UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Jasmina M. Nestorović Živković ANTIOKSIDATIVNO, ANTIMIKROBNO I ALELOPATSKO DEJSTVO TRI ENDEMIČNE VRSTE RODA Nepeta (Lamiaceae) doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Jasmina M. Nestorović Živković ANTIOXIDATIVE, ANTIMICROBIAL AND ALLELOPATHIC EFFECTS OF THREE ENDEMIC Nepeta SPECIES (Lamiaceae) Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Mentori: Naučni saradnik dr Danijela Mišić Univerzitet u Beogradu Institut za biološka istraživanja „Siniša Stanković” Docent dr Aneta Sabovljević Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet Članovi komisije: Naučni saradnik dr Suzana Živković Univerzitet u Beogradu Institut za biološka istraživanja „Siniša Stanković” Naučni saradnik dr Ana Ćirić Univerzitet u Beogradu Institut za biološka istraživanja „Siniša Stanković” Datum odbrane: Eksperimentalni deo doktorske teze je urađen u laboratorijama Odeljenja za fiziologiju biljaka, Instituta za biološka istraţivanja „Siniša Stanković“ i u laboratorijama Odeljenja za fiziku ţivotne sredine Instituta za fiziku, Univerziteta u Beogradu. Doktorska disertacija je urađena u okviru projekta osnovnih istraţivanja „Fiziološka, hemijska i molekularna analiza diverziteta retkih i ugroţenih biljnih vrsta u cilju ex situ zaštite i produkcije biološki aktivnih jedinjenja”, Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije (ON173024). Srdačno se zahvaljujem svom dragom mentoru dr Danijeli Mišić na strpljenju i podršci tokom izrade doktorske disertacije! Posebno ţelim da joj se zahvalim na uloţenom trudu, stručnoj pomoći, interesantnim idejama, smernicama i stečenom znanju, koji su bili ključni za izradu ove teze. Posebnu zahvalnost dugujem dr Suzani Ţivković za angaţovanje u realizaciji eksperimenata iz oblasti antioksidativnih enzima i za pomoć oko uobličavanja teksta. Naravno, ţelim da joj se zahvalim i na velikoj podršci i razumevanju. Veliko zadovoljstvo i čast je raditi u društvu pozitivnih osoba koje imaju rešenje za svaki problem! Zahvaljujem se svom mentoru dr Aneti Sabovljević na korisnim savetima i angaţovanju na Biološkom fakultetu, Univerziteta u Beogradu, u realizaciji doktorske disertacije. Veliku zahvalnost dugujem dr Ani Ćirić na angaţovanju u realizaciji eksperimenata iz oblasti antimikrobnog dejstva, i pomoći u tumačenju i prezentovanju rezultata, takođe zahvalnost u realizaciji eksperimenata iz iste oblasti dugujem i dr Jasmini Glamočliji i dr Marini Soković. Svojim kolegama sa Instituta za fiziku, dr Neveni Puač, Andreji Stojić i Mirjani Perišić zahvaljujem se na dugogodišnjoj uspešnoj saradnji, kao i u tumačenju i predstavljanju rezultata PTR-MS analiza. Veliku zahvalnost dugujem dr Vuku Maksimović za realizaciju eksperimenata iz oblast fitohemijskih HPLC analiza. Ovom prilikom ţelim da se zahvalim i dr Mihajlu Ristiću iz Instituta za proučavanje lekovitog bilja „dr Josif Pančić“ na realizaciji eksperimenata iz oblasti fitohemijskih GC-MS i GC-FID analiza. Kolegi iz Instituta za pesticide i zaštitu ţivotne sredine dr Vladanu Jovanović ţelim da se zahvalima na ustupljenim semenima poljoprivrednih i korovskih biljnih vrsta koja su nam bila neophodna za realizaciju eksperimenata iz oblasti alelopatskog dejstva. Takođe zelim da mu se zahvalim na velikoj pomoći prilikom statističke analize podataka, kao i na veoma korisnim smernicama u oblasti klijanja semena. Koleginici dr Slavici Dmitrović se zahvaljujem na velikoj pomoći u eksperimentalnoj fazi rada prilikom realizacije eksperimenata iz oblati alelopatskog dejstva, takođe joj se zahvaljujem i na veoma korisnim diskusijama. Kolegi dr Branislavu Šileru ovom prilikom ţelim da se zahvalim na nesebičnoj pomoći prilikom završne faze uobličavanja teksta, takođe i kolegi Martinu Rasporu zelim da se zahvalim na korisnim savetima i sugestijama u finalnoj fazi uobličavanja teksta. Svojim kolegama sa Odeljenja za fiziologiju biljaka Instituta za biološka istraţivanja „Siniša Stanković“ ţelim ovom prilikom da se zahvalim na kolegijalnosti i pomoći, a naročito Milici Milutinović, Tijani Banjanac, Jeleni Cvetković, mr Marijani Skorić i dr Slađani Todorović na pozitivnoj energiji i podršci u trenucima kada je bilo najteţe. Neizmernu zahvalnost dugujem dr Dragoljubu Grubišiću, koji na veliku ţalost nije više sa nama. Nadam se da sam opravdala njegova očekivanja i poverenje koje mi je ukazao na početku izrade disertacije. Bilo je zadovoljstvo i čast poznavati takvog čoveka, a još veća čast blisko sarađivati sa njim. I naravno, najveću zahvalnost dugujem Ivanu i Aleksi…bez njihovog razumevanja i ljubavi ne bih mogla da istrajem do kraja… Takođe, hvala mojim roditeljima i sestri kojima i posvećujem ovaj rad. Antioksidativno, antimikrobno i alelopatsko dejstvo tri endemične vrste roda Nepeta (Lamiaceae) REZIME Nepeta rtanjensis Diklić i Milojević, N. sibirica L. i N. nervosa Royle ex Bentham (fam. Lamiaceae) su endemične vrste roda Nepeta, koje su nedovoljno fitohemijski okarakterisane i slabo ispitane u pogledu biološke aktivnosti. Radi se o vrstama koje se odlikuju različitim kvalitativnim i kvantitativnim sadržajem nepetalaktona, zbog čega predstavljaju idealne objekte u istraživanjima biološke aktivnosti različitih izomera ovog monoterpenskog jedinjenja. S obzirom da se radi o retkim vrstama, a u slučaju N. rtanjensis i o krajnje ugroženoj vrsti, biljni materijal za potrebe eksperimenata je dobijen mikropropagacijom. Istraživanje je obuhvatilo fitohemijske analize sekundarnih metabolita tri vrste roda Nepeta gajenih in vitro, kao i analizu njihovih bioaktivnih svojstava kao što su antimikrobno, antioksidativno i alelopatsko dejstvo. Fitohemijska karakterizacija tri vrste roda Nepeta gajenih in vitro, omogućila je identifikaciju i kvantifikaciju glavnih grupa sekundarnih metabolita (terpenoida i fenolnih jedinjenja) koji se u ovim uslovima produkuju. Metode koje su korišćene u fitohemijskim analizama su: GC-MS, GC-FID, PTR-MS, Headspace GC-MS, HPLC- UV, HPLC-MS, UHPLC/DAD/HESI-MS/MS. Dominantno isparljivo jedinjenje iz grupe terpenoida je monoterpenski lakton - nepetalakton, pri čemu je kod vrste N. rtanjensis većinski prisutan tran,cis- izomer a kod N. sibirica cis,trans- izomer nepetalaktona. Kod vrste N. nervosa nepetalakton je detektovan samo u tragovima. Kod ispitivanih vrsta, ruzmarinska kiselina se javlja kao dominantno fenolno jedinjenje, dok su ostale fenolne kiseline (hlorogena, neohlorogena i kafeinska kiselina) prisutne u znatno nižoj koncentraciji. Metanolni ekstrakti N. rtanjensis, N. sibirica i naročito N. nervosa, pokazuju značajnu antioksidativnu aktivnost u ABTS i DPPH testovima, kao i visoki kapacitet za redukciju gvožĎa u FRAP testu. Značajna antioksidativna aktivnost se pripisuje fenolnim jedinjenjima, na prvom mestu ruzmarinskoj kiselini. Nepetalakton ne utiče značajno na antioksidativni potencijal metanolnih ekstrakata, ali postoji mogućnost antagonističkog delovanja izmeĎu fenolnih kiselina i nepetalaktona. Metanolni ekstrakti tri vrste roda Nepeta pokazuju značajnu antimikrobnu aktivnost protiv osam vrsta bakterija i osam vrsta gljiva, a aktivnost potiče od monoterpenskih laktona i fenolnih jedinjenja. Najveću antimikrobnu aktivnost pokazuje metanolni ekstrakt N. rtanjensis, sledi N. sibirica, i na kraju N. nervosa. Stereohemija nepetalaktona bitno odreĎuje njegovu antimirobnu aktivnost, pri čemu je trans,cis- izomer aktivniji od cis,trans-izomera. PotvrĎeno je da vrste N. rtanjensis i N. sibirica poseduju jedinjenja koja mogu uticati na rastenje i razviće drugih biljnih vrsta u njihovom neposrednom okruženju, i na taj način aktivno učestvovati u alelopatskim interakcijama. Alelopatsko dejstvo N. rtanjensis i N. sibirica potiče od dominantnog bioaktivnog jedinjenja ovih vrsta- nepetalaktona. Stereohemija nepetalaktona značajno odreĎuje njegov alelopatski potencijal, pri čemu tran,cis- izomer pokazuje veću aktivnost od cis,trans- izomera. Alelopatsko dejstvo nepetalaktona se ogleda kroz usporenu dinamiku klijanja semena test vrste Lepidium sativum L., ali i kroz efekat na biohemijske procese koji su posledica poremećenog antioksidativnog sistema biljaka. Alelopatsko dejstvo nepetalaktona, a naročito njegovog trans,cis- izomera, dovodi do promena u antioksidativnom sistemu klijanaca kresa narušavanjem normalnih modela ekspresije i aktivnosti antioksidativnih enzima (POD, CAT, SOD, PPO). Primećena je inhibicija aktivnosti, kao i izmenjen profil izoformi POD, CAT, Fe-SOD i CuZn-SOD kod klijanaca kresa. Trans,cis- nepetalakton dovodi do povećanog sadržaja ukupnih fenola u prvim fazama rastenja i razvića klijanaca L. sativum, što je praćeno ranijom indukcijom ekspresije i povećanom aktivnošću PPO. Nepetalakton tokom alelopatskih interakcija indukuje odreĎene modifikacije metabolizma sinapata kod klijanaca kresa, koje se generalno mogu opisati usporenim prevoĎenjem sinapoil- holina do sinapoil- glukoze, i potom do sinapoil- malata. Alelopatska svojstva N. rtanjensis i N. sibirica ukazuju na mogućnost uspešne primene ovih vrsta i njihovih bioaktivnih komponenti u poljoprivrednoj praksi, kao bioherbicida, a u cilju suzbijanja i kontrole korovskih vrsta. U ovom radu potvrĎeno je alelopatsko dejstvo N. rtanjensis i N. sibirica u slučaju poljoprivrednih kultura kao što su L. sativum, Lactuca sativa L. sorta „Majska kraljica“, Lotus corniculatus L. sorta „Bokor“, Brassica napus L., i korovskih vrsta poput Stellaria media (L.) Vill., Rumex crispus L., i Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotip Kolumbija. Ključne reči: Nepeta rtanjensis, Nepeta sibirica, Nepeta nervosa, nepetalakton, fenolne kiseline, antioksidativni potencijal, antimikrobno dejstvo, alelopatija, antioksidativni enzimi Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Fiziologija biljaka UDK broj: 581.6:582.929.4(043.3) 581.1:582.929.4(043.3) Antioxidative, antimicrobial and allelopathic effects of three endemic Nepeta species (Lamiaceae) ABSTRACT Nepeta rtanjnsis Diklić and Milojević, N. sibirica L. and N. nervosa Royle ex Bentham (fam. Lamiaceae) are endemic species of genus Nepeta that are insufficiently phytochemically characterized and poorly tested in a sense of their biological activity. These three species are characterized by different qualitative and quantitative nepetalactone content, what makes them ideal objects in investigating the biological activity of different stereoisomers of this compound. Considering that these species are rare, and extremely endangered in case of N. rtanjensis, plant material for the experiments was obtained by micropropagation. The research included phytochemical characterization of in vitro grown three Nepeta species , as well as analysis of their bioactivities such as antimicrobial, antioxidative activity and allelopathic potential. Phytochemical characterization of three Nepeta species grown in vitro, involving GC-MS, GC-FID, PTR-MS, Headspace GC-MS, HPLC-UV, HPLC-MS, and UHPLC/DAD/HESI-MS/MS analyses, enabled identification and quantification of the main secondary metabolites (terpenes and phenolics). The dominant volatile compound from terpenes group is monoterpene lacton - nepetalactone, whereby its trans,cis- isomer is mostly present in N. rtanjensis and its cis,trans- isomer in N. sibirica. In N. nervosa, nepetalactone has been detected only in traces. In all investigated species, rosmarinic acid is a dominant phenolic compound, while the other phenolic acids (chlorogenic, neochlorogenic and caffeic acids) are present in significantly lower concentrations. The results of ABTS and DPPH assays showed that methanol extracts of N. rtanjensis, N. sibirica and especially N. nervosa, possess considerable antioxidant activities, and the FRAP assay revealed high ferric reducing capacity for all the samples tested.. Significant antioxidant activity is attributed to phenolic acids, in the first place to rosmarinic acid. Nepetalactone doesn’t contribute notably to the antioxidant potential of the methanol extracts, but there is a possibility of antagonistic action between phenolic acids and nepetalactone. The methanol extracts of three Nepeta species show significant antimicrobial activity against eight bacterial and eight fungal species, and the activity originates from monoterpenic lactones and phenolic acids. The highest antimicrobial activity was recorded for N. rtanjensis methanol extract, while extracts of N. sibirica and N. nervosa were less efficient. Nepetalactone stereochemistry substantially determines its antimicrobial activity, whereby the trans,cis- isomer is more active than the cis,trans- one. It has been confirmed that N. rtanjensis and N. sibirica possess compounds that can influence growth and development of other plant species in their proximate surrounding, thus actively participating in allelopathic interactions. Allelopathic effect of N. rtanjensis and N. sibirica originates from the dominant bioactive compound of these species - nepetalactone. Stereochemistry of nepetalactone considerably determines its allelopathic potential, with trans,cis- isomer being more active than the cis,trans- nepetalactone. Allelopathic effect of nepetalactone is reflected through slugged dynamic of seed germination in the test species Lepidium sativum L., but also through its effect on biochemical processes that are the consequence of plant’s disturbed antioxidative system. Allelopathic effect of nepetalactone, especially of its trans,cis- isomer, leads to the changes in antioxidative system of cress seedlings by violating normal models of antioxidative enzymes expression and activity (POD, CAT, SOD, PPO). In cress seedlings, the inhibition of activities and changed profiles of POD, CAT, Fe-SOD and CuZn-SOD isoforms were observed. Trans,cis- nepetalactone action leads to the increased content of total phenols in the first phases of growth and development of L. sativum seedlings, which is followed by earlier induction of expression and increased PPO activity. During allelopathic interactions, nepetalactone induces certain modifications of sinapate metabolism in cress seedlings, which in general can be described by decreased conversion of sinapoylholin to sinapoylglucose, and further to sinapoylmalate. Allelopathic features of N. rtanjensis and N. sibirica indicate the possibility of successful application of these species and their bioactive components in agricultural practice, as bioherbicides, toward weed control. In this thesis the allelopathic effect of N. rtanjensis and N. sibirica was confirmed in case of crops L. sativum, Lactuca sativa L. cv. „Majska kraljica“, Lotus corniculatus L. cv. „Bokor“, and Brassica napus L., and weeds Stellaria media (L.) Vill., Rumex crispus L., and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ecotype Colombia. Key words: Nepeta rtanjensis, Nepeta sibirica, Nepeta nervosa, nepetalactone, phenolic acid, antioxidative potential, antimicrobial effects, allelopathy, antioxidant enzyme Scientific field: Biology Specific scientific field: Plant physiology UDC number: 581.6:582.929.4(043.3) 581.1:582.929.4(043.3) SADRŽAJ 1. UVOD...................................................................................................................1 1.1. Povezanost primarnog i sekundarnog metabolizma.................................1 1.2. Terpenoidi.................................................................................................2 1.2.1. Terpenoidi vrsta roda Nepeta........................................................3 1.2.2. Biosinteza terpenoida i nepetalaktona...........................................8 1.3. Fenolna jedinjenja....................................................................................10 1.3.1. Fenolne kiseline kod vrsta roda Nepeta.......................................12 1.3.2. Biosinteza fenolnih jedinjenja.....................................................13 1.3.3. Metabolizam fenolnih jedinjenja kod vrsta familije Brassicaceae...................................................15 1.4. Biološka aktivnost vrsta roda Nepeta......................................................17 1.4.1. Antioksidativna aktivnost............................................................19 1.4.1.1.Antioksidativna aktivnost fenolnih jedinjenja.................21 1.4.1.2.Monoterpenoidi kao antioksidansi...................................23 1.4.1.3.ROS kod biljaka...............................................................23 1.4.1.4.Enzimske komponente antioksidativnog sistema............25 1.4.1.4.1.Superoksid dismutaze (SOD)...........................26 1.4.1.4.2.Katalaze (CAT)................................................27 1.4.1.4.3.Peroksidaze (POD)...........................................28 1.4.1.4.4.Polifenol oksidaze (PPO).................................29 1.4.1.4.5.Antioksidativni enzimi vrsta fam. Brassicaceae.......................................30 1.4.2. Antimikrobna aktivnost...............................................................31 1.4.2.1. Antimikrobna aktivnost vrsta roda Nepeta.....................32 1.4.3. Alelopatija....................................................................................33 1.4.3.1. Monoterpenoidi kao alelohemikalije..............................34 1.4.3.2. Alelopatski potencijal vrsta roda Nepeta........................36 1.5. Opšte odlike rtanjske metvice N. rtanjensis Diklić i Milojević, N. sibirica L. i N. nervosa Royle ex Bentham........................................37 1.5.1. Nepeta rtanjensis Dikić i Milojević............................................37 1.5.2. Nepeta sibirica L.........................................................................39 1.5.3. Nepeta nervosa Royle ex Bentha................................................39 2. CILJEVI RADA..................................................................................................40 3. MATERIJAL I METODE...................................................................................41 3.1. Biljni materijal.........................................................................................41 3.1.1. Uspostavljanje in vitro kulture tri vrste roda Nepeta...................41 3.1.2. In vitro ko-kultivacija vrste Lepidium sativum sa tri vrste roda Nepeta................................................................42 3.1.3. Ispitivanje alelopatskog potencijala etarskog ulja N. rtanjensis, N. cataria, α-pinena i α-pinena.............................42 3.2. Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM).........................................43 3.3. Fitohemijske analize N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa gajenih in vitro.........................................................................................44 3.3.1. Analiza isparljivih jedinjenja u kulturi in vitro tri vrste roda Nepeta.....................................................................44 3.3.1.1. „Headspace“ GC-MS kvalitativna analiza sadržaja isparljivih jedinjenja........................................................44 3.3.1.2. PTR-MS (eng. Proton Transfer Reaction-Mass Spectrometry) kvantitativna analiza................................45 3.3.2. Fitohemijska karakterizacija isparljivih jedinjenja u metanolnim i dihlor-metanskim ekstraktima izdanaka N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa gajenih in vitro.......................................................... 45 3.3.2.1. GC-MS i GC-FID analiza metanolnih ekstrakata (Gasna hromatografija sa masenom spektrometijom i gasna hromatografija sa plameno jonizujućim detektorom eng. Gas Chromatography Flame Ionization Detector)..........................................................................46 3.3.2.2. GC-MS analiza (Gasna hromatografija sa masenim spektrometrom eng. Gas Chromatography Mass Spectrometry) dihlor-metanskih ekstrakata.........................................................................46 3.3.2.3. HPLC-UV i HPLC-MS analiza (Tečna hromatografija pod visokim pritiskom sa UV detekcijom i masenom spektrofotometrijom) sadržaja nepetalaktona u metanolnim ekstraktima.................................................. 47 3.3.2.4. UHPLC/DAD/+HESI-MS/MS analiza (Tečna hromatografija pod ultra visokim pritiskom sa UV detekcijom i MS/MS masenom spektrofotometrijom) nepetalaktona u metanolnim ekstraktima........................47 3.3.3. Fitohemijska karakterizacija fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima izdanaka N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, kao i klijanaca Lepidium sativum gajenih in vitro................................50 3.3.3.1. Spektrofotometrijsko odreĎivanje količine ukupnih slobodnih fenola................................................50 3.3.3.2. Spektrofotometrijsko odreĎivanje količine ukupnih flavonoida..........................................................51 3.3.3.3. Kvalitativna i kvantitativna UHPLC/DAD/+HESI- MS/MS i UHPLC/DAD/-HESI-MS/MS analiza sadržaja fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima tri vrste roda Nepeta i L. sativum..................................................51 3.4. OdreĎivanje antioksidativne aktivnosti metanolnih ekstrakta tri vrste Nepeta, etarskog ulja (N. rtanjensis i N. cataria), ruzmarinske i hlorogene kiseline....................................................................................52 3.4.1. OdreĎivanje antioksidativne aktivnosti DPPH metodom............52 3.4.2. ABTS +. radikal katjon metoda......................................................53 3.4.3. Fe 3+ / Fe 2+ redoks kapacitet (FRAP) test......................................55 3.5. Ispitivanje antimikrobne aktivnosti metanolnog ekstrakta tri vrste roda Nepeta......................................................................................................55 3.5.1. Priprema ekstrakta Nepeta...........................................................55 3.5.2. Testirani mikroorganizmi............................................................55 3.5.3. Testirani antibiotici i antimikotici...............................................56 3.5.4. In vitro testovi za odreĎivanje antimikrobne aktivnosti..............56 3.5.5. Pripremanje prekonoćne kulture bakterija...................................56 3.5.6. Pripremanje kultura mikromiceta................................................57 3.5.7. Metoda mikrodilucije...................................................................57 3.6. Analiza antioksidativnih enzima Lepidium sativum................................58 3.6.1. Ekstrakcija ukupnih proteina.......................................................58 3.6.2. Nativna elektroforeza (eng. Native PAGE).................................59 3.6.2.1. Elektroforetska detekcija aktivnosti katalaza (CAT)...................................................................59 3.6.2.2. Elektroforetska detekcija aktivnosti peroksidaza (POD)...............................................59 3.6.2.3. Elektroforetska detekcija aktivnosti superoksid dismutaza (SOD).................................................60 3.6.2.4. Elektroforetska detekcija aktivnosti polifenol oksidaza(PPO).....................................................60 3.6.3. Spektrofotometrijska analiza enzimske aktivnosti......................................................................................60 3.6.3.1. Spektrofotometrijsko odreĎivanje aktivnosti ukupnih katalaza..................................................60 3.6.3.2. Spektrofotometrijsko odreĎivanje aktivnosti ukupnih peroksidaza........................................... 61 3.6.3.3. Spektrofotometrijsko odreĎivanje aktivnosti ukupnih superoksid dismutaza.............................62 3.6.3.4. Spektrofotometrijsko odreĎivanje aktivnosti ukupnih polifenol oksidaza................................. 62 3.6.4. SDS-PAGE elektroforeza i imunodetekcija proteina (eng. Immuno blotting).........................................................................63 3.6.4.1. Primarna antitela................................................. 64 3.6.4.2. Sekundarna antitela............................................. 64 3.7. Statistička analiza podataka.....................................................................65 4. REZULTATI...............................................................................................................66 4.1. In vitro kultura tri vrste roda Nepeta.......................................................66 4.2. Analiza žlezdanih struktura površine lista tri vrste roda Nepeta.............66 4.3. Fitohemijske analize N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa gajenih in vitro..........................................................................................................67 4.3.1. Analiza isparljivih jedinjenja u kulturi in vitro N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa.................................................................................67 4.3.1.1. Headspace GC-MS analiza..................................67 4.3.1.2. PTR-MS analiza...................................................71 4.3.2. Fitohemijska karakterizacija metanolnih i dihlor-metanskih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa....................................72 4.3.2.1. GC-MS analiza dihlor-metanskih ekstrakata N.rtanjensis, N. sibirica i N.nervosa.........................................................................72 4.3.2.2. GC-MS i GC-FID analiza metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa............................. 74 4.3.2.3. HPLC-DAD i analiza metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa..............................................75 4.3.2.4. UHPLC/DAD/HESI-MS/MS analiza metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa........................77 4.3.2.5. Spektrofotometrijsko odreĎivanje ukupnih fenola i flavonoida u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa....................................................................................84 4.4. Antioksidativna aktivnost........................................................................85 4.4.1. Antioksidativna aktivnost ispitivana DPPH metodom................85 4.4.2. Sposobnost neutralizacije ABTS +. radikal katjona.......................87 4.4.3. Fe 3+ / Fe 2+ redoks kapacitet (FRAP) test.......................................88 4.5. Antimikrobno dejstvo..............................................................................88 4.6. Uticaj isparljivih jedinjenja tri vrste roda Nepeta sp. na klijanje i rast test vrste Lepidium sativum L. (kres).............................................................91 4.6.1. Analiza antioksidativnih enzima Lepidium sativum....................96 4.6.1.1. Elektroforetska i spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti superoksid dismutaza (SOD) i imunoblot analiza..................................96 4.6.1.2. Elektroforetska detekcija i spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti katalaza (CAT).................................................................102 4.6.1.3. Elektroforetska i spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti peroksidaza (POD).................................................................105 4.6.1.4. Polifenol oksidaze (PPO): elektroforetska detekcija, spektrofotometrijska aktivnost i imunoblot analiza...............................................108 4.6.2. Spektrofotometrijsko odreĎivanje ukupnih fenola u metanolnim ekstraktima klijanaca L. sativum................................................110 4.6.2.1. UHPLC-DAD/HESI-MS/MS karakterizacija metanolnih ekstrakata Lepidium sativum...............................................................111 4.6.3. Ispitivanje alelopatskog efekta trans,cis-nepetalaktona, cis,trans- nepetalaktona, α-pinena i α-pinena na klijanje odabranih poljoprivrednih kultura i korovskoh vrsta............................................................................................116 5. DISKUSIJA.......................................................................................................125 5.1. Antioksidativna aktivnost N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa..............................................................................................130 5.2. Antimikrobna aktivnost N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa..............................................................................................134 5.3. Alelopatsko dejstvo N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa...................139 6. ZAKLJUČCI......................................................................................................161 7. LITERATURA..................................................................................................165 BIOGRAFIJA AUTORA..................................................................................218 Prilog 1 - Izjava o autorstvu doktorskog rada Prilog 2 - Izjava o istovetnosti štampane i elektronske verzije doktorskog rada Prilog 3 - Izjava o korišćenju doktorskog rada SKRAĆENICE APOD - askorbat peroksidaze BHA - butilovani hidroksianisolen BHT - butilovani hidroksitoluen C3H - 4-kumaratestar 3- hidroksilaza C4H- cinamat-4-hidroksilaza CAH - cinamat-4-hidroksilaza CAT - katalaze CCoAOMT - koniferil-CoA o-metiltransferaza CCR - cinamoil-CoA reduktaza 4CL - hidroksicinamat: CoA-ligaza 4CL - 4-kumarat: CoA ligaza COMT - kafeoil O-metiltransferaza DHAR - dehidroaskorbat reduktaze DMAPP - dimetilalil difosfat F5H - ferulat 5-hidroksilaza FPP - farnezil difosfat FPS - farnezildifosfat sintaza GC-FID - gasna hromatografija sa plameno jonizujućim detektorom GC-MS - gasna hromatografija sa masenom spektrometijom GGPP - geranilgeranil difosfat GGPS - geranilgeranil difosfat sintaza GPOD - gvajakol perokidaze GPP - geranil difosfat GPS - geranil difosfat sintaza GR - glutation reduktaze GST - glutation transferaze HCT - hidroksicinamoil transferaza HK - hlorogena kiselina HPPR - hidroksifenilpiruvat reduktaza IPP - izopentenil difosfat KGT - kapitatne glandularne trihome KK - kafeinska kiselina MBC - minimalna baktericidna koncentracija MDHAR - monodehidroaskorbat reduktaze MEP - metileritritol fosfatni biosintetski put MFC - minimalna fungicidna koncentracija MIC - minimalna inhibitorna koncentracija MTOV - mehaničke trihome sa zaobljenim vrhom MTZV - mehaničke trihome sa zašiljenim vrhom MVA - mevalonatni biosintetski put PAL - fenilalanin amonijum lijaza PAL - fenilalanin-amonijum liaza PEP - fosfoenolpiruvat PGT - peltatne glandularne trihome PPO - polifenol oksidaze PSII - fotosistem II RAS - hidroksicinamoil-CoA: hidroksifenilacetathidroksicinamoil transferaza RK - ruzmarinska kiselina ROS - reaktivne vrste kiseonika SALDH/CALDH- sinapaldehid/koniferaldehid dehidrogenaza SCE- sinapin esteraza SCT- sinapoilglukoza: malat sinapoiltransferaza SEM - skenirajuća elektronska mikroskopija SGT - sinapat glukoziltransferaza SMT - sinapoilglukoza: malatsinapolitransferaza SOD - superoksid dismutaze TAT - tirozin aminotransferaza TPS - terpenske sintaze 1 1. UVOD 1.1. Povezanost primarnog i sekundarnog metabolizma Metabolizam je širok pojam koji obuhvata sintezu, degradaciju i sve biohemijske transformacije organskih jedinjenja, koje se dešavaju u živom organizmu. Svim živim bićima je za održavanje života, kao i za rastenje i razviće, potrebna energija, ali ne energija u bilo kom obliku, nego samo ona koja potiče od organskih hemijskih jedinjenja. Jedinjenja kao što su šećeri, aminokiseline, masne kiseline, nukleotidi kao i polimeri koji nastaju iz pomenutih molekula deo su primarnog metabolizma i predstavljaju primarne metabolite (Nešković i sar., 2003). Sa druge strane postoji i područje metaboličkih procesa preko kojih se sintetišu jedinjenja koja na prvi pogled nemaju očiglednu funkciju u biljnom organizmu. Ovakvi procesi čine sekundarni metabolizam a jedinjenja koja su proistekla iz njih nazivaju se sekundarni metaboliti. MeĎutim, ne može se napraviti jasna granica izmeĎu primarnog i sekundarnog metabolizma, sa obzirom da su ova dva tipa metabolizma meĎusobno povezana. (Fridman i Pichersky, 2005, Besseau i sar., 2007, Böttcher i sar., 2008). Okarakterisan je veliki broj enzima koji su uključeni u sekundarni metabolizam biljaka, a čiji homolozi su prepoznati i funkcionišu i u primarnom metabolizmu (Ober i Hartmann 1999, Steffens, 2000). Dugo se verovalo da su sekundarni metaboliti samo sporedni produkti bez esencijalnog značaja za biljke. Danas je poznato da su ova jedinjenja sastavni delovi nekih enzimskih sistema, poseduju hormonsku aktivnost, imaju zaštitnu ulogu u biljkama, alelopatsku i repelentnu funkciju. TakoĎe, proizvodi sekundarnog metabolizma danas predstavljaju važan izvor farmakološki važnih jedinjenja (Paré i sar., 1985, Dudareve i sar., 2004). Na osnovu brojnih opisanih uloga sekundarnih metabolita, kako u biljkama, tako i u ljudskom organizmu, sekundarni metaboliti se često označavaju kao bioaktivna jedinjenja. Bioaktivna jedinjenja se mogu definisati i kao nenutritivni sastojci biljaka koji se obično javljaju u veoma malim količinama. Poznato je na hiljade bioaktivnih jedinjenja koja najčešće pripadaju klasama alkaloida, heterozida, saponoida, polifenola, steroida i terpenoida. 2 1.2. Terpenoidi Terpenoidi predstavljaju jednu od najvećih klasa prirodnih proizvoda. Iz različitih biljaka i mikroorganizama do sada je izolovano preko 25 000 terpenoida (Baser i Demirci, 2007). Terpenoidi su jedinjenja koja su izgraĎena od izoprena (5 C atoma), i upravo zbog toga se često nazivaju i izoprenoidi. Na osnovu broja ugljenikovih atoma, odnosno broja izoprenskih jedinica od kojih su izgraĎeni, terpenoidi se mogu podeliti na monoterpenoide (10 C atoma, dve izoprenske jedinice), seskviterpenoide (15 C atoma, tri izoprenske jedinice), diterpenoide (20 C atoma, četiri izoprenske jedinice), triterpenoide (30 C atoma, šest izoprenskih jedinica), tetraterpenoide (40 C atoma, osam izoprenskih jedinica) i politerpenoide (>40C atoma, >8 izoprenskih jedinica) (Mahmoud i Croteau, 2002). Terpenoidi su jedinjenja koja su odgovorna za karakteristični miris biljka, pri čemu se u isparljive terpenoide svrstavaju monoterpenoidi i seskviterpenoidi. Monoterpenoidi su jedinjenja koja predstavljaju glavne komponente etarskih ulja velikog broja aromatičnih biljnih vrsta. Do sada je izolovano i okarakterisano više od 1500 jedinjenja ove grupe. IzgraĎeni su od dve izoprenske jedinice, a strukturna raznovrsnost monoterpenoida je rezultat različitog načina povezivanja osnovnih gradivnih jedinica, intramolekulskog premeštanja i sekundarne ciklizacije. Prema najjednostavnijem sistemu klasifikacije monoterpenoidi se dele na: aciklične (dve izoprenske jedinice povezane su po principu glava – rep, i smatra se da su derivati 2,6- dimetiloktana) i ciklične (po veličini prstena mogu biti monociklični, biciklični i triciklični). TakoĎe, postoji i šira klasifikacija prema kojoj se monoterpenoidi mogu podeliti na osnovu funkcionalne grupe na alkohole, ketone, estre i druge (Buckinghman, 1994). Posebnu grupu monoterpenoida čine iridoidi, koji se u prirodi najčešće nalaze kao neisparljiva jedinjenja, vezana u obliku glikozida. 3 Preciznu ulogu monoterpenoida je teško definisati, ali se zna da učestvuju kao posrednici u mnogobrojnim interakcijama u prirodi, učestvuju u privlačenju oprašivača, štite biljku od napada patogenih mikroorganizama i od napada insekata, a imaju i važnu ulogu u „komunikaciji“ izmeĎu biljaka (Croteau i sar., 2000). Pored mnogobrojnih ekoloških uloga, monoterpenoidi se intenzivno koriste i u industriji hrane, kozmetike, kao i u farmaceutskoj industriji (Mahmoud i Croteau, 2002). Seskviterpenoidi su jedinjenja izgraĎena od tri izoprenske jedinice i predstavljaju veoma raznoliku grupu terpenoida. U biljkama imaju ulogu feromona i juvenilnih hormona. Kao i monoterpenoidi, dele se na aciklične i ciklične. Aciklični predstavnici seskviterpenoida se često nazivaju i farnezani, pošto nastaju od farnesola (Graβmann, 2005). Na osnovu veličine prstena razlikujemo monociklične (bisaboleni, germakreni, elemenini, humuleni i drugi) i policiklične seskviterpene (kariofileni, eudezmani, akorani, kamferani, kedrani, drimani, kadinani, oplopani, gvajani) (Aharoni i sar., 2005, Zwenger i Basu, 2008, Civjan, 2012). Diterpenoidi su velika grupa strukturno veoma različitih jedinjenja, i u prirodi se najčešće javljaju kao diciklična, triciklična i tetraciklična jedinjenja. Diterpenoidi u biljkama imaju važne ekološke i fiziološke funkcije: diterpenoid fitol je strukturni segment hlorofila, dok fitoaleksini predstavljaju prirodni odbrambeni mehanizam biljaka u zaštiti od patogenih mikroorganizama i predatora (Dewick, 2002). Triterpenoidi se sastoje iz dve farnezanske jedinice povezane po principu glava- rep. Triterpenoidi nisu uobičajeni sastojci etarskih ulja. Glavne grupe ovih jedinjenja koje se javljaju u prirodi su saponini, glikozidi, fitosteroli, steroidi. (Sawai i Saito, 2011, Civjan, 2012). 1.2.1. Terpenoidi vrsta roda Nepeta Najnoviji sistem klasifikacije na osnovu hemijskih karaktera u okviru familije Lamiaceae daje Takhtajan (2009). Po njemu su vrste familije Lamiaceae podeljene u dve grupe: A) vrste koje su siromašne etarskim uljima i kod kojih ruzmarinska kiselina nije prisutna, ali sadrže iridoidne glukozide, dok ulje u semenima sadrži umereno nezasićene masne kiseline (Caryiopteridoideae, Ajugoideae, Chloantoideae, Wenchengioideae, Scutellarioideae i Lamioideae); 4 B) vrste koje su bogate etarskim uljima i sadrže ruzmarinsku kiselinu ali ne sadrže iridoidne glikozide, dok ulje u semenima sadrži jako nezasićene masne kiseline. U drugu grupu se ubrajaju samo vrste podfamilije Nepetoideae. Podfamiliju Nepetoideae, tribus Nepeteae, čine vrste roda Nepeta, koje se takoĎe dele u dve grupe na osnovu prisustva ili odsustva hemotaksonomskog markera nepetalaktona. Kod najvećeg broja vrsta roda Nepeta, prisutan je neki od diastereoizomera nepetalaktona. Ovaj iridiodni monoterpenski lakton, za razliku od uobičajenih iridoida, nije vezan u obliku glikozida i veoma je isparljiv. MeĎutim, odreĎeni broj vrsta ne poseduje ovo jedinjenje. U Tabeli 1 je dat pregled kvalitativnog sadržaja nepetalaktona u etarskom ulju vrsta roda Nepeta koje su fitohemijski okarakterisane GC-MS analizama. Značajno je napomenuti da su pored stereoizomera nepetalaktona, iz vrsta roda Nepeta izolovana i druga jedinjenja koja su slična nepetalaktonima: α- i -dihidronepetalakton, - i - dihidronepetalakton (Regnier i sar., 1967, Kalpoutzakis i sar., 2001, Heuskin i sar., 2009), nepetalinska kiselina (McElvain, 1955) i mnoga druga. Prva fitohemijska analiza vrsta roda Nepeta uraĎena je 1955. godine (McElvain i sar., 1955). Od tada pa do danas, kod vrsta ovog roda potvrĎeno je prisustvo različitih tipova sekundarnih metabolita kao što su monoterpenoidi, seskviterpenoidi, diterpenoidi, triterpenoidi, flavonoidi, fenolna jedinjenja, itd. Do 2010. godine identifikovana su ukupno 193 jedinjenja kod različitih vrsta ovog roda, meĎu kojima terpenoidi predstavljaju dominantnu grupu jedinjenja (Formisano i sar., 2011). Nepetalakton (C9H14O2) je izgraĎen od ciklopentanoidnog prstena i cikličnog estra. Nepetalaktoni mogu postojati u obliku osam stereoizomera, četiri diastereoizomera i njihovih odgovarajućih enantiomera (Liblikas i sar., 2005). Prvi metil-ciklopentanoidni monoterpenoid koji je u potpunosti okarakterisan je 4aα,7α,7aα- nepetalakton (cis,trans izomer nepetalaktona), a izolovan je iz etarskog ulja N. cataria (Bates i sar., 1958, Regnier i sar., 1967, DePooter i sar., 1987) (Slika 1). Epimer 4aα,7α,7aα-nepetalaktona je 4aα,7α,7a-nepetalakton (trans,cis-nepetalakton) i takoĎe je prvi put izolovan iz etarskog ulja N. cataria (Bellesia i sar., 1979, Einsenbraun i sar., 1981). 5 Treći diastereoizomer nepetalaktona koji je izolovan iz etarskog ulja N. mussinii je cis,cis-nepetalakton (4a,7α,7a) (Regnier i sar., 1967), dok je 4aα,7,7a- stereoizomer nepetalaktona prvi put okarakterisan kod vrste N. elliptica (Bottini i sar., 1987). DePooter i sararadnici su 1987. godine prvi put detektovali trans,trans- nepetalakton (4a,7α,7aα) kod vrste N. nuda. Stereoizomeri nepetalaktona koji do danas nisu izolovani iz prirodnih izvora, a teoretski mogu da postoje su 4a,7,7a- nepetalakton i njegov enantiomer 4a,7,7aα-nepetalakton. Ineresantno je da su jedino 7S diastereoizomeri pronaĎeni u prirodnim uslovima, kao i to da se izomeri nepetalaktona razlikuju u orijentaciji samo jedne hemijske veze, a pokazuju potpuno različitu biološku aktivnost (Liblikas i sar., 2005). Slika 1. Stereoizomeri nepetalaktona Tabela 1. Saržaj nepetalaktona (%) u etarskom ulju različitih vrsta roda Nepeta. Rezultati dobijeni upotrebom metode gasne hromatografije sa masenom spektroskopijom (CG-MS). Vrsta 4αα,7α,7αα 4αα,7α,7αβ 4α,7α,7αβ 4αβ,7α,7αα Reference N.argolica Bory i Chaub. ssp. argolica 0-26,52 0-12,93 0,38-15,45 1,93-29,38 Skaltsa i sar. 2000. N. atlantica Ball. - 71,4 - - Zenasni i sar. 2008. N. asterotrichus Rech. F. i Aell. - 14,8 - Rustaiyan i sar. 1999. N.binaludenisis Jamzad 25,2 - - 0,7 Rustaiyan i Najadi 1999. N.betonicifolia C.A. Meyer - - - - Baser i sar. 2001. N. bornmuelleri Hausskn. ex Bornm. - - 64 - Sefidkon i Jamzad, 2007. 6 N. bracteata Benth. - - - - Sefidkon i Jamzad, 2007. N. cadmea Boiss. 81,6 - - - Celik i sar. 2008. N. caesarea Boiss. 92-95 - - - Aydin i sar. 1998. N. cataria L. 89,0 - - - Handijeva i sar. 1996. N. cataria L. 60-99 1-40 t - Lawrence, 1992. N. cataria L. 70,1-91,1 0,1-20 1 t-0,1 Regnier i sar. 1967. N. cataria L. 10,6-94,1 0,4-65,2 0,1-0,2 - DePooter i sar. 1988. N. crassifolia Boiss. i Bushe. 92,5 - 0,64 - Dabiri i Sefidkon, 2003b. N. crispa Willd. - 20,3 1,9 - Sonboli i sar. 2004. N. cephalotes Boiss. 35,1 - - - Rustaiyan i sar. 2000. N.congesta Fisch. i Mey. ssp. congesta - - - - Kaya i sar. 2007. N.curviflora Boiss. - - - - Senatore i sar. 2005. N. cilicia Boiss. - - - - Karaman i sar. 2007. N. depauperata Benth. - - - - Mehrabani i sar. 2004. N. denudate Benth. - - - - Rustaiyan i sar. 2000. N. discolor Benth. - - - - Mathela i sar. 1994. N. daenensis Boiss. - - - - Sajjadi i Mehregan, 2005. Nepeta eremophila Hausskn. i Bornm 2,6 2,6 73,3 - Sefidkon i sar. 2006. N. elymatica Bornm. - - - 35,6 Nori-Shargha i Baharvand, 2005. N. faassenii Bergmans ex Stearn 67,8 - 2,3 - Radulović i sar. 2011. N. flavida Hub.-Mor. - - - - Tepe i sar. 2007 N. fissa C.A.Mey. - - - - Sefidkon i sar. 2002. N. gloeocephala Rech. - - - - Safaei-Ghomi i sar. 2006. N. grandiflora L. 1,3-1,9 - - - Handijeva i sar. 1996. Nepeta glomerulosa Boiss. ssp. carmanica - - - - Sajjadi i Ghassemi, 1999. N. ispahanica Boiss. - 2,6 0,6 0,3 Sefidkon i sar. 2006 N. italica L. - - - - Kökdil i sar. 1997. N. heliotropifolia Lam. - - - - Sajjadi i Khatamsaz, 2001. N. kotschyi Boiss. - - - 92 Nori-Shargh i sar. 2006. N. macrosiphon Boiss - - - - Javidnia i sar. 2004. 7 N. meyeri Benth. 53,2 - - Sefidkon i Shaabani, 2004. N. meyeri Benth. - 68,1 - - Esmaeili i sar. 2006. N. mahanensis Jamzad i Simmonds - 37,6 - - Sefidkon i sar. 2005. N. makuensis Jam. i Mozaf. - - - - Habibia i sar. 2004. N. mirzayanii Rech. i Esfand. 61 - - - Sefidkon i Jamazd, 2007. N. menthoides Boiss i Buhse 23,3 - - - Sonboli i sar. 2009. N. nepetalla L. 76,5-89,5 0,4-0,6 - - Lawrence, 1992 N. nervosa Royle ex Benth. 0,5 - - - Lawrence, 1992. N. nuda L. ssp. albiflora (Boiss.) 37,5 37,6 - - Kökdil i sar. 1996. N. nuda L. ssp. nuda - - - - Kökdil i sar. 1998. N. pannonica L. 15 11,5 - - Lawrence, 1992. N. parnassica Heldr. i Sart 17,3 8,9-22,0 7,9 - Gkinis i sar. 2003. N. persica Boiss. 80 - - - Mahboubi i sar. 2011. N. podostachys Benth. 0,2 - - - Lawrence, 1992. N. pogonosperma Jamzad i Assadi - 57,6 - - Sefidkon i sar. 2003. N. pilinux P. H. Davis 66,7 - - - Baser i sar. 2000. N. racemosa Lam. 24,4 25,6 33,6 - Dabiri i Sefidkon, 2003a. N. rivularis Bornm. 2,4 1,9 - - Sefidkon i sar. 2006 N. raphanorhiza Benth. - - - - Rather i sar. 2012. N. rtanjensis Diklić i Milojević - 86,4 0,9 - Chalchar i sar.. 2000. N. sibirica L. 84,7 1,6 - - Letchamo i sar. 2005 N. satureioides Boiss. - - - - Hadian i sar. 2006. N. sintenisii Bornm. - 1,6 23,4 - Sajjadi, 2005. N. sulfluriflora P. H. Davis 0,5 - - - Kӧkdil i sar. 1997. N. teydea Webb i Benth. 1,4-89,5 0-0,4 0-1,5 0-0,1 Lawrence, 1992 N. tuberosa L. ssp. reticulata (Desf.) Maire t 76,8 - - Zenasni i sar. 2008. N. ucrainica L. ssp. kopetdaghensis - - - - Javidnia i sar. 2005. 8 Kod vrsta roda Nepeta koje ne poseduju nepetalaktone, etarska ulja sadrže neka od sledećih monoterpenoida: α-pinen, β-pinen, 1,4-cineol, 1,8-cineol (Sajjadi i Eskandari, 2005), iridodial β-monoeol acatat, dihidroiridodial acetat , iridodial dienol diacetat (Bottini i sar., 1992, Saxena i Mathela, 1996), aktinidin (Saxsena i Mathela 1996), argolinsku kiselinu ili metil estre argolinske kiseline (Ahmed i sar.,2006), α- kopaen (Gkinis, 2003). Od seskviterpenoida prisutni su germakren D (Zamfirache i sar., 2010), kadinen (Bozari, 2012), farnesen (Sajjadi, 2005), a od diterpenoida parnapimarol (Gkinis i sar., 2008), krasifol (Ibrahim i sar., 2007) kao i dimeri nepetalaktona - diterpenoidi nepetanudon i nepetaparnon (Kokdil i sar., 1998). 1.2.2. Biosinteza terpenoida i nepetalaktona Svi terpenoidi nastaju kombinacijom iz dva prekursora: izopentenil difosfata (IPP) i njegovog izomera dimetilalil difosfata (DMAPP) (Slika 2). IPP nastaje u plastidima iz gliceraldehid-3-fosfata i piruvata, dok u citoplazmi iz acetil-CoA nastaje IPP koji izomerizacijom prelazi u DMAPP, u reakciji koju katalizuje enzim IPP izomeraza. Sami prekursori vode poreklo iz jednog od dva biosintetička puta: citoplazmatičnog mevalonatnog (MVA) puta i plastidnog metileritritol fosfatnog puta (MEP). Iz početnih molekula dejstvom enzima geranil-difosfat sintaze (GPS), farnezil- difosfat sintaze (FPS) i geranilgeranil-difosfat sintaze (GGPS), nastaju geranil difosfat (GPP), farnezil difosfat (FPP) i geranilgeranil difosfat (GGPP). Ovi intermedijeri predstavljaju ključne tačke grananja izoprenoidnog metabolizma, odakle delovanjem terpenskih sintaza (TPS), iz GPP kao supstrata nastaju monoterpenoidi, iz FPP se dalje sintetišu seskviterpenoidi, dok iz GGPP nastaju diterpenoidi. U višim biljkama se odvijaju oba biosintetička puta izoprenoidnog metabolizma. MVA biosintetski put je lokalizovan u citoplazmi i odgovoran je za sintezu većine seskviterpena (C15) i triterpena (C30), dok se sinteza monoterpenoida (C10), diterpenoida (C20) i tetraterpenoida (C40) odvija u plastidima preko MEP puta (Yu i Utsumi, 2009). 