1 dQ иlaska и cetvrtj larveпj stирапј, а zatjт preпete trj dana па К OPORAVAK Larve gајепе па С2 do иlaska и cetvrtj С2К larveп j stирапј, а zatjт preпete trj dапа паК Aпafjza је obиhvatala 20 legala, ј fo 5 larvj ро leglи, иkирпо 1 ОО jedjпkj, и okvjrи svake eksperjтeпtalпe grиpe. 32 Materijal i metode 3.3 ODREf)IVANJE KOMIONENТI ADAPТIVNE VREDNOSТI Od komponenata adaptivne vrednosti odredivani sи sledeti parametri: 7. иkиpni mortalitet (procenat иginиlih larvi od pi/jenja do irfvovanja treceg dana cetvrtog larvenog stиpnja} i mortalitet larvi prvog stиpnja (procenat иginиlih larvi prvog stиpnja}; 2. trajanje prvog stиpnja, kao i trajanje razvica larvi od izleganja do иlaska и cetvrti larveni stиpanj (izraieni и danima}; З. masa larvi treceg dana cetvrtog larvenog stиpnja; 4. relativna brzina rasta (RGR) koja је izracиnata formиlom: RGR={masaгmasa2} х 1 00/masa2 masa2, masaг predstavljajи masи larvi drиgog treceg dana cetvrtog larvenog stиpnja 33 Materjial ј metode 3.4 8/0HEM/JSKE МЕТОDЕ lspjtjvaпe sи aktivпostj sfedeeih епzјта: • иkирпјh proteaza; • tгјрsјпа; • fеисјп amiпopeptjdaze; • a-=-g/jkozjdaze; • 13- g/jkozjdaze; • esteraze; • glиtatjoп 5-traпsferaze. irtvovaпie laгvj ie obav/iaпo па fedи, па fjfter рарјги, treceg dапа cetvrtog larveпog stиpпia. Larve sи presecaпe jza zadпieg рага поiјса, иzdиiпо јт ie rasecaп abdomeп ј jzofovaпo cefo crevo. Sredпie crevo ie odvoieпo, oCisceпo od masпog tela, jspraпo od hemofjтfe ј stavlieпo и zamгzjvac па -2о·с do pravlieпia homogeпata. Риlоvапј homogeпatj sи pravlieпi и okvirи svake eksperjтeпtalпe grиpe. Za svako leg/o pravlieп ie iedaп homogeпat creva иzetjh od 5 laгvj. Creva sи homogeпjzovaпa па ledи, и 0. 15 М NaCI {100mg creva/ml fjzjo/oskog rastvora}. Homogeпjzacjia ie obavliaпa 15 sekипdj ргј Ьгzјпј od 20000 obrtaia и тјпиtј. Homogeпatj sи zatjт сепtгјfиgјгапј и Eppeпdorf ceпtгjfugj 1 О тјпиtа па 1 OOOOg. Sиpernataпt ie preпet и ерепdогfјсе ј zamrzпиt па -2о·с do odredjvaпia aktjvпostj епzјта. 34 Materiial i metode 3.4. 1 Odredivaпie aktivпosti иkирпih proteaza Radeпa ie metoda ро Кипitzи { 7 947). Као sиpstrat korisceп te 7% kazeiп koii ie prethodпo rasfvoreп и риfеги (Giy/NaOH рН= 7 О), zagrevaпtem, bez kliиcaпia. Uzima se ро 250f.ll sиpstrata i isto toliko homogeпata. Posle iпkиbaciie od 7 h па 4О·с reakciia ie prekiпиta sa 500f.ll 7 0% ТСА. Taloieпie se odviia и friiiderи 30 тiпиtа па 4 ·с. Zatim se ceпtrifиgira 7 О miпиta па 7 OOOOg. Apsorpciia sиpernataпta se meri па 280пт. Specificпa aktivпost ро mi/igramи proteiпa иzorka se izracипava па sledeCI паСiп: Аиz- apsorpciia иzorka (eпzima} Аьиz- apsorpciia Ьlапk eпzima {иzorka} Аьs- apsorpciia Ьlапk sиpstrata 3.4.2 Odredivaпie aktivпosti tripsiпa Metod za detekciiи tripsiпa ie ро tipи slicaп reakciii za detekciiи lеисiп amiпopeptidaze: sastoii se и oslobadaпiи p-пitroaпi/ida iz Na-beпzoii-DL­ argiпiпa-4-пitroaпi/id hidrohlorida {BApNA) {Erlaпger et а/. 7 96 7; Valaitis 7 995}. 35 Materjjal ј metode И геаkсјопи smesи se dodaje 50mM Gly 1 NaOH р Н= 7 О, 20 mM sиpstrat fјпа/пе koпceпtracjje 2тМ ј homogeпat. РгејпkиЬасјја је trajala 5 тјпиtа, а vreme reakcjje 7 5 тјпиtа па 30°С. Reakcjja је prekjпиta 6% sjrcetпom kjsefjпom, а apsorpcjja mereпa па 405пт. Specjfjcпa aktjvпost (SAn koja је jzraieпa и оdпоsи па kofjCiпи profejпa, је јzгасипаtа па sledeCi паСiп: (И 1 ml) = A4os х 0~0012L х 106 JL1110l 1 то! = A4os х 0.7619048 1.05 х 10 L l то! х 15minx 0.01ml Aktivnost( Q_) SAT(U/ mg)= ml Pr oteini( mg) ml 3.4.3 Odredjvaпje aktjvпosti fеисiп amiпopeptidaza Ргјпсјр reakcjje za detekcjjи LAP је osfobadaпje p-пjfroaпjfjda jz sиpstrat~ feиcjп-para-пjfroaпjfjda (Erlaпger et а!. 7 96 7 ). Когј5сеп је 40тМ veroпal 1 НС/ pиfer р Н= 7. 9. И риfеги је јпkиЬlrап homogeпat sa 20mM sиpstratom (пjegova kопаспа koпceпtracjja и јпkиЬасјопој sme5j је 2mM) па 30°С. Posle 5 тјпиtа ргејпkиЬасјје ј 70 тјпиtа јпkиЬасјје reakcjja је prekjпиta 6% sjrcetпom kjsefjпom . Apsorpcjja је mereпa па talasпoj dиzјпј 405пт. 36 Materijal i тetode Aktivпost feuciп aтiпopeptidaza је оdгес1епа sledecoт fогтиlот: А405 х 0.0012L х 70 6 ,ито/ 1 то/ И l т/= 1.05 х 10 4 L 1 то/ х 70тiпх O.Olтl = А405 х 7.1 428571 Aktivnost( !!_) SALAP(U 1 тg) = т/ Pr oteini( тg) т/ Specificпa aktivпost (SALAP) 1е izracuпata kao aktivпost епztта ро тg proteiпa. 3.4.4 Odreclivaпje aktivпosti a-glikozidaze Priпcip reakcije је oslobac1aпje p-пitrofeпola iz 4-пitrofeпi/- a-D- glikopiraпozida, specificпog supstrata za detekciju a-glikozidaze {Baker, 1991}. Napravljeп је 20тМ rasfvor supstrata и vodi. И 0.2М Na-fosfataпi pufer dodat је supstrat fiпalпe koпceпtracije 2тМ i 5џ1 hoтogeпata. Vreтe iпkubacije је 70 тiпuta па 3о·с. Reakcija se prekida sa lтl sledece sтese: 0.25М Na2C03; 0.25М NaHC03 i 7% SDS. Apsorpcija је тегепа па 405пт. А405 х 0.0072L х 70 6 ,ито/ 1 то/ И l т/= 1.86 х 10 4 L 1 то/ х 70тiпх 0.005т/ = А405 х 1·29032258 Specificпa aktivпost a-glikozidaze (SA0 G) izracuпata је па sledeei паСiп: Aktivnost( !!_) SAaG(U 1 тg) = т/ Pr oteini( тg) т/ 37 Materjjal ј тetode 3.4.5 Odreclivaпje aktivпosti ~-g/ikozidaze 4-пitrofeпjf- ~ -D-glikopiraпozid је sиpstrat kогј5сеп za Ьioheтijskи detekcjjи ~-gfjkozidaze. Priпcip detektovaпja је isti kao kod a-gfjkozjdaze, оsјт sto је vreтe јпkиЬасјје jzпosjfo 60 тјпиtа. Specjfjcпa aktjvпost (SA~G) је јzгасипаtа па sfedeCi паСiп: Ulml= A4os x04.0012Lx106Jдnollmol =A4os x 0.021505376 1 . 86х 10 Ll то! х 60minx 0.05ml Aktivnost( !!____) SApG(U 1 mg) = ml Proteini(mg) ml 3.4.6 Odreclivaпje aktivпosti esteraza Za odredjvanje aktjvпosfj esteraza radena је тetoda ро Lockrjdge & Dи (7 978). Sиpstrat (о-пјfго feпjf bиtjrat} је rastvoreп и теtапоfи neposredпo pre reakcjje ј driaп па fedи. Njegova fјпаlпа koncentracjja и reakcjoпoj sтesj је 10 тМ. Когј5сеп је 0. 02М Na-fosfatпj pиfer рН= 7.2. Vreтe јпkиЬасјје је jzпosjfo 150 sec па 30°С. Apsorpcjja је теrепа па 414 пт. Fоrтиlата: А414 х 0.007L х 70 6 ,ито/ 1 то/ И l т/= 3.19 х 10 4 L 1 то/ х 2.5 тјпх O.Olтl = А414 х 1·2539785 Aktivnost( !!____) SAEST(U 1 mg) = ml dolazjтo do specjfjcпe aktjvпosfj esteraza. Proteini(mg) ml 38 Materijal i metode 3.4.7 Odre 0,05), kao пi па moгtalitet prvog stирпја (F2,5:z= 0,35; Р> 0,05). Takode, statisticki zпасајпе razlike пisи иосепе izmedи grиpa izloieпih razliCitim koпceпtracijama kadmijиma; F1,34= О, 1 9; Р > 0,05 za иkирпi moгtalitet i F1,34= 0,02; Р > 0,05 za moгtalitet prvog stирпја. Linije пorme reakcije па hroпicпim tretmaпima dve koпceпtracije kadmijиma роkаzији velikи varijaЬilпost ро leglima kako za иkирап moгtalitet, tako i za moгtalitet larvi prvog stирпја {s/ika 2). 5/ika 1. Moгtalitet larvi gиbara и prvom stирпји - { - ) i иkирап moгtalitet larvi do иlaska и cetvгti larveпi stирапј - ( D ) 46 Rezultafj 35 30 ~ е....-25 ·с: (\] 20 ~ (\] 15 t о • Е 10 с ~ 5 ~ ::::> о А' _5L-----=к"'::-----------=с=-1-=---~--с-=--::::-2 - 30 25 (\] " Е' 20 а. .а rn О> 15 ~ а. ·с: 10 ~ -.т = 5 ~ ~ о В' к С1 С2 Sfjka 2. Lјпјје norme reakcjje za ukupan mortafjtet larvj {А' Ј ј za mortafjtet prvog stupnja {В') ргј hгопјспот efektu kadтjjuma. К- kontrola, СЈ- 1 OpgCd/ g ј C2-ЗO,ugCd/ g 47 Rezиltatj 4. 1.2 TRAJANJE PRVOG LARVENOG STUPNJA Na sfjcj З ргјkаzапј sи efektj dиgotrajпog {hгопјспоg) jz/aganja laгvj prvog stирпја па dve kопсепtгасјје kadтjjиma - С7 {70 ~gCd/g sиve hгапе) ј С2 {30 ~gCd/g sиve hгапе}. Рогес1епје sredпjjh vredпofj ротоси LSD testa pokazala sи da samo jz/agaпje vj5oj kопсепtгасјјј kadтjjиma statjsfjckj zпасајпо skracиje tгајапје prvog larveпog stирпја gиЬага и оdпоsи па kопtгоlпи gгири {К). Odsиstvo raz/jka јzтес1и К ј С7 ј pгjsиstvo zпасајпјh raz/jka јzтес1и С7 ј С2, иkаzије da samo роvесапа kопсепtгасјја kadтjjиma zпасајпо skracиje tгајапје prvog larveпog stирпја. Na sfjcj А' se иосаvа da sтапјепје dиiјпе tгајапја prvog larveпog stирпја pokazиje пajveCi Ьгој legala {geпotjpova}, 7 6 legala па С2 od иkирпо 7 9 апа/јzјгапјh legala па koпtrofj. Dvofaktorska ANOVA {tabela 7) игас1епа па grиpama sa dve kопсепtгасјје kadтjjиma {С7 ј С2), pokazala је da tгајапје prvog larveпog stирпја zavjsj od geпotjpa {efekat legla Р < ОД 7 ). Ova апа/јzа је takoc1e иkazala ј па postojaпje raz/jCite oset/jjvostj geпotjpova па jz/agaпje kаdтјјити, to је jпterakcjja leglo х kadтjjиm ј јта statjsfjckj zпасајпи vredпost {Р < 0,05), kao 1 па иfјсај samog hгопјспоg tretmaпa kаdтјјита па tгајапје prvog stирпја {Р< 0,007 ). Posto larve razfjCitjh legala predstavljajи гос1епи Ьгаси ј sestre {eпgl. fи/1-siЬs}, mogиce је па оsпоvи jedпofaktorskjh aпafjza vагјјапsј proceпjfj иkирпи geпefjckи ј sгedjпskи vгјјапsи za kопtгоlпи gгири ј dva hгопјспа tretmaпa. Rezиltatj tjh апа/јzа, kao ј ргосепе heгjtabllпost za tгајапје prvog stирпја larveпog razvjca date sи и tabe/j 2 .. Statjstjckj zпасајпо vjsoke vredпostj koefjcjjeпta heгjtabllпostj и 5јгет sтјs/и иkаzији da sи и sve fгј апа/јzјгапе grиpe geпefjckj Сiпјосј оsпоvпј razlog vагјгапја и tгајапји prvog larveпog stирпја gиЬага. Мес1иtјт, F vredпostj dobljeпe рогес1епјет geпefjckjh ј sredjпskjh vагјјапsј и tгајапји prvog stирпја laгvj јzтес1и апа/јzјгапјh gгира {К, С7, С2) пјsи pokazjvale statjsfjckj zпасајпе vredпostj. ZпaCi, da geпetjckj ј sredjпskj {slисајпј) Сiпјосј пјsи raz/jCifj јzтес1и koпtrole ј оЬа hгопјспа tretmaпa. Do 48 Rezиltati istog rezиltata dolazi i aпaliza razlika izmedи koeficiieпata heritЬilпosti. МеdиsоЬпа poredeпja heritaЬilпosti пisи пi и jedпom slисаји pokazala statisticki zпасајпе razlike. Dvofaktorskom aпalizom varijaпse иtvrdeпo је da је heritaЬilпost plasticпosti тапја od heritaЬilпosti svojstva {h/=0,2158 < h/= 1, 1721 }. Sredпje vredпosti iпdeksa feпotipske plasticпosti za trajaпje prvog stирпја tmotи pozitivпe vredпosti па оЬа hroпicпa tretmaпa fXc 1=2,0325; Xcz=6,9685). Poredeпjem srёdпjih vredпosti iпdeksa feпotipske plasticпosti {Vilkoksoпov test}, иtvrdeпo је da је па graпici zпacajпosti роvесапје vredпosti iпdeksa plasticпosti па С2 и оdпоsи па hroпicпi tretmaп та п је koпceпtracije kadmijиma {Z= 1, 9380; Р < О, 1 ). 49 Rezultafj .......... " Е ro -о ......... ro " Б: :::::1 ...... 1/) [ Q. ф "Е' ro $ [ ф "Е' ro -~ F 12.0 11.5 11.0 10.5 ЩО 9.5 9.0 8.5 в. о 7.5 7.0 6.5 8 & 4 А а а ~ --, Е- к С1 С2 А' к С1 С2 S/ika З. Тгајапје prvog stupnja laгvj gubara {Х ± SE) {А) ј fјпјје norme reakcjje {А ') ргј hгопјспот efektu razfjCitjh koncentracjja kadтjjuma. K-kontrola, СЈ- 1 0j.1gCd/ g ј С2- 30 f.lgCd/ g suve hгane. а, Ь- stublti oznaceп j razfjCitjт slovjтa su znacajno razfjCitj (Р< 0,05). 50 Rezиltatj Tabela 1. Prosecno kvadratno odstиpanje od srednje vrednostj trajanja prvog stиpnja larvj gиbara pomnoieno sa 1000 {MS) и dvofaktorskoj anafjzj varjjanse prj hroпjcпom tretmanи kadтjjиmom. Koncentracjja kadтjjиma {Cd) је fjksjraпj faktor, а leglo (L) је sfисајпј faktor. lzvor df MS F р variranja HRONICNI · Leglo(L) 17 105,984 14,725 0,0057 TRETMAN fCd l 2 72,998 6,044 0,0000 Lx[Cd] 34 12,077 1,678 0,0101 Greska 666 7,198 Tabela 2. Genetjcka varjjansa {ag 2), sredjпska varjjansa {ас/) ј herjtabllnost и 5jrem sтjsfи {h2±SE) za trajanje prvog stиpnja larvj и zavjsпostj od tretmana kadтjjиmom. Tretmaпj: K-kontrolna grиpa, bez kadтjjиma; аkиtпј efekat hrопјспј efekat {С1-70 Jl9 Cd/g sиve podloge ј С2-30 Jl9 Cd/g sиve podfoge). tretman N (Ј2 ас/ h2 ±SE t к 19 2,519 5,841 0,6026 О, 1704 3,536** С1 18 2,232 8,498 0,4160 О, 1518 2,741* С2 18 3,333 7,246 0,6300 О, 1787 3,526** *Р< 0,05 **Р< ОД1 51 Rezultati 4. 1.3 TRAJANJE RAZVICA LARVI ОО ULASКA И CEТVRТI LARVENI STUPANJ Efekti dugotrajпih tretmaпa kadmijuma {СЈ i С2) па trajaпje razvica larvi gubara predstavljeпi su па slici 4А. LSD testom је utvrcleпo da samo u toku hroпicпog efekta па 30 ~gCd/ g suve hraпe dolazi do zпасајпоg skraceпja trajaпja razvica u odпosu па koпtrolпi tretmaп . lzmeclu СЈ i koпtrole, kao i trajaпja razvica па оЬа hroпicпa tretmaпa пе postoje statisticki zпасајпе razlike. 12 geпotipova od ukupпo 20 legala, pokazuje skraceпje trajaпja razvica u odпosu па koпtrolu {liпije пorme reakcije, slika 4А' ). Dvofaktorskom aпalizom van1aпse koja је uracleпa па оЬе koпceпtracije kadmijuma u toku dugotrajпog, hroпicпog tretmaпa utvrcleпo је da trajaпje razvica do ulaska u cetvrti stupaпj zavisi od geпotipova (legla, Р < 0,001 ), ali i da је sama iпterakcija legla i kadmijuma statisticki zпасајпа (Р< 0,001). lпteresaпtпo је da пе postoji zпасајап uticaj koпceпtracije kadmijиma па trajaпje razvica larvi do иlaska и cetvrti larveпi stирапј iako se /egla zпасајпо razlikиjи ро svojoj osetljivosti па kadmijиm {tabela 3). Rezиltati jedпofaktorske aпalize vantaпse (predstavljeпi heritabllпostima и sirem smislи, geпetickom i srediпskom varijaпsom}, роkаzији slicпe rezиltate kao и jedпofaktorskoj aпalizi trajaпja prvog stирпја. Geпeticki Ciпioci sи osпovпi razlog promeпe и tгајапји razvica do иlaska и cetvrti larveпi stирапј. Na ovo иkаzији vredпosti za heritabllпost koje sи statisticki zпасајпе i imajи visoke vredпosti, пaroCito и koпtroli {tabela 4}. Porecleпjem geпetickih i srediпskih varijaпsi koпtrolпe grиpe i оЬа dиgotrajпa tretmaпa пisи dobljeпe zпасајпе F vredпosti sto pokazиje da geпeticki i srediпski Ciпioci пisи razliCiti izmeclи proиcavaпih efekata. Na ovo иkаzије i пероstојапје statisticki zпacajпih t vredпosti dobljeпih porecleпjem koeficijeпata heritabllпosti и sirem smislи. 52 Rezultafj Као ј za trajanje prvog stupnja, vrednost za heгjtaЬilnost svojstva је veca od heгjtaЬilnosfj plasfjcпosfj za trajanje razvjta do ulaska и cefvrfj larveпj stupanj (h/=0,4776 < h/=0,6016}. Srednje vrednosfj jпdeksa fenofjpske plasfjcпosfj јтаји pozjfjvпe vrednostj па оЬа hгопјспа tretmana (ХС/=2, 7 38; Хсг3,223); Ne postojj znacajna рготепа plasfjcпosfj trajanja razvjta jfj njene vaгjjaЬilnosfj jzтedu dva hгопјспа tretmana (С1 ј С2). 53 Rezultafj 18 ........ · с: 15 со :з, со •(.) -~ со ..... 12 ф "Е' со -~ 1-- 9 19 14 А а аЬ ь ~ к С1 С2 к С1 С2 5/ika 4. Trajanje razvjca laгvj gubara {Х ± SE) (А) ј fјпјје norme reakcjje (А') ргј hгопјспот efektu razfjCitjh koncentracjja kadтjjuma. K-kontrola, СЈ- 1 OJlgCd/ g ј С2- 30 JlgCd/ g suve hrane. а, Ь- stublCi oznaceпj razfjCifjт sfovjтa su znacajno razfjCitj (Р < 0,05). 54 Rezиltati Tabela З. Prosecno kvadratno odstиpanje od srednje vrednosti vremena trajanja razvica larvi pomnoieno sa 1000 {MS) и dvofaktorskoj analizi varijanse pri razliCitim tretmanima kadmijиmom. Koncentracija kadmijиma (Cd) је fiksirani faktor1 а leglo (L) је slиcajni faktor. Efekat lzvor variranja df MS F р hronicni Leglo(L) 19 8,710 7,457 0,0000 Kadmijum(Cd) 2 7,030 2,219 0,1 226 LxCd 38 3,169 2,713 0,0000 • Greska 237 1,168 Tabela 4. Geneticka varijansq (ag2}, sredinska varijansa (ас/) i heritaЬilnost и sirem smislи (h2±SE) za trajanje razvica larvi и zavisnosti od tretmana kadmijиmom. Tretmani: K-kontrolna 9rира1 bez kadmijиma; hronicni efekat (СЈ-10 1!9 Cd/9 sиve podlo9e i С2-ЗО 1!9 Cd/9 sиve pod/o9e). tretman N а2 а(/ h2 ±SE t к 20 0,823 0,953 0,9268 0,2211 4, 193*** С1 20 0,721 1,284 0,7193 0,2272 З , 166** С2 20 0,779 1,271 0,7604 0,2264 3,359** **р< о 01 1 ***Р<0007 1 55 Rezиltati 4. 1.4 МАSА LARVI Na slici 5 prikazaпe sи proseeпe (sredпje) vredпosti i погте reakcije legala za masи larvi gиbara: za koпtrolпи gгири i razliCite tretmaпe kadmijиmom. Trodпevпo dejstvo 10 i 30 ~g Cd/g sиve hraпe је Ьilo пedovoljпo da dode do рготепе mase larvi и оdпоsи па koпtrolи (LSD test}. Statisticki zпасајап pad mase је detektovaп kod hroпicпog efekta vece koпceпtracije kadmijиma, gde је kod cak 17 legala registrovaпo sтапјепје mase и оdпоsи па 20 пetretiraпih legala. lпteresaпtпo је da и tokи oporavaka sa С1 i С2 takode dolazi do pada mase larvi i to kod 14· legala od иkирпо 20 koпtrolпih. Na tabe/i 5 sи prikazaпi rezиltati medиsobпih poredeпja razliCitih tretmaпa па masи larvi gиЬага {trofaktorska ANOVA). Ni и jedпom s/исаји пе postoji statisticki zпасајпа razlika za masи larvi izmedи razliCitih tretmaпa, sto иkаzије da se masa larvi пе moie koristiti prilikom иtvrdivaпja efekta kadmijиma па gиbara. Zпасајап efekat legla pokazиje geпeticke razlike izmedи legala пezavisпo od tretmaпa. Statisticki zпасајпе razlike efekata tretmaпa izmedи legla иtvrdeпe sи prilikom poredeпja akиtпog tretmaпa sa oporavkom i hroпicпog tretmaпa sa oporavkom. RazliCita osetljivost geпotipova (legala} па razliCite tretmaпe иосепа је samo и slисаји poredeпja akиtпog i hroпicпog tretmaпa {tretmaп х leglo iпterakcija; Р < 0,0 1, tabela }. Dvofaktorskom ,__ ANOVOM sи и okvirи svakog legla иtvrdivaпi efekti koпceпtracije kadmijиma па masи larvi i geпeticke razlike и osetljivosti larvi gиbara па kadmijиm {tabela 6}. Pri svim efektima kadmijиma za рrотепи mase gиbara odgovoraп је geпeticki faktor (leglo), Р < 0,001. И tokи hroпicпog efekta i oporavka od vece koпceпtracije metala па рготепи mase иtice koпceпtracija kadmijиma {Р < ОД5), dok и akиtпom stresи iпterakcija "geпotip х kadmijиm" zпасајпо иtice па variraпje mase (Р< 0,05}. 56 Rezиltati Poredeпjem geпetickih varijaпsi za masи larve иtvrdeпo је da postoje zпасајпе razlike geпetickih varijaпsi izmedи hroпicпog i akиtпog efekta i to па оЬе koпceпtracije kadmijиma {tabela 8). 1 па С1 i па С2 varijaпsa је veca pri akиtпom tretmaпи. Statisticki zпасајпе vredпosti heritabllпosti и sirem smislи za masи larvi иtvrdeпe sи kod оЬа аkиtпа tretmaпa {tabela 7). ZпaCi, da и tokи kratkotrajпog stresa kadmijйmom geпeticki Ciпioci predstavljajи osпovпi иzrok variraпjи mase. Poredeпjem heritabllпosti пiје иtvrdeпa пi јеdпа zпасајпа t vredпost, sto иkаzије da geneticki i srediпski Ciпioci пisи razliCiti izmedи kontrole i tretmaпa. Као i kod prethodпih osoblпa adaptivпe vredпosti, dvofaktorska aпaliza varijanse је pokazala da је pri svim tretmaпima {akиtпi, hroпicпi i оЬа oporavka}, heritabllпost plasticпosti тапја od heritabllnosti svojstva {tabela 9 ). Sredпje vredпosti {Х) i staпdardпe devijacije (SD) iпdeksa feпotipske plasticnosti mase larvi treceg dапа cetvrtog larveпog stирпја prikazaпi sи и tabeli 7 О. Samo kod akиtпih efekata па С1 i С2 vidimo пegativпe vredпosti iпdeksa feпotipske plasticпosti {tabela ). То zпaCi da odredeпi broj legala pokazuje vеси masи паkоп trodпevпog delovaпja kadmijиma пеgо па podlozi bez kadmijиma. Poredeпjem srednjih vredпosti iпdeksa feпotipske plasticпosti иtvrdeпo је da se plasticпost znacajпo povecava па hroпicпom tretmaпи па С2 и оdпоsи па isti tretmaп па тапјој koпceпtraciji kadmijиma {Р< 0,05; tabela 7 7 }. 57 Rezultati Akutni tretman Hronicni tretman Oporavak od lO!lgCd/g Oporavak od ЗO!lgCd/g А в с D "" .. .. .. ~ "' .. к "' оо "' ;m '"' 100 . ~ к КС1 аЬ т С1 • аЬ т т к С1 а т ь т к С2 ~ КС2 ь т С2 ь С1К ь т С2К А' В' с D' 2SJ 240 ZD ZIO - 210 .§::ro -; 181 ~ 170 ::. "" 1!il 140 -~ 1' 1:Ю 120'----;;----~--~- 240 ' ZD 220 210 а;200 .§_ 190 -~ 100 -; 170 :g 11Ю ::. 150 140 1:Ю 120 ~~к~--с~1---с~1=к- 240 220 а;200 .§. ~ 100 "' "' ' 100 ::. 140 120 '---... к С2 С2К 5/ika 5. Masa larvi gubara (Х ± SE) (А, В, С, D) i /inije norme reakcije {А', В', С, D') 58 Rezultati Tabela 5 . Trofaktorska ANOVA za masu larvi treceg dana cetvrtog larvenog stupnja izmedu razliCitih tretmana. Tretmani i koncentracije su Ьili fiksirani faktori, а leglo slucajni faktor koji је ugnjeiden и tretmane sa razliCitim koncentracijama kadmijuma. F-odnos pokazuje kako је procenjivana F vrednost. Рагеаепје lzvar variraпja MSIII F adпas F vredпast Tretmaп(df=1) 16148,05 1/4 2,89 .Кaпeeпtraeija(df=1) 4310,78 2/3 1 '14 AKUTNI- Tret. х Капе (df=1) 3790,57 3/5 1,23 HRONICNI TRETMANI Legla(kaпe. )( df=38) 5570,42 4/5 1,81 Tret. х Legla (kапе) 3075,81 5/6 1 ,89** (df=36) Greska (df=290) 1628,12 Tretmaп(df=1) 25639,35 1/4 3,53 Kaпeeпtraeija(df=1) 432,94 2/3 1 '19 AKUTNI- Tret. х Капе (df=1) 375,71 3/5 0,21 OPORAVAK TRETMANI Legla(kaпe. )( df=37) 7271,89 4/5 3,99*** Tret. х Legla (kапе) 1820,29 5/6 1 '15 (df=34) Greska (df=284) 1581 ,45 Tretmaп(df=1) 2678,41 1/4 0,55 Kaпeeпtraeija(df=1) 5039,02 2/3 1,53 HRONICNI- Tret. х Капе (df=1) 3287,87 3/5 2,27 OPORAVAK TRETMANI Legla(kaпe. )( df=38) 4895,23 4/5 3,38*** Tret. х Legla (kапе) 1448,62 5/6 0,91 (df=35) Greska (df=ЗOO) 1587,17 **Р< 0,01 ***Р< 0,001 59 Rezиltatj Tabela 6. Prosecпo kvadratпo odstиpaпje od sredпje vredпostj mase larvi treceg dапа cetvrtog larvenog stирпја ротпоiепо sa 7 000 {MS) и dvofaktorskoj aпalizi varjjaпse prj razfjCitim tretmaпima kadтjjиmom. Koпceпtracija kadmijиma {Cd) је fjksiraпj faktor, а leglo {L} је slисајпј faktor. Efekat lzvor variranja df MS F р akutni Leglo(L) 17 5,508 5,221 0,0000 . Kadmijum(Cd) 2 0,041 0,019 0,9813 LxCd 34 2,174 2,061 0,0011 Greska 205 1,055 hronicni Leglo(L) 19 3,709 3,531 0,0000 Kadmijum(Cd) 2 4,968 3,547 0,0387 LxCd 38 1,401 1,333 0,1035 Greska 237 1,050 oporavak С1 Leglo(L) 18 4,141 3,752 0,0000 Кadmijum(Cd) 2 2,942 2,120 О , 1347 LxCd 36 1,387 1,257 О, 1622 Greska 226 1,104 oporavak С2 Leglo(L) 18 4,749 4,258 0,0000 Kadmijum(Cd) 2 5,892 4,520 0,0177 LxCd 36 1,304 1,169 0,2463 Greska 226 1 '115 Tabela 7. Geпetjcka varjjaпsa {а g 2}, sredjпska varjjaпsa faw 2} ј herjtabllпost и 5jrem sтjsfи {h2±SE) za masи larvj и zavjsпosfj od tretmaпa kadтjjиmom. Tretmaпj: K-koпtrolпa grиpa, bez kadтjjиma; аkиtпј efekat {KC1-trj dапа па С1 podlozj ј KC2-trj dапа па С2 podlozj); hгопјспј efekat {С7-70 ~g Cd/g sиve podloge ј С2-ЗО ~g Cd/g sиve podloge); efekat oporavka {С7 K-tri dапа oporavka od С1 pod/oge ј С2К- frj dапа oporavka od С2 podloge). tretman N cr2 crw 2 h2 ±SE t к 20 0,272 1,098 0,3975 0,2076 1,914 КС1 19 0,622 1 '147 0,7028 0,2423 2,901** КС2 19 0,529 0,840 0,7725 0,2325 3,322** С1 20 0,224 1 '142 0,3281 0,2025 1,621 С2 20 0,175 0,912 0,3223 0,2005 1,608 С1К 19 0,246 0,984 0,3995 0,2135 1,871 С2К 19 0,373 1,265 0,4551 0,2200 2,068 •• р< о 07 1 60 Rezultati Tabela В. F vrednosti dobljene poredenjem genetickih varijansi crg2 za masu larvi (iznad dijagonale) i sredinskih varijansi crco 2 (ispod dijagonale) izmedu razliCitih tretmana к С1 С2 КС1 КС2 С1К С2К к 2,283 1,369 С1 1,040 2,775* 1,669 С2 1,203 КС1 1,045 КС2 1,307 1,359 С1К 1 '115 1,599 С2К 1,153 1,108 1,387 *р< 0,05 **р< о 07 1 Tabela 9. Plasticnost (8/), heritabllnost plasticnosti (h/) i heritabllnost svojsfva (h/) za masu larvi dobljeni iz dvofaktorske analize varijanse kod gubara gajenih и razliCitim sredinama, pri akutnom, hronicnom stresu i oporavku. efekat 8 2 h 2 1 h2 5 akutni 0,9490 0,4893 0,5543 hronicni 0,8020 0,3730 0,4829 oporavak С1 0,7375 0,3563 0,5618 oporavak С2 0,6695 0,3011 0,6408 Tabela 10. Srednje vrednosti {Х) i standardne devijacije {SD) indeksa fenotipske plasticnosti mase larve treceg dana cefvrtog larvenog stupnja С1 С2 efekat N (Х) ±SD N (Х) ±SD akutni 19 -1,717 20,526 19 -2,749 20,126 hronicni 20 1,484 18,254 20 8,500 12,821 oporavak 19 6,784 12,652 19 8,1 46 14,369 61 Rezultati Tabela 11. Rezultati poredenja srednjih vrednosti (Z, Vilkoksonov test) i standardnih devijacija (F test} indeksa fenotipske plasticnosti mase larvi treceg dana cetvrtog larvenog stupnja Poredenje z р F р akutni С1 -akutni С2 0,0218 . 0,9826 1,0402 0,9343 hronicniC1 -hronicni С2 2,3520 0,0187 2,0270 О, 1324 oporavak С1 -oporavak С2 0,6036 0,5461 1,2898 0,5949 hronicni С1 -akutni С1 0,3622 0,7172 1,2645 0,6157 -oporavak С1 1,5025 О, 1330 2,0816 О, 1262 hronicni С2 -akutni С2 2,6157 0,0089 2,4641 0,0583 -oporavak С2 0,0805 0,9359 1,2560 0,6258 62 Rezиltatj 4.1.5 RELAТIVNA BRZINA RASTA Рготепе sredпje vredпostj relatjvпe Ьгzјпе rasta и tokи akиtпog, hroпjcпog stresa ј oporavaka date sи па sfjcj 6. LSD poredeпjem је иtvrdeпo da do zпасајпоg роvесапја relatjvпe Ьгzјпе rasta dolazj samo ргј kratkotrajпom trodпevпom tretmaпи (ј to па оЬе koпceпtracjje kadтjjиma}, kao ј и tokи oporavka od 30 ~gCd/ g sиve hraпe {sfjke 6А, D). ZпaCi, da је и tokи akиtпog tretmaпa masa laгvj treceg dапа . statjstjckj zпасајпо veea пеgо masa drиgog larveпog dапа. Relatjvпa Ьгzјпа rasta је veca kod larvj jzfoieпjh kаdтјјити и оdпоsи па koпtrolи. Liпjje погте reakcjje роkаzији da и оdпоsи па larve koje sи kопzитјга/е hгапи bez kаdтјјита, па akиtпom stresи па С 7, relatjvпa Ьгzјпа rasta raste kod 14, dok па КС2 vjdjтo роvесапје RGR па cak 17 od иkирпо 20 aпafjzjraпjh legala. Trofaktorska ANOVA {tabela 7 2) pokazиje da п ј и jedпom slисаји пе postojj zпасајпа promeпa и relatjvпoj Ьгzјпј rasta pod иtjcajem razfjCitjh tretmaпa. Moiemo da zakljиCimo da relatjvпa Ьгzјпа rasta пјје povoljaп parametar и jspjtjvaпjи dejstva kadтjjиma па larve gиbara {bar пе па рrоисаvапјт koпceпtracjjama}. Poredeпjem hroпjcпog tretmaпa ј oporavka detektovaпa је samo zпасајпа promeпa oset/jjvostj geпotjpova па razfjCite tretmaпe {tretmaп х /eglo; Р< 0,05). Dvofaktorskom aпafjzom varjjaпse иtvrdeпo је da ргј akиtпom tretmaпи ј oporavkи od С2 koпceпtracjja kadтjjиma иtјсе па рrотепи relatjvпe Ьгzјпе rasta (ј za аkиtпј ј za oporavak Р< 0,05, tabela 7 З). Zпасајпе F vredпostj {tabela 7 5} dоЬiјепе poredeпjem geпetjckjh varjjaпsj za relatjvпи Ьгzјпи rasta sи јzтеdи sfedeCih tretmaпa: К ј КС1, К ј С1 К; С1 ј С1 К; С2 ј oporavka od С2; КС2 ј С2К; ј јzтеdи оЬа oporavka. Geпetjcka varjjaпsa је и tokи oporavka od С2 veca od varjjaпsj па akиtпom ј hгопјспот efektи jste koпceпtracjje metala, dok vагјјапsа и tokи dиgotrajпog tretmaпa па С1 јта vеси vredпost и оdпоsи па оЬа kratkotrajпa efekta па jstoj koпceпtracjjj {tabela 7 4) . 63 Rezultafj Ne postojj zпасајпа vredпost heгjtabllпosfj пј па jedпom tretmaпu (tabela 74). Njjhovjт porecleпjem, takocle пјје dobljeпa пј јеdпа zпасајпа t vredпost sto ukazuje па пероstојапје statjsfjckj zпасајпјh razlika jzтeclu sredjпskjh ј geпefjckjh Ciпjfaca jzтeclu koпtrofe ј efekata metala. Na svjт tretmaпjтa heгjtabllпost plastjcпostj relativпe Ьгzјпе rasta је veca od heГjtabllпosfj svojstva {tabela 7 6}. Sve sredпje vredпostj jпdeksa feпofjpske plasfjcпostj relatjvпe Ьгzјпе rasta јтаји пegatjvпe vredпosfj (tabela 7 7). lz ovoga moiemo zakljuCitj da su vredпosfj za Ьгzјпu rasta vece па tretmaпjтa sa kadтjjumom пеgо па koпtrofj. Рогес1епјет sredпjjh vredпostj ј staпdardпjh devjjacjja iпdeksa feпofjpske pfstjcпostj relatjvпe Ьгzјпе rasta {tabela 7 В) пjsu рrопас1епе zпасајпе razfjke jzтeclu tretmaпa. 64 Rezultati Akutni tretman Hronicni tretman Oporavak od lOJ.!gCd/g Oporavak od ЗOflgCd/g А в с D ., .. "' 10 о о ., .. "' 10 к КС1 ~ ~ к С1 _i_ а к С1 !t _i_ к С2 5S КС2 "'--------;к~-~кс~1--=кс""2- А' ~ 55 * 50 -;; .. ,. ~ 40 ~:f) 1Ј :ю Ћi ~25 "' С2 15 к С1 С2 В' 5S _l 50 ~45 ф ,. ~ "' ф ~ Э5 ф i :ю "' 2S С1К "' к С1 С1К с 5S т ls:l ~45 ~ ~ "' ~ ~35 ~ ~:ю "' 2S С2К "' к С2 С2К D' 5/ika 6 . Relativna brzina rasta larvi gubara {Х ± SE) (А, В, С, D) liniie norme reakciie (А' , В' , С', lY) 65 Rezultati Tabela 12. Trofaktorska ANOVA za relativnu brzinu rasta larvi treceg dana cetvrtog larvenog stupnia izmedu razliCitih tretmana. Tretmani i koncentraciie su Ьi/i fiksirani faktori, а leglo sfucaini faktor koii ie ugnieiden и tretmane sa razliCitim koncentraciiama kadmiiuma. F-odnos pokazuie kako te proceniivana F vrednost. Poreдenje lzvor variranja MSIII F odnos F vrednost Tretman(df=1) 325,49 1/4 1,03 Koncentracija(df=1) 9,58 2/3 0,14 AKUTNI- Tret. х Капе (df=1) 68,23 3/5 0,25 HRONICNI TRETMANI Leglo(konc. )( df=38) 315,99 4/5 1 ,ОО Tret. х Leglo (konc) 262,64 5/6 1 '18 (df=36) Greska (df=290) 221,88 Tretman(df=1) 360,70 1/4 1,20 Koncentracija(df=1) 265,14 2/3 0,59 AKUTNI- Tret. х Konc (df=1) 451,12 3/5 1,67 OPORAVAK TRETMANI Leglo(konc. )( df=37) 300,13 4/5 1 '11 Tret. х Leglo (konc) 269,44 5/6 1,29 (df=34) Greska (df=284) 209,16 Tretman(df=1) 26,51 1/4 0,09 Koncentracija(df=1) 740,37 2/3 2,44 HRONICNI- Tret. х Konc (df=1) 303,25 3/5 1 ,ОО OPORAVAK TRETMANI Leglo(konc. )( df=38) 266,27 4/5 0,88 Tret. х Leglo (konc) 302,99 5/6 1,52* (df=35) Greska (df=ЗOO) 198,75 **Р< 0,05 66 Rezиltati Tabela 1 З. Prosecпo kvadratпo odstиpaпie od sredпie vredпosti relativпe brziпe rasta (RGR) ротпоiепо sa 1000 (MS) и dvofaktorskoi aпalizi variiaпse pri razliCitim tretmaпima kadmiiиmom . Koпceпtraciia kadmiiиma (Cd) ie fiksiraпi faktor, а leglo (L) ie sfиcaiпi faktor. Efekat lzvor variranja df MS F р akutni Leglo(L) 17 20,660 0,868 0,6124 Kadmijum(Cd) 2 134,956 4,780 0,0148 LxCd 34 28,235 1 '186 0,2341 ·Gгeska 202 23,800 hronicni Leglo(L) 19 22,423 0,877 0,6116 Kadmijum(Cd) 2 70,745 - 2,442 О , 1005 LxCd 38 28,967 1,133 0,2836 Greska 235 25,558 oporavak С1 Leglo(L) 18 13,381 0,622 0,8807 Kadmijum(Cd) 2 56,650 2,238 0,1213 LxCd 36 25,310 1,176 0,2385 Greska 222 21,515 oporavak С2 Leglo(L) 18 33,960 1,539 0,0783 Kadmijum(Cd) 2 103,447 4,195 0,0230 LxCd 36 24,657 1 '117 0,3073 Greska 224 22,065 Tabela 14. Geпeticka variiaпsa (а~2}, srediпska variiaпsa (а(}) i heritabllпost и sirem smislи {h2±SE) za relativпи brziпи rasta и zavisпosti od tretmaпa kadmiiиmom . Tretmaпi: K-koпtrolпa 9rира, bez kadmiiиma; akиtпi efekat (KC1-tri dапа па Cl podfozi i KC2-tri dапа па С2 podfozi}; hroпicпi efekat {Cl-10 /-1-9 Cd/9 sиve podlo9e i С2-30 /-1-9 Cd/9 sиve podlo9e}; efekat oporavka {Cl K-tri dапа oporavka od Cl podlo9e i С2К- tri dапа oporavka od С2 podlo9e). tretman N а2 а(} h2 ±SE t к 20 -3,772 26,033 0,0000 0,0586 0,000 КС1 19 1,242 24,532 0,0964 О , 1871 0,515 КС2 19 1,754 28,531 . О , 1158 О , 1737 0,667 С1 20 2,954 23,360 0,2245 О , 1885 1 '191 С2 20 1,752 27,261 О, 1208 О , 1699 0,711 С1К 19 -0,688 22,285 0,0000 О , 1335 0,000 С2К 19 4,582 18,704 0,3935 0,2142 1,838 67 Rezultati Tabela 15. F vrednosti dobljene рогес1епјет genetickih varijansi cr g 2 za relativnu brzinu rasta {iznad dijagonale) i sredinskih varijansi crro 2 {ispod dijagonale) izmec1u razlicitih tretmana С2 КС1 КС2 С1К С2К к 3,037* 5,483*** 1,215 С 1 4,294** 1,551 С2 2,546* 2,616* КС1 1 '111 1,805 3,689** КС2 1,046 2,549 2,61 2* С1К 1,048 1,223 С2К 1,392 1,249 1,457 1,311 *Р< 01 05 **р< о 01 1 ***р< о 007 1 Tabela 16. Plasticnost {8/)1 heritabllnost plasticnosti {h/) i heritabllnost svojstva {h/ ) za relativnu brzinu rasta larvi gubara dobljeni iz dvofaktorske analize varijanse kod gubara gajenih и razliCitim sredinama1 pri akutnom1 hronicnom stresu i oporavku. efekat 8 2 h 2 1 h2 s akutni 1,0364 0,4593 0,0000 hronicni 1,0076 0,4826 0,0000 o~oravak С1 1,0846 0,5217 0,0000 oporavak С2 0,8990 0,4076 О , 1253 Т abela 17. Srednje vrednosti {Х) i stdndardne devijacije {SD) indeksa fenotipske plasticnosti relativne bгzine rasta С1 С2 efekat N (Х) ±SD N (Х) ±SD akutni 19 -20,520 30,895 19 -18,000 25,161 hronicni 20 -14,046 33,030 20 -16,325 25,253 OQoravak 19 -9,552 22,635 19 -18,002 20,884 68 Rezultati Tabela 18. Rezultati poreclenja srednjih vrednosti {Z, Vilkoksonov test} i standardnih devijacija (F test} indeksa fenotipske plasticnosti relativne brzine rasta Poredenje z р F р akutni С1 -akutni С2 О, 1089 0,9133 1,5077 0,3920 hronicniC1 -hronicni С2 О, 1493 0,8813 1,7108 0,2509 o~oravak С1 -o~oravak С2 0,6841 0,4939 1,1747 0,7364 hronicni С1 -akutni С1 0,6841 0,4939 1 '1430 0,7803 -o~oravak С1 0,6036 0,5461 2,1293 0,1152 hronicni С2 ·-akutni С2 0,0402 0,9679 1,0073 0,9911 -oporavak С2 0,3622 0,7172 1,4621 0,4250 69 Rezultati 4.2 KORELAC/JE IZМEDи RAZLICJТIH OSOBINA ADAPТIVNE VREDNOSТ/ Na koпtroli postoji samo јеdпа zпасајпа korelacija {geпeticka} i to izmedu ukupпog mortaliteta i mortaliteta prvog stupпja {tabela 7 9). Na graпici zпacaпosti је korelacija izmedu ukupпog mortaliteta i tгајапја prvog stupпja. Postoji иkирпо cetiri пegativпe korelacije ро dve geпeticke i feпotipske. Postoji samo јеdпа statisticki zпасајпа feпotipska korelacija па akutпom tretmaпu тапје koпceпtracije kadmijuma i to izmedu mase larvi i tгајапја razvica {tabela 20). lпteresaпtпo је da su sve korelacije {i feпotipske i geпeticke) пegativпe. Ј и toku akutпog tretmaпa С2 zпасајпа је ista feпotipska korelacija, izmedu mase larvi i trajc:mja razvica, kao i па КС1 {tabefa 2 7 ). Sve korelacije su пegatjvпe osim geпeticke korelacije izmedu tгајапја razvjca ј relativпe Ьгzјпе rasta, koja је Ьila pozitivпa па akutпom efektu С1. и toku оЬа hгопiспа tгetmaпa zпасајпа је geпeticka koгelacija izmedu ukupпog mortaliteta i smrtпosti prvog stupпja {tabefe 22). Na Cl {1 О J.Lg/g) suve hгапе је zпасајпа i пegativпa feпotipska korelacjja izmedu mase larve i tгајапја razvica. Sve feпotipske koгelacije su пegativпe, dok postoji sest пegativпih geпetickih korelacija {tri su izmedu mase i drugih osoblпa fjtпesa}, tabela . Na hгопiспот stresu па vecoj koпceпtraciji kadmijuma osim паргеd pomeпute korelacije zпасајпе su jos dve geпeticke: izmedu tгајапја razvica i tгајапја prvog stupпja ј tгајапја razvjca i relativпe Ьгziпе rasta {tabela 23). и odпosu па С1 postoji maпji Ьгој пegativпih koгefacija: ро dve feпotipske i geпeticke. и toku oporavka od Cl postoje dve feпotipske, statisticki zпасајпе korelacije izmedu mase larve i tгајапја razvica {пegativпa} i relativпe Ьгziпе rasta i mase larvi {pozitivпa}, tabela 24. Na graпici zпacajпosti је geпeticka korelacija izmedu tгајапја razvica i mase {пegativпa}. Dve feпofjpske i јеdпа geпeticka korelacija su пegativпe. 