iUniverzitet u Beogradu Biološki fakultet Miloš Č. Stupar Diverzitet mikromiceta na objektima kulturne baštine i testiranje fungicida primenljivih u konzervaciji Doktorska disertacija Beograd, 2013 ii University of Belgrade Faculty of Biology Miloš Č. Stupar Micromycetes diversity on cultural heritage objects and testing the fungicides applicable in conservation Doctoral dissertation Belgrade, 2013 iii Mentor: dr Milica Ljaljević Grbić, vanredni profesor Univerzitet u Beograd, Biološki fakultet Članovi komisije: dr Jelena Vukojević, redovni profesor Univerzitet u Beogradu, Biološki fakultet dr Jelena Lević, naučni savetnik Institutut za kukuruz „Zemun Polje“ dr Gordana Subakov Simić, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu, Biološki fakultet dr Ana Džamić, docent Univerzitet u Beogradu, Biološki fakultet Datum odbrane: iv Eksperimentalni deo doktorske disertacije urađen je na Katedri za algologiju, mikologiju i lihenologiju, Univerziteta u Beogradu, Biološkog fakulteta, Instituta za botaniku i Botaničke bašte „Jevremovac“. Zahvaljujem se svim članovima ove i dru- gih institucija koji su mi pružili pomoć i podršku tokom izrade disertacije. Srdačno se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Milici Ljaljević Grbić, na pruženim mogućnostima za rad, nesebičnoj pomoći u interpretaciji rezultata i konsultacijama tokom izrade disertacije. Posebno se zahvaljujem, prof. dr Jeleni Vukojević, prof. dr Gordani Subakov Simić, dr Ani Džamić i dr Jeleni Lević na korisnim savetima i predlozima tokom čitanja disertacije. Zahvaljujem se Aleksi Jelikiću, hemičaru - savetniku, mr Draganu Stanojeviću, slikaru - restauratoru - savetniku, mr Bilja- ni Šipetić, konzervatoru i Veselinu Lađiću, restauratoru - savetni- ku na korisnim sugestijama, pristupu predmetima kulturne baštine i pomoći tokom izrade disertacije. Zahvaljujem se mr Mihailu Ristiću za ekstrakciju i hemijs- ku analizu etarskih ulja. Hvala mojoj porodici, prijateljima i svima koji su bili uz mene tokom izrade ove disertacije. v Diverzitet mikromiceta na objektima kulturne baštine i testiranje fungicida primenljivih u konzervaciji Rezime Cilj istraživanja doktorske disertacije je bio proučavanje biodeterioracije objekata kulturne baštine u Srbiji. Na osnovu predloga stručnih timova u institucijama za zaštitu objekata kulturne baštine izvršen je odabir istraživanih objekata i predmeta. Spomeni- ci kulture obuhvaćeni u istraživanju bili su: crkva Svete Trojice manastira Sopoćani i crkva Svete Bogorodice manastira Gradac kod Novog Pazara, crkva Svetog Nikole u Paležu, Ajfelova prevodnica kod Bečeja, spomenik Neznanom junaku na Avali, Bran- kov most u Beogradu i srednjovekovni kameni stećci sa lokaliteta Mramorje i Rasti- šte kod Perućca. Opservacijom in situ opisani su simptomi biodeterioracije: pojava bi- opatine, izmenjena tekstura kamene površine, fenomen „biopitting“ i drugi. Sa mesta sa vidljivim simptomima biopatine izvršeno je uzorkovanje fragmenata biofilma adhe- zivnom trakom sa kamenog supstrata. Direktnim posmatranjem fototrofne komponen- te biofilma, svetlosnim mikroskopom, identifikovane su prisutne cijanobakterije i alge, uzročnici različite obojenosti supstrata. Crvena biopatina na fasadi crkve svete Bogoro- dice je posledica prisusutva kolonija Gloeocapsa sanguinea (C.Agardh) Kützing dok je Trentepohlia aurea (Linnaeus) C.F. P. Martius izazvala pojavu narandžaste biopatine na istom objektu. Crna katranasta biopatina na Ajfelovoj prevodnici je posledica prisusutva kolonija Nostoc sp., dok je Haematococcus pluvialis Flotow uzročnik narandžaste bio- vi patine na spomeniku Neznanom junaku. Cijanobakterija Oscillatoria sp. i zelena alga Cylindrocistis brebissonii (Ralfs) de Bary su uzročnici zelene biopatine na istom objek- tu. U okviru fototrofne komponente biofilma na površini kamenog supstrata 5 istraži- vanih spomenika kulturne baštine u Srbiji identifikovano je 17 taksona cijanobakterija i 13 taksona algi, što sugeriše nizak diverzitet fototrofa. Najčešće identifikovana vrsta na kamenom supstratu objekata materijalne kulturne baštine je cijanobakterija Gloeocap- sa violacea (Corda) Rabenhorst a najčešće identifikovana alga je Desmococcus oliva- ceus (Persoon ex Acharius) J.R.Laundon. Mikromicete prisutne na površini spomenika kulture i umetničkih predmeta uzorkovane su metodom sterilnog brisa, izolovane su monosporične kulture i identifikovane do nivoa roda ili vrste. U okviru fungalne ko­ mponente biofilma na površini kulturno­istorijskih spomenika u Srbiji identifikovano je 28 taksona. Zastupljenost identifikovanih mikromiceta je različita na ispitivanim obje­ ktima. Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries i vrste rodova Alterna- ria i Fusarium bile su prisutne na svim ispitivanim objektima. Epicoccum purpurascens Ehrenb je izolovan, sa visokom učestalošću, na četiri objekta. Najveći broj vrsta mi- kromiceta (13) zabeležen je na kamenu peščaru Ajfelove prevodnice. Mikološka ana- liza zidnih slika u srpskim sakralnim objektima pokazala je njihovu kolonizaciju vrsta- ma rodova Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Emericella, Nigrospora i Penicillium. Izolacija i identifikacija mikromiceta sa umetničkih predmeta sačinjenih od različitih tipova materijala, pokazala je različit afinitet mikromiceta da kolonizuju ove supstrate. Analizirani su umetnički predmeti iz zbirki Muzeja istorije Jugoslavije, Muzeja grada Beograda, Galerije Slika „Sava Šumanović“ i zbirke Muzeja savremene umetnosti. Najveći diverzitet mikromiceta zabeležen je na umetničkim predmetima od drveta, na kome su zabeležene vrste rodova Absidia, Alternaria, Aspergillus, Chaetomi- um, Cladosporium, Epicoccum, Neurospora, Penicillium, Rhizopus, Syncephalastrum, Trichoderma i Ulocladium. Umetničke slike su do sada retko proučavane sa stanovi- šta biodeterioracije i fungalne kontaminacije. Tokom ovog istraživanja pokazano je da i bojeni slojevi slika i slikarska platna mogu biti kolonizovani različitim vrstama mi- vii kromiceta. Sa slikarskih boja izolovane su vrste rodova: Alternaria, Aspergillus, Cla- dosporium, Drechslera, Fusarium, Neurospora, Paecylomyces, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma i Ulocladium, dok su sa slikarskih platna izolovane vrste rodova: Alter- naria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Penicillium, Trichoderma, Ulocladium i Wardomyces. Najmanji diverzitet zabeležen je na fotografskom papiru (vrste rodova Fusarim, Humicola, Paecylomyces, Rhizopus, Trichoderma i Ulocladium) i na tkanina- ma (Aspergillus i Penicillium vrste). Mikološka analiza vazduha zatvorenih prostorija različite namene u institucijama kulture, izvršena je metodom pasivne sedimentacije, a procena brojnosti gljiva je određena metodom po Omelijanskom. Kvantitativna anali- za vazduha, poređenjem sa standardima Svetske zdravstvene organizacije, pokazala je umerenu kontaminaciju vazduha zatvorenih prostorija ispitivanih institucija kulture. Do- minirale su vrste rodova Cladosporium, Penicillium, Trichoderma i Aspergillus. U cilju pronalaženja neagresivnih, efikasnih i ekološki bezbednih agenasa, koji se mogu kori- stiti u procesu prevencije i sanacije u okviru konzervatorskih postupaka, testirana je an- tifungalna aktivnost etarskih ulja odabranih aromatičnih biljka (Rosmarinus officinalis L., Lavandula angustifolia Miller, Origanum vulgare L. i Helichrysum italicum (Roth) G. Don i benzalkonijum hlorida, osnove nekih komercijalnih biocida. Test mikromicete su izolati sa objekata kulturne baštine Aspergillus fumigatus Fresen, Aspergillus niger Tiegh, Aspergillus ochraceus G. Wilh, Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab., Bipolaris spicifera (Bainier) Subram, Emericella nidulans (Eidam) Vuill., Epicoccum purpuras- cens Ehrenb, Penicillium spp. i Trichoderma viride Pers. Hemijski sastav etarskih ulja određen je kombinacijom metoda gasne hromatografije i gasne hromatografije sa spek- trometrijom masa. Sastav etarskog ulja R. officinalis pokazuje dominaciju komponente 1.8­cineol (44,28 %.). Dominantne komponente etarskog ulja L. angustifolia su linalol (37,61%) i linalol acetat (34,86 %), dok je karvakrol (64,06%) dominirao u etarskom ulju O. vulgare. Najzastupljenija komponenta etarskog ulja H. italicum je γ­kurkumen (22,45 %). Kombinacijom različitih metoda za ispitivanje antifungalne aktivnosti (me- toda mikroatmosfere, mikrodiluciona metoda, makrodiluciona metoda i metoda neutra- viii lizacije biocida) pokazano je da svi testirani agensi poseduju antifungalnu aktivnost ra- zličitog stepena. Etarsko ulje O. vulgare i benzalkonijum hlorid pokazali su snažnu anti- fungalnu aktivnost, etarska ulja R. officinalis i L. angustifolia umerenu, dok je najslabije dejstvo zasbeleženo za H. italicum. Dobijeni rezultati sugerišu mogućnost implementa- cije etarskih ulja kao potencijalno novih fungicida u sistem konzervacije i sanacije obje- kata kulturne baštine. Ključne reči: biodeterioracija, biofilm, mikromicete, kulturna baština, etarska ulja, antifungalna aktivnost Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Algologija i mikologija UDK broj: 581.135.5:[[582.28/.282+582.282.12/582.282.123.4]+58 2.232+582.26/.27] : 725/728(497.11)] (043.3) ix Micromycetes diversity on cultural heritage objects and testing the fungicides applicable in conservation Abstract The aim of presented PhD thesis was research of biodeterioration of cultural he- ritage objects in Serbia. The objects and artefacts for this study were chosen accor- ding to the recomendations of the experts in the field of cultural heritage conservation. Cultural heritage monuments chosen for this study were The Church of The Holly Tri- nity of the Monastery Sopoćani (Novi Pazar), The Holly Virgin Church of the Mo- nastery Gradac (Novi Pazar), Saint Nicholas church (Palež), Eiffel’s Lock (Bečej), Monument of the Unknown Hero (Avala), bridge „Brankov most“ (Belgrade) and me- dieval tombstones on two localities Mramorje and Rastište (Perućac). During in situ observations of examined stone monuments clear signs of biodeterioration were ob- served, such as presence of biopatinas, changed texture of stone surface, biopitting and other. Biofilm fragments were sampled using adhesive tape from the stone sur- faces with visible biopatinas and examined using light microscopy in order to identi- fy cyanobacteria and algae as phototrophic components of biofilm. It was shown that causative agent of red biopatina on the facade of Holly virgin church was Gloeocapsa sanguinea (C.Agardh) Kützing colonies, while Trentepohlia aurea (Linnaeus) C.F. P. caused the orange biopatina on the same monument. Black gelationous patina on Ei- fel’s Lock was caused by Nostoc sp. colonies. Haematococcus pluvialis Flotow cau- x sed the orange biopatina on the Monument of the Unknown Hero. On the same mo- nument the green biopatina caused by Oscillatoria sp. and Cylindrocistis brebissonii (Ralfs) de Bary was documented. The total of 17 taxa of cyanobacteria and 13 taxa of algae from all five examined monuments suggested low diversity of phototrophs. Cya- nobacteria Gloeocapsa violacea (Corda) Rabenhorst and green algae Desmococcus olivaceus (Persoon ex Acharius) J.R.Laundon were the phototrophs most freuqently found during this research. Fungi were sampled using sterile cotton swabs from the surface of the monuments, and cultivated in laboratory in order to obtain pure cul- tures and identified to the species or genus level. The total of 28 fungal taxa were documented on the surface of the stone monuments. Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries along with species belonging to genera Alternaria and Fu- sarium were present on all examined surfaces. Epicoccum purpurascens Ehrenb was isolated with high frequency. The biggest fungal diversity was documented on sand- stone substrata of the Eifel’s Lock (13). Fungi isolated from wall pantings in Serbian monasteries and churches belonged to genera Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Emericella, Nigrospora and Penicillium Isolation and identification of fungi from museum artefacts suggested different susceptility of different substrata to be colonized by fungi. Examined artefacts belonged to the collections of the Museum of Yugoslav History, Belgrade City Museum, Galery „Sava Šumanović” and Museum of Contemporary Art. The wooden substrata were the most susceptible for fungal co- lonization and fungi belonging to genera Absidia, Alternaria, Aspergillus, Chaetomi- um, Cladosporium, Epicoccum, Neurospora, Penicillium, Rhizopus, Syncephalastrum, Trichoderma and Ulocladium were isolated from wooden artefacts. Canvas paintings, which in general have seldomly been investigated for biodeterioration, can be also colonized by fungi. This research showed that fungi belonging to genera Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Drechslera, Fusarium, Neurospora, Paecylomyces, Peni- cillium, Rhizopus, Trichoderma and Ulocladium colonize pictorial surface, while Al- ternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Penicillium, Trichoderma, Ulocla- xi dium and Wardomyces colonize the canvases. Photographic papers and textiles were less susceptible for fungal colonization. From the surfaces of examined photographs fungi Fusarim sp, Humicola sp, Paecylomyces sp, Rhizopus sp, Trichoderma sp. and Ulocladium sp. were isolated. Examined textiles were colonized by Aspergillus and Penicillium species. Sampling of airmycota in indoor environment in Serbian cultural institutions was carried out using passive sedimentation method and the fungal pre- velance in the air was estimated using Omelyansky’s method. The obtained results were compared with World Health Organization’s recommendations and low risk for human health was proved. Cladosporium spp., Penicillium spp, Trichoderma spp. and Aspergillus spp. were the most dominant air­borne fungi in examined indoor environ- ments. In order to find efficaceous and non agressive and safe chemical agents which can be used in cultural heritage conservation, the antifungal actrivity of selected aro- matic plants (Rosmarinus officinalis L., Lavandula angustifolia Miller, Origanum vul- gare L. and Helichrysum italicum (Roth) G. Don) along with biocide benzalconium chloride were tested against fungi isolated from cultural heritage objects (Aspergillus fumigatus Fresen, Aspergillus niger Tiegh, Aspergillus ochraceus G. Wilh, Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab., Bipolaris spicifera (Bainier) Subram, Emericella nidulans (Eidam) Vuill., Epicoccum purpurascens Ehrenb, Penicillium spp. and Trichoder- ma viride Pers.). The chemical composition of essential oils were carried out using gas chromatography and gass chromatography mass spectrometry. The main compo- nent of R. officinalis essential oil was 1.8­cineole(44,28 %.), the main components of L. angustifolia oil were linalool (37,61%) and linalool acetate (34,86 %). Carva- crol (64,06%) was the main component of O. vulgare oil, while γ­curcumene were the main component of H. italicum oil. Using different methods for testing antifungal activity (microatmosphere method, microdilution method, macrodilution method and biocide neutralization method) all tested agents showed different antifungal potential. O. vulgare oil and biocide were the strongest inhibitors fungi, while oils of R. offici- nalis and L. angustifolia showed moderate antifungal activity. H. italicum oil was the xii weakest inhibitor of fungal growth. However, presented research could be the first step in implementation of essential oils as potentialy novel fungicides in cultural heri- tage conservation. Key words: Biodeterioration, biofilm, micromycetes, cultural heritage, essential oils, antifungal activity Scientific field: Biology Specific scientific field: Algology and mycology UDK number: 581.135.5:[[582.28/.282+582.282.12/582.282.123.4]+58 2.232+582.26/.27] : 725/728(497.11)] (043.3) xiii Skraćenice AH – apsolutna vlažnost vazduha (eng. absolute humidity) aw – sadržaj aktivne vode u supstratu (eng. water activity) BAC – benzalkonijum hlorid (eng. Benzalconium chloride) CFU – broj kolonija po Petri kutiji (eng. colony forming units) CZA – Czapek­ov agar (eng. Czapek’ agar) EPS – ekstracelularne polimerne substance (eng. extracellular polymere substances) GC – gasna hromatografija (eng. gas chromatography) GC/MC – gasna hromatografija sa spektometrijom masa (eng. gas chromatography mass spectrometry). IAQ – kvalitet vazduha zatvorenih prostora (eng. Indoor air quality) ID 50 – inhibitorna doza 50% (eng. Inhibotory dose 50%) ID 95 – inhibitorna doza 95% (eng. Inhibotory dose 95%) MEA – Malt agar (eng. Malt Extract Agar) MEB – Tečni malt (eng. Malt extract broth) MCF – mikrokolonijalne gljive (eng. мicrocolonial fungi) MFC – minimilna fungicidna koncentracija (eng. minimal fungicidal concentration) MIC – minimalna inhibitorna koncentracija (eng. minimal inhibitory concentration) RH – relativna vlažnost vazduha (eng. relative humidity) RIF – gljive kolonizatori kamena (eng. rock inhabiting fungi) SAB – subaerialni biofilm (eng. subaerial biofilms) SBS – Sindrom bolesne zgrade (eng. Sick building syndrome) WHO – Svetska zdravstvena organizacija (eng. World Health Organization) xiv Sadržaj 1 Uvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1 Fungi – Gljive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.1 Diverzitet gljiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.2 Mikobiota objekata i predmeta kulturne baštine . . . . . . 2 1.1.2.1 Taksonomska pripadnost gljiva izolovanih sa objekata i predmeta kulturne baštine . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.1.2.2 Izvor fungalne infekcije na objektima i predmetima kulturne baštine . . . . . . . . . . . . . . 5 1.1.2.3 Rast mikromiceta na objektima kulturne baštine . . . . . . 8 1.1.3 Gljive kao uzročnici biodeterioracije . . . . . . . . . . . . 10 1.1.3.1 Biodeterioracija kamenih spomenika i građevina . . . . . . 11 1.1.3.1.1 Gljive u sastavu subaerialnih biofilmova na kamenom supstratu. . . 13 1.1.3.1.2 Mehanizmi fungalne biodeterioracije kamenog supstrata . . . . . 16 1.1.3.1.3 Simptomi biodeterioracije na kamenim građevinama . . . . . . . 19 1.1.3.2 Biodeterioracija umetničkih i zidnih slika . . . . . . . . . 26 1.1.3.3 Biodeterioracija umetničkih predmeta od celuloznih vlakana . 27 1.2 Prevencija i sanacija u sistemu konzervacije objekata i predmeta kulturne baštine . . . . . . . . . . . . 29 2 Cilj rada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 3 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.1 Kulturno­istorijski spomenici . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.1.1 Crkva Svete Trojice manastira Sopoćani kod Novog Pazara . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.1.2 Crkva Svete Bogorodice manastira Gradac kod Novog Pazara . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.1.3 Crkva Svetog Nikole u Paležu . . . . . . . . . . . . . . . 37 xv 3.1.4 Ajfelova prevodnica kod Bečeja . . . . . . . . . . . . . . 37 3.1.5 Spomenik Neznanom junaku na Avali . . . . . . . . . . . 38 3.1.6 Brankov most u Beogradu . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 3.1.7 Srednjovekovni kameni stećci u Perućcu . . . . . . . . . . 39 3.2 Umetnički predmeti (artefakti) iz muzeja i galerija . . . . 40 3.2.1 Zbirka štafeta i poklona Josipa Broza Tita iz Muzeja istorije Jugoslavije. . . . . . . . . . . . . . . . 40 3.2.2 Umetnički predmeti iz zbirki Muzeja grada Beograda . . . 41 3.2.3 Zbirka slika iz Galerije slika „Sava Šumanović“ u Šidu . . 42 3.2.4 Zbirke Muzeja Savremene umetnosti u Beogradu . . . . . 43 4 Materijal i metode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 4.1 Materijal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 4.1.1 Hranljive podloge . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 4.1.2 Etarska ulja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 4.1.3 Sintetički biocid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.1.4 Izolati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.2. Metode. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.2.1 Uzorkovanje mikromiceta . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 4.2.2 Uzorkovanje cijanobakterija i algi . . . . . . . . . . . . . 48 4.2.3 Identifikacija mikromiceta . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 4.2.4 Identifikacija cijanobakterija i algi . . . . . . . . . . . . . 49 4.2.5 Analiza hemijskog sastava etarskih ulja . . . . . . . . . . 49 4.2.6 In vitro testovi za određivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja i biocida benzalkonijum hlorida . . . . . . . . 50 4.2.7 Statistička obrada rezultata . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 5 Rezultati i diskusija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 5.1 Biofilm na kamenom suspstratu kulturno­istorijskih spomenika u Srbiji . . . . . . . . . . . 54 5.1.1 Analiza biofilma na fasadi Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac . . . . . . . . . . . . 54 5.1.2 Analiza biofilma sa Ajfelove prevodnice . . . . . . . . . . 59 5.1.3 Analiza biofilma sa Spomenika Neznanom junaku na Avali . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 xvi 5.1.4 Analiza biofilma sa stubova Brankovog mosta u Beogradu . . . . . . . . . . . . . . . 67 5.1.5 Analiza biofilma sa srednjovekovnih kamenih stećaka na lokalitetima Mramorje i Rastište kod Bajine Bašte. . . . 71 5.1.6 Mikromicete izolovane sa kamena kulturno­istorijskih spomenika . . . . . . . . . . . . . . . 76 5.1.7 Cijanobakterije i alge detektovane na kamenom supstratu kulturno­istorijskih spomenika . . . . . . . . . . 78 5.2 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha u zatvorenim prostorijama institucija kulture . 87 5.2.1 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha iz zbirke štafeta i poklona Josipa Broza Tita u Muzeju istorije Jugoslavije. . . . . . . 87 5.2.2 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha Muzeja grada Beograda . . . . . . . . . . . . 90 5.2.3 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha izložbenog prostora i depoa Galerije slika „Sava Šumanović“ . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 5.2.4 Mikromecete izolovane sa zbirki i iz vazduha Muzeja savremene umetnosti u Beogradu . . . . . . . . 101 5.2.5 Pregled izolovanih mikromiceta iz muzejskih zbirki prema supstratima koje kolonizuju. . . . . . . . . 106 5.2.6 Pregled mikromiceta izolovanih iz vazduha zatvorenih prostorija ispitivanih institucija kulture . . . . 107 5.3 Mikromicete izolovane sa zidnih slika . . . . . . . . . . 115 5.3.1 Mikromicete izolovane sa zidnih slika Crkve Svetog Nikole u Paležu. . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 5.3.2 Mikromicete izolovane sa zidnih slika Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac . . . . . . . . . . . 116 5.3.3. Mikromicete izolovane sa zidnih slika Crkve Svete Trojice manastira Sopoćani . . . . . . . . . . . . 118 5.4 Opis identifikovanih taksona mikromiceta na kulturno­istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 5.4.1 Zygomycotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123 5.4.2 Ascomycotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 128 5.4.3 Deuteromycotina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132 xvii 5.5 Antifungalna aktivnost etarskih ulja i biocida . . . . . . 160 5.5.1 Antifungalna aktivnost odabranih etarskih ulja . . . . . . 162 5.5.1.1 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Rosmarinus officinalis . . . . . . . . . . . . . . . . 162 5.5.1.2 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Lavandula angustifolia . . . . . . . . . . . . . . . . 167 5.5.1.3 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Origanum vulgare . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 5.5.1.4 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Helichrysum italicum . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 5.5.2 Antifungalna aktivnost biocida BAC . . . . . . . . . . . 182 5.5.3 Uporedna analiza antifungalne aktivnosti etarskih ulja i biocida BAC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190 5.6 Opšta diskusija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198 6 Zaključci . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201 7 Literatura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206 11 Uvod 1.1 Fungi – Gljive 1.1.1 Diverzitet gljiva Prema Index of Fungi, do 1991. godine bilo je opisano 69 000 vrsta gljiva, a svake godine se opiše novih 1700 vrsta (Hawksworth, 1991). Pretpostavka je da na planeti Zemlji egzistira 1,5 miliona vrsta gljiva. Do ovog broja došlo se na osnovu odnosa broja vrsta viših biljaka i gljiva (1:6) utvrđenog na jednom ograničenom području. Potencijalni izvori novih vrsta gljiva za nauku, predstvljaju slabo istražena staništa i ekosistemi pre sve- ga tropske kišne šume (Hawksworth, 2004). Intenzivna proučavanja mikobiote tropskih kišnih šuma u oblasti Hong Konga doprinela su da se broj opisanih vrsta gljiva u tom regi- onu učetvorostruči, a od toga 150 vrsta bilo je novo za nauku (Hyde, 2001). Istraživanjem različitih tipova zemljišta u Australiji otkriveno je 209 hipogeičnih vrsta gljiva, od čega je za nauku bilo čak 152 noviootkrivene vrste (Claridge i dr., 2000). Nove vrste gljiva se često otkrivaju na ekstremnim staništima. Rubai i dr. (2005) su sa krečnjačkih stena u okolini Majorke izolovali 117 morfološki različitih izolata melanizovanih gljiva koje su predstavljene sa 39 različitih genotipova od kojih su samo 3 izolata uspešno identifikovana a za ostale se pretpostavlja da su nove vrste za nauku. Broj neistraženih staništa na kojima egzistiraju retke i specijalizovane gljive je veliki. Gljive koje su zabeležene kao nove za nauku u periodu od 1981 do 1990 bile su asocirane sa 1982 roda različitih domaćina ili supstrata (Ljaljević Grbić, 2006). 2Uvod Složen životni ciklus gljiva takođe otežava procenu njihove brojnosti. Posebnost taksonomije gljiva definisana je “Međunarodnim kodeksom botaničke nomenklature” usvojenim na XI međunarodnom botaničkom kongresu u Sijetlu 1969. godine. Na ovom kongresu je odlučeno da jedna vrsta može imati više autonomnih, fenotipskih, binarnih naziva, i predloženi su termini: holomorf, teleomorf i anamorf. Holomorf se odnosi na gljive koje imaju opisan kompletni životni ciklus, teleomorf karakteriše polni stadijum gljive, a anamorf bespolni. Uglavnom teleomorf i anamorf imaju različite latinske nazi- ve. Jedan teleomorf može imati više anamorfa i obrnuto (Muntaňola­Cvetković, 1987; Vukojević, 2000). 1.1.2 Mikobiota objekata i predmeta kulturne baštine Gljive su kosmopolitski ili ubikvitalni organizmi, sposobni da kolonizuju veliki broj različitih staništa i mikrostaništa. Izolovane su sa velikog broja čvrstih supstrata, kao što su drvo, kamen, plastika, kao i antropogenih veštačkih površina u urbanim sredinama (be- ton, crep, fasade, metalni delovi i sl). Veliki broj vrsta gljiva može se naći i na zidovima, tapetama, tkaninama, drvenom nameštaju, silikonskom materijalu, posebno u vlažnim uslovima. Imajući u vidu veliki potencijal gljiva da kolonizuju vrlo heterogene tipove supstrata, ne iznenađuje činjenica da su gljive izolovane sa objekata i predmeta koji pri- padaju kulturnoj baštini. Kulturna baština podrazumeva dobra nasleđena od prethodnih generacija ili koja nastaju u sadašnjosti, a imaju specifičnu vrednost za ljude i treba da budu sačuvana za buduće generacije. U materijalnu kulturnu baštinu spadaju izuzetne gra- đevine (sakralne ili svetovne), spomenici i materijalna umetnička dela (Jokilehto, 2005) Kulturno istorijski spomenici, izgrađeni od različitih tipova građevinskih materijala, pre svega različitih tipova kamena i maltera, mogu biti kolonizovani gljivama. Takođe i predmeti i objekti, izgrađeni od različitih tipova organskih i neorganskih materijala, koji se nalaze u izložbenim prostorijama muzeja i depoima muzeja mogu biti kolonizovami mikromicetama. Poslednjih nekoliko decenija posebna pažnja u svetu pridaje se gljivama 3Uvod koje su opisane kao uzročnici propadanja umetničkih predmeta i objekata kulturne baštine. Stoga, veliki izazov je za konzervatore i restauratore umetničkih objekata da se pronađu odgovarajuća sredstva i metode za zaštitu od destruktivnog dejstva gljiva. Prvi korak u uspešnoj sanaciji umetničkih predmeta i objekata kulturne baštine kolonizovanih gljivama predstavlja identifikacija uzročnika. Zanimljivo je pomenuti da je devastacija materijala od kojih su bile izgrađene neka- dašnje kuće, od strane različitih vrsta plesni prvi put pomenuta u Bibliji kao bela, crvena ili zelena „gubavost“ na ciglama, opeci i drvnom materijalu (Stari Zavet, Treća Knjiga Mojsijeva, poglavlje 14, stihovi 33­57): 14: 33 I reče Gospod Aronu i Mojsiju govoreći: 14: 34 Kad dođete u zemju hanansku, koju ću vam ja dati da je vaša, pa kad pustim gubu na koju kuću u zemlji koju ćete držati, 14: 35 Onda onaj čija je kuća neka dođe i javi svešteniku govoreći: čini mi se da je guba na kući. 14: 36 A sveštenik neka zapovedi da se isprazni kuća pre nego on dođe da vidi gubu, da se ne bi oskrnavilo šta je u kući i potom neka sveštenik dođe da vidi kuću. 14: 37 Pa kad vidi bolest, ako bude bolest na zidovima kućnim kao rupice zelenkaste ili crvenkaste i na oči niže od zida, 14: 38 Neka izađe sveštenik iz kuće one na vrata kućna, i zatvori kuću za sedam dana. 14: 39 Pa opet neka dođe sveštenik u sedmi dan, pa ako vidi sveštenik, da se bolest dalje razišla po zidovima kućnim, 14: 40 Zapovediće sveštenik da se da povade kamenje na kome je bolest i da ga bace iza grada na mesto nečisto, 14: 41 A kuću zapovediće da ostružu iznutra svuda unaokolo, i prah što sastružu da prospu iza grada na mesto nečisto, 4Uvod 14: 42 I da uzmu drugo kamenje i da ugrade na mesto gde je bilo pređašnje kamenje; tako i blato drugo uzevši da oblepe kuću. 14: 43 Ako se povrati bolest i opet izraste po kući, pošto se povadi kamenje i ostruže i nanovo oblepi, 14: 44 Tada došavši sveštenik ako vidi da se bolest razišla po kući, ljuta je guba na kući, nečista je. 14: 45 Neka se razruši ona kuća, kamenje i drva i sav lep od one kuće, i neke se iznese iza grada na mesto nečisto. 14: 46 A ko je ušao u kuću dok je ona zatvorena, da je nečist do večeri. 14: 47 I ko bi spavao u onoj kući, neka opera haljine svoje; tako i ko bi jeo u onoj kući neka opere haljine svoje. 14: 48 Ako li sveštenik došavši vidi da se bolest nije razišla po kući i pošto je kuća nanovo obnovljena, neka proglasi sveštenik da je čista, jer se izlečila bolest. 14: 49 I neka uzme da bi se kuća očistila dve ptice i drvo kedrovo i crvca isopa, 14: 50 I neka zakolje jednu pticu nad sudom zemljanim nad vodom živom. 14: 51 Pa neka uzme drvo kedrovo i isop i crvac i drugu pticu živu i neka zamoči u krv od zaklane ptice i u vodu živu i pokropi kuću sedam puta. 14: 52 I tako će očistiti kuću onu krvlju ptičijom i vodom živom i drvetom kedrovim i isopom i crvcem. 14: 53 Pa onda neka pusti pticu živu iza grada u polje; i očisti kuću, i biće čista. 14: 54 Ovo je zakon za svaku gubu i za ospu, 14: 55 Za gubu na haljini i na kući, 14: 56 I za otok i za krastu i za bubuljicu, 14: 57 Da se zna kad je ko nečist i kad je ko čist. To je zakon za gubu. 5Uvod 1.1.2.1 Taksonomska pripadnost gljiva izolovanih sa objekata i predmeta kulturne baštine Gljive zabeležene na objektima kulturne baštine pripadaju podrazdelima Zygomycotina, Ascomycotina i Deuteromycotina. U okviru podrazdela Zygomycotina sa objekata kulturne baštine često su izolovani pripadnici reda Mucorales klase Zygomycetes. Ipak prema Sterflin- ger (2010) pripadnici Zygomycotina nisu „pravi kolonizatori” objekata kulturne baštine, već tranzijenti. Teleomorfna faza gljiva je retko nađena na umetničkim predmetima zbog čega su pripadnici podrazdela Ascomycotina retko opisani kao kolonizatori ovih predmeta. Ipak, na supstratima sa niskim sadržajem aktivne vode (aw) (npr. istorijski dokumenti u arhivama, tek- stil, koža) nalažene su kleistotecije pripadnika reda Eurotiales, a njihovi anamorfni stadijumi su često izolovani i pripadaju Aspergillus glaucus grupi (Florian, 2002). Isti autor je zabeležio peritecije vrsta rodova Chaetomium i Neurospora (red Sordariales) na umetničkim predmeti- ma. Vrste roda Chaetomium, posebno vrsta C. globosum Künze, se često izoluju sa celuloznih supstrata (drvo, papir). Iako je opisano pet anamorfnih rodova za ovaj teleomorf, konidijalni stadijumi su do sada retko saopštavani na umetničkim predmetima (Florian, 2002). Na objekti- ma kulturne baštine dominantnu grupu gljiva predstavljaju pripadnici podrazdela Deuteromy- cotina, i to klase Hyphomycetes. Pripadnici druge dve klase Coelomycetes i Blastomycetes, takođe, su identifikovani na objektima kulturne baštine ali u manjem obimu (Florian, 2002). Predstavnici podrazdela Basidiomycotina su retko zabeleženi kao kolonizatori obje- kata kulturne baštine. Ipak, određeni umetnički predmeti od drveta ili drvne građe mogu biti kolonizovani vrstama rodova Poria, Polyporus, Ganoderma, Coniophora i Serpula iz reda Aphylophorales (Florian, 2002). 1.1.2.2 Izvor fungalne infekcije na objektima i predmetima kulturne baštine Propagule gljiva dospevaju na površinu objekata i predmeta kulturne baštine uglav- nom iz vazduha. Izuzetak predstavljaju umetnički predmeti koji su sakupljeni iz arheo- loških iskopina i oni su uglavnom kontaminirani zemljišnim gljivama (Heaton i Cleal, 6Uvod 2000). Konidije, sporangiospore, askospore, bazidiospore, fragmenti hifa i konidiofora velikog broja vrsta gljiva nalaze se u vazduhu, i zajedno sa česticama polena čine najzna- čajniju bioaerosolnu komponentu vazduha. Aerobiologija je grana biologije koja se bavi proučavanjem bioaresolnih komponenti vazduha (gljivične strukture, polen, bakterije, sitni insekti). U okviru nje je aeromikologija koja se bavi proučavanjem struktura gljiva u vazduhu (Urzi i dr., 2001). Gljivične strukture koje se nalaze u vazduhu označavaju se kao air­borne fungi ili airspora ali za ovaj termin ne postoji adekvatan prevod u srpskom jeziku. Strukture gljiva koje imaju sposobnost klijanja na odgovarajućem supstratu pred- stavljaju vijabilne propagule gljiva u vazduhu (Dix i Webster, 1995). Od svih struktura gljiva u vazduhu najdominantnije su konidije predstavnika Deute- romycotina. Ove gljive se odlikuju jednostavnim životnim ciklusom, tokom koga se na mi- celiji formira konidiogeni aparat sa konidijama koje prolaze kroz četiri faze u razvoju: sa- zrevanje, dormancija, aktivacija i klijanje. Kod većine vrsta sazrevanje konidija se dešava dok su još uvek pričvršćene za konidiogenu ćeliju. Tokom procesa sazrevanja konidije po- staju morfološki i fiziološki „spremne“ za klijanje. Zrele konidije se oslobađaju u vazdušni prostor i vrši se njihova disperzija. Kada padnu na pogodan supstrat konidije klijaju ako su ekološki faktori odgovarajući. Kod nekih vrsta gljiva procesu klijanja prethodi dormancija i aktivacija konidija. Dormanciju odlikuje niska metabolička aktivnost i osnovna funkcija ove faze je da se spreči klijanje konidija u nepovoljnim uslovima. Aktivacijom se prekida faza dormancije, konidija postaje spremna za germinaciju. Određeni fizički, ili hemijski faktori, kao i kombinacija ovih faktora mogu imati funkciju aktivatora. Tokom klijanja konidija usvaja vodu, bubri, na ćelijskom zidu se formira ruptura kroz koju izlazi klijajuća cevčica koja formira hife koje će obrazovati somatsko telo­miceliju. Na miceliji se obrazuje konidiogeni aparat a u ređim slučajevima, uglavnom u nepovoljnim uslovima, dolazi do polnog procesa i obrazovanja plodonosnih tela sa seksualnim sporama (Gottlieb, 1978). Na disperziju konidija utiču mnoge njihove karakteristike: oblik, veličina, ornamen- tura ćelijskog zida, gustina, težina, pigmentacija i naelektrisanje. Na kolonizaciju odgova- rajućih površina utiču morfologija konidija i uslovi sredine. Na kvalitativni i kvantitavni 7Uvod sastav bioaresolnih komponenti utiču dnevni i sezonski klimatski faktori (Gregory, 1973). Na svim geografskim širinama i u svim klimatskim zonama konidije vrsta roda Clado- sporium su najzastupljenija bioaresolna komponenta, a po zastupljenosti odmah slede konidije vrsta roda Alternaria. Konidije rodova Penicillium i Aspergillus vrsta su vrlo česte, s tim što su konidije Penicillium spp. učestalije u umerenim klimatskim regionima, a Aspergillus spp. u uslovima vlažne tropske klime (Florian, 2002). O zastupljenosti i broj- nost konidija gljiva u vazduhu govori podatak da je u toplim letnjim danima u Nemačkoj izbrojano preko 20000 konidija po kubnom metru vazduha, a samo 100–2000 polenovih zrna (Gravesen, 1979). Gljive koje su prisutne na kulturnim dobrima, takođe su prisutne i u vazduhu depoa i galerija. Međutim, sve gljive prisutne u vazduhu nisu sposobne da kolonizuju objekte materijalne kulturne baštine (Florian, 2002). U zatvorene prostore vijabilne propagule gljiva uglavnom dospevaju iz spoljašnjih izvora, kroz vrata, prozore, klima uređaje, ili ih posetioci i zaposleni unose na odeći (Camuffo i dr., 2001). Ponekad broj spora može biti i viši u zatvorenim prostorima nego u spoljašnjoj sredini kada je prisutan neki sekundarni izvor infekcije (vuna, pokvarena hrana, biljni materijal) (Lehtonen i Reponen, 2002). U slučaju poplava i pojave povišene vlage u prostorijama na zidovima se mogu stvoriti ide- alni uslovi za prenamnožavanje gljiva (Slika 1). Slika 1. Vidljiv porast plesni na različitim supstratima u unutrašnjosti zatvorenih prostora usled povećanja vlažnosti 8Uvod Ljaljević Grbić i dr. (2008) su saopštili da se u filterima klima uređaja nalazi masa konidija gljiva koje su sposobne da klijaju i formiraju miceliju. Veliki broj čestica prašine sa organskim materijama (polen viših biljaka, delovi egzoskleta insekata, fragmenti pera ptica) akumuliraju se u filterima klima uređaja gde predstavljaju nutrijente za gljive. To- kom toplih letnjih meseci, kad su optimalni uslovi temperature i vlažnosti, spore gljiva klijaju, formiraju miceliju i sporulišu (Slika 2A, B i D). Tokom letnjih meseci klima ure- đaji zajedno sa hladnim vazduhom u prostorije ubacuju i spore gljiva što ima za posledicu njihovo prenamnožavanje. Periode nepovoljnih uslova u filterima klima uređaja gljive preživljavaju obrazovanjem hlamidospora (Slika 2C). 1.1.2.3 Rast mikromiceta na objektima kulturne baštine Spore iz vazduha se talože na površinu kulturnih dobara. U zavisnosti od tipa supstra- ta, kao i od ekoloških faktora dolazi do germinacije, obrazovanja micelije, i sporulacije, nekada i do formiranja kolonija. Vidljiv porast gljiva na kulturnim dobrima se smatra simptomom oštećenja. Ekološki faktori: vlažnost, temperatura, kiseonik, ugljen dioksid, Slika 2. Fungalne strukture prisutne u filterima klima uređaja (Ljaljević Grbić i dr, 2008): A. hifa sa hlamidosporom obrasta vlakno filtera; B. lanci konidija vrste roda Aspergillus;. C. hlamidospora; D. diktiospora Alternaria sp. 9Uvod pH, svetlost, nutrijenti i toksičnost supstrata utiču na germinaciju konidija i na rast hifa (Dix i Webster, 1995). Za germinaciju spora i rast hifa najvažniji faktor je vlažnost vazduha, i vlažnost prisutna u supstratu. Vlažnost vazduha se može izraziti kao apsolutna (AH) ili relativ- na vlažnost (RH) koja je značajna za rast mikromiceta. U cilju sprečavanja rasta mi- kromiceta u muzejskim prostorima (depoi i izložbeni prostori) preporučeno je da se pri temperaturi od 20ºC, RH održava na nivou nižem od 70%. Vlažnost supstrata izražava se pomoću sadržaja aktivne vode (water activity, aw). Optimalna aw za rast većine vrsta gljiva kreće se od 0.90 do 0.99, dok konidije mnogih vrsta ne mogu da klijaju ako je aw ispod 0.98. Vrste rodova Aspergillus i Penicillium spadaju u kserofilne gljive i njihove konidije mogu klijati i formirati miceliju na supstratima koji imaju aw ispod 0.85 (Dix i Webster, 1995). Pojedine kserofilne vrste mogu klijati na supstratima na kojima je aw 0.70 i one su često izolovane sa objekata materijalne kulturne baštine, posebno sa celu- loznih materijala (papiri, stare knjige i dokumenti, fotografije deponovani u arhivima i bibliotekama). Optimalna temperatura za klijanje spora i rast hifa kod većine vrsta gljiva je u opsegu od 20ºC do 25ºC. Brojne vrste tolerišu i niže (do 5ºC) kao i više (do 40ºC) temperature. Gljive kolonizuju supstrate koji se odlikuju blago kiselom reakcijom (pH 5,6–6,5), ali mnoge tolerišu širok dijapazon pH vrednosti (pH 2,0–9,0) (Dix i Webster, 1995). Imajući u vidu veliku toleranciju gljiva prema ekstremnim vrednostima temperature i koncentracije vodoničnih jona, ovi faktori nemaju limitirajući efekat prema gljivama koje kolonizuju predmete i objekte kulturne baštine. Glavni limitirajući ekološki faktor, za vrste koje kolonizuju kamene spomenike u spoljašnjoj sredini, predstavljaju visoke vrednosti UV zračenja. Da bi uspešno preživele nepovoljne ekološke uslove gljive su tokom procesa evolucije razvile određene adaptacije. Polimorfizam, posebno obrazovanje različitih tipo- va spora, predstavlja odličnu životnu strategiju za preživljavanje i naseljavanje različitih tipova staništa. Preživljavanje nepovoljnih uslova omogućeno je sposobnošću gljiva da brzo transportuju nutrijente kroz micelijalu (Gadd, 2007). Od ekstremnih mikroklimatskih 10 Uvod uslova na kamenim objektima (radijacija, salinitet, pH, vodni potencijal i dr.), gljive se štite produkcijom antioksidativnih supstanci – npr. mikosporina i melanina u ćelijskim zidovima, kao i spajanjem kolonija uz pomoć mucilogenih supstanci (Gorbushina i dr., 2003a). Kao još jedan vid adaptacije mnoge vrste gljiva u nepovoljnim uslovima formiraju modifikacije micelije – hlamidospore i sklerocije. 1.1.3 Gljive kao uzročnici biodeterioracije Supstrat na i u kome se razvijaju gljive tokom vremena podložan je promenama usled njihovog rasta i metaboličke aktivnosti što dovodi do procesa biodeterioracije. Hueck (1965, 1968) je definisao biodeterioraciju kao svaku neželjenu promenu u osobinama materijala nastalu usled aktivnosti živih organizama. Prema kasnijim istraživanjima Morton i Surman (1994) su biodeterioraciju podelili na: mehaničku, hemijsku asimilacionu i hemijsku disimilacionu. Mehanička biodeterioracija predstavlja svaku promenu u osobinama i kvalitetu materijala usled direktne aktivnosti organizama (pokret, rastenje). Gljive koje kolonizuju kameni supstrat oštećuju ga apikalnim rastom hifa koje imaju sposobnost penetracije kroz supstrat (Kumar i Kumar, 1999; Sterflinger, 2000). Proces penetracije je olakšan visokim vrednostima turgorovog pritiska u hifama (Money, 1999). Hemijska asimilaciona biodeterioracija se ogleda u aktivnosti odgovarajućih enzima koji razlažu supstrat do gradivnih komponenti, koje gljiva usvaja u procesu ishrane (Erickson i dr., 1990). Karakteristična je za celulolitičke i ligninolitičke gljive, izazivače bele, mrke i meke truleži na drvnim objektima i drugim celuloznim supstratima. Vrste rodova Chaetomium i Trichoderma, koje produkuju celulolitičke enzime, često su koloni- zatori umetničkih predmeta izgrađenih od celuloznih materijala (papir, drveni umetnički predmeti). Gljive koje produkuju proteolitičke enzime mogu da razlažu keratinozni sup- strat i one su česte na umetničkim predmetima od kože (Nigam i dr., 1994). Za ovaj tip biodeterioracije u literaturi se često koristi sinonim biodegradacija. 11 Uvod Hemijska disimilaciona biodeterioracija predstavlja promenu materijala kao po- sledicu produkcije metabolita, najčešće organskih kiselina i pigmenta, koji oštećuju ma- terijal izazivajući koroziju ili pigmentaciju (Sayer i Gadd, 2001). Najčešće organske ki- seline koje produkuju gljive su: limunska, oksalna, sukcinatna, glutaminska, fumarinska, jabučna i sirćetna (Hanson, 2008). Pigmenti gljiva su brojni i raznovrsni po hemijskom sastavu. Lokalizovani su u hifama, konidijama ili se mogu izlučiti u supstrat, i odgovorni su za proces pigmentacije ili dekolorizacije, dok obojene konidije prisutne u masi ne mogu da oboje površinu supstrata (Florian, 2002). Melanin nastaje oksidativnom polimerizaci- jom indolnih i fenolnih jedinjenja i karakterističan je za Dematiaceae, koje se odlikuju tamnim i debelim hifama (Butler i Day, 1998). Veliki broj pigmenata gljiva spadaju u kvinone i nastaju poliketidnim biosintetskim putem. U ovu grupu spada fumigatin koga sintetiše Aspergillus fumigatus Fressen, auroglaucin, flavoglaucin i rubraglaucin koje sin- tetiše više vrsta A. glaucus grupe (Hanson, 2008). Isti autor saopštava da pigmente iz grupe hidroksiantrakvinona sintetišu vrste rodova Helminthosporium, crveni pigment, au- rofusarin, sintetiše Fusarium graminearum Schw., dok je bikhaverin, prvobitno izolovan iz Gibberella fujikuroi (Sawada) Wollenw. (anamorf: F. moniliforme J. Sheld). Pigmenti iz grupe karotenoida su retki u carstvu gljiva, ali je pokazano da sposobnost produkcije ovih pigmenata imaju vrste Phycomyces blakesleeanus Burgeff i Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge (Hanson, 2008). 1.1.3.1 Biodeterioracija kamenih spomenika i građevina Odavno je poznato da gljive mogu uspešno da kolonizuju kameni supstrat i da svojim rastom i metaboličkom aktivnošću izazovu biodeterioracione promene na njemu. Kamen se definiše kao prirodno formiran čvrst materijal koji se sastoji od jednog ili više minerala. Naučna disciplina koja se bavi proučavanjem gljiva na kamenom supstratu je geomiko- logija. Ona je deo geomikrobiologije čiji je predmet proučavanja uticaj mikroorganizama na geološke procese, uključujući promene i propadanje kamena i minerala, akumulaciju 12 Uvod metala i njihovu ulogu u kruženju nutrijenata, kao i uticaj kamena na proliferaciju mikrob- nih zajednica na mineralnom supstratu. Uloga gljiva u biogeohemijskom ciklusu kruženja ugljenika u prirodi je dobro proučena, dok se o njihovoj ulozi u geohemijskim procesima malo zna (Burford i dr., 2003). Kolonizacija kamenog supstrata mikroorganizmima, kao i intenzitet kolonizacije, zavise od stepena bioreceptivnosti kamene površine (Prieto i Silva, 2005). Termin biore- ceptivnost je u nauku uveo Guillete (1995) definišući ga kao sposobnost materijala da bude kolonizovan od strane jedne ili više grupa mikroorganizama i ta kolonizacija ne mora da dovodi do procesa biodeterioracije. Isti autor razlikuje tri osnovna tipa bioreceptivnosti. Primarna bioreceptivnost kamena odnosi se na sposobnost intaktnih ka- menih površina, na kojima ne postoje znaci oštećenja, da budu kolonizovanine različitim grupama organizama. Sekundarna bioreceptivnost predstavlja podložnost kamenih povr- šina sa simptomima deterioracije (fizičkim, hemijskim i biološkim) da budu kolonizovani drugim organizmima. Tercijarna bioreceptivnost predstavlja potencijal kamenih površina objekata kulturne baštine, koje su očišćene tokom restauracije i konzervacije, da budu rekolonizovane različitim grupama organizama. Ekološki faktori koji bitno utiču na kolonizaciju kamenog supstrata jesu vlažnost, dostupnost nutrijenata, temperatura, pH, kao i petrološki parametri (mineraloški sastav, tip cementa, poroznost i permeabilnost). Ovaj tip ekosistema podložan je stalnim dnev- nim i sezonskim kolebanjima ekoloških faktora (May, 2003). Bioreceptivnost kamena zavisi od njegove strukture i hemijskog sastava, dok intenzitet kontaminacije gljivama zavisi od faktora sredine kao i od antropogene eutrofikacije atmosfere (Prieto i Silva, 2005). Prisustvo velike količine karbonatnih jedinjenja u kamenu (npr. krečnjački pe- ščar, beton, krečnjački malter) stvara puferski sistem i održava pH konstantnim i opti- malnim za razvoj bakterija (Warscheid i dr., 1989). Tako, na građevinama izgrađenim od kamena na bazi silikata obično nema mikrobne kontaminacije. Međutim, posle restau- racije ovih zgrada malterom i cementom može doći do kontaminacije mikroorganiza- ma (Arino i Saiz­Jimenez, 1996). Krečnjak i mermer koji dozvoljavaju samo površinsku 13 Uvod mikrobnu kontaminaciju, su vrlo podložni kolonizaciji gljivama i lišajevima. Feldspati, gline i ferunginozni minerali vrlo su pogodni za razvoj mikroorganizama (Warscheid i Braams, 2000). Kameni građevinski materijali, takođe su bioreceptivni u zavisnosti od veličine pora i pH vrednosti. Istorijska cigla i malter kod kojih su dodavane organske supstance kao adhezivi (npr. piljevina, dlaka, lepak) imaju povećanu bioreceptivnost (Palmer i dr. 1991). Gljive su sposobne da kolonizuju kamen, sve tipove stena koje se mogu naći u prirodi (magmatske, sedimentne i metamorfne), kao i kamen koji se koristi u građevinarstvu i od koga su izgrađeni i kulturno­istorijski spomenici na čijim površinama, sa drugim mikro- organizma, formiraju specifične mikrobijalne zajednice tzv. biofilm (Sterflinger, 2000). 