9 Slika 2. Biosintetski put terpenoida u višim biljkama. Skraćenice: MVA mevalonatni biosintetski put ograničen na citosol, MEP metileritritol fosfatni put ograničen na plastide. IPP izopentenil difosfat, DMAPP dimetilalil difosfat, GPP geranil difosfat, E,E-FPP farnezil difosfat, E,E,E-GGPP geranilgeranil difosfat, GPS geranil difosfat sintaza, FPS farnezildifosfat sintaza, GGPS geranilgeranil difosfat sintaza. Predstavljena shema je modifikovana prema Yu i Utsumi, 2009. Biosintetski put koji vodi ka sintezi nepetalaktona do danas nije rasvetljen. Kao mogući intermedijeri konverzije GPP u nepetalakton pominju se monoterpenski alkoholi geraniol (Clark i sar., 1997), nerol i citronelol (Bellesia i sar., 1984, Hallahan i sar., 1998). Mogući put biosinteze nepetalaktona pretpostavlja hidroksilaciju geraniola, nerola ili citronelola membranskim enzimom iz grupe citohrom P450 oksigenaza (Inouye, 1991, Hallahan i sar., 1995) (Slika 3). Kod nekih vrsta hidroksigeraniol i hidroksinerol učestvuju u formiranju loganina (Escher i sar., 1970), dok se pretpostavlja da hidroksicitronelol učestvuje u formiranju nepetalaktona. Oksidaciju hidroksilovanih intermedijera katalizuje enzim NADP + zavisna oksidoreduktaza (Ikeda i sar., 1991, Hallahan i sar., 1995). Ciklaze, koje učestvuju u prevoĎenju acikličnih monoterpenskih aldehida u metilciklopentansku strukturu, delimično su okarakterisane od strane Uesato i saradnika (1991). TakoĎe je okarakterisan enzim nepetalaktol oksidaza koja prevodi nepetalaktol do nepetalaktona. 10 Prisustvo ovog enzima kod vrste Nepeta racemosa navodi na pretpostavku da put biosinteze nepetalaktona ide preko citronelola. Nepetalaktol oksidaza je pronaĎena u ekstraktima peltatnih glandularnih trihoma, što ukazuje na to da je ovaj tip žlezdanih dlaka mesto akumulacije i sinteze nepetalakona (Hallahan i sar., 1998). Slika 3. Pretpostavljeni put biosinteze nepetalaktona od geraniola, nerola ili citronelola. Predstavljena shema je modifikovana prema Hallahan i sar., 1998. 1.3. Fenolna jedinjenja Fenolna jedinjenja čine najrasprostranjeniju grupu sekundarnih metabolita, koji se zbog svojih antioksidativnih osobina upotrebljavaju u medicini, farmaceutskoj, kozmetičkoj i prehrambenoj industriji (Martin i Appel, 2010). Fenolna jedinjenja u svom sastavu imaju bar jedan aromatični prsten sa jednom ili više hidroksilnih grupa (Stalikas, 2007). Jedna od najčešće pominjanih i najčešće ispitivanih osobina fenolnih jedinjenja je njihova antioksidativna aktivnost. Smatra se da je izražena antioksidativna aktivnost fenolnih jedinjenja rezultat sposobnosti fenolnih jedinjenja da budu donori vodonikovih atoma i da pri tome uklanjaju slobodne radikale, uz formiranje manje reaktivnih fenoksil radikala (Pietta, 2000). 11 Formirani radikali su stabilniji zbog delokalizacije elektrona i postojanja više rezonantnih formi. Postoje različite klasifikacije fenola. Na Slici 4 je predstavljena klasifikacija fenolnih jedinjenja na osnovu broja konstitutivnih ugljenikovih atoma osnovnog skeleta fenola. Prema ovoj podeli postoje: prosti fenoli, fenolne kiseline, cimetne kiseline, naftohinoni, ksantoni, stilbeni, flavonoidi i lignini (Boros i sar., 2010). Fenolne kiseline se mogu podeliti u dve grupe: kiseline koje su derivati benzoeve kiseline i one koje su derivati cimetne kiseline (Robbins, 2003). Najzastupljeniji derivati hidroksibenzoeve kiseline su vanilinska, galna, elaginska, protokatehinska, siringinska i gentisinska kiselina. Derivati cimetne kiseline su zastupljeniji u prirodi i obuhvataju kumarinsku, kafeinsku, ruzmarinsku, ferulinsku, sinapinsku i hlorogenu kiselinu. Scarpati i Oriente (1958) su prvi put izolovali ruzmarinsku kiselinu iz vrste Rosmarinus officinalis, po kojoj je ova fenolna kiselina i dobila naziv. Ruzmarinska kiselina u osnovi predstavlja estar kafeinske kiseline i 3,4-dihidroksifenil mlečne kiseline (Scarpati i Oriente, 1958). U prirodi postoji veliki broj derivata ruzmarinske kiseline koji se sastoje iz jednog ili više molekula ruzmarinske kiseline, povezanih sa drugim aromatičnim ili alifatičnim strukturama. Najpoznatji derivati ruzmarinske kiseline su litosperminska kiselina A, koja predstavlja estar ruzmarinske i kafeinske kiseline, i litosperminska kiselina B koja je dimer ruzmarinske kiseline (Kelley i sar., 1975, Tanaka i sar., 1989). Ruzmarinska kiselina ima brojne biološke aktivnosti, kao što su: antioksidativna (Laguerre i sar., 2008, Exarchou i sar., 2002), antiinflamatorna (Osakabe i sar., 2004), antivirusna (Swarup i sar., 2007), antimutagena, antibakterijska, antikancerogena (D’Amelio, 1999, Erkan i sar, 2008), itd. Slika 4. Klasifikacija fenolnih jedinjenja na osnovu broja konstitutivnih ugljenikovih atoma osnovnog skeleta fenola. Predstavljena shema je modifikovana prema Boros i sar., 2010. 12 1.3.1. Fenolne kiseline kod vrsta roda Nepeta Aromatične biljke predstavljaju značajan izvor fenolnih jedinjenja. Neke biljne familije su posebno bogate fenolnim jedinjenjima. Tu spadaju familije Lamiaceae (Scarpati i Oriente, 1958), Boraginaceae (Kelley i sar 1975), Apiaceae (Hiller, 1965), Araliaceae (Trute i Nahrstedt 1996), Cucurbitaceae (De Tommasi, 1991) i Tiliaceae (Lasure i sar., 1994). U okviru familije Lamiaceae najzastupljenije fenolne kiseline su ruzmarinska i kafeinska kiselina (Litvinenko i sar., 1975), s tim što je zastupljenost ruzmarinske kiseline ograničena na podfamiliju Nepetoideae. Neke od identifikovanih fenolnih kiselina kod vrsta roda Nepeta prikazane su u Tabeli 2. Tabela 2. Prikaz fenolnih kiselina zastupljnih kod nekih vrsta roda Nepeta Jedinjenje Vrsta Reference Ruzmarinska kiselina N. apulei Ucria ex Guss. Formisano i sar. 2011. N. cadmea Boiss. Takeda i sar. 1998. N. cataria L. ssp. citriodora Backer Modnicki i sar. 2007. N. nepetalla ssp. cordifolia Formisano i sar. 2011. N. pratti Lèvl. Hou i sar. 2002. N. tuberosa L. ssp.reticulata Desf. Formisano i sar. 2011. N. transcaucasica Grossh. Kraujalis i sar. 2011. N. bulgaricum Kraujalis i sar. 2011. N. caesarea Boiss. Topçu i sar. 2000. Kafeinska kiselina N. cataria L. Proestos i sar 2006. N. cataria L. ssp. citriodora Backer Formisano i sar. 2011. N. nepetalla ssp. cordifolia Formisano i sar. 2011. N. pratti Lèvl. Hou i sar. 2002 Hlorogena kiselina N. sibthorpii Bentham Galati i sar. 2006; Micel i sar. 2005. Galna kiselina N. cataria L. Proestos i sar, 2006. N. melissifolia Pers. Proestos i sar. 2013. Ferulinska kiselina N. cataria L. Proestos i sar, 2006. N. nepetalla ssp. cordifolia Formisano i sar. 2011. N. septemcrenata Erenb. El-Moaty, 2009. N. tuberosa L. ssp. reticulata Desf. Formisano i sar. 1985. Kumarna kiselina N. cataria L. ssp. citriodora Backer Modnicki i sar. 2007. N. nepetalla ssp. cordifolia Formisano i sar. 2011 N. tuberosa L. ssp. reticulata Desf. Formisano i sar, 2011 Vanilinska kiselina N. nepetalla ssp. cordifolia Formisano i sar. 2011 N. tuberosa L. ssp. reticulata Desf. Formisano i sar. 2011. 13 1.3.2. Biosinteza fenolnih jedinjenja Najvažniji put biosinteze fenolnih jedinjenja kod viših biljaka je geranil fenilpropanoidni biosintetski put tj. ciklus šikimske kiseline (Schmid i Amrhein, 1995) (Slika 5). U geranil fenilpropanoidnom biosintetskom putu nastaju aromatične aminokiseline fenilalanin, tirozin i triptofan. Sve tri aminokiseline su prekursori mnogih sekundarnih metabolita. Od fenilalanina deaminacijom nastaje cimetna kiselina i sva jedinjenja koja imaju strukturu fenil-propana. Hidroksilacijom cimetne kiseline pomoću enzima cinamat-4-hidroksilaze (CAH), nastaje 4-kumarna kiselina (Peterson, 1997), dok u sledećem koraku, delovanjem enzima hidroksicinamat CoA ligaze (4CL), dolazi do formiranja CoA tioestra tj. 4-kumaroil-CoA kao i drugih estara cimetne kiseline (npr. hlorogene kiseline). Od tirozina, transaminacijom uz pomoć enzima tirozin aminotransferaze (TAT), nastaje 4-hidroksifenil piruvat, čijom redukcijom, u reakciji koju katalizuje hidroksifenilpiruvat reduktaza (HPPR), nastaje 4-hidroksifenil acetat (DeEknamkul i Ellis, 1987, Peterson i sar., 1993). OslobaĎanjem CoA iz kompleksa 4-kumaroil-CoA, dolazi do formiranja estra izmeĎu karboksilne grupe kumarne kiseline i hidroksilne grupe 4-hidroksifenil acetata, pri čemu nastaje 4- kumaroil-4-hidroksifenil acetat (Peterson, 1997). Hidroksilacijom nastalog estra na jednom mestu, u delu kumarne kiseline, nastaje estar kafeinske kiseline, kafeoil-4- hidroksifenil acetat (Matsuno i sar., 2002), dok hidroksilacijom 4-kumaroil-4- hidroksifenil acetata na dva mesta u poziciji 3 i 3 ᾿ nastaje 4-kumaroil-3,4-dihidroksifenil acetat. Od dva nastala estra formira se ruzmarinska kiselina (Slika 6). 14 Slika 5. Fenilpropanoidni biosintetski put. Skraćenice: PEP-fosfoenolpiruvat, PAL- fenilalanin amonijum lijaza. Predstavljena shema je modifikovana prema Vogt, 2010. 15 Slika 6. Biosintetski put ruzmarinske kiseline. Skraćenice: CAH-cinamat-4-hidroksilaza, 4CL-hidroksicinamat: CoA-ligaza, TAT- tirozin aminotransferaza, HPPR-hidroksifenilpiruvat reduktaza, RAS-hidroksicinamoil- CoA: hidroksifenilacetathidroksicinamoil transferaza, 3-H i 3'-H hidroksicinamoil- hidroksifenilacetat 3 i 3' hidroksilaza. Predstavljena shema je modifikovana prema Petersena i Simmonds, 2003. 1.3.3. Metabolizam fenolnih jedinjenja kod vrsta familije Brassicaceae Vrste familije Brassicaceae metaboličku energiju sekundarnog metabolizma usmeravaju ka sintezi sinapata. Sinapati se, kao i druga fenilpropanoidna jedinjenja sintetišu u fenilpropanoidnom biosintetskom putu: od fenilalanina, preko 4-kumaroil- CoA, hidroksilacije kumaroilšikimata (Schoch i sar. 2001, Nair i sar. 2002, Franke i sar., 2002) i metilacije kafeoil-CoA (Slika 7). 16 Nastali koniferaldehid se hidroksilacijom prevodi u 5-hidroksi-koniferaldehid (Meyer i sar., 1996, Humphreys i sar., 1999, Osakabe i sar., 1999), čijom metilacijom nastaje sinapaldehid. Dejstvom sinapaldehid dehidrogenaze (SALDH) iz sinapaldehida nastaju sinapati (Nair i sar. 2000, 2002, Franke i sar., 2002). U reakciji koju katalizuje enzim sinapat glukoziltransferaza (SGT) nastaje sinapoilglukoza, iz koje dejstvom enzima sinapoilglukoza: holin sinapoiltransferaze (SCT) nastaje sinapin (sinapoilholin). Sinapin predstavlja dominantno fenolno jedinjenje koje se akumulira u semenima vrsta roda Brassicaceae tokom njihovog sazrevanja i nalivanja, a koje se hidrolizuje za vreme klijanja. Moguća fiziološka i ekološka uloga estra karakterističnog za semena još uvek nije razjašnjena, ali se pretpostavlja da estar sinapoilholin nastaje radi skladištenja holina, koji se kasnije prilikom klijanja semena uključuje u primarni metabolizam. Holin je, sam po sebi, higroskopan molekul, dok je u kompleksu sa sinapatima manje higroskopan. Za vreme klijanja, aktivnošću esteraza, dolazi do hidrolize sinapina (Tzagoloff, 1963, Nurmann i Strack, 1979, Strack, 1980). Na početku klijanja sinapin esteraza (SCE) hidrolizuje sinapilholin do sinapata, dok se u mladim klijancima nastali sinapat ponovo esterifikuje preko sinapoilglukoze u sinapoilmalat, u reakciji koju katalizuju enzimi SGT i SMT (sinapoilglukoza: malat sinapoiltransferaza). Prilikom formiranja sinapoilmalata dolazi i do oslobaĎanja manje količine slobodnog holina, koji se može uključiti u biosintezu fosfatidilholina (Strack, 1981, Milkowski i sar., 2004, 2010). 17 Slika 7. Biosintetski put estara sinapata kod Arabidopsis thaliana i Brassica napus. Skraćenice: PAL- fenilalanin-amonijum liaza, C4H- cinamat-4-hidroksilaza, 4CL-4- kumarat: CoA ligaza, HCT- hidroksicinamoil transferaza, C3H- 4-kumaratestar 3- hidroksilaza, CCoAOMT- koniferil-CoA o-metiltransferaza, CCR- cinamoil-CoA reduktaza, F5H- ferulat 5-hidroksilaza, COMT- kafeoil O-metiltransferaza, SALDH/CALDH- sinapaldehid/koniferaldehid dehidrogenaza, SGT- sinapat glukoziltransferaza, SCT- sinapoilglukoza: malat sinapoiltransferaza, SCE- sinapin esteraza, SMT- sinapoilglukoza: malatsinapoiltransferaza. Predstavljena shema je modifikovana prema Milikowski i Strack, 2010. 1.4. Biološka aktivnost vrsta roda Nepeta Vrste roda Nepeta imaju veliki broj farmakoloških i bioloških aktivnosti koje se uglavnom pripisuju nepetalaktonu. Ljudi su ih decenijama koristili u narodnoj medicini za lečenje glavobolje, groznice, zubobolje, ali i u kulinarstvu. Alkoholni ekstrakti nekih vrsta roda Nepeta koriste se kod reumatskih, gastrointestinalnih i respiratornih tegoba, kao što su kolike, dijareja, astma, bronhitis (Duke i sar., 2002). 18 TakoĎe, poznato je i njihovo antiviralno (Formisano i sar., 2011), citotoksično (Badisa i sar., 2003), analgetičko (Aydin i sar., 1999) i antiinflamatorno dejstvo (Miceli i sar., 2005). Pokazano je citotoksično dejstvo etarskog ulja N. glomerata na C32 (eng. C32 amelanotic melanoma) i ACHN (eng. renall cell adenocarcinoma) ćelijske linije kancera (Rigano i sar., 2011). TakoĎe je pokazano da etarsko ulje N. caesarea deluje kao analgetik, tako što blokira naloksone koji se vezuju za opioidne receptore. Ova biološka aktivnost etarskog ulja N. caesarea se može pripisati 4aα,7α,4aα- nepetalaktonu, koji predstavlja dominantnu komponentu (95%) etarskog ulja ove vrste (Aydin i sar. 1998). Veoma važan farmakološki efekat nekih vrsta roda Nepeta ogleda se u sprečavanju nastanka ateroskleroze, smanjivanjem količine lipida i lipoproteina u organizmu (Formisano i sar. 2011). Postoje i komercijalni farmakološki suplementi koji sadrže etarsko ulje i vodeni ekstrakt cveta N. hindostana, koji deluju na smanjenje holesterola i triglicerida (Arora i sar., 1985). Etarsko ulje nekih vrsta roda Nepeta pokazuje antimikrobno dejstvo (Sonboli i sar., 2004, Stojanović i sar., 2005, Adiguzel i sar., 2009, Alim i sar., 2009). Intenzivno ispitivana vrsta ovog roda N. cataria pokazuje izraženi antioksidativni potencijal (Adiguzel i sar., 2009). Vodeni ekstrakti vrsta N. nepetalla, N. coerules, N. tuberosa imaju antivirusno dejstvo na dva različita tipa DNK i RNK virusa, a ispoljavaju i antivirusno dejstvo na viruse kao što su Herpes simplex tip I (HSV-1), pri čemu dolazi do inhibicije replikacije HSV-1 bez citotoksičnog efekta. TakoĎe, vodeni ekstrakt N. nepettela, N. coerulea i N. tuberosa deluje i na Vesicular stomatitis virus (Bedoya i sar., 2002). Pokazano je da nepetalinska kiselina i nepetalakton imaju efekat na centralni nervni sistem miševa i pacova (Harney i sar., 1978). Ekstrakt N. cataria koji sadrži nepetalakton, nepetalinsku kiselinu, timol, citronelol i geraniol izaziva pospanost, smanjenje krvnog pritiska i utiče na pamćenje (Formisano i sar., 2011). Etarsko ulje N. sibthorpii dovodi do izmene uobičajenih obrazaca ponašanja kog glodara (Galati i sar., 2004), dok hidroalkoholni ekstrakt N. persica pokazuje anksiolitički efekat sa manjim sedativnim i hipnotišućim dejstvom od diazepama (Rabbani i sar., 2008). Jedinjenja iz N. cataria izazivaju jedinstveni način ponašanja kod velikog broja vrsta fam. Felideae. 19 Najviše ispitivana vrsta ovog roda N. cataria, koja se još naziva i mačja metvica, deluje kao seksualni atraktant kod mačaka (Bates i Sigel, 1963). Ovi autori su pokazali da na ponašanje kod mačaka intenzivnije utiče cis,trans- stereoizomer nepetalaktona (4aα,7α,4aα) u odnosu na tran,cis-nepetalakton (4aα,7α,4aβ). Ranija istraživanja biološke aktivnosti vrsta roda Nepeta i nepetalaktona uključuju i repelentnu aktivnost protiv komaraca, bubašvaba, muva, crva i krpelja (Peterson i Coats 2001, Peterson i sar., 2002, Chauhan i sar., 2005, Bernier i sar., 2005, Webb i Russel, 2007, Polsomboon i sar., 2008, Spero i sar., 2008, Birkett i sar., 2010). Trans,cis-stereoizomer nepetalaktona pokazuje veoma toksično dejstvo i jaču repelentnu aktivnost na bubašvabe od cis,trans-stereoizomera (Peterson i Coats, 2001, Peterson i sar., 2002, Gkinis i sar., 2003), dok oba stereoizomera nepetalaktona pokazuju repelentnu aktivnost na komarce (Coats i sar., 2003, Schultz i sar., 2004). Trans,cis- i cis,trans-nepetalakton su feromoni pčela, mada jače dejstvo ispoljava trans,cis-nepetalakton (Birkett i Pickett, 2003). Etarsko ulje nekih vrsta roda Nepeta pokazuje fitotoksičnu aktivnost na veliki broj korovskih vrsta i poljoprivrednih kultura, ali mehanizam dejstva do danas nije poznat. Pokazano je da etarska ulja vrsta roda Nepeta imaju izražen inhibitorni efekat na rast nadzemnog dela i korena klijanaca Lepidium sativum (Mutlu i Atici, 2009). Nedavno je objavljeno da etarsko ulje N. meyeri dovodi do oksidativnog stresa kod klijanaca nekih korovskoh vrsta (Mutlu i sar., 2011). 1.4.1. Antioksidativna aktivnost Tokom normalnih fizioloških procesa, ali i u stresnim uslovima, u ljudskom organizmu dolazi do produkcije reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS, eng. Reactive Oxigen Species) i enzimskih antioksidanasa. Termin antioksidansi ne podrazumeva grupu jedinjenja koja su slična po hemiskoj strukturi, već je to opšti naziv za sva jedinjnja koja mogu sprečiti ili bar smanjiti oksidaciju supstrata. 20 Neravnoteža izmeĎu nastalih slobodnih radikala i antioksidanasa dovodi do oksidativnog oštećenja makromolekula ćelije (Aruoma i sar., 1998, Lefer i Granger, 2000, Smith i sar., 2000, Bhatia i sar., 2003, Peuchant i sar., 2003), kao što su peroksidacija membranskih lipida, oksidativno oštećenje nukleinskih kiselina i šećera, oksidacija sulfonskih i drugih grupa u proteinima. Sve promene na makromolekulima ćelije vode ka nastanku mnogih zdravstvenih poremećaja kod ljudi (Uchida i sar., 2000, Steer i sar., 2002). Slobodni radikali su molekuli koji imaju jedan ili više nesparenih elektrona u svojoj strukturi, što dovodi do njihove izražene reaktivnosti. Radikali koji imaju nesparen elektron na kiseonikovom atomu pripadaju grupi reaktivnih kiseoničnih vrsta. U ovu grupu se ubrajaju: superoksid radikali (O2 .- ), hidroksil radikal (OH . ), perhidroksi radikal (HO2 . ) i alkoksi radikali (RO . ). Postoje i neradikalske vrste koje sadrže kiseonik kao što su vodonik peroksid (H2O2), singlet kiseonik ( 1О2) i ozon (O3) (Gill i Tuteja, 2010) (Slika 8). U nedostatku antioksidanasa koji mogu neutralisati reaktivne slobodne radikale, dolazi do nastanka mnogih bolesti (Shahidi i sar., 1992), kao što su kardiovaskularna oboljenja i kancer (Gerber i sar., 2002), neurodegenerativne bolesti, Alchajmerova bolest (Di Matteo i Espossito, 2003) i inflamatorna oboljenja (Sreejayan i Rao, 1996). Postoji veliki broj sintetičkih antioksidanasa koji se upotrebljavaju u prehrambenoj industriji, uključujući butilovani hidroksitoluen (BHT) i butilovani hidroksianisolen (BHA). Smatra se da su upravo sintetički antioksidansi odgovorni za nastanak mnogih oboljenja povezanih sa oštećenjem jetre i karcinogeneze (Grice i sar., 1988, Wichi i sar., 1986). Slika 8. Nastanak reaktivnih kiseoničnih vrsta ROS (eng. Reactive Oxigen Species). Predstavljena shema je modifikovana prema Gill i Tuteja, 2012. 21 U poslednje vreme velika pažnja se posvećuje preventivnoj medicini koja propagira upotrebu antioksidanasa biljnog porekla u ishrani i u terapiji. Prisustvo neenzimskih antioksidanasa kao što su vitamin C, vitamin E, karoteni, ksantofili i tanini, opravdava ulogu lekovitog i začinskog bilja kao moćnih antioksidanasa. U okviru prirodnih jedinjenja koja imaju veliki antioksidativni potencijal posebno se ističu fenolne kiseline (galna, kafeinska, ruzmarinska kiselina), fenolni diterpeni (karnozol), flavonoidi (kvercetin, katehin), kao i konstituenti etarskih ulja (Shan i sar., 2005, Galati i sar., 2006). PoreĎenjem antioksidativnog potencijala fenolnih jedinjenja i terpenoida, fenolna jedinjenja su se pokazala kao bolji antioksidansi (Bramley i sar., 2000, Davey i sar., 2000, Harbone i Williams, 2000, Parr i Bowell, 2000, Pietta, 2000, Kim i Lee, 2004, Asard i sar., 2004), a to se pripisuje njihovoj osobini da lako predaju vodonikov atom. 1.4.1.1. Antioksidativna aktivnost fenolnih jedinjenja Antioksidativna aktivnost fenolnih jedinjenja se zasniva na direktnoj reakciji fenola i slobodnih radikala, a ovaj proces se na molekularnom nivou može odvijati na tri načina (Leopoldini i sar., 2004a, 2004b, 2004c, Wright i sar., 2001): Slika 9. Mehanizam dejstva fenolnih jedinjenja u reakciji uklanjanju slobodnih radikala. Prenos vodonikovog atoma sa fenolnog jedinjenja na slobodni radikal. Prvi način uklanjanja slobodnih radikala (R.) se zasniva na homolitičkom cepanju O-H grupe i prenosu vodonikovog atoma sa fenolnog jedinjenja (Ar-OH) na slobodni radikal. U opisanoj reakciji ponovo nastaje radikal (ArO . ) koji je manje reaktivan, zbog sposobnosti nastalog fenol radikala da stabilizuje i delokalizuje nespareni elektron (Slika 9). 22 Slika 10. Mehanizam dejstva fenolnih jedinjenja u reakciji uklanjanju slobodnih radikala. Prenos elektrona sa fenolnog jedinjenja na slobodni radikal. Drugi mehanizam se zasniva na prenosu jednog elektrona sa fenolnog jedinjenja, pri čemu nastaju katjonski radikal (ArOH+) i anjon (R-) (Slika 10). Nastali anjon ima sparen broj elektrona i pri tome je energetski stabilizovan, dok je aromatična struktura sa preostalim elektronom takoĎe stabilizovana delokalizacijom elektrona i postojanjem više rezonantnih oblika. (Leopodini i sar., 2004a, Wright i sar., 2001). Slika 11. Mehanizam dejstva fenolnih jedinjenja u reakciji uklanjanju slobodnih radikala. Vezivanje metala od strane fenolnog jedinjenja. Treći mehanizam se bazira na sposobnosti fenolnih jedinjenja da vezuju za sebe metale, formirajući stabilne komplekse, što sprečava učešće metala u reakcijama u kojima se proizvode slobodni radikali (Slika 10) (Brown i sar., 1998, Jovanović i sar., 1998, van Acker i sar., 1996). Poznato je da neki metali u nižem oksidacionom stanju mogu da učestvuju u Fentonovoj reakciji (Schulz i sar., 2000) sa H2O2, pri čemu dolazi do formiranja OH . radikala koji je veoma reaktivan i jedan od najštetnijih radikala u biljnom tkivu. 23 1.4.1.2. Monoterpenoidi kao antioksidansi Glavni sastojci etarskih ulja takoĎe imaju antioksidativni potencijal. Monoterpenoidi su veoma efikasni u sprečavanju lipidne peroksidacije, što je od velikog značaja u ljudskom organizmu. Monoterpenoidi štite LD lipoproteine (LDL eng. Low Density Lipoproteins) od okidacije, i samim tim smanjuju rizik od nastanka mnogih srčanih oboljenja. Pokazan je veliki oksidativni potencijal γ-terpinena (monoterpenoid), koji hidrofobnim interakcijama reaguje sa LDL partikulama i sprečava njihovu oksidaciju (Takahashi i sar., 2003). Monoterpenoidi pokazuju sinergistički efekat u dejstvu sa drugim antioksidansima, kao što je npr. α-tokoferol (Wagner i Elmadfa, 2003). MeĎutim, poslednjih godina je pokazano da postoji i antagonistički efekat izmeĎu antioksidativne aktivnosti glavnih komponenti etarskih ulja, ali i izmeĎu fenolnih jedinjenja i terpenoida (Azza i sar., 2011, Motohashi i sar., 2002, Perry i sar., 2003). 1.4.1.3. ROS kod biljaka ROS nastaju u ljudskom organizmu, ali i kod biljaka, kao rezultat dejstva različitih abiotičkih i biotičkih faktora kao što su: UV zračenje, suša, teški metali, ekstremne temperature, nedostatak hranljivih materija, herbicidi, napad patogena, alelopatske interakcije, ali i kao sporedni produkti metaboličkih puteva u fiziološkim uslovima (Gill i Tuteja, 2010). Fotosistemi I i II u hloroplastima su glavna mesta produkcije 1 O2 i O2 .- (Foyer i sar., 2005), dok u mitohondrijama dolazi do stvaranja O2 .- . ROS takoĎe mogu nastati i u citosolu i u endoplazmatičnom retikulumu za vreme detoksifikacije (Dybing i sar., 1976). U biljnom tkivu ROS dovode do nepovratne oksidacije proteina kao i do karbonilacije uskladištenih proteina u semenima, koja se značajno povećava za vreme klijanja semena (Job i sar., 2005). ROS dovode do oštećenja svih komponenti DNK molekula, deluju na purinske i pirimidinske baze, ali i na dezoksiribozu (Halliwell i sar., 1999), uzrokujući deleciju baza i njihovu alkilaciju ili oksidaciju (Wiseman i sar., 1996, Tuteja i sar., 2001). 24 U biljnim ćelijama ROS mogu imati i pozitivan efekat, kao što je to slučaj u različitim stadijumima razvoja semena (od embriogeneze do klijanja). U suvim semenima, za koje je karakteristična veoma slaba enzimska aktivnost, jedini način produkcije ROS je lipidna peroksidacija i minimalni nivo disanja za koju je potrebna mala količina vlage (Priestley i sar., 1986, Sun i sar., 1995, McDonald, 1999). MeĎutim, kada se poveća sadržaj vlage u semenima, dolazi do značajnih promena u metabolizmu koje dovode do klijanja semena (Bouteau i Bailly, 2008). Mnoga istraživanja pokazuju da je prelazak semena iz faze mirovanja u metabolički aktivnu fazu povezan sa produkcijom ROS. Pokazano je da u periodu rane imbibicije dolazi do produkcije vodonik peroksida kod semena soje (Puntarulo i sar., 1988, Puntarulo i sar., 1991, Gidrol i sar., 1994), kukuruza (Hite i sar., 1999), suncokreta (Bailly i sar., 2002), pšenice (Caliskan i sar., 1998), graška (Wojtyla i sar., 2006), paradajza (Morohashi i sar., 2002), itd. Kao deo normalnih fizioloških procesa za vreme klijanja produkuju se i azot monoksid (Caro i sar., 1999, Sarath i sar., 2007), hidroksil radikali (Schopfer i sar., 2001), kao i superoksid radikali (Puntarulo i sar., 1991, Gidrol i sar., 1994, Schopfer i sar., 2001). Po svoj prilici, prilikom imbibicije semena, ROS se najviše produkuju u mitohondrijama tokom procesa disanja (Moller i sar., 2001). Glioksizomi, koji su uključeni u metabolizam rezervnih lipida u semenima, produkuju veliku količinu vodonik peroksida koji nastaje aktivnošću enzima glikolat oksidaze (Huang i sar., 1983). Tačno mesto produkcije ROS za vreme klijanja semena nije precizno utvrĎeno, ali se pretpostavlja da je to omotač semena ili aleuronski sloj (Bailly, 2004). Iako ROS predstavljaju signalne molekule veoma važne za proces klijanja, u semenima postoje posebni mehanizmi koji omogućavaju uklanjanje ROS, kao i regulaciju njihove koncentracije u tkivu (Bouteau i Bailly, 2008). ROS, a naročito vodonik peroksid, mogu indukovati ekspresiju gena koji su uključeni u kodiranje fosfataza, kinaza i enzima uključenih u antioksidativnu zaštitu (Desikan i sar., 2001, Neill i sar., 2002). 25 Antioksidativna jedinjenja i enzimi su od velikog značaja za sve faze u procesu klijanja semena. Primećeno je da u toku klijanja dolazi do promene količine α- tokoferola (Simontacchi i sar., 1993, 2003, Yang i sar., 2001 ), flavonoida i fenola (Simontacchi i sar., 1993, Andarwulan i sar., 1999, Yang i sar.,2001). Rusydi i Azrina (2012) su pokazali da kod semena soje i pasulja u toku faze klijanja dolazi do opadanja količine fenolnih jedinjenja. TakoĎe, za vreme imbibicije dolazi do povećanja količine askorbata i glutationa u semenima (Kranner i Grill, 1993, De Gara i sar., 1997, Tommasi i sar., 2001, Yang i sar., 2001, De Tullio i Arrigon, 2003). Značajne promene za vreme imbibicije i klijanja semena se dešavaju i na polju antioksidativnih enzima. Primećeno je da kod semena suncokreta dolazi do povećanja aktivnosti katalaza (CAT) i glutation reduktaza (GR) pre izbijanja radikule (Bailly i sar., 2000). Slično povećanje aktivnosti CAT za vreme klijanja je primećeno i kod semena kukuruza (Scandalios i sar., 1997, Hite i sar., 1999, Guan i Scandalios, 2002), soje (Puntarulo i sar., 1991; Gidrol i sar., 1994) i Arabidopsis thaliana (Gallardo i sar., 2001). Primećena je povećana aktivnost superoskid dismutaza i askorbat peroksidaza tokom klijanja semena duvana i ječma (Lee i sar., 2010c). Kod A. thaliana aktivnost peroksidaza je detektovna u endospermu i na ivicama kotiledona, dok je kod semena Lepidium sativum peroksidazna aktivnost detektovana u endospermu i radikuli, ali ne i u kotiledonima (Linkies i sar., 2010b). 1.4.1.4. Enzimske komponente antioksidativnog sistema biljaka U sprečavanju nagomilavanja štetnih ROS u biljnim tkivima, uključene su enzimska komponenta antioksidativnog sistema (SOD superoksid dismutaze, APOD askorbat peroksidaze, GPOD gvajakol perokidaze, GR glutation reduktaze, GST glutation transferaze, MDHAR monodehidroaskorbat reduktaze, DHAR dehidroaskorbat reduktaze i CAT katalaze) i neenzimska komponenta antioksidativnog sistema (askorbinska kiselina, glutation, α-tokoferol, karotenoidi i flavonoidi) (Gill i sar., 2010). 26 1.4.1.4.1. Superoksid dismutaze (SOD) SOD (EC 1.12.1.1) su metaloenzimi koji predstavljaju prvu liniju odbrane od ROS. Ova grupa enzima uklanja superoksid radikale (O2 .- ), pri čemu nastaju H2O2 i O2. SOD se klasifikuju na osnovu metalnog kofaktora koji enzim koristi, pa razlikujemo Fe-SOD, Mn-SOD i CuZn-SOD. U genomu Arabidopsis thaliana okarakterisana su tri gena koji kodiraju Fe-SOD, tri CuZn-SOD gena i jedan gen za Mn-SOD (Kliebenstein i sar., 1998). Aktivnost SOD izoenzima može biti detektovana na osnovu njihove različite osetljivosti na dejstvo inhibitora KCN i H2O2. Mn-SOD su otporne na dejstvo oba inhibitora, CuZn-SOD su osetljive na oba inhibitora, dok su Fe-SOD otporne na dejstvo KCN a osetljive na dejstvo H2O2 (Gill i Tuteja, 2010). Značajno je napomenuti da postoji subćelijska lokalizacija izoenzima SOD. Mn-SOD su pronaĎene u mitohondrijama i peroksizomima (del Rio i sar., 2003), CuZn-SOD su detektovane u hloroplastima i citosolu (del Rio i sar., 2002), dok su Fe-SOD detektovane samo u hloroplastima (Alscher i sar., 2002). Fe-SOD su zastupljene u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama. Smatra se da je Fe-SOD prvi SOD izoenzim koji je nastao tokom evolucije, zbog velike raspoloživosti slobodnog Fe (II) u vreme nastanka enzima. Kako se količina O2 u prirodi povećavala, tako se povećavala i količina oksidovanih mineralnih komponenti, a samim tim je došlo do smanjenja količine dostupnog Fe (II), pa je ovaj metal na aktivnom mestu enzima zamenio mnogo dostupniji metal Mn (III) (Bannister i sar., 1991). Postoje dve različite grupe Fe-SOD. Prvu grupu čini homodimerni enzim koji je izgraĎen od dve identične proteinske subjedinice, veličine 20 kDa. Nalazi se kod prokariota i u plastidima nekih evolutivno starijih biljaka (Salin i Bridges, 1981.). Kod većine viših biljaka prisutan je tetramerni enzim, izgraĎen od četiri identične proteinske subjedinice veličine 80-90 kDa (Kusunose i sar., 1976, Kirbyi sar., 1981, Barro i sar., 1990). 27 Mn-SOD su prisutne i kod prokariota i kod eukariota, i njihova primarna, sekundarna i tercijarna struktura je veoma slična sa Fe-SOD (Fridovich, 1986). Postoje kao homodimeri, koji su izgraĎeni od dve identične subjedinice veličine 40 kDa, ili i kao homotetrameri koji su izgraĎeni od četiri identične subjedinice od 80 kDa, pri čemu sadrže samo po jedan Mn(III) atom po subjedinici. CuZn-SOD se javljaju uglavnom kod eukariota. Kada je zemljina atmosfera postala potpuno zasićena kiseonikom, Fe (II) je postalo nedostupno biljkama, a nerastvorni Cu (I) je prešao u rastvorni Cu (II) koji je mogao biti upotrebljen kao metalni kofaktor na aktivnom mestu SOD. Postoje dve grupe CuZn-SOD: 1) homodimerne citoplazmatične i periplazmatične CuZn-SOD i 2) homotetramerne hloroplastne CuZn-SOD (Alcher i sar., 2002). Lokalizacija i osetljivost na dejstvo inhibitora SOD izoformi predstavljena je u Tabeli 3. Tabela 3. Lokalizacija i osetljivost na dejstvo inhibitora pojedinih SOD izoformi SOD izoforme Lokalizacija Otporne na Osetljive na Fe-SOD Hloroplasti KCN H2O2 Mn-SOD Mitohondrije i peroksizomi KCN i H2O2 - CuZn-SOD Hloroplasti i citosol - KCN i H2O2 1.4.1.4.2. Katalaze (CAT) Katalaza (EC 1.11.1.6) je široko rasprostanjen enzim, koji je zastupljen kod gotovo svih organizama, počev od mikroorganizama (aerobnih i anaerobnih), biljaka, životinja do čoveka. Katalaza je tetramer sastavljen od četiri polipeptidna lanca, od kojih svaki sadrži preko 500 aminokiselina. U sastav enzima ulaze četiri porfirinska hema, grupe koje omogućavaju enzimu da reaguje sa vodonik peroksidom. Katalaze predstavljaju grupu metalo-enzima koje katalizuju reakciju dismutacije vodonik peroksida do vode i kiseonika (Garg i sar., 2009). 28 Katalaza je veoma aktivan enzim: jedan molekul katalaze prevodi million molekula vodonik peroksida do vode i kiseonika u sekundi (Garg, 2009). U biljnim ćelijama se ovi enzimi najčešće sreću na mestima povećane produkcije vodonik peroksida, tj. u peroksizomima, glioksizomima i citosolu (Tolbert, 1980; Dat i sar., 2000). Pored CAT koje u svom aktivnom centru sadrže gvožĎe, postoje i CAT u čijem aktivnom centru se nalazi Mn. Mn-CAT su otkrivene kod Lactobacillus plantarum i kod nekih termofilnih bakterija (Kono i Fridovich, 1983). 1.4.1.4.3. Peroksidaze (POD) Peroksidaze (EC 1.11.1.7) su glikoproteini izgraĎeni od jedne subjedinice i veoma su rasprostranjenje u biljnom svetu. Peroksidaze katalizuju reakciju oksidacije supstrata, pri čemu nastaje voda i oksidovani radikalski produkt (Veitch, 2004): Na osnovu primarne strukture proteina, peroksidaze se mogu podeliti u III klase: I. citohrom C peroksidaze (EC 1.11.1.5), askorbat peroksidaze (EC 1.11.1.11) i neke bakterijske peroksidaze čine prvu grupu enzima. Njihovu primarnu strukturu čine: N-terminalni signalni peptid, disulfidni mostovi, ugljeni hidrati i kalcijum (Veitch, 2004). II. peroksidaze koje sa nalaze kod gljiva, uključujući lignin peroksidaze (EC 1.11.1.14) i mangan peroksidaze (EC 1.11.1.13), predstavljaju grupu ekstracelularnih enzima koji u svom sastavu poseduju N-terminalni signalni peptid, četiri disulfidna mosta (drugačije lokalizovanih u poreĎenju sa klasom III peroksidaza), kalcijum, ugljene hidrate i C-terminalni domen koji poseduje oko 60 aminokiselinskih ostataka manje nego klase I i III peroksidaza (Veitch, 2004). III. enzimi (EC 1.11.1.7), prvobitno opisani kao peroksidaze, se transportuju u vakuole ili izlučuju iz ćelije (Rahnama i Ebrahimzadeh, 2006). Ova grupa enzima kao elektron donore najčešće koristi fenole (Welinder i Gajhede, 1992). Primarnu strukturu III grupe peroksidaza čine N-terminalni signalni peptid, četiri konzervirana disulfidna mosta, kalcijum i ugljeni hidrati (Veitch, 2004). 29 POD se nalaze u vakuolama, peroksizomima, ćelijskom zidu, citoplazmi (Schlos i sar., 1987). Poseduju veliki broj fizioloških funkcija u biljnom organizmu, učestvuju u biosintezi lignina i suberina (Quiroga i sar., 2000), biosintezi etilena, degradaciji indol- 3-sirćetne kiseline (Macháčková i Zmrhal, 1981., Lee, 1977), imaju važnu ulogu pri odbrani od patogena (Stout i sar., 1999) itd. 1.4.1.4.4. Polifenol oksidaze (PPO) PPO (1,2-benzendiol: kiseonik oksidoreductaze EC. 1.10.3.1) su poznate i kao tirozinaze, polifenolaze, katehol oksidaze, krezolaze (Whitaker i sar., 1996). PPO pripadaju grupi metaloenzima sa bakrom u aktivnom centru, i široko su zastupljeni u hloroplastima biljaka (Mayer i Harel, 1979). Fizička povreda ćelijske strukture dovodi do oslobaĎanja PPO iz hloroplasta i njihovog fenolnog supstrata iz vakuola (Mishra i sar., 2012). PPO katalizuju hidroksilaciju monofenola do o-difenola, nakon čega aktivnošću monofenolaza i kasnijom oksidacijom od o-difenola nastaju o-kinoni koji imaju kateholaznu/difenolaznu aktivnost (Mayer, 2006) i čijom aktivnošću, u prisustvu kiseonika nastaje tamno obojeni pigment – melanin (Madinez i Whitaker, 1995). Tačna uloga PPO nije u potpunosti razjašnjena. Zapaženo je da se aktivnost ovog enzima povećava tokom izlaganja biljaka različitim abiotičkim agensima, i da dovodi do povećanja otpornosti biljaka na novonastale stresne uslove (Thipyapong i sar., 1995, 1997). Povećana produkcija PPO u biljkama može biti rezultat napada insekata ili patogena (Mayer i Harel 1979, Steffens i sar., 1994, Constabel i sar., 1995, Thipyapong i sar., 1995, Thipyapong i Steffens 1997). Poznato je da PPO učestvuje u procesima kao što su lignfikacija i formiranje pigmenata (Bolaños i Silva, 2004, Richardson i McDougall, 1977). 30 1.4.1.4.5. Antioksidativni enzimi vrsta fam. Brassicaceae Kao rezultat dejstva različitih abiotičkih i biotičkih faktora, kod najviše ispitivane vrste familije Brasicaceae (Arabidopsis thaliana) postoji veliki broj istraživanja u pogledu stvaranja ROS i uključivanja antioksidativnih enzima. Drazkiewicz i sar., (2004) su pokazali da pod dejstvom teških metala (bakar) kod A. thaliana dolazi do stvaranja velike količine O2 -. , H2O2, i OH .. TakoĎe, primećena je velika aktivnost SOD i POD, dok je aktivnost CAT veoma slaba. Pretpostavlja se da velika količina O2-. inhibira aktivnost CAT. Ista vrsta stresa je kod Ceratophyllum demersum (fam. Ceratophyllaceae) za razliku od A. thaliana, dovela do velike aktivnosti CAT (Devi i Prasad, 1998). Kubo i sar. (1999) su ispitivali delovanje različitih vrsta stresa na aktivnost antioksidativnih enzima. U zavisnosti od tipa stresa biljke su imale različiti antioksidativni odgovor. Visoka temperatura i nedostatak svetlosti dovode do povećanja aktivnosti monodehidroaskorbat reduktaza (MDHAR). Vodni deficit takoĎe utiče na povećanje aktivnosti MDHAR kao i gvajakol peroksidaza (GPOD), dok visoke temperature povećavaju aktivnost askorbat peroksidaza (APOD) i glutation reduktaza (GR), a dovode do smanjenja aktivnosti CAT. Visok intenzitet UV B zračenja dovodi do najizraženijeg povećanje aktivnosti antioksidativnih enzima kod A. thaliana (dolazi do povećane aktivnosti APOD, MDHAR, GR, GPOD, SOD). Poslednjih godina raste interesovanje za upotrebu kresa (Lepidium sativum) kao test vrste u mnogim eksperimentima, u prvom redu zbog lake dostupnosti ove vrste, kao i zbog kratkog perioda klijanja semena, itd. Prilikom tretmana klijanaca kresa teškim metalima (olovo) primećeno je da dolazi do povećanja aktivnosti SOD, dok povećana aktivnost POD i CAT nije zabeležena (Ibrahim i Bafeel, 2011). Sa povećanjem koncentracije kadmijuma takoĎe dolazi po porasta aktivnosti nekih antioksidativnih enzima kod navedene vrste (SOD, APOD, GR, i CAT) (Gill i sar., 2012). 31 1.4.2. Antimikrobna aktivnost Iako je farmaceutska industrija u poslednje vreme veoma razvijena, sve više raste broj patogenih mikroorganizama koji su otporni na antibiotike. Strategija farmaceutske industrije ogleda se u izmenama molekulske strukture postojećih antibiotika u cilju poboljšanja njihove efikasnosti. MeĎutim, bakterije poseduju genetičku sposobnost da veoma brzo postignu i rašire rezistentnost i na novo- primenjena sintetička jedinjenja. Pored sintetisanih molekula, prirodni proizvodi su jedan od glavnih izvora novih terapijskih agenasa za različite bolesti uključujući i bolesti izazvane patogenim mikroorganizmima (Nascimento i sar., 2000, Sakagami i sar., 2002). Intezivne studije su poslednjih godina usmerene ka ispitivanju mogućnosti upotrebe biljnih ekstrakata i etarskih ulja u tretmanima protiv patogenih bakterija i gljiva (Chalchat i sar., 1998, Salehi i sar., 2007, Ljaljević Grbić i sar., 2008, Celik i sar., 2008, Hussain i sar., 2009, Sonboli i sar., 2004, Stojanović i sar., 2005). Hemijska jedinjenja izolovana iz biljaka, koja su odgovorna za antimikrobnu aktivnost su fenolne kiseline, kinoni, flavoni i flavonoidi, tanini, kumarini, terpenoidi, alkaloidi (Cowan i sar., 1999). Od svih pomenutih jedinjenja, pokazano je da konstituenti etarskih ulja, terpenoidi pokazuju najveću antimikrobnu aktivnost (Knobloch i sar., 1989). U pogledu dejstva na patogene mikroorganizme posebno se ističu oksidovani monoterpenoidi, kao sto su kamfor, eugenol, borneol, linalol i drugi (Brand i sar., 1995). Prirodna jedinjenja deluju na bakterijsku ćeliju tako što dovode do narušavanja citoplazmatične membrane i koagulacije ćelijskog sadržaja, utiču na aktivni transport i protok elektrona u ćeliji (Burt i sar., 2004). Antibakterijske supstance iz etarskih ulja deluju kako na proteine, tako i na lipide citoplazmatične membrane bakterijske ćelije. Vezujući se za lipide membrane ova jedinjenja dovode do povećanja njene propustljivosti (Sikemma i sar., 1994). 32 Ranija istraživanja su se bazirala na antibakterijskom potencijalu prirodnih produkata i njihovih derivata, dok je interesovanje za istraživanjem antifungalne aktivnosti počelo nešto kasnije (Weidenbörner i Jha, 1994). U poslednje vreme se velika pažnja posvećuje upotrebi etarskih ulja aromatičnih biljnih vrsta u sprečavanju rasta patogenih vrsta gljiva. Dambolena i sar., (2010) su pokazali da etarsko ulje Ocimum basilicum i O. gratissimum deluje mikrobiostatski na Fusarium verticillioides i takoĎe pokazuje inhibitorni efekat na produkciju mikotoksina. Isti autori navode da su dominantne monoterpenoidne i seskviterpenoidne komponente etarskih ulja odgovorne za antifungalnu aktivnost. Pored terpenoidnih jedinjenja Weidenbbörner i sar., (1989, 1990) su pokazali mikrobiocidno dejstvo flavanona, flavona kao i izoflavona i izoflavanona na nekoliko vrsta roda Aspergillus. Predpostavlja se da prirodna antifungalna jedinjenja mogu imati inhibitorni efekat na neke od enzima koji su uključenu u sintezu mikotoksina, takoĎe mogu reagovati sa sulfonskim proteinskim grupama u membranama mada može doći i do nespecifičnog proteinskog vezivanja što dovodi do membranskog oštećenja koje neminovno utiče na ravnotežu neorganskih jona (Cowan i sar., 1999, Lambert i sar., 2001). 1.4.2.1. Antimikrobna aktivnost vrsta roda Nepeta Prva potvrda antimikrobne aktivnosti vrsta roda Nepeta datira iz 1974. godine kada su Goutam i Purohit pokazali antibakterijsku aktivnost etarskog ulja N. hindostana nа Bacillus subtilis, Corynebacterium pyogenes, Pasteurella multocida i Sarcina lutea. TakoĎe, etarsko ulje ove vrste pokazuje antifungalno dejstvo na nekoliko vrsta roda Penicillium i Aspergillus. Etarsko ulje N. cataria koje sadrži 4aα,7α,7aα-nepetalakton (70.4%), 4aα,7α,7aβ-nepetalakton (6%) i 4aα,7β,7aβ-nepetalakton (2.5%) pokazuje antimikrobnu aktivnost na pet testiranih vrsta bakterija i sedam testiranih vrsta gljiva, od čega na 44 soja Staphylococcus aureus rezistentnih na meticilin, kao i aktivnost protiv respiratornih bakterija i bakterija koje izazivaju kožne infekcije (Bourel i sar. 1993). Poznato je da etarsko ulje N. camforata i N. argolica ssp. dirphya, koje sadrži 4aα,7α,7aα-nepetalakton i 4aα,7α,7aβ-nepetalakton, pokazuje značajnu baktericidnu aktivnost protiv Helicobacter pylori (Kalpoutzakis i sar., 2001), uzročnika nekih gastrointestinalnih oboljenja. 33 Stereohemija nepetalaktona je veoma značajna za antibakterijsku i antigljivičnu aktivnost, pa tako trans,cis-stereoizomer nepetalaktona pokazuje znatno veću aktivnost protiv H. pylori nego cis,trans-nepetalakton (Kalpoutzakis i sar., 2001). Manja ili veća antimikrobna aktivnost vrsta roda Nepeta se može pripisati razlikama u kvantitativnom i kvalitativnom sastavu etarskog ulja, naročito nepetalaktona. Moguć je takoĎe sinergistički i antagonistički efekat glavnih komponenti etarskih ulja sa jedinjenjima koja su manje zastupljena u biljci. 1.4.3. Alelopatija Opisane hemijske interakcije izmeĎu biljaka, koje mogu imati inhibitorni ili stimulativni efekat na rast drugog učesnika alelopatske interakcije, predstavljaju alelopatiju u užem smislu (Molish, 1937), dok u širem smislu alelopatija predstavlja i hemijsku komunikaciju izmeĎu mikroorganizama, izmeĎu biljke i mikroorganizama kao i izmeĎu biljaka i insekata (Weir i sar., 2004). Veliki broj prirodnih jedinjenja biljaka mogu biti inhibitori klijanja semena, rastenja i razvića drugih billjnih vrsta u njihovom okruženju. Rice i saradnici (1984) navode derivate cimetne kiseline kao inhibitore klijanja i rasta, drugi autori navode kumarine, flavonoide, alkaloide, cijano-glikozide, proteine i amino kiseline kao inhibitorna jedinjenja (Friedman i Waller, 1983, Putnam, 1985, Waller, 1989). Listi alelohemikalija se mogu dodati i terpenoidi, posebno monoterpenoidi, isparljive komponente etarskih ulja, za koje je primećeno da pokazuju inhibitorni efekat na klijanje i rast klijanaca drugih biljnih vrsta (Muller i Muller, 1964, Fisher, 1986., Muller, 1986, Abrahim i sar, 2000, Romagni i sar., 2000, Singh i sar., 2002,2006a, 2006b, Nishida i sar., 2005). Poslednjih godina raste interes za upotrebu prirodnih jedinjenja u kontroli rasta korovskih vrsta. Herbicidi, koji se u poljoprivrednoj praksi široko koriste za suzbijanje neželjenih korovskih biljaka, predstavljaju veliki problem za ljudsko zdravlje i životnu sredinu sa obzirom na činjenicu da uzrokuju poremećaj ekološkog balansa. Prirodna jedinjenja sa alelopatskim dejstvom uglavnom predstavljaju produkte sekundarnog metabolizma i nazivaju se alelohemikalije. Alelohemikalije su bezbednije od sintetičkih herbicida u prvom redu zato što su biorazgradive i imaju minimalan štetan uticaj na životnu sredinu (Topal i Kocaçalişkan, 2006). 34 Biljke oslobaĎaju alelohemikalije u okolnu sredinu na nekoliko načina. Isparljiva jedinjenja se oslobaĎaju sa površine listova u atmosferu, dok se neisparljive alelohemikalije izlučuju preko nadzemnih delova biljke, oslobaĎaju eksudacijom preko korena, ili dospevaju u životnu sredinu nakon raspadanja biljnih ostataka (Singh i sar., 2003, Noguchi i Ino, 2005). Alelohemikalije su prisutne u svim tkivima lista, stabla, korena, cveta, pupoljaka (Weston i Duke, 2003) i mogu imati štetno/inhibitorno dejstvo na rastenje i razviće biljnih vrsta u njihovom okruženju. U nekim slučajevima alelohemikalije mogu imati i stimulativni efekat na klijanje semena, rastenje i razviće drugog učesnika alelopatske interakcije. MeĎutim, u većini slučajeva alelopatske interakcije su toksične, izazivaju alelopatski stres i u ekstremnim slučajevima smrt vrste na koju deluju alelohemikalije (Weston i Duke, 2003, Mutlu i Atici, 2009). Slično kao kod drugih vrsta stresa, ROS se oslobaĎaju i za vreme alelopatskog stresa (Meloni i sar., 2003, Singht i sar., 2006a, Ding i sar., 2007, Mutlu i sar., 2011). 1.4.3.1. Monoterpenoidi kao alelohemikalije Jedan od najpoznatijih i najviše ispitivanih primera alelopatije je takozvani „Salvia fenomen“ (Müller, 1964): vrsta Salvia leucophylla u Mediteranskom području utiče na karakterističan izgled vegetacije, koji se odlikuje pojavom da u krugu od tri metra oko jedinki pomenute vrste nema vegetacije, od trećeg do šestog metra se javljaju trave izmenjene morfologije i smanjenog rasta, dok se tek u krugu od šestog do desetog metra javljaju trave normalnog izgleda karakteristične za taj tip vegetacije. U listovima vrste Salvia leucophylla detektovano je prisustvo pet isparljivih monoterpenoida: kamfor, 1,8-cineol, α-pinen, -pinen i kamfen. U laboratorijskim uslovima je pokazano da, kada se pomenuti monoterpenoidi dodaju kao čiste supstance, dolazi do inhibicije klijanja testiranih semena i inhibicije rasta klijanaca. Najtoksičnije dejstvo su pokazali kamfor i 1,8-cineol, čije je prisustvo detektovano u atmosferi oko S. leucophylla. Postoji jasna veza izmeĎu strukture i funkcije monoterpenoida. Pokazano je da svi monoterpenoidi pokazuju manju ili veću alelopatsku aktivnost u zavisnosti od strukture. Tako aciklični alkoholi (nerol, geraniol, linalol), monociklični alkoholi (terpinen-4-ol, α-terpinelol, borneol) i ketoni (karvon, kamfor, menton) imaju veći alelopatski potencijal od aldehida (limonen, terpinen, α i β pinen) (Angelini i sar., 2003). 