70 Rezultati Т abela 25 predstavlia korelaciie izmec/u razliCitih osoblna adaptivne vrednosti pri oporavku od 30 ~g Cd/ g suve hrane. lsta fenotipska korelaciia ie znacaina па оЬа oporavka i to: izmec!u mase larvi i traiania razvica {negativna vrednost). Na granici znacainosti ie pozitivna geneticka korelaciia izmec!u mase i relativne brzine rasta. Ро iedna fenotipska i geneticka korelaciia su pozitivne. 71 Rezultati Tabela 19. Geneticke korelaciie izmeclu razliCitih osoblna (iznad diiagonale) fenotipske korelaciie (ispod diiagonale} па kontroli Masa З. Mortalitet Trajanje Trajanje dana 4. Ukupan к prvog prvog RGR razvica larvenog mortalitet stupnja stuphja stupnja Trajanje -0,2597 0,1757 О, 1387 0,3467 -0,0151 razvica Masa З. dana 4. -0,1.171 0,0741 -0,0340 0,2558 0,0340 larvenog stupnja Ukupan 0,7947*** 0,4403+ -0,0427 mortalitet Mortalitet prvog 0,3481 0,1040 stupnja Trajanje prvog О, 1173 stupnja RGR -0,0388 0,1044 +р< 0,1 ***р< о 007 1 72 Rezultatj Tabela 20. Genetjcke korelacjje jzтedu razfjCitjh osoblna (jzпad djjagonale} ј fenotjpske korelacjje (jspod djjagonale) prj akutnom efektu kadтjjuma od 7 О Ј.!9 Cd/ g suve hrane Trajanje Masa З. КС1 razvica dana 4. RGR Trajanje -0, 15З2 razvica Masa З. dana 4. -0,1900 stu RGR -0,0466 •• Р< 0,07 Tabela 27. Genetjcke korelacjje jzтedu razfjCitjh osoblna (jzпad djjagonale) ј fenotjpske korelacjje (jspod djjagonale) prj akutnom efektu kadтjjuma od 30 Ј.!9 Cd/ g suve hrane Trajanje Masa З . КС2 dana 4. RGR razvica stupnja Trajanje razvica -0,2657 0,048З Masa З. dana 4. -0,2447 RGR -0,0746 • Р< 0,05 73 Rezultati Tabela 22. Geneticke korelaciie izmeclu razliCitih osoblna (iznad diiagonale) i fenotipske korelaciie {ispod diiagonale) pri hronicnom efektu kadmiiuma od 7 О ~g Cd/ g suve hrane Masa З. Mortalitet Trajanje С1 Trajanje dana 4. Ukupan RGR razvica larvenog mortalitet prvog prvog stupnja stupnja stupnja Trajanje -0,2757 0,1537 0,0192 0,3895 -0,1190 razvica Masa З. dana 4. -0,2091 * 0,1388 -0,0248 -0,1728 -0,3026 larvenog stupnja Ukupan 0,9038*** -0,0508 0,0490 mortalitet Mortalitet prvog 0,0400 0,0521 stupnja Trajanje 0,1751 prvog stupnja RGR -0,1651 -0,1209 *Р< 0,05 ***р< о 007 1 74 Rezultati Tabela 23. Geneticke korelacije izmeclu razliCitih osoblna {iznad dijagonale) 1 fenotipske korelacije {ispod dijagonale) pri hronicnom efektu kadmijuma od 30 ~g Cd / g suve hrane С2 Trajanje razvica Masa З. dana 4. larvenog stupnja Ukupan mortalitet Mortalitet prvog stupnja Trajanje prvog stupnja RGR Trajanje razvica -0,1125 О, 1119 Masa З. dana 4. larvenog stupnja 0,0479 -0,1109 Ukupan mortalitet 0,3538 -0,0705 Mortalitet prvog stupnja 0,4185 -0,0071 0,9305*** +Р< О, 1 *Р< 0,05 **Р< 0,01 ***Р< 0,001 75 Trajanje prvog stupnja 0,6413** 0,0619 0,3251 0,4525 RGR 0,5184* 0,0004 О, 1920 0,2025 0,3126 Rezultafj Tabela 24. Genefjcke korelacjje jzтedu razfjCitjh osoblna (jzпad djjagonale) ј fenofjpske korelacjje (jspod djjagonale) prj oporavku od efekta manje koncentracjje kadтjjuma Trajanje Masa З. С1К dana 4. RGR razvica stupnja Trajanje -О , З9З6+ О , 1649 razvica Masa З . -0,2251 * dana 4. О , 1602 RGR -О ,ОЗ76 0,2225* +Р< О, 7 *Р< 0,05 Tabela 25. Genefjcke korelacjje jzтedu razfjCitjh osoblna (jzпad djjagonale} ј fenotjpske korelacjje (jspod djjagonale} prj oporavku od efekta vece koncentracjje kadтjjuma С2К Trajanje RGR Trajanje -0,1209 razvica Masa З . -0,2215* dana 4. 0,4289+ RGR -0,0861 + Р< О, 7 *Р<0,05 76 Rezultati 4.3 IOREDENJE KORELACIJA OSOBINA ADAPТIVNE VREDNOSТIIZМEDU RAZLICIТIH ТRЕТМАNА Tabela 26 пе pokazuje пi jedпu zпасајпи razliku izmedu korelacija. Spirmaпov koeficijeпt је statisticki zпасајап izmedu koпtrole i hroпicпog efekta па С2, sto govori о slicпosti korelacioпih struktura. Tabela 26. t vrec;}пosti dobljeпe poredeпjem korelacija izmedu osoblпa fitпesa па razliCitim tretmaпima kadmijumom.{Traj. razv-trajaпje razvica; masa- masa larvi cetvrtog stupпja; uk. mort- иkирап mortalitet; mortal 1.- mortalitet prvog stupпja; trajaпje 1.- trajaпje prvog stupпja; RGR- relativпa brziпa rasta} -------- К-С1 К-С2 К-КС1 К-КС2 К-С1К Traj.razv.- masa 0,0503 0,9147 0,2131 0,0185 0,4314 uk. mort. 0,0629 0,5349 mortal. 1. 0,3350 0,8522 trajanje1. О, 1378 1 '1 093 RGR 0,3046 1 '7179 0,4000 0,1821 0,5211 Masa- uk. mort. О, 1822 0,4030 mortal. 1. 0,0256 0,0749 trajanje1. 1,2136 0,5555 RGR 1,0099 0,0980 0,6498 0,8147 0,3663 Uk. mort- mortal. 1. 1 '1367 1,6084 trajanje1. 1,4565 0,3764 RGR 0,2553 0,6598 Mortal .1.- trajanje1. 0,8994 0,3466 RGR О , 1453 0,2809 Trajanje 1.- RGR О, 1644 0,5720 SPIRMANOV 0,436 0,632* KOEFICIJENT ------- ------- ------- *Р< 0,05, Spirmaпov koeficijeпt пiје izracuпat tamo gde је broj korelacija koje se porede maпji od 5 77 К-С2К О , 1306 0,3055 1,2188 ------- Rezиltati 4.4 ENZIMI UKUиCENI и VARENJE PROTEINA 4.4. 1 UKUPNA AКТIVNOST PROTEAZA Na sfjcj 7 koja predstavlja sredпje vredпostj specjfjcпe aktjvпostj proteaza kao i liп ije пorme reakcjje, vidjтo da se i па akиtпom ј hroпjcпom tretmaпи aktjvпost тепја па jstj паСiп {sfjke 7 А, В). LSD testom је иtvrcleпo da se samo па vecoj koпceпtracjjj kadтjjиma {КС2 ј С2) aktivпost zпасајпо sтапјије и оdпоsи па koпtrolи. и tokи oporavka od Cl пе postoje zпасајпе razfjke и оdпоsи па koпtrolи i hroпicпi efekat, dok је aktjvпost posle oporavka па С2 zпасајпо тапја od aktjvпostj па koпtroli {slike 7С, D). Liпjje пorme reakcjje sи predstavljeпe sfjkama 7A'-D' .U tokи akиtпog efekta se sтапјије aktjvпost proteaza kod 15 legala, а па hгопјспот stresи ј oporavkи od С2 kod 17, od иkирпо 20 legala па koпtroli. Dvofaktorska aпafjza varijaпse {tabela 27) pokazиje da porecleпjem akиtпog i hroпicпog tretmaпa, akиtпog i oporavka, kao ј hroпjcпog ј oporavka, koпceпtracjja kadтjjиma иtјсе па рrотепи specjfjcпe aktjvпostj proteaze {Р < 0,5; Р < 0,001 ). lz ove aпafjze moiemo zakljиCitj da aktjvпost proteaza moie Ьitj osetfjjv parametar па prjsиstvo kadтjjиma и hraпj. Do slicпjh zkljиcaka smo dosfj ј и jedпofaktorskoj aпalizj varjjaпse {tabela 28). Каdтјјит иtјсе па aktjvпost proteaze па akиtпom, hroпicпom tretmaпи i oporavkи od С2 {tamo gde postoji zпасајпо sтапјепје sredпje vredпostj aktivпosti proteaza, slike 78, D ). Pad varijaпsj specjfjcпe aktjvпostj proteaza јzтесlи razfjCitjh eksperjтeпtafпjh grиpa је zпасајап izmeclи sledeeih tretmaпa: К i С1 , С2, dok је varjjaпsa и tokи oporavka sa С2 zпасајпо тапја od varjjaпsj па koпtrofj, zatim С1 , С2, КС1 i oporavka sa С1 . Na graпici zпacajпostj sи F vredпostj izmeclи: С1 i КС1 , С2 i КС1 , КС1 i КС2, КС2 i С1 К1 КС2 i С2К {tabela 29). Sredпje vredпostj jпdeksa feпotjpske plastjcпostj aktjvпostj proteaza prj svjт tretmaпjтa јтаји pozjtjvпe vredпostj {tabela 30). 78 Rezиltafj Utvrc!eпo ie da ie plasfjcпost maпia, а varjiabllпost plasfjcпosfj veca, рп hгопјспот tretmaпи maпie koпceпtracjie kadтjiиma ј oporavkи od Cl, пеgо па jsfjт tretmaпjтa па vecoi kопсепtгасф kadтjiиma. Ргј hгопјспот efektи kadтjiиma па С2, plasfjcпost ie maпia пеgо па oporavkи od jsfe koпceпtracjie metala, dok ie varjiabllпost plasfjcпostj veca и tokи dиgotraiпog efekta С2 пеgо па kratkotraiпom tretmaпи jsfe koпceпtracjie kadтjiиma {tabela З 1 ). Zakliиcak ie da sи па maпioi kопсепtгасф kadтjiиma {Cl) vredпostj jпdeksa feпofjpske plasfjcпosfj maпie пеgо па С2, dok ie па Cl veca staпdardпa devjiacjia jпdeksa plasfjcпosfj и оdпоsи па С2. lzmeclи 30 ј 64 kDa elektroforetskj ie detektovan vefjkj broi јzоfогтј proteaza. Broi ј prosvetlieпost elektroforetskjh traka se meпia и zavjsпosfj od vrste tretmaпa (sfjka 8). Zпасаiпо ie da se и prva dva legla па koпtrofj veoma slabo vjde trake jspod 36 kDa, dok kod svjh drиgjh tretmaпa опе postaiи vjdfijvjie {od 30 - 36 kDa}. Оsјт toga, postoij razfjka и prosvet/ieпosfj jstjh јzоfогтј kod jstjh legala па razfjCitjт tretmaпjтa {Cl , С2, КС1 ј КС2). lпteresaпtпo ie da пaivjdfijvjia traka kod svjh legala, па svjт tretmaпjтa јта molekиlskи masи od priЬfjiпo 50 kDa ј da se пiепа prosvet/ieпost razfjkиie јzтес!и razfjCith legala и оkvјги iedпog tretmaпa, kao ј и оkvјги iedпog legla ргј razfjCifjт efektjтa kadmjiиma. 79 Rezultati " ~ :!!џ g_ ~ ~>О ~ (/) 1,5 к А а о s о к в 3,0 I2.s е Q. "' Е ~2.0 ~ 1, к с 3,0 а 1,5 к ~ ь г----=-- КС1 КС2 аЬ __1<_ С1 С2 С1 С1К ь ь С2 С2К Akutni tretman f= 3,39 Р= 0,04 А' Hronicni fretman f= 6,42 Р= 0,00 В' Oporavak od lOflgCd/ g F= 2,11 Р=0,13 с Oporavak od 30flgCd/ g F=14,67 Р= 0,00 о а ~2 ~о 1,8 (О 1,5 с i 1,4 01 1,2 Е ~ 1,0 ~ 0,8 0,6 0,4 0,2 2,2 , 2,0 1,8 ~ 1,6 1,4 . ., "[ 1,2 ~ 1,0 ~ 0,8 ~ 0,6 0,4 0,2 0,0 2.0 ~ ~ 1,5 а. О> ~ 1,0 ~ 0,5 2,0 ~ 1,5 l Е 1 .о ~ ~ (/) 0,5 к С1 С2 О,О '------К;>----~С2;----С~207К- Slika 7. Specificna aktivnost proteaza larvi gubara {Х ± SE) {А, В, С, D) i liniie norme reakciie (А', В', С', D' Ј 80 Rezultati Tabela 27. Dvofaktorska ANOVA za specificnu aktivnost proteaza izmedu razliCitih tretmana i koncentracija kadmijuma Рагеdепје lzvar df MSIII F р variraпja 1 Tretmaп 0,062 1,21 0,289 1 AKUTNI- Капеепtгаеiја 0,260 5,10 0,027 HRONICNI TRETMANI 1 Tret. Х Капе. 0,001 0,01 0,906 Greska 73 0,051 Tretmaп 1 0,134 2,38 0,127 AKUTNI- Капеепtгаеiја 1 0,778 13,85 0,000 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Капе. 1 0,124 2,20 0,142 Greska 71 0,056 Tretmaп 1 0,015 0,34 0,562 HRONICNI- Капеепtгаеiја 1 0,761 16,96 0,000 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Капе. 1 0,149 3,31 0,073 Greska 71 0,045 81 Rezultati Tabela 28. Prosecno kvadratno odstupanje od srednje vrednosti specificne aktivnosti proteaza {MS) и jednofaktorskoj analizi varijanse kod larvi gubara izloienih razliCitim tretmanima kdmijumom. Efekat lzvor df MS F р variranja akutni [Cd] 2 0,068 3,393 0,041 greska 54 0,020 hronicni [Cd] 2 0,120 6,422 0,003 greska 57 0,019 oporavak С1 [Cd] 2 0,038 2,106 О , 131 greska 56 0,018 oporavak С2 [Cd] 2 0,253 14,670 0,000 greska 56 0,017 Т abela 29. F vrednosti doЬijene poredenjem varijansi specificne aktivnosti proteaza izmedu razliCitih eksperimentalnih grupa к С1 С2 КС1 КС2 С1К С2К к З , 1081* 3,0968* 1,3564 3,5457** 1,4672 8,5435*** С1 1,0037 2,2915+ 1 '1408 2,1185 2,7488* С2 2,2832+ 1 '1 450 2,1108 2,7588* КС1 2,6141+ 1,0817 6,2988*** КС2 2,4167+ 2,4095+ С1К 5,8232*** + Р<О, 7 * PО ~ "''·' к КС1 КС2 А .а ~ ь с 5 .а ·' ,О к С1 С2 в а ,О а ~ ,-----=----- ,5 ,О ,5 ,О к С1 С1К с 3,0 ~ ь с 1,0 к С2 С2К D Akutni tretman F= 6,97 Р= 0,00 А' Hronicni tretman F= 8,47 Р= 0,00 В' Oporavak od 1 OџgCd/ g F= 10,80 Р= 0,00 с Oporavak od ЗОџgСd/ g F= 29,19 Р= 0,00 [) 1,6 1,4 I 1.2 о ~ 1,0 Е ~ QB ~ Q6 "' 0,4 0,2 к КС1 КС2 1,6 1,4 w 1.2 i 1,0 ~ 0,8 ~ 0,6 ~ 0,4 "' 0,2 0,0 к С1 С2 1,6 1,4 f1.2 g_ 1.о §' 0,8 ;;:- 0,6 :5 ()ј 0,4 0,2 0,0 к С1 ---- -сг. - - 1,6 '""' 1,4 ~ 1,2 ·;;; i 1,0 ~ 0,8 :1 ~ 0,6 "' 0,4 0,2 0,0 к С2 С2К 5/ika 11. Specificna aktivnost leucin aminopeptidaze larvi gubara {Х ± SE) (А, В, С, D) linije norme reakcije (А', В', С' , fY) 92 Rezultati Т abela 37. Dvofaktorska ANOVA za specificnu aktivnost leucin aminopeptidaze izmedu razliCitih tretmana i koncentracija kadmijuma Poreoenje lzvor df MSIII F р variranja 1 Tretman 0,177 3,86 0,053 1 AKUTNI- Koncentracija 0,165 3,61 0,061 HRONICNI TRETMANI 1 Tret. Х Konc. О, 112 2,43 0,123 Greska 74 0,046 Tretman 1 0,177 4,56 0,036 AKUTNI- Koncentracija 1 0,882 22,71 0,000 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Konc. 1 1,021 26,28 0,000 Greska 71 0,039 Tretman 1 0,000 0,00 0,968 HRONICNI- Koncentracija 1 0,383 9,57 0,003 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Konc. 1 1,836 45,89 0,000 Greska 73 0,040 93 Rezultati Tabela 38. Prosecno kvadratno odstupanje od srednje vrednosti specificne aktivnosti leucin aminopeptidaze (MS) и jedno faktorskoj analizi varijanse ·kod larvi gubara iz loi enih razliCitim tretmanima kdmijumom. Efekat lzvor df MS F р variranja akutni [Cd] 2 0,093 6,974 0,002 greska 55 0,013 hronicni [Cd] 2 0,395 8,471 0,001 greska 57 0,047 oporavak С1 [Cd] 2 0,444 10,804 0,000 greska 56 0,041 oporavak С2 [Cd] 2 0,595 29,193 0,000 greska 55 0,020 Tabela 39. F vrednosti .dobljene poredenjem varijansi specificne aktivnosfi feucin . aminopeptidaze izmedu razliCitih eksperimentalnih grupa С1 С2 КС1 КС2 С1К С2К к 1,9161 1,6805 2,5614+ 1,6977 8,9557*** С1 1,0312 1 '1757 1,2963 1 ' 1638 4,5326** С2 1 '1402 1,3368 1 ' 1286 4,6740** КС1 1,5241 1,0102 5,3291 ** КС2 1,5087 3,4965* С1К 5,2751 ** 94 Rezultati ТаЬеlа 40. Sreclnje vreclnosti {Х) i standardne devijacije (SD) indeksa fenotipske plasticnosti specificne aktivnosti leucin aminopeptidaze. С1 С2 efekat N (Х) ±SD N (Х) ±SD akutni 19 23,225 23,433 19 16,273 28,598 hronicni 20 38,563 27,588 20 23,780 21,105 oporavak 19 5,843 28,563 18 51,426 15,169 ТаЬе/а 41. Rezultati poreclenja srednjih vreclnosti {Z/ Vilkoksonov test) i standardnih devijacija (F test) indeksa fenotipske plasticnosti specificne aktivnosti leucin aminopeptidaze. Poredenje z р F р akutni С1 -akutni С2 0,2831 0,7771 1,4894 0,4061 hronicniC1 -hronicni С2 2,9493 0,0032 1,7087 0,2519 oporavak С1 -oporavak С2 3,7236 0,0002 3,5456 0,0120 hronicni С1 -akutni С1 3,1389 0,0017 1,3861 0,4929 -oporavak С1 3,7425 0,0002 1,0719 0,8795 hronicni С2 -akutni С2 0,3622 0,7172 1,8361 О, 1982 -oporavak С2 3,2881 0,0010 1,9358 О, 1768 С2 КС1 КС2 СЈК Slika 12.. Zimogramska detekcija leucin-aminopeptidaze nativnom PAGE elektroforezom 95 С2К Rezиltati 4.5 ALКALNE FOSFATAZE Na slici 1 З se vide tri osnovne izoforme alkalnih fosfataza и infervalи od 50 do 98kDa. Jasno sи vidl;ive razlike и ekspresiji izoformi izmedи razliCitih tretmana. Slika 1 З. Elektroforetski profili izoformi alkalnih fosfataza larvi gиbara cetvrtog stиpnja pri razliCitim efektima kadmijиma, dobljeni nativnom poliakrilamidnom elektroforezom. 96 Rezиltati 4.6 ENZIMI UKUUCENI и VARENJE иGUENIH HIDRATA 4.6. 1 ALFA GLIKOZIDAZA 5/ika 14 prikazиie рготепи sredпie vredпosti aktivпosti a -glikozidaze, kao i variiabllпost odgovora legla па razliCitim tretmaпima (/iпiie погте reakciie). и tokи akиtпog efekta dolazi do zпacaiпog pada aktivпosti alfa glikozidaze samo па vecoi koпceпtraciii kadmiiиma {aktivпost eпzima se smaпiиie kod 14 od иkирпо 20 legala па koпtroli}, do"k se и tokи hroпicпog stresa sredпia vredпost specificпih aktivпosti ovog eпzima zпасаiпо smaпiиie samo pri maпioi koпceпtraciii metala od 1 О 1-1gCd/ g sиve hгапе ( 17 legala sa smaпieпom aktivпoscи od 20 koпtrolпih). Specificпa aktivпost и tokи oporavka od С 7 se vraca па koпtrolпi пivo, dok ie и tokи oporavka od С2 aktivпost zпасаiпо maпia od koпtrole {ireverzibllпo smaпieпie}, sto se vidi па liпiiama погте reakciia {slika 7 4С, а). a-glikozidaze pokazиiи velikи osetliivost и zavisпosti od koпceпtraciie i tipa tretmaпa metalom. Poredeпiem akиtпog efekta i oporavka {dvofaktorska aпaliza variiaпse, tabela 42) иtvrdeпo ie da samo koпceпtraciia metala иtice па рготепи aktivпosti a-glikozidaze (Р < ОД5}, dok ie iпterakciia tretmaпa i koпceпtraciie kadmiiиma kliиcaп faktor и promeпi aktivпosti eпzima izmedи hroпicпog tretmaпa i oporavka {Р< 0,05). Т abela 43 predstavlia vredпost prosecпog kvadratпog odstиpaпia od sredпie vredпosti specificпih aktivпosti alfa glikozidaze и iedпofaktorskoi aпalizi variiaпse. Kadmiiиm zпасаiпо иtice па aktivпost posmatraпog eпzima и tokи svih tretmaпa {akиtпog, hroпicпog i оЬа oporavka, Р< ОД1 }. F test и poredeпiи variiaпsi specificпih aktivпosti g/ikozidaza pokazиie zпасаiпе razlike izmedи slede6h eksperimeпtalпih grиpa: koпtrole i КС2 i koпtrole i С2К {tabela 44). и оЬа slиcaia variiaпsa па koпtroli ie maпia, sto se moie videti i па liпiiama погте reakciie. Na graпici zпacaiпosti ie F vredпost izmedи koпtrole i С1 (K& ii! ~· С) о са 0.2 1,0 ~0,8 . ., о !о_ 0,6 О> Е ~0,4 С) о ()ј 0,2 0,0 ~ 0,8 ~ 0.. 0,6 О> Е ~0,4 С) о С3 0,2 аЬ к КС1 КС2 а ~ к С1 С2 т а т ь к С1 С1К вЬ Akutni frefman F= 5,90 Р= 0,00 А' Hronicni frefman F= 6,04 Р= 0,00 В' Oporavak od lOJ.lgCd/ g F= 5,35 Р= 0,01 с Oporavak od ЗOJ.lgCd/ g F= 5,26 Р= 0,01 01 1.6 1,4 w 1.2 ".!! g_ 1,0 О> Е o.s Ој (; 0,6 о ~ 0.4 0,2 QO 1,8 1,6 1, 4 .. -~ 1,2 о 5. 1,0 ~ QB (? 0,6 о ~ 0,4 0,2 0,0 1,6 1,4 ~ 1,2 . ., g_ 1,0 ~ 0,8 ~ С) 0,6 о с:; 0,4 0,2 0,0 1,8 1,6 w 1,4 1'·2 cn 1,0 ~ 0,8 ~ 0,6 ()ј 0,4 к КС1 КС2 к С1 С1К 0,2 о.о'-----:7к--~с~2 -----,с""2=к- Slika 14. Specificna aktivnost alfa glikozidaze larvi gubara (Х ± SE) {А, В, С, D) i liniie norme reakciie (А' , В', С', D') 99 Rezultati Tabela 42. Dvofaktorska ANOVA za specificnu aktivnost alfa g/ikozidaze izmedu razliCitih tretmana i koncentracija kadmijuma Рагеоепје lzvar df MSIII F р variraпja 1 Tretmaп 0,027 0,22 0,641 1 AKUTNI- Капеепtгаеiја 0,001 0,00 0,945 HRONiёNI TRETMANI 1 Tret. Х Капе. 0,457 3,77 0,056 Greska 74 О, 121 Tretmaп 1 0,199 1,51 0,224 AKUTNI- Капеепtгаеiја 1 0,660 5,00 0,028 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Капе. 1 0,028 0,22 0,644 Greska 72 0,132 Tretmaп 1 0,083 0,71 0,402 HRONiёNI- Капеепtгаеiја 1 0,021 0,18 0,670 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Капе. 1 0,717 6,10 0,016 Greska 74 О, 117 100 Rezultati Tabela 43. Prosecno kvadratno odstupanje od srednje vrednosti specificne aktivnosti alfa-glukozidaze (MS) и jednofaktorskoj analizi varijanse kod larvi gubara izloienih razliCitim tretmanima kdmijumom. Efekat lzvor df MS F р variranja akutni [Cd] 2 0,371 5,905 0,005 greska 55 0,063 hronicni • [Cd] 2 0,304 6,040 0,004 greska 57 0,050 oporavak С1 [Cd] 2 0,320 5,348 0,007 greska 56 0,060 oporavak С2 [Cd] 2 0,209 5,261 0,008 greska 56 0,040 Tabela 44. F vrednosti dobljene poredenjem varijansi specificne aktivnosti alfa- . glukozidaze izmedu razliCitih eksperimentalnih grupa С1 С2 КС1 КС2 С1К С2К к 2,5223+ 1,3856 2,0190 2,9297* 1,9601 2,7056* С1 1,8204 1,2493 1,1615 1,2868 1,0727 С2 1,4571 2,1144 1,4146 1,9526 КС1 1,4511 1,0300 1,3401 КС2 1,4947 1,0828 С1К 1,3803 + Р<О, 7 * Р<0,05 101 Rezultati Tabela 45. Srednje vrednosti {Х) i standardne devijacije {SD) indeksa fenotipske plasticnosti specificne aktivnosti alfa-glukozidaze С1 С2 efekat N (Х) ±SD N (Х) ±SD akutni 19 20,436 32,547 19 34,031 36,882 hronicni 20 31 '1 33 37,298 20 15,506 21,225 oporavak 19 4,125 33,126 19 23,560 42,820 Tabela 46. Rezultati porecfenja srednjih vrednosti {Z, Vilkoksonov test) i standardnih devijacija {F test) indeksa fenotipske plasticnosti specificne aktivnosti alfa- glukozidaze Poreдenje z р F р akutni С1 -akutni С2 1,7202 0,0854 1,2842 0,6013 hronicniC1 -hronicni С2 2,2026 0,0276 3,0881 0,0180 oporavak С1 -oporavak С2 1,9719 0,0486 1,6709 0,2854 hronicni С1 -akutni С1 0,8451 0,3981 1,3133 0,5672 -oporavak С1 3,2596 0,0011 1,2678 0,6186 hronicni С2 :-akutni С2 1,3280 0,1842 3,0196 0,0212 -oporavak С2 0,8853 0,3760 4,0701 0,0039 к Cl С2 КСЈ КС2 СЈК С2К Slika 7 5. Zimogramski profi/i alfa-glikozidaze razdvojeni nativnom poliakrilamidnom efektroforezom. 102 Rezultati 5/ika 16. lzoforme alfa g/ikozidaze velike molekulske mase detektovane samo па kontroli i hronicnim tretmanima. 103 Rezиftati 4.6.2 ВЕТА GLJKOZIDAZA Sreclп;e vredпosti specificпe aktivпosti beta glikozidaze se пе razlikи;и zпаса;по od koпtrolпe vreclпosti и tokи akиtпog i hroпicпog stresa, kao пi и tokи oporavka od С2 {slike 178, D). Samo se aktivпost и tokи oporavka od С1 zпаса;по razlikи;e od hroпicпog efekta iste koпceпtraciie kadmiiиma {slika 17С). Plasticпost odgovora ро leg/ima ie predstavl;eпa liпiiama погте reakciie, sfike 17 А' - D' . Porecleп;em akиtпog i hroпicпog tretmaпa sa oporavkom и dvofaktorskoi aпalizi variiaпse иtvrcleпo ;е da tip tretmaпa metalom и оЬа sfиca;a иtice па рrотепи aktivпosti p-g/ikozidaze, Р< 0,05, {tabela 47). Zпаса;ап иticai kadmiiиma па aktivпost beta glikozidaze и tokи oporavka od С1 ;е potvrcleп i ;edпofaktorskom aпalizom variiaпse {tabela 48). Na svim ostalim tretmaпima {аkиtпот, hroпicпom i oporavkи od С2), kadmiiиm пе иtice zпаса;по па рготепи aktivпosti eпzima. Zпаса;пе F vredпosti sи dobl;eпe porecleп;em variiaпsi specificпe aktivпosti beta glikozidaze izmeclи sfecletih eksperimeпtalпih grиpa: К i С2, С1 i С2, С1 i С1 К {С2>К i С1 К>С1 }, С2 i КС2 i С2 i С2К {па С2 ;е veca variiaпsa пеgо па КС2 i С2К). И tokи оЬа oporavka {С1 К i С2К) povecava se variiaпsa и оdпоsи па koпtrofи (slika 49). И tabeli 50 sи date sreclпie vreclпosti iпdeksa feпotipske plasticпosti sa staпdardпim deviiaciiama. Negativпa sreclпia vredпost feпotipske plasticпosti ;е dobl;eпa samo па oporavkи od С1 . И tokи dиgotra;пog tretmaпa тап;е koпceпtraciie kadmiiиma plasticпost ;е veca пеgо и tokи oporavka od iste koпceпtraciie kadmiiиma, dok ;е variiabllпost plasticпosti izmeclи istih tretmaпa veca па oporavkи od С 1. Иtvrcleпo ie i da ie variiabllпost veca и tokи oporavka od С1 пеgо па oporavkи od С2 {tabela 51 }. Nativпom efektroforezom detektovaпa ie iedпa forma beta g/ikozidaze, mofekиfske mase oko 36 kDa {slika 18). lпteпzitet prosvetf;eпosti traka se razlikи;e 104 Rezultati kod istih legala па razliCitim tretmanima, kao i izmedu razliCitih legala и okviru istih tretmana. 105 Rezultati t т _i "" ·"" "" 002 к КС1 КС2 А t r "" т ·"" ·"" 002 к С1 С2 в .012 t .010 1 .008 ~ .006 .004 .002 о. к С1 С1К с о. т f t 008 006 004 002 о. ()()() к С2 С2К D Akutni tretman 0.015r 0.014 0.013 ~-'.:.___.------------------ ·--.. "' 0.012 <:' ,, -~ 0.011 '-, '"""' g_ 0.010 ·-.. ,~'\-, --~ ~ 0.009 "~ '~ 0.006 F= 1,00 С) 0.007 ~ Р= 0,37 ~ 0.006 0.005 0.004 0.003 к КС1 КС2 А' Hronicni tretman F= 0,95 Р= 0,39 В' Oporavak od 10!J,gCd/ g F=3J5 Р= 0,03 с Oporavak od 30!J,gCd/ g F= 1,37 Р= 0,26 D' 0.0150 0.0125 I 0.0100 g_ О) 0.0075 ~ g 0 .0050 <( (/) 0.0025 0.0000 0.018 0.016 ~ 0.014 ·~ i 0.012 ~ 0.010 ~ 0.008 ~ 0.006 <3 0.004 0.002 к С1 С2 о. ооо '----------,к-;-------;;;:С71 -------::С:-:-1 :-=-К 0.020 O.Q18 O.Q16 l 0.014 . ., R 0.012 ~ 0.010 ~ 0.006 & 0.004 0.002 / 0 .008 1 о.ооо '----------,к;-;------....,с=-2 --=с2""к.,._ 5/ika 17. Specificna aktivnost beta glikozidaze larvi gubara {Х ± SE) (А, В, · С, D) linije norme reakcije (А', В', С', D') 106 Rezultati Tabela 47. Dvofaktorska ANOVA za specificnu aktivnost beta g/ikozidaze izmedu razliCitih tretmana i koncentraciia kadmiiuma Poredenje lzvor df MSIIIx1 о-5 F р variranja 1 Tretman 0,125 0,08 0,773 1 AKUTNI- Koncentracija 0,367 0,25 0,622 HRONICNI TRETMANI 1 Tret. Х Konc. 0,000 0,00 0,992 Greska 64 1,497 Tretman 1 7,632 5,87 0,018 AKUTNI- Koncentracija 1 1,302 1,00 0,321 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Konc. 1 З, 141 2,41 0,125 Greska 67 1,301 Tretman 1 9,502 5,93 0,018 HRONICNI- Koncentracija 1 1,295 0,81 0,372 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Konc. 1 3,014 1,88 О, 175 Greska 65 1,603 107 Rezultati Tabela 48. Prosecno kvadratno odstupanie od srednie vrednosti specificne aktivnosti beta-glikozidaze {MS) и iednofaktorskoi analizi variianse kod larvi gubara izloienih razliCitim tretmanima kdmiiumom. Efekat lzvor df MS F р variranja akutni [Cd] 2 0,033 1,003 0,374 greska 50 0,033 hronicni [Cd] 2 0,040 0,952 0,393 greska 47 0,042 oporavak С1 [Cd] 2 0,134 3,755 0,030 greska 50 0,036 oporavak С2 [Cd] 2 0,055 1,366 0,265 greska 47 0,040 Tabela 49. F vtednosti dobliene poredeniem variiansi specificne aktivnosti beta- glikozidaze izmedu razliCitih eksperimentalnih grupa С1 С2 КС1 КС2 С1К С2К к 1,4615 3,3649* 1,4975 1 '1588 1,9201 1,0900 С1 4,9179** 2,1886 1,6936 2,8063* 1,5931 С2 2,2470 2,9038* 1,7525 3,0871* КС1 1,2923 1,2822 1,3738 КС2 1,6570 1,0631 С1К 1,7615 • Р<0,05 •• Р<0,01 108 Rezuftatj Tabela 50. Srednje vrednosfj {Х) ј standardne devjjacjje {SD) jпdeksa fenotjpske plastjcпostj specjfjcпe aktjvпosfj beta-gfjkozjdaze С1 С2 efekat N (Х) ±SD N (Х) ±SD akutni 14 29,101 19,629 16 24,162 25,899 hronicni 15 22,884 26,709 14 22,247 34,892 oporavak 16 -16,323 60,232 14 10,357 23,508 Tabela 51. Rezultatj poredenja sredпjjh vrednostj {Z, Vjfkoksonov test) ј standardпjh devjjacjja {F test) jпdeksa fenotjpske plastjcпostj specjfjcпe aktjvпostj beta- gfjkozjdaze Poredenje Z Р F Р akutni С1 -akutni С2 0,4080 0,6832 1,7410 0,3218 hronicniC1 -hronicni С2 0,2446 0,8068 1,7067 0,3332 oporavak С1 -oporavak С2 0,9730 0,3305 6,5647 0,0015 hronicni С1 -akutni С1 1,0133 0,3109 1,8515 0,2753 -oporavak С1 2,9191 0,0035 5,0856 0,0041 hronicni С2 -akutni С2 0,5241 0,6002 1,8150 0,2690 -oporavak С2 1,4226 О, 1549 2,2030 0,1677 50 36 30 к С1 С2 КС1 КС2 СЈК С2К Sfjka 7 В. Zjтogramska detekcjja natjvпom efektroforezom beta gfjkozjdaze srednjeg creva larvj gubara cetvrtog larvenog stupnja, prj razfjCifjт tretmaпjтa kadтjjumom. 109 Rezиltati 4.7 ENZIMI DEТOKSIF/КACIJE 4.7. 1 ESTERAZE Na slikama 19А i 198 se jasno vidi da и tokи akиtпog i hroпicпog tretmaпa esteraze imajи velikи osetljivost, јег па тапјој koпceпtraciji kadmijиma па akиtпom i hroпicпom tretmaпи dolazi do pada sredпje vredпosti specificпe aktivпosti esteraza и оdпоsи па koпtrolи. И tokи akиtпog tretmaпa liпije погте reakcije роkаzији da se aktivпost esteraze па КС 1 sтапјије kod 15 legala, а па С 1 cak kod 17 od иkирпо 20 legala па koпtroli. Moida se esteraze mogи koristiti kao Ьiomarkeri za detekcijи kseпoblotika prisиtпih и malim koliCiпama и iivotпoj srediпi. Kod oporavka od Cl aktivпost esteraza se vraca па koпtrolпi пivo {slika 7 9С), dok је и tokи oporavka od С2 pad aktivпosti ireverzibllaп. Dvofaktorskom aпalizom van1aпse 1е иtvrdeпo da poredeпjem akиtпog tretmaпa i oporavka iпterakcija izmedи tretmaпa i koпceпtracije kadmijиma иtice па рrотепи aktivпosti esteraza, dok је poredeпjem hroпicпog tretmaпa i oporavka detektovaпo da sam tretmaп metalom иtice па рrотепи aktivпosti esteraze {tabela 52}. Jedпofaktorska aпaliza varijaпse pokazиje da aktivпost esteraza pri akиtпom efektи i oporavcima od оЬе koпceпtracije, zпасајпо zavisi od tretmaпa kadmijиmom {tabela 53). F vredпosti dobljeпe poredeпjem varijaпsi specificпe aktivпosti esteraza sи statisticki zпасајпе izmedи sledeCih grиpa: Cl i КС2, kao i Cl i С2К. И оЬа slиcaja varijaпsa је veca па hroпicпom tretmaпи Cl. Na graпici zпacajпosti sи razlike izmedи varijaпsi koпtrolпe grиpe i КС2, kao i izmedи К i С2К {tabela 54). Vredпost iпdeksa feпotipske plasticпosti ima пegativпи vredпost samo па oporavkи od Cl {tabela 55). ZпaCi, da је kao i kod p-glikozidaze, aktivпost esteraze и tokи oporavka od Cl veca пеgо па koпtroli. 110 Rezиltati lпteresaпtпo fe da sи plasticпost specifjcпe aktivпostj esteraza vece рп dиgotrajпim efektima (Cl >Cl К ј С2>КС2), dok је varjjabllпost plastjcпosti takode veca па Cl и оdпоsи па КС1 {tabela 56). Medиtim, па oporavkи od С2 plasticпost је veca пеgо и tokи oporavka od тапје koпceпtracije metala. Elektroforetski је detektovaпo vise razliCitih izoformi esteraza molekиlskih masa od 64-250 kDa {slika 20). lzoforma vece molekиlske mase {oko 250 kDa} је vid/jjva samo па koпtrofj ј pri hroпjcпim tretmaпjтa. И zavjsпostj od vrste tretmaпa dolazi do promeпe и пivои ekspresije i tipи esteraza. 111 Rezultati А в с '" ,. 12 1 08 ЏЈ; 04 02 .16 14 .12 ... с ~о. ю "· ,08 ~ ~· Јјо <( а; ... (Ј) о .02 ,(D Q16 0,1 w 0,1 ·;;; "[ 0,1 4 2 о Е о.се ~ 0,06 ~ 0,04 rJ) 0,00 0,1 ~0.1 ·;;; i 0,1 6 4 2 о Е о.се ~ 0,05 ~ 0,04 rJ) ЦО2 QOO ь к КС1 т ~ к С1 т l к С1 ~ к С2 "1' КС2 аЬ С2 а С1К ь С2К Akutni tretman F= 3,52 Р= 0,04 Hronicni tretman F=2,77 Р= 0,07 А' В' Oporavak od lOflgCd/ g F= 3,50 Р= 0,04 с Oporavak od 30!-LgCd/ g F= 5,68 Р= 0,01 D' 0,25 I о.~ "' ~ 0,15 ~ 0.10 ""'1 0,2Sf I ""' i g' Q15 ~ an 0.10 rJJ ца; QOO 0,30 0,25 0,05 к С1 К С2 D Slika 19. Specificna aktivnost esteraze larvi gubara norme reakcije (А', В', С ' , О') (Х ± SE) (А, В, С, D) 112 С1К С2К linije Rezultati Tabela 52. Dvofaktorska ANOVA za specificnu aktivnost esteraze izmeclu razliCitih tretmana i koncentracija kadmijuma Poreaenje lzvor df MSIII F р variranja 1 Tretman 0,004 3,43 0,068 1 AKUTNI- Koncentracija 0,000 0,61 0,438 HRONICNI TRETMANI 1 Tret. Х Konc. 0,000 0,05 0,816 Greska 73 0,001 Tretman 1 0,001 0,62 0,432 AKUTNI- Koncentracija 1 0,001 1,00 0,322 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Konc. 1 0,004 4,84 0,031 Greska 70 0,001 Tretman 1 0,008 6,39 0,014 HRONICNI- Koncentracija 1 0,001 1,16 0,284 OPORAVAK TRETMANI Tret. Х Konc. 1 0,003 2,65 0,108 Greska 73 0,001 113 Rezultati Tabela 53. Proseeno kvadratno odstupanje od srednje vrednosti specificne aktivnosti esteraza {MS) и jednofaktorskoj analizi varijanse kod larvi gubara izloienih razliCitim tretmanima kdmijumom. Efekat lzvor df MS F р variranja akutni [Cd] 2 0,035 3,523 0,036 greska 54 0,010 hronicni [Cd] 2 0,238 2,768 0,071 greska 57 0,086 oporavak С1 [Cd] 2 0,289 3,500 0,037 greska 56 0,083 oporavak С2 .[Cd] 2 0,079 5,683 0,006 · . greska 55 0,014 Tabela 54. F vrednosti dobljene poredenjem varijansi specificne aktivnosti esteraza izmedu razliCitih eksperimentalnih grupa С1 С2 КС1 КС2 С1К С2К к 1 '1655 1,3337 1,6239 2,3542+ 1,6630 2,5029+ С1 1,5545 1,8927 2,7439* 1,9383 2,9173* С2 1,2176 1,7651 1,2469 1,8767 КС1 1,4497 1,0241 1,5413 КС2 1,4156 1,0632 С1К 1,5051 + Р<О, 1 * Р<0, 05 114 250-1 98 64 - , Rezultati ТаЬе/а 55. Sreclnie vreclnosti {Х) i standardne deviiaciie (SD) indeksa fenotipske plasticnosti specifitne aktivnosti esteraza С1 С2 efekat N (Х) ±SD N (Х) ±SD akutni 18 14,452 15,217 19 6,906 18,710 hronicni 20 25,279 26,766 20 21,841 21,526 oporavak 19 -q,369 18,492 18 14,226 14,447 ТаЬе/а 56. Rezultati poreilenia sredniih vrednosti (Z/ Vilkoksonov test) i standardnih deviiaciia (F test) indeksa fenotipske plasticnosti specificne aktivnosti esteraza Poredenje z р F р akutni С1 -akutni С2 1,3283 О, 1841 1,5118 0,3994 hronicniC1 -hronicni С2 0,2613 0,7938 1,5461 0,3505 OEoravak С1 -oEoravak С2 2,5912 0,0096 1,6383 0,3146 hronicni С1 -akutni С1 1,7202 0,0854 3,0941 0,0232 -OEOГavak С 1 3,0182 0,0025 2,0950 О, 1230 hronicni С2 -akutni С2 2,6157 0,0089 1,3237 0,5559 -oEoravak С2 1,4589 0,1446 2,2201 0,1043 к СЈ С2 КСЈ КС2 СЈК С2К Slika 20. Elektroforetski profili izoformi esteraza larvi gиЬага cetvrtog stupnia pri razliCitim efektima kadmiiuma/ doblieni nativnom poliakrilamrdnom elektroforezom. 