1.1.3.1.1 Gljive u sastavu subaerialnih biofilmova na kamenom supstratu Poznato je da mikroorganizmi u svojim prirodnim staništima retko opstaju kao po- jedinačni organizmi već je tokom evolucije došlo do pozitivnog selektivnog pritiska koji je doveo do organizovanja grupa mikroorganizama u kompleksne zajednice, biofilm, u kojima su bolje zaštićeni od stresnih uslova spoljašnje sredine (Hall­Stoodley, i dr. 2004). Biofilm se može naći u vrlo različitim sredinama (voda, zemljište, čvrste površine, živi organizmi i sl.), formiran na površini objekata i predmeta koji su u direktnom kontaktu sa atmosferskim vazduhom naziva se subaerialni biofilm (SAB) (Gorbushina i Broughton, 2009). Bakterije, cijanobakterije, alge, protozoe i gljive (uključujući i kvasce i filamen- tozne forme) predstavljaju značajne komponente SAB. S obzirom da kameni supstrat u ekološkom smislu predstavlja ekstremno mikrostanište ono favorizuje udruživanje mi- kroorganizama u SAB. Mikroorganizmi u sastvu SAB na kamenom supstratu su adap- tirani na uslove vodnog deficita (Morton i Surman, 1994) i suočavaju se sa izraženim temperaturnim kolebanjima, promenama u relativnoj vlažnosti vazduha i zračenju, što je posledica dnevno­sezonskih kolebanja klimatskih faktora u određenim regionu (Gor- bushina i dr., 2003a). Ćelije mikroorganizama u sastavu SAB pričvšrćene su za površinu pomoću organskog matriksa koga čine ekstracelularne polimerne supstance (EPS) kao što 14 Uvod su polisaharidi, lipopolisaharisi, proteini, glikoproteini, lipidi, glikolipidi, masne kiseline i enzimi. Ove supstance su odgovorne za povezivanje ćelija mikroorganizama (kohezija) i za njihovo vezivanje za supstrat (adhezija) (Warscheid i Braams, 2000). SAB je teš- ko analizirati konvencionalnim mikrobiološkim tehnikama. Za proučavanja i izolacije mikroorganizama, komponenata SAB, primenjuju se različite metode zavisno od grupa mikroorganizama. Sa trofičkog stanovišta alge i cijanobakterije se navode kao fotosinte- tička ili fotoautotrofna komponenta, dok se gljive i bakterije označavaju kao heterotrofna komponenta SAB. Gorbushina (2007) uvodi termin fungalna komponenta subaerialnog biofilma za gljive u sastavu SAB. Harding i dr. (2009) smatraju, takođe, da filamentozne gljive u sastavu SAB ima- ju izmenjenu gensku ekspresiju koja dovodi do fenotipa sa drukčijom fiziologijom. Pre svega, filamentozne gljive u sastavu SAB imaju veći stepen rezistencije na antimikrobna jedinjenja i biocide, a odlikuju se i izmenjenom produkcijom ekstracelularnih enzima i sekundarnih metabolita. Iako su hemolitotrofni mikroorganizmi često opisani kao činioci biofilma na kame- nim površinama, novija istraživanja naglašavaju da su fotoautotrofi i hemoorganotrofi glavni kolonizatori kamena pri čemu fotoorganotrofi imaju ulogu u pionirskom naselja- vanju (Chertov i dr., 2004). Fotoautotrofi, za čiji su razvoj najbitniji svetlost i vlažnost, grade vidljivi zaštitni biofilm obogaćen neorganskom i organskom biomasom na kame- noj površini (Darlington, 1981) čija je glavna uloga regulacija temperature i vlažnosti supstrata (Warscheid, 2000; Chertov i dr. 2004). Akumulacija fotosintetičke bioma- se omogućava stvaranje nutrijenata za heteroorganotrofe obzirom da fototrofi izlučuju ugljene hidrate, faktore rasta, antibiotike i dr. (Strzelcyk, 1981). Asocijacija koju formi- raju fototrofi može da posluži kao bioindikator fizičko­hemijskih parametara okruženja (Caneva i dr., 1993). Fototrofi nisu jedini jedini izvor nutrijenata za heteroorganotrofe jer gljive mogu da usvajaju hranljive materije iz vazduha i kišnice (čestice prašine sa organskim materijama) što im olakšava kolonizaciju kamenih površina (Karavaiko, 1978). Ostali izvori nutrije- 15 Uvod nata mogu biti u samom kamenu, npr. diagenetičke rezidue u sedimentnim stenama mogu se smatrati pogodnim nutrijentom za razvoj mikroorganizama (Hunt, 1961; Nooner i dr., 1972). Atmosfersko zagađenje, takođe, predstavlja dobar izvor nutrijenata za gljive (Pal- mer i dr., 1991). Mnoga organska jedinjenja koja čine polutante dolaze od izduvnih gaso- va automobila sa dizel motorima ili iz procesa sagorevanja u industriji i domaćinstvima (Simoneit, 1984). Takođe, i šumski ekosistemi ispuštaju određenu količinu ugljovodonika u atmosferu (Lamb i dr., 1987). Uglavnom organske supstance koje se mogu naći na ka- menim površinama spadaju u alifatične i aromatične ugljovodonike, mono i dikarboksilne kiseline s kratkim lancim i dugolančane masne kiseline i alkohole (Sáiz­Jiménez, 1993; Steiger i dr. 1993). Mikrooraganizmi u sastavu SAB predstavljaju pionire u naseljavanju kamenih po- vršina, ovi organizmi prethode lišajevima, mahovinama i višim biljkama sposobnim da takođe kolonizuju kameni supstrat (Morton i Surman, 1994). Fungalne komponente SAB na kamenom supstratu mogu se podeliti na: (i) epilit- ne – nalaze se isključivo na površini kamena; (ii) hipolitne – nalaze se ispod površine i najčešće su pričvršćene za šljunak; (iii) endolitne – naseljavaju pukotine i rascepe na kamenoj površini; (iv) hazmolitne – posebna grupa endolitnih gljiva koja se mogu uočiti i na površini kamena; (v) kriptoendolitne – nalaze se duboko u pukotinama i ne mogu se videti sa spoljne strane; (vi) euendolitne – imaju sposobnost penetracije u kameni supstrat (Burford i dr., 2003). Gljive su široko rasprostranjeni kolonizatori kamena u svim geografskim i klimat- skim zonama (Gadd, 2007). U uslovima umerene i vlažne klime u sastavu SAB dominiraju predstavnici klasa Hyphomycetes i Coelomycetes (Deuteromycotina) i to vrste rodova Alternaria, Cladosporium, Epicoccum, Aureobasidium i Phoma (Sterflinger, 2010). U sušnim regionima najčešći kolonizatori kamenih spomenika su crni kvasci i mikrokoloni- jalne gljive (MCF), vrste rodova Hortaea, Sarcinomyces, Coniosporium, Capnobotryella, Exophiala i Trimmatostroma, koje penetriraju u kamen i vrlo često grade zajednice sa lišajevima (Sterflinger, 2005). 16 Uvod 1.1.3.1.2 Mehanizmi fungalne biodeterioracije kamenog supstrata Na trajnost kamena utiču fizički, hemijski i biološki faktori koji mogu delovati si- nergistički ili antagonistički. U prirodi je jako teško razdvojiti efekte fizičkog i hemijskog oštećenja kamena od biološkog (Ehrlich, 1981). Deterioracija i degradacija kamena su bit- ni procesi kojim započinje formiranje zemljišta, što je značajno za evoluciju živog sveta. Međutim, na kamenu koji se koristi u građevinarstvu kao gradivni materijal, deterioracija je neželjena pojava koji stvara oštećenja na objektima. Ovaj proces počinje od trenutka kad kamen „napusti“ kamenolom, a na njega utiču vetar, sunčevo zračenje, temperatura, kiša, sneg i vlažnost. Navedeni faktori utiču na fizičke i hemijske procese propadanja ka- mena (eng. weathering), (Warscheid i Braams, 2000). Fizičko propadanje manifestuje se kao poremećaj stabilnosti kamenog matriksa, dok se hemijsko ogleda u koroziji minerala koji formiraju kamen u reakcijama oksidacije i hidratacije, kao i u rastvaranju karbonata i solubilizaciji nekih elemenata iz silikatnih minerala (Keller, 1957). Gljive na kamenom supstratu vrše mehaničku i hemijsku disimilacionu biodeterio- raciju. Mehanička biodeterioracija može biti direktna i indirektna (Gadd, 2007). Direktna nastaje penetracijom hifa i pravljenjem tunela u inače intaktan mineralni materijal (Ku- mar i Kumar, 1999; Sterflinger, 2000). Bitna karakteristika rasta hifa jeste „istraživanje prostora“ pri čemu je tigmotropizam dominantan faktor koji usmerava rast hifa prema pukotinama i porama u čvrstom materijalu nalazeći najslabija mesta za dalju penetraciju (Watts i dr., 1998). Veliku ulogu u prodiranju hifa u supstrat ima i hemotropizam važan za izbegavanje stresa, npr. toksičnih metala (Formina i dr. 2000). Intenzitet kolonizacije kamena od strane gljiva kao i prostorni raspored najviše zavise od hemijskog sastava i mikrotopografije. Invazivni rast micelije na kamenu potpomognut je visokim turgorovim pritiskom u hifama (Money, 1999). Prisustvo melanina takođe olakšava penetraciju i štiti hife od toksičnih metala. Indirektna biomehanička deterioracija potpomognuta je luče- njem mucilogenih EPS, koji mogu da sadrže kiseline i metal­helatne metabolite (Burford i dr., 2003). Razvoj i bujanje SAB utiče na povećanje pritiska na kamen, što dovodi do erozije ili abrazije. Utvrđeno je da su homogene karbonatne stene, koje se sastoje 17 Uvod od krečnjaka (CaCO3) ili dolomita (MgCa(CO3)2), često kolonizovane kriptoendolitnim, hazmolitnim i euendolitnim gljivama koje aktivnom penetracijom grade sistem kanala i šupljina (Gadd, 2007). Hemijska disimilaciona biodeterioracija kamenog supstrata posledica je produkcije i lučenja organskih kiselina koje gljive sintetišu kao primarne ili sekundarne metabolite od intermedijera ciklusa trikarbonskih kiselina (Krebsov ciklus). Prema Bertherlin (1983), organske kiseline su sposobne da vezuju katjone iz minerala i grade kompleksna jedinje- nja (helate). „Izvlačenje“ katjona i njegova zamena protonom označava se kao acidoliza kamena, čiji je mehanizam: (mineral)– M+ + H+ R– ↔ H+(mineral)– + M+R– R– = NO3– R1COO– HCO3– SO4– Acidolizu mogu da vrše i neorganske kiseline kao što su karbonatna, nitritna, i sum- porna kiseline, ali ovaj tip acidolize je karakterističan isključivo za hemolitotrofe, sum- porne i azotne bakterije (Keller, 1957). Hemoorganotrofi, pre svega gljive, uglavnom luče oksalnu, limunsku, glukonsku, 2­oksoglukonsku, glioksaličnu, oksalacetalnu i fumaričnu kiselinu, kao i karbonantnu tokom procesa disanja. Ove kiseline lako mobilišu katjone iz minerala (npr. Ca2+, Al3+, Si4+, Fe3+, Mn2+ i Mg2+) sa kojima lako grade helate. Biogene organske kiseline mnogo su uspešnije u vezivanju katjona iz minerala nego neorganske i prouzrukuju veću štetu (Manley i Evans, 1986). Utvrđeno je da Aspergillus niger Tiegh. sintetiše 4­6 g l-1 oksalne kiseline u prisustvu 3% glukoze (Henderson i Duff, 1963), a Penicillium chrysogenum Thom. 1­27 g l-1 (Eckhardt, 1988). Velike količine limunske i glukonske kiseline sintetiše P. frequentans Westling (Gómez­Alacrón i dr., 1994). Eck- hardt (1985) je saopštio da oksalna i limunska kiselina mogu da „izvlače“ nekoliko ka- tjona iz biotita (K(Mg,Fe)3AlSi3O10(F,OH)2), dok Manley i Evans (1986) su pokazali da oksalna, limunska i neke aromatične kiseline mogu da razlažu feldspat (KAlSi3O8­NaAl- Si3O8-CaAl2Si2O8). Prema Gómez­Alacrón i dr. (1994) vrste rodova Penicilium i Fusarium mogu da sintetišu oksalnu, fumaričnu i sukcinatnu kiselinu koje su biokorozivne. Ovi autori su saopštili da P. corylophilum Dierckx može da sintetiše oksalnu kiselinu ako se 18 Uvod u podlogu doda alga Chlorolobion braunii (Nägeli) Komárek (Monoraphidium braunii (Nägeli) Komárková­Legnerová) kao jedini izvor ugljenika i azota. Time je pokazano da u prirodnim uslovima gljive mogu da žive na račun hranljivih materija iz algi, posebno polisaharida i da uz pomoć njih sintetišu organske kiseline. Produkcija organskih kiselina je inter ili intra specijska i uglavnom je indukovana prisustvom toksičnih metala (Sayer i Gadd, 2001). Kiseline sa snažnom helatnom aktivnošću su oksalna i limunska i one mogu snažno da se vezuju za metale (Formina i dr., 2004). Tako, oksalna kiselina može da gradi oksalne komplekse sa gvožđem i aluminijumom (Gadd, 2007). Epilitne i endolitne gljive izlučuju i mnoge druge metabolite koji mogu da vezuju metal, pre svega poliole. Uloga poliola je u osmotskoj zaštiti u uslovima vodnog stresa (osmoprotektori). Oni se odlikuju malom molekulskom masom i zajedno sa polisahari- dima mogu da se vezuju za silikatne slojeve (liskuni) vodoničnim vezama (Gaylarde i Gaylarde, 2004). Osim acidolizom, gljive mogu da „izvlače“ metale iz minerala i aktivnom bioap- sorpcijom velikog broja metala, Fe, Ni, Zn, Ag, Cu, Cd i Pb (Gadd, 1990). Bioapsorpcija metala zavisi od pH supstrata., tako pri niskim pH vrednostima apsorpcija Cu, Zn i Cd je smanjena (Rome, de i Gadd, 1987). Prisustvo hitina i melanina u ćelijskom zidu gljiva takođe utiče na apsorpciju metala (Manoli i dr., 1997). Metali se unose u hife najčešće aktivnim transportom (H+ ATP­aze) ili se vezuju za specifičnu grupu jedinjenja, siderofore (Callot i dr., 1987). Gljive imaju sposobnost da vrše oksidaciju minerala koji ulaze u sastav kamenog supstrata procesom biooksidacije ili biokorozije. Poznato je da su Fe i Mn esencijalni elementi mikroorganizama koji naseljavaju kameni supstrat. Mnoge gljive izolovane s kamenih površina imaju sposobnost oksidacije oba elementa i to direktnim (enzimskim) i indirektnim putem, mada je enzimska oksidacija dominantna (Torre, de la i Gómez­Ala- cron, 1994). Vrste roda Lichenothelia mogu da oksidiju Mn i Fe iz minerala siderita (FeCO3) i rodohrozita (MnCO3) i da na površinami nagrade i nekoliko milimetara debeo 19 Uvod sloj patine (Grote i Krumbein, 1992). Intenzitet biokorozije zavisi od petroloških, morfo- loških i fizičko­hemijskih osobina kamena (Warscheid i Braams, 2000). 1.1.3.1.3 Simptomi biodeterioracije na kamenim građevinama Dominantne komponente SAB koji se formira na zgradama i spomenicima su cija- nobakterije, mikroalge (najčešće iz razdela Bacilariophyta i Chlorophyta) i gljive. Svojom biološkom aktivnošću ovi mikroorganizmi vrše biodeterioraciju što za posledicu ima za- pušten i neprivlačan izgled tih površinama, kao i smanjenje estetske vrednosti pogotovo u slučaju objekata od istorijskog i kulturnog značaja. Na kulturno­istorijskim spomenicima od kamena opisani su različiti simptomi kao posledica procesa biodeterioracije, od kojih su najznačajniji fenomen „biopitting“ i pojava pinte i patine. Fenomen „biopitting“ predstavlja formiranje lezija dubokih i do 2 cm na kame- nim površinama (Slika 3). Najčešći uzročnici ovog fenomena su crni kvasci iz grupe MCF. Slika 3. Fenomen „biopitting“ na kamenom supstratu spomenika kulturne baštine 20 Uvod SAB je prekursor za formiranje kvržica na kamenoj površini koje su posledice acido- litičke i oksidoreduktivne biokorozije minerala iz supstrata (Slika 4) (Blaschke, 1987) što u slučaju spomenika posebno utiče na umanjenje estetske vrednosti. Takođe je utvrđeno da SAB na kamenim spomenicima ubrzava akumulaciju polutanata iz atmosfere (Steiger i dr., 1993). Patina (ili pinta) predstavlja golim okom vidljivu manifestaciju prisustva SAB na različitim materijalima, uključujući i kamene spomenike (Warscheid i Braams, 2000). Ranije se smatralo da patina ima isključivo neorgansko poreklo i da predstavlja depozi- ciju iz vazduha. Tako se smatralo da crne, narandžaste ili braon diskolorizacije objekata, pogotovo mermera ili krečnjaka, potiču od fizičko­hemijskih reakcija izazvanih klimat- skim faktorima i zagađenjem neorganskim materijama, kao i od ostataka boja i hemikalija korišćenih za konzervaciju (Jenkins i Middleton, 1988). Tek je kasnije uveden termin biopatina kad je uočeno da nastaje od fototrofnih mikroorganizama, a potom je i utvrđeno da i heterotrofne gljive mogu biti izazivači biopatine. Smatra se da je Filipo Baldinucci prvi uveo termin patina u rečnik umetnosti 1881. godine. On je pod patinom smatrao vremenski zavisno tamnjenje fresaka i uljanih slika. Veruje se da reč patina potiče iz italijanskog jezika i da prvi opis pojma potiče od vene- Slika 4. Crne kvržice mikrokolonijalnih gljiva (MCF) na površini kamenog supstrata kulturnih dobara 21 Uvod cijanskog pesnika M. Boschini­ja, 1660. godine. U 18. veku termin patina se koristio za promene obojenosti na bakarnim i bronzanim objektima usled procesa oksidacije (ital. verde di bronzo). Danas se termin patina široko upotrebljava za starenje svih površina umetničkih predmeta. Savremenu definiciju patine dao je Brachert (1985), kao transfor- macije površine svih tipova materijala koji se koriste za izradu umetničkih predmeta. Nešto kasnije, Krumbein (1992) je definisao patinu kao zbir materijalnih i teksturnih promena na površini materijala usled starenja, raspadanja, uticaja sredine i uticaja živih organizama, posebno na objektima od istorijskog nasleđa. Formiranje patine je vrlo kompleksan proces koji traje dugo zbog čega je i sama pa- tina objekat od arheološkog značaja. Ponekad se opisuje i kao razmena materije i energije između dva otvorena sistema (čvrstog supstrata i okruženja). Oba sistema su definisana njihovim fizičkim (masa, veličina i oblik čestica, gustina, kohezija, pritisak, vlažnost, difuziona konstanta), hemijsko­kristalografsko­mineralno­petrografskim, biološkim i ter- modinamičkim karakteristikama. Takođe, formiranje patine utiče na termohigroskopske karakteristike kamena, posebno na stenama s velikom količinom kvarca i gline. Prvu promenu obojenosti kamene površine izazvanu delimično mineralizovanim hlorofilom iz cijanobakterija i algi opisao je Jaag (1945). Biopatina koju izazivaju izlučeni pigmenti živih organizama se prema boji može podeliti na: 1. Crne prevlake (Slika 5) su posledica prisustva melanina, melanoida, produkata degradacije hlorofila kao i Fe i Mn minerala u SAB. Kao što je istaknuto melanin i njemu srodne pigmente sintetišu vrste iz familije Dematiaceae, ali i aktinomicete, pseudomonade, gram pozitivne korineformne i metilotrofne bakterije. Takođe, oslobađanje enzima tirozi- naze iz uginulih ćelija mikroorganizama dovodi do formiranja crne biopatine (Willimzig i dr., 1993). Ovaj enzim vrši oksidaciju fenolnih jedinjenja i katalizuje biosintezu melanina. Na mnogim građevinama u gradskim zonama vremenom se mogu pojaviti crne pre- vlake a jedan od uzročnika je i čađ. U novije vreme su se pojavile i teorije koje crne prevlake na građevinskom kamenu objašnjavaju biološkim uzročnicima. Anagnostidis i 22 Uvod dr. (1992) su analizirajući crne prevlake na spomeniku Partenon na Akropolju prvi izneli hipotezu da crna obojenost spomenika potiče od hlorofila a i b i karotenoida cijanobakte- rija, melanina i melanoida gljiva i aktinomiceta. Do sličnih zaključaka došli su Krumbein (1992) i Urzi i dr. (1992) proučavajući diskoloricaju na više mermernih spomenika u Evropi (u Atini, Potsdamu, Sankt Petersburgu, Rimu i Beču). Prema ovim autorima crne prevlake na kulturno istorijskim spomenicima, osim čađi, izazivaju i gljive, te se stoga ove promene mogu smatrati biopatinom. 2. Zelene prevlake (Slika 6) su posledica prisustva fotosintetičkih pigmenata algi i cijanobakterija, najčešće hlorofila a i b. Najpoznatiji primer zelenih prevlaka opisan je na slikama u pećini Lascaux u Francuskoj (1963). Otkriće impresivne preistorijske umetnosti u ovoj pećini 1940. godine jedno je od najznačajnijih arheoloških otkrića 20. veka. Od kada je pećina otvorena za posetioce i instalirana rasveta, kao i veliki broj posetilaca su tokom vremena doveli do povećanja koncentracije CO2 što je omogućilo razvoj fotoau- Slika 5. Crna biopatina na spomeniku Ankgor Vat u Kambodži 23 Uvod totrofa. Za samo 20 godina razvila se zelena biopatina, koja do tada nije bila prisutna, i u potpunosti prekrila preistorijske slike. U literaturi ova biopatina opisana je kao zelena bolest (ital. maladie verde), a kao uzročnik je naavedena zelena alga Bracteacoccus minor (Chodat) Petrová (Lefèvre, 1974). 3. Žuto-narandžasto-braon prevlake (Slika 7) karakterišu se prisustvom karotena i karotenoida, kao i fikobiliproteina koji nastaju kao produkti degradacije hlorofila. Slika 6. Zelena biopatina na spomenicima Slika 7. Žuto­narandžasto­braon biopatina na spomeniku 24 Uvod 4. Svetlo oranž-crvene prevlake (Slika 8) nastaju usled produkcije različitih pi- gmenata heterotrofnih organizama, kao i degradacionih produkata algi i cijanobakterija obogaćenih gvožđem. Na mermernim spomenicima je opisana jedna specifična patina braon­crvenkasto­žu- te boje koja je označena kao „scialbatura“ (ital.) (Slika 9). Nju čine dva minerala, vevelit (kalcijum oksalat monohidrat) i vedelit (kalcijum oksalat dihidrat). Oksalna kiselina, koju produkuju određene mikromicete i lišaji koji se razvijaju na mermeru, ima sposobnost da „izvlači“ Ca iz kalcita (CaCO3) i dolomita (MgCO3) i da sa njima gradi hidratisane soli ok- salne kiseline. Način nastanka ovih minerala ih svrstava u sekundarne mikogene minerale. Kolonizacija kamenih površina lišajevima, mahovinama i višim biljkama narušava estetsku vrednost spomenika kulture. Intenzivna kolonizacija spomenika ovim grupama organizmima takođe se smatra simptomom biodeterioricaje (Slika 10). Nasuprot opšte prihvaćenom mišljenju da su lišajevi „pioniri vegetacije“ sposobni da kolonizuju intaktnu kamenu površinu nenaseljenu drugim organizmima, Savoye i Lallemant (1980) smatra- ju da je preduslov za uspešnu kolonizaciju kamena lišajevima depozicija nutrijenata iz Slika 8. Crvena biopatina na stubovima i fasadi istorijske građevine Slika 9. Patina „sciabaltura“ na stubovima i fasadi istorijske građevine 25 Uvod atmosfere i prethodna kolonizacija bakterijama. Mahovine i više biljke zahtevaju dodatnu eutrofikaciju kamene popvršine, i prisustvo inicijalnog sloja zemljišta – protosoil (Wars- cheid i Braams 2000; Gómez­Alarcón i dr., 1995a). Smenjivanje različitih grupa organi- zama na kamenom supstratu predstavlja ekološku sukcesiju. Na mnogim poznatim spomenicima u svetu opisani su simptomi biodeterioracije (Sterflinger, 2010). Na antičkom spomeniku Erehteon, izgrađenom od mermera, koji se nalazi na severnoj strani Akropolja u Atini opisana je žuta biopatina kao posledica bio- deteracione aktivnost MCF i heterotrofnih bakterija. Na kamenu peščaru koji se nalazi u Novom muzeju Pinakoteke u Minhenu opisana je zelena biopatina formirana od zelenih algi koje zajedno sa gljivama i bakterijama obrazuju SAB. Takođe, na ovom spomeniku primećene su velike površine obrasle lišajevima. Spomenik Rotorua na Novom Zelandu, izgrađen od kamena peščara u potpunosti je prekriven crvenom biopatinom koju su for- mirale cijanobakterije, alge i gljive. Produkcija pigmenata od strane mikroorganizama u sastavu SAB svakako dovodi do narušavnja estetske i umetničke vrednosti kulturno­isto- rijskih spomenika. Biološka uloga produkcije pigmenata je zaštitna jer oni štite SAB od visokih vrednosti UV radijacije, desikacije i temperaturnih stresova (Sterflinger, 2010). Slika 10. Mahovine na površini nadgrobnog spomenika 26 Uvod 1.1.3.2 Biodeterioracija umetničkih i zidnih slika Slikarstvo predstavlja umetnost stvaranja slika bilo realističnih, fiktivnih ili apstrak- tnih na površinama različite prirode, tehnikom mešanja pigmenata sa drugim supstan- cama organskog ili sintetičkog porekla. Umetničke slike na platnu, kao i zidne slike u crkvama i manastarima predstavljaju specifične ekološke niše koje mogu biti kolonizova- ne različitim grupama mikroorganizama. Tokom istorije različiti materijali su korišćeni kao podloge za slike: platno, kamen, drvo, papir, pergament, koža, metal. Hemijski sa- stav boja varirao je u zavisnosti od načina slikanja, tehnike, istorijskog perioda i samog slikara. Boje su pripremane od mineralnih pigmenata pomešanih sa vezivom, od kojih su najčešće korišćeni različita ulja, smole, voskovi, žumance, kazein, biljni i životinj- ski lepak (Sterflinger, 2010). Hemijski gledano slike se sastoje od različitih organskih i neorganskih materija koje imaju različit stepen bioreceptivnosti, a pojedini konstituenti slika su vrlo biodegradabilni. Danas se većina umetničkih slika radi na slikarskom plat- nu na koje se nanose slikarske boje. Biodeterioracija slikarskih boja je malo izučavana i literaturni podaci u ovoj oblasti su vrlo oskudni. Kao organsko vezivo, stari majstori koji su naslikali najlepše freske u manastirima, vrlo često su koristili žumance, kazein, ulja iz različitih biljaka (lan, mak, konoplja) i različite smole. Sorlini i dr. (1987) utvrdili su da materijal sa želatinom zečje šape pogoduje obilnom rastu gljiva, ali ako se u želatin do- daju pigmenti limonit, hematit i malahit, dolazi do inhibicije rasta gljiva. Supstrati sred- njovekovnih slika vrlo su postojani jer sadrže visoke koncentracije teških metala – olova, bakra, žive (Ciferri, 1999), ali i organske supstance životinjskog porekla – npr. žumance koje je bogato lipidima (Huang i dr., 2003), lateks smokve bogat masnim kiselinama (Hosamani i Pattanashettar, 2003), lišće smokve koje sadrži triterpenoide (Saeed i Sabir, 2002). Ovi organski rastvarači odlično su se vezivali za neorganske boje koje su srednje- vekovni umetnici koristili za bojenje fresaka i slika. Materijali koji se koriste za konzer- vaciju zidnih slika mogu, takođe, da posluže kao nutrijent za gljive (Sorlini i dr., 1987). Slikarska platna i drveni ramovi se pre nanošenja slikarskih boja često premazuju žela- tinom zečije šape, što im povečava stepen bioreceptivnosti. Prisutni nutrijenti u zidnim 27 Uvod i umetničkim slikama kombinovani sa optimalnim ekološkim faktorima (temperatura i vlažnost) omogućavaju prenamnožavanje gljiva na ovim supstratima koje mogu izazvati proces biodeterioracije slika (Gorbushina i dr., 2004). Mehanička biodeterioracija slika manifestuje se rastom hifa i njihovom penetracijom kroz supstrat ili formiranjem plodo- nosnih tela i drugih modifikacija micelije. Kao posledica formiranja peritecija, piknidija ili stroma na površini zidnih slika mogu se pojaviti ispupčenja ili pukotine (Garg i dr., 1995). Takođe, može doći do odvajanja slikarske boje od podloge i ova pojava označava se kao eksfolijacija. Produkcijom različitih ekstracelularnih enzima (celulaza, glukana- za, lakaza, fenolaza, keratinaza, mono­oksigenaza i drugih) gljive su sposobne da vrše asimilacionu biodeterioraciju, a produkcijom organskih kiselina i disimilacionu biode- terioraciju. Ove kiseline reaguju sa različitim konstituentima slika, najčešće rastvarajući katjone ili gradeći helatne komplekse sa metalima prisutnim u mineralnim pigmentima (Gómez­Alarcón i Torre de la, 1994). Najupečatljiviji simptom koji se može javiti na sli- kama, a posledica je biodeteriracione aktivnosti gljiva, je promena obojenosti slika, bilo kao posledica gubljenja slikarske boje ili kao obojenost izazvanu produktima gljiva, što svakako dovodi do umanjenja estetske i umetničke vrednosti dela. Emoto i Emoto (1974) su objavili da je prisustvo crnih, zelenih i crvenih prevlaka na zidnim slikama drevnih japanskih grobnica posledica rasta gljiva. 1.1.3.3 Biodeterioracija umetničkih predmeta od celuloznih vlakana Celuloza je složeni makromolekul, empirijske formule (C 6 H10O5)n, koji predstavlja dominantnu komponentu ćelijskog zida biljaka i gljiva iz klase Oomycetes (podrazdeo Mastigomycotina). Celulozna vlakna predstavljaju glavnu gradivnu komponentu mnogih umetničkih predmeta pre svega onih sačinjenih od drveta. Papir predstavlja najznačajniji materijal na kome se beleže i čuvaju kulturna dostignuća u celom svetu. S obzirom na to da nastaje kao produkt drvne industrije i izgrađen je od vlakana celuloze, u ekološnom smislu papir smatramo celuloznim supstratom. Knjige, dokumenti, spisi, stare mape, fotografije 28 Uvod i dr. su predmeti napravljeni od papira koji se najčešće čuvaju u bibliotakama, arhivima i muzejima. Pamuk i lan su tkanine izgrađene od celuloznih vlakana. Mnogi umetnički predmeti, pre svega stara nošnja, i predmeti koji su koristili naši preci izgrađeni su od ovih tkanina i deponovani su u muzejskim prostorima. Umetnički predmeti izgrađeni od celuloznih vlakana mogu da budu kolonizovani celulolitičkim gljivama sposobnim da vrše asimilacionu biodeterioraciju papirnih vla- kana. Celuloliza ili hidroliza celuloze je katalizovana enzimskim kompleksom koji se označava kao celulaza i koji se sastoji od ekstracelularnih β(1→4) glukanaza. Svi celu- lolitički enzimi se dele na endo­ i egzonukleaze. Endohidrolaze seku β(1→4) glikozidnu vezu na ma kom mestu proizvodeći glukozu, celobiozu i frakcije glukanskih lanaca veće molekulske mase. Egzohidralaze (β(1→4) celobiohidrolaze) seku samo krajeve β(1→4) glukanskih lanaca dajući kao proizvod reakcije isključivo disaharid celobiozu (Dix i Webster, 1995). Postoje i glukohidrolaze koje seku samo jednu D­glukozidnu jedinicu iz polisaharidnog lanca, ali one su jako retke kod mikroorganizama (Dix i Webster, 1995). Primeri celulolitičkih vrsta gljiva često izolovanih sa dokumenata i knjiga koje su ču- vaja u bibliotekama i arhivima su vrste rodova Chaetomium, Penicillium, Aspergillus, Eurotium i Trichoderma (Sczezepanowska i Cavaliere, 2000; Corte i dr., 2003). Većina kolonizatora papirnog supstrata su kserofilne vrste sposobne da se razvijaju na supstrati- ma sa niskim vodnim potencijalom. Celulolitičke vrste gljiva mogu vrlo brzo da potpuno razlože papir (Adamo i dr., 2003). Specifična i ireverzibilna pojava u vidu braon do riđih mrlja na papirnom materijalu opisana je u literaturi (Arai, 2000). S obzirom na to da boja ovih mrlja podseća na boju li- sičjeg krzna pojava je nazvana „foxing“ (Slika 11). Poreklo ove pojave na papirnim doku- mentima objašnjavaju dve teorije – abiotička i biotička. Prema abiotičkoj teoriji „foxing“ je posledica prirodnih hemijskih procesa, najčešće oksidacije, koji se odigravaju na papir- nom materijalu, kao i posledica depozicije određenih jedinjenja na površini papira (Cain i Miller, 1982). Prema biotičkoj teoriji, „foxing“ izazivaju mikroorganizmi, posebno gljive koje produkcijom organskih kiselina vrše disimilacionu biodeterioraciju papira trajno ga 29 Uvod oštećujući (Press, 1976; Meynell i Newsam 1978; Meynell, 1979; Nol i dr., 1983; Arai, 2000). Izolacija velikog broja vrsta gljiva upravo sa delova papira na kojima se primećuju simptomi „foxing“ govori u prilog biotičkoj teoriji. 1.2 Prevencija i sanacija u sistemu konzervacije objekata i predmeta kulturne baštine Pod konzervacijom objekata kulturne baštine podrazumeva se korišćenje efikasnih metoda u održavanju kulturne baštine u stanju što bližem izvornom, pri čemu je neophodno zadržati prvobitnu nameru umetnika (Kabbani, 1997). Preventivna konzervacija omoguća- va da se umanje ili eliminišu rizici od oštećena predmeta materijalne kulturne baštine, dok se mere sanacije sprovode na objektima i predmetima na kojima ima znakova oštećenja. Tri osnovne aktivnosti koje se moraju sprovoditi tokom prevencije su: kontrola mikro- Slika 11. Simptomi „foxinga“ na starim spisima i mapama 30 Uvod klimatskih uslova, učestalo mehaničko čišćenje i redovni monitoring (Sterflinger, 2010). Pod kontrolom mikroklimatskih uslova, u prostorijama, depoima i izložbenim prostorima muzeja, podrazameva se kontrola RH i temperature i njihovo održavanje na određenom nivou. Da bi se koncentracija spora u vaduhu zatvorenog prostora održavala na minimumu preporučeuje se korišćenje specifičnih filtera klase F5­F7, na ventilacionim sistemima, koji sprečavaju prodor spora gljiva i polenovih zrna. Monitoring koncentracije spora se određuje uz pomoć specifičnih „air­sampler“ uređaja. Zbog specifičnosti namene svakog muzejskog prostora potrebno je predložiti higijenske mere koje bi bile primenljive za svaki muzejski prostor pojedinačno. Takođe, poželjno je da svaki muzej poseduje posebnu prosto- riju za skladištenje, tzv. karantin, u koji bi se odlagali objekti sa vidljivim porastom plesni (Sterflinger, 2010). Mehaničko čišćenje predstavlja fizičko uklanjanje micelije sa kolonizovanih ume­ tničkih objekata gde je golim okom vidljiv porast plesni. Takođe, na kamenim spomeni- cima i građevinskim objektima potrebno je mehanički ukloniti prisutnu biopatinu, kao i lišajeve, mahovine i više biljke ako su prisutne. Prilikom mehaničkog čišćenja mora se uzeti u obzir tip materijala da ne bi došlo do dodatnog oštečenja umetničkog predmeta. Nakon uklanjanja mikromiceta sa objekata kulturne baštine, neophodno je ispitati njihovu vijabilnost u laboratorijskim uslovima. Prisustvo vijabilnih propagula na predmetima i objektima materijalne kulturne baštine zahteva primenu mera sanacije u vidu dezinfekcije kontaminiranih površina. Takođe, gajenjem izolata na selektivnim mikološkim podlogama može se odrediti njihov biodeteracioni potencijal, pre svega sposobnost produkcije ekstra- celularnih enzima i organskih kiselina (Sterflinger, 2010). Dezinfekcija predmeta i objekata materijalne kulturne baštine se može vršiti fizičkim ili hemijskim sredstvima. γ – radijacija je predloženo fizičko sredstvo za uklanjanje plesni a vrednosti od 20 kGy i više eliminiše sve prisutne plesni i njihove spore. Međutim, ovaj metod nije primenljiv za sve tipove materijala, pogotovo za celulozni supstrat koji se hemijski menja dejstvom zračenja. Kao hemijska sredstva dezinfekcije koriste se biocidi. 31 Uvod Veliki broj biocida je do sada primenjivan za dezinfekciju objekata i predmeta kulturne baštine izgrađenih od različitih tipova materijala (Sterflinger, 2010). Blazquez i dr. (2000) su izvršili efikasnu dezinfekciju krečnjačkog i granitnog sup- strata Katedrale Alcalá de Henares (Španija) upotrebom biocida Mergal S97 (karbendazim oktil izotiazolin­5­benzimidazol metilkarbamat), Preventol A9D (N­dihlorofluor­metil- tio­N’,N’­dimetil­N­p­tolil sulfamid) i Metatin N5810/101 (smeša tributil tin­naftenata i kvarternarnih amonijumovih soli). Ipak, kvasolike forme gljiva su pokazale rezistentnost prema primenjenim biocidima. Diakumaku i dr. (1995) su saopštili da se triciklazol, fun- gicid iz grupe triazolnih jedinjenja, može uspešno primeniti za uništavanje mikromiceta iz familije Dematiacea prisutnih na mermernim i krečnjačkim spomenicima. Sharma i dr. (2011) preporučuju 2% rastvor natrijum pentahlorofenola kao biocid koji uspešno inhibira rast većine mikromiceta koje kolonizuju kameni supstrat. Veliki broj hemijskih agenasa do sada je primenjivan prilikom konzervacije umetnič- kih predmeta izgrađenih od papira. Najčešće korišćen agens u konzervaciji papira je timol (3­hidroksi­p­cimen) koji spada u grupu jedinjenja derivata fenola. Ostala fenolna jedinje- nja pentahlorofenol, p­hloro­m­krezol, ortofenilfenol, n­fenilsalicilanid i 2­fenilfenol ređe su u upotrebi. Ipak zbog visoke toksičnosti kao i zbog mogućnosti da trajno oštete papirni supstrat upotreba ovih jedinjenja više se ne preporučuje (Nittereus, 2000). Izotiazolinon spadu u grupu savremenih biocida koji se od nedavno primenjuje u konzervaciji papira i do sada je pokazao visoku antifungalnu aktivnost (Sterflinger, 2010). Konzervacija umetničkih i zidnih slika do sada je vršena različitim hemijskim sred- stvima. Paner (2012) je pokazao da su komercijalni proizvodi Preventol R­80 (benzal- konijum hlorid) i Umonium­38 u poređenju sa ostalim biocidima najefikasniji prilikom dezinfekcije slika rađenih tehnikom ulje na platnu. Benzalkonijum hlorid i Preventol A8 su pokazali veliku efikasnost u inhibiciji rasta svih gljiva izolovanih sa površine murala (Gorbushina i dr., 2003b). Danas se konzervacija murala uspešno vrši rastvorom vodonik peroksida (H2O2) niskih koncentracija i 70% izopropil alkohola (Kigawa i dr., 2009). Čišćenje slika izopropil alkoholom nakon tretmana drugim biocidima predstavlja vrlo 32 Uvod uspešnu preventivnu metodu čiji je cilj sprečavanje rekolonizacije dezinfikovanih površi- na rezistentnim mikroorganizmima (Helmi i dr., 2011). Veliki broj biocida do sada je više ili manje uspešno primenjivan prilikom konzer- vacijskih tretmana umetničkih predmeta od drveta. Osim primene biocida, uobičajena praksa u muzejima je premazivanje drveta odgovarajućim hemijskim agensima koji na površini drvnog supstrata formira zaštitni sloj koji onemogućava kolonizaciju mikroorga- nizama. Efikasna zaštita se postiže premazivanjem drveta smešom 10% Paraloid B72 i 6% pentahlorofenola. Podjednako dobri rezultati se dobijaju primenom smeše 10% polivinil acetata i 6% pentahlorofenola (Kalpana i dr., 2011). Biocidi primenljivi u procesu konzervacije i restauracije moraju da zadovolje sle- deće kriterijume: (1) da imaju visoku fungicidnu ili fungistatsku aktivnost tj. sposobnost zaustavljanja ili inhibicije rasta mikromiceta pri niskim koncentracijama; (2) ne smeju da reaguju sa materijalom od koga je izgrađeno umetničko delo i da na bilo koji način utiču na njegov sastav i kvalitet; (3) i treba da su netoksični za ljude (Sterflinger, 2010). Veliki broj biocida, do sada primenjivanih prilikom konzervacije objekata i predmeta kulturne baštine, je zabranjen od strane Evropske direkcije za biocide zbog neispunjavanja na- vedenih kriterijuma, pre svega toksičnosti po ljude i životnu sredinu. Tri grupe biocida primenljivih u konzervaciji i restauracuju kulturnih dobara odobrenih od strane Evropske direkcije za biocide su: 1. jedinjenja koja oslobađaju formaldehid; 2. kvarterne amonijumove soli; 3. izotiazolinon. U određenim slučajama moguće je koristiti i 70% etanol u cilju prevencije kontami- nacije gljivama na kulturno­istorijskim objektima, dok je preporučeno da se do sada vrlo često korišćena fenolna jedinjenja (timol i cimol) više ne upotrebljavaju zbog njihove veće toksičnosti za ljude. 33 2 Cilj rada Na osnovu svega do sada predstavljenog, u cilju proučavanja biodeterioracije na objektima i predmetima kulturne baštine u ovom radu su postavljeni sledeći ciljevi istraživanja: 1. opis simptoma deterioracije na ispitivanim objektima kulturne baštine, izgrađenih od različitih tipova kamena; 2. identifikacija cijanobakterija i algi, fototrofnih komponenti subaerialnih biofilmova koji kolonizuju kameni supstrat kulturno­istorijskih spomenika i prouzrukuju pro- mene u vidu različito obojenih biopatina; 3. izolacija i identifikacija mikromiceta, heterotrofnih komponenti subaerialnih biofil- mova koje kolonizuju kameni supstrat kulturno­istorijskih spomenika i vrše njegovu biodeterioraciju; 4. izolacija i identifikacija mikromiceta sa umetničkih predmeta izgrađenih od različitih tipova materijala (drvo, tekstil, papir, fotografski papir, slikarske boje); 5. izolacija i identifikacija mikromiceta prisutnih u vazduhu zatvorenih prostorija insti- tucija kulture (muzejski depoi i izložbeni prostori); 6. izolacija i identifikacija mikromiceta koje kolonizuju zidne slike odabranih srpskih crkava i manastira. 34 Cilj rada U cilju pronalaženja neagresivnih, efikasnih i ekološki bezbednih agenasa koji se mogu koristiti u procesu prevencije i sanacije u okviru konzervatorskih postupaka u ovom radu su postavljeni sledeći ciljevi: 7. uporedna analiza antifungalne aktivnosti etarskih ulja odabranih aromatičnih biljaka kao potencijalno novih agenasa primenljivih u konzervaciji baštine i komercijalnog biocida benzalkonijum hlorida (BAC) odobrenog od strane Evropske direkcije za biocide na odabrane izolate objekata kulturne baštine; 8. hemijska analiza odabranih etarskih ulja; 9. ispitivanje uticaja etarskih ulja i biocida BAC na rast somatskih hifa i germinaciju spora odabranih izolata sa kulturnih dobara; 10. određivanje minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC), minimalnih fungicidnih kon- centracija (MFC) i doza inhibicije (ID 50 i ID 95 ) ispitivanih etarskih ulja i biocide BAC; 11. ispitivanje uticaja dužine tretmana (kontaktnog vremena) na inhibitorni potencijal biocida BAC u niskim koncentracijama. 35 3 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine 3.1 Kulturno­istorijski spomenici Izbor istraživanih objekata i predmeta izvršen je na osnovu opservacije i stepena deterioracije kao i predloga stručnih timova u institucijama kulture za zaštitu objekata kulturne baštine Srbije. 3.1.1 Crkva Svete Trojice manastira Sopoćani kod Novog Pazara Manastir Sopoćani (Slika 12A), dom Svete Trojice, datira iz XIII veka i zadužbina je kralja Stefana Uroša I. Nalazi se na 17 km od Novog Pazara (43º 11΄ 49.20˝ N; 20º 33΄ 16.42˝ E, 683 mnv). Jedan je od najznačajnijih srpskih kulturno­istorijskih spomenika, i od 1979. godine uvršćen je na Unesco listu svetske baštine. Arhitektura crkve Svete Tro- jice rađena je u stilu Raške škole, sa uticajima romaničke arhitekture. Unutrašnjost crkve oslikana je freskama koje datiraju iz XIII veka (Slika 12B). Umetničku vrednost Sopoćana predstavljaju freske koje su prvobitno zahvatale 760 m2 zidne površine, od kojih je danas sačuvano oko polovina. Prema opštem mišljenju freske u Sopoćanima su vrhunac ne samo srpskog, već i vizantijskog slikarstva uopšte. Sopoćani su danas muški manastir i u njemu živi 30 monaha i iskušenika (Mandić, 1965). 36 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine 3.1.2 Crkva Svete Bogorodice manastira Gradac kod Novog Pazara Manastar Gradac (Slika 13A), je podignut u XIII veku i predstavlja zadužbinu Jelene Anžujske, supruge srpskog kralja Stefana Uroša I. Na ruševima prethodne crkve u cen- tru manastirskog kompleksa podignuta je Crkva Svete Bogorodice, posvećena prazniku Blagovesti. Crkva je zidana u stilu Raške škole, ali su na samoj gra- đevini prisutni i elementi vizantijskog i romanogotičkog i gotičkog arhitekton- skog stila. Nalazi se u južnoj Srbiji na obodima planine Golija (43º 17΄ 10.60˝ N; 20º 36΄ 59.10˝ E, 563 mnv). Unu- trašnjost crkve oslikana je freskama koje datiraju iz XIII veka (Slika 13B). Manastir Gradac je proglašen za spo- menik kulture od izuzetnog značaja za republiku Srbiju 1979. godine. Mana- stir Gradac danas funkcioniše kao žen- ski manastir (Kandić, 2008). Slika 12. Crkva Svete Trojice manastira Sopoćani: A. izgled crkve; B. detalj freske Slika 13. Crkva Svete Bogorodice manastira Gradac: A. izgled crkve; B. detalj freske 37 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine 3.1.3 Crkva Svetog Nikole u Paležu Crkva Svetog Nikole (Slika 14A) datira iz XIV veka i nalazi se u selu Reka, u zase- oku Palež nedaleko od sela Rudno (43º 24΄ 06.59˝ N; 20º 28΄ 54.63˝ E, 1022 mnv). Ova crkva je jedan od najznačajnijih kulturno­istorijskih spomenika u slivu Studenice. Iznad ulaznih vrata nalazi se i dobro očuvana freska Svetog Nikole kome je ova crkva posvećena (Slika 14B). Unutrašnjost crkve je oslikana freskama. Nekoliko figura iz crkve, kao i delo- vi fresaka, su zbog svoje lepote prenete u Narodni Muzej u Beogradu (Pavić­Basta, 1975). 3.1.4 Ajfelova prevodnica kod Bečeja Ajfelova prevodnica (Slika 15) je iz- građena je 1898. godine i nalazi se na ušću Bačkog dela kanala Dunav­Tisa­Dunav u Tisu, kod Bečeja (45º 36΄ 15.50˝ N; 20º 03΄ 08.23˝ E, 76 mnv). Gvozdena konstrukcija ovog spomenika potiče iz radionice čuve- nog francuskog inženjera Gustava Ajfela, po kome je spomenik dobio ime. Ovaj objekat predstavlja i značajno industrijsko Slika 14. Crkva Svetog Nikole u Paležu: A. izgled crkve; B. detalj freske iznad ulaznih vrata Slika 15. Ajfelova prevodnica 38 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine nasleđe Srbije jer je kod njega za pokretenje mehanizma prevodnice prvi put korišćena sopstveno proizvedena električna energija (Ljaljević Grbić i dr., 2009). 3.1.5 Spomenik Neznanom junaku na Avali Spomenik Neznanom ju- naku (Slika 16) je monumen- talni mauzolej na vrhu planine Avala (44º 42΄ 25.64˝ N; 20º 31΄ 05.70˝ E, 486 mnv). Spomenik je delo vajara Ivana Meštrovića i podignut je 1938. Izgradnju spo- menika inicirao je kralj Aleksan- dar I Karađorđević, po uzoru na spomenike koje su u čast zahvalnosti mnogim poginulim vojnicima tokom Prvog svetskog rata podignuti u Francuskoj, Sjedinjenim američkim državama, Velikoj Britaniji i drugim državama. Ovaj spomenik predstavlja memorijal žrtvama Balkanskih ratova i Prvog Svet- skog rata. Nalazi se na mestu nekadašnje srednjovekovne tvrđave Žrnov i projektovan je u neoklasičnom stilu u formi grčkog hrama. Direktna inspiracija za izgradnju ovog spome- nika Meštroviću je poslužila grobnica persijskog vladara Kira II u Parsagadu. Grob leži na pet uspravnih blokova granita i okružen je sa 8 karijatida koje nose krov. Karijatide simbo- lizuju majke vojnika iz regija Kraljevine Jugoslavije (Šumadinka, Panonka­vojvođanka, Crnogorka, Kosovka, Dalmatinka, Zagorka, Slovenka i Makedonka) (Ignjatović, 2006). 3.1.6 Brankov most u Beogradu Brankov most (Slika 17) premošćuje reku Savu i spaja centar Beograda sa Novim Beogradom (44º 48΄ 53.15˝ N; 20º 26΄ 51.35˝ E, 67 mnv). Pušten je u saobraćaj 1956. Slika 16. Spomenik Neznanom junaku 39 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine godine, a sagrađen je na ostacima visećeg mosta kralja Aleksandra koji je srušen tokom Drugog svetskog rata, a bio je napravljen po uzoru na viseći most preko Rajne u Kelnu. Kamene površine Brankovog mosta izgrađene su od kamena peščara i datiraju iz 1934. go- dine, kada su predstavljale deo starog Mosta kralja Aleksandra (Buđevac i Stipanić, 1989). 3.1.7 Srednjovekovni kameni stećci u Perućcu Arheološko nalazište Mramorje (Slika 18B) je jedna od najočuvanijih srednjovekov- nih nekropola stećaka i nalazi se u Perućcu kod Bajine Bašte (43º 57΄ 20.90˝ N; 19º 23΄ 39.87˝ E, 698 mnv). Nekropola potiče iz XIV veka. Lokalitet je pod zaštitom Republike kao spomenik kulture od izuzetnog značaja od 1968. godine. U okviru nekropole nalazilo se 200 stećaka, izgrađenih od karbonatnog kamena dužine do 2 m, a širine i visine do 1 m. Prema poslednjim podacima u nekropoli je sačuvano 93 nadgrobna spomenika. Stećci su poređani paralelno i orijentisani istok­zapad (Đorđević, 2011). U selu Rastište (43º 56΄ 02.21˝ N; 19º 20΄ 58.70˝ E, 729 mnv) u blizini jezera Perućac nalazi se arheološko nalazište sa 38 nadgrobnih spomenika (Slika 18A) (Đorđević, 2012). Slika 17. Centralni stub Brankovog mosta – starobeogradska strana 40 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine 3.2 Umetnički predmeti (artefakti) iz muzeja i galerija Izbor umetničkih predmeta za mikološku analizu izvršen je od strane konzervatora Muzeja istorije Jugoslavije, Muzeja grada Beograda, Galerije slika “Sava Šumanović” i Muzeja savremene umetnosti na osnovu opservacije i utvrđenog stepena deterioracije. 3.2.1 Zbirka štafeta i poklona Josipa Broza Tita iz Muzeja istorije Jugoslavije Zbirka se čuva u Muzeju istorije Jugoslavije osnovanom 1956. godine spajanjem memorijalnog centra „Josip Broz Tito“ i muzeja Revolucije naroda i narodnosti Jugosla- vije. Fond Muzeja obuhvata preko 200 000 eksponata koji ilustruju jugoslovensku istoriju tokom 20. veka sa posebnim akcentom na lik i delo Josipa Broza Tita. U muzeju se čuvaju, Slika 18. Srednjovekovni kameni stećci: A. Lokalitet Rastište; B. Lokalitet Mramorje 41 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine pokloni koje je Josip Broz Tito dobio u zemlji i inostranstvu, a osnovno obeležje muzeja je i stalna postavka zbirke štafeta (Slika 19). 3.2.2 Umetnički predmeti iz zbirki Muzeja grada Beograda Muzej grada Beograda je osnovan 1903. godine i sadrži 132 000 registrovanih pred- meta iz različitih perioda istorije grada Beograda. Muzejski eksponati (Slika 20) su priku- pljeni i sistematizovani u tri glavna odeljenja: arheološko, istorijsko i odeljenje za istoriju kulture i umetnosti. Odeljenja su podeljenja na 25 odseka u okviru kojih se nalazi 25 legata. Slika 19. Predmeti iz Zbirke štafeta i poklona Josipa Broza Tita: A. drvena maketa Crkve Hrista Pantokratora Manastira Dečani; B. drvena štafeta; C. umetnička slika „Tito na konju“, ulje na platnu 42 Istraživani objekti i predmeti kulturne baštine 3.2.3 Zbirka slika iz Galerije slika „Sava Šumanović“ u Šidu Galerija slika „Sava Šumanović“ nalazi se u Šidu, gde se čuva preko 400 likovnih dela ovog umetnika. Najveći deo slika rađen je tehnikom ulje na platnu (Slika 21), dok ostala dela čine pasteli, crteži i dokumentacija. Slika 21. Umetnička slika Save Šumanovića, ulje na platnu Slika 20. Predmeti iz depoa Muzeja grada Beograda: A. fotografija starog Beograda, crno­bela tehnika; B. komplet građanske nošnje 43 3.2.4 Zbirke Muzeja Savremene umetnosti u Beogradu Muzej savremene umetnosti u Beogradu prikuplja, čuva, proučava, publikuje i izlaže jugoslovensku i srpsku umetnost od 1900. godine do danas. Fundus muzeja čine: zbirka slika od 1900 do 1945. godine, zbirka slika posle 1945. godine, zbirka skulptura, zbirka grafika i crteža, zbirka novih umetničkih medija. Deo eksponata ovog muzeja (slike, skul- pture, fotografije) skladišten je u trezoru Narodne banke Srbije. Edukativne igračke autora Marka Crnobrnje (Slika 22A) i fotografije „Nebo“ i „Ze- mlja“ (slika 22B) autora Aleksandra Rafajlovića bile su poslate u Istanbul radi učešća na izložbi Beogradsko iskustvo: Oktobarski salon. U skladištu Bursan, na ispostavi istanbul- ske carine u Halkali, desila se poplava nezapamćenih razmera. Skladište je bilo blokirano tokom dve nedelje, nakon čega je ugovoren povratak eksponata u Srbiju. Slika 22. predmeti iz ispitivanih zbirki: A. računaljka, edukativna igračka autora Marka Crnobrnje; B. umetnička fotografija „Zemlja“ autora Aleksandra Rafajlovića 44 Materijal i metode 4 Materijal i metode 4.1 Materijal 4.1.1 Hranljive podloge Za primarnu izolaciju mikromiceta sa uzorkovanih mesta korišćena je hranljiva podloga malt agar (MEA) sa dodatkom antibiotika (streptomicin ili sinacilin). Za dobijanje čistih kul- tura mikromiceta iz primarnih izolata korišćene su podloge MEA i Czapek­ov agar (CZA). Podloga MEA je korišćen i za testiranje antifungalne aktivnisti odabranih etarskih ulja i ben- zalkonijum hlorida metodama mikroatmosfere, makrodilucionom i metodom neutralizacije biocida. Kao hranljivi medijum u mikrodilucionoj metodi korišćen je tečni malt (MEB). Malt agar (MEA) ekstrakt slada . . . 40 g agar . . . . . . 15g destilovana voda . . 1000 ml Agar (15 g) sipati u 1000 ml destilovane vode, zatim zagrevati uz stalno mešanje do rastvaranja. Dodati 40 g ekstrakta slada i doliti do 1000 ml destilovane vode i prokuvati. Kiselost podloge regulisati na 6,5 – 6,8 korišćenjem 1N NaOH (Booth, 1971a). 45 Materijal i metode Za primarne izolacije pre regulisanja pH podloge dodato je 500 mg odabranog antibiotika MEB se priprema kao MEA samo bez dodatka agara (Booth, 1971a). Czapek-ov agar (CZA) NaNO3 . . . . . 3,0 g K2HPO4 . . . . . 1,0 g MgSO 4 × 7H2O . . . 0,5 g KCl . . . . . . 0,5. g FeSO 4 × 7H2O . . . 0,01 g saharoza . . . . . 30,0 g agar . . . . . . 15 g destilovana voda . . 1000 ml U 1000 ml destilovane vode rastvara se jedna po jedna so navedenim redosledom (NaNO3, K2HPO4, MgSO4x7H2O, KCl, FeSO4×7H2O). Naredna so se ne dodaje sve dok se prethodna potpuno ne rastvori. Nakon soli dodati 30 g saharoze i na kraju 15 g agara. Podlogu zagrevati uz stalno mešanje dok se agar potpuno ne rastvori, doliti do 1000 ml destilovanom vodom i prokuvati. Kiselost podloge se reguliše na 6,5 – 6,8 uz pomoć 1N NaOH (Booth, 1971a). Pripremljene hranljive podloge su sterilisane u autoklavu (Raypa) na temperaturi od 114º C pod pritiskom od 0,08 Mpa u trajanju od 25 minuta. 4.1.2 Etarska ulja Testirana je antifungalna aktivnost etarskih ulja četiri aromatične biljke i ispitivan njihov hemijski sastav. Sva ulja predstavljaju komercijalne uzorke dobijene od Instituta za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić” u Beogradu (Tabela 1). 46 Materijal i metode 4.1.3 Sintetički biocid Za ispitivanje antifungalne aktivnosti biocida koji se koriste u konzervaciji odabran je sintetički biocid benzalkonijum hlorid (BAC) (Slika 23). Vodeni rastvor BAC (50%) dobijen je u saradnji sa timom stručnjaka za restauraciju Zavoda za zaštitu spomenika kulture – Beograd. 4.1.4 Izolati Za ispitivanje antifungalne aktivnosti odabranih etarskih ulja i sintetičkog biocida BAC korišćeni su sledeći izolati mikromiceta: Aspergillus fumigatus Fresen., Aspergillus Tabela 1: Ispitivana etarska ulja Aromatična biljka Familija Šifra Rosmarinus officinalis L. (ruzmarin) Lamiaceae (Herba) impr 107 / 2002 Lavandula angustifolia Miller (lavanda) Lamiaceae Frey Lav Origanum vulgare L. (origano) Lamiaceae (Po 125 062) Frey Lav Helichrysum italicum (Roth) G. Don (smilje) Asteraceae Herba Slika 23. Benzalkonijum hlorid, strukturna formula 47 Materijal i metode niger Tiegh, Aspergillus ochraceus G. Wilh., Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab., Bipola- ris spicifera (Bainier) Subram, Emericella nidulans (Eidam) Vuill., Epicoccum purpuras- cens Ehrenb, Penicillium sp. 1, Penicillium sp. 2. i Trichoderma viride Pers. Sve mikro- micete na kojima je ispitivana antifungalna aktivnost izolovane su sa objekata kulturne baštine i sa umetničkih predmeta. 