35 Male strukturne razlike mogu takoĎe značajno uticati na aktivnost bioaktivnih jedinjenja. PoreĎenjem alelopatskog potencijala 1,4-cineola i 1,8-cineola pokazano je da veće inhibitorno dejstvo na klijanje i rast klijanaca test vrsta ima 1,8-cineol. Sa obzirom da se oba monoterpenoida uglavnom javljaju zajedno, moguće je i njihovo sinergističko dejstvo u alelopatskim interakcijama (Romagni i sar., 1999). TakoĎe, β-pinen pokazuje značajan alelopatski potencijal dok je alelopatski potencijal α-pinena znatno slabiji (Nishida i sar., 2005). Poznato je da monoterpenoidi svoj fitotoksični efekat ispoljavaju tako što dovode do morfoloških i fizioloških promena kod biljaka na koje deluju. Oksidativni stres može biti jedna od osnovnih posledica negativnog delovanja alelohemikalija (Mutlu i sar., 2011). Singh i saradnici (2006a, 2009) su pokazali da monoterpenoidi iz etarskih ulja nekih alelopatskih biljaka uzrokuju nakupljanje H2O2 u korovskim vrstama na koje deluju. Akumulacija H2O2 u korovskim vrstama pojačava nivo lipidne peroksidacije, što dovodi do povećanja oksidativnog stresa u biljkama, a samim tim i do poremećaja pojedinih metaboličkih procesa u ćeliji. Peroksidacija nezasićenih masnih kiselina u fosfolipidima dovodi do stvaranja malondialdehida (MDA) koji je odgovoran za oštećenja ćelijskih membrana (Maness i sar., 1999, Xu i sar., 2006). Poznato je da H2O2 ometa funkciju enzima koji sadrže –SH grupu, narušava fotosintetičku aktivnost u hloroplastima i usled toga dovodi do redukcije biljnog rasta (Takeda i sar., 1995). MeĎu različitim ROS koje se proizvode u biljkama kao odgovor na stres, H2O2 ima značajnu signalnu ulogu, u veoma malim koncentracijama može da zaštiti ćeliju obezbeĎujući joj povećanu toleranciju na ponovni stres, dok u velikim koncentracijama izaziva ćelijska oštećenja (Stone i Jang, 2006). S obzirom da su monoterpenoidi lipofilna jedinjenja, postoje brojna tumačenja po kojima monoterpenoidi mogu da uĎu u ćelije prolaskom kroz ćelijski zid i ćelijsku membranu, pri čemu dolazi do narušavanja ćelijske strukture, odnosno, do isticanja kalijuma iz ćelije i do otežanog disanja (Sikemma i sar.,1995, Batish i sar., 1997, Perillo i sar., 1994, Turina i Parillo 2003, Oracz i sar.,2007, Singh i sar., 2009). 36 Neki od poznatih mehanizama delovanja bio-herbicida su 1) inhibicija elektron transportnog lanca fotosistema II (PSII) u hloroplastima- vezujući se na mesto plastokinona u PSII bio-herbicidi zaustavljaju fotofosforilaciju inhibicijom ATPaza (Duke i Dayan, 2005); 2) inhibicija H + -ATPaze plazma membrane i tonoplasta (Cruz- Otega i sar., 1990), 3) inhibicija transporta elektrona u mitohondrijama (Abrahim i sar., 2003); 4) sprečavanje formiranja mikroubula (Gordazlia i sar., 2000) što dovodi do inhibicije mitoze (Vaughan i Vaughn, 1988); 5) izazivanje nakupljanja lipidnih globula u citoplazmi, i sprečavanje proliferacije ćelija korena (Zunino i Zygadlo, 2004, Nishida i sar., 2005). 1.4.3.2. Alelopatski potencijal vrsta roda Nepeta Nepetalaktoni kao glavne komponente etarskih ulja najvećeg broja vrsta roda Nepeta poseduju veliki alelopatski potencijal (Kobaisy i sar., 2005, Jahan i sar., 2006, Mutlu i sar., 2009, 2011, Mancini i sar., 2009, Hyun Eon i sar., 2011). U prirodnim uslovima je primećeno da oko jedinki nekih vrsta roda Nepeta postoji zona inhibicije u kojoj ne rastu druge vrste biljaka karakteristične za taj tip vegetacije. Zona inhibicije predstavlja važan ekološki kontekst za proučavanje alelopatije kod vrsta ovog roda (Mutlu i Atici, 2009). Primećeno je da isparljiva jedinjenja N. fasseni, meĎu kojima su dominantna jedinjenja trans,cis-nepetalakton i cis,trans-nepetalakton, imaju jak inhibitorni efekat na rast klijanaca kresa (Lepidium sativum L.) (Hyum Eom i sar., 2006). Pokazano je takoĎe da 4aα,7α,7aα-nepetalakton deluje fitotoksično na klijanje semena nekoliko korovskih vrsta, kao što su Amaranthus retroflexus L., Bromus danthoniae Trin., Bromus intermedius Guss., Chenopodium album L., Cynodon dactylon L., Lactuca seriola L., Portulaca oleracea L. (Mutlu i sar., 2011). Etarsko ulje N. pannonica, koje kao glavne komponente sadrži 4aα,7α,7aα-nepetalakton i 1,8-cineol, inhibira klijanje nekih korovskih vrsta, i u potpunosti inhibira klijanje semena salate (Kobaisy i sar., 2005). Etarska ulja N. nuda ssp. albiflora i N. curviflora inhibiraju izduživanje radikule klijanaca L.sativum i Raphanus sativus L. (Mancini i sar., 2009). 37 1.5. Opšte odlike rtanjske metvice N. rtanjensis Diklić i Milojević, N. sibirica L. i N. nervosa Royle ex Bentham Rod Nepeta jedan je od najvećih rodova u familiji Lamiaceae, pripada podfamiliji Nepetoideae i tribusu Nepeteae (Takhtajan, 2009). Rod obuhvata oko 300 zeljastih višegodišnjih, reĎe jednogodišnjih vrsta, koje su rasprostranjene u većem delu centralne i južne Evrope, centralne i južne Azije, na Bliskom istoku i u nekim oblastima Afrike (Cantino i sar., 1992). Najveća raznovrsnost i bogatstvo vrsta iz roda Nepeta postoji u jugozapadnoj Aziji, pogotovo u Turskoj i Iranu gde je od 75 vrsta, ovog roda više od 53% endemično. Flora Evrope opisuje 24 vrste roda Nepeta, koje su pretežno rasprostranjene u centralnoj i južnoj Evropi, naročito oko Sredozemnog mora (Turner, 1976). U flori Srbije rod Nepeta prisutan je sa tri vrste: N. cataria L., N. nuda L. (Diklić, 1972) i N. rtanjensis Diklić i Milojević. Slika 12. A-C) Prirodno stanište N. rtanjensis lokalitet Javor (planina Rtanj u jugoistočnoj Srbiji); D) N. rtanjensis E) N. sibirica F) N. nervosa gajene u uslovima staklare. 1.5.1. Nepeta rtanjensis Dikić i Milojević N. rtanjensis je prvi put zabeležena u severoistočnoj Srbiji, na južnim padinama planine Rtanj. Na Slici 12 A B i C prikazano je prirodno stanište rtanjske metvice, dok je na Slici 12 D prikazana rtanjska metvica iz uslova staklenika. Kao nova biljna vrsta za nauku opisana je 1976. godine od strane Nikole Diklića i Bojane Milojević. 38 Ova vrsta je u narodu poznata kao rtanjska metvica. N. rtanjensis pripada mediternansko-submediteranskom / istočnomediteranskom / zapadnomezijskom / rtanjskom flornom elementu. Srodna je taksonima N. camphorata, N. heldreichii, N. parnassica, N. spruneri, N. sibthorpii i N. dirphya, koje spadaju u sekciju Pycnonepeta i N. sibthorpii kompleks. Centar njihovog rasprostranjenja je na krajnjem jugu Balkanskog poluostrva. Jako udaljen i izdvojen areal N. rtanjensis, severno od centra rasprostranjenja ostalih vrsta agregata u Mediteranu, ukazuje na reliktni karakter ove vrste (Diklić, 1999). Stanište N. rtanjensis su otvoreni, zasenjeni i kompaktni kamenjari na visini od 650 do 850 m nadmorske visine. N. rtanjensis je uvršćena u Crvenu Knjigu Flore Srbije i to u kategoriju krajnje ugroženih taksona (CR B 2C), što ukazuje na opasnost da u neposrednoj budućnosti doĎe do njenog iščezavanja iz prirode. Vrsta je kao prirodna retkost zaštićena i zakonom (Sl. Gl. Srbije br. 66/91, 83/92/ i 50/93). N. rtanjensis je višegodišnji polužbun, čije je stablo tupo četvorostrano, visoko do 65 cm. Listovi su sa kratkom drškom, izduženo jajasti ili jajasti, pri osnovi srcasti, tupo nazubljeni. Značajna morfološka osobina N. rtanjensis je indumentum na stablu i naročito na listovima. Čine ga gusto isprepletane različite višećelijske mehaničke dlake i dobro razvijeno egzogeno sekretorno tkivo (žlezdane dlake i sedeće uljane žlezde, prvenstveno na epidermisu naličja lista). Razlikuju se dva tipa dlaka: dugačke, 0,2-1,5 mm, višećelijske sa žlezdanim vrhom ili bez njega i kratke, 0,01-0,08 mm, papilozne koje su vrlo retke u indumentumu (Hussain, 1989). Do 35 cvetova je zbijeno u 4-11 pršljenova. Brakteje su brojne, izduženo lancetaste, gusto prekrivene kratkim dlakama. Čašica je valjkasta, sa 15 nerava, čašičnih zubaca ima pet i svi su jednake dužine. Krunica je beličasta sa sitnim ljubičastim pegama. Cveta od juna do jula, tip oprašivanja je entomofilija. Plodonosi u avgustu i septembru. Plod je bradavičasta orašica jajastog oblika. Rasejavanje je autohorno. Razmnožava se semenima i vegetativno iz odrvenelih donjih delova stabljike. U etarskom ulju N. rtanjensis kao dominantno jedinjenje prisutan je trans,cis- stereoizomer nepetalaktona dok se cis,trans-nepetalakton nalazi samo u tragovima (Chalchat i sar., 2000, Stojanović i sar., 2005). Etarsko ulje vrste N. rtanjensis pokazalo je izrazito antibakterijsko dejstvo na sojeve Staphylococcus aureus (Jovanović- Đurđević, 1986) i može se primeniti putem inhalacije u lečenju infekcija gornjih disajnih puteva izazvanih ovom bakterijom (Jančić i sar., 1995). 39 Kasnije je pokazano antibaktrijsko dejstvo etarskog ulja N. rtanjensis i na druge bakterijske sojeve kao što su Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enteritidis, Echerichia coli i Aspergillus niger (Stojanović i sar., 2005). Etarsko ulje rtanjske metvice pokazuje i jako fungicidno dejstvo (Ljaljević-Grbić i sar., 2007, 2008, 2011a, 2011b). Nedavno je pokazano antifungalno dejstvo N. rtanjensis na humanu patogenu vrstu Bipolaris spicifera (Ljaljević-Grbić i sar., 2011b). 1.5.2. Nepeta sibirica L. N. sibirica je endemična vrsta centralne Azije, Mongolije i južnog Sibira (Letchamo i sar. 2005). Na slici 12 E prikazana je N. sibirica iz uslova staklenika. N. sibirica je zeljasta višegodišnja biljka sa velikim brojem izdanaka dužine do 40 cm. Listovi su na kratkim lisnim drškama, trouglasti, sa izraženom nervaturom i nazubljenih ivica. Cvasti se nalaze na vršnom delu stabljike, čašični listići su trouglasti zašiljenog vrha i pokriveni su žlezdanim dlakama. Krunični listići su plave boje, proreĎeno pokriveni dlakama (Shu, 1994). Oskudna fitohemijska istraživanja vrste N. sibirica ukazuju na to da je dominantna komponenta etarskog ulja cis,trans-stereoizomer nepetalaktona (Letchamo i sar., 2005, de Pooter i sar., 2006). Veoma su malobrojni podaci o biološkoj aktivnosti N. sibirica. Jedino je opisano antimikrobno dejstvo metanolnog ekstrakta N. sibirica (Nestorović i sar., 2010). 1.5.3. Nepeta nervosa Royle ex Bentham N. nervosa je endemična vrsta Kašmira (Blatter, 1928) koja nastanjuje osunčana ili delimično zasenčena mesta. Na slici 12 F prikazana je N. nervosa iz uslova staklenika. Botaničko ime je dobila zbog izraženih lisnih nerava. N. nervosa je višegodišnji polužbun, visine do 60 cm. Na kratkim lisnim drškama su dugački listovi nazubljenih ivica i zašiljenog vrha, dok je površina lista duboko izborana. Cvasti se nalaze na vršnom delu stabljike, krunica je ljubičasto-plave boje. U prirodi se mogu naći i forme sa žutim cvetovima (Shu, 1994). N. nervosa spada u grupu Nepeta koje ne poseduju hemotaksonomski indikator –nepetalakton. Podaci o biološkoj aktivnosti ove vrste nisu dostupni u naučnoj literaturi. Jedino je opisano antimikrobno dejstvo metanolnog ekstrakta N. sibirica (Nestorović i sar., 2010), a ti rezultati su rezultat ove disertacije. 40 2. CILJEVI RADA Glavni cilj ovog rada je ispitivanje biološke aktivnosti N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa koje su u tom pogledu nedovoljno istražene i koje se razlikuju u kvalitativnom i kvantitativnom sadržaju glavnih grupa sekundarnih metabolita (terpenoida i fenolnih jedinjenja). Istraživanja obuhvataju:  uspostavljanje in vitro sistema za propagaciju endemičnih vrsta N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, s ciljem obezbeĎivanja biljnog materijala za potrebe eksperimenata;  fitohemijsku karakterizaciju in vitro gajenih izdanaka tri vrste roda Nepeta, koja uključuje kvalitativnu i kvantitativnu analizu terpenoidnih i fenolnih jedinjenja u metanolnim i dihlor-metanskim ekstraktima, kao i analize isparljivih jedinjenja u atmosferi posude za in vitro gajenje biljaka;  ispitivanje antioksidativnog dejstva metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, etarskih ulja N. rtanjensis i N. cataria, kao i dominantnih fenolnih jedinjenja (ruzmarinska kiselina i hlorogena kiselina), u seriji testova kao što su DPPH, ABTS i FRAP;  ispitivanje antimikrobnog dejstva metanolnih ekstrakata ispitivanih vrsta roda Nepeta na 8 vrsta bakterija i 8 vrsta gljiva;  uspostavljanje eksperimentalnog model sistema ko-kulture in vitro vrsta roda Nepeta i test vrste Lepidium sativum za izučavanje alelopatskog potencijala isparljivih terpenoidnih jedinjenja  ispitivanje alelopatskog potencijala N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa kao i rasvetljavanje mehanizma delovanja alelohemikalija na nivou enzimskih komponenti antioksidativnog sistema (superoksid dismutaze, peroksidaze, katalaze i polifenol oksidaze).  izučavanje alelopatskog efekta etarskih ulja N. rtanjensis i N. cataria, kao i α-pinena i β-pinena, na klijanje odabranih korovskih vrsta i nekoliko poljoprivrednih kultura, s ciljem ispitivanja mogućnosti njihovog korišćenja u poljoprivrednoj praksi kao bioherbicida 41 3. MATERIJAL I METODE 3.1.Biljni materijal Semena Nepeta rtanjensis Diklić i Milojević su sakupljena 2004. godine sa biljaka odgajenih na eksperimentalnoj parceli Instituta za biološka istraživanja „Siniša Stanković“ Univerziteta u Beogradu. Semena su čuvana na -20°C do trenutka upotrebe. Semena N. sibirica L. i N. nervosa Royle ex Bentham su dobijena od botaničke bašte u Esenu, Nemačka. 3.1.1. Uspostavljanje in vitrokulture tri vrste roda Nepeta Površinska sterilizacija je izvršena tretiranjem semena 20% rastvorom komercijalnog izbeljivača (Domestos, Unilever Magyarorszog Kft., MaĎarska) koji sadrži 5% aktivne supstance Na-hipohlorita, tokom 10 minuta. Semena su potom pet puta isprana sterilnom dejonizovanom vodom. Klijanje semena je indukovano 1 mM rastvorom GA3 koji je sadržao i 500 mg l -1 nistatina tokom 24 sata. Nakon ispiranja sterilnom dejonizovanom vodom, površinski sterilisana semena su prebačena na ½ MS hranljivu podlogu (Murashige i Skoog, 1962) koja je sadržala 100 mg l-1myo-inozitola, 20 g l -1 saharoze i 7 g l -1 agara (Torlak, Beograd, Srbija). pH vrednost hranljive podloge je podešena na 5.8 pre sterilizacije na 114°C tokom 25 minuta. Biljke su rasle u staklenim teglama zapremine 350 ml, sa providnim polikarbonatnim zatvaračima i gajene u sobi za rast kultura u uslovima dugog dana (16/8 sati svetlo/mrak), na temperaturi od 252C, i relativnoj vlažnosti vazduha od 60- 70%. Pasažiranje je vršeno svake četvrte nedelje, do trenutka kada je obezbeĎena dovoljna količina biljnog materijala za potrebe eksperimenata. Četiri nedelje od postavke eksperimenta mereni su sledeći parametri: dužina nadzemnog dela izdanka, dužina korena, broj nodusa i aksilarnih pupoljaka po izdanku, procenat ožiljavanja, sveža i suva masa izdanaka. Biljni materijal je osušen na sobnoj temperaturi i čuvan u papirnim kesama do trenutka upotrebe. 42 3.1.2. In vitro ko-kultivacija vrste Lepidium sativum sa tri vrste roda Nepeta Za potrebe analize alelopatskog potencijala tri vrste roda Nepeta, kao test vrsta korišćen je kres (Lepidium sativum L.). Semena kresa su komercijalno nabavljena (Royal Sluis®, Magrovet, MaĎarska). Eksperimentala postavka: Četiri nedelje stari izdanci N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa in vitro su ko-kultivisani sa L. sativum. Svaka eksperimentalna postavka je sadržala od 1 do 9 jedinki neke od vrsta roda Nepeta i po trideset semena L. sativum. Narednih pet dana je praćen efekat isparljivih jedinjena tri vrste roda Nepeta na klijanje i rast klijanaca kresa. S obzirom da je najveći efekat na klijanje i rast klijanaca uočen prilikom ko-kultivisanja sa po devet jedinki Nepeta sp., u daljim eksperimentima su praćene samo te ko-kulture. U drugom tipu eksperimenta su korišćena prethodno isklijana semena, tj. 3 dana stari klijanci kresa, koji su ko-kultivisani sa po 9 jedinki N. rtanjensis, N. sibirica ili N. nervosa, kako bi se razdvojio efekat isparljivih jedinjenja u fazi klijanja semena i onog u ranim fazama razvića klijanaca. 3.1.3. Ispitivanje alelopatskog potencijala etarskog ulja N. rtanjensis, N. cataria, α-pinena i -pinena Ispitan je alelopatski potencijal etarskog ulja N. rtanjensis koje sadrži približno 73% trans,cis-nepetalaktona i etarskog ulja N. cataria koje sadrži 90% cis,trans- nepetalaktona, s ciljem da se utvrdi koji izomer nepetalaktona ima jači alelopatski efekat. TakoĎe je ispitan i alelopatski efekat standarda monoterpenoida: α-pinena i β- pinena (Haarman i Reimer, Južna Afrika). Etarsko ulje N. cataria dobijeno je ljubaznošću dr Michael Birkett (Biological Chemistry and Crop Protection Department, Rothamsted Research, Harpenden, Herts., Velika Britanija). U ovoj analizi korišćena su semena Lactuca sativa L. sorta „Majska kraljica“ (Bioprodukt, Srbija) koja su komercijalno nabavljena. Semena Lotus corniculatus L. sorta „Bokor“ su dobijena iz Centra za poljoprivredna i tehnološka istraživanja (Zaječar, Srbija). Semena Brassica napus L., Stellaria media (L.) Vill. i Rumex crispus L. su sakupljena 2010. godine na širem području Beograda, i dobijena su iz Instituta za pesticide (Zemun, Srbija). 43 Semena Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotip Kolumbija, koja su dobijena od European Arabidopsis Stock Centre, isklijavana su i gajena u stakleniku Instituta za biološka istraživanja „Siniša Stanković“. Semena koja su korišćena u eksperimentu su sakupljena sa biljaka gajenih u stakleniku 2010. godine. Sva semena su čuvana u papirnim kesama, na sobnoj temperaturi do trenutka upotrebe. Eksperimentalna postavka: Etarska ulja i standardi su razblaženi u metanolu (AppliChem, Cheshire, SAD) do finalne koncentracije aktivnih komponenti od 0,13%, 0,26%, 0,53%, 1,07%, 2,15% i 4,3%. Po 15 ml ½ MS hranljive podloge razliveno je na pola sterilne Petri kutije (prečnika 9 cm), dok je u drugoj polovini postavljen sterilni filter papir (1,5 cm x 1,5 cm) koji nije bio u kontaktu sa hranljivom podlogom. Na filter papire je dodato po 30 µl metanolnog rastvora ispitivanog jedinjenja, ili čistog metanola koji je korišćen kao kontrola. Svaka Petri kutija sadržala je po 20 sterilisanih semena. Petri kutije sa biljnim materijalom su hermetički zatvarane parafilmom (Bemis Flexible Packaging, Neenah, SAD) i gajene u sobi za rast kultura u uslovima dugog dana, sa izuzetkom semena A. thaliana koja su po postavci eksperimenta bila u mraku na 4 ○ C tokom tri dana, a zatim prebačena u uslove dugog dana do kraja eksperimenata. Broj proklijalih semena je zabeležen najranije dva a najkasnije devet dana od početka eksperimenta, u zavisnosti od vrste semena. 3.2. Skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) Skenirajuća elektronska mikroskopija omogućava istraživanje finih detalja posmatranih struktura. SEM nudi mogućnost uveličanja od 10 do čak 500 000 puta, а skeniranjem preparata slika se oblikuje otkrivanjem elektrona koji su se odbili o spoljašnju površinu posmatranog preparata. Na skenirajućem elektronskom mikroskopu (JSM-6390, JEOL, SAD) bez prethodne fiksacije posmatrano je lice lista tri vrste roda Nepeta koje su gajene u uslovima in vitro, s ciljem analize prisustva i strukture žlezdanih dlaka. TakoĎe, posmatrani su i klijanci L. sativum stari 18 i 24 sata. 44 3.3. Fitohemijske analize N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa gajenih in vitro 3.3.1. Analiza isparljivih jedinjenja u kulturi in vitro tri vrste roda Nepeta 3.3.1.1. „Headspace“ GC-MS kvalitativna analiza sadržaja isparljivih jedinjenja Sakupljanje isparljivih jedinjenja tri vrste roda Nepeta koje su rasle u uslovima in vitro uraĎeno je čeličnim Tenax kolonama (Ultra, Markes, Lantrisant, Velika Britanija), dimenzija 89 mm x 66,4 mm. Priprema kolona za analize uraĎena je zagrevanjem na 280 0 C tokom 40 minuta, na struji azota od 20 psi (TC 20 multi-tube conditioner, Markes International Limited, Velika Britanija). Izdanci tri vrste roda Nepeta su postavljeni u male boce koje sadrže vodu kako bi se izbegla njihova dehidratacija, i potom ubačeni u staklene tegle zapremine 2 l. Sakupljanje isparljivih jedinjenja u Tenax kolonama je izvršeno tokom dva sata, uz konstantan protok vazduha kroz tegle od 90 ml min-1. Nakon dva sata, a neposredno pre GC-MS analize, kolone su osušene tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi, na struji azota od 30 psi. GC-MS analiza je uraĎena na gasnom hromatografu Termo Trace GC Ultra koji je povezan sa masenim spektrometrom (ThermoFisher Scientific, SAD), na ZB-5MSI koloni dimenzija 30 m x 60,25 mm i debljine filma 1,00 mm (Zebron, Phenomenex). Helijum je korišćen kao noseći gas a brzina protoka je podešena na 50 ml min-1. Temperatura injektora je postepeno povećavana od 40○C do 280○C, brzinom 10○C u minuti i potom održavana na 2800C. Skenirane su mase u opsegu m/z 33 do 280, sa vremenom skeniranja od 4,2 scan s -1 . Identifikacija jedinjenja uraĎena je masenospektrofotometrijski i preko Kovačevih indeksa, poreĎenjem sa bazama masenih spektara (NIST/Wiley) i raspoloživih literaturnih podataka. Za upravljanje instrumentom i analizu podataka korišen je Xcalibur softwer (ThermoFisher Scientific, SAD). 45 3.3.1.2. PTR-MS (eng. Proton Transfer Reaction-Mass Spectrometry) kvantitativna analiza Detekcija isparljivih jedinjenja u atmosferi, na osnovu njihovih masa i relativna kvantifikacija na osnovu jačine signala, uraĎena je na standardnom PTR-MS ureĎaju (Ionicon, Analytik, Innsbruck, Austria), koji nudi mogućnost detekcije isparljivih jedinjenja u veoma malim koncentracijama (prag detekcije je 30 pptv = 30 x 10 -12 mol/mol), bez pripreme uzoraka i hromatografije. Isparljiva jedinjenja su jonizovana protonom iz H3O + , tako da maseni spektrometar detektuje molekulsku masu u pozitivnom modu M+1+. Analiza koncentracije nepetalaktona (m/z 167) u atmosferi posuda u kojima su gajene N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa izvršeno je tokom 20 ciklusa, na svakih 10 sekundi. Pritisak u reakcionoj komori je podešen na 2,19 mbar, a u detekcionoj komori na 3,5 x 10 -5 mbar. Zagrevanje inleta i drift cevi vršeno je na 60○C, dok je odbrojavanje H3O + jona bilo 3,37 x 10 6 cps. 3.3.2. Fitohemijska karakterizacija isparljivih jedinjenja u metanolnim i dihlor- metanskim ekstraktima izdanaka N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa gajenih in vitro Priprema metanolnih ekstrakata tri vrste roda Nepeta: Nadzemni delovi tri vrste roda Nepeta koje su gajene u uslovima in vitro, osušeni su na temperaturi od 300C, do konstantne mase. Nakon mehaničkog usitnjavanja biljnog materijala, odmereno je po 250 mg svakog uzorka. Uzorci, kojima je dodato po 10 µl internog standarda geraniola (Harmman Reimer, Nemačka), ekstrahovani su sonifikacijom u trajanju od 20 minuta, u 10 ml 99,8% rastvora metanola (AppliChem, Cheshire, CT), posle čega su profiltrirani u normalne sudove zapremine 10 ml. Nakon podešavanja zapremine uzorci su profiltrirani kroz 0,2 µm celulozne filtere (Agilent Technologies, Santa Clara, SAD), i čuvani na - 20 ○ C do trenutka analiza. Za potrebe UHPLC-DAD-MS/MS analize, uzorci su pripremljeni po istom protokolu, ali bez dodatka internog standarda. 46 Priprema dihlor-metanskih ekstrakata tri vrste roda Nepeta: Nadzemni delovi tri vrste roda Nepeta (100 mg) su usitnjeni u tečnom azotu i ekstrahovani u 600 µl dihlor- metana (CH2Cl2), koji je sadržao 40 µg ml -1 cis-nerolidola (Sigma-Aldrich, Nemačka) kao internog standarda. Nakon 20 minuta sonifikacije, uzorci su centrifugirani na 3000 g tokom 20 minuta. Supernatant je dehidratisan anhidrovanim natrijum sulfatom (Na2SO4) i tako dobijen filtrat je korišćen za GC-MS analizu. Uzorci su čuvani na -20 ○ C do trenutka analize. 3.3.2.1. GC-MS i GC-FID analiza metanolnih ekstrakata i etarskog ulja N. rtanjensis (Gasna hromatografija sa masenom spektrometijom i gasna hromatografija sa plameno jonizujućim detektorom eng. Gas Chromatography Flame Ionization Detector) Izolacija etarskih ulja: Biljni material za potrebe izolacije etarskih ulja vrste N. rtanjensis je prikupljen 2009. godine na eksperimentalnoj parceli Instituta za biološka istraživanja „Siniša Stanković” Univerziteta u Beogradu. Nadzemni delovi biljaka u fazi cvetanja su osušeni do konstantne mase i iskorišćeni za izolaciju etarskih ulja metodom hidrodestilacije tokom 2 sata u Clevenger aparaturi, kao što je ranije opisano (Ljaljević Grbić i sar., 2008). Kvalitativna i kvantitativna analiza uzoraka metanolnih ekstrakata izdanaka vrsta N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa kao i etarskog ulja N. rtanjensis vršena je gasnohromatografski uz korišćenje dva tipa detektora. GC-FID analiza metanolnih ekstrakata uraĎena je na HP-5890 Series II gasnom hromatografu (Hewlett-Packard, SAD), koji je opremljen „split-splitless“ injektorom povezanim sa HP-5 kolonom (25 m x 0,32 mm, debljine filma 0,52 µm) i plameno jonizujući detekorom (FID). Kao noseći gas korišćen je vodonik, a brzina protoka je bila 1 ml u minutu. Temperatura injektora iznosila je 250 ○ C, detektora 300 ○ C, dok je temperatura kolone rasla u linarnom režimu temperaturnog programiranja od 40-260 ○ C (u intervalima 4 ○ C u minuti), a zatim održavana izotermski tokom narednih 10 minuta. Isti analitički uslovi korišćeni su i za potrebe GC/MS analize raĎene na Hewlett-Packard HP-G1800C Series II GCD analitičkom sistemu, s tim što je korišćena HP-5MS kolona (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) i što je kao noseći gas korišćen helijum. 47 Temperatura transfer linije iznosila je 260°C. Maseni spektri snimani su u EI režimu (70 eV), u opsegu m/z 40-400. U svim slučajevima metanolni rastvori (1 µl) injektirani su u splitless režimu rada inleta. Identifikacija pojedinačnih komponenti vršena je masenospektrometrijski i preko Kovačevih indeksa, uz korišćenje različitih baza masenih spektara (NIST/Wiley), različitih načina pretrage (PBM/NIST/AMDIS) i raspoloživih literaturnih podataka (Adams). Procenti površina pikova dobijeni integracijom sa odgovarajućih hromatograma (GC/FID) uzeti su kao osnova za kvantifikaciju podataka. 3.3.2.2. GC-MS analiza (Gasna hromatografija sa masenim spektrometrom eng. Gas Chromatography Mass Spectrometry) dihlor-metanskih ekstrakata Analiza dihlor-metanskih ekstrakata je uraĎena na gasnom hromatografu 7809A (Agilent, SAD), na ZB-5 koloni dimenzija 30 m x 0,25 mm, i debljine filma 0,25 µm (Phenomenex, SAD). Helijum je korišćen kao noseći gas a brzina protoka je podešena na 1ml u minutu. Temperatura injektora je postepeno povećavana brzinom od 10○C u minutu i održavana je na 250○C. Gasni hromatograf je bio direktno povezan sa masenim detektorom (5975C, Agilent, SAD). Identifikacija pojedinačnih komponenti vršena je masenospektrofotometrijski i preko Kovačevih indeksa, uz korišćenje različitih baza masenih spektara (NIST/Wiley), različitih načina pretrage (PBM/NIST/AMDIS) i raspoloživih literaturnih podataka. 3.3.2.3. HPLC-UV i HPLC-MS analiza (Tečna hromatografija pod visokim pritiskom sa UV detekcijom i masenom spektrofotometrijom) sadržaja nepetalaktona u metanolnim ekstraktima Analiza sadržaja monotrpenoida, trans,cis-nepetalaktona i cis,trans- nepetalaktona u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis, N. nervosa i N. sibirica uraĎena je po izmenjenoj metodi koju su prvobitno opisali Ganzera i sar. (2001). Metodu sa izmenama su opisali Mišić i sar., 2005a. HPLC analize su uraĎene na Hewlett Packard HPLC sistemu, model 1100 sa UV detektorom. Korišćena je Hypersil BDS-C18 kolona, 125  2 mm sa veličinom partikula od 5 µm. Identifikacija jedinjenja je uraĎena pomoću HP Chemstation hromatografskog softvera (Palo Alto, SAD). 48 Standardni rastvori su pripremljeni rastvaranjem etarskog ulja N. rtanjensis koje je sadržalo 79,89% trans,cis-nepetalaktona i 6,3% cis,trans-nepetalaktona u metanolu (10 µl/10ml metanola). Drugi kalibracioni nivoi su pripremljeni daljim razblaživanjem rastvora u metanolu do željenih koncentracija. U cilju potvrde identifikacije stereoizomera nepetalaktona uraĎena je HPLC-MS analiza metanolnih ekstrakata, korišćenjem izmenjene metode koju su prvobitno opisali Wang i sar. (2007). Analize su uraĎene na Waters Breeze HPLC sistemu (Waters, Milford, SAD) sa EMD 1000 masenim detektorom, u pozitivnom ESI modu. Signali su snimljeni u SIM (eng. Single Ion Mode) modalitetu za nepetalakton m/z M+H+ 167, dok je MS skeniranje jona vršeno u opsegu od 100 do 400 amu. Korišćena je kolona Waters Xterra MS C-18 dijametra 2,1 x 50 mm (dimenzija pora 3,5 µm). Kao mobilna faza korišćeni su 0,1% mravlja kiselina i 30% acetonitril (HPLC čistoće, J.T. Baker, SAD). Mravlja kiselina (A) i acetonitril (B) su eluirani gradijentom prema sledećoj šemi: 30% B (0 minuta), 40% B (2 minuta), 50% B (5 minuta), 60% B (10 minuta), 70% B (20 minuta). Identifikacija pikova je uraĎena pomoću Waters Empower 2 softvera (Waters, Milford, SAD), na osnovu standarda. 3.3.2.4. UHPLC/DAD/+HESI-MS/MS analiza (Tečna hromatografija pod ultra visokim pritiskom sa UV detekcijom i MS/MS masenom spektrofotometrijom) nepetalaktona u metanolnim ekstraktima Hromatografsko razdvajanje metanolnih ekstrakata je uraĎeno na Dionex Ultimate 3000 UHPLC sistemu (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Nemačka) u čijem se sklopu nalazi binarna pumpa, vakuum degaser, termostat za kolone, auto-sempler i UV/VIS detektor (DAD, eng. diode array detector). UHPLC sistem je konfigurisan sa triple-quadrupole masenim spektrofotometrom (TSQ Quantum Access MAX, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Nemačka) sa elektron sprej jonizacijom (HESI, eng. heated electro spray ionization). Hromatografsko razdvajanje je uraĎeno na Hypersil gold C18 koloni dimenzija 50 x 2,1 mm, sa česticama veličine 1,9 μm (Thermo Fisher Scientific, SAD). 49 Mobilna faza se sastojala od 0,1% rastvora mravlje kiseline (A) i acetonitrila (B), a uzorci su eluirani prema sledećem gradijentu: 5-20% B u prva 3 minuta; 20–40% B od 3 do 5 minuta, 40-50% B od 5 do 7,5 minuta, 50–60% B u periodu od 7,5-8,5 minuta, 60–95% B od 8,5 do 10,5 minuta, 95% B do 11,5 minuta, 95% do 5% B od 11,5 do 12 minuta, i na kraju 5% B do 15 minuta. Protok je podešen na 0,4 ml min-1 a talasne dužine na 225, 260 i 320 nm. Sve analize su uraĎene korišćenjem rastvora MS kvaliteta (Fisher Scientific, Leics, Velika Britanija). Kolona je termostatirana na 30C, dok je injekciona zapremina bila 2 μl. Za kontrolu UHPLC instrumenta korišćen je Chromeleon Xpress softver (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Nemačka). Temperatura jonske probe (eng. vaporizer temperature) masenog spektrofotometra podešena je na 350°C. HESI proba je podešena na sledeće parametre: voltaža 4000 V, pritisak nosećeg gasa (N2) 50 AU (arbitrarne jedinice; eng. arbitrary units), pritisak gasa u jonskom izvoru 0 AU, pritisak auksilarnog gasa 20 AU, temperatura kapilare 270°C, podešavanje jonskih sočiva 0 V. Podaci dobijeni na masenom spektrofotometru su praćeni u pozitivnom modalitetu u opsegu m/z od 100 do 1000. U eksperimentima fragmentacije, disocijacija molekula je indukovana kolizijom (CID, eng. collision-induced dissociation), pri čemu je energija kolizione ćelije podešena na 30 eV. U PIS (eng. product ion scanning) eksperimentima, MS/MS produkt joni su dobijeni disocijacijom odabranih jona prekursora u kolizionoj ćeliji triple- quadrupole masenog spektrofotometra (Q2), a njihove mase su analizirane u Q3 kvadrupolu instrumenta. U NLS (eng. neutral loss scanning) eksperimentima Q1 i Q3 kvadrupoli zajedno skeniraju parove jona koji se razlikuju u karakterističnim neutralnim masama-masama koje se ne jonizuju i usled toga ih nije moguće detektovati kvadrupolima. SRM (eng. selected reaction monitoring) je najosetljiviji tip analize korišćenog instrumenta koji pokazuje najveću specifičnost za analizirano jedinjenje, i zbog toga se najčešće koristi za apsolutnu kvantifikaciju. Mehanizam SRM eksperimenta se zasniva na odabiru predefinisanih masenih fragmenata, tj. produkt-jona, koji pokazuju najveći intenzitet u PIS eksperimentu. Xcalibur softver (verzija 2.1) je korišćen za kontrolu instrumenta, kao i za prikupljanje i obradu podataka. 50 Cis,trans-nepetalakton i trans,cis-nepetalakton su identifikovani na osnovu njihovih UV, MS i MS/MS spektara, pri čemu je kao standard korišćeno etarsko ulje N. cataria sa unapred utvrĎenim sadržajem oba izomera nepetalaktona (poklon prof. dr Bikett, Harpenden Research, Velika Britannija). Standardi su pripremljeni rastvaranjem etarskog ulja u metanolu, u odnosu 1:200 (v:v). Ostali kalibracioni nivoi su dobijeni daljim razblaživanjem stok rastvora do 1:2000 (v:v). Linerana regresiona analiza kalibracionih kriva je pokazala odličnu linearnost, uz korelacione koeficijente od r=0.9753, p<0.001 za cis,trans-nepetalakton i r=0.9977, p<0.001 za trans,cis- nepetalakton. Kvantifikacija navedenih monoterpenoida u uzorcima je uraĎena na osnovu površine pikova u SRM eksperimentu. Rezultati su predstavljeni kao µg u 100 mg sveže mase uzorka (µg 100 mg -1 ). 3.3.3. Fitohemijska karakterizacija fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima izdanaka N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, kao i klijanaca Lepidium sativum gajenih in vitro Priprema metanolnog ekstrakta L. sativum:.Klijanci kresa (Lepidium sativum L.) stari od jednog do pet dana, koji su rasli u kokulturi sa N. rtanjensis, N. nervosa ili N. sibirica, ekstrahovani su u 99,8% metanolu (AppliChem, Cheshire, CT) (1:10 w/v), tokom 20 minuta, uz sonifikaciju. Ekstrakti su centrifugirani 10 minuta na 10000 g pri temperaturi od +4 o C. Supernatant je profiltriran (0,2 µm celulozne filtere Agilent Technologies, Santa Clara, SAD), alikvotiran i čuvan na -20oC do trenutka upotrebe. 3.3.3.1. Spektrofotometrijsko određivanje količine ukupnih slobodnih fenola Ukupni slobodni fenoli u metanolnim ekstraktima Nepeta, kao i u metanolnim ekstraktima L. sativum su odreĎeni spektrofotometrijski, korišćenjem Folin-Ciocalteu metode (Feldman i Hanks, 1968). Metoda se zasniva na merenju redukujućeg kapaciteta polifenolnih jedinjenja, čijom disocijacijom nastaje proton i fenoksidni anjon, koji redukuje Folin-Ciocalteu reagens do plavo obojenog jona (fenol-MoW11O40) -4 . U 475 µl 5% rastvora natrijum karbonata (Na2CO3) i 475 µl Folin-Ciocalteu reagensa (Sigma Aldrich, SAD) dodato je 50 µl uzorka, nakon čega je sledilo inkubiranje u trajanju od 1 51 sata u mraku, na sobnoj temperaturi. Apsorbanca uzoraka je očitavana na 724 nm (HP Agilent 8453 Spectrophotometer, Agilent Technologies, Santa Clara, SAD), sa po tri ponavljanja po uzorku. Kao standard je korišćena galna kiselina (Sigma Aldrich, Nemačka). Količina ukupnih slobodnih fenola izražena je u mmol ekvivalentima galne kiseline (EGA) po gramu suve mase uzorka za vrste roda Nepeta ili sveže mase uzorka za L. sativum (mmol EGA g -1 ). 3.3.3.2. Spektrofotometrijsko određivanje količine ukupnih flavonoida Ukupni flavonoidi u metanolnim ekstraktima Nepeta kao i u metanolnim ekstraktima Lepidium sativum su odreĎeni spektrofotometrijski, po metodi koju su opisali Karadeniz i sar., (2005), sa malim izmenama. 100 µl biljnog ekstrakta i 550 µl ddH2O je pomešano sa 40µl 5% kalijum nitrita (KNO2). Smeša je inkubirana 6 minuta na sobnoj temperaturi, zatim je dodato 70 µl aluminijum-hlorid heksa-hidrata (AlCl3 x 6H2O). Posle 5 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi i dodavanja 240 l 1 M rastvora natrijum hidroksida (NaOH) očitana je apsorbanca uzorka na 510 nm, po tri ponavljanja za svaki uzorak. Koncentracija ukupnih flavonoida za svaki uzorak je izračunata iz kalibracione krive rutin hidrata (Sigma, Aldrich, Nemačka). Rezultati su izraženi u mmol ekvivalenata rutina (RE) po gramu suve mase uzorka za vrste roda Nepeta ili sveže mase uzorka za L. sativum (mmol RE g-1). 3.3.3.3. Kvalitativna i kvantitativna UHPLC/DAD/+HESI-MS/MS i UHPLC/DAD/-HESI-MS/MS analiza sadržaja fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima tri vrste roda Nepeta i L. sativum UHPLC i MS uslovi analiza su bili isti kao što je ranije opisano za analize nepetalaktona u metanolnim ekstraktima. Za kvalitativnu analizu fenolnih jedinjenja korišćeni su različiti tipovi (modaliteti) skeniranja, uključujući FS, PIS, SRM i NLS. Skeniranje jona uraĎeno je u pozitivnom i u negativnom modu, u opsegu m/z od 100 do 1000. Ruzmarinska kiselina (RK), hlorogena kiselina (HK) i kafeinska kiselina (KK) su identifikovane na osnovu njihovih UV, MS i MS/MS spektara, kao i korišćenjem odgovarajućih rastvora standarda (Sigma Aldrich, Nemačka), pripremljenih u metanolu, u odnosu 1:1 (w/v). Stokovi standarda su razblaženi do koncentracije 20 μg ml-1. Kalibracioni nivoi su dobijeni injektiranjem različitih zapremina rastvora standarda. 52 Linerana regresiona analiza kalibracionih kriva je pokazala odličnu linearnost, uz korelacione koeficijente od r=0.9936, p<0.001 za RK, r=0.9753, p<0.001 za HK i r=0.9977, p<0.001 za KK. Kvantifikacija RK, HK i KK u svakom uzorku je uraĎena na osnovu površine pikova u SRM eksperimentu. Rezultati su predstavljeni kao µg u 100 mg sveže mase uzorka (µg 100 mg-1SM). Usled nedostupnosti standarda nekih jedinjenja od interesa u našim istraživanjima, njihova identifikacija je uraĎena poreĎenjem dobijenih UV, MS i MS/MS spektara sa literaturnim podacima, ali i na osnovu fragmentacionih profila sličnih jedinjenja. Takav je slučaj sa derivatima sinapične kiseline kod klijanaca Lepidium sativum: sinapoil-glukoza, sinapoil-holin, sinapoil-malat i sinapaldehid. Praćena je dinamika u promeni sadržaja ovih jedinjenja tokom 5 dana rastenja i razvića klijanaca. Rezultati su predstavljeni kao relativna količina jedinjenja (RA, eng. relative abundance) u 100 mg sveže mase uzorka (RA 100 mg-1SM). 3.4. Određivanje antioksidativne aktivnosti metanolnih ekstrakta tri vrste roda Nepeta, etarskog ulja (N. rtanjensis i N. cataria), ruzmarinske i hlorogene kiseline Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata nadzemnog dela N. rtanjensis, N. sibirica i N.nervosa ispitivana je DPPH testom, ABTS +. radikal katjon metodom i Fe 3+ /Fe 2+ redoks kapacitet (FRAP) testom. TakoĎe je ispitan antioksidativni potencijal etarskog ulja N. rtanjensis koje sadrži 73% trans,cis-nepetalaktona, etarskog ulja N. cataria koje sadrži 90% cis,trans-nepetalaktona, α-pinena i β-pinena, kao i dominantnih fenolnih jedinjenja, ruzmarinske i hlorogene kiseline koja su prisutna kod vrsta koje su korišćene u eksperimentu. 3.4.1. Određivanje antioksidativne aktivnosti DPPH metodom DPPH radikal (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) je stabilan radikal sa maksimumom apsorpcije na 517 nm. Reakcijom antioksidanasa, stabilni DPPH . radikali se transformišu u 1,1-difenil-2-(2,4,6-trinitrofenil)-hidrazin. Antioksidanti, donori vodonika u reakciji sa DPPH . radikalima vrše njihovu redukciju do žuto obojenog difenil-pikrilhidrazina, što dovodi do smanjenja apsorbance na 517 nm. Nivo obezbojenosti rastvora DPPH . radikala ukazuje na kapacitet vezivanja radikala, odnosno potencijal antioksidativnih jedinjenja da redukuju DPPH . . 53 DPPH test je uraĎen po metodi koju su prvobitno opisali Brand-Williams i sar., (1995). Reakciona smeša se sastojala od 500 µl 200 µM 1,1-difenil-2-pikrilhidrazila (Sigma Aldrich, Nemačka) rastvorenog u metanolu, 30 µl uzorka i 470 µl metanola. Reakciona smeša je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi, u mraku, da bi se odigrala reakcija redukcije DPPH . radikala. Stepen redukcije DPPH . radikala je odreĎen merenjem apsorbance na 517 nm, uz tri ponavljanja za svaki uzorak. Kao standard je korišćen derivat vitamina E rastvorljiv u vodi - troloks, tj. 6- hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhroman-2-karboksilna kiselina (Sigma Aldrich, Nemačka). Rezultati su predstavljeni na sledeći način: a.) DPPH „skevendžing“ aktivnost Računa se prema sledećoj formuli i predstavljena u procentima: DPPH „skevendžing“ aktivnost= 1001 517 517                 blank uzorak A A gde je A517blank – apsorbanca kontrole, koja je pripremljena tako što je umesto biljnog ekstrakta u reakcionu smešu dodata ista zapremina metanola. b.) TEAC (antioksidativni kapacitet ekvivalenata troloksa) izračunat iz standardne krive za troloks i izražen kao mmol ekvivalenta troloksa po gramu suve mase uzorka (mmol TE g -1 ). c.) IC50 IC50 predstavlja koncentraciju uzorka koja je potrebna za neutralizaciju 50 % DPPH radikala. Vrednosti su izražene kao redukujuća aktivnost ekvivalenta troloksa u mmol po gramu suve mase uzorka (mmol TE g -1 ). 3.4.2. ABTS +. radikal katjon metoda ABTS +. (2,2'-azinobis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kiselina) radikalski katjon test je spektrofotometrijska metoda koja je široko u upotrebi prilikom odreĎivanja antoksidativne aktivnosti velikog broja jedinjenja. Primenljiv je kako za lipofilna, tako i za hidrofilna jedinjenja. 54 Ispitivanje antioksidativne aktivnosti ABTS +. radikal katjonskom metodom se zasniva na kolorimetrijskom merenju stepena obezbojavanja ABTS +. radikala u prisustvu antioksidanasa. ABTS +. radikalski katjon se dobija oksidacijom ABTS sa K2S2O8 (kalijum persulfat) pre dodavanja antioksidanasa. Relativno stabilan ABTS +. radikal je zelene boje i kvantifikuje se spektrofotometrijski na 734 nm. ABTS test je uraĎen po metodi koju su prvobitno opisali Re i sar., (1999). ABTS +. je dobijen inkubacijom 7 mM vodenog rastvora ABTS (Sigma Aldrich, Nemačka) sa 2,45 mM K2S2O8, tokom 16 sati u mraku, na sobnoj temperaturi. Za merenje antioksidativne aktivnosti rastvor dobijenog ABTS +. je razblažen 80% etanolom u odnosu 1:40 i ekvilibrisan na 30 ○ C da bi se dobio rastvor čija je absorbanca 0,70±0,02. Reakciona smeša se sastojala od 970 µl ABTS rastvora i 30 µl uzorka. Smeša je inkubirana 10 minuta na sobnoj temperaturi u mraku, da bi se odigrala reakcija, a zatim je izmerena absorbanca na 734 nm. Kao standard korišćen je troloks. Sva merenja su ponovljena tri puta. Rezultati su predstavljeni na sledeći način: a.) ABTS „skevendžing“ aktivnost prema sledećoj formuli ABTS „skevendžing“ aktivnost= 1001 517 517                 blank uzorak A A gde jeA517blank – apsorbanca kontrole, koja je pripremljena tako što je umesto biljnog ekstrakta u reakcionu smešu dodata ista zapremina metanola. Vrednosti su predstavljene u procentima. b.) TEAC (antioksidativni kapacitet ekvivalenta troloksa), izračunat iz standardne krive za troloks i izražen kao mmol ekvivalenta troloksa po gramu suve mase uzorka (mmol TE g -1 ). c.) IC50 predstavlja koncentraciju uzorka koja dovodi do 50 % inhibicije. Vrednosti su izražene kao redukujuća aktivnost ekvivalenta troloksa u mmol po gramu suve mase uzorka (mmol TE g -1 ). 55 3.4.3. Fe 3+ / Fe 2+ redoks kapacitet (FRAP) test FRAP metod se zasniva na sposobnosti antioksidanasa koji su rastvorljivi u vodi da predaju elektron tj. redukuju Fe 3+ u Fe 2+ . Nastali Fe 2+ sa TPTZ reagensom (gvožĎe- 2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazin) stvara plavo obojeni kompleks čija se absorbanca očitava na 593 nm. Reakcija se odigrava u kiseloj sredini (pH 3,6). FRAP test u ovom radu uraĎen je po metodi koju su prvobitno opisali Benzie i Strain (1996). Reakciona smeša se sastojala od 300 mM Na-acetatnog pufera (pH 3,6), 20 mM FeCl3x 6H20 (gvožĎe hlorid heksa hidrat) i 10 mM Fe 3+ -TPTZ (Sigma Aldrich, Nemačka) u odnosu 10:1:1. Fe3+-TPTZ je rastvoren u 40 mM HCl. Svaki uzorak je pripremljen mešanjem 950 µl sveže pripremljenog FRAP reagensa i 50 µl uzorka. Apsorbanca je merena posle 4 minuta, na 593 nm. Sva merenja su ponovljena tri puta. Vodeni rastvor troloksa je upotrebljen za konstrukciju kalibracione krive i rezultati su predstavljeni kao redukujuća aktivnost ekvivalenta troloksa u mmol po gramu suve mase uzorka (mmol TE g -1 ). 3.5. Ispitivanje antimikrobne aktivnosti metanolnog ekstrakta tri vrste roda Nepeta 3.5.1. Priprema ekstrakta Nepeta Metanolni ekstrakti tri vrste roda Nepeta su pripremljeni na isti način kao i za potrebe hemijskih analiza, bez dodavanja internog standarda geraniola. Metanolni uzorci su zatim koncentrovani na 30 0 C u vakuum uparivaču (Eppendorf Concentrator 5301, Hamburg, Nemačka) do suve mase i rastvoreni u 5% DMSO. 3.5.2. Testirani mikroorganizmi U radu su korišćeni mikroorganizmi deponovani u laboratoriji za Mikologiju, Odeljenja za biljnu fiziologiju, Instituta za biološka istraživanja „Siniša Stanković“, Beograd. Testirane su sledeće vrste bakterija: Bacillus cereus (klinički izolat), Escherichia coli (ATCC 35210), Listeria monocytogenes (NCTC 7973), Micrococcus flavus (ATCC 10240), Enterobacter cloacae (klinički izolat), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Salmonella typhimurium (ATCC 13311) i Staphylococcus aureus (ATCC 6538). 56 Korišćene su sledeće mikromicete Aspergillus niger (ATCC 6275), A. versicolor (ATCC 11730), A. flavus (ATCC 9170), A. fumigatus (klinički izolat), Fusarium sporotrichoides (ITM 496), Fulvia fulvum (TK 5318), Penicillium funiculosum (ATCC 11797), P. ochrochloron (ATCC 9112) i Trichoderma viride (IAM 5061). 3.5.3. Testirani antibiotici i antimikotici Korišćeni su antibiotici streptomicin, koji sadrži 1 mg aktivne supstance u 1 ml DMSO (Sigma Aldrich, Nemačka (P7794)), i amoksicilin koji sadrži 500 mg amoksicilin trihidrata u 500 ml DMSO (Panfarma, Beograd, Srbija). Referentne supstance koje su korišćene kao antimikotici su bifonazol (Bicutrin) i ketokonazol. Losion bifonazol sadrži 1 g aktivne supstance u 100 ml razblaženog etanola uz dodatak solubizatora i glicerola (Srbolek, Beograd, Srbija). Ketokonazol sadrži 200 mg ketokonazola u 200 ml DMSO (Hemofarm koncern A.D., Vršac, Srbija). Testirani antibiotici i mikotici su korišćeni kao pozitivna kontrola (1-3500 μg/ml), a 5% DMSO kao negativna kontrola. Testovi su uraĎeni u duplikatu i ponovljeni tri puta. 3.5.4. In vitro testovi za određivanje antimikrobne aktivnosti Za in vitro ispitivanje antimikrobne aktivnosti ekstrakata, korišćena je mikrodilucina metoda, 96- sistem (Hanel i Raether, 1988; Daouk i sar., 1995). Za test organizme odabrano je 8 vrsta bakterija i 8 vrsta gljiva. 3.5.5. Pripremanje prekonoćne kulture bakterija Bakterijski sojevi, čiji su stokovi čuvani u glicerolu, sterilnom špatulom su zasejani u 2 ml TSB hranljive podloge (eng. Tryptic Soy Broth, Biolife, Italija), koje su sadržale 30 g l-1 triptik soje. Podloge su sterilisane 15 minuta na 121 ○ C. Zasejane kulture u duplikatu, zajedno sa kontrolnim TSB epruvetama inkubirane su u termostatu tokom 24 sata, na 37C. Iz prekonoćnih kultura koje sadrže približno 1.0 x 109 ćelija ml-1, uzeto je po 100 l i preneto u mikrotube koje sadrže 900 l hranjive podloge. Tako je dobijena koncentracija od 1.0 x 10 8 ćelija ml-1. Daljim serijskim razreĎenjima dobijaju se željene koncentracije. Za mikrodilucionu metodu je korišćena koncentracija 1.0 x 106 ćelija ml-1. 57 3.5.6. Pripremanje kultura mikromiceta Mikromicete su gajene na MA hranljivoj podlozi (eng. Malt-Agar)u periodu od 21-og dana na 26C. Njihovo čuvanje je vršeno na +4C do trenutka upotrebe (Booth, 1971). MA hranljiva podloga je sadržala 15 g l -1 agara i 50 g l -1 ekstrakta slada. pH vrednost podloge je podešena na 7 pre sterilizacije autoklaviranjem, tokom 25 minuta na 121 ○ C. Inokulum je pripreman spiranjem spora sa površine medijuma, u kulturama starim 21 dan, korišćenjem sterilnog 0.85% rastvora NaCl-a koji sadrži 0.1% Tween 80 (v/v). Suspenzija spora je sterilnim rastvorom NaCl-a dovedena do konačne koncentracije od 1.0 x 105 ćelija ml-1 medijuma. Tako pripremljen inokulum držan je na +4C do upotrebe. Radi provere validnosti inokuluma, kao i odsustva kontaminacije, vršena je inokulacija na čvrstu podlogu (MA). 