115 Rezиltati 4.7.2 GLUTAТION 5-TRANSFERAZA Slike kojima је predstavljeпa sredпja vredпost specificпe aktivпosti glиtatioп 5- traпsferaze роkаzији da se aktivпost пе тепја zпасајпо и оdпоsи па koпtrolи и tokи akиtпog i hroпicпog efekta пi па јеdпој koпceпtraciji kadmijиma (slike 21А i 218). Liпije погте reakcije prikazиjи heterogeпo ропаsапје legala pri istim efektima kadmijиma. lпteresaпtпo је da se и tokи oporavka od С1, оdпоsпо С2 primecиje роvееапје specificпe aktivпosti GST. Naime, и tokи oporavka od С1 vidi se zпасајпо роvесапје aktivпosti kod 15 od 20 legala koja sи Ьila па hroпicпom tretmaпи па С1 (slika 21С'), dok 14 od 20 legala pokazиje vеси aktivпost па oporavkи od С2 и оdпоsи hroпicпi stres па С2 {slika 21 D' }. Na tabeli 57 prikazaпi sи rezиltati poredeпja razliCitih tretmaпa па specificпи aktivпost GST {dvofaktorska ANOVA). Poredeпjem aktivпosti GST izmedи akиtпog i hroпicпog tretmaпa i hroпicпog i oporavka vidimo da tretmaп kadmijиmom direktпo иtice па рrотепи aktivпosti GST. Zajedпicko delovaпje (iпterakcija} tretmaпa i koпceпtracije иtice па рготепи aktivпosti GST izmedи akиtпog i hroпicпog tretmaпa i akиtпog i oporavka. Poredeпjem · hroпicпog tretmaпa i oporavka doslo se do zakljиcka da koпceпtracija metala zпасајпо иtice па рrотепи aktivпosti GSТ. Jedпofaktorskom aпalizom varijaпse {tabela 58) иtvrdeпo је da kadmijиm dovodi do zпасајпе promeпe specificпe aktivпosti GST samo и tokи oporavka od тапје koпceпtracije kadmijиma, Р< 0,05. Poredeпjem vaп1aпst specificпe aktivпosti GST izmedи razliCitih eksperimeпtalпih grиpa detektovaпa је samo јеdпа zпасајпа F vredпost izmedи С1 i С2К {varijaпsa па С1 је тапја od С2К, tabela 59). F vredпosti па graпici zпacajпosti sи izmedи sledeCih tretmaпa: С1 i КС2, КС1 i С2К. Liпije погте reakcije, takode, пе роkаzији vid/jivи рrотепи varijaЬilпosti {zпасајап pad i/i роvесапје) aktivпosti GST ро /eg/ima pri razliCitim efektima kadmijиma {slike 21 А' -D' }. 116 Rezиltafj Sredпje vredпosfj jпdeksa feпofjpske plastjcпosfj па veCiпj tretmaпa јтаји пеgаtјvпи vredпost, sto иkаzије па vеси vredпost aktjvпostj GST па tretmaпjтa и оdпоsи па koпtrolи, оsјт prj akиtпom efektи па С1 ј hгопјспот па С2 {tabela 60}. lпteresaпtпo је da porecleпjem staпdardпjh devjjacjja jпdeksa feпofjpske plastjcпostj GST пјје dobljeпa пј јеdпа zпасајпа F vredпost, dok sи porecleпjem jпdeksa plasfjcпosfj skoro sve Z vredпosfj zпасајпе. Samo se plasfjcпost GST јzтес1и hroпjcпog efekЉ С1 ј akиtпog tretmaпa па jstoj koпceпtracjjj kadтjjиma пе razfjkиje {tabela 6 7 ). lпdeks feпotjpske plasfjcпosfj јта тапји vredпost ј па akиtпom ј hгопјспот tretmaпи па С1 и оdпоsи па jsfe tretmaпe па vecoj koпceпtracjjj kadтjjиma. GST и tokи oporavka od С1 јта vеси vredпost plasfjcпosfj пеgо па hгопјспот tretmaпи С1 ј oporavkи od С2, dok је jпdeks feпofjpske plasfjcпosfj и tokи hroпjcпog tretmaпa па С2 тапјј od plasfjcпostj и tokи akиtпog efekta па jsfoj koпceпtracjjj, а veCi od oporavka od 30 119/g sиve hraпe. 117 Rezultati "" ~ т ; "" "" " к КС1 КС2 А т а т "' ~ "" " к С1 С2 в т "" ~ ~ "" "" " к С1 С1К с '!f т а "' т I]J " к С2 С2К D Akutni tretman f= 1,63 Р= 0,20 А' Hronicni frefman f= 2,08 Р= О, 13 В' Oporavak od 1 OJ.lgCd/ g с Oporavak od 30J.1gCd/ g I 2D ' / l ~ ПЈ 2 t-~ "" « (/) к КС1 КС2 ' <а "" ~ [ т О> Е 2 "" t- ~ m (/) ------------ к С1 С2- 350 зао !:1 ~~ ~ 1: Lf __ ~/--~---~~-----=~- 350 зао @ 150 ~100 K С1 С1К j:l; 50 L-~------~----~~ О' 5/ika 21 . Specificna aktivnost beta GST larvi gubara (Х ± SE) {А, В, С, D) i linije norme reakcije (А', В' , С ', D') 118 Rezultati Tabela 57. Dvofaktorska ANOVA za specificnu aktivnost GST izmeclu razliCitih tretmana i koncentracija kadmijuma Poredenje lzvor df MSIII F р variranja 1 Tretman 6257,503 4,43 0,039 1 AKUTNI- 1 h2 c11r0,2226. RazfjCitost јzтесfи legala је veca па hгопјспот tretmaпи vece koпceпtracjje kadтjjиma и оdпоsи па dиgotrajпj efekat тапје koпceпtracjje kadтjjиma . lпteresaпtпo је da је vaгjjabllпost па oporavkи od С2 zпасајпо veca od vaгjjabllпostj ргј osta/jт efektjтa kadтjjиmom, bez оЬzјга da fj se radj о kratkotrajпjт jfj dиgоtгајпјт (tabela 65}. Vaгjjabllпost па vestackoj djjetj bez kadтjjиma је veca пеgо и tokи trodпevпog efekta vece kопсепtгасјје kadтjjиma. Geпetjcka vагјјапsа и tokи dиgotrajпog efekta kadтjjиma па С2 је veca пеgо и tokи akиtпog stresa jste koпceпtracjje metala. Nema zпасајпјh razfjka и sredjпskjт vaгjjaпsama јzтесfи ekspeгjтeпtafпjh grиpa. Heгjtabllпost plastjcпostj Је veca od heгjtabllпostj svojstva па akиtпom, hгопјспот efektи ј oporavkи od СЈ, dok је heгjtabllпost svojstva veca samo па oporavkи od С2 (tabela 66). Sredпja vredпost jпdeksa feпotjpske plastjcпostj јта samo јеdпи пеgаtјvпи vredпost ј to па hгопјспот tretmaпи па тапјој koпceпtracjjj kadтjjиma (tabela 67). Рогесfепјет sredпjjh vredпostj jпdeksa feпotjpske plastjcпostj ј staпdardпjh devjjacjja proceпta creva и оdпоsи па masи cele larve иtvrcfeпo је da пе postoje zпасајпе razfjke јzтесfи ekspeгjтeпtafпjh grиpa, sto zпaCi da se plastjcпost proceпta 123 Rezultati mase srednjeg creva i standardne devijacije njegove plasticnost ne mogu uzeti kao osetljivi parametri па prisustvo kadmijuma и hrani {tabela 68}. 124 Rezultati Akutni tretman Hronicni tretman Oporavak od lOf.lgCd/g Oporavak od ЗOf.lgCd/g А в с D "' 15 10 5 "' ~"' б; ь g'1 .Е' ~ ~ 10 ~ 11 ?!.. 5 25 20 ~ ~ 15 f 10 ~ Е 5 "" 20 ~ ь 15 g> I 10 ~ Е 5 "" ;. ь к КС1 аЬ к С1 а ~ _____L_ к С1 к С2 32 :ю ь "' "' ~ 6;24 ь ~22 ~ Е ", "" 18 16 14 КС2 А' 32 :ю "' ~ "' ~ ь 24 ~ 11 22 ?ft.:ю 18 16 С2 к С1 С2 В' 32 :ю ___!L_ "' "' ~ б) 24 ь ~ 22 ~ ;:ю 18 16 С1К 14 к С1 С1К с 32 :ю "' "' ~ ~ 24 ь mzz Е ", "" 18 16 14 С2К D' Slika 22. Procenat mase srednjeg creva larvi gubara (Х ± SE) {А, В, С, D) linije norme reakcije {А' , В' , С', D' Ј 125 Rezиltati Tabefa 62. Trofaktorska ANOVA za procenat mase srednieg creva и odnosи па masи larvi gиbara izmeclи raz licitih tretmana. Tretmani i koncentraciie sи Ьili fiksirani faktori, а leg/o sfиcaini faktor koii ie иgnieiclen и tretmane sa razliCitim koncentraciiama kadmiiиma. F-odnos pokazиie kako te proceniivana F vrednost. Poreaenje lzvor variranja MSIII F odnos F vrednost Tretman(df=1) 63,56 1/4 13,97*** Koncentracija(df=1) 22,45 2/3 4,93* AKUTNI- Tret. х Konc (df=1) 0,32 3/5 0,07 HRONICNI TRETMANI Leglo(konc. )( df=38) 4,93 4/5 1,08 Tret. х Leglo (konc) 7,18 5/6 1,58* (df=36) Greska (df=288) 4,55 Tretman(df=1) 10,61 1/4 2,58 Koncentracija(df=1) 23,74 2/3 5,77* AKUTNI- Tret. х Konc (df=1) 0,03 3/5 0,01 OPORAVAK TRETMANI Leglo(konc. )( df=37) 6,50 4/5 1,58* Tret. х Leglo (konc) 6,07 5/6 1,48* (df=34) Greska (df=283) 4,11 Tretman(df=1) 15,35 1/4 3,93* Koncentracija(df=1) 23,30 2/3 5,96* HRONICNI- Tret. х Konc (df=1) 0,06 3/5 0,02 OPORAVAK TRETMANI Leglo(konc. )( df=38) 5,52 4/5 1,41 Tret. х Leglo (konc) 7,84 5/6 2,01 ** (df=35) Greska (df=296) 3,91 126 Rezиltatj Tabela 63. Prosecпo kvadratпo odstиpaпje od sredпje vredпostj proceпta mase creva и оdпоsи па masи larve ротпоiепо sa 7 000 {MS) и dvofaktorskoj aпafjzj varjjaпse prj razfjCifjт tretmaпjтa kadтjjиmom. Копсепtrасјја kadтjjиma {Cd) је fjksjraпj faktor, а leglo {L) је sfисајпј faktor. Efekat lzvor variranja df MS F р akutni Leglo(L) 17 8,408 1,122 0,3351 Kadmijum(Cd) 2 53,657 6,430 0,0043 LxCd 34 8,345 1,11 з 0,3172 Greska 204 7,497 hronicni Leglo(L) 19 7,765 1,181 0,2749 Kadmijum(Cd) 2 13,437'. 1,417 0,2550 LxCd 38 9,485 1,442 0,0545 Greska 235 6,576 oporavak С1 Leglo(L) 18 5,404 0,877 0,6072 Kadmijum(Cd) 2 3,342 0,381 0,6858 LxCd 36 8,769 1,423 0,0661 Greska 224 6,163 oporavak С2 Leglo(L) 18 17,217 2,706 0,0003 Kadmijum(Cd) 2 23,321 3,158 0,0545 LxCd 36 7,385 1,161 0,2557 Greska 224 6,363 Tabela 64. Geпefjcka varjjaпsa {а82), sredjпska varjjaпsa {ас/) ј herjtabllпost и 5jrem sтjsfи (h2±SE) za proceпat mase sredпjeg creva и оdпоsи па masи larvj и zavjsпosfj od tretmaпa kadтjjиmom. Tretmaпj: K-koпtrolпa grиpa, bez kаdтјјита; аkиtпј efekat {KCJ-trj dапа па СЈ podfozj ј KC2-trj dапа па С2 podfozj); hrопјспј efekat (СЈ-10 ~g Cd/g sиve podfoge ј С2-ЗО ~g Cd/g sиve podloge}; efekat oporavka {СЈ K-trj dапа oporavka od СЈ pod/oge ј С2К- frj dапа oporavka od С2 podloge). tretman N а2 ас/ h2 ±SE t к 20 0,489 7,058 0,1296 0,1700 0,762 КС1 19 0,341 8,035 0,0814 0,1844 0,441 КС2 19 0,134 7,182 0,0365 0,1580 0,231 С1 20 0,256 6,602 0,0748 0,1645 0,454 С2 20 0,719 6,057 0,2123 0,1867 1,137 С1К 19 0,543 4,331 0,2226 0,1920 1,160 С2К 19 1,544 5,643 0,4296 0,2177 1,973 127 Rezиltati Tabela 65. F vredпosti dobljeпe poredeпjem geпetickih varijaпsi ag2 za % mase sredпjeg creva и оdпоsи па masи larve (izпad dijagoпale} i srediпskih varijaпsi а00 2 {ispod dijagoпale} izmedи razliCitih tretmaпa к С1 С2 КС1 КС2 С1К С2К к 3,656** 1 '11 о З, 158* С1 1,917 2,117 6,023*** С2 1,326 2,146 КС1 1 '138 1,327 1,592 4,530** КС2 1,018 1, 186 4,058** С1К 1,630 1,524 1,398 С2К 1,251 1 '170 1,073 *Р<0,05 .... р< о 01 1 ...... р< 0,001 Tabela 66. Plasticпost {8/), heritabllпost plasticпosti {h/) i heritabllпost svojstva {h/) za proceпat mase sredпjeg creva dobljeпi iz dvofaktorske aпalize varijaпse kod gиbara gajeпih и razliCitim srediпama, pri akиtпom, hroпicпom stresи i oporavkи . efekat 8 2 h 12 h2 s akutni 0,9555 0,4062 0,0025 hronicni 1,1492 0,5677 0,0000 oporavak С1 1,2016 0,6124 0,0000 oporavak С2 0,7861 0,3678 0,3955 Tabela 67. Sredпje vredпosti {Х) i staпdardпe devijacije {SD) iпdeksa feпotipske plasticпosti proceпta mase creva и оdпоsи па masи cele larve С1 С2 efekat N (Х) ±SD N (Х) ±SD akutni 19 9,600 22,381 19 14,339 20,374 hronicni 20 -5,871 24,429 20 3,245 19,858 oporavak 19 1,726 19,908 19 11 ,666 14,617 128 Rezultati Tabela 68. Rezultati poredenia sredniih vrednosti {Z, Vilkoksonov test} i standardnih deviiaciia {F test) indeksa fenotipske plasticnosti procenta mase creva larve и odnosu па masu larvi treceg stupnia Poredenje z р F р akutni С1 -akutni С2 1,2847 0,1989 1,2067 0,6944 hronicniC1 -hronicni С2 1,4933 О, 1354 1,5133 0,3745 oporavak С1 -oporavak С2 1,8511 0,0642 1,8550 0,1996 hronicni С1 -akutni С1 1,7707 0,0766 1,1914 0,7139 -oporavak С1 0,9256 0,3547 1,5057 0,3902 hronicni С2 -akutni С2 1,8511 0,0642 1,0526 0,9101 -oporavak С2 1,2475 0,2122 1,8457 0,1997 129 Rezиltatj 4. 9 KORELACUE IZМEf)U ENZIМA Na podlozj bez kadтjjиma GST пјје и korelacjjj пј sa јеdпјт posmatraпjт епzјтот {tabela 69). a-gfjkozjdaze sи и zпасајпој пegatjvпoj korelacjjj sa ~­ gfjkozjdazom, dok te и pozjfjvпjт korelacjjama sa esterazama, lеисјп aтjпopeptjdazom, frjpsjпom ј proteazama. ~-gfjkozjdaza је и пegatjvпoj korelacjjj sa trjpsjпom ј proteazama. Postojj zпасајпа korelacjja јzтеdи esteraza ј lеисјп aтjпopeptjdaze, frjpsjпa ј proteaza; lеисјп aтjпopeptjdaze ј trjpsjпa, kao ј proteaza; ј frjpsjпa ј proteaza. И tokи akиtпog efekta kadтjjиma па 7 О ~g/ g sиve hraпe postojj korelacjja јzтеdи a-gfjkozjdaze ј ~-gfjkozjdaze, esteraze, lеисјп aтjпopeptjdaze ј trjpsjпa . ~­ gfjkozjdaza је korelacjjj sa /еисјп aтjпopeptjdazom, а esteraza sa /еисјп aтjпopeptjdazom, trjpsjпom ј proteazom {tabela 70). Lеисјп aтjпopeptjdaza је и korelacjjj sa trjpsjпom ј proteazom, а trjpsjп sa proteazom (jsto kao јп а С2). Sve stafjsfjckj zпасајпе korelacjje sи pozjtjvпe, dok postojj 5 пegafjyпjh korelacjja ј to sve јzтеdи GST ј djgesfjvпjh епzјта. lпteresaпtпo је da јzтеdи proteaza ј GST postojj prva zпасајпа negatjvпa korelacjja. Na tabefj 71 vjdjтo korelacjje јzтеdи specjfjcпjh aktjvпostj razfjCitjh епzјта ргј akиtnom efektи kadтjjиma od 30 ~g/g sиve hгапе. a-g/jkozjdaza је и korelacjjj sa ~-gfjkozjdazom, esterazom ј trjpsjпom; esteraza 1е и korelacjjj sa /еисјп aтjпopeptjdazom ј trjpsjпom; lеисјп aтjпopeptjdaza sa trjpsjпom, а trjpsjп sa proteazama. Na graпjcj zпacajпostj sи korelacjje јzтеdи a-gfjkozjdaza ј proteaza, ~-gfjkozjdaze ј lеисјп aтjпopeptjdaze, frjpsjпa ј GST. Sve korelacjje јтаји pozjtjvпe vredпostj оsјт korelacjja јzтеdи GST ј drиgjh posmatraпjh djgestjvпjh епzјта. Na Cl postojj та/ј broj zпасајпјh korelacjja {tabela 72). GST пјје и korelacjjj пј sa јеdпјт djgesfjvпjт епzјтот {kao ј па koпtrofj) . Pozjtjvпe korefcjje sи јzтеdи a- g/jkozjdaze ј sledeCih епzјта: ~-g/jkozjdaze, esteraza, lеисјп aтjпopeptidaze ј trjpsjпa. ~-gfjkozjdaza је и pozjtjvпoj korelacjjj samo sa lеисјп aтjпopeptjdazom, а 130 Rezиltatj esteraze sa lеисјп aтjпopeptjdazom ј trjpsjпom . Pozjfjvпe korelacjje sи ј јzтеdи lеисјп aтjпopeptjdaze ј trjpsjпa, kao ј trjpsjпa ј proteaza. Na graпjcj zпacajпostj је korelacjja јzтеdи p-gfjkozjdaze ј GST. Samo dve korelacjje sи пegatjvпe, od cega пј jedna zпасајпа. Na tabefj 73 sи prjkazaпe korelacjje јzтеdи specjfjcпjh aktjvпostj епzјта prj hroпjcпom efektи kadтjjиma od 30 ~g/ g sиve hraпe. GST пјје и korelacjjj пј sa јеdпјт епzјтот, а/ј је korelacjja sa lеисјп aтjпopeptjdazom па graпjcj zпacajпostj. a-gfjkozjdaze sи и korelacjjj sa p-gfjkozjdazom, esterazom, lеисјп aтjпopeptjdazom ј trjpsjпom, dok је korelacjja sa proteazama па graпfcj zпacajпostj. p-gfjkozjdaza је и pozjfjvпoj korelacjjj sa /еисјп aтjпopeptjdazom, а esteraze sa /еисјп aтjпopeptjdazom, trjpsjпom ј proteazama. Lеисјп aтjпopeptjdaza је и pozjfjvпoj korelacjjj sa frjpsjпom ј proteazama. Trjpsjп је takode и pozjfjvпoj korelacjjj sa proteazama. Na graпjcj zпacajпostj је ј korelacjja јzтеdи a-gfjkozjdaze ј proteaze. Postojj samo јеdпа пegatjvпa korelacjja. Korelacjje јzтеdи specjfjcпjh aktjvпostj eпz1ma ргј oporavkи od тап1е koпceпtracjje kadтjjиma prjkazaпe sи и tabefj 74. a-gfjkozjdaza је и korelacjjj samo sa lеисјп aтjпopeptjdazom ј frjpsjпom, esteraza sa fеисјп aтjпopeptjdazom, /еисјп aтjпopeptjdaza sa trjpsjпom ј proteazom , а trjpsjп sa proteazom. Kod GST samo је јеdпа korelacjja па graпjcj zпacajпostj {opet GST ј proteaza}. Na graпjcj zпacajпostj sи jos korelacjje јzтеdи a-gfjkozjdaza i esteraze i a-glikozidaza i proteaze, kao i p-glikozidaze i proteaze {пegatjvпa}. Sve statisticki zпасајпе korelacije sи pozitivпe, а postoje ј trj пegatjvпe korelacjje. Najmaпjj broj statjsticki zпасајпјh korelacija izmedи specificпih aktjvпosti епzјта је prjsиtaп ргј oporavkи od vece koпceпtracije kadmijиma {tabela 75}. Postoje samo tri zпасајпе korelacjje i to lеисјп aтjпopeptjdaze sa trjpsjпom ј proteazom, kao ј јzтеdи frjpsjпa ј proteaza. Postojj ј та/ј broj korelacjja koje sи па graпici zпacajпosfj ј to izmedи оЬе gfjkozjdaze ј a-glikozjdaze ј esteraze. И tokи 131 Rezиltati oporavka od С2, GST је и пegativпoj korelaciji sa tri digestivпa eпzima, dok је ~­ g/ikozidaza пegativпo korelisaпa sa esterazom, lеисiп amiпopeptidazom i fгjpsjпom. 4. 9. 1 Korelacije izmeclи proceпta mase creva i eпzima lпteresaпtпo је da је kod fгј tretmaпa, оЬа hгопјспа ј akиtпog па СЈ , proceпat mase creva и korelacjji sa aktjvпoscи proteaza {tabele 70, 72, 73). Na hгоп јспјт tгеtтапјта korelacije sи pozitjvпe, dok је па akиtпom пegativпa vredпost korelac jje. Na hгопјспот efektи vece kопсепtгасјје kadтjjиma proceпat mase creva је и pozjfjvпoj korelacjjj ј sa aktjvпoscи fгјрsјпа {tabela 73), dok је па akиtпom efektи vece kопсепtгасјје и pozjtjvпoj korelacjjj sa lеисјп aтjпopeptjdazom {tabela 71 ). Ne postoje stafjsfjckj zпасајпе korelacjje јzтес!и proceпta mase creva ј eпzjma па koпtrofj ј oporavkи od С2, dok је korelacjja јzтеdи proceпta mase ј ~-g/jkozjdaze ргј oporavkи od Cl па graпjcj zпacajпostj (tabele 69, 75, 74). Korelacjja јzтеdи proceпta creva ј esteraze па akиtпom tгеtтапи па СЈ је takode па graпjcj zпacajпosfj {tabela 70). 132 Rezultafj Т abela 69. Korelacjje јzтес!и specjfjcпjh aktjvпosfj епzјта, kao ј procenta mase ј aktjvпosfj епzјта, па vestackoj hraпj bez kadтjjuma KONTROLA a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST % mase creva 0,0323 0,2026 -0,1769 -0,1876 -0,0334 -0,1373 -0,3718 a-Giik -0,5735* 0,5359* 0,5638* 0,7832*** 0,7009** 0,0679 p-Giik -0,4548 -0,3825 -0,4852* -0,4935* -0,2319 EST 0,7703*** 0,8366*** -0,1723 LAP 0,7609*** -0,0175 TRIP -0,2527 Proteaze -0,1858 *Р< 0,05 **Р< О 07 1 ***Р< О 007 1 Т abela 70. Korelacjje јzтес!и specjfjcпjh aktjvпostj епzјта, kao ј procenta mase ј aktjvпosfj епzјта, ргј akutnom efektu kadтjjuma od 7 О f.l91 g suve hrane КС1 a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST % mase creva 0,0376 0,4196 -0,5029+ -0,2698 -0,4163 -0,6288* 0,1821 a-Giik 0,5762* 0,5965* 0,6809** 0,5726* 0,4333 -0,1298 p-Giik 0,0954 0,5761* 0,3267 0,1592 -0,2742 EST 0,5286* 0,5317* 0,6294* 0,0605 LAP 0,5631* -0,2444 TRIP -0,4947+ Proteaze -0,6056* +р< О, 7 *Р< 0,05 **Р< 0,07 ***Р< 0,007 133 Rezultatj Tabela 71. Korefacjje jzтedu specjfjtпjh aktjvпosfj епzјта, kao ј procenta mase ј aktjvпostj епzјта, prj akutnom efektu kadтjjuma od 30 Jl91 g suve hrane КС2 a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST % mase creva 0,0433 0,2715 0,0818 0,5430* 0,3241 О, 1405 -0,1642 a -Giik 0,4971* 0,6189** 0,1 516 0,5453* 0,4506+ -0,3379 P-Giik 0,3309 0,4266+ 0,4412+ О , 161 7 -0,4352+ EST 0,5065* 0,4792* 0,2513 -0,2248 LAP 0,3208 -0,2193 TRIP 0,8624*** -0,2868 Proteaze -0,307 +р< О, 1 *Р < 0,05 **Р< О 0 1 1 ***Р< О 001 1 Tabela 72. Korelacjje jzтedu specjfjcпjh aktjvпosfj епzјта, kao ј procenta mase ј aktjvпosfj епzјта, prj hronicnom efektu kadтjjuma od 1 О Jl91 g suve hrane С1 a-GLIK p-GLIK EST LAP TRIP Proteaze GST % mase creva 0,2743 -0,2975 -0,1197 -0,0715 0,4042 0,4943* -0,2249 a-Giik 0,4868* 0,5183* 0,6536** 0,6589** 0,2508 0,154 P-Giik 0,4180 0,5790* 0,3312 О, 1207 0,4337+ EST 0,4914* -0,0944 0,2262 LAP 0,4919* -0,0984 0,3072 TRIP 0,1 477 Proteaze О , 1617 +р< 0,1 *Р< 0,05 **Р< О 01 1 ***Р< О 001 1 134 Rezultati Tabela 73. Korelacije izmeclu specificnih aktivnosti enzima, kao i procenta mase i aktivnosti enzima, pri hronicnom efektu kadmijuma od 30 1-19/ g suve hrane С2 a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST % mase creva 0,323 0,0311 0,1770 0,3244 0,5823* 0,5970* 0,0425 a-Giik 0,8143*** 0,6207* 0,8449*** 0,6890** 0,4517+ 0,1798 p-Giik 0,3357 0,5873* 0,4092 0,1864 -0,0657 EST 0,5917* 0,5680* 0,4253 LAP 0,6147* 0,4620+ TRIP 0,2510 Proteaze 0,4198 +р< О, 1 *Р< 0,05 **Р< О 01 1 ***Р< 0,001 Tabela 74. Korelacije izmeclu specificnih aktivnosti enzima, kao i procenta mase i aktivnosti enzima, pri oporavku od manje koncentracije kadmijuma С1К a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST % mase creva -0,0168 0,4366+ О, 1126 О, 1017 -0,1260 -0,0879 0,0315 a-Giik -0,2809 0,3926+ 0,5516* 0,4806* 0,4226+ 0,0234 P-Giik 0,0494 0,0256 -0,3343 -0,4086+ 0,0972 EST 0,3742 0,3132 0,2881 LAP 0,5579* 0,5600* 0,3771 TRIP 0,2117 Proteaze 0,4069+ +р< О, 1 *Р< 0,05 **Р< 0,01 ***Р< О 007 1 135 Rezultati Tabela 75. Korelacije izmeclu specificnih aktivnosti enzima, kao i procenta mase i aktivnosti enzima, pri oporavku od veee koncentracije kadmijuma С2К a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST % mase creva -0,1609 -0,1273 0,0584 О, 1118 0,2666 0,2330 -0,2034 a-Giik 0,4255+ 0,4294+ 0,305 0,3906 0,3914 0,0794 p-Giik -0,0446 -0,3167 -0,1377 0,0042 0,2204 EST 0,2313 0,0592 0,0460 -0,0553 LAP 0,5784* 0,085 TRIP 0,8749*** -0,1112 Proteaze -0,0429 +р< О, 7 *Р<ОД5 **Р< 0,01 ***Р< 0,007 136 Rezиltafj 4. 1 О POREDENJE KORELAC/JA IZМEDИ AКТIVNOSТI ENZIМA Poredeпje korelaciia јzтеdи aktjvпosfj razfjCitjh eпz1ma па razfjCifjт tretmaпjтa је predstavljeпo и tabefj 76. Zпасајпе t vredпosfj dobljeпe sи poredeпjem korelacjja јzтеdи а ј ~-gfjkozjdaze па svjт tretmaпjтa kadтjjиmom и оdпоsи па koпtrolи, оsјт па oporavkи od Cl. Zпak korelacjja јzтеdи ova dva епzјта и оdпоsи па koпtrolи se тепја па оЬа аkиtпа, оЬа hгопјспа tretmaпa ј oporavkи od С2 {па koпtrofj је korelacjja stafjsfjckj zпасајпа ј пegatjvпa, а па tretmaпjтa ј oporavkи od С2 zпасајпа ј pozjtjvпa}. Zпасајпе t vredпosfj јzтеdи ~-gfjkozjdaze ј esteraze sи dobljeпe poredeпjem korelacjja па koпtrofj ј оЬа hгопјспа efekta, kao ј akиtпog tretmaпa па vecoj koпceпtracjjj kadтjjиma. И sva trj slиcaja doslo је do zпасајпе promeпe zпaka korelacjja и оdпоsи па koпtrolи (pozjfjvпe sи па tretmaпjтa}. lпteresaпtпo је da sи za ~-gfjkozjdazи ј lеисјп атјпорерtјdаzи, kao ј za ~­ gfjkozjdazи ј frjpsjп dobljeпe zпасајпе t vredпosfj poredeпjem korelacjja јzтеdи jstjh tretmaпa: koпtrole ј оЬа hгопјспа ј koпtrole ј оЬа аkиtпа efekta. И svjт ротепиfјт роrеdепјјта doslo је do zпасајпе promeпe zпaka korelacjja: па koпtrofj је vredпost korelacjja пegatjvпa, а па tretmaпjтa pozjfjvпa. Stafjsfjckj zпасајпо sтапјепје vredпosfj korelacjja јzтеdи esteraze ј иkирпјh proteaza и оdпоsи па koпtrolи је detektovaпo па akиtпom efektи vece koпceпtracjje kadтjjиma ј оЬа oporavka. lstj slиcaj је ј sa korelacjjama јzтеdи frjpsjпa ј иkирпјh proteaza. Меdиtјт, zпасајпо sтапјепје vredпosfj korelacjja па Cl и оdпоsи па koпtrolи је detektovaпo јzтеdи esteraze ј иkирпјh proteaza ј /еисјп aтjпopeptjdaze ј иkирпјh proteaza. Korelacjja јzтеdи esteraze ј frjpsjпa и tokи oporavka od С2 је zпасајпо тапја od korelacjje јzтеdи jstjh епzјта па koпtrofj. Poredeпjem korelacjja јzтеdи proceпta mase creva ј specjfjcпe aktjvпosfj епzјта regjsfrovaпe sи dve zпасајпе t vredпosfj ј to јzтеdи proceпta creva ј lеисјп aтjпopeptjdaze јzтеdи koпtrole ј akиtпog efekta па С2 ј proceпta mase creva ј 137 Rezultati ukupпih proteaza izmeclu koпtrole i hroпicпog tretmana па С2. И оЬа slucaia doslo ie do zпасаiпе promeпe vredпosti zпaka korelaciia: па koпtroli su Ьile пegativпe dok su па tretmaпima {i dugotraiпom i kratkotraiпom) pozitivпe. Spirmaпov koeficiieпt пiie zпасаiап izmeclu koпtrole i hroпicпog efekta maпie koпceпtraciie kadmiiuma, dok ie izmeclu akutпog tretmaпa С2 i koпtrole па graпici zпacaiпosti. ZпaCi, da se izmeclu pomeпutih tretmaпa meпia korelacioпa struktura. 138 Rezultati Tabela 76. t vredпosti dobljeпe porecleпjem korelacija izmeclu aktivпosti eпzima i proceпta mese sredпjeg creva и odпosu па masu larve па razliCitim tretmaпima k d .. а mtJUmom. ------ К-КС1 К-КС2 К-С1 К-С2 К-С1К К-С2К а -~ 3,3286*** 3,2740** 3,1341** 4,6536*** 0,9948 2,9291** -est 0,2270 0,3411 0,0645 0,3317 0,5015 0,3684 -lap 0,4891 1,3269 0,3788 1,5569 0,0484 0,8555 -trip 1,0224 1,2076 0,6951 0,5388 1,4478 1,6962 - -prot 1,0298 1,0482 1,6213 0,9924 1 '1428 1,2054 -gst 0,5047 1 '1469 0,2308 0,2954 0,1219 0,0306 -о/о 0,0135 0,0301 0,6593 0,7858 0,1342 0,5149 ~ -est 1,4907 2,2805* 2,4764* 2, 1808* 1,4760 1 '1803 - lap 2,6934** 2,3465* 2,8149** 2,7950** 1,1711 0,1985 -trip 2,2087* 2,7420** 2,3122* 2,5039* 0,4976 1,0350 -prot 1,7825 1,9232 1,7514 1,8934 0,2917 1,4416 -gst О, 1149 0,6287 1,8537 0,4424 0,9119 1,2178 -% 0,6145 О, 1996 1,3552 0,4526 0,7175 0,8822 Est -lap 0,4804 0,5990 0,6974 0,0599 0,0576 1 ,4331 -trip 1,0894 1,3639 1,2783 0,8848 1,7154 2,5447* -prot 1 '1930 2,6039** 3,4512*** 1,4673 2,4200* 3,0789** -gst 0,5964 О, 1494 1,0695 1,6309 1,2857 0,3140 -о/о 0,9517 0,7125 О, 1548 0,9286 0,7975 0,6277 lap -trip 0,4633 0,9447 1,4418 0,2310 1,2399 0,5136 -prot 0,9176 1,8193 2,9026** 0,7319 0,9988 0,8950 -gst 0,5896 0,5613 0,8862 1,3432 1,1317 0,2717 -о/о 0,2206 2, 1812* 0,3128 1,3667 0,7976 0,7993 Trip -prot 1,0031 1 '1921 2,1481 * 1 '1972 0,3273 1,0194 -gst 0,7309 О, 1005 1,0770 1,3365 1,2932 0,3880 _о/о 1,0417 1,01 оо 1,2225 1,8157 0,2548 0,8112 prot -gst 1,3065 0,3532 0,9290 1,6498 1,6938 0,3838 _о/о 1,5284 0,7640 1,7989 2, 1462* 0,1367 0,9936 Gst _о/о 1,4608 0,6143 0,4278 1 '1243 1 '1 532 0,4874 SPIRMANOV 0,496** 0,363+ 0,250 0,501 ** 0,763*** 0,545** KOEFICIJENT 139 Rezultati 4. 11 KORELACIJE IZМEDU OSOBINA ADAPТIVNE VREDNOSТ/1 AКТIVNOSТI ENZIМA Kod larvi koje пisu koпzumirale kadmijum пiје detektovaп veliki Ьгој korelacija izmedu osoblпa adaptivпe vredпosti i aktivпosti eпzima па razliCitim tretmaпima. Na koпtroli postoji samo јеdпа (pozitivпa} statisticki zпасајпа korelacija izmedu mortaliteta prvog stupпja i leuciп amiпopeptidaze {tabela 77), sto zпaCi da је роvееапје aktivпosti ovog eпzima ргасепо povecaпom smrtпoscu и ovom stupпju razvica gubara. Sa druge straпe, пegativпe korelacije sa aпaliziraпim komponentama adaptivпe vredпosti ukazuju da роvесапје aktivпosti pojediпih eпzima, пр г. GST а, kao eпzima detoksifikacije, ргасепо padom aпaliziraпih kompoпeпti adaptivпe vredпosti. Od cetrdeset dve korelacije deset је пegativпo, od toga cak pet izmedu GST i osoblпa fitпesa. Na graпici zпacajпosti su korelacije izmedu trajaпja razvica i tripsiпa i relativпe brziпe rasta i GST. Pri akutпom tretmanu па тапјој koпcentraciji kadmijuma zпасајпе korelacije su izmedu trajaпja razvica i esteraze {пegativпa}, mase i f3-glikozidaze {пegativпa}, tripsiпa i proteaze (оЬе pozitivпe) {tabela 78). Na gгaпici zпacajпosti је samo korelacija izmedu trajaпja razvica i f3-g/ikozidaze. Od dvadeset јеdпе korelacije devet је пegativпo {cak pet izmedu trajaпja razvica i eпzima}. Na akutпom efektu vece koпceпtracije kadmijuma {tabela 79) zпасајпе su samo dve korelacije: izmedu trajaпja razvica i leuciп amiпopeptidaze (pozitivпa} i mase larvi i a-glikozidaze {пegativпa}. Korelacija izmedu a-glikozidaze i relativпe brziпe rasta је па graпici zпacajпosti. Sedam korelacija је пegativпo, cak pet izmedu mase larvi i eпzima. И toku trodпevпog dejstva maпte koпceпtracije kadmijuma роvесапје aktivпosti tripsiпa i proteaza utice па роvесапје mase, ali роvесапје f3-g/ikozidaze smaпjuje masu. Medutim, па КС2 роvесапје a-glikozidaze smaпjuje masu, а trajaпje razvica је produzeпo sa veeom aktivпoscu leuciп amiпopeptidaze {trade-off}. 140 Rezиltatj Na hгопјспот tretmaпи па тапјој koпceпtracjjj kadтjjиma {tabela 80) zпасајпе sи dve korelacjje ј to јzтесfи GST ј mase larve cetvrtog stирпја (пegatjvпa}, kao ј GST ј relatjvпe Ьгzјпе rasta (pozjtjvпa}. Na graпjcj zпacajпostj је korelacjja јzтесfи mortafjteta prvog stирпја ј ~-gfjkozjdaze. Postojj иkирпо dvaпaest пegatjvпjh korelacjja {cak pet јzтесfи mase ј posmatraпih епzјта}. Na dиgotrajпom efektи 30 11-9Cd/g sиve hraпe postojj pet zпасајпјh pozjtjvпjh korelacjja: јzтёсf оЬа mortafjteta ј a-gfjkozjdaze ј trjpsjпa, kao ј trajaпja razvjta ј proteaza {tabela 8 7 ). Sve korelacjje јzтесfи osoblпa fjtпesa {оsјт za RGR) ј GST sи пegatjvпe. Pored pomeпиtjh pet, postojj jos jedaпaest пegatjvпjh korelacjja. Na graпjcj zпacajпostj sи sledece korelacjje: јzтесfи trajaпja razvjta ј trjpsjпa, kao ј mase larve ј оЬе g/jkozjdaze {takocfe пegatjvпa}. lпteresaпtпo је da је и tokи slabljeg hroпjcпog stresa {Cl) роvесапје aktjvпostj GST рrасепо padom mase larvj treceg stирпја ј povecaпjem relatjvпe Ьгzјпе rasta {pozjtjvпa korelacjja}. Т akocfe, и tokи hroпjcпog tretmaпa па С2, moiemo prjтefjfj da је za /egla koja јтаји тапјј mortafjtet {иkирап ј mortafjtet и prvom stирпји} и odgovorи па vеси kопсепtrасјји kadmijиma karakteristicпa тапја aktivпost trjpsiпa и sredпjem crevи larvi, а роvесапје aktivпostj GST sтапјије dиiјпи razvjta, masи, smrtпost, dиzјпи trajaпja prvog stирпја. Razvjte је prodиieпo sa vetom aktjvпoscи proteaza (trade--off}. И tokи oporavka od оЬе koпceпtracjje kadтjjиma postojj samo јеdпа zпасајпа пegatjvпa korelacjja јzтесfи mase larvi cetvrtog stирпја ј ~-glikozjdaza {tabele 82, 83). Ovakva zakoпitost је primeceпa ј kod akиtпog tretmaпa Cl, gde takocfe jпhiblcija ~-gfjkozjdaze zпасајпо иtјсе па роvесапје mase larvi. Cak jedaпaest korelacjja је пegatjvпo и tokи oporavka od Cl, а па graпicj zпacajпostj је pozitivпa korelacjja јzтесfи ~-gfjkozjdaze ј trajaпja razvjta. Na oporavkи od С2 devet korelacjja је пegativпo, а jпteresaпtпo da sи GTS i ~-glikozidaza и пegativпoj korelaciji sa svim posmatraпjт osoblпama fjtпesa. 141 Rezultatj Tabela 77. Korelacjie jzmecfu osoblna adaptjvпe vrednostj ј aktjvпostj епzјта па kontrofj KONTROLA a-Giik ~-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST Trajanje О, 1855 0,4114 О , 1996 0,0131 0,3816+ 0,3384 -0,0199 razvica Masa З.dana -0,1184 -0,3456 0;2109 0,2330 0,0080 0,0658 О , 1785 4. stupnja Ukupan 0,3296 О , 1209 0,2550 0,2866 0,3521 0,3680 -0,1918 mortalitet Mortalitet 1. 0,2130 . 0,3086 О, 1888 0,5548* 0,3530 0,3690 -0,2303 stupnja Trajanje 1. 0,0796 0,1365 О, 1039 0,2396 0,0983 О , 1950 -0,0719 stupnja RGR -0,0519 -0,0129 -0,0908 О, 1925 0,0592 О, 1562 -0,4048+ + Р<О, 7 • Р<0,05 Tabela 78. Korelacjie jzmecfu osoblna adaptjvпe vrednostj ј aktjvпostj епzјта ргј akutnom efektu kadтjiuma od 7 О Ј-1.9 Cd/ g suve hrane КС1 a-Giik ~-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST Trajanje 0,0144 0,4269+ -0,5010* -0,2159 -0,3126 -0,3813 -0,0201 razvica Masa З.dana О, 1958 -0,5517* 0,2140 -0,0067 0,7316** 0,6031** -0,3888 4. stupnja RGR О, 1555 0,2231 0,1750 О, 1150 -0,0225 0,0640 0,1206 + Р<О, 7 • Р<0,05 **Р<О,О 7 142 Rezultati Tabela 79. Korelacije izmeclu osoblna adaptivne vrednosti i aktivnosti enzima pri akutnom efektu kadmijuma od 30 Jl9 Cd/ g suve hrane КС2 a-Giik p-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST Trajanje '0,0433 0,2715 0,0818 0,5430* 0,3241 0,1405 -0,1642 razvica Masa З.dana -0,5331* -0,3286 -0,0092 -0,0540 -0 ,0594 0,0961 0,0538 4. stupnja RGR 0,4408+ 0,0986 0,3599 0,0294 0,2649 0,3339 -0,1834 + Р<О, 7 * Р<0,05 Tabela 80. Korelacije izmeclu osoblna adaptivne vrednosti i aktivnosti enzima pri hronicnom efektu kadmijuma od 7 О Jl9 Cd/ g suve hrane С1 a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST Trajanje 0,0189 -0,2817 0,0127 0,0426 О , 1102 0,0123 0,2156 razvica Masa З.dana -0,0666 -0,4022 -0,1900 -0,1 380 О, 1097 О , 1724 -0,6569** 4. stupnja Ukupan 0,2377 0,3351 0,01 15 0,0519 0,3025 0,3214 -0,0270 mortalitet Mortalitet 1. 0,0862 0,4405+ -0,1326 -0,0807 0,0124 0,1114 0,0892 stupnja Trajanje 1. -0,1398 0,2904 -0,1414 О , 1267 -0,0592 -0,0773 0,1508 stupnja RGR О , 1641 0,2408 0,0116 О , 1145 0,2292 0,3488 0,5224* + Р<О, 7 * Р<0,05 ** Р<О,О 7 143 Rezultati Tabela 81. Korelaciie izmec!u osoblna adaptivne vrednosti i aktivnosti enzima pri hronicnom efektu kadmiiuma od 30 1-19 Cd/ g suve hrane С2 a-Giik p-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST Trajanje 0,2499 0,0311 0,1320 0,2693 0,4060+ 0,5206* -0,0107 razvica Masa З.dana -0,3906+ -0,4817+ -0,0642 -0,2676 -0,1164 -0,0037 -0,1101 4. stupnja Ukupan 0,5050* 0,4252 0,3034 0,2805 0,5567* 0,3630 -0,1786 mortalitet Mortalitet 1. 0,5037* 0,4015 0,3137 0,2883 0,4996* 0,3819 -0,0851 stupnja Trajanje 1. 0,0855 О, 1934 -0,2302 0,0315 0,2011 О, 1297 -0,2532 stupnja RGR -0,1731 -0,3037 -0,0641 -0,0524 0,2493 0,3707 0,2906 Tabela 82. Korelaciie izmec!u osoblna adaptivne vrednosti i aktivnosti enzima pri oporavku od manie koncentraciie kadmiiuma С1К a-Giik p-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST Trajanje -0,0168 0,4366+ О; 1126 0,1017 -0,1260 -0,0879 0,0315 razvica Masa З.dana 0,0029 -0,5337* -0,0192 -0,0137 0,2357 О, 1268 -0,1750 4. stupnja RGR 0,3228 -0,0352 0,1911 -0,0011 0,0762 -0,1527 -0,1824 144 Rezultati Tabela 83. Korelacije izmedu osoblna adaptivne vrednosti i aktivnosti enzima pri oporavku od vece koncentracije kadmijuma С2К a-Giik P-Giik EST LAP TRIP Proteaze GST Trajanje :0,3109 -0,1273 -0,0022 0,0448 О, 1316 О, 1323 -0,1422 razvica Masa З.dana О, 1571 -0,5407* 0,2172 0,3352 0,1641 0,2524 -0,3719 4. stupnja RGR 0,0418 -0,2072 -0,2959 0,0547 0,1620 0,2352 -0,1176 145 Rezиltafj 4. 7 2 IOREDENJE KORELACIJA IZМEDU OSOBINA ADAPТIVNE VREDNOSТII AКТIVNOSТI ENZIМA Poredeпje korelacjja јzтесfи osoblпa adaptjvпe vredпostj ј aktjvпosfj епzјта па razfjCifjт tretmaпjтa и оdпоsи па koпtrofи predstavljeпo је tabelom 84. Korelacjja јzтеdи mase ј trjpsjпa па koпtrofj је zпасајпо тапја od korelacjje па akиtпom efektи тапје koпceпtracjje kadтjjиma. Ovo иkаzије па drиgaCijи povezaпost ova dva svojstva и tokи akиtпog tretmaпa КСЈ, kao ј па роvесапје mase и tokи stresa sa povecaпjem aktjvпosfj trjpsjпa {vece jskorj5tavaпje hraпe}. Obzjrom da пе postojj zпасајпа razfjka korelacjje mase ј aktjvпosfj frjpsjпa јzтесfи koпtrofe ј КС2, kao пј јzтесfи koпtrole ј hroпjcпjh tretmaпa, verovatпo da и tokи jaceg ј dиgotrajпjjeg stresa пјје mogиca ova adapfjvпa reakcjja. lzmecfи relatjvпe Ьгzјпе rasta ј GST dolazj do zпасајпе promeпe zпaka korelacjje па оЬа hгопјспа tretmaпa и оdпоsи па koпtrofи {и tokи dиgotrajпog efekta korelacjje sи pozjfjvпe, а па koпtrofj је korefacjja пegatjvпa}. Вгzјпа rasta larvj је veca и tokи hroпjcпog efekta иkofjko је aktjvпost GST а, а sатјт fјт ј odbraпa orgaпjzтa od kseпoЬiotjka veca. Najverovatпjje da и tokи dиgotrajпog defovaпja stresora, епzјтј detoksjfjkacjje јтаји k/јиспи иlоgи и rastи larvj. Zato dolazj ј do alokacjje епегgјје, koja se tro5j па sjпfezи GST, Cija роvесапа aktjvпost zпасајпо иfјсе ј па vеси relatjvпи Ьzјпи rasta larvj. lzmecfи trajaпja razvjca ј esteraze, frjpsjпa ј иkирпе proteaze dolazj do zпасајпе promeпe zпaka korelacjja па КСЈ и оdпоsи па koпtrofи {па akиtпom tretmaпи sи korelacjje пegatjvпe}. Моgисе је da и tokи kratkotrajпog efekta kаdтјјита, povecaпjem aktjvпosfj djgesfjyпjh епzјта larve skracиjи razvjce. И tokи presvlaceпja larva prestaje da jede sto ијеdпо zпaCi da sтапјије ипоs kопtатјпјгапе hraпe. Pored toga, sатјт procesom presvfaceпja, pиtem odbacjvaпja kosиfjjce, dolazj do jzbacjvaпja metala jz orgaпjzтa. 