4.2. Metode 4.2.1 Uzorkovanje mikromiceta Uzorkovanje mikromiceta sa čvrstih supstrata Vijabilne propagule gljiva prisutne na površini spomenika kulture i umetničkih pred- meta uzorkovane su sterilnim brisevima. U aseptičnim uslovima u bris je dodat 1 ml steril- nog fiziološkog rastvora i sadržaj je homogenizovan vorteksom. Inokulacija je izvršena na MEA sa dodatkom antibiotika i Petri kutije inkubirane u termostatu na 25º C u trajanju 5 do 7 dana. Nakon razvoja primarnih izolata, morfološki različite kolonije su reinokulisane na podlogu MEA u cilju dobijanja čistih kultura za identifikaciju. Uzorkovanje mikromiceta iz vazduha Metodom pasivne sedimentacije izvršena je analiza kontaminacije vazduha vijabil- nim propagulama gljiva u zatvorenim prostorijama izložbenih prostora i depoa muzeja. Veći broj otvorenih Petri kutija sa MEA sa antibiotikom je izloženo, na visini od 1 m iznad poda, u trajanju od 30 minuta. Nakon 7 do 15 dana inkubacije u termostatu na temperaturi od 25ºC brojane su kolonije gljiva. Procena brojnosti spora gljiva u vazduhu izrčunata je po formuli (Omelyansky, 1940): 48 Materijal i metode N = 5a × 104(bt)-1 N – broj CFU/m3 vazduha a – broj formiranih kolonija po Petri kutiji, b – površina Petri kutije u cm2 t – vreme koliko je Petri kutija bila otvorena. Relativna gustina mikromiceta u vazduhu zatvorenih prostorija, izražena u procenti- ma, računata je po formuli (Smith, 1980): Relativna gustina = (broj kolonija određene vrste ili roda/ukupan broj kolonija) × 100 4.2.2 Uzorkovanje cijanobakterija i algi Uzorci cijanobakterija i algi izeti su površinski sa kamenog supstrata kulturno­isto- rijskih spomenika. Uzorci su uzimani sa mesta sa simptomima diskolorizacije usled pri- sustva biopatine. Za uzorkavanje sa mesta sa očiglednim porastom biofilma korišćena je metoda adhezivne trake (Gaylarde i Gaylarde 1998; Urzì i Leo de, 2001). 4.2.3 Identifikacija mikromiceta Identifikacija dobijenih izolata izvršena je na osnovu makroskopskih karakteristika kolonija i mikroskopskih karakteristika reproduktivnih struktura monosporičnih kultura. Rezultati su dokumentovani originalnim fotografijama. Za svetlosnu mikroskopiju kori- šćen je mikroskop Zeiss Axio Imager M.1, sa softverom AxioVision Release 4.6. Za iden- tifikaciju izolovanih mikromiceta korišćeni su dostupni ključevi: Raper i Fennel (1965), Rifai (1969), Booth (1971b), Ellis (1971, 1976), Ainsworth i dr. (1973), Arx von (1974), Ellis i Ellis (1997), Pitt (1979), Sutton (1980), Watanabe (2002) i Samson i dr. (2004). 49 Materijal i metode 4.2.4 Identifikacija cijanobakterija i algi Preparati cijanobakterija i algi pravljeni su u glicerinu i posmatrani pod svetlosnim mikroskopom Zeiss Axio Imager M.1, sa softverom AxioVision Release 4.6. Identifika- cija cijanobakterija i algi izvršena je uz pomoć ključeva: Elliot (1934), Starmach (1972), Komarek i Fott (1983), Laundon (1985), Krammer i Lange­Bertalot (1988), Komarek i Anagnostidis (1998; 2005), Lange­Bertalot (2001), Lenzenweger (2003). 4.2.5 Analiza hemijskog sastava etarskih ulja Određivanje hemijskog sastava etarskih ulja urađeno je u Institutu za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić”. Kvantitativna i kvalitativna analiza dobijenih etarskih ulja izvršena je kombinacijom metoda gasne hromatografije (GC) i gasne hromatografije sa spektrometrijom masa (GC/MS). Analiza etarskog ulja vršena je korišćenjem plameno­jonizujućeg (FID) i mase- no­spektrometrijskog detektora (MSD). GS analiza je urađena na gasnohromatografskom aparatu HP­5890 series II koji je opremljen split­splitless injektorom, HP­5­srednje po- larnom kolonom (25 m × 0.32 mm) i povezan sa plameno­jonizujućim detektorom (FID). Protok nosećeg gasa (H2) je 1ml min-1. Rastvor etarskog ulja u etanolu injektovan je u split modu (1:30), temperatura injektora je bila 250 °C, detektora 300°C, dok je temperatura kolone povećavana programirano od 40­280°C, po 4°C/min. Za GC­MSD, korišćen je HP G1800 C serije, II GCD opremljen sa HP­5MS kolonom (30 m × 0,25 mm). Transfer linija je zagrejana na 280°C. EIMS spektri su snimani na 70 eV u opsegu m/z 40­300. Identifikacija jedinjenja izvršena je poređenjem njihovih retencionih vremena sa retencionim vremenom referentnih terpenoida, metodom koinjektiranja, poređenjem masenih spektara (za šta je ko- rišćena biblioteka masenih spektara (Wiley 275. L)) i na osnovu retencionih indeksa dobi- jenih korišćenjem kalibrisanog AMDIS programa u odnosu na literaturne podatke (Adams, 2007). Kvantifikacija je izvršena metodom normalizacije površina ispod GC pikova. 50 Materijal i metode 4.2.6 In vitro testovi za određivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja i biocida benzalkonijum hlorida Metoda mikroatmosfere Za ispitivanje uticaja etarskih ulja na rast micelije odabranih izolata korišćen je me- toda mikroatmosfere (Singh i dr., 2006). Inokulacija test mikromiceta izvršena je na pod- logu MEA iz 7 dana starih monosporičnih kultura. Inokulisane Petri kutije sa hranljivom podlogom su okrenute sa poklopcem na dole i na sredinu unutrašnje strane poklopca po- stavljen je sterilni filter disk Ø 1cm. Na filter papir mikropipetom nanete su odgovarajuće zapremine testiranih etarskih ulja. Za etarska ulja R.officinalis, L. angustifolia i H. italicum ispitivana je antifungalna aktivnost u opsegu koncentracija od 10 do 100 μl ml-1, dok je za etarsko ulje O. vulgare korišćen opseg koncentracija od 0,1 do 2,0 μl ml-1. Inokulisane podloge su inkubirane na 25ºC. Dinamika rasta micelije praćena je svakih 7 dana mere- njem prečnika kolonije tokom tri nedelje. Inhibicija rasta micelije izražena u procentima određena je formulom (Pandey i dr., 1982): % inhibicije = 100 (dk – dt) / dt , dk – dijametar kontrolne kulture dt – dijametar kolonije koja je rasla u uslovima aromatične atmosfere. Najniža koncentracije ulja koja 100% inhibira rast micelije, u korišćenom opsegu koncentracija, je minimalna inhibitorna koncentracija (MIC). Ukoliko nakon reinokula- cije inokuluma na MEA, nije zabeležen rast micelije dobijena je minimalna fungicidna koncentracija (MFC). Makrodiluciona metoda Makrodiluciona metoda je korišćena za ispitivanje uticaja biocida BAC na rast mi- celije odabranih izolata (Ishi, 1995). Za razliku od metode mikroatmosfere biocid je do- dat direktno u zagrejanu hranljivu podlogu (40ºC) razlivenu u Petri kutije. Ispitivan je 51 Materijal i metode antifungalni potencijal biocida u rasponu koncentracija od 0.1 do 5.0 μl ml-1. Inhibicija rasta micelije, kao i MIC i MFC vrednosti određivane su na isti način kao u metodi mi- kroatmosfere. Mikrodiluciona metoda Mikrodilucionom metodom ispitivan je uticaj etarskih ulja i biocida BAC na germi- naciju spora odabranih izolata (Hanel i Raether, 1998). Inokulum je pripremljen spiranjem spore sa površine 21 dana starih kulture na kosom MEA sterilnim fiziološkim rastvorom koji sa dodatkom 0.1% Tween 20. Suspenzija spora je dovedena do konačne koncentracije 1,0 × 105 CFU ml-1 pomoću hemocitometra. Tako pripremljen inokulum čuvan je na ­20ºC do upotrebe. Provera validnosti inokuluma i odsustva kontaminacije vršena je inokulaci- jom suspenzije spora na podlogu MEA pre upotrebe. Određene zapremine etarskih ulja ili biocida BAC dodavana je u „bunarčiće“ mikrotititracionuh ploča u koje je prethodno dodat MEB sa suspenzijom spora. Za etarska ulja R. officinalis, L. angustifolia i H. itali- cum antifungalna aktivnost je ispitivana u opsegu koncentracija ulja od 10 do 100 μl ml-1, za etarsko ulje O. vulgare korišćen je opseg koncentracija od 0,1 do 2,0 μl ml-1, dok je za biocid BAC korišćen opseg od 0,1 do 5,0 μl ml-1. Izvršene su dve varijante eksperimenta. U prvom slučaju mikrotitracione ploče su in- kubirane na 28ºC u trajanju od 24h. Germinacija konidija je zaustavljana dodavanjem stan- dardne mikološke boje Lactofenol cotton blue. Na mikroskopsku pločicu je naneto, mikro- pipetom, 8 μl sadržaja svakog „bunarčića”. Preparati su posmatrani pod svetlosnim mikro- skopom i brojane klijale i neklijale konidije. Za izolate koji se odlikuju sitnim globoznim ili subgloboznim konidijama, konidije su smatrane klijalim ako je dužina klijajuće cevčiće bila jednaka ili veća od dijametra konidije. Za vrste koje se odlikuju krupnim porokonidija- ma, konidija je smatrana klijalom ako je klijajuća cevčica bila jednaka polovini dužine po- rokonidije ili veća. Poređenjem broja klijalih i neklijalih konidija određene su inhibitorne doze (ID). ID 50 vrednost predstavlja onu koncentraciju antifungalnog agensa gde je uočen približno jednak broj klijalih i neklijalih konidija. ID 95 vrednost predstavlja koncentraciju 52 Materijal i metode antifungalnog agensa gde preovlađaju neklijale konidije, i njihov broj se procentualno kre- će od 90 do 100%. U drugom slučaju mikrotitrcione ploče su inkubirane na 28ºC u trajanju 72h. Rast hifa i formiranje micelije u „bunarčićima“ posmatran je pod lupom. Najmanja koncentracija ispitivanog antifungalnog agensa gde nije detektovan rast hifa uzimana je za MIC vrednost. MFC je određivan reinokulacijom sadržaja „bunarčića“ gde je zabeležena inhibicije rasta na podlogu MEA. Najniža koncentracija antifungalnog agensa na kome nije došlo do obrazovanja kolonije nakon reinokulacije smatrana je MFC vrednošću. Metod neutralizacije biocida Metodom neutralizacije testiran je uticaj kontaktnog vremena na antifungalni poten- cijal niskih koncentracija biocida BAC (Tortorano i dr., 2005) Inokulum je pripremljen spiranjem spora sa površine 7 dana starih kultura na kosom MEA sterilnim fiziološkim rastvorom sa dodatkom 0,1% Tween 20. Suspenzija spora je dovedena do konačne kon- centracije 1,5 × 107 CFU ml-1 pomoću hemocitometra. 1 ml pripremljene suspenzije spora je dodat u vodeni rastvor BAC određene koncentracije i dopunjen do 10 ml sterilnom destilovanom vodom. Testirane koncentracije biocida iznosile su: 0,25 %, 0,15% i 0,05%. Biocidna aktivnost BAC je određivana za 4 kontaktna vremena (5, 15, 30 i 60 min). Na kraju svakog kontaktnog vremena, 1 ml testirane suspenzije i 1ml sterilne destilovane vode su dodati u 8 ml prethodno pripremljenog neutrališućeg rastvora (3% Tween 20, 0,3% lecitin, 0,1% histidin i 3% saponin). Nakon neutralizacije u trajanju od 5 minuta, 1 ml neutrališućeg rastvora je inokulisan na podlogu MEA, u duplikatu. Inokulisane Petri kutije su inkubirane na 24ºC u trajanju od 48h. Redukcija vijabilnosti konidija za dato kontaktno vreme izračunava se kao: odnos N × 10-1/ Na. Na – srednja vrednost broja kolonija na obe Petri kutije pomnožene sa faktorom raz- blaženja 102. Početna suspenzija konidija je razblažena do konačnih koncentracija 1,5 × 102 CFU ml-1 i 1,5 – 5 × 101 CFU ml-1 i po 1 ml obe suspenzije se u duplikatu inokulisane na MEA. 53 Materijal i metode Inokulisane Petri kutije se inkubiraju na 24º C u trajanju od 48h. Broj CFU po ml (N) određuje se pomoću formule: N = c/(n1 + 0.1n2) x d , c­ zbir svih kolonija formiranih na sve četiri Petri kutije n1, n2 – broj Petri kutija prvog i drugog razblaženja d­ faktor razblaženja u poređenju sa prvim rastvorom 4.2.7 Statistička obrada rezultata Sva merenja tokom eksperimenata metode mikroatmosfere, makrodilucione, i mi- krodilucione metode su vršena u najmanje tri ponavljana radi statističke obrade rezultata u programu Microsoft Excel 2003. Svi rezultati su prikazani kao srednja vrednost više merenja ± standardna greška. Statistički test One way ANOVA je korišćen za statističku obrada rezultata dobijenih u in vitro testovima za ispitivanje antifungalne aktivnosti etar- skih ulja i biocida BAC, na nivou značajnosti p<0,05. 54 Rezultati i diskusija 5 Rezultati i diskusija 5.1 Biofilm na kamenom suspstratu kulturno­istorijskih spomenika u Srbiji Analiza biofilma u ovom istraživanju obuhvatila je kulturno­istorijske spomenike: Crkvu Svete Bogorodice manastira Gradac (MG), Ajfelovu Prevodnicu na ušću Velikog bačkog kanala u Tisu (AP), Spomenik Neznanom junaku na Avali (NJ), Brankov most u Beogradu (BM) i srednjovekovne kamene stećke na lokalitetima Mramorje i Rastište kod Bajine Bašte (SS). Uzorkovanje je izvršeno sa više tipova kamenog supstrata, sa karbo- natnog kamena na lokalitetima MG i SS, sa mermera na lokalitetu MG, sa kamena peščara na lokalitetima AP i BM i sa granita na lokalitetu NJ. 5.1.1 Analiza biofilma na fasadi Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac Opservacija in situ i simptomi Opservacijom in situ konstatovana je biodeterioracija visokog stepena na pojedinim delovima fasade. Uočeni su brojni epilitski lišajevi uglavnom krustoznog tipa (Slika 24C), mahovine i paprati (Slika 24E), a na pojedinim mestima i biljke cvetnice (Slika 24F) što ukazuje na dugogodišnju sukcesiju. Uzorci biofilma su uzeti sa mesta promenjene teksture 55 Rezultati i diskusija površine karbonatnog kamena i simptomima biopatine na velikim površinama (Slika 24A i B). Biopatina se manifestovala u vidu prevlaka različite obojenosti, teksture i forme. Domi- nantna biopatina na fasadnim zidovima je bila tamno crvena, crna i zelenkasta (Slika 24C i D). Sastav zajednice biofilma Sa 7 uzorkovanih mesta sa vidljivim simptomima biodeterioracije identifikovano je 9 taksona gljiva, dva taksona cijanobakterija i dva taksona algi (Tabela 2). Najveći broj taksona gljiva pripada klasi Hyphomycetes podrazdela Deuteromy- cotina (8), dok je Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel jedini pripadnik klase Blastomycetes. Dominiraju predstavnici grupe Dematiaceae sa 6 izolata, uključujući i neidentifikovani izolat označen kao Mycelia sterilia (Tabela 2). Slika 24. Simptomi biodeterioracije fasade Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac: A. biopatina na fasadi i ulaznim vratima crkve; B. promene u teksturi i pukotine na fasadi; C. crna biopatina na mermernom stubu; D. crveno obojena biopatina na oštećenoj površini maltera; E. mahovine i paprati na oštećenoj površini kamena; F. biljke cvetnice u pukotinama devastiranog stuba 56 Rezultati i diskusija Ši fr a uz or ka Si m pt om i M ik ro m ice te C ija no ba kt er ije i al ge M G 1 ­ t am no c rv en a bi op at in a u ud ub lje nj u u zi du G lo eo ca ps a s an gu in ea (C .A ga rd h) K üt zi ng D es m oc oc cu s o liv ac eu s ( Pe rs . e x A ch ar .) J.R .L au nd on C is te n ei de nt ifi ko va ne z el en e al ge M G 2 ­ c rn a bi op at in a ­v as ku la rn e bi ljk e u pu ko tin am a Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b M G 3 ­ s iv o– br ao n bi op at in a ­ p uk ot in e i l ez ije Al te rn ar ia N ee s s pp . Pe ni cil liu m Li nk sp p. M G 4 ­ z el en ka st o­ na ra nd ža st a bi op at in a ­ m ah ov in e Al te rn ar ia a lte rn at a (F r.) K ei ss l. Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b Pe ni cil liu m Li nk sp p. M yc el ia st er ili a (m el an iz ov an a) Tr en tep oh lia au re a ( Li nn ae us ) C .F . P . M ar tiu s M G 5 ­ z el en ka st o­ na ra nd ža st a bi op at in a Al te rn ar ia N ee s s pp . Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b Ni gr os po ra sp ha er ica . ( Sa cc .) M as on M yc el ia st er ili a (m el an iz ov an a) G lo eo ca ps a vi ol ac ea (C or da ) R ab en ho rs t Tr en tep oh lia au re a ( Li nn ae us ) C .F . P . M ar tiu s M G 6 ­ z el en o­ br ao n bi op at in a; ­ m ah ov in e i k ru pn i f ol io zn i i k ru st oz ni li ša je vi Al te rn ar ia a lte rn at a (F r.) K ei ss l. Au re ob as id iu m p ul lu la ns (d e B ar y) G . A rn au d Cl ad os po riu m cla do sp or io id es (F re se n. ) G .A . d e V rie s Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b Fu sa riu m Li nk sp p. Sp or ob ol om yc es ro se us K lu yv er & C .B . N ie l M yc el ia st er ili a (m el an iz ov an a) D es m oc oc cu s o liv ac eu s ( Pe rs .e x A ch ar .) J.R .L au nd on G lo eo ca ps a vi ol as ce a (C or da ) R ab en ho rs t Tr en tep oh lia au re a ( Li nn ae us ) C .F . P . M ar tiu s M G 7 ­ c rn a bi op at in a na m er m er no m st ub u ­ k ru st oz ni i sk va m ul oz ni e pi liz sk i l iš aj ev i ­ b io pi tti ng Al te rn ar ia a lte rn at a (F r.) K ei ss l. Au re ob as id iu m p ul lu la ns (d e B ar y) G . A rn au d Cl ad os po riu m cla do sp or io id es (F re se n. ) G .A . d e V rie s Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b Sp or ob ol om yc es ro se us K lu yv er & C .B . N ie l M yc el ia st er ili a (m el an iz ov an a) Ta be la 2 . M ik ro m ic et e, c ija no ba kt er ije i al ge u b io fil m u na fa sa di C rk ve S ve te B og or od ic e m an as tir a G ra da c (M G ) 57 Rezultati i diskusija Iz grupe cijanobakterija identifikovani su kokalni pripadnici reda Chroococcales, Gloeocapsa sanguinea (C.Agardh) Kützing i G. violacea (Corda) Rabenhorst, dok su identifikovane alge iz razdela Chlorophyta i to kokalna vrsta Desmococcus olivaceus (Pers.ex Achar.) J.R. Laundon (Prasiolales,Trebouxiophyceae) i trihalna Trentepohlia au- rea (Linnaeus) C.F.P. Martius (Trentepohliales, Ulvophyceae) (Tabela 2). U uzorcima uzetim metodom adhezivne trake sa mesta sa simptomima tamno crvene biopatine kao dominantna vrsta identifikovana je svetlosnom mikroskopijom G. sanguinea (Slika 25A). Analizom fragmenta SAB uočavaju se kolonije sa debelim crveno obojenim galertnim omotačima, koje su gusto pakovane zajedno sa agregatima ćelija D. olivaceus Slika 25. Cijanobakterije i alge u biofilmu na fasadi Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac: A. kolonija Gloeocapsa sanguinea; B. kolonije Gloeocapsa violacea; C. agregati ćelija Desmococcus olivaceus sa neorganskim sadržajem; d. trihomi Trentepohlia aurea 58 Rezultati i diskusija (Slika 25C) čineći kompaktan sloj biofilma. Na mestima sa narandžasto­zelenom biopati- nom konstatovana je dominacija trihalne, zelene alge T. aurea (Slika 25D). U uzorku biofil- ma trihomi T. aurea sa kolonijama G. violacea (Slika 25B) i gusto pakovanim agregatima D. olivaceus formiraju sloj narandžasto­zelene biopatine na fasadi u vidu somotaste prevlake. Nakon perioda inkubacije uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa dobijeni su primarni izolati (mešovite kulture) filamentoznih gljiva i kvasaca (Slika 26). U skoro svim uzorcima bile su dominantne vrste iz familije Dematiaceae: E. purpurascens (Slika 26A), A. pullulans, C. cladosporioides, Alternaria spp. i N. sphaerica kao i kvasci i aktinomicete (Slika 26C i D). U uzorku MG3 Penicillium spp. je bio zastupljen sa velikim brojem kolonija (Slika 26B). Slika 26. Primarni izolati filamentoznih gljiva i kvasaca (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa fasade Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac: A. Epicoccum purpurascens, monosporična kultura (MG2); B. Penicillium spp., kolonije u masi (MG3); C. kolonije dominantnih predstavnika Dematiaceae (MG6); D. dominantne kolonije kvasaca i aktinomiceta (MG7) 59 Rezultati i diskusija 5.1.2 Analiza biofilma sa Ajfelove prevodnice Opservacija in situ i simptomi Opservacijom in situ konstatovana je biodeterioracija visokog stepena na pojedinim de- lovima Ajfelove prevodnice, kao što su izmenjen izgled površine kamena i prisustvo zelene i crne biopatine na velikim površinama (Slika 27A, B i D). Uočeni su i brojni epilitski lišajevi krustoznog tipa (Slika 27C). Talusi pojedinih lišaja dostižu i nekoliko desetina centimetara i pokrivaju veliku površinu kamenog supstrata. Uzorci biofilma su uzeti na mestima izmenjenog izgleda sa promenama u teksturi površine kamena i simptomima biopatine na velikim površinama. Slika 27. Simptomi biodeterioracije kamena peščara Ajfelove prevodnice: A. velike površine prekrivene crnom i zelenom biopatinom; B. izmenjena tekstura kamena sa biofilmom; C. izmenjena tekstura kamena sa krustoznim lišajevima; D. biopatina u vidu crne želatinozne prevlake 60 Rezultati i diskusija Sastav zajednice biofilma Sa 8 uzorkovanih mesta kamenog supstrata Ajfelove prevodnice identifikovano je 13 taksona gljiva, četiri taksona cijanobakterija i dva taksona algi (Tabela 3). Najveći broj identifikovanih gljiva (12 taksona) pripada klasi Hyphomycetes (De- uteromycotina) dok je samo Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. iz klase Zygomycetes (Zygomycotina). Izolati su identifikovani do nivoa roda ili vrste, dok su izolati koji u kulturama nisu formirali reproduktivne strukture označeni kao M. sterilia (Tabela 3). Četiri identifikovana taksona cijanobakterija nalaze se na trihalnom stupnju mor- fološke organizacije. Leptolyngbya sp. i Microcoleus vaginatus (Vaucher) Gomont ex Gomont pripadnici su reda Oscillatoriales, dok su Nostoc sp. i Stigonema ocellatum (Di- llwyn) Thuret ex Bornet & Flauhault pripadnici reda Nostocales. Razdeo Chlorophyta je zastupljen sa 2 taksona: jednoćelijskom algom Haemato- coccus sp. (Chlamydomonadales, Chlorophyceae) i agregatima ćelija vrste Desmococcus olivaceus (Prasiolales, Trebouxiophyceae) (Tabela 3). U uzorcima sa mesta izrazito katranaste biopatine, čvrste želatinozne konzistencije, uočene su direktnim posmatranjem na svetlosnom mikroskopu domininantne loptaste kolo- nije filamentozne cijanobakterije Nostoc sp. (Slika 28An i B). Filamenti ove vrste su gusto isprepletani sa drugim fototrofnim komponentama SAB: filamenti Leptolyngbia sp. (Slika 28 Al i C), ciste Haematococcus sp. (Slika 28 Ah i D) i filamenti M. vaginatus (Slika 28D). Posmatranjem fragmenta kamena pod binokularnim mikroskopom identifikovan je krustozni lišaj Caloplaca sp. Na površini kamenog supstrata su prisutne narandžaste apo- tecije (Slika 29A), dok je na uzdužnom preseku kamena uočeno prodiranje hifa u dublje slojeve poroznog kamena. Fotobiont ove vrste čini zelena alga Trebouxia sp. (Slika 29B), dok je mikobiont gljiva iz klase Discomycetes, Ascomycotina. Primarni izolati filamentoznih gljiva i kvasaca (mešovite kulture) na MEA sa antibio- tikom uzeti metodom sterilnog brisa (Slika 30). Od 13 identifikovanih taksona gljiva vrsta Acremonium strictum W. Gams sa porastom u vidu belih spororastućih kolonija je bila prisutna i dominantna u svim uzorcima (Slika 30A­D). U nekim uzorcima broj kolonija A. strictum po 61 Rezultati i diskusija Ši fra u zo rk a Si m pt om i M ikr om ice te Ci jan ob ak ter ije i a lge AP 1 - e ks fo lij ac ija ka me na Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s Pe nic ill ium ex pa ns um L ink Rh izo pu s s to lo ni fe r ( Eh re nb .) Vu ill A P2 . ­ t am na b io pa tin a Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s Al te rn ar ia a lte rn at a (F r.) K ei ss l. Al te rn ar ia N ee s s p. Au re ob as id iu m p ul lu la ns (d e Ba ry ) G . A rn au d Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s No sto c V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t s p. Le pto lyn gb ya A na gn os tid is & K om ár ek sp . Ha em ato co cc us F lo to w sp . D es m oc oc cu s o liv ac eu s ( Pe rs oo n ex A ch ar iu s) J. R. La un do n Sti go ne ma oc ell atu m (D ill w yn ) T hu re t e x Bo rn et & F la ha ul t AP 3 ­ t am na b io pa tin a Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s Ep icc oc um pu rp ur as ce ns E hr en b Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s D re ch sle ra d em at oi de a (B ub ák & W ró bl .) Sc ha rif M yc el ia st er ili a (m el an iz ov an a) A P4 ­ e ks fo lij ac ija sa ta m no m p ig m en ta ci jo m Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s D re ch sle ra d em at oi de a (B ub ák & W ró bl .) Sc ha rif Ep icc oc um pu rp ur as ce ns E hr en b Pe nic ill ium ex pa ns um L ink A P5 ­ c rn a že la tin oz na b io pa tin a Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s Al te rn ar ia N ee s s p. As pe rg ill us te rr eu s T ho m Sc op ula rio ps is br ev ica uli s ( Sa cc .) Ba in ie r No sto c V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t s p. Le pto lyn gb ya A na gn os tid is & K om ár ek sp . Ha em ato co cc us sp . F lo to w A P6 - k ru sto zn i li ša ji Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s Al te rn ar ia sp p. N ee s Bi po lar is sp ici fer a ( Ba in ie r) Su br am Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s Ep icc oc um pu rp ur as ce ns E hr en b Fu sa riu m sp p. L in k No sto c V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t s p. Le pto lyn gb ya A na gn os tid is & K om ár ek sp . Ha em ato co cc us F lo to w sp . A P7 ­ z el en ka sta b io pa tin a Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s D re ch sle ra d em at oi de a (B ub ák & W ró bl .) Sc ha rif Pe nic ill ium ex pa ns um L ink No sto c V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t s p. Le pto lyn gb ya A na gn os tid is & K om ár ek sp . Ha em ato co cc us F lo to w sp . M ic ro co le us v ag in at us (V au ch er ) G om on t e x G om on t AP 8 ­ ek sf ol ija ci ja sa ta m no m p ig m en ta ci jo m Ac re m on iu m st ric tu m W . G am s Al te rn ar ia N ee s s p. Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s M yc el ia st er ili a Ta be la 3 . M ik ro m ic et e, c ija no ba kt er ije i al ge u b io fil m u na A jfe lo vo j P re vo dn ic i n a uš ću B ač ko g ka na la u T is u 62 Rezultati i diskusija Slika 28. Cijanobaterije i alge u biofilmu Ajfelove prevodnice: A. filamenti Nostoc sp. (n) i Leptolynbya sp. (l) sa cistama Haematococcus sp. (h); B. kolonija Nostoc sp.; C. ciste Haematococcus sp.; D. isprepletani filamenti Microcoleus vaginatus u zajedničkoj sari Slika 29. Caloplaca sp.: A. krustozni talus sa apotecijama; B. fotobiont Trebouxia sp. 63 Rezultati i diskusija Petri kutiji (CFU) iznosio je više od 500 (Slika 30C). Na uzorkovanom mestu AP7 dominirala je vrsta Penicillium expansum Link sa CFU vrednošću preko 300 kolonija po Petri kutiji (Slika 30B). U skoro svim uzorcima zabeležene su morfološki različite kolonije braon i crne boje vrste rodova: Alternaria, Bipolaris, Cladosporium, Drechslera i Epiccocum (Slika 30A­D). 5.1.3 Analiza biofilma sa Spomenika Neznanom junaku na Avali Opservacija in situ i simptomi Opservacijom in situ konstatovana je biodeterioracija na pojedinim delovima gra- nitnog supstrata na Spomeniku Neznanom junaku na Avali. Uzorci biofilma su uzeti na Slika 30. Primarni izolati filamentoznih gljiva (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa kamena peščara Ajfelove prevodnice: A. kolonije sa dominacijom predstavnika Dematiaceae (AP6); B. kolonije sa dominacijom Penicillium expansum (AP7); C. kolonije sa dominacijom Acremonium strictum (AP3); D. kolonije sa dominacijom Acremonium strictum i predstavnicima Dematiacea (AP2) 64 Rezultati i diskusija mestima izmenjenog izgleda, sa promenama u teksturi površine kamena i simptomima biopatine na velikim površinama, ali i sa površina na kojima nije bilo simptoma deterio- racije. Najupečatljivija promena u izgledu površine granita bila je eksfolijacija (ljuspanje) sa suvim, belim prevlakama (Slika 31A i B), a biopatina na ovom spomeniku se manife- stovala u vidu narandžastih i zelenih prevlaka u pukotinama i spojnicama između granitnih ploča (Slika 31C i D). Sastav zajednice biofilma Sa ukupno 11 uzorkovanih mesta sa granitnog supstrata i vezivnog maltera u pukoti- nama i spojnicama granita identifikovano je 11 taksona gljiva, jedan takson cijanobakterija i pet taksona algi (Tabela 4). Najveći broj taksona gljiva (9) pripada klasi Hyphomycetes, Deuteromycotina, dok je 2 taksona iz klase Zygomycetes, Zygomycotina. Izolati koji u datim uslovima kultivacije nisu formirali reproduktivne strukture označeni su kao M. sterilia (Tabela 4). Slika 31. Simptomi deterioracije granitnog Spomenika Neznanom junaku na Avali: A. izmenjena tekstura površine granita sa depozitom soli; B. eksfolijacija granita sa depozitom soli; C. narandžasta biopatina u pukotini spomenika; D. zelena biopatina u spojnici granitnih ploča 65 Rezultati i diskusija Identifikovana cijanobakterija je vrsta roda Oscillatoria, pripadnik reda Oscillatoria- les, na trihalnom stupnju morfološke organizacije. Iz razdela Chlorophyta identifikova- na su 5 pripadnika: Cylindrocapsa sp. (Chlorococcales, Chlorophyceae), Cylindrocystis brebissonii (Ralfs) de Bary (Zygnematales, Zygnematophyceae), Microspora sp. (Mi- crosporales, Chlorophyceae) i Haematococcus pluvialis Flottow (Chlamydomonadales, Chlorophyceae). Razdeo Bacillariophyta je zastupljen samo sa vrstom Navicula veneta Kützing (Naviculales, Bacillaryophyceae) (Tabela 4). Ši fra u zo rk a Si m pt om i M ik ro mi ce te Ci ja no ba kt er ije i al ge NJ 1 ­ p od kl ob uč en je i ek sfo lija cij a M yc eli a ste ril ia (m ela ni zo va na ) N av icu la ve ne ta Kü tzi ng NJ 2 ­ b ez v id lji vi h sim to m a Al ter na ria N ee s s pp . Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G. A. d e V rie s Cl ad os po riu m sp ha ero sp erm um Pe nz . Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b M yc eli a ste ril ia NJ 3 ­ b ez v id lji vi h sim to m a Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en ) G .A . d e V rie s NJ 4 ­ t am na b io pa tin a Al ter na ria N ee s s p. M uc or P. M ich eli ex L .sp . Fu sa riu m Li nk sp . NJ 5 ­ b ez v id lji vi h sim to m a Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G. A. d e V rie s Dr ec hs ler a de ma to id ea (B ub ák & W ró bl .) Sc ha rif NJ 6 ­ t am na b io pa tin a Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G. A. d e V rie s Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b M yc eli a ste ril ia NJ 7 ­ b ez v id lji vi h sim to m a Al ter na ria N ee s s pp . Cl ad os po riu m sp ha ero sp erm um P en z. Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b kv asc i N av icu la ve ne ta Kü tzi ng NJ 8 ­ z ele na b io pa tin a n a ve ziv no m m alt er u) Al ter na ria N ee s s p. Cu nn ing ha me lla ec hin ula ta (T ha xt .) Th ax t Fu sa riu m sp . L in k M uc or P. M ich eli ex L . S p. M yc eli a ste ril ia (m ela ni zo va na ) Os cil lat or ia Va uc he r e x Go m on t s p. NJ 9 ­ ze len a b io pa tin a n a ve ziv no m ma lte ru Al ter na ria N es s s p. As pe rg ill us fl av us Li nk As pe rg ill us ve rs ico lo r ( Vu ill .) Ti ra b. Os cil lat or ia Va uc he r e x Go m on t s p. Cy lin dro ca ps a R ein sc h sp . Cy lin dro cis tis br eb iss on ii ( Ra lfs ) d e B ar y M icr os po ra T hu re t s p. NJ 10 ­ be z v id lji vi h sim to m a As pe rg ill us ve rs ico lo r ( Vu ill .) Ti ra b. Cl ad os po riu m sp ha ero sp erm um P en z. NJ 11 ­ c rv en o­ na ra nd ža sta bi op ati na u p uk ot in i izm eđ u gr an itn ih p lo ča Cu nn ing ha me lla ec hin ula ta (T ha xt .) Th ax t M uc or P. M ich eli ex L sp . M yc eli a ste ril ia (m ela ni zo va na ) Ha em ato co cc us pl uv ial is Flo tow Ta be la 4 . M ik ro m ic et e, c ija no ba kt er ije i al ge u b io fil m u na S po m en ik u N ez na no g ju na ka n a A va li 66 Rezultati i diskusija Kao dominantna vrsta, identifikovana direktnim posmatranjem svetlosnim mikro- skopom, u uzorcima sa mesta sa simptomima narandžaste biopatine bila je zelena alga H. pluvialis (Slika 32C). U uzorcima sa simptomima zelene biopatine na vezivnom malteru kao dominantne vrste su identifikovane cijanobakterija Oscillatoria sp. (Slika 32D), i zelena alga C. brebissonii (Slika 32B), koje se gusto prepliću formirajući kompaktan sloj biofilma (Slika 32A). Komponentu SAB čine hife, hlamidospore i konidije gljiva gusto ispreletane sa ćelijama cijanobakterija i zelenih algi, formirajući kompaktan sloj. Nakon 7 dana inkubacije Petri kutija (MEA sa antibiotikom) inokulisanih brisevima razvile su se filamentozne gljiva i kvasci (Slika 33A­D). Identifikacija mikromiceta poka- zala je dominaciju vrsta iz familije Dematiaceae koje su bile prisutne na svim uzorkova- nim mestima (Alternaria spp., Cladosporium sp., Epicoccum sp.) (Slika 33 A). Pripadnici Slika 32. Cijanobakterije i alge u biofilmu na površini Spomenika Neznanom junaku na Avali: A. isprepletani trihomi zelene alge i cijanobakterije; B. trihom Cylindrocistis brebissonii; C. ciste Haematococcus pluvialis; D. trihomi Oscillatoria sp. 67 Rezultati i diskusija Zygomycotina, Cunninghamella echinulata (Thaxt.) Thaxt. i Mucor sp., zabeleženi su na tri uzorkovana mesta (Slika 33D). Najveću kvantitativnu zastupljenost po jednom uzorku imale su dve vrste roda Aspergillus (A. flavus Link i A. versicolor) čiji je CFU iznosio oko 50 kolonija po Petri kutiji (Slika 33B). 5.1.4 Analiza biofilma sa stubova Brankovog mosta u Beogradu Opservacija in situ i simptomi Direktnom opservacijom in situ kamena peščara na stubovima Brankovog mosta u Beogradu primećena je eksfolijacija kao najzastupljeniji simptom biodeterioracije (Slika Slika 33. Primarni izolati filamentoznih gljiva i kvasaca (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa površine Spomenika Neznanom junaku na Avali: A. kolonije sa dominacijom predstavnika Dematiaceae (NJ7); B. kolonije sa dominacijom Aspergillus flavus i A. versicolor (NJ9); C. kolonije sa dominacijom kvasaca (NJ6); D. invazivni rast pripadnika Zygomycotina (NJ8) 68 Rezultati i diskusija 34B). Prisutni su i simptomi biopatine u vidu zelenih i narandžastih prevlaka na velikim površinama (Slika 34A i C). Uzorci biofilma su uzeti na mestima izmenjenog izgleda sa promenama u teksturi površine kamena i simptomima biopatine. Epilitski lišajevi kru- stoznog tipa (Slika 34D) i mahovine su takođe zastupljeni ali sa malom učestalošću. Sastav zajednice biofilma Sa 8 uzorkovanih mesta identifikovano je 12 taksona gljiva, 4 taksona cijanobakterija i 7 taksona algi (Tabela 5). Podrazdelu Deuteromycotina pripada 11 taksona: 10 klasi Hyphomycetes a samo Phoma sp. klasi Coelomycetes. Mucor racemosus Bull. je jedini pripadnik klase Zygomy- cetes (Zygomycotina). I u ovim uzorcima su prisutni izolati bez reproduktivnih struktura, tj. M. sterilia. Kvasci su bili prisutni u dva uzorka (Tabela 5). Cijanobakterije su bile zastupljene sa 3 kokalna pripadnika iz reda Chroococcales i jednim filamentoznim pripadnikom reda Oscillatoriales (Leptolyngbia). Alge su zastuplje- ne sa 7 taksona: 6 iz razdela Bacillariophyta i jedan iz razdela Chlorophyta. Jedini identi- fikovan takson zelenih algi je jednoćelijska vrsta, D. olivaceus (Prasiolales, Trebouxiop- hyceae), koja formira agregate ćelija. Pet identifikovanih taksona silikatnih algi pripada redu Naviculales, Bacillaryophyceae, dok je Planothidium frequentissimum var. magnum (F.Straub) Lange­Bertalot jedini pripadnik reda Achnanthales (Tabela 5). Slika 34. Simptomi deterioracije površine kamena peščara na stubovima Brankovog mosta: A. narandžasta patina; B. eksfolijacija površine kamena peščara; C. zelena biopatina; D. apotecije krustoznih lišajeva 69 Rezultati i diskusija Velikog broj cijanobakterija i zelenih algi koje se razvijaju u masi i formiraju debeo kompaktan sloj biofilma, zelenu biopatinu, uočen je direktnim posmatranjem uzoraka svetlosnim mikroskopom. Kokalne cijanobakterije Gloecapsa sp. i Aphanocapsa sp. su uglavnom bile zastupljene u malim otvorima između čestica peska (Slika 35). Ši fra u zo rk a Si m pt om i M ikr om ice te Ci ja no ba kt er ije i al ge BM 1 - e ks fo lij ac ija Al te rn ar ia N ee s s pp . Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s Ph om a F r. S p. M yc el ia st er ili a Lu tic ola D .G .M an n sp . Na vic ula ve ne ta K üt zi ng Ni tzs ch ia co mm un is G ru no w Ni tzs ch ia fru stu lum (K üt zi ng ) G ru no w Ni tzs ch ia inc on sp icu a G ru no w Pl an oth idi um fr eq ue nti ssi mu m va r. m ag nu m (F .S tra ub ) L an ge ­ Be rta lot BM 2 ­ z el en a bi op at in a A lte rn ar ia N ee s s pp . Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b Fu sa riu m Li nk sp . Pa ec ylo my ce s v ar iot i B ain ier Ap ha no ca ps a m us cic ola (M en eg hi ni ) W ill e D es m oc oc cu s o liv ac eu s ( Pe rs oo n ex A ch ar iu s) J. R. La un do n G lo eo ca ps a n ov ac ek ii K om ár ek & A na gn ot id is G lo eo ca ps a vi ol ac ea (C or da ) R ab en ho rs t Le pto lyn gb ya A na g. & K om sp . BM 3 - e ks fo lij ac ija Pe nic ill ium L ink sp p. Al te rn ar ia N ee s s pp . Au re ob as id iu m p ul lu la ns (d e Ba ry ) G . A rn au d K va sc i Cl ad os po riu m sp ha ero sp er mu m Pe nz . BM 4 - e ks fo lij ac ija Al te rn ar ia N ee s s pp . Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s Ep icc oc um pu rp ur as ce ns E hr en b Fu sa riu m ox ys po ru m E. F. S m . & S w in gl e Pe nic ill ium au ra nti og ris eu m Di erc kx BM 5 ­ z el en a bi op at in a Al te rn ar ia N ee s s pp . Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s M yc el ia st er ili a Ap ha no ca ps a m us cic ola (M en eg hi ni ) W ill e D es m oc oc cu s o liv ac eu s ( Pe rs oo n ex A ch ar iu s) J. R. La un do n G lo eo ca ps a n ov ac ek ii K om ár ek & A na gn ot id is G lo eo ca ps a vi ol ac ea (C or da ) R ab en ho rs t Le pto lyn gb ya A na gn os tid is & K om ár ek sp . BM 6 - e ks fo lij ac ija M uc or ra ce m os us B ul l. BM 7 - e ks fo lij ac ija Al te rn ar ia N ee s s pp . Au re ob as id iu m p ul lu la ns (d e Ba ry ) G . A rn au d Ep icc oc um pu rp ur as ce ns E hr en b Fu sa riu m Li nk sp . Pe nic ill ium L ink sp p. BM 8 - e ks fo lij ac ija kv as ci Ta be la 5. M ik ro m ic et e, c ija no ba kt er ije i al ge u b io fil m u na s tu bo vi m a B ra nk ov og m os ta u B eo gr ad u 70 Rezultati i diskusija I u uzorcima BM, uzetih metodom sterilnog brisa, nakon perioda inkubacije dobijeni su primarni izolati (mešovite kulture) filamentoznih gljiva i kvasaca (Slika 36A­D). Iden- tifikacija mikromiceta pokazala je dominaciju vrsta iz familije Dematiaceae koje su bile identifikovane na 6 uzorkovanih mesta (Alternaria spp., Aureobasidium sp. Cladosporium sp., Epicoccum sp.) (Slika 36A i D), dok su kvasci, pripadnici podrazdela Zygomycotina (Slika 36C), i vrste roda Penicillium (Slika 36B) bile ređe zastupljene. Slika 35. Agregati ćelija Desmococcus olivaceus grupisani sa kokalnim cijanobakterijama Slika 36. Primarni izolati filamentoznih gljiva i kvasaca (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa površine kamena peščara stubova Brankovog mosta: A. kolonije sa dominacijom predstavnika Dematiaceae (BM4); B. kolonije sa dominacijom kvasaca i Penicillium sp. (BM3); C. invazivni rast Mucor racemosus (BM6); D. kolonije Alternaria sp. i Mycelia sterilia (BM1) 71 Rezultati i diskusija 5.1.5 Analiza biofilma sa srednjovekovnih kamenih stećaka na lokalitetima Mramorje i Rastište kod Bajine Bašte Opservacija in situ i simptomi Opservacijom in situ srednjovekovnih kamenih stećaka konstatovana je biodeterio- racija visokog stepena. Na lokalitetu Mramorje na površini stećaka dominiraju katranaste kolonije Nostoc commune Vaucher ex Bornet & Flahault i epilitski lišajevi velikog dijame- tra, krustoznog tipa i mahovine (Slika 37A i B). Na lokalitetu Rastište stećci su sa gotovo 100% pokrovnosti prekriveni mahovinama i talusom lišaja Collema auriforme (With.) Coppins & J.R. Laundon (Slika 37C). Uzorci biofilma su uzeti na mestima izmenjenog izgleda sa promenama u teksturi površine kamena. Sastav zajednice biofilma Sa stećka na lokalitetu Mramorje uzeto je 3 uzorka metodom sterilnog brisa za mi- kološku analizu i 3 uzorka direktnom metodom adhezivne trake za analizu SAB, dok je sa Slika 37. Simptomi biodeterioracije površine kamena na srednjovekovnim kamenim stećcima: A, B. krustozni lišajevi i mahovine na lokalitetu Mramorje; C. talus Collema auriforme i mahovine na lokalitetu Rastište 72 Rezultati i diskusija stećka na lokalitetu Rastište uzeto 2 uzorka metodom sterilnog brisa i 2 uzorka metodom adhezivne trake. Iz uzoraka sa lokaliteta Mramorje identifikovano je 10 taksona podraz- dela Deuteromycotina od kojih 9 pripadaju klasi Hyphomycetes a samo Phoma sp. klasi Coelomycetes. Na lokalitetu Rastište identifikovana su samo dva taksona: Phoma sp. (Coelomycetes) i C. echinulata (Zygomycetes). I u izolatima sa stećaka razvila se sterilna micelija, tj. M. sterilia. Phoma sp. je jedini zajednički takson za oba lokaliteta (Tabela 6). Na kamenim srenjovekovnim stećcima na lokalitetu Mramorje u okviru fototrofne komponente SAB, identifikovano je 8 taksona cijanobakterija, dok alge nisu bile prisutne. Dominiraju kokalne cijanobakterije iz reda Chrococcales, sa 6 identifikovanih taksona, dok su trihalne cijanobakterije iz reda Nostocales bile zastupljene sa dve vrste. Na lokali- tetu Rastište identifikovano je 7 taksona cijanobakterija, 4 kokalna pripadnika reda Chro- coccales i 3 trihalne iz reda Nostocales. D. olivaceus (Priales, Trebouxiophyceae) jedini je pripadnik Chlorophyta identifikovan na stećcima iz Rastišta. Zajednički taksoni cija- nobakterija prisutni na oba lokaliteta su: Gloeocapsa compacta Kützing, Gloeocapsopsis pleurocapsoides (Novácek) J.Komárek & K.Anagnostidis, Gleothece sp. N. commune, i Scytonema myochrous (Dillwyn) C.Agardh ex Bornet & Flahault (Tabela 6). Analizom fragmenata biofilma sa lokaliteta Mramorje u uzorcima sa mesta izme- njene površine kamena uočeno je prisustvo gusto isprepletanih filamenata sa dobro ra- zvijenim želatinoznim omotačima cijanobakterije S. myochrous i kolonija G. sanguinea koje formiraju kompaktan sloj (Slika 38A i B). U pojedinim snimcima dominiraju kolo- nije G. sanguinea različite starosti (Slika 38C), kao i suve kolonije G. pleurocapsoides (Slika 38D i E). Direktnim posmatranjem fragmenata biofilma sa lokaliteta Rastište u uzorcima sa mesta izmenjene površine kamena uočeno je prisustvo velikog broja loptastih kolonija cijanobakterije N. comunne (Slika 39C), kao i veliki broj praznih sara filamentozne vrste Tolypothryx byossoidea (C.Agardh) Kirschner (Slika 39B). U pojedinm snimcima vide se filamenti S. myochrous okruženi kolonijama G. pleurocapsoides (Slika 39A). Agregati ćelija D. olivaceus okruženi mladim ćelijama G. violacea takođe su prisutni. U pojedinim 73 Rezultati i diskusija snimcima konstatovane su dvoćelijske i troćelijske spore gljiva koje klijaju i formiraju mi- celiju (Slika 39E i F). Retko, u uzorcima je zabeležena pojava melanizovanih, toruloznih hifa karakterističnih za grupu gljiva koje naseljavaju kamen (RIF), poznatih i kao MCF. Ši fra u zo rk a Si m pt om i M ikr om ice te Ci ja no ba kt er ije i al ge Lo ka lit et M ra m or je u P er uć cu – sp om en ik 2 0 sle m en ja k SS 1 - k ru sto zn i li ša ji Pa ec ylo my ce s v ar iot i B ain ier Ph om a F r. sp . M yc el ia st er ili a G lo eo ca ps a co m pa ct a K üt zi ng G lo eo ca ps op sis p le ur oc ap so id es (N ov ác ek ) J .K om ár ek & K .A na gn os tid is No sto c c om mu ne V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t G lo eo th ec e sp . N äg el i G lo eo th ec e in ce rta S ku ja G lo eo ca ps op sis sp . G ei tle r e x K om ár ek Sc yto ne ma m yo ch ro us (D ill w yn ) C .A ga rd h ex B or ne t & F la ha ul t G lo eo ca ps a sa ng ui ne a (C .A ga rd h) K üt zi ng SS 2 - k ru sto zn i li ša ji i crn a k atr an as ta bi op at in a Al te rn ar ia N ee s s pp . Cl ad os po riu m cla do sp or ioi de s ( Fr es en .) G .A . d e V rie s D re ch sle ra d em at oi de a (B ub ák & W ró bl .) Sc ha rif Ep ico cc um pu rp ur as ce ns E hr en b Fu sa riu m Li nk sp . M yc el ia st er ili a M CF G lo eo ca ps a co m pa ct a K üt zi ng G lo eo ca ps op sis p le ur oc ap so id es (N ov ác ek ) J .K om ár ek & K .A na gn os tid is No sto c c om mu ne V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t G lo eo th ec e sp . N äg el i G lo eo th ec e in ce rta S ku ja G lo eo ca ps op sis sp . G ei tle r e x K om ár ek Sc yto ne ma m yo ch ro us (D ill w yn ) C .A ga rd h ex B or ne t & F la ha ul t G lo eo ca ps a sa ng ui ne a (C .A ga rd h) K üt zi ng SS 3 - k ru sto zn i li ša ji i crn a k atr an as ta bi op at in a As pe rg ill us P . M ic he li ex L in k sp . Fu sa riu m Li nk sp . Pa ec ylo my ce s v ar iot ii B ain ier M CF G lo eo ca ps a co m pa ct a K üt zi ng G lo eo ca ps op sis p le ur oc ap so id es (N ov ác ek ) J .K om ár ek & K .A na gn os tid is No sto c c om mu ne V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t G lo eo th ec e N äg el i s p. G lo eo th ec e in ce rta S ku ja G lo eo ca ps op sis G ei tle r e x K om ár ek sp . Sc yto ne ma m yo ch ro us (D ill w yn ) C .A ga rd h ex B or ne t & F la ha ul t G lo eo ca ps a sa ng ui ne a (C .A ga rd h) K üt zi ng Lo ka lit et M ram or je u s elu R as tiš te SS 4 ­ m ah ov in e Cu nn ing ha me lla ec hin ula ta (T ha xt .) Th ax t M yc el ia st er ili a M CF G lo eo ca ps a co m pa ct a K üt zi ng G lo eo ca ps op sis p le ur oc ap so id es (N ov ác ek ) J .K om ár ek & K .A na gn os tid is No sto c c om mu ne V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t G lo eo th ec e sp . N äg el i Sc yto ne ma m yo ch ro us (D ill w yn ) C .A ga rd h ex B or ne t & F la ha ul t G lo eo ca ps a vi ol ac ea K üt zi ng To lyp oth rix by sso ide a ( C. A ga rd h) K irc hn er D es m oc oc cu s o liv ac eu s ( Pe rs oo n ex A ch ar iu s) J. R. La un do n SS 5 ­ m ah ov in e Ph om a Fr . s p. M yc el ia st er ili a K va sc i M CF G lo eo ca ps a co m pa ct a K üt zi ng G lo eo ca ps op sis p le ur oc ap so id es (N ov ác ek ) J .K om ár ek & K .A na gn os tid is No sto c c om mu ne V au ch er e x Bo rn et & F la ha ul t G lo eo th ec e N äg el i s p. Sc yto ne ma m yo ch ro us (D ill w yn ) C .A ga rd h ex B or ne t & F la ha ul t G lo eo ca ps a vi ol ac ea K üt zi ng To lyp oth rix by sso ide a ( C. A ga rd h) K irc hn er D es m oc oc cu s o liv ac eu s ( Pe rs oo n ex A ch ar iu s) J. R. La un do n Ta be la 6 . M ik ro m ic et e, c ija no ba kt er ije i al ge u b io fil m u sr ed nj ev ek ov ni h ka m en ih s te ća ka 74 Rezultati i diskusija Slika 38. Cijanobakterije u biofilmu sa površine srednjovekovnih kamenih stećaka sa lokaliteta Mramorje: A,B, filamenti Scytonema myochrous i trajne spore Gloecapsa sanguinea; C. mlade i uginule kolonije Gloecapsa sanguinea; D, E. suve kolonije Gloeocapsopsis pleurocapsoides Slika 39. Cijanobkterije, zelene alge i gljive u biofilmu sa srednjovekovnih kamenih stećaka sa lokaliteta Rastište: A. filamenti Scytonema myochrous i kolonije Gloeocapsopsis pleurocapsoides; B. prazne sare Tolypothrix byossoidea sa kolonijama Gloeocapsa compacta, Gloeocapsa violacea i Desmococcus olivaceous; C. kolonija Nostoc commune; D. agregati ćelija Desmococcus olivaceous sa mladim kolonijama Gloeocapsa violacea; E. dvoćelijka klijajuća spora gljive. F. micelija 75 Rezultati i diskusija Nakon perioda inkubacije uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa dobijeni su pri- marni izolati (mešovite kulture) filamentoznih gljiva i kvasaca (Slika 40A­D). Mikobi- ota površine analiziranih stećaka se kvalitativno razlikuje na istraživanim lokalitetima. U uzorcima sa lokaliteta Mramorje dominiraju predstavnici familije Dematiaceae (Slika 40Bd) i podrazdela Zygomycotina (Slika 40Dz). Dok na lokalitetu Rastište dominiraju aktinomicete (Slika 40Aa) i kvasci (Slika 40Ak). Često su prisutne spororastuće, tačkaste, crne kolonije označene kao MCF (Slika 40Cmcf). Slika 40. Primarni izolati filamentoznih gljiva, kvasaca, aktinomiceta i mikrokolonijalnih gljiva (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa srednjovekovnih kamenih stećaka: A. kolonije sa dominacijom kvasaca i aktinomiceta (SS3), B. kolonije sa dominacijom Dematiaceae (SS5), C. dominacija Epicoccum purpurascens i kvasaca (SS2); D. invazivni rast Cunninghamella echinulata (SS4) 76 Rezultati i diskusija 5.1.6 Mikromicete izolovane sa kamena kulturno­istorijskih spomenika Sa svih pet istraživanih kamenih kulturno­istorijskih spomenika u Srbiji identifikova- no je ukupno 28 taksona gljiva. 24 taksona pripada podrazdelu Deuteromycotina; 22 klasi Hyphomycetes, vrste roda Phoma pripadaju klasi Coelomycetes, a vrsta S. roseus klasi Blastomycetes. Podrazdeo Zygomycotina zastupljen je sa 4 taksona klase Zygomycetes (Tabela 7). Redni broj Takson Lokalitet MG AP NJ BM SS 1. Acremonium strictum W. Gams + 2. Alternaria alternata (Fr.) Keissl. + + 3. Alternaria Nees spp. + + + + + 4. Aspergillus flavus Link + 5. Aspergillus terreus Thom + 6. Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. + 7. Aspergillus P. Micheli ex Link sp. + 8. Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud + + + 9. Bipolaris spicifera (Bainier) Subram + 10. Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries + + + + + 11. Cladosporium sphaerospermum Penz. + + 12. Cunninghamella echinulata (Thaxt.) Thaxt + + 13. Drechslera dematoidea (Bubák & Wróbl.) Scharif + + + 14. Epicoccum purpurascens Ehrenb + + + + 15. Fusarium Link spp. + + + 16. Fusarium oxysporum Schl. + 17. Fusarium sambucinum Fuckel + 18. Mucor racemosus Bull. + 19. Mucor P. Micheli ex L.sp. + 20. Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason + 21. Paecylomyces variotii Bainier + + 22. Penicillium expansum Link + 23. Penicillium aurantiogriseum Dierckx + 24. Penicillium Link spp. + + 25. Phoma Fr. spp. + + 26. Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. + 27. Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier + 28. Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel + Tabela 7. Mikromicete izolovane sa kamenih spomenika u Srbiji 77 Rezultati i diskusija Kvantitativna zastupljenost identifikovanih taksona se veoma razlikuje prema istra- živanim lokalitetima. Najviše identifikovanih taksona zabeleženo je na lokalitetu AP (13) a najmanje na SS (8). Vrsta C. cladosporioides i vrste rodova Alternaria i Fusarium za- beležene su na svim istraživanim lokalitetima. Visoku frekvencu pojavljivanja imala je i vrsta E. purpurascens koja je utvrđena na četiri od pet istraživanih spomenika. Vrste A. pullulans i D. dematoidea su prisutne na 3 istraživana lokaliteta. Prosečan broj identifikovanih taksona gljiva na 5 istraživanih lokaliteta (n) prikazan u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom iznosi 10,6 ± 0,93. Analizom zajednica mikromiceta mogu se izdvojiti grupe izolovane sa različitih ti- pova kamena: 1. sa karbonatnog kamena na lokalitetima MG i SS izolovano je 14 taksona gljiva: A. alternata, Alternaria sp., Aspergillus sp., A. pullulans, C. cladosporioides, C. echinulata, E. purpurascens, F. sambucinum, Fusarium sp., N. sphaerica, P. variotii, Penicillium sp., Phoma sp. i S. roseus, 2. sa mermera na lokalitetu MG izolovano je 5 taksona gljiva: A. alternata, A. pullulans, C. cladosporioides, E. purpurascens i S. roseus, 3. sa granita na lokalitetu NJ izolovano je 10 taksona gljiva: Alternaria sp., A. flavus, A. versicolor, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, C. echinulata, D. dematoidea, E. purpurascens, Fusarium sp. i Mucor sp. i 4. sa kamena peščara na lokalitetima AP i BM izolovano je 20 taksona gljiva: A. stric- tum, A. alternata, Alternaria sp., A. terreus, A. pullulans, B. spicifera, C. cladospo- rioides, C. sphaerospermum, D. dematoidea, E. purpurascens, F. oxysporum, Fusa- rium sp., M. racemosus, P. variotii, P. aurantiogriseum, P. expansum, Penicillium sp., Phoma sp., R. stolonifer i S. brevicaulis. Sastav zajednica mikromiceta na različitim kamenim supstratima pokazuje veliki broj zajedničkih vrsta. 