3.5.7. Metoda mikrodilucije OdreĎivanje minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC) vršeno je serijskim razreĎenjem ekstrakata rastvorenih u DMSO. Tako pripremljeni ekstrakti dodavani su u tečni medijum sa inokulumom. Mikroploče sa inokuliranim gljivama i testiranim ekstraktima su inkubirane 72 sata na 28C, dok su ploče sa bakterijama držane na 37C tokom 48 sata. Najmanja koncentracija na kojoj nije bilo vidljivog rasta mikroorganizama podrazumevana je kao minimalna inhibitorna koncentracija (MIC). Minimalne baktericidne koncentracije (MBC) i minimalne fungicidne koncentracije (MFC) odreĎivane su reinokulisanjem po 2 l u 100 l svežeg tečnog medijuma i inkubirane sledećih 24 sata na 37C u slučaju bakterija i 72 sata na 28C za gljive. Ukoliko nije bilo rasta tj. koncentracija ekstrakata koja ubija 99.5% bakterija/gljiva u odnosu na početni inokulum, uzimane su za MBC ili MFC (CSLI, 2006, Tsukatani i sar., 2012). Na kraju je u mikrotitracione ploče dodato 40 l boje p-jodonitrotetrazolijum violet (2-(4-jodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolijum hlorid) u koncentraciji 2 mg ml -1 H2O (Sigma Aldrich, Nemačka), nakon čega je usledila inkubacija tokom 2 sata na 37C. Mesta koja se nisu obojila su rezultat mikrobicidnog dejstva, a mesta sa bleĎom bojom u odnosu na kontrolu (koja je ljubičaste boje) su rezult mikrobistatičkog dejstva. 58 3.6. Analiza antioksidativnih enzima Lepidium sativum Oksidativni stres je praćen kod klijanaca kresa koji su klijali i rasli u ko-kulturi sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa. Oksidativni stres je praćen od prvog do petog dana rasta u ko-kulturi. Determinacija izoformi enzima (katalaza, peroksidaza, superoksid dismutaza i polifenol oksidaza) vršena je nakon razdvajanja proteina pomoću nativne elektroforeze na poliakrilamidnom gelu (eng. Native PAGE). Razdvajanje proteina je takoĎe izvršeno i denaturišućom eng. SDS-PAGE elektroforezom i ispitano je prisustvo specifičnih proteina eng. Immuno blotting analizom. Gelovi su slikani koristeći Gel-DocTM EQ System (Life Science Research, Bio-Rad Co.). Analiza gelova je raĎena primenom grafičkog paketa ImageJ 1.32j software (W. Rasband, National Institute of Health, SAD). Uzorci su analizirani u 3 ponavljanja. Osim navedenog, raĎena je i spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti ukupnih katalaza, peroksidaza, superoksid dismutaza i polifenol oksidaza. 3.6.1. Ekstrakcija ukupnih proteina Uzorci kresa su mehanički usitnjeni do sitnog praha u tečnom azotu, a zatim homogenizovani u izolacionom puferu (1:3 w/v). Za izolaciju proteina korišćen je 100 mM kalijum fosfatni pufer (pH 6,5) koji je sadržao 20 µl ml-1 koktela inhibitora proteaza (Protease Inhibitor Coctail for Plant Tissue, Sigma-Aldrich, SAD) i 10% (w/v) nerastvornog polivinilpolipirolidona (PVPP, Sigma-Aldrich, SAD). Nakon homogenizacije uzorci su centrifugirani 20 minuta na 15000 g, na temperaturi od +4°C. Koncentracija ukupnih proteina u supernatantu odreĎena je spektrofotometrijski na talasnoj dužini od 595 nm (Bradford, 1976), uz korišćenje BSA (eng. Bowine Serum Albumin) kao proteinskog standarda. 59 3.6.2. Nativna elektroforeza (eng. Native PAGE) Determinacija izoformi enzima vršena je nakon razdvajanja proteina pomoću nativne elektroforeze na poliakrilamidnom gelu (eng. Native PAGE). Uzorcima je dodavan glicerol do finalne koncentracije od 10%. Na gel je nanaošeno 20 μg proteina po uzorku. Za nativnu elektroforezu je korišćen 5% gel za koncentrovanje (eng. stacking gel) i 10% gel za razdvajanje (eng. separating gel), izuzev u slučaju determinacije izoformi katalaza kada je korišćen 7% gel za razdvajanje. Razdvajanje proteina je vršeno tokom 120 minuta na 4°C, u puferu koji je sadržao 25 mM Tris i 192 mM glicin (pH 8.3), korišćenjem Mini-Protein II sistema (Bio-Rad, Richmond, CA), pri čemu je napon podešen na 120 V. 3.6.2.1. Elektroforetska detekcija aktivnosti katalaza (CAT) Za potvrĎivanje katalazne aktivnosti korišćena je metoda koju su prvobitno opisali Woodbury i sar., (1971). Gelovi su nakon nativne elektroforeze preinkubirani 30 minuta u 0,01% rastvoru H2O2 (v/v), a zatim tretirani smešom 2% rastvora kalijum fericijanida (K3Fe(CN)6) i 2% rastvora ferihlorida (FeCl3). U reakciji kalijum fericijanida i ferihlorida nastaje jedinjenje plavo-zelene boje KFe III (Fe II (CN)6). Na mestima na kojima je prisutna katalaza, koja vrši degradaciju H2O2, došlo je do obezbojavanja gela. 3.6.2.2. Elektroforetska detekcija aktivnosti peroksidaza (POD) Za potvrĎivanje peroksidazne aktivnosti korišćena je metoda koju su opisali Jiménez-Atiénzar i sar., (2007) sa odreĎenim izmenama. Gelovi su nakon nativne elektroforeze inkubirani u 50 mM kalijum fosfatnom puferu (pH 6,5) koji je sadržao 10% rastvor 4-hloro-α-naftola (w/v) i 0,03% H2O2 (v/v). Na mestima na kojima je bila prisutna peroksidaza, koja je katalizovala reakciju prenosa elektrona sa 4-hloro-α- naftola na peroksid, pojavile su se tamne trake. 60 3.6.2.3. Elektroforetska detekcija aktivnosti superoksid dismutaza (SOD) Za ispitivanje aktivnosti superoksid dismutaza korišćena je metoda po Beauchamp i Fridovich (1971). Gelovi su inkubirani 30 minuta u mraku, na sobnoj temperaturi, u smeši koja je sadržala 100 mM EDTA (ethylendiaminetetraacetic acid), 0,098 mM NBT (Nitrotetrazolim blue chloride, SigmaAldrich, SAD), 0,03 mM riboflavin i 2 mM TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, SigmaAldrich, SAD) u kalijum fosfatnom puferu (pH 7,8). Nakon inkubacije, gelovi su dobili ljubičastu boju usled formiranja formazana, a na mestima aktivnosti superoksid dismutaza pojavile su se bezbojne trake. Različite SOD izoforme su identifikovane tako što su gelovi inkubirani u rastvoru inhibitora (3 mM KCN ili 5 mM H2O2) pre bojenja. 3.6.2.4. Elektroforetska detekcija aktivnosti polifenol oksidaza (PPO) Za potvrĎivanje aktivnosti polifenol oksidaza korišćena je metoda koju su opisali Jiménez-Atiénzar i sar., (2007) sa odreĎenim izmenama. Gelovi su nakon nativne elektroforeze inkubirani u 0,1% rastvoru pirokatehola (1,2-dihidroksi benzen (Sigma Aldrich, Nemačka)) u 100 mM kalijum fosfatnom puferu (pH 6,5), do pojave tamnih taka. 3.6.3. Spektrofotometrijska analiza enzimske aktivnosti 3.6.3.1. Spektrofotometrijsko određivanje aktivnosti ukupnih katalaza Aktivnost katalaza odreĎena je praćenjem kinetike nestajanja vodonik peroksida (A240 ε=0,0436 mM-1cm-1) u reakcionoj smeši, prema metodi Aebi (1984). Reakciona smeša se sastojala od 340 l reagensa 1 (50 mM K-Na-fosfatni pufer pH 7,0 i 30% H2O2, apsorbanca reagensa 1 na 240 nm je iznosila 0,85 0,02), reagensa 2 (650 l 50 mM K- Na-fosfatni pufer pH 7,0) i 10 l uzorka. Praćena je promena apsorbance reakcione smeše na 240 nm. 61 Aktivnost CAT je merena na svakih 20 sekundi tokom 3 minuta, na temperaturi od 20°C, i izračunata prema jednačini: ΔA - promena apsorbance (min-1 cm-1) – promena apsorbance blank rastvora (min-1 cm-1) VK – zapremina reakcione smeše u kiveti (ml) VE – zapremina uzorka u kiveti (ml) 0,0436 - milimolarni ekstinkcioni koeficijent H2O2 na 240 nm (mM -1 cm-1). 3.6.3.2. Spektrofotometrijsko određivanje aktivnosti ukupnih peroksidaza Aktivnost peroksidaza je izmerena po metodi Jiménez-Atiénzar i sar., (2007). POD aktivnost je merena uz korišćenje pirogalola (A430 ε=2,47 mM -1 cm -1 ) kao elektron- donora. Reakciona smeša je sadržala 10 l uzorka,12,5 l 0,5 mM rastvora H2O2 i 10 l 10 mM pirogalol (Sigma Aldrich, Nemačka) u 968 l 50 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6,5). Oksidacijom pirogalola nastaje smeĎe obojen purpurogalin sa maksimumom apsorpcije na 430 nm. Aktivnost enzima je praćena tokom 3 minuta, pri temperaturi od +20ºC i izračunata je prema jednačini: ΔA - promena apsorbance (min-1 cm-1) – promena apsorbance blank rastvora (min-1 cm-1) VK – zapremina reakcione smeše u kiveti (ml) VE – zapremina uzorka u kiveti (ml) 2,47 - milimolarni ekstinkcioni koeficijent pirogalola na 430 nm (mM-1 cm-1). 62 3.6.3.3. Spektrofotometrijsko određivanje aktivnosti ukupnih superoksid dismutaza Ukupna aktivnost superoksid dismutaza je odreĎena prema metodi Beyer i Fridovich (1987). Reakciona smeša se sastojala od: 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 7,8), 0,1 mM EDTA, 3mM L-metionina, 5mM NBT i 2 mM riboflavina. Reakcija je izazvana izlaganjem reakcione smeše osvetljenju od 30 W pod fluorescentnom lampom, u trajanju od 15 minuta na temperaturi od +20°C. SOD aktivnost je odreĎivana na osnovu kapaciteta ekstrakta da inhibira fotohemijsku redukciju NBT do formazana. Apsorbanca na 540 nm je izmerena pomoću ELISA Micro Plate Reader aparata (LKB 5060-006, Austrija). Aktivnost ukupnih SOD izražena je kao U mg -1 . Jedna SOD jedinica (U) je definisana kao količina enzima neophodna da inhibira 50% NBT u poreĎenju sa smešom bez uzorka proteina i izražava se u odnosu na koncentraciju ukupnih rastvorenih proteina. 3.6.3.4. Spektrofotometrijsko određivanje aktivnosti ukupnih polifenol oksidaza Za odreĎivanje PPO aktivnosti korišćena je metoda koju su opisali Jiménez- Atiénzar i sar., (2007) sa odreĎenim izmenama. Reakciona smeša se sastojala od 50 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6,5), a kao supstrat korišćen je 10 mM rastvor pirokatehola (Sigma Aldrich, Nemačka). Praćena je promena apsorbance na 410 nm, pri čemu se jedinica aktivnosti enzima (U) definiše kao promena apsorbance za 0.001 po minutu u 1 ml reakcione smeše: ΔA - promena apsorbance u (min-1 cm-1) VK – zapremina reakcione smeše u kiveti (ml) VE – zapremina uzorka u kiveti (ml). 63 Sva merenja za spektrofotometrijsko odreĎivanje aktivnosti katalaza, peroksidaza, superoksid dismutaza i polifenol oksidaza su raĎena u 3 ponavljanja. Aktivnost enzima je izražena u odnosu na koncentraciju ukupnih proteina (U mg-1). 3.6.4. SDS-PAGE elektroforeza i imunodetekcija proteina (eng. Immuno blotting) Uzorci su pripremljeni mešanjem ekstrakta ukupnih proteina kresa sa puferom za uzorke u odnosu 1:1 (v:v) (Laemmli, 1970). Pufer za uzorke sadrži 62 mM Tris-HCl (pH 6,8), 2,5% BPB (eng. bromophenol blue), 2% Na-dodecil sulfat (SDS), 10% glicerol i 0,5% β-merkaptoetanol. Uzorci su kuvani 5 minuta na 95°C, nakon čega su ohlaĎeni do 4°C i centrifugirani 3 minuta na 12000 g. Razdvajanje proteina je izvršeno denaturišućom SDS-PAGE elektroforezom, na Mini-Protein II sistemu (Bio-Rad, SAD). Proteini su razdvajani 120 minuta na 200 V. Finalna koncentracija akrilamida u razdvajajućem gelu bila je 10% (w:v), a u gelu za koncentrovanje 5% (w:v). Na gelove su nanošene jednake zapremine uzoraka sa 20 μg ukupnih proteina. Za odreĎivanje molekulske mase proteina korišćeni su obojeni markeri molekulskih masa 10-260 kDa-Spectra TM Multicolor Broad Range Protein Ladder (Fermentas GmbH, Nemačka). Razdvajanje proteina je paralelno vršeno na dva gela. Jedan je korišćen za bojenje ukupnih proteina na gelu. Bojenje proteina je izvršeno inkubiranjem gela u rastvoru boje eng. Coomassie Blue tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega je gel obezbojavan u PDS rastvoru (eng. Protein Destaining Solution), koji sadrži 15% metanola (v/v) i 7% glacijalne sirćetne kiseline (v/v). Drugi gel je iskorišćen za Immuno blotting analizu. U imuno blot proceduri, proteini su sa 10% poliakrilamidnog gela prenošeni na nitroceluloznu membranu (Bio-Rad, SAD) u transfer puferu (TB) koji sadrži 25 mM Tris-HCl (pH 8,3) i 192 mM glicin, putem elektrotransfera (Mini Trans-Blot Module, Biorad, SAD). Transfer proteina je vršen na 60 V tokom 1,5 sata. Blotovane membrane su nakon toga preinkubirane preko noći na 4°C, u rastvoru 10% nemasnog mleka u prahu (NFDM: Non fat dry milk, Nestle, SAD) u T-PBS puferu (PBS buffer + 0,05% Tween-20). PBS pufer (eng. Phosphate-Buffered Saline) sadrži 80 g l-1 NaCl, 2 g l-1 KCl, 37,2 g l -1 Na2HPO4×12H2O i 2,4 g l -1 KH2PO4. Sledećeg dana su membrane inkubirane sa primarnim antitelom, tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, uz blago mešanje. Primarna antitela su rastvorena u T-PBS puferu 64 koji je sadržao 5% NFDM. Membrane su zatim ispirane u T-PBS puferu, prema šemi: 2x1 minuta; 1x15 minuta; 3x5 minuta. Sledila je jednočasovna inkubacija membrana sa sekundarnim antitelom, na sobnoj temperaturi. Sekundarno antitelo je rastvoreno u T- PBS puferu koji sadrži 5% NFDM. Detekcija antigenih proteina izvršena je metodom pojačane hemiluminiscencije (eng. Enhanced ChemiLuminescence-ECL). Membrane su inkubirane 5 minuta u 12 ml smeše koja je sadržala 0,2 mM p- kumarnu kiselinu (Sigma Aldrich, St. Louis, SAD), 1,25 mM 3-amino ftalidrazid ("Luminol", Sigma Aldrich, St. Louis, SAD) i 30% H2O2 (v:v) u 100 mM Tris-HCl puferu. Nakon toga, membrane su izložene filmu (Kodak X-Omat LS film,Sigma Aldrich, St. Louis, SAD), u trajanju od 5 minuta. 3.6.4.1. Primarna antitela: Za imunodetekciju PPO korišćena su mišja poliklonalna antitela dobijena imunizacijom eksperimentalnih životinja sa PPO gljiva (Mouse Anti-fungi PPO). Antitela su rastvorena u T-PBS puferu koji je sadržao 5% NFDM, u odnosu 1:500 (v:v). Za imunodetekciju CuZn-SOD korišćena su komercijalna primarna antitela: CSD2 (eng. Anti Rabbit Chloroplastic CuZn Superoxide Dismutase, AS06 170 (Agrisera Antibodies, Švedska)). CSD2 antitela su rastvorena u T-PBS puferu koji je sadržao 5% NFDM, u odnosu 1:10000 (v:v). Za imunodetekciju Mn-SOD, takoĎe su korišćena komercijalna antitela (eng. Anti Rabbit Mn-Superoxide Dismutase AS09 524, Agrisera Antibodies, Švedska), a rastvorena su u puferu istog sastava, u odnosu 1:10000 (v:v). 3.6.4.2. Sekundarna antitela: U radu su korišćena komercijalna sekundarna antitela, koja su konjugovana sa peroksidazom iz rena i rastvorena u T-PBS puferu koji sadrži 5% NFDM, u odnosu 1:20000 (v:v): 1) eng. Goat Anti- Rabbit IgG-HRP (product No. A0545, Sigma Aldrich, St. Louis, SAD); 2) eng. Goat Anti-Mouse IgG-HPR (No. SC 2031, Agrisera Antibodies, Švedska). 65 3.7. Statistička analiza podataka Numerički rezultati su obraĎivani One-Way analizom varijanse (ANOVA test) primenom računarskog programa Statgraphics Centurion XVI. OdreĎivanje statističke značajnosti razlika izmeĎu srednjih vrednosti vršeno je: Fisher’s LSD (least significant difference) testom na nivou značajnosti od p≤0,05. Vrednosti su predstavljene kao srednje vrednosti od tri ponavljanja. Različita slova koja prate numeričke vrednosti ukazuju na statistički značajne razlike. Grafičko predstavljanje rezultata uraĎeno je pomoću računarskog programa Microsoft Office Excel. 66 4. REZULTATI 4.1. In vitro kultura tri vrste roda Nepeta Sterilisana semena tri vrste roda Nepeta uspešno su isklijana na ½ MS hranljivoj podlozi u uslovima in vitro (>70%) (Slika 13A 13B 13C). Dalje umnoţavanje je uraĊeno korišćenjem segmenta stabla sa po jednim nodusom i vršnih delova izdanaka, do obezbeĊivanja dovoljne koliĉine biljnog materijala za dalja istraţivanja. Slika 13. Vrste roda Nepeta iz kulture in vitro. A) Nepeta rtanjensis B) Nepeta sibirica C) Nepeta nervosa. Posle ĉetiri nedelje rasta u kulturi in vitro, primećeneno je formiranje aksilarnih pupoljaka u pazuhu listova na eksplantatima, njihovo izduţivanje, kao i spontano oţiljavanje na podlozi bez regulatora rasta. Spontano oţiljavanje N. rtanjensis i N. nervosa je iznosilo oko 40%, dok je oţiljavanje kod N. sibirica bilo pribliţno 35%. Na izduţenim izdancima formiralo se u proseku od 3 do 5 nodusa. Morfološki parametri koji su beleţeni mesec dana od postavke eksperimenta predstavljeni su u Tabeli 4. 67 Tabela 4. Parametri rastenje i morfogeneza Nepeta rtanjensis, N. sibirica, N. nervosa na ½ MS hranljivoj podlozi sa 20 g l -1 saharoze. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta ± standardna greška. N. rtanjensis N. sibirica N. nervosa Dužina izdanka [mm] 53,67 ± 1,95 51,04 ± 2,30 58,43 ± 2,50 Broj nodusa po izdanku 4,35 ± 0,11 3,26 ± 0,14 4,91 ± 0,14 Broj aksilarnih pupoljaka po izdanku 8,12 ± 0,22 6,35 ± 0,24 9,47 ± 0,28 % ožiljavanja 39,34 34,52 40,99 Sveža masa [g] 0,27 ± 0,07 0,171 ± 0,041 0,134 ± 0,011 Suva masa [g] 0,021 ± 0,001 0,023 ± 0,004 0,012 ± 0,001 Sveža masa/Suva masa 0,124 ± 0,003 0,151 ± 0,001 0,114 ± 0,006 4.2. Analiza žlezdanih struktura površine lista tri vrste roda Nepeta Na elektronskim mikrografijama lica lista tri vrste roda Nepeta sp. koje su rasle u uslovima in vitro, najveće razlike se uoĉavaju u pogledu mehaniĉkih i ţlezdanih struktura. Kod vrste N. rtanjensis uoĉava se da indumentum saĉinjava veliki broj glandularnih i mehaniĉkih trihoma (Slika 14A 14B), kod N. sibirica uoĉene su samo glandularne trihome (Slika 14D 14E 14F), dok se kod vrste N. nervosa uoĉava prisustvo velikog broja mehaniĉkih i samo po koja ţlezdana struktura (Slika 14G 14H 14I). Na semi-elektronskoj mikrografiji N. rtanjensis uoĉene su peltatne i kapitatne glandularne trihome (Slika 14C), dok su od mehaniĉkih trihoma uoĉene trihome sa zaobljenim vrhom (Slika 14A). Kod N. sibirica uoĉene su peltatne glandularne trihome (Slika 14F), a kod N. nervosa je pored peltatnih ţlezdanih trihoma detektovan i veliki broj mehaniĉkih trihoma, uglavnom sa zašiljenim vrhom (Slika 14I). 68 Slika 14. Elektronska mikrografija lista tri vrste roda Nepeta. A-C) indumentum lica lista N. rtanjensis D-F) indumentum lica lista N. sibirica G-I) indumentum lica lista N. nervosa. Skraćenice: KGT- kapitatne glandularne trihome PGT- peltatne glandularne trihome MTOV- mehaniĉke trihome sa zaobljenim vrhom MTZV- mehaniĉke trihome sa zašiljenim vrhom. 4.3. Fitohemijske analize N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa gajenih in vitro 4.3.1. Analiza isparljivih jedinjenja u kulturi in vitro N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa 4.3.1.1. Headspace GC-MS analiza Headspace GC-MS analizom uraĊena je identifikacija i kvantifikacija isparljivih jedinjenja osloboĊenih sa površine listova tri vrste roda Nepeta. Na Slici 15 prikazano je prikupljanje isparljjivih jedinjenja vrsta iz roda Nepeta za potrebe Headspace GC-MS analize. U atmosferi N. rtanjensis, kao dominantno jedinjenje detektovan je trans,cis- nepetalakton (Slika 16A 16G), koji se na GC-MS hromatogramu uoĉava na Rt=19,36 minuta. 69 Na masenom spektru trans,cis-nepetalaktona, koji pokazuje molekularni jon m/z M+H+ od 167 (Slika 16B), uoĉeni su dominantni fragmenti od m/z 166 (intenzitet 100%) i m/z 123 (90%). Pored trans,cis-nepetalaktona, u kulturi in vitro rtanjske metvice identifikovani su i drugi monoterpeni (α-pinen, cis,trans-nepetalakton, α- kopaen) i seskviterpeni (germakren D, -farnezen, δ-kadinen), koji su prisutni u znaĉajno niţim koncentracijama od trans,cis-nepetalaktona (Slika 16F). Rezultati su pokazali da je dominantni monoterpen u atmosferi N. sibirica (Slika 16C 16G) cis,trans- isomer nepetalaktona (Rt=19,84 minuta), koji pokazuje molekularni jon m/z M+H+ od 167 (Slika 16D) i fragment od m/z 166 sa intenzitetom 90%. Od ostalih monoterpena identifikovani su još α-pinen, -pinen, linalol i trans,cis-nepetalakton, ali u znatno niţoj koncentraciji (Slika 16F). Za razliku od N. rtanjensis, kod N. sibirica je detektovana znaĉajna koliĉina seskviterpena -farnezena, α-zingiberena i germakrena D. U atmosferi tegle u kojima je gajena N. nervosa nije detektovan nepetalakton (Slika 16E 16G), dok su ostala isparljiva jedinjenja prisutna u niskim koncentracijama (Slika 16F): α-pinen, -pinen, δ-limonen (monoterpeni), germakren D, -kariofilen i 4,5-di- epi-aristolohen (seskviterpeni). Slika 15. Prikupljanje isparljivih jedinjenja u Tanex kolone za potrebe headspace GC- MS: analize: A) N. rtanjensis B) N. sibirica C) N. nervosa. 70 Slika 16. Headspace GC-MS analiza isparljivih jedinjenja u kulturi in vitro izdanaka N. rtanjensis, N, sibirica i N. nervosa: A) Headspace GC-MS hromatogram isparljivih jedinjenja N. rtanjensis i (B) maseni spektar trans,cis-nepetalaktona (Rt=19,36 minuta); C) Headspace GC-MS hromatogram isparljivih jedinjenja N. sibirica i (D) maseni spektar cis,trans-nepetalaktona (Rt=18,90 minuta); E) Headspace GC-MS hromatogram isparljivih jedinjenja N. nervosa; F) Relativna zastupljenost identifikovanih monoterpena i seskviterpena u atmosferi posuda za in vitro gajenje N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa. Vrednosti su normalizovane u odnosu na 1 g sveţe mase; G) Izdvojen i uvećan region headspace GC-MS hromatograma, u vremenskom intervalu Rt od 19,7 do 19,7 minuta, u kome se uoĉavaju izomeri nepetalaktona. 71 4.3.1.2. PTR-MS analiza Nakon kvalitativne Headspace GC-MS analize i identifikacije isparljivih jedinjenja u kulturi in vitro izdanaka N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, relativna kvantifikacija nepetalaktona u atmosferi posuda u kojoj su gajene biljke uraĊena je PTR-MS analizom. Praćena je koncentracija nepetalaktona na protonovanoj masi m/e M+1+ od 167, pri ĉemu nije bilo moguće razdvajanje izomera nepetalaktona. Izmerene vrednosti izraţene su u ppbV, i ukazuju na koliĉinu date hemijske supstance u bilionitom delu atmosfere. U eksperimentu u kome je praćen efekat koliĉine biljnog materijala na sadrţaj nepetalaktona u atmosferi in vitro kultura, koncentracija nepetalaktona merena je u posudama u kojima su gajene od 1 do 9 jedinki N. rtanjensis, N. sibirica ili N. nervosa. Srazmerno broju jedinki gajenih u posudama za in vitro kulture, raste aktivna površina listova sa koje se oslobaĊaju isparljiva jedinjenja, a samim tim i koncentracija analiziranog monoterpena (Slika 17A 17B). Najveća koncentracija nepetalaktona zabeleţena je u sluĉaju kad je gajeno po 9 jedinki N. rtanjensis ili N. sibirica. U atmosferi posude gde je gajena vrsta N. nervosa nepetalakton je detektovan u tragovima (Slika 17C). Slika 17. Zavisnost koncentracije nepetalaktona (ppbV) u atmosferi posuda za in vitro gajenje biljaka od broja jedinki, tj. koliĉine biljnog materijala: A) N. rtanjensis; B) N. sibirica; C) N. nervosa. Analiza sadrţaja ukupnih nepetalaktona je uraĊena PTR-MS metodom, na protonovanoj masi m/e M+1+ od 167. 72 4.3.2. Fitohemijska karakterizacija metanolnih i dihlor-metanskih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa 4.3.2.1. GC-MS analiza dihlor-metanskih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa Analizom dihlor-metanskog ekstrakta N. rtanjensis gasnom hromatografijom sa masenim spektrometrom, detektovan je monoterpenoid nepetalakton i to trans,cis- stereoizomer (Slika 18A), koji se na hromatogramu uoĉava kao dominantni pik (Rt=19.36 minuta). Maseni spektar nepetalaktona, koji pokazuje molekularni jon na m/z M+H+ od 167 (Slika 18B), pokazuje dominantne fragmente od m/z 166 (intenzitet 100%) i m/z 123 (90%), kao u sluĉaju headspace GC-MS analize. Pored trans,cis- nepetalaktona, detektovane su znaĉajno niţe koliĉine drugih monoterpenoida kao što su α-pinen, α-kopaen, i cis,trans-nepetalakton, ali i male koliĉine seskviterpena, ukljuĉujući germakren D i δ-kadinen (Slika 18F). Na GC-MS hromatogramu dihlor- metanskog ekstrakta N. sibirica na Rt=19,84 minuta detektovano je prisustvo cis,trans- izomera nepetalaktona (Slika 18C). Na masenom spektru cis,trans-nepetalaktona (m/z M+H+ je 167), kao dominantni fragmenti izdvajaju se m/z 123 (100%) i m/z 166 (90%). U dihlor-metanskom ekstraktu N. sibirica detektovano je i prisustvo tragova trans,cis-nepetalaktona, α-pinena i -pinena, a od seskviterpena, germakren D i - farnesen takoĊe u tragovima (Slika 18F). U ekstraktima N. nervosa, u kojima je detektovan cis,trans-izomer nepetalaktona u tragovima (Slika 18E), identifikovano je prisustvo monoterpena α-pinena, -pinena i α-kopaena. Seskviterpeni identifikovani u dihlor-metanskim ekstraktima N. nervosa su α-bisabolen, -farnesen i germakren D. Generalno je koliĉina ispaljivih jedinjenja kod N. nervosa znatno manja nego kod druge dve ispitivane vrste (Slika 18F). 73 Slika 18. GC-MS analiza dihlor-metanskih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa: A) GC-MS hromatogram dihlor-metanskog ekstrakta N. rtanjensis i B) maseni spektar pika na Rt=19,36 minuta, koji odgovara trans,cis- izomeru nepetalaktona; C) GC-MS hromatogram dihlor-metanskog ekstrakta N. sibirica i D) maseni spektar pika na Rt=18,90 minuta, koji odgovara cis,trans-nepetalaktonu; E) GC- MS hromatogram dihlor-metanskog ekstrakta N. nervosa, nepetalakton nije detektovan; F) Relativna zastupljenost identifikovanih monoterpena i seskviterpena u dihlor- metanskim ekstraktima N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa. Vrednosti su normalizovane u odnosu na 1 g sveţe mase; G) Izdvojen i uvećan region GC-MS hromatograma, u vremenskom intervalu Rt od 18,4 do 19,7 minuta, u kome se uoĉavaju izomeri nepetalaktona. 74 4.3.2.2. GC-MS i GC-FID analiza metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa GC-MS analizom je utvrĊeno prisustvo trans,cis-nepetalaktona u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis (Slika 19A), cis,trans-nepetalaktona u metanolnim ekstraktima N. sibirica (Slika 19C), dok je u ekstraktu N. nervosa nepetalakton prisutan u tragovima (Slika 19E). Uoĉeno je jasno hromatografsko razdvajanje dva izomera nepetalaktona na razliĉitim retencionim vremenima. Gasnom hromatografijom sa plamenojonizujućim detektorom, potvrĊeno je prisustvo trans,cis- izomera kod N. rtanjensis (Slika 19B), i cis,trans- izomera nepetalaktona kod N. sibirica (Slika 19D). Kvantifikacijom stereoizomera nepetalaktona u metanolnim ekstraktima zakljuĉeno je da 79,19% trans,cis- i 2,19% cis,trans- stereoizomera ima u ekstraktu N. rtanjensis, dok ekstrakt N. sibirica sadrţi 50,96% cis,trans- i samo 0,76% trans,cis- nepetalaktona. Nepetalakton je u veoma malim koliĉinama (0,87% trans,cis- i 0,18% cis,trans-) kvantifikovan i u metanolnom ekstraktu N. nervosa (Slika 19G). Ako govorimo o ukupnom nepetalaktonu, najveći sadrţaj ovog monoterpena je zabeleţen kod N. rtanjensis. 75 Slika 19. GC-MS i GC-FID analiza metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa: A) GC-MS i B) GC-FID hromatogrami metanolnog ekstrakta N. rtanjensis; C) GC-MS i D) GC-FID hromatogrami metanolnog ekstrakta N. sibirica; E) GC-MS i F) GC-FID hromatogrami metanolnog ekstrakta N. nervosa; G) Relativna zastupljenost stereoizomera nepetalaktona u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa izraţena u % u odnosu na ukupnu koliĉinu isparljivih jedinjenja koja su detektovana u metanolnim ekstraktima. 4.3.2.3. HPLC-DAD i HPLC-MS analiza metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa Sadrţaj nepetalaktona u metanolnim ekstraktima nadzemnog dela N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, odreĊen je i teĉnom hromatografijom pod visokim pritiskom primenom UV detektora. Detekcija razdvojenih pikova uraĊena je na 225 nm (Slika 20). Prilikom kvantitativne HPLC analize korišćeni su standardni rastvori koji su pripremljeni rastvaranjem etarskog ulja N. rtanjensis koje je sadrţalo 79,89% trans,cis- nepetalaktona i 6,3% cis,trans-nepetalaktona u metanolu. Na Slici 20B, 20E i 20H prikazani su hromatogrami metanolnih ekstrakta tri vrste roda Nepeta. Jedinjenja u ekstraktima su identifikovna na osnovu Rt razdvojenih komponenti koja su poreĊena sa 76 Rt standardnog jedinjenja, kao i na osnovu apsorpcionih spektara. Trans-cis- nepetalakton je identifikovan i kvantifikovan u metanolnom ekstraktu N. rtanjensis na retencionom vremenu Rt=10 minuta. Velika koliĉina cis,trans- izomera nepetalaktona je detektovana u metanolnom ekstraktu N. sibirica na retencionom vremenu Rt=8 minuta, dok u metanolnim ekstraktima vrste N. nervosa nepetalaktoni nisu detektovani. Potvrda identifikacije stereoizomera nepetalaktona uraĊena je teĉnom hromatografijom pod visokim pritiskom sa masenom spektrofotometrijom (Slika 20C 20F). Dominantni pikovi koji se javljaju na m/z 167 odnosno 189 odgovaraju masi nepetalaktona uvećanoj za masu vodonika [M+H]+ odnosno masi nepetalaktona uvećanoj za masu natrijuma [M+Na]+. Slika 20. Metanolni ekstrakti A) N. rtanjensis; D) N. sibirica; G) N. nervosa, analizirani HPLC-UV i HPLC-MS metodom. Na HPLC-UV hromatogramu (B) metanolnog ekstrakta N. rtanjensis uoĉavaju se pikovi koji predstavljaju trans,cis-nepetalakton (1) i geraniol (2). Prikazan je maseni spektar trans,cis-nepetalaktona (C) na m/z M+H+ od 167; HPLC-UV analiza metanolnog ekstrakta N. sibirica (E) pokazala je prisustvo cis,trans-nepetalaktona, koji je na hromatogramu obeleţen brojem 3. TakoĊe je prikazan maseni spektar cis,trans-nepetalaktona (F) na m/z M+H+ od 167. Na HPLC- UV hromatogramu metanolnog ekstrakta N. nervosa (H) nije uoĉen nepetalakton. 77 4.3.2.4. UHPLC/DAD/HESI-MS/MS analiza metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa FS UHPLC/HESI-MS spektri su dobijeni kako u pozitivnom, tako i u negativnom modalitetu, korišćenjem UHPLC gradijenta, kao što je opisano u materijalu i metodama. UHPLC/+HESI-MS i UHPLC/-HESI-MS spektralni podaci pokazuju seriju pikova u opsegu m/z od 100 do 1000. Prilikom analize metanolnog ekstrakta N. rtanjensis, na UHPLC/-HESI-MS hromatogramu ukupnih jona su jasno razdvojeni pikovi na Rt 2.39 minuta, 2.58 minuta, 3.02 minuta, 3.63 minuta i 4.83 minuta (Slika 21A), koji su na osnovu standarda identifikovani kao: (1)- hlorogena kiselina (m/z M-H- je 353), (2)- kafeinska kiselina (m/z M-H- je 179), (3)- neohlorogena kiselina (m/z M-H- je 353), (4)-ruzmarinska kiselina 3′-O-β-D-glukozid (m/z M-H- je 521) i (5)-ruzmarinska kiselina (m/z M-H- je 359). Identifikacija je potvrĊena FS, PIS, SRM i NLS eksperimentima. UHPLC/-HESI-MS analiza metanolnog ekstrakta N. sibirica pokazala je prisustvo (1)- hlorogene kiseline, (2)- kafeinske kiseline, (5)- ruzmarinske kiseline i (6)- neidentifikovanog derivata ruzmarinske kiseline (Slika 21 B). U metanolnom ekstraktu N. nervosa, potvrĊeno je prisustvo (1)- hlorogene kiseline, (2)- kafeinske kiseline u tragovima i (5) ruzmarinske kiseline, koja predstavlja dominantnu fenolnu kiselinu (Slika 21C). Kod ove vrste nisu zabeleţeni derivati ruzmarinske kiseline. 78 Slika 21. UHPLC/-HESI-MS (a), UHPLC/+HESI-MS (b) i UHPLC-DAD, =260 nm (c) hromatogrami metanolnih ekstrakata A) N. rtanjensis B) N. sibirica i C) N. nervosa. Identifikovana su jedinjenja: hlorogena kiselina (1), kafeinska kiselina (2), neohlorogena kiselina (3), 3′-O-β-D-glukozid ruzmarinske kiseline (4), ruzmarinska kiselina (5), nepoznati derivat ruzmarinske kiseline (6), trans,cis-nepetalakton (7), cis,trans-nepetalakton (8). 79 Tabela 5. UHPLC/-HESI-MS/MS i UHPLC/+HESI-MS/MS karakterizacija komponenti metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa korišćenjem razliĉitih tipova skeniranja u masenoj spektrofotometriji. Pika Identifikacija -HESI-MS/MS eksperimenti DAD podaci Rt (min) FS M-H- m/z Produkt jon skeniranje MS2 fragmenti (m/z (relativna zastupljenost)) Neutral loss skeniranje Rt (min) max (nm) 1 3-O- kafeoilkininska kiselina (Hlorogena kiselina)s 2,39 353 353 191 (100), 173 (5), 135 (10), 127 (5) 2,33 230,330 2 Kafeinska kiselinas 2,58 179 179 135 (100), 134 (85), 132 (5), 117 (10), 109 (10), 106 (5), 91 (5) 2,52 230,330 3 5-O- kafeoilkininska kiselina (Neohlorogena kiselina)l 3,01 353 353 191 (100), 173 (5), 161 (5), 135 (10), 127 (5) 2,95 230,330 4 Ruzmarinska kiselina 3′-O-β- D-glukozid 3,63 521 521 359 (10), 341 (15), 197 (60), 179 (5), 161 (5), 153 (100) 162 3.57 330 5 Ruzmarinska kiselinas 4,83 359 359 197 (5), 179 (20), 161 (100), 135 (40), 133 (50), 123 (15) 4,76 330 7 Trans, cis- nepetalakton 7,20 167 167 111 (60), 105 (10), 95 (10), 93 (35), 91 (50), 83(15), 81 (15), 79 (50), 77 (100), 69 (5), 67 (10), 65 (20) 7,11 225 8 Cis,trans- nepetalakton 7,07 167 167 111 (5), 105 (10), 95 (5), 93 (15), 91 (55), 81 (25), 79 (55), 77 (100), 69 (5), 67 (15), 65 (10) 6,85 225 a Brojevi pikova, prema Slici 1; sPotvrĊeno standardima; lPotvrĊeno na osnovu literaturnih podataka; Podebljanim slovima su obeleţeni MS2 fragmenti koji su korišćeni u SRM eksperimentu UHPLC/-HESI-MS analiza hlorogene kiseline (C16H17O9) pokazuje molekularni jon m/z M-H- od 353 (Tabela 5). HK u osnovi predstavlja estar kafeinske i kininske kiseline. Na masenom spektru produkt-jona HK uoĉeni su MS2 fragmenti koji su prikazani u Tabeli 5. 80 Fragment od m/z 191 je dominantni fragment (relativna zastupljenost iznosi 100%) i on odgovara elementalnom sastavu C7H11O6 usled gubitka kafeinskog dela. MS/MS fragmentacija ovog jona daje produkt-jon na m/z 173 (5%) usled gubitka molekula vode. Produkt-jon na m/z 135 odgovara elementalnom sastavu C8H7O2, i nastaje zbog gubitka CO2 grupe sa kafeinske kiseline (m/z 179). HK je dalje kvantifikovana u metanolnim ekstraktima tri vrste roda Nepeta izvoĊenjem SRM eksperimenta, u kojim su kao referentni produkt-joni izabrani m/z 191 i m/z 127 (Slika 22b). Neohlorogena kiselina (C16H17O9) pokazuje isti fragmentacioni profil kao hlorogena kiselina u PIS eksperimentu, tako da su u SRM eksperimentu takoĊe korišćeni joni m/z 191 i m/z 127. Kafeinska kiselina (C9H8O4) pokazuje molekularni jon m/z M-H - od 179 (Tabela 5), dok su njeni produkt-joni na m/z 135 (100%), 134 (85%), 117 (10%) i 109 (10%). Fragment od m/z 135 je dominantni fragment i on odgovara elementalnom sastavu C8H7O2 zbog gubitka 44 Da, što se pripisuje gubitku CO2 grupe. MS/MS fragmentacija ovog jona daje produkt-jon na m/z 117 (10%) usled gubitka molekula vode. U SRM eksperimentu, kao referentni produkt-joni praćeni su m/z 134 i m/z 117 (Slika 22c). Ruzmarinska kiselina (C18H16O8), koja u osnovi predstavlja estar kafeinske kiseline i 3,4-dihidroksifenil mleĉne kiseline, pokazuje molekularni jon m/z M-H- od 359. Fragment na m/z 197 nastaje usled gubitka kafeinske grupe sa molekularnog jona M-162-. MS/MS fragmentacija jona m/z 197 daje produkt-jon na m/z 179 usled gubitka molekula vode. Glavni produkt-jon je uoĉen na m/z 161 i on nastaje gubitkom molekula vode sa jona m/z 179 koji odgovara kafeinskom delu ruzmarinske kiseline. Fragment od m/z 135 odgovara elementalnom sastavu C8H7O2 i nastaje nakon gubitka CO2 grupe sa kafeinskog dela molekula m/z 179. RK je dalje kvantifikovana u metanolnim ekstraktima tri vrste roda Nepeta, izvoĊenjem SRM eksperimenta u kome su kao referentni produkt-joni praćeni m/z 161 i m/z 133 joni (Slika 22a). 81 Slika 22. SRM eksperiment za kvantifikaciju HK, KK i RK u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis. HK je kvantifikovana izvoĊenjem SRM eksperimenta u kome su kao referentni produkt joni izabrani m/z 191 i m/z 127 (b). Predefinisani produkt joni u SRM eksperimentima za kvantifikaciju KK bili su m/z 134 i m/z 117 (c), a za kvantifikaciju RK m/z 161 i m/z 133 joni (a). Analiza kvantitativnog sadrţaja HK, KK i RK pokazala je da je RK dominantna fenolna kiselina u metanolnim ekstraktima sve tri ispitivane vrste (Tabela 6). Najveća koliĉina RK je uoĉena kod N. nervosa, sledi N. rtanjensis i na kraju N. sibirica kod koje je prisutna za trećinu manja koliĉina ove fenolne kiseline nego kod N. nervosa. Znaĉajna koliĉina HK prisutna je kod N. rtanjenis, dok je kod N. sibirica, i naroĉito kod N. nervosa detektovana znaĉajno manja koliĉina ovog jedinjenja. 82 Tabela 6. Sadrţaj nekih fenolnih kiselina i nepetalaktona u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa Broj pikova odgovara brojevima oznaĉenim na TIC hromatogramima Prilikom analize metanolnog ekstrakta N. rtanjensis, UHPLC/+HESI-MS hromatogram ukupnih jona pokazuje jasno razdvojen dominantni pik na Rt=7.20 minuta, (Slika 21Ab), koji je identifikovan kao (7)- trans,cis-nepetalakton (m/z M+H+ je 167), monoterpenoid koji je karakteristiĉan za rod Nepeta. Kao standardi za identifikaciju izomera nepetalaktona korišćena su etarska ulja N. rtanjensis i N. cataria sa poznatim kvalitativnim i kvantitativnim sadrţajem nepetalaktona. UHPLC-DAD hromatogram takoĊe pokazuje prisustvo pikova od 1 do 5 i pik 7 u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis. Retenciona vremena i max ovih jedinjenja su prikazani u Tabeli 5. UHPLC/+HESI-MS analiza metanolnog ekstrakta N. sibirica pokazuje prisustvo drugog stereoizomera nepetalaktona u metanolnom ekstraktu. UHPLC/+HESI-MS hromatogram ukupnih jona pokazuje jasno razdvojen dominantni pik na Rt=7.07 minuta, (Slika 21Bb), koji je identifikovan kao monoterpenoid (8)-cis,trans- nepetalakton (m/z M+H+ je 167). U metanolnom ekstraktu N. nervosa UHPLC/DAD/+HESI-MS i UHPLC-DAD analizom nije potvrĊeno prisustvo nepetalaktona. UHPLC/+HESI-MS analiza nepetalaktona (C10H14O2) pokazuje molekularni jon m/z M+H+ od 167. Br. pika Naziv jedinjenja Koncentracija jedinjenja μg ml -1 metanolnog ekstrakta μg 100 mg -1 sveže mase N. rtanjensis N. sibirica N. nervosa 1. Hlorogena kiselina 228,506 7,357 51,752 2. Kafeinska kiselina 6,058 3,827 12,703 5. Ruzmarinska kiselina 296,727 136,980 391,980 7. Trans,cis-nepetalakton 2657,233 / / 8. Cis,trans-nepetalakton / 1777,719 / 83 Na UHPLC/+HESI-MS/MS masenom spektru produkt-jona (Slika 23A), trans,cis- nepetalakton koji je identifikovan kod N. rtanjensis (Rt=7.18 minuta), i cis,trans- nepetalakton, koji je identifikovan u metanolnim ekstraktima N. sibirica (Rt=6.93 minuta), pokazuju isti fragmentacioni profil. MS 2 fragmenti su prikazani u Tabeli 5. U sluĉaju cis,trans-nepetalaktona uoĉen je fragment m/z 111 (55%) koji nastaje gubitkom C4H8 grupe sa molekularnog jona (Slika 5B). Kod trans,cis- izomera (Slika 23C) ovaj fragment je znatno manjeg intenziteta (5%). Dominantan produkt-jon kod oba izomera je m/z 77 (100%), a pretpostavljeni putevi fragmentacije nepetalaktona su predstavljeni na Slici 23B. Slika 23. PIS (eng. product ion scaning) eksperiment za masu m/z 167, koja odgovara molekularnom jonu M+H+ nepetalaktona. Kao standard je korišćeno etarsko ulje T5, sa prethodno definisanim kvalitativnim i kvantitativnim sadrţajem nepetalaktona. UHPLC/+HESI-MS/MS maseni spektri produkt-jona, trans,cis-nepetalaktona (B) i cis,trans-nepetalaktona (C) pokazuju iste fragmentacione profile. Pretpostavljeni putevi fragmentacije oznaĉeni su crvenim strelicama. Diferencijacija izomera nepetalaktona se moţe vršiti na osnovu retencionih vremena i odnosa jona m/z 77 i m/z 111, pa je kvantifikacija nepetalaktona u metanolnim ekstraktima tri vrste roda Nepeta uraĊena izvoĊenjem SRM eksperimenta u kome su kao referentni produkt-joni izabrani upravo m/z 77 i m/z 111 (Slika 24). 84 Slika 24. SRM eksperiment za kvantifikaciju nepetalaktona u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis (a) i N. sibirica (b). Nepetalakton je kvantifikovan izvoĊenjem SRM eksperimenta u kome su kao referentni produkt joni izabrani m/z 77 i m/z 111. 4.3.2.5. Spektrofotometrijsko određivanje ukupnih fenola i flavonoida u metanolnim ekstraktima N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa Koliĉina ukupnih fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima nadzemnog dela tri vrste roda Nepeta koje su gajene u uslovima in vitro odreĊena je spektrofotometrijskom metodom korišćenjem Folin-Ciocalteu reagensa. Dobijene vrednosti izraţene su u ekvivalentima galne kiseline po g suve mase uzorka. Rezultati pokazuju da najveću koliĉinu fenolnih jedinjenja sadrţi ekstrakt N. rtanjensis zatim N. nervosa, dok najmanju koliĉinu fenolnih jedinjenja sadrţi ekstrakt N. sibirica. (Tabela 7). Ukupni flavonoidi u metanolnim ekstraktima Nepeta su odreĊeni spektrofotometrijski, a koncentracija ukupnih flavonoida je dobijena izraĉunavanjem iz kalibracione krive rutin hidrata. Rezultati pokazuju da najveću koliĉinu flavonoida sadrţi ekstrakt N. rtanjensis dok najmanju koliĉinu flavonoida sadrţi ekstrakt N. sibirica (Tabela 7). 85 Tabela 7. Koliĉina ukupnih fenolnih jedinjenja i flavonoida u metanolnim ekstraktima tri vrste roda Nepeta. vrsta N. rtanjensis N. sibirica N. nervosa Ukupni fenoli [mmol EGA g-1] 17,59 b 13,02 a 13,94 a Ukupni flavonoidi [mmol RE g-1] 1,02 c 0,56 a 0,78 b . 4.4. Antioksidativna aktivnost Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata nadzemnog dela N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa koje su rasle u uslovima in vitro, odreĊena je primenom razliĉitih metoda (neutralizacija DPPH. radikala, neutralizacija ABTS.+ radikala i odreĊivanje redukcione sposobnosti). TakoĊe je uraĊena i antioksidativna aktivnost dominantnih monoterpenskih i fenolnih jedinjenja koja su prisutna kod ispitivanih vrsta: α-pinena, β-pinena, etarskog ulja koje sadrţi 73% trans,cis-nepetalaktona (etarsko ulje N. rtanjensis), etarskog ulja koje sadrţi 90% cis,trans-nepetalaktona (etarsko ulje N. cataria) kao i ruzmarinske i hlorogene kiseline. 4.4.1. Antioksidativna aktivnost ispitivana DPPH metodom DPPH antioksidativni test se najĉešće koristi za odreĊivanje sposobnosti sekundarnih metabolita prisutnih u ekstraktima pojedinih biljaka da predaju vodonikov atom slobodnim radikalima. Zbog nesparenih elektrona, molekul DPPH apsorbuje svetlost na talasnoj duţini od 517 nm. Pri sparivanju elektrona u molekulu DPPH pod dejstvom antioksidanasa, apsorpcija na ovoj talasnoj duţini opada. DPPH test se ĉesto primenjuje zbog taĉnosti metode, kao i komercijalne dostupnosti DPPH reagensa. U Tabeli 8 su prikazane IC50 vrednosti (koncentracije potrebne za neutralizaciju 50% DPPH radikala, kao i antioksidativni kapacitet ekvivalenta troloksa (TEAC) ispitivanih metanolnih ekstrakata. 86 Tabela 8. Antioksidativna aktivnost metanolnih ekstrakata nadzemnog dela N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, etarskog ulja koje sadrţi 73% trans,cis- nepetalaktona, etarskog ulja koje sadrţi 90% cis,trans-nepetalaktona, ruzmarinske i hlorogene kiseline. Rezultati su izraţeni kao IC50 vrednost i TEAC. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. Vrsta DPPH . ABTS .+ FRAP N. rtanjensis IC50[mmol TE/g suve mase] 1,329 b 1,164 b TEAC [mmol TE/g suve mase] 0,835 b 1,073 b 2,939 b N. sibirica IC50 [mmol TE/g suve mase] 1,417 b 1,373 c TEAC [mmol TE/g suve mase ] 0,768a 0,706a 1,935a N. nervosa IC50[mmol TE/g suve mase] 0,937 a 0,816 a TEAC [mmol TE/g suve mase] 0,870 b 1,217 c 2,968 b trans,cis-nepetalakton IC50[mmol TE/g] 0,717 c 0,602 c TEAC [mmol TE/g] 17,016 a 0,806 a / cis,trans-nepetalakton IC50[mmol TE/g] 1,155 d 0,753 d TEAC [mmol TE/g] 13,678 a 0,706 a / ruzmarinska kiselina IC50 [mmol TE/mg] 0,393 a 0,232 a TEAC [mmol TE/mg] 40,326 c 1,695 b 1,523 a hlorogena kiselina IC50 [mmol TE/mg] 0,628 b 0,394 b TEAC [mmol TE/mg] 23,311 b 0,823 a 1,403 a PoreĊenjem IC50 vrednosti metanolnih ekstrakata u DPPH testu, primećena je veća antioksidativna aktivnost metanolnog ekstrakta nadzemnog dela N. nervosa (IC50NN= 0,937 mmol TE g -1 suve mase), u poreĊenju sa IC50 vrednostima metanolnih ekstrakta N. rtanjensis i N. sibirica izmeĊu kojih nema statistiĉki znaĉajne razlike (IC50NR=1,329 mmol TE g -1 suve mase; IC50NS=1,417 mmol TE g -1 suve mase). PoreĊenjem vrednosti za TEAC ispitivanih ekstrakata najslabiji antioksidativni potencijal pokazuje ekstrakt vrste N. sibirica, dok ekstrakti N. rtanjensis i N. nervosa pokazuju sliĉnu antioksidativnu aktivnost. Antioksidativna aktivnost ekstrakata je poreĊena i sa antioksidativnim kapacitetom dominantnih monoterpenskih i fenolnih jedinjenja prisutnih u ispitivanim vrstama (Tabela 8). 87 PoreĊenjem koncentracija potrebnih za neutralizaciju 50% DPPH radikala, uoĉava se da veći antioksidativni kapacitet imaju fenolne kiseline u poreĊenju sa monoterpenskim laktonima, trans,cis- i cis,trans-nepetalaktonom. Monoterpeni, α-pinen i β-pinen, nisu pokazali antioksidativni potencijal, pa rezultati nisu predstavljeni u tabeli. PoreĊenjem antioksidativne aktivnosti fenolnih kiselina, koje su najzastupljenije komponente u metanolnim ekstraktima sve tri ispitivane vrste, uoĉava se da ruzmarinska kiselina ima veću antioksidativnu aktivnost (IC50 =0,393 mmol TE mg -1 ) od hlorogene kiseline (IC50 = 0,628 mmol TE mg -1 ). TakoĊe, rezultati pokazuju da oba izomera nepetalaktona imaju znatno niţu antioksidativnu aktivnost u poreĊenju sa fenolnim kiselinama. Trans,cis-nepetalakton je pokazao veći antioksidativni potencijal (IC50=0,717 mmol TE g -1 suve mase uzorka), u poreĊenju sa cis,trans-nepetalaktonom (IC50=1,155 mmol TE g -1 suve mase uzorka). PoreĊenjem vrednosti dobijenih za TEAC potvrĊeno je snaţno antioksidativno delovanje fenolnih kiselina, kao i jaĉa aktivnost trans,cis- u poreĊenju sa cis,trans- stereoizomerom nepetalaktona. 4.4.2. Sposobnost neutralizacije ABTS +. radikal katjona U Tabel 8 su prikazane IC50 i TEAC vrednosti metanolnih ekstrakta tri vrste roda Nepeta kao i analiziranih referentnih jedinjenja. Metanolni ekstrakti biljaka su pokazali znaĉajnu sposobnost neutralizacije ABTS+.radikal katjona, te samim tim i antioksidativnu aktivnost. Najveću sposobnost neutralizacije pokazuje metanolni ekstrakt vrste N. nervosa (IC50=0,816; TEAC=1,217 mmol TE g -1 suve mase uzorka), a najmanju ekstrakt N. sibirica (IC50=1,373; TEAC=0,706 mmol TE g- 1 suve mase). Ruzmarinska kiselina, hlorogena kiselina, trans,cis- i cis,trans-nepetalakton pokazali su sposobnost neutralizacije ABTS +. radikal katjona sa IC50 i TEAC vrednostima koje se meĊusobno statistiĉki znaĉajno razlikuju (p≤0,05), pri ĉemu su kao u DPPH testu fenolne kiseline pokazale veću antioksidativnu aktivnost nego monoterpeni. Najveću antioksidativnu aktivnost pokazala je ruzmarinska kiselina (IC50=0,232 mmol TE mg -1 ; TEAC=1,695 mmol TE mg -1 ), dok je najmanju aktivnost pokazao cis,tran-nepetalakton (IC50=0,706; TEAC=0,753 mmol TE g -1 ). Monoterpeni α-pinen i β-pinen ne pokazuju sposobnost neutralizacije ABTS +. . 88 4.4.3. Fe 3+ / Fe 2+ redoks kapacitet (FRAP) test Najmanju sposobnost redukcije Fe 3+ pokazuje metanolni ekstrakat N. sibirica (TEAC=1,935 mmol TE g -1 suve mase uzorka), dok nije uoĉena statistiĉki znaĉajna razlika izmeĊu metanolnih ekstrakta N. rtanjensis i N. nervosa (TEACNR=2,939 mmol TE g -1 suve mase; TEACNS=2,968 mmol TE g -1 suve mase (Tabela 8). FRAP testom je pokazano da etarsko ulje N. rtanjensis, kao i etarsko ulje koje kao dominantno jedinjenje sadrţi cis,trans-nepetalakton ne pokazuju sposobnost redukcije Fe 3+ (Tabela 8). TakoĊe, monoterpeni α-pinen i β-pinen nisu pokazali redukujuću aktivnost prema Fe3+. Ruzmarinska kiselina je, kao i u prethodnim antioksidativnim testovima pokazala najveći potencijal predaje elektrona i prevoĊenja Fe 3+ u Fe 2+ . 4.5. Antimikrobno dejstvo Antimikrobno dejstvo metanolnih ekstrakta Nepeta rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa na odreĊene vrste bakterija i gljiva ispitivano je primenom mikrodilucione metode sa ciljem odreĊivanja minimalne inhibitorne koncentracije ekstrakta koja inhibira rast mikroorganizama (MIC). Ukoliko nije bilo rasta, te koncentracije uzimane su kao minimalna baktericidna i minimalna fungicidna koncentracija (MBC i MFC). Aktivnost ekstrakata je uporeĊena sa referentnim antibiotikom streptomicinom, kada je testiranje raĊeno na bakterijskim vrstama, odnosno sa komercijalnim fungicidima bifonazolom i ketokonazolom u sluĉaju antifungalnog ispitivanja. Rezultati antibakterijskog i antifungalnog dejstva metanolnog ekstrakta tri vrste roda Nepeta predstavljeni su u Tabeli 9. 