146 Rezиltafj lsta promeпa zпaka korelacjia se vjdj ј па hroпjcпom stresи па Cl и оdпоsи па koпtrolи јzтеdи mase ј GST {korelacjia ie veca па Cl ). GST ie епzјт detoksjfjkacjie ј povecaпiem пiegove aktjvпosfj и иsfovjтa stresa masa larve opada zbog preиsmeravaпia eпergjie па пiegovи sjпfezи. Меdиtјт, poredeпiem korelacjia јzтеdи mortafjteta prvog stиpпia ј /еисјп aтjпopeptjdaze иtvrdeпo ie da па Cl korelacjia postaie maпia и оdпоsи па К ј stafjsfjckj пјiе zпасаiпа. ZпaCi, da и samom pocetkи larveпog razvjca, па hгопјспот stresи maпieg jпfeпzjteta, povecaпie aktjvпosfj LAP јта vаiпи иlоgи и smaпieпiи mortafjteta larvj gиbara. Spirmaпov koeficiieпt ie statisticki zпасаiап sarrю izmedи koпtrole ј hroпicпog tretmaпa па С2 sto иkazиie па рrотепи korelacioпih strиktиra izmedи ostalih posmatraпih tretmaпa. 147 Rezultati Tabela 84. t vrednosti dobljene poredenjem korelacija izmedu osoblna adaptivne vrednosti i aktivnosti enzima па razliCitim tretmanima kadmijumom. ---- К-С1 К-С2 К-КС1 К-КС2 К-С1К К-С2К Uk.mortal.- а 0,2784 0,5944 р 0,5789 0,8117 Est 0,6935 0,1461 Lap 0,6759 0,0185 Trip 0,1546 0,7240 Prot 0,1472 0,0161 GST 0,4652 0,0380 Mortal. 1.- а 0,3614 0,9403 р 0,3923 0,2598 Est 0,9028 0,3716 Lap 1,9649* 0,9142 Trip 0,9918 0,5006 Prot 0,7663 0,0418 GST 0,9014 0,4151 Trajanje1.- а 0,6135 0,01 65 р 0,4121 0,1428 Est 0,6862 0,9423 Lap 0,3254 0,5922 Trip 0,4393 0,2929 Prot 0,7651 0,1867 GST 0,6232 0,5198 Тгај. razv.- а 0,4920 0,1972 0,4975 0,4144 0,5870 1,4619 р 1,9230 1,0546 0,0488 0,4340 0,0840 1,4956 Est 0,5528 0,2027 2,1255* 0,3455 0,2562 0,5773 Lap 0,0861 0,7668 0,6674 1,7091 0,2554 0,0896 Trip 0,8492 0,0842 2,0476* 0,1886 1,5176 0,7609 Prot 0,9912 0,6556 2,1281* 0,6053 1,2644 0,6293 GST 0,6966 0,0268 0,0006 0,4186 0,1476 0,3480 148 Rezultati Masa- а О, 1524 0,8558 0,9110 1,3652 0,3498 0,7963 ~ О , 1742 0,4278 0,6760 0,0524 0,6418 0,6474 Est 1 '1850 0,8117 0,0092 0,6411 0,6698 0,0186 Lap 1,0969 1,4917 0,7007 0,8366 0,7208 0,3142 Trip 0,2978 0,3642 2,6088** О , 1937 0,6667 0,4449 Prot 0,3156 0,2029 1,7844 0,0876 0,1768 0,5515 GST 2,8215** 0,8483 1,6962 0,3634 1,0257 1,6120 RGR- а 0,6342 0,3584 0,5992 1,5077 1 '11 02 0,2692 ~ 0,6840 0,7807 0,6226 0,3056 0,0610 0,5221 Est 0,2993 0,0783 0,7562 1,3431 0,8169 0,6040 Lap 0,2330 0,7212 0,2280 0,4752 0,5628 0,3957 Trip 0,5075 0,5697 0,2308 0,6089 0,0490 0,2941 Prot 0,6023 0,6756 0,2637 0,5447 0,8940 0,2360 GST 2,9417** 2,1242* 1,5807 0,7002 0,7031 0,8786 SPIRMANOV -0.041 0,635*** -0,147 0,270 0,022 0,316 KOEFICIJENT • Р<01 05 •• Р<О О 7 ***Р<О ОО 1 1 1 149 1 • • Diskцst а Diskиsija 5.1 DEJSТVO КАDМ/ЈИМА NA ENZIME SREDNJEG CREVA Zagacfeпost teskim metalima је detektovaпa и mпogim iпdиstrijskim regijama, ali пjihov иticaj па orgaпizme, иk/јисијиСi coveka је skoro пероzпаt. VeCiпa stиdija se zaпiva samo па тегепји metala koji је akиmиliraп и tkivи, dok је mehaпizam toksicпosti metala па celijskom пivои пedovoljпo razjasпjeп. Promeпe koje паstаји pod иticajem teskih metala se prvo desavajи па mofekиlarnom пivои. Citogeпeticke aпalize koje sи izveli Warchafowska-Silwa i saradпici {2005) роkаzији da 45,8% ieпki iz рориfасоје Tetrix teпиicornis koje sи iivefe и zagacfeпim srediпama imajи skиpove mozaicпih oogoпialпih mitotickih hromozoma kao i рrотепјеп broj hromozoma, sto moie poticati od razaraпja citoskefeta. Stиdije па fiЬroЬ/astima hrcka sи pokazafe da ofovo i iiva иtiси па sakиpljaпje tиЬи/iпа i ometajи hromozomskи segregacijи kroz iпterakcijи sa motornim proteiпima citoskefeta {Their et а/. 2003). Hrom, ofovo i kadmijиm dovode do specificпih somatskih hromozomskih rearaпimaпa kod vrste Chiroпomиs ripariиs i promeпe fипkсiопаfпе aktivпosti Ba!Ьaпijevih prsteпova {Michailova et а/. 1 ~98). И tokи mejoze kod Т. teпиicornis и prisиsfvи teskih metala primeceпe sи asocijacije izmecfи razliCitih hromozoma, aberacije hromatida {gapovi i prekidi), пedostatak fragmeпata kod пekih hromozoma i sfvaraпje mostova {Warchalowska-Silwa & Maryaпska-Nadachowska 1991 ). Prisиsfvo gapova је povezaпo sa tzv. "sfablm mestima" па hromozomи i пajverovatпije је iпdиkovaпo razliCitim mиtageпim faktorima kao sto sи uv zraceпje i/ili prisиsfvo hemikalija {Кirsch-Yofder 1984). Plaпelfo i saradпici {2006} sи иtvrdi/i da kod larvi Chiroпomиs ripariиs posfe izlagaпja kadmijиmи dolazi do razaraпja пиkfeolarne aktivпosti zbog velikog sтапјепја traпskripcije rDNK gепа. lsti tim је detektovao роvесапје ffиoresceпtпih sigпala и oЬ/asti ceпtromera, koje predstavljajи regioпe sa visoko repetitivпim {пekodirajиCim} DNK sekveпcama. Redиkcija prekиrsora rRNA i koпdeпzovaпje hromatiпa predstavljajи specificпe promeпe iпdиkovaпe kadmijиmom, obzirom da 150 Djskиsjia ove poiave пе postoie и tokи delovaпia toplotпog stresa. ZпaCi, da jzfoieпost kadтjiиmи smaпiиie пјvо aktjvпostj пиkleolиsa, sto predstav/ia dиgotraiaп efekat ce/iiskog osteceпia. Vaiпo ie паротепиtј da ostale protejпske kompoпeпte zrefjh riЬozoma koie петаiи veze sa пиkleolиsom пјsи jzfoieпe ротепиtот efektи kadтjiиma {Goviпda et а/. 2000). Novjia jstrijvaпia jsfjcи da ie пиkleofиs orgaпela koia detektиie, "oseca", ce/iiskj stres (0/sоп 2004). Моgисе ie da i kadтjiиm dovodj do promeпa па· пиk/ео/иsи, а samjm fjm iпhjblra sjпtezи епzјта па veCiпj tretmaпa (sfjke 7, 9, 11, 14, 19); Toksjcпo deistvo kadmjiиma па molekиlarnom njvoи takode zavjsj od пiegove koпceпtracjie. Ргј jzfaskи iопа Zп jz ce/iie maпie koпceпtracjie kadmjiиma od 1, 5 ј 1 О f.!M zameпiиiи iопе сјпkа ј иspostavliaiи splaisjпg molekиla RNK јп vjtro. Меdиtјт, vece koпceпtracjie kadmjiиma pokazиiи роtрипо odsиstvo prodиkata splaisjпga kod larvi Сhјгопотиs гјрагјиs {Lee et а/. 2006). Svj пapred паvеdепј molekиlarnj toksjcпj efektj teskjh metala mogи Ьitj иzrocj pada aktjvпostj posmatraпih епzјта и пasem eksperjтeпtи. lпteresaпtпo ie sto se kod cak cetjrj епzјта, иkирпјh proteaza, frjpsjпa, lеисјп aтjпopeptjdaze ј a-g/jkozjdaze, aktjvпostj zпасаiпо razfjkиiи od koпtrole па jsfjm tretmaпjтa: КС2, С2 ј С2К {sfjke 7, 9, 11, 14). Verovatпo da ie za iпhiblcjiи aktjvпosti razliCitjh епzјта potrebпa veca kofjCiпa kadтjiиma bez obzjra па dиiјпи ј fjp tretmaпa. Јеdјпо и tokи oporavaka od оЬе koпceпtracjie kadтjiиma, zпасаiап porast aktjvпostj postoij samo kod GSTa (sfjka 21 ), dok povecaпie aktjvпostj и tokи akиtпog ј hroпjcпog tretmaпa kadтjiиmom пiie statjstjckj zпасаiпо. ОЬе koпceпtracjie kadmiiиma и tokи akиtпog ј hгопјспоg tretmaпa ргјтепiепе и пasem еksрегјтепtи sa gиbarom oCigledпo пјsи Ьile dovoliпe da dovedи do ocekjvaпe aktjvacjie GST а. Njske koпceпtracjie metala ипеtе и orgaпjzam и prvim fazama detoksjfjkacjie aktjvjraiи siпtezи metalotjoпejпa koij takode јта иlоgи и eliтjпaciii kadтjiиma, ра ie to moida iedaп od razloga zasto и аkиtпјт ј hroпjcпim tretmaпjтa пе postoij zпасаiпа promeпa GSTa и оdпоsи па koпtrolи. Kod pacova ie иtvrdeпo da ргј oralпom ипоsепiи kadmjiиma prvo dolazj do 151 Diskиsija zпасајпоg роvесапја metalotioпeiпa (metallothioпeiп-like cadmiиm Ьiпdiпg proteiп} и testisima, dok sи aktivпost G5T а, kao i koпceпtracija glиtatioпa smaпjeпi iпtraperitoпealпim ипоsепјет kadmijиma и iivotiпjи (Ohta et а/. 7 997). ZпaCi, iпhiblcija samog eпzima moie Ьiti pod иticajem kadmijиma {5idhи et а/. 7 997; Cervera et а/. 2003). Ovaj metal, takocle, redиkиje G5T aktivпost kod iпsekata {Migиla & Glowacka 7 996} i vodeпih iпvertebrata (А/таг et а/. 7 987). Aktivпost ovog eпzima zavisi i od pola. Aиgиstyпiak i Migиla {2000) sи иtvrdi/i da је kod mиijaka skakavca Chorthippиs Ьгиппеиs (Thипberg) aktivпost G5T Ьila veca пеgо kod ieпki. Kod misa kadmijиm moie da formira komplekse sa glиtatioпom {Diaz- Crиz et а/. 1997}, koji иtiси па пjegovo sтапјепје, а samim tim i pad aktivпost G5Ta {fscaп et а/. 7 995). lnteresaпtaп podatak је роvесапје aktivпosti glиtatioп 5- traпsferaze kod gиseпica koje sи sи se tri dапа oporavljale od hroпicпog delovaпja kadmijиma {slika 21 С, D). Gиseпice koje sи tretiraпe kadmijиmom imajи skraceпo razvice do иlaska и cetvrti larveпi · stирапј (5/ika 4А), ра је samim tim razliCit hormoпski statиs koji ga prati и оdпоsи па koпtrolпи grири. Brie razvice larvi tretiraпih kadmijиmom kod kojih је рrотепјеп hormoпski statиs verovatпo је posledica povecane siпteze ekdisteroida i pripreme za morfogeпetske promeпe koje prati iпdиkcija aktivпosti glиtatioп 5-traпsferaze, sto sи пasi rezиltati posredпo pokazali {Nijhoиt 7 994; Kafel et а/. 2003; Eпayati et а/. 2005; Freitas et а/. 2007). Lee i saradпici {2006} sи proиcavali ekspresijи proteiпa и prisиstvи kadmijиma kod larvi Chiroпomиs прапиs. Poredeti iпteпzitet proteiпskih tacaka и dvodimeпzioпalпoj elektroforezi, иtvrdi/i sи da је aktivпost 2 7 proteiпa ора/а, а kod 7 В porasla posle tretmaпa kadmijиmom. И eпzime koji imajи роvесапи aktivпost spadajи i tri eпzima иk/јисепа и Ьiosiпtezи glиtatioпa i regиlacijи siпteze masпih kiseliпa . Eпzimi kojima је pod dejstvom kadmijиma sтапјепа aktivпost sи иklјисеп i и prodиkcijи eпergije, иtiси па fипkcioпalпost proteiпa, Ьiosiпtezи пиkleotida, celijskи dеоЬи, s igпalпи traпsdиkcijи, metabolizam masпih kiselina i fosfolipida. ·tsti tim istraiivaca pomiпje da, osim raпije opisaпih tipova detoksifikacije teskih metala kod 152 Djskиsjja jпsekata, postojj jos јеdап vjd sekvestracjje kojj zavjsj od melaпjzacjje. Nајте, јzтеdи strиktиrnjh јеdјпјса теlапјпа se пalazj пekofjko пegatjvпo пaelektгjsaпjh karboksjfпjh grиpa kojj јтаји fипkсјји katjoпskjh helatora (Rjfey 1997}. Ovakva strиktиra omogиcava рјgтепtи теlапјпи da selektjvпo veie pozjtjvпo пaelektгjsaпe cestjce, kao sto sи metafj, ј da jh sekvestгjгa и cefjje koje sadrie рјgтепtе (Bfjпska 2001 ). Njvo ovakve sekvestracjje zavjsj od епzјта {прг. feпol hjdгolaze, Zп­ metaloeпzjтa} na koje takode moie delovatj kadтjjиm. Ortel ( 1995а} је иtvгdjfa da hгопјспа jzfoieпost laгvj teskjт metafjтa (Cd, РЬ, Zп, Си) dovodj do sтапјепја иkирпјh protejпa -hemofjтfe, povecava иkирпе slobodпe атјпоkјsеfјпе hemofjтfe ј иkирпе protejпe и огgапјzти. Tako је kod laгvj koje sи gајепе па sиpstratи sa kadтjjиmom ( 1 О ј 30 ~g/ g hгапе) doslo do zпасајпоg роvесапја hjstjdjпa ј fепјfаlапјпа. Ипоsепјет kadтjjиma kгoz hгапи, kod laгvj leptjгa kиpиsara, detektovaпo је ј роvесапје Ьiogeпog атјпа - hjstaтjпa и hemofjтfj {Hиckova et а/. 1996}. Рготепјеп sastav hemofjтfe: атјпоkјsеfјпа, пеигоhогпота ј пeиromodиlatora, verovatпo moie иtjcatj па рготепи aktjvпostj eпztma. Jos јеdап od razloga kojj moie dovestj do јпhјЬ;сјје епzјта је sposobпost dvovaleпtпog kаdтјјита da zameпj katjoпe, сјпk jfj kafcjjиm, kojj и ргоtејпјта јтаји иlоgи kofaktora {Најпаиt & Mjfпer 1993; Chao et а/. 1990, 1995}. Utvrdeпo је da se kod razfjCitjh orgaпjzama, и prjsиstvи teskjh metala sтапјије aktjvпost пekjh епzјта: прг. dolazj do јпhјЬ;сјје ATPaza kod pacova (Carfagпa et а/. 1996} ј raCica Репаеиs јпdјсиs {Satyavathj & Prabhakara Rao 2000), aтjпolevиfjпske kjsele dehjdгataze kod гiЬе Hopfjas malabaгjcиs (Costa et а/. 2007), hofjпesteraze kod vrste Daphпja magпa (Dјатапtјпо et а/. 2003), alkalпe fosfataze (VIahovjc et а/. 2009}. Kod krabe Сагсјпиs maeпas је detektovaпo роvесапје aktjvпostj GST ј laktat dehidrogeпaze и odgovorи па pгjsиstvo сјпkа ј Z.ive и vodi (Eiиmafaj et а/. 2007). Сјпk ј zjva sи metafj kojj dovode do oksjdatjvпog stresa, ра је роvесапје aktjvпosti GST odbrambeпj odgovor cefjje па oksjdatjvпj stres (Eiиmafaj et а/. 2007). Medиtim, пajverovatпjje је 153 Diskиsija da pojediпi eпz1m1 lmOJи vеси osetljivost, ра do пjihove iпhiblcije dolazi i па koпceпtraciji kadmijиma od 10 ~g/g sиve hгапе. Tako, и tokи akиtпog tretmaпa КС1, sтапјепје aktivпosti је primeeeпa kod lеисiп amiпopeptidaze i esteraze {slike 1 ЈА, 1 9А), dok hroпicпi efekat С1 sтапЈиЈе aktivпosti tripsiпa, fеисiп amiпopeptidaze, a-glikozidaz e i esteraze {slike 9В, 1 7 В, 1 4В, 7 9В). lпhiblcija eпzima, иkирпih proteaza, trips iпa, fеисiп amiпopeptidaze, a -glikozidaze i esteraza primeeeпa је posfe defovaпja hroпicпog tretmaпa С2 {slike 7В, 9В, 11 В, 7 4В, 7 9В). И tokи oporavka od iste koпceпtracije пi kod jedпog pomeпиtog eпzima пета povratka aktivпosti па koпtrolпi пivo. Моgисе оЬјаsпјепје za оvи ројаvи је sиvise kratko vreme od tri dапа da Ьi dosfo do oporavka i/ili gиbltak fипkcije DNK, riЬozoma, mitohoпdrija i promeпa па пivои celijskog metabolizma koji dovode do ireverziЬilпih promeпa и strиktиri i/ili siпtezi ovih eпzima. Dиgotrajaп efekat i odredeпa koпceпtracija metala moie lakse dovesti do kompeпzatornih reakcija, povecavajиCi toferaпcijи orgaпizma и okvirи odredeпog geпetickog opsega (Doпker & Bogert 7 992; Posthиma & Vап Straaleп 7 993). Na toferaпcijи prema teskim metalima i drиgim polиtaпtima пastalim aпtropogeпim aktivпostima kod iпsekata, mogи иticati preadaptacije koje sи пastale kao оdЬгапа od prirodпih toksiпa koje proizvode Ьiljke domaCiпi {Liпdqvist 1992; Dalliпger 1993). Aktivпost p-glikozidaze samo па oporavkи od С1 zavisi od prisиstva kadmijиma и hraпi {jedпofaktorska aпaliza varijaпse, tabefa 48). Nakoп trodпevпog oporavka aktivпost beta glikozidaze је zпасајпо veea od aktivпosti izmereпe kod larvi izloieпih hгопiспот defovaпjи С1 . Negativпa vredпost iпdeksa feпotipske plasticпosti pokazиje da aktivпost ovog eпzima, takode, raste samo па С1 К и оdпоsи па koпtrofи {tabela 50). Sve ovo иkаzије па specificпost пjegove regиlacije и tokи defovaпja razliCitih tretmaпa i koпceпtracija kadmijиma. Obzirom da ovaj eпzim ima иlоgи и detoksifikaciji toksicпih glиkozida Ьiljaka, te tako omogиcava Ьо/ји toferaпcijи па Ьiljke domaCiпe, mogиce је da se tek па visim koпceпtracijama kadmijиma povecava пJegova иloga и detoksifikaciji, ali i metabolizmи secera. Vaiпo је istaCi da 154 Diskиsija lepidoptere петаји [3-galaktozidazи, vec klasи 1 [3-glиkozidazи ili klasи 1 i klasи з [3-g/иkozidaza {Ferreira et а/. 1998). Prema istim aиtorima, postoji evolиtivпi treпd ро kome se veliki broj eпzima sa razliCitom specificпoscи za sиpstrat stapa и јеdап eпzim koji moie da hidrolizиje vise sиpstrcita и istom aktivпom mestи. И пasem eksperimeпtи elektroforetska detekcija [3-g/иkozidaze gиbara cetvrtog stирпја potvrdиje оvи teorijи јег је па svim tretmaпima kadmijиmom prisиtпa samo јеdпа forma ovog eпzima {slika 18). Esteraze sи do sada иglavпom korisceпe kao Ьiomarkeri za prisиstvo orgaпofosfatпih i karbamatпih pesticida и prirodi, ра sи zato i mehanizmi iпhiЬicije пајсеsсе proиcavaпi kod ove vrste eпzima. Meciиtim, о promeпi aktivпosti ovih eпzima, kao i samim mehaпizmima iпterakcije sa teskim metalima та/о se zпа. Aktivпost karboksilesteraza skakavaca пiје Ьila и korelaciji sa stepeпom zagacieпja {Aиgиstyпiak & Migиla 2000). Najverovatпije је da па пjihovи aktivпost, osim metala, mogи иticati i drиgi faktori kao sto sи orgaпska јеdiпјепја i sastav dijete. Marczyk i saradпici { 199З) i Wilczek i Migиla ( 1996} sи pokazali пiiи karboksilesterazпи aktivпost kod paиkova iz srediпa koje sи zagadeпe metalima. Meciиtim, Wilczek i saradпici {200З) паротiпји da heterogeпost odgovora esteraza kod paиkova и prisиstvи teskih metala zavisi od pola jediпke, starosti, zagacieпosti srediпe и kojoj sи iivotiпje iivele, kompeпzatornih reakcija samog orgaпizma. Do vaiпih podataka о mehaпizmи iпhiЬicije holiпesteraze и prisиstvи iive kod drozofile sи dosli Frasco i saradпici {2007). Опi tvrde sledece: 1. iпhiЬicija је пekompetitivпa; 2. iiva se vezиje za povrsiпи proteiпa; З. iпhiЬicija пе иklјисије amiпokiseliпske ostatke и aktivпom сепtrи; 4. iiva dovodi do agregacije molekиla eпzima i stoga iпdirektпo итапјије osetljivost eпzima па iivи {slepljivaпje sprecava vezivaпje jos jedпog molekиla metala za vеzијисе mesto). 155 Diskиsija И пasem eksperimeпtи iпhiЬicija esteraza па тапјој koпceпtraciji и tokи akиtпog i hroпicпog tretmaпa pokazиje velikи osetljivost ovih eпzima. Aktivпost esteraza па КС2 i С2 је i dalje тапја od aktivпosti па koпtroli, ali је veca od aktivпosti па akиtпom i hroпicпom tretmaпи па тапјој koпceпtraciji kadmijиma. Ali, povratak aktivпosti esteraza и tokи oporavka od С 1 па koпtrolп i пivo i zпасајпо veca aktivпost па С1 К и оdпоsи па С 1 (slika 7 9А, В, С, D), potvrclиje prethodпe zakljиcke da је iпhiЬicija reverziЬilпa i da agregacija proteiпa do koje dovodi odrecleпa koпceпtracija teskog metala sprecava daljи iпtramolekиlarnи iпaktivacijи proteiпa. Kod vrste Glossiпa morsitaпs detektovaпe sи dve vrste eпzima koje sadrie јоп ciпka: tzv. ciпk-metaloproteaza i ciпk karboksipeptidaza {Уап et а/. 2002). Meclиtim, istraiivaпja па amiпopeptidazama iz sredпjeg creva vrste Spodoptera /ittoralis роkаzији da dvovaleпtпi јоп i bakra, ofova i ciпka iпhiЬirajи оvи vrstи eпzima {Lee & Aпstee 7 994). Mehaпizam iпhiЬicije eпz1ma od straпe metala jos иvek пiје и potpипosti pozпat. Postoji vise hipoteza о паСiпи iпhiЬicije. Opste је pozпato da iпaktivacija eпzima potice od vezivaпja metala za specificпe (SH) grиpe eпzima (Viareпgo 7 989; Simkiss et а/. 7 993). Proteaze sredпjeg creva vrste Mamestra coпfigиrata {Lepidoptera}, sadrie cisteiпe koji formirajи disиlfidпe mostove {Hegedиs et а/. 2003). Razlog proteazпe inhiЬicije и prisиstvи kadmijиma moie Ьiti пjegovo vezivaпje za sиlfhidrilпe grиpe, razaraпje fипkcioпalпih 5-S mostova i formiraпje mostova izmeclи metala i sиmpora и peptidпim laпcima proteiпa . Lеисiп amiпopeptidaze роkаzији пајvеси osetljivost i пjihova aktivпost se sтапјије па akиtпom efektи kadmijиma i to па оЬе koпceпtracije. Posto sи amiпopeptidaze iпsekata metaloeпzimi и Ciji sastav пајсеsсе иlaze јопi ciпka i тапgапа {Del Lama et а/. 200 7 ), mogиCi razlog iпhiЬicije ovog eпzima и пasem eksperimeпtи moie Ьiti i zameпa dvovaleпtпih metala joпima kadmijиma. Tripsiп pokazиje vееи osetljivost пеgо иkирпе proteaze i пjegova iпh iЬicija se vidi i и tokи hroпicпog stresa па С1 {slika 98), dok sи иkирпе proteaze sredпjeg creva gиbara iпhiЬirane pri svim tretmaпima па vecoj koпceпtraciji metala 156 Djskиsiia {sfjka 7А, В). Моgисе је da se и prjsиsfvи тапје koпceпtracjje kadтjjиma јпdиkији drиge proteaze, прr. elastaze, Cija је osetfjjvost па kadтjjиm тапја. Kod gиbara sи elastaze dотјпапtпе proteaze {Vafajfjs 7 995}. Копсепtrасјја od 7 О ~g Cd/ g sиve hraпe је пajverovafпjje sиvj5e та/а da Ьi doslo do detektablfпjh stetпjh efekata kod proteofjtjckjh епzјта (OSETU/VOST: LAP>TRIP>ИК.PROT) . Posto LAP јта ekstra ј jпtracefjjskи lokafjzacjjи, mogиce је da ovaj епzјт prvj reagиje па osmotskj stres {Нiгајzитј et а/. 7 992}. Obzjrom da prjsиstvo kadтjjиma dovodj do promeпe celokиpпog eпergetskog ј osmotskog balaпsa и cefjjj, promeпa aktjvпostj /еисјп aтjпopeptjdaze moie bltj јеdап od jпdjkatora пjegovog prjsиstva. Jedпofaktorskom aпafjzom varjjaпse иtvrdeпo је da koпceпtracjja kadтjjиma иtјсе па sтапјепје aktjvпosfj frjpsjпa, lеисјп aтjпopeptjdaze, иkирпјh proteaza ј a- gfjkozjdaze {tabele 28, 33, 38, 43). Kod p-gfjkozjdaze ј GST mehaпjzam promeпe aktjvпosfj se пajverovatпjje razfjkиje od prethodпjh епzјта. Nајте, ј kod p- gfjkozjdaze ј GST promeпa aktjvпosfj samo и tokи oporavka od Cl zavjsj od prjsиsfva kadтjjиma и hraпj {tabele 48, 58). Моgисе da do promeпe aktjvпostj ovjh епzјта dolazj jпdjrektпo, modиlacjjom mпogobrojпjh mehaпjzama sjпfeze ј sekrecjje, а пе samo djrektпom jпhjblcjjom. Qvj mehaпjzтj se razfjkиjи od mehaпjzama jпhjblcjje proteofjtjckjh епzјта, ра zato па ostafjт efektjтa ј koпceпtracjjama kadтjjиma пе moiemo пј detektovatj promeпe aktjvпostj ovjh епzјта detoksjfjkacjje. Gијfhегтјпо ј saradпjcj {1998) sи jzпefj hjpotezи da jпhjblcjja hofjпesteraze potjce od vezjvaпja metala za апјопskо mesto епzјта. Zbog vezjvaпja metala za апјопskо mesto, acetjfhofjп se пе moie vezatj za епzјт ј пе moie bltj razloieп. 1 RazfjCitj metafj петаји jstj afjпjtet za vezjvaпje za епzјт. Razfjke и afjпjtetи роtјси od razfjCife vefjCiпe јопа, kapacjteta za fогтјгапје kompleksa, elektroпegatjvпostj redиkcjoпog poteпcjjala {Gијfhегтјпо et а/ 1998; Grjppo & Heath 2003). Zbog sposobпostj kadтjjиma da zameпj dvovaleпtпe metale и епzјтјта kojj јтаји fипkсјји kofaktora, ј vezjvaпja za traпsportere metala kojj se пalaze и cefjjskoj 157 Diskиsija membraпi (Vап Straaleп & Doпker 7 994), moiemo da zakljиCimo da је иgroieп kako пormalпi metabolizam и celiji, tako i metabolizam metala koji imajи vаiпи fizioloskи fипkсiји. Kod iпsekata sи detektovaпe dve proteaze kojima је potrebaп јоп ciпka za pravilпи fипkсiји {Macoиrs & Непs 2004). Metaloproteiпaza оzпасепа kao АСЕ {aпgioteпs iп-coпvertiпg eпzyme} и sredпjem crevи diptera ima digestivпи иlоgи (Wijffefs et а/. 7 996}, а kod drozofile јој se aktivпost povecava pre i za vreme formiraпja lиtke {Wilsoп et а/. 2002). Metali sи sposobпi da formirajи veoma jake veze sa histidiпom i metioпiпom и bocпim laпcima kod прr. metaloeпzima (Frasco et а/. 2007), sto је пajverovatпije i иzrok iпhiblcije пekih eпzima и tokи delovaпja vece koпceпtracije kadmijиma и пasem eksperimeпtи. 5.2 DEJSNO КADMUUМA NA OSOBINE ADAPТIVNE VREDNOSТ/ Рготепе па molekиlarnom mvoи koje sи posledica delovaпja kadmijиma mogи dovesti i do promeпa kod osoblпa adaptivпe vredпosti. Cervera i saradпici {2004) sи kod vrste Oпcopeltиs fasciatиs ispitivali иticaj razliCitih koпceпtracija kadmijиma па veliki Ьгој osoblпa adaptivпe vredпosti. Utvrdi/i sи da se prodиiava trajaпje stadijиma lиtke i opada teiiпa adиlta sa povecaпjem koпceпtracije kadmijиma. Kod jediпki koje sи Ьile izloieпe kadmijиmи иstaпovljeпa је i zavisпosti izmedи sтапјепја teiiпe i vremeпa izlegaпja {sтапјепје teiiпe је proporcioпalпo kаsпјепји и razvicи). lпteresaпtпo је da и пjihovom eksperimeпtи osetljivost па prisиstvo kadmijиma zavisi od pola jediпki. Na sтапјепо preiivljavaпje ieпki иticala је тапја koпceпtracija kadmijиma и оdпоsи па preiivljavaпje mиijaka. Medиtim, stepeп ovipozicije, fekипditet i fertilitet sи parametri koji sи пajvise Ьili pogodeпi prisиstvom ovog metala. Redиkcija rasta и prisиstvи teskih metala је detektovaпa kod terestrijalп ih hemimetaЬola {Posthиma 1990; Schmidt et а/. 7 992), holometabolпih iпsekata (Ortel 158 Diskиsija 7 996) vodeпih holometabolпih larvi, С. прапиs, (Sildaпchaпdra & Сгапе 2000) i kolembola (Crommeпtиijп et а/. 7 993). Terestrijalпe isopode и prisиsfvи kadmijиma sтапјији masи i роkаzији veCi mortalitet (Odeпdaal & Reiпecke 7 999). И пasem eksperimeпtи sa povecaпjem koпceпtracije kadmijиma dolazi do statisticki пеzпасајпоg роvесапја mortaliteta larvi gиbara, kako иkирпоg do cefvrtog stирпја, tako i mortaliteta prvog stирпја. Koпceпtracije kadmijиma od 7 О i 30 ~g sи verovatпo пiske· da Ьi dovele do vece smrtпosti jedпog odredeпog larveпog stирпја i/i da Ьi zbog eveпtиalпog kиmиlativпog efekta · и tokи razvica Ьile иzrok sтапјепот preiivljavaпjи. Vап Ooik i saradпici (2007) sи иtvrdi/i da se brziпa rasta moljca Epirrita аиtитпаtа zпасајпо razlikиje izmedи legala koja sи gајепа па пekoпtamiпiraпom liscи i liscи и kome је иtvrdeпo prisиsfvo teskih metala, dok se teiiпa lиtke пiје razlikovala и odgovorи па zagadeпost srediпe. Postoji mogиcпost da larve тапји Ьгziпи rasta и prisиsfvи teskih metala kотрепzији prodиiavaпjem larveпih stиpпjeva. И пasem eksperimeпtи vidljivo је skraceпje trajaпja razvica prvog stирпја i иkирпоg trajaпja razvica do иlaska larve и cetvrti stирапј и оdпоsи па koпtrolи i to samo и tokи hroпicпog tretmaпa па vecoj koпceпtraciji kadmijиma . Rezиltati dobljeпi и паsој laboratoriji иkаzији da koпceпtracije kadmijиma od 7 О i 30 ~gCd/ g sиve hгапе пе иtiси zпасајпо па trajaпje larveпog razvica, masи lиtke i dиiiпи iivota ieпki i mиijaka gиbara. Jediпo тапја koпceпtracija kadmijиma kod ieпki i оЬе koпceпtracije kadmijиma kod mиijaka zпасајпо skracиjи trajaпje razvica lиtke (MirCic, пeobjavljeпi podaci}. Моgисе је da sи akиtпi tretmaпi па оЬе koпceпtracije kadmijиma, ali i hroпicпi efekat па 7 О ~g Cd/ g hгапе sиvise slabl da Ьi doveli do statisticki zпacajпih рготепа dиiiпe razvica larvi gиbara . Dиgotrajпi tretmaп пiskih koпceпtracija teskih metala moie dovesti do odredeпog stepeпa toleraпcije i/i adaptacije па teske metale kod iпsekata {Posthиma & Vап Straaleп 7 993; GodoCikova et а/. 7 993). Osim toga, Liпgj~rde i saradпici (2001 Ј sи иstaпovili da је razvice kod adиlta, Lиcilia sericata, и tokи izloieпosti kadmijиmи, 159 Djskиsjja osetfjjvjje па toksjkaпt od larvenog razvjta. ZпaCi, da se stefпj efektj kadтjjиma sтапјепје adaptjvпe vredпosfj mogи иoCifj ј kasпjje kod adиlta jпsekata . Gjпfeпrejfer ј saradпjcj {1993) sи kod gиbara иoCifj sпаiпи korelacjjи јzтеdи sadriaja teskjh metala ј tezjпe razfjCitjh razvojпjh stиpпjeva gиbara. Prema tome, sтапјепје mase larvj cetvrtog stирпја moie da se оЬјаsп ј иtroskom eпergjje za razfjCite fjpove ekskrecjje teskjh metala {preko fecesa, glaveпe kapsиfe ј egzиvjja}, koje sи ротепиfј aиtorj detektovafj и tokи jzfoieпosfj gиbara teskjт metafjтa. Оsјт toga, oko 35% иkирпе kofjCiпe kadтjjиma se ekskretиje prj svakom presvlaceпjи {Posthиma et а/. 1992). Моgисе је da se odriavaпjem adekvatпog broja razvojпjh stиpпjeva јzЬасије kadтjjиm ј sprecava пjegovo dеропоvапје. lпteresaпtпo је da ројеdјпе vrste mogи da osete kопtатјпапtе и hraпj ј јzЬеgпи пjjhovo ипоsепје (01/а et а/. 1980; Vап Capelleveeп et а/. 1986}. Tako прr. gиsепјсе Dejfephjfa efpeпor koje sи gајепе па fjstи sa kаdтјјитот ostavljajи перојеdепе delove fjsta и kојјта је koпceпtracjja metala роvесапа {Nиorteva et а/. 1992). lzbegavaпje kопtатјпјrапе hraпe moie dovesfj do sтапјепја mase larvj. Т ako se и пasem eksperjтeпtи па оЬе koпceпtracjje kadтjjиma и tokи akиtпog efekta ј па С2 и tokи hroпjcпog tretmaпa sтапјије proceпat mase sredпjeg creva и оdпоsи па masи larve {sfjke 22А, В). Posto рrоисаvапј parametar predstavlja jпdjrektпи merи koпzиmacjje hraпe, moiemo da zakljиCimo da kadтjjиm kod larvj gиbara cetvrtog stирпја moie dovesfj do smaпjeпog ипоsа hraпe. lпteresaпtпo је sto se % mase sredпjeg creva и tokи oporavka od С2 пе vraca па koпtrofпj пјvо {sfjka 22D). Verovatпo da za оvи оsоЬlпи koпceпtracjja od 30 J..tgCd/ g sиve hraпe predstavlja sиvjse vefjkи kопсепtrасјји da Ьi se povecala koпzиmacjja, jfj је fr j dапа пedovoljпo za oporavak. Qvj rezиltafj sи и saglasпosfj sa rezиltafjтa koje sи doblfj Fred ј Brommer {2005). Опј sи иtvrdjfj da se kod larvj dve рориlасјје vrste Parnass jиs apollo sтапјије ипоsепје hraпe kопtатјпјrапе kadтjjиmom ј to kod оЬа pola. Doпker { 1992) smatra da orgaпjzтj mogи da trose dodatпи епеrgјји па jzbegavaпje kопtатјпапаtа. Na ovaj паСiп se moie dеfјтјспо objasпjfj ј zпасајап gиbltak mase 160 Djskиsjja kod orgaпjzama kojj sи jzfoieпj kаdтјјити и оdпоsи па пеtгеtјгапе zjvotjпje. Kod jпsekata postojj jos јеdап jпteresaпtaп паСiп adaptacjje ј jzbegavaпja te5kjh metala kojj se sastojj и fогтјгапји tиЬе oko larve kod Сhјгопотиs fигјdиs {Helpern et а/. 2002), jпkapsиlacjje ј modиfjsaпja јтипоg odgovora рготепот aktjvпostj feпol oksjdaze kod moljca Е. аиtитпаtа {Vап Oojk et а/. 2007). Kod jпsekata је ргјsиtпо иzајатпо оgгапјсепје {eпgl. trade-off} јzтеdи rasta ј јтипоg odgovora {Raпtala & Roff 2005). Alokacjja епегgјје ka јтипот odgovoru ј sjпtezj protejпa kojj иlaze и sastav za5tjtпjh strиktиra moie dovestj do иsporeпog rasta, sтапјепја mase laгvj ј jпhjblcjje djgestjvпjh епzјта. Posto аkиtпј tretmaп 1 О ј 30 Ј.!9 Cd/ g sиve mase hгапе п ј је doveo do pada mase laгvj cetvгtog stирпја (slika 5А}, moiemo da zakljuCimo da је koпceпtracjja metala пedovoljпa jfjfj tretmaп kadтjjиmom vremeпskj kratak da Ьi doslo do pada mase. Меdиtјт, па dиgotrajпom stresи па С2 ј oporavcjтa (С1 К ј С2К) гegjstrovaп је pad mase gиЬага cetvгtog stирпја (sfjke 5С, D). Sтапјепје ove оsоЬiпе adaptjvпe vredпostj је јгеvегzјЬi/па pojava povezaпa sa vefjkjт Ьгојет regиlatornjh mehaпjzama kojj пе dozvoljavajи oporavak mase, иk/јисијиСi ј preиsmeravaпje епегgјје па procese kojj omogиcavajи preijv/javaпje. И рогеdепји sa masom laгvj, kadтjjиm па relatjvпи Ьгzјпи rasta delиje па drиgj паСiп. И tokи akиtпog tretmaпa, оЬе koпceпtracjje kadтjjиma ј oporavak od С2 dеlији stjтиlatorno па Ьгzјпи rasta cetvгtog stирпја (s/jke 6А, D). Ро prestaпkи defovaпja stresora jaceg jпteпzjteta larva иbrzava razvjte, povecavajиCi masи ј иspostavljajиCi погтаlпе fjzjo/oske procese. Na akиtпom tretmaпи se пajverovatпjje radj о kотрепzаtогпјт reakcjjama kојјта se иbrzava proces presvlaceпja. Иtvrdeпo је da па 10 ј 30 J.!gCd/g sиve hгапе dolazj do рготепе и vefjCiпj пиkleolиsa L' 2 пеигопа, kao ј saтjh пеигопа kojj sи detektovaпj kao mesto sjпteze vefjke forme РТТН (1/јјјп, пеоЬјаv/јепј podacj). Моgисе је da ova рготепа и пjvou РТТН moie иtjcatj па иЬгzапо presvlaceпje ј razvjce laгvj jzfoieпjh kаdтјјити. Nascarella ј saradпjcj (2003) sи kod vrste Рhогтја геgјпа Mejg иstaпovjfj da је па пјzјт koпceпtracjjama kаdтјјита иspesпost иlиtkavaпja veca 161 Djskиsjja пеgо па veCim kопсепtгасјјата. Navedeпe pojave se mogи objasпjfj pojavom koja se пazjva hoгmezjs. То је adaptjvaп odgovor zavjsaп od kопсепtгасјје polиtaпata, а kaгakteгjse ga stjтиlacjja оdгеdепе osoblпe па та/ој kопсепtгасјјј polиtaпta ј jпhjblcjja па vecoj. Hormezjs moie bltj jfj djгektпo јпdиkоvап jfj rezиltat kompeпzatoгпjh Ьioloskjh procesa koje zatjт pratj рогетесај homeostaze {Calabгese & Baldwjп 2002). Каdтјјит јпdиkије hoгmefjckj odgovor kod vefjkog Ьгоја orgaпjzama {Calabгese & Baldwjп 7 999), а пjegov mehaпjzam је jos пероzпаt. Каdтјјит kojj је dodat и hгапи dovodj do sтапјепја mase ј ргоdиiепја laгveпog гazvjta kod laгvj Boettcheгjsca регеgгјпа (Djptera} {Gиo-Xiпg et а/. 2006}. Оsјт toga, kod ovjh laгvj је иtvгdепо da pгjsиstvo ovog metala dovodo do sтапјепја sadгiaja sfobodпjh ргоfејпа и hemofjfj. Ovo је и saglasпosfj sa rezиltafjтa koje sи doblfj dгиgј jsfгaijvaCi ргоисаvајиСi dejstvo kadтjjиma па jпsekte jfj dгиgе jпvertebгate {Rathoгe et а/. 7 979; Са гг et а/. 7 985; Ortel 7 99 7; Сhјппј & Yallapragada 2002), а и skladи је ј sa jпhjblcjjom skoгo svjh ргоисаvапјh djgesfjyпjh епzјта и пasem еksрегјтепtи. Nasиprot sтапјепји solиblfпjh ргоfејпа, pгjsиstvo kadтjjиma и hгапј povecava sadгiaj иgljeпjh hjdгata kod В . peregrjпa ј Chrysochoгjs stofj {lslam & Roy 7 983; W и et а/. 2006}. /пtегеsапtпо је da је и пasem еksрегјтепtи и tokи hroпjcпog tгetmaпa па тапјој kопсепtгасјјј kadтjjиma, akиtпom efektи С2 ј oporavkи od С2 јпhјЬlгапа degгadacjja иgljeпjh hjdгata zbog jпhjblcjje a-gfjkozjdaze {sfjke 14А, В, D). И tokи dиgotгajпog tretmaпa па 30 11gCd aktjvпost ovog епzјта se zпасајпо povecava. Rezиltatj пasjh jstraijvaпja sи и saglasпostj sa rezиltatjтa koje је па jstoj vrsfj doblla Ortel { 7 996), gde se па тапјој kопсепtгасјјј teskjh metala {kadтjjиma, olova ј Ьаkга} povecava kопсепtгасјја sloieпjh иgljeп jh hjdrata {g/jkogeпa} . Na vecoj kопсепtгасјјј metala, ovaj odпos јzтеdи sloieпjh ј prostjh иgljeпjh hjdгata se тепја. Рогеd fjzjofoskjh aspekata jedпog огgапјzта, eпergetskj metabofjzam јта klјиспи иlоgи и prevazjfaieпjи stefпjh иtјсаја teskjh metala, koj j иfјси па preijv/javaпje, rast, razvjce ј гергоdиkсјји orgarijzama. Се/оkирп ј efekat jzfoieпosfj teskjт metafjтa kojj иfјсе па рготепи и п јvои 162 Djskиsjja energetskjh prekиrsora {иgljeпjh hjdrata, protejпa ј fjpjda} moie иtjcatj па иkирпи kalorjjskи vrednost. Npr. zbog smanjenja secera, smanjиje se ј kalorjjska vrednost hemofjтfe kod vrste В. peregrjпa. Promene kalorjjske vrednostj и tokи delovanja ksenoblotjka mogи bltj posledjca modjfjkacjje metabofjzтa jfj smanjenja jпteпzjteta metabofjzтa {Graney & Gjesy 1986; Сhјппј et а/. 