78 Rezultati i diskusija 5.1.7 Cijanobakterije i alge detektovane na kamenom supstratu kulturno­istorijskih spomenika Sa svih pet istraživanih kamenih kulturno­istorijskih spomenika identifikovano je 17 taksona cijanobakterija. Red Chrococcales bio je zastupljen sa 9 identifikovanih pripadni- ka, red Nostocales sa 5, a red Oscilatorialles sa 3 (Tabela 8). Zastupljenost i raspored identifikovanih taksona se veoma razlikuje prema istraži- vanim lokalitetima. Najviše identifikovanih taksona zabeleženo je na lokalitetu SS (11). Jedna vrsta iz roda Oscillatoria bila je jedini pripadnik cijanobakterija dokumentovan u fragmentima SAB na lokalitetu NJ. Vrsta G. violacea je imala najveću zastupljenost na 4 istraživana lokaliteta, dok su vrste roda Nostoc bile prisutne na 3 istraživana lokaliteta. Prosečan broj identifikovanih taksona cijanobakterija na 5 istraživanih lokaliteta (n) prikazan u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom iznosi 4,4 ± 1,7. Redni broj Takson Lokalitet MG AP NJ BM SS 1. Aphanocapsa muscicola (Meneghini) Wille + 2. Gloeocapsa compacta Kützing + 3. Gloeocapsa novacekii Komárek & Anagnotidis + 4. Gloeocapsa sanguinea (C.Agardh) Kützing + + 5. Gloeocapsa violacea (Corda) Rabenhorst + + + + 6. Gloeocapsopsis sp. Geitler ex Komárek + 7. Gloeocapsopsis pleurocapsoides (Novácek) J.Komárek & K.Anagnostidis + 8. Gloeothece Nägeli sp. + 9. Gloeothece incerta Skuja + 10. Leptolyngbya Anagnostidis & Komárek sp. + 11. Microcoleus vaginatus (Vaucher) Gomont ex Gomont + 12. Nostoc Vaucher ex Bornet & Flahault sp. + + 13. Nostoc commune Vaucher ex Bornet & Flahault + 14. Oscillatoria Vaucher ex Gomont sp. + 15. Scytonema myochrous (Dillwyn) C.Agardh ex Bornet & Flahault + 16. Stigonema ocellatum (Dillwyn) Thuret ex Bornet & Flahault + 17. Tolypothrix byssoidea (C.Agardh) Kirchner + Tabela 8. Identifikovane cijanobakterije sa kamenih spomenika u Srbiji 79 Rezultati i diskusija Površina ispitivanih kamenih spomenika u Srbiji je kolonizovana zajednicom cijano- bakterija, koje se prema tipu supstrata na kome su zabeležene mogu podeliti na sledeće grupe: 1. na površini karbonatnog kamena na lokalitetima MG i SS identifikovano je 10 taksona cijanobakterija : G. compacta, G. sanguinea, G. violacea, G. pleurocapsoides, Gloeo- capsopsis sp., G. incerta, Gloeothece sp., N. commune, S. myochrous i T. byssoidea, 2. na povrršini vezivnog maltera na lokalitetu NJ identifikovana je samo jedna vrsta roda Oscillatoria, 3. na površini kamena peščara na lokalitetima AP i BM identifikovano je 6 taksona cija- nobakterija: A. muscicola, G. novacekii, G. violacea, Leptolyngbya sp., M. vaginatus, Nostoc sp. i S. ocellatum. Na pet kulturno­istorijskih spomenika u Srbiji identifikovano je 13 taksona algi, 7 taksona pripada razdelu Chlorophyta i 6 razdelu Bacilariophyta. Razdeo Chlorophyta bio je zastupljen sa četiri klase: Chlorophycea (redovi Chlorococcales, Chlamydomonadales i Microsporales), Zygnematophyceae (red Zygnematales) Trebouxiophyceae (red Prasio- lales) i Ulvophyceae (red Trentepohliales). Sve identifikovane alge iz razdela Bacilariop- Redni broj Takson Lokalitet MG AP NJ BM SS 1. Cylindrocapsa Reinsch sp. + 2. Cylindrocistis brebissonii (Ralfs) de Bary + 3. Desmococcus olivaceus (Persoon ex Acharius) J.R.Laundon + + + + 4. Haematococcus pluvialis Flotow + 5. Haematococcus sp. Flotow + 6. Luticola sp. D.G.Mann + 7. Microspora sp. Thuret + 8. Navicula veneta Kützing + + 9. Nitzschia communis Grunow + 10. Nitzschia frustulum (Kützing) Grunow + 11. Nitzschia inconspicua Grunow + 12. Planothidium frequentissimum var. magnum (F.Straub) Lange­Bertalot + 12. Trentepohlia aurea (Linnaeus) C.F. P. Martius + Tabela 9. Identifikovane alge sa kamenih spomenika u Srbiji 80 Rezultati i diskusija hyta pripadaju klasi Bacilariophyceae, i to 5 taksona pripada redu Naviculales, dok je P. frequentissimum var. magnum jedini pripadnik reda Achnanthales (Tabela 9). Najčešće nalažena alga je D. olivaceus, zabeležena na lokalitetima MG, AP, BM i SS. Najviše predstavnika algi zabeleženo na lokalitetu BM. Prosečan broj identifikovanih taksona algi na 5 istraživanih lokaliteta (n) prikazan u vidu srednje vrednosti sa standar- dnom greškom iznosi 3,4 ± 1,3. Alge prisutne u okviru fototrofne komponente SAB ispitivanih kulturno istorijskih spomenika u Srbiji prema tipu supstrata koji kolonizuju mogu se podeliti na četiri grupe: 1. na površini karbonatnog kamena na lokalitetima MG i SS identifikovane su alge iz razdela Chlorophyta: D. olivaceus i T. aurea, 2. na površini granitnog supstrata na lokalitetu NJ identifikovana je vrsta N. veneta, 3. na površini kamena peščara na lokalitetima AP i BM identifikovano je 7 taksona algi: D. olivaceus, Haematococcus sp., Luticola sp., N. veneta, N. communis, N. frustulum i N. inconspicua i 4. na površini vezivnog maltera na lokalitetu NJ identifikovano je 4 taksona algi: Cy- lindrocapsa sp., C. brebissonii, H. pluvialis i Microspora sp. Prosečan broj svih identifikovanih taksona fotototrofne komponente SAB (cijano- bakterije i alge) na 5 istraživanih lokaliteta (n) prikazan u vidu srednje vrednosti sa stan- dardnom greškom iznosi 7,6 ± 1,9. * * * Metodom sterilnog brisa moguće je izolovati i do 70% mikromiceta prisutnih na uzorkovanim mestima. Iako je ovom metodom nemoguće izolovati sve prisutne vrste, ona je vrlo pogodna za izolaciju mikromiceta, dok je za izolaciju bakterija neodgovarajuća, jer se izoluje se manje od jednog procenta (Sterflinger, 2010). Iako je srednja vrednost ukupnog broja identifikovanih taksona gljiva sa svih ispitivanih lokaliteta relativno niska (10,6 ± 0,93, n = 5), diverzitet mikromiceta na kamenim površinama nije zanemarljiv. Prisustvo nevijabilnih propagula u uzorcima, kao i nemogućnost svih izolata da formi- 81 Rezultati i diskusija raju reproduktivne strukture na hranljivoj podlozi MEA (M. sterilia) imaju za posledicu evidentiranje manjeg broja taksona u odnosu na realno stanje što se oslikava manjom srednjom vrednošću broja taksona gljiva. Srednja vrednost ima isključivo komparativ- ni značaj u cilju poređenja dobijenih rezultata kvantitativne i kvalitativne zastupljenosti mikromiceta na kamenim spomenicima sa drugim rezultatima istraživanja iz ove oblasti. Suihko i dr. (2007) su sa površine kulturno­istorijskih spomenika i ruševina u Škotskoj izolovali 13 morfološki različitih kolonija mikromiceta od kojih su 11 izolata sekvenci- ranjem ITS segmenta DNK identifikovali do nivoa roda. Sa fasade crkve Carrascosa del Scampo u Španiji, sa 10 uzorkovanih mesta, sa vidljivim oštećenjima kamene površine Gómez­Alarcón i dr. (1995a) izolovali su i identifikovali 13 taksona mikromiceta. Na svim istraživanim lokalitetima metodom sterilnog brisa sa najvećom učestalošću izolovane su gljive iz familije Dematiaceae, i to vrste rodova: Alternaria, Aureobasidium, Bipolaris, Cladosporium, Drechslera, Epicoccum i Nigrospora. Zbog obrazovanja pikni- dija vrste roda Phoma su prema Ainsworth (1973) svrstane u klasu Coelemycetes, ali zbog prisustva melanina u ćelijskim zidovima vrste ovog roda mogu se svrstati u melanizovane gljive. Od hijalinih vrsta veliku učestalost izolacije imale su i vrste roda Fusarium, koje se takođe odlukuju produkcijom pigmenata. Produkcija melanina i drugih pigmenata javlja se prilikom gajenja izolata na MEA. Uočene su i kvalitativne razlike u sastavu zajednica mkromiceta na različitim ispititivanim lokalitetima usled različitog stepena bioreceptivnosti ispitivanih tipova kamena, kao i različitog dejstva ekoloških faktora, pre svega temperature, vlažnosti, insolacije i dostupnosti nutrijenata. Sa mermernog stuba na lokalitetu MG izolo- vane su A. alternata, A. pullulans, C. cladosporioides, E. purpurascens, S. roseus i mela- nizovana M. sterilia. U okviru SAB sa mermernih spomenika izloženih na terasi muzeja u Mesini (Sicilija), kao glavni kolonizatori navedeni su taksoni: Alternaria spp., A. pullulans, Aspergillus flavus, A. ochraceous A. niger, Aspergillus spp., Cladosporium spp., Fusarium spp., Phoma eupyrena Sacc., Phoma spp., Stemphylium., Trichoderma spp., Ulocladium spp. (Urzi i dr., 2001). Isti autori su, prilikom posmatranja SAB, svetlosnim mikroskopom, konstatovali melanizovane strukture slične hlamidosporama gljiva, grupisane sa agregatima 82 Rezultati i diskusija prašine. Poređenjem dobijenih rezultata sa navedenim uočava se sličnost u dominantnom prisustvu predstavnika Dematiaceae, kao i drugih pigmentisanih vrsta, i mala zastupljenost hijalinih (nepigmentisanih) vrsta gljiva. Do sličnih rezulta došli su i Gorbushina i dr. (2002), koji navode da su glavni kolonizatori mermernih spomenika na lokalitetima Manastir Smo- lenske Bogorodice (Новоде́вичий монасты́рь, Богоро́дице­Смоле́нский монасты́рь) i Donski Manastir (Донско́й монасты́рь) u Moskvi gljive iz familije Dematiacea. Analizom SAB sa kamena peščara na lokalitetima AP i BM izolovane su vrste rodova Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Bipolaris, Cladosporium, Drechs- lera, Epicoccum, Fusarium, Mucor, Paecylomices, Penicillium, Phoma, Rhizopus i Sco- pulariopsis. Takođe, za peščar od koga su sagrađena utvrđenja iz srednjeg veka u Madridu (Alcala de Henares), Gómez­Alarcón i dr. (1995b) su saopštili vrste rodova Alternaria, Penicillium, Phoma, Trichoderma, Mucor, Ulocladium, Dictyodesmium. Poređenjem na- vedenih rezultata istraživanja uočava se dominanacija pigmentisanih vrsta, dok su hijaline vrste manje zastupljene. Prema Sterflinger (2010) gljive iz podrazdela Zygomycotina (vrste rodova Mucor i Rhizopus) obično ne kolonizuju kamen, već se na kamenim površinama nalaze uglavnom kao tranzijenti. Zanimljivo je pomenuti da kameni supstrat može biti i potencijalni izvor novih, do sada neopisanih, vrsta gljiva. Sert i Sterflinger (2010) su sa mer- mernog poklopca sarkofaga u Muzeju u Sideu (Turska) izolovali i opisali do tada nepoznatu vrstu iz roda Coniosporium (Dematiaceae). Na osnovu detaljnih morfoloških i molekularnih ispitivanja ustanovljeno je da se radi o Coniosporium sümbüli, novoj vrsti za nauku. Metoda adhezivne trake se pokazala odgovarajućom za analizu fotoautotrofne kom- ponente SAB, posebno sa mesta sa vidljivim siptomima deterioracije. Iako prema To- maselli i dr. (2000) diverzitet fototrofnih mikroorganizama u sastavu SAB na kamenim površinama treba da bude visok, dobijena srednja vrednost svih organizama fototrofne komponente SAB (7,6 ± 1,9, n = 5) ukazuje da je diverzitet cijanobakterija i algi na ispiti- vanim lokalitetima nizak. Ipak, iako je ukupan broj identifikovanih taksona cijanobakterija i algi mali, direktna posmatranje fragmenata SAB svetlosnim mikroskopom pokazala su da su jedinke pojedinih vrsta vrlo brojne i gusto pakovane čineći kompaktan sloj. Kvalita- 83 Rezultati i diskusija tivni sastav zajednica fotoautotrofa se razlikuju na ispitivanim lokalitetima usled različite bioreceptivnosti kamenog supstrata i različitog dejstva ekoloških faktora (osunčanost i zasenčenost staništa, vodni režim, temperatura, prostorna orijentacija staništa). Prema Tomaseli i dr. (2000) više od 200 taksona cijanobakterija i algi iz razdela Chlorophyta i Bacilariophyta može da formira aerofitne zajednice na kamenom supstratu. Isti autori saopštavaju da su u okviru fototrofne komponente SAB sa kamenog supstrata najčešće dokumentovana grupa mikroorganizama cijanobakterije sa više od 35 rodova i 90 vrsta, dok su alge iz Chlorophyta zastupljene sa 20 rodova i više od 35 vrsta. Dominacija algi iz razdela Bacilariophyta može se očekivati na spomenicima koji su u bliskom kontaktu sa vodom, npr. fontana di Trevi u Rimu ili kod spomenika koji se nalaze u blizini mora (Partenon u Atini). Ovaj podatak je u saglasnosti sa dobijenim rezultatima najvećeg diver- ziteta predstavnika Bacilariophyta kod nas na stubovima BM, koji se nalaze u neposred- noj blizini reke Save. Pionirsko istraživanje fototrofnih mikroorganizama koji mogu da formiraju aerofitne zajednice na kamenom supstratu sproveli su Anagnostidis i dr. (1983) i saopštili prisustvo 14 taksona cijanobakterija i 17 taksona algi iz razdela Bacilariophyta na mermernim stubovima spomenika Partenon na Akroplju (Atina, Grčka). Na granitnom supstratu na lokalitetu NJ identifikovan je samo jedan takson algi, vrsta N. veneta (Bacilariophyta). Prema Ortega­Calvo i dr. (1995), granitni supstrat se odliku- je malom bioreceptivnošću, što ga čini nepovoljnim za kolonizaciju cijanobakterijama i algama. Glavni limitirajući faktor za razvoj fotoautotrofa na granitu je mala poroznost i niska pH vrednost supstrata koji sprečavaju usvajanje vode kapilarnim silama (Prieto i Silva, 2005). Potvrda da je granit nepovoljan suspstrat su i rezultati Macedo i dr. (2009) koji su na granitnim spomenicima Mediteranskog područja zabeležili samo 10 taksona cijanobakterija. Takođe, mali broj vrst beleže i Gärtner i Stoyneva (2003) koji su saopštili da su glavni uzročnici zelene biopatine na granitnim spomenicima u gradu Koprivštica u Bugarskoj alge iz razdela Chlorophyta: Apatococcus lobatus (Chodat) J.B. Petersen, Trebouxia arboricola Puymaly i Coccomyxa sp. 84 Rezultati i diskusija U ovim istraživanjima sa lokaliteta AP i SS identifikovani su taksoni cijanobakterija: A. muscicola, G. novacekii, G. violacea, Leptolyngbya sp., M. vaginatus, Nostoc sp. i S. ocellatum i sledeći taksoni algi D. olivaceus, Haematococcus sp., Luticola sp., N. veneta, N. communis, N. frustulum i N. inconspicua. Međutim, u radu Macedo i dr. (2009) vrste rodova Gloeocapsa i Microcoleus su zabeležene na spomenicima od kamena pešćara na području Mediterana, dok je je M. vaginatus bila prisutna u SAB sa fasade crkve Carras- cosa del Campo u Španiji izgrađenoj od kamena peščara (Gόmez­Alarcόn i dr., 1995a). Zelena alga D. olivaceus je identifikovana na kamenu peščaru podzemnih galerija kaza- mata Pėtrusse u Luksemburgu (Hoffman i Darienko, 2005). Kada je analiziran SAB sa karbonatnog kamena na lokalitetima MG i SS identifikova- no je ukupno 10 taksona cijanobakterija: G. compacta, G.sanguinea, G. violacea, Gloeo- capsopsis sp., G. pleurocapsoides, Gloeothece sp., G.incerta, N.commune, S. myochrous i T. byssoidea i dva taksona algi iz razdela Chlorophyta: D. olivaceus i T.aurea. Prema Macedo i dr. (2009) vrste rodova Gloeocapsa, Nostoc, Scytonema, Tolypothrix i Desmo- coccus do sada su saopštene kao kolonizatori kamenih spomenika na području Mediterana izgrađenih od kamena peščara. Pretpostavka je da su razlike u kvalitativnom sastavu zajednica fototrofnih orga- nizama na kamenom supstratu, posledica različitog dejstva ekoloških faktora i različite bioreceptivnosti različitih tipova kamena. Simptomi deterioracije koji su dokumentovani prilikom in situ opservacije uzor- kovanih mesta na ispitivanim spomenicima mogu biti hemijskog, fizičkog ili biološkog porekla (Suihko i dr., 2007). Efekte hemijske fizičke i biološke deterioracije je vrlo teško razdvojiti pogotovo ako se uzme u obzir njihov sinergistički efekat i za to su potrebne dodatne analize. Njihov konačni efekat je stvaranje estetski neprihvatljive površine spo- menika. Direktnim posmatranjem pod mikroskopom fragmenata SAB dokazano je da su obojene prevlake na površini ispitivanih spomenika poreklom od fototrofnih organizama i da se stoga mogu smatrati biopatinama. Tamno crvena biopatina u udubljenju fasadnog zida crkve svete Bogorodice (MG), je posledica prisustva pigmenta gleokapsina koga pro- 85 Rezultati i diskusija dukuje cijanobakterija G. sanguinea. Višeslojni galertni omotači bogati ovim pigmentom bili su uočeni prilikom posmatranja ćelija G. sanguinea pod svetlosnim mikroskopom. Zeleno­narandžasta biopatina na površini istog spomenika, može se objasniti dominaci- jom trihalne alge T. aurea čije su ciste bogate pigmentima iz grupe karotenoida, posebno β­karotenom (Goodwin i Jamicorn, 1954). Crvena biopatina na lokalitetu NJ posledica je prisustva pigmenta astaksantina (Goodwin i Jamikorn, 1954). Ovaj pigment, iz grupe ka- rotenoida, sintetišu ciste alge H. pluvialis, koja je identifikovana u udubljenju spomenika iz Drugog svetskog rata, gde su bile vidljive ciste sa depozitima astaksantina. Biološka funkcija produkcije pigmenata je zaštita od nepovoljnih uslova životne sredine. Cijano- bakterije produkuju pigmente koje skladište u ćelijama ili ih izlučuju u galertne omotače što predstavlja adaptaciju na visoku solarnu radijaciju koja je ujedno i limitirajući ekološki faktor za aerofitne fototrofne mikroorganizme (Garcia­Pitchel i dr., 1992). Pigmenti u galertnim omotačima predstavljaju i zaštitu od sitnih artropoda prisutnih u biofilmu koji se hrane cijanobakterijama (Gaylarde i Gaylarde, 2005). Mikromicete takođe učestvuju u formiranju biopatine, posebno u vidu crnih prevlaka na kamenoj površini. Opservacija in situ je pokazala prisustvo crnih prevlaka na svim lo- kalitetima MG, AP i NJ. Osim crne katranaste biopatine na lokalitetu AP, posledice prena- množavanja cijanobakterije Nostoc sp., uzročnik ostalih patina mogu biti i gljive iz familije Dematiacea (Krumbein, 1992; Urzì i dr., 1992). Prema ovim autorima crne prevlake na kulturno istorijskim spomenicima, osim čađi, izazivaju i melanizovane gljive, te se stoga ove promene mogu smatrati biopatinom. Gorbushina i dr. (2002) su analizirali fungalnu komponentu SAB na kamenim spomenicima na 3 lokaliteta u Sankt Petersburgu: Mana- stir Aleksandra Nevskog (Свято­Троицкая Александро­Невская Лавра), Letnja bašta (Лeтний сад) i groblje Smolensk (Смоленское кладбище) i na krečnjačkim i mermernim skulpturama na dva lokaliteta u Moskvi: Manastir Smolenske Bogorodice (Hоводе́вичий монасты́рь, Богоро́дице­Смоле́нский монасты́рь) i Donski Manastir (Донско́й монасты́рь). Kao dominantan simptom biodeterioracije na svim istraživanim mermernim spomenicima opisana je pojava crnih mikrokolonija prečnika od 100 do 150 μm, prisutnih 86 Rezultati i diskusija na uzorkovanim mestima sa povećanom vlažnošću. Mikroskopskim posmatranjem (SEM) patine, ustanovljeno je prisustvo hifa i mikrokolonija koje rastu i radijalno se šire od centra kolonije. Slična biopatina, samo manjih dimenzija, od 70 do 80 μm, uzrokovana mikromi- cetama opisana je na mermernim spomenicima na antičkom lokalitetu Hersinosos na Kri- mu u Ukrajini (Gorbushina i dr., 1996). Osim crne biopatine melanizovane gljive se navode i kao uzročnici još jedne ireverzibilne promene na kamenim kulturno istorijskim spomeni- cima – fenomena „biopiting“. Opservacijom in situ, lezije koje bi se mogle okarakterisati kao „biopitting“ konstatovane su na mermernom stubu na lokalitetu MG i u tom uzorku bili su dominantni predstavnici familije Dematiaceae (vrste rodova Alternaria, Aureobasidium, Cladosporium, Epicoccum). Inokulacijom određenih sojeva gljiva iz familije Dematiaceae na intaktne sterilne kocke od Karara mermera in vitro je pokazano da za formiranje lezija dijametra 500 μm potrebno 10 meseci. Takođe, proučavajaću fenomen „biopitting“ na mermernim spomenicima Svetilišta Delos na ostrvu Ciklade u Grčkoj, autori su pokazali da su kolonije gljiva iz familije Dematiaceae uvek prisutne na delovima spomenika gde je konstatovan „biopitting“. Melanin osim primarne funkcije u zaštiti od UV povećava otpor- nost na hidrolitičke enzime koje produkuju bakterije i zglavkari prisutni u biofilmu, i štiti mikromicete od slobodnih radikala (Bloomfeld i Alexander, 1967; Jacobson, 2000). Neposredno uočljiva promena koje se takođe može smatrati simptomom biodeteri- oracije je odmakla kolonizacija površine kamenih spomenika epifitskim lišajevima, ma- hovinama i cvetnicama tokom dugogodišnje ekološke sukcesije. Od ispitivanih lokaliteta posebno se ističu fasadni zidovi Crkve Svete Bogorodice na lokalitetu MG i srednjo- vekovni kameni stećci na lokalitetima Rastište i Mramorje (SS). Prisustvo talusa lišaja C. auriforme, koji je na lokalitetu Rastište bio prisutna sa preko 80% pokrovnosti, a čiji su pojedeni talusi iznosili i više desetina centimetara u prečniku, ukazuje da je zajednica na stadijumu klimaksa. Na lokalitetu MG opisana je velika pokrovnost kamenih površina epilitskim lišajevima i mahovina i prisustvo cvetnica u pukotinama između gradivnih ka- menih blokova. Neophodan preduslov za kolonizaciju kamenih površina mahovinama i cvetnicama je eutrofikacija kamene površine i početak formiranja inicijalnog sloja zemlji- 87 Rezultati i diskusija šta (protosoil formation). Na ove procese utiču prethodni kolonizatori kamene površine – gljive, bakterije, cijanobakterije i alge, ali i depozicija organskih polutanata iz atmosfere koje u pukotinama i šupljinama na kamenoj površini mogu ostati tokom dugog perioda vremena (Gómez­Alarcón i dr., 1995a; Warscheid i Braams, 2000). 5.2 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha u zatvorenim prostorijama institucija kulture Fungalna kontaminacijama u zatvorenim prostorijama dovodi do biodeterioracije različitih tipova materijala a prisustvo velike koncentracije spora gljiva u vazduhu može imati štetne posledice po zdravlje ljudi. Uzorkovanje je izvršeno u depoima i izložbenim prostorima muzeja: Muzej Istorije Jugoslavije u Beogradu (MIJ), Muzej grada Beograda (MGB), Muzej savremene umet- nosti u Beogradu (MSU), Dvorana kulturnog centra (DKC) u Beogradu i Galerija slika Sava Šumanović u Šidu (GSSŠ). 5.2.1 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha iz zbirke štafeta i poklona Josipa Broza Tita u Muzeju istorije Jugoslavije Mikromicete sa umetničkih predmeta Uzorkovanje je izvršeno na ukupno 12 umetničkih predmeta od kojih je 11 bilo bez vidljivih simptoma deterioracije. Jedino su u unutrašnjosti drvene makete manastira De- čani zabeleženi simptomi vidljivog porasta plesni (Slika 41). Nakon perioda inkubacije uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa dobijeni su pri- marni izolati (mešovite kulture) filamentoznih gljiva i kvasaca (Slika 42). 88 Rezultati i diskusija Slika 41. Unutrašnjost drvene makete crkve manastira Dečani sa vidljivim porastom plesni (MIJ5) Slika 42. Primarni izolati filamentoznih gljiva i kvasaca (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa umetničkih predmeta iz zbirke u Muzeju istorije Jugoslavije: A. čista kultura Aspergillus niger (MIJ/4); B. dominacija kvasaca i Chaetomium globosum (MIJ/10); C. dominacija vrsta rodova Aspergillus i Penicillium (MIJ/7); D. sterilna micelija i kvasci (MIJ/5) 89 Rezultati i diskusija Identifikovano je ukupno 8 taksona filamentoznih gljiva (Tabela 10). Dominiraju predstavnici klase Hyphomycetes sa 6 identifikovanih vrsta. R. stolonifer je jedina vrsta klase Zygomycetes, dok je C. globosum jedini pripadnik klase Pyrenomycetes. Izolovane filamentozne gljive koje u kulturama nisu obrazovale reproduktivne strukture označene su kao M. sterilia. Prisutni kvasci nisu identifikovani do nivoa roda ili vrste. Mikološla analiza vazduha U cilju određivanja stepena kontaminacije vazduha sporama gljiva metodom pasiv- ne sedimentacije izvršeno je uzorkovanje vijabilnih propagula gljiva prisutnih u Galeriji Muzeja istorije Jugoslavije. Sve izolovane filamentozne gljive iz vazduha pripadaju klasi šifra uzorka Umetnički predmet/supstrat Identifikovane mikromicete MIJ/1 skulptura Josipa Broza/drvo Penicillium Link sp. Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. Mycelia sterilia MIJ/2 tapiserija sa likom Josipa Broza/sintetička vuna Aspergillus niger Tiegh MIJ/3 štafeta sa likom Josipa Broza/drvo Aspergillus niger Tiegh MIJ/4 štafeta u obliku ploda kruške/drvo Aspergillus niger Tiegh MIJ/5 maketa manastira Dečani/drvo kvasciMycelia sterilia MIJ/6 skulptura u obliku ruke/metal, drvo (uzorak sa drvenog dela) Aspergillus niger Tiegh Penicillium Link sp. MIJ/7 maketa kamiona/metal, pliš (uzorak sa plišanog postolja) Aspergillus P. Micheli ex Link sp. Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. Penicillium Link sp. kvasci MIJ/8 slika “Nosioci štafeta”, ulje na platnu/slikarske boje Alternaria Nees sp. Mycelia sterilia MIJ/9 slika “Tito na konju”,ulje na platnu/slikarske boje kvasci MIJ/10 slika “Tito na konju”, ulje na platnu/slikarsko platno, naličje Chaetomium globosum Kunze kvasci MIJ/11 portret Josipa Broza Tita/drvo (lesonit) sterilno MIJ/12 portret Josipa Broza Tita, tuš/papir, naličje Graphium putredinis (Corda) S. Hughes Tabela 10. Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta u Muzeju istorije Jugoslavije 90 Rezultati i diskusija Hyphomycetes podrazdela Deuteromycotina. U vazduhu su bili prisutni i kvasci, ali oni nisu identifikovani do nivoa roda ili vrste. Metodom Omelijanskog koncentracija spora gljiva u vazduhu je procenjena na 104,78 ± 13,96 CFU m-3 (n = 4). U vazduhu galerije dominiraju vijabilne propagule vrsta Geotrichum candidum Link, Cladosporium macro- carpum Preuss i Graphium putredinis (Corda) S. Hughes (Slika 43). 5.2.2 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha Muzeja grada Beograda Mikromicete sa umetničkih predmeta Uzorkovanje je izvršeno sa ukupno 15 umetničkih predmeta bez vidljivih simptoma de- terioracije. Nakon perioda inkubacije uzoraka uzetih metodom sterilnog dobijeni su primarni izolati (mešovite kulture) filamentoznih gljiva i kvasaca, a čak 5 zasejanih hranljivih podloga je ostalo sterilno. Ukupno je identifikovano 9 taksona gljiva. Dominiraju predstavnici klase Hyphomycetes (Deuteromycotina) sa ukupno 8 identifikovanih taksona, posebno vrste rodo- va Aspergillus, Cladosporium i Penicillium. R. stolonifer je jedina vrsta klase Zygomycetes (Zygomycotina). Izolovani kvasci nisu identifikovani do nivoa roda ili vrste (Tabela 11). Slika 43. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Galeriji Muzeja istorije Jugoslavije 91 Rezultati i diskusija Mikološka analiza vazduha Mikološka analiza vazduha metodom pasivne sedimentacije izvršena je u ukupno 12 prostorija Muzeja grada Beograda. Procenjene vrednosti koncentracije spora gljiva me- todom po Omelijanskom prikazane su u tabeli 12. Najveća kontaminacija sporama gljiva bila je u depou za skladištenje eksponata iz srednjeg veka (366,60 ± 9,80 CFU m-3, n = 4, dok je najmanja u Istorijskom odeljenju i Odeljenju za konzervaciju keramike (26,25 ± 2,92 CFU m-3, n = 4 i 26,45 ± 2,94 CFU m-3, n = 4. Iz vazduha svih 12 ispitivanih prostorija u Muzeju grada Beograda izolovane su filamentozne gljive i kvasci. Sve filamentozne gljive pripadaju klasi Hyphomycetes, dok kvasci nisu identifikovani. Kvalitativna zastupljenost pojedinih taksona gljiva se razlikuje Šifra uzorka Umetnički predmet/supstrat Identifikovane mikromicete MGB/1 umetnička skulptura/keramika sterilno MGB/2 orman/metal Aspergillus niger Tiegh. Penicillium aurantiogriseum Dierckx Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Cladosporium macrocarpum Preuss Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. MGB/3 skulptura Bivolja glava/kost Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vrieskvasci MGB/4 fotografija, crno­bela tehnika/fotografski papir sterilno MGB/5 plan Beograda /papir sterilno MGB/6 kožni šlem/koža Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. MGB/7 balska haljina/tkanina sterilno MGB/8 umetnička slika/slikarske boje Penicillium aurantiogriseum Dierckx Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. Kvasci MGB/9 slika iz zemunska zbirke/ slikarske boje sterilno MGB/10 Beograda/papir sterilno MGB/11 mađarski leksikon posle čišćenja/papir Penicillium aurantiogriseum Dierckx Aspergillus P. Micheli ex Link sp. MGB/12 slika Petra Dobrovića/bojeni sloj Drechslera S. Ito sp.Penicillium aurantiogriseum Dierckx MGB/13 fotografija iz 1931.god.,crno bela tehnika/fotografski papir Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. MGB/14 dokument iz obrenovačke zbirka/papir Penicillium aurantiogriseum Dierckx Penicillium Link sp. Alternaria alternata (Fr.) Keissl. MGB/15 skulptura iz 1969.godine/drvo sterilno Tabela 11. Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta u Muzeju grada Beograda 92 Rezultati i diskusija u ispitivanim prostorijama. U arheološkom depou u vazduhu su bile najbrojnije spore vrsti roda Penicillium (Slika 44). Veliki diverzitet vijabilnih propagula gljiva u vazduhu zabeležen je u depou za skla- dištenje eksponata iz srednjeg veka. Vrste C. cladosporioides i P. aurantiogriseum bile su najdominantnije, dok su sa manjom učestalošću izolovane vrste rodova Alternaria, Ulocladium, Aureobasidium i Stemphylium (Slika 45). Prostorija Koncentracija spora u vazduhu (CFU m-3) 1. Arheološki depo 235,78 ± 7,87 2. Depo za skladištenje eksponata iz srednjeg veka 366,60 ± 9,80 3. Istorijsko odeljenje 26,25 ± 2,92 4. Odsek za književnost, kulturu i nauku 235,78 ± 7,79 5. Istorijsko odeljenje za eksponate od 1941. god. 104,74 ± 7,79 6. Odsek za primenjenu umetnost i etnologiju 209,52 ± 7,90 7. Depo za likovnu umetnost 130,99 ± 6,71 8. Odeljenje za arhitekturu i urbanizam 209,84 ± 7,92 9. Depo za skulpture 288,18 ± 8,94 10. Odeljenje za konzervaciju metala 183,39 ± 6,85 11. Odeljenje za konzervaciju keramike 26,45 ± 2,94 12. Prijemna prostorija 183,43 ± 8,18m *Dobijene vrednosti su prikazane u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom sa 4 Petri kutije (n). Tabela 12. Procenjene koncentracije vijabilnih propagula gljiva u vazduhu različitih prostorija Muzeja grada Beograda Slika 44. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u arheološkom depou Muzeja grada Beograda 93 Rezultati i diskusija U Istorijskom odeljenju u vazduhu je zabeležena jedino vrsta T. viride, dok je u vazduhu Odeljenja za književnost, kulturu i nauku, najdominantniji identifikovani takson je Cladosporium spp., dok su vijabilne propagule vrsta P. aurantiogriseum i T. viride za- stupljene sa manjom učestalošću (Slika 46). U istorijskom odeljenju za skladištenje eksponata od 1941. god najučestalija vrsta bila je A. versicolor, a spore jedne vrste roda Ulocladium su takođe bile prisutne u vazduhu (Slika 47). Slika 45. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u depou za skladištenje eksponata iz srednjeg veka Muzeja grada Beograda Slika 46. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Odeljenju za književnost, kulturu i nauku Muzeja grada Beograda 94 Rezultati i diskusija U vazduhu Odeljenja za primenjenu umetnost i etnologiju jedini zabeleženi takson filamentoznih gljiva je C. cladosporioides (slika 48). U vazduhu depoa za likovnu umetnost kao dominantni takson zabeležena je vrsta C. cladosporioides, dok je Alternaria sp. imala manju učestalost (Slika 49). Slika 47. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Odeljenju za skladištenje eksponata od 1941. god. Muzeja grada Beograda Slika 48. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Odeljenju za primenjenu umetnost i etnologiju Muzeja grada Beograda 95 Rezultati i diskusija Najdominantnija vrsta izolovana iz vazduha Odeljenja za arhitekturu i urbanizam je P. aurantiogriseum, dok je Paecilomyces sp. imala manju učestalost (Slika 50). Iz vazduha depoa za skulpture izolovani su Cladosporium sp. i Penicillium sp. sa različitom učestalošću (Slika 51). Slika 49. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Odeljenju za likovnu umetnost Muzeja grada Beograda Slika 50. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Odeljenju za arhitekturu i urbanizam Muzeja grada Beograda 96 Rezultati i diskusija U vazduhu Odeljenja za konzervaciju metala najdominantnija vrsta bila je A. versi- color, dok je Gliomastix sp. bila manje zastupljena (Slika 52). Vrsta P. aurantiogriseum je jedina identifikovana vrsta u vazduhu Odeljenja za kon- zervaciju keramike. Ista vrsta zajedno sa vrstom C. macrocarpum imala je veliku relativnu gustinu i u prijemnoj prostoriji Muzeja grada Beograda (Slika 53). Slika 51. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u depou za skulpture Muzeja grada Beograda. Slika 52. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Odeljenju za konzervaciju metala Muzeja grada Beograda 97 Rezultati i diskusija 5.2.3 Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta i iz vazduha izložbenog prostora i depoa Galerije slika „Sava Šumanović“ Mikromicete sa umetničkih predmeta Uzorkovanje je izvršeno na ukupno 14 umetničkih slika u depou i izložbenom pro- storu Galerije slika „Sava Šumanović“. Na zidovima izložbenog prostora uočena je dete- rioracija sa simptomima eksfolijacije i depozitom soli (Slika 54A). Na delovima zidova sa povećanom vlažnošću usled curenja vode konstatovana je zelena biopatina (Slika 54B). Slika 53. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u prijemnoj prostoriji Muzeja grada Beograda Slika 54. Simptomi deterioracije u Galeriji slika Sava Šumanović: A. eksfolijacija sa depozicijom soli; B. zelena biopatina 98 Rezultati i diskusija Na pojedinim umetničkim slikama uočen je vidljiv porast plesni na ramovima (Slika 55A), kao i na bojenim slojevima slika (Slika 55B). Nakon perioda inkubacije uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa dobijeni su pri- marni izolati (mešovite kulture) filamentoznih gljiva i kvasaca (Slika 56). Sa ukupno 8 umetničkih slika iz depoa Galerije slika Sava Šumanović identifikovano je ukupno 9 taksona filamentoznih gljiva (Tabela 13). Dominiraju pripadnici klase Hyp- homycetes sa 8 identifikovanih taksona, dok je vrsta R. stolonifer jedini identifikovani izo- lati klase Zygomycetes. Izolovane filamentozne gljive koje u kulturama nisu obrazovale Slika 55. Vidljiv porast plesni na umetničkim slikama Save Šumanovića: A. ram slike; B. bojeni sloj Slika 56. Primarni izolati filamentoznih gljiva (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa umetničkih slika u Galeriji slika “Sava Šumanović”: A. primarni izolat sa slikarsih boja (GSSŠ/5); B. primarni izolat sa drvenog rama (GSSŠ/13) 99 Rezultati i diskusija reproduktivne strukture označene su kao M. sterilia. Izolovani kvasci nisu identifikovani do nivoa roda ili vrste. Sa ukupno 6 umetničkih slika iz izložbenog prostora identifikovano je ukupno 10 taksona filamentoznih gljiva (Tabela 13). Dominiraju pripadnici klase Hyphomycetes sa 9 identifikovanih taksona, dok je vrsta R. stolonifer jedini identifikovani izolati klase Zy- gomycetes. M. sterilia i kvasci nisu bili prisutni. šifra uzorka Umetnički predmet/supstrat Identifikovane Mikromicete depo GSSŠ/1 slika 206/slikarske boje– kolonije, sa bojenog sloja Aspergillus P. Micheli ex Link sp. beo kvasac Mycelia sterilia GSSŠ/2 slika 351/slikarske boje Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill.Penicillium Link sp. GSSŠ/3. ram velike slike/drvo Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill.Penicillium Link sp. GSSŠ/4 slika 35/1/slikarsko platno, naličje Ulocladium chartarum (Preuss) E.G. SimmonsCrni kvasac GSSŠ/5 slika 101/1, /slikarske boje Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Penicillium Link sp. Mycelia sterilia GSSŠ/6 slika 351 /slikarsko platno, naličje Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Ulocladium oudemansii E.G. Simmons Penicillium Link sp. Wardomyces F.T. Brooks & Hansf. sp. GSSŠ/7 slika 240, /slikarske boje Cladosporium Link sp. GSSŠ/8 slika 103 Š – vidljivi simptomi/slikarske boje Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Penicillium Link sp. Ulocladium Preuss sp. Mycelia sterilia izložbeni prostor GSSŠ/9 slika 51/slikarske boje Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. GSSŠ/10 slika 140 /slikarsko platno naličje Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de VriesCladosporium Link sp. GSSŠ/11 ram slika 5/drvo Aspergillus niger Tiegh Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Ulocladium chartarum (Preuss) E.G. Simmons Epicoccum purpurascens Ehrenb. Penicillium Link sp. GSSŠ/12. ram slika 140/drvo Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. Penicillium Link sp. GSSŠ/13 ram slika 256/drvo Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de VriesAlternaria alternata (Fr.) Keissl. GSSŠ/14 ram slike 256 /drvo Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. Aspergillus flavus Link Penicillium Link sp. Tabela 13. Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta u galeriji Save Šumanovića 100 Rezultati i diskusija Mikološka analiza vazduha U cilju određivanja kontaminacije vazduha zatvorenih prostorija sporama gljiva me- todom pasivne sedimentacije izvršeno je uzorkovanje vijabilnih propagula gljiva prisutnih u depou i izložbenom prostoru Galerije slika “Sava Šumanovića”. Metodom Omelijan- skog koncentracija spora gljiva u vazduhu depoa je procenjena na 104,87 ± 8,18 CFU m-3 (n = 4), dok je koncentracija vijabilnih propagula gljiva u izložbenom prostoru iznosila 91,76 ± 8,06 CFU m-3 (n = 4). Iz obe prostorije metodom pasivne sedimentacije izolovane su samo filamentozne gljive, dok kvasci nisu bili prisutni. Svi identifikovani taksoni pri- padaju klasi Hyphomycetes. Spore vrsta roda Cladosporium imale su najveću frekvencu izolacije (Slika 57). Najdominantnija vrsta u izložbenom prostoru bila je C. cladosporioides, dok su vrste rodova Aureobasidium i Penicillium bile manje zastupljene (Slika 58). Slika 57. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u depou Galerije slika Sava Šumanović 101 Rezultati i diskusija 5.2.4 Mikromecete izolovane sa zbirki i iz vazdu- ha Muzeja savremene umetnosti u Beogradu Mikromicete sa umetničkih predmeta – edukativne igračke i fotografije Uzorkovanje je izvršeno na ukupno 6 umetničkih predmeta u depou u Dvorani kul- turnog centra. Na oštećenim drvenim predmetima bili su vidljivi simptomi oštećenja i porast plesni (Slika 59A­C), dok su na fotografijam prisutne dekolorizacije (Slika 59D). Fragmenti biofilma sa dekolorizovanih fotografija uzeti su metodom adhezivne trake i posmatrani svetlosnim mikroskopom. Zabeleženo je prisustvo fungalnih struktura na oštećenim delovima fotografija. U pojedinim snimcima uočeni su konidiogeni aparati vrsta rodova Paecillomyces (Slika 60A) i Humicola (Slika 60B) kao i makro­ i mikro- konidije vrste roda Fusarium (Slika 60D). Samo na jednom snimku uočene su nematode (Slika 60C). Slika 58. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Izložbenom prostoru Galerije slika Sava Šumanović 102 Rezultati i diskusija Slika 59. Simptomi biodeterioracije na umetničkim predmetima iz zbirke Aleksandra Rafajlovića: A-C. vidljiv porast plesni na drvenim predmetima; D. dekolorizacija umetničke fotografije Slika 60. Strukture gljiva i drugih organizama uočene pod svetlosnim mikroskopom u uzorcima uzetih metodom adhezivne trake sa oštećenih fotografija Aleksandra Rafajlovića: A. konidiogeni aparat Paecylomices variotii; B. konidiogeni aparat Humicola sp.; C. nematoda; D. mikro- i makrokonidije Fusarium sp. 103 Rezultati i diskusija U primarnim izolatima (Slika 61) identifikovano je 15 taksona filamentoznih gljiva (Tabela 14). Dominiraju predstavnici klase Hyphomycetes sa 10 identifikovanih taksona. Klasa Pyrenomycetes podrazdela Ascomycotina je zastupljena sa dva predstavnika dok su iz klase Zygomycetes identifikovane tri vrste. I u ovim uzorcima je zabeležena M. sterilia. Slika 61. Primarni izolati filamentoznih gljiva (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa umetničkih predmeta i fotografija iz zbirke Aleksandra Rafajlovića u Dvorani Kulturnog Centra u Beogradu: A. primarni izolat sa drvenog sanduka sa dominacijom vrsta rodova Aspergillus i Penicillium (DKC/4); B. primarni izolat fotografskog papira sa dominacijom Trichoderma viride (DKC/6) šifra uzorka Umetnički predmet/supstrat Identifikovane Mikromicete DKC/1 sanduk/drvo Alternaria Nees sp. Chaetomium globosum Kunze Trichoderma viride Pers. DKC/2 skulptura –računaljka/drvo Aspergillus flavus Link Eurotium pseudoglaucum (Blochwitz) Malloch & Cain Mycelia sterilia DKC/3 ram i površina fotografije/fotografski papir Fusarium Link sp. Paecylomices variotii Bainier Trichoderma viride Pers. Ulocladium Preuss sp. DKC/4 drveni sanduk – igračke/drvo Absidia corymbifera (Cohn) Sacc. & Trotter Aspergillus niger Tiegh. Aspergillus ochraceus G. Wilh. Alternaria Nees sp. Penicillium verrucosum Dierckx Syncephalastrum racemosum Cohn DKC/5 ram sanduka/drvo Alternaria Nees sp. Aspergillus niger Tiegh. Aspergillus ochraceus G. Wilh. Chaetomium globosum Kunze Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. DKC/6 fotografija/fotografski papir Humicola Traaen sp. Paecylomices variotii Bainier Trichoderma viride Pers. Tabela 14. Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta u Dvorani kulturnog centra 104 Rezultati i diskusija Mikološka analiza vazduha u sali Dvorane kulturnog centra Beograda Mikološka analiza vazduha je izvršena u sali Dvorane kulturnog centra Beograda gde je privremeno skladištena zbirka edukativnih igračaka Marka Crnobrnje i fotografija Aleksandra Rafajlovića, oštećenih posle poplave u Turskom skladištu. Koncentracija spo- ra gljiva u vazduhu je procenjena na 210,09 ± 8,06 CFU m-3 (n = 4), a dominiraju vijabilne propagule vrsta A. niger, N. crassa i T. viride (Slika 62). Mikromicete sa umetničkih predmeta iz trezora Narodne banke Srbije Sa ukupno 6 umetničkih predmeta bez vidljivih simptoma deterioracije u trezoru Narodne banke Srbije izolovano je 11 taksona filamentoznih gljiva. Ispitivani umetnički predmeti nisu fotografisani iz sigurnosnih razloga. U primarnim izolatima (Slika 63) do- miniraju pripadnici klase Hyphomycetes sa 10 identifikovanih taksona. N. crassa je jedini pripadnik Pyrenomycetes. Među primarnim izolatima su prisutni i kvasci i M. sterilia (Tabela 15). Slika 62. Relativna zastupljenost taksona gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u Dvorani Kulturnog Centra 105 Rezultati i diskusija šifra uzorka Opis uzorkovanog mesta Identifikovane Mikromicete MSU/1 slika “Pijana lađa”, Sava Šumanović,/slikarske boje Fusarium Link sp. Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge Paecylomices variotii Bainier Trichoderma viride Pers. MSU/2 slika Save Šumanovića/ slikarsko platno, naličje Aspergillus niger Tiegh. Aspergillus ochraceus G. Wilh. Aspergillus flavus Link Alternaria alternata (Fr.) Keissl. Penicillium verrucosum Dierckx Penicillium Link sp. Trichoderma viride Pers Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge kvasci MSU/3 skulptura/drvo Alternaria alternata (Fr.) Keissl. Penicillium verrucosum Dierckx Penicillium Link sp Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge Trichoderma viride Pers. kvasci MSU/4 slika Vere Božičković Popović/slikarske boje Paecilomyces variotii Bainier Aspergillus ochraceus G. Wilh. Trichoderma viride Pers Penicillium Link sp MSU/5 skulptura/drvo Aspergillus niger Tiegh. Aspergillus ochraceus G. Wilh. Penicillium verrucosum Dierckx Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge kvasci MSU/6 slika Save Šumanovića/ slikarsko platno, naličje Aspergillus ochraceus G. Wilh. Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge Penicillium verrucosum Dierckx Trichoderma viride Pers. Slika 63. Primarni izolati filamentoznih gljiva i kvasaca (MEA sa antibiotikom) iz uzoraka uzetih metodom sterilnog brisa sa umetničkih predmeta iz trezora Narodne banke: A. kolonije sa dominacijom Penicillium sp. i Cladosporium cladosporioides (MSU/5); B. kolonije sa dominacijom Neurospora crassa (MSU/1); C. kolonije sa dominacijom Penicillium spp. (MSU/3); D. izolat sa dominacijom Aspergillus sp i Penicillium sp. (MSU/2) Tabela 15. Mikromicete izolovane sa umetničkih predmeta u trezoru Narodne banke Srbije 106 Rezultati i diskusija Mikološka analiza vazduha u trezoru Narodne banke Srbije U trezoru Narodne banke Srbije nakon analize vazduha metodom pasivne sedimen- tacije procenjena koncentracija spora je 157,27 ± 8,74 CFU m-3 (n = 4). U vazduhu su prisutne vijabilne propagule vrsta N. crassa, T. viride i R. stolonifer (Slika 64). 5.2.5 Pregled izolovanih mikromiceta iz muzejskih zbirki prema supstratima koje kolonizuju Uzorkovanje vijabilnih propagula gljiva sa umetničkih predmeta u ustanovama kul- ture izvršeno je metodom sterilnog brisa. Ispitivani umetnički predmeti su izrađeni od različitih tipova materijala, koji predstavljaju supstrat za kolonizaciju gljivama. Stoga je izvršeno grupisanje mikromiceta prema tipu supstrata koje kolonizuju na: 1. mikromicete izolovane sa materijala od drveta: A. corymbifera (DKC/4); A. al- ternata (GSSŠ/13, MSU/3); Alternaria spp. (DKC/4, DKC/5); A. flavus (GSSŠ/14, DKC/2); A. niger (MIJ/3, MIJ/4, MIJ/6, GSSŠ/11, DKC/4, DKC/5, MSU/5); A. ochraceus (DKC/4, DKC/5, MSU/5); C. globosum (DKC/1, DKC/5); C. clado- sporioides (GSSŠ/11, GSSŠ/12, GSSŠ/13, GSSŠ/14, MSU/5); E. purpurascens Slika 64. Relativna gustina mikromiceta gljiva (%) izolovanih metodom pasivne sedimentacije u trezoru Narodne banke Srbije 107 Rezultati i diskusija (GSSŠ/11); E. pseudoglaucum (DKC/2); N. crassa (DKC/5, MSU/3, MSU/5); P. verrucosum (MSU/3, MSU/5); Penicillium spp. (MIJ/1, MIJ/6, GSSŠ/3, GSSŠ/11, GSSŠ/12, GSSŠ/14, MSU/3); R. stolonifer (MIJ/1, GSSŠ/3, GSSŠ/12, GSSŠ/14, DKC5); S. racemosum (DKC/4); T. viride (MSU/3) i U. chartarum (GSSŠ/11), 2. mikromicete izolovane sa bojenih slojeva slika: Alternaria sp. (MIJ/8); A. ochra- ceus (MSU/4); A. versicolor (GSSŠ/9); Aspergillus sp. (GSSŠ/1); C. cladosporioides (GSSŠ/5, GSSŠ/8); Cladosporium sp. (: GSSŠ/7); Drechslera sp. (MGB/12); Fusa- rium sp. (MSU/1); N. crassa (MSU/1); P. variotii (MSU/1, MSU/4); P. aurantiogri- seum (MGB/8, MGB/12); Penicillium spp. (GSSŠ/2, GSSŠ/5, GSSŠ/8, MSU/4); R. stolonifer (MGB/8, GSSŠ/2); T. viride (MSU/1, MSU/4) i Ulocladium sp. (GSSŠ/8). 3. mikromicete izolovane sa poleđine slikarskih platna: A. alternata (MSU/2); A. flavus (MSU/2); A. niger (MSU/2); A. ochraceus (MSU/2); C.globosum (MIJ/10); C. cladosporioides (GSSŠ/6, GSSŠ/10, MSU/2); Cladosporium sp. (GSSŠ/10); P. verrucosum (MSU/2); Penicillium sp. (GSSŠ/6, MSU/2); T.viride (MSU/2); U. char- tarum (GSSŠ/4); U. oudemansii (GSSŠ/6) i Wardomyces sp. (GSSŠ/6), 4. mikromicete izolovane sa fotografskog papira: Fusarium sp. (DKC/3); Humicola sp. (DKC/6); P. variotii (DKC/3, DKC/6); R. stolonifer (MGB/13); T. viride (DKC/3, DKC/6) i Ulocladium sp. (DKC/3). 5. mikromicete izolovane sa tkanina: A. niger (MIJ/2); A. versicolor (MIJ/7); Asper- gillus sp. (MIJ/7) i Penicillium sp. (nalaz: MIJ/7). 5.2.6 Pregled mikromiceta izolovanih iz vazduha zatvorenih prostorija ispitivanih institucija kulture Uzorkovanje vijabilnih propagula gljiva iz vazduha, metodom pasivne sedimentacije, izvršeno je u 17 prostorija (n), u 4 ustanove kulture. U Muzeju grada Beograda, uzorko- vanje je izvršeno u ukupno 12 prostorija. U Galeriji Sava Šumanović u dve prostorije, dok je u Muzeju Savremene umetnosti Beograda i u Muzeju istorije Jugoslavije, Dvorani 108 Rezultati i diskusija kulturnog centra i trezoru Narodne banke Srbije uzorkovanje izvršeno u po jednoj prosto- riji. Poređenjem kvalitativnog sastava identifikovanih mikromiceta iz vazduha u svih 17 ispitivanih prostorija utvrđeno je da je najveću frekvencu izolacije imala vrsta P. auran- tiogriseum (41,18%), a zatim C. cladosporioides (29,41%). Najmanja zastupljenost od 5,88% je zabeležena kod 9 taksona, tj. 8 vrsta i Alternaria spp. Učestalost identifikovanih mikromiceta iz vazduha svih ispitivanih prostorija prikazana je u Tabeli 16. Poređenjem kvalitativnog sastava identifikovanih rodova može se zaključiti da u bioaresolnoj komponenti vazduha zatvorenih prostorija ispitivanih muzeja na teritoriji Beograda dominiraju vrste rodova Cladosporium i Penicillium, sa učestalošću izolacije preko 50%, dok su vrste rodova Aspergillus i Trichoderma bile dvostruko manje zastuplje- ne (25%) u aerosolnoj komponenti vazduha analiziranih prostorija (Slika 65). Takson Učestalost (%) Alternaria Nees spp. 5,88 Alternaria alternata (Fr.) Keissl. 5,88 Aspergillus niger Tiegh 5,88 Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. 11,76 Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud 11,76 Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries 29,41 Cladosporium Link sp. 17,64 Cladosporium macrocarpum Preuss 11,76 Geotrichum candidum Link 5,88 Gliomastix Guég. sp. 5,88 Graphium putredinis (Corda) S. Hughes 5,88 Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge 11,76 Paecylomyces Bainer. sp. 5,88 Penicillium aurantiogriseum Dierckx 41,18 Penicillium Link sp. 17,64 Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. 5,88 Stemphylium Wallr. sp. 5,88 Trichoderma viride Pers. 23,53 Ulocladium Preuss sp. 11.76 Tabela 16. Učestalost identifikovanih mikromiceta u vazduhu ispitivanih 17 prosterija različitih muzeja na teritoriji Beograda. 