89 Tabela 9. Minimalna inhibitorna (MIC) i letalna koncentracija (MBC- baktericidna i MFC-fungicidna koncentracija) metanolnog ekstrakta tri vrste roda Nepeta N. nervosa MIC-MBC [µg ml-1] N. rtanjensis MIC-MBC [µg ml-1] N. sibirica MIC-MBC [µg ml-1] Streptomicin MIC-MBC [µg ml-1] B a k te ri je Bacillus cereus 50-100 50-100 100-200 12.5-25.0 Micrococcus flavus 50-100 50-100 100-200 25.0-50 Staphylococcus aureus 50-100 50-100 100-200 50-100 Escherichia coli 100-200 50-100 100-200 50-100 Pseudomonas aerginosa 100-200 50-100 100-200 50-100 Enterobacter cloacae 100-200 50-100 100-200 50-100 Salmonella typhimurium 100-200 50-100 - 50-100 Listeria monocytogenes 100-200 50-100 - 150-300 N. nervosa MIC-MFC [µg ml-1] N. rtanjensis MIC-MFC [µg ml-1] N. sibirica MIC-MFC [µg ml-1] Bifonazol MIC-MFC [µg ml-1] Ketokonazol MIC-MFC [µg ml-1] G lj iv e Fusarium sporotrichoides 75-100 75-100 75-100 100-200 200-500 Fulvia fulvum 100-200 75-100 100-200 100-200 200-500 Trichoderma viride 50-75 25-75 25-75 200-250 2500-3000 Penicillium ochrochloron 75-100 25-100 75-100 150-200 1000-1000 Penicillium funiculosum 75-100 25-50 50-75 200-250 200-500 Aspergillus ochraceus 75-100 50-75 75-100 150-200 1500-2000 Aspergillus flavus 50-75 50-75 50-75 150-200 1500-2000 Aspergillus fumigatus 75-100 75-100 75-100 150-200 200-500 Metanolni ekstrakt sve tri vrste roda Nepeta pokazuju znaĉajnu antibakterijsku aktivnost na sve testirane bakterijske vrste, pri ĉemu je ekstrakt N. rtanjensis pokazao najveću antibakterijsku aktivnost, sa MIC vrednostima od 50 µg ml-1 i MBC vrednostima od 100 µg ml -1 . Metanolni ekstrakt N. nervosa, u zavisnosti od bakterijske vrste pokazao je antibakterijsku aktivnost sa MIC vrednostima izmeĊu 50 i 100 µg ml-1 i MBC vrednostima izmeĊu 100 i 200 µg ml-1, dok je ekstrakt N. sibirica prema svim testiranim bakterijama pokazao MIC vrednost od 100 µg ml -1 i MBC vrednost od 200 µg ml -1 . 90 Ekstrakt N. rtanjensis i komercijalni antibiotik streptomicin pokazuju sliĉnu antibakterijsku aktivnost. Metanolni ekstrakti N. nervosa i N. rtanjensis su pokazali jaĉe antibakterijsko dejstvo na sojeve bakterija Listeria monocytogenes nego komercijalni antibiotik, dok je antibakterijsko dejstvo ekstrakta N. rtanjensis na Bacillus cerus slabije od streptomicina. Ekstrakt N. sibirica nije pokazao antibakterijsko dejstvo na sojeve bakterija Salmonella typhimurium i L. monocytogenes. Sva tri metanolna ekstrakta pokazuju veoma dobru sposobnost u spreĉavanju rasta gljiva, od deset do trideset puta jaĉu od komercijalnih antifungalnih supstanci. MIC vrednosti metanolnih ekstrakata variraju u zavisnosti od vrste gljiva, i kreću se izmeĊu 50 i 100 µg ml-1 za metanolni ekstrakt N. nervosa, izmeĊu 25 i 75 µg ml-1 kod ekstrakta vrste N. rtanjensis i izmeĊu 25 i 100 µg ml-1 u sluĉaju metanolnog ekstrakta N. sibirica. Najbolje fungicidno dejstvo, sa MFC vrednostima izmeĊu 50 i 100 µg ml-1 pokazao je metanolni ekstrakt N. rtanjensis. 91 4.6. Uticaj isparljivih jedinjenja tri vrste roda Nepeta sp. na klijanje i rast test vrste Lepidium sativum L. (kres) Ĉetiri nedelje stare in vitro gajene biljke N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa (1, 3, 5, 7 ili 9 jedinki), ko-kultivisane su sa po trideset semena Lepidium sativum L. (Slika 25). Slika 25. A) Ko-kultura jedne jedinke N. rtanjensis i L. sativum; B) Ko-kultura devet jedinki N. nervosa i L. sativum; C) Ko-kultura devet jedinki N. sibirica i L. sativum; D) Ko-kultura jedne jedinke N. sibirica i L. sativum. Koncentracija nepetalaktona u atmosferi posude u kojoj su biljke rasle izmerena je pomoću PTR-MS ureĊaja. Rezultati pokazuju da srazmerno broju jedinki raste i koncentracija nepetalaktona u atmosferi posude za gajenje biljaka (Slika 17A 17B), osim u sluĉaju N. nervosa gde je nepetalakton detektovan u tragovima (Slika 17C). U atmosferi in vitro kultura N. rtanjensis izmerena je koncentracija nepetalaktona u opsegu od 5 do 23 ppbV, u zavisnosti od broja jedinki (Slika 17A). Sliĉan opseg koncentracija, od 3 do 25 ppbV, izmeren je u atmosferi posude za in vitro kulturu N. sibirica (Slika 17B), dok je u sluĉaju N. nervosa detektovana jako niska koncentracija nepetalaktona, na pragu detekcije PTR-MS ureĊaja (Slika 17C). 92 Semena L. sativum isklijavana su u koncentracionom gradijentu nepetalaktona, kako bi se uoĉila zavisnost procenta klijanja od koncentracije ovog monoterpena. Semena kresa su klijala i rasla u atmosferi isparljivih jedinjenja N. rtanjensis, N. sibirica i N.nervosa tokom pet dana, nakon ĉega je prebrojan broj proklijalih semena (Slika 26A 26B 26C), kao i duţina nadzemnog dela i korena klijanaca (Slika 28A 28F). TakoĊe je praćena dinamika klijanja kresa tokom pet dana, poĉev od trenutka formiranja ko-kulture (Slika 26D 26E 26F). Slika 26. A-C) Procenat klijanja Lepidium sativum posle pet dana rasta u ko-kulturi, u zavisnosti od koncentracije nepetalaktona u atmosferi posude za in vitro gajenje A) N. rtanjensis B) N. sibirica C) N. nervosa D-E) Procenat klijanja L. sativum po danima u ko-kulturi sa D) N. rtanjensis E) N. sibirica F) N. nervosa. Kada su semena L. sativum isklijavana bez prisustva Nepeta, dobijena vrednost klijanja semena je 100% (rezultati nisu prikazani na graficima). Rezultati pokazuju da sa povećanjem koncentracije nepetalaktona u atmosferi posuda za gajenje biljaka opada procenat klijanja semena L. sativum, naroĉito u sluĉaju ko-kultivacije sa N. rtanjensis koja se karakteriše prisustvom trans,cis- izomera nepetalaktona (Slika 26A). Inhibitorni efekat na klijanje su pokazale koncentracije trans,cis-nepetalaktona u opsegu od 10 do 25 ppbV, pri ĉemu su najjaĉe koncentracije ovog izomera smanjile broj proklijalih semena L. sativum do 67%. 93 Isti opseg koncentracija nepetalaktona u ko-kulturi sa vrstom N. sibirica, kod koje je dominantni izomer cis,trans-nepetalakton, imao je manje izraţeno inhibitorno dejstvo na klijanje semena kresa, smanjujući procenat klijanja na oko 90% (Slika 26B). U ko-kulturi N. nervosa i L. sativum nepetalakton je zabeleţen samo u tragovima, a prisustvo niske koncentracije ovog monoterpena nije se odrazilo na klijanje semena kresa (Slika 26C). Rezultati su uporeĊivani sa kontrolnom grupom semena kresa koja nisu rasla u ko-kulturi sa vratama roda Nepeta, ĉiji je procenat klijanja semena iznosio 100% 18 sati od postavke eksperimenta. Na Slici 27 prikazani su kontrolni klijanci kresa stari 18 sati, 24 sata i klijanci kresa stari pet dana. Slika 27. SEM klijanca L. sativum starog A) 18 sati B) 24 sata C) pet dana, gajenih u kulturi in vitro Praćenjem dinamike klijanja semena kresa, tokom pet dana ko-kultivisanja sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, uoĉeno je da semena u atmosferi trans,cis- nepetalaktona znaĉajno zaostaju u klijanju (Slika 26D). Na kraju petog dana ukupan broj proklijalih semena iznosio je 69%. Semena su u atmosferi cis,trans-nepetalaktona (ko-kultura sa N. sibirica) već drugog dana dostigla visok procenat klijanja od 93% (Slika 26E), dok su semena u ko-kulturi sa N. nervosa nakon jednog dana proklijala 100%, što je odgovaralo kontrolnoj grupi (Slika 26F). Rezultati su takoĊe ukazali na usporenu dinamiku klijanja semena kresa tokom njihovog ko-kultivisanja sa N. sibirica i N. rtanjensis. Posle petog dana ko-kultivisanja odreĊena je duţina nadzemnog dela, kao i korena klijanaca kresa (Slika 28). 94 Slika 28. Promena duţine nadzemnog dela i korena klijanaca L. sativum u zavisnosti od koncentracije nepetalaktona u ko-kulturama sa: A i D) N. rtanjensis B i E) N. sibirica C i F) N. nervosa. Niske koncentracije trans,cis-nepetalaktona, do pribliţno 5 ppbV, ne utiĉu na rastenje i razviće klijanaca kresa, pa su duţine nadzemnih delova i korenova u opsegu vrednosti koje su izmerene kod kontrolnih biljaka. Sa daljim porastom koncentracije trans,cis-nepetalaktona u ko-kulturama sa N. rtanjensis dolazi do znaĉajnog opadanja duţine nadzemnih delova i korenova klijanaca kresa (Slika 28A 28D). Sa porastom koncentracija cis,trans-nepetalaktona uoĉeno je neznatno smanjenje duţine nadzemnog dela klijanaca (Slika 28B 28E), dok efekat na rastenje i izduţivanje korenova nije primećen u ko-kulturi sa N. nervosa. Klijanci kresa su se normalno razvijali, i nisu pokazali znaĉajne razlike u odnosu na kontrolnu grupu (Slika 28C 28F). Da bi se utvrdilo da li je smanjenje duţine nadzemnih delova i korenova klijanaca posledica usporene dinamike klijanja semena, uraĊen je eksperiment u kome su semena kresa prethodno isklijana, a zatim su klijanci stari tri dana ko-kultivisani sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa (Slika 29 A-F). 95 Slika 29. Ko-kultivacija tri dana starih klijanaca kresa sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa A i D) trans,cis-nepetalakton B i E) cis,trans- nepetalakton C i F) nepetalakton nije detektovan. Poseĉna duţina klijanaca starih tri dana bila je oko 20 mm. Nakon tri dana ko- kultivacije sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa nije zabeleţena razlika u duţini nadzemnih delova ili korenova klijanaca izmeĊu tretmana. Time je potvrĊena pretpostavka da su uoĉene razlike u duţini nadzemnih delova i korenova klijanaca gajenih u atmosferi nepetalaktona posledica usporene dinamike klijanja. Najizraţeniji efekat nepetalaktona na klijanje semena, kao i rastenje i razviće klijanaca kresa, zapaţen je pri koncentracijama ovog monoterpena u opsegu od 15 do 20 ppbV, pa su u daljim eksperimentima klijanci L. sativum gajeni na navedenim efektivnim koncentracijama nepetalaktona. Kao kontrolna grupa biljaka, korišćeni su klijanci ko-kultivisani sa N. nervosa. 96 4.6.1. Analiza antioksidativnih enzima Lepidium sativum Ispitivano je da li prisustvo visokih koncentracija nepetalaktona u atmosferi dovodi do oksidativnog stresa kod klijanaca kresa koji su tokom pet dana rasli u ko- kulturi sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa. Praćen je efekat cis,trans- i trans,cis- nepetalaktona, s ciljem da se utvrdi da li stereohemija ovog monoterpena utiĉe na njegov alelopatski potencijal. Promene u enzimskoj komponenti antioksidativnog sistema kresa ispitane su praćenjem aktivnosti i ekspresije enzima superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), peroksidaza (POD) i polifenol oksidaza (PPO). 4.6.1.1. Elektroforetska i spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti superoksid dismutaza (SOD) i imunoblot analiza U uslovima abiotiĉkog ili biotiĉkog stresa, SOD predstavljaju prvu liniju odbrane ćelija od reaktivnih oblika kiseonika (ROS). Aktivnost i zastupljenost ove grupe enzima analizirana je tokom rastenja klijanaca, do petog dana od formiranja ko-kulture sa vrstama roda Nepeta. SOD aktivnost analizirana je in gel metodom. Ukupni solubilni proteini iz ekstrakta testiranih biljaka razdvojeni su nativnom elektroforezom (Slika 31 B), a identifikacija pojedinih izoformi SOD izvršena je na osnovu njihove razliĉite osetljivosti na dejstvo inhibiora KCN i H2O2 (Slika 30 A-D). 97 Slika 30. Relativna aktivnost SOD kod klijanaca kresa tokom 5 dana gajenja u ko- kulturi in vitro: a) kontrolna grupa klijanaca i klijanci ko-kultivisani sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. (B), a identifikacija izoformi je izvršena na osnovu njihove razliĉite osetljivosti na dejstvo inhibitora, 3 mM KCN i 5 mM H2O2. Relativna aktivnost pojedinih izoformi Mn-SOD (A), Fe-SOD (C) i CuZn-SOD (D) odreĊena je densitometrijskom kvantifikacijom. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna eksperimenta. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fisher’s LSD testu. 98 In gel enzimskim testom detektovane su tri izoforme Mn-SOD (Mn-SOD1, Mn-SOD2 i Mn-SOD3) kod klijanaca koji su in vitro ko-kultivisani sa tri vrste roda Nepeta i kod kontrolnih klijanaca. Sve tri izoforme Mn-SOD kod klijanaca kresa u ko- kulturi sa N. nervosa, N. rtanjensis i kod kontrolnih klijanaca se javljaju prvog dana i primećen je porast njihove relativne aktivnosti do petog dana (Slika 30 Aa Ab Ad). Aktivnost Mn-SOD3 izoforme kod klijanaca kresa gajenih u ko-kulturi sa N. sibirica se moţe detektovati tek petog dana (Slika 30 Ac). Najslabija aktivnost Mn-SOD prvog i trećeg dana je zabeleţena kod klijanaca gajenih u atmosferi cis,trans-nepetalaktona, koji je karakteristiĉan za vrstu N. sibirica. In gel enzimskim testom detektovane su tri izoforme Fe-SOD (Fe-SOD1, Fe-SOD2 i Fe-SOD3) kod klijanaca kresa koji su klijali i rasli u ko-kulturi in vitro sa N. nervosa i kod kontrolnih klijanaca (Slika 30 Ca Cd). Sve tri izoforme Fe-SOD se kod pomenutih eksperimentalnih grupa klijanaca javljaju prvog dana i njihova relativna aktivnost statistiĉki znaĉajno raste tokom vremena. Kod klijanaca kresa koji su ko- kultivisani sa N. rtanjensis detektovane su dve izoforme (Fe-SOD2 i Fe-SOD3), takoĊe su dve izoforme Fe-SOD detektovane u ko-kulturi sa N. sibirica (Fe-SOD1 i Fe-SOD2) (Slika 30 Cb Cc). U ko-kulturi sa N. sibirica trećeg dana je primećena aktivnost i FeSOD3 , koja petog dana nije detektovana. Izoforma Fe-SOD2 se kod klijanaca kresa u ko-kulturi sa N. rtanjensis moţe detektovati prvog dana, dok je Fe-SOD3 izoforma zapaţena tek petog dana. Generalno, aktivnost ovih enzima raste sa vremenom. Najslabija aktivnost je zabeleţena kod klijanaca gajenih u atmosferi trans,cis- i cis,trans-nepetalaktona. Kod kontrolne grupe klijanaca i kod klijanaca koji su ko-kultivisani sa tri vrste roda Nepeta, in gel enzimskim testom detektovane su dve izoforme CuZn-SOD (CuZn- SOD1 i CuZn-SOD2) (Slika 30 D). Obe CuZn-SOD izoforme su kod klijanaca koji su ko-kultivisani sa N. nervosa i kod kontrolnih klijanaca detektovane trećeg dana (Slika 30 Da Dd). Kod klijanaca koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis i N. sibirica izoforma CuZn-SOD2 se javlja trećeg dana, dok je CuZn-SOD1 izoforma detektovana petog dana (Slika 30 Db Dc). Primećen je neznatan porast aktivnosti CuZn-SOD izoformi sa vremenom. 99 Slika 31. A) Relativna aktivnost ukupnih SOD kod klijanaca kresa starih jedan, tri i pet dana a) kontrolni klijanci; klijanci koji su klijali i rasli u ko-kulturi sa b) N. rtanjensis; c) N. sibirica; d) N. nervosa. B) Nativna elektroforeza solubilnih proteina klijanaca kresa. C) Ukupna aktivnost SOD odreĊena spektrofotometrijski, na talasnoj duţini 540 nm. Rezultati spektrofotometrijske kvantifikacije aktivnosti ukupnih SOD u klijancima kresa (Slika 31 C) koji su ko-kultivisani in vitro sa tri razliĉite vrste roda Nepeta pokazali su veću enzimsku aktivnost kod klijanaca kresa koji su rasli u ko- kulturi bez nepetalaktona u poreĊenju sa ukupnom aktivnošću SOD kod klijanaca koji su rasli u atmosferi sa trans,cis- odnosno cis,trans-nepetalaktonom. 100 Generalno, ukupna aktivnost SOD raste od prvog do petog dana na svim tretmanima, pri ĉemu je najveći porast primećen prvog dana, što odgovara periodu probijanja radikule kod klijanaca iz kontrolne grupe. Broj i relativna zastupljenost pojedinih Mn-SOD izoformi utvrĊena je imunoblot analizom (Slika 32 A i B). Kod klijanaca kresa su identifikovane tri Mn-SOD izoforme, relativne molekulske teţine 48 kDa, 33 kDa i 22 kDa. Rezultati imunodetekcije jasno ukazuju na to da se zastupljenost sve tri izoforme enzima znaĉajno menja tokom procesa klijanja. Relativna koliĉina Mn-SOD1 izoforme raste tokom vremena. Kod kontrolnih klijanaca i klijanaca ko-kultivisanih sa N. nervosa, ova izoforma se javlja trećeg i petog dana (Slika 32 Ba Bd). Pojava MnSOD1 izoforme je odloţena kod klijanaca gajenih u atmosferi trans,cis- (do petog dana) i cis-trans-nepetalaktona (do trećeg dana) (Slika 32 Bb Bc). Mn-SOD2 izoforma enzima je prisutna u klijancima kresa od prvog dana i njena relativna koliĉina raste tokom vremena. Maksimalna zastupljenost ove izoforme uoĉena je kod klijanaca starih 3 dana, i to u kontrolnoj grupi klijanaca, kao i kod klijanaca gajenih u ko-kulturi sa N. sibirica i N. nervosa. Kod klijanaca ko-kultivisanih sa N. rtanjensis relativna koliĉina Mn-SOD2 izoforme raste tokom vremena i dostiţe maksimum petog dana. Rezultati ukazuju na to da trans,cis- nepetalakton usporava porast ekspresije ove izoforme SOD tokom rasta klijanaca. Uoĉava se da relativna koliĉina Mn-SOD3 izoforme opada tokom vremena. Ova izoforma detektovana je kod kontrolnih klijanaca i klijanaca ko-kultivisanih sa N. nervosa samo prvog dana, dok se kod klijanaca gajenih u prisustvu oba izomera nepetalaktona javlja prvog i trećeg dana. Rezultati ukazuju da oba izomera nepetalaktona odlaţu pojaĉanu ekspresiju Mn-SOD1 i usporavaju opadanje ekspresije Mn-SOD3 tokom rasta klijanaca. Trans,cis-nepetalakton, koji je karakteristiĉan za vrstu N. rtanjensis, odlaţe pojaĉanu ekspresiju Mn-SOD2 izoforme. 101 Slika 32. Imuno-detekcija Mn-SOD kod klijanaca kresa: A) Relativna zastupljenost Mn-SOD izoformi kod (a) kontrolnih klijanaca, kao i klijanaca ko-kultivisanih sa (b) N. rtanjensis, (c) N. sibirica i (d) N. nervosa. Nakon SDS-PAGE solubilnih proteina i njihovog prebacivanja na nitrocelulozne membrane, vizuelizacija Mn-SOD izoformi uraĊena je korišćenjem Anti-Rabbit Mn-SOD primarnih antitela i Goat Anti-Rabbit IgG- HRP sekundarnih antitela, metodom pojaĉane hemiluminiscencije. Vrednosti relativne zastupljenosti enzima odreĊene su densitometrijski i izraţene su u odnosu na maksimalnu izmerenu vrednost. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost tri nezavisna merenja. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. Imunoblot analizom ustanovljeno je prisustvo dve CuZn-SOD izoforme koje se javljaju pri svim tretmanima i ĉija se relativna zastupljenost ne menja tokom vremena. (Slika 33A 33B). Broj i relativna zastupljenost pojedinih CuZn-SOD izoformi utvrĊena je imunoblot analizom. Kod klijanaca kresa su identifikovane dve CuZn-SOD izoforme molekulske teţine 45 kDa i 27 kDa (Slika 33). Rezultati imunodetekcije jasno ukazuju na to da se zastupljenost CuZn-SOD1 i CuZn-SOD2 ne menja tokom vremena. Obe izoforme detektovane su i kod kontrolnih klijanaca i kod klijanaca koji su rasli u atmosferi nepetalaktona već prvog dana i njihova zastupljenost se ne menja tokom vremena. 102 Slika 33. A) Relativna zastupljenost CuZn -SOD u klijancima kresa: a) kontrolni klijanci i klijanci ko-kultivisani sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. B) Nakon SDS-PAGE solubilnih proteina i njihovog prebacivanja na nitrocelulozne membrane, vizuelizacija CuZn-SOD izoformi uraĊena je korišćenjem Anti-Rabbit Chloroplastic CuZn-SOD primarnih antitela i Goat Anti-Rabbit IgG-HRP sekundarnih antitela, metodom pojaĉane hemiluminescencije. Vrednosti relativne zastupljenosti enzima odreĊene su densitometrijski i izraţene su u odnosu na maksimalnu izmerenu vrednost. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost tri nezavisna merenja. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. 4.6.1.2. Elektroforetska detekcija i spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti katalaza (CAT) Promena aktivnosti CAT praćena je u klijancima kresa koji su isklijavani i rasli u ko-kulturi sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa. Ukupni solubilni proteini razdvojeni su metodom nativne elektroforeze, a potom je izvršena in gel detekcija katalaznih izoformi (Slika 34). 103 Slika 34. Relativna aktivnost CAT kod klijanaca kresa tokom 5 dana gajenja u uslovima in vitro: a) kontrolna grupa klijanaca i klijanci ko-kultivisani sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. Relativna aktivnost pojedinih izoformi CAT odreĊena je densitometrijskom kvantifikacijom. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost dva merenja. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. 104 In gel enzimskim testom detektovane su tri izoforme CAT (CAT1, CAT2 i CAT3) kod klijanaca kresa koji su klijali i rasli u ko-kulturi in vitro sa N. nervosa i kod kontrolnih klijanaca (Slika 34a 34d), odnosno dve izoforme (CAT1 i CAT2) kod klijanaca kresa koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis i N. sibirica (Slika 34b 34c). Sve tri izoforme CAT kod klijanaca kresa u ko-kulturi sa N. nervosa i kod kontrolnih klijanaca se javljaju drugog dana i njihova relativna aktivnost statistiĉki znaĉajno raste tokom vremena. Aktivnost CAT1 i CAT2 izoformi se kod klijanca kresa gajenih u ko- kulturi sa N. rtanjensis moţe detektovati tek ĉetvrtog dana, odnosno trećeg dana u ko- kulturi kresa sa N. sibirica (Slika 34b). Aktivnost ovih izoformi raste sa vremenom. Najslabija aktivnost katalaza je zabeleţena kod klijanca gajenih u atmosferi trans,cis- nepetalaktona, koji je karakteristiĉan za vrstu N. rtanjensis. Rezultati pokazuju da oba izomera, a naroĉito trans,cis-nepetalakton, usporavaju porast aktivnosti katalaza tokom rasta klijanaca kresa. TakoĊe, u prisustvu oba izomera nepetalaktona izostaje aktivnost CAT3 izoforme. Rezultati spektrofotometrijske kvantifikacije aktivnosti ukupnih CAT u klijancima kresa pokazuju sliĉan obrazac. Aktivnost CAT statistiĉki znaĉajno raste tokom rasta klijanaca i dostiţe maksimum kod klijanaca starih 5 dana. Najveća aktivnost CAT je detektovana u kontrolnim klijancima, a najmanja u klijancima kresa koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis (Slika 35). 105 Slika 35. Spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti CAT kod klijanaca kresa starih od 1 do 5 dana: a) kontrolni klijanci; klijanci gajeni u ko-kultuti in vitro sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. Aktivnost je odreĊena na talasnoj duţini 240 nm uz korišćenje H2O2 kao supstrata. Rezultati predstavljaju srednju vrednost dva nezavisna eksperimenta. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. 4.6.1.3. Elektroforetska i spektrofotometrijska kvantifikacija aktivnosti peroksidaza (POD) Promene aktivnosti POD ispitivali smo u klijancima kresa od prvog do petog dana rasta u ko-kulturi in vitro sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa. Specifiĉna POD aktivnost odreĊena je in gel testom (Slika 36) i spektrofotometrijskom metodom, a kao supstrat je korišćen pirogalol (Slika 37). 106 Slika 36. Ukupna relativna aktivnost POD u klijancima kresa starim od 1 do 5 dana: a) kontrolni klijanci; klijanci gajeni u ko-kulturi in vitro sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. Relativna aktivnost pojedinih izoformi POD odreĊena je densitometrijski. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri merenja. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. 107 In gel enzimskim testom su detektovane ĉetiri izoforme POD kod klijanaca kresa koji su klijali i rasli u ko-kulturi in vitro sa N. nervosa i kod kontrolnih klijanaca (POD1, POD2, POD3 i POD4) (Slika 36a 36d), odnosno dve izoforme (POD2 i POD3) kod klijanaca kresa koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis i N. sibirica (Slika 36b 36d). Aktivnost POD1 izoforme uoĉava se kod kontrolne grupe klijanaca kresa i kao i kod klijanaca koji su rasli u ko-kulturi sa N. nervosa poĉev od prvog dana. Aktivnost ove izoforme opada tokom vremena. Kod istih eksperimentalnih grupa klijanca, kao i kod klijanca raslih u ko-kulturi sa N. sibirica POD2 izoforma se pojavljuje 3. dana i njena aktivnost neznatno raste tokom vremena. POD2 izoforma se kod klijanaca ko- kultivisanih sa N. rtanjensis javlja tek 4. dana i nije uoĉena statistiĉki znaĉajna promena aktivnosti petog dana. Aktivnost POD3 izoforme je zabeleţena kod klijanaca starih 3 dana, i njena aktivnost znaĉajno raste tokom vremena, pri ĉemu maksimum aktivnosti dostiţe petog dana. Izuzetak su klijanci ko-kultivisani sa N. rtanjensis, kod kojih je pojava aktivnosti POD3 odloţena za jedan dan. I kod ove eksperimentalne grupe klijanca znaĉajno raste aktivnost POD3 izoforme tokom vremena, a maksimalna aktivnost se dostiţe petog dana. POD4 izoforma je karakteristiĉna za klijance gajene u odsustvu nepetalaktona, i kod ove dve eksperimentalne grupe aktivnost POD4 je uoĉena kod klijanaca starih 3 dana, nakon ĉega aktivnost blago opada. Ukupna aktivnost peroksidaza raste tokom vremena i postiţe najviše vrednosti kod klijanaca gajenih u odsustvu nepetalaktona. Tretman klijanaca trans,cis-nepetalaktonom dovodi do odlaganja aktivnosti peroksidaza za jedan dan. Rezultati spektrofotometrijske kvantifikacije aktivnosti ukupnih POD u klijancima kresa su pokazali da aktivnost POD od drugog do petog dana statistiĉki znaĉajno raste, s tim što ĉetvrtog dana dolazi do smanjenja aktivnosti u klijancima na svim tretmanima, nakon ĉega aktivnost ponovo raste. Najveća aktivnost je detektovana u klijancima koji su ko-kultivisani sa N. nervosa, dok je najmanja aktivnost POD detektovana u klijancima kresa koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis (Slika 37). 108 Slika 37. Ukupna aktivnost POD u klijancima kresa: a) kontrolni klijanci; klijanci koji su klijali i rasli u ko-kultuti in vitro sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. Aktivnost je odreĊena spektrofotometrijski na talasnoj duţini 430 nm uz korišćenje pirogalola kao supstrata. Rezultati predstavljaju srednju vrednost tri nezavisna merenja. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. 4.6.1.4. Polifenol oksidaze (PPO): elektroforetska detekcija, spektrofotometrijska aktivnost i imunoblot analiza Pored POD i PPO mogu da oksiduju fenole i da na taj naĉin uĉestvuju u regulaciji koncentracije fenolnih jedinjenja u biljkama. Praćena je promena aktivnosti PPO u klijancima kresa tokom 5 dana rasta, na svim opisanim tretmanima. In gel enzimskim testom detektovana je jedna PPO izoforma (Slika 38A). U kontrolnim klijancima kresa aktivnost PPO je detektovana od ĉetvrtog dana (Slika 38 Aa). Kod klijanaca kresa koji su ko-kultivisani sa N. sibirica i N. nervosa PPO aktivnost je zabeleţena od trećeg dana (Slika 38 Ac Ad). U ko-kulturi klijanaca kresa sa N. rtanjensis PPO aktivnost se uoĉava već od drugog dana (Slika 38 Ab). Relativna aktivnost PPO na svim tretmanima raste tokom vremena, a maksimalana vrednost je uoĉena kod klijanca gajenih u ko-kulturi sa N. rtanjensis, starih 5 dana. Moţe se zakljuĉiti da trans,cis-nepetalakton stimuliše aktivnost PPO, tako što dovodi do ranije aktivacije enzima. 109 Rezultati spektrofotometrijske kvantifikacije aktivnosti ukupnih PPO u klijancima kresa su pokazali da aktivnost PPO od trenutka kada se pojave statistiĉki znaĉajno raste. Najveća aktivnost je detektovana u klijancima koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis, dok je najmanja aktivnost PPO detektovana u kontrolnim klijancima (Slika 38 B), što je potvrdilo rezultate dobijene in gel analizom aktivnosti ovog enzima. Slika 38. Analiza aktivnosti PPO u klijancima kresa tokom 5 dana rastenja u kulturi in vitro: a) kontrolni klijanci; klijanci koji su klijali i rasli u ko-kultuti sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. Aktivnost PPO odreĊena je A) in gel metodom, korišćenjem pirokatehola kao supstrata, uz densitometrijsku kvantifikaciju; i B) spektrofotometrijski, na talasnoj duţini 410 nm uz korišćenje pirokatehola kao supstrata. Rezultati predstavljaju srednju vrednost dva nezavisna merenja. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. Broj i relativna zastupljenost pojedinih izoformi PPO uraĊena je pomoću imunoblot analize. U klijancima kresa, bez obzira na tretman, identifikovana je jedna izoforma PPO, relativne molekulske teţine 60 kDa. Rezultati imunodetekcije jasno ukazuju da zastupljenost PPO raste tokom procesa klijanja u svim ko-kulturama (Slika 39), kao i da je prvog dana u klijancima koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis i N. sibirica PPO prisutna, ali nije aktivna (Slika 39b 39c). Rezultati pokazuju da oba izomera nepetalaktona utiĉu na aktivnost PPO tako što indukuju ekspresiju PPO dan ranije u 110 odnosu na kontrolu, dok se aktivnost enzima javlja dva dana (u sluĉaju trans,cis- nepetalaktona) ili dan ranije (u sluĉaju cis,trans-nepetalaktona) u poreĊenju sa klijancima gajenim u odsustvu nepetalaktona (Slika 39a 39d). Pored toga, najveća aktivnost PPO detektovana je kod klijanaca gajenih u armosferi trans,cis-nepetalaktona koji je karakteristiĉan za N. rtanjensis, a zatim i cis,trans-nepetalaktona, koji je dominantan izomer nepetalaktona kod N. sibirica. Slika 39. Relativna zastupljenost PPO u klijancima kresa tokom 5 dana gajenja in vitro: a) kontrolni klijanci; klijanci koji su ko-kultivisani sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. Nakon SDS-PAGE solubilnih proteina i njihovog prebacivanja na nitrocelulozne membrane, vizuelizacija PPO uraĊena je korišćenjem poliklonalnih Mouse Anti-Fungi PPO primarnih antitela i Goat Anti-Mouse IgG-HPR sekundarnih antitela, metodom pojaĉane hemiluminescencije. Vrednosti relativne zastupljenosti enzima odreĊene su densitometrijski i izraţene su u odnosu na maksimalnu izmerenu vrednost. Rezultati predstavljaju srednju vrednost dva nezavisna merenja. Vrednosti oznaĉene istim slovom ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p≤0,05). 4.6.2. Spektrofotometrijsko određivanje ukupnih fenola u metanolnim ekstraktima klijanaca L. sativum Koliĉina ukupnih fenolnih jedinjenja u metanolnim ekstraktima L. sativum od prvog do petog dana rasta u ko-kulturi sa tri vrste Nepeta odreĊena je spektrofotometrijskom metodom korišćenjem Folin-Ciocalteu reagensa (Tabela 10). Rezultati pokazuju da kod kontrolnih klijanaca koliĉina fenolnih jedinjenja od prvog do petog dana neznatno raste, što je takoĊe primećeno i kod klijanaca kresa koji su rasli u ko-kulturi sa N. nervosa. Kod klijanaca kresa koji su rasli u ko-kulturi sa N. rtanjensis primećena je statistiĉki znaĉajno veća koliĉina fenolnih jedinjenja od prvog dana, koja opada sa vremenom. Primećeno je da koliĉina fenolnih jedinjenja kod klijanca kresa koji su rasli u ko-kulturi sa N. sibirica od prvog do trećeg dana raste, a nakon toga ĉetvrtog i petog dana, dolazi do opadnja koliĉine fenolnih jedinjenja u klijancima. 111 Tabela 10. Ukupni fenoli u klijancima kresa tokom 5 dana rastenja u ko-kulturi in vitro sa vrstama iz roda Nepeta. Koliĉina ukupnih fenolnih jedinjenja odreĊena je spektrofotometrijskom metodom, korišćenjem Folin-Ciocalteu reagensa. Vrednosti oznaĉene istim slovima ne pokazuju statistiĉki znaĉajnu razliku (p ≤ 0,05) prema Fišerovom LSD testu. Ukupni fenoli L. sativum [mmol EGA g-1 sveže mase] 1.DAN 2.DAN 3.DAN 4.DAN 5.DAN Kontrola 1,00 a 1,11 a 1,21 a 1,21 a 1,26 a Ko-kultura sa N. rtanjensis 1,88 c 1,41 ab 1,39 ab 1,38 ab 1,18 a Ko-kultura sa N. sibirica 1,16 a 1,24 a 1,32 a 1,14 a 1,25 a Ko-kultura sa N. nervosa 1,15 a 1,10 a 1,35 a 1,47 a 1,58 a 4.6.2.1. UHPLC-DAD/HESI-MS/MS karakterizacija metanolnih ekstrakata Lepidium sativum FS UHPLC/HESI-MS spektri su dobijeni kako u pozitivnom, tako i u negativnom modalitetu, pri ĉemu spektralni podaci pokazuju seriju pikova u opsegu m/z od 100 do 900. Prilikom analize metanolnog ekstrakta Lepidium sativum UHPLC/-HESI-MS hromatogram ukupnih jona pokazuje jasno razdvojene pikove na Rt 2,89 minuta i 4,17 minuta (Slika 40a), koji su identifikovani kao: (1)- sinapoil-glukoza (m/z [M-H] - je 385), i (2)- sinapoil-malat (m/z [M-H] - je 339). Identifikacija je potvrĊena u FS, PIS, SRM i NLS eksperimentima. UHPLC/+HESI-MS hromatogram ukupnih jona pokazuje jasno razdvojene pikove na Rt 2,56 minuta i 2,90 minuta (Slika 40b), koji su identifikovani kao (3)- sinapaldehid (m/z [M+H] + je 209) i (4)- sinapoil-holin (sinapin) (m/z [M+H] + je 310). 112 Slika 40. UHPLC/-HESI-MS (a) i UHPLC/+HESI-MS (b) hromatogrami metanolnih ekstrakta klijanaca L. sativum starih 1 dan (a i b), 2 dana (c i d), 3 dana (e i f), 4 dana (g i h) i 5 dana (i i j). U metanolnim ekstraktima su identifikovani: (1) sinapoil-glukoza, (2) sinapoil-malat, (3) sinapaldehid i (4) sinapoil-holin (sinapin). Derivati sinapinske kiseline su identifikovani uporeĊivanjem DAD, MS i MS/MS spektara sa literaturnim podacima i korišćenjem standarda sinapiĉne kiseline, kao referentnog jedinjenja. Retenciona vremena i max identifikovanih jedinjenja su prikazana u Tabeli 11. 113 Tabela 11. UHPLC/-HESI-MS/MS i UHPLC/+HESI-MS/MS karakterizacija komponenti metanolnih ekstrakata Lepidium sativum korišćenjem razliĉitih tipova skeniranja u masenoj spektrofotometriji, uz energiju kolizione ćelije od 30 eV. Identifikacija -HESI-MS/MS eksperimenti DAD podaci Rt (min) FS M- H - m/z PIS MS 2 fragmenti (m/z (relativna zastupljenost %)) NLS Rt (min) max (nm) cis-sinapoil glukoza l 2,89 385 385 257 (5), 232 (5), 223 (5), 205 (35), 191 (5), 190 (100), 175 (40), 164 (10) 162 2.77 240, 330 trans-sinapoil glukoza 3,03 385 385 257 (5), 232 (5), 223 (5), 205 (35), 191 (5), 190 (100), 175 (40), 164 (10) 162 2.95 240, 330 Sinapoil malat l 4,18 339 339 223 (15), 207 (5), 193 (10), 164 (100) 4,10 240, 330 +HESI-MS/MS eksperimenti DAD podaci Rt (min) FS M+H + m/z PIS MS 2 fragmenti (m/z (relativna zastupljenost %)) NLS Rt (min) max (nm) Sinapaldehid l 2,59 209 209 209 (5), 203 (5), 164 (5), 150 (20), 149 (5), 107 (10), 106 (100), 105 (85) 2,51 230, 330 cis- sinapin (sinapoil holin) l 2,90 310 310 251 (100), 236 (8), 235 (15), 207 (55), 206 (10),191 (8), 179 (10), 175 (100), 164 (10), 163 (15), 162 (8) 2,85 240, 330 trans- sinapin (sinapoil holin) l 3,16 310 310 251 (100), 236 (8), 235 (15), 207 (55), 206 (10),191 (8), 179 (10), 175 (100), 164 (10), 163 (15), 162 (8) 3,08 240, 320 Sinapična kiselina S 3,85 225 225 207 (20), 192 (10), 174 (8), 164 (6), 149 (30), 147 (12), 132 (12), 119 (15), 118 (25), 101 (12), 91 (100), 89 (10) 3,77 240, 320 a Brojevi pikova, prema Slici 1 s PotvrĊeno standardima lPotvrĊeno na osnovu literaturnih podataka Podebljanim slovima su obeleţeni MS2 fragmenti koji su korišćeni u SRM eksperimentu Relativna koliĉina dominantnih fenilpropanoidnih jedinjenja koja se akumuliraju u semenima kresa i hidrolizuju za vreme klijanja prikazana je na Slici 41 A-D. Primećen je isti trend opadanja koliĉine sinapaldehida sa vremenom i kod kontrolnih klijanaca kresa i kod klijanaca koji su rasli u ko-kulturi sa N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, stim što je od drugog do petog dana koliĉina sinapaldehida veća kod klijanaca koji su rasli u ko-kulturi sa N. rtanjensis i N. sibirica nego kod kontrolnih klijanaca i klijanaca ko-kultivisanih sa N. nervosa (Slika 41A). 114 Od prvod do petog dana kod svih klijanaca, kako kontrolnih, tako i ko- kultivisanih dolazi do povećanja koliĉine sinapoil-glukoze (Slika 41B), s tim što se znatno manja koliĉina sinapoil-glukoze stvara kod klijanaca koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis i N. sibirica. Na Slici 41C primećuje se isti trend opadanja koliĉine sinapoil-holina tokom vremena kod kontrolnih klijanaca kresa i kod klijanaca ko-kultivisanih sa tri vrste Nepeta. Primećuje se da se trećeg, ĉetvrtog i petog dana stvara veća koliĉina sinapoil- holina kod klijanaca kresa koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis i N. sibirica. Pored toga, koliĉina sinapoil-malata opada sa vremenom kod svih klijanaca kresa (Slika 41D). U poreĊenju sa kontrolnim klijancima, koliĉina sinapoil-malata kod klijanaca kresa koji su ko-kultivisani sa N. rtanjensis i N. sibirica je od trećeg do petog dana znaĉajno manja, dok kod klijanaca kresa koji su ko-kultivisani sa N. nervosa koliĉina sinapoilmalata je od prvog do petog dana znaĉajno manja u poreĊenju sa kontrolnim klijancima. 115 Slika 41. Relativna koliĉina A) sinapaldehida B) sinapoil-glukoze C) sinapoil-holina D) sinapoil-malata u klijancima kresa tokom 5 dana gajenja in vitro: a) kontrolni klijanci; klijanci koji su ko-kultivisani in vitro sa b) N. rtanjensis, c) N. sibirica i d) N. nervosa. Vrednosti su normalizovane u odnosu na 1 g sveţe mase. 116 4.6.3. Ispitivanje alelopatskog efekta trans,cis-nepetalaktona, cis,trans- nepetalaktona, α-pinena i -pinena na klijanje odabranih poljoprivrednih kultura i korovskih vrsta Rezultati hemijskih analiza su pokazali da osim nepetalaktona, koji su dominantna isparljiva jedinjenja kod N. rtanjenjsis i N. cataria, ispitivane vrste poseduju i druga isparljiva jedinjenja, naroĉito iz grupe monoterpena i seskviterpena. U Tabeli 12 je prikazana procentualna zastupljenost pojedinih isparljivih jedinjenja etarskog ulja N. rtanjensis koja je odreĊena GC-MS analizom. Tabela 12. GC-MS analiza etarskog ulja N. rtanjensis Jedinjenje Zastupljenost [%] Jedinjenje Zastupljenost [%] α-pinen 2,99 α-kopaen 0,86 -pinen 0,40 trans,cis-nepetalakton 72,03 1,8-cineol 0,26 δ-kadinen 0,15 α -kamfolenal 0,21 γ-kadinen 0,59 2-metoksi-para- krezol 1,69 α-kalakoren 0,12 cis,trans-nepetalakton 16,31 α-kadinol 0,13 Moţe se pretpostaviti da sva prisutna isparljiva jedinjenja u odreĊenoj meri mogu doprineti alelopatskom efektu ispitivanih vrsta. S ciljem da se dalje rašĉlani pojedinaĉni efekat cis,trans-nepetalaktona, trans,cis-nepetalaktona, α-pinena i -pinena, ispitan je efekat etarskog ulja N. rtanjensis koje sadrţi 73 % trans,cis-nepetalaktona, etarskog ulja N. cataria koje sadrţi 90 % cis,trans-nepetalaktona kao i standarda monoterpena α- i - pinena na klijanje nekoliko poljoprivrednih kultura (Lactuca sativa L. sorta „Majska kraljica―, Lotus corniculatus L. sorta „Bokor― (ţuti zvezdan), Brassica napus L. (uljana repica)), i korovskih vrsta (Stellaria media (L.) Vill. (mišjakinja), Rumex crispus L. (štavelj) i Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotip Kolumbija). U sluĉaju kontrolne grupe semena L. sativum (fam. Brassicaceae) (Slika 42 A), pokazano je da se maksimum klijanja dostiţe već posle 24 sata. Cis,trans- izomer (Slika 42 Aa), a naroĉito trans,cis- izomer nepetalaktona (Slika 42 Ab) znaĉajno usporavaju dinamiku klijanja. 117 Na koncentracijama trans,cis-nepetalaktona višim od 0,53%, semena ĉak ni posle 5 dana ne dostiţu maksimum klijanja. Na najvišoj primenjenoj koncentraciji ovog izomera proklijalo je samo 35% semena. Kada su semena isklijavana u atmosferi cis,trans-nepetalaktona primećeno je usporeno klijanje semena u odnosu na kontrolnu grupu, pa su petog dana samo dve najviše koncentracije pokazale znaĉajan efekat na klijanje semena; pri ĉemu je takoĊe zabeleţen visok procenat klijanja od 90% i 87,5% na koncentracijama cis,trans-nepetalaktona od 2,15% i 4,30%. α-pinen (Slika 42 Ac) i β-pinen (Slika 42 Ad) blago usporavaju dinamiku klijanja semena kresa, ali već drugog dana, na svim ispitivanim koncentracijama, semena su klijala do nivoa kontrole. (Slika A). Statistiĉka analiza je predstavljena u Tabelama 13 i 14. Semena Lactuca sativa (fam. Asteraceae) pokazala su veliku osetljivost na ispitivana jedinjenja u svim primenjenim koncentracijama, a naroĉito na dva izomera nepetalaktona (Slika 42 B). Kontrolna grupa semena salate dostiţe maksimum klijanja šestog dana (85%). Tretmani trans,cis- i cis,trans-nepetalaktonom u koncentracijama višim od 0,52% u sluĉaju trans,cis- izomera (Slika 42 Ba) i 0,26% u sluĉaju cis,trans- izomera nepetalaktona (Slika 42 Bb), doveli su do potpune inhibicije klijanja semena salate. Na koncentracijama dva izomera niţim od pomenutih zabeleţena je znaĉajno usporena dinamika klijanja, pri ĉemu je maksimum klijanja na ovim tretmanima postignut šestog dana i iznosio je 12,5%. U poreĊenju sa kontrolnom grupom, α-pinen (Slika 42 Bc) i -pinen (Slika 42 Bd) takoĊe znaĉajno utiĉu na klijanje semena salate. Sa porastom koncentracije ovih monoterpena dolazi do znaĉajnog usporavanja dinamike klijanja semena, naroĉito u sluĉaju α-pinena gde dve najveće primenjene koncentracije skoro potpuno inhibiraju klijanje semena salate. Statistiĉka analiza je predstavljena u Tabelama 13 i 14. Praćen je efekat razliĉitih koncentracija cis,trans-nepetalaktona, trans,cis- nepetalaktona, α-pinena i -pinena na procenat klijanja semena ţutog zvezdana (Lotus corniculatus, fam. Fabaceae), i na dinamiku klijanja semena tokom 9 dana u kulturi in vitro, pošto semena ţutog zvezdana dostiţu punu klijavost tek osmog dana (80%). Dinamika klijanja semena ţutog zvezdana na tretmanima sa cis,trans-nepetalaktonom (Slika 43 Ab), α-pinenom (Slika 43 Ac)i -pinenom (Slika 43 Ad) je imala isti trend kao kod kontrolne grupe semena, bez obzira na koncentraciju primenjenih jedinjenja. 118 Sve primenjene koncentracije trans,cis-nepetalaktona su imale inhibitorni efekat na klijanje semena, znaĉajno usporavajući dinamiku njihovog klijanja (Slika 43 Aa). Najizraţeniji efekat je imala najveća primenjena koncentracija ovog monoterpena (4,3%), pa broj proklijalih semena nakon 9 dana nije prelazio 50%. Statistiĉka analiza rezultata je predstavljena u Tabelama 13 i 14. Semena uljane repice (Brassica napus, fam Brassicaceae) su u eksperimentima pokazala visoku otpornost na alelopatski efekakt svih ispitivanih jedinjenja. Znaĉajna inhibicija klijanja semena uljane repice sa porastom koncentracije cis,trans- nepetalaktona (Slika 43 Bb), trans,cis-nepetalaktona (Slika 43 Ba), α-pinena (Slika 43 Bc) i -pinena (Slika 43 Bd), uoĉena je samo prvog dana. Kako semena kontrolne grupe dostiţu maksimalnu klijavost već drugog dana, a tada nije uoĉen efekat ispitivanih jedinjenja i njihovih razliĉitih koncentracija na klijanje, moţe se reći da nije uoĉeno alelopatsko dejstvo na ovu vrstu semena (Slika 43 B). Statistiĉka analiza rezultata je predstavljena u Tabelama 13 i 14. Uticaj ispitivanih jedinjenja na klijanje semena Rumex crispus (fam. Polygonaceae) praćen je tokom ĉetiri dana u kulturi in vitro, s obzirom da semena ove vrste dostiţu maksimalnu vrednost klijanja ĉetvrtog dana. Rumex crispus je pokazao visok stepen otpornosti na alelopatski efekat ispitivanih jedinjenja, u svim primenjenim koncentracijama (Slika 44 A). Efekat trans,cis-nepetalaktona, cis,trans-nepetalaktona, α-pinena i -pinena na klijanje semena obiĉnog štavelja ogleda se jedino u blagom usporavanju dinamike klijanja do ĉetvrtog dana, naroĉito u sluĉaju trans,cis- nepetalaktona (Slika 44 Aa). Statistiĉka analiza rezultata je predstavljena u Tabelama 13 i 14. Uoĉen je visok stepen osetljivosti semena mišjakinje (Stellaria media, fam. Caryophyllaceae) na alelopatsko dejstvo ispitivanih jedinjenja (Slika 44 B). Semena S. media u našim eksperimentalnim uslovima dostiţu maksimum klijanja drugog dana. Sa porastom koncentracije monoterpena koji su korišćeni u eksperimentima, raste inhibitorno dejstvo na klijanje semena, naroĉito u sluĉaju trans,cis-nepetalaktona (Slika 44 Ba) i cis,trans-nepetalaktona (Slika 44 Bb). 119 Najmanja primenjena koncentracija oba izomera nepetalaktona drastiĉno usporava dinamiku klijanja semena mišjakinje, pri ĉemu se maksimum klijanja dostiţe petog dana i iznosi 5% u sluĉaju trans,cis- izomera i oko 33% u sluĉaju cis,trans- izomera nepetalaktona. Koncentracije oba izomera više od 0,13% potpuno inhibiraju klijanje semena ove vrste. Sa porastom koncentracije α-pinena i -pinena uoĉeno je opadanje procenta klijanja semena, kao i znaĉajno usporavanje dinamike klijanja semena mišljakinje. Na svim tretmanima α-pinenom i -pinenom maksimalna klijavost uoĉena je petog dana, i te vrednosti se zadrţavaju do osmog dana. Dve najviše primenjene koncentracije α-pinena (2,15% i 4,3%) u potpunosti inhibiraju klijanje semena S. media (Slika 44 Bc). U sluĉaju -pinena (Slika 44 Bd), najveće alelopatsko dejstvo detektovano je u prisustvu 4,3% ovog monoterpena. Statistiĉka analiza rezultata je predstavljena u Tabelama 13 i 14. Efekat alelopatskog dejstva etarskog ulja N. rtanjensis i N. cataria, kao i α- pinena i -pinena na klijanje semena Arabidopsis thaliana (fam. Brassicaceae) praćen je od ĉetvrtog do devetog dana, nakon što su semena stratifikovana na 4○C tokom tri dana u mraku. Odmah po izlaganju uslovima dugog dana, kontrolna semena su klijala 100%, dok su semana na tretmanu sa α-pinenom (Slika 45 Ac) i -pinenom (Slika 45 Ad) dostigla maksimalnu klijavost sa zakašnjenjem od jednog dana, tj. drugog dana nakon završene stratifikacije. Na osnovu toga se moţe zakljuĉiti da ova dva monoterpena blago usporavaju dinamiku klijanja semena A. thaliana na svim primenjenim koncentracijama. Koncentracije cis,trans-nepetalaktona do 1,07% utiĉu na klijanje semena A. thaliana tako što blago usporavaju dinamiku klijanja, a maksimum klijanja se dostiţe petog dana, tj. drugog dana nakon stratifikacije (Slika 45 Ab). Dalji porast koncentracije ovog izomera znaĉajno utiĉe na dinamiku klijanja semena, kao i generalno na procenat klijanja koji nakon 9 dana iznosi oko 83% na tretmanu sa 2,15% cis,trans-nepetalaktona i oko 48% na tretmanu sa 4,3% istog izomera. U ovim sluĉajevima se maksimalna klijavost dostiţe osmog dana. Koncentracije trans,cis- nepetalaktona od 4,3% i 2,15%, smanjile su broj proklijalih semena na 48%, tj. 35%, dok su na ostalim koncentracijama semena klijala u istom procentu kao i u kontrolnim uslovima, ali sa smanjenom dinamikom (Slika 45 Aa). Statistiĉka analiza rezultata je predstavljena u Tabelama 13 i 14. 120 Slika 42. Uticaj metanolnog razblaţenja etarskog ulja a) N. rtanjensis (sadrţi 73% trans,cis-nepetalaktona); b) etarskog ulja N. cataria (sadrţi 90% cis,trans- nepetalaktona); c) standarda α-pinena i d) -pinena, na klijanje semena A) Lepidium sativum L. i B) Lactuca sativa L. Na histogramima su predstavljene srednje vrednosti dva eksperimenta. 121 Slika 43. Uticaj metanolnog razblaţenja etarskog ulja a) N. rtanjensis (sadrţi 73% trans,cis-nepetalaktona); b) etarskog ulja N. cataria (sadrţi 90% cis,trans- nepetalaktona); c) standarda α-pinena i d) -pinena, na klijanje semena A) Lotus corniculatus L. i B) Brassica napus L. Na histogramima su predstavljene srednje vrednosti dva eksperimenta. 122 Slika 44. Uticaj metanolnog razblaţenja etarskog ulja a) N. rtanjensis (sadrţi 73% trans,cis-nepetalaktona); b) etarskog ulja N. cataria (sadrţi 90% cis,trans- nepetalaktona); c) standarda α-pinena i d) -pinena, na klijanje semena A) Rumex crispus L. B) Stellaria media (L). Vill. Na histogramima su predstavljene srednje vrednosti dva eksperimenta. 