2000). Utvrcleno је da kod mrava, prjsиstvo kadтjjиma proиzrokиje pad АТРа, povecanje koncentracjje АМРа dovodeti do smanjenja • vrednostj АЕС {engl. adenylate energy charge} (Mjgиla 1997). Optjтalno resenje za иsmeravanje energjje rezиltиje и postojanjи najvece adaptjvпe vrednostj и datjт иslovjтa. Pod иslovjтa se podrazиmeva vrsta toksjkanata ј пjjhova koncentracjja, cena detoksjfjkacjje, а/ј ј drиgj blotjckj ј ablotjckj faktorj zjvotne sredjпe kao sto је npr. dostиpnost hrane {Maryanskj et а/. 2002). Ро Roelofsи ј saradпjcjтa {2008) tolerantne zjvotjпje sи se adaptjrale preko jzтenjene konstjtиtjvпe detoksjfjkacjje kadтjjиma (jfj nekog drиgog teskog metala}. Na taj naCin, kod zjvotjпja koje zjve и zagacleпjт sredjпama, cefjjska homeostaza moie bltj odriavana иprkos povecanjи иnиtrasnje koncentracjje jona metala, omogиcavajиti pro5jrjvanje пј5а koje naseljavajи ove vrste. Tako npr., jпsektj оsјт povecane sjпteze metalotjoпejпa kojj иcestvиje и detoksjfjkacjjj kаdтјјита, mogи vr5jtj detoksjfjkacjjи metala sресјfјспјт g/jkoprotejпjтa kojj пјsи metaloprotejпske prjrode {Маrопј 1990), granиlama koje se nalaze и crevи {Hensbergen et а/. 2000), eksfo/jjacjjom jednoslojnog crevnog epjtela {Posthиma et а/. 1992), akиmиlacjjom и egzoskeletи {Van Straalen & Donker 1994} ј sekvestracjjom {Laиverjat et а/. 1989). 163 Djskиsjja 5.3 VARIJABILNOST Еvоfисјопо gledaпo, toksjkoloskj odgovorj ипиtаг рориlасјје sи јzгаiепј preko zЬira raz fjCi fost j geпetjckjh jпformacjja koje sи kоdјгапе ипиtаг geпofjpa jпdjvjdиe. Geпefjcka vaгjjaЬifпost је osnova adaptjvпe ffeksjЬifnosfj и рориlасјјј {Dиап et а/. 200 1 ). Sposobпost рориlасјје da odgovorj па promeпe и ijvotпoj sгеdјпј zavjsj od geпetjcke varjjaЬilпostj (Gиttmaп 1994; Tempfetoп 1995}. Aпtropogeпj faktoгj, kao sto је zagadeпost, moie dovestj do sefektjvпog preijvfjavaпja jedjпkj odredeпjh geпotjpova. Hoffmaпп ј Мегјfёi ( 1999} sи jzпefj пekofjko hjpoteza zasto heгjtaЬilпost svojstva moie da se razfjkиje јzтеdи рориlасјја koje паstапјији povoljпe ј пероvоlјпе ijvotпe sredjпe. Prvo, stresпj иsfovj {опј kojj dovode do drastjcпog sтапјепја adaptjvпe vredпostj), mogи djгektпo da dovedи do роvесапја geпetjcke vагјјапsе razfjCitjh оsоЬiпа zЬog povecaпog stepeпa mиtacjja ј rekomЬiпacjja. Ova hjpoteza, jpak, пе moie da оЬјаsпј razfjke и heгjtaЬilпosfj јzтеdи sredjпa koje se mogи иoCitj јzтеdи rodjtelja ј potomaka. Роvесапје geпetjckjh varjjaпsj za masи gиЬага и оdпоsи па koпtrolи је ргјтеtепо па оЬе koпcentracjje kadтjjиma и tokи akиtпog tretmaпa. Т akode, и tokи оЬа kratkotrajпa efekta kadтjjиma heгjtaЬilпost је stafjsfjckj zпасајпа {tabela 7), sto иkаzије da sи ргј kratkotrajпom tretmaпи kadтjjиmom geпefjckj Сiпјосј иzrok vагјгапји mase, dok sa povecaпjem koпceпtracjje kadтjjиma vагјгапје mase zavjsj ј od koпceпtracjje metala {па С2 ј С2К promeпa mase zavjsj od kadтjjиma}. Vaiпo је jstati da variraпje mase па svim tretmaп jтa zavisi od geпetickih faktora . Znacajпa iпterakcija ,,Leglo х Cd" и akиtпom efektи {tabela 6}, иkаzије da se geпotipovi razfjkиjи и паСiпи promeпe mase и odgovorи па kadmijиm. Najverovatnije, da posfe kratkotrajпog stresa, geпotipovi роkаzији razlike и efikasпostj odbrambeпjh mehaпizama · i razliCitih kompeпzatornih reakcija koje и pocetпim fazama stresa исеstvији и odriavaпjи homeostaze osoЬina povezaпih sa adaptivпom vredпoscи orgaпjzтa, иk/јисијиСi i masи. 164 Djskиsjja И пеkјт slиcajevjтa kratkotrajпj fjzjofoskj odgovor па stres јаsпо иklјисије jsfj mehaпjzam kao ј selekcjoпj odgovor па jzfoieпost stresи tokom vjse geпeracjja. Ovo se moie пaroCito ocekjvatj и s/исаји prjsиsfva retkjh metabofjta и hraпj, dok sи роvесапе aktjvпostj епzјта potrebпe za procese detoksjfjkacjje jfj koгjsteпja hгапе {Ciark & Fиcjto 7 998). Postoje dokazj da рготепе и hraпj иtјси па пјvо traпskгjpcjje: прг. etaпol и теdјјити јпdиkије роvесапи traпskгjpcjjи Adh kod larvj drozofjfa {Geer et а/. 7 988). • Aпafjze varjjaпse sи pokazale da Ьi proteofjtjckj епzјтј {иkирпе proteaze, trjpsjп ј LAP) mogfj da Ьиdи oset/jjvj parametrj па -prjsиsfvo kаdтјјита, јег јт se aktjvпost тепја и zavjsпostj od koпceпtracjje metala и tokи akиtпog, hroпjcпog stresa ј оЬа oporavka {izиzecj: kadтjjиm пе иtјсе па иkирпе proteaze па С7 К ј па trjpsjп и tokи akиtпog tretmaпa С7 ј opravka od jste koпceпtracjje, sfjke 7С, 9А ј С). Dvofaktorska ANOVA pokazиje da, ргј рогес1епји akиtпog ј hroпjcпog tretmaпa, tretmaп, koпceпtracjja metala, kao ј пjjhova jпterakcjja пе иtјси zпасајпо па рготепе aktjvпostj LAP, оЬе g/jkozjdaze ј esteraze {tabele 37, 42, 47, 52}. Рогес1епјет akиtпog jfj hгопјспоg tretmaпa sa oporavkom иtvгdjfj smo da па иkирпе proteaze, trjpsjп ј LAP zпасајпо иtјси koпceпtracjje metala, kao ј jпterakcjja tretmaпa ј koпceпtracjje, dok aktjvпost p-gfjkozjdaze zavjsj ј od tretmaпa {tabele 27, 32, 37, 47). Рогес1епје hroпjcпog efekta ј oporavka је pokazalo da па aktjvпost detoksjfjkacjoпjh епzјта (p-g/jkozjdaze, esteraze ј GST) zпасајпо иtјсе tretmaп {tabele 47, 52, 57). Jedпofaktorska aпafjza vагјјапsе иkаzије da prjsиstvo kadтjjиma- и hгапј zпасајпо иtјсе па aktjvпost LAP ј a-gfjkozjdaze па sv1m tretmaпjтa {tabele 38, 43), dok и tokи oporavka od С7 kadтjjиm zпасајпо иtјсе па sve ргоисаvапе епzјте, оsјт иkирпјh proteaza {tabela 28}. Ргј hгопјспот delovaпjи kadтjjиma ј oporavkи od С2 aktjvпost svjh proteofjtjckjh епzјта, kao ј a- g/jkozjdaze zavjsj od prjsиsfva metala и hraпj {tabele 28, 33, 38, 43). lzпete sи ј hjpoteze koje оЬјаsпјаvаји sтапјепје geпetjcke vап1апsе и пероvоlјпјт иslovjтa. Najcesce оЬјаsпјепје sтапјепји heгjtaЬilпostj и иslovjтa 165 Diskиsija stresa је роvесапје srediпske vantaпse. Ovo је cesti sfиcaj kod artropoda koje prolaze kroz veliki broj larveпih stиpпjeva. Ako пepovoljпi иsfovi роvесаји variraпje Ьгоја iпstara, роvесапје feпotipske varijaпse и vefiCiпi i seksиafпom sazrevaпjи moie da smaпji heritablfпost svojstva (Ebert et а/. 7 993}. Pad varijaпse и tokи oporavka od С2 z a LAP i trips iп moie иkazivati: 1} da se posfe hroп icпog e fekta С2 siпteza i sekrecija ovih eпzima odvijajи ипiformпije, а samim tim verovatпo dolazi do boljeg iskoristavaпja hraпe и tokи stresa, oporavka larvi i preiivljavaпja i/ ili 2) da је kod vetiпe legala mogиc ireverzibllaп pad aktivпosti и tokи oporavka od С2. Varijansa tripsina i иkирпih proteaza је veca па koпtroli пеgо па tretmaпima kadmijиmom {tabefe 29 i 34). Neki aиtori smatrajи da se и tokи stresa varijaпsa povecava samo kod oпih eпzima koji direktпo иtiси па detoksifikacijи posmatraпog kseпoblotika {Parker & Callaghaп 1997; Callaghaп et а/. 1998). ZпaCi da ova vrsta proteolitickih enzima пiје иk/јисепа и detoksifikacijи kadmijиma. Videli smo da iivotпa srediпa moie иticati па ekspresijи geпeticke vrijaпse, dovodeti do роvесапја i/i sтапјепја heritabllпosti. Ako је sredпja vredпost svojstva sтапјепа pod иticajem пероvоlјпе srediпe, пјепа heritablfпost moie da se smaпji zato sto geпi koji и пajvetoj meri koпtrolisи vrednost tog svojstva петаји иticaj па kопаспi feпotip (Ноffтапп & Merili:i 1999). И пasem eksperimeпtи, heritabllпost ima zпасајпи vredпost па koпtroli i па оЬа hronicпa tretmaпa za trajaпje razvica prvog stирпја, kao i za trajaпje razvica do иlaska и cetvrti larveпi stирапј. Ove osoblпe роkаzији sficпe rezиltate и aпalizi varijaпse. lпterakcija geпotip {fegfo) i srediпa (tretmaп kadmijиmom} иtiси па рrотепи ovih osoblпa adaptivпe vredпosti. Obzirom da poredeпjem geпetickih i srediпskih varijaпsi пisи dobljeпe zпасајпе F vredпosi moiemo da zakljиCimo da za trajaпje razvica prvog stирпја i razvica do иlaska и cetvrti geпeticki i srediпski Ciпioci пisи razliCiti izmeclи koпtrofe i tretmaпa kadmijиmom. Vaiпa Сiпјепiса је da se masa i relativпa brziпa rasta пе mogи koristiti kao pogodпi parametri za иtvrclivaпje efekata kadmijиma па gиbara. Naime, 166 Diskиsija poredeпjem ovih parametara izmec!и razliCitih tretmaпa trofaktorskom aпalizom varijaпse иtvrc!eпo је da koпceпtracija kadmijиma пе dovodi do statisticki zпacajпih promeпa ovih osoblпa {tabele 5, 7 2) . Ргоисаvапје iпterakcije "geпotip х srediпa" se оЬlспо odпosi па proЬiem kako se evolиtivпo тепја feпotipska plasticпost i do kog пivoa је adaptivпa. Рготепа и poretkи adaptivпe vredпosti geпotipa и razliCitim srediпama moie da odrii polimorfizam й klasicпo рори/асiопо geпetickom smislи, ра iпterakcija "geпotip х srediпa" moie slicпo tome blti zпасајпа sпaga koja odriava varijabllпost и prisиstvи drifta i drиgih Ciпilaca koji mogи smaпjivati varij~Ьilпost (Ciark & Fиcito 7 998). Gillespie & Т иrelli { 7 989) sи razmatrali zпасај iпterakcije "geпotip х srediпa" kao Cist aditivaп model и kome geпotipovi imajи varirajиcи adaptivпи vredпost zbog razliCitih иslova srediпe. Ро ovom modelи geпotip kojima пajvise heterozigotпih lokиsa је bolje prilagoc!eп пovim иslovima srediпe. Mec!иtim, пismo и mogиcпosti da и laЬoratorijskim eksperimeпtima и potpипosti sagledamo рипi opseg iivotпih srediпa, јег eksperimeпtalпo izabraп skиp иslova пе opisиje tаспо staпje svih parametara и prirodi koji dеlији па јеdап geпotip. Da blsmo bl/i и mogиcпosti da odredimo da /i је iпterakcija "geпotip х srediпa" vaiпa za odriavaпje varijabllпosti, пеорhоdпо је odrediti veze izmec!и пivoa metabolizma i adaptivпe vredпosti {fitпesa}, sto пiје lak zadatak. Prvo, vaiпi izvori varijabllпosti sи cesto regиlatorni faktori, koji sи cesto plejotropпi. Drиgo, па рrотепи пekih osoblпa metabolizma иvek delиje istovremeпo vise parametara, а пе samo јеdап koji moie blti predmet пaseg istraiivaпja. 5.4 VARUABILNOST ENZIMSКIH /ZOFORМI Мпоgе ekotoksikoloske stиdije isticи zпасај geпeticke varijabllпosti za adekvataп odgovor popиlacije па аkиtпе promeпe и iivotпoj srediпi, kao i delovaпja koпtamiпaпata tokom vise geпeracija. И prisиstvи koпtaminaпata selekcija favorizиje iпdividиe toleraпtпe па stres i moie da dovede do sтапјепја geпeticke varijabllпosti 167 Diskиsija {Gиttmaп 1994). Aпaliza alozima {а takocle i izozima}, moze da se koristi kako Ьi se odgovorilo па pitaпja kao sto sи ideпtifikacija otpornosti/osetljivosti geпotipova, veza izmeclи geпeticke razпolikosti i toleraпcije, kao i kako se geпotip i/ili frekveпcija alela тепјаји и zavisпosti od izlozeпosti koпtamiпaпtima. Geпeticki faktori mogи da ispolje jaCi efekat па preZivljavaпje пеgо па drиge osoblпe, kao sto sи прг. masa i/i drиge osoblпe orgaпizma koje sи cesto povezivaпe sa preZivljavaпjem (Schlиeter et а/. 1997). Rezиltat ovakvih stиdija favorizиje determiп isticki model и рориlасiопој geпetici. Ovaj model podrzava misljeпje da је proteiпski polimorfizam adaptabllaп ili poteпcijalпo adaptabllaп и prirodi. ZпaCi, da odrzavaпje stabllпe geпeticke strиktиre, sa odrecleпim пivoom varijabllпosti, omogиcava popиlaciji sa geпetickom plasticпoscи da adekvatno reagиje па izпепаdпе ili dиgotrajne srediпske рготепе {Сhаgпоп & Gиffmaп 1989; Gиffmaп 1994). Na primer, kod medoпosпe pcele detektovaпe sи cetiri vrste amiпopeptidaza и zavisпosti od prefereпce za sиpstrat, efekata iпhibltora, tkivпe specificпosti i distriЬиcije koja zavisi od oпtogeпetskog razvica. Osim toga, elektroforetski је иtvrcleпo da samo јеdпа vrsta amiпopeptidaze {оzпасепа kao Lap-D) ima cetiri varijaпte sa veoma velikim пivoom iпtralokиsпe heterozigotпosti {Del Lama et а/. 2001). lzozimi predstavljajи mиltipпe forme пekog eпzima koje se mogи pojaviti kod јеdпе vrste i/i и okvirи јеdпе celije. Опi katalizиjи istи reakcijи i kodiraпi sи od straпe jedпog gепа {Hodgsoп 2004). lzozimi poteпcijalпo predstavljajи Ьгојпе alozimske forme {Mиkherjee et а/. 2004). Za svakи рориlасiји i za svaki specificпi polиtaпt, aleli koji determiпisи otpornost па пjih се povecati иcestalost ako је orgaпizam koпtiпиiraпo izlozeп koпtamiпaciji {Уар et а/. 2004). lstrazivaпja sи pokazala da se sa veeim stepeпom geпeticke varijabllпosti и popиlaciji povecava saпsa da се popиlacija blti и mogиcnosti da tolerise izlozeпost teskim metalima (Kierks & Weis 1987). Ako prezivljavaпje popиlacije pod иticajem srediпskog stresa z avisi od пekoliko specificп ih otpornih alozimskih geпotipova, опdа је рготепа frekveпcije 168 Djskиsjja alozjтa adaptjvпa . Afj, ako promeпe и frekveпcjjj alozjтa исеstvији и redиkcjjj иkирпе geпetjcke varjjabllпosfj {sтапјије se heterozjgotпost ј pofjтorfjzam), jfj povecavajи oset/jjvost па drиge sredjпske stresore, tada sи promeпe и аlоzјтјта maladaptjvпe ј mogи bltj povezaпe sa пegatjvпim efektom sredjпe {Gиttmaп 1994; Еvепdеп & Depledge 1997). Vjdjтo da se и пasem eksperjтeпtи jzoforme jedпog eпz1ma па jedпom tretmaпи razlil<иjи izmedи razfjCitjh legala {ozпaceпih sa 1, 2, 3), kao i da se izoforme eпzima kod jedпog legla (obeleieпih istim brojevjтa) razfjkиjи јzтеdи vise tretmaпa. RazfjCita legla predstavljajи razfjCite geпotjpove, ра se moie zakljиCifj da је geпetjckj poteпcjjal jedjпke da adekvatпo odgovorj па stresore jz zjvotпe sredjпe, иklјисијиСi ј teske metale, osпova za varjjabllпost ј plasfjcпost епzјта и stresпjт иslovjтa. Мпоgј aиtorj smatrajи da vefjka varjjabllпost alela kod рори/асјја и zagadeпoj sredjпj moie bltj jzazvaпa adaptacjjama koje omogucavajи toleraпcjjи па teske metale {Gиttmaп 1994). Веаитопt ј Toro {1996) sи иtvrdjfj da и laboratorjjskjт иslovjтa heterozjgotпe jпdjvjdиe toleraпtпjje па stres jzazvaп bakrom od homozjgotпjh. Levjпs { 1968) је zakljиCio da је geпefjcka varjjabllпost veca и stresпjт sredjпama. Оsјт toga, роvесапа varjjabllпost eпzjтskjh jzoforтj moie bltj posledjca djfereпcjjalпe ekspresjje gепа и prjsиstvи kadтjjиma. Utvrdeпo је da pod иtjcajem kadтjjиma kod vrste Orchesella сјпсtа dolazj do јпdиkоvапе ekspresjje odredeпjh gепа {preteiпo опјh kojj иtјси па detoksjfjkacjjи}, dok iivotjпje toleraпtпe па kadmijиm zadriavajи istj jfj cak пјzј stepeп ekspresjje gепа {Roelofs et а/. 2007). Моgисе је da pod utjcajem te5kjh metala ј kod larvj gиbara dolazj do de поvо sjпfeze jzozjтa {kako опјh kojj иtјси па detoksjfjkacjjи, tako ј опјh kojj јтаји иlоgи и vаrепји) kojj иtјси па odriavaпje homeostaze и иslovjтa stresa. lпteresaпtпo је da se и пasem eksperjтeпtи, kod a-gfjkozjdaze ј esteraze па koпtrofj ј dиgotrajпjт tretmaпjтa kаdтјјитот, pojavljиje ро јеdпа jzoforma vefjke molekиlske mase koje пета и tokи akиtпjh efekata ј oporavaka {sfjke 16, 20). Takode se ргјтесије da је kod jstjh eпzjтskjh jzoforтj {прr. kod иkирпјh proteaza, alkafпjh fosfataza, esteraza, 169 Diskиsija a-glikozidaze, slike В, 7 З, 7 5, 20,) izmedи razliCitih tretmaпa роvесапа obojeпost traka, sto иkаzије пajverovatпije па роvесапи siпtezи tih izoformi и razliCitim srediпama. Рrотепи broja i iпteпziteta obojeпosti elektroforetskih traka esteraza i peroksidaze pod иticajem teskih metala detektovali sи Sип {2005) kod crva Pheretima gиillelmi i Sobkowiak i saradп ici {2004) и ce/iiskoj kиltиri soje kod eпzima aпtioksidativпog stresa. Mиkherjee i saradпici (2004) sи kod bifike Lemпa miпor иtvrdi/i da promeпa izozima esteraza zavisi od prisиstva teskih metala. ZпaCi, da se aktivirajи adaptivпi mehaпizmi па пivои iпdиkcije odbrambeпih proteiпa (Nevo et а/. 7 98 7; De Wolf et а/. 200 7 ), kako Ьi orgaпizam preiiveo и zagadeпim iivotпim srediпama. Јаsпо је da se veeiпa eпzima koji исеstvији и metabolizmи kseпoblotika, i/i па koje polиtaпti direktпo i/i iпdirektпo dе/ији, ројаvlјији и vise izoeпzimskih formi koje koegzistirajи ипиtаr јеdпе iпdividиe ili cak и okvirи orgaпele. Razиmevaпje Ьiohemije i molekиlarne Ьiologije ovih izoeпzima moie objasпiti razlikи и osetljivosti па kseпoblotike kod razliCitih vrsta, orgaпa, izmedи polova i/i stadijиma razvica. И prirodi пisи svi geпotipovi jedпako oset/iivi па stres {Gиttmaп 7 994). Geпotipovi oset/iiviji и prirodi sи i и laboratorijskim иslovima podloiпiji пegativпom иtiсаји koпtamiпaпata. Gиttmaп {1 994) је kod vrste Gambиsia ho/Ьrooki, иstaпovio i vezи prisиstva {i иcestalosti) geпotipova alozima koji иslovljavajи (i/i determiпisи} otpornost па koпtamiпaпte i adaptivпe vredпosti kako iпdividиa, tako i popиlacije. Medиtim, potrebпo је jos mпogo istraiivaпja koja Ьi objasпila Ьiohemijske mehaпizme osetljivosti koji mogи da vode razиmevaпjи geпeticke osпove otpornosti orgaпizma па toksicпe иslove и iivotпoj srediпi. 170 Djskиsjja 5.5 PIASТICNOST Feпotjpska plastjcпost predstavlja рготепи jzгaieпog feпotjpa odrec1eпog geпotjpa и fипkсјјј zjvotпe sredjпe. Plastjcпost је оdгес1епа razfjkama и alelskoj ekspresjjj и razfjCitjт sredjпama ј рготепата и jпterakcjjj lokиsa. Опа пјје и fипkсјјј heterozjgotпostj ра podleie ј ргјгоdпој ј vestackoj selekcjjj (Schejпer 7 993). zjvotпa sredjпa јта dve иloge и evolиtjvпjт procesjтa. Prvo, sredjпa иspostavlja vezи јzтес1и feпotjpa jпdjvjdиe ј adaptjvпe vredпostj. Drиgo, sredjпa jпteragиje sa procesjтa razvjta ј јgга k/јиспи иlоgи и odrecfjva~jи feпotjpa. Ova jпterakcjja se ozпacava kao feпotjpska plastjcпost {Bradshaw 7 965}. Feпotjpska plastjcпost se odпosj па op5tj efekat sredjпe па feпotjpskи ekspresjjи (иk/јисијиСi ј jzostaпak odgovora}, dok se погта reakcjje odпosj па specjfjcaп oЬfjk ovog efekta (Schejпer 7 993). Postoje dve "vrste" plastjcпostj: prva, kопtјпиаlпо vaгjjabllпa jfj gradиjsaпa, kaliЬгjsaпa {eпgl. graded) ј drиga dјskопtјпијгапо vaгjjabllпa jfj djskretпa {West- Eberhard 2003). Тегтјп "погта reakcjje" se cesce odпosj па kаliЬгјsапи plastjcпost, mada se moie odпosjfj ј па djskretпи, gde postojj prag odgovora {eпgl. thresho/d respoпses) (Vja et а/ 7 995). ОЬе plastjcпostj sи pгojzvodj рготепа Cijj је prag zavjsaп od geпetjcke vaгjjabllпostj ј adaptjvпog pгjfagoc1avaпja и tokи ргјгоdпе sefekcjje {West-Eberhard 2003). Plastjcпost пјје opste svojstvo geпotjpa, vec se odпosj па specjfjcпost ројеdјпаспе osoblпe {Schejпer & Goodпjght 7 984; Schejпer et а/. 7 997 ). Data osoblпa moie pokazjvatj plastjcпost и odgovorи ј па samo јеdап sredjпskj faktor {ТаиЬег & ТаиЬег 7992}. Na ргјтег, dиgovecпost se kod ieпke Drosophjfa melaпogaster povecava do rasta temperatиre od 7 7 ос, zadriava jstj пјvо do 25 ос ј opada sa dа/јјт povecaпjem temperatиre {Davjd et а/. 7 983). Lјпјје погте reakcjje роkаzији plastjcпost odgovora laгvj jz razfjCitjh legala па prjsиstvo kadтjjиma и iivotпoj sredjпj. Tako se па sfjkama 7, 9 ј 7 7 vjdj da aktjvпost proteofjtjckjh епzјта opada ј da veCiпa legala {faтjfjja} reagиje па sfjcaп паСiп kod 171 Diskиsija иkирпih proteaza, tripsiпa i LAP па КС2, С2 i С2К. Za razlikи od proteolitickih eпzima, sredпje vredпosti a-glikozidaze ро leglima veoma heterogeпo геаgији па kratkotrajпo prisиsfvo kadmijиma и hraпi {slika 14}. lako kod veCiпe legala dolazi do pada aktivпosti ovog eпzima па КС2, па КСЈ veliki Ьгој legala povecava aktivпost, verovatпo zbog пеkе vrste homeotickog odgovora па kratkotrajп i stres пiskog iпteпziteta . Velika plasticпost i heterogeпost odgovora kod p-g/ikozidaze se vidi па svim tretmanima (slika 17). Mecfиtim, odgovor esteraza i GST па istim tretmaп ima је ипiformпiji {slike 19, 21). Kod esteraza cak 75/egala па КСЈ i 17 па Cl {od иkирпо 20 legala па koпtroli) sтапјије svojи aktivпost. Utvrcfeпo је da tгајапје prvog stирпја i trajanje razvica do иlaska и cetvrti stирапј па hroпicпom tretmaпи i рготепа mase и tokи akиtпog stresa zavise od iпterakcije geпotipa i koпceпtracije kadmijиma {tabele 1, З, 6}. Jediпo variraпje plasticпosti odgovora relativпe brziпe rasta пе zavisi od legla tj. iпterakcija ,,Leglo х Cd" пiје zпасајпа {tabela 1 З). Оsпоvпа determiпaпta evofиcije plasticпosti и odgovorи па variraпje иsfova iivotпe srediпe tokom vremena је relativan stepeп promeпe sredine и odnosи па feпotip individиe. Ako se fenotip individиe тепја brzo kao i sredina, tada је svojstvo labllпo, прг. osoblne poпasanja (Via & Lande 1987) kao i fizioloske osoblпe {Hoffmann & Parsons 1991 }. Postoje svojstva koja sи fiksirana jednom za vreme razvica, npr. veliCina holometabolnih iпsekata posfe metamorfoze. И nasem eksperimentи, za osoblпe adaptivne vrednosti, detektovaпo је jako та/о statisticki znacajnih рготепа plasticпosti i njihovih standardnih devijacija izmecfи razliCitih tretmana. Kod trajanja razvica prvog stиpnja, trajanja razvica do cefvrtog stирпја i mase larvi treceg dana cefvrtog larvenog stиpnja heritabllпost plasticnosti је manja od heritabllпosti svojstva, sto znaCi da moiemo ocekivati evofиcijи specijalizovanih individиa и heterogenoj sredini. Od svih proиcavaпih osoblna adaptivne vrednosti, jedino kod relativne brzine rasta heritabllnost plasticnosti је veca od heritabllпosti svojstva, sto иkаzије da Ьi ocekivani evolиtivпi 172 Djskиsjja odgovor mogao Ьitj роvесапје plastjcпostj relatjvпe Ьгzјпе rasta {tabela 7 6}. Рогеdепјет jпdeksa plastjcпostj ј пjegove <;staпdardпe devjjacjje пјsи dobljeпe zпасајпе Z ј F vredпostj {оsјт za masи, gde је plastjcпost па С2 zпасајпо veca пеgо па С1 }. Zbog та/е osetfjjvostj, jпdeks plastjcпostj se пе тепја па razfjCitjт tгеtтапјта, ргоисаvапе оsоЬiпе adaptjvпe vredпostj ј пјјhоvи plastjcпost пе moiemo иzetj kao dobre jпdjkatore pгjsиstva kadтjjиma и hгапј. Za razlikи od ovjh оsоЬiпа, plastjcпost епzјта se тепја и tokи delovaпja razfjCitjh tretmaпa kadтjjиmom. /пtегеsапtпо је da proteofjtjckj епzјтј јтаји jstj паСiп рготепе plastjcпostj па jsfjт tгеtтапјта {tabele 30, З 7, 35, 36, 40, 4 7 ). Na dиgotrajпom ј jacem stresи {С2} odgovor laгvj и sjпtezj ovjh епzјта пјје heterogeп. Т ako је plastjcпost proteaza, tгјрsјпа ј fеисјп aтjпopeptjdaze па С2 та п ја od jпdeksa plastjcпostj па oporavkи od jste kопсепtгасјје metala. То иkаzије па jгeveгzjblfпe рготепе koje se odvjjajи ј ро prestaпkи defovaпja toksjkaпata. Posto sva /egla пе геаgији jstom Ьгzјпот па рготепи sredjпe, staпdardпa devjjacjja jпdeksa plastjcпostj za proteaze ј tгјрsјп је veca па oporavkи od С2 пеgо и tokи hгопјспоg stresa С2. lпdeks plastjcпostj tгјрsјпа, lеисјп aтjпopeptjdaze ј a- gfjkozjdaze па hгопјспот tгеtтапи па С1 је ve6 пеgо и tokи akиtпog tretmaпa ј oporavka па jstoj kопсепtгасјјј. Kod svjh proиcavaпjh proteofjtjckjh eпz1ma па tretmaпjтa па kојјта је jпdeks plastjcпostj statjstjckj zпасајпо ve6, staпdardпa devjjacjja је тапја. Cepfjkov jпdeks plastjcпostj pokazиje pravac рготепе plastjcпostj. Ako se faтjfjje zпасајпо razfjkиjи и pravcи odgovora {sтапјепје jfj роvесапје vredпostj пеkе оsоЬiпе} осеkије se pad jпdeksa plastjcпostj ј vefjka vaгjjabllпost. Kod fеисјп aтjпopeptjdaze ј a-gfjkozjdaze plastjcпost и tokи hгопјспоg efekta па С1 је zпасајпо veca пеgо па С2. Aпafjzom jпdeksa feпotjpske plastjcпostj иtvrdeпo је sledece: vredпostj jпdeksa plastjcпostj и tokи dиgotrajпog tretmaпa па С1 za tгјрsјп ј LAP sи vece пеgо па akиtпom efektи ј oporavkи od jste {С1} kопсепtгасјје {tabele 35, 4 7 ). Kod svjh proteofjtjckjh епzјта plastjcпost odgovora па hгопјспот tгеtтапи vece kопсепtгасјје 173 Djskиsjja v kadтjjиma {sтапјепје aktjvпostj и оdпоsи па koпtrolи) је тапја пеgо па oporavkи od jste koпceпtracjje, sto иkаzије па jгeverzjblfпe efekte kadтjjиma па aktjvпost proteofjtjckjh епzјта. Na vecoj koпceпtracjjj kadтjjиma sтапјепо је ј vагјгапје plastjcпostj odgovora proteofjtjckjh епzјта tj. ипјfогтпјјј је odgovor епzјта иklјисеп јh и vareпje па jacem stres и. Za razfjkи od ovjh епzјта, а ј p-gfjkozjdaze, kao ј епzјтј detoks jfjkacjje (GST ј esteraze) јтаји veCi iпdeks plastjcпostj па hгопјспот tretmaпи па Cl и оdпоsи па trodпevп j oporavak od jste koпceпtracjje {tabele 45, 46, 50, 51 , 55, 56, 60, 61 ). Т akocle, GST ј esteraze ј та ји vеси plastjcпost па hгопјспот efektи С2 и оdпоsи па аkиtпј efekat jste koпceпtracjje kadтjjиma. lz Cepfjkove formиle kojom smo јzгасипаfј feпotjpskи plastjcпost, moiemo da zakljиCimo da и tokи hroпjcпog stresa (ј па Cl ј па С2) епzјтј detoksjfjkacjje јтаји тапји aktjvпost и оdпоsи па oporavak jfj аkиtпј efekat. Ovo је и saglasпostj sa prethodпo јzпеtјт pretpostavkama о еvепtиаlпој jпhjblcjjj епzјта detoksjfjkacjje od straпe kadтjjиma. lпteresaпtпo је ј sto se jпteпzjtet aktjvпostj kod proteofjtjckjh епzјта тепја и zavjsпostj od toga koja је koпceпtracjja Ьila рптеп1епа. Vaгjjabllпost jпdeksa plastjcпostj је za а gfjkozjdazи тапја па hгопјспот efektи С2 и оdпоsи па КС2 ј oporavak С2, dok p-gfjkozjdaza па Cl јта тапји varjjabllпost пеgо па Cl К. Moida jstj паСiп promeпe plastjcпostj, kao ј пјепе varjjabllпostj pojedjпjh grиpa епzјта иkаzији па пјјhоvи zajedпjckи regиlacjjи ј sfјспи fипkсјји и prjsиstvи toksjkaпata. Negatjvпe korelacjje јzтесlи jпdeksa feпotjpske plastjcпostj ј пjegove vaгjjabllпostj иkаzији па пјјhоvи тоgиси пеzаvјsпи еvоlисјји (Тисјс etal. 1991; Pemac & Тисјс 7998). Predloieпa sи trj modela geпetjcke osпove plastjcпostj koj j se meclиsobпo пе јsklјисији . 1. Overdoтjпaпtпost: plastjcпost zavjsj od homozjgotпostj (Dobzhaпsky 1947; Gillespje & Т иrelli 1989). Ovaj model pretpostavlja da је kofjCiпa promeпe и fепоtјри и razfjCitjт sredjпama obrnиto рrорогсјопаlпа Ьгоји heterozjgotп jh lokusa. 174 Djskиsjja 2. Plejotropjja: plastjcпost је fипkсјја djfereпcjjalпe ekspresjje jedпog gепа и razfjCitjт sredjпama (Vja & Laпde 1985, 1987). Ovaj model pretpostavlja da је ekspresjja alela и јеdпој sredjпj роtепсјја/по пezavjsпa od пjegove ekspresjje и dгиgјт sredjпama. З. Epjstaza: Plastjcпost пastaje zbog gепа kojj оdгеdији vefjCiпи odgovora и оdпоsи па efekte jz spoljasпje sredjпe ј kojj јпtегаgији sa gепјта kojj dеtегтјпјsи рrоsеспи ekspresjjи karakteгjstjke {Lyпch et а/. 7988, Schejпer & Lymaп 1989). Ovaj model predvjda da sи svojstvo ј plastjcпost пezavjsпe karakterjstjke {Gcivгjfets & Schejпer 199За,Ь}. И razиmevanjи plastjcпostj se javlja поvј Ciпjfac - сепа plastjcпostj {Могап 1992). То је сепа potrebпa za odriavaпje пеорhоdпе plastjcпostj geпetjcke ј cefjjske таsјпегјје. Na ргјтег, сепа kоји orgaпjzam placa је пиiпа za odriavaпje regиlatornjh gепа ј епzјта. Gledajиti sa geпetjckog aspekta, сепа plastjcпostj је epjstatjckj efekat jпterakcjje јzтеdи gепа kojj оdгеdији da fj се orgaпjzam da reagиje па zjvotпи sredjпи ј drиge strиktиrne gепе {Schejпer 1993). 175 Djskиsjja 5.6 KORELACUE Posledпjjh godjпa se prjdaje роvесап zпасај иtјсаји sredjпskjh иslova па geпetjckи koпtrolи osoblпa adaptjvпe vredпostj. Eтpjrjjskj podacj пат sиgerjsи da sи geпetjcke korelacjje опе koje паstаји zbog delovaпja gепа па veCi broj osoblпa ј da sи sredjпskj zavjsпe {Gиttefjпg et а/. 2007). Korelacjje mogи bltj zпасајпе za еvоlисјји ekoloske specjjafjzacjje иkofjko se sтапјије stepeп do koga osoblпe и dve sredjпe mogи пezavjsпo da evofиjrajи (Vja & Laпde 1985). Pokazaпo је da ove korelacjje mogи da promeпe zпak {pozjtjvaп-пegatjvaп} и razfjCitjт sredjпama (Sgr6 & Ноffтапп 2004}. Na prjтer, Czesak ј Fox {2003) sи иtvrdjfj da zпak geпetjckjh korelacjja јzтеdи vefjCiпe jajeta ј mase ieпke kod vrste Stator fjтbatиs zavjsj od vrste hraпe koja је kопzитјrапа. Ako korelacjje јzтеdи osoblпa adaptjvпe vredпostj zavjse od sredjпskjh иslova, опdа dаји dиЬ/јј sтjsao evolиtjvпjт pravcjтa, роsеЬпо опdа kada sи geпetjcke korelacjje пegatjvпe ј reflektиjи иzајатпо ograпjcavaпje јzтеdи osoblпa. Negatjvпe korelacjje иkаzији па postojaпje gепа sa plejotropпjт efektom ј/ј delovaпjem Ьfjsko focjraпjh gепа {Gиttefjпg et а/. 2007). Plejotropjja је pojava gde јеdап gеп иtјсе па vjse osoblпa. Geпetjcke korelacjje јzтеdи dva svojstva postajи oCigledпe kada па пјјh иtјси jstj gепј ј/ј skиpovj gепа. Pozjtjvпe geпetjcke korelacjje mogи da иЬrzаји еvоlисјји specjfjcпjh osoblпa. Pozjtjvпe geпetjcke korelacjje јzтеdи svojstava koja иtјси и otpornostj па stres sи ceste {Ноffтапп & Parsoпs 1991 ). lako п ј је prjkazaпo и Rezиltatjтa, иtvrdeпo је da и пasem eksperjтeпtи пajveCi broj statjstjckj zпасајпјh pozjtjvпjh korelacjja јzтеdи razfjCitjh sredjпa detektovaп za esterazи ј GST, sto moie иkazatj da ova dva епzјта јтаји и/оgи и detoksjfjkacjjj kаdтјјита, kao ј da jstj gепј иtјси па aktjvпost ovjh епzјта и tokи razfjCitjh tretmaпa kadтjjиmom. Korelacjje јzтеdи .razfjCitjh osoblпa и istoj sredjпj, jfj јеdпе osoblпe и razfjCifjт sredjпama kompfjkиjи odredivaпje smera delovaпja selekcjje па пеkи оsоЬlпи. Geпetjcke korelacjje јzтеdи osoblпa zbog plejotropjje mogи se odriavatj и 176 Djskusjja odsusfvu sefekcjje, а/ј jh takode, prjrodпa sefekcjja moie oЬfjkovatj Favorjzujuti поvе mutacjje koje јтаји razfjCite efekte па korelacjje {Laпde & Arnold 1983). Geпetjcke korelacjje mogu пastatj zbog 1) plejotropjje, 2) bfjske povezaпostj {asocjjacjje geпskjh lokusa zbog fjzjcke bfjzjпe), З) gametske пeravпoteie, пeravпoteie vezaпostj - {statjstjcke asociJaCIJe jzтedu lokusa kojj пastaju zbog evofutjvпjh sjfa - eпgl. fjпkage djsequjfiЬrjuтa} jfj 4) veze sa drugjт osoblпama. Odriavaпje gёпetjckjh korelacjja zahteva postojaпje plejotropпog efekta jfj veoma bfjske povezaпostj gепа {Guttefjпg et а/. 2007). OCigledпo је da иkирап mortafjtet larvj zavjsj od smrtпostj larvj prvog stupпja, јег smo kod gubara cefvrtog stupпja detektovafj pozjtjvпe geпetjcke korelacjje jzтedu ukupпog mortafjteta ј mortafjteta prvog stupпja ј to па koпtrofj, ј оЬа dugotrajпa efekta kadтjjumom {tabefe 7 9, 22, 23). Оsјт toga, prvj stupaпj је ј пajosetfjjvjjj, ра se zato ј veti deo ukupпog mortafjteta desava и prvom stupпju. Statjstjckj zпасајпе пegatjvпe feпotjpske korelacjje se srecu jzтedu mase ј trajaпja razvjca па kratkotrajпjт {аkиtпјт) tretmaпjтa, oporavcjтa ј hroпjcпom efektu 7 О 119Cd/ g suve hraпe { 7 9, 22, 23, 24, 25). ZпaCi da па kadтjjumu sa produieпjem trajaпja razvjca dolazj do sтапјепја mase larvj. S druge straпe, larve koje su otpornjje па kadтjjum za krace vreme dostjzu vecu masu. /пасе feпotjpske korelacjje se cesto korjste radj рrосепјјvапја fипkсјопаlпе veze jzтedu Ьioheтjjskjh, morfofoskjh jfj drugjh osoblпa Citavog orgaпjzтa {Garlaпd 7 984; Steyermark et а/. 2005). Nedovoljпa kofjCiпa hraпe jfj пјеп пероvо/јап sastav se smatraju sredjпskjт stresoiтl. Smatra se da stres povezaп sa grапјспјт usfovjтa zjvotпe sredjпe utjce па populacjje mпogjh vrsta (Whjte 7 993). И eksperjтeпtjтa па lepjdopterama ј kolembolama utvrdeпo је da hrопјспа jzfoieпost teskjт metafjтa utjce па sтапјепје koпzumacjje hraпe, ра dolazj do pada mase larvj {Gahukar 7 975; Joose & Verhoef 7 983). Оsјт toga, пеkе vrste kolembola јтаји sposobпost otkrjvaпja ј jzbegavaпja ипоsепја kопtатјпјгапе hraпe, zbog cega moie doti do gladovaпja {Joosse & Verhoef 7 983; Beпgtssoп et а. 7 994; fjfser & Holscher 7 997; Fouпtajп & Норkјп 177 Diskиsija 2001 ). Stиdije sи pokazale da kod drozofile gladovaпje иtice па aktivпost eпzima {Ресsепуе et а/. 1996}, kao i da је variraпje alozima povezaпo sa otpornoscи па gladovaпje {Оиdтап et а/. 1994}. Postoje podaci о vezi izmedи stresa, eпerglfe i iпteпziteta metabolizma {Ноffтапп & Parsoпs 1991 }. Otpornost па stres se moie postiCi тепјапјет potrosпje eпergije koja se иsmerava kompeпzatornim fiziofoskim odgovorima па stres i/i ka ispravljaпjи osteceпja izazvaпog stresorom, оdпоsпо, depoпovaпi eпergetski resиrsi se mogи koristiti da Ьi se prevazisao stetaп иticaj stresa. Smaпjeпi iпteпzitet metabolizma Ьi se mogao ocekivati kao posfedica promeпjeпih eпzimskih aktivпosti koje sи и vezi sa jediпjeпjima koja se koriste и blosiпtezi, ра gladovaпje moie imati sпаiап иticaj па aktivпost ovih eпzima {Harshmaп et а/. 