109 Rezultati i diskusija Izolacija gljiva iz vazduha korišćenom metodom pokazala je dominaciju filamen- toznih gljiva koje su izolovane iz svih ispitivanih prostorija, dok je učestalost kvasolikih formi 41,18%. U okviru filamentoznih gljiva pripadnici klase Hyphomycetes (Deuteromy- cotina) imale su najveću učestalost izolovanja (100%), dok je učestalost gljiva iz podraz- dela Ascomycotina i Zygomycotina znatno manja (Slika 66). Slika 65. Procentualna zastupljenost dominnatnih rodova mikromiceta u vazduhu ispitivanih prostorija Slika 66. Procentualna zastupljenost filamentoznih gljiva različite taksonomske pripadnosti sa izdvojenim kvasolikim formama, u vazduhu ispitivanih prostorija u različitim institucijama kulture 110 Rezultati i diskusija * * * Korišćena metoda pasivne sedimentacije za analizu vazduha je vrlo prihvatljiva jer ne zahteva skupe uzorkivače vazduha i do rezultata se dolazi vrlo brzo. Ipak, treba naglasi- ti da dobijene vrednosti predstavljaju samo procenu stanja fungalne kontaminacije vazdu- ha, a ne realne vrednosti. Analiza prisustva gljiva u vazduhu u zatvorenih prostorija vrši se zbog njihovog mogućeg uticaja na objekte kulturne baštine i zdravlje ljudi. Umetnički predmeti izrađeni su od različitih materijala koji se odlikuju različitim stepenom biore- ceptivnosti i mogu predstavljati supstrat za kolonizaciju gljivama, ako su spore prisutne u vazduhu. Kolonizacija umetničkih predmeta gljivama dovodi do procesa biodeterioracije što često ima za posledicu promenu njihovog izgleda i vrednosti. Prisustvo spore gljiva u zatvorenom prostoru može biti jedan od uzročnika „sindroma bolesne zgrade” (SBS). (Godish, 2001). SBS predstavlja skup simptoma (alergijske reakcije, astma, umor, gla- vobolja, mučnina, suva koža, iritacija očiju i nosa), koji se javljaju usled dugog boravka u zatvorenim prostorijama, a posledica je lošeg kvaliteta vazduha (IAQ). Prisustvo spora gljiva u visokoj koncentraciji u zatvorenim prostorijama snižava IAQ. SBS se prvi put pominje u izveštaju Svetske zdravstvene organizacije (WHO) iz 1990. godine (Godish, 2001). Spore gljiva dospevaju u zatvorene prostore iz spoljašnje sredine kroz različite tipove otvora (prozori, vrata, ventilacioni sistemi i dr.) ili ih ljudi unose na svojoj odeći (Niesler i dr., 2010; Ljaljević Grbić i dr., 2008). U svetu još uvek nije prihvaćena zvanična standardizacija kontaminacije zatvore- nih prostora sporama gljiva. Prema Wonder Makers Environmental, Inc., (2001) i prema Eagle Industrial Hygiene Associates (2004), zatvoreni prostor se smatra kontaminiranim ako je CFU m-3 veći od 1000. Radler de Aquino i de Góes, (2000) smatraju da nivo broj vijabilnih propagula gljiva u zatvorenim prostorijama ne sme biti procenjen na više od 750 CFU m-3, dok Kolwzan i dr. (2006) smatraju da je već preko 300 CFU m-3 kritič- no. U praksi se još poštuju preporuke WHO iz 1990 godine po kojima se koncentracija vijabilnih propagula gljiva u vazduhu zatvorenih prostorija toleriše ako ne prelazi 500 CFU m-3. Poređenjem dobijenih rezultata istraživanja sa svetskim standardima, može se 111 Rezultati i diskusija zaključiti da su ispitivane prostorije u Srbiji umereno kontamirane. Najveća koncentraci- ja vijabilnih propagula gljiva bila je u depou za skladištenje eksponata iz srednjeg veka Muzeja grada Beograda (366,60 ± 9,80 CFU m-3, n = 4), što je ispod kritičnog nivoa preporuke WHO. Imajući u vidu namenu prostorije, vrednost CFU m-3 svakako nije za- nemerljiva i zahteva primenu preventivnih mera, kao i konstantno praćenje stanja. Borre- go i dr. (2010) su takođe koristili metodu pasivne sedimentacije po Omelijanskom za procenu fungalne kontaminacije u Bibliteci fotografija Nacionalnog arhiva Kube (Pho- tographic Library of the National Archive of the Republic of Cuba, PLNARC) i u isto- rijskom arhivu Muzeja La Plata (Historical Archive of the Museum La Plata, HAMP). U PLNARC fungalna kontaminacija je procenjena na 492,8 CFU m-3, a u HAMP 229,9 CFU m-3. Ovi autori razlike u koncentraciji vijabilnih propagula gljiva tumače različitim okruženjem objekata. PLNARC je smešten u šumskom okruženju, gde je u prirodnim uslovima veća koncentracija vijabilnih propagula gljiva, a samim tim veći je influks spo- ra iz spoljašnje sredine, dok je HAMP smešten u urbanoj sredini. Imajući u vidu da su svi ispitivani prostori u Srbiji u urbanom okruženju, CFU vrednosti su bliske procenjenim vrednostima u HAMP. Metoda pasivne sedimentacije je često korišćena za ispitivanje aeromikobiote mno- gih zatvorenih prostorija. Ovom metodom su Bogomolova i Kirtsideli (2009) ispitivali prisustvo gljiva u vazduhu stanica podzemne železnice u Moskvi i Sankt Petersburgu, a procenu brojnosti vijabilnih propagula gljiva uradili metodom po Omelijanskom. U svim ispitivanim stanicama CFU vrednost bila je ispod dozvoljene gornje granice po WHO, osim u slučaju stanice Гости́ный двор u Sankt Petersburgu (864 ± 374 CFU m-3). Ima- jući u vidu da je ova stanica najprometnija i da dnevno kroz nju prođe više od 49 000 putnika, rezultat sugeriše da je i ljudski faktor vrlo bitan za dospevanje spora gljiva u zatvorene prostore. Sa stanovišta potencijalnog rizika po zdravlje ljudi koji borave u zatvorenim prosto- rijama, osim brojnosti vijabilnih propagula gljiva u vazduhu bitan je kvalitativni sastav prisutnih zajednica mikromiceta. U vazduhu svih ispitivanih zatvorenih prostorija koje 112 Rezultati i diskusija predstavljaju depoe za skladištenje umetničkih dela i izložbene prostore najveću frekven- cu izolacije imale su vrste rodova: Cladosporium, Penicilium, Aspergillus i Trichoderma. Izolovane mikromicete mogu uticati na IAQ i biti uzročnici SBS, pre svega alerijskih reakcija i respiratornih smetnji. Predstavnici rodova Cladosporium i Alternaria su glavni izazivači alergijskih reakcija u zatvorenim prostorijama (Achatz i dr., 1995). Konstan- tno izlaganje visokim koncentracijama spora vrsta roda Cladosporium uzrokuje hroničnu astmu i jake alergijske reakcije (Flanning i dr., 2001). Iz konidija velikog broja vrsta rodova Aspergillus i Penicillium izolovani su mnogi protenski molekuli koji se vezuju za imunoglobulin G (IgG) i izazivaju alergijske reakcije (Schwab i Straus, 2004). Izolovana vrsta A. versicolor, sa značajnom učestalošću (11,76%), je producent proteina Asp v 13 koji deluje kao snažan alergen (Shi i Miller, 2011). Takođe, A. niger je producent alergena označenih Asp n 14 i Asp n 18 (Knutsen i dr., 2011). Niesler i dr. (2010) su proučavali kontaminaciju vazduha u depou za skladištenje slika, mapa i predmeta koji su pripadali lo- gorašima u muzejskom kompleksu Aušvic­Birkenau i pronašli dominaciju filamentoznih gljiva u odnosu na kvasce što je u saglasnosti sa dobijenim rezultatima. Ovi autori kao najfrekventnije izolate navode vrste rodova Acremonium, Aspergillus, Aureubasidium, Rhizopus i Ulocladium, dok su samo vrste roda Aspergillus bile među frekventnijim u ovim istraživanjima. Međutim, rezultati analize vazduha iz depoa za skladištenje sta- rih mapa u Nacionalnom arhivu Republike Kube autora Guiamet i dr. (2011) u velikom procentu podudaraju sa dobijenim rezultatima (Aspergillus, Cladosporium, Penicillium i Syncephalastrum). Poređenjem rezultata ovih istraživanja može se zaključiti da sastav aeromikobiote zatvorenih prostorija uglavnom čine propagule vrsta koje obilno sporulišu i produkuju sitne spore u masi. Na supstratu od drveta metodom sterilnog brisa izolovane su vrste rodova Absidia, Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Epicoccum, Neurospora, Penicil- lium, Rhizopus, Syncephalastrum, Trichoderma i Ulocladium. Neke od izolovanih vrsta zabeležene su i na drugim umetničkim predmetima od drveta, tako Fazio i dr. (2010) su sa- opštili da mikromicete C. globosum i N. sphaerica kolonizuju jezuitsku drvenu skulpturu, 113 Rezultati i diskusija deponovanu u Prirodnjačkom muzeju u Buenos Ajresu (Argentina). Mnogo veći broj mi- kromiceta (vrste rodova Cadophora, Cladosporium, Geomyces, Cryptococcus, Hormone- ma, Rhodotorula i Fusarium) kolonizovao je arheološko drvo od koga su izgrađene kolibe za potrebe naučnoistraživačke ekspedicije istraživača Robert F. Scott i Ernest Shackleton na Antarktiku u periodu od 1901. do 1911 (Arenz i dr., 2006). Takođe, sa arhološkog drva sa nalazišta iz perioda Neolita u Grčkoj Dispilio, izolovane su vrste rodova Acremonium, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Fusarium, Mucor, Penicillium, Stachybotrys, Stemphylium, Trichoderma (Pournou i Bogomolova, 2009). Poređenjem rezultata ovih istraživanja uočava se veliki broj zajedničkih taksona mikromiceta saopštenih na supstratu od drveta. Dominantan tip bioderioracije na ovom tipu supstrata je hemijska asimilaciona biodeterioracija i većina gljiva koje kolonizuje drvo produkuje celulolitičke i ligninoli- tičke enzime koji dovode do truljenja i devastacije predmeta od drveta. U zavisnosti od tipa enzimskog kompleksa koje posuduju i tipa promene koje se javljaju na predmetima od drveta kolonizatori drveta se mogu podeliti u nekoliko grupa: izazivači bele truleži, izazivači mrke truleži i izazivači meke truleži (Erickson i dr. 1990). Ipak, primarni ko- lonizatori supstrata od drveta su oportunističke vrste sposobne da kao izvore ugljenika i azota koriste proste šećere, hemicelulozu, proteine i aminokiseline (Florian, 2002). Vrste sposobne da razlažu celulozu i lignin kolonizuju supstrat od drveta ako je supstrat bio vlažan tokom dužeg perioda vremena. C. globosum i Alternaria sp. produkuju enzime koji razlažu supstrate od drveta, i zabeležene su na drvenim skulpturama i edukativnim igračkama iz zbirke Marka Crnobrnje, koje su natopljene vodom tokom poplave u Turskoj. C. globosum spada u grupu gljiva izazivača meke truleže i ima sposobnost razlaganja ce- luloze u S2 sloju sekundarnog ćelijskog zida biljaka (Popescu i dr., 2011), dok vrste roda Alternaria produkuju veliki broja enzima sposobnih da hidrolizuju celulozu do molekula glukoze (Sohail i dr., 2011). Na umetničkim slikama, na bojenom sloju zabeležene su brojne mikromicete klasi- fikovane u 11 rodova, od kojih je 6 identifikovanih rodova zabeleženo i na poleđini sli- karskog platna a C. globosum i Wardomyces sp. su karakteristični za platno. Za razliku 114 Rezultati i diskusija od zidnih slika i murala čija je mikrobiološka kontaminacija bila predmet mnogih istra- živanja, umetničke slike su retko istraživane sa ovog aspekta, i stoga ne postoji veliki broj literaturnih podataka iz ove oblasti. Vukojević i Ljaljević Grbić (2011) su prouča- vali kontaminaciju umetničkih slika u 11 muzeja u Srbiji i najučestaliji taksoni su u veli- koj meri podudarni kao i u ovim istraživanjima. Raznovrsnost mikromiceta je bila veća u istraživanju Vukojević i Ljaljević Grbić (2011) gde su zabeleženi i rodovi Aureobasi- dium, Geotrichum, Graphium i Mucor, dok jedino vrste roda Neurospora nisu nađene. Istraživanja Inoue i Koyano (1991) su potvrdila da su vrste rodova Alternaria, Aspergil- lus, Cladosporium, Fusarium, Penicillium i Trichoderma česti kolonizatori umetničkih slika oslikane metodom ulja na platnu. Poređenjem navedenih istraživanja uočava se ve- liki broj zajedničkih taksona zabeleženih na površini i platnima umetničkih slika. Fotografski papir je retko proučavan sa stanovištva fungalne kolonizacije. Umet- ničke fotografije imaju slojevitu strukturu i sastoje se od papirne osnove, materijala po- trebnih za formiranje slike i emulzionih gelova koji služe kao vezivo. Delovi fotografi- ja najpodložniji kolonizaciji mikromicetama su papirna osnova i emulzije (Lourenço i Sampaio, 2009). Proučavnjem biodeterioracije fotografskog papira skladištenog u PL- NARC i HAMP i saopšeno je su da ga od filamentoznih gljiva kolonizuju samo vrste rodova Aspergillus i Penicillium, dok su glavni uzročnici propadanja kvasci i bakterije (Borrego i dr., 2010). Ipak, u slučaju zbirke oštećenih fotografija Aleksandra Rafajlovi- ća, može se zaključiti da su filamentozne gljive glavni uzročnik propadanja fotografija. Možda je objašnjenje ovih razlika u tome što je ova zbirka poplavljena pa vlažan foto- grafski papir postao povoljni supstrat za kolonizaciju filamentoznim gljivama koje su sposobne da svojim enzimskim kompleksima vrše hemijsku disimilacionu biodeterio- raciju. Metoda adhezivne trake, kojom je moguće direktno posmatrati mikroorganizme prisutne na različitim površinama spada u destruktivne metode koje mogu dodatno ošte- titi umetničko delo, pa se stoga izbegava ili selektivno koristi prilikom proučavanja bio- deterioracije umetničkih predmeta. Imajući u vidu da su fotografije iz zbirke Aleksandra Rafajlovića potpuno devastirane, ova metoda je mogla biti primenjena. 115 Rezultati i diskusija 5.3 Mikromicete izolovane sa zidnih slika U cilju proučavanja biodeterioracije zidnih slika crkvi i manastira u Srbiji metodom sterilnog brisa izvršeno je uzorkovanje vijabilnih propagula gljiva prisutnih na površini oslikanih zidova. Simptomi biodeterioracije koji se na zidnim slikama javljaju najčešće u vidu promene originalne obojenosti opisani su prilikom opservacije spomenika in situ. Uzorkovanje plesni je izvršeno sa zidnih slika na sledećim lokalitetima: Crkva Sve- tog Nikole u Paležu, Crkva Svete Bogorodice Manastira Gradac i Crkva Svete Trojice Manastira Sopoćani. 5.3.1 Mikromicete izolovane sa zidnih slika Crkve Svetog Nikole u Paležu Opservacija in situ i simptomi Opservacijom in situ konstatovana je promena inten- ziteta originalnih slikarskih boja korišćenih prilikom osli- kavanja zidova kao i promena teksture površine freske i maltera (Slika 67). Mikromicete sa zidnih slika Sa 4 uzorkovana mesta sa vidljivim simtomima bio- deterioracije izolovano je ukupno 7 taksona filamentoznih gljiva: 6 taksona pripada klasi Hyphomycetes, podrazdela Deuteromycotina. Jedan takson nije identifikovan do nivoa, ali se na osnovu prisustva piknidija zauključuje da pripada klasi Coelomycetes (Deuteromycotina). Taksoni identifikovani do nivoa roda ili vrste na zidnim slikama Crkve Svetog Nikole su: A. favus, C. cladosporioides E. purpurascens, P. aurantiogriseum i Penicillium spp. Slika 67. Simptomi deterioracije freske Crkve Svetog Nikole u Paležu: dekolorizacija i promena u teksturi 116 Rezultati i diskusija Nakon kultivacije na inokulisanim hranljivim podlogama dominirale su kolonije ma- log prečnika vrsta roda Penicillium (Slika 68). Broj kolonija gljiva po Petri kutiji (CFU) iznosio je više od 500. 5.3.2 Mikromicete izolovane sa zidnih slika Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac Opservacija in situ i simptomi Opservacijom in situ uočena je totalna devastacija zidne slike. Na preostalom fra- gmentu freske vidljive su promene u vidu gubljenja boje i diskoloracija originalnih boja (Slika 69a). U bliskom okruženju fragmenta freske, u udubljenjima u malteru konstato- vano je prisustvo gustog, zelenog biofilma (Slika 69b). Mikromicete sa zidnih slika Sa 4 uzorkovana mesta sa vidljivim simtomima biodeterioracije izolovano je 4 tak- sona filamentoznih gljiva. Sve identifikovane mikromicete pripadaju klasi Hyphomycetes (Deuteromycotina). Vrste roda Aspergillus bile su predstavljene sa tri od 4 identifikovane vrste: A. fumigatus, Emericella nidulans (Eidam) G. Winter (anamorf: A. nidulans (Ei- dam) G. Winter) i A. versicolor. U primarim izolatima pored navedenih bio je prisutan i Penicillium sp. (Slika 70). Slika 68. A.,B. Primarni izolati mikromiceta sa freske na Crkvi Svetog Nikole u Paležu 117 Rezultati i diskusija Slika 69. Simptomi deterioracije fragmenta freske Crkve Svete Bogorodice manastira Gradac: a. diskoloracija bojenog sloja; b. biofilm u udubljenjima na malteru Slika 70. Primarni izolati mikromiceta sa freske u crkvi Svete Bogorodice manastira Gradac 118 Rezultati i diskusija 5.3.3. Mikromicete izolovane sa zidnih slika Crkve Svete Trojice manastira Sopoćani Opservacija in situ i simptomi Opservacijom in situ konstatovana je promena intenziteta originalnih slikarskih boja korišćenih prilikom oslikavanja zidova. Na zlatno obojenom sloju konstatovana su mrko obojena polja nepravilnog oblika (Slika 71A i B). Slika 71. Simptomi deterioracije fresaka Crkve Svete Trojice manastira Sopoćani: A., B. diskoloracije zlatno obojenog sloja u vidu mrkih polja 119 Rezultati i diskusija Mikromicete sa zidnih slika Sa 9 uzorkovanih mesta sa vidljivim simptomima biodeterioracije identifikovano je 7 taksona gljiva. Svi taksoni pripadaju klasi Hyphomycetes. Taksoni identifikovani do nivoa roda ili vrste na zidnim slikama Manastira Sopoćani su: A. alternata, A. niger, C. cladosporioides, C. sphaerospermum, E. purpurascens, N. sphaerica i Penicillium ochro- chloron Biourge (Slika 72). * * * Korišććena metoda sterilnog je nedestruktivna i vrlo primenljiv za uzorkovanje mi- kromiceta sa objekata kulturne baštine, uključujući i zidne slike. Vrste rodova Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Nigrospora i Penicillium su zabeležene na zidnim slikama u srpskim crkvama i manastirima. Najveću učestalost izolacije imale su vrste rodova Aspergillus i Penicillium koje su zabeležene na svim istraživanim zidnim slika- ma. Biodeterioracija zidnih slika prouzrokovana gljivama u mnogim sakralnim objetima široma sveta bila je predmet mnogih istraživanja. Guglielmineti i dr. (1994) proučavajući Slika 72. Primarni izolati mikromiceta sa freske u crkve Svete Trojice manastira Sopoćani 120 Rezultati i diskusija biodeteriorizaciju murala i fresaka u manastiru Sveti Demijan u Asizi (Italija) na slikama “Crocifisso con Francesco giovane” i “Mensa di S. Chiara zabeležili su veću raznovrsnost mikromiceta (Alternaria spp., Aspergillus spp., Cladosporium spp., Fusarium spp. i Pe- nicillium spp.) ”. Tako, 20 morfološki različitih gljiva iz rodova Acremonium, Aspergil- lus, Blastobotrys, Cladosporium, Engyodontium, Mortierella, Penicillium i Verticillium je identifikovane su sa srednjovekovnih zidnih slika Kapele zamka Herberštajn (Schloss Herberstein) i Parohijskoj Crkvi Sveti Georgije u Štajerskoj, Austriji (Berner i dr., 1997). Gorbushina i Petersen (2000) su proučavali razvoj biofilma na zidnim slikama u Nemač- koj: Parohijskoj crkvi u Kodersdorfu sa zidnim slikarstvom iz XVIII veka, crkvi Svetog Petra i Pola sa freskama koje datiraju iz XII veka ali su bojene 1894. godine, i crkvi Sveti Martin u Grin Krajnsenu sa freskama iz XVI veka koje su ponovo bojene 1716. godine. Autori su izolovali oko 15 vrsta mikromiceta gde su značajni udeo imale vrste rodova Acremonium, Aspergillus i Cladosporium, često izolovane i sa drugih proučavanih fresko slika. Većina izolovanih gljiva spada u grupu halotolerantnih i uspešno su se razvijale na hranljivoj podlozi MEA obogaćenoj 10% NaCl. Ovo ukazuje da su gljive, koje kolonizuju freske, sposobne da se razvijaju u uslovima visokog osmotskog pritiska u spoljašnjoj sre- dini. Milanesi i dr. (2006) su proučavali biodeterioraciju fresaka u kapeli Svete Katarine u Sijeni (Italija) prouzrokovanu filamentoznim gljivama. Molekularnim metodama utvrdili su da je P. chrysogenum uzročnik deterioracije zidnih slika. Poređenjem predstavljenih rezultata različitih istraživanja uočava se veliki broj zajedničkih taksona gljiva izolovanih sa zidnih slika, posebno vrste rodova Aspergillus i Penicillium. Kako veliki broj vrsta ova 2 roda su kserofilne gljive, to objašnjava njihovu učestalu pojavu na zidnim slikama gde je niska vrednost aw (Dix i Webster, 1995). Pored toga, zidne slike su specifičan supstrat i po svom hemijskom sastavu, pa ova dva faktora imaju ključni uticaj na vrstu kolonizatora ali svakako dominiraju gljive adaptirane na vodni deficit. Iako je broj morfološki različitih izolata identifikovanih na zidnim slikama u crkvama i manastirima u Srbiji relativno mali, imajući u vidu sposobnost gljiva da trajno i irever- zibilno izmene ovaj supstrat, broj identifikovanih taksona nije zanemarljiv. Penetracijom 121 Rezultati i diskusija hifa kroz oslikane slojeve dolazi do eksfolijacije bojenog sloja od podloge. Produkcijom enzima, neorganskih i organskih kiselina gljive oksiduju ili redukuju komponente supstra- ta zidnih slika i trajno ih oštećuju (Berner i dr., 1997). 5.4 Opis identifikovanih taksona mikromiceta na kulturno­istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima Tokom ispitivanja mikobiote na kulturno istorijskim objektima i umetničkim pred- metima do nivoa vrste identifikovano je 38 izolata gljiva. Podrazdeo Zygomycotina je zastupljen sa 5 vrsta iz klase Zygomycetes. Iz podrazdela Ascomycotina identifikovane su po dve vrste iz klasa Pyrenomycetes i Plectomycetes. Najveći broj vrsta pripada klasi Hyphomycetes podrazdela Deuteromycotina (29), dok samo jedna identifikovana vrsta pripada klasi Blastomycetes podrazdela Deuteromycotina (S. roseus) (Tabela 17). Izolati određeni do nivoa roda na predmetima i objektima kulturne baštine, kao i u vazduhu za- tvorenih prostorija institucija kulture su Alternaria spp., Aspergillus sp., Cladosporium spp., Drechslera sp., Gliomastix sp., Fusarium spp., Humicola sp, Mucor sp., Paecilomy- ces sp., Penicillium spp., Phoma spp., Stemphylium sp., Ulocladium sp. i Wardomyces sp. Osim izolata Mucor sp. svi ostali pripadaju klasama Coelomycetes i Hyphomycetes (De- uteromycotina). Takođe, određeni broj izolata nije formirao reproduktivne strukture tako da nije bila moguća njihova identifikacija do nivoa roda ili vrste, pa su označene kao M. sterilia. Na osnovu građe micelije i ranijih iskustava ovi izolati najverovatnije pripadaju podrazdelu Deuteromycotina. Sve izolovane vrste su predstavljene originalnim fotografijama izuzev A. strictum, A. pullulans, E. purpurascens, S. roseus, S. racemosum i T. viride preuzetih sa interneta i F. oxysporum, F. sambucinum, dobijenih od dr Jelene Lević. 122 Rezultati i diskusija Podrazdeo Klasa Vrsta Zygomycotina Zygomycetes Absidia corymbifera (Cohn) Sacc. & Trotter Cunninghamella echinulata (Thaxt.) Thaxt Mucor P. Micheli ex L. Sp. Mucor racemosus Bull. Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. Syncephalastrum racemosum Cohn Ascomycotina Pyrenomycetes Chaetomium globosum KünzeNeurospora crassa Shear & B.O. Dodge Plectomycetes Emericella nidulans (Eidam) Vuill.Eurotium pseudoglaucum (Blochwitz) Malloch & Cain Deuteromycotina Coelomycetes Phoma Fr. spp. Blastomycetes Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel Hyphomycetes Acremonium strictum W. Gams Alternaria Ness sp. Alternaria alternata (Fr.) Keissl. Aspergillus P. Micheli ex Link sp. Aspergillus flavus Link Aspergillus fumigatus Fressen Aspergillus niger Tiegh Aspergillus ochraceus G. Wilh Aspergillus terreus Thom Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud Bipolaris spicifera (Bainier) Subram Cladosporium Link sp. Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Cladosporium macrocarpum Preuss Cladosporium sphaerospermum Penz. Drechslera S. Ito sp. Drechslera dematoidea (Bubák & Wróbl.) Scharif Epicoccum purpurascens Ehrenb Fusarium Link spp. Fusarium oxysporum Schl. Fusarium sambucinum Fuckel Geotrichum candidum Link Gliomastix Guég sp. Graphium putredinis (Corda) S. Hughes Humicola Traen sp. Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason Paecilomyces Bainer sp. Paecylomyces variotii Bainier Penicillium Link sp. Penicillium expansum Link Penicillium ochrochloron Biourge Penicillium verrucosum Dierckx Penicillium aurantiogriseum Dierckx Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier Stemphylium Wallr. sp. Trichoderma viride Pers. Ulocladium Preuss sp. Ulocladium chartarum Preuss Simmons Ulocladium oudemansii E.G. Simmons Wardomyces F.T. Brooks & Hansf. sp. Tabela 17. Spisak identifikovanih taksona sa kulturno­istorijskih spomenika i umetničkih predmeta i vazduha zatvorenih prostorija institucija kulture i njihova taksonomska pripadnost 123 Rezultati i diskusija 5.4.1 Zygomycotina Absidia corymbifera (Cohn) Sacc. & Trotter Morfologija: micelija raste vrlo brzo i prerasta Petri kutiju (Ø 9 cm), za manje od nedelju dana, formirajuću sivkastu paučinastu koloniju. Stoloni su 5­20 µm dugi, često sa kapljicama, hijalini ili smeđu, glatkih zidova. Granati rizoidi se obrazuju na zadebljanjima stolona, i dugi su do 370 µm. Sporangiofori su hijalini ili blago pigmentisani, glatki ili bla- go hrapavih zidova, retko granati, uzdižu se pojedinačno sa stolona ili u grupama od 3 do 7, dimenzija 40­500 × 3­13 µm (Slika 73). Sporangija je kruškasta, 10­40 µm u prečniku, u početku hijalina, a sa sazrevanjem postaje sivo mrka. Zid sporangije je providan, gladak ili blago hrapav. Kolumela je hijalina ili siva, loptasta ili jajasta ponekad sa kragnom, Ø 7­30 µm (Slika 73). Sporangiospore su poluloptaste ili duguljasto elipsaste, hijaline ili svetlo sive, glatkih zidova, dimenzija 2,5­7 × 2,5­4,5 µm. Zigospore su loptaste ili blago spljoštene, smeđe, debelih zidova, sa nekoliko ekvatorijalnih grebena, Ø 40­95 µm. Ekologija i rasprostranjenje: kosmopolitska vrsta, izolovana sa različitih supstrata (zemljište, izmet, namirnice, mleko, zrna žita). Ređe se javlja na životinjama (Samson i dr., 2004). Nalaz: drvene edukativne igračke (DKC/4). Slika 73. Absidia corymbifera, sporangiofor sa kolumelom i sporangijom 124 Rezultati i diskusija Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: unu- trašnji zidovi katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); stubovi kripte „Abbey of Montecorona“, Peruđa, Italija (Cataldo i dr., 2008). Cunninghamella echinulata (Thaxt.) Thaxt Morfologija: u kulturi micelija raste vrlo brzo i prerasta Petri kutiju (Ø 9 cm) za manje od nedelju dana, formirajuću belo­sivu paučinastu koloniju. Glavnu masu kolonije čine uspravni sporangiofori koji se granaju verticilatno ili simpodijalno, dužine preko 800 µm (Slika 74). Sa njihove osnove polaze rizoidi. Sporangiofor i grane se terminalno zavr- šavaju sporangijom, koja je hijalina ili svetlo smeđa, loptasta ili poluloptasta. Sporangija formirana na sprangioforu je krupnija, dimenzija 25­37,5 × 20­35 μm, dok je formirana na granama sitnija, 13­23 × 11­20 μm (Slika 74). Sporangiospore su jednoćelijske i poje- dinačne, loptaste, ređe jajaste, Ø 8,7­14 μm, ornamentisane sa šiljcima dugim od 2,5 do 3,8 μm. Na sporangiosporama se nekada mogu formirati kristalne strukture. Slika 74. Cunninghamella echinulata, sporangiofor sa sporangijama 125 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kosmopolitsko rasprostranjenje, ali je učes- talija u uslovima tople klime. Izolovana je iz vazduha, i zemljišta, i sa biljnog materijala. Nalaz: granit (NJ) i karbonatni kamen (SS). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: zid- ne slike iz XIV do XVII veka u manastirima Voronet, Sučevita, Humor, Arbore, Patrate, Varatec, Agapia, Putna, Kozia i crkvi Curtea de Arges, Severna Moldavija, (Savulescu i Ionita, 1971). Mucor racemosus Bull. Morfologija: u kulturi micelija raste vrlo brzo i prerasta Petri kutiju (Ø 9 cm) za manje od nedelju dana, formirajuću sivo–smeđu paučinastu koloniju. Glavnu masu kolonije čine kratki i dugi sporangiofori koji se granaju monopodijalno ili simpodijalno (Slika 75). Kratke grane su uglavnom zakrivljene sa inkrustacijama na ćelijskom zidu. Sporangije su hijaline, sa starenjem postaju smeđe, bodljikavih zidova, do 70 µm u prečniku (Slika 75). Kolumela je jajasta, ili blago kruškolika, najčešće sa skraćenom bazom, svetlo smeđe boje sa kragnom, Ø 37­55 µm. Sporangiospore su eliptične ili poluloptaste, glatkih zidova, sivkaste, dimen- zija 5,5­10 × 4­7 µm. Hlamidospore su brojne, često i u sporangiforima, nekad i u kolumeli, oblika su bureta kad su mlade, poluloptaste u starijim kulturama, žućkaste boje. Zigospore su crveno–smeđe ili svetlo smeđe, loptaste ili poluloptaste, do 110 µm. Na površini zigospora obrazuju se kratke bodlje do 5 µm dužine. Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kosmopolitsku distribuci- ju, a izolovana je sa različitih sup- strata (zemljište, izmet, namirnice, mleko, semena žitarica). Kolonizu- je je i životinje (Samson i dr., 2004). Slika 75. Mucor racemosus, sporangiofori i sporangije 126 Rezultati i diskusija Nalaz: kamen peščar (BM). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: ki- nematografski filmovi deponovani u muzejima i arhivama u Madridu, Barseloni i Gran Kanariji (Abrusci i dr., 2005). Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill. Morfologija: micelija raste vrlo brzo u kulturi i za 7 dana prerasta Petri kutiju (Ø 9 cm) i formira belu paučinastu koloniju koja sa starenjem postaje sivo–smeđa usled obrazovanja smeđih sporangiofora i crno­smeđe sporangije. Visina kolonije može da dostigne i 20 mm. Sporangiofori su 1,5­4 mm visoki, pojedinačni ili u grupama od 2 do 7 (Slika 76). Uzdižu se sa bezbojnih ili tamno smeđih stolona sa grubim zidovima, sa kojih polaze i granati rizoidi (Slika 76). Sporangija je loptasta ili poluloptasta, Ø 50­360 µm, crno smeđe boje kad sazri (Slika 76). Kolumela je loptasta, poluloptasta, ili jajasta, Ø 40­250 µm. Sporangiospore su različitog oblika, često poligonalne ili jajaste, eliptične sa strijama, dimenzija 4­5 × 6­8 µm. Hlamidospore se nikad ne formiraju na stolonama, ali se ponekad mogu obrazovati na hifama. Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kosmopolitsku distribuciju i izolovana je iz zemljišta, žita, voća, povrća, orašica. Spore ove vrste su česte u vazduhu. Iako ima kosmo- politsko rasprostranjenje, češća je u toplijim krajevima (Samson i dr., 2004). Slika 76. Rhizopus stolonifer, rizoidi i sporangiofori sa sporangijama 127 Rezultati i diskusija Nalaz: kamen peščar (AP); drvena skulptura (MIJ/1); drveni ramovi slika (GSSŠ/3, GSSŠ/12 i GSSŠ/14); drveni sanduk (DKC/5); bojeni slojevi slika (MGB/8, GSSŠ/2); fotografski papir (MGB/13) i vazduh (MSU). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: vazduh katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); vazduh galerije egi- patskih i vavilonskih eksponata Muzeja Baroda, Indija (Arya i dr., 2001); bojeni slojevi sli- ka i drveni ramovi umetniških slika u 11 muzeja, Srbija (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010). Syncephalastrum racemosum Cohn. Morfologija: micelija raste vrlo brzo u kulturi i prerasta Petri kutiju (Ø 9 cm) za ma- nje od nedelju dana, formirajuću belu paučinastu koloniju koja sa starenjem postaje siva. Visina kolonije dostiže i do 15 mm. So- matske hife su hijaline, granate. Septe se javljaju samo prilikom formiranja reproduktivnih struktura. Glavni spo- rangiofor polazi sa rizoida, nosi veliki broj izuvijanih bočnih grana, i završava se terminalnom vezikulom (Slika 77) a bočne grane lateralnom vezikulom. Preko cele površine vezikule obrazuju se merosporangije (Slika 77). Vezikule su smeđe, loptaste ili poluloptaste, ret- ko jajaste. Terminalna vezikula je 30­40 µm, a lateralne 10­40 µm u prečniku. Merosporangije su sive, cilindrične, di- menzija 15­33 × 4 µm i sadrže 5 do 18 merospora. Merospore su loptaste ili jajaste, svetlo smeđe, blago grubih zidova, Ø 2,5­6,5 µm (Slika 77). Zigospore su loptaste, Ø 50­90 µm, narandžasto–smeđe boje i formiraju se uglavnom u supstratnoj miceliji. Slika 77. Syncephalastrum racemosum, glavni sporangiofor sa terminalnom vezikulom, merosporangijom i merosporama. 128 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta je izolovana iz hrane, izmeta, žita. Češća je u tropskim i subtropskim krajevima (Samson i dr., 2004). Nalaz: drvene edukativne igračke (DKC/4). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmeti- ma: vazduh galerije egipatskih i vavilonskih eksponata Muzeja Baroda, Indija (Arya i dr., 2001). 5.4.2 Ascomycotina Chaetomium globosum Kunze Morfologija: raste relativno brzo (5­7,5 cm, 10 dana, MEA) i formira maslinasto­sme- đu koloniju. Boja kolonije potiče od gusto pakovanih peritecija. Periticije su crno–smeđe, loptaste ili jajaste, obrasle velikim brojem tamnih hifa (hete ili dlake), dimenzija 150­350 µm (Slika 78A i B). Askusi su klavatni i sadrže 8 askospora. Askospore su limunaste, sa apikalnom klijajućom porom, dimenzija 9­11 × 7­8,5 µm (Slika 78C i D). Askusi se razlažu se dok su u periteciji i oslobađaju askospore u masi zajedno sa mucilogenom supstancom kroz ostiolum. Slika 78. Chaetomium globosum: A,B. peritecija sa hetama; C,D. askospore 129 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kosmopolitsko rasprostranjenje i često je izolovana sa celuloznih supstrata (Samson i dr., 2004). Nalaz: drveni sanduk (DKC/1 i DKC/5) i naličje slike (MIJ/10). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: polihromna drvena skulptura poreklom iz Južne Amerike, Prirodnjački muzej La Plata, Buenoa Aires, Argentina, (Fazio i dr., 2010); istorijski papirni dokumenti iz 18. i 19. veka, Kolekcija Porodice Tilman, Merilend, SAD (Szczepanowska i Cavaliere, 2000); vazduh katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); knjiga iz 19.veka sa simpto- mima foksinga (Rakotonirainy i dr., 2007) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Emericella nidulans (Eidam) Vuill. Anamorf: Aspergillus nidulans (Eidam) G. Winter Morfologija: u kulturi raste relativno sporo i formira tamno zelenu koloniju. Nakon obrazovanja kleistotecija, na koloniji se uočavaju žute ili narandžaste zone. Smeđi eksku- dat je često prisutan na površini micelije. Kleistotecije su smeđe ili crne, Ø 100­200 μm, često okružene sa Hülle ćelijama (Slika 79A). Askospore su crveno­smeđe, sočivastog oblika, Ø 4­5 μm, često sa dva longitudinalna grebena. Hife su hijaline, glavice su kolum- narne. Konidiofori su u nijansama smeđe boje, glatkih zidova dužine 60­150 μm i uzdižu se sa stopaone ćelije (Slika 79B). Vezikule su poluloptaste, Ø 8­12 μm. Metule i fijalide se vezuju samo na gornjem delu vezikule (biserijatni tip). Konidije su loptaste i hrapavih zidova, Ø 3­4 μm (Slika 79B). Ekologija i rasprostranjenje: vrsta je široko rasprostranjena i često izolovana iz zemljišta. Kolonizuje i vlažne zidove (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje nidulotoksin i sterigmatocistin (Samson i dr., 2004). Nalaz: zidne slike crkve svete Bogorodice (MG). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: knji- ga iz šesnaestog veka sa simptomima foksinga (Michaelsen i dr., 2009); kinematografski 130 Rezultati i diskusija filmovi deponovani u muzejima i arhivama u Madridu, Barseloni i Gran Kanariji (Abrusci i dr., 2005); kamen peščar, tvrđava Gwalior Fort, Indija (Pandey i dr., 2011) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Eurotium pseudoglaucum (Blochwitz) Malloch & Cain Anamorf: Aspergillus pseudoglaucus Blochwitz Morfologija: u kulturi formira sivo­tirkiznu koloniju, koja sa starenjem postaje ta- mno zelena i žuta u centru. Žute zone u centru kolonije su posledica obrazovanja kleisto- tecija. Hife su hijaline, a glavice radijatne. Prosečna dužina konidiofora je od 200­350 μm. Vezikule su loptaste ili poluloptaste i uvek uniserijatne. Fijalide se obrazuju samo na gornjoj strani vezikule. Konidije su loptaste ili poluloptaste, na površini bodljikave, Ø 3,5­6,5 μm. Kleistotecije su žute, tankozide Ø 75­125 μm i obično obrasle crvenim hifama (Slika 80). Askospore su hijaline i glatke ili blago ornamentisane i poseduju jednu ekvatorijalnu brazdu. Slika 79. Emericella nidulans: A. kleistotecija; B. grupa konidiofora sa klavatnom glavicom i konidijama 131 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta je kosmopolitska, izolovana sa velikog broja različitih supstrata. Najčešće je to biljni materijal i zemljište, ali kolonizuje i celulozne supstrate, kožne predmete i tekstil. Specifični metaboliti: produkuje toksične metabolite: hloroanizol, ehinulin, eritro- glaucin i flavoglaucin. Nalaz: drvena edukativna igračka (DKC/2). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: knji- ga iz 1854 godine sa simptomima foksinga (Florian i Manning, 2000). Neurospora crassa Shear & B.O. Dodge Anamorf: Chrysonilia crassa (Shear & Dodge) v Arx Morfologija: u kulturi raste brzo (2,5 cm za jedan dan, MEA) i formira koloniju koja je u početku bezbojna, sa staranjem postaje narandžasta. Konidiogene hife su septirane, glatkih zidova i granaju se lateralno. Jednoćelijske konidije se formiraju u lancima i povezane su uskom hijalinom niti, eliptične, cilindrične, loptaste ili poluloptaste, glatkih zidova, dimenzija 5­8 x 4­6 µm (Slika 81). Askokarp je tipična periticija u kojoj se obrazuju tamne askospore. Slika 80. Eurotium pseudoglaucus, kleistotecija 132 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima široko rasprostranjene i izolovana je sa različitih supstrata. Kontaminira namirnice i poznata je kao „crvena hlebna buđ“. Spa- da u ekološku grupu fenikoidnih gljiva jer se javlja na zgarištima posle požara (Dix i Webster, 1995). Nalaz: drveni sanduk (DKC/5); skulpture od drveta (MSU/3 i MSU/5); bojeni slojevi slike (MSU/1) i vazduh (MSU i DKC). 5.4.3 Deuteromycotina Acremonium strictum W. Gams Morfologija: u kulturi raste sporo (1­2 cm za 10 dana, MEA) i obrazuje belu, hijalinu miceliju somotaste teksture. Konidiofori kratki i uglavnom negranati. Fijalide uspravne, na vrhovima zašiljene, blago obojene u bazalnom delu, 20­65 μm duge. Konidije slepljene sluzavim supstancama u glavice (Slika 82). Konidije cilindrične ili eliptične, dimenzija 3,3­5,8 x 0,9­1,8 μm. Ćelijski zid konidija je hijalin i gladak. Ekologija i rasprostranjenje: široko rasprostranjena vrsta, često izolovana iz zemlji- šta, biljnog materijala i vlažnih površina u zatvorenim prostorima, ali može biti oportuni- stički patogen životinja i ljudi (Samson i dr., 2004). Nalaz: kamen peščar (AP). Slika 81. Neurospora crassa, konidije anamorfnog stadijuma Chrysonilia crassa, povezane lancima 133 Rezultati i diskusija Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: stu- bovi od breča i mermera na kripti Katedrale “Cattedrale di Otranto”, južna Italija (Cataldo i dr., 2005) i podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimo- novičova i dr., 2004). Alternaria alternata (Fr.) Keissl. Morfologija: u kulturi raste brzo (5­6 cm za 7 dana, MEA) i obrazuje vunaste sive, maslinasto zelene ili crne kolonije. Konidiofori kratki, 40­70 × 3­4 μm, svetlo smeđi, glatki, uglavnom negranati, retko sa kolenastim proširenjma. Konidije po tipu diktiospo- re, jajaste ili eliptične sa kljunom, dimenzija 25­40 × 5­12 μm. Zrele konidije su smeđe obojene i poseduju do 8 transverzalnih i nekoliko longitudinalnih septi, glatkih zidova, ređe hrapave, povezane u duge lance (Slika 83). Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kosmopolitsku distribuciju. Izolovana je sa svežeg voća, žita, povrća, vlažnog tekstila i drugih vlažnih supstrata (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje altenuen, alternariol, monometiletar, tentoksin (Samson i dr., 2004). Slika 82. Acremonium strictum, konidiofor, fijalide i konidije 134 Rezultati i diskusija Nalaz: karbonatni kamen (MG); kamen peščar (AP); drveni ram slike (GSSŠ/13); skulptura od drveta (MSU/3); poleđina slikarskog (MSU/2); zidna slika Manastira Sopo- ćani i vazduh (MGB). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: mermer- nii spomenici izloženih na terasi muzeja u Mesini, Sicilija (Urzì i dr., 2001); kinematografski filmovi deponovani u muzejima i arhivama u Madridu, Barseloni i Gran Kanariji (Abrusci i dr., 2005); fontana Gallatea a Villa Litta sa simptomima crnih mrlja, Milano (Sorlini i dr., 1994); zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994) i pod- zemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004). Aspergillus flavus Link Morfologija: u kulturi raste relativno brzo (3­5 cm za 7 dana, CZA). Kolonije su zeleno–žute, a glavica je tipično radijatna (Slika 84). Konidiofori su hijalini i hrapavi, dugi do 1,0 mm. Vezikula je loptasta ili poluloptasta, Ø 25­45 μm. Fijalide se vezuju za vezikulu indirektno preko metula (biserijatni tip). Dijametar fijalida iznosi 6­10 × 4­5,5 μm, a metula 6,5­10 × 3­5 μm. Konidije su loptaste ili poluloptaste, svetlo zelene, bodlji- kave, Ø 3,6 μm (Slika 84). Formira sklerocije nepravilnih oblika i varijabilnih dimenzija koje su svetle dok su mlade, a sa starenjem postaju crno­smeđe. Slika 83. Alternaria alternata, diktiospore u masi. 135 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta je široko rasprostranjena, ali je uglavnom izolo- vana u tropskim i suptropskim regionima. Kolonizuje različite supstrate (namirnice, drvo, pamuk, građevinski materijal). Često je izolovana sa perja ptica (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje kojičnu kiselinu, 3–nitropropionsku kiselinu, ciklo- piazoničnu kiselinu, aflatoksin B1 i aspergiličnu kiselinu (Samson i dr., 2004). Nalaz: granit (NJ); drveni slikarski ram (GSSŠ/14); drvene edukativne igračke (DKC/2); poleđina slike (MSU/2) i zidna slika u crkvi Svetog Nikole Palež. Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: muralne slike u Egiptu (Helmi i dr., 2011); vazduh zatvorenih prostorija zoološkog mu- zeja u Pandžabu (Shabir i dr., 2007); zidine drevnog hrama Deverbi u Indiji (Sharma i Agarwal, 2011); kamen peščar, tvrđava Gwalior Fort, Indija (Pandey i dr., 2011); istorijski papir topografskih mapa iz XVIII veka kolekcije “Collezione Topografica del Comune di Genova” (Zotti i dr., 2008) i unutrašnji zidovi katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007). Slika 84. Aspergillus flavus, konidiofor sa radijatnom glavicom i konidije 136 Rezultati i diskusija Aspergillus fumigatus Fresen. Morfologija: u kulturi raste relativno brzo (3­5 cm za 7 dana, CZA) i formira ta- mno zelenu koloniju. Glavica je tipično kolumnarna ili paličasta (Slika 85). Konidiofori su kratki, glatkih zidova. Vezikule su široko klavatne, fertilne samo u treminalnom delu, Ø 20­30 μm. Fi- jalide su obojene kao i konidiofo- ri i direktno se vezuju za vezikulu (uniserijatni tip). Dimenzije fijalida iznose 6­8 × 2­3 μm. Konidije su loptaste ili poluloptaste, hrapavih zidova ili bodljaste, Ø 2,5–3 μm. Ekologija i rasprostranjenje: često je utvrđena na žitima, komu- nalnom otpadu, u kućnoj prašini, kompostu, klima uređajima. Izazi- vač je respiratorne aspergiloze plu- ća (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produ- kuje gliotoksin, verukologen, fumi- tremorgin A i B, fumitoksine i triptokvivaline (Samson i dr., 2004). Nalaz: zidne slike crkve Svete Bogorodice (MG). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: zi- dine antičkih hramova u Indiji (Sharma, 2011); vitraž manastira Cartuja de Miraflores, Španija, (Carmona i dr., 2006); kamen peščar, tvrđava Gwalior Fort, Indija (Pandey i dr., 2011); unutrašnji zidovi katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Slika 85. Aspergillus fumigatus, konidiofor sa kolumnarnom glavicom 137 Rezultati i diskusija Aspergillus niger Tiegh Morfologija: u kulturi raste relatvno brzo (4­5 cm za 7 dana, CZA) i formira kom- paktan beli ili žuti bazalni sloj sa koga se uzdižu gusto pakovani tamno smeđi ili crni konidiofori. Glavica je radijatna i obično se sa starenjem kolonije podeli u kolumne (Slika 86). Konidiofori su hijalini, ali postaju smeđi u vršnom delu, glatkih zidova, dugi 400­ 3000 μm. Vezikula je loptasta ili poluloptasta, Ø 50­100 μm. Na celoj površinu vezikule se formiraju sterilne metule sa 4 konidiogenim ćelijama – fijalidama (biserijatni tip). Metule su hijaline ili smeđe, često septirane, dimenzija 15­25 × 4,5­6 μm. Dimenzije fijalida su 7­9,5 × 3­4 μm. Konidije su loptaste ili poluloptaste, Ø 3,5­5 μm, često sa nepravilnim bradavicama i grebenima. Specifični metaboliti: sintetiše nafto­γ­pirone i malformine. Pojedini izolati sintetišu i ohratoksin A (Samson i dr., 2004). Ekologija i rasprostranjenje: kosmopolitska vrsta. Čest je kontaminant na različitim supstratima kao što su suva semena, plodovi, tekstil (Samson i dr., 2004). Nalaz: drvene štafete (MIJ/3 i MIJ/4); Metalna skulptura u obliku ruke (uzorak sa drvenog dela skulpture) (MIJ/6); drveni sanduk i drvene edukativne igračke (DKC/4 i DKC/5); skulptura od drveta (MSU/5); drveni ram slike (GSSŠ/11); platno slike (MSU/2); tapiserija (MIJ/2); zidne slike Manastira Sopoćani i vazduh (DKC). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: mer- merni spomenici na Smolenskom groblju i Letnjoj bašti, Sankt Petersburg (Gorbushina Slika 86. Aspergillus niger: A. konidijalne glavice u masi (in situ); B. konidiofor sa radijatnom glavicom 138 Rezultati i diskusija i dr., 2002); mermernii spomenici izloženi na terasi muzeja u Mesini, Sicilija (Urzì i dr., 2001); vazduh katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); kamen peščar, tvrđava Gwalior Fort, Indija (Pandey i dr., 2011) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Aspergillus ochraceus G. Wilh. Morfologija: u kulturi raste relatvno brzo (2,5­3,5 cm za 7 dana, CZA) i formira oker­žutu koloniju. Boja kolonije potiče od gusto pakovanih konidijalnih glavica. Glavica je loptasta i sa starenjem se deli u dve ili više kompaktnih kolumni (Slika 87). Konidiofori su do 1,5 mm dugi, žute ili smeđe boje, hrapavih zidova. Vezikule su loptaste, hijaline, Ø 35­50 μm. Na celoj površinu vezikule se formiraju metule sa fijalidama (biserijatni tip) (Slika 87). Dimenzije metula iznose 15­20 × 5­6 μm, a fijalida 7­11 × 2­3,5 μm. Konidije su loptaste ili poluloptaste, hijaline, glatkih zidova ili blago hrapave, Ø 2,5­3 μm. Obrazuje sklerocije nepravilnog oblika. Ekologija i rasprostranjenje: širo- ko rasprostranjena vrsta, posebno česta u tropskim i suptropskim krajevima. Izolo- vana je iz vazduha, kućne prašine a česta je na zrnima kafe i začinima (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje pe- nicilinsku kiselinu, ohratoksin A, ksanto- megnin, viomelein i vioksantin (Samson i dr., 2004). Nalaz: drveni sanduk i drvene edu- kativne igračke (DKC/4 i DKC/5); skul- ptura od (MSU/5); bojeni slojevi slike (MSU/4) i platno slike (MSU/2). Slika 87. Aspergillus ochraceus, konidiofori sa radijatnom glavicom 139 Rezultati i diskusija Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: fre- ske, arheološko nalazište Herkulaneum blizu Napulja, Italija (Pepe i dr., 2011). Aspergillus terreus Thom Morfologija: U kulturi raste relatvno brzo (3,5­5 cm za 7 dana, CZA) i formira ko- loniju žuto­smeđe boje koja sa starenjem tamni. Boja kolonije podseća na boju zemljišta. Glavica je kolumnarna (Slika 88). Konidiofori su hijalini, glatkih zidova. Vezikula je poluloptasta, Ø 10­20 μm. Poseduje i metule i fijalide (biserijatni tip). Di- menzije metula su 5­7 × 2­2,5 μm, a fijalida 5­7 × 1,5­2 μm. Konidije su loptaste ili eliptične, hijaline ili žuć- kaste, glatkih zidova, Ø 1,5­2,5 μm. Ekologija i rasprostranjenje: ima široku distrubicuju a posebno je česta u tropskim i suptropskim kra- jevima. Tipično je zemljišna gljiva i česta je u zoni rizosfere (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produku- je terein, patulin, citrinin i citreoviri- din (Samson i dr., 2004). Nalaz: kamen peščar (AP). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: vazduh katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); građevina iz 18. veka, izgrađena od tufa, Palazzo De Francesco, Kampanija, Italija, (Felice de i dr., 2010) i kamen peščar, tvrđava Gwalior Fort, Indija (Pandey i dr., 2011). Slika 88. Aspergillus terreus, konidiofor sa kolumnarnomm glavicom 140 Rezultati i diskusija Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. Morfologija: u kulturi raste sporo (1­1,5 cm za 7 dana, CZA) i odlikuje se slabom sporulacijom. Boja kolonije je u početku bela, zatim žućkasto­narandžasta, do žuto­zelena sa ružičastim slojevima. Konidiofori su hijalini ili blago pigmentisani, glatkih zidova. Ve- zikula je loptasta ili eliptična, Ø 12­ 16 μm. Poseduje i metule i fijalide (biserijatni tip) (Slika 89). Dimenzije metula su 5­7,5 × 2­2,5 μm, a fijalida 5,5­8 × 2,5­3 μm. Konidije su u lop- taste i bodljikave, Ø 2­3,5 μm (Slika 89). Ponekad su prisutne Hülle ćelije. Ekologija i rasprostranjenje: za razliku od ostalih vrsta ovog roda, A. versicolor je češće izolovana u umerenim nego u tropskim regioni- ma. Čest je kontaminant hrane (si- revi, žita, začini, mesni proizvodi). Prisutna je u kućnoj prašini (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje sterigmatocistin i nidulatoksin (Samson i dr., 2004). Nalaz: granit (NJ); bojeni sloj slike (GSSŠ/9); skulptura metalni kamion (uzorak sa plišanog postolja) (MIJ/7); zidne slike crkve Svete Bogorodice (MG) i vazduh (MGB). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: knji- ga iz XVI veka sa simptomima foksinga (Michaelsen i dr., 2009); kinematografski filmovi deponovani u muzejima i arhivama u Madridu, Barseloni i Gran Kanariji (Abrusci i dr., 2005); knjiga sa simptomima foksinga, javna biblioteka, Brazil (Silva da i dr., 2006); podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Slika 89. Aspergillus versicolor, konidiofori sa radijatnim glavicama 141 Rezultati i diskusija Aureobasidium pullulans (de Bary) G. Arnaud Morfologija: u kulturi raste relativno brzo (4 cm za 7 dana, MEA ) i formira glatku ko- loniju prekrivenu sluzavom masom konidija. Kolonija može biti žuta, ružičasta, smeđa ili crna. Ponekad se javlja i vazdušna micelija. Hife su hijaline, tankozidne i septirane, Ø 2­16 μm. Sa starenjem hife postaju debelozidne i tamne. Debelozidne hife imaju ulogu hlamido- spora ili se često mogu procesom holotalusne transformacije raspasti na pojedinačne ćelije formirajući lančano povezane artrokonidije (Slika 90). Stadijum artrokonidija je u literaturi opisan i kao drugi anamorfni rod Scytalidium. Konidiogene ćelije se formiraju interkalar- no ili terminalno na subhijalinim hifama. Konidije koje su po tipu amerospore, formiraju se sinhrono procesom blastične konidiogeneze i ostaju u grupama (Slika 90). Konidije su jednoćelijske, najčešće elipsoidnog oblika, hijaline, glatkih zidova, sa hilumom, dimenzija 8­12 × 4­6 μm. Ponekad se javljaju i sekundarne konidije, manjih dimenzija. Ekologija i rasprostranjenje: kosmopolitska distribucija. Tipičan je saprob, često izolovana iz zemljišta, sa filosfere, semena, žita, voćnih sokova. Izolovana je i sa kože i noktiju ljudi i neretko može izazvati feohifomikoze (Samson i dr., 2004). Nalaz: karbonatni kamen (MG); kamen peščar (AP i BM) i vazduh (MGB i GSSŠ). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: bo- jeni slojevi slika iz više muzeja u Srbiji (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010); podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004); Slika 90. Aureobasidium pullulans, artrokonidije stadijuma Scytalidium sp. i amerospore u grupama 142 Rezultati i diskusija unutrašnji zidovi katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); istorijski papir topografskih mapa iz XVIII veka kolekcije “Collezione Topografica del Comune di Genova” (Zotti i dr., 2008) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Gugliel- mineti i dr., 1994). Bipolaris spicifera (Bainier) Subram Telemorf: Cochliobolus spicifer R.R. Nelson Morfologija: u kulturi raste brzo (5 cm za 7 dana, CZA) i formira vunastu koloniju. U početku je kolonija bela, a starenjem postaje sivo mrka, ili crna. Na periferiji kolonije često se formira svetlo siva margina. Hife su septirane i smeđe boje (Slika 91). Konidio- fori su dužine 4,5­6 µm, prosti ili simpodijalno granati, često genikulatni i savijaju se na mestima gde se formiraju konidije obrazujući cik­cak strukturu. Konidije su po tipu poro- konidije, fuziformne ili eliptične, zaravnjene na oba kraja, dimenzija 30­35 µm × 11­13,5 µm (Slika 91). Na porokonidijama se uočava tamni hilum. Klijanje konidija je bipolarno. Slika 91. Bipolaris spicifera, melanizovane hife i porokonidije u masi 143 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: kosmopolitsko rasprostranjenje. Izolovana je sa ra- zličitih supstrata (zemljište, biljni materijal). Oportunistički je humani patogen i izaziva feohifomikoze (McGinnis i dr., 1992). Nalaz: kamen peščar (AP). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: zid de- poa za skladištenje umetničkih predmeta, Narodni muzej, Srbija (Ljaljević Grbić i dr., 2011). Cladosporium cladosporioides (Fresen.) G.A. de Vries Morfologija: u kulturi raste sporo (1,5­4 cm za 10 dana, MEA) i formira somotastu ili praškastu koloniju maslinasto­smeđe ili sivo­zelene boje. Kolonija je često radijalno zonirana. Naličje kolonije je ze- leno crno. Konidiofori se uzdižu bočno ili ređe terminalno sa ta- mnih hifa i mogu da dostignu du- žinu do 350 µm ali su uglavnom kraći, 2­6 µm široki. Sa vrha ko- nidiofora se uzdižu ramokonidi- je cilindričnog oblika, smeđe ili zelenkasto­smeđe boje, uglav- nom glatkih zidova, dimenzija 30 × 3,5 µm (Slika 92). Konidije elipsoidnog ili limunastog obli- ka, hrapavih zidova, dimenzija 3­11 × 2­5 µm, često grupisane u akropetalnim lancima (Slika 92). Ekologija i rasprostranjenje: veoma česta vrsta, izolovana sa biljnog materijala, ze- mljišta, tekstila, hrane, semena. Spore ove vrste su česte u vazduhu zatvorenih prostorija (Samson i dr., 2004). Slika 92. Cladosporium cladosporioides, ramokonidija i konidije u masi 144 Rezultati i diskusija Nalaz: karbonatni kamen (MG i SS); mermer (MG); kamen peščar (AP i BM); granit (NJ); drveni ramovi slika (GSSŠ/11, GSSŠ/12, GSSŠ/13 i GSSŠ/14); bojeni slojevi slika (GSSŠ/5 i GSSŠ/8); poleđine slika (MSU/6, GSSŠ/6 i GSSŠ/10); zidne slike Crkve Sve- tog Nikole Palež i zidne slike Manastira Sopoćani i vazduh (MGB i GSSŠ). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: ki- nematografski filmovi deponovani u muzejima i arhivama u Madridu, Barseloni i Gran Kanariji (Abrusci i dr., 2005); istorijski papirni dokumenti, Univerzitetski Arhiv, Koim- bra, Portugal, (Mesquita i dr., 2009); zidovi Gojine sobe za skladištenje tapiserija, Muzej katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007); podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004); bojeni slojevi slika i slikarski ramovi iz više muzeja u Srbiji (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Cladosporium macrocarpum Preuss Morfologija: u kulturi raste sporo (2,5­3,5 za 7 dana, MEA) i formira somo- tastu koloniju, često prekrivenu slojem ma- slinasto zelene vazdušne micelije. Naličje kolonije je zeleno­crno. Konidiofori se uz- dižu lateralno sa tamnih hifa i dostižu du- žinu do 300 µm i širinu 4­8 µm (Slika 93). Konidiofori su često kolenasto savijeni, i na njima se obrazuju proširenja (čvorići) usled simpodijalne elongacije i terminalnog ili interkalarnog bubrenja. Konidije su uglav- nom jednoćelijske, eliptičnog oblika, bra- davičaste, u kratkim lancima, poseduju 0­3 septe, dimenzija 7­17 × 5­8 µm (Slika 93). Slika 93. Cladosporium macrocarpum, konidiofori i konidije 145 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kosmopolitsku distribuciju, i izolovana je uglavnom sa biljnog materijala (Samson i dr., 2004). Nalaz: vazduh (MIJ i MGB) Ostali nalazi na kulturno istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: vazduh katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007) i bojeni slojevi slika iz više muzeja u Srbiji (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010). Cladosporium sphaerospermum Penz. Morfologija: u kulturi raste relativno sporo (1,5­2 cm za 10 dana, MEA) i formira maslinasto zelene do maslinasto­braon somotaste ili praškaste kolonije. Naličje kolonije je zelenkasto­crno. Konidiofori se uzdižu lateralno ili terminalno sa hifa i dosežu do 300 µm, ali su obično kraći, širine 3­5 µm (Slika 94). Konidiofori nisu nikad genikulatni. Na konidioforima se formiraju granati lanci konidija, koji počinje sa ramokonidijama (Slika 94). Ramokodije poseduju 0­3 septe, glatkih su zidova ili bradaviča- ste, dimenzija 33 × 3­5 µm. Konidi- je su grupisane u akropetalne lance, uglavnom su jednoćelijske, loptaste ili poluloptaste, smeđe ili zelenkasto braon, verukozne, 3­7 µm u prečniku. Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kosmopolitsku distribuci- ju. Izolovana je sa različitih supstrata, vazduha, zemljišta, hrane, semena, boje, tekstila. Ova vrsta je sekundar- ni kolonizator mnogih biljnih vrsta. Retko se može izolovati sa životinja i ljudi (Samson i dr., 2004). Slika 94. Cladosporium sphaerospermum, konidiofor, ramokonidije i konidije u masi 146 Rezultati i diskusija Nalaz: granit (NJ); kamen peščar (BM) i zidne slike Manastira Sopoćani. Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: freske iz XV veka, Sveti Augistin (Botticelli) i Sveti Žerom (Ghirlandaio), crkva Ognissanti, Firen- ca, Italija (Sampǒ i Mosca, 1989); vazduh katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Drechslera dematioidea (Bubák & Wróbl.) Scharif Morfologija: u kulturi raste brzo (5 cm za 7 dana, MEA) i formira tamnu, vunastu koloniju. Hife su septirane i smeđe boje (Slika 95). Konidiofori su braon, pojedinačni ili manjim grupama, ponekad genikulatni, dužine do 350 µm. Konidije su cilindrične ili klavatne, oblih krajeva, debelih zidova, zlatno do tamno smeđe sa dve ili tri pseudosepte, sa hi- lumom, dimenzija 20­70 × 10­16 µm (Slika 95). Ekologija i rasprostranjen- je: vrsta je široko rasprostranjena i često je izolovana sa uginulog biljnog materijala, posebno biljaka iz familije Poacea. Kolonizator je uginulih listova i cvasti vrsta roda Anthoxanthum (Ellis i Ellis,1997). Nalaz: kamen peščar, loka- litet AP; granit (NJ) i karbonatni kamen (SS). Ostali nalazi na kulturno- istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: bojeni slojevi slika i drveni slikarski ramovi iz više muzeja u Srbiji (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010). Slika 95. Drechslera dematioidea, melanizovane hife i konidije 147 Rezultati i diskusija Epicoccum purpurascens Ehrenb Morfologija: u kulturi raste vrlo brzo (6 cm za 10 dana, MEA) i formira vunastu koloniju, žuto narandžaste boje, ponekad crno–smeđe. Naličje kolonije je uvek intenziv- nije obojenije od lica. U kulturama često ostaje sterilna. Sporulacija se može indukovati izlaganjem kolonije „crnom“ svetlu (Samson i dr., 2004). E. purpurascens obrazuje pulvi- natne sporodohije, Ø 100­2000 µm (Slika 96). Konidiofori su kratki, dimenzija 5­15 × 3­6 µm, grupisani u klastere koji se završavaju izodijametričnim konidiogenim ćelijama (Slika 96). Konidije se obrazuju pro- cesom blastične konidiogene- ze, i loptastog su ili kruškastog oblika, bradavičaste, 15­25 µm (Slika 96). Bazalni deo konidije je levkastog oblika, a na konidiji se formira septa koja deli koni- diju na do 15 ćelija. Ekologija i rasprostran- jenje: vrsta je kosmopolitska, često je izolovana iz zemljišta, semena, papira, tekstila, insekata, kože i sputuma. Spada u sekundarne kolonizatore mnogih biljnih vrsta (Samson i dr., 2004). Nalaz: karbonatni kamen (MG); kamen peščar (AP i BM); granit (NJ); drveni ram slike (GSSŠ/11) i zidne slike crkve Sveti Nikola Palež i Manastira Sopoćani. Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: bo- jeni slojevi slika i drveni slikarski ramovi iz više muzeja u Srbiji (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010); zidne slike grobnica Ozuka (Fukuoka) i Kibusan (Kumamoto), Japan, (Emo- Slika 96. Epicoccum purpurascens, pulvinatna sporodohija sa konidioforima grupisanim u klastere i višećelijskim konidijama 148 Rezultati i diskusija to i Emoto, 1974); zidne slike starih crkava, Pavia, Italija, (Crippa, 1983) i zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Fusarium oxysporum Schl. Morfologija: u kulturi raste brzo (3­5,5 cm za 4 dana) i formira oskudnu vazdušnu miceliju koja postaje boje breskve. Kolonija u centru ima ružičastu nijansu. Naličje kolo- nije je žuto sa purpurnim nijansama. Neki sojevi obrazuju narandžaste sporodohije. Koni- diofori mogu biti granati ili negranati i na njima se formiraju monofija- lide. Mikrokonidije su sa 0­2 septe, formiraju se na bočnim fijalidama ili na fijalidama formira- nim na kratkim granatim konidioforima i vrlo su brojne (Slika 97). Vari- jabilnog su oblika i ve- ličine, mogu biti jajaste, cilindrične ili elipstične, prave ili blago zakrivljene, dimenzija 5­12 × 2,2­3,5 µm. Makro- konidije su retke, razvijaju se na fijalidama na granatim konidioforima, ili u sporodohija- ma i obrazuju 3­5 septi. Fuziformnog su oblika i blago zakrivljene, zašiljene na oba kraja (Slika 97). Dimenzije makrokonidija su 20­50 × 3­5 µm. Hlamidospore su poluloptaste ili loptaste, glatkih ili hrapavih zidova, Ø 5­15 µm. Formiraju se terminalno ili interkalarno u paru ili pojedinačno. Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima kospopolitsku distribuciju. Česta je saprob u zemljištu, ali i patogen mnogih biljnih vrsta. Izazivač je truljenja u skladištima hrane. Može da opstane u anaerobnim uslovima (Samson i dr., 2004). Slika 97. Fusarium oxysporum, makrokonidije 149 Rezultati i diskusija Specifični metaboliti: produkuje fuzaričnu kiselinu, moniliformin, pigmente na bazi naftokvinona i nektriafuron (Samson i dr., 2004). Nalaz: kamen peščar (BM). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: zid- ne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Fusarium sambucinum Fuckel Teleomorf: Giberella pulicaris (Fr.) Sacc. Morfologija: u kulturi raste brzo (3,4–5,9 cm za 4 dana) i formira vazdušnu miceliju bele boje sa roze nijansama. Naličje kolonije je žućkasto ili roze do crveno. Konidiofori se uzdižu u vidu pojedinačnih bočnih monofijalida, koji se kasnije granaju na sporodohijama i pionotama. Kod ove vrste se ne obrazuju mikrokonidije. Makrokonidije su uniformne, srpastog oblika, snažno dorzoventralno zakrivljene, debelih zidova, sa 3­7 septi (Slika 98). Dimenzije makrokonidija sa tri septe iznose 22­35 × 4­5,2 µm, sa 4 ili 5 septi 26­44 × 4­5,6 µm, a sa 6 ili 7 septi 37­50 × 4,5­5,6 µm. Hlamidospore ako se formiraju mogu biti pojedinačne ili u grupi. Slika 98. Fusarium sambucinum, makrokonidije 150 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima široku distribuciju i uglavnom je izolovana sa žita, krompira, trava, kore drveta. Kolonizuje i zemljište (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje butenolide, eniatine i trihotecene (Samson i dr., 2004). Nalaz: karbonatni kamen (SS). Geotrichum candidum Link Teleomorf: Galactomyces geotrichum (Butler & Peterson) Redhead & Malloch Morfologija: U kulturi raste brzo (7 cm za 7 dana) i formira belu, glatku puterastu koloniju, često prijatnog mirisa. Hife su septirane, dihotomo granate i formiraju strukture slične viljušci, širine 7­11 µm. Konidije su po tipu artrokonidije cilindrične su, oblika bureta ili elipso- idne, dimenzija 6­20 × 3­9 µm i nastaju razdeljiva- njem fertilnih hifa (Slika 99). Mogu biti uzdignute ili položene i uglavnom su u lancima. Ekologija i rasprostranjenje: Vrsta je široko rasprostranjena. Izolovana je iz zemljišta, vode, vazduha, žita, mlečnih prozvoda, papira, tekstila i dr. (Samson i dr., 2004). Nalaz: vazduh (MIJ). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: bo- jeni slojevi slika umetniških slika u 11 muzeja, Srbija (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010). Graphium putredinis (Corda) S. Hughes Morfologija: u kulturi formira sivu, maslinasto smeđu do crnu koloniju. Konidiofori su grupisani u sinemate maslinasto do crvenkasto smeđe boje, dužine do 1 mm (Slika 100). Debljina sinemate je do 40 µm u bazi, prema vrhu se širi. Anelide su cilindrične ili oblika šila, dimenzija 10­30 × 1­2 µm. Konidije su eliptične ili kljunaste, smeđe boje, glatkih zidova, 5­11 × 2­4 µm. Slika 99. Geotrichum candidum, artrokonidije 151 Rezultati i diskusija Ekologija i rasprostranjenje: česta je na biljnom materijalu i u zemljištu. Kolo- nizuje stabljike Brassica sp. (Ellis, 1971). Nalaz: vazduh (MIJ) Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: bojeni slojevi slika umetniških slika u 11 muzeja, Srbija (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010). Nigrospora sphaerica (Sacc.) E.W. Mason Morfologija: u kulturi u početku formira belu koloniju, koja staranjem postaje tamna do potpuno crna, što je praćeno obilnom sporulacijim. Konidiofori su smeđe boje, glatkih zidova, 4­8 µm debljine. Konidiogene ćelije su bezbojne, ampuliformnog oblika, dijame- tra 8­11 µm. Konidije su pojedinačne, sferične ili elipsoidne, tamne, sjajne bez septi, glatkih zidova, Ø 14­20 µm (Slika 101). Ekologija i rasprostranjenje: vrsta je kosmopolitska, vrlo česta u tropskim regionima. Kolonizuje veliki broj biljnih vrsta, a izolovana je i iz zemljišta i razli- čitih namirnica (Ellis i Ellis, 1997). Nalaz: karbonatni kamen (MG) i zidne slike Manastira Sopoćani. Ostali nalazi na kulturno-istori ­ jskim spomenicima i umetničkim Slika 100. Graphium putredinis, sinemata Slika 101. Nigrospora sphaerica, tamne hife i konidije 152 Rezultati i diskusija predmetima: polihromna drvena skulptura poreklom iz Južne Amerike, Prirodnjački mu- zej La Plata, Buenoa Aires, Argentina, (Fazio i dr., 2010). Paecylomyces variotii Bainier Morfologija: u kulturi raste relativ- no brzo (3­5 cm za 7 dana, MEA) i formira žuto–smeđu praškastu koloniju. Praškasta konzistencija kolonije je posledica velikog broja gusto zbijenih konidiofora. Često je prisutan slatkast miris kolonije. Konidiofori se sastoje od vertikalno postavljenih grana, od kojih svaka nosi od 2 do 7 fijalida. Fijalide mogu biti pojedinačne ili u snopovima, flašo- likog su oblika, dimenzija 12­20 × 2,5­5 µm. Konidije se obrazuju u dugim divergentnim lancima i uvek su jednoćelijske, hijaline ili žute, glatkih zidova, varijabilnih dimenzija ali najčešće 3­5 × 2­4 µm (Slika 102). Hlamidospore su pojedinačne ili u kratkim lancima, braon boje, glatkih debeih zidova, poluloptaste ili kruškolike, 4–8 µm u prečniku. Ekologija i rasprostranjenje: čest kontaminan vazduha. Vrsta je termofilna i zbog toga se često izoluje sa komposta (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje patulin i viriditoksin (Samson i dr., 2004). Nalaz: kamen peščar (BM); karbonatni kamen (SS); bojeni slojevi slika (MSU/1 i MSU/4) i fotografski papir (DKC/3 i DKC/6). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: isto- rijski papir topografskih mapa iz XVIII veka kolekcije “Collezione Topografica del Co- mune di Genova” (Zotti i dr., 2008) i unutrašnji zidovi katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007). Slika 102. Paecilomyces variotii, konidiogeni aparat 153 Rezultati i diskusija Penicillium aurantiogriseum Dierckx Morfologija: u kulturi raste relativno brzo (3­3,5 cm za 7 dana, CZA) i formira radijalno zoniranu koloniju, glatke ili zrnaste teksture tirkizno zelene boje sa izraženom marginom. Eksudacija je često prisutna u vidu smeđih kapljica blizu periferije kolonije. Nalič- je kolonije je bledo, do smeđe, ponekad u nijansama narandža- ste. Konidiofori su pojedinačni ili grupisani u fascikule i uzdi- žu se sa subpovršinskih hifa. Konidiofor je hrapavih zidova, ređe gladak, dimenzija 200­400 x 3­4 µm. Konidiogeni aparat po tipu može biti terverticilata ili biverticilata (Slika 103). Rami su pojedinačni, dimen- zija 15­25 × 3­4µm. Metule su u grupama od tri ili četiri, 10­12 × 2,8­3,5 µm. Od 5 do 8 tankih, ampuliformnih fijalida dimenzija 9­10 × 2,5­2,8 µm se nalazi na metuli. Konidije su poluloptaste do eliptične, dimenzija 3,5­4 × 2,5­3,2 µm. Ekologija i rasprostranjenje: kosmpolitska vrsta, najčešće izolovana plesan na Ze- mlji. Kolonizuje hranu, posebno žita (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: producent je toksičnih metabolita: nefrotoksični glikopeptidi, verukozidin, penicilična kiselina i terestrična kiselina. Ostali metaboliti sa još neispitanom toksičnošću su auranciamin, aurancin i anacin (Samson i dr., 2004). Nalaz: kamen peščar (BM); bojeni slojevi slika (MGB/8 i MGB/12); zidne slike u crkvi Svetog Nikole Palež i vazduh (MGB i GSSŠ). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: unu- trašnji zidovi katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007) i podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004). Slika 103. Penicillium aurantiogriseum, konidiogeni aparat 154 Rezultati i diskusija Penicillium expansum Link Morfologija: u kulturi raste relativno brzo (4­5 cm za 14 dana, CZA) i formira kolo- niju žute do plavo zelene boje. Ponekad miriše na jabuke. Eksudacija je prisutna u vidu hi- jalinih kapljica. Naličje kolonije je žuto ili žuto–smeđe. Konidiofori su hijalini, uglavnom pojedinačni (mononematozni), ređe u grupama (sinematozni). Konidiofori u grupama se nalaze na periferiji kolonije. Konidiogeni aparat po tipu može biti terverticilata ili kvater- verticilata (Slika 104). Metule su cilindrične, dimenzija 10­15 × 2­3 µm i obično nose od 5 do 8 fijalida. Fijalide su cilindrične sa izraženim vratom, dimenzija 8­12 × 2­3,5 µm. Konidije su poluloptaste ili eliptične, zelene sa glatkim zidom, dimenzija 3­3,5 × 2,5–3 µm. Ekologija i rasprostranjenje: uglavnom je izolovana sa namir- nica. Uzročnik je brzog truljenja jabučastog voća (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produ- kuje rokverfortin C, patulin, citri- nin, komunezine i hetoglobozin C (Samson i dr., 2004). Nalaz: kamen peščar (AP). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: bo- jeni slojevi slika umetniških slika u 11 muzeja, Srbija (Vukojević i Ljaljević Grbić, 2010); zidne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994) i podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004). Slika 104. Penicillium expansum, konidiogeni aparat 155 Rezultati i diskusija Penicillium ochrochloron Biourge Morfologija: u kulturi raste relativno brzo (3,5­4,5 cm za 7 dana, CZA) i formira radijalno zoniranu koloniju bele do svetlo roze boje. Eksudacija je prisutna u vidu hijalinih kapljica. Naličje kolonije nije obojeno. Konidiofori se formiraju na subpovršinskim hifa- ma na periferiji kolonije ili na vazdušnim hifama na celoj površini kolonije. Konidiofori su glatkih zidova ili hrapavi, 300­500 µm dužine. Konidiogeni aparat je po tipu biverticilata (Slika 105). Metule mogu biti terminalne ili interkalarne, dimenzija 15­25 × 2­2,5 µm, fijalide su ampuliformne sa dugom kolulom, dimenzija 8­12 × 2,2­2,5, i u grupama od 4 do 8. Konidije su eliptične ili apikulatne, glatkog zida, dimenzija 3­4 × 2­2,8 µm. Ekologija i rasprostranjenje: tipična zemljišna gljiva (Pitt, 1979). Nalaz: zidne slike manastira Sopoćani. Penicillium verrucosum Dierckx Morfologija: U kulturi raste relativno sporo (1,5­2,5 mm za 7 dana, CZA) i formira radijalno zoniranu koloniju bele do zelene boje sa izraženom belom marginom širene 2­4 mm. Eksudacija je prisutna u vidu žutih kapljica. Naličje kolonije je svetlo do tamno smeđe. Konidiofori se razvijaju na subpovršinskim ili površinskim hifama i poseduju duge i robusne konidiofore, dimenzija 200­500 × 3,5­4 µm. Konidiogeni aparat je po tipu terverticilata ili kvaterverticilata, ređe biverticilata (Slika 106). Jedan ili dva rama glatkih Slika 105. Penicillium ochrochloron, konidiogeni aparat 156 Rezultati i diskusija ili hrapavih zidova se vezuje za konidiofor. Ramuli podsećaju na sitnije rame. Metule se formiraju u grupama od 2 do 7, dimenzija 7­10 × 3,5­4 µm. Fijalide su ampuliformne sa kratkom kolulom, dimenzija 7­9 × 2,5­3,5 µm. Konidije su loptaste, ređe poluloptaste ili eliptične, glatkih zidova, često povezane u lance, dimenzija 3­3,5 × 2,5­2,8 µm. Ekologija i rasprostranjenje: često se izoluje sa namirnica, posebno sa žita i sireva (Samson i dr., 2004). Specifični metaboliti: produkuje toksič- ne metabolite ohratoksin A, citrinin, arabenoičnu kiselinu i verucine (Samson i dr., 2004). Nalaz: skulpture od drveta (MSU/3 i MSU/5) i platno slike(MSU/2). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: zid- ne slike Manastira Sveti Demijan, Asiza, Italija (Guglielmineti i dr., 1994). Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier Teleomorf: Microascus brevicaulis Abbot, Sigler & Currah Morfologija: u kulturi raste relativno brzo (4,5­5,5 cm za 7, MEA) i formira braon roze koloniju koja sa starenjem postaje praškasta. U centru kolonije formira se ispup- čenje. Naličje kolonije je smeđe. Konidiogene ćelije su anelatne i razvijaju se direktno na vazdušnim hifama, terminalno ili na granatim konidioforima koji su u grupama do 4. Cilindričnog su oblika sa ispupčenom bazom, dimenzija 9­25 × 2,5­3,5 µm (Slika 107). Anelide su 2,5­3,5 µm široke. Konidije su loptaste ili jajaste sa izraženo bazalnim delom i zašiljenim apeksom, grubih zidova, dimenzija 5­9 × 5­7 µm. Ekologija i rasprostranjenje: vrsta ima široku distrubuciju i izolovana je iz zemlji- šta, sena, žita, voća, mrtvih insekata, izmeta, papira. Može da kolonizuje i hranu, pre Slika 106. Penicillium verrucosum, konidiogeni aparat 157 Rezultati i diskusija svega meso, i mlečne proizvode, a u retkim slučajevima kolonizuje pluća i kožu ljudi. Ponekad prisustvo ove gljive može da se pretpostavi na osnovu mirisa amonijaka (Sam- son i dr., 2004). Nalaz: kamen peščar (AP). Sporobolomyces roseus Kluyver & C.B. Niel Morfologija: u kulturi raste sporo i formira belo žute kolonije tipične za kvasolike forme mikromiceta. Konidiofori se retko diferenciraju, već se konidije obrazuju direktno na hifama ili na sterigmama. Konidije mogu da se umnožavaju pupljenjem, hijaline su, cilindrične ili polumeseča- ste (Slika 108), dimenzija 7,5–12,6 × 1,5–2,5 μm. Ekologija i rasprostranjenje: vr- sta je kosmopolitska, izolovana sa ra- zličitih supstrata. Nalaz: karbonatni kamen i mer- mer (MG). Slika 107. Scopulariopsis brevicaulis, konidiofor sa konidijama povezanim u lance Slika 108. Sporobolomyces roseus, konidije 158 Rezultati i diskusija Trichoderma viride Pers. Morfologija: u kulturi raste vrlo brzo (5­7 cm za 7 dana, MEA) i formira imer- znu koloniju, iz koje u vidu bokora izranja- ju konidiofori. Kolonija je u početku bela, zatim postaje belo­zelena. Naličje kolonije nije obojeno. Konidiofori su nepravilno­pi- ramidalnog oblika, i sastoje se od grana i bočnih grana (Slika 109). Dužina grana se smanjuje prema apeksu konidiofora. Fijali- de su u grupama, od 2 do 4, oblika bureta i obično zakrivljene, dimenzija 6­20 × 2,4­3 µm. Konidije su poluloptaste, ređe eliptične, 3,6–4,5 µm u prečniku, hrapavih zidova, što predstavlja glavni morfološki kriterijum za razdvajanje ove vrste od T. harzianum kod koje su konidije glatkih zidova. Hlamidospore se formiraju interkalarno ili terminalno na miceliji u starijim kulturama. Hijaline su, loptaste i glatkih zidova. Ekologija i rasprostranjenje: tipična zemljišna gljiva i izolovana je iz različitih tipova zemljišta u različitim zonama (umerena zona, tropi, alpska zona). Zbog potentnog celu- llitičkog kompleksa enzima uzročnik je truljenja drvne mase. Često kolonizuje žitarice u silosima, i vrlo je otporna na konzervanse i druge antifungalne agense (Samson i dr., 2004). Nalaz: skulptura od drveta (MSU/3); platno slike (MSU/2); fotografski papir i (DKC/3 i DKC/6) i vazduh (MGB, DKC i MSU). Ostali nalazi na kulturno-istorijskim spomenicima i umetničkim predmetima: ki- nematografski filmovi deponovani u muzejima i arhivama u Madridu, Barseloni i Gran Kanariji (Abrusci i dr., 2005); unutrašnji zidovi katedrale Santiago de Compostela, Španija (Aira i dr., 2007) i podzemni spomenici od krečnjaka na Jevrejskom groblju, Bratislava (Šimonovičova i dr., 2004). Slika 109. Trichoderma viride, konidiogeni aparat 159 Rezultati i diskusija Ulocladium chartarum Preuss Simmons Morfologija: u kulturi raste brzo (do 5,5 cm za 7 dana, MEA) i formira crnu vunastu koloniju, ponekad sa belom marginom. Konidiofori su uglavnom negranati, glatkih zido- va, zlatno smeđe boje, genikulatni, sa jednim ili više mesta za vezivanje konidija, dimenzija 40­55 × 5­7 µm. Konidije su po tipu diktiospore, jaja- ste, glatkih zidova, dimenzija 19­39 × 11­22 µm, sa jednom do 5 transfer- zalnih i jednom do 5 longitudinalnih ili kosih septi (Slika 110). Konidije su pojedinačne, ređe u lancima. Ekologija i rasprostranjenje: izolovana je iz zemljišta, boja, celuloznih materijala: drvo, papir, vlakna. Nekad kolo- nizuje i biljke (Samson i dr., 2004). Nalaz: drveni ram slike (GSSŠ/11); poleđina slike (GSSŠ/4). Ulocladium oudemansii E.G. Simmons Morfologija: u kulturi raste brzo (do 5,5 cm za 7 dana, MEA) i formira crnu vunastu koloniju. Konidiofori su glatkih zidova, smeđi ili zlatno obojeni, dimenzija 250 × 5­7 µm. Konidije su po tipu diktiospore, jajaste, klavatne ili eliptične sa 3 do 5 transferzalnih i nekoliko longitudinalnih septi, zlatno do tamno smeđe, izrazito bradavičaste osim u ba- zalnom delu, dimenzija 18­34 × 9­17 µm (Slika 111). Ekologija i rasprostranjenje: Široko je rasprostranjena i izolovana je uglavnom sa biljnog materijala (Ellis, 1976). Nalaz: poleđina slike (GSSŠ/6). Slika 110. Ulocladium chartarum, diktiospore na kratkim konidioforima 160 Rezultati i diskusija 5.5 Antifungalna aktivnost etarskih ulja i biocida U cilju pronalaženja efikasnih i odgovarajućih antifungalnih agenasa, koji bi mogli biti primenjeni u sistemu konzervacije objekata i predmeta kulturne baštine ispitana an- tifungalna aktivnost nekoliko agenasa biološkog porekla – etarskih ulja i komercijalnog biocida benzalkonijum hlorida (BAC). Za ispitivanje fungistatske i fungicidne aktivnosti kao test mikromicete korišćeni su odabrani izolati sa različitih objekata kulturne baštine i umetničkih predmeta (Tabela 18). Slika 111. Ulocladium oudemansii, diktiospore Vrsta Nalaz Aspergillus fumigatus Fresen. zidna slika Crkve Svete Bogorodice (MG) Aspergillus niger Tiegh drveni sanduk i drvene edukativne igračke (DKC/4) Aspergillus ochraceus G. Wilh. drveni sanduk i drvene edukativne igračke (DKC/5) Aspergillus versicolor (Vuill.) Tirab. zidna slika Crkve Svete Bogorodice (MG) Bipolaris spicifera (Bainier) Subram kamen peščar (AP) Emericella nidulans (Eidam) Vuill. zidna slika Crkve Svete Bogorodice (MG) Epicoccum purpurascens Ehrenb granit (NJ) Penicillium sp. 1 skulptura od drveta (MSU/3) Penicillium sp. 2. zidna slika Crkve Svete Bogorodice (MG) Trichoderma viride Pers. fotografski papir (DKC/6) Tabela 18. Test mikromicete korišćene u eksperimentima za odeđivanje antifungalne aktivnosti 161 Rezultati i diskusija Antifungalna aktivnost odabranih etarskih ulja i biocida BAC ispitivana je metodom mikroatmosfere, makrodilucionom metodom, mikrodilucionom metodom i metodom ne- utralizacije biocida. Kombinacijom ovih metoda praćen je uticaj antifungalnih agenasa na rast somatskih hifa in vitro i germinaciju spora in vitro Metoda mikroatmosfere je efikasna ispitivan je uticaja etarskih ulja na rast somatskih hifa in vitro. Ovom metodom praćena je inhibicija rasta micelije, kao i promene u izgledu, teksturi, boji kolonije i intenzitetu sporulacije u poređenju sa kontrolnom kulturom. Za testirane izolate određene su MIC i MFC vrednosti etarskih ulja. Za određivanje anti- fungalne aktivnosti etarskih ulja ovom metodom korišćene su mikromicete: A. niger, A. ochraceus, B. spicifera, E. purpurascens, Penicillium sp. 1. i T. viride. S obzirom na slabu isparljivost BAC, uticaj ovog biocida na rast somatskih hifa in vitro ispitan je makrodilucionom metodom. Korišćeni su isti izolati kao i u metodi mi- kroatmosfere i određene su MIC i MFC vrednosti, kao i promene u izgledu, teksturi, boji kolonije i intenzitetu sporulacije. Mikrodilucionom metodom ispitivan je uticaj i etarskih ulja i biocida BAC na klijanje spora. Praćeno je klijanje konidija u tečnoj podlozi (MEB) sa dodatim antifungalnim agensom. U ovom eksperimentu su korišćeni izolati koji obilno sporulišu na MEA medijumu tokom tri nedelje (A. niger, A. ochraceus, B. spicifera, Penicillium sp. 1. i T. viride). Brojanjem klijalih i neklijalih konidija u tečnoj podlozi sa antifungalnim agensom određene su koncentracije koje izazivaju približno 50 i 95% inhibicije klijanja konidija (ID 50 i ID 95 vrednosti), nakon 24h in- kubacije. Za pojedine izolate mikrodilucionom metodom određene su i MIC i MFC vrednosti. Metodom neutralizacije biocida određeno je minimalno vreme za koje u kontaktu biocida BAC i konidija gljiva, dolazi do najvećeg stepena inhibicije vijabilnosti konidija. U ovom eksperimentu korišćene su mikromicete izolovane sa zidnih slika Crkve Svete Bogorodice (MG): A. fumigatus, A. versicolor, E. nidulans i Penicillium sp. 2. 162 Rezultati i diskusija 5.5.1 Antifungalna aktivnost odabranih etarskih ulja Polazeći od osnove da etarska ulja mnogih biljaka poseduju antifungalna svojstva, ispitivana je antifungalna aktivnost komercijalnih uzoraka etarska ulja (R. officinalis, L. angustifolia, O. vulgare i H. italicum.) metodom mikroatmosfere i mikrodilucionom me- todom. U ovom odeljku prikazana je analiza hemijskog sastava etraskih ulja i njihov uticaj na rast somatskih hifa kao i njihov antifungalni potencijal. 5.5.1.1 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Rosmarinus officinalis Hemijski sastav ulja Kombinacijom metoda GC i GC/MS izvršena je kvalitativna i kvantitativna ana- liza etarskog ulja R. officinalis. Identifiko- vane su 23 komponente ulja što predstav- lja 100% ulja. Dominantna komponenta u ovom ulju je 1.8­cineol (eukaliptol) koji je u uzorku ulja bio zastupljen sa 44,28%. (Slika 112). U značajnijem procentu za- stupljene komponente su kamfor (12,54%) i α­pinen (11,62%), dok se ostale komponente nalaze u manjem procentu od 0,14 % do 8,26% (Tabela 19). Uticaj ulja na rast somatskih hifa in vitro Metodom mikroatmosfere testiran je uticaj etarskog ulja R. officinalis na micelijalni rast 6 odabranih izolata merenjem prečnika kolonija 21. dana od inokulacije. Testirane koncentracije ulja iznosile su 10, 15, 25, 50, 75 i 100 μl ml-1. Inhibicija rasta micelije (%) dobijena je poređenjem prečnika kolonija koje su rasle u uslovima aromatične atmosfere sa prečnikom kolonije u kontroli, starosti 21 dan. Slika 112. 1.8­cineol, strukturna formula 163 Rezultati i diskusija Etarsko ulje R. officinalis izazvalo je morfo­fiziološke promene u kulturi A. niger. Potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentraciji ulja od 50 μl ml-1 (Tabela 20). Niže koncentracije ulja u eksperimentu (10, 15 i 25 μl ml-1) prouzrokovale su pojavu belih sektora u koloniji A. niger (Slika 113). Mikroskopskom analizom struktura Komponenta KIE1 KIL2 % triciklen 915,7 921 0,24 α­tujen 921,6 924 0,14 α­pinen 927,5 932 11,62 kampfen 941,2 946 4,60 β­pinen 969,8 974 8,26 mircen 987,2 988 0,98 α­felandren - 1002 0,18 p­cimen 1019,5 1020 1,22 limonen 1023,2 1024 2,79 1.8­cineol 1028,5 1026 44,28 γ­terpinen 1053,7 1054 0,91 terpinolen 1083,2 1086 0,19 linalol 1097,5 1095 0,46 kamfor 1140,0 1141 12,54 izoborneol 1151,7 1155 0,52 borneol 1161,4 1165 2,96 terpinen­4­ol 1172,8 1174 0,55 α­terpineol 1186,9 1186 1,55 γ­terpineol 1193,9 1199 0,38 bornil acetat 1281,2 1287 1,13 juniperen 1397,6 1402 0,19 trans­β­kariofilen 1413,1 1417 3,96 α­humulen 1447,0 1452 0,36 ukupno 100 1 Kovačev (retencioni) indeks eksperimentalno određen (AMDIS) 2 Kovačev (retencioni) indeks literaturni podatak (Adams, 2007) Tabela 19. Procentualna zastupljenost komponenti etarskog ulja Rosmarinus officinalis 164 Rezultati i diskusija gljiva sa belih sektora konstatovano je prisusutvo sterilnih, septiranih hifa A. niger i od- susutvo reproduktivnih struktura. U kulturi A. ochraceus potpuna inhibicija rasta micelije (100%) je postignuta pri koncentraciji ulja od 100 μl ml-1 (Tabela 20). Morfo­fiziološke promene nastale usled interakcije gljive i etarskog ulja R. officinalis pri koncentracijama od 10, 15, 25, 50 i 75 μl ml-1 manifestovale su se u vidu pojave bele vazdušne micelije u centru kolonije i ma- som sklerocija oker boje, mekane konzistencije. Mikroskopskom analizom micelije A. ochraceus uočene su transformacije hifa za koje se pretpostavlja da predstavljaju začetke formiranja sklerocija. U kontrolnoj kulturi sklerocije nisu konstatovane. Kod B. spicifera nijedna korišćena koncentracija ulja nije prouzrokovala 100% in- hibicije rasta micelije (Tabela 20). Kolonije B. spicifera koje su se razvijale u uslovima aromatične atmosfere bile su svetlije nego u kontrolnoj kulturi. Pri koncentracijama ulja od 75 i 100 μl ml-1 uočeni su i beli sektori u centru kolonije koji nisu bili prisutnu u kon- trolnoj kulturi. Mikroskopskom analizom dokazano je prisusutvo malog broja porokoni- dija, smanjenog intenziteta melanizacije. Najosetljiviji testirani izoloat bio je E. purpurascens kod koga je potpuna inhibicija (100%) postignuta sa najmanjom korišćenom koncentracijom ulja (10 μl ml-1) (Tabela Slika 113. Efekat etarskog ulja Rosmarinus officinalis (25 μl ml-1) na miceliju Aspergillus niger: A. kontrola; B. beli sektori sterilne micelije 165 Rezultati i diskusija 20). Stoga, kod ove vrste nije bilo moguće pratiti morfo­fiziološke promene nastale usled interakcije ulja i gljive. U kulturi Penicillium sp.1 potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentraciji ulja od 100 μl ml-1 (Tabela 20). Osim smanjenja dijametra kolonije pri nižim koncentracijama ulja nisu dokumentovane morfo­fiziološke promene. Izolat T. viride pokazao je potpunu rezistenciju na sve korišćene koncentracije ulja. Nije konstatovan uticaj na rast micelije (Tabela 20) kao ni morfo­fiziološke promene u kulturi. Nakon utvrđivanja koncentracije ulja koja izaziva 100% inhibicije rasta micelije bilo je moguće preciznije odrediti MIC vrednosti. U opsegu koncentracija ulja od 10 do 100 μl ml-1 nije bilo moguće odrediti MIC vrednosti za B. spicifera i T. viride. Kod ovih izo- lata MIC vrednosti se nalaze iznad najveće testirane koncentracije od 100 μl ml-1 (Tabela 21). Reinokulacijom tretiranih inokuluma čiji je rast bio inhibiran u uslovima aromatične atmosfere pri određenim koncentracijama ulja ustanovljeno je da li je inhibicija reverzi- bilnog karaktera ili ne i na taj način određene su MFC vrednosti. Najniža MIC vrednost zabeležena je za vrstu E. purpurascens (10 μl ml-1). Ova vrednost ujedno i predstavlja i MFC za ovu vrstu (Tabela 21). MIC vrednost za A. niger iznosi 30 μl ml-1, dok MFC Izolat Aspergillusniger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Koncentracija (μl ml-1) Inhibicija rasta micelije (%) 10 0 0 0 100 6,67 ± 1.66* 0 15 0 0 0 100 24,31 ± 2.16* 0 25 0 6,67 ± 1,66* 0 100 51,31 ± 7.71* 0 50 100 32,66 ± 2.33* 23,33 ± 1,66* 100 66,33 ± 3,43* 0 75 100 65,33 ± 2,67* 30,66 ± 1,21* 100 73,26 ± 2,33* 0 100 100 100 50,67 ± 2,52* 100 100 0 * dobijene vrednosti prikazane su u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom (n=3, p<0,05) Tabela 20. Efekat ulja Rosmarinus officinalis na rast micelije testiranih mikromiceta metodom mikroatmosfere 166 Rezultati i diskusija vrednost za ovu gljivu iznosi 80 μl ml-1 (Tabela 21). MIC vrednosti za A. ochraceus i Pe- nicillium sp. 1 iznosi 80 μl ml-1. MFC vrednost za A. ochraceus jednak je MIC vrednosti ove gljive, dok MFC za Penicillum sp. 1 iznosi 100 μl ml-1 (Tabela 21). Uticaj ulja na germinaciju spora Uticaj etarskog ulja R. officinalis na germinaciju spora ispitivanih izolata praćen je mikrodilucionom metodom. Testirane su iste koncentracije ulja kao i u metodi mikro- atmosfere: 10, 15, 25, 50, 75 i 100 μl ml-1. Zaustavljanjem reakcije laktofenolom nakon 24h od trenutka inokulacije suspenzije spora i brojanjem klijalih i neklijalih konidija odre- đene su koncentracije ulja koje izazivaju približno 50% i 95% inhibicije germinacije spora (ID 50 i ID 95 ). Na mikrotitracionim pločama na kojima reakcija nije zaustavljena dodatkom laktofenola praćeno je formiranja hifa i micelije i određene su MIC i MFC vrednosti. Najniže ID 50 i ID 95 vrednosti zabeležene su za vrstu A. ochraceus (10 i 25 μl ml-1) (Tabela 22). Najviša ID 50 vrednost zabeležena je za vrstu B. spicifera (100 μl ml-1), dok je ID 95 vrednost bila iznad opsega testiranih koncentracija ulja (Tabela 22). Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC 30 80 > 100 10 80 > 100 MFC 80 80 > 100 10 100 > 100 Tabela 21. MIC i MFC vrednosti ulja Rosmarinus officinalis određene metodom mikroatmosfere na testiranim mikromicetama Izolat ID 50 ID 95 Aspergillus niger 75 100 Aspergillus ochraceus 10 25 Bipolaris spicifera 100 / Penicillium sp. 1 25 50 Trichoderma viride 50 75 Tabela 22. ID 50 i ID 95 vrednosti (μl ml-1) ulja Rosmarinus officinalis određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama. 167 Rezultati i diskusija MIC i MFC vrednosti su određene za sve testirane izolate osim za vrstu B. spicifera kod kojih je pokazano da su MIC i MFC iznad opsega koncentracija testiranog ulja (Tabela 17). Najniža MIC vrednost zabeležena je za vrstu A. ochraceus (30 μl ml-1), dok je najvi- ša MIC vrednost (100 μl ml-1) zabeležena za vrstu A. niger. MFC vrednost svih izoloata određena je na 100 μl ml-1 (Tabela 23). 5.5.1.2 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Lavandula angustifolia Hemijski sastav ulja Kombinacijom metoda GC i GC/MS izvršena je kvalitativna i kvantitativna ana- liza ulja L. angustifolia. Identifikovano je ukupno 29 komponenti ulja što predstavlja 99,53 %. Dominantne komponente ovog ulja su linalol (37,61%) (Slika 114) i linalol acetat (34,86 %), dok se ostale komponente nalaze u manjem procentu (od 0,08 % do 3,45% ) (Tabela 24). Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC 100 30 > 100 50 80 MFC 100 100 > 100 100 100 Tabela 23. MIC i MFC vrednosti ulja Rosmarinus officinalis određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama Slika 114. Linalol, strukturna formula 168 Rezultati i diskusija Uticaj ulja na rast somatskih hifa in vitro Metodom mikroatmosfere testiran je uticaj etarskog ulja L. angustifolia na micelijal- ni rast 6 odabranih vrsta merenjem prečnika kolonija, 21. dana od inokulacije. Testirane koncentracije ulja iznosile su 10, 15, 25, 50, 75, i 100 μl ml-1. Inhibicija rasta micelije (%) dobijena je poređenjem prečnika kolonija koje su rasle u uslovima aromatične atmosfere sa prečnikom kolonije u kontroli starosti 21. dan. Komponenta KIE1 KIL2 % triciklen - - 0,08 α­pinen 927,5 932 3,45 kamfen 941,6 946 1,17 β­pinen 969,9 974 1,30 mircen 987,4 988 1,85 α­felandren 999,2 1002 0,10 δ­3­karen 1005,1 1008 1,75 p-cimen 1019,9 1020 1,81 limonen 1023,3 1024 0,36 1.8­cineol 1026,5 1026 1,16 trans­β­ocimen 1044,5 1044 0,10 γ­terpinen 1053,8 1054 0,12 α­terpinolen 1083,2 1086 0,21 linalol 1101,3 1095 37,61 kamfor 1139,4 1141 0,73 izoborneol 1152,2 1155 0,37 borneol 1161,6 1165 2,48 terpinen­4­ol 1173,1 1174 1,89 α­terpineol 1187,5 1186 0,18 n­heksil butanoat 1189,8 1191 0,51 nerol - - 0,19 linalol acetat 1255,2 1254 34,86 lavandulil acetat 1288,2 1288 1,06 neril acetat 1363,0 1359 2,42 geranil acetat 1380,7 1379 0,27 β­kariofilen 1413,1 1417 2,84 α­humulen 1447,1 1452 0,29 trans­β­farnezen 1452,3 1454 0,20 murola­4(14), 5­dien 1474,9 1465 0,17 Ukupno 99,53 Tabela 24. Procentualna zastupljenost komponenti etarskog ulja Lavandula angustifolia 1 Kovačev (retencioni) indeks eksperimentalno određen (AMDIS) 2 Kovačev (retencioni) indeks literaturni podatak (Adams, 2007) 169 Rezultati i diskusija Korišćene koncentracije etarskog ulja L. angustifolia od 10, 15, i 25 μl ml-1 nisu izazvale promene u izgledu, teksturi i boji kolonije A. niger. Kolonija A. niger koja se razvijala u uslovima aromatične atmosfere pri koncentraciji ulja od 50 μl ml-1 bila je ne- znatno svetlija i na licu i na naličju od kontrolne kulture. Potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentraciji ulja od 75 μl ml-11 (Tabela 25). U kulturi A. ochraceus potpuna inhibicija rasta micelije (100%) je postignuta pri kon- centraciji ulja od 75 μl ml-1 (Tabela 25). Morfo­fiziološke promene nastale usled interakcije gljive i etarskog ulja L. angustifolia pri koncentracijama od 10, 15, i 25 ml-1 nisu zabele- žene. U koloniji A. ochraceus koja se razvijala u uslovima aromatične atmosfere pri kon- centraciji ulja od 50 μl ml-1 dominara bela vazdušna micelija (Slika 115). Mikroskopskom analizom uočen je zonalni rast i pokazano je da je najveći intenzitet sporulacije u centru ove kolonije, dok formiranje konidijalnih glavica opada od centra ka periferiji koloniji. Etarsko ulje L. angustifolia izazvalo je morfo­fiziološke promene u kulturi B. spici- fera. Potpuna inhibicija rasta micelije (100%) B. spicifera je postignuta pri koncentraciji ulja od 75 μl ml-1 (Tabela 25). Kod B. spicifera pri koncentraciji ulja od 10 μl ml-1 kon- statovano je neznatno smanjenje prečnika kolonije, dok su tekstura, izgled i boja kolonije bili identični kao u kontrolnoj kulturi. Pri koncentraciji ulja od 15 i 25 μl ml-1 kolonije B. Slika 115. Efekat etarskog ulja Lavandula angustifolia na miceliju Asprgillus ochraceus: A. kontrola; B. dominacija bele vazdušne micelije, 50 μl ml-1 170 Rezultati i diskusija spicifera bile su sivo obojene i znatno svetlije nego u kontrolnoj kulturi. Najveći stepen depigmentacije zabeležen je u kulturi B. spicifera koja se razvijala u uslovima aromatične atmosfere pri koncentraciji ulja od 50 μl ml-1. Kolonija je bila svetlo siva, sa ružičastom marginom (Slika 116). Mikroskopskom analizom ove kolonije zabeležen je visok stepen demelanizacije i smanjen intenzitet sporulacije. Najosetljivija vrsta bila je E. purpurascens, kod koje je potpuna inhibicija rasta mi- celije (100%) postignuta sa koncentracijom ulja od 25 μl ml-1 (Tabela 25). Pri koncentra- cija ulja od 10 i 15 μl ml-1, kolonija E. purpurascens se od kontrolne kulture razlikovala samo po smanjenom prečniku kolonije, dok razlike u boji, teksturi i izgledu kolonije nisu zabeležene. Kod izolata Penicillium sp. 1 potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentraciji ulja od 50 μl ml-1 (Tabela 25). Osim smanjenja prečnika kolonije pri koncentracijama ulja od 15 i 25 μl ml-1 kod Penicillium sp. 1. nisu zabeležene morfo­fi- ziološke promene. Najrezistentnija vrsta bila je vrsta T. viride kod koje je tek najveća korišćena koncen- tracija ulja od 100 μl ml-1 izazvala potpunu inhibiciju rasta micelije (100%) (Tabela 25). Promene u boji kolonije u vidu svetlije boje vazdušne micelije u poređenju sa kontrolnom Slika 116. Efekat etarskog ulja Lavandula angustifolia na miceliju Bipolaris spicifera: A. kontrola; B. depigmentacija kolonije, 50 μl ml-1 171 Rezultati i diskusija kulturom su zabeležene kod T. viride koja se razvijala u uslovima aromatične atmosfere pri koncentraciji ulja od 25, 50 i 75 μl ml-1. Nakon utvrđivanja koncentracije ulja koja izaziva 100% inhibicije rasta micelije bilo je moguće preciznije odrediti MIC vrednosti za sve testirane izolate u rasponu koncentra- cija od 10 do 100 μl ml-1. Reinokulacijom tretiranih inokuluma čiji je rast bio inhibiran u uslovima aromatične atmosfere, pri određenim koncentracijama ulja, ustanovljeno je da li je inhibicija reverzibilnog karaktera ili ne (MFC vrednosti). Najniža vrednost MIC zabe- ležena je za E. purpurascens (20 μl ml-1). MFC ove vrste je bio takođe najniži (40 μl ml-1) (Tabela 20). Ista vrednost MFC zabeležena je i za Penicillium sp. 1 (Tabela 26). Vrsta T. viride imala je najveću vrednost MIC (80 μl ml-1), dok je MFC bio 100 μl ml-1 (Tabela 26). Izolat Aspergillusniger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Koncentracija (μl ml-1) Inhibicija rasta micelije (%) 10 0 0 6,67 ± 1,66* 51,31 ± 7,71* 0 0 15 0 6,67 ± 1,66* 10,67 ± 1,76* 73,26 ± 2,33* 5,67 ± 1,66* 0 25 10,67 ± 1,76* 21,33 ± 1,67* 69,33 ± 2,02* 100 59,56 ± 1,67* 0 50 32,66 ± 1,76* 57,33 ± 1,66* 75,33 ± 3,21* 100 100 59,66 ± 2,03* 75 100 100 100 100 100 89,33 ± 1,2* 100 100 100 100 100 100 100 * dobijene vrednosti prikazane su u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom (n=3, p<0,05) Tabela 25. Efekat ulja Lavandula angustifolia na rast micelije testiranih mikromiceta metodom mikroatmosfere Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC 60 60 55 20 40 80 MFC 60 100 100 40 40 100 Tabela 26. MIC i MFC vrednosti ulja Lavandula angustifolia određene metodom mikroatmosfere na testiranim mikromicetama 172 Rezultati i diskusija Uticaj ulja na germinaciju spora Uticaj etarskog ulja L. angustifolia na germinaciju spora ispitivanih izolata praćen je mikrodilucionom metodom. Testirane su iste količine ulja kao i u metodi mikroatmos- fere: 10, 15, 25, 50, 75 i 100 μl ml-1. Zaustavljanjem klijanja laktofenolom nakon 24h od trenutka inokulacije suspenzije spora i brojanjem klijalih i neklijalih konidija određene su koncentracije koje izazivaju 50% i 95% inhibicije germinacije spora (ID 50 i ID 95 ). Na mikrotitracionim pločama, na kojima reakcija nije zaustavljena dodatkom laktofenola, praćeno je formiranja hifa i micelije i određene su MIC i MFC vrednosti. Mikrodilucio- nom metodom je pokazano da etarsko ulje L. angustifolia ne utiče na germinaciju spora A. niger i B. spicifera, te kod ovih izolata nije bilo moguće odrediti ID 50 , ID 95 , MIC i MFC vrednosti etraskog ulja L. angustifolia u opsegu testiranih koncentracija. Najniže ID 50 i ID 95 vrednosti zabeležene su za Penicillium sp. 1 (10 i 15 μl ml-1), dok su više vrednosti zabeležene za vrste A. ochraceus i T. viride (25 i 50 μl ml-1) (Tabela 27). Najniža MIC vrednost zabeležena je za Penicillium sp. 1 (25 μl ml-1). Ova koncentracija ujedno pretdstavlja i MFC vrednost za ovu gljivu, dok je najviša MIC vrednost određena za T. viride (75 μl ml-1) (Tabela 28). Ova vrednost ujedno predstavlja i MFC za ovu gljivu (Tabela 28). Izolat ID 50 ID 95 Aspergillus niger / / Aspergillus ochraceus 25 50 Bipolaris spicifera / / Penicillium sp. 1. 10 15 Trichoderma viride 25 50 Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC >100 50 > 100 25 75 MFC >100 75 > 100 25 75 Tabela 27. ID 50 i ID 95 vrednosti (μl ml-1) ulja Lavandula angustifolia određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama Tabela 28. MIC i MFC vrednosti ulja Lavandula angustifolia određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama 173 Rezultati i diskusija 5.5.1.3 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Origanum vulgare Hemijski sastav ulja Kombinacijom metoda GC i GC/MS izvršena je kvalita- tivna i kvantitativna analiza ulja O. vulgare. Identifikovana je ukupno 21 komponenta etarskog ulja što predstavlja 99.89% ulja. Dominantna komponenta ovog ulja je karvakrol (64,06%) (Slika 117). U značajnijem procentu zastupljena je komponenta linalool (17,56%), dok se ostale komponente nalaze u manjem procentu (od 0,11 % do 4,44 %) (Tabela 29). Slika 117. Karvakrol, strukturna formula Komponenta KIE1 KIL2 % α­pinen 977,6 932 0,42 kamfen 941,7 946 0,16 β­mircen 987,6 988 0,52 α­felandren 999,9 1002 0,12 δ­3­karen 1011,8 1001 0,56 p-cimen 1020,1 1020 4,44 β­ felandren 1023,6 1025 0,35 1.8­cineol 1026,8 1026 0,28 γ­terpinen 1053,9 1054 2,50 α­terpinolen 1083,3 1086 0,20 linalol 1099,8 1095 17,56 kamfor 1139,8 1141 0,11 borneol 1161,4 1165 0,95 terpinen­4­ol 1173,0 1174 1,01 p-ment-1-en-8-ol 1191,0 1186 0,33 izoterpinolen - - 0,11 timol 1292,0 1289 3,86 karvakrol 1307,3 1298 64,06 β­kariofilen 1413,1 1417 1,53 β­bisabolen 1503,1 1505 0,60 kariofilen oksid 1584,0 1582 0,22 Ukupno 99,89 1 Kovačev (retencioni) indeks eksperimentalno određen (AMDIS) 2 Kovačev (retencioni) indeks literaturni podatak (Adams, 2007) Tabela 29. Procentualna zastupljenost komponenti etarskog ulja Origanum vulgare 174 Rezultati i diskusija Uticaj ulja na rast somatskih hifa in vitro Metodom mikroatmosfere testiran je uticaj etarskog ulja O. vulgare na micelijalni rast 6 odabranih izolata merenjem dijametra kolonija, 21. dana od inokulacije. Testirane koncentracije ulja iznosile su 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5 i 2,0 μl ml-1. Inhibicija rasta mi- celije (%) dobijena je poređenjem prečnika kolonija koje su rasle u uslovima aromatične atmosfere sa prečnikom kolonije u kontroli starosti 21. dan. Kod A. niger pri koncentraciji ulja od 0,1, 0,25, 0,5 i 0,75 μl ml-1 nisu zabeležene promene u izgledu, teksturi i boji kolonije. Kolonija A. niger koja se razvijala u uslovima aromatične atmosfere pri koncentraciji ulja od 1 μl ml-1, bila je svetlija i na licu i na naličju od kontrolne kulture sa maslinasto zelenom zonom u centru (Slika 118). Sporulacija je bila oskudnija nego u kontrolnoj kulturi. Za ovu vrstu potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentraciji ulja od 1,5 μl ml-1 (Tabela 30). Najosetljiviji testirani izolati bili su A. ochraceus i E. purpurascens kod kojih je pot- puna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta sa najmanjom korišćenom koncentraci- jom ulja (0,1 μl ml-1). Kod ovih izolata nije bilo moguće pratiti morfo­fiziološke promene nastale usled interakcija ulja i gljive (Tabela 30). Slika 118. Efekat etarskog ulja Origanum vulgare na miceliju Aspergillus niger: A. kontrola; B. izmenjena morfologija kolonije, 1,0 μl ml-1 175 Rezultati i diskusija Kod izolata B. spicifera najmanja koncentracija ulja korišćena u eksperimentu (0,1 μl ml-1) izazvala je neznatnu inhibiciju rasta micelije od 29 ± 1,32%, dok morfo­fizio- loške promene nisu konstatovane u kulturi. Kod ove vrste potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentraciji ulja od 0,25 μl ml-1 (Tabela 30). Kod izolata Penicillium sp. 1 potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentracijama ulja od 0,75 μl ml-1 (Tabela 30). Niže korišćene koncentracije ulja u eksperimentu (0,1, 0,25 i 0,5 μl ml-1) izazvale su morfo­fiziološke promene u vidu depi- gmentacije u odnosnu na kontrolnu kulturu. Kolonija Penicillium sp. 1 koja se razvijala u uslovima aromatične atmosfere pri koncentraciji ulja od 0,25 μl ml-1 odlikovala se tirkizno plavom bojom, izraženom belom zonom u centru, kao i smanjenim prečnikom kolonije u poređenju sa kontrolnom kulturom (Slika 119B). Najveći stepen depigmentacije zabeležen je u kulturi Penicillium sp. 1, koja je gajena u uslovima aromatične atmosfere pri koncen- traciji ulja od 0,5 μl ml-1. U kulturi je formirana bila micelija, praškaste konzistencije a mikroskopskom analizom je konstatovana oskudna sporulacija (Slika 119C). Najrezistentniji testirani izolat pripadao je vrsti T. viride, kod koje je potpuna inhibi- cija rasta micelije (100%) postignuta tek sa najvišom korišćenom koncentracijom ulja u eksperimentu (2 μl ml-1) (Tabela 30). Kod ove vrste su na nižim korišćenim koncentraci- jama ulja bile zabeležene morfo­fiziološke promene tipa depigmentacije i pojave koncen- tričnih zona u vazdušnoj miceliji (Slika 120). Slika 119. Efekat etarskog ulja Origanum vulgare na miceliju Penicillium sp. 1: A. kontrola; B. 0,25 μl ml-1, delimična depigmentacija kolonija; C. 0,5 μl ml-1, potpuna depigmentacija kolonija 176 Rezultati i diskusija Nakon određivanja koncentracije ulja koja izaziva 100% inhibicije rasta micelije bilo je moguće preciznije odrediti MIC vrednosti. Reinokulacijom inokuluma čiji je rast bio onemogućen u uslovima aromatične atmosfere pri određenim koncentracijama ulja ustanovljeno je da li je inhibicija reverzibilnog karaktera ili ne i tom prilikom određe- ne su MFC vrednosti. Najniža vrednost MIC zabeležena je za vrste A. ochraceus i E. purpurascens (0,1 μl ml-1) (Tabela 25). MFC vrste E. purpurascens je bio, takođe, najniži Slika 120. Efekat etarskog ulja Origanum vulgare na miceliju Trichoderma viride: A. kontrola; B. izmenjena morfologija kolonije, 0,75 μl ml-1 Izolat Aspergillusniger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Koncentracija (μl ml-1) Inhibicija rasta micelije (%) 0,1 0 100 29,5 ± 1,32* 100 59,56 ± 1,67 * 0 0,25 0 100 100 100 66.33 ± 3.43* 0 0,5 0 100 100 100 73,26 ± 2,33* 0 0,75 0 100 100 100 100 0 1,0 62,57 ± 0,92* 100 100 100 100 6,67 ± 1,67* 1,5 100 100 100 100 100 10,67 ± 1,76* 2,0 100 100 100 100 100 100 Tabela 30. Efekat ulja Origanum vulgare na rast micelije testiranih mikromiceta metodom mikroatmosfere * dobijene vrednosti prikazane su u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom (n=3, p<0,05) 177 Rezultati i diskusija i bio je jednak MIC vrednosti (0,1 μl ml-1) (Tabela 31). Najveća vrednost MIC zabeležena je za izolate Penicillium sp. 1 i T. viride (1,75 μl ml-1) (Tabela 31). Uticaj ulja na germinaciju spora Uticaj etarskog ulja O. vulgare na germinaciju spora ispitivanih izolata praćen je mikrodilucionom metodom. Testirane su iste količine ulja kao i u metodi mikroatmosfe- re: 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5 i 2,0 μl ml-1. Zaustavljanjem reakcije laktofenolom nakon 24h od trenutka inokulacije suspenzije spora i brojanjem klijalih i neklijalih spora pod svetlosnim mikroskopom određene su koncentracije ulja koje izazivaju približno 50% i 95% inhibicije germinacije spora (ID 50 i ID 95 ). Na mikrotitracionim pločama na kojima reakcija nije zaustavljena dodatkom laktofenola praćenjo je formiranja hifa i micelije i tom prilikom su određene MIC i MFC vrednosti. Najniža korišćena koncentracija ulja u eksperimentu 0,1 μl ml­1 predstavlja ujedno i ID 50 vrednost za A. niger, A. ochraceus, B. spicifera i Penicillium sp. 1 (Tabela 32). ID 95 vrednost ovih izolata zabeležena je pri koncentraciji ulja od 0,25 μl ml-1 (Tabela 32). Više ID 50 i ID 95 vrednosti zabeležene su za T. viride (0,2 i 0,5 μl ml-1) (Tabela 32). Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC 1,25 0,1 0,25 0,1 1,0 1,75 MFC 1,5 0,75 1 0,1 1,75 2 Tabela 31. MIC i MFC vrednosti ulja Origanum vulgare određene metodom mikroatmosfere na testiranim mikromicetama Izolat ID 50 ID 95 Aspergillus niger 0,1 0,25 Aspergillus ochraceus 0,1 0,25 Bipolaris spicifera 0,1 0,25 Penicillium sp.1 0,1 0,25 Trichoderma viride 0,2 0,5 Tabela 32. ID 50 i ID 95 vrednosti (μl ml-1) ulja Origanum vulgare određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama 178 Rezultati i diskusija MIC i MFC vrednosti su određene za sve testirane izolate. Najniže MIC vrednosti zabeležene su za izolate A. ochraceus, B. spicifera i Penicillium sp. 1 (0,2 μl ml-1), dok je najviša MIC vrednost (0,5 μl ml-1) zabeležena za vrstu T. viride (Tabela 33). Ipak ta kon- centracija predstavlja ujedno i MFC vrednost za T. viride, što je i najniža MFC vrednost zabeležena u eksperimentu. Najviše MFC vrednosti dokumentovane za izolate A. niger, A. ochraceus i Penicillium sp. 1 (2 μl ml-1) (Tabela 33). 5.5.1.4 Antifungalna aktivnost etarskog ulja Helichrysum italicum Hemijski sastav ulja Kombinacijom metoda GC i GC/MS izvršena je kvalitativna i kvantitativna analiza etarskog ulja H. italicum. Identifikovano je 60 komponenti što predstavlja 100% ulja. Do- minantna komponenta u ovom ulju je γ­kurkumen koji je u uzorku ulja bio zastupljen sa 22,45% (Slika 121).U značajnijem procentu zastupljene komponente su α­pinen (15,91%) i neril acetat (7,85%), dok se ostale komponente nalaze u manjem procentu od 0,05 % do 5,42 % (Tabela 34). Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC 0,25 0,2 0,2 0,2 0,5 MFC 2 2 1 2 0,5 Tabela 33. MIC i MFC vrednosti ulja Origanum vulgare određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama. Slika 121. γ­kurkumen, strukturna formula 179 Rezultati i diskusija Komponenta KIE1 KIL2 % α­pinen 926,4 932 15,91 α­fenhen 939,2 945 0,39 kamfen 949,1 946 0,20 β­pinen 969,0 969 0,31 p-cimen 1019,1 1020 0,06 limonen 1022,4 1024 2,52 1,8-cineol 1025,4 1026 0,30 izobutil angelat - 1045 0,21 γ­terpinen 1052,9 1054 0,25 α­terpinolen 1082,3 1086 0,19 linalol 1096,5 1095 0,51 izoamil 2­metil butirat 1100,1 1100 0,15 endo-fenol 1108,0 1114 0,08 trans­pinokarveol 1133,3 1135 0,08 izoamil tiglat 1149,6 1148 0,77 nerol oksid 1150,4 1154 0,11 borneol 1160,3 1165 0,10 cis­pinokamfon 1179,1 1172 0,53 terpinen­4­ol 1172,2 1174 0,55 α­terpineol 1185,8 1186 0,26 dekanal 1201,8 1201 0,06 nerol 1224,7 1227 0,78 heksil 2­metil butanoat 1232,7 1233 0,16 heksil 3­metil 2­butenoat 1281,8 n/a 0,30 2-undekanon 1291,4 1293 0,06 neril acetat 1362,5 1359 7,85 α­ilangen 1364,0 1373 0,42 α­kopaen 1368,7 1374 3,52 italicen 1395,8 1405 5,42 cis­α­bergamoten 1408,1 1411 1,44 trans­kariofilen 1411,6 1417 4,74 trans­α­bergamoten 1428,6 1432 3,24 neril propanoat 1449,4 1452 1,39 allo-aromadendren 1464,4 1458 0,28 α­akoradien 1471,0 1464 0,12 β­akoradien 1473,8 1469 0,64 selina­4,11­dien 1468,2 1475 1,13 γ­kurkumen 1474,3 1481 22,45 ar-kurkumen 1477,0 1479 1,90 β­selinen 1479,1 1489 6,94 α­selinen 1488,1 1498 4,78 α­muurolen 1493,2 1500 1,39 β­kurkumen 1505,0 1514 0,60 δ­kadinen 1516,0 1522 1,52 italicen eter 1526,6 1536 0,54 α­kalakoren 1535,4 1544 0,13 trans-nerolidol 1557,1 1561 0,06 kariolan-8-ol 1561,5 1571 0,05 geranil 2­metilbutirat 1570,2 1574 0,57 neril izovalerat 1573,7 1582 0,47 kariofilen oksid 1585,5 1582 0,08 globulol 1589,8 1590 0,17 viridiflorol 1595,8 1592 0,40 rosifoliol 1599,1 1600 2,20 humulan­1,6­dien­3­ol 1604,0 1619 0,14 γ­eudesmol 1623,0 1630 0,17 β­eudesmol 1625,8 1649 0,06 selin­11­en­4­α­ol 1646,3 1658 0,40 epi­β­bisabolol 1661,7 1670 0,09 α­bisabolol 1675,7 1685 0,14 ukupno 100 Tabela 34. Komponente etarskog ulja Helichrysum italicum 1 Kovačev (retencioni) indeks eksperimentalno određen (AMDIS) 2 Kovačev (retencioni) indeks literaturni podatak (Adams, 2007) 180 Rezultati i diskusija Uticaj ulja na rast somatskih hifa in vitro Metodom mikroatmosfere testiran je uticaj etarskog ulja H. italicum na micelijalni rast 6 odabranih izolata merenjem prečnika kolonija, starih 21 dan. Testirane koncentracije ulja iznosile su 10, 15, 25, 50, 75, i 100 μl ml-1. Inhibicija rasta micelije (%) dobijena je poređenjem prečnika kolonija koje su rasle u uslovima aromatične atmosfere sa prečnika kolonije u kontroli starosti 21 dan. U rasponu korišćenih koncentracija potpuna inhibicija rasta micelije (100%) nije posti- gnuta kod nijedne testirane vrste (Tabela 35). Etarsko ulje H. italicum u koncentraciji 100 μl ml-1 izazvalo je morfo­fiziološke promene u kulturi A. niger u vidu potpune depigmentacije kolonije (Slika 122). Mikroskopskom analizom struktura gljiva depigmentisane micelije kon- statovano je prisustvo gusto pakovanih sterilnih vazdušnih hifa, dok su glavice bile odsutne. U uslovima aromatične atmosfere pri koncentraciji ulja od 75 i 100 μl ml-1, detek- tovana je neznatna inhibicija rasta micelije A. ochraceus, dok morfo­fiziološke promene nisu bile detektovane. U kulturi B. spicifera pri koncentraciji ulja od 100 μl ml-1 osim inhibicije rasta micelije od 42% uočeno je blaga depigmentacija (Tabela 35). Mikroskop- skom analizom dokazano je prisusutvo manjeg broja porokonidija smanjenog intenziteta melanizacije u odnosu na kontrolnu kulturu. Slika 122. Efekat etarskog ulja Helichrysum italicum na miceliju Aspergillus niger : A. kontrola; B. depigmentacija kolonije, 100 μl ml-1 181 Rezultati i diskusija Najveći antifungalni efekat zabeležen je kod izolata E. purpurascens kod koje je najviša korišćena koncentracija ulja u eksperimentu od 100 μl ml-1 izazvala inhibiciju rasta micelije od 77% (Tabela 35). Osim smanjenog prečnika micelije, tretirani izolati se nisu razlikovali od kontrolne kulture. U kulturi Penicillim sp. 1 pri najvišoj korišćenoj koncentraciji ulja od 100 μl ml-1 zabeležena je inhibicija rasta micelije od 65% i blaga depigmentacija kolonije (Tabela 35). Najrezistentniji vrsta bila je T. viride kod koje nisu detektovani ni inhibicija rasta micelije niti promene u teksturi, boji i izgledu kolonije. S obzirom da etarsko ulje H. italicum nije izazvalo inhibiciju rasta micelije od 100 % kod nijednog testiranog izolata, može se zaključuti se da se MIC i MFC vrednosti ovog ulja nalaze iznad 100 μl ml-1 i uopšteno govoreći ovo ulje ima nizak antifungalni potencijal (Tabela 36). Izolat Aspergillusniger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Koncentracija (μl ml-1) Inhibicija rasta micelije (%) 10 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 0 0 0 25 0 0 0 24,31 ± 2,16 73,26 ± 2,33* 0 50 0 0 0 59,66 ± 2,03 12,5 ± 1,66 0 75 2,67 ± 1,4 9,1 ± 0,81 18,67 ± 1,33 65,33 ± 3,72 31,68 ± 8,23 0 100 29 ± 1,4 11,5 ± 1,22 42,33 ± 6,17 76,93 ± 4,0 59,56 ± 4,07 0 Tabela 35. Efekat ulja Helichrysum italicum na rast micelije testiranih mikromiceta metodom mikroatmosfere Tabela 36. MIC i MFC vrednosti ulja Helichrysum italicum određene metodom mikroatmosfere na testiranim mikromicetama * dobijene vrednosti prikazane su u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom (n=3, p<0,05) Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 MFC > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 182 Rezultati i diskusija Uticaj ulja na germinaciju spora Uticaj etarskog ulja H. italicum na klijanje spora ispitivanih izolata praćen je mikro- dilucionom metodom. Testirane su iste koncentracije ulja kao i u metodi mikroatmosfere: 10, 15, 25, 50, 75 i 100 μl ml-1. Nakon zaustavljanja klijanja laktofenolom nakon 24h od trenutka inokulacije mikroskopskom analizom nisu uočene neklijale kod svih testiranih izolata pri svim korišćenim koncentracijama ulja, te stoga za ovo ulje nije bilo moguće odrediti ID 50 i ID 95 vrednosti u opsegu korišćenih koncentracija. Na svim mikrotitracionim pločama u kojima reakcija nije zaustavljena dodavanjem laktofenola konstatovano je formiranje hifa i micelije, te stoga ni MIC ni MFC koncen- tracije nije bilo moguće odrediti u opsegu koncentracija od 10 do 100 μl ml-1 (Tabela 37). 5.5.2 Antifungalna aktivnost biocida BAC Benzalkonijum hlorid (BAC), koji spada u grupu kvarternih amonijumovih soli, pre- poručen je kao biocid od Zavoda za zaštitu spomenika kulture u Beogradu. Za ispitivanje antifungalne aktivnosti biocida BAC, korišćene su makrodiluciona metoda, mikrodiluci- ona metoda i metoda neutralizacije biocida. Uticaj BAC na rast somatskih hifa in vitro Makrodilucionom metodom testiran je uticaj biocida BAC na rast micelije 6 odabra- nih izolata merenjem prečnika kolonija 21. dana od inokulacije. Testirane koncentracije biocida iznosile su 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,5 i 5,0 μl ml-1. Inhibicija rasta micelije (%) dobi- Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 MFC > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 > 100 Tabela 37. MIC i MFC vrednosti (μl ml-1) ulja Helichrysum italicum određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama 183 Rezultati i diskusija jena je poređenjem prečnika kolonija koje su rasle sa BAC­om u podlozi sa prečnikom kolonije u pozitivnoj kontroli starosti 21. dana. Praćene su i promene u izgledu, boji i teksturi kolonije i intenzitetu sporulacije tretiranih kultura sa kontrolnom kulturom. Biocid BAC izazvao je morfo­fiziološke promene u kulturi A. niger. Potpuna inhi- bicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncentraciji biocida od 2,5 μl ml-1 (Tabela 38). Najniža korišćena koncentracija biocida u eksperimentu (0,1 μl ml-1) nije izazvala inhibiciju rasta micelije, ali je na koloniji A. niger uočeno prisustvo belih sektora u centru micelije koji nisu bili prisutni u kontrolnoj kulturi (Slika 123). Prisustvo belih sektora kon- statovano je i pri koncentracijama biocida od 0,25, 0,5 i 1,0 μl ml-1. Broj i površina belih sektora je rasla sa povećanjem koncentracije BAC u podlozi. Mikroskopskom analizom belih sektora utvrđeno prisustvo sterilne micelije. U kulturi A. ochraceus konstatovane su morfo­fiziološke promene nastale usled re- akcije gljive na BAC. Potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta je pri koncen- traciji biocida od 1,0 μl ml-1 podloge (Tabela 38). A. ochraceus koja se razvijala pri nižim koncentracijama biocida BAC (0,1, 0,25, i 0,5 μl ml-1) formirala je bele sektore krupno zrnaste micelije koja nije bila prisutna u kontrolnoj kulturi (Slika 124B i C). Mikroskop- Slika 123. Efekat benzalkonijum hlorida na miceliju Aspergillus niger: A. kontrola; B. beli sektori na miceliji, 0,25 μl ml-1 184 Rezultati i diskusija skom analizom pokazano je da u koloniji izmenjene morfologije pod uticajem biocida dominiraju sklerocije, dok su glavice retke (Slika 124D). U kontrolnoj kulturi sklerocije nisu bile prisutne. Najosetljivije testirane vrste bile su B. spicifera, E. purpurascens i Penicillium sp. 1 jer je kod nih potpuna inhibicija rasta micelije (100%) postignuta koncentracijom biocida BAC od 0,25 μl ml-1 (Tabela 38). Niža koncentracija biocida u eksperimentu (0,1 μl ml-1) prouzrokovala je formiranje kolonija sa izmenjenom morfologijom. B. spicifera, koja je rasla na MEA podlozi sa biocidom BAC u finalnoj koncentraciji od 0,1 μl ml-1 formirala kolonije sa izmenjenom bojom lica i naličja. Ova gljiva je u tretmanu sa biocidom BAC Slika 124. Efekat benzalkonijum hlorida na miceliju Aspergillus ochraceus: A. kontrola; B. micelija izmenjene morfologije, 0,25 μl ml-1; C. sklerocije in situ D. početak obrazovanja sklerocija pod uvećanjem od 400× 185 Rezultati i diskusija bila znatno svetlija od kontrolne kulture i sa izraženom belom marginom na periferiji ko- lonije (Slika 125). Mikroskopska analiza je pokazala smanjen intenzitet konidijacije, kao i smanjenu melanizaciju konidiofora i porokonidija. Kolonija E. purpurascens gajena na MEA sa dodatkom biocida BAC u finalnoj kon- centraciji od 0,1 μl ml-1 razlikovala se od kontrolne kulture po intenzivnijoj obojenisti lica kolonije, prisustvu bele margine na periferiji kolonije i prisustvu eksudata (Slika 126B). Slika 125. Efekat benzalkonijum hlorida na miceliju Bipolaris spicifera: A. kontrola; B. micelija izmenjene morfologije, 0.1 μl ml-1 Slika 126. Efekat benzalkonijum hlorida na miceliju Epicoccum purpurascens: A. kontrola; B. micelija izmenjene morfologije, 0,1 μl ml-1 186 Rezultati i diskusija Potpuna inhibicija rasta micelije (100%) kod izolata T. viride postignuta je pri kon- centraciji BAC u podlozi od 2,5 μl ml-1 (Tabela 32). Niže koncentracije biocida BAC (0,1, 0,25, 0,5 i 1,0 μl ml-1) izazvale su promene u teksturi, boji i izgledu kolonije T. viride u poređenju sa kontrolnom kulturom. Formirane kolonije T. viride na MEA sa dodatkom biocida BAC (0,25 μl ml-1) odlikovale su izraženom belom vazdušnom micelijom (Slika 127B). Mikroskopskom analizom ovij kultura utvrđeno je da je intenzitet sporulacije ma- nji u tretiranim kolonijama nego u kontrolnoj kulturi. Slika 127. Efekat benzalkonijum hlorida na miceliju Trichoderma viride: A. kontrola. B. 0,25 μl ml-1 Izolat Aspergillusniger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Koncentracija (μl ml-1) Inhibicija rasta micelije (%) 0,1 0 12,5 ± 1,66 42,33 ± 6,17 65,33 ± 3,72 73,26 ± 2,33 12,5 ± 1,66 0,25 6,67 ± 3,33 66,67 ± 6.67 100 100 100 67 ± 1,76 0,5 36,67 ± 3.33 68,67 ± 0,67 100 100 100 84,5 ± 7,76 1,0 93,83 ± 6,17 100 100 100 100 96,67 ± 3,33 2,5 100 100 100 100 100 100 5,0 100 100 100 100 100 100 Tabela 38. Efekat benzalkonijum hlorida na rast odabranih mikromiceta u makrodilucionoj metodi * dobijene vrednosti prikazane su u vidu srednje vrednosti sa standardnom greškom (n=3, p<0,05) 187 Rezultati i diskusija Nakon određivanja koncentracije ulja koja izaziva 100% inhibicije rasta micelije bilo je moguće preciznije odrediti MIC vrednosti. Reinokulacijom inokuluma čiji je rast bio onemogućen usled prisustva BAC u podlozi ustanovljeno je da li je inhibicija rever- zibilnog karaktera ili ne i tom prilikom određene su MFC vrednosti. Na osnovu rezultata dobijenih makrodilucionom metodom bilo je moguće odrediti MIC i MFC vrednosti u rasponu koncentracija od 0,1 do 5,0 μl ml-1 za sve testirane gljive. Najniža vrednost MIC utvrđena je za vrstu E. purpurascens i iznosi 0,2 μl ml-1 (Tabela 39). Najviša vrednost MIC od 1,5 μl ml-1, utvrđena je za vrstu T. viride (Tabela 39). Najniža vrednost MFC od 0,5 μl ml-1 zabeležena je za izolate B. spicifera, E. purpurascens i Penicillium sp. 1, dok je najviša MFC vrednost od 4,0 μl ml-1 zabeležena za A. ochraceus (Tabela 39). Uticaj BAC na germinaciju spora Uticaj biocida BAC na klijanje spora ispitivanih mikromiceta praćen je mikrodiluci- onom metodom. Testirane su iste koncentracije biocida kao i u makrodilucionoj metodi: 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 2,5 i 5,0 μl ml-1. Zaustavljanjem klijanja laktofenolom nakon 24h od trenutka inokulacije suspenzije spora određene su koncentracije koje izazivaju 50% i 95% inhibicije germinacije spora (ID 50 i ID 95 ). Na mikrotitracionim pločama na kojima reakcija nije zaustavljena dodatkom laktofenola praćeno je formiranje hifa i micelije i tom prilikom su određene MIC i MFC vrednosti. ID 50 vrednosti nisu određene za A. niger i A. ochra- ceus jer su ispod opsega testiranih koncentracija biocida. ID 95 ovih vrsta imala je najnižu vrednost od 0,1 μl ml-1 (Tabela 40). Najviše ID 50 i ID 95 vrednosti su zabeležena za T. viride (0,25 i 0.5 μl ml-1) (Tabela 40). Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Epicoccum purpurascens Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC 1,25 1,0 0,25 0,2 0,25 1,5 MFC 1,5 4,0 0,5 0,5 0,5 2,0 Tabela 39. MIC i MFC vrednosti ulja benzalkonijum hlorida određene makrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama 188 Rezultati i diskusija MIC i MFC vrednosti su određene za sve testirane mikromicete. Najniže MIC vred- nosti zabeležene su za A. niger i A. ochraceus (0,1 μl ml-1), dok je najviša MIC vrednost (0,5 μl ml-1) zabeležena za T. viride (Tabela 41). Najviše MFC vrednosti zabeležene su za A. ochraceus i T. viride (0,5 μl ml-1) (Tabela 41). Uticaj kontaktnog vremena na inhibiciju germinacije spora BAC Metodom neutralizacije biocida testirana je antifungalna aktivnost ispitivanih kon- centracija vodenih rastvora biocida BAC (0,25%, 0,15% i 0,05%) u određenom kontak- tom vremenu (5, 15, 30 i 60 min). Antifungalna aktivnost biocida BAC određivana je posmatranjem redukcije vijabilnosti konidija usled uticaja biocida. Kao test mikromicete u eksperimentu neutralizacije biocida korišćeni su izolati sa zidnih slika Crkve Svete Bo- gorodice manastira Gradac (A. fumigatus, A. versicolor, E. nidulans, i Penicillium sp. 2). Vodeni rastvori BAC (0,25 % i 0,15%) maksimalno su redukovalu vijabilnost koni- dija svih testiranih izolata (> 104) već nakon 5 min (Tabela 42 i 43). Izolat ID 50 ID 95 Aspergillus niger / 0,1 Aspergillus ochraceus / 0,1 Bipolaris spicifera 0,1 0,25 Penicillium sp. 1 0,1 0,25 Trichoderma viride 0,25 0,5 Tabela 40. ID 50 i ID 95 vrednosti (μl ml-1) benzalkonijum hlorida određene mikrodilucionom metodom na testiranim mikromicetama Izolat Aspergillus niger Aspergillus ochraceus Bipolaris spicifera Penicillium sp. 1 Trichoderma viride Minimalna inhibitorna i minimalna fungicidna koncentracija (μl ml-1) MIC 0,1 0,1 0,25 0,25 0,5 MFC 0,25 0,5 0,25 0,25 0,5 Tabela 41. MIC i MFC vrednosti ulja benzalkonijum hlorida određene mikrodilucionom metodom 189 Rezultati i diskusija Najmanja koncentracija vodenog rastvora BAC (0,05%), bila je, takođe, efikasna u redukciji vijabilnosti konidija ali je zahtevala period od 30 min (Tabela 44). Izolat kontaktno vreme (min) 5 15 30 60 Redukcija vijabilnosti konidija Aspergillus fumigatus > 104 > 104 > 104 > 104 Aspergillus versicolor > 104 > 104 > 104 > 104 Emericella nidulans > 104 > 104 > 104 > 104 Penicillium sp. 2 > 104 > 104 > 104 > 104 Tabela 42. Redukcija vijabilnosti konidija odabranih izolata usled interakcijem sa vodenim rastvorom BAC (0,25 %) Izolat kontaktno vreme (min) 5 15 30 60 Redukcija vijabilnosti konidija Aspergillus fumigatus > 104 > 104 > 104 > 104 Aspergillus versicolor > 104 > 104 > 104 > 104 Emericella nidulans > 104 > 104 > 104 > 104 Penicillium sp. 2 > 104 > 104 > 104 > 104 Tabela 43. Redukcija vijabilnosti konidija odabranih izolata usled interakcijem sa vodenim rastvorom BAC (0,15 %) Tabela 44. Redukcija vijabilnosti konidija odabranih izolata usled interakcijem sa vodenim rastvorom BAC (0.05 %) Izolat kontaktno vreme (min) 5 15 30 60 Redukcija vijabilnosti konidija Aspergillus fumigatus < 104 < 104 > 104 > 104 Aspergillus versicolor < 104 < 104 > 104 > 104 Emericell nidulans > 104 > 104 > 104 > 104 Penicillium sp. 2 < 104 < 104 > 104 > 104 190 Rezultati i diskusija 5.5.3 Uporedna analiza antifungalne aktivnosti etarskih ulja i biocida BAC Antifungalni potencijal etarskih ulja, u in vitro uslovima, može se predstaviti slede- ćim nizom, idući od najaktivnijih ka manje aktivnim uljima: O. vulgare > L. angustifolia > R. officinalis > H. italicum. Poređenjem MIC i MFC vrednosti dobijenih dvema kori- šćenim metodama (metoda mikroatmosfere i mikrodiluciona metoda), ispitivana etarska ulja su različito delovala na rast hifa i na klijanje konidija testiranih izolata. Etarsko ulje vrste O. vulgare delovalo je najjače na sve testirane mikromicete. Konidije A. niger bile su osetljivije prema ulju O. vulgare u odnosu na miceliju, što ukazuje niža MIC vrednost dobijena mikrodilucionom metodom (0,25 μl ml-1). Viša MFC vrednost dobijena mi- krodilucionom metodom sugeriše da je fungicidni efekat etarskog ulja O. vulgare izraženiji na nivou rasta micelije nego na nivou klijanja konidija. Kod vrste A. ochraceus fungistatski i fun- gicidni efekat etarskog ulja O. vulgare bili su izraženiji na nivou rasta hifa na šta sugerišu niže MIC i MFC vrednosti dobijena metodom mikroatmosfere. Kod vrste B. spicifera MIC vrednost dobijena mikrodilucionom metodom neznatno je veća od MIC vrednosti dobijene metodom mi- kroatmosfere, dok su MFC vrednosti dobijene obema metodama jednake. Može se zaključiti da su fungistatski i fungicidni efekat etarskog ulja O. vulgare isti na nivou rasta micele i na nivou klijanja spora. Kod izolata Penicillium sp.1 fungistatski efekat etarskog ulja bio je izraženiji na nivou germinacije konidija, dok je fungicidni bio izraženiji na nivou rasta hifa. Konidije vrste T. viride bile su osetljivijena ulje O. vulgare u odnosu na miceliju ove gljive (Tabela 45). Testirani izolati Metod mikroatmosfere Mikrodiluciona metoda MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) Aspergillus niger 1,25 1,5 0,25 2,0 Aspergillus ochraceus 0,1 0,75 0,2 2,0 Bipolaris spicifera 0,25 1,0 0,2 1,0 Penicillium sp. 1 1,0 1,75 0,2 2,0 Trichoderma viride 1,75 2,0 0,5 0,5 Tabela 45. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja Origanum vulgare dobijene metodama mikroatmosfere i mikrodilucionom metodom 191 Rezultati i diskusija Etarsko ulje vrste L. angustifolia pokazalo je umereno­jak antifungalni potencijal. Kod vrste A. niger i B. spicifera fungistatski i fungicidni efekti ovog ulja bili su izraženiji na nivou rasta hifa. Kod ovih MIC i MFC dobijene mikrodilucionom metodom bile su iznad 100 μl ml-1 što upućuje na nizak antifungalni efekat etarskog ulja L. angustifolia na nivou klijanja konidija ovih gljiva. Kod izolata A. ochraceus, Penicillium sp.1 i T. viride fungistatski i fungicidni efekti bili su izraženiji na nivou germinacije konidija (Tabela 46). Etarsko ulje vrste R. officinalis pokazalo je umereno­jak antifungalni potencijal pre- ma svim testiranim izolatima osim prema vrsti B. spicifera kod koje su dobijene vrednosti za MIC i MFC primenom obe metode bile iznad 100 μl ml-1. Fungistatski i fungicidni efekat ulja R. officinalis su bili izraženiji na nivou rasta hifa A. niger. Fungistatski efekat ovog ulja je bio izraženiji na nivou klijanja konidija A. ochra- ceus, dok je fungicidni efekat bio izraženiji na nivou rasta hifa ove gljive. Kod izolata Penicillium sp. 1 fungistatski efekat etarskog ulja R. officinalis bio je izraženiji na nivou germinacije spora. MFC vrednosti dobijene obema metodoma bile su identične (100 μl ml-1), što sugeriše da je fungicidni efekat etarskog ulja R. officinalis jednak i na nivou rasta hifa i na nivou germinacije konidija. Kod vrste T. viride fungistatski i fungicidni efekat bili su izraženiji na nivou germinacije konidija. Metodom mikroatmosfere je pokazano da su MIC i MFC vrednosti etarskog ulja iznad 100 μl ml-1, i to upućuje na slab antifungalni potencijal ulja R. officinalis na rast hifa T. viride (Tabela 47). Testirani izolati Metod mikroatmosfere Mikrodiluciona metoda MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) Aspergillus niger 60 60 >100 >100 Aspergillus ochraceus 60 100 50 75 Bipolaris spicifera 55 100 >100 >100 Penicillium sp. 1 40 40 25 25 Trichoderma viride 80 100 75 75 Tabela 46. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja Lavandula angustifolia dobijene metodama mikroatmosfere i mikrodilucionom metodom 192 Rezultati i diskusija Etarsko ulje H. italicum pokazalo je slab antifungalni potencijal prema svim testira- nim izolatima. Obema korišćenim metodama pokazano je da su MIC i MFC vrednosti za sve testirane izolate iznad 100 μl ml-1 što upućuje na slab fungistatski i fungicidni poten- cijal ovog ulja (Tabela 48). Antifungalni potencijal biocida BAC na nivou rasta hifa i na nivou germinacije konidija ispitivan je makrodilucionom i mikrodilucionom metodom. Zbog slabe isparljivosti biocida me- tod mikroatmosfere nije korišćen. Biocid BAC ispoljio je jak antifungalni potencijal u odnosu na sve testirane izolate. Kod vrsta A. niger, A. ochraceus i T. viride fungistatski i fungicidni efekti biocida bili su izraženiji na nivou klijanja konidija. Kod izolata B. spicifera i Penicillium sp. 1 dobijena MIC vrednost biocida u obe korišćene metode bila je jednaka (0.25 μl ml-1), što sugeriše da je fungistatski efekat ovog biocida identičan na nivou rasta hifa i na nivou klijanja konidija. Kod oba izolata fungicidni efekat je bio izraženiji na nivou germinacije konidija. Zaključak je da biocid BAC ima jači antifungalni efekat na nivou germinacije konidija (Tabela 49). Testirani izolati Metod mikroatmosfere Mikrodiluciona metoda MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) Aspergillus niger 30 80 100 100 Aspergillus ochraceus 80 80 30 100 Bipolaris spiciferas >100 >100 >100 >100 Penicillium sp. 1 80 100 50 100 Trichoderma viride >100 >100 80 100 Tabela 47. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja Rosmarinus oficinalis dobijene metodama mikroatmosfere i mikrodilucionom metodom Testirani izolati Metod mikroatmosfere Mikrodiluciona metoda MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) Aspergillus niger > 100 > 100 > 100 > 100 Aspergillus ochraceus > 100 > 100 > 100 > 100 Bipolaris spicifera > 100 > 100 > 100 > 100 Penicillium sp. 1 > 100 > 100 > 100 > 100 Trichoderma viride > 100 > 100 > 100 > 100 Tabela 48. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja Helichrysum italicum dobijene metodama mikroatmosfere i mikrodilucionom metodom 193 Rezultati i diskusija *** Poznato je da su mnoge komponente etarskih ulja teško rastvorljive u agarizovanim podlogama što onemogućava njihovu difuziju i disperziju, pa se stoga preporučuje da se antifungalna aktivnost etarskih ulja na nivou rasta micelije prati u uslovima aromatične atmosfere (Soković, 2001). S druge strane, zbog slabe isparljivosti BAC je dodavan di- rektno u MEA. Glavni nedostatak metode mikroatmosfere i makrodilucione metode je dug peri- od inkubacije (21 dan). Tokom perioda inkubacije može doći do isparavanja pojedinih komponenti ulja, a i same gljive u uslovim prisustva antifungalnog agensa mogu razviti mehanizme rezistentnosti (Soković, 2001). Gljive pre svega mogu da sintetišu odgovara- juće enzimske komplekse uz pomoć kojih mogu da metabolišu aktivne komponente ulja u inaktivne forme (Farooq i dr., 2002). Mikrodiluciona metoda u tečnoj podlozi je opšte prihvaćena metoda za ispitivanje antifungalnog potencijala različitih supstanci. Prednost korišćenja ove metode je smanjen period inkubacije na samo 3 dana kao i smanjenje iskorišćenje količine hranljive podloge i testiranih komponenti. Pojedine mikromicete ne sporulišu uopšte ili ne sporulišu obilno u laboratorijskim uslovima na hranljivim podlo- gama, te nije moguće pripremiti suspenzije spora u željenim koncentracijama. Vrsta E. purpurascens gajena na MEA bila je sterilna i zbog toga je izuzeta iz mikrodilucione me- tode. Različite vrednosti MIC i MFC posledica su različite osetljivosti micelije i konidija gljiva na antifungalne agense. Antifungalna aktivnost etarskih ulja, posledica je hemijskog sastava i procentualne zastupljenosti pojedinačnih komponenti, koje se odlikuju antifun- Testirani izolati Makrodiluciona metoda Mikrodiluciona metoda MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) MIC (μl ml-1) MFC (μl ml-1) Aspergillus niger 1,25 1,5 0,1 0,25 Aspergillus chraceuso 1,0 4,0 0,1 0,5 Bipolari spicifera 0,25 0,5 0,25 0,25 Penicillium sp. 1 0,25 0,5 0,25 0,25 Trichoderma viride 1,5 2,0 0,25 0,25 Tabela 49. MIC i MFC vrednosti benzalkonijum hlorida dobejine makro­ i mikrodilucionom metodom 194 Rezultati i diskusija galnom aktivnošću. Etarska ulja korišćena u ovom radu izolovana su iz aromatičnih i lekovitih biljaka, i određena svojstva etarskih ulja ovih biljaka su već poznata u literaturi, pre svega njihov antimikrobni i antioksidativni potencijal. R. officinalis se od davnina koristi u narodnoj medicini zbog antiinflamatorne ak- tivnosti što doprinosi zaceljivanju rana. Poseduje i antiviralne i antibakterijaske karak- teristike (Bremnes, 1994; Sosa i dr., 2000). Dominantna komponenta ulja je 1.8­cineol (sinonim: eukaliptol), koja je u našem uzorku ulja bila zastupljena sa 44,28 %, dok su ostale zastupljene komponente bile kamfor (12,54%), α­pinen (11,62%), β­pinen (8,26%), kamfen (4,60%), trans­β­kariofilen (3,96%), borneol (2,96%) i limonen (2,79%). Etarsko ulje vrste R. officinalis do sada su analizirali mnogi autori (Tucker i Maciarello, 1986; Bondini i dr., 1991; Bouchra i dr., 2003; Jiang i dr., 2011). Njihovi rezultati pokazuju da su najzastupljenije komponente etarskog ulja vrste R. officinalis: α­pinen, kamfen, β­pinen, 1.8­cineol i borneol. Morreti i dr. (1998), kao dominantne komponente etarskog ulja R. officinalis, navode α­pinen (38,6%), β­pinen (2,46%), kamfen (4,22%), 1.8­cineol (17,4%), limonen (3,31%), kamfor (15,0­31,0%), verbenon (10,2%) i borneol (6,61%). Soković (2001), kao dominantne komponente etarskog ulja R. officinalis, navodi neidenti- fikovanu komponentu (32,31%), borneol (22,60%), kamfor (18,04%), 1.8­cineol (8,41%), kamfen (7,31%) i α­pinen (4,87%). Zaouali i dr. (2010) su saopštili da su glavne kompo- nente etarskog ulja R. officinalis 1.8­cineol (40,0%), kamfor (17,9%), α­pinen (10,3%) i kamfen (6,3%). Sastav etarskog ulja ispitivanog u ovom radu razlikuje se od drugih autora samo po kvantitativnoj zastupljenosti dominantnih komponenti. Etarsko ulje R. officina- lis korišćeno u ovom radu pokazalo je umereno jak antifungalni potencijal prema svim testiranim mikromicetama osim prema B. spicifera, kod koga ovo ulje nije delovalo ni na nivou rasta micelije ni na nivou germinacie konidija. Micelija vrste T. viride pokazala je visoku rezistentnost prema ulju R. officinalis kada je primenjena metoda mikroatmosfere, dok su konidije bile osetljive prema ovom ulju kada je primenjena mikrodiluciona meto- da. Ostali testirani izolati bili su umereno osetljivi, kako na nivou rasta micelije, tako i na nivou germinacije konidija. Antifungalni potencijal etarskog ulja R. officinalis testiran je 195 Rezultati i diskusija u mnogim radovima do sada na mnoge mikromicete, uglavnom na komercijalne sojeve, biljne i humane patogene, dok antifungalni potencijal ovog ulja na mikromicete pore- klom sa kulturne baštine nije testiran. Različite koncentracije etarskog ulja R. officinalis delovale su inhibitorno na A. niger (Jiang i dr., 2011), Botrytis cinerea Pers. (Bouchra i dr., 2003; Soylu i dr., 2010; Marandi i dr., 2011) Candida albicans (C.P. Robin) Berkhout (Braga i dr., 2007; Jiang i dr., 2011), Cryptococcus neoformans (San Felice) Vuill. (Braga i dr., 2007) i P. expansum (Marandi i dr., 2011). Rezultati dobijeni u ovom radu, zajedno sa drugim literaturnim podacima, potvrđuju visok antifungalni potencijal etarskog ulja R. officinilis pema širokom spektru mikromiceta. L. angustifolia se od davnina koristi u lečenju raznih infektivnih bolesti i oboljenja kože (Bremnes, 1994). Dominantne komponente ulja korišćenog u ovom radu bile su lina- lol (37,61%) i linalol acetat (34,86%). Lavandulil acetat je bio slabije zastupljen (1,06%). Ove komponente su karakteristične za sve vrste roda Lavandula (Venskutonis i dr., 1997). Dosadašnja istraživanja hemijskog sastava etarskog ulja L. angustifolia pokazuju veliku varijabilnost u kvantitativnoj zastupljenosti dominantnih komponenti. Zastupljenost linalo- la može varirati u opsegu od 9,25 do 68,7%, linalol acetata od 1,22 do 59,49%, a lavandulil acetata od 0,28 do 21,62% (Lawrence, 1993; Venskutonis i dr., 1997; Lis­Balchin i dr., 1998). Prema Soković (2001) antifungalna aktivnost etarskog ulja vrsta roda Lavandula je vrlo varijabilna i može biti jaka, umerena ili slaba. Intenzitet antifungalne aktivnosti ovog ulja zavisi od procentualne zastupljenosti pojedinačnih komponenti ulja, i njihovog siner- gističkog efekta, pre svega linalola i linalol acetatata (Lis­Balchin i dr., 1998). Umereno jak antifungalni potencijal ovog ulja dobijen u ovom radu je u saglasnosti sa procentualnom zastupljenošću komponenti linalola i linalol acetata. Na nivou rasta micelije etarsko ulje je u nižim koncentracijama delovalo na A. niger i B. spicifera, dok se pokazalo da na nivou germinacije konidija ovih vrsta ulje deluje u višim koncentracijama. Pigmenti prisutni u konidijama A. niger i porokonidijama B. spicifera verovatno imaju zaštitnu ulogu i štite konidije od negativnog dejstva ulja. Za ispitivanju antifungalne aktivnosti etarskog ulja L. angustifolia na mikromicete izolovane sa kulturne baštine postoje literaturni podaci. Ra- 196 Rezultati i diskusija kotonirainy i Lavédrine (2005) su ispitivali uticaj etarskog ulja L. angustifolia kao i uticaj glavnih komponenti ovog ulja (linalol i linalol acetat) na vrste gljiva koje su izolovane sa iz biblioteka i arhiva: A. niger, Eurotium repens de Bary, Cladosporium herbarum (Pers.) Link, P. frequentans, T. viride, C. globosum, P. variotii i Stachybotrys chartarum (Ehrenb.) S. Hughes. Ovi autori su pokazali da etarsko ulje L. angustifolia deluje inhibitorno na sve testirane mikromicete i sugerisali su da linalol može preventivno da se koristi u konzerva- ciji jer sprečava rast mikromiceta na spapiru starih knjiga. O. vulgare se od davnina koristi kao začinska biljka i lekovita biljka. Snažan i kara­ kterističan miris i ukus mnogih jela posledica je korišćenja sasušenih listova ove biljke. Poznato je da je otac medicine Hipokrat koristio origano kao antiseptik i kao narodni lek za stomačne i respiratorne tegobe (White, 1998). Etarsko ulje ove vrste odlikuje se snažnom antioksidativnom aktivnošću zbog visokog sadržaja fenolnih i flavoniodnih jedinjenja, a odlikuje se i visokom antimikrobnom aktivnošću. Dominantna komponenta ulja testiranog u ovom radu je karvakrol (54,06%), dok je sledeća komponenta po zastupljenosti bila linalol (17,56%). Vrlo zastupljene komponente su bile i p­cimen (4,44%), timol (3,86%), γ­terpinen (2,50%). Azizi i dr. (2009) su, proučavajući hemijski sastav etarskog ulja tri varijateta vrste O. vulgare, ustanovili da su najdominantnije komponente ovog etarskog ulja karvakrol (70­77,4%), γ­terpinen (8,1­9.5%) i p­cimen (4,5­5,3%). Prieto i dr. (2007) su saopštili da su glavne komponente etarskog ulja O. vulgare karvakrol (54,7%) i timol (22,1%). Etarsko ulje grčkog origana O. vulgare L. subsp. hirtum karakterišu karvakrol (65,25%) i timol (14,84%) i ovo ulje je pokazalo izuzetno jaku antifungalnu aktivnost u mikrodilucionoj metodi (Džamic, 2010) Sastav etarskog ulja ispitivanog u ovom radu razlikuje se od literaturnih podata- ka samo po kvantitativnoj zastupljenosti dominantnih komponenti. Visok antifungalni potencijal etarskog ulja O. vulgare prema svim testiranim izolatima sa objekata i pred- meta kulturne baštine demonstriran je niskim MIC i MFC vrednostima, dobijenih pri- menom metode mikroatmosfere i mikrodilucione metode. Antifungalni efekat etarskog ulja O. vulgare testiran je do sada potvrđen mnogo puta na komercijalne sojeve mikro- 197 Rezultati i diskusija miceta, biljne i humane patogene, uzročnike kvarenja hrane. Iako i ostale komponen- te etarskog ulja O. vulgare mogu imati antifungalni potencijal, pre svega linalol, ipak antifungalna aktivnost ovog ulja najviše zavisi od količine karvakrola. Khosravi i dr. (2011) su izolovali etarsko ulje iz populacije samoniklih biljaka O. vulgare iz provinci- je Gnom u Iranu. GC/MC analizama kod ovog ulja nije konstatovano prisustvo karva- krola, dok je kao dominantna komponenta ovog ulja bile linalol (42%) i timol (25,1%). Ovo ulje je pokazalo slab antifungalni potencijal protiv Candida glabrata (H.W. Ander- son) S.A Mey & Yarrow. Zaključak je da je dobijena jaka antifungalna aktivnost etar- skog ulja O. vulgare na izolate sa objekulturne i predmeta kulturne baštine u korelaciji sa visokim sadržajem karvakrola. H. italicum se od davnina koristi kao začinska i lekovita biljka u mnogim kultura- ma posebno u južnim delovima Afrike (Germishuizen i Meyer, 2003). Hemijski profil ispitivanoog uzorka vrste H. italicum u ovom radu pokazao je dominaciju komponenti γ­kurkumena, α­pinena i neril acetata. Kao glavne komponente etarskog ulja dva različita genotipa H. italicum, Perrini i dr. (2009) navode neril acetat (55,7% i 41,5%), nerol (4,4% i 13,1%) i neril propanoat (12,7% i 5,6%). Sastav etarskog ulja ispitivanog u ovom radu razlikuje se od literaturnih podataka samo po kvantitativnoj zastupljenosti dominantnih komponenti. Antifungalni potencijal etarskog ulja H. italicum prema izolatima sa kulturne baštine bio je slab. Literaturni podaci sugerišu da antifungalni potencijal ovog ulja može biti vrlo varijabilan, i da zavisi od zastupljenosti pojedinačnih komponenti. Tomás­Bar- berán i dr. (1990) su izolovali fluoroglicinol i acetofon iz vrste H. italicum. Ova jedinjenja su pokazala snažnu antifungalnu aktivnost pri testiranju Penicillium sp., C. herbarum i Phytophthora capsicii Leonian a nisu delovala uopšte na testirani Aspergillus sp. BAC predstavlja smešu alkildimetilamonium hlorida sa ugljovodoničnim lancima različite dužine. Broj ugljenikovih atoma u ugljovodiničnim lancima je uvek paran. BAC spada u kvarterne amonijumove soli i odlikuje se antimikrobnom aktivnošću, jer dezinte- griše ćelijsku membranu, što izaziva curenje ćelijskog sadržaja, kao i deaktivaciju enzima (Day i dr., 2009). Biocid BAC u ovom radu pokazao je jak antifungalni potencijal u od- 198 Rezultati i diskusija nosu na sve testirane izolate, što je demonstrirano niskim MIC i MFC vrednostima, kao i morfo­fiziološkim promenama tretiranih izolata koje su posledica interakcije sa BAC. Njegova upotreba kao biocida u konzervaciji i prevenciji predmeta i objekata kulturne baštine je preporučena od strane evropske direkcije za biocide (Cooke, 2002). BAC se pokazao uspešnim pri tretmanu infekcije izazvane sa kompleksom vrste Fusarium so- lani (Mart.) Sacc., koja je kolonizovala zidne slike iz perioda gornjeg Paleolita u pećini Lascaux (Francuska) (Dupont i dr., 2007; Bastian i dr., 2009). Ipak, treba napomenuti da prekomerna upotreba ovog biocida može izazviti rezistentnost kod mikroorganizama. Poznato je da su Gram­negativne bakterije, kao i vrste roda Pseudomonas, rezistentne na BAC, i da nakon primene ovog biocida na objektima kulturne baštine može doći do kolonizacije tretiranih mesta ovim bakterijama (Langsrud i dr., 2003). Da bi se to sprečilo preporučuje se rotacija biocida. Ispitivanje antifungalne aktivnosti metodom neutralizacije pokazalo je da biocid BAC ima snažno antifungalno dejstvo i da kao vodeni rastvor u niskim koncentracijama za najkraće kontaktno vreme inhibira germinaciju konidija testiranih gljiva. Slične rezul- tate su dobili i Tortorano i dr. (2005), koji su pokazali da vodeni rastvori BAC niskih kon- centracija u kratkom vremenskom inervalu inhibiraju klijavost konidija kliničkih izolata vrste A. fumigatus. 5.6 Opšta diskusija Biološke analize u ovoj doktorskoj disertaciji (analiza kvalitativnog sastava biofilma na kamenim spomenicima kulture, mikološka analiza vazduha u zatvorenim prostori- jama instutucija kulture, izolacija i identifikacija mikromiceta sa umetničkih predmeta) sprovedene su paralelno sa planiranim konzervatorskim i restauratorskim radovima na ispitivanim predmetima i objektima kulturne baštine. Ujedno istraživanja prezentovana u ovom radu predstavljaju pionirski pokušaj implementacije bioloških analiza u sistem 199 Rezultati i diskusija konzervacije u Srbiji. Rezultati mikrobioloških analiza izvršenih na kamenim stećcima na arheološkom lokalitetu Mramorje čine sastavni deo dokumentacije za nominaciju ovog kulturno – istorijskog spomenika za stavljanje na UNESCO listu kulturne baštine. Ispitivanje antifungalne aktivnosti biocida BAC, koji se već koristi kao biocid i koji je odobren od strane Evropske direkcije za biocide (Cook, 2002), potvrdila su snažan fungistatski i fungicidni potencijal ovog hemijskog agensa na nivou rasta somatskih hifa i na nivou klijanja mikromiceta koje se često razvijaju na objektima i predmetima srpske kulturne baštine. Ipak, tokom degradacije BAC nanetog na tretirani objekat dolazi do for- miranja jedinjenja benzil­di­metil­amina, benzil­metil­amina, benzil amina, benzaldehida i bebnzoeve kiseline, koja određeni heterotrofni mikroorganizmi mogu da koriste kao izvore ugljenika i azota (Patrauchan i Oriel, 2003). Takođe, česta upotreba biocida izaziva pojavu rezistentnosti mikroorganizama. Preporuka je testirati osetljivost izolata u in vitro uslovima pre njegove in situ implementacije, ali i testirati i uvoditi nove agense u sistem konzervacije kulturne baštine (Patrauchan i Oriel, 2003). Priroda predstavlja nepresušan izvor biološki aktvnih supstanci koje se mogu primenjivati u svim vidovima suzbijanja mikroorganizama. Sekundarni metaboliti biljaka, pre svega lako isparljiva etarska ulja se poslednju deceniju intenzivno ispituju sa stanovišta njihove antimikrobne aktivnosti. Testiranje antifungalne aktivnosti etarskih ulja i sintetičkih biocida u eksperimentima sa izolatima poreklom sa objekata i predmeta srpske kulturne baštinena prvi put je objavljeno ovom radu. Etarsko ulje O. vulgare pokazalo je jak fungistatski i fungicidni efekat na nivou rasta somatskih hifa i na nivou germinacije konidija in vitro. Etarska ulja R. officinalis i L. angustifolia pokazala su umereno jak antifungalni potencijal protiv testiranih mikromice- ta, dok je etarsko ulje H. italicum pokazalo slab antifungalni potencijal. Dobijeni rezultati se mogu tumačiti i sa stanovišta osetljivosti mikromiceta na odgovarajući testirani antifun- galni agens, što ide u prilog tvrdnji da je neophodno ispitati osetljevost izolata na određeni agens u in vitro uslovima pre njegove implementacije in situ. Takođe, imajući u vidu da materijali od kojih su izgrađena umetnička dela predstravljaju specifične supstrate, mora se voditi računa o pravilnoj implementaciji antifungalnih agenasa na način koji dodatno ne 200 Rezultati i diskusija oštećuje supstrat. Uvođenje agenasa biološkog porekla u sistem konzervacije predmeta i objekata kulturne baštine do sada nije često vršeno osim pionirskih pokušaja. Polisaharid sfagnan i fenolna jedinjenja izolovana iz jetrenjače Sphagnum palustre Kopersky & al. su uspešno primenjeni u cilju suzbijanja rasta gljiva sa drvenih predmeta iz Etnografskog muzeja i arheoloških iskopina Arktika (Zaitseva, 2010). Axinte i dr. (2011) su utvrdili da cinamaldehid, dominantna komponenta etarskog ulja Cinnnamomum sp. ima snažan antifungalni efekat na kvasac Torula sp. i makromicetu Coniophora puteana (Scumach) P. Karst., uzročnike mrke truleži, na umetničkim predmetima od drveta. Hidroalkoholni ekstrakti biljaka Arctium lappa L. i Centaurea cyanus L. imaju antimikrobno dejstvo na mikroorganizame izolovane iz vazduha u arhivama kao i sa papirnih dokumenata skla- dištenih u arhivama (Saravia i dr., 2008). Zanimljiv pristup u ovoj problematici imali su Mironescu i dr. (2010) koji su testirali 5 novih biocida, smeša odabranih komercijalnih biocida (glutaraldehid, heksadecil triamonijum bromid, BAC, didecil dimetil amonijum hlorid, soli 2­etil heksanoične kiseline, propikonazol, i ε­ftalimidoperoksiheksanoična kiselina) i etarskog ulja Thymus vulgaris L. u različitim koncentracijama. Sve testirine smeše delovale su antifungalno prema vrstama rodova Alternaria, Aureobasidium i Peni- cillium izolovanih sa kamenog supstrata gradskih bedema grada Sibiu (Rumunija). Prema Cataldo i dr. (2005) biološke analize predstavljaju sastavni deo integrisanih metoda primenljivih u proučavanju deterioracije predmeta i objekata kulturne baštine, kao i njihove konzervacije. Iako su ova istraživanja novijeg datuma, dobijeni rezultati su pomogli da se shvate mehanizmi biodeterioracije spomenika kulture, kao i u izboru odgovarajućih fizičkih metoda i hemijskih agenasa primenljivih u konzervaciji. Mikro- organizmi, posebno mikromicete kao uzročnici biodeterioracije, su odavno prepoznati u svetu kao dominantan problem u očuvanju predmeta i objekata kulturne baštine. Pozna- vanje bioloških agenasa, uzročnika biodeterioracije, kao i praćenje i opisivanje promena koje su direktna posledica biološke aktivnosti mikroorganizama, vrše se u cilju očuvanja predmeta i objekata materijalne baštine. 201 Zaključci 6 Zaključci 1. Primenom in situ observacije kulturno istorijskih spomenika, izgrađenih od različitih tipova kamena opisani su simptomi biodeterioracije u vidu različito obojenih bio- patina, izmenjene teksture kamene površine, fenomena „biopiting“, kao i prisustva lišajeva, mahovina i viših biljaka vielike pokrovnosti. 2. Promena obojenosti kamenih površina i formiranje biopatine posledica su produkcija pigmenata od strane algi i cijanobakterija u okviru fotoautrofne komponente SAB. – Uzročnik crvene biopatine na fasadi crkve Svete Bogorodice Manastira Gra- dac (MG) je cijanobakterija Gloeocaosa sanguinea, a uzročnik narandžaste biopatine na istom objektu je zelena alga Trentepohlia aurea. – Uzročnik katransate biopatine želatinozne konzistencije na objektu Ajfelova prevodnica (AP) je cijanobakterija Nostoc sp. – Uzročnik narandžaste biopatine na vezivnom malteru Spomenika Neznanom junaku na Avali (NJ) je zelena alga Haematococcus pluvialis, a uzročnici zelene bio- patine na istom objektu su cijanobakterija Oscillatoria sp. i zelena alga Cylidrocistis brebissonii. 3. U okviru fototrofne komponente SAB na površini kamenog supstrata 5 istraživanih spomenika kulturne baštine u Srbiji identifikovano je 17 taksona cijanobakterija. 202 Zaključci – Cijanobakterije su bile zastupljene sa 9 taksona reda Chrococcales, 5 taksona reda Nostocales i 3 taksona reda Oscilatorialles. – Raspored identifikovanih cijanobakterija bio je neravnomeran na istraživanim lokalitetima. Najviše taksona (11) je zabeleženo na srednjevekovnim kamenim steć- cima (SS), dok je na Spomeniku Neznanom junaku na Avali (NJ) identifikovan samo jedan pripadnik cijanobakterija. – Najčešće identifikovana vrsta na kamenom supstratu objekata materijalne kul- turne baštine je cijanobakterija Gloeocapsa violacea. – Prosečan broj identifikovanih cijanobakterija na ispitivanim lokalitetima (4,4 ± 1,7) sugeriše nizak diverzitet. 4. U okviru fototrofne komponente SAB na površini kamenog supstrata 5 istraživanih spomenika kulturne baštine u Srbiji identifikovano je 13 taksona algi. – Alge su bile zastupljene sa 7 taksona razdela Chlorophyta i 6 taksona razdela Bacilariophyta. – Raspored idntifikovanih algi je neravnomeran na ispitivanim lokalitetima. Najčešće identifikovan predstavnik je vrsta Desmosoccus olivaceus, zabeležena na četiri istraživana lokaliteta, a najveći diverzitet algi je dokumentovan na stubovima Brankovog mosta (lokalitet MG). – Prosečan broj identifikovanih algi na ispitivanim lokalitetima (3,4 ± 1,3) su- geriše nizak diverzitet. 5. Prosečan broj svih identifikovanih taksona fototrofne komponente SAB na svim istraživanim lokalitetima (7,6 ± 1,9) sugeriše nizak diverzitet fotoautotrofa. 6. U okviru komponente SAB koju su sačinjavale mikromicete na površini kulturno istorijskih spomenika u Srbiji identifikovano je 28 taksona. 203 Zaključci – Raspored identifikovanih mikromiceta je neravnomeran na ispitivanim loka- litetima. Cladosporium cladosporioides i vrste rodova Alternaria i Fusarium su pri- sutne na svim ispitivanim lokalitetima. Epicoccum purpurascens je identifikovana sa visokom učestalošću na četiri istraživana lokaliteta. Najveći broj vrsta mikromiceta (13) zabeležen je na Ajfelovoj prevodnici (AP). – Prosečan broj identifikovanih mikromiceta na svim istraživanim objektima (10,6 ± 0,93) sugeriše malu raznovrsnost, tj. nizak diverzitet mikromiceta. 7. Izolacija i identifikacija mikromiceta sa različitih umetničkih predmeta, sačinjenih od različitih tipova materijala, pokazala je različit afinitet mikromiceta da kolonizuju ove supstrate. – Najveći diverzitet mikromiceta je zabeležen na umetničkim predmetima iz- građenim od drvnog materijala, sa koga su izolovane vrste rodova: Absidia, Alterna- ria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Epicoccum, Neurospora, Penicillium, Rhizopus, Syncephalastrum, Trichoderma i Ulocladium. – Sa slikarskih boja izolovane su vrste rodova: Alternaria, Aspergillus, Clado- sporium, Drechslera, Fusarium, Neurospora, Paecylomyces, Penicillium, Rhizopus, Trichoderma i Ulocladium, dok su sa poleđine slikarskih platna izolovane vrste rodo- va: Alternaria, Aspergillus, Chaetomium, Cladosporium, Penicillium, Trichoderma, Ulocladium i Wardomyces. – Najmanji diverzitet mikromiceta bio je na fotografskom papiru na tkaninama. Na fotografaskom papiru utvrđene su vrste rodova: Fusarim, Humicola, Paecylomy- ces, Rhizopus, Trichoderma i Ulocladium, a na tkaninama: Aspergillus i Penicillium. 8. U vazduhu zatvorenih prostorija različite namene u instutucijama kulture dominiraju vijabilne propagule vrsta Penicillium aurantiogriseum (41,18 %) i C. cladosporio- ides (29,41%). 204 Zaključci – Vrste rodova Cladosporium i Penicillium su najčešće izolovane iz vazduha zatvorenih prostorija (58,83 %). – Visoka učestalost izolacije zabeležena je i za vrste rodova Trichoderma (23,53 %) i Aspergillus (17,64%). – U vazduhu zatvorenih prostorija ispitivanih institucija kulture dominara- ju vijabilne propagule filamentoznih gljiva, dok su kvasci izolovani sa manjom učestalošću. – Kvantitativna analiza vazduha i poređenje sa standardima Svetske zdravstve- ne organizacije pokazuje umerenu kontaminaciju vazduha zatvorenih prostorija ispi­ tivanih institucija kulture. 