123 Slika 45. Uticaj metanolnog razblaţenja etarskog ulja a) N. rtanjensis (sadrţi 73% trans,cis-nepetalaktona); b) etarskog ulja N. cataria (sadrţi 90% cis,trans- nepetalaktona); c) standarda α-pinena i d) -pinena, na klijanje semena Arabidopsis thaliana L. Heynh. ekotip Kolumbija. Na histogramima su predstavljene srednje vrednosti dva eksperimenta. Tabela 13. Statistiĉka analiza podataka (% klijanja semena) dobijenih za kontrolnu grupu semena svake ispitivane vrste. Analiza je predstavljena za dane kada su semena dostigla maksimalnu klijavost. vrsta 1. dan 2. dan 3. dan 4. dan 5. dan 6. dan 7. dan 8. dan 9. dan Lepidium sativum 100 a 100 a Lotus corniculatus 19 a 52 b 55 b 65 c 68 c 69 c 80 d 80 d Brassica napus napus 24 a 98 b Lactuca sativa 59 a 64 ab 68 ab 74 bc 79 cd 84 cd 85 d Stellaria media 48 a 85 b 85 b 88 b 90 b 90 b Arabidopsis thaliana 97 a 100 a 100 a Rumex crispus 65 a 92 b 124 Tabela 14. Statistiĉka analiza podataka (% klijanja semena) dobijenih za sve koncentracije trans,cis-nepetalaktona, cis,trans-nepetalaktona, α-pinena i -pinena. Analiza je predstavljena za dane kada je kontrolna grupa semena dostigla maksimalnu klijavost. K [%] Lepidum sativum 1. dan Lotus corniculatus 8.dan Brassica napus 2.dan Lactuca sativa 5.dan Stelaria media 4.dan Arabidopsis thaliana 4.dan Rumex crispus 4.dan tr a n s, ci s- n ep et a la k to n 0 100 b 80 e 98 b 79 b 85 c 98 d 92 a 0,13 20 a 65 d 100 b 0 a 5 b 75 c 92 a 0,26 12 a 50 bcd 100 b 0 a 0 a 35 b 92 a 0,53 10 a 42 ab 100 b 0 a 0 a 0 a 100 a 1,07 10 a 68 d 100 b 0 a 0 a 0 a 95 a 2,15 10 a 58 cd 100 b 0 a 0 a 0 a 92 a 4,30 8 a 32 a 92 a 0 a 0 a 0 a 92 a ci s, tr a n s- n ep et a la k to n 0 100 d 80 b 98 a 79 b 85 c 98 e 92 a 0,13 32 c 78 ab 100 a 0 a 18 b 45 d 100 b 0,26 30 bc 78 ab 100 a 0 a 0 a 25 cd 100 b 0,53 28 bc 78 ab 100 a 0 a 0 a 12 bc 100 b 1,07 15 ab 75 ab 100 a 0 a 0 a 2 ab 100 b 2,15 15 ab 75 ab 100 a 0 a 0 a 0 a 100 b 4,30 10 a 62 a 100 a 0 a 0 a 0 a 100 b α - p in en 0 100 c 80 a 98 a 79 e 85 c 98 b 92 a 0,13 72 ab 70 a 100 a 78 e 85 c 78 a 100 a 0,26 72 b 70 a 100 a 55 d 38 b 75 a 98 a 0,53 72 b 75 a 100 a 38 c 42 b 72 a 98 a 1,07 65 ab 75 a 100 a 18 b 0 a 72 a 98 a 2,15 65 ab 70 a 100 a 8 ab 0 a 65 a 98 a 4,30 40 a 78 a 100 a 2 a 0 a 65 a 98 a  - p in en 0 100 f 80 a 98 a 79 c 85 d 98 b 98 a 0,13 95 e 70 a 100 a 75 bcd 75 d 85 a 100 b 0,26 88 de 70 a 100 a 70 bcd 45 c 80 a 92 a 0,53 78 cd 70 a 100 a 50 ab 35 bc 78 a 98 a 1,07 70 bcd 68 a 100 a 40 a 18 b 73 a 100 b 2,15 55 b 68 a 100 a 35 a 2 a 65 a 100 b 4,30 25 a 68 a 100 a 35 a 0 a 65 a 100 b 125 5. DISKUSIJA Sekundarni metaboliti biljaka se zbog mnogobrojnih bioloških i farmakoloških osobina koje pokazuju, ĉesto oznaĉavaju i kao bioaktivna jedinjenja. Iako se ranije smatralo da su sekundarni metaboliti sporedni produkti metabolizma bez znaĉaja za biljke, danas se zna da oni ostvaruju mnoge fiziološke i ekološke funkcije u samoj biljci. Etarska ulja štite biljku od prevelikog zagrevanja, uĉestvuju u privlaĉenju insekata, odbrani od herbivora, itd. Sa stanovišta ekologije veoma je bitna alelopatska i repelentna uloga sekundarnih metabolita koja opravdava njihovu upotrebu kao prirodnih herbicida i insekticida. Flavonoidi, terpenoidi i alkaloidi su najviše korišćene klase sekundarnih metabolita u hemotaksonomskim studijama (Marin, 2003). Danas se sekundarni metaboliti upotrebljavaju u industriji hrane kao konzervansi i zaĉini. Produkti sekundarnog metabolizma se koriste u farmaceutskoj industriji kao bioaktivna jedinjenja koja imaju mnogobrojne medicinske efekte (Wyk i Wink, 2004). Razliĉiti glikozidi se koriste u leĉenju srĉane isuficijencije, dok su mnogi alkaloidi našli primenu u industriji lekova. Morfin se koristi za ublaţavanje bolova, kodein za ublaţavanje kašlja, papaverin predstavlja inhibitor diesteraza, kinin ispoljava antimalariĉno dejstvo, rezerpin se upotrebljava za leĉenje hipertenzije, galantamin je inhibitor acetil-holin esteraze, dok kapsaicin ublaţava reumatske bolove (Karruppusamy, 2009). Opisan je veliki broj bioloških aktivnosti vrsta roda Nepeta, ukljuĉujući repelentnu aktivnost protiv insekata (komaraca, bubašvaba, crva i krpelja), i ulogu feromona kod maĉaka (Bates i Sigel, 1963, Peterson i Coats, 2001, Peterson i sar., 2002, Chauhan i sar., 2005, Bernier i sar., 2005, Webb i Russel, 2007, Polsomboon i sar.,2008, Spero i sar., 2008, Birkett i sar., 2010). Vrste ovog roda takoĊe pokazuju i brojne farmakološke aktivnosti, kao što su: antiviralno, citotoksiĉno, antiinflamatorno, analgetiĉko i antimutageno dejstvo (Harney i sar., 1978, Aydin i sar., 1999, Aydin i sar. 1998, Duke i sar., 2002, Badisa i sar., 2003, Galati i sar., 2004, Miceli i sar., 2005, Rabbami i sar., 2008, Rigano i sar., 2011). Već duţi niz godina se ispituje antimikrobno dejstvo etarskog ulja vrsta roda Nepeta. 126 Pokazan je znaĉajan antibakterijski i antifungalni efekat etarskih ulja vrsta N. crispa, N. rtanjensis, N. cataria, N. nuda subsp. albiflora, N. camphorata N. argolica, N. juncea, N. leavigata, N. kurramensis, N. septemcrenata i drugih (Kalpoutzakis i sar., 2001, Sonboli i sar., 2004, Stojanović i sar., 2005, Adiguzel i sar., 2009, Alim i sar., 2009, Hussain i sar., 2009, El-Moaty, 2010, Shinwari i sar., 2013). Pored toga, pokazano je da ekstrakti vrsta N. flavida, N. mayeri, N. sibthorpi, N. italica, N. cilicia, N. caesarea imaju znaĉajan antioksidativni potencijal za razliku od odgovarajućih etarskih ulja, koja pokazuju slabo antioksidativno dejstvo (Yazici i sar., 2001, Miceli i sar., 2005, Tepe i sar., 2007, Cigremis i sar., 2010). Poslednjih godina raste interes za upotrebu prirodnih jedinjenja u kontroli rasta korovskih vrsta. Kobaisy i sar., (2005) i Mancini i sar., (2009) su pokazali alelopatski potencijal etarskih ulja N. pannonica, N. curviflora i N. nuda, dok isparljiva jedinjenja vrste N. fassennii inhibiraju klijanje test vrste L. sativum (Hyun Eon i sar., 2006). TakoĊe je pokazano da ekstrakt N. meyeri inhibira klijanje i rast klijanaca nekih korovskih vrsta i poljoprivrednih kultura (Mutlu i sar., 2011, Mutlu i Atici, 2009). Kao objekti istraţivanja, u ovoj doktorskoj disertaciji korišćene su tri endemiĉne vrste roda Nepeta, za koje u literaturi postoje oskudni podaci o biološkim aktivnostima koje pokazuju. Poznato je da etarsko ulje N. rtanjensis ima snaţno antibakterijsko i antifungalno dejstvo, dok za N. sibirica i N. nervosa u literaturi ne postoje podaci o biološkkim aktivnostima. Prema tome, ovom disertacijom je po prvi put ispitana antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa, kao i njihov antioksidativni potencijal. TakoĊe, ova disertacija po prvi put ukazuje na znaĉajno alelopatsko dejstvo monoterpena, koji su glavne komponente etarskih ulja vrsta N. rtanjensis i N. sibirica. S obzirom da se radi o endemiĉnim i retkim biljnim vrstama, a u sluĉaju N. rtanjensis i o krajnje ugroţenoj vrsti, biljni materijal za potrebe eksperimenata je dobijen gajenjem biljaka u uslovima in vitro. Uspešna mikropropagacija vrste N. rtanjensis je ranije opisana (Mišić i sar, 2005a, Mišić i sar, 2005b), pri ĉemu su kao eksplantati korišćeni segmenti stabla sa po jednim nodusom i vršni delovi stabala. Isti protokol za mikropropagaciju je primenjen i za vrste N. sibirica i N. nervosa. 127 Sve tri ispitivane vrste su pokazale visok stepen regeneracije i multiplikacije u uslovima u kojima su gajene. Generalno, in vitro kulture predstavljaju dobar izvor biljnog materijala za potrebe eksperimenata. U literaturi postoje podaci samo za in vitro gajenje vrste N. nuda ssp. nuda koja najveći stepen regeneracije i multiplikacije postiţe uz primenu regulatora rastenja, auksina i citokinina (Nedelkova i sar., 2011). Pokazano je da u kulturi izdanaka N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa dolazi do produkcije osnovnih grupa sekundarnih metabolita karakteristiĉnih za vrste roda Nepeta. Biljke gajene in vitro su fitohemijski okarakterisane korišćenjem serije razliĉitih analitiĉkih metoda kao što su GC-MS, CG-FID, PTR-MS, Headspace-GC-MS, HPLC-DAD, HPLC-MS i UHPLC/DAD/HESI-MS/MS. Uspešno su identifikovani i kvantifikovani glavni bioaktivni sekundarni metaboliti u metanolnim i dihlor- metanskim ekstraktima nadzemnih delova biljaka i u atmosferi posuda u kojima su gajene tri vrste roda Nepeta. Od isparljivih jedinenja, kod vrsta N. rtanjensis i N. sibirica, kao dominantno jedinjenje identifikovan je monoterpen nepetalakton, dok su druga isparljiva jedinjenja iz grupe monoterpena i seskviterpena prisutna u znatno manjoj koliĉini. Cis,trans- izomer nepetalaktona je dominantan kod vrste N. sibirica, dok je kod N. rtanjensis to trans,cis-nepetalakton. GC-MS i CG-FID analize su potvrdile prisustvo ovih jedinjenja u metanolnim i dihlor-metanskim ekstraktima nadzemnih delova. Identifikacija isparljivih jedinjenja u atmosferi posuda za gajenje biljaka uraĊena je Headspace-GC-MS analizom, dok je PTR-MS analiza omogućila njihovu kvantifikaciju. PTR-MS analiza se pokazala veoma korisnom u našim istraţivanjima pošto obezbeĊuje on line monitoring isparljivih jedinjenja na osnovu njihovih masa, u realnom vremenu. Ova metoda je u našim eksperimentima po prvi put korišćena za identifikaciju i kvantifikaciju isparljivih jedinjenja u biljnim kulturama in vitro (Nestorović i sar., 2009a, Nestorović i sar., 2009b, Nestorović i sar., 2010). Vrsta N. nervosa se generalno odlikuje niskim sadrţajem isparljivih jedinjenja, dok je nepetalakton detektovan samo u tragovima. Ĉinjenica da se tri vrste koje smo odabrali za objekte u eksperimentima odlikuju razliĉitim kvalitativnim sadrţajem nepetalaktona, omogućila je ispitivanje i razdvajanje antimikrobnog, antioksidativnog i alelopatskog dejstva razliĉitih stereoizomera nepetalaktona, ĉime je omogućena potvrda hipoteze da stereohemija nepetalaktona utiĉe na njegove biološke aktivnosti. 128 Produkcija i akumulacija sekundarnih metabolita u kulturi in vitro ćelija i kalusa uspešno je demonstrirana u sluĉaju diterpenoida i seskviterpenoida, ali retko u sluĉaju monoterpenoida (Knoss, 1999). Kulture kalusa Nepeta cataria, Salvia officinalis, Mentha spicata i M. piperita i mnogih drugih vrsta fam. Lamiaceae, ne proizvode merljive koliĉine monoterpenoida koje su karakteristiĉne za intaktne biljke (Downing i Mitchelli, 1975, Falk i sar., 1990). Izostanak vidljive akumulacije monoterpenoida moţe biti posledica odsustva biosinteze u nediferenciranim ćelijama kakve su ćelije kalusa, ali i njihove degradacije i ukljuĉivanja u kataboliĉke procese (Falk i sar., 1990). Biosinteza i akumulacija monoterpenoida kod vrsta fam. Lamiaceae obiĉno je povezana sa prisustvom sekretornih struktura, epidermalnih ţlezdanih trihoma. Usled odsustva ţlezdanih struktura kod in vitro kultura ćelija i tkiva, verovatno izostaje de novo sinteza monoterpenoida. TakoĊe, moguće je da u kalusnim tkivima dolazi do sinteze terpena, ali u koliĉinama koje nisu detektabilne primenjenim analitiĉkim metodama. S druge strane, u kulturi in vitro izdanaka velikog broja vrsta fam. Lamiaceae primećena je biosinteza i akumulacija monoterpenoida: Salvia officinalis (Santos-Gomes i Fernandes-Ferreira, 2003), Rosmarinus officinalis (Tawfik, 1998), N. rtanjensis (Mišić, 2003, Mišić i sar., 2005a, Nestorović i sar., 2010), N. sibirica, N. nervosa (Nestorović i sar., 2010). Kod in vitro gajenih N. rtanjensis i N. sibirica skenirajućom elektronskom mikroskopijom ustanovljeno je prisustvo velikog broja kapitatnih i peltatnih ţlezdanih trihoma, što je povezano sa detekcijom znaĉajne koliĉine monoterpena nepetalaktona. Kod vrste N. nervosa, koja u uslovima in vitro produkuje znaĉajno niţe koliĉine isparljivih monoterpenoidnih i seskviterpenoidnih jedinjenja, primećen je i srazmerno manji broj ţlezdanih struktura. Postoji veoma malo literaturnih podataka o postojanju ţlezdanih struktura kod aromatiĉnih biljnih vrsta familije Lamiaceae u uslovima in vitro. Zuzarte i sar. (2010) su skenirajućom elektronskom mikroskopijom kod lavande, gajene u uslovima in vitro, detektovali prisustvo velikog broja kapitatnih i peltatnih ţlezdanih trihoma. U pogledu produkcije sekundarnih metabolita in vitro kultura omogućava selekciju visokoproduktivnih ćelijskih linija, pruţa mogućnost modifikacije hranljive podloge u cilju veće produkcije sekundarnih metabolita, omogućava upotrebu abiotiĉkih i biotiĉkih elicitora (Jeong i Park, 2007), omogućava razliĉite genetiĉke transformacije i modifikacije ekspresije gena koji su povezani sa biosintezom ţeljenog 129 produkta sekundarnog metabolizma (Sévon i sar., 2002, Bourgaud i sar., 2001), i omogućava produkciju velike koliĉine sekundarnih metabolita u bioreaktorima (Bourgaud i sar., 2001). Druga grupa sekundarnih metabolita od interesa u našim istraţivanjima su fenolna jedinjenja, kojima se pripisuje veliki broj bioloških aktivnosti, ukljuĉujući antimikrobno, antioksidativno i alelopatsko dejstvo. UHPLC/DAD/HESI-MS/MS analiza je omogućila identifikaciju i kvantifikaciju dominantnih fenolnih kiselina u metanolnim ekstraktima nadzemnih delova biljaka koje su gajene u uslovima in vitro. Ruzmarinska kiselina je zabeleţena kao glavna fenolna kiselina u metanolnim ekstraktima sve tri ispitivane vrste. Kod vrsta N. sibirica i N. rtanjensis, kao znaĉajne komponente prisutni su i derivati ruzmarinske kiseline. Ruzmarinska kiselina je takoĊe detekotovana u kulturi in vitro izdanaka mnogih vrsta familije Lamiaceae kao što su Origanum vulgare (Yang i Shetty, 1998), Zataria multiflora (Mohagheghzadeh i sar., 2004) Salvia officinalis i S. fruticosa (Kintzios i sar., 1999), Mentha longifolia i M. piperita (Krzyzanowska i sar., 2011), Rosmarinus officinalis (Kuhlaman i Rühl, 2006), itd. Pored ruzmarinske kiseline, biljke gajene u uslovima in vitro mogu da sintetišu i druga fenolna jedinjenja, kao što su: cirsimaritin, kafeinska kiselina, karnoziĉna kiselina, hlorogena kiselina, galna kiselina itd. (Santos-Gomes i sar., 2002). Bitno je istaći da opisana UHPLC/DAD/HESI-MS/MS metoda omogućava brzu, pouzdanu i efikasnu identifikaciju jedinjenja od interesa, a to su u ovom sluĉaju nepetalaktoni i fenolne kiseline. Visoka kvalitativna i kvantitativna varijabilnost ove dve grupe jedinjenja kod vrsta roda Nepeta, kvalifikuje ih kao dobar marker sistem za procenu hemijskog diverziteta u okviru roda Nepeta. Prema tome, metoda koja je razvijena moţe imati širi znaĉaj i primenu u hemotaksonomiji i populacionoj genetici, ali i praktiĉnu primenu prilikom odabira vrsta koje poseduju odreĊene grupe jedinjenja od interesa. 130 5.1. Antioksidativna aktivnost N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa Poslednjih godina raste interesovanje za upotrebu prirodnih antioksidanasa u cilju oĉuvanja zdravlja, zbog njihove osobine da mogu da zaštite ćelije i organizam od oštećenja koja su izazvana oksidativnim stresom. Mnoga istraţivanja pokazuju da su aromatiĉne biljke, koje sadrţe veliku koliĉinu fenolnih jedinjenja dobar izvor prirodnih antioksidanasa (Lamaison i sar., 1991, Tepe i sar., 2007, Erkan i sar., 2009, Sarahroodi i sar., 2013). Osobine fenolnih jedinjenja kao što su antikancerogena, antimutagena i zaštitna uloga mogu se povezati sa njihovom antioksidativnim svojstvima da eliminišu slobodne radikale i spreĉavaju lipidnu peroksidaciju (Potter, 2005). Pokazane su razlike u pogledu antioksidantivne aktivnosti izmeĊu glavnih grupa fenolnih jedinjenja. Flavonoidi pokazuju bolji antioksidativni potencijal u poreĊenju sa flavonolima, dok su derivati cimetne kiseline (kumarinska, kafeinska, ruzmarinska, ferulinska, sinapinska i hlorogena kiselina) bolji antioksidansi od derivata benzoeve kiseline (vanilinska, galna, elaginska, protokatehinska, siringinska i gentisinska kiselina) (Soobratte i sar., 2005). Fadel i sar. (2011) su pokazali da se molekuli ruzmarinske kiseline vezuju za polarne lipide ćelijske membrane pri ĉemu ne menjaju strukturu i propustljivost membrana, a dovode do spreĉavanja lipidne peroksidacije u prisustvu reaktivnih kiseoniĉnih vrsta. Isti autori su takoĊe pokazali da ruzmarinska kiselina moţe prolaziti kroz membrane ne narušavajući njenu strukturu. Nekoliko vrsta iz roda Nepeta je već analizirano u pogledu postojanja antioksidativne aktivnosti. Tepe i sar., (2007) su pokazali da postoji pozitivna korelacija izmeĊu antioksidativne sposobnosti N. flavida i koliĉine ukupnih fenolnih jedinjenja. Ekstrakt N. meyeri u acetonu koji sadrţi veliku koliĉinu fenolnih jedinjenja pokazuje redukujuću sposobnost prema DPPH. i NO. radikalima (Cigremis i sar., 2010). Miceli i sar. (2005) su antioksidativni potencijal metanolnog ekstrakta N. sibthorpii takoĊe pripisali fenolnim jedinjenjima, meĊu kojima se kao dominantno fenolno jedinjenje izdvaja hlorogena kiselina. Yazici i sar., (2010) su odredili antioksidativni potencijal i koliĉinu ukupnih fenolnih jedinjenja kod N. italica, N. cilicia i N. caesarea. Vrsta koja sadrţi najviše fenolnih jedinjenja (N. italica) pokazala je i najveći antioksidativni potencijal. 131 Mnoge druge biljne vrste fam. Lamiaceae koje kao dominantna fenolna jedinjenja sadrţe ruzmarinsku kiselinu pokazuju znaĉajan antioksidativni potencijal, ukljuĉujući vrste Salvia officinalis, Rosmarinus officinalis, Origanum vulgare, Lycopus europaeus, i druge (Lamaison i sar., 1991). Za razliku od ekstrakata koji kao glavne komponente sadrţe fenolna jedinjenja, etarska ulja Nepeta su se pokazala kao znatno slabiji antioksidansi. Etarska ulja N. sessilifolia i N. laxiflora, koja kao dominantna jedinjenja sadrţe oksidovane monoterpenoide, pokazuju slabu antioksidativnu aktivnost (Safaei-Ghomi i sar., 2011). Mothana (2012) je pokazao slab antioksidativni potencijal etarskog ulja N. deflersiana koje sadrţi preko 30% oksidovanih monoterpenoida i preko 30% oksidovanih seskviterpenoida. TakoĊe, etarsko ulje Nepeta nuda ssp. albiflora pokazuje slab antioksidativni potencijal (Alim i sar., 2009). Etarsko ulje N. ispahanica, koje kao dominantno jedinjenje sadrţi 1,8-cineol (78%), ne pokazuje antioksidativni potencijal (Salehi i sar., 2007). Etarsko ulje N. foliosa, koje takoĊe sadrţi 1.8-cineole, nije redukovalo DPPH radikale. Dok etarsko ulje Nepeta nuda ssp. nuda pokazuje antioksidativni potencijal prema DPPH . radikalu tek kada se primeni u visokim koncentracijama (Gkinis i sar., 2010). DPPH i ABTS testom u našim eksperimentima je pokazano da najveći antioksidativni potencijal poseduje ekstrakt N. nervosa zatim N. rtanjensis, dok najslabiju sposobnost ka neutralizaciji DPPH . i ABTS .+ radikala pokazuje ekstrakt N. sibirica. FRAP testom je takoĊe potvrĊena velika sposobnost redukcije Fe3+ od strane metanolnog ekstrakta N. nervosa i N. rtanjensis. S obzirom da u ekstraktu N. nervosa nije detektovano prisustvo nepetalaktona, antioksidativni potencijal se moţe pripisati detektovanim fenolnim kiselinama (ruzmarinska, kafeinska i hlorogena). U sluĉaju vrsta N. rtanjensis i N. sibirica, u metanolnim ekstraktima je pored fenolnih jedinjenja detektovana znaĉajna koliĉina trans,cis-nepetalaktona ili cis,trans-nepetalaktona. S ciljem da se razdvoji efekat fenola od efekta monoterpena na ukupni antioksidativni potencijal metanolnih ekstrakata ove dve vrste izvršeno je poreĊenje antioksidativnog potencijala ruzmarinske kiseline, hlorogene kiseline, etarskog ulja N. rtanjensis koje sadrţi 72% trans,cis-nepetalaktona i etarskog ulja N. cataria koje sadrţi 92% cis,trans- nepetalaktona. 132 Pokazano je da antioksidativni potencijal u najvećoj meri zavisi od fenolnih kiselina, dok je udeo etarskih ulja daleko manji. Pored toga, veću sposobnost neutralizacije DPPH . i ABTS .+ radikala pokazuje ruzmarinska kiselina u poreĊenju sa hlorogenom. Trans,cis-nepetalakton ima bolji antioksidativni potencijal od cis,trans- nepetalaktona, ali neuporedivo slabiji od fenolnih jedinjenja koja su ispitana. S obzirom na ĉinjenicu da je ruzmarinska kiselina dominantno fenolno jedinjenje u metanolnim ekstraktima sve tri vrste iz roda Nepeta, logiĉan je zakljuĉak da upravo ova fenolna kiselina najviše doprinosi njihovom antioksidativnom potencijalu. FRAP testom nije pokazan antioksidativni potencijal trans,cis i cis,trans-nepetalaktona, što ukazuje na to da sposobnost metanolnih ekstrakta ispitivanih vrsta da redukuje Fe3+ potiĉe od fenolnih jedinjenja prisutnih u ekstraktima: ruzmarinske, kafeinske, hlorogene i neohlorogene kiseline u sluĉaju N. rtanjensis, dok su kod N. sibirica to ruzmarinska, kafeinska i hlorogena kiselina. Veliki broj autora antioksidativni potencijal vrsta iz fam. Lamiaceae pripisuje upravo ruzmarinskoj kiselini, kao u sluĉaju N. menthoides (Sarahroodi i sar., 2012), Rosmarinus officinalis (Erkan i sar., 2008), Origanum vulgare (Lamaison i sar., 1991 ), Salvia virgata, Salvia staminea, Salvia verbenaca (Tepe i sar., 2007), Melissa officinalis (Lamaison i sar., 1991). Kraujalis i sar. (2011) su DPPH testom ispitali antioksidativni potencijal metanolnih ekstrakta N. cataria, N. cataria var. citriodora, N. transcaucasica i N. bulgaricum i pokazali da on u najvećoj meri zavisi od ruzmarinske kiseline koja je dominantno fenolno jedinjenje kod ovih vrsta. Isti autori su pokazali da postoji visok stepen korelacije izmeĊu koliĉine ruzmarinske kiseline u ispitivanom ekstraktu i antioksidativnog potencijala. Do sliĉnog su zakljuĉka došli Tundis i sar. (2012), koji su DPPH, ABTS i FRAP testom pokazali da metanolni ekstrakti N. crassifolia i N. binaludensis pokazuju znaĉajan antioksidativni potencijal, pri ĉemu se vrsta N. crassifolia odlikuje duplo višim sadrţajem ukupnih fenolnih jedinjenja i pokazuje jaĉi antioksidativni potencijal. Rezultati ove disertacije su u skladu sa pomenutim istraţivanjima. S obzirom da ekstrakt N. nervosa sadrţi skoro tri puta više ruzmarinske kiseline od ekstrakta N. sibirica, shodno tome je i antioksidativni potencijal metanolnog ekstrakta N. nervosa znatno veći. 133 Antioksidativni potencijal metanolnog ekstrakta N. rtanjensis se moţe na prvom mestu pripisati ruzmarinskoj kiselini, a zatim i hlorogenoj kiselini. Iako metanolni ekstrakt N. rtanjensis sadrţi veću koliĉinu ukupnih fenola od ekstrakta N. nervosa, bolji antioksidativni potencijal ekstrakta N. nervosa se moţe pripisati većoj koliĉini ruzmarinske kiseline nego kod N. rtanjensis. TakoĊe, uzrok slabijeg antioksidativnog potencijala ekstrakta N. rtanjensis moţe biti antagonistiĉko delovanje izmeĊu glavnih komponenti metanolnog ekstrakta, kako izmeĊu fenolnih jedinjenja, tako i izmeĊu fenolnih jedinjenja i velike koliĉine trans,cis-nepetalaktona. Iacopini i sar., (2008) su pokazali da se antioksidativni potencijal katehina, epikatehina, kvercetina i rutina razlikuje u sluĉaju kada se primenjuju kao posebna jedinjenja i u sluĉaju kada se naprave smeše ovih fenola, zakljuĉivši pri tome da fenoli mogu imati sinergistiĉki ili antagonistiĉki efekat na ukupnu antioksidativnu aktivnost smeše. TakoĊe je pokazan sinergistiĉki efekat prilikom odreĊivanja antioksidativnog potencijala glavnih fenolnih jedinjenja u ekstraktu Olea europaea (Benavente-Garcia i sar., 2000). Koliĉina ukupnih fenolnih jedinjenja nije obavezno pokazatelj antioksidativne aktivnosti nekog ekstrakta, već se mora uzeti u obzir da dolazi do sinergistiĉkih ili antagonistiĉkih interakcija izmeĊu pojedinaĉnih komponenti uzorka, što u velikoj meri zavisi od njihove strukture (Kratchanova i sar., 2010). Metanolni ekstrakti N. rtanjensis i N. sibirica su pokazali znatno bolju sposobnost redukcije DPPH ∙ i ABTS ∙+ radikala u poreĊenju sa etarskim uljima, koja kao dominantne komponente sadrţe nepetalaktone, što ide u prilog ĉinjenici da antioksidativni potencijal ispitivanih vrsta roda Nepeta u najvećoj meri zavisi od fenolnih jedinjenja. Naši rezultati su u korelaciji sa ranije objavljenim istraţivanjima koja pokazuju veoma slab antioksidativni potencijal etarskih ulja Nepeta, dok ekstrakti koji sadrţe fenolna jedinjenja pokazuju znaĉajnu antioksidativnu aktivnost (Miceli i sar., 2005, Proestos i sar., 2006, Salehi i sar., 2007, Tepe i sar., 2007, Alim i sar., 2009, Cigremis i sar., 2010, Mahboubi i sar., 2011, Kraujalis i sar., 2011, Mothana i sar., 2012., itd.). Mahboubi i sar. (2011) su pokazali da etarsko ulje N. persica koje kao dominantno jedinjenje sadrţi 4aα,7α,7aα-nepetalakton (80%) pokazuje veoma slab antioksidativni potencijal, dok etanolni ekstrakt ove vrste pokazuje visoku sposobnost redukcije DPPH . radikala. 134 TakoĊe, i etarsko ulje N. cataria koje kao dominantna jedinjenja poseduje 4aα,7α,7aα- nepetalakton (70%), 4aα,7α,7aβ-nepetalakton (6%) i 4aβ,7α,7aβ-nepetalakton (2%), nije pokazalo sposobnost redukcije prema stabilnom DPPH . radikalu, dok metanolni ekstrakt ove vrste, koji sadrţi veoma malu koliĉinu ukupnih fenola, pokazuje slab antioksidativni potencijal (Adiguzel i sar., 2009, Proestos i sar., 2006). Antioksidativni potencijal tri vrste roda Nepeta na osnovu naših rezultata se moţe pripisati fenolnim kiselinama prisutnim u ekstraktu, naroĉito ruzmarinskoj kiselini, dok terpenoidna jedinjenja imaju veoma slab antioksidativni potencijal. 5.2. Antimikrobna aktivnost N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa Jedinjenja izolovana iz biljaka su jedan od glavnih izvora novih terapijskih agenasa za razliĉite bolesti ukljuĉujući i bolesti izazvane patogenim mikroorganizmima (Sakagami i sar., 2002). Intenzivne studije su u poslednje vreme usmerene ka ispitivanju mogućnosti upotrebe biljnih ekstrakata i etarskih ulja aromatiĉnih biljnih vrsta u tretmanima protiv patogenih bakterija i gljiva (Chalchat i sar., 1998, Salehi i sar., 2007). Mnogi autori su opisali antimikrobno dejstvo etarskog ulja vrsta roda Nepeta, ukljuĉujući N. ciliaris (Gautam i sar., 2012), N. crispa (Sonboli i sar., 2004), N. septemcrenata (El-Moaty, 2010), N. leavigata, N. kurramensis (Shinwari i sar., 2013), N. juncea (Hussain i sar., 2009), N. nuda ssp. albiflora (Alim i sar., 2009), N. meyeri (Cigremis i sar., 2010), N. fassenii (Nedorostova i sar., 2009) i N. italica (Emre i sar., 2011). Kao aktivna komponenta etarskih ulja navedenih vrsta uglavnom se pominje nepetalakton. Pored nepetalaktona i neki od oksidovanih monoterpenoida etarskih ulja, kao što su kamfor, eugenol, borneol i linalol su opisani kao antimikrobna jedinjenja (Carson i Riley, 1995). Adiguzel i sar. (2009) su pokazali antimikrobnu aktivnost etarskog ulja N. cataria, koje sadrţi 4aα,7α,7aα-nepetalakton (70%), 4aα,7α,7aβ- nepetalakton (6%) i 4aβ,7α,7aβ-nepetalakton (2%), još neki autori su pokazali antimikrobnu aktivnost etarskog ulja ove vrste, pri ĉemu se dominantna komponenta etarskih ulja- nepetalakton smatra odgovornim za ispitanu biološku aktivnost (Bourel i 135 sar., 1993., Nostro i sar., 2000, Zomorodian i sar., 2012). Etarsko ulje N. deflersiana, koje pokazuje slabu antimikrobnu aktivnost, sadrţi samo 30% oksidovanih monoterpenoida (Mothan, 2012). N. persica kao dominantno jedinjenje etarskog ulja sadrţi 4aα,7α,7aα-nepetalakton (80%) i pokazuje antibakterijsku aktivnost na Staphylococcus aureus i Klebsiella pneumoniae, kao i antifungalno dejstvo na gljive kao što su Candida albicans, Aspergillus flavus, A. parasiticus i A. niger. N. crispa sadrţi 4aα,7α,7aα-nepetalakton, 4aα,7α,7aβ-nepetalakton i 4aβ,7α,7aβ-nepetalakton, od kojih je tran,cis- izomer (4aα,7α,7aβ-nepetalakton) dominantno jedinjenje etarskih ulja, i poseduje antimikrobnu aktivnost na veliki broj bakterijskih i gljiviĉnih vrsta, ukljuĉujući Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger i Microsporium gypsium. Zenasni i sar. (2008) su pokazali antimikrobno dejstvo etarskih ulja N. atlantica i N. tuberosa koje sadrţe preko 80% 4aα,7α,7aβ-nepetalaktona. PoreĊenjem antimikrobne aktivnosti etarskih ulja N. leucophylla, N. discolor, N. govaniana, N. clarkei, N. elliptica i N. erecta pokazano je da vrste koje kao glavnu komponentu poseduju 4aα,7,7aβ-nepetalakton (N. elliptica i N. erecta, u koliĉini od preko 83%) pokazuju bolju antimikrobnu aktivnost u poreĊenju sa drugim ispitivanim vrstama koje ovaj monoterpenski lakton sadrţe samo u tragovima (Bisht i sar., 2010). Prema tome, etarska ulja Nepeta, koja kao dominantno jedinjenje sadrţe nepetalaktone, pokazuju snaţno antibakterijsko i antifungalno dejstvo (Sonboli i sar., 2004). U ovoj disertaciji je po prvi put ispitano antimikrobno dejstvo metanolnih ekstrakata N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa na osam vrsta bakterija i osam vrsta gljiva. Metanolni ekstrakt N. rtanjensis je pokazao najbolju antimikrobnu aktivnost, a kod najvećeg broja testiranih bakterija (S. aureus, E. coli, P. aerginosa, E.cloacae i S. typhimurium) aktivnost je bila na nivou referentnog antibiotika streptomicina. TakoĊe, metanolni ekstrakt N. rtanjensis je pokazao jaĉu aktivnost od streptomicina na bakteriju L. monocytogenes. Metanolni ekstrakt N. nervosa pokazuje istu (B. cereus, M. flavus, S. aureus, E. cloacae) ili bolju (E. coli, P. aerginosa, S. typhimurium, L. monocytogenes) antimikrobnu aktivnost u poreĊenju sa ekstraktom N. sibirica. Ekstrakt N. rtanjensis je generalno pokazao najjaĉu antifungalnu aktivnost u poreĊenju sa druge dve ispitivane vrste, pri ĉemu je zabeleţena aktivnost bolja od referentnog fungicida 136 ketokonazola. Ekstrakti N. nervosa i N. sibirica, koji se nisu znaĉajno razlikovali u pogledu antifungalne aktivnosti, pokazuju znatno slabiju aktivnost od primenjenog komercijalnog fungicida. Kako je u metanolnom ekstraktima tri ispitivane vrste roda Nepeta fitohemijskim analizama pokazan razliĉit sastav u pogledu prisustva i koliĉine glavnih grupa monoterpenoida i fenolnih jedinjenja upravo se razliĉitom kvantitativnom i kvalitativnom sastavu komponenti metanolnih ekstrakata moţe pripisati antimikrobno dejstvo. TakoĊe se moţe pretpostaviti da dolazi i do sinergistiĉkog delovanja izmeĊu terpenskih jedinjenja prisutnih u ekstraktima i fenolnih jedinjenja, kao i izmeĊu samih fenolnih jedinjenja. Nostro i sar. (2000) takoĊe navode mogući sinergistiĉki efekat glavnih jedinjenja u metanolnom i dihlor metanskom ekstraktu, u ispoljavanju antimikrobnog dejstva N. cataria. Najbolja antimikrobna aktivnost metanolnog ekstrakta N. rtanjensis se moţe pripisati visokom sadrţaju trans,cis-nepetalaktona (4aα,7α,7aβ), kao i prisutnim fenolnim kiselinama, od kojih su ruzmarinska i hlorogena dominantne. S obzirom da je u ekstraktu N. nervosa cis,trans-nepetalakton detektovan samo u tragovima, postojeća antimikrobna aktivnost verovatno potiĉe od velike koliĉine ruzmarinske kiseline prisutne u ekstraktu. Antimikrobna aktivnost metanolnog ekstrakta N. sibirica se moţe pripisati dominantnoj komponenti metanolnog ekstrakta cis,trans-nepetalaktonu (4aα,7α,7aα), a u manjoj meri i detektovanim fenolnim kiselinama, s obzirom da je koliĉina ruzmarinske kiseline u metanolnom ekstraktu ove vrste za trećinu niţa nego u ekstraktima N. rtanjensis i N. nervosa. Ovakvi rezultati su u saglasnosti sa ranije objavljenim podacima za druge vrste iz roda Nepeta. Lee i sar., (2010b) su antimikrobno dejstvo N. cataria pored nepetalaktona pripisali i ruzmarinskoj kiselini. Pored vrsta roda Nepeta antimikrobno dejstvo ispitano je i kod drugih vrsta iz familije Lamiaceae. Adiguzel i sar. (2007) su pokazali jako antimikrobno dejstvo metanolnog ekstrakta Satureja hortensis. Metanolni ekstrakt Teucrium scordium pokazuje antibakterijsko dejstvo na sve testirane Gram-negativne bakterije (Kundaković i sar., 2011), a metanolni ekstrakt Origanum majorana pokazuje jaĉu antifungalnu aktivnost od nistatina u spreĉavanju rasta Aspergillus niger (Leja i Thoppil, 2007). TakoĊe, pokazana je veoma slaba antimikrobna aktivnost metanolnih ekstrakata Salvia cryptantha, S. multicaulis i Mentha longifolia ssp. longifolia (Gulluce i sar., 2007, Tepe i sar., 2004). 137 Mora se naglasiti da i stereohemija prisutnih monoterpenskih laktona moţe imati kljuĉnu ulogu u ostvarivanju atimikrobne aktivnosti. Kalpoutzakis i sar. (2001) su pokazali da trans,cis-stereoizomer nepetalaktona ima znatno veću antibakterijsku aktivnost na Helicobacter pylori od cis,trans-nepetalaktona. S obzirom da je pokazano snaţnije antimikrobno dejstvo metanolnog ekstrakta N. rtanjensis od dejstva ekstrakta N. sibirica, ovakvi rezultati se u velikoj meri mogu pripisati razliĉitom kvalitativnom sastavu nepetalaktona u njima. TakoĊe, moţe se zakljuĉiti da trans,cis-izomer nepetalaktona pokazuje jaĉe antibakterijsko i antifungalno dejstvo od cis,trans- nepetalaktona. Ranija istraţivanja su pokazala postojanje antimikrobne aktivnosti vrste N. rtanjensisi, i ona su u skadu sa našim rezultatima. Stojanović i sar. (2005) su opisali antibakterijsko dejstvo etarskih ulja na nekoliko sojeva Gram-pozitivnih bakterija i jako antifungalno dejstvo na Aspergillus niger. Ljaljević-Grbić i sar. (2011a) su pokazali dejstvo etarskog ulja rtanjske metvice tokom prvih faza aseksualnog ţivotnog ciklusa gljiva (klijanje konidija), i to na vrstu koja je izolovana sa lista i semena N. rtanjensis, Alternaria sp., kao i na Cladosporium cladosporioides i Trichoderma viride. Pokazano je da su spore Alternaria sp. rezistentne na primenjeno etarsko ulje. Ljaljević-Grbić i sar. (2011b) su takoĊe pokazali antifungalno dejstvo etarskog ulja N. rtanjensis na ljudskog patogena Bipolaris spicifera koji izaziva alergijski sinuzitis. U literaturi nisu poznati rezultati biološke aktivnosti N. sibirica i N. nervosa. Rezultati ove disertacije opisuju snaţno antimikrobno dejstvo metanolnih ekstrakata N. sibirica, N. nervosa i naroĉito N. rtanjensis, na seriju bakterija i gljiva, i ukazuju na mogućnost njihove primene u praksi, u prevenciji i leĉenju bolesti i zaraza izazvanih patogenih mikroorganizama. Poznat je veliki broj bakterijskih vrsta koje narušavaju ispravnost prehrambenih proizvoda oslobaĊajući mnogobrojne ekstracelularne toksine. Neke od najĉešćih bakterija koje su izazivaĉi intoksikacije ili infekcije kod ljudi, uzrokovanih konzumiranjem kontaminirane hrane ili vode su: Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, C. perfingens, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Shigella sp., Staphylococcus aureus, Trichinella spiralis, Yersinia enterocolitica, Arcobacter butzleri, Cryptosporidium parvum, Legionella pneumophila, itd (Jay i sar., 2005). 138 Bakterije koje su korišćene u našim testovima, kao što su E. coli, L. monocytogenes, S. aureus, B. cereus, narušavanjem ispravnosti prehrambenih proizvoda, mogu dovesti do fatalnih infekcija i bolesti kod ljudi i ţivotinja. Uobiĉajeno stanište za B. cereus su prašina, voda i zemlja i ove bakterije se ĉesto mogu naći na površini mesa. Ova bakterija uzrokuje kvarenje sireva i pasterizovanog mleka. B. cereus moţe proizvoditi termolabilan enterotoksin koji uzrokuje dijareju (dijaretiĉki), i termostabilan toksin koji kod ljudi uzrokuje povraćanje (emetiĉki-cereulid) (Agata i sar., 2002, Jay i sar., 2005). L. monocytogenes se moţe naći u nepreraĊenom mesu i mleku kao i na sveţem povrću. Ljudsku listeriozu moţe izazvati bilo koji od 13 serotipova L. monocytogenes, a meningitis ili meningoencefalitis je najteţa manifestacija ove bolesti kod odraslih (Dalton i sar., 1997, Juraldo i sar., 1993, Schlüter i sar., 1996). Stafilokokni enterotoksini vrste S. aureus mogu izazvati upalne procese u stomaku i crevima (gastroenteritis) (Loir i sar., 2003). Salmonella sp. moţe biti prisutna u crevnom traktu i drugim tkivima ţivine i ţivotinja sa crvenim mesom, a da se pri tome kod te ţivotinje ne javi nijedan oĉigledan simptom oboljenja. Veoma ĉesto se nalaze u jajima mada je pokazana njihova adaptacija i na namirnice biljnog porekla (Samelis i sar., 2001, Wells i Butterfield, 1997). Salmoneloze ljudi obuhvataju sledeće grupe oboljenja: opšta cikliĉna zarazna oboljenja (tifus i paratifusi), uzroĉnik tifusa je S. typhi, a paratifusa S. paratyphi. Salmonele dovode i do toksikoinfekcija ĉiji su najĉešći uzroĉnici S. eneritidis, S. typhimurium i S. choleraeuis. P. aeruginosa se kod ljudi nalazi u malom broju kao deo fiziološke mikroflore creva, a moţe se naći i na koţi. U sluĉajevima poremećene ravnoteţe u bakterijskoj flori creva, moţe izazvati enterokolitis (Forestier i sar., 2008). E. coli je ĉest uzrok kvarenja mesa i mleĉnih preraĊevina i kod ljudi moţe dovesti do pojave hemoragiĉnog kolitisa i hemolitiĉne uremije (Belongia i sar., 1991). Sekundarni metaboliti gljiva poznatiji kao mikotoksini predstavljaju veliku opasnost po zdravlje ljudi i mogu dovesti do nastanka mnogih zdravstvenih problema ukljuĉujući ĉak i kancer i neurološke poremećaje (Bhat i sar., 2010). Mikromicete koje su izazivaĉi štetnog dejstva u prehrambrenoj industriji zbog potencijalne proizvodnje mikotoksina ukljuĉuju rodove: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Cladosporium, Alternaria, Trichothecium, Byssochlamys i Sclerotinia (Kavanagh i sar., 2005). 139 Ove mikrogljive mogu kontaminirati ţitarice, pre i posle ţetve, prilikom neadekvatnog skladištenja i mogu se naći u hrani za ţivotinje i ljude. Neki od mikotoksina koje produkuju vrste korišćene u našim testovima su aflatoksini, ciklopiazoniĉna kiselina (A. flavus), ohratoksin A i ohratoksin B, ksantomegnin, viomelein (A. ochraceus), gliotoksin (A. fumigatus), deoksinivalenol (DON), diacetoksiscirpenol (DAS), zearalenon, T2 mikotoksin (F. sporotrichioides), trihotoksin A (T. viride), griseofulvin, rokuefortin C, ketoglobosin B, verukulogen, penitrem A, patulin, ohratoksin A, B i C, citrinin, ksantomegnin (Penicillium) (Hedayati i sar., 2007, Harris i Mantle, 2001, Bauer i sar., 1989, Madheswaran i sar., 2004, Hou i sar., 1972, Sokolović i Šimpraga, 2006). Usled visoke i specifiĉne antimikrobne aktivnosti, metanolni ekstrakati ispitivanih vrsta roda Nepeta se mogu preporuĉiti za prevenciju ili za leĉene intestinalnih oboljenja kod ljudi i ţivotinja koja su nastala usled razliĉitih bakterijskih ili gljiviĉnih infekcija. Tako se metanolni ekstrakt N. rtanjensis moţe koristiti za leĉenje poremećaja nastalih delovanjem bakterijskih vrsta kao što su M. flavus, S. aureus, E. coli, P. aerginosa, S. typhimurium i L. monocytogenes. Ekstrakti sve tri vrste iz roda Nepeta koje su korišćene u ovom radu, zbog jaĉeg antifungalnog dejstva od komercijalnih fungicida bifonazola i ketokonazola, mogu se preporuĉiti za suzbijanje infekcija izazvanih vrstama gljiva kao što su: F. sporotrichoides, F. fulvum, T. viride, P. ochrochloron, P. funiculosum, A. ochraceus, A. flavus i A. fumigatus. 5.3. Alelopatsko dejstvo N. rtanjensis, N. sibirica i N. nervosa Veliki broj jedinjenja biljnog porekla moţe uticati na rastenje i razviće drugih biljnih vrsta u neposrednom okruţenju biljke koja ih emituje. Razliĉite grupe prirodnih jedinjenja su okarakterisane kao jedinjenja koja imaju stimulativni ili u većini sluĉajeva inhibitorni efekat na druge biljne vrste, a ovakva jedinjenja su jednim imenom okarakterisana kao alelohemikalije. Alelohemikalije direktno utiĉu na mnoštvo biohemijskih i fizioloških procesa, pa i na klijanje semena i rast i razviće biljnih organa klijanaca susednih biljnih vrsta (Weir i sar., 2004). Neisparljiva jedinjenja svoj alelopatski efekat uglavnom ostvaruju tako što dospevaju u ţivotnu sredinu eksudacijom preko korena ili raspadanjem biljnih ostataka. 140 U grupu jedinjenja sa alelopatskim dejstvom se ubrajaju flavonoidi, fenoli, derivati cimetne kiseline (p-kumarinska, kafeinska, ferulinska kiselina) alkaloidi, ketoni, alkoholi, cijano-glikozidi, prosti nezasićeni laktoni, benzohinoni, antrahinoni, kompleksni kinini, kumarini, tanini (Rice i sar., 1984, Friedman i Walker, 1983, Putnam, 1985, Waller, 1989, Mitić i sar., 2012, Lee i sar., 2010c). Pored toga, razliĉita isparljiva jedinjenja iz klase terpena, koja u spoljašnju sredinu dospevaju emisijom sa površine nadzemnih delova biljaka, pokazuju znaĉajan alelopatski potencijal. Neki autori su opisali alelopatski efekat etarskih ulja aromatiĉnih biljnih vrsta iz fam. Lamiaceae (Poser i sar., 1996, Dudai i sar., 1999, Angelini i sar., 2003, Islam i Kato-Noguchi, 2012). Kao potencijalna monoterpenska alelopatska jedinjenja se navode: cineol i citronelol (Romagni i sar., 2000, Singh i sar., 2002, Singh i sar., 2004), citronelal (Singh i sar., 2002) kamfor (Schulz i sar., 2007), 1,8-cineol, β- pinen (Nishida i sar., 2005), α-pinen (Singh i sar., 2006a, Kordali i sar., 2007), linalol (Singh i sar., 2002), γ-terpinen (Kordali i sar., 2007), β-citronelen (Kordali i sar., 2007), itd. Mutlu i Atici (2009) su pokazali alelopatski efekat vodenog ekstrakta N. meyeri na klijanje semena i rast klijanaca poljoprivrednih vrsta kao što su pšenica, jeĉam i suncokret. Kasnije je pokazan i alelopatski efekat etarskog ulja iste vrste, koje sadrţi 4aα,7α,7aβ nepetalakton (83,4%) i 4aα,7α,7aα-nepetalakton (8,83%), na klijanje i rast nekih korovskih vrsta kao što su Amaranthus retrofexus, Bromus danthoniae, Bromus intermedius, Chenopodium album, Cynodon dactylon, Portulaca oleracea (Mutlu i sar., 2011). Pretpostavlja se da alelopatski efekat ove vrste u najvećoj meri potiĉe od nepetalaktona. Hyun Eom i sar., (2006) su pokazali alelopatski potencijal isparljivih jedinja N. fassenii na rast klijanaca kresa. U atmosferi u kojoj su rasla semena kresa detektovan je veliki broj isparljivih jedinjenja kao što su: 1,8-cineol, -pinen, α-kopaen, germakren D, -farnezen, ocimen, neril-acetat i cis,trans-nepetalakton koji predstavlja dominantno jedinjenje (73%). Primećeno je da isparljiva jedinjenja N. fassenii u velikoj meri dovode do inhibicije rasta nadzemnog dela i korena klijanaca kresa. U ovoj disertaciji je ispitan alelopatski potencijal isparljivih jedinjenja tri vrste roda Nepeta na klijanje semena, rastenje i razviće klijanaca test vrste Lepidium sativum. 141 Razvijen je eksperimentalni sistem u kome je izvršena in vitro ko-kultivacija nepeta i L. sativum, a sa ciljem da se eksperimentalni uslovi što više pribliţe realnim dešavanjima u prirodi, te da se isprati alelopatski efekat isparljivih jedinjenja iz atmosfere, u neposrednom okruţenju jedinki iz roda Nepeta koje ih emituju. U ranijim istraţivanjima su obiĉno korišćena etarska ulja biljaka sa potencijalnim alelopatskim dejstvom (Poser i sar., 1996, Dudai i sar., 1999, Angelini i sar., 2003, Verdeguer i sar., 2009, Kordali i sar., 2008, Mutlu i sar. 2011 itd.). Ovakvi eksperimenti obiĉno ne daju realnu sliku o interakcijama izmeĊu biljaka u prirodi, ali su znaĉajni u potrazi za novim bioherbicidima koji se mogu koristiti u poljoprivrednoj praksi. Fundamentalna istraţivanja alelopatskih interakcija zahtevaju odabir odgovarajućih test vrsta ĉija semena brzo, uniformno i kompletno klijaju, kao u sluĉaju vrste L. sativum, i omogućavaju ponovljivost rezultata. U sluĉaju praćenja alelopatskog efekta isparljivih jedinjenja, jako je vaţno obezbediti analizu njihove koncentracije u atmosferi neposredno u okruţenju test vrsta. Ovo moţe biti ograniĉavajući faktor u eksperimentima koji se rade na otvorenom prostoru, tj. na polju. Gajenje biljaka u uslovima in vitro, u atmosferi ograniĉene i konstantne zapremine, omogućilo je da u našim eksperimentima izvršimo kvantifikaciju isparljivih jedinjenja od interesa PTR-MS analizom, što ĉini opisani eksperimentalni sistem veoma pogodnim u fundamentalnim istraţivanjima alelopatskih interakcija. U literaturi su vrlo oskudni podaci o ispitivanju alelopatskih interakcija in vitro ko-kultivisanjem potencijalne alelopatske vrste koja emituje isparljiva jedinjenja i test vrste. Yang i Futsuhara (1991) su opisali inhibitorni efekat isparljivih jedinjenja osloboĊenih od strane kalusa pirinĉa na rast kalusa soje u ko-kulturi in vitro. Najmanji procenat klijanja kao i najslabiji rast nadzemnog dela i korena klijanaca kresa primećen je u ko-kulturi sa N. rtanjensis. Kako je trans,cis-nepetalakton dominantno jedinjenje u atmosferi posude za gajenje biljaka, dok se ostala isparljiva jedinjenja (cis,trans-nepetalakton, α-pinen, α-kopaen, germakren D) nalaze samo u tragovima, upravo se ovom jedinjenju moţe pripisati inhibitorni efekat na klijanje i rast i razviće biljnih organa. Inhibitorni efekat na klijanje i rast klijanaca test vrste u ko- kulturi sa N. sibirica moţe se pripisati cis,trans-nepetalaktonu, koji je dominantno ispraljivo jedinjenje u atmosferi posude za gajenje biljaka. 142 Ostala isparljiva jedinjenja su detektovana u znatno niţoj koncentraciji (α-pinen, β-farnezen, α-zingiberen). Alelopatski efekat je izraţeniji prilikom ko-kulivacije kresa sa N. rtanjensis nego sa N. sibirica, što ukazuje na snaţnije alelopatsko dejstvo trans,cis-nepetalaktona od cis,trans-nepetalaktona. Moţe se pretpostaviti da je stereohemija nepetalaktona veoma bitna za ostvarivanje alelopatskog potencijala. Ranije je takoĊe pokazano da stereohemija nekih monoterpena znaĉajno odreĊuje njihov alelopatski potencijal. Nishida i sar. (2005) navode alelopatski potencijal α-pinena i β-pinena, ukazujući na to da β-pinen u visokim koncentracijama inhibira klijanje semena test vrste, dok α-pinen ne utiĉe na klijanje ali ima efekat na inhibiciju rasta korena. S obzirom da u ko-kulturi kresa i N. nervosa nije uoĉena inhibicija klijanja i rasta klijanaca kresa, a istovremeno nije detektovan ni nepetalakton u atmosferi posuda za gajenje biljaka, još jednom je potvrĊena pretpostavka da su nepetalaktoni u najvećoj meri odgovorni za alelopatske interakcije. Alelopatski efekat isparljivih jedinjenja koje u atmosferu emituju N. rtanjensis i N. sibirica ogleda se u usporenoj dinamici klijanja semena kresa, što dalje dovodi do usporenog rastenja i razvića klijanaca u poreĊenju sa kontrolom. TakoĊe, pokazana je znaĉajna korelacija izmeĊu koncentracije nepetalaktona u atmosferi posuda za gajenje kultura in vitro i procenta klijanja semena. S obzirom da je atmosfera posuda za gajenje kultura zasićena isparljivim jedinjenjima koja se emituju sa površine izdanaka N. rtanjensis i N. sibirica, a da su osim nepetalaktona, koji je prisutan kao dominantno jedinjenje u oba sluĉaja, detektovana i druga monoterpenska jedinjenja za koje je ranije pokazano alelopatsko dejstvo (α-pinena i β-pinena), pokušali smo da razdvojimo udeo pojedinaĉnih jedinjenja u celokupnom alelopatskom potencijalu. Singh i sar. (2006a) su pokazali da α-pinen neznatno usporava klijanje testiranih vrsta i usporava rast korena klijanaca izazivajući oksidativni stres, dok su Abrahim i sar. (2003) pokazali da ovo jedinjenje usporava rast klijanaca kukuruza tako što izaziva oksidativnu fosforilaciju i spreĉava transporta elektrona u mitohondrijama. Jones i sar. (2012) alelopatski potencijal etarskih ulja Lamium amplexicaule i L. purpureum pripisuju njegovim glavnim komponentama α- pinenu i β-pinenu. 143 Ispitano je dejstvo etarskog ulja N. rtanjensis koje sadrţi oko 73% trans,cis- nepetalaktona, etarskog ulja N. cataria sa 90% cis,tran-nepetalaktona, kao i α-pinena i β-pinena na klijanje semena odabranih poljoprivrednih kultura i korovskih vrsta. Zakljuĉeno je da trans,cis-stereoizomer nepetalaktona najviše utiĉe na usporavanje dinamike klijanja ili zaustavljanja klijanja semena testiranih vrsta. Uoĉen je visok stepen osetljivosti semena Lepidium sativum, Lactuca sativa, Lotus corniculatus, Stelaria media, Arabidopsis thaliana na alelopatsko dejstvo etarskog ulja N. rtanjensis, koje se moţe pripisati trans,cis-nepetalaktonu. Postojanje inhibicije klijanja i usporene dinamike klijanja semena L. sativum, Lactuca sativa, Stelaria media, Arabidopsis thaliana u atmosferi etarskog ulja N. cataria se moţe objasniti visokom koncentracijom cis,trans-nepetalaktona. Hyun Eom i sar., (2006) navode cis,trans-nepetalakton vrste N. fassennii kao jedinjenje sa alelopatskim potencijalom, dok Mutlu i sar., (2009, 2011) navode trans,cis-nepetalakton vrste N. meyeri kao alelohemikaliju. Blago usporena dinamika klijanja semena L. sativum, Lactuca sativa, Stelaria media, Arabidopsis thaliana ukazuje na postojanje odreĊenog alelopatskog potencijala α-pinena i β-pinena, mada znatno slabijeg od nepetalaktona, naroĉito njegovog trans,cis-izomera. TakoĊe, primećen je neznatno jaĉi alelopatski efekat β-pinena u poreĊenju sa α -pinenom. Alelopatska svojstva nekih biljaka i pojedinih proizvoda njihovog sekundarnog metabolizma mogu se uspešno primeniti u poljoprivrednoj praksi, a u cilju suzbijanja i kontrole korovskih vrsta i biljnih patogena. Dugogodišnja i opseţna istraţivanja su omogućila selekciju znaĉajnog broja biljaka sa alelopatskim potencijalom, ukljuĉujući i neke poljoprivredne kulture, i pokazala da primena ovakvog biljnog materijala u praksi moţe znaĉajno redukovati biomasu korovskih vrsta, i samim tim povećati prinos poljoprivrednih kultura. Brojni su primeri alelopatskih interakcija izmeĊu poljoprivrednih kultura i korovskih vrsta (Leather, 1983, Wu i sar., 1999, Weston, 1996, 2003, Xuan i sar., 2005). Biološka borba protiv korovskih vrsta i biljnih patogena je danas trend u svetu, koji u bliskoj budućnosti treba da preovlada nad upotrebom herbicida i pesticida u poljoprivrednoj proizvodnji. Zbog toga, potraga za novim, prirodnim izvorima alelohemikalija moţe imati veliki znaĉaj za razvoj bioherbicida i biopesticida. Ono što mora da predhodi upotrebi novih bioherbicida i biopesticida u polju, jeste jasno definisanje naĉina primene, kao i precizno odreĊivanje vremena tretiranja u zavisnoti od vegetacionog perioda poljoprivrednih kultura. 