1999). Veza izmedи performaпse orgaпizma i eпzimske aktivпosti је vaiпa zbog dva razloga. Prvo, korelacije izmedи eпzimske aktivпosti ј performaпse sи potrebпe za odredivaпje mogиcпosti sefekcije eпzimske aktivпosti. Drиgo, ove korelacije mogи da obezbede dokaze za иzajamпim ograпicavaпjem јzтеdи aktivпosti епzјта i drиgih vidova iпdividиafпe performaпse {Berrjgaп & Ноапg 1999). Tako smo иtvrdjfj da postojj vefjki broj пegatjvпih korelacija јzтеdи mase i: f3-g/jkozjdaze па КС1 i a- glikozidaze па КС2; GSTa па С1; а i f3 -g/ikozidaze па С2 {па graпici zпacajпosti); i f3-g/ikozidaze па оЬа oporavka {tabefe 78, 79, 80, 81, 82, 83). Negativпa geпeticka korelacjja moie bltj rezиltat raspodefe ograпjceпjh resиrsa izmedи razfjCitjh fипkсјја (Rickfefs 1991 }. И ovom sfисаји пajverovafпjje dolazj do иzajamпog ograпjcavaпja ј preиsmeravaпja eпergjje па procese sjпteze eпzima kojj јтаји · k/јиспи иlоgи и detoksifikaciji, izmedи ostafjh i GSTa, kao i obezbedivaпjи eпergije za оsпоvпе fипkcije koje orgaпizmи omogиcavajи preiivljavaпje и иsfovjтa stresa. OCigfedпo је da se eпergetski resиrsj trose i za siпtezи drиgih eпzima detoks ifikacije . Jos јеdпо mogиce оЬјаsпјепје za postojaпje ovih пegafjvпih korelacjja је da se kod larvj sa vecom masom eпergija tro5j za sjпtezи metalotioпejпa jfj proteiпa topfotпog stresa kojj prvi rеаgији sa kadтjjиmom ј па taj паСiп blvajи bolje adaptiraпe па 178 Djskиsjia пiegovo prjsиstvo и hraпj. Traiaпie razvjta larvj gиbara se skracиie sa povecaпiem aktjvпosfj esteraza, koie takode јтаiи vаiпи иlоgи и procesjтa detoksjfjkacjie vefjkog broia kseпoЬiotjka. Меdиtјт, пеkе оsоЬiпе adaptjvпe vredпosfj sи и pozjfjvпoi korelaciii sa епzјтјта. Ргј hгопјспот, tretmaпи па С7, relatjvпa Ьгzјпа rasta se povecava sa porastom aktjvпosfj GST {tabela 80), jako se masa larvj smaпiиie, sto иkazиie da se и tokи stresa teskjт metafjтa razvjce moie иbrzafj, а da iedjпke Ьиdи maпie mase. Na КС2 traiaпie razvjca se prodиiava sa povecaпiem aktjvпosfj LAP {tabela 83). lпteresaпtпo ie da иkofjko se па dиgotraiпom tretmaпи С2 vjse eпergjie trosj па sjпfezи a-gfjkozjdaze ј frjpsjпa, povecava se mortafjtet prvog stиpпia, kao ј иkирап mortafjtet {tabela 8 7 ). И ovom slиcaiи, па iacem stresи, verovatпo postoij иzaiamпo ograпjceпie јzтеdи sjпfeze, obrade ј traпsporta епzјта ј preijvfiavaпia larvj gиbara. Legla sa таfјт mortafjtetom sи otporniia па kadтjiиm zato sto se kod пijh verovatпo vjse eпergjie trosj па епzјте koij djгektпo иcestvиiи и detoksjfjkacjij ј јтаiи prjoгjfet и оdпоsи па sjпfezи djgesfjvпjh епzјта. Иzrok иzaiamпog ograпjcavaпia ј preraspodele eпergjie јzтеdи vjse оsоЬiпа и пероvоliпјт иslovjтa ijvotпe sredjпe moie Ьitj ј smaпieпa potrosпia kjseoпjka и prjsиstvи teskjh metala. Ova poiava ie regjsfrovaпa kod vrsta Leptomysjs fjпgvиra {Gaиdy et а/. 7 99 7 ), zafjт Иса аппиfјреs ј Иса frjaпgиlarjs {Иma-Devj & Prabhakara-Rao 7 989), kao kod morskog raCica Palaemoп serratиs {Papathaпassjoи 7 983). Vaiпo te паротепиfј da toksjcпj efekat kadmjiиma ј potrosпia kjseoпjka zavjsj ј od spoliasпijh иslova kao sto sи прr. рН, safjпjtet jfj kvafjtet hraпe. Chjppjпdale ј saradпjcj ( 7 996) sи, иtvгdjfj иzщатпа ograпjceпia јzтеdи larveпog razvjca ј akиmиlacjie eпergetskjh resиrsa, gde sporjie razvjce omogиcava vеси akиmиlacjiи fjpjda kod adиlta. Vefjkj broi stиdjia иkazиie па povezaпost smaпieпia jпfeпzjfeta metabofjzтa ј otpornosfj па stres {Hoffmaпп & Parsoпs 7 997 ). Оvи hjpotezи sи potkrepjfj Waпg & Clark {7 995) koij sи kod drozofjfe gaieпe па sиbopfjтalпom medjiиmи, detektovafj 179 Djskиsjja та п ји aktjvпost eпz1ma jпtermedjjarnog metabofjzтa. Kod jste _ vrste је zameпa drиgog hromozoma dovefa do pozjfjvпe korelacjje јzтесfи kofjCiпe trjacjfgfjcerola ј sjпteze masпjh kjsefjпa, kao ј aktjvпostj епzјта kojj иtјси па sjпtezи NADPH potrebпog za Ьiosjпtezи fjpjda {Ciark & Kejth 1988). ZпaCi, da postojj veza јzтес!и geпetjcke varjjabllпostj епzјта jпtermedjjarnog metabofjzтa ј dеропоvапја eпergjje. Kod паs је, оsјт kod p-gfjkozjdaze ј GST, jпhjblraпa aktjvпost епzјта, а jstovremeпo dofazj ј do sтапјепја mase larvj. Redиkovaп jпteпzjtet metabofjzтa ј тапја Ьiosjпteza gradjvпjh kompoпeпtata пegatjvпo иtјси па masи, Cime sи potvrcfeпe teorjje о sтапјепот jпteпzjtetи metabofjzтa и stresпoj sredjпj kod otpornjh jedjпkj. Sпјiепа kofjCiпa protejпa и razfjCifjт tkjvjтa moie bltj posledjca smaпjeпog stepeпa sjпteze protejпa и tokи stresa jzazvaпog metafjтa {Syverseп 1981 ). Posfedjce osjromaseпja protejпa mogи bltj dalje modjfjkacjje eпzjтske aktjvпostj {stjтиlacjja jfj jпhjblcjja}, promeпe sjgпalпog traпsfera и cefjjj, modjfjkacjje атјпо kjsefjпa, oksjdacjja sиffhjdгjfпjh grиpa koje dovode do koпformacjoпjh promeпa, иmreiavaпja protejпa {eпgl. cross fjпkjпg), серапја peptjdпjh veza, kao ј modjfjkacjje иgljeпohjdratпog dela и gfjkoprotejпjтa {Vиtиkиrи et а/. 2005). Aпafjzom korelacjja јzтес!и proиcavaпjh епzјта и okvjrи jedпog tretmaпa иtvrcfeпo је sledeee: па koпtrofj, zafjт па оЬа hrопјспа ј оЬа аkиtпа tretmaпa postoje stafjstjckj znacajпe korelacjje јzтес!и a-gfjkozjdaze ј: p-gfjkozjdaze, esteraze ј djgesfjvпjh епzјта, LAP ј frjpsjпa {tabele 69, 70, 71, 72, 73). lпteresaпtпo је da sи sve korefacjje pozjtjvпe, оsјт па koпtrofпom tretmaпи а ј p-gfjkozjdaze и пegatjvпoj korelacjjj {tabela 69), dok se pod dejstvom kadтjjиma {kratkotrajпj jfj dиgotrajпj efekat) тепја zпak korefacjje. Obzjrom da ova frj fjpa епzјта dеlији па razfjCite sиpstrate moiemo zakljиCifj da је и tokи stresa пajverovafпjje пjjhova aktjvпost иsaglaseпa ј omogиcava пajefekfjyпjje jskorjsfavaпje hraпfjjvjh materjja, а sатјт tјт ј preijvfjavaпje. Vaiпo је jsta6 da postojj zпасајпа pozjtjvпa korelac jja јzтес!и p-gfjkozjdaze ј fеисјп aтjпopeptjdaze па оЬа hrопјспа efekta, kao ј КС 1 ј 180 Djskиsjja КС2 {па graпjcj zпacajпostj). Моgисе је da jaCi stres јпhјЬlга aktjvпost LAP koja иtјсе па proteofjzи hraпe ј jskoгjsfavaпje ograпjceпjh resиrsa и пероvоlјпјт иsfovjтa ј p- gfjkozjdaze Cija је ekspresjja kod Lepjdoptera jskljиCivo и sredпjem crevи. Na skoro svjт tretmaпjтa ј koпtrofj detektovaпa је pozjfjvпa korefacjja јzтесlи esteraze ј: fеисјп aтjпopeptjdaze ј frjpsjпa {па oporavcjтa postojj samo јzтесlи esteraze ј LAP па С7 К, dok па С2К ovakve korelacjje пјsи detektovaпe). Obzjгom da karboksjfesteraze kod jпsekata hjdгofjzиjи vefjkj Ьгој sиpstrata, иtјси па moblfjzacjjи mastj, metabofjzam ј иk/апјапје "пepoieljпjh" estara {Ahmad, 7 970; 7 976), а acetjfhofjпesteraze јтаји vаiпи иlоgи и jпferтedjjarnom metablfjzти ј djgestjjj estara masпjh kjsefjпa {Krjshпa et а/. 7 984), verovatпo da је и tokи defovaпja heтjjskjh stresora, kao sto sи teskj metafj, иloga esteraza Ьfjsko povezaпa sa fипkcjjom proteofjtjckjh епzјта ј hjdгofjzom sloieпjh јеdјпјепја. NajveCi Ьгој pozjfjvпjh korelacjja па svjт tretmaпjтa је иtvrcleп јzтесlи proteofjtjckjh епzјта, sto иkаzије па zajedпjckи geпetjckи regиlacjjи епzјта sa proteofjtjckom иlogom и prjsиstvи kadтjjиma. Нiгајzитј ј saradпjcj { 7 992) sи kod laгvj drozofjfe koje sи gајепе и иsfovjтa osmotskog stresa, takocle иtvгdjfj vefjkj Ьгој zпасајпјh korelacjja јzтесlи peptjdaza. Postojj пekofjko stиdjja koje tvrde da postoje korelacjje јzтесlи eпzjтskjh aktjvпosfj и odgovorи па sredjпskj stres jfj рготепа и hraпj (Geer & Laиrje-Ah/Ьerg 7 984; Geer et а/. 7 985; Clark 7 989а}, kao ј da korefjsaпe aktjvпosfj mogи da projstekпи jz sјтиftапе sefekcjje aktjvпosfj пekofjko епzјта {Laпde 7 980). Moie se zakljиCifj da aktjvпosfj peptjdaza mogи meclиsobпo bltj korefjsaпe, da zavjse od srediпskog stresa, od geпefjcke osпove, а пajverovafпjje ј od strиktиre samog епzјта . Оsјт toga, та/ј Ьгој zпасајпјh korelacjja GST а ј ostafjh eпzima иkаzије па пеzаvјsпи geпefjckи dеtегтјпасјји ovog епzјта detoksjfjkacjje и оkvјги јеdпе sredjпe . Na jacem ј sfabljem stresи fjzjofoskj odgovor moie bltj drиgaCijj. Моgисе је da sи па dиgotrajпom efektи kadтjjиma оsпоvпј prjoгjfefj jedjпkj preijvfjavaпje ј dosfjzaпje stирпја adиlta, ра se zbog toga svj геsигsј иsmeravajи ka pravilпom razvicи djgestivпog sjsfema, а samim tim ј adekvatпoj asjтjfacjjj hгапе. Faтjfjje 181 Djskиsjja (/egla} sa vе6т рrосепtот таsе sredпjeg creva јтаји и иslovjтa hrопјспе jzfoieпostj kаdтјјити па kопсепtrасјјата 7 О ј 30 ~g/ g sиve hraпe vеси aktjvпost proteaze ј trjpsjпa {tabele 72, 73), dok sи па koпtrofj, КС7 ј С7 К korelacjje sa proteazaтa пegatjvпe (statjstjckj пјsи zпасајпе} {tabele 69, 70, 77 ). Месlиtјт, treba јтаtј и vjdи da је proceпat таsе sredпjeg creva jпdjrektaп pokazatelj kопzитасјје hraпe, јег таsа creva иklјисије i ипеtи hrапи, а пе sато tk jvo creva. Odrec/jvaпjeт korelacjja јzтесlи osoblпa adaptjvпe vredпostj ј aktjvпosfj епzјта и okvjrи jsfe sredjпe иstaпovljeпo је da је таsа larvj gиbara и пegatjvпoj korelacjjj sa vefjkjт Ьrојет епzјта и razfjCifjт sredjпaтa: sa GST {па С7 }, sa p- gfjkozjdazoт {па КС7, С7 К ј С2К) {tabela 78, 80, 82, 83) ј a-gfjkozjdazoт {па КС2} {tabela 79). Do пegatjvпjh geпefjckjh korelacjja тоgи da dovedи aпtagoпjsfjcka plejotropjja ј сепа raspodele ograпjceпjh resиrsa. lzтeclи GST ј osoblпa adaptjvпe vredпostj, kao ј јzтесlи drиgjh aпafjzjraпjh епzјта postojj та/ј broj zпасајпјh korelacjja. Моiето da zakljиCiтo da GST јта drиgaCijи geпefjckи koпtrolи и оdпоsи па рrоисаvапе djgesfjvпe епzјте, ра zato јzтесlи пјјh пета пета zпасајпјh korelacjja и okvjrи jsfe sredjпe. И tokи hroпjcпog stresa па 7 О ~gCd/ g роvесапа aktjvпost епzјта detoksjfjkacjje povecava relatjvпи Ьгzјпи rasta~ lпteresaпtпo је da skoro svj stresorj јпdиkији vjse od jedпog stres-zavjsпog odgovora {риtа} {Roefofs et а/. 2008). Molekиlarпj теhапјzтј kojj leie и osпovj jпferakcjje јzтесlи razfjCitjh pиteva zahtevajи vjse od jedпog traпskrjpcjoпog faktora za aktjvacjjи gепа, zafjт potrebи za dodatпjт traпs-aktjvacjoпjт DNK-vezaпjт traпskrjpcjoпjт faktorjтa ј koтpfjkovaпe jпterakcjje јzтесlи razfjCitjh kjпaza sjgпafпjh traпsdиkcjoпjh pиteva . Takocle, stres sат ро sebl тоiе da aktjvjra vjse od jedпog odgovora, прr. kada docle do пekofjko тetabofjckjh роrетесаја . Моgисе је da prjsиstvo kаdтјјита dovodj do роvееапе sjпteze Hsp protejпa, теtаlоtјопејпа ј drиgjh profejпa Cija se aktjvпost ј s jпfeza povecavajи zbog пjjhove иloge и tokи stresa. ZЬog eпergjje koja је иtroseпa па s jпtezи ovjh protejпa, sтапјије se таsа 182 Diskusiia larve i sinteza pojedinih digestivnih enzima koji nisu esencijalni и detoksifikaciji teskih metala. 183 Diskиsija 5.7 BIOМARKER/1 MOGиCNOST KORISCENJA ENZIМA SREDNJEG CREVA и MONITORINGи ZAGADENJA ZIVOTNE SREDINE Stиdije о иtiсаји teskih metala па razliCite orgaпizme sи Ьrојпе i razпovrsпe. Neke иkаzији da kod iпsekata hroпicпi иticaj teskih metala dovodi do пegativпih efekata па rast, razvice, reprodиkcijи i/ili procese presvlaceпja {Vап Straaleп et а/. 7 989; Giпteпreiter et а/. 7 993; Sildaпchaпdra & Сrапе 2000; Cervera et а/. 2004), dok drиge stиdije иkаzији па promeпe и respiratornim {Ortel & Vogel 7 989) i/i metabolickim procesima {Bischof 7 995; Ortel 7 995а,Ь, 7 996; Nascarella et а/. 2003). lako se ekotoksikolosko korisceпje Ьiomarkera иglavпom razvilo kod vertebrata {McCarthy & Shиgart 7 990; Peaka/1 7 992), zпасајап razvoj ove metodologije kod iпvertebrata se pojavio и zadпjih 20 godiпa. Korisceпje Ьiomarkera и moпitoriпgи zagacleпja iivotпe srediпe omogиcava odreclivaпje odgovora па stres od molekиlskog/Ьiohemijskog do popиlacioпog пivoa. Bioloski markeri sи ро defiпiciji kseпobloticki iпdиkovaпe promeпe celijskih ili Ьiohemijskih kompoпeпata i procesa, strиktиra i/i fипkcija koje se mogи detektovati i meriti {NRC 7 987). и okvirи NAS/NRC {Natioпal Academy of Scieпce/Natioпal Research Соипсi/ 7 989) klasifikovaпe sи tri vrste Ьiomarkera: 7. markeri izloieпosti {eпgl. markers of exposиres) 2. markeri efekata izloieпosti {eпgl. markers of effects of exposиre) i З. markeri osetljivosti па efekte izloieпosti {eпgl. markers of sиsceptibllity to the effects of exposиre). ZпaCi, da se pod Ьiomarkerima podrazиmevajи promeпe iпdиkovaпe srediпskim stresom па svim пivoima Ьioloske orgaпizacije. Meclиtim, и praksi se termiп Ьiomarker cesce koristi и иiem smislи i podrazиmeva Ьiohemijske sиbletalпe promeпe koje sи izazvaпe izloieпoscи jediпke kseпobloticima {Lagadic et а/. 7 994}. Neki od parametara koji se иzimajи kao Ьiomarkeri kod iпvertebrata sи sledeCi: aktivпost eпzima detoksifikacije, zatim eпzima koji исеstvији и metabolizmи, promeпa koliCiпe glikogeпa, promeпa аdепiп пиkleotidпog ри/а, brziпa rasta, 184 Djskиsjja larveпo razvjte, proтene и ропаsапји, lokoтotornjт fипkсјјата jtd. Оsјт toga, sve cesce se aпafjzjrajи рrотепе eпergetskog тetabofjzтa koje пат рrиiаји иvjd и теhапјzат toksjcпostj razfjCitjh kseпoblotjka, оЬјаsпјаvаји efekat kseпoblotjka па рориlасјји sa toksjkoloskog aspekta ј па krajи dovode do razvoja alternatjvпjh тetoda и testjranjи toksjcпostj. Sagledavaпje fjzjofoskjh {иzјтапје hraпe}/Ьioheтjjskjh (djgestjja} оgrапјсепја и toksjcпjт иslovjтa пат тоiе рото6 da dodeтo do пovjh сјпјепјса о strategjjaтa осиvапја eпergjje и рориlасјјата jzfoieпjh stresи ј еvепtиаfпјт posledjcaтa ро preiivljavaпje рори/асјја koje sи jzfoieпe kseпoblotjcjтa {Hasset & Laпdry 7983). Takode, рrоисаvапјет djgestjvпjh епzјта kojj sи odgovornj za razlagaпje тakroтolekиla hraпe, moieтo otkrjtj zпасај razfjCitjh kataЬofjckjh pиteva kojj zadovoljavajи тetabofjcke potrebe orgaпjzaтa и stresпjт иslovjтa. •il Иzјтапје hraпe Aktjvпost djgestivпih епziта (crevo) Ј} 1 Eпergetski тetaЬolizaт {Celija) {1, п• \r>- Rast Bazalпi тetaЬolizaт Reprodиkcija Seтatskj prjkaz odgovora test orgaпjzтa па toksicпj stres. VefjCiпa strefjca је proporcjoпalna vefjCiпi alokacjje energije kod orgaпjzaтa. Ве/е strelice- иslovj bez stresa; сте strelice-stresпj иslovj {De Coen & Janssen 7 998) Оsјт jzbora tjpa bloтarkera и тoпjtoringи zagadenostj тога se vodjtj racиna о izborи vrste kоји рrоисаvато, kao i о djzajnи тoпjtoringa {Marjgoтez 200 7 ). Proиcavajиti иtјсај teskjh тetala па odredene vrste jпsekata Nиттеfјп ј 185 Djskиsjja saradпjcj (2007) sи dosfj do zakljиcka da sи прг. mravj пајпероvоlјпјја grиpa za detekcjjи promeпa jzazvaпjh teskjт metafjтa {аkитиfјгаји samo тапgап}, /а rve vjfjпog kопјјса pogodпa vrsta za detekcjjи gvoida, тапgапа ј kadтjjиma, dok sи Myrmefeoпtjdae povoljпe za аkитиfјгапје gvoida ј тапgапа {Nиmmefjп et а/. 7 998). Као blojпdjkatorj kadтjjиma povoljпe sи vrste Halobates spp. {Cheпg et а/. 7 984; Schиlz-Baldes 7 989), dok је toks jcaп efekat kadтjjиma ргоисаvап ј па gиЬаги (Gjпfeпгejfer et а/. 7 993; Ortel 7 995а, Ь, 7 996}. Nekj аиtогј smatrajи da se promeпe sadriaja gfjkogeпa ј profejпa kod гiЬа pod иfjcajem metala, mogи koгjsfjfj kao Ьiomarkerj za brzo ргосепјјvапје toksjcпosfj teskjh metala и Ьiотопјfогјпgи vodeпjh sгеdјпа {Vиtиkиги et а/. 2005). De Соеп ј Јапssеп { 7 998) sи proиcavafj djgesfjvпи fjzjofogjjи vrste Daphпja magпa jzfoieпи kаdтјјити ј 2,4-djhforofeпoksj sjrcetпoj kjsefjпj. Utvгdjfj sи da па епzјте kojj razlaiи pofjsahaгjde тапје иfјси toksjkaпtj и рогеdепји sa епzјтјта kojj vrse djgestjjи protejпa ј fjpjda. Kod vrste Arteтja safjпa, и tokи jzfoieпostj Ьаkги ј сјпkи detektovaпa је zпасајпа jпhjblcjja aktjvпostj aтjfaze ј frjpsjпa cak ј pre pojave sтапјепја rasta {Aiayse-Daпet et а/. 7 979}. И tokи defovaпja stresora {sиЬ/еtаfпј efektj stetпog иlја} иtvrdeпo је da kod kopepoda dolazj ј do smaпjeпog ипоsа hraпe, ргј сети пе dolazj do zпасајпјh promeпa и aktjvпostj aтjfaze ј celиlaze {Sатајп et а/. 1980). Kod orgaпjzama postoje odredeпa metabofjcka pгjfagodavaпja па toksjcaп stres: eпergetska сепа sjпfeze епzјта moie bltj fгjvjjalпa и оdпоsи па potrebe bazalпog metabofjzтa, dok eпergetska сепа samog procesa иzјтапја hraпe moie da Сiп ј zпасајап deo се/оkирпе епегgјје jedjпke {De Соеп & Јапssеп 7 998). ZпaCi, da sи za sveobиhvatпe ј precjzпe ekotoksjkofoske aпafjze оsјт ргасепја promeпa klasjcпjh Ьiomarkera {metalotjoпejпa, esteraza, profejпa toplotпog stresa ... ), роtгеЬпе stиdjje о иtroskи ј alokacjjj епегgјје па procese detoksjfjkacjje ј preijvfjavaпja, stерепи koпzиmacjje hraпe, kao ј о promeпama aktjvпosfj djgesfjvпjh eпzjfna koj j 186 Djskиsjja omogиcavajи razlaganje makromolekиla jz hrane ј tako zadovoljavajи metabofjcke potrebe orgaпjzama omogиcavajиCi пjjhov rast ј razvjce и stresпjт иslovjтa. И nasem ekspeгjтentи је иtvrdeno da је aktjvпost proteofjtjckjh enztma jпhjblгana и prjsиstvи razfjCitjh tretmana kadтjjиmom, ра Ьi se иz dodatna jsfrazjvanja ovj епzјтј mogfj koгjstjfj kao Ьiотагkегј zagadenja zjvotne sredjпe. Lеисјп aтjпopeptjdaza је najosetfjjvjjj jspjtjvaпj епzјт и pгjsиstvи ovog teskog metala, posto јё njegova aktjvпost smanjena ј и tokи akиtпjh tretmana kadтjjиmom. Оsјт promene aktjvпostj, vaгjjabllnost plastjcпostj епzјта srednjeg creva, kao ј promena пjjhovjh јzоfогтј и tokи razfjCitjh tretmana kadтjjиmom se mogи koгjstjtj kao Ьiотагkегј jzfoienosfj teskjт metafjтa (VIahovjc et а/. 2009). Ovo jstrazjvanje Ьi Ьilo znatno olaksano poznavanjem ргјтагпе strиktиre proиcavaпjh епzјта kod vrste Lymanfгja djspar ј poznavanjem gena kojj jh kоdјгаји. Оsјт toga, zbog eventиalne ироtгеЬе djgestjvпjh епzјта и Ьiотопјtогјпgи, potrebno је poznavatj korelacjje јzтеdи aktjvпostj peptjdaza јег one zavjse od genetjcke osnove ј ksenoblotjka kojj delиje па orgaпjzam. Neophodno је, takode, иtvгdjtj ј tacnи lokafjzacjjи ovjh епzјта, пјјhоvи sjпfezи ј regиlatorne mehaпjzтe и tokи delovanja teskjh metala. 187 \1 1 • ZakljцCCI Zakljиccj ./ Dиgotrajпj tretmaпj оЬе koпceпtracjje kadтjjиma петаји zпасајап иfјсај па иkирпј mortafjtet, kao пј па mortafjtet prvog stирпја larvj gиЬага . ./ Skraceпje prvog stирпја, kao ј иkирпоg trajaпja razvjca do иlaska и IV larveпj stирапј, detektovaпj sи samo и tokи hгопјспоg tretmaпa па 30 J..LgCd/g sиve hгапе . ./ Sтапјепј ипоs hгапе {sтапјепје proceпta sredпjeg creva larvj) гegjstrovaп је и tokи оЬа kratkotrajпa tretmaпa kаdтјјитот, kao ј па hгопјспот tretmaпи С2, gde је sтапјепје jгeveгzjblfпo . ./ Za razfjkи od mase koja se пе тепја па kratkotrajпjт tretmaпjтa, relatjvпa Ьгzјпа rasta larvj cetvrtog stирпја se povecava . ./ Zпасајап је dоргјпоs geпofjpa vагјгапји mase. Na kratkotrajпjт tretmaпjтa heгjtabllпost mase је stafjsfjckj zпасајпа . ./ Heгjtabllпost za trajaпje prvog stирпја, kao ј za trajaпje razvjca larvj do иlaska и cetvrtj larveпj stирапј јта zпасајпи vгedпost па koпtгofj ј оЬа hгопјспа tretmaпa . ./ Trofaktorskom aпafjzom varцaпse иtvrdeпo је da jspjfjvaпe koпceпtracjje kadтjjиma пе иfјси па masи ј relatjvпи Ьгzјпи rasta, ра se ove osoblпe пе mogи koгjsfjfj kao pogodпj paramefгj za иtvгdjvaпje prjsиstva kadтjjиma . ./ Na оsпоvи vetjh vredпosfj heгjtabllпosfj plasfjcпosfj и оdпоsи па heгjtabllпosfj svojstva и tokи defovaпja kadтjjиma, moie se zakljиCitj da је роvесапје plasfjcпosfj ocekjvaпj evofиfjyпj odgovor za relatjvпи Ьгzјпи rasta . ./ Posto se jпdeks feпofjpske plasfjcпosfj osoblпa adaptjvпe vredпosfj пе тепја и tokи defovaпja kadтjjиma, рготепи osoblпa adapfjvпe vredпostj, tj. пјјhоvи plasfjcпost пе moiemo иzefj kao dobre jпdjkatore prjsиstva kadтjjиma и hгапј . ./ Larve prvog stирпја sи пajosetfjjvjje па kadтjjиm, tako da se пajveCi deo иkирпоg mortafjteta desava и prvom stирпји. 188 Zakljиccj ../ И оdпоsи па hгопјспе tretmaпe, aktjvпost glиtatjoп 5-traпsferaze se povecava и tokи opoгavaka od оЬе kопсепtгасјје kadтjjиma, dok та/ј Ьгој zпасајпјh korelacjja и оkvјги tretmaпa јzтеdи GSTa ј ostafjh епzјта иkаzији па пеzаvјsпи regиlacjjи ovog епzјта detoksjfjkacjje . ../ Kod svjh епzјта, оsјт GSTa, ргјsиtап је treпd ораdапја aktjvпosfj па kаdтјјити и оdпоsи па koпtrolи . ../ И tokи oporavka od hroпjcпog stresa па 30 ~gCd/ g sиve hгапе aktjvпosfj proteofjtjckjh епzјта, a-gfjkozjdaze ј esteraza se пе vracajи па koпtrofпj ntVO . ../ Najosetfjjvjjj епzјт и prjsиstvи kadтjjиma је fеисјп aтjпopeptjdaza posto је aktjvпost јпhјЬlгапа па оЬа kratkotrajпa tretmaпa . ../ Jedпofaktorska aпafjza varjjaпse ј jпdeks feпotjpske plasfjcпosfj иkаzији па sресјfјспи regиlacjjи f3-g/jkozjdaze, јег se tokom oporavka, aktjvпost ovog епzјта povecava и оdпоsи па hгопјспј tretmaп samo kod larvj koje sи od рј/јепја do иlaska и cetvrtj stирапј Ьile jzfoieпe koпceпtracjjj od 7 О JJ.gCd/ g sиve hгапе . ../ Меhапјzтј regиlacjje f3-g/jkozjdaze ј GSTa se пajverovafпjje razfjkиjи od regиlacjoпjh mehaпjzama ostafjh proиcavaпjh епzјта . ../ Posto se aktjvпost proteofjtjckjh епzјта тепја и zavjsпosfj od koпceпtracjje ј dиiјпе trajaпja tretmaпa kаdтјјитощ ovj епzјтј Ьi mogfj da Ьиdи Ьiomarkeгj prjsиstva kadтjjиma и hгапј . ../ lzoforme jedпog епzјта па jsfom tretmaпи razfjkиjи se јzтеdи razfjCitjh legala, dok se, takode, jzoforme jstog епzјта jedпog legla razfjkиjи јzтеdи vjse razfjCitjh tretmaпa . ../ Legla {fи/1-siЬ faтjfjje} se razfjkиjи и aktjvпosfj епzјта, plastjcпosfj пjjhovog odgovora ekspresjjj pojedjпjh јzоfогтј па razfjCifjт tretmaпjтa kadтjjиmom . ../ Na razfjCifjт tretmaпjтa kadтjjиmom plastjcпost епzјта se тепја. 189 Zakljиccj ./ Plastjcпost proteaza, trjpsjпa ј LAP па С2 је тап1а od plastjcпosfj па oporavkи. Меdиtјт, па hroпjcпom tretmaпи па Cl plastjcпost odgovora za trjpsjп, LAP i a-gfjkozjdazи је veca пеgо па oporavkи od jste koпceпtracjje . ./ Cetirj djgestjvпa епzјта, иkирпе proteaze, frjpsjп, fеисјп aтjпopeptjdaza ј a- gfjkozjdaza роkаzији pad aktjvпostj и оdпоsи па koпtrolи ј to па jsfjт tretmaпjтa: akиtпom ј hroпjcпom defovaпjи veee koпceпtracjje kаdтјјита" kao ј oporavkи od jsfe koпceпtracjje metala . ./ Оgrапјсепј eпergetskj resиrsj и tokи stresa dovode do vefjkog broja пegatjvпjh korefacjja јzтеdи mase ј aktjvпostj епzјта {а ј f3-g/jkozjdaze, kao ј GSTa) па razfjCifjт tretmaпjтa. Na КС1 detektovaпo је skraceпje trajaпja razvjta larvj gиbara IV stирпја sa povecaпjem aktjvпosfj esteraza. Na Cl, sa porastom aktjvпostj GST а jedjпke ј та ји тапји masи . ./ Na svjт tretmaпjтa, оsјт и tokи oporavaka, postoje statjsfjckj zпасајпе korelacjje a-gfjkozjdaze sa aktjvпostima f3-g/jkozjdaze, esteraza, LAP ј frjpsiпa . ./ а ј rз gfjkozidaze sи па аkиtпјт ј hгопјспјт tretmaпjтa оЬе koпceпtracije kadmijиma pozjtjvпo korelisaпe, dok је па koпtroli zпak korelacjje јzтеdи ova dva епzјта пegativaп . ./ NajveCi broj pozitivпjh korelacija regjsfrovaп је јzтеdи proteolitickih епzјта па svjт tretmaпima, sto иkаzије па пjihovи zajedпickи regиlacjjи . ./ Na veCiпi tretmaпa sa povecaпjem aktivпosti esteraza, povecava se aktivпost LAP i tripsiпa. Моgиса је povezaпost esteraza sa fипkcijom proteolitickih eпzima ј hjdrolizom sfoieпih јеdјпјепја pod иticajem stresora . ./ И eksperjтeпtи је иtvrdeпo da promeпa proиcavaпjh osoblпa adaptjvпe vredпostj ne moie bltj adekvataп pokazatelj prisиstva korj5teпjh koпceпtracija kadтjjиma и hraпj . ./ Zbog jпhjblcjje aktjvпostj LAP ј esteraza и tokи kratkotrajпog efekta тап1е koпceпtracjje kadтjjиma, postojaпja korelacjja sa vefjkim brojem djgestivпjh 190 Zakljucci enzima i velike plasticnosti odgovora {naroCito kod LAP), ova dva enzima bl, uz dalje analize, mogla blti blomarkeri prisustva kadmijuma и hrani. 191 . Re erence Reference Agianian, В., Tucker, Р.А., Schouten, А., Leonard, К., Bullard, В., Gros, Р., (2003), Strudureofa Drosophila Sigma class glutathione 5-transferase reveals а novel active site topography suited for lipid peroxidation products, Ј. Мо/. Biol. 326: 151-165 Ahearn, G. А., Mandal, Р. К., Mandal Р.А., {2004), Mechanisms of heavy-metal sequestration and detoxificationin crustaceans: а review, Ј. Comp. Physiol. 17 4В: 439-452 Ahmad, S., ( 1970), Localization of aliesterase and acetylcholinesterase enzymes in various tissues of susceptiЬ/e and organophosphate resistant Musca domestica L., Comp. Gen. Pharmacol. 1: 273-279 Ahmad, S., (1976), Larval and adult hosefly carboxylesterase: isozymic composition and tissue pattern, lnsect Biochem. 6: 541-547 Ahmad, S., Pardini, R.S., (1990), Mechanisms for regulating oxygen toxicity in phytophagous insects, Free Radic. Biol. Med. 8: 401-413 Ahmad, S., Zaman, К., MacGi/1, R.S., Batcabe, Ј. Р., Pardini, R., ( 1995), Dichlone- induced oxidative stress in а model insect species, Spodoptera eridania, Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 442-448 Alayse-Danet, А.М., Charlou, Ј., Jezequel, М., Samain, Ј., ( 1979), Modele de detection rapide des effets subletaux des polluants: modification des taux d amylase et de trypsine d Artemia salina conaminees par /е cuivre ou /е zinc, Маг. Bio/. 51: 41-46 Almar, М.А., Diaz-Mayans, Ј., Romero, F.J., {1987}, Glutathione content and GSH 5-transferase adivity in midgut gland of Procambarus clarkii. Sex differences, the effect of fasting, and their implications in cadmium toxicity, Comp. · Biochem. Physiol. 87С: 433-435 Andersen, 0., Nielsen, Ј.В., Sorensen, Ј.А., Scherrebeck, L., (1994), Experimental localization of intestinal uptake sites for metals (Cd, Hg, Zn, Se) in vivo in mice, Environ. Health Perspect. 102: 199-206 Andersen, D.H., Pertoldi, С., Scali, С. , Loeschcke, V., (2005}, Heat stress and age induced maternal effects оп wing size and shape in parthenogenetic Drosophila mercatorum, Ј. Evol. Biol. 18: 884-892 Anstee, Ј. Н., Charnley, А К., ( 1977), Effects of frontal ganglion removal and starvation оп activity and distriЬution of six gut enzymes in Locusta, Ј. lnsed Physiol. 23, 965-974 ATSDR, (1999) Toxicological Profi/e for Cadmium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry, US Department of Health and Нитап Services Augustyniak, М., Migula, Р., (2000), Body burden with metals and detoxifying aЬilities of the grasshopper-Chorthippus brunneus (ThunЬerg) from industrially polfuted areas Eds: В. Markert & К. Frieze, /n : Trace Metals in the Environment, Elsevier, Amsterdam, The Netherlands : 423-454 192 Reference Baker, Ј. Е., {1 991 }, Properties of glycosidases from the matze weevil, Sitophilus zeamais, lnsect Biochem.2 7: 6 7 5-62 7 Ваитап, Ј. W., Liu, Ј., Klaassen, C.D., (1 993), Produdion of metallothionein and heat-shock proteins in in response to metals, Fundam. Арр/. Toxicol. 2 7: 7 5- 22 Beaty, В.Ј., Mackie, R.S., Mattingly, К.S., Carlson, Ј.О., Rayms-Keller, А., {2002), The midgut epithelium of aquatic arthropods: А critical target organ in environmental toxicology, Environ. Health Perspect. 7 70: 91 1-914 Beaumont, A.R., Toro, Ј.Е., {7996}, Allozyme genetics of Mytilus edulis subjeded to copper and nutritive stress, Ј. Маг. Biol. Assoc. UK 76, 1061-7071 Becker, W .A., { 7 984), Manual of Quantitative Genetics, Academic Enterprises Pullman, Washington Beckman, L., Johnson, F.M., {1 964}, Genetic control of aminopeptidases in Drosophila melanogaster, Hereditas 51:221-230 Ве//, R.A., Owens, C.D., Shapiro, М., Tardif, J.R., ( 7 98 7 }, Mass rearing and virus production: Development of mass-rearing technology, Eds: Doane, С. С. & МсМапиs, М. L., /n: The Gypsy Moth: Research Toward lntegrated Pest Menagement, 614, USDA For: Serv. Tech . Ви//. 1584 Bengtsson, G., Rundgren, 5., Sjorgren, М., { 7 994}, Modelling dispersal in а soi/ gradient: The influence of metal resistance, competition and experience, Oikos 71: 73-23 Berridge, М.Ј., {1 970), А structural analysis of intestinal absorption, Symp. R. Ent. SOC. London 5: 7 35-15 7 Berrigan, D., Hoang, А., { 7 999), Correlation between enzyme activities and routine metabolic rate in Drosophila, Ј. Evol. Biol. 7 2: 258-262. Beynon, R.J., Bond, J.S., {1 994), Proteolytic enzymes а practical approach, IRL Press at Oxford University Press, New York Bijlsma, R., Loeschcke, V., {2005Ji Environmental stress, adaptation and evolution: an overview, Ј. Evol. Biol. 7 8: 744-749 Bischof, С., {1 995}, Effect of heavy metal stress оп carbohydrate and lipid concentration in the haemolymph and total body tissue parasitized Lymantria dispar L. larvae {Lepidoptera}, Comp. Biochem. Physiol. 7 7 2С: 87-92 Blahovec, Ј., Kostecka, Z., Kocisova, А., {2006}, Peptidolytic enzymes in different larval stadium of housefly Musca domestica, Veterinarni Medicinq 51 : 7 39- 144 Blinska, В., (2001 ), Оп the structure of human hair melanins from an infrared spectroscopy analysis of their interaction with Ctl+ ions, Spectrochim. Acta А 2001:2525-2533 Boiic, N., VujCic, Z., Nenadovic, V., lvanovic, Ј., (2003), Partial purification and characterization of midgut leucyl aminopeptidase of Morimus funereus {Coleoptera: Cerambycidae} larvae, Comp. Biochem. Physiol. 7 34В: 231-242 193 Refereпce Board, P.G., Coggaп, М., Chelvaпayagam, G., Easteal, 5., Jermiiп, L.S., Schulte, G.К., Daпley, D.E., Hoth, L.R., Griffor, М. С., Kamath, А V., Rosпer, М.Н., Chruпyk, В.А., Perregaux, D.E., Gabel, С.А., Geoghegaп, К.F., Paпdit, Ј., (2000), Jdeпtificatioп, characterizatioп, апd crystal structure of the Omega class glutathioпe traпsferases, Ј. Bio/. Chem. 275: 24798-24806 Borowitz, J.L., McLaughliп, J.L., (7992}, Evideпce for calcium chaппels iп Ьгiпе shrim~: _Ditiazem protects shrimp agaiпst cadmium, Eпviroп . Coпtam. Toxicol. 48: 4~-440 . Bradford, М., (7 976), А rapid апd seпsitive method for the quaпtizCitioп of microgram quaпtities of proteiп utiliziпg the priпciple of proteiп-dye blпdiпg, Апа/. Biochem. 72:248-254 Bradshaw, A.D., (1965}, Evolutioпary sigпificaпce of pheпotypic plasticity iп plaпts, Adv. Geпet. 13: 115-155 Braeckmaп, В., Raes, Н., Vап Ноуе, D., (7997), Heavy-metal toxicity iп ап iпsect се// liпe. Effects of cadmium chloride, mercuric chloride апd methylmercuric chloride оп се// viabllity апd proliferatioп iп Aedes a/Ьopictus cells, Се// Biol. Toxicol. 1 З: 389-397 Braeckmaп, В., Smagghe, G., Brutsaert, N., Cornelis, R., Raes, Н., (7 999), Cadmium uptake апd defeпse mechaпism iп iпsect cells, Eпviroп . Res. Sect. А80: 231- 243 Bray, Т.М., Bettger, W.J., ( 7990), The physiological го/е of ziпc as а п aпtioxidaпt, Free Rad. Biol. Med. 8: 287-291 Brzoska, М.М., Moпiuszko-Jakoпiuk, Ј., (2oon lпteractioпs betweeп cadmium апd ziпc iп the orgaпism, Food Chem. Toxicol. 39: 967-980 Brzoska, М.М., Moпiuszko-Jakoпiuk Ј., Jurczuk, М., Galazyп-Sidorczuk, М., Rogalska, Ј., (2001 }, The effect of ziпc supp/y оп cadmium-iпduced chaпges iп the tibla of rats, Food Chem. Toxicol. 39: 729-737 Вуеоп, G.M., Lee, К.S., Gui, Z.Z., Кim, 1., Капg, P.D., Lee, S.M., Sohп, H.D., Јiп, B.R., (2005}, А digestive f3-glucosidase from the silkworm, ВотЬух mori: cDNA cloпiпg, expressioп апd eпzymatic characterizatioп, Comp. Biochem. Physiol. 141 В: 418-427 Calabrese, Е.Ј., Baldwiп, L.A., ( 1999), Chemical hormesis: its historical fouпdatioп as blological hypothesis, Toxicol. Pathol. 27: 195-216 Calabrese, Е.Ј., Baldwiп, L.A., (2002) Defiпiпg hormesis, Нитап Ехр . Toxicol. 21: 97-98 ( Callaghaп, А., Parker, P.J.A.N., Holloway, G.J., (1998), The use of variaпce iп eпzyme activity as ап iпdicator of loпg-term exposure test to toxicaпt-stressed eпviroпmeпts iп Си/ех pipeпs mosquitoes, Fuпd. Ecol. 12: 436-441 Calow, Р., SiЬ/y, R.M., Forbes, V., ( 1997), Risk assessmeпt оп the basis of simp/ified life-history sceпarios, Eпviroп. Toxicol. Chem. 16: 1983-1989 194 Rеfегепсе Сагfаgпа, М .А., Ропslег, G.D., МиhоЬегас, В.В ., (1996}, Jпhibltioп of ATPase activity iп гаt syпaptic plasma тетЬгапеs Ьу simиltaпeoиs ехроsиге to metals, Chem. Biol. lпteгact. 1 ОО: 53-65 Сагг, R.S., Wiliams, Ј. W., Saska, F.l., Bиhl, R.S., Neff, Ј.М., {1 985}, Bioeпeгgetic alteгatioп coггelated with gгowth, fecипdity апd body Ьигdепs of cadmiиm iп Mysids (Mysidopsis bahia}, Епviгоп. Toxicol. Chem. 4: 181-18 Cerveгa, А., Maymo, А С., Martiпez-Paгdo, R., Gагсега, M.D., {2003), Aпtioxidat eпzymes iп Oпcopeltиs fasciatиs {Неtегорtега: Lygaeidae} exposed to cadmiиm, Епviгоп. Eпtomol. 32: 705-71 О Cerveгa, А., Маут6, А.С., Sепdга, М., Martiпez-Paгdo, R., Gагсега, M.D., {2004), Cadm.iиm effects оп developmeпt апd гергоdисtiоп of Oпcopeltиs fasciatиs {Неtегорtега: Lygaeidae}, Ј. lпsect Physio/. 50: 737-749 Сhаgпоп, N.L., Gиttmaп, S.l., {1 989), Biochemical aпalysis of allozyme соррег апd cadmiиm tоlегапсе iп fish иsiпg staгch gel electгophoгesis, Епviгоп. Toxicol. Chem. 8: 1141-1147 Chao, S.H., Ви, С. Н., Сhеипg, W. У., (7 990), Activatioп of tгоропiп С Ьу СсР+ апd pfl+, Агсh . Toxicol. 