9. Zide slike ispitivanih srpskih sakralnih objekata kolonizuju vrste rodova: Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Epicoccum, Emericella, Nigrospora i Penicillium. Naj- češće izolovane vrste pripadaju rodovima Aspergillus i Penicillium. 10. U okviru istraživanja antifungalne aktivnosti testiranih etarskih ulja i benzalkoni- jum hlorida (BAC), svi testirani agensi pokazali su antifungalnu aktivnost različi- tog stepena. – Antifungalni potencijal etarskih ulja, u in vitro uslovima, može se predstaviti sledećim nizom, idući od najaktivnijih ka manje aktivnim uljima: Origanum vulgare > Lavandula angustifolia > Rosmarinus officinalis > Helichrysum italicum. – BAC pokazao je snažan antifungalni potencijal. 11. Hemijski sastav etarskog ulja R. officinalis pokazuje dominaciju komponente 1.8­ci- neol (44,28 %.). Dominantne komponente etarskog ulja L. angustifolia su linalol (37,61%) i linalol acetat (34,86 %), dok je karvakrol (64,06%) dominirao u etarskom ulju O. vulgare. Dominantna komponenta etarskog ulja H. italicum bila je γ­kurku- men (22,45 %). 205 Zaključci 12. Različite koncentracije ispitivanih etarskih ulja i BAC delovale su različito na ni- vou rasta somatskih hifa i na nivou germinacije spora. Ovo je potvrđeno različitim vrednostima MIC i MFC dobijenim primenom metoda: metoda mikroatmosfere i makrodilucionom metodom. 13. Ispitivana etarska ulja i biocid BAC izazvala su morfo­fiziološke promene na somat- skim i reproduktivnim strukturama testiranih gljiva. – Pod uticajem biocida BAC i etarskog ulja R. officinalis favorizovano je for- miranje sklerocija u kulturu Aspergillus ochraceus. – U kulturi Bipolaris spicifera zabeležena je pojava demelanizacije pod utica- jem biocida BAC i etarskog ulja L. angustifolia. 14. Vodeni rastvori BAC deluju antifungalno u niskim koncentracijama i u kratkom kon- taktnom vremenu inhibiraju germinaciju konidija testiranih mikromiceta. 206 Literatura 7 Literatura Abrusci, C., Martín­González, A., Del Amo, A., Catalina, F., Collado, J. & Platas, G. (2005): Isolation and identification of bacteria and fungi from cinematographic films. Int Biodeter Biodegr. 56: 58­68. Achatz, G., Oberkofler, H., Lechenauer, E., Simon, B., Unger, A., Kandler, D., Ebner, C., Prillinger, H., Kraft, D. & Breitenbach, M. (1995): Molecular cloning of major and minor allergens of Alternaria alternata and Cladosporium herbarum. Mol Immunol. 32: 213­227. Adamo, M., Magaudda, G., Nisini, P.T. & Tronelli, G. (2003): Susceptibility of cellu- lose to attack by cellulolytic microfungi after gamma irradiation and ageing. Restaurator. 24: 145­151. Adams, R.P. (2007): Identification of essential oil components by gas chromatograp- hy/mass spectrometry. 4th edition. Allured Pub Corp. Ainsworth, G.C., Sparow, F.K. & Sussman, A.S. (1973): The Fungi. The taxonomic review with keys: Ascomycetes and Fungi Imperfecti. Academic Press New York and London. Aira, M.J., Jato, V., Stchigel, A.M., Rodríguez­Rajo, F.J. & Piontelli, E. (2007): Ae- romycological study in the Cathedral of Santiago de Compostela (Spain). Int Biodeter Biodegr 60: 231–237. 207 Literatura Anagnostidis, K., Economou­Amilli, A. & Roussomoustakaki, M. (1983): Epilithic and chasmolithic microflora (Cyanophyta, Bacillariophyta) from marbles of the Parthenon (Acropolis­Athens, Greece). Nova Hedwigia. 38: 227­282. Anagnostidis, K., Gehrmann, C.K., Gross, M., Krumbein, W.E, Lisi, S., Pantazidou, A., Urzí, C. & Zagari, M. (1992): Biodeterioration of marbles of the Parthenon and Propylaea, Acropolis, Athens – associated organisms, decay and treatment suggestions. In: La Conservation des Monuments dans le Bassin Mėditerranėen. (eds). Decrouez, D., Chamay, J. & Zezza, F. Musėe d’art et d’histoire. Genėve. Arai, H. (2000): Foxing caused by fungi: twenty fife years of study. Int Biodeter Biodegr. 46: 181­188. Arenz, B.E., Held, B.W., Jurgensa, J.A., Farrell, R.L. & Blanchette, R.A. (2006): Fungal diversity in soils and historic wood from the Ross Sea Region of Antar- ctica. Soil Biol Biochem 38: 3057–3064. Arino, X. & Saiz­Jimenez, C. (1996): Factors affecting the colonization and distri- bution of cyanobacteria, algae and lichens in ancient mortars. In: Proceedings of the Eighth International Congress on Deterioration and Conservation of Sto- ne. Vol. 2. (ed). Riededer, J. Rathgen­Forschlungslabor. Berlin, Germany, pp. 725­731. Arx von, J.A. (1974): The genera of fungi. Sporulating in pure culture. Vaduz: J. Cramer. Arya, A., Shah, A.R. & Satish Sadasivan, S. (2001): Indoor aeromycoflora of Baroda museum and deterioration of Egyptian mummy. Curr Sci India. 81: 793­799. Axinte, L., Cuzman, A.O., Feci, E., Palanti, S. & Tiano, P. (2011): Cinnamaldehyde, a potential active agent for the conservation of wood and stone religious artefacts. Eur J Sci Theol. 7: 25­34. Azizi, A., Yan, F. & Honermeier, B. (2009): Herbage yield, essential oil content and composition of three oregano (Origanum vulgare L.) populations as affected by soil moisture regimes and nitrogen supply. Ind Crop Prod. 29: 554­561. 208 Literatura Bastian, F., Alabouvette, C., Jurado, V. & Saiz­Jimenez, C. (2009): Impact of biocide treatments on the bacterial communities of the Lascaux Cave. Naturwissensc- haften. 96 863­868. Berner, M., Wanner, G. & Lubitz, W. (1997): A comparative study of the fungal flora present in medieval wall paintings in the chapel of the castle Herberstein and in the parish church of St Georgen in Styria, Austria. Int Biodeter Biodegr. 40: 53­61. Betherlin, J. (1983): Microbial weathering process. In: Microbial Geochemistry. (ed). Krumbein, W.E. Blackwell Scientific Publications. Oxford, pp, 223­262. Blaschke, R. (1987): Natural building stone damaged by slime and acid producing microbes. Proceedings of the Nineth International Conference on Cement Mi- croscopy, Reno. Nevada. USA. pp. 70 ­81. Blazquez, A.B., Lorenzo, J., Flores, M. & Gómez­Alarcón G. (2000): Evaluation of the effect of some biocides against organisms isolated from historic monuments. Aerobiologia. 16: 423­428. Bloomfeld, B.J. & Alexander, M. (1967): Melanins and resistance of fungi to lysis. J Bacteriol. 93: 1276­1280. Bogomolova, E. & Kirtsideli, I. (2009): Airborne fungi in four stations of the St. Petersburg Underground railway system. Int Biodeter Biodegr. 63: 156­160. Bondini, A.J., Mizrachi, I. & Juarez, M.A. (1991): The Essential oil of Rosmarinus officinalis growing in Argentina. J. Essent. Oil Res., 3: 63­65. Booth, C. (1971a): The fungal culture media. In: Methods in Microbiology. (ed). Booth, C. 4: 49­94. Booth, C. (1971b): The genus Fussarium. Commonwealth Mycological Institute. Kew. England. Borrego, S., Guiamet, P.,Gómez de Saravia, S., Batistini, P., Garcia, M., Lavin, P. & Perdomo, I. (2010): The quality of air at archives and the biodeterioration of photographs. Int Biodeter Biodegr. 64: 139­145. 209 Literatura Bouchra, C., Achouri, M., Idrissi Hassani, L.M. & Hmamouchi, M. (2003): Chemical composition and antifungal activity of essential oils of seven Moroccan Labia- tae against Botrytis cinerea Pers: Fr. J Ethnopharmacol. 89: 165­169. Brachert, T. (1985): Patina – Von Nutzen und Nachteil der Restaurierung. Callwey. München. Braga, F.G., Bouzada, M.L.M., Fabri, R.L., de O. Matos, M., Moreira, F.O., Scio, E. & Coimbra, E.S. (2007): Antileishmanial and antifungal activity of plants used in traditional medicine in Brazil. J Ethnopharmacol. 111: 396­402. Bremnes, L. (1994): Herbs. Eyewitness­Handbooks. DK Publishing. New York. Burford, P.E., Kierans, M. & Gadd, M.G. (2003): Geomycology: Fungi in mineral substrata. Mycologist. 17: 98­107. Buđevac, D. & Stipanić, B. (1989): Čelični mostovi. IRO. „Građevinska knjiga”. Beograd. Butler, J.M. & Day A.W. (1998): Fungal melanins: a review. Can J Microbiol. 44: 1115–1136. Cain, E. & Miller, B.A. (1982): Photographic, spectral and chromatographic searches into the nature of foxing. Preprints American Institute for Conservation, 10th Annual Meeting. Milwaukee, pp. 54­52. Callot, G., Maurette, M., Pottier, L. & Dubois, A. (1987): Biogennic etching of mi- crostructures in amorphous and crystalline silicates. Nature 328: 147­149. Camuffo, D., Van Grieken, R., Busse, H.­J., Sturaro, G., Valentino, A., Bernardi, A., et al., (2001): Environmental monitoring in four European museums. Atmos Environ.35: 127–140. Caneva, G., de Marco, P. & Pontrandolfi, M.A. (1993): Plant comunities on the walls of Venosa Castle (Basilicata, Italy) as biodetergen and bioindicators. In: Con- servation of Stone and Other Materials, vol 1. (ed). Thiel, M.­J. E & FN Spon. London, pp. 263­270. 210 Literatura Carmona, N., Laiz, L., Gonzalez, J.M., Garcia­Heras, M.,Villegas, M.A. & Saiz­Ji- menez, C. (2006): Biodeterioration of historic stained glasses from the Cartuja de Miraflores (Spain). Int Biodeter Biodegr. 58: 155–161. Cataldo, R., de Donno, A, de Nunzio, G., Leucci, G., Nuzzo, L. & Siviero, S. (2005): Integrated methods for analysis of deterioration of cultural heritage: the Crypt of ‘‘Cattedrale di Otranto’’. J Cult Herit. 6: 29–38. Cataldo, R., de Donno, A, de Nunzio, G., Leucci, G., Nuzzo, L. & Siviero, S. (2005): Integrated methods for analysis of deterioration of cultural heritage: the Crypt of ‘‘Cattedrale di Otranto’’. J Cult Herit. 6:29–38. Cataldo, R., Siviero, S., Leucci, G., Pagiotti, R. & Angelini, P. (2008): Integrated surveys for the analysis of the deterioration in the Crypt of the Abbey of Mon- tecorona – Italy. 9th International Conference on NDT of Art. Jerusalem. Israel. 25­30 May. Chertov, O., Gorbushina, A. & Deventer, B., (2004): A model for microcolonial fungi growth on rock surfaces. Ecol Model. 177: 415­426. Ciferri O. (1999): Microbial Degradation of Paintings. Appl Environ Microbiol. 65: 879­885. Claridge, A.W., Cork, S.J., & Trappe, J.M. (2000): Diversity and habbitat relationship of hypogeous fungi, I. study design, sampling techniques and general survey results. Biodivers. Conserv. 9: 151 – 173. Cooke, M. (2002): European review of biocides: PharmaChem. B5srl: 48­50. Corte, A.M., Ferroni, A. & Salvo, V.S. (2003): Isolation of fungal species from test samples and maps damaged by foxing, and correlation between these species and environment. Int Biodeter Biodegr. 51: 167­173. Crippa, A. (1983): Funghi isolati da affreschi murali in antiche chiese di Pavia, Atti Societa Italiana Scienze Naturali Museo Civica Storia Naturale Milano. 124: 3 – 10. Darlington, A. (1981) Ecology of walls. Heinemann. London. 211 Literatura Day, S., Lalitha P., Haug, S., Forthergill, A.W., Cevallos, V., Vijayakumar, R., Prajna, N.V., Archarya, N.R., McLeod, S.D. & Lietman, T.M.. (2009): Activity of anti- biotics against Fusarium and Aspergillus. Br J Ophatmol. 93: 116­119. Diakumaku, E., Gorbushina, A.A., Krumbein, W.E., Panina, L. & Soukharjevski, S. (1995): Black fungi in marble and limestone – an aesthetical, chemical and physical problem for the conservation of monuments. Sci Tot Environ. 167: 295­304. Dix , N. J. & Webster J. (1995): Fungal Ecology. Chapman and Hall. New York. Dupont, J., Jacquet, C., Dennetière, B., Lacoste, S., Bousta, F., Orial, G., Cruaud, C., Couloux, A. & Roquebert, M.F. (2007): Invasion of the French Paleolithic painted cave of Lascaux by the members of Fusarium solani complex. Myco- logia. 99: 526­533. Đorđević, M. (2011): Mramorje­Projekat konzervacije srednjovekovnih kamenih obeležja­strećaka na arheološkom nalazištu Mramorje u Perućcu, opština Bajina Bašta. Republički zavod za zaštitu spomenika kulture. Beograd. Đorđević, M. (2012): Srednjovekovna kamena nadgrobna obeležja­stećci na arheo- loškom nalazištu Mramorje u Rastištu na potesima Gajevi i Uroševine, opština Bajina Bašta. Republički zavod za zaštitu spomenika kulture. Beograd. Džamić, Ana. (2010): Sastav, antifungalna i antioksidativna aktivnost etarskih ulja I ekstrakata odabranih vrsta iz familije Lamiacea. Doktorska disertacija. Univer- zitet u Beogradu. Biološki fakultet. Eagle Industrial Hygiene Associates (2004): Microbial Sampling and Analysis: Mo- lds and Bacteria. Publikacija dostupna na: http://www.eagleih.com/micro.html. Eckhardt, F.E.W. (1985): Mechanism of the microbial degradation of minerals on sandstone monuments, medieval frescoes and plasters. In: Vth International Congress on Deterioration and Conservation of Stone. Vol 2. Presses Polytech- niques Romandes. Lausane. pp. 85­90. 212 Literatura Eckhardt, F.E.W. (1988): Influence of culture media employed in studying microbial weathering of building stones and monuments by heterotrophic bacteria and fungi. In: VI th International Congress on Deterioration and Conservation of Stone. Nicholas Copernicus University. Torun, pp. 71­81. Ehrlich, H.L. (1981): Geomicrobiology. Marcel dekker Inc. New York. Ellis, M.B. (1971): Dematiaceous hyphomycetes. Commonwealth Mycological In- stitute. Kew. England. Ellis, M.B. (1976): More dematiaceous hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute. Kew. England. Ellis, M.B. & Ellis, P.J. (1997): Microfungi on land llants. an identification handbo- ok. The Richmond Publishing Co. Ltd. Elliot, A.M. (1934): Morphology and life history of Haematococcus pluvialis. Arch Protistenk. 82: 250­272. Erickson, K.E.L., Blanchette, R.A. & Ander, P. (1990): Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components. Springer – Verlag. Berlin, p. 407. Emoto, Y. & Emoto, Y. (1974): Microbiological investigation of ancient tombs with paintings. Sci Conserv. 12: 95­102. Farooq, A., Choudhary, M.I., Rahman, A., & Tahara, S. (2002): Detoxification of terpi- nolene by plant pathogenic fungus Botrytis cinerea. Z Naturforsch. 57: 863­866. Fazio, A.T., Papinutti, L., Gómez, B.A., Parera, S.D., Rodríguez Romero, Siracusa- no, A,G. & Maier, M.S. (2010): Fungal deterioration of a Jesuit South American polychrome wood sculpture. Int Biodeter Biodegr. 64: 694–701. Felice de, B., Pasquale, V., Tancredi, N., Scherillo, S. & Guida, M. (2010): Genetic fingerprint of microorganisms associated with the deterioration of an historical tuff monument in Italy. J Genet. 89: 253­257. Flanning B., Samson, RA. & Miller, D.J. (2001): Microorganisms in home and in- door work environments. Diversity, Health Impacts, Investigation and control. Taylor & Francis 213 Literatura Florian, M­L, E. (2002): Fungal facts: Solving fungal problems in heritage collecti- ons. Archetype Publications LtD. London. Florian, M­L.E. & Manning, L. (2000): SEM analysis of irregular fungal fox spots in an 1854 book: population dynamics and species identification. Int Biodeter Biodegr. 46: 205­220. Formina, M.A., Alexander, I.J., Hillier, S. & Gadd, G.M. (2004): Zinc phosphate and pyromorphite solubilization by soil plant symbiotic fungi. Geomicrobiol J. 21: 351­366. Formina, M., Ritz, K. & Gadd, G.M. (2000): Negative fungal chemotropism to toxic metals. FEMS Microbiol Lett. 193: 207­211. Gadd, G.M. (1990): Fungi and yeast for metal accumulation. In: Microbial Mine- ral Recovery. (eds). Ehrlich, H. L. & Brierley, C.J. McGraw­Hill. New York. pp. 249­275. Gadd, G.M. (2007): Geomycology: biogeochemical transformations of rocks, mine- rals, metals and radionuclide by fungi, biowatering and bioremeditiation. Mycol Res. 111: 3­49. Garcia­Pitchel, F., Sherrz, N.D. & Castenholz, R.W. (1992): Evidence for ultra­violet sunscreen role of the extracellular pigment scytonemin in the terrestrial cyano- bacterium Chlorogloepsis sp. Photochem Photobiol. 56: 17­23. Garg, K.L., Jain, K.K. & Mishra, A.K., (1995): Role of fungi in the deterioration of Wall Paintings. Sci Total Environ. 167: 255­271. Gärtner, G. & Stoyneva, M.P. (2003): First Study of Aerophytic Cryptogams on Mo- numents in Bulgaria. Ber Nat­med. (90): 73­82. Gaylarde, C.C. & Gaylarde, P.M. (2005): A Comparative study of the major micro- bial biomass of biofilms exterior on buildings in Europe and Latin America. Int Biodeter Biodegr. 55: 131­139. Gaylarde, P.M. & Gaylarde, C.C. (1998): A rapid method for the detection of algae and cyanobacteria on the external surfaces of buildings. In: Third Latin American 214 Literatura Biodegradation and Biodeterioration Symposium. (eds). Gaylarde, C.C., Barbo- sa T.C.P. & Gabilan, N.H. Paper No. 37. The British Phycological Society, UK. Gaylarde, P.M & Gaylarde, C.C, (2004): Deterioration of siliceous stone monuments in Latin America: microorganisms and mechanisms. Corros Rev. 22: 395­415. Germishuizen, G. & Meyer, N.L. (2003): Plants of Southern Africa. Strelitzia 14. Pretoria. National Botanical Institute. Godish, T., (2001): Indoor Environmental Quality. CRC Press. New York. pp. 196­197. Goodwin, T.W. & Jamikorn, M. (1954): Studies in carotenogenesis. H. Caretenoid Synthesis in the alga Haematococcus pluvialis. Biochem J 57: 376­381. Gorbushina A.A., Vlasov, D.Yu., Panina, L.K. & Krumbain, V.E. (1996): Fungi de- teriorating marble in Cherson. Mikol Fitopatol.30: 23­28. Gorbushina, A.A. & Peterson, K., (2000): Distribution of Microorgamisms on an- cient Wall paintings as related to associated faunal elements. Int Biodeter Bio- degr 46: 277­284. Gorbushina, A.A., Lyalikova, N.N., Vlasov, D.Yu. & Khizhnyak, T.V. (2002): Micro- bial communities on the monuments of Moscow and St. Petersburg: biodiversity and trophic relations. Microbiology. 71: 409­417. Gorbushina, A.A., Whitehead, K., Dornieden T., Niesse, A., Schulte, A. & Hedges, J.I. (2003a): Black fungi colonies as unites of survival: hyphal mycosporines synthesiyed by rock­dwelling microcolonial fungi. Can J Botany. 81: 131­138. Gorbushina, A.A., Diakumaku, E., Müller, L. & Krumbein, W.E. (2003b): Biocide treatment of rock and mural paintings: Problems of application, moleculat tech- niques of control and environmental hazards. In: Molecular biology and cultular heritage. (ed). Saiz­Jimenez, Proc Int Congr. pp. 61­71. Gorbushina, A.A., Heyrman, J., Dornieden T., Gonyalez­Delvalle, M., Krumbein, E. W., Laiz, L., Peterson, K., Saiz­Jimenez, C. & Swings, J., (2004): Bacterial and fungal diversity and biodeterioration problems in mural painting enviro- 215 Literatura ments of St. Martins Church (Greene­Kreiensen, Germany). Int Biodeter Bio- degr 53: 13­24. Gorbushina, A.A. (2007): Life on the rocks. Environ Microbiol. 9: 1613­1631 Gorbushina AA. & Broughton W.J, (2009): Microbiology of atmosphere­rock inter- face: how biological interactions and physical stresses modulate a sophisticated microbial ecosystem. Annu Rev Microbiol 63: 431­550. Gómez­Alarcón, G., Muñoz, M.L. & Flores, M., (1994): Excretion of Organic Acids by fungal strains isolated from decayed sandstone. Int Biodeter Biodegr 34: 169­180. Gómez­Alarcón, G. & Torre de la, A.M. (1994): The effect of filamentous fungi on stone monuments – the Spannish experience. In: Building Mycology. (ed). Sin- gh. E & FN Spon, London, pp. 295–309. Gómez­Alarcón, G., Muñoz, M.,Ariño, X. & Ortega­Calvo, J.J. (1995a): Microbial communities in weathered sand stones: the case of Carrascosa del Campo chur- ch, Spain. Sci Total Environ. 167: 249­254. Gómez­Alarcón, G., Cilleros, B., Flores, M. & Lorenzo, J. (1995b): Microbial com- munities and alteration process at Alcals de Henares, Spain. Sci Total Environ. 167: 231­239. Gottlieb, D. (1978): The germination of fungus spores. Durham. Meadowfield Press. Gravesen, S. (1979): Fungi a cause of allergic disease. Allergy 34: 135 – 154. Gregory, P.H. (1973): Microbiology of the atmosphere. 2nd edn. Aylesbury: Leo- nard Hill. Grote, G. & Krumbein, W.E. (1992): Microbia precipitation of manganese by ba- cteria and fungi from desert rock and rock varnish. Geomicrobiol J. 10: 49­57. Guglielmineti, M., Morghen de Guili, C., Radaeli, A., Bistoni, F., Carruba, G., Spera, G. & Careta G. (1994): Mycological and ultrastructural studies to evaluate bi- odeterioration of mural paintings. detection of fungi and mites in frescos of the Monastery of St Damian in Assisi. Int Biodeter Biodegr. XX: 269­283. 216 Literatura Guillitte, O. (1995): A bioreceptivity: A new concept for building ecology studies. Sci Total Environ.167:215–220. Guiamet, P., Borrego, S., Lavin, P., Perdomo, I. & Gómez de Saravia, S. (2011): Biofouling and biodeterioration in materials stored at the Historical Archive of the Museum of La Plata, Argentine and at the National Archive of the Republic of Cuba. Colloid Surface B.85: 229­234. Hall­Stoodley, L., Costerton, J.W. & Stoodley, P. (2004): Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2: 95–108. Hanel, H. & Raether, W. (1998): A more sophisticated method of determining the fungicidal effect of water­insoluble preparations with a cell harvester, using miconazole as an example. Mycoses. 31:148–154. Hanson, J.R. (2008): The Chemistry of Fungi. The Royal Society of Chemistry. Tho- mas Graham House. Science Park. Milton Road. Cambridge. UK. Harding, M.W., Marques, L.L., Howard, R.J., & Olson, M.E. (2009): Can filamen- tous fungi form biofilms? Trends Microbiol. 17: 475­480. Hawksworth, D.L. (1991): The fungal dimensions of biodiversity: Magnitude, signi- ficance, and conservation. Mycol. Res. 95: 641­645. Hawksworth, D.L. (2004): Fungal diversity and its implications for genetic resource collections. Stud Mycol. 50: 9–18. Heaton, M. & Cleal, R.M.J. (2000): Beaker pits at Crescent copse, near Shrewtown, Wiltshire, and the effect of arboreal fungi on archeological remains. Wiltshire Archeological & Natural History Magazine. 93: 71­61. Helmi, M.F., Elmitwalli, R.H., Rizk, A.M. & Hagrassy, F.A. (2011): Antibiotic extra- ction as a recent biocontrol method for Aspergillus niger and Aspergillus flavus fungi in ancient Egyptian mural paintings. Mediterr Archaeol Ar. 11: 1­7. Henderson, M.E. & Duff, R.B. (1963): The release of metallic and silicate ions from minerals, rocks, and soils by fungal activity. J.Soil Sci. 14: 236­246. 217 Literatura Hoffman, L. & Darienko, T. (2005): Algal biodiversity on sandstones in Luxembo- urg. Ferrantia. 44: 99­101. Hosamani M.K. & Pattanashettar R.S. (2003): Occurrence of unusual fatty acids in Ficus benghalensis seed oil. Ind Crop Prod. 18: 139­143. Huang C.H., Liang M.F. & Kam Y C., (2003): The fatty acid composition of oop- haguous tadpoles (Chiraxalus eoffingeri) fed conspecific or chicken egg yolk. Comp Biochem Physiol. 135: 329­326. Hueck, H.J. (1965): The Biodeterioration of Materials as a part of Hylobiology. Ma- ter. Org. 1: 5­34. Hueck, H.J.(1968): The Biodeterioration of Materials – an Appraisal. In: Biodeteriora- tion of materials. (eds) Walters. A.H & Elphick, J.S. Elsevier. London, pp. 6­12. Hunt, J.M. (1961): Distribution of hydrocarbons in the sedimentary rocks. Geochim Cosmochim Ac. 22:37­49. Hyde, K.D. (2001): Where are the missing fungi? Does Hong Kong have any an- swers? Mycol Res. 105: 1514 ­1518. Ignjatović, A. (2006): Od istorijskog sećanja do zamišljanja nacionalne tradicije: Spomenik Neznanom junaku na Avali. in: Institut za noviju istoriju Srbije. Isto- rija i sećanje. Studije istorijske svesti. Beograd. Inoue, M. & Koyano, M. (1991): Fungal contamination of oil paintings in Japan. Int Biodeter. 28: 23­35. Ishii, H. (1995): Monitoring of fungicide resistence in fungi: biological to biochemi- cal approaches. In: Molecular methods in plant pathology. (eds). Singh, S.U. & Singh, P.R. Lewis Publisher.Boca Ratton. London. Tokio. pp. 483­495. Jaag, O. (1945): Untersuchung über die Vegetation und Biologie der Algen des nac- kten Geistens in den Alpen I, Jura und im schweizerischen Mitteland. Beträge zur Kryptongamenflora der Schweiz 9. Heft 3. Jacobson, E.S. (2000): Pathogenic role for fungal melanins. Clin Microbiol Rev. 13: 708­717. 218 Literatura Jenkins, I.D. & Middleton, A.P. (1988): Paint on the Parthenon Sculptures. The Annual of the British School of Archeology at Athens. 87: 183­207. Jiang, Y., Wu, N., Fu, Y­J., Wang, W., Luo, M., Zhao, C­J., Zu, Y­G. & Liu, X­L. (2011): Chemical composition and antimicrobial activity of the essential of Ro- semary. Environ toxicol Pharmacol. 32: 63­68. Jokilehto, J. (2005): Definition of cultural heritage. References to documents in history. ICCROM Working group „Heritage Society“. Kabbani R.M. (1997): Conservation: a collaboration between art and science. The chemical educator. 2: 1­18. Kalpana, Srivastava R., Mishra A.K. & Nair, M.V. (2011): Polymeric products as effective biocide (antifungal agens) against deteriorating wood. Asiatic journal of biotechnology resources, 2: 542­546. Kandić, O. (2008): Manastir Gradac. Republički zavod za zaštitu spomenika culture. Karavaiko, G.I. (1978): Microflora of land microenvironments and its role in the tur- nover of substance. In: Environmental Biogeochemistry and Geomicrobiology, The Terrestrial Environment, Vol 2. (ed) Krumbein. W.E. Ann Arbor Sciencce Publ. Inc. Michigan, pp. 397 – 411. Keller, W.D. (1957): Principes of chemical weathering. Lucas Brothers Publishers. Columbia. Misouri. Khosravi, A.R., Shokri, H., Kermani, S., Dakhili, M., Madani, M. & Parsa, S. (2011): Antifungal properties of Artemisia sieberi and Origanum vulgare essential oils against Candida glabrata isolates obtained from patients with vulvovaginal can- didiasis. J Mycol Méd. 21: 93­99. Kigawa, R., Sano, C., Ishizaki, T., Miura, S. & Sugiyama, J. (2009): Biological issues in the conservation of mural paintnings of Takamatsuzuka and Kitora tumuli in Japan. In: International symposium on the conservation and restoration of cultu- ral property—study of environmental conditions surrounding cultural properties 219 Literatura and their protective measures. (ed). Sano, C. National Research Institute for Cultural Properties, Tokyo, pp. 43–50. Knutsen, A.P., Bush, R.K, Demain, J.G., Denning, D.W.,Dixit, A.,Fairs, Greenberger, P.A., Kariuki, B., Kita, K., Kurup, V.P., Moss, R.B., Niven, R.M., Pashley, C.H., Slavin, R.G., Vijay, H.M. & Wardlaw, A.J. (2011): Fungi and allergic lower respiratory tract diseases. Clin Rev Allerg Immu. 280­291. Kolwzan, B., Adamiak, W., Grabas, K. & Pawe1czyk, A. (2006): Introduction to Environmental Microbiology. Oficyna Wydawnicza Politechniki Wroc1awskiej, Wroc1aw. Komarek, J. & Anagnostidis, K. (1998): Cyanoprokaryota. 1. Teil: Chroococcales. Susswasserflora von Mitteleuropa. Band 19/1. Spektrum Akademischer Verlag. Berlin. Komarek, J. & Anagnostidis, K. (2005): Cyanoprokaryota. 2. Teil: Chroococcales. Susswasserflora von Mitteleuropa. Band 19/2. Spektrum Akademischer Verlag. Berlin. Komarek, J. & Fott B. (1983): Das phytoplankton des Susswassers. Band XVI. 7. Teil 1. Halfte. In: Die Binnengewasser (ed). Huber­Pestalozzi, C. Schweizer- bart‘sche Verlagbuchhandlung. Stuttgart. Krammer, K. & Lange­Bertalot, H. (1988): Bacillariophyceae. 1. Teil. Gustav Fisc- her Verlag. Stuttgart. Krammer, K. & Lange­Bertalot, H. (1998): Bacillariophyceae. 2. Teil. Gustav Fisc- her Verlag. Stuttgart. Krumbein, W.E. (1992): Colour changes of buildings stones and their direct and indirect biological causes. In: 7th International Congress on Deterioration and Conservation of Stone. (eds). Rodrigues, J.D., Henriques, F. & Jeremias, F.T. L.N.E.C. Lisbon. p443. Kumar, R. & Kumar, A.V. (1999): Biodeterioration of stone in tropical environments: an overview. The Getty Conservation Institute. Santa Monica, CA. 220 Literatura Lamb, B., Guenther, A., Gay, D. & Westberg, H. (1987): A national inventory of biogenic hydrocarbon emissions. Atmos Environ 21: 1696­1705. Lange­Bertalot, H. (2001): Diatoms of Europe. Vol 2. A.R.G. Gantner Verlag K.G. Langsrud, S., Sundheim, G., Borgmann­Strahsen, R. (2003): Instrinsic and required resistance to quaternary ammonium compounds in food­related Pseudomonas spp. J Appl Microbiol. 95: 874–882. Laundon, J.R. (1985): Desmococcus olivaceus. The name of the common subaerial Green algae. Taxon. 34: 671­672. Lawrence, B.M. (1993): Progress in Essential oil. Perfum Flavor. 18:58­61. Lenzenweger, R. (2003): Dezmidiaceenflora von Osterreich. Teil 4. Bibliotheca Phy- cologica. Band 111. J. Cramer. Berlin. Lefèvre, M.: 1974: La ‘Maladie Verte’ de Lascaux. Stud Conserv.19: 126­156. Lehtonen, M. & Reponen, T. (2003): Everyday activities and variations of fungal spore concentration in indoor air. Int Biodeter Biodegr. 31: 35­39. Lis­Balchin, M., Deans, G.S. & Eaglesham, E. (1998): Relationship between bioa- ctivity and chemical composition of commercial essential oils. Flavor Fragr. J. 13: 98­104. Lourenço, M.J.L. & Sampaio, J.P. (2009): Microbial deterioration of gelatin emul- sion photographs: Differences of succeptibility between black and white and colour materials. Int Biodeter Biodegr. 63: 496­502. Ljaljević Grbić, M. (2006): Ispitivanje interakcije rtanjske metvice (Nepeta rtanjensis Diklić et Milojević) i odabranih mikromiceta. Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu. Biološki fakultet. Ljaljević Grbić, M., Vukojević J. & Stupar, M. (2008): Fungal colonization of air­conditioning systems. Arch Biol Sci. 60: 201­206. Ljaljević Grbić, M., Subakov­Simić, G., Krizmanić, J & Lađić, V. (2009): Cyanoba- cterial, algal and fungal biofilm on sandstone substrata of Eiffel’s Lock in Bečej (Serbia). Bot. Serb. 33: 101­105. 221 Literatura Laljević Grbić, M., Stupar, M., Vukojević, J. & Grubišić, D., (2011): In vitro antifun- gal and demelanizing activity of Nepeta rtanjensиs essential oil against human pathogen Bipolaris spicifera. Arch Biol Sci 63: 897­905. Macedo, M.F., Miller, A.Z., Dionǐsio, A. & Saiz­Jimenez, C. (2009): Biodiversity of cyanobacteria and green algae on monuments in Mediterranean Basin: an overview. Microbiology. 155: 3476­3490. Mandić, S. (1965): Sopoćani. Beograd. Turistička štampa Manley, E.P. & Evans, L.J. (1986): Dissolution of feldspars by low­molecular­weight alliphatic and aromatic acids. Soil Sci. 141: 106­112. Manoli, F., Koutsopoulos, E. & Dalas, E. (1997): Crystalization of calcite on chitin. J Cryst growth. 1982: 116­124. Marandi, R.J., Hassani, A., Ghosta, Y., Abdollahi, A., Pirzad, A. & Sefidkon, F. (2011): Control of Penicillium expansum and Botrytis cinerea on pear with Thymus kotshyanus, Ocimum basilicum and Rosmarinus officinalis essential oils. J Med Plant Res. 5: 626­634. May, E. (2003): Microbes on building stone – for good or ill?. Culture. 24: 5­8. Mc Ginnis, M.R., Campbell, G., Gourley, W.K. & Lucia, H.L. (1992): Phaeohyp- homycosis caused by Bipolaris spicifera: an informative case. Eur J Epidemiol 8: 383­386. Mesquita, N., Portugal, A., Videira, S., Rodríguez­Echeverría, S., Bandeira, A.M.L., Santos, M.J.A. & Freitas, H. (2009): Fungal diversity in ancient documents. A case study on the Archive of the University of Coimbra. Int Biodeter Biodegr 63: 626­629. Meynell, G., 1979. Notes on foxing, chlorine dioxide bleaching and pigments. Paper Conservator. 4: 30­32. Meynell, G. & Newsam, R.J. (1978): Foxing, a fungal infection of paper. Nature 274: 466­468. 222 Literatura Michaelsen, A., Piñar, G., Montanari, M. & Pinzari, F. (2009): Biodeterioration and restoration of a 16th­century book using a combination of conventional and molecular techniques: A case study. Int Biodeter Biodegr. 63: 161­168. Milanesi, C., Baldi, F., Vignani, R., Ciampolini, F., Faleri, C & Cresti, M., (2006): Fungal deterioration of medieval wall fresco determined by analysing small fragments containing copper. Int Biodeter Biodegr. 57: 7­13. Mironescu, M., Mironescu, I.D. & Georgescu, C. (2010): Microstructural changes indu- ced by five new biocidal formulations on moulds. Annals of RSCB. 15: 162­167. Money, N.P. (1999): Biophysics: fungus punches its way in. Nature 401: 332­333. Morreti, L.D.M., Peana, T.A. & Satta, M. (1998): Effects of soil properties on yield and composition of Rosmarinus officinalis essential oil. J Essent Oil Res. 9: 199­204. Morton, L.H.G. & Surman, S.B. (1994): Biofilms in biodeterioration – a review. Inter Biodeter Biodegr 34: 203­221. Muntaňola­Cvetković, M. (1987): Opšta mikologija. Književne novine. Beograd. Nigam, N., Dhawan, S. & Nair, V.M. (1994): Deterioration of feather and leather objects of some Indian museums by keratinophilic fungi and non­keratinophilic fungi. Inter Biodeter Biodegr. 33: 145­152. Niesler, A., Gόrny, R.L., Wlazlo, A., Ludzeń­Izbińska, B., Ławniczek­Wałczyk, A., Gołofit­Szymczak, M., Meres, Z., Kasznia­Kocot, J., Harkawy, A., Lis, D.O. & Anczyk, E. (2010): Microbial contamination of storerooms at the Auschwi- tz­Birkenau Museum. Aerobiologia. 26: 125­133. Nittereus M. (2000): Fungi in archives and libraries. Restaurator. 21: 25­40. Nol, L., Henis, Y. &Kenneth, R.G. (1983): Biological factors of foxing in postage stamp paper. Int Biodegr 19: 19­25. Nooner, D.W., Oro, J. % Gilbert, J.M. (1972): Ubiquity of hydrocarbons in nature: aliphatic hydrocarbons in weathered limestone. Geochim Cosmochimi Ac 36: 953­959. 223 Literatura Omelyansky, V.L. (1940): Manual in Microbiology. USSR Academy of Sciences, Moscow, Leningrad. Ortega­Calvo, J.J., Arin˜ O.X., Hernandez­Marine, M. & Saiz­Jimenez, C. (1995): Factors affecting the weathering and colonization of monuments by phototrop- hic microorganisms. Sci Total Environ 167: 329–341. Palmer, R.J., Siebert, J. & Hircsh, P. (1991): Biomass and organic acids in sandstone of a weathering building: production by bacterial and fungal isolates. Microb Ecol. 21: 253­266. Pandey, A.K., Shrivastav, A., Bhatnagar, P., Sarsaiya, S. & Awasthi, M.K. (2011): Diversity of monument deterioration­causing fungi at Gwalior Fort (M.P) India. Ann Environ Sci. 5: 35­40. Pandey, D.K., Tripathi, N.N., Tripathi, R.D. & Dixit, S.N. (1982): Fungitoxic and phytotoxic properties of the essential oil of H. suaveolens. Zeit Pflazenkran Pflanzensch 89: 344–349. Paner, C.M. (2012): Chemical control of fungi infesting easel oil paintings at the University of Santo Tomas, Museum of Art and Sciences. Prime journal of mi- crobiology research. 2: 114­120. Patrauchan, M.A. & Oriel, P.J. (2003): Degradation of benzyldimethylalkylammoni- um chloride by Aeromonas hydrophyla sp. K: J Appl Microbiol. 96: 266–272. Pavić­Basta, B. (1975): Crkva Sv. Nikole u Paležu. Raška baština, Kraljevo. Pepe, O., Palomba, S., Sannino, L., Blaiotta, G., Ventorino, V., Moschetti, G. & Villani., F. (2011): Characterization in the archaeological excavation site of heterotrophic bacteria and fungi of deteriorated wall painting of Herculaneum in Italy. J Environ Biol 32: 241­250. Perrini, R., Morone­Fortunato, I., Lorusso, E. & Avato, P. (2009): Glands, essential oils and in vitro establishment of Helichrysum italicum (Roth) G. Don ssp mi- crophyllum (Willd.) Nyman. Ind Crop Prod. 29: 395­403. 224 Literatura Pitt, J.I. (1979): The genus Penicillium and its teleomorphic state Eupenicillium and Talaromyces. Academic Press. Popescu, C­M., Tibirna, C.M. & Manoliu, A. (2011): Microscopic study of lime wood decayed by Chaetomium globosum. Cem Chem Technol. 45: 565­569. Pournou, A. & Bogomolova, E. (2009): Fungal colonization on excavated prehistoric wood: Implications for in-situ display. Int Biodeter Biodegr. 63: 371–378. Press, R.E. (1976): Observation on the foxing paper. Int Biodegr 12: 27­30. Prieto, B.& Silva B. (2005): Estimation of potential bioreceptivity of granitic rocks from their instrinsic properties. Int Biodeter Biodegr. 56: 206­215. Prieto, M.J., Iacopini, P., Cioni, P. & Chericoni, S., (2007): In vitro activity of the essential oils of Origanum vulgare and Satureja montana and their main con- stituents in peroxynitrite­induced oxidative process. Food Chem. 104: 889­895. Radler de Aquino, F. & de Góes, L.F. (2000): Guidelines for indoor air quality in offices in Brazil. Proceedings of Healthy Buildings 4: 549­553. Rakotonirainy, M.S. & Lavédrine, B. (2005): Screening for antifungal activity of essential oils and related compounds to control the biocontamination in libraries and archives storage areas. Int Biodeter Biodegr. 55: 41­147. Rakotonirainy, M.S., Heude, E. & Lavédrine, B. (2007): Isolation and attempts of biomolecular characterization of fungal strains associated to foxing on a 19th century book. J Cult Herit. 8: 126­133. Raper, B.K. & Fennel, D.I. (1965): The Genus Aspergillus. The Williams and Wilkins Company. Baltimore. Rifai, MA. (1969): A revision of the genus Trichoderma. Commonwealth Mycologi- cal Institute. Kew. Surrey. England. Rome de, L. & Gadd, G.M. (1987): Copper adsorption by Rhyzopus arrhizus, Cla- dosporium resinae and Penicillium italicum. Appl Microbiol Biot 26: 84­90. Rubai, C., Platas, G. & Bills, G.F. (2005): Isolation and characterization of melanized fungi from limestone formations of Mallorca. Mycol. Progr. 4: 23­38. 225 Literatura Saeed M. A. & Sabir A.W. (2002): Irritant potential of triterpenoids from Ficus ca- rica. Fitoterapia 73: 417­420. Sáiz­Jiménez, C. (1993): Deposition of airborne organic pollutants on hystoric buil- dings. Atmos Environ. 27: 77­85. Sampǒ, S. & Mosca, A.M.L., (1989): A study of the fungi occurring on 15th century frescoes in Florence, Italy. Int Biodeter. 25: 343­353. Samson, R.A., Hoekstra, E.S. & Frisvad, J.C. (2004): Introduction to food­ and air- borne fungi. Ponse & Looyen. Wageningen. The Netherlands. Saravia de, S.G., Paz Naranjo de la, J., Guiamet, P., Arenas, P. & Borrego, S.F. (2008): Biocide activity of natural extracts against microorganisms affecting archives. BLACPMA 7: 25–29. Savoye, D. & Lallemant, R. (1980): Evolution de la microflore d’un substrat avant et pendant sa colonis ation par les lichens. I Le cas de toitures en amiante­ciment en zone urbain. Cryptogamie Bryol L. 1: 21­31. Savulescu, A & Ionita, I, (1971): Contribution to the study of the biodeterioration of works of art and historic monuments I. Species of fungi isolated from frescoes. Rev Roum Biol Bot. 16: 201­206. Sayer, J.A. & Gadd, G.M. (2001): Binding of cobalt and zinc by organic acids and culture filtrates of Aspergillus niger grown in the absence or presence of inso- lubile cobalt or zinc phosphate. Mycol Res. 105: 1261­1267. Schwab, C.J. & Straus, D.C. (2004): The roles of Penicillium and Aspergillus in sick building syndrome. Adv Appl Microbiol. 55: 215­238. Sczepanowska, H. & Cavaliere, A.R. (2000): Fungal deterioration of 18th and 19th century documents: a case study of the Tilghman Familly Collection, Wye Hau- se, Easton, Maryland. Int Biodeter Biodegr. 46: 245­249. Sert, H. & Sterflinger, K. (2010): A new Coniosporium species from historical marble monuments. Mycol Progress. 9: 353­359. 226 Literatura Shabbir, A., Khan, M.A., Khan, A.M., Iqbal, M. & Ahmad, F. (2007): Fungal biode- terioration: A case study in the zoological museum of the Punjab University. J Anim Pl Sci 17: 3­4. Sharma, K. & Agarwal, M. (2011): Prevalence of airborne Aspergillus in the air of monuments: Impact on biodeterioration and human health. Curr Bot. 2: 25­26. Sharma, K., Verma, K.P. & Motilal (2011): Fungal involvement in biodeterioration of ancient monuments: problem and prospects. J Phytol. 3: 15­17. Sharma, K. (2011): Microbial impacts on the Cultural Heritage. The First Internati- onal Conference on Interdisciplinary Research and Development. 31 May – 1 June 2011. Thailand. Shi, C. & Miller, J.D. (2011): Characterization of the 41 kDa allergen Aspv13, a subtili- sin­like serine protease from Aspergillus versicolor. Mol Immunol. 48: 1827­1834. Silva da, M., Moraes, A.M.L., Nishikawa, N.N., Gatti , M.J.A., Vallim de Alencar, M.A., Brandão, L.E. & Nóbrega, A. (2006): Inactivation of fungi from deterio- rated paper materials by radiation. Int Biodeter Biodegr. 57: 163–167. Simoneit, B.R.T. (1984): Organic matter in the tropsfere – III. Characterization and sources of petroleum and pyrogenic residues in aerosols over western United States. Atmos Environ 18: 51­67. Singh, G., Maurya, S., Lampasona de, M.P. & Catalan, C. (2006): Chemical consti- tuents, antifungal and antioxidative potential of Foeniculum vulgare volatile oil and its acetone extract. Food Control. 17: 745–752. Smith, G., (1980): Ecology and Field Biology, second ed. Harper & Row, New York. p. 835. Sohail, M., Ahmad, A. & Khan, S.A. (2011): Production of cellulases from Alternaria sp. MS28 and their partial characterization. Pak J Bot. 43: 3001­3006. Soković, M.D. (2001): Antifungalna aktivnost etarskih ulja odabranih aromatičnih i lekovitih biljaka in vitro i in vivo. Doktorska disertacija. Univerzitet u Beogradu. Biološki fakultet. 227 Literatura Sorlini, C., Sacchi, M. & Ferrari, A. (1987): Microbial deterioration of Gambara’s frescoes exposed to open air in Brescia, Italy. Int Biodeter. 23: 167­179. Sorlini, C., Zanardini, E., Albo, S., Praderio, G., Cariati, F., Bruni, S., Research on chromatic alterations of marbles from the fountain of Villa Litta (Lainate, Mi- lan). International Biodeterioration & Biodegradation, 56(1): 58­68. Sosa, S., Brkić, D., Tubaro, A., & Della Loggia, R. (2000): Topical anti­inflamatory activity of Rosmarinus officinalis L. extracts. Proceedings of the I conference on medicinal and aromatic plants of southeast European countries and VI meeting „Days of medicinal plants 2000“. Aranđelovac. Yugoslavia. 597­601. Soylu, E.M., Kurt, Ş. & Soylu, S. (2010): In vitro and in vivo antifungal activities of the essential oils of various plants against tomato grey mould disease agent Botrytis cinerea. Int J Food Microbiol. 143: 183­189. Starmach, K. (1972): Chlorophyta III flora flodkowodna polski. Tom 10. Panstwowe Wydawnictwo Naukowe. Warszawa. Steiger, M., Wolf, F. & Dannecker, W. (1993): Deposition and enrichment of atmosp- heric pollutants on building stones as determined by field exposure experiments. In: Conservation of Stone and Other Materials, Vol. 1. (ed). Thiel, M.­J. E & FN Spon. London, pp. 35­42. Sterflinger, K. (2000): Fungi as geologic agents. Geomicrobiol J. 27: 97­124. Sterflinger, K. & Krumbein, WE. (1997): Dematiaceous fungi as a major agent for bio- pitting on Mediterranean marbles and limestones. Geomicrobiol J. 14: 219–230. Sterflinger, K. (2005): Black yeasts and meristematic fungi: ecology, diversity and identification. In: Yeast Handbook. Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts, vol 1. (eds). Rosa, C. & Gabor, P. Springer. New York. pp. 501­514. Sterflinger, K. (2010): Fungi: Their role in deterioration of cultural heritage. Fungal Biology Rewiews. 24: 47­55. Strzelcyk, A.B. (1981): Microbial biodeteriarition: stone: In: Economic Microbio- logy Vol 6. (ed). Rose, A.H. Academic Press. London, pp. 62­80. 228 Literatura Suihko, L.M., Alakomi, L.H., Gorbushina, A.A., Fortune, I., Marquardt, J. & Saa- rela, M. (2007): Characterization of Aerobic Bacterial and Fungal Microbiota on Surfaces of Historic Scottish Monuments. Syst Appl Microbiol 30: 494­508. Sutton, B.C. (1980): The coelomycetes. fungi imperfecti with pycnidia, acervuli and stromata. Commonwealth Mycological Institute. Kew. Surrey. England. Šimonovičova, A., Gódyova. M. & Ševc, J. (2004 ): Airborne and Soil Microfungi as Contaminants of Stone in a Hypogean Cemetary. Int Biodeter Biodegr. 54: 7­11. Tomás­Barberán, F., Iniesta­Sanmartín, E., Tomás­Lorente, F. & Rumbero, A. (1990): Antimicrobial phenolic compounds from three Spanish Helichrysum species. Phytochemistry. 29: 1093–1095. Tomaselli, L., Lamenti, G., Bosco, M., & Tiano, P. (2000): Biodiversity of photosyn- thetic micro­organisms dwelling on stone monuments. Int Biodeter Biodegr 46: 251­258. Torre de la, MA. & Gómez­Alarcón, G. (1994): Manganese and iron oxidation by fungi isolated from building stone. Microb Ecol. 27: 177­188. Tortorano, A,M., Viviani, M.A., Biraghi, E., Rigoni, A.L., Pritigano, A., Grillot, R. / EGBA Network. (2005): In vitro testing of fungicidal activity of biocides aga- inst Aspergillus fumigatus. J Med Microbiol. 54:955–957. Tucker, A.O. & Maciarello, M.J. (1986): The essential oil of some essential oil cul- tivars. Flav Frag J. 1: 137­142. Urzì, C., Krumbein, W.E. & Warscheid, Th. (1992): On the question of biogenic colour changes of Mediterranean monuments (coating­crust­microstromatoli- te­patina­scialbatura­skin­rock varnish) In: La Conservation des Monuments dans le Bassin Mėditerranėen. (eds). Decrouez, D., Chamay, J. & Zezza, F. Musėe d’art et d’histoire. Genėve. Urzì, C., Leo de, F., Salamone, P. & Criseo G. (2001): Airborne Fungal Spores Co- lonising Marbles Exposed in the Terrace of Messina Museum, Sicily. Aerobio- logia. 17: 11­ 17. 229 Literatura Urzì, C. & Leo de, F. (2001): Sampling with adhesive tape strips: an easy and rapid method to monitor microbial colonization on monument surfaces. J Microbiol Meth. 44: 1­11. Venskutonis, N.P., Dapkevicius, A & Baramanaskierue, M. (1997): Composition of the essential oil of lavander (Lavandula angustifolia Mill) from Lithuania. J Essent Oil Res. 9:107­110. Vukojević, J. (1998): Praktikum iz Mikologije i Lihenologije, NNK Internacional, Beograd. Vukojević, J. & Ljaljević Grbić, M., (2010): Moulds on paintings in Serbian fine art museums. Afr J Microbiol Res. 13: 1453­1456. Watanabe, T. (2002): Pictorial atlas of soil and seed fungi. Morphologies of the cul- tured fungi and key to the species. Second Edition. CRC Press. Boca Raton. London. New York. Washington DC. Warscheid, Th., Petersen, K. & Krumbein, W.E. (1989): Die Besiedung unterschied- licher Sandsteine durch chemoorganotrophe Bakterien und deren Einfluβ auf der Prozeβ der Gesteinszerstörung. Z Deut Geol Gessel 140: 209­ 217. Warscheid, Th. (2000): Integrated concepts for the protection of cultural artifacts aga- inst biodeterioration. In: of Microbes and Art: The Role Microbial Communities in the Degradation and Protection of Cultural Heritage. (eds). Cifferi, O., Tiano, P. & Mastromei, G. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, pp. 185 – 182. Warscheid, Th. & Braams, J. (2000): Biodeterioration of stone: a review. Inter Bio- deter Biodegr. 46: 343­368. Watanabe, T. (2002): Soil and seed fungi. Morphologies of cultured fungi and key to species. Crc press. Boca Raton. London. Watts, H.J., Very, A.A., Perera, T.H.S., Davies, J.M. & Gow, N.A.R. (1998): Thi- gmotropism and strech­activated channels in the pathogenic fungus Candida albicans. Microbiology 144: 689­685. 230 Literatura White, S. (1998): Origanum: the herb marjoram and its relatives. Surrey: NCCPG. (HSA Library). Willimzig, M., Fahrig, N., Meyer, C. & Bock, E. (1993): Biogene scwarze Krusten auf Gesteinen. Bautenschutz + Bautensanierung. 16: 22­25. Wonder Makers Environmental. Inc. (2001): Post­remediation guideline. Informati- on Series 147. Publikacija dostupna na: http://www.wondermakers.com/public html/Articles/Remediation%20Guidelines.pdf. World Health Organization. (1990): Indoor Air Quality: Biological Contaminants. In:European Series No 31. WHO Regional publications. Copenhagen, p67. Zaitseva, N. (2010): A Polysaccharide extracted from Sphagnum moss as antifungal agent in archaeological conservation. Master teza. Queen’s University. Kin- gston. Ontario. Kanada. Zaouali, Y., Bouzaine, T. & Boussaid, M. (2010): Essential oil composition in two Rosmarinus officinalis L. varietes and incidence for antimicrobial and antioxi- dant activities. Food Chem Toxicol. 48: 3144­3152. Zotti, M., Ferroni, A. & Calvini, P. (2008): Microfungal biodeterioration of historic paper: Preliminary FTIR and microbiological analyses. Int Biodeter Biodegr. 62: 186­194. Biografija Miloš Stupar je rođen 04.08.1981. godine u Beogradu. Osnovnu školu i gimnaziju završio je u Beogradu. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu upisao je 2000. godine, smer biologija, a diplomirao u redovnom roku februara 2006. godine sa prosečnom oce- nom 9,47. Doktorske studije upisao je 2006. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, smer Eksperimentalna mikologija. U periodu 2007–2008. bio je stipendista Republičke fondacije za razvoj naučnog i umetničkog podmlatka, a u periodu 2008–2012, stipendista Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije. Od 2012. godine zaposlen je kao istraživač pripravnik na Katedri za algologiju, mikologiju i lihenologiju Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu, a 2013. izabran je u zvanje istraživača saradnika. Objavio je 8 naučnih radova u međunarodnim i domaćim časopisima i imao je 7 sa- opštenja na skupovima od međunarodnog značaja (Letonija, Rusija, Ukrajina, Nemačka, Švajcarska, Srbija i Brazil). Za prezentacije svojih naučnih radova do sada je osvojio dve nagrade: nagradu na 13. međunarodnom simpozijumu evropskih studenata biologije, Symbiose, u Kazanju (Rusija) i treće mesto u kategoriji opšta biologija na Trećem međunarodnom simpozijumu studenata bioloških nauka International Life Science Students’ Conference u Kijevu (Ukrajina). Učestvovao je u organizaciji četvrtog međunarodnog ekološkog kampa, Eurenssa, održanog jula 2009. na teritoriji Nacionalnog parka Đerdap. Tema skupa je bila „Uticaj klimatskih promena na ekosisteme“. Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани Милош Ступар број индекса ФО 060205 Изјављујем да је докторска дисертација под насловом „Диверзитет микромицета на објектима културне баштине и тестирање фунгицида применљивих у конзервацији“ ● резултат сопственог истраживачког рада, ● да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа, ● да су резултати коректно наведени и ● да нисам кршио ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанта У Београду, 21.08.2013. Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора Милош Ступар Број индекса ФО 060205 Студијски програм Експериментална микологија Наслов рада „Диверзитет микромицета на објектима културне баштине и тестирање фунгицида применљивих у конзервацији“ Ментор др Милица Љаљевић Грбић Потписани Милош Ступар изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанта У Београду, 21.08.2013. Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: „Диверзитет микромицета на објектима културне баштине и тестирање фунгицида применљивих у конзервацији“ која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио. 1. Ауторство 2. Ауторство ­ некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанта У Београду, 21.08.2013. 1. Ауторство ­ Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство ­ некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство ­ некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство ­ делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.