144 TakoĊe, mora se jasno sagledati uticaj novih alelohemikalija na široki spektar korovskih vrsta i poljoprivrednih kultura, kako bi se unapred mogle predvideti interakcije u okviru poljoprivrednih ekosistema. Preliminarna istraţivanja u okviru ove doktorske disertacije, koja u budućnosti mogu dovesti do praktiĉne primene etarskih ulja razliĉitih vrsta iz roda Nepeta, kao i nepetalaktona u suzbijanju i kontroli korovskih vrsta, ukazuju na potrebu da se jasno definišu poljoprivredne kulture na koje se ovi potencijalni bioherbicidi mogu primeniti i jasno odredi u kojoj fazi njihovog vegetativnog ciklusa treba uraditi tretman. Pored toga, treba precizirati efektivnu dozu, koja će dovesti do ţeljenog efekta, tj. do suzbijanja korovskih vrsta, a neće uticati na normalno rastenje i razviće poljoprivrednih kultura. Naime, rezultati su pokazali da poljoprivredne kulture pokazuju razliĉitu osetljivost na alelopatsko dejstvo etarskih ulja bogatih nepetalaktonima. Od analiziranih poljoprivrednih kultura, visoku osetljivost u fazi klijanja semena na ispitivana etarska ulja pokazale su vrste Lepidium sativum, Lactuca sativa, Lotus corniculatus, pri ĉemu je osetljivost u korelaciji sa primenjenom koncentracijom etarskih ulja. Prema tome, u sluĉaju ovih vrsta je neophodno da tretman etarskim uljima sledi nakon faze klijanja semena i prvih faza rastenja i razvića. S druge strane, uljana repica (Brassica napus) je pokazala slabu osetljivost na alelopatski efekat obe vrste etarskih ulja u primenjenim koncentracijama. To ukazuje na veliki potencijal primene etarskih ulja kao bioherbicida u zasadima uljane repice, bez bojazni da će primenjeni tretman uticati na rastenje i razviće ove poljoprivredne kulture, a samim tim i na prinos. Neophodno je u istraţivanja ukljuĉiti i druge poljoprivredne kulture, ali i ispitati alelopatski efekat u razliĉitim fazama razvića. Kada govorimo o korovskim vrstama koje su korišćene u našim biotestovima, najveću osetljivost na alelopatski efekat etarskih ulja N. rtanjensis i N. cataria pokazala je vrsta Stelaria media, kod koje je ĉak i na vrlo niskim koncentracijama nepetalaktona uoĉena potpuna inhibicija klijanja semena. Dobijeni rezultati ukazuju na veliki potencijal primenjenih etarskih ulja u suzbijanju ove korovske vrste, koja moţe naneti velike štete nekim poljoprivrednim usevima. A. thaliana je takoĊe pokazala znaĉajnu osetljivost na etarska ulja obe vrste, kada su ona primenjena u visokim koncentracijama, dok je vrsta Rumex crispus tolerantnija u tom pogledu i kod nje je uoĉena samo blago usporena dinamika klijanja semena. 145 Dalja istraţivanja će imati za cilj da ukaţu na alelopatski potencijal etarskih ulja N. rtanjensis i N. cataria kod većeg broja korovskih vrsta. Ono što se generalno moţe zakljuĉiti jeste da etarsko ulje N. rtanjensis koje se odlikuje visokim sadrţajem trans,cis-nepetalaktona ima snaţno alelopatsko dejstvo na većinu analiziranih vrsta, te mu se zbog toga moţe dati prednost u daljim istraţivanjima i moţe se preporuĉiti kao potencijalni visoko efikasni bioherbicid. Većina zrelih semena skrivenosemenica se sastoji od embriona koji je okruţen endospermom i semenjaĉom. Zrela semena vrste Arabidopsis thaliana, i njenog bliskog srodnika Lepidium sativum, poseduju tanki endosperm, izgraĊen od 1-2 sloja ćelija, koji pokriva embrion. Hranljive materije su uglavnom uskladištene u kotiledonima (Müller i sar., 2006). U poslednje vreme se pominje znaĉajna uloga endosperma u kontroli klijanja semena (Lee i sar., 2010a). Pucanje semenjaĉe se odvija duţ preformirane linije cepanja, ĉime radikula ostaje okruţena samo endospermom. Do probijanja endosperma dolazi nakon omekšavanja kape endosperma, posle ĉega potencijal rasta radikule moţe prevazići otpor mikropilarne kape endosperma. Procesi kao što su rast embriona i omekšavanje endosperma regulišu fitohormoni (ABA, GA) i u njima uĉestvuju brojni hidrolitiĉki enzimi (manaze, celulaze i glukanaze, i dr.), ekspanzini i ROS u apoplastu (Ni i Bradford, 1993, Toorop i sar., 2000, Petruzzelli i sar., 2003, Bailly i El‑Maarouf‑Bouteau, 2008; Da Silva i sar., 2008; Müller i sar., 2009; Morris i sar., 2011; Voegele i sar., 2011). Hidrolitiĉki enzimi najverovatnije uĉestvuju u modifikaciji ćelijskog zida i dovode do njegovog slabljenja tokom procesa omekšavanja endosperma (Oracz i sar., 2009). Semena kresa koja su korišćena u našim eksperimentima pripadaju grupi semena koja klijaju u dva koraka. Najveće metaboliĉke promene kod ovakvih semena se dešavaju prilikom faze I -imbibicije- suva semena imaju veoma mali vodni potencijal koji omogućava brzi influks vode (Woodstock, 1988; Obroucheva i Antipova, 1997, Liu i sar., 2005; Müller i sar., 2006). U ovoj fazi klijanja dolazi do reaktivacije enzima koji su preformirani u semenima prilikom njihovog sazrevanja (maturacije). Kod suvih semena A. thaliana je pokazano prisustvo velikog broja uskadištenih enzima koji su ukljuĉeni u znaĉajne metaboliĉke puteve i do ĉije reaktivacije dolazi u fazi I klijanja (Gallardo i sar., 2001, Rajjou i sar., 2004, Fu i sar., 2005). 146 Pored uskladištenih enzima, kod semena A. thaliana u prvih 8 sati dolazi i do de novo sinteze proteina, pri ĉemu je najveća aktivnost de novo sintetisanih proteina primećena na poĉetku faze II (u završetku faze II dolazi do izbijanja radikule). Pored antioksidativnih enzima, u procesu klijanja su veoma bitni i fitohormoni (ABA, GA, etilen). Da bi došlo do klijanja na samom poĉetku faze II mora doći do sniţavanja nivoa ABA. Kod A. thaliana okarakterisana su dva enzima (cis-epoksikarotenoid dioksigenaza i ABA 8 ᾿ -hidroksilaza) koji su kljuĉni za biosintezu i degradaciju ABA (Toh i sar., 2008). Kod iste vrste je primećeno da se GA nalazi uskladišten i u suvim semenima, kao i da dolazi do njegove de novo sinteze koja premašuje nivo ABA tri puta u fazi I i ĉak deset puta u fazi II (Ogawa i sar., 2003). Za vreme klijanja biosinteza GA je lokalizovana u radikuli, hipokotilu i u mikropilarnom endospermu (Weitbrecht i sar., 2011). Sa druge strane, povezana je uloga fitohormona i produkcije ROS tokom klijanja semena. Pokazano je da kod semena L. sativum GA stimuliše, dok ABA inhibira nakupljanje ROS. Mnoga istraţivanja pokazuju da je prelazak semena iz faze mirovanja u metaboliĉki aktivan organizam povezan sa produkcijom ROS. Produkcija OH-.i O2 .- je pokazana kod razliĉitih biljnih vrsta za vreme klijanja i rasta klijanaca (Bailly i sar., 2004, Oracz i sar., 2009). TakoĊe i u stadijumu dormancije dolazi do produkcije ROS, ali njihova uloga u ovoj fazi nije razjašnjena. Uloga ROS za vreme klijanja semena moţe biti: 1) indirektna, koja ukljuĉuje ćelijsku signalizaciju (Oracz i sar., 2009); ili 2) direktna, koja podrazumeva delovanje na ćelijske polimere (Müller i sar., 2009). Najnovija istraţivanja Müller i sar. (2009) pokazuju direktnu ulogu OH- prilikom klijanja semena Lepidium sativum i Arabidopsis thaliana, i interakciju OH - sa polisaharidima ćelijskog zida, što dovodi do njegovog opuštanja i daljeg izduţivanja radikule. Isti autori su takoĊe pokazali da tokom klijanja semena kresa pored produkcije OH - dolazi i do produkcije O2 .- i H2O2, dok je ukljuĉivanje antioksidativnih enzima za vreme klijanja semena povezano sa signalnom ulogom ROS. Prema tome, ROS se produkuju i akumuliraju kao rezultat normalnih fizioloških procesa prilikom klijanja semena kresa. MeĊutim, prekomerno nakupljanje ROS u ćelijama i tkivima moţe biti rezultat dejstva razliĉitih abiotiĉkih i biotiĉkih stresogenih faktora spoljašnje sredine, i moţe dovesti do promene opšteg stanja biljnog organizma koji se naziva oksidativni stres. 147 Taĉan mehanizam delovanja alelohemikalija još uvek nije poznat, ali se zna da, kao i kod drugih vrsta stresa, alelopatske interakcije dovode do nekontrolisane produkcije i akumulacije ROS (Weir i sar., 2004). Delovanjem alelohemikalija (katehin) na semena Arabidopsis thaliana pokazano je znaĉajno povećanje koliĉine ROS u korenu. Semena slaĉice (Sinapis alba) na dejstvo alelohemikalija reaguju nakupljanjem velike koliĉine H2O2, što dovodi do povećanja MDA koji je odgovoran za oštećenja ćelijskih membrana i uzrokuje isticanje elektrolita iz ćelije. Krajnji rezultat ovih procesa jeste gubitak vijabilnosti semena (Oracz i sar., 2007, Bogatek i sar., 2006). Delovanjem α-pinena dolazi do nakupljanja H2O2 u korenu Cassia occidentalis, Amaranthus viridis, Triticum aestivum, Pisum sativum i Cicer arietinum (Singh i sar., 2006a). Zunino i Zygadlo (2004) su pokazali da monoterpenoidi kao što su 1,8-cineol, timol, geraniol i kamfor indukuju oksidativni stres u korenu kukuruza produkcijom MDA. Etarsko ulje N. meyeri koje kao dominantno jedinjenje sadrţi 83% 4aα,7α,7aβ-nepetalaktona dovodi do povećanja lipidne peroksidacije i nakupljanja H2O2 u semenima Amaranthus retroflexus, Bromus danthoniae, Bromus intermedius, Chenopodium album, Cynodon dactylon, Lactuca serriola i Portulaca oleracea (Multu i sar., 2011). Da bi se makromolekuli zaštitili od oštećenja izazvanih oksidativnim stresom, u biljnom organizmu dolazi do aktivacije ćelijskih antioksidativnih sistema, što ukljuĉuje antioksidativne enzime. Pokazano je da dolazi do povećane ekspresije peroksidaza tokom kasnijih faza klijanja semena Arabidopsis thaliana i Lepidium sativum, a da se aktivnost enzima prvo javlja u kapi endosperma, a kasnije i u mikropilarnom endospermu i kapi radikule (Linkies et al., 2010a). Tri izoforme peroksidaza koje pokazuju tkivno-specifiĉnu ekspresiju identifikovane su u cDNA biblioteci kresa, (Linkies et al., 2010b). U našim eksperimentima je primećen porast aktivnosti POD tokom rasta klijanaca i moţe se pretpostaviti da je uzrok tome povećanje koliĉine H2O2 u klijancima. Kod kontrolnih klijanaca i klijanaca kresa koji nisu bili izloţeni dejstvu nepetalaktona primećena je znaĉajna POD aktivnost već nakon 24 sata od poĉetka imbibicije, i u tim prvim fazama klijanja ova aktivnost verovatno potiĉe od POD koje su preformirane i uskladištene u suvim semenima, ili od POD koje se sintetišu u ranim fazama klijanja, tokom probijanja radikule kroz endosperm. POD1 izoforma je uoĉena već prvog dana kod klijanaca koji nisu tretirani nepetalaktonom i moţe se pretpostaviti da upravo ova izoforma doprinosi ukupnoj aktivnosti peroksidaza u ovim poĉetnim 148 fazama rasta klijanaca. Sve ĉetiri detektovane izoforme ovog enzima kod pomenutih eksperimentalnih grupa klijanaca (POD1, POD2, POD3, POD4) pokazuju porast aktivnosti tokom klijanja, što verovatno predstavlja normalni obrazac klijanja semena ove vrste. Moţe se pretpostaviti da tokom ranih faza rastenja klijanaca dolazi do povećane ekspresije i de novo sinteze POD izoformi, što u krajnjoj liniji dovodi do povećane ukupne aktivnosti peroksidaza. Usporena dinamika klijanja semena kresa na tretmanima nepetalaktonom praćena je odloţenom pojavom aktivnosti POD ali i promenjenim profilom izoformi ovog enzima. Trećeg dana od poĉetka imbibicije, kod semena izloţenih cis,trans-nepetalaktonu, javljaju se dve izoforme POD, koje su oznaĉene kao POD2 i POD3, dok se na tretmanima trans,cis-nepetalaktonom aktivnost ove dve izoforme javlja tek ĉetvrtog dana. Moţe se zakljuĉiti da oba stereoizomera, a naroĉito trans,cis-nepetalakton odlaţu pojavu aktivnosti POD, što je verovatno posledica usporene dinamike klijanja. Oba stereoizomera nepetalaktona bitno menjaju profil izoformi POD, tako da dolazi do potpune inhibicije aktivnosti POD1 i POD4. Moţe se pretpostaviti da se ove dve izoforme javljaju kao rezultat normalnih fizioloških procesa tokom klijanja semena kresa, a da je njihova aktivnost i verovatno ekspresija inhibirana dejstvom alelohemikalija. Nepetalaktoni kao alelohemikalije najverovatnije indukuju drugaĉije mehanizme koji regulišu eliminaciju H2O2 iz ćelija i tkiva klijanaca kresa. Postoje brijni radovi koji opisuju ulogu peroksidaza za vreme klijanja semena. Miao i sar. (2006) navode znaĉajnu ulogu GPOD u uklanjanju H2O2 za vreme klijanja i rasta klijanaca A. thaliana. Cakmak i sar. (1992) navode da su imbibicaja i klijanje semena Triticum sativum povezani sa kapacitetom ćelija da eliminišu H2O2 i da u prvom redu zavise od APOD. U našim eksperimentima je takoĊe pokazano da kod semena koja nisu bila izloţena nepetalaktonima, peroksidaze predstavljaju jednu od prvih grupa enzima koja se javljaju da bi zaštitile ćelije od H2O2 i verovatno da bi omogućile probijanje radikule kroz endosperm. U dosadašnjim istraţivanjima vrlo retko je praćena dinamika klijanja semena pod dejstvom razliĉitih stresnih uslova. U uslovima suše dolazi do povećanja aktivnosti POD u klijancima A. thaliana (Miao i sar., 2006), dok delovanjem teških metala dolazi do stvaranja velike koliĉine ROS i do porasta aktivnosti POD (Drazkiewicz i sar., 2004). 149 Isti autori su najizraţenije povećanje aktivnosti APOD i GPOD opisali kod A. thaliana koji su izloţeni UV zraĉenju. Kod klijanaca kresa koji su izloţeni dejstvu teških metala (olovo) nije primećen porast aktivnosti POD (Ibrahim i Bafeel, 2011). Moţemo zakljuĉiti da u zavisnosti od vrste stresa, biljne vrste, a najviše od stadijuma razvića u kojem se biljka nalazi u trenutku delovanja stresogenih faktora, mogu postojati drugaĉiji mehanizmi zaštite makromolekula od ROS. Kod semena Phaseolus mungo u uslovima slanog stresa dolazi do smanjenja aktivnosti POD (Dush i Panda, 1991), dok kod semena Sorghum vulgare u uslovima osmotskog stresa dolazi do smanjene aktivnosti POD (Varadin i Rao, 2003). Moţe se pretpostaviti da specifiĉan odgovor semena prilikom delovanja razliĉitih stresnih uslova, ukljuĉuje smanjenu aktivnost POD i najverovatnije smanjenu ekspresiju ovog enzima u semenima. Katalaze predstavljaju grupu enzima koje katalizuju reakciju dismutacije vodonik peroksida do vode i kiseonika, i najĉešće se sreću baš na mestima povećane produkcije H2O2, odnosno u peroksizomima, glioksizomima i citosolu (Tolbert i sar., 1980, Dat i sar., 2000, Garg i sar., 2009). Dučić i sar. (2004) su pokazali da prilikom klijanja semena Chenopodium rubrum dolazi do rane ekspresije CAT odmah po imbibiciji semena, što je povezano sa ulogom ovog enzima tokom izbijanja radikule. Pretpostavlja se da H2O2, koji se nakuplja u semenima za vreme klijanja, predstavlja signalni molekul za aktivaciju CAT. Pokazano je da su CAT veoma bitne u procesu klijanja i tokom ranog razvića kod A. thaliana (Gallardo i sar., 2001). Pojava aktivnosti CAT u našim eksperimentima, kod klijanaca koji nisu bili izloţeni dejstvu nepetalaktona, primećena je 48 sati nakon poĉetka imbibicije, tj. nakon izbijanja radikule. U ovoj grupi semena primećen je porast aktivnosti CAT tokom rastenja klijanaca, koji moţe biti posledica povećane koliĉine H2O2. Moţe se zakljuĉiti da je u fazi klijanja semena L. sativum, koja ukljuĉuje probijanje radikule kroz endosperm, za eliminaciju H2O2 bitna aktivnost POD, a da je aktivnost CAT indukovana u poĉetnim fazama rastenja klijanaca. Rezultati ove disertacije ne ukazuju na naĉin regulacije ekspresije i aktivnosti CAT tokom klijanja semena i rastenja klijanaca kresa, ali će to biti predmet naših budućih istraţivanja. Ono što je jasno jeste da je usporena dinamika klijanja semena kresa, koja su bila izloţena nepetalaktonima, praćena odloţenom pojavom aktivnosti CAT ali i promenjenim profilom izoformi ovog enzima. 150 Trećeg dana (nakon 72 sati) od poĉetka imbibicije, kod semena izloţenih cis,trans- nepetalaktonu, javljaju se dve izoforme CAT (CAT1 i CAT2), dok se na tretmanima trans,cis-nepetalaktonom aktivnost ove dve izoforme javlja tek ĉetvrtog dana (nakon 96 sati). Moţe se izvesti zakljuĉak da oba stereoizomera, a naroĉito trans,cis-nepetalakton, odlaţu pojavu aktivnosti CAT, što je verovatno posledica usporene dinamike klijanja. Oba stereoizomera nepetalaktona menjaju profil izoformi CAT kod klijanaca kresa i dolazi do potpune inhibicije aktivnosti CAT3. Moţe se pretpostaviti da se ova izoforma javlja kao rezultat normalnih fizioloških procesa tokom klijanja semena kresa, a da je njena aktivnost i verovatno ekspresija inhibirana dejstvom alelohemikalija. Inhibicija aktivnosti i izmenjen profil izoformi CAT mogu dovesti do akumulacije H2O2 u ćelijama i tkivima, što moţe imati drastiĉne posledice po osnovne fiziološke procese i samim tim uticati na rastenje i razviće klijanaca. U našim eksperimentima je primećena izmenjena morfologija klijanaca kresa koji su tretirani nepetalaktonima, a koji se odlikuju manjom duţinom nadzemnog dela i korena. Kod A. thaliana okarakterisana su tri gena za katalaze i pokazana je njihova visoka ekspresija u stresnim uslovima, naroĉito cat2 i cat3 gena koji se eksprimiraju u listovima (Frugoli i sar., 1996). U našim eksperimentima, pojava aktivnosti CAT poklapa se upravo sa periodom pojavljivanja prvih listova kod klijanaca, tj. 48 sati nakon poĉetka imbibicije. U literaturi postoje podaci o razlikama u aktivnosti antioksidativnih enzima u zavisnosti od stadijuma razvića vrste izloţene stresu. Pokazano je da kod semena Phaseolus mungo koja klijaju u uslovima slanog stresa dolazi do smanjenja aktivnosti CAT (Dash i Panda, 1991). Kod semena pšenice je u uslovima suše pokazan prvobitni pad aktivnosti CAT, a naknadno i porast aktivnosti ovog enzima (Zhang i Kirkham, 1994). Goel i sar. (2003) su pokazali da kod semena Gossypium hirsutum razliĉiti stresni uslovi dovode do smanjene aktivnosti antioksidativnih enzima, ukljuĉujući i CAT (Goel i sar., 2003). Mutlu i sar. (2011) su pokazali da kod pet dana starih klijanaca korovskoh vrsta kao što su Amaranthus retroflexus, Bromus danthoniae, Chenopodium album, Cynodon dactylon, Lactuca serriola, Portulaca oleracea, izloţenih dejstvu etarskog ulja N. meyer koje sadrţi trans,cis-nepetalakton (83%), dolazi do znaĉajnog povećanja aktivnosti CAT u poreĊenju sa kontrolnom grupom. Povećanje aktivnosti CAT je pripisano povećanoj koliĉini vodonik peroksida kod klijanaca izloţenih dejstvu alelohemikalija. 151 Kod klijanaca A. thaliana je pokazano da prilikom povećanog zraĉenja i smanjene koliĉine CO2 dolazi do smanjene aktivnosti CAT u peroksizomima (Vandenabeele i sar., 2004). Moţe se pretpostaviti da je u ranim fazama razvića klijanaca kresa pod dejstvom alelohemikalija inhibirana aktivnost i verovatno ekspresija CAT. Rano pojavljivanje aktivnosti POD i CAT kod klijanaca koji nisu rasli u atmosferi nepetalaktona moţe biti povezano sa nakupljanjem H2O2 u semenima koja klijaju i u najranijim fazama razvića klijanaca. Visoka produkcija i akumulacija H2O2 moţe dovesti do rane ekspresije POD i CAT. Pokazano je da u periodu rane imbibicije dolazi do produkcije vodonik peroksida kod semena soje (Puntarulo i sar., 1988, Puntarulo i sar., 1991, Gidrol i sar., 1994), kukuruza (Hite i sar., 1999), suncokreta (Bailly i sar., 2002), pšenice (Caliskan i sar., 1998), graška (Wojtyla i sar., 2006), paradajza (Morohashi i sar., 2002), itd. Wang i sar. (2009) su pokazali pojavu aktivnosti POD i CAT već prvog dana prilikom klijanja semena Medicago sativa, dok su Bailly i sar. (2004) pokazali porast aktivnosti CAT u periodu rane imbibicije semena Heliantus annuus, što je povezano sa ĉinjenicom da u prvoj fazi klijanja semena, odmah po povećavanju sadrţaja vlage, pored intenziviranog ćelijskog disanja dolazi i do sinteze proteina (Bewley, 1997). Pored toga, poznato je da H2O2 nastaje i tokom uklanjanja O2 .- pod dejstvom SOD (Kliebenstein i sar., 1998). U procesu klijanja semena mnogih biljnih vrsta detektovano je prisustvo ROS i antioksidativnih enzima, pa tako u toku imbibicije semena Pisum sativum dolazi do poĉetnog nakupljanja O2 .- i inicijalne pojave aktivnosti SOD, a u periodu izbijanja radikule i do sekundarnog povećanja koliĉine superoksid radikala i povećane aktivnosti SOD (Kranner i sar., 2010). Kod semena Triticum sativum u toku imbibicije i klijanja u celom semenu kao i u izolovanom embrionu i endospermu primećena je aktivnost enzima kao što su: APOD, GPOD, CAT, SOD, GR, MDHAR, DHAR. Odmah po imbibiciji primećen je porast aktivnosti GPOD, CAT, SOD, i naroĉito APOD, pri ĉemu enzimi dostiţu najveću aktivnost u periodu izbijanja radikule. TakoĊe, primećeno je opadanje aktivnosti enzima GR, MDHAR i DHAR (Cakmak i sar., 1993). Xi i sar. (2010) su pokazali da je ekspresija Mn-SOD u fazi imbibicije semena veoma bitna za proces klijanja semena A. thaliana. Isti autori takoĊe ukazuju na to da je ekspresija svih antioksidativnih gena A. thaliana specifiĉna za semena i povećava toleranciju na 152 oksidativni stres za vreme klijanja i ranog rasta klijanaca. U našim eksperimentima je kod klijanaca L. sativum koji nisu tretirani nepetalaktonima primećena znaĉajna aktivnost tri izoforme Mn-SOD (Mn-SOD1, Mn-SOD2 i Mn-SOD3) već posle 24 h od poĉetka imbibicije. Uoĉena je i pojava aktivnosti tri izoforme Fe-SOD (Fe-SOD1, Fe- SOD2 i Fe-SOD3), dok je aktivnost dve izoforme CuZn-SOD (CuZn-SOD1 i CuZn- SOD2) detektovana trećeg dana. Rana pojava aktivnosti Mn-SOD i Fe-SOD kod ove grupe klijanaca moţe biti povezana sa normalnim obrascem klijanja semena L. sativum. Müller i sar. (2009) su kod semena L. sativum u periodu imbibicije detektovali O2 -. u radikuli i kapi endosperma, kao i aktivnost SOD nakon 8 sati od poĉetka imbibicije. U toku imbibicije semena kresa dolazi do biosinteze fitohormona GA koji se smatra odgovornim za nakupljanje ROS u apoplastu, u prvom redu OH - i O2 .- (Müller i sar., 2009). Nakupljeni O2 .- predstavlja signalni molekul za ekspresiju SOD. Kod klijanaca kresa koji su bili izloţeni delovanju nepetalaktona nije uoĉena znaĉajna promena u ekspresiji i aktivnosti Mn-SOD izoformi kao ni promene u brojnosti izoformi ovih enzima. Prisustvo sve tri izoforme Mn-SOD je uoĉeno već nakon 24 h od poĉetka imbibicije, pri ĉemu ekspresija Mn-SOD1 i Mn-SOD2 raste tokom vremena, dok ekspresija Mn-SOD3 opada. Moţemo pretpostaviti da do zakasnele pojave aktivnosti Fe-SOD koje su lokalizovane u hloroplastima dolazi zbog odloţene pojave prvih pravih listova i funkcionalnih hloroplasta kod klijanaca tretiranih nepetalaktonom. Prema tome, moţe se pretpostaviti da u prvim fazama razvića klijanaca (u heterotrofnoj fazi) Mn- SOD izoforme lokalizovane u mitohondrijama najviše doprinose eliminaciji O2 •- radikala, a zatim se u kasnijim fazama razvića (autotrofnoj fazi) ukljuĉuju CuZn-SOD i Fe-SOD izoforme. U sluĉaju CuZn-SOD, kod klijanaca kresa koji nisu bili izloţeni dejstvu nepetalaktona, aktivnost obe izoforme (CuZn-SOD1 i CuZn-SOD2) se javlja trećeg dana, iako je prisustvo enzima detektovano već nakon 24 h od poĉetka imbibicije. Kod klijanaca kresa koji su bili izloţeni dejstvu nepetalaktona primećeno je da se aktivnost CuZn-SOD1 izoforme pojavljuje tek petog dana. Prisustvo enzima od najranijih faza razvića klijanaca i odloţena pojava aktivnosti na tretmanima nepetalaktonom ukazuje na mogućnost postojanja regulacije aktivnosti CuZn-SOD na posttranslacionom nivou. Mutlu i sar. (2011) su pokazali da etarsko ulje N. meyeri kod pet dana starih klijanaca nekih korovskih vrsta dovodi do povećanja aktivnosti SOD. 153 Kubo i sar. (1999) su pokazali da razliĉite vrste stresa dovode do indukcije donekle drugaĉijeg tipa odgovora A. thaliana, pa tako tokom slanog stresa dolazi do pojaĉane ekspresije Fe-SOD gena, u uslovima suše i niskih temperatura uoĉena je povećana aktivnost Mn-SOD, dok dejstvo herbicida izaziva povećanu aktivnost CuZn-SOD. Teški metali dovode do povećane aktivnosti SOD, kao u sluĉaju dejstva bakra kod A. thaliana (Drazkiewicz i sar., 2004), ili kadmijuma kod L. sativum (Gill i sar., 2012). Demeke i sar. (2001) su pokazali da je aktivnost PPO u semenima stabilna i da povećanje vlage dovodi do blagog porasta aktivnosti PPO. U semenima kresa primećena je zastupljenost i aktivnost jedne PPO izoforme. Moţe se zakljuĉiti da nepetalakton indukuje raniju ekspresiju PPO u klijancima kresa i na tretmanima ovom alelohemikalijom prisustvo PPO je zabeleţeno već nakon 24 sata od poĉetka imbibicije. Kod klijanaca koji nisu rasli u atmosferi nepetalaktona, pojava PPO je uoĉena trećeg dana od poĉetka imbibicije. Relativna koliĉina PPO raste tokom vremena kod svih eksperimentalnih grupa klijanaca. Generalno gledano, aktivnost PPO se uoĉava sa zakašnjenjem od 24 h u odnosu na trenutak pojave enzima, i znaĉajno raste tokom vremena. Prema tome, postoji regulacija aktivnosti PPO na nivou ekspresije enzima tokom razvića klijanaca kresa. Moţe se pretpostaviti da u klijancima dolazi do ekspresije i de novo sinteze PPO koji oksiduju fenole i vrše regulaciju njihove koncentracije. Cis,trans-nepetalakton i naroĉito trans,cis-nepetalakton stimulišu ekspresiju PPO, a samim tim i aktivnost ovog enzima. Rezultati ukazuju na to da je stereohemija nepetalaktona bitna u regulaciji aktivnosti PPO, koja se odvija na nivou ekspresije (na transkripcionom ili translacionom nivou). Sliĉno našim rezultatima, zapaţeno je da se aktivnost PPO povećava tokom izlaganja biljaka razliĉitim stresnim uslovima (Thipyapong i sar., 1997). U toku klijanja semena vrste Glycine hispida dolazi do povećanja koliĉine α-tokoferola (Simontacchi i sar., 1993, 2003, Yang i sar., 2001), flavonoida i fenola (Simontacchi i sar., 1993, Andarwulan i sar., 1999, Yang i sar., 2001), koji predstavljaju supstrat za delovanje PPO. Pokazano je da koliĉina ukupnih fenola u klijancima kresa u našim eksperimentima zavisi od tretmana na kojima su klijanci gajeni. Na tretmanima trans,cis-nepetalaktonom uoĉena je znaĉajno viša koncentracija fenola u klijancima kresa već prvog dana od poĉetka imbibicije, u odnosu na klijance koji nisu bili izloţeni dejstvu nepetalaktona. Jedan od uzroka pojave pojaĉane akumulacije fenolnih jedinjenja pod dejstvom nepetalaktona moţe biti upravo 154 inhibicija aktivnosti POD u ranim fazama razvića klijanaca kresa koja je uoĉena u našim eksperimentima. Naši rezultati pokazuju da POD u tom periodu dominantno doprinose eliminaciji H2O2 i oksidaciji fenola kod netretiranih klijanaca, što nije primećeno pod dejstvom nepetalaktona. Drugo moguće objašnjenje za visoke koncentracije fenola u prisustvu nepetalaktona moţe biti inhibicija ekspresije i/ili aktivnosti PPO tokom faze klijanja semena. U svakom sluĉaju, porast koncentracije fenola do kog dolazi pod dejstvom alelohemikalije moţe biti signal za pojaĉanu ekspresiju PPO. S druge strane, upravo pojaĉana ekspresija PPO dovodi do ubrzanog opadanja koliĉine ukupnih fenolnih jedinjenja tokom rastenja i razvića klijanaca kresa u ovim uslovima. Opadanje koliĉine fenola tokom vremena je izraţenije kod klijanaca kresa gajenih u prisustvu trans,cis-nepetalaktona, što je rezultat upravo najveće aktivnosti PPO koja je zabeleţena u ovoj eksperimentalnoj grupi klijanaca. Moţe se pretpostaviti da prilikom rasta klijanaca u atmosferi sa cis,trans- a pogotovo sa trans,cis-nepetalaktonom dolazi do narušavanja ćelijskih struktura što dovodi do oslobaĊanja PPO iz hloroplasta i njihovog fenolnog supstrata iz vakuola i do reakcije oksidacije fenola. Pokazano je da u stresnim uslovima kod Lycopersicon esculentum i Citrullus lanatus dolazi do povećanja koliĉine fenolnih jedinjenja u biljkama (Rivero i sar., 2001). Ranija istraţivanja pokazuju da abiotiĉki stres kod mnogih biljnih vrsta dovodi do porasta aktivnoosti PPO, kao u sluĉaju klijanaca A. thaliana izloţenih dejstvu kadmijuma (Saffar i sar., 2009). Wang i sar. (2007) su pokazali da toplotni stres kod vrste Brassica napus dovodi do povećanja aktivnosti PPO. Ustanovljeno je da u semenima Astragalus cicer postoje dve forme PPO, jedna koja je preformirana i uskladištena u endospermu i druga de novo sintetisana koja je aktivna u klijancima (Sahbaz i sar., 2009). Pourcel i sar. (2005) su kod A. thaliana identifikovali TT10 gen u omotaĉu semena koji kodira protein zasluţan za oksidaciju fenolnih jedinjenja, i opisali oksidaciju flavonoid-proantocijanidina koji je polimer katehina i epikatehina pod dejstvom PPO. U našim eksperimentima smo pokušali da utvrdimo koja su to fenolna jedinjenja najzastupljenija u klijancima kresa, i eventualno pokaţemo promene njihovog kvantitativnog sastava u zavisnosti od dejstva nepetalaktona. Fenolna jedinjenja koja su karakteristiĉna za vrste fam. Brassicaceae su sinapat i njegovi estri, ĉija moguća fiziološka uloga još uvek nije dovoljno poznata. 155 Tokom sazrevanja semena, iz sinap-aldehida nastaje sinapat a zatim sinapoil-glukoza (Nair i sar. 2000, 2002, Franke i sar., 2002), koja se zatim prevodi do sinapoil-holina. Sinapoil-holin se kao dominantno fenolno jedinjenje akumulira u semenima tokom njihovog sazrevanja i nalivanja. Za vreme klijanja, aktivnošću esteraza, dolazi do hidrolize sinapoil-holina (Tzagoloff, 1963, Nurmann i Strack, 1979, 1981, Strack, 1980, 1981). Uloga sinapoil-holina još uvek nije razjašnjena, ali se pretpostavlja da nastaje radi skladištenja holina koji se kasnije prilikom klijanja semena ukljuĉuje u biosintezu fosfatidilholina. U mladim klijancima nastali sinapat se ponovo esterifikuje preko sinapoil-glukoze u sinapoil-malat. Kod klijanaca kresa, bez obzira na tretman, sa vremenom dolazi do opadanja koliĉine sinap-aldehida. Ovakvi rezultati su u skladu sa ĉinjenicom da je sinap-aldehid uskladišten u semenima i da njegove metaboliĉke transformacije poĉinju prilikom klijanja semena. Nije uoĉena znaĉajna razlika u koliĉini ovog jedinjenja izmeĊu tretmana, pa se moţe pretpostaviti da dejstvo nepetalaktona nema uticaja na metabolizam ovog jedinjenja. Sinapoil-holin je u klijancima kresa starim 1 dan zabeleţen u znaĉajnoj koliĉini, naroĉito kod kontrolne grupe klijanaca. Tokom vremena, dolazi do opadanja koliĉine sinapoil-holina u klijancima, a opadanje je sporije kod klijanaca tretiranih nepetalaktonom. Moţe se pretpostaviti da aktivnošću enzima SCE dolazi do prevoĊenja sinapoil-holina do sinapata i holina. U našim analizama nije zabaleţen sinapat u slobodnom obliku, što nije neuobiĉajeno, s obzirom da se ovo jedinjenje vrlo brzo ukljuĉuje u metaboliĉke procese i esterifikuje do sinapoil- glukoze. U sagalasnosti sa tim je i porast koliĉine sinapoil-glukoze u klijancima tokom vremena, naroĉito kod kontrolne grupe klijanaca a potom i klijanaca ko-kultivisanih sa N. nervosa. Moţe se pretpostaviti da alelopatsko dejstvo nepetalaktona dovodi do usporene i smanjene ekspresije i aktivnosti enzima SGT, ĉijom aktivnošću se sinapat prevodi do sinapoil-glukoze. Koliĉina sinapoil-malata, koji nastaje od sinapoil-glukoze u reakciji katalisanoj enzimom SMT, drastiĉno opada tokom rastenja klijanaca kresa, naroĉito u sluĉajevima kada su klijanci gajeni u ko-kulturama sa tri vrste roda Nepeta. Ovo su po malo iznenaĊujući rezultati, i moglo bi se oĉekivati da koliĉina sinapoil- malata raste tokom vremena s obzirom da već posle trećeg dana dolazi do pojave pravih listova, koji preuzimaju funkciju fotosinteze. Mogućnosti su sledeće: ili se ovo jedinjenje u listovima klijanaca kresa odmah dalje ukljuĉuje u metaboliĉke procese te stoga nije detektovana njegova znaĉajna koliĉina, ili je inhibirana njegova sinteza. 156 Jedno od objašnjenja bi moglo da bude da se kod fotomiksotrofnih biljaka u uslovima in vitro, koje najveći deo energije i ugljenika za odvijanje primarnog metabolizma obezbeĊuju asimilacijom šećera iz hranljive podloge, ne sintetiše dovoljna koliĉina malata, te da se on ne usmerava ka sintezi sinapoil-malata, već se direktno ukljuĉuje u Kalvinov ciklus koji predstavlja proces od esencijalnog znaĉaja za rastenje i razviće biljaka. U opisanim uslovima moţe doći, ili do inhibicije ekspresije i aktivnosti enzima SMT koji katališe reakciju prevoĊenja sinapoil-glukoze do sinapoil-malata, ili je aktivnost ovog enzima inhibirana usled nedovoljne koliĉine supstrata, tj. malata. Ovo su samo pretpostavke koje treba potvrditi daljim istraţivanjima. Oĉigledno je da alelopatske interakcije generišu odgovor biljaka koji se ogleda kroz ĉitav niz promena u primarnom i sekundarnom metabolizmu semena i klijanaca kresa. Metaboliĉke transformacije sinapata koje se odigravaju tokom klijanja semena kresa, oĉigledno su direktno ili indirektno regulisane alelohemikalijama. Generalno je primećeno da izlaganje semena i klijanaca kresa dejstvu trans,cis- i cis,trans-nepetalaktona dovodi do poremećenog fluksa u biosintetskom putu sinapata, što izaziva variranje u koliĉini sinapoil-glukoze, sinapoil-holina i sinapoil-malata, i moţe dalje imati fatalne posledice na rastenje i razviće biljaka i njihov odbrambeni odgovor na razliĉite vidove abiotiĉkih i biotiĉkih stresova. Indirektno dejstvo nepetalaktona na metabolizam sinapata moţe takoĊe biti posledica usporene dinamike klijanja ili dejstva ove alelohemikalije na druge metaboliĉke procese. Pretpostavka je da se direktni efekat alelopatskih interakcija moţe ogledati kroz regulaciju ekspresije i aktivnosti enzima kao što su SALDH, SGT, SCT i SCE, koji su ukljuĉeni u metabolizam sinapata. TakoĊe, ovakve promene u sadrţaju sinapata mogu direktno uzrokovati i promene u aktivnosti nekih antioksidativnih enzima kao što su PPO. Naši budući eksperimenti su usmereni ka razjašnjavanju moguće uloge nekih od pomenutih enzima u alelopatskim interakcijama. Hause i sar. (2002) su pokazali da se enzim SMT nalazi u svim biljnim organima izuzev u semenima i mladim klijancima. Isti autori su takoĊe pokazali lokalizaciju enzima u centralnoj vakuoli mezofila kao i u epidermalnim ćelijama lista. Moţemo pretpostaviti da je u našim eksperimentima manja koliĉina sinapoil-malata na tretmanu sa vrstama iz roda Nepeta posledica smanjene ekspresije i aktivnosti ovog enzima usled nedovoljne diferencijacije tkiva. 157 Kod A. thaliana okarakterisani su geni (At1g28640, At1g28650, At1g28660, i At1g28670) koji kodiraju katalitiĉki aktivan SCE, pri ĉemu je pokazano da, kada u semenima doĊe do ekspresije ovih gena, dolazi do dramatiĉnog smanjenja koliĉine sinapoil-holina (Clauß i sar., 2008). U našim rezultatima je primećeno znaĉajno smanjenje sinapoil-holina samo kod kontrolne grupe, dok je kod semenaa koja su bila izloţena dejstvu nepetalaktona primećen znatno sporiji pad koliĉine sinapoil-holina što moţe biti rezultat smanjene ekspresije pomenutih gena. Dixon i Pavla (1995) su pokazali da razliĉiti stresni uslovi dovode do intenziviranja fenilpropanoidnog metabolizma koji je odgovoran za sintezu estara sinapata. Elguera i Barrientos (2013) su pokazali da teški metali ne dovode do znaĉajne promene koliĉine sinapinske kiseline kod klijanaca L. sativum. Poznato je da sinapoil-malat ima zaštitnu ulogu u listovima od UV zraĉenja, a izlaganjem A. thaliana ovoj vrsti stresa dolazi do povećanja koliĉine flavonoida i sinapoil-malata u listovima (Frohnmeyer i Staiger, 2003). Kod mnogih vrsta fam. Brasicaceae je pokazano da prilikom napada patogenih mikroorganizama dolazi do povećanja koliĉine sinapoil-malata (Jahangir i sar., 2009). Na fiziološkom i molekularnom nivou postoje razliĉiti mehanizmi dejstva alelohemikalija. Pokazano je da alelohemikalije kao što su juglon (Juglans nigra) i sorgoleon (Sorghum bicolor) dovode do inhibicije fotosinteze (Einhellig i sar., 1992, Hejl i sar., 1992, Jose i sar, 1998). Abrachim i sar. (2000, 2003) su pokazali da α-pinen (Salvia leucophylla, Citrus aurantium, Calamintha ashei, Conradina canescens) dovodi do inhibicije disanja. Neke alelohemikalije kao što je npr. katehin mogu dovesti do ćelijske smrti u meristemu korena (Prithiviraj i sar., 2006). Pokazano je da stereoizomeri jednog jedinjenja pokazuju razliĉite mehanizme delovanja u ostvarivanju alelopatskih interakcija, pa tako 1,8-cineol inhibira deobu ćelija dok 1,4-cineol dovodi do inhibicije odreĊenih enzima kao što je npr. asparagin sintaza (Duke i sar., 2005). Oracz i sar. (2011) su pokazali da alelohemikalije vrste Myrica gale zaustavljaju proces klijanja semena L. sativum. Alelohemikalije, kao što je npr. mirigalon mogu delovati direktno na 13-hidroksilovani biosintetski put u radikuli i kapi endosperma semena L. sativum gde se sintetišu GA1 i GA4 GA4 ima veliku ulogu prilikom klijanja semena A. thaliana i L. sativum s obzirom da stimuliše nakupljanje O2. - i OH što je povezano sa izduţivanjem radikule i probijanjem endosperma (Ogawa i sar., 2003). 158 Pokazano je da alelohemikalija mirigalon dovodi do smanjene sinteze GA4 u radikuli, i samim tim do smanjene produkcije i nakupljanja ROS u semenima, što dovodi do inhibicije klijanja. Na osnovu poznate fiziologije klijanja semena L. sativum kao i poznate fiziologije i morfologije rasta i razvića klijanaca moţe se pretpostaviti da cis,trans- i trans,cis-nepetalakton mogu delovati na semena tako što spreĉavaju reaktivaciju enzima koji su uskladišteni u semenima ili dovode do izostanka de novo sinteze proteina na poĉetku faze II prilikom klijanja semena. TakoĊe moţemo pretpostaviti da na nivou fitohormona dolazi do izostanka ekspresije gena koji su odgovorni za degradaciju ABA ili izostanka ekspresije gena koji su odgovorni za biosintezu GA, pri ĉemu ne dolazi do narušavanja inhibitornog odnosa ABA/GA koji se odrţava za sve vreme dormancije semena. Kako je GA odgovoran za nakupljanje ROS u semenima tokom klijanja u prvom redu O2 .- i OH - , moţemo pretpostaviti da izostaje signalna uloga ROS u ekspresiji antioksidativnih enzima koji su neophodni za klijanje. Kako je u našim eksperimentima primećena izmenjena morfologija klijanaca kresa na tretmanima nepetalaktonom, kao i odloţena i smanjena aktivnost antioksidaivnih enzima (POD, CAT i SOD, moţe se pretpostaviti da usled smanjene aktivnosti antioksidativnih enzima dolazi do nakupljanja ROS u ćelijama i tkivima klijanaca, što moţe imati negativne posledice na rastenje i razviće klijanaca. Biološki aktivna jedinjenja - produkti sekundarnog metabolizma se satoje od osnovnog ugljovodoniĉnog niza koji je u suštini hemijski priliĉno inertan, dok supstituisane grupe i njihov poloţaj daju reaktivnost datom jedinjenju. Stereoizomeri su jedinjenja koja imaju istu molekulsku formulu ali je pokazano da zbog stereohemije imaju razliĉite funkcionalne grupe, razliĉite hemijske i fiziĉke osobine, drugaĉije kiselo- bazne osobine, pokazuju drugaĉiju sposobnost vezivanja za ciljna mesta, drugaĉiju jonizaciju, kao i razliĉitu termostabilnost (Lemke i sar, 2003, Cairs, 2002, Graham, 2009). Pokazano je da su receptori za sintetiĉke lekove hiralni i da im odgovara samo jedan specifiĉan stereoizomer aktivnog jedinjenja. Primer je cis-ketoprofen koji ublaţuje migrenozne bolove, dok je trans-ketoprofen neaktivan. Interesantno je da orijentacija samo jedne hemijske veze dovodi do promene ukusa jedinjenja, kao u sluĉaju cis,cis-aspartama koji je slatkog ukusa dok je trans,trans-aspartam gorak. Istraţivanja sekundarnih metabolita biljaka pokazuju da stereohemija aktivnog jedinjenja ima znaĉajnu ulogu u ostvarivanju bioloških aktivnosti. 159 Pokazano je da trans,cis-stereoizomer nepetalaktona pokazuje jaĉe toksiĉno dejstvo i jaĉu repelentnu aktivnost na bubašvabe od cis,trans-stereoizomera nepetalaktona (Gkinis i sar., 2003, Peterson i Coats, 2001, Peterson i sar., 2002). Birkett i Pickett (2003) su pokazali da je trans,cis-nepetalakton jaĉi feromon pĉela od cis,trans- nepetalaktona. Romagni i sar. (1999) su pokazali da 1,4-cineol ima jaĉe inhibitorno dejstvo na rast klijanaca Echinochloa crusgalli od 1,8-cineola. Pomenuti autori su opisali da 1,4-cineol dovodi do inhibicije rasta korena i nadzemnog dela, što je praćeno izmenjenim intezitetom fotosinteze i formiranjem abnormalnih listova pomenute korovske vrste, dok 1,8-cineol inhibira samo rast korena. Analozi cineola poseduju istu molekulsku teţinu i istu molekulsku formulu a razlikuju se u poloţaju samo jedne hemijske veze, što uslovljava minimalne promene u strukturnoj formuli, koje meĊutim znaĉajno utiĉu na konformaciju cineola. Romagni i sar. (1999) su slabije dejstvo 1,8- cineola pripisali neznatno manjoj stabilnosti 1,8- konformacije (neznatno veća energija) kao i drugaĉijoj prostornoj orijentaciji. Dambolena i sar. (2010) su primetili jaĉe toksiĉno dejstvo (+)-mentola i (-)- mentola na Fusarium verticillioides u poreĊenju sa (+)-izomentolom i (-)-neomentolom, što je pripisano lipofilnom karakteru (+)-mentola i (-)-mentola. MeĊutim, jaĉe antitoksiĉno dejstvo (+)-mentola od (-)-mentola isti autori su pripisali specifiĉnom stereohemijskom vezivanju jedinjenja za citoplazmatiĉnu membranu gljiva. Poznato je da hiralnost komponenti biomembrana ima znaĉajnu ulogu u organizaciji i funkcionisanju samih membrana. Hiralna organizacija dovodi do toga da samo hiralni molekuli mogu uzajamno delovati sa membranama (Bonbelli i sar., 2008). Stereospecifiĉna interakcija monoterpenoida sa npr. citoplazmatiĉnom membranom Bacillus cereus dovodi do znaĉajnog smanjenja ukupne koliĉine ATP u ćeliji, što je povezano sa promenom membranskog potencijala. Smanjenjem membranskog potencijala dolazi do povećane permeabilnosti za H+ i K+ i do narušavanja jonskog gradijenta, koji moţe dovesti do oštećenja osnovnih esencijalnih procesa i do smrti ćelija. U našim eksperimantima, u testovima za utvrĊivanje antimikrobne aktivnosti i alelopatskog potencijala, pokazano je da stereohemija nepetalaktona znaĉajno odreĊuje njegovu biološku aktivnost. U oba sluĉaja jaĉe dejstvo ostvaruje trans,cis- stereoizomer 160 nepetalaktona. Nepetalakton se sastoji od nepolarnog ciklopentanoidnog prstena i cikliĉnog estra, kao i supstituisanih grupa. Nepetalaktoni poseduju tri hiralna centra, pa mogu postojati u obliku osam stereoizomera, ĉetiri diastereoizomera i njihovih odgovarajućih enantiomera. Na osnovu ranijih istraţivanja na drugim analognim jedinjenjima, moţemo pretpostaviti da veća aktivnost trans,cis-nepetalaktona potiĉe od veće stabilnosti trans,cis- konformacije. Moguće je da pomenuti stereoizomer, zbog stereospecifiĉnog vezivanja, lakše interaguje sa ćelijskim membranama, što neminovno dovodi do mnogih promena na samoj membrani. Moţe doći do promena membranskog potencijala, kao i povećanja permeabilnosti plazmamembrane što moţe usloviti narušavanje jonskog gradijenta i smrti ćelije. Rasvetljavanje taĉnog mehanizma dejstva nepetalaktona na nivou plazmamembrane i aktivacije signala koji indukuju odbrambeni odgovor je predmet naših budućih istraţivanja. 161 6. ZAKLJUČCI Osnovni zakljuĉci istraţivanja izvedenih u okviru ovog rada su:  Fitohemijska karakterizacija tri vrste roda Nepeta gajenih in vitro, omogućila je identifikaciju i kvantifikaciju glavnih grupa sekundarnih metabolita (terpenoida i fenolnih jedinjenja) koji se u ovim uslovima produkuju. Dominantno isparljivo jedinjenje iz grupe terpenoida je monoterpenski lakton nepetalakton, pri ĉemu je kod vrste N. rtanjensis većinski prisutan tran,cis- izomer a kod N. sibirica cis,trans-izomer nepetalaktona. Kod vrste N. nervosa nepetalakton je detektovan samo u tragovima. Kod ispitivanih vrsta, ruzmarinska kiselina se javlja kao dominantno fenolno jedinjenje, dok su kod N. rtanjensis i N. sibirica identifikovani i derivati ruzmarinske kiseline.  Opisana UHPLC/DAD/HESI-MS/MS metoda za brzu, pouzdanu i efikasnu identifikaciju nepetalaktona i fenolnih kiselina u metanolnim ekstraktima, moţe imati veliki znaĉaj i široku primenu u hemotaksonomiji i populacionoj genetici. Velika kvalitativna i kvantitativna varijabilnost ove dve grupe sekundarnih metabolita kod vrsta roda Nepeta kvalifikuje ih kao dobar marker sistem za procenu hemijskog diverziteta u okviru roda.  Metanolni ekstrakti N. rtanjensis, N. sibirica i naroĉito N. nervosa, pokazuju znaĉajnu antioksidativnu aktivnost, koja se pripisuje fenolnim jedinjenjima, a na prvom mestu ruzmarinskoj kiselini. Nepetalakton ne utiĉe znaĉajno na antioksidativni potencijal metanolnih ekstrakata, ali postoji mogućnost antagonistiĉkog delovanja izmeĊu fenolnih kiselina i nepetalaktona.  Najveću antimikrobnu aktivnost pokazuje metanolni ekstrakt N. rtanjensis, sledi N. sibirica, i na kraju N. nervosa. Monoterpenoidna jedinjenja (nepetalaktoni) znaĉajno doprinose antibakterijskoj i antigljiviĉnoj aktivnosti. Stereohemija nepetalaktona bitno odreĊuje njegovu antimirobnu aktivnost, pri ĉemu je tran,cis- izomer aktivniji od cis,trans-izomera. Fenolna jedinjenja takoĊe imaju znaĉajnog udela u antimikrobnoj aktivnosti metanolnih ekstrakata ispitivanih vrsta. 162 Еkstrakti ispitivanih vrsta se mogu preporuĉiti u prevenciji i u leĉenju bolesti i zaraza izazvanih patogenim mikroorganizmima kao što su Escherishia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Aspergillus ochraceus, A. flavus i A. fumigatus.  PotvrĊeno je alelopatsko dejstvo N. rtanjensis i N. sibirica, koje se pripisuje nepetalaktonu. Postoji pozitivna korelacija izmeĊu alelopatskog efekta i koncentracije nepetalaktona. Stereohemija nepetalaktona znaĉajno odreĊuje njegov alelopatski potencijal, pri ĉemu tran,cis- izomer pokazuje veću aktivnost od cis,trans-izomera. Alelopatsko dejstvo nepetalaktona se ogleda kroz usporenu dinamiku klijanja semena Lepidium sativum L., ali i kroz efekat na biohemijske procese koji su posledica poremećenog antioksidativnog sistema biljaka.  Alelopatsko dejstvo nepetalaktona, a naroĉito njegovog trans,cis-izomera, dovodi do promena u antioksidativnom sistemu klijanaca kresa narušavanjem normalnih modela ekspresije i aktivnosti antioksidativnih enzima kao što su SOD (Mn-SOD, Fe-SOD i CuZn-SOD). Nije uoĉena znaĉajna promena ekspresije i aktivnosti Mn-SOD i CuZn-SOD izoformi u zavisnosti od delovanja nepetalaktona, kao ni promene u brojnosti izoformi ovih enzima. Usporena dinamika klijanja semena je praćena usporenim razvojnim procesom klijanaca, odloţenom pojavom prvih pravih listova i funkcionalnih hloroplasta, što je verovatno uzrok zakasnele pojave aktivnosti Fe-SOD izoformi lokalizovanih u ovim organelama. Moţe se pretpostaviti da u prvim fazama razvića klijanaca (u heterotrofnoj fazi) Mn-SOD izoforme lokalizovane u mitohondrijama najviše doprinose eliminaciji O2 •- radikala, a zatim se u kasnijim fazama razvića (autotrofnoj fazi) ukljuĉuju CuZn-SOD i Fe-SOD izoforme.  Normalni program rastenja i razvića klijanaca kresa podrazumeva ukljuĉivanje CAT u proces eliminacije H2O2, njegovom razgradnjom do kiseonika i vode, drugog dana od poĉetka imbibicije. Aktivnost CAT vremenom raste. Odloţena pojava i inhibicija aktivnosti CAT pod dejstvom nepetalaktona, naroĉito njegovog trans,cis-izomera, moţe biti posledica usporene dinamike klijanja semena, ali moţe biti i regulisana na nivou ekspresije ili aktivnosti enzima direktnim dejstvom alelohemikalije. 163 Inhibicija aktivnosti i izmenjen profil izoformi CAT mogu rezultovati akumulacijom H2O2 u ćelijama i tkivima, što moţe imati drastiĉne posledice po esencijalne fiziološke procese i samim tim na rastenje i razviće klijanaca.  Peroksidaze (POD1) kod netretiranih klijanaca regulišu nivo H2O2 u ćelijama već u najranijim fazama razvića. Vremenom ukupna aktivnost POD raste i dolazi do pojave aktivnosti novih izoformi (POD2, POD3 i POD4). Pod dejstvom nepetalaktona, izostaje aktivnost POD1 u najranijim fazama razvića, kao i aktivnost POD4. Odloţena je i pojava aktivnosti POD2 i POD3 izoformi. Rezultat ovakvih dešavanja moţe biti akumulacija H2O2 u prvim danima razvića klijanaca i akumulacija fenola usled izostanka aktivnosti vakuolarne POD koja redukuje H2O2 tako što koristi fenolna jedinjenja kao primarne elektron donore. Modifikovani profil izoformi POD, kao i izmenjeni model aktivnosti POD pod dejstvom nepetalaktona, moţe biti posledica usporene dinamike klijanja semena, ali vrlo verovatno postoji nepetalakton-specifiĉna regulacija na nivou ekspresije i aktivnosti ovih enzima.  