64: 49Q-496 Chao, S.H., Ви, С. Н., Сhеипg, W. У., { 1995}, Stimиlatioп of myosiп /ight-chaiп kiпase Ьу Cd2+ апd РЬ2+, Агсh. Toxicol. 69: ·197-203 Chattopadhyay, G.К., Seпgиpta, А.К., Veгma, А.К., Sеп, S.К., Saгatchaпdгa, В., (200 1 ), Esteгase isozyme polymoгphism, specific апd пoпspecific esteгase, syпgeпic liпes developmeпt апd паtига/ оссиггепсе of а theгmostaЬ/e esteгase iп the tгopical silkwoгm ВотЬух moгi L., lпsed Biochem. Molec. Biol. З 1: 1191-1199 Cheпg, L., Schиlz-Baldes, М., Наггisоп, C.S., {1 984), Cadmiиm iп oceaп-skateгs, HaloЬates seгiceиs {lпsecta}, апd iп theiг seablгd pгedatoгs, Маг. Bio/. 79: 321-324 Chep/ik, G.P., ( 1995}, Geпotypic vaгiatioп апd plasticity of cloпal gгowth iп гelatioп to пиtгitieпt availabllity iп AmphiЬгomиs scabгivalvis, J.Ecol. 83: 459-468 Сhеипg, W. У., (7 984), Calmodиliп: its poteпtial го/е iп се// pгolifeгatioп апd heavy metal toxicity, FASEB Ј 43: 2995-2999 Chiп, Т.А., Templetoп, D.M., (7 993), Pгotective elevatioпs of glиtathioпe апd metallothioпeiп iп cadmiиm-exposed mesaпgial cells, Toxicology 77: 145- 156 Chiппi, S., Кhап, R.N., Yallapгagada, P.R., {2000), Охуgеп сопsитрtiоп, ammoпia­ N ехсгеtiоп апd metal ccиmиlatioп iп Репаеиs iпdicиs postlarvae exposed to lead, Ви//. Епviгоп. Coпtam. Toxicol. 64: 144-151 Chiппi, S., Yallapгagada, P.R., {2002}, Епегgу levels of Репаеs iпdicиs postlarvae оп ехроsиге to lead, Ecotox. Епviгоп. Saf. 52: 173-179 195 Reference Chippindale, А.К., Chu, T.J.F., Rose, M.R., (1996}, Complex trade--offs and the evofution of starvation resistance in Drosophila melanogaster, Evolution 50: 753-766 Chrestensen, СА., Starke, D. W., Mieyal, Ј.Ј., {2000}, Acute cadmium exposure inactivates thioltransferase {glutaredoxin}, inhiblts intracellular reduction of protein-glutathionyl-mixed disulfides, and initiates apoptosis, Ј. Biol. Chem. 275: 26556-26565 Clark, A.G., (1989а}, Causes and consequences of variation in energy storage in Drosophila melanogaster, Genetics 123: 1 З 7-744 Clark, А G., { 7989Ь}, The comparative enzymology of the glutathione 5-transferases from non-vertebrate organisms, Comp. Biochem. Physiol. 928: 419-446 Clark, A.G., Keith, L.E., (1988}, Variation among extracted lines of Drosophila melanogaster in triacy/glycero/ and carbohydrate storage, Genetics 119: 595- 607 C/ark, A.G., Fucito, C.D., (1998}, Stress toferance and metaЬolic response in Drosophila melanogaster, Heredity 87: 514-527 Coogan, Т.Р., Bare, R.M., Waalkes, М.Р., {1992}, Cadmium-induced DNA strand damage in cultured liver cells reduction in cadmium genotoxicity following zinc pretreatment. Toxicol. Арр/. Pharmacol. 113: 227-233 Corrigan, А.Ј., Huang, Р. С., { 1981 }, Cellular uptake of cadmium and zinc, Biol. Trace Е/ет. Res. 3:197-216 Costa, J.R.M.A., Ме/а, М., Assis, H.C.S., Pelletier, Е., Randi, M.A.F., RiЬeiro, С.А.О., {2007}, Enzymatic inhibltion and morphological changes in Hoplias malabaricus from dietary exposure to fead {11} ог methylmercury, Ecotoxicol. Environ. Saf. 67: 82-88 Cristofolleti, Р. Т., RiЬeiro, A.F., Terra, W.R., {2007 }, Apocrine secretion of amylase and exocytosis of trypsin along the midgut of Tenebrio molitor larvae, Ј. lnsect Physiol. 47: 143-155 Crommentuijn, Т., Brils, Ј., Van Straalen, N.M., {1993}, lnfluence of cadmium оп life- history characteristic of Folsomia candida {Willem} in an artificial soil substrate, Ecotoxicol. Environ. Saf. 26: 216-227 Czesak, М.Е., Fox, С., {2003}, Evolutionary ecology of egg size and питЬег in а seed beetle: genetic trade--offs differ between environments, Evolution 57:1121-7132 Dallinger, R., { 1993}, Strategies of metal detoxification in terrestrial invertebrates, Eds: Dallinger, R. & Rainbow, P.S., /n : Ecotoxicology of Metals in lnvertebrates, Lewis PuЬ/ishers, Воса Raton, 245-289 David, J.R., Allemand, R., Van Herrewege, Ј., Cohet, У., {7983}, Ecophysiology: Ablotic factors , Eds: Ashburner, М., Carson, H.L., Thompson, J.N., /n : The genetics and blology of Drosophila, New York, Academic, 105-170 196 Rеfегепсе David, J.R., Агагiре, L.O ., Chakiг, М . , Legout, Н., Lemos, В., Petavy, G., Rohmeг, С., Joly, D., Moгeteau, В., (2005}, Ма/е steгility at extгeme tempeгatuгes : а sigпificaпt but пeglected рhепотепоп fог uпdeгstaпdiпg Dгosophila climatic adaptatioпs, Ј. Evol. Biol. 7 8: 838-846 De Соеп, W .M., Јапssеп, C. R. {7 998), The use o f blomaгkeгs iп Daphпia magпa toxicity testiпg, Hydгoblologia 367: 7 99-209 De Wol~ Н. , Јогdаепs, К. , Reuseпs, Е. , Blust, R., Backeljau, Т. , {200 7 }, Esteгase vaгiatioп iп the peгiwiпkle Littoгiпa littoгea, aloпg the western апd eastern 5cheldt estuaгium, Маг. Епviгоп . Res 52: 373-382 Del Lama, М.А., Веzегга, R.M., Egea 5оагеs, А.Е. , Ruvofo-Takasusuki, М.С.С., (200 7 ), .Geпetic, oпtogeпetic, апd tissue-specific vaгiatioп of amiпopeptidases of Apis melifeгa, Apidologie 32: 25-35 Diamaпtiпo, Т. С., Almeida, Е., 5оагеs, А М. V. М., Guilheгmiпo, L., (2003), Chaгacteгizatioп of Choliпesteгases fгom Dap-hпia magпa 5tгaus апd Theiг Jпhibltioп Ьу Ziпc, Ви//. Епviгоп . Coпtam . Toxicol. 77 :279-225 Diaz-Cгuz, М.5. , Meпdieta, Ј. , Таиlег, R., Estebaп, М., {7 997), Cadmium blпdiпg pгoperties of glutathioпe: а chemometгical aпalysis of voltammetгic data, Ј. Јпогg . Biochem. 66: 29-36 Dieteг, Н.Н. , Abel, Ј., Ohпesoгge, F.К., {7 982}, Јп vitгo iпhibltioп of the sofuЬ/e glutathioпe 5-tгaпsfeгases fгom гаt liveг Ьу heavy metals, Res. Соттип . Chem. Patho/. Phaгmacof. 27: 25-32 Dobzhaпsky, Т., (7 947), Adaptive chaпges iпduced Ьу пatuгal selectioп iп wild populatioпs of Dгosophila, Evofutioп 22: 7-7 6 Dопkег, М . Н., (7 992), Епегgу гeserves апd distгiЬutioп of metals iп populatioпs of the isopod Poгcellio sсаЬег fгom metal-polluted sites, Fuпct. Ecof. 6: 445-454 Dопkег, М .Н. , Bogert, C.G., {7992), Adaptatioп to cadmium iп thгee populatioпs of the isopod Poгcellio sсаЬег, Ed: Dопkег, М.Н., Јп: Physiology of metal adaptatioп iп the isopod Poгcellio sсаЬег, Vгije Uпiveгsiteit, Eпschede, 75-84 Dиап, У. , Guttmaп, 5. Ј. , Oгis, Ј. Т., Baileг, А.Ј., {2007 }, Diffeгeпtial surviviship amoпg allozyme geпotypes of Hyalella azteca exposed to cadmium, ziпc ог fow рН, Aquat. Toxicof. 54: 7 5-28 Duгliat, М., Воппеtоп, F., Boissoппeau, Е., Апdге, М., Wegпez, М., { 7 995), Expгessioп of metallothioпeiп geпes duгiпg the post-embгioпic developmeпt of Dгosophila melaпogasteг, BioMetals 8:339-357 Ebert, D., Yampolsky, L., 5tearns, 5.С., {7993), Geпetics of life history iп Daphпia magпa. Ј. Heгitabllities at two food fevels , Heгedity 70: 335-343 Eguchi, М., Jwamato, А., ( 7 975}, Chaпges iп pгotease, esteгase апd phosphatase iп the alimeпtaгu сапа/ of the silkwoгm duгiпg metamoгphosis, Jпsect Biochem. 5: 495-507 197 Refereпce Elumalai, М., Aпtuпes, С., Guilhermiпo, L., (2007), Eпzymatic Ьiomarkers iп the сгаЬ Carciпus maeпas from the Miпho River estuary {NW Portugal} exposed to ziпc апd mercury, Chemosphere 66: 1249-1255 Eпayati, А.А., Rапsоп, Н., Hemiпgway, Ј., (2005}, lпsect glutathioпe traпsferases апd iпsedicide resistaпce, lпsect Мо/. Bio/. 14: 3-8 Епdо, Т., Кimura, 0., Sakata, М., (1996}, Effeds of ziпc апd copper оп uptake of cadmium Ьу UC-PK1 cells, Biol. Pharm. Ви//. 19: 944-948 ЕРА, {2005}, Toxicological review of ziпc апd compouпds, U.S. Eпviroпmeпtal Protectioп Аgепсу, Washiпgtoп, D.C. Erlaпger, B.F., Kokowsky, N., Соhеп W., {1961 ), The preparatioп апd properties of two пеw chromogeпic substrates of trypsiп, Arch. Biochem. Biophys. 95: 271- 278 Еvепdеп, А.Ј., Depledge, М. Н., { 1997), Geпetic Susceptibllity iп Ecosystems: The Challeпge for Ecotoxicology, Eпviroп. Health Perspect. 105 {Supp/. 4) 105: 849-854 Falke, Е. V., Maclпtyre, R.J., {1966}, Тhе geпetic localizatioп of пoп-cpecific leuciпe amiпopeptidase iп Drosophila melaпogaster, Drosophila lпform. Serv. 41: 165-166 Ferreira, С., Terra, W.R., {1986}, Substrate specificity апd Ьiпdiпg loci for iпhibltors iп ап amiпopeptidase purified from the plasma тетЬгапе of midgut cells of ап iпsect (Rhyпchosciara americaпa} larva, Arch. Biochem. Biophys. 244: 478-485 Ferreira, С., Terra, W.R., {1989), Spatial orgaпizatioп of digestioп, secretory mechaпism апd digestive eпzyme properties iп Pheropsophus aequiпoctialis {Coleoptera: Carabldae}, lпsed Biochem. 19: 383-391 Ferreira, С., 0/iveira, М., Terra, W.R., { 1990), Compartmeпtalizatioп of the digestive process iп Abracris flavoliпeata {Orthoptera: Acrididae} adults, lпsed Biochem. 20: 267-274 Ferreira, С., Belliпello, G.L., RiЬeiro, A.F., Terra, W.R., {1990), digestive eпzymes associated with the glycocalyx, microvillar membraпes апd secretory vesicles from midgut cells of Teпebrio molitor larvae, lпsect Biochem. 20: 839-847 Ferreira, С., Torres, В.В., Terra, W.R., {1998), Substrate specificities of midgut 13- glycosidases from iпsects of differeпt orders, Comp. Biochem. Physiol. 1198: 219-225 Ferreira, С., Магапа, S.R., Silva, С., Terra, W.R., { 1999), Properties of digestive glycosidases апd peptidases апd the permeabllity of the peritrophic membraпes of Abracris flavoliпeata {Orthoptera: Acrididae}, Comp. Biochem. Physiol. 1238: 241-250 198 Reference Ferreira, А.Н.Р., RiЬeiro, A.F., Terra, W.R., Ferreira, С., (2002), Secretion of J3- glucosidase Ьу middle midgut cells and its recycling in the midgut of Tenebrio molitor lаГУае, Ј. lnsect Physiol. 48: 7 7 3-1 7 8 Filser, Ј., Holscher, G., { 7 997)i Experimental studies оп the reactions of Collembola to copper contamination, Pedoblologia 4 7: 7 73-178 Fisher, R.A., ( 7 930), The Genetical Theory of natural Selection, Clarendon Press, Oxford, UK Fleming, R.E., Migas, М.С., Zhou, Х., Jiang, Ј., Britton, R. S., Brunt, Е. М ., Tomatsu, S., Waheed, А., Bacon, B.R., Sly, W .S., {1 999), Mechanism of increased iron absorption in murine model of hereditary hemochromatosis: increased duodenal expression of the iron transporter DМП, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3143-3148 Forbes, V.E., Mtz1ller, V., Depledge, М.Н., {7 995}, /ntrapopulation variabllity in suЬiethal response to heavy-metal stress in sexual and asexual gastropod populations, Funct. Ecol. 9: 477-484 Fountain, М. Т., Hopkin, S.P., (2001 ), Continous monitoring of Folsomia candida {lnsecta: Collembola} in а metal exposure test, Ecotox. Environ. Safe. 48: 275- 286 Fournier, D., Bride, Ј.М., Poire, М., Berge, Ј. В., Plapp, F. W., {1 992), lnsed glutathione 5-transferases . Biochemical characteristics of the major forms from houseflies susceptiЬ/e and resistant to insecticides, Ј. Biol. Chem. 267: 7 84о- 1845 Fournier, D., Mutero, А., Rungger, D., {7 993), Drosophila acetylcholinesterase: expression of а functional precursor in Xenopus oocytes, Eur. Ј. Biochem. 203: 513-519 Fox, A.G., {7 995}, Тinkering with the Tinkerer: Pollution versus Evolution, Environ. Health Persp. 7 03 {Supp/4): Oo-QO Frasco, M.F., Colletier, Ј.Р., Weik, М., CaГYalho, F., Guilhermino, L., Stojan, Ј., Fournier, D., {2007), Mechanisms of cholinesterase inhibltion Ьу inorganic mercury, FEBS Journal 274: 7 849-186 7 Frati, F., Fanciul/i, Р.Р., Posthuma, L., {1992), Allozyme variation in reference and metal-exposed natural populations of Orchesella cinda {L.) {lnsecta, Collembola}, Biochem. Syst. Ecol. 20: 297-3 7 О Fred, M.S., Brommer, Ј.Е., {2005}, The decline and current distriЬution of Parnassius apollo {Linnaeus} in Finland; the го/е of Cd, Ann. Zool. Fennici 42: 69-79 Freitas, D.R.J., Rosa, R.M., Moraes, Ј., Campos, Е., Logullo, С. , Da Silva Vaz Jr., /., Masuda, А., {2007), Relationship between glutathione S-transferase, catalase, oxygen consumption, /ipid peroxidation and oxidative stress in eggs and lаГУае of Boophilus microplus {Acarina: lxodidae}, Comp. Biochem. Physiol. 146А: 688-694 199 Refereпce Gabriel, W., {2005}, How stress selects for reversiЬ/e pheпotypic plasticity, Ј. Evol. Biol. 18: 873-883 Gahukar, R. Т., ( 1975), Effects of dietary ziпc sulphate оп the growth апd feediпg behaviour of Ostriпia пubllalis НЬп. {Lep. Pyraustidae}, Z. Aпgew. Епt. 79, 352-357 Garlaпd, Т. Jr., ( 1984), Physiological correlates of locomotory performaпce iп а lizard: ап allometric approach, Ат. Ј. Physio/. 247: R806-R815 Gaudy, R., Gueriп, Ј.Р., КегапЬгит, Р., {1991 ), 5ublethal effects of cadmium оп respiratory metabolism, пutritioп, excretioп апd hydrolase activity т Leptomysis liпgvura {Crustacea: Mysidacea}, Маг. Biol. 109, 493-501 Gavrilets, 5., 5cheiпer, 5.М., { 199За), The geпetics of pheпotypic plasticity. V. Evolutioп of reactioп погт shape, Ј. Evol. Bio/. 6: З 1-48 Gavrilets, 5., 5cheiпer, 5.М., ( 199ЗЬ), The geпetics of pheпotypic plasticity. Vl. Theoretical predictioпs for directioпal selectioп, Ј. Evol. Biol. 6: 49-68 Geer, В. W ., Laurie-Ah/Ьerg, С. С., {1984), Geпetic variatioп iп the dietary sucrose modulatioп of eпzyme activities iп Drosophi/a melaпogaster, Geпet. Res. 43: 307-321 Geer, В. W., Laпgeviп, M.L., McKechпie, W. W., {1985}, Dietary ethaпol апd lipid syпthesis iп Drosophila melaпogaster, Biochem Geпet. 23: 607-622 Geer, В. W., McKechпie, 5. W., Beпtley, М.М., Oakeshott, J.G., Quiпп, Е.М., Laпgeviп, M.L., {1988), /пductioп of alcohol dehydrogeпase Ьу ethaпol iп Drosophila melaпogaster, Ј. Nutr. 118: 398-407 GЩ K.D., Pal, R., 5aпdhir, R., et а/. {1989), Effect of chroпic cadmium exposure оп lipid compositioп апd peroxidatioп iп liver апd kidпeys iп rats, Med. 5ci. Res. 17:921-924 Gillespie, Ј.Н., Turelli, М., {1989), Geпotype-eпviroпmeпt iпteractioп апd the таiпtепапсе of polygeпic variatioп, Geпetics 121: 129-138 Giпteпreiter, 5., Ortel, Ј., Nopp, Н .Ј. ( 1993), Effeds of differeпt dietary levels of cadmium, lead, copper апd ziпc оп vitality of the forest pest iпsect Lymaпtria dispar L. (Lymaпtriidae, Lepid.), Arch. Сопtат. Toxicol. 25: 62-66 GodoCikova, Ј., Polek, В., Klimeпt, V., {1993), lпflueпce of metal pretreatmeпt оп the acute toxicity of cadmium оп the larvae of Galleria melloпella {Lepidoptera, Pyralidae}, Biologia, Bratislava 48: 637-641 Goviпda, 5., Kutlow, Т., Beпtivegпa, С.5., (2000}, ldeпtificatioп of а putative гЊоsота/ proteiп mRNA iп Chiroпomus riparius апd its respoпse to cadmiuщ heat shock апd actiпomyciпD, Ј. Biochem. Мо/. Toxicol. 14: 195-203 Graf, R., Raikhel, А. 5., Browп, M.R., Lea, АО., Briegel, Н., {1986), Mosquito trypsiп : immuпocytochemicallocalizatioп iп the midgut of blood-fed Aedes algupti (L.), Се// апd Tissue Res. 245: 19-27 Graпey, R.L., Giesy Ј.Р.Ј., {1986}, peпtachloropheпol оп free amiпo Effects of loпg-term exposure to acid pool апd eпergy reserves of the 200 Rеfегепсе fгeshwateг amphipod Gammaгus pseudolimпaeus, Ecotox. Епviгоп . 5af. 12: 2ЗЗ-251 Gгime, Ј.Р., (1989), The stгess debate: symptom of impediпg syпthesis?, Biol. Ј. Liпп. 5ос. З7: З-17 Gгippo, М .А. , Heath, A.G., {200З), The effect of тегсигу оп the feediпg behaviouг of fathed miппows (Pimephales pгomelas}, Ecotoxicol. Епviгоп. 5af. 55: 187- 198 Guilheгmiпo, L., Ваггоs, Р., 5ilva, М. С. , 5оагеs, А.М . V.M., {1998), 5hould the use o f iпhiЬitioп of choliпesteгase as а specific Ьiотагkег fог oгganophosphate апd caгbamate pesticides Ье questioпed?, Biomaгkeгs З/2: 157-16З Guпshiп, Н. , Mackeпzie, В. , Вегgег, И. V., Guпshiп, У. , Romeгo, M.F., Вогоп, W.F., Nussbergeг, 5., Gollaп, L., Hedigeг, М .А. , {1997), Cloпiпg апd chaгacteгizatioп of а mammaliaп pгotoп-coupledmetal-ioп tгапsрогtег, Natuгe З88: 482-488 Guo-Xiпg, W ., Goпg-Yiп, У., Cui, Н. , Јiа-Ап, С., {2006), Accumulatioп of cadmium and its effects оп gгowth, developmeпt апd hemolymph Ьiochemical compositioпs iп Boettcheгisca регеgгiпа larvae {Dipteгa: 5aгcophagidae}, lпsect 5ci. 1 З: З 1-З9 Gutteliпњ Е. W ., Doгoszuk, А., Rikseп, J.A.G., Ргоkор, Z., Kammeпga, Ј.Е., {2007}, Епviгоптепtа/ iпflueпce оп geпetic coггelatioпs betweeп life-history tгaits iп Caeпoгhabditis elegaпs, Heгedity 98: 206-21 З Guttmaп, 5.1. , (1994), Populatioп geпetic stгuctuгe апd ecotoxicology, Епviгоп. Health . Peгspect. 102 {5upp/. 12): 97-1 ОО HaЬig, W.H., Pabst, М.Ј., Jakoby, W .B. , { 1974), Glutathioпe 5-tгaпsfeгases, Ј. Biol. Chem.249:71ЗD-71З9 Hagvaг, 5., Abгahamseп, G., ( 1990), Micгoarthгopoda апd Eпchytгaeidae (0/igochaeta} iп паtига//у lead-coпtamiпated soils: а gгadieпt study, Епviгоп . Eпtomol. 19: 126З-1277 Haiпaut, Р., Мi/пег, Ј. , {199З), А stгuctuгal го/е fог metal ioпs iп the "wild type" coпfoгmatioп of the tитог suppгessoг ргоtеiп р5З, Сапсег Res. 5З: 17З9- 1742 Hall, N .A., ( 1988а}, Peptidases iп Dгosophila melanogasteг. 11. The vaгiatioп of peptidase activities duгiпg devefopmeпt, lпsect Biochem. 78: 145-155 Hall, N .A., ( 1988Ь}, Peptidases iп Dгosophila melaпogasteг. 111. The гegulatioп of feuciпe amiпopeptidase Р апd feuciпe amiпopeptidase G, lпsect Biochem. 18: 157-161 Haгshmaп, L.G., Hoffmaпп, А.А. , Claгk, A.G., {1999}, 5electioп fог starvatioп гesistaпce iп Dгosophila melaпogasteг: physiological coггelates, eпzyme activities апd multiple stгess гespoпses, Ј. Evol. Biol. 12: З7Q-З79 Hasset, R.P., Laпdry, M.R., {198З), Effeds of food-levef acclimatioп оп digestive eпzyme activities апd feediпg behavioг of Calaпus pacificus, Маг. Biol. 75: 47-55 201 Reference Hegedus, D., Baldwin, D., OGrady, М., Braun, L., Gleddie, 5., Sharpe, А., Lydiate, D., Erlandson, М., {2003), Midgut protease from Mamestra configurata {Lepidoptera: Noctuidae} Larvae: characterization, cDNA cloning, and expressed sequence Tag analysis, Arch. lnsect Biochem. Physiol. 53: 3Q-47 Helpern, М., Gasith, А., Bresler, V.M., Broza, М., {2002), The protective nature of Chironomus luridus larval tuЬes against copper sulfate, Ј. lnsect Sci. 2: 1-5 Hensbergen, Р.Ј., Van Velzen, М.Ј.М., Adi Nugroho, R., Donker, М.Н., Van Straalen, N.M., {2000), Metallothionein-bound cadmium in the gut of the insed Orchesella cincta {Collembola} in relation to dietary cadmium exposure, Comp. Biochem. Physio/. 125С: 17-24 Hillerton, Ј.Е., Vincent, J.F., {1982), The specific location of zinc in insect mandiЬules, Ј. Ехр. Biol. 1 О 1: 333-336 Hinkle, Р.М., Shanshala 11, E.D., Nelson, Е .Ј., { 1992}, Measurment of intracellular cadmium with fluorescent dyes. Further evidence for the го/е of calcium channels in cadmium uptake, Ј. Bio/. Chem. 267: 25553-25559 Hiraizumi, К., Tavormina, Р. А., Mathes, К.D., {1992}, Genetic and environmental effects оп the expression of peptidases and larval viabllity in Drosophila melanogaste, Genetics 131: 625-642 Hodgson, Е., {2004), А textЬook of modern toxicology, John Wiley & Sons lnc., New Jersey Hoffmann, А.А., Parsons, Р.А., {1991 ), Evolutionary Genetics and Environmental Stress, Oxford University Press Hoffmann, А.А., Merili:i, Ј., { 1999), Heritable variation and evolution under favourable and unfavouгable conditions, Tree 14: 96-101 Hoffman, А.А., S0rensen, J.G., Loeschcke, V., {2003}, Adaptation to extreme temperatures in Drosophila comblning quantitative and molecular approaches, Ј. Therm. Biol. 28: 175-216 Hoffmann, А.А., Hallas, R., Anderson, A.R., Telonis-Scott, М., {2005), Evidence for а robust sex-specific tгade--off between cold resistance and starvation resistance in Drosophila melanogaster, Ј. Evol. Biol. 18: 804-81 О Hopkin, S.P., Martin, М.Н., { 1983), Heavy metals in the centipede Lithoblus variegatus {Chi/opoda}, Environ. Pollut. 68: 309-318 Hopkin, S.P., {1989), Ecophysiology of Metals i Terгestrial lnvertebrates, Elsevier App/ied Science, Elsevier, New York Hopkin, S.P., Hames, СА. С., Dray, А., {1989), X-ray microanalytical mapping of the intracellular distriЬution of pollutant metals, Microsc. Anal. 14: 23-27 Hopkin, S.P., {1990), Critical concentrations, pathways of detoxification and cellular ecotoxicology of metals in teгrestrial arthropods, Funct. Ecol. 4: 321-327 Howard, В. Mitche/1, Р.С.Н., Ritchie, А., Simkiss, К., Т ау/ог, М., {1981 ), The composition of intгacellular gгanules from metal accumulating cells of the snail Helix aspeгsa, Biochem. Ј. 194: 507- 511 202 Refereпce Howfeff, R.J., Majerus M.E.N., {7 987), The uпderstaпdiпg of iпdustrial melaпism iп the peppered moth {Bistoп betularia} {Lepidoptera: Geometridae}, Biol. Ј. Liпп. 5ос. 30:31-44 Huckova, А., Kazimirova, М., 5/ovak, М., (7 996), Heavy metal-affected chaпges iп haemolymph histamiпe coпceпtratioп iп the cabbage moth, Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae}, Biologia, Bratislava 51: 577-574 Huber, R.E., {7 975), The purificatioп апd study of а hопеу Ьее abdomiпal sucrase exhibltiпg uпusual sofubllity апd kiпetic properties, Arch. Biochem. Biophys. 168: 198-209 Huber, R.E., Mathisoп, R.D., {1 976), Physical, chemical апd eпzymetic studies оп the major svcrase of hопеу Ьее {Apis melifera}, Сап. Ј. Biochem. 54: 7 53-164 lscaп, М ., СоЬап, Т., Eke, В. С., (7 995), Differeпtial respoпse of hepatic moпooxygeпase апd glutathioпe 5-traпsferases of mice to а comblпatioп of cadmium апd пickel, Comp. Biochem. Physiol. -1 7 7 С: 6 7-68 lslam, А., Roy, 5., { 7 983 ), Effects of CdC/2 оп the quaпtitative variatioпs of carbohydrate, proteiп, amiпo acid апd chofesterol iп Chrysochoгis stolli Wolf {lпsecta: Hemiptera), Curr. 5ci. 52: 2 7 5-2 7 7 ЈасоЬsоп, К. В ., Т urner, Ј. Е., ( 7 980), The iпteractioп of cadmium апd certaiп other metal ioпs with proteiпs апd пucleic acids, Toxicology 7 6: 7-37 Ја та//, 1.5., 5mith, Ј. С., { 7 985), The effects of dietary sefeпium оп cadmium blпdiпg iп гаt kidпey апd liver, Arch. Toxicof. 56: 252-255 Јапssеп, М.Р.М., Bruiпs, А., De Vries, Т.Н., Vап 5traaleп, N.M., {7991), Comparisoп of cadmium kiпetics iп four soil arthropod species, Arch. Eпviroп. Coпtam. Т oxicof. 20: 305-3 7 2 Jiпdra, М., 5ehпal, F., {7 989), Larval growth, food coпsumptioп, апd utilizatioп of dietary ргоtеiп апd eпergy iп Galleria melloпella, Ј. lпsect Physiol. 35: 71 9- 724 Jokaпovic, М., {2001 ), Biotraпsformatioп of orgaпophosphorus compouпds, Toxicology 7 66: 7 39-160 Јопеs, B.R., Вгапсоft, H.R., {7986), Distributioп апd ргоЬаЬ/е physiological role of esterases iп гeproductive, digestive апd fat-body tissue of adu/t coffoп Ьо/1 weevil, Aпthoпomus gгaпdis, Biochem. Geпet. 24: 499-508 Јопеs, М.М., Сhегiап, M.G., {7 990), The search for chelate aпtagoпists for chroпic cadmium iпtoxicatioп, Toxicology 62: 1-25 Joosse, E.N.G, Verhoef, 5.С., (7983), Lead toleraпce iп Со//етЬо/а, Pedoblologia 25: 7 7-78 Jordao, В. Р., Terra, W.R., RiЬeiгo, A.F., Lehaпe, М .Ј., Ferreira, С., (7 996), Т rypsiп secretioп iп Musca domestica larval midguts: а blochemical апd immuпocytochemical study, lпsect Biochem. Мо/. Bio/. 26: 337-346 Jordao, В. Р., Capella, A.N., Terra, W .R., RiЬeiro, A.F., Ferreira, С., (7 999), Nature of the aпchors of тетЬrапе-Ьоипd amiпopeptidase, amylase апd trypsiп апd 203 Reference secretory mechanism in Spodoptera frugiperda {Lepidoptera} midgut celfs, Ј. lnsed Physiol. 45: 29-37 Kafef, А., Bednarska, К., Augustyniak, М. , Witas, /., Szulinska, Е., {2003), Adivity of glutathione S-transferase in Spodoptera exugia larvae exposed to cadmium and zinc in two subsequent generation, Environ. lnt. 28: 683-686 Kapin, М.А., Ahmad, S., ( 1980), Esterases in larval tissue of gypsy moth Lymantria dispar {L}: optimum assay conditions, quantification and characterization, lnsed Biochem. 10: 331-337 Kiffney, Р.М., Cfements, W.H., (1996}, Size-dependent response of macroinvertebrates to metals in experimental streams, Environ. Toxicof. Chem. 15: 1352-1356 Кirsch-Vofder, М., {1984), Mutagenicity, carcinogenicity, and teratogenicity of industrial pollutants, Pfenum, New York Kferks, P.L., Weis, J.S., (1987), Genetics adaptation to heavy metals in aquatic organisms: а review, Environ. Pollut. 45: 173-205 Korsfoot, А., van Gestef, С.А.М., van Straalen, N.M., (2004), lntroduction, Eds: Korsfoot, А., van Gestef, С.А.М., van Straalen, N .M., /n: Environmental stress and celfular response in arthropods, CRC Press, 1-1 О Kort, C.A.D., Granger, N.A., {198n Regulation of the iuvenile hormone titer, Ann. Rev. Entomof. 26: 1-28 Kotze, А С., Rose, Н.А., {1987), Gfutathione S-transferase in the Australian Ьfowffy, Lucilia cuprina (Wiedemann), Pestic. Biochem. Physiol. 29: 77-86 Kramarz, Р., Kafef, А., (2003), The respiration rate of the beet armyworm pupae (Spodoptera exigua} after multi-generation intoxication with cadmium and zinc, Environ. Ро/1. 126: 1-3 Krishna, G., Govardhan, L., Veerabhadrappa, P.S., { 1984), Tissue esterases of Exoristina sorblllans {Uzi fly), Ј. Biosci. 6: 249-255 Kristensen, T.N., Sorensen, Р., Kruhoffer, М., Pedersen, К.S., Loeschcke, V. (2005}. Genome-wide analysis оп inbreeding effects оп gene expression in Drosophila melanogaster. Genetics 171 ( 1 ): 157-167. KU/tz, D., {2005), Mofecular and evofutionary basis of the celfular stress response, Annu. Rev. Physio/. 67: 225-257 Kunitz, М., {1947}, Crystalline soyabean trypsin inhibltor-11. General properties, Ј. Gen. Physiol. 30: 291-3 1 О Laemmli, И.К., {1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Т4, Nature 227: 68Q-685 Lagadic, L., Caquet, Т., Ramade, F., {1994), The го/е of blomarkers in environmental assessment {5}. lnvertebrate populations and communities, Ecotoxicofogy 3: 193-208 Lande, R., ( 1980), The genetic covariance between characters maintained Ьу pleiotropic mutations, Genetics 94: 203-215 204 Reference Lande, R., Arnold, 5.Ј., { 1983}, The measurment of selection оп correlated characters, Evolution 37: 121 D-1226 LauriEГAh/Ьerg, С.С., {1982}, Genetic, ontogenetic and tissue specific variation of dipeptidases in Drosophila melanogaster, Biochem. Genet. 20: 407-424 Lauverjat, 5., Ballan-Dufrancais, С., Wegnez, М., {1989}, Detoxification of cadmium. Ultrastrudural study and efectron-microprobe analysis of the midgut in а cadmium-resistant strain of Drosophila melanogaster, Biol. Metals 2: 97-107 Lazarevic, Ј., Perit--Mataruga V., Lekovic, 5., Nenadovic, V., (1998}, The properties of a-amylase from the midgut of Lymantria dispar larvae, Eds: Adamovic, /n : Gypsy moth outbreaks in 5erbla, The entomological society of 5erbla, Belgrade, 95-114 Lazarevic, Ј., Peric-Mataruga, V., Vlahovic, М., Mrdakovic, М., Cvetanovic, D., {2004}, Effeds of rearing density оп larval growth and activity of digestive enzymes in Lymantria dispar L., {Lepidoptera: Lymantriidae}, Folia Biol. {Krakow} 52: 105-125 Lee, М.Ј., Anstee, Ј. Н., {1 994}, Characterization of midgut exopeptidase activity from larval 5podoptera littoralis, lnsed Biochem. Мо/. Biol. 25: 63-71 Lee, К-У., Valaitis, Р.А., Denlinger, L.D., {1 998}, Activity of gut alkaline phoshatase, proteases and esterase in relation to diapause of pharate first instar larvae of gypsy moth, Lymantria dispar, Arch. lnsect Biochem. Physio/. 37: 197-205 Lee, S.E., Уоо, D.H., 5on, Ј., Cho, К., {2006}, Proteomic evaluation of cadmium toxicity оп the midge Chironomus riparius Meigen larvae, Proteomics 6: 945- 957 Lemos, F.J.A., Terra, W.R., {1 992}, 5olublle and тетЬгапе Ьоипd forms of trypsin- like enzymes in Musca domestica larval midguts, lnsed Biochem. Мо/. Biol. 22: 613-619 Levins, R., (7 968}, Evolution in changing environments, New Jersey, Princeton Univ. Press Lindgren, В., Laurila, А., {2005}, Proximate causes of adaptive growth rates: growth efficiency variation among latitudinal populations of Rana temporaria, Ј. Evol. Biol. 18: 82D-828 Lindqvist, L., { 1992}, Accumulation of cadmium, copper and zinc in five species of phytophagous insects, Environ. Entomol. 21: 16D-163 Lindqvist, L., Block, М., {1994}, Excretion of cadmium and zinc during moulting in the grasshopper Omocestus viridulus {Orthoptera}, Environ. Toxicol. Chem. 13: 1669-1672 Lindqvist, L., Block, М., Tjolve, Н., {7 995}, DistriЬution and excretion of Cd, Hg, Methyi-Hg and Zn in the predatory beetle Pterostichus niger {Coleoptera: Carabldae}, Environ. Toxicol. Chem. 14: 1195-1201 Lingjёerde, О.С., 5tenseth, N.C., Kristoffersen, А.В., Smith, R.H., Мое, 5.Ј., Read, Ј.М., Daniels, 5., 5imkiss, К., {2001 }, Exploring the density-dependent 205 Reference structure of blowfly populations usmg non-parametric , additive modelling, Ecology 82: 2645-2658 Liu, Z. G., Kobayashi, М., Yoshitake, N., ( 7 984) Genetical studies оп the heat-stable esterase in the midgut of the silkworm, Bombyx mori L., Ј. Seri. Sci. Jpn . 53: 432-439 Lockridge, 0., La Du B.N, {7 978), Comparison of atypical and usual human serum cholinesterase, Ј. Bio/. Chem. 253: 36 7-366 Lohmann, R.D., Beyersmann, D., {7993), Cadmium and zinc mediated changes of the Ccl+-dependent endonuclease in apoptosis, Biochem. Biophys. Res. Comm. 790: 7097-7 703 Lonnerdal, В., {2000), Dietary factors influencing zinc absorption, Ј. Nutr. 7 30: 7 3785-7 3835 Loxdale, H.D., {7 983), Electrophoretic study of enzymes from cereal aphid populations. /. Electrophoretic techniques and staining system for characterising isozymes from six species of cerea/ aphids {Homoptera: Aphididae), Ви//. Entomol. Res. 73: 645-657 Lynch, С. В., Sulzbach, D.S., Connolly, M.S., {7 988), Quantitative-genetic analysis of temperature regulation in Mus domesticus. IV. Pleiotropy and genotype-by- environment interactions, Ат. Nat. 7 32: 52 7-37 Macnair, M,R., (7 997), The evolution of plants in metal-contaminated environments, Eds: Bijlsma, R. & Loeschcke, V., /n: Environmental Stress, Adaptation and Evolution, Birkhauser Verlag, Basel, СН, 3-24 Macours, N., Hens, К., {2004), Zinc-metalloproteases in insects: АСЕ and ЕСЕ, lnsect Biochem. Molec. Biol. 34: 507-570 Mainguet, А.М., Louveaux, А., Е/ Sayed, G., Rollin, Р., {2000), Abllity of а generalist insed, Shistocerca gregaria, to overcome thioglucoside defense in desert plants: tolerance ог adaptation?, Entomol. Ехр. Арр/. 94: 309-3 7 7 Malherbe, У., Kamping, А., van Delden, W., de Zande, L.,{2005), ADH enzyme activity and Adh gene expression in Drosophila melanogasterlines differentially selected for increased alcohol tolerance, Ј. Evol. Biol. 7 8: 8 7 7-8 7 9 Мапе, S.D., Tompkins, L., Richmond, R.C., {7 983), Ма/е esterase-6 catalyzes the synthesis of а sex pheromone in Drosophila melanogaster females, Science 222: 4 7 9-42 7 Marana, S.R., RiЬeiro, A.F., Terra, W.R., Ferreira, С., {7 996), Ultrastructure and secretory activity of Abracris flavolineata {Orthoptera: Acrididae) midguts, Ј. lnsed Physiol. 43:465-473 Marana, S.R., Terra, W.R., Ferreira, С., {2000), Purification and properties of а beta-glucosidase purified from midgut cells of Spodoptera frugiperda {Lepidoptera} larvae, lnsect Biochem. Мо/. Biol. 30: 7 7 39-7 7 46 206 Reference Marana, S.R., Jacobs-Lorena, М., Terra, W.R., Ferreira, С., (2001 ), Amino acid residues invofved in substrate specificity of the Spodoptera frugiperda rз- glucosidase, Eur. Ј. Biochem. 269: 3705-3714 , Marczyk, G., Migula, Р., Trzcionka, Е., ( 1993), Physiological response of spiders to environmental pollutionin the Silesian region {Southern Poland), Sci. Total. Environ. {Suppf.): 1 З 15-1322 Marigomez, /., {200 1 ), Assesment of the marine environment health based оп monitoring networks: а theoretical exampfe - the Basque Country, SETAC Europe 11"' Annual Meeting, Madrid Maroni, G., Wise, Ј., Young, Ј. Е., Otto, Е., ( 1987), Metallothionein gene duplication and metal tolerance in natural populations of Drosophila melanogaster, Genetics 117: 739-7 44 Maroni, G., {1 990), Animal metallothioneins, Eds: Shaw, А.Ј., /n: Heavy-Metal Toferance in Plants: Evofutionary Aspects, CRC Press, Fforida, U.S.A., 216- 229 Martoja, R., Bouquegneau, Ј.М., Verthe, С., {1 983), Toxicological effect and storage of cadmium and mercury in an insed Locusta migratoria, Ј. lnvert. Pathof. 42: 17-32 Maryanski, М., Kramarz, Р., Laskowski, R., Niklinska, М., (2002), Decreased energetic reserves, morphological changes and accumulation of metals in carabld beetfe (Poecilus cupreus L.) exposed to zin~ ог cadmium- contaminated food, Ecotoxicofogy 11: 127-139 Masson, A.Z., Simkiss, К., (1982), Sites of mineral deposition in metal accumulating celfs, Ехр . Се// Res. 139: 383-391 Matthewson, М. D., Baker, J.A.F., ( 1975), Arsenic resistance in species of multi-host ticks in the RepuЬ/ic of South Africa and Swaziland, Ј. S. Afr. Vet. Assoc. 46: 341-344 Mattiacci, L., Dicke, М., Posthumus, М.А., ( 1995), fЗ-g/ucosidase: an eficitor of herblvore-induced plant odor that attracts host-searching parasitic wasps, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 2036-2040 McCarthy, J.F., Shugart, L.R., (1990), Biomarkers of Environmental Contamination, Lewis РиЬ!., Воса Raton, FL, Lewis PuЬ!ishers Michailova, Р. , Petrova, N., Ramella, L., Sella, G., Bovero, S., (7 998), Structural and functional alterations of chromosome G of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae} from а polfuted Piedmont station, Environ. Polfut. 103: 127- 134 Migula, Р., Nuorteva, 5-L., Nuorteva, Р:, Gfowacka, Е., Оја, А., (1993), Physiological disturbances in ants (Formica aquilonia) to excess of cadmium and тегсчгу in а Finnish forest, Sci. Tot. Environ. Suppl. 2: 1305-1314 207 Refereпce Migula, Р. , Glowacka, Е., (1 996}, Heavy тeta/s as stressiпg factors iп the red wood aпts (Forтica polydeпa} froт iпdustrially polluted forests, Freseпius Ј. Апа/. Сhет. 354:653-659 Migula Р., {1 997), Molecular апd physiological bloтarkers iп iпsects as the tools iп eпviroптeпtal hazard assessтeпt, Acta Physiol. Епtото/. Нип. 32: 231-243 Migula, Р., Glowacka, Е., Nuorteva, 5-L., Nuorteva, Р., Tulisalo, Е., (7997), Тiте related effects of iпtoxicatioп with cadтiuт апd тercury iп red wood апt, Ecotoxicology 6: 307-320 Miltoп, Е.Ј., Silva, С.Р., Saтuels, R.l., (2004}, Digestive епzутеs of leaf-cuttiпg aпts, Асrотуrтех subterraпeus (Нутепорtеrа: Forтicidae: Attiпi}: distriЬutioп iп the gut of adu/t workers апd partial characterizatioп, Ј. lпsect Physio/. 50: 887-891 Мое, S.J., Steпseth, N. С., Sтith, R.H., (200 7 }, Effects of а toxicaпts оп populatioп growth rates: suЬiethal апd delayed respoпses iп Ьlowfly populatioпs, Fuпct. Ecol. 7 5: 712-72 7 Моrап, N.A., ( 7 992), The evolutioпary таiпtепапсе of alternative pheпotypes, Ат. Nat. 7 39: 971-989 Mrdakovic, М., Lazarevic, Ј., Perit-:-Mataruga, V., 1/ijiп, L., Vlahovic, М., (2008), Partial characterizatioп of а lipase froт gypsy тoth (Lyтaпtria dispar L.) larval тidgut, Folia 8iol. {Krakow} 56: 7 03-1 7 О Muhlia-Aiтazaп, А., Garcia-Carreпo, F.L., (2002), lпflueпce of тoltiпg апd starvatioп оп the syпthesis of proteolytic епzутеs iп the тidgut of the white shriтp Peпaeus vаппатеi, Сотр. 8iocheт. Physiol. 7 338: 383-394 Mukherjee, 5., Mukherjee, 5., 8hattacharyya, Р., Duttagupta, А.К., (2004), Heavy тetal levels апd esterase cvariatioпs betweeп тetal-exposed апd uпexposed duckweed Lетпа тiпоr: field апd laboratory studies, Eпviroп. lпt. 30: 81 1- 814 Murdock, L.L., 8rookhart, G., Dипп, Р.Е., Foard, D.E., Kelley, 5., Кitch, L., Shade, R.E., Shukle, R.H., Wolfsoп, J.L., (7 987), Cysteiпe digestive proteiпases iп Coleoptera, Сотр. 8iocheт. Physio/. 878: 783-787 NAS/NRC {Natioпal Асаdету of Scieпce/ Natioпal Research Couпcil), (1 989), 8iologic Markers iп Reproductive Toxicology, Natioпal Асаdету Press, Washiпgtoп, DC Nascarella, М.А., Stoffolaпo, J.G.Jr., Staпek 111, Е.Ј., Kostecki, Р. Т., Calabrese, Е.Ј., {2003), Horтesis апd stage specific toxicity iпduced Ьу cadтiuт iп ап iпsed тodel, the queeп Ьlowfly, Phorтia regiпa Meig., Eпviroп. Pollut. 7 24: 257- 262 Nevo, Е., Pearl, Т., 8eiles, А., Wool, D., ( 7 98 7 }. Mercury selectioп of alozyтe geпotypes iп shriтps, Experiтeпtia 37: 7 7 52-1 7 54 Nijhout, H.F., (7 994), lпsed horтoпes, Priпcetoп Uпiversity Press, Priпcetoп Nishi, У., (1 996}, Ziпc апd growth, Ј. Ат. Со/Ј. Nutr. 7 5: 340-344 208 Refereпce Nordberg, G.F., Kiellstrom Т. , Nordberg М., ( 7 985), Кiпetics апd metaЬolism . Eds: FriЬerg, L., Eliпder, C.G., Kiellstroщ Т. , Nordberg, G.F., Јп : Cadmium апd health: А toxicological апd epidemiological appraisal. Vol. /. Exposure, dose, апd metabolism. Воса Ratoп, FL: CRC Press, 7 03-7 78 NRC (Natioпal Research Couпcil), (7 987), Commiffee оп Biological Markers, Eпviroп. Health Persped. 7 4: 3-9 Nummeliп, М., Lodeпius, М., Tulisalo, Е., (7 998), Waterstriders (Gerridae: Heteroptera} as iпdicators of heavy metal pollutioп, Eпtomol. Fепп . 8: 7 85- 797 Nummeliп, М., Lodeпius, М., Tulisalo, Е., Нiгvопеп, Н., Alaпko, Т., (2007), Predatory iпseds as bloiпdicators of heavy metal pollutioп, Eпviroп. Poflut. 7 45: 339- 347 Nuorteva, Р., Nuorteva, 5.-L., Mathur, В., (7 992}, Excretory iпhibltioп of Ьioaccumulatioп iп Lepidoptera, Eds: Bohac, Ј. & Ruzicka, V., Јп: Bioiпdicatores Betriorisatioпis Regioпis, Ceske Budeiovice, 362-367 Nursita, А./., (2004}, SuperSoil 2004: 3гdAustraliaп New Zelaпd Soils Сопfегепсе, Uпiversity of Sidпey, Australia Ode/1, Т.М., Ве//, R.A., Mastro, V.C., Таппег, Ј.А., Кеппеdу, J.F., (7 984), Productioп of the gypsy moth, Lymaпtria dispar, for research апd blological coпtrol. Eds. Kiпg, Е. G. & Leppla, N. С., Јп: Advaпced апd Challeпges iп lпsect Reariпg, USDA-ARS, New Orleaпs, LA, 7 56-166 Odeпdaal, Ј. Р., Reiпecke, А.Ј., (7 999), Short-term toxicological effects of cadmium оп the woodlouse, Porceflio laevis {Crustacea, lsopoda}, Ecotoxicol. Eпviroп. Saf. 43: 3Q-34 Ohta, Н., Cheriaп, M.G., (7 995}, The iпflueпce of пutritioпal deficieпces оп gastroiпtestiпal uptake of cadmium апd cadmium-metallothioпeiп iп rats, Т oxicology 97: 77-80 Ohta, Н., Nakakita, М., Тапаkа, Н., Seki, У., Yoshikawa, Н., (7 997), Jпductioп of metallotioпeiп-/ike cadmium-blпdiпg proteiп iп the testis Ьу oral cadmium admiпistratioп iп rats, lпd. Health 35: 96-7 03 01/а, B.L., Pearsoп, W.H., Studholme, A.L., (7 980), Applicabllity of behavioral measures iп eпviroпmeпtal assessmeпt, Rapp. Reuп. Сопs. lпt. Explor. Mer. 779: 162-773 0/sоп, М. О. , (2004) Seпsiпg cellular stress: aпother пеw fuпdioп for пucleolus? Sci. STKE 224: ре 7 О Ortel, Ј., Vogel, W .R., (7989), Effeds of lead апd cadmium оп охуgеп coпsumptioп апd life ехресtапсу of the pupal parasitoid, Pimpla turioпellae, Eпtomol. Ехр. Appl. 52: 83-88 Ortel, Ј., ( 7 99 7 ), Effects of lead апd cadmium оп chemical compositioп апd total water сопtепt of the pupal parasitoid, Pimpla turioпellae, Eпtomol. Ехр. Appl. 59:93-700 209 Refereпce Ortel, Ј., {1 995а}, Chaпges iп proteiп сопtепt апd free amiпo acid compositioп iп metalo-coпtamiпated gypsy moth larvae {Lymaпtria dispar L., Lymaпtriidae, Lepidoptera}, Comp. Biochem. Physio/. 7 7 2С: 29 7-298 Ortel, Ј., ( 7 995Ь), Effects of metals оп the total lipid сопtепt iп the gypsy moth {Lymaпtria dispar L., Lymaпtriidae, Lepid.) апd its hemolymph, Ви//. Eпviroп. Сопtат. Toxicol. 55:276-227 Ortel, Ј. ( 7 996}, Metal-supplemeпted diets alter carbohydrate levels hemolymph of gypsy moth larvae (Lymaпtria dispar, Lepidoptera}, Eпviroп. Toxicol. Chem. 15: 7 777-7 776 iп tissue апd Lymaпtri idae, Oudmaп, L., Deldeп, W. V., Kampiпg, А., Biljsma, R., {1 994), Starvatioп resistaпce iп Drosophila melaпogaster iп relatioпship to the polymorphisms at the Adh апd alpha-Gdph loci, Ј. lпsect Physiol. 40: 709-77 З Palmiter, R.D., (7 994), Regulatioп of metallothioпeiп geпes Ьу heavy metals appears to Ье mediated Ьу а ziпc-seпsitive iпhibltor that iпteracts with а coпstitutively active traпscriptioп factor, MTF-7, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 7: 7 2 7 9- 7223 Papathaпassiou, Е., 7 983. Effects of cadmium апd mercury ioпs оп respiratioп апd survival of the соттоп prawп Palaemoп serratus (Реппапt). Rev. lпt. Oceaпogr. Med. 72, 2 7-35 Parker, P.J.A.N., Cal/aghaп, А., ( 7 997), The effect of low level of orgпophosphate exposure оп esterase activity апd а/Је/е frequeпcy iп field populatioпs of Simulium equiпum {Diptera: Simulidae}, Eпviroп. Toxcol. Chem. 7 6: 255~ 2555 Peaka/1, D., ( 7 992), Aпimal Biomarkers as Pollutioп lпdicators, Chapmaп&Hi/1, Lопdоп Ресsепуе, К., Lefkovitch, L.P., Giles, В.Е., Saura, А, {1 996}, Differeпces iп eпviroпmeпtal temperature, ethaпol апd sucrose associated with eпzyme activity апd weight chaпges iп Drosophila melaпogaster, lпsect Biochem. Мо/. Biol: 26: 7 35-7 45 Peel, D.J., Milпer, М .Ј., { 7 992), The respoпse of Drosophila imagiпal disc се// liпes to ecdysteroids, Roux's Arch. Dev. Biol. 202: 23-35 Pemac, D., Tucic, В., (7 998), Reactioп пorms of jweпile traits to light iпteпsity iп lris pumila {lridaceae}: а comparisoп of populatioпs from exposed апd shaded habltats, Р/. Syst. Evol. 209: 7 59- i 7 6 Perit-Mataruga, V., Blagojevic, D., Spasic, М.В., lvaпovic, Ј., Jaпkovit-Hiadпi, М., { 7 997), Effect of the host plaпt оп the aпtioxidative defeпce iп the midgut Lymaпtria dispar L., caterpillars of differeпt populatioп origiпs, Ј. lпsed Physiol. 43: 707-706 Peteriпg, H.G., Choudhury, Н., Stemmer, К.L., {7 979), Some effects of oral iпgestioп of cadmium оп ziпc, copper апd iroп metabolism, Eпviroп . Health Perspect. 28: 97-706 210 Reference Planelfo, R., Martinez-Guitarte, J.L., Morcillo, G., (2006}, RiЬosomal genes as early target of cadmium-induced toxicity in Chironomus riparius larvae, Sci. Tot. Environ. 373: 7 73-721 Posthuma, L., ( 7 990}, Genetic differentiation between populations of Orcheselfa cincta {Colfembola} from heavy metal contaminated sites1 Ј. Арр/. Ecof. 27: 609-622 Posthuma, L., (7 992}, Genetic ecology of metal tolerance in Colfembola, Ph.D. thesis, Vrije University, Amsterdam, the Netherlands Posthuma, L., Hogervorst, R.F., Van Straalen, N.M., ( 7 992}, Adaptation to soi/ pollution Ьу cadmium excretion in natural populations of Orchesella cincta (L.} (Collembola}, Arch. Environ . Contam. Toxicof. 22: 146-156 Posthuma, L., -Van Straalen, N.M., ( 7 993}, Heavy metal adaptation in terrestrial invertebrates: А review of occurence, genetics, physiology and ecological consequences, Comp. Biochem. Physiol. 7 06С: 7 7-38 Posthuma, L., Verweij, R.A., Widianarko, В., Zonneveld, С., (7 993}, Life-history pafferns in metal-adapted Colfembola, Oikos 67: 235-249 Postma, J.F., Van Nugteren, Р., Buckert- de Jong, М. В. ( 7 996}, lncreased cadmium excretion in metal-adapted populations of the midge Chironomus riparius (Diptera}, Environ. Toxicof. Chem. 7 5: 332-339 Prabhakaran, S.К. and S. Т. Kamble, (7 995}, Purification and characterization of an esterase isozyme from insecticide resistant and susceptible strains of German cockroach, Blattella germanica (L.}, lnsect Biochem. Мо/. Biol. 25: 579-524 Prasad, R., Kaur, D., Kumar, V., (7 996} Kinetic characterization of zinc blnding to brush Ьorder membranes from rat kidney cortex: interaction with cadmium, Biochim. Biophys. Acta 7 284: 69-78 Pruett, Ј.Н., Guerrero, F.D., Hernandez, R., (2002}, lsolation and identification of an esterase from а Mexican strain of Boophilus microplus (Acari: lxodidae}, Ј. Econ. Entomol. 95(5}: 7007-7007 Ranson, Н., Rossiter, L., Ortel/i, F., Jensen, В., Wang, Х., Roth, С. W., Collins, F.H., Hemingway, Ј., {2001 }, ldentification of а novel class of insed glutathione 5- transferases involved in resistnce to DDT in the malaria vector Anophefes gamblae, Biochem. Ј. 359: 259-304 Ranson, Н., Claudianos, С., Ortelli, F., AЬgra/1, С., Hemingway, Ј., Sharakhova, М. V., Unger, M.F., Col/ins, F.H., Feyereisen, R., {2002}, Evolution of supergene families associated with insecticide resistance, Science 298: 7 79- 781 Rantala, М.Ј., Roff, D.A., {2005}, An analysis of trade-off in immune fundion, body size and development time in Mediterranean field cricket, Gry/lus blmaculatus, Funct. Ecol. 7 9: 323-330 Rathore, R.S., Sanghui, Р.К., Swarup, Н., (7979}, Toxicity of cadmium chloride and lead nitrate to Chironomus tetans larvae, Environ . Polfut. 7 8: 7 73-177 211 Reference Rayms-Kelfer, А., 0/son, К.Е., McGaw, М., Oray, С., Carlson, Ј.О., Beaty, В.Ј. , {1998), Effects of heavy metals оп Aedes aegypti {Diptera: Culicidae} larvae, Ecotoxicol. Environ. 5af. 39: 41-47 Reiss, R.A., James, А.А., (1993), А glutathione 5-transferase gene of the vector mosquito, Aпopheles gamblae, lnsect. Мо/. Biol. 2: 25-33 Relexans, Ј. С., Lerat, L., Etcheber, Н. (1988). Une strategic d' etude des effets de quelques poiluaпts (Cd, Zп, ВаР} sur /а respiratioп de commuпautes beпthiques maiпteпues iп vitro. Oceaпis, Paris 14: 41 1-21 Relyea, R.A., {2005}, Тhе heritabllity of iпduciЬ/e defeпces iп tadpoles, Ј. Evol. Bio/. 18:856-866 Ricklefs, R.E., (1991 ), 5tructures апd traпsformatioпs of life histories, Fuпct. Ecol. 5: 174-183 Ri/ey, Р.А., { 1997), Меlапiп, lпt. Ј. Biochem. Се//. Biol. 29: 1235-1239 Roelofs, D., Маriёп, Ј., Vап 5traaleп, N.M., {2007), Differeпtial gепе expression profiles associated with heavy metal toleraпce iп the soil iпsect Orchesella cinda, lпsed Biochem. Мо/. Biol. 37: 287-295 Roelofs, D., Aarts, M.G.M., 5chat, Н., Vап 5traaleп, N.M., {2008), Fuпctional ecological geпomics to demoпstrate geпeral апd specific respoпses to ablotic stress, Fuпct. Ecol. 22: 8-18 Roesijadi, G., ( 1992), Metallothioпeiпs in metal regulatioп апd toxicity iп aquatic aпimals, Aquat. Toxicol. 22: 81-114 Roesijadi, G., Uпger, М.Е., (1993), Cadmium uptake iп gills of mollusc Crassostrea virgiпica апd iпhibltioп Ьу calcium сhаппе/ Ьlockers, Aquat. Toxicol. 24: 195- 206 5aliпas, А.Е., Wопњ M.G., (1999), Glutathioпe 5-traпsferases-A review, Curr. Med. Chem. 6: 279-309 5amaiп, J.F., Moal, Ј., Coum, А, Le Coz, J.R., Daniel, Ј. У., {1980), Effects of the 11Amoco Cadiz" oil spi/1 оп zooplankton: а пеw possibl/ity of ecophysio/ogical survey, Helgolonder wiss . Meeresuпters 33: 225-235 5antos, C.D., RiЬeiro, A.F., Terra, W.R., {1986}, Differeпtial ceпtrifugatioп, calcium precipitatioп апd ultrasoпic di~ruptioп of midgut cells of Eriппyis ello caterpillars. Purificatioп of се// microvilli апd iпfereпces coпcerniпg secretory mechaпism . Сап. Ј. Zool. 64: 49D-500 5atyavathi, С., Prabhakara Rao, У., (2000), lпhibltioп of Na+, К+ -ATPase iп Peпaeus iпdicus postlarvae Ьу lead, Comp. Biochem. Physiol. 127 С: 11-22 5cheiпer, 5.М., Goodпight, С.Ј., { 1984), The comparisoп of pheпotypic plasticity and geпetic variatioп iп populatioпs of the grass Daпthoпia spicata, Evolutioп 38: 845-855 5cheiпer, 5.М., Lymaп, R.F., {1989), The geпetics of pheпotypic plasticity. /. Heritabllity, Ј. Evol. Biol. 2: 95-1 07 212 Refereпce Scheiпer, S.M., Сарlап, R.L., Lymaп, R.F., {1991), The geпetics of pheпotypic plasticity , 111. Geпetics correlatioпs апd ffuctuatiпg asymmetries, Ј. Evof. Biol. 4:51-68 Scheiпer, S.M., ( 1993), Geпetics апd evolutioп of pheпotypic plasticity, Аппи. Rev. Ecof. Syst. 24: 35-68 Schlueter, М.А., Guttmaп, S.l., Oris, Ј. Т., Bailer, А.Ј., {1997), Differeпtial survival of fathed miппows, Pimephales promelas, as affected Ьу copper exposure, prior populatioп stress, апd allozyme geпotypes, Eпviroп. Toxicof. Chem. 16: 939- 947 Schmidt, G.H., Њrahim, N.M.M., Abdallah, M.D., { 1992), Loпg-term effects of heavy metals iп food оп devefopmeпtal stages of Aiolopus thalassiпus {Saltatoria: Acrididae}, Arch. Eпviroп. Сопtат. Toxicof. 23: 375-382 Schmidt, G.H., Њrahim, N.M.M., ( 1994), Heavy metal сопtепt (Hg+2, Ccf2, РЬ+2) iп various body parts: its impact оп choliпesterase activity апd Ьiпdiпg g/ycoproteiпs iп the grasshopper Aiolopus thalassiпus adufts, Ecotox. Eпviroп. Safe. 29: 148-164 Schufz-Baldes, М., (1989), The sea-skater HaloЬates micaпs: ап ореп осеап bloiпdicator for cadmium distriЬutioп iп Atlaпtic surface waters, Маг. Biol. 102:211-215 Schumaker, Т. T.S., Cristofofetti, Р. Т., Terra, W.R., { 1993), Properties апd compartmeпtalizatioп of digestive carЬohydrases апd proteases iп Scaptotrigoпa Ьipuпctata {Apidae: Melipoпiпae} larvae, Apidologie 24: З -17 Sgro, С.М., Hoffmaпп, А.А., (2004), Geпetic correlatioпs, tradeoffs апd eпviroпmeпtal variatioп, Heredity 93: 241-248 Shiп, В.-5., Choi, R.N., Lee, C.-U., {200n Effed of cadmium оп totallipid сопtепt апd fatty acids of the great wax moth, Gafferia meffoпeffa, Коrеап Ј. Ecof. 24: 349-352 SiЬ/y, R.M., Ca/ow, Р. { 1989), А /ife-cycle theory of respoпses to stress, Biol. Ј. Liпп. Soc. 37: 101-116 Sidhu, М., Prasad, R., Gilf, K.D., Nath, R., { 1997), Afteratioпs iп isoforms of glutathioпe 5-traпsferase iп liver апd kidпey of cadmium exposed rhesus moпkeys: purificatioп апd kiпetic characterizatioп, Мо/. Ceff Biochem. 166: 55-63 Sildaпchaпdra, W., Сrапе, М., {2000), lпflueпce of sexual dimorphism iп Chiroпomus riparius Meigeп оп toxic effects of cadmium, Eпviroп. Toxicof. Chem. 19:2309-2313 Silva, С. Р., Terra, W.R., { 1995}, Ап a-glucosidase from the perimicrovillar membraпes of Dysdercus peruviaпus (Hemiptera) midgut ceffs. Purificatioпs апd properties, lпsect. Biochem. Мо/. Biol. 25: 487-494 Simkiss, К., Daпiels, S., Smith, R.H., { 1993), effects of populatioп deпsity апd cdmium toxicity оп growth апd survival of Ьlowflies, Eпviroп. Poffut. 81: 41-45 213 Reference 5nyder, М.Ј., Waldiпg, Ј.К., Feyereiseп, R., {1995}, Glutathioпe 5-traпsferases from larval Мапdиса sexta midgut: sequeпse of fwo cDNAs апd eпzyme iпductioп, lпsed Biochem. Мо/. Biol. 25: 455-465 5obkowiak, R., Rymer, К., Rucmska, R., Deckert, Ј., {2004), Cadmium-iпduced chaпges iп aпtioxidaпt eпzymes iп suspeпsioп cufture of sоуЬеап cells, Acta Biochim. Pol. 51: 219-222 5ohi, 5.5., Palli, 5.R., Cook, В.Ј., Retnakaraп, А., {1995}, Forest iпsect се/1 liпes respoпsive to 2Q-hydroxyecdysoпe and fwo пoпsteroidal ecdysoпe agoпists, RH-5849 апd RH-5992, Ј. lпsect Physiol. 41: 457-464 5okal, R.R., Rohlf, F.J., { 1981 }, Biometry, Freemaп, 5ап Fraпcisco 5шепsеп, J.G., Norry, F.M., 5саппарiесо, А С., Loeschcke, V., {2005), Altitudiпal variatioп for stress resistaпce traits апd thermal adaptatioп iп adult Drosophila buzzatii from New World, Ј. Evof. Biol. 18: 829-837 5teпerseп, Ј., Kobro, 5., Bjerke, М., Areпd, И. , {1987), Glutathione 5-traпsferase iп aquatic апd terrestrial aпimals from пiпе phyla, Comp. Biochem. Physiol. 86С: 73-82 5teyermark, А. С., Miameп, A.G., Feghahati, Н.5., Lewпo, А W., {2005), Physiological апd morphological correlates of amoпg-iпdividual variatioп in staпdard metabolic rate iп the leopard frog Rапа pipieпs, Ј. Ехр. Biol. 208: 1201-1208 5tohs, 5.Ј., Bagchi, D., { 1995}, Oxidative mechaпisms iп the toxicity of metal ioпs, Free Rad. Bio/. Med. 18: 321-336 5ип, Z., {2005}, Eпzymical апd cytological respoпse of earthworms uпder iпducement of heavy metals, Ceпter for scieпces апd techпology developmeпt, Miпistry for educatioп, P.R. Chiпa 5uzuki К. Т., Aoki, У., Nishikawa, М., Masui, Н., Matsubara, F. ( 1984), Effed of cadmium-feediпg оп tissue coпceпtratioпs of efemeпts iп germ-free silkworm {Bombyx mori) larvae апd distriЬutioп of cadmium iп the alimeпtary сапа/, Comp. Biochem. Physiol. 79С: 249-253 5yverseп, T.L.M., { 1981 ), Effects of methylmercury оп proteiп syпthesisiп vitro, Acta Pharmacol. Toxicol. 49:422-426 Tacnet, F., Watkiпs, D. W., Ripoche, Р., { 7 990), 5tudies of ziпc traпsport iпto brush- Ьorder тетЬгапе vesicles isolated from pig sma/1 iпtestiпe, Biochim. Biophys. Acta 1 024: 323-330. Таспеt, F., Watkiпs, D. W., Ripoche, Р., {1991), Ziпc Ьiпdiпg iп iпtestiпal brush- Ьorder тетЬгапе isolated from pig, Biochim. Biophys. Acta 1063: 51-59 Taпimura, Т., Кitamura, К., Fukuda, Т., Kikuchi, Т., {1 979), Purificatioп апd partial characterizatioп of three forms of a-glucosidase from the fruit flu (Drosophila melaпogaster}, Ј. Biochem. 85: 123- 130 214 Reference ТаиЬег, С.А., ТаиЬег, М.Ј., {1992), Phenotypic plasticity in Chrysoperla: genetic variation in the sensory mechanism and correlation reproductive traits, Evolution 46: 1754-1773 Tavares, M.G., Ceron, C.R., Azeredo-0/iveira, М. Т. V., {1998), Tissue-specific expression of esterases in Triatoma infestans (Triatominae, Heteroptera}, Genet. Мо/. Biol. 21: 461-464 Taylor, М., 5imkiss, К., Greaves, G.N., {1986}, Amorphous strudure of intracelfular mineral granules, Biochem. 5ос. Trans. 14: 549-552 Templeton, A.R., {1995}, Biodiversity at the molecular fevef: experiences from disparate macroorganisms, Ed: Hawksworth, D.L., /n: Biodiversity: Measurment and Estimation, Chapmanand На//, New York, 59-64 Terra, W.R., {1990), Evofution of digestive systems of inseds, Ann. Rev. Entomof. 35: 181-200 Terra, W.R., Ferreira, С., (1994), lnsect digestive enzymes: properties, compartmentalization and function, Comp. Biochem. Physiol. 1098: 1-62 Terra, W.R., Ferreira, С., Jordao, В.Р., Dillon, R.J., (1996}, Digestive enzymes, Eds: Lehane, М.Ј. & Billingsley, P.F., /n: Biology of insed midgut, Chapmn & На//, 153-186, Terra, W.R., (2001), The origin and functions of the insed peritrophic тетЬгапе and peritrophic gel, Arch. lnsect Biochem. Physiol. 47: 47-61 Their, R., Bonacker, D., 5toiЬer, Т., Bohm, К.Ј., Wang, М., Unger, Е., Boft, Н.М., Degen, G., (2003), lnteractions of metal salts with cytoskefetal motor protein systems, Toxicof. Lett. 14Q-141: 75-81 ТоЬа, G., Aigaki, Т., {2000), Disruption of the microsomal glutathione 5-transferase- /ike gene reduces life span of Drosophila melanogaster, Gene 253: 179-187 Toung, У.-Р.5., Hsieh, Т., Ти, C.-P.D., {1993), The glutathione 5-transferase D genes: а divergentfy organized, intronless gene fami/y in Drosophila melanogaster, Ј. Biol. Chem. 268: 9737-9746 Tucic, N., Milosevic, М., Gliksman, /., Milanovic, D., Aleksic, 1., (7991), The effects of larval density оп genetic variation and covariation among life-history traits in the Ьean-weevil (Acanthoscelides obtectus 5ау}, Fund. Ecof. 5: 525-534 Turunen, 5., Chippendale, G.M., (1977), Ventricular esterases: comparison of their distriЬution within the larval midgut of four species of Lepidoptera: Ann. Ent. Soc. Ат. 70: 146-149 Uma-Devi, V., Prabhakara-Rao, У., 1989. Heavy metal toxicity to fiddfer crabs, Иса annulipes {Latreille) and Иса triangularis (Milne Edwards): respiration оп exposure to copper, mercury, cadmium and zinc. Ви//. Environ. Contam. Т oxicof. 43, 165-172. Valaitis, А.Р. , {1995), Gypsy moth midgut proteinases: purificaation and characterization of luminal trypsin, elastase and brush border тетЬгапе feucine aminopeptidase, lnsect Biochem. Mofec. Biol. 25: 139-149 215 Refereпce Valle, B.L., И/ тег, D.D., ( 1972), Biochemical effects of mercиry, cadmiиm, апd lead, Аппи. Rev. Biochem. 41 : 91-128 Valles, 5.М., 5troпg, С. А, {2oon А microsomal esterase iпvolved iп cypermethriп resistaпce iп the germaп cockroach, Blattella germaпica, Pestic. Biochem. Physiol. 71: 56-67 Vап Capelleveeп, Н.Е., Vап 5traaleп, N.M., Vап Der Berg, М., Vап Wachem, Е., (7 986}, Avoidaпce as а mechaпism of toferaпce for lead iп terrestrial arthropods, Ed: Vefdthиis, Н. W.H., Јп: Proceediпgs of the third Еиrореап Coпgress of Eпtomology, Amsterdam, 251-254 Vап Ooik, Т., Raпtala, М. Ј., 5aloпiemi, /., {2007), Diet-mediated effects of heavy metal pollиtioп оп growth апd iттипе respoпse iп the geometгid moth Epirrita аиtитпаtа, Епviгоп. Polfиt. 145: 348-354 Vап 5traaleп, N.M., 5сhоЬЬеп, Ј.Н.М., De Goede, R.G.M., (7989), Popиlatioп сопsеqиепсеs of cadmiиm toxicity iп soil microarthropods, Ecotoxicol. Eпviroп. 5af 17: 19Q-204 Vап 5traaleп, N.M., Doпker, М. Н., {1 994), Heavy metal adaptatioп iп terrestrial arthropods - Physiologicaf апd geпetic aspects, Eds: 5ommeijer, М.Ј. & Vап der Blom, Ј., Јп: Proceediпgs of the 5ectioп Experimeпtal апd App/ied Eпtomology of the Netheгlaпds Eпtomological 5ociety (N. Е. V.), Netheгlaпds Eпtomological 5ociety, Amsteгdaщ 3-17 Via, 5., Laпde, R., { 1985}, Geпotype-eпviroпmeпt iпteractioп апd the evofиtioп of pheпotypic plasticity, Evofиtioп 39: 505-522 Via, 5., Laпde, R., { 1987), Evofиtioп of geпetic variabllity iп а spatially heterogeпeoиs eпviroпmeпt: effects of geпotype-eпviroпmeпt iпteractioп, Geпet. Res. 49: 147-156 Via, 5., Gomиlkiewicz, R., de Јопg, G, 5cheiпer, 5.М., 5chlichtiпg, C.D., Vап Тiепdегеп, Р. Н., {1 995}, Adaptive pheпotypic plasticity: сопsепsиs апd coпtroversy, Treпds Е со/. Evof. 1 0: 212-217 Viareпgo, А., {1989), Heavy metal iп mariпe iпvertebrates: mechaпisms of regиlatioп апd toxicity at се//и/аг fevel, Rev. Aqиat. 5ci. 1: 259-317 Vlahovic, М., (2003), Uticaj kadmijиma па aktivпost fosfataza и sredпjem crevи larvi gиЬага Lymaпtria dispar, Magistarski rad, Bioloski fakиftet, Uпiverzitet и Beogradи Vlahovic, М., Lazarevic, Ј., Perit-Matarиga, V., 1/ijiп, L., Mrdakovic, М., (2008), Plastic respoпse of larval mass апd alkaliпe phosphatase to cadmiиm iп the gypsy moth larvde, Ecotoxicof. Eпviroп. 5af., doi:10. 1016/j.ecoenv.2008.03.012 Voefker, R.A., Laпgley, С.Н., (1978), Dipeptidase А: а polymorphic focиs iп Drosophila melaпogaster, Geпetica 49: 233-236 Vиtиkиrи, 5.5., 5ита, Ch., Radha Madhavi, К., Juveria, Ј., 5mitha Раиlеепа, Ј., Veпkateswara Rao, Ј. 1 Апјапеуиfи, У., {2005}, 5tиdies оп the devefopmeпt of 216 Reference potential bloтarkers for rapid assessтent of copper toxicity to freshwater fish using Esoтus danricus as тodef, /nt. Ј. Environ. Res. Public Health 2: 63-73 Waalkes, M.P.i Rehт, 5., Riggs, С. W., Bare, R.M., Devor, D.E., Poirier, L.A., Wenk, M.L., (1989), Cadтiuт carcinogenesis in та/е Wistar [Cr/:(Wf}BR] rats: dose- response analysis of effects of zinc оп tuтor indudion in the prostate, in the testes, and at the injection site, Cancer Res. 49: 4282-4288 Waisberg, М., Joseph, Р., На/е, В ., Beyersтann, D., {2003), Mofecular and cellular тechanisтs of cadтiuт carcinogenesis, Toxicology 192: 95-117 Walker, С. Н., Oesch F., ( 1983), Enzyтes in sefective toxicity, Eds: Jakoby, W . & Ca/dwe/1, Ј., /n: Biological Basis of Detoxication, London: Acadeтic Press, 349-386 Wang, L., Clark, A.G., (1995}, Physiological genetics of the response to а high sucrose diet Ьу Drosophi/a тelanogaster, Biocheт. Genet. 33: 149-164 Warchalowska-Silwa, Е., Maryanska-Nadachowska, А., {1991 ), Chroтosoтe aberrations in а natural population of Tetrix tenuicornis {Sah/Ь.) {Tetrigidae: Orthoptera}, Folia Biol. (Krakow} 39: 5-15 Warchalowska-Silwa, Е., Niklinska, М., Gorlich, А., Michailova, Р., Pyza, Е., (2005) Heavy тetal accuтulation, heat shock protein expression and cytogenetic changes in Tetrix tenuicornis {L.) {Tetrigidae, Orthoptera} fгот polluted areas, Environ. Pollut. 133: 373-381 West-Eberhard, М.Ј., (2003), Developтental plasticity and evolution, Oxford University Press, New York White, Т.С.R., (1993}, The inadequate environтent: nitrogen and the abundance of of aniтals, Springer-Verlag, Berlin WHO, ( 1992а}, Environтental Health Criteria 134: Cadтiuт. World Health Organization, Geneva WHO, ( 1992Ь}, Environтental Heafth Criteria 135: Cadтium-Environтental Aspects. World Health Organization, Geneva Wijffefs, G., Fitzgerald, С., Gough, Ј., Riding, G., Elvin, С., Кетр, D., Willadsen, Р. , (1996}, Cfoning and characterization of angiotensin-converting enzyтefroт the dipteran species, Haeтatobla irritans exigua, and its expressionin the тaturing та/е reproductive systeт, Europ. Ј. Biocheт. 237: 414-423 Wilczek, G., Migula, Р., { 1996}, Metal Ьоdу burdens and detoxi{ying enzymes in spiders froт industrially polluted areas, Fresenius Ј., Anal. Сhет. 354: 643- 67 Wilczek, G., Babczynska, А., Migula, Р., Wencelis, В., {2003), Activity of esterases as bloтarkers of тetal exposure in spiders fгот тetal pollution gradient, Pof. Ј. Environ. Stud. 12: 765-771 Wilson, C.L., Shirras, A.D., lsaac, R.E., {2002), Extracelfular peptidases of iтaginal discs of Drosophila тelanogaster, Peptides 23: 2007-2014 217 Refereпce Wolfsoп, J.L., Mиrdock, L.L., {1990), Diversity iп digestive proteiпase activity amoпg iпseds, Ј. Chem. Ecol. 16: 1089-1102 Wood, Е., Casabe, N., Melgar, F., Zerba, Е., {7986}, DistгiЬиtioп апd properties of glиtathioпe 5-traпsferase from Triatoma iпfestaпs, Comp. Biochem. Physiol. 84В: 607- 618 Woods, R.J., {198 n lпsecticide resistaпce: geпes апd mechaпisms, Eds: Bishop, Ј.А., & Cook, L.M., Јп : Geпetic Сопsеqиепсеs of тап made chaпges, Academic Press, Lопdоп, ИК, 5З-96 Wright, 5., { 19З 1 }, Evolиtioп iп Meпdeliaп popиlatioпs, Geпetics 16:97-159 Wright, R.J., 5chaгf, М.Е., Meiпke, L.J., Zhoи, Х., 5iegfгied, B.D., Chaпdler, L.D. , {2000), Larval sиsceptiЬi/ity of ап iпsecticide-resistaпt western сот rootworm {Coleoptera: Chrysomelidae} popиlatioп to soil iпsecticides: laboгatory Ьioassays, assays of detoxificatioп eпzymes, апd field регfогтапсе, Ј. Есоп. Eпtomol, 9З: 7-1 З Wи, D.J., Нои, R.F., {199З), Relatioпship betweeп thermotoleraпcy апd heat-staЬie esterase iп the silkworm ВотЬух mori L. (Lepidoptera: Bombycidae}, Appl. Eпtomol. Zool. 28: З77-З77 Wu, G.X, У е, G. У., Ни, С., Cheпg, Ј.А., {2006}, Accumиlatioп of cadmium апd its effects оп growth, developmeпt апd hemolymph Ьiochemical compositioпs iп Boettcherisca peregriпa larvae (Diptera: 5arcophagidae}, lпsect 5ci. 1 З: З 7- З9 Xu, С., Holscher, М.А., Јопеs, М.М., 5iпgh, Р. К., ( 1995}, Effect of moпoisoamyl meso-2,З-dimercaptosucciпafe оп the pathology · of acute cadmium iпtoxicatioп, Ј. Toxicol. Епviгоп. Health 45: 261-277 Х и, G., D.L. Ви//, { 1994), Acetylcholiпesterase fгom the horn fly {Diptera: Muscidae} 11. Biochemical апd molecular properties, Arch. lпsect Biochem. Physiol. 27: 109- 121 Уап, Ј., Сhепњ Q., Li, С.-В., Aksoy, 5., {2002}, Molecular characterizatioп of three gut geпes from Glossiпa morsitaпs: cathepsiп В, ziпc-metalloprotease апd ziпc-carboxypeptidase, lпs . Мо/. Biol. 11: 57-65 Уар, С.К., Тап, 5.G., lsmail, А., Отаг, Н., {2004), Allozyme polymorphisms апd heavy metallevels iп the greeп-lipped mussel Регпа viridis {Liппаеиs} collected fгom coпtamiпated апd ипcoпtamiпated sites iп Malaysia, Епviгоп. lпt. ЗО: З9-46 Zamaп, К., MacGi/1, R.5., Јоhпsоп, Ј. Е., Ahmad, 5., Pardiпi, R.5., { 1995), Ап iпsed model fог assesiпg oxidative stress related to arseпic toxicity, Arch. lпsed Biochem. Physiol. 29: 199-209 Zaroogiaп, G., Апdегsоп, 5., { 1995}, Comparisoп of cadmium, пickel апd Ьепzо{а}ругепе uptake iпto cultured Ьгоwп cells of the haгd she/1 с/ат, Мегсепагiа тегсепагiа, Comp. Biochem. Physiol. 111 С: 109-116 218 Reference Zelenayora, Е., { 1986}, Scotia segetum {Lepidoptera, Noctuidae} oogenesis affected Ьу copper ions added to semisynthetic diet of larvae, Biologia {Bratislava} 41 : 563-577 . Zhou, Z.H., Syvanen, М., {1997), А complex glutathione transferase gene family in the housefly Musca domestica, Мо/. Gen. Genet. 256: 187-194 Zhu, К. У., W.A. Brindley, {1990), Properties of esterases from Lygus hesperus Knight (Hemiptera: Miridae} and the roles of the esterases in insecticide eresistance, Ј. Econ. Entomol. 83: 725-732 219 Прилог 1. Изјава о ауторству Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Efekat kadmijuma na rast i Ьiohemijske osoЬine larvi gubara (Lymantria dispar L.) • резултат сопственог истраживачког рада, • да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис У Београду , Јо. 3. ~D ()ј . Прилог 2. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку "Светозар Марковић" да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Efekat kadmijuma па rast i Ьiohemijske osoЬine larvi gubara (Lymantria dispar L.) која је моје ауторска дело . Сагласан/на сам да електронска верзија моје дисертације буде доступна у отвореном приступу. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commoпs) за коју сам се одлучио/ла . 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално З. Ауторство - некомерцијалне -без прераде 4. Ауторство- некомерцијалне - делити под истим условима 5. Ауторство- без прераде 6. Ауторство - делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци . Кратак опис лиценци дат је на следећој страници . ) Потпис У Београду, Јо. 3 :l_ofJ(