Trans,cis-nepetalakton dovodi do povećanog sadrţaja ukupnih fenola u prvim fazama rastenja i razvića klijanaca kresa, što je praćeno ranijom indukcijom ekspresije i povećanom aktivnošću PPO. Rezultat je ubrzano opadanje sadrţaja fenolnih jedinjenja tokom vremena do nivoa specifiĉnog za netretirane klijance kresa. PPO predstavljaju bitnu komponentu odbrambenog mehanizma klijanaca kresa na alelopatski potencijal nepetalaktona i preuzimaju glavnu funkciju oksidacije fenola i regulacije njihove koncentracije u ranim fazama rastenja i razvića, kada dolazi do izostanka aktivnosti POD.  Promene u metaboliĉkim transformacijama sinapata, koje se odigravaju pod dejstvom nepetalaktona, mogu rezultovati ĉitavim nizom promena u primarnom i sekundarnom metabolizmu semena i klijanaca kresa, i na taj naĉin poremetiti osnovne modele rastenja i razvića biljaka i uticati na njihov antioksidativni sistem. 164  Alelopatsko dejstvo nepetalaktona pokazano je u sluĉaju poljoprivrednih kultura kao što su Lactuca sativa L. sorta Majska kraljica, Lotus corniculatus L. sorta Bokor, Brassica napus L., i korovskih vrsta poput Stellaria media (L.) Vill., Rumex crispus L., i Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. ekotip Kolumbija. Iako se radi o preliminarnim istraţivanjima, ona ukazuju na visoki potencijal korišćenja etarskog ulja N. rtanjensis u poljoprivrednoj praksi, kao bioherbicida za kontrolu i suzbijanje korovskih vrsta. 165 LITERATURA 1. Abrahim, D., Braguini, W.L., Kelmer-Bracht, A.M., Ishii-Iwamoto, E.L. (2000). Effects of four monoterpenes on germination, primary root growth, and mitochondrial respiration of maize. Journal of Chemical Ecology, 26: 611-624. 2. Abrahim, D., Francischini, A.C., Pergo, E.M., Kelmer-Bracht, A.M., Ishii- Iwamoto, E.L. (2003). Effects of alpha-pinene on the mitochondrial respiration of maize seedlings. Plant Physiology and Biochemistry, 41: 985-991. 3. Adiguzel, A., Ozer, H., Kilic, H., Cetin, B. (2007). Screening of antimicrobial activity of essential oil and methanol extract of Satureja hortensis on foodborne bacteria and fungi. Czech Journal of Food Science, 25: 81-89. 4. Adiguzel, A., Ozer, H., Sokmen, M., Gulluce, M., Sokman, A., Kilic, H., Sahin, F., Baris, O. (2009). Antimicrobial and antioxidant activity of the essential oil and methanol extracts of Nepeta cataria. Polish Journal of Microbiology, 58(1): 69-76. 5. Aebi, H. (1984). Catalase in vitro. Methods in Enzymology, 105: 121-126. 6. Agata, N, Ohta, M, Yokoyama, K. (2002). Production of Bacillus cereus emetic toxin (cereulide) in various foods. International Journal of Food Microbiology, 71(1): 23–27. 7. Aharoni, A., Jongsma, M.A., Bouwmeester, H.J. (2005). Volatile science? Metabolic engineering of terpenoids in plants. Trends in Plant Science, 10(12): 594-602. 8. Ahmed, A.A., Husaam, E.H. Hegazy, M.F., Tzakou, O., Couladis, M., El- Hamed, A., Mohamed, H., Mohamed A., Pare, A.P. (2006). Argolic acid A and argolic methyl ester B, two new cyclopentano-monoterpenes diol from Nepeta argolica. Natural Product Communications, 1: 523-526. 9. Alcher, R.G., Erturk, N., Heath, L.S. (2002). Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Botany, 53: 1331-1341. 166 10. Alim, A., Goze, I., Cetin, A., Atas, A.D., Cetinus, S.A., Vural, N. (2009). Chemical composition and in vitro antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil of Nepeta nuda L. subsp. albiflora (Boiss.). African Journal of Microbiology Research, 3(8): 463-467. 11. Alscher, R.G., Erturk, N., Heatrh, L.S. (2002). Role of superoxide dismutases (SODs) in controlling oxidative stress in plants. Journal of Experimental Bototany, 53: 1331-1341. 12. Andarwulan, N., Fardiaz, D., Wattimena, G.A., Shetty, K. (1999). Antioxidant activity associated with lipid and phenolic mobilization during seed germination of Pangium edule Reinw. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 3158-3163. 13. Angelini, L.G., Capranese, G., Cioni, P.L., Morelli, I., Macchia, M., Flamini, G. (2003). Essential oils from Mediterranean Lamiaceae as weed germination inhibitors. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51: 6158-6164. 14. Aquino-Bolaños, E.N., Mercado-Silva, E. (2004). Effects of polyphenol oxidase and peroxidase activity, phenolics and lignin content on the browning of cut jicama. Postharvest Biology and Technology, 33: 275-283. 15. Arora, R.B., Roy, S., Qadri, I.Z., Kesar, D.K. (1985). Long term follow up of patients of hypercholesteremia and hyperlipidemia with herbal polypharmaceutical-lipotab. Hamdard National Foundation Monograph, 175- 184. 16. Aruoma, O.L. (1998). Free radicals, oxidative stress and antioxidants in human health and disease. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 75: 199-212. 17. Asard, H., May, J.M., Smirno, V.N. (2004). Vitamin C: Functions and biochemistry in animals and plants. Garland Sciences/BIOS Scientific Publishers, Oxon, New York. 18. Aydin, S., Beis, R., Ozturk, Y., Husnu, K, Baser, K.H.C. (1998). Nepetalactone: A new opioid analgesic from Nepeta cesarea Boiss. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 50: 813-817. 19. Aydin, S., Demir, T., Öztürk, Y., Hüsnü, K. Başer, C. (1999). Analgesic activity of Nepeta italica L. Phytotherapy Research, 13: 20-23. 167 20. Azza, S., Lyoussi, B., Miguel, M.G. (2011). Antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of some commercial essential oils and their major compounds. Molecules, 16: 7672-7690. 21. Badisa, R.B., Tzakou, O., Couladis, M., Pilarinou, E. (2003). Cytotoxic activities of some Greek Labiatae herbs. Phytotherapy Research, 17: 472-476. 22. Bailly, C. (2004). Active oxygen species and antioxidants in seed biology. Seed Science Research, 14: 93-107. 23. Bailly, C., Benamar, A., Corbineau, F., Côme, D. (2000). Antioxidant systems in sunflower (Helianthus annuus L.) seeds as affected by priming. Seed Science Research, 10: 35-42. 24. Bailly, C., El-Maarouf-Bouteau, H., Corbineau, F. (2008). From intracellular signaling networks to cell death: the dual role of reactive oxygen species in seed physiology. Comptes Rendus Biologies, 331(10): 806-814. 25. Bailly, C., Leszczynska B., Côme R., Corbineau, F. (2002). Changes in activities of antioxidant enzymes and lipoxygenase during growth of sunflower seedlings from seeds of different vigour. Seed Science Research, 12: 47‑55. 26. Bannister, W.H., Bannister, J.V., Barra, D., Bond, J., Bossa, F. (1991). Evolutionary aspects of superoxide dismutase: the copper/zinc enzyme. Free Radical Research Communications, 12–13: 349-361. 27. Barro, D., Schinina, M.E., Bossa, F., Puget, K., Durosay, P. (1990). A tetrameric iron superoxide dismutase from the eukaryote Tetrahymena pyridornis. Journal of Biological Chemistry, 265: 17680-17687. 28. Baser, K.H.C., Demirci, B. (2007). Chemistry of essential oils, In: Flavours and Fragnances. Chemistry, Bioprocessing, Sustainability. (Berger, R.M. Ed.) Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg. pp. 648. 29. Baser, K.H.C., Kirimer, N., Kurkcuoglu, M., Demirci, M. (2000). Essential oils of Nepeta specie growing in Turkey. Chemistry of natural compounds, 36 (4): 356-359. 30. Basera, K.H.C., Oözeka, T., Bemircia, B., Tümenb, G. (2001). Composition of the essential oil of Nepeta betonicifolia C.A. Meyer from Turkey. Journal of Essential Oil Research, 13(1): 35-36. 168 31. Bates, R.B. Sigel, C.W. (1963). Terpenoids, cis-trans and trans-cis nepetalactones. Experientia, 19: 564-565. 32. Bates, R.B., Eisenbraun, E.J., McElvain, S.M. (1958). The methylcyclopentane- 1, 2-dicarboxylic acids and the configurations of the nepetic acids. Journal of the American Chemical Society, 80: 3420-3428. 33. Bath, R., Rai, R.V., Karim, A.A. (2010). Mycotoxins in food and feed: present status and future concerns. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safet, 9(1): 57-81. 34. Batish, D.R., Kohli, R.K., Singh, H.P., Saxena, D.B. (1997). Studies on herbicidal activity of parthenin, a constituent of Parthenium hysterophorus towards billgoat weed (Ageratum conyzoides). Current Science, 73: 369-371. 35. Bauer, J., Gareis, M., Bott, A., Gedek, B. (1989). Isolation of a mycotoxin (gliotoxin) from a bovine udder infected with Aspergillus fumigatus. Medical Mycology, 27(1): 45-50. 36. Beauchamp, C., Fridovich I. (1971). Superoxide dismutase: Improved assays and an assay applicable to acrylamide gels. Analytical Biochemistry, 44(1): 276- 287. 37. Bedoya, L.M., Palomino, S.S., Abad, M.J., Bermejo, P., Alcami, J. (2002). Screening of selected plant extracts for in vitro inhibitory activity on human immunodeficiency virus. Phytotherapy Research, 16: 550-554. 38. Bellesia, F., Grandi, R., Pagnoni, U.M., Pinetti, A., Trave, R. (1984). Biosynthesis of nepetalactone in Nepeta cataria. Phytochemistry, 23(1): 83-87. 39. Bellesia, F., Pagnoni, U.M, Trave, R., Andreetti, G.D., Bocelli, G., Sgarabotto, P. (1979). Synthesis and molecular structures of (1S)-cis, cis-iridolactones. Journal of the chemical society. Perkin transactions, 2(10): 1341-1346. 40. Belongia, E.A., McDonald, K.L., Parham, G.L., White, K.E., Korlath, J.A., Lobato, M.N., Strand, S.M., Casale, K.A. Osterholm, M.T. (1991). An outbreak of Escherichia coli 0157:H7 colitis associated with consumption of precooked meat patties. The Journal of Infectious Diseases, 164 (2): 338-343. 41. Benavente-Garc aa, O., Castilloa, J., Lorentea, J., Ortu ob, A., Del Riob, J.A. (2000). Antioxidant activity of phenolics extracted from Olea europaea L. leaves. Food chemistry, 68(4): 457-462. 169 42. Benzie, I.F F., Strain, J.J. (1996). The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of ―Antioxidant Power‖: the FRAP assay. Analytical Biochemistry, 239: 70-76. 43. Bernier, U.R., Furman, K.D., Kline D.L., Allan, S.A., Barnard, D.R. (2005). Comparison of contact and spatial repellency of catnip oil and N, N-diethyl-3- methylbenzamide (deet) against mosquitoe. Journal of Medical Entomology, 42: 306-311. 44. Besseau, S., Hoffmann, L., Geoffroy, P., Lapierre, C., Pollet, B., Legrand, M. (2007). Flavonoid accumulation in Arabidopsis repressed in lignin synthesis effects auxin transport and plant growth. Plant Cell, 19: 148-162. 45. Bewley, J.D. (1997). Seed germination and dormancy. The Plant Cell, 9: 1055- 1061. 46. Beyer, W.F., Fridovich, I. (1987). Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequences of minor changes in conditions. Analytical Biochemistry, 161(2): 559 – 566. 47. Bhatia, S., Shukla, R., Madhu, S.V., Gambhir, J.K., Prabhu, K.M. (2003). Antioxidant status, lipid peroxidation and NO end products in patients of type 2 diabetes mellitus with nephropathy. Clinical Biochemistry, 36: 557-562. 48. Birkett, M.A., Bruce, T., Pickett, J.A. (2010). Repellent activity of Nepeta grandiflora and Nepeta clarkei (Lamiaceae) against the cereal aphid, Sitobion avenae (Homoptera: Aphididae). Phytochemistry Letters, 3(3):139-142. 49. Birkett, M.A., Pickett, J.A. (2003). Aphid sex pheromones: from discovery to commercial production. Phytochemistry, 62(5): 651-656. 50. Bisht, D.S., Padalia, R.C., Singh, L., Pande, V., Lal, P., Mathela, C.S. (2010). Constituents and antimicrobial activity of the essential oils of six Himalayan Nepeta species. 75: 739-747. 51. Blatter, E. (1928). Beautiful flowers of Kashmir, vol II, John Bale, Sons and Danielsson Limited Publishers, London. 52. Bogatek, R., Gniazdowska, A., Zakrzewska, W., Oracz, K, Gawronski, S.W. (2006). Allelopathic effects of sunflower extracts on mustard seed germination and seedling growth. Biologia Plantarum, 50:156-158. 170 53. Bombelli, C., Borocci, S., Cruciani, O., Mancini, G., Monti D., Segre, A.L., Sorrenti A., Venanzi M. (2008). Chiral recognition of dipeptides in bio- membrane models: the role of amphiphile hydrophobic chains. Tetrahedron: Asymmetry, 19(1): 124-130. 54. Booth, C. (1971). Fungal culture media. In: Methods in microbiology (Norris, J.R., Ribbons, D.W., Eds.). London & New York: Academic Press. pp: 49-94. 55. Boros, B., Jakabova, S., Dornyeia, A., Horvathd, G., Pluhare, Z., Kilar, F., Felingera, A. (2010). Determination of polyphenolic compounds by liquid chromatography-mass spectrometry in Thymus species. Journal of chromatography A, 1217: 7972-7980. 56. Böttcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Schmidt, J., Schmotz, C., Neumann S., Scheel, D., Clemens, S. (2008). Metabolome analysis of biosynthetic mutants reveals a diversity of metabolic changes and allows identi acation of a large number of new compounds in Arabidopsis. Plant Physiology, 147: 2107-2120. 57. Bottini, A.T., Dev, V., Garfagnoli, D.J., Lohani, H., Mathela C.S., Pant, A.K. (1987). Isolation and ctystal structure of a novel dichemical bis-monoterpenoid from Cymbopogon martinii. Phytochemistry, 26(8): 2301-2302. 58. Bottini, A.T., Dev, V., Shah, G.C., Mathela, C.S., Melkani, A.B., Strum, N.S. (1992). Cyclopentano-monoterpene enol acetates from Nepeta leucophylla. Phytochemistry, 35: 1653-1657. 59. Bourel, C., Perineau, F., Michel, G., Bessire, J.M. (1993). Catnip (Nepeta cateria L.) Essential oil: analysis of chemical constituents, bacteriostatic and fungistatic properties. Journal of Essential oil Research, 5: 159-167. 60. Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier E. (2001). Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science, 161(5): 839-851. 61. Bouteau, H.E.M., Bailly, C. (2008). Oxidative signaling in seed germination and dormancy. Plant Signaling & Behavior, 3(3): 175-182. 62. Bozari, S., Agar, G., Aksakal, O., Erturk, F.A., Yanmis, D. (2012). Determination of chemical composition and genotoxic effects of essential oil obtained from Nepeta nuda on Zea mays seedlings. Toxicology and Industrial Health, DOI: 10.1177/0748233711433939. 171 63. Bradford, M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of proteins utilising the principal of protein–dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 24-54. 64. Bramley, P.M., Elmadfa, I., Kafatos, A., Kelly, F.J., Manios, Y., Roxborough, H.E., Schuch, W., Sheehy, P.J.A., Wagnerm, K.H. (2000). Vitamin E. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80: 913-938. 65. Brand-Williams, W.W., Cuvelier, M.E., Berset, C. (1995). Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel – Wissenschaft und Technologie, 28: 25-30. 66. Brown, J.E., Khodr, H., Hider, R.C., Rice-Evans, C.A. (1998). Structural dependence of flavonoid interactions with Cu 2+ ions: implications for their antioxidant properties. Biochemical Journal, 330(3): 1173-1178. 67. Buckinghman, J. (1994). Dictionary of natural products. Champan and Hall, London. 68. Burt, S. (2004). Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods -a review. International Journal of Food Microbiology, 94(3): 233-253. 69. Cairns, D. (2002). Essentials of Pharmaceutical Chemistry. Pharmaceutical Press, 2002. 70. Cakmak, I., Štrbac, D., Marschner, H. (1993). Activities of hydrogen peroxide- scavenging enzymes in germinating wheat seeds. Journal of Experimental Botany, 44(1): 127-132. 71. Caliskan, M., Cuming, A.C. (1998). Spatial specificity of H2O2‑generating oxalate oxidase gene expression during wheat embryo germination. The Plant Journal, 15: 165‑71. 72. Cantino, P.D., Harley, R.M., Wagstaff, S.J. (1992). Status and classification. In: Advances in Labiate species. (Harley, R.M., Reynolds, T. Eds.). Royal Botanic Gardens, pp: 511-522. 73. Caro, A., Puntarulo, S. (1999). Nitric oxide generation by soybean embryonic axes. Possible effect on mitochondrial function. Free Radical Research, 31: 205-212. 172 74. Carson, C.F., Riley, T.V. (1995). Antimicrobial activity of the major components of the essential oil of Melaleuca alternifolia, Journal of Applied Bacteriology, 78: 264-269. 75. Celik, A., Mercan, N., Arslan, I., Davran, H. (2008). Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil from Nepeta cadmea. Chemistry of Natural Compounds, 44(1): 199-120. 76. Chalchat, J.C., Gurović, M.S., Petrović, S.D., Maksimović, T.A. (2000). Composition of the essential oil of Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević, Lamiaceae from Serbia. Journal of essential oil research, 12: 238-240. 77. Chalchat, J.C., Petrović, S.D., Gorunović, M.S. (1998). Quantity and composition of essential oil of the wild plant Nepeta nuda L. from Yugoslavia. Journal of Essential Oil Research, 10: 423-425. 78. Chauhan, K.R., Klun, J.A., Debboum, M., Kramer, M. (2005). Feeding deterrent effects of catnip oil components compared with two synthetic amides against Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology, 42: 643-646. 79. Cigremis, Y., Ulukanli, Z. Ilcim, A. Akgoz, M. (2010). In vitro antioxidant and antimicrobial assays of acetone extracts from Nepeta meyeri Bentham. Europiean Review for Medicinal and Pharmacological Sciences, 14: 661-668. 80. Civjan, N. (2012). Plant terpenoids In: Natural products in chemical biology. (Keeling, C.I. Ed.). John Wiley & Sons. 81. Clark, L.J., Hamilton, J.G.C., Chapman, J.V., Rhodes, M.J.C., Hallahan, D.L. (1997). Analysis of monoterpenoids in glandular trichomes of the catmint Nepeta racemosa. Plant Journal, 11(6): 1387-1393. 82. Clauß, K., Baumert, A., Nimtz, M., Milkowski, C., Strack, D. (2008). Role of GDSL lipase-like protein as sinapine esterase in Brassicaceae. The Plant Journal, 53: 802-813. 83. Clinical and Laboratory Standards Institute (2006). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard, 8th ed. CLSI publication M07-A8. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA. 84. Coats, J., Schultz, G., Peterson, C. (2003) Botanical products as repellents against mosquitoes and cockroaches. 226th ACS National MeetingAGRO-16. 173 85. Constabel, C.P., Berger, D.R. and Ryan, C.A. (1995). Systemin activates synthesis of wound-inducible tomato leaf polyphenol oxidase via the octadecanoid defense signaling pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 92: 407-411. 86. Cowan, M.M. (1999). Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews, 12: 564-568. 87. Croteau, R. (2000). Natural products (secondary metabolites). In: Biochemistry and molecular biology of plants (Buchanan, B.B., Ed.). American Society of Plant Physiology, Rockville, MD, USA. pp: 1250-1318. 88. Cruz-Ortega, R., Anaya, A.L., Gavilanes-Ruiz, M., Sanchez, N.S., Jimenez- Esatrada, M. (1990). Effect of diacetyl piquerol on hydrogen ion ATPase activity of microsomes from Ipomoea purpurea. Journal of Chemical Ecology, 16: 2253-2261. 89. D‘Amelio, F.S. (1999). Botanicals. A Phytocosmetic Desk Reference. CRC Press, London, pp. 361. 90. Da Silva, E.A., Toorop, P.E., Van Lammeren, A.M., Hilhorst, W.M. (2008). ABA inhibits embryo cell expansion and early cell division events during coffee (Coffea arabica) seed germination. Annals of Botany, 102: 425- 433. 91. Dabiri, M., Sefidkon, F. (2003a). Chemical composition of the essential oil of Nepeta racemosa Lam. from Iran. Flavour and Fragrance Journal, 18: 157-158. 92. Dabiri, M., Sefidkon, F. (2003b). Chemical composition of Nepeta crassifolia Boiss. & Buhse oil from Iran. Flavour and fragrance journal, 18: 225-227. 93. Dalton, C.B., Med, B., Austin, C.C., Sobel, J., Hayes, P.S., Bibb, W.F., Graves, L.M., Swaminathan, B.Proctor, M.E., Griffin, P.M. (1997). An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocitogenes in milk. The New England Journal of Medicine, 336(2): 100-105. 94. Dambolena, J.S., Zunino, M.P., López, A.G., Rubinstein, H.R., Zygadlo, J.A., Mwangi, J.W., Thoithi, G.N., Kibwage, I.O., Mwalukumbi, J.M., Kariuk, S.T. (2010). Essential oils composition of Ocimum basilicum L. and Ocimum gratissimum L. from Kenya and their inhibitory effects on growth and fumonisin production by Fusarium verticillioides. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 11(2): 410-414. 174 95. Daouk, R.K., Dagher, S.M., Sattout, E.J. (1995). Antifungal activity of the essential oil of Origanum syriacum L. Journal of Food Protection, 58: 1147- 1149. 96. Dash, M., Panda, S.K. (2001). Salt stress induced changes in growth and enzyme activities in germinating Phaseolus mungo seeds. Biologia plantarum, 44(4): 587-589. 97. Dat, J., Vandenabeele, J., Vranova, E., Van Montagu, M., Inźe, D., Van, Breusegem, F. (2000). Dual action of the active oxygen species during plant stress responses. Cellular and Molecular Life Sciences, 57: 779-795. 98. Davey, M.W., Montagu, M.V., Inzé, D., Sanmartin, M., Kanellis, A., Smirno, V.N., Benzie, I.J.J., Strain, J.J., Favell, D., Fletscher, J. (2000). Plant L‐ascorbic acid: Chemistry, function, metabolism, bioavailability and effects of processing. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80: 825-860. 99. De Eknamkul, W., Ellis, B.E. (1987). Tyrosine aminotransferase: the entrypoint enzyme of the tyrosine-derived pathway in rosmarinic acid biosynthesis. Phytochemistry 26:1941-1946. 100. De Gara, L., de Pinto, M.C., Arrigoni, O. (1997). Ascorbate synthesis and ascorbate peroxidase activity during the early stage of wheat germination. Physiologia Plantarum, 100: 894-900. 101. De Tommasi, N., De Simone, F., De Feo, V., Pizza, C. (1991). Phenylpropanoid glycosides and rosmarinic аcid from Momordica balsamina. Planta Medica, 57: 201-208. 102. De Tullio, M.C., Arrigoni, O. (2003). The ascorbic acid system in seeds: to protect and to serve. Seed Science Research, 13: 249-260. 103. del Rio, L.A., Corpas, F.J., Sandalio, L.M., Palma, J.M., Gómez, M., Barroso, J.B. (2002). Reactive oxygen species, antioxidant systems and nitric oxide in peroxisomes. Journal of Experimental Bototany, 53: 1255-1272. 104. del Rio, L.A., Sandalio, L.M., Altomare, D.A., Zilinskas, B.A. (2003). Mitochondrial and peroxisomal magnese superoxide dismutase: differential expression during leaf senescence. Journal of Experimental Bototany, 54: 923- 933. 175 105. Demeke, T., Chang H.G., Morris, C.F. (2001). Effect of germination, seed abrasion and seed size on polyphenol oxidase assay activity in wheat. Plant Breeding, 120(5): 369–373. 106. DePooter, H.L., Nicolai, B., De Buyck, L.F., Goetghebeur, P., Schamp, N.M. (1987) The essential oil of Nepeta nuda. Identification of a new nepetalactone diastereoisomer. Phytochemistry, 26(8): 2311-2314. 107. Desikan, R., Mackerness, S.A.H., Hancock, J.T., Neill, S.J. (2001). Regulation of the Arabidopsis transcriptome by oxidative stress. Plant Physiology, 127: 159-172. 108. Devi, S.R, Prasad, M.N.V. (1998). Copper toxicity in Ceratophyllum demersum L. (Coontail), a free floating macrophyte: Response of antioxidant enzymes and antioxidants. Plant Science, 138: 157-165. 109. Dewick, P.M. (2002). Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. John Wiley & Sons, England. 110. Di Matteo, V., Esposito, E. (2003). Biochemical and therapeutic effects of antioxidants in the treatment of Alzheimer‘s disease, Parkinson‘s disease, and amyotrophic lateral sclerosis. Current drug targets. CNS and neurological disorders, 2: 95-107. 111. Diklić, N. (1972). Rod Nepeta, Flora Srbije, Tom VI (Josifović, M. Ed.), Srpska Akademija Nauka i Umetnosti, Beograd, pp: 372-376. 112. Diklić, N. (1999). Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević. The Red Data Book of Flora of Serbia 1. Extinct and critically Endangered Taxa. (Stevanović, V. ed), GC Etiketa, Beograd, pp: 153-155. 113. Diklić, N., Milijević, B. (1976). Nepeta rtanjensis Diklić et Milojević spec. Nova vrsta iz roda Nepeta L.-Glasnik prirodnjačkog muzeja u Beogradu, B31: 25-35. 114. Ding, J., Sun, Y., Xiao, C.L., Shi, K., Zhou, Y.H., Yu, J.Q. (2007). Physiological basis of different allelopathic reactions of cucumber and figleaf gourd plants to cinnamic acid. Jornal of Experimental Botany, 58(13): 3765- 3773. 115. Dixon, R.A., Paiva, N.L. (1995). Stress induced phenilpropanoid metabolism. The Plant Cell, 7: 1085-1087. 176 116. Downing, M.R., Mitchell, E.D. (1975). Mevalonate activating enzymes in callus culture cells from Nepeta cataria. Phytochemistry, 14: 369-372. 117. Drazkiewicz, M., Skorzynska-Polit, E., Krupa, Z. (2004). Copper- induced oxidative stress and antioxidant defence in Arabidopsis thaliana. BioMetals, 17: 379-387. 118. Duĉić, T., Lirić-Rajlić, I., Mitrović, A., Radotić, K. (2003). Activities of antioxidant systems during germination of Chenopodiumn rubrum seeds. Biologia Plantarum, 47(4): 527-533. 119. Dudai, N., Poljakoff-Mayber, A., Mayer, A.M., Putievsky, E, Lerner, H.R. (1999). Eeesential olis as allelochemicals and their potent use as bioherbicides. Journal of Chemical Ecology, 25(5): 1079-1089. 120. Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. (2004). Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology, 135: 1893-1902. 121. Duke, J.A. (2002). Handbook of medicinal herbs. (Bogenschutz-Godwin, M.J., duCellie, R.J., Duke, P.A.K. Eds.) CRC Press, London. 122. Duke, S.O., Dayan, F.E., Kagan, I.A., Baerson, S.R. (2005). New herbicide target sites from natural compounds. New discoveries in agrochemicals, 14: 151-160. 123. Dybing, E., Nelson, J.R., Mitchell, J.R., Sesame, H.A., Gillette, J.R. (1976). Oxidation of a methyldopa and other catechols by chytochromes R450- generated superoxide anion: possible mechanism of methyldopa hepatitis. Molecular Pharmacology, 12: 911-920. 124. Einhellig, F.A., Ramussen, J.A., Hejl, A.M., Souza, I.F. (1992). Effects of root exudate sorgoleone on photosynthesis. Journal of chemical ecology, 19(2): 369-374. 125. Einsenbraun, E.J., Browne, C.E., Eliel, E.L., Harris, D.L., Rahman, A., Van der Helm D. (1981). Structure of nepetalic-acid in the solid and in solution by X-ray diffraction and NMR analysis. Journal of Organic Chemistry, 46: 3302-3305. 126. El Moaty, H.I.A. (2009). Essential oil and iridoide glycoside of Nepeta septemcrenata Erenb. Journal of Nature Products, 3: 103-111. 177 127. Elguera, J.C.T., Barrientos, E.Y., Wrober, K., Wrober, K. (2013). Effect of cadmium (Cd(II)), selenium (Se(IV)), and deir mixture on phenolic compounds and antioxidant capacity in Lepidium sativum. Acta Physiologiae Plantarum, 35: 431-441. 128. El-Moaty, H.I.A. (2010). Essential oil and iridoide glycosides of Nepeta septemcrenata Erenb. Journal of Natural Products, 3: 103-111. 129. Emre, İ., Kurşat, M., Kurşat, M., Y lmaz, Ö., Erecevit, P. (2011). Some biological compounds, radical scavenging capacities and antimicrobial activities in the seeds of Nepeta italica L. and Sideritis monthana L. subsp. monthana from Turkey. Grasas y Aceites, 62(1): 68-75. 130. Erkan, N., Ayranci, G., Ayranci, E. (2008). Antioxidant activities of rosemary (Rosmarinus Officinalis L.) extract, blackseed (Nigella sativa L.) essential oil, carnosic acid, rosmarinic acid and sesamol. Food Chemistry, 110(1): 76-82. 131. Escher, S., Loew, P., Arigoni, D. (1970). The role of hydroxygeraniol and hydroxynerol in the biosynthesis of loganin and indole alkaloids. Chemical Communications, 13: 823-825. 132. Esmaeili, A., Rustaiyan, A., Masoudi, S. (2006). Composition of the essential oils of Mentha aquatica L. and Nepeta meyeri Benth.from Iran. Flavour and fragrance journal, 18(3): 263-265. 133. Exarchou, V., Nenadis, N., Tsimidou, M., Gerothanassis, I.P., Troganis, A., Boskou, D. (2002). Antioxidant activities and phenolic composition of extracts from Greek oregano, Greek sage, and summer savory. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 50: 5294-5299. 134. Fadel, O., El Kirat, K., Morandat, S. (2011). The natural antioxidant rosmarinic acid spontaneously penetrates membranes to inhibit lipid peroxidation in situ. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes, 12: 2973-2980. 135. Falk, K.L., Gershenzon, J., Croteau, R. (1990). Metabolism of monoterpenes in cell cultures of common Sage (Salvia officinalis). Plant Physiology, 93: 1559-1567. 178 136. Feldman, A.W., Hanks, R.W. (1968). Phenolic content in the roots and leaves of tolerant and susceptibile citrus cultivars attacked by Rodopholus similis. Phytochemistry, 7: 5-12. 137. Fisher, N.H. (1986). The function of mono and sesquiterpenes as plant germination and growth regulators. In: The Science of Allelopathy (Putnam, A.R., Tang, C.S. Eds.).Wiley-Interscience, New York. pp. 203-218. 138. Forestier, C., Guelon, D., Cluytens, V., Gillart, T., Sirot, J. De Champs, C. (2008). Oral probiotic and prevention of Pseudomonas aeruginosa infections: a randomized, double-blind, placebo-controlled pilot study in intensive care unit patients. Critical Care, 12: 1-10. 139. Formisano, C., Rigano, D., Senatore, F. (2011). Chemical constituens and biological activity of Nepeta species. Chemistry & Biodiversity, 8: 1783- 1817. 140. Foyer, C.H., Noctor, G. (2005). Redox homeostis and antioxidant signaling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses, Plant Cell, 17: 1866-1875. 141. Franke, R., Humphrey, J.M., Hemm, M.R., Denault, J.W., Ruegger, M.O., Cusumano, J.C., Chapple, C. (2002). The Arabidopsis REF8 gene encodes the 3-hydroxylase of phenylpropanoid metabolism. The Plant Journal, 30: 33-45. 142. Fridman, E., Pichersky, E. (2005). Metabolomics, genomics, proteomics, and the identi of enzymes and their substrates and products. Current Opinion Plant Biology, 8: 242-248. 143. Fridovich, I. (1986). Superoxide dismutases. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, 58: 61-97. 144. Friedman, J., Waller, G. (1983). Seeds as allelopathic agents. Journal of Chemical Ecology, 9(8): 1107-1112. 145. Frohnmeyer, H., Staiger, D. (2003). Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants. Balancing damage and protection. Plant Physiology, 133: 1420-1428. 179 146. Frugoli, J.A., Zhong, H.H., Nuccio, M., McCourt, P., McPeek, M.A., Thomas, T., McClung, C.R. (1996). Catalase encoded by a multigene family in Arabidopsis thaliana Heynh. Plant Physiology, 112: 327-336. 147. Fu, Q., Wang, B.C., Jin, X., Li, H.B., Han, P., Wei, K., Zhang, X., Zhu, Y.-X. (2005). Proteomic analysis and extensive protein identification from dry, germinating Arabidopsis seeds and young seedlings. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 38: 650–660. 148. Galati, E.M., Miceli, N., Galluzzo, M., Taviano, M.F., Tzakou, O. (2004). Neuropharmacological effects of epinepetalactone from Nepeta sibthorpii behavioral and anticonvulsant activity. Pharmaceutical Biology, 42: 391-395. 149. Galati, E.M., Tzakou, O., Miceli, N., Pizzimenti, F., Rapisarda, A. (2006). Pharmacognostic screening on Nepeta sibthorpii Bentham. Recent Progress in Medicinal Plants, 12: 239-256. 150. Gallardo, K., Job, C., Groot, S.P.C., Puype, M., Demol, H., Vandekerckhove. J., Job. D. (2001). Proteomic analysis of Arabidopsis seed germination and priming. Plant Physiology, 126: 835-848. 151. Ganzera, M., Crockett, S., Tellez, M.R., Khan, I.A. (2001). Determination of nepetalactone in Nepeta cataria by reversed phase high performance liquid chromatography. Pharmazie, 56: 896-897. 152. Garg, N., Manchanda, G. (2009). ROS generation in plants: boon or bane? Plant Biosystems, 143: 81-96. 153. Gautam, S.S., Sanjay, N., Prabhat, K. (2012). Screening of atibacterial activity of Nepeta ciliaris Benth. against respiratory tracts patogens. Kathmandu University Journal of Science, Engineering and Technology, 8: 100-103. 154. Gerber, M., Boutron-Ruault, M.C., Hercberg, S., Riboli, E., Scalbert, A., Siess, M.H. (2002). Food and Cancer: state of the art about the protective effect of fruits and vegetables. Bull Cancer, 89: 293-312. 155. Ghannadi, A., Aghazari, F., Mehrabani, M., Mohagheghzadeh, A., Mehregan I. (2003). Quantity and Composition of the SDE Prepared Essential Oil of Nepeta macrosiphon Boiss. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 8(2):103-105. 180 156. Gidrol, X., Lin, W.S., Degousee, N., Yip, S.F., Kush, A. (1994). Accumulation of reactive oxygen species and oxidation of cytokinin in germinating soybean seeds. European Journal of Biochemistry, 224: 21‑28. 157. Gill, S.S., Khan, N.A., Tuteja, N. (2012). Cadmium at high dose perturbs growth, photosynthesis and nitrogen metabolism while at low dose it up regulates sulfur assimilation and antioxidant machinery in garden cress (Lepidium sativum L.). Plant Science, 182: 112-120. 158. Gill, S.S., Tuteja, N. (2010). Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 909-930. 159. Gkinis, G., Bozin, B., Mimica-Dukic, N., Tzakou, O. (2010). Antioxidant activity of Nepeta nuda L. ssp. nuda essential oil rich in nepetalactones from Greece. Journal of Medicinal Food, 13(5):1176-1181. 160. Gkinis, G., Ioannou, E., Quesada A., Vagias C., Tzakou, O., Roussis, V. (2008). Parnapimarol and nepetaparnone from Nepeta parnassica. Journal of Natural Products, 71: 926-936. 161. Gkinis, G., Tzakou, O., Iliopoulou, D., Roussis, V. (2003). Chemical composition and biological activity of Nepeta parnassica oils and isolated nepetalactones. Zeitschrift für Naturforschung, 58c: 681-686. 162. Goel, A.G., Goel, A.K., Sheoron, I.S. (2003). Changes in oxidative stress enzymes during artificial ageing in cotton (Gossypium hirsutum L.) seeds. Journal of Plant Phisiology, 160(9): 1093-1100. 163. Gordaliza, M., Castro, M.A., Miguel Del Corral, J.M., San Feliciano, A. (2000). Antitumor properties of podophyllotoxin and related compounds. Current Pharmaceutical Design, 6: 1811-1839. 164. Goutam, M.P., Purohit, R.M. (1974). Antibacterial activity of some essential oils. Riechst Aromen. 24: 70-76. 165. Graham, L.P. (2009). An Introduction to Medicinal Chemistry. Oxford University Press. 166. Graβmann, J. (2005). Terpenoids as plant antioxidants. Vitamins and Hormones, 72: 505-535. 181 167. Grice, H.P. (1988). Enhanced tumour development by butylated hydroxyanisole (BHA) from the prospective of effect on forestomach and oesophageal squamous epithelium. Food and Chemical Toxicology, 26: 717- 723. 168. Guan, L.M., Scandalios, J.G. (2002). Catalase gene expression in response to auxin-mediated developmental signals. Physiologia Plantarum, 114: 288-295. 169. Gulluce, M., Sahin, F., Sokmen, M., Ozer, H., Daferera, D., Polissiou, M., Adiguzel, A., Ozkan, H. (2007). Antimicrobial and antioxidant properties of the essential oils and methanol extract from Mentha longifolia L. ssp. longifolia. Food Chemistry, 103(4): 1449–1456. 170. Habibia, Z., Masoudib, S., Rustaiyanc, A. (2004). Essential oil of Nepeta makuensis Jamzad et Mozaffarian from Iran. Journal of Essential Oil Research, 16(3): 214-221. 171. Hadian, J., Sonboli, A., Ebrahimi N.S., Mirjalili M.H. (2006). Essential oil composition of Nepeta satureioides from Iran. Chemistry of Natural Compounds, 42 (2): 175-177. 172. Hallahan, D.L., West, J.M. (1995). Production and characterisation of an acyclic monoterpene primary alchohol NADP + oxidoreductase from catmint (Nepeta racemosa). Archives of Biochemnistry and Biophysics, 318: 105-112. 173. Hallahan, D.L., West, J.M., Smiley, D.W.M., Pickett, J.A. (1998). Nepetalactol oxidoreductase in trichomes of the catmint Nepeta racemosa. Phytichemistry, 48(3): 421-427. 174. Halliwell, B. (1999). Oxygen and nitrogen are pro-carcinogens. Damage to DNA by reactive oxygen, chlorine and nitrogen species: measurement, mechanism and the effects of nutrition. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 443: 37–52. 175. Handijeva N.V., Popova S.S., Evstatievab Lj.N. (1996). Constituents of essential oils from Nepeta cataria L., N. grandiflora M.B. and N. nuda L. Journal of Essential Oil Research, 8(6): 639-643. 182 176. Hänel, H., Raether, W. (1998). A more sophisticated method of determining the fungicidal effect of water-insoluble preparations with a cell harvester, using miconazole as an example. Mycoses, 31: 148-154. 177. Harbone, J.B., Williams, C.A. (2000). Advances in flavonoid research since. Phytochemistry, 55: 481-504. 178. Harney, J.W., Barofsky I.M., Leary J.D. (1978). Behavioral and toxo logical studies of cyclopentanoids monoterpenes from Nepeta cataria. Lloydia, 41:367-374. 179. Harris, J.P., Mantle, P.G. (2001). Biosynthesis of ochratoxins by Aspergillus ochraceus. Phytochemistry, 58(5): 709-716. 180. Hause, B., Meyer, K., Viitanen, P.V., Chapple, C., Strack, D. (2002). Immunolocalization of 1-O-sinapoylglucose: malate sinapoyltransferase in Arabidopsis thaliana. Planta, 215: 26-32. 181. Hedayati, M.T., Pasqualotto, A.C., Warn, P.A., Bowyer, P. Denning, D.W. (2007). Aspergillus flavus: human pathogen, allergen and mycotoxin producer. Microbiology, 153: 1677-1692. 182. Hejl, A.M., Einhellig, F.A., Rasmussen, J.A. (1992). Effects of juglone on growth, photosynthesis and respiration. Journal of Chemical Ecology, 19(3): 559-563. 183. Heuskin, S., Godin, B., Leroy, P., Capella, Q., Wathelet, J.-P., Verheggen, F., Haubruge, E., Lognay, G. (2009). Fast gas chromatography characterization of purified semiochemicals from essential oils of Matricaria chamomile L. (Asteraceae) and Nepeta cataria L. (Lamiaceae). Journal of Chromatography A, 14: 2768-2775. 184. Hiller, K., (1965). Zur Kenntnis der Inhaltsstoffe einiger Saniculoidae. 1. Mitteilung: Sanicula europaea L.—Isolierung und quantitative Erfassung von Chlorogen-und Rosmarinsaüre. Pharmazie, 20: 574–579. 185. Hite, D.R.C., Auh, C., Scandalios, J.G. (1999). Catalase activity and hydrogen peroxide levels are inversely correlated in maize scutella during seed germination. Redox Report, 4: 29‑34. 183 186. Hou, C.T., Ciegler, A., Hesseltine, C.W. (1972). New mycotoxin, trichotoxin A, from southern leaf blight-infected from Trichoderma viride isolated corn. Applied and Environmental Microbiology, 23(1): 183-189. 187. Hou, Z.F., Tu, J.Q., Li, Y. (2002). Three new phenolic compounds from Nepeta prattii. Journal of the Chinese Chemical Society, 49:255-258. 188. Huang, A.H.C., Trelease, R.N., Moore, T.S. (1983). Plant peroxisomes. American society of plant physiologists. New York: Academic Press. 189. Humphreys, J.M., Hemm, M.R., Chapple, C. (1999). New routes for lignin biosynthesis defined by biochemical characterization of recombinant ferulate 5-hydroxylase, a multi-functional cytochrome P450-dependent monooxygenase. Proceedings of the National Academi of Sciences USA, 96: 10045-10050. 190. Hussain, J., Jamila, N., Abdullah, S., Abbas, G., Ahmed, S. (2009). Platelet aggregation, antiglycation, cytotoxic, phytotoxic and antimicrobial activities of extracts of Nepeta juncea. African Journal of Biotehnology, 8(6): 935-940. 191. Hussain, S.Z., Marin, P.D., Diklić, N., Petković, B. (1989). Micromorfological and phytochemical studies in two new endemic Nepeta (Lamiaceae) species in Yugoslavia. Pacistan Joournal of Botany, 21(2): 210- 217. 192. Hyun Eom, S., Yang, H.S., Weston, L.A. (2006). An evaluation of the allelopathic potential of selected perennial groundcovers: foliar volatiles of catmint (Nepeta faassenii) inhibit seedling growth. Journal of Chemical Ecology, 32: 1835-1848. 193. Iacopini, P., Baldi, M. Storchi, P., Sebastiani, L. (2008). Catechin, epicatechin, quercetin, rutin and resveratrol in red grape: Content in vitro antioxidant activity and interactions. Journal of Food Composition and Analysis, 21: 589-598. 194. Ibrahim, S.A., Ali, M.S. (2007). Constituents of Nepeta crassifolia (Lamiaceae). Turkish Journal of Chemistry, 31: 463-470. 184 195. Ibrahim, M.M., Bafeel S.O. (2011). Molecular and physiological aspects for Lepidium sativum tolerance in response to lead toxicity. Fresenius Environnemental Bulletin, 20(8): 40- 56. 196. Ikeda, H., Esaki, N., Nakai, S., Hashimoto, K., Uesato, S., Soda, K. Fujita, T. (1991). Acyclic monoterpene primary alcohol:NADP+ oxidoreductase of Rauwolfia serpentina cells: the key enzyme in biosynthesis of monoterpene alcohols. Journal of Biochemistry, 109: 341-347. 197. Inouye, H. (1991). Methods in plant biochemistry. (Charlwood, B.V., Banthorpe, D.V. Eds.). Aacademic Press, London. pp: 99-144. 198. Islam, A.K.M., Kato-Noguchi, H. (2012). Allelopathic potentiality of medicinal plant Leucas aspera. International Journal of Sustainable Agriculture, 4: 1-7. 199. Jahan, N., Israr, M., Mansoor A., Yousafzai, A. (2006). Phytotoxicity of Acropitilon repens (Asteraceae) and Nepeta pretervisa (Lamiaceae). Journal of Applied and Emerging sciences, 1(3): 164-166. 200. Jahangira, M., Abdel-Farida, I.B., Kima, H.K., Choia, Y.H., Verpoortea, R. (2009). Healthy and unhealthy plants: The effect of stress on the metabolism of Brassicaceae. Environmental and Experimental Botany, 67(1): 23-33. 201. Jamzad, Z., Ingrouille, M., Simmonds, M. (2003). Three new species of Nepeta (Laminaceae) from Iran. Taxon, 52: 92-98. 202. Janĉić, R., Stošić, D., Mimica-Dukić, N. (1995). Fam: Lammiaceae, In: Aromatiĉne biljke Srbije. Deĉje novine, Gornji Milanovac, Serbia & Montenegro, pp. 211-272. 203. Javidnia, K., Miri, R., Mehregan, I., Sadeghpour, H. (2005). Volatile constituents of the essential oil of Nepeta ucrainica L. ssp. kopetdaghensis from Iran. Flavour and Fragrance Journal, 20(2): 219-221. 204. Jay, J.M., Loessner, M.J., Golden, D.A. (2005). Modern food microbiology. (Heldman, D.R. Ed.). Springer Verlag, Berlin, Heidelberg. 205. Jeong, G.A., Park, D.H. (2007). Enhanced secondary metabolite biosynthesis by elicitation in transformed plant root system. Applied Biochemistry and Biotechnology, 130: 436-446. 185 206. Jimenez-Atienzer, M., Pedreño, M.A., Caballero, N., Cabanes, J., Garcia-Carmona, F. (2007). Characterisation of polyphenol oxidase and peroxidase from peach mesocarp (Prunus persica L. Cv. Babygold) Journal of the Science of Food and Agriculture, 87: 1682-1690. 207. Job, C., Rajjou, L., Lovigny, Y., Belghazi, M., Job, D. (2005). Patterns of protein oxidation in Arabidopsis seeds and during germination, Plant Physiology, 138: 790-802. 208. Jones, C.D., Woods, K.E., Setze, W.N. (2012). A chemical ecological investigation of the allelopathic potential of Lamium amplexicaule and Lamium purpureum. Open Journal of Ecology, 2(4): 167-177. 209. Jose, S., Gillespie, A.R. (1998). Allelopathy in black walnut (Juglans nigra L.) alley cropping. II. Effects of juglone on hydroponically grown corn (Zea mays L.) and soybean (Glycine max L. Merr.) growth and physiology. Plant and Soil, 203: 199-205. 210. Jovanović, S.V., Steenken, S., Simić, M.G., Hara, Y. (1998). Antioxidant properties of flavonoids: Reduction potentials and electron transfer reactions of flavonoids radicals. In: Flavonoids in health and disease (Rice-Evans, C., Packer, L.Eds.). New York: Marcel Dekker. pp. 137–161 211. Jovanović-ĐurĊević, G., Ivanić, R., Savin, K. (1989). Nepetalactone, a dominant component in the essential oil of Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević. Acta Pharmaceutica Yugoslavica, 39: 253-257. 212. Juraldo, R.L., Farley, M.M., Pereira, E., Harvey, R.C., Schuchat, A., Wenger, J.D., Stephens, D.S. (1993). Increased risk of meningitis and bacteremia due to Listeria monocytogenes in patients with human immunodeficiency virus infection. Clinicaal Infectious Diseases, 17(2): 224- 227. 213. Kalpoutzakis, E., Aligiannis, N., Mentis, A., Mitaku, S., Charvala, C. (2001). Composition of the essential oil of two Nepeta species and in vitro evaluation of their activity against Helicobacter pylori. Planta medica, 67: 880- 883. 186 214. Karadeniz, F., Burdurlu, H.S., Koca, N., Soyer, Y. (2005). Antioxidant activity of selected fruits and vegetables grown in Turkey. Turkish Journal of Agriculture and Forestry, 29: 297-303. 215. Karaman, S., Cӧmlekçioĝolu, N. (2007). Essential oil composition of Nepeta cilici Boiss. Apud Bentham and Phlomis viscosa Poiret from Turkey. International Journal of Botany, 3(1): 122-124. 216. Karruppusamy, S. (2009). A review on trends in production of secondary metabolites from higher plants by in vitro tissue, organ and cell cultures. Journal of Medicinal Plants Research, 3(13): 1222-1239. 217. Kavanagh, K. (2005). Fungi. Biology and Applications. John Wiley and Sons. England. 218. Kaya, A., Demirci, B., Baser, K.H.C. (2007). Micromorphology of glandular trichomes of Nepeta congesta Fisch. & Mey. var. congesta (Lamiaceae) and chemical analysis of the essential oils. South African Journal of Botany, 73: 29-34. 219. Kelley, C.J., Mahajan, J.R., Brooks, L.C., Neubert, L.A., Breneman, W.R., Carmack, M., (1975). Polyphenolic acids of Lithospermum ruderale Dougl. ex Lehm. (Boraginaceae). 1. Isolation and structure determination of lithospermic acid. The Journal of Organic Chemistry, 40: 1804-1815. 220. Kim, D.O., Lee, C.Y. (2004). Comprehensive study on vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of various polyphenolics in scavenging a free radical and its structural relationship. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 44: 253-273. 221. Kintzios, S. Nikolaou, A. Skoula, M. (1999). Somatic embryogenesis and in vitro rosmarinic acid accumulation in Salvia officinalis and S. fruticosa leaf callus cultures. Plant Cell Reports, 18: 462-466. 222. Kirby, T.W., Lancaster, J.R., Fridovich, I. (1981). Isolation and characterization of the iron‐containing superoxide dismutase of Methanobacterium bryantii. Archives of Biochemistry and Biophysics, 210: 140- 148. 187 223. Kliebenstein, D.J., Monde, R., Last, R.L. (1998). Superoxid dismutase in Arabidopsis: an electic enzyme family with disparate regulation and protein localization. Plant Physiology, 118: 637-650. 224. Knobloch, K., Pauli, A., Iberl, B. (1989). Antibacterial and antifungal properties of essential oil components. Journal of Essential Oil Research, 1(3): 119-28. 225. Knoss, W. (1999). Marrubium vulgare: in vitro culture and the production of diterpene marrubin and other secondary metabolites. Biotechnology in Agriculture and Forestry. Medicinal and Aromatic Plants XI. (Bajaj Y.P.S. Ed.). Springer Verlag Berlin Heidelberg. 226. Kobaisy, M., Tellez, M.R., Dayan, F.E., Mamonov, L.K., Mukanova, G.S., Sitpaeva, G.T., Gemejieva, N.G. (2005). Composition and phytotoxic activity of Nepeta pannonica L. essential oil. Journal of Essential Oil Research, 17(6): 704-707. 227. Kokdil, G., Kurucu, S., Y ld z, A. (1998). Essential oil composition of Nepeta nuda L. ssp. nuda. Flavour and Fragrance Journal, 13(4): 233-234. 228. Kokdil, G., Topcu, G., Krawiec, M., Watson, W.H. (1998). Nepetanudone, a dimer of the a-pyrone 5, 9- dehydronepetalactone. Journal of Chemical Crystallography, 28(7): 517-519. 229. Kokdil, G., Kurucu, S., Topçu, G. (1997). Composition of the essential oil of Nepeta nuda L. ssp. albiflora (Boiss.) Gams. Flavour and Fragrance Journal, 11(3): 167-169. 230. Kono, Y., Fridovich I. (1983). Inhibition and reactivation of Mn-catalase. The Journal of Biological Chemistry, 258(22): 13646-13648. 231. Kordali, S., Cakir, A., Ozer, H, Cakmakci, R., Kesdek, M., Mete, E. (2008). Antifungal, phytotoxic and insecticidal properties of essential oil isolated from Turkish Origanum acutidens and its three components, carvacrol, thymol and p-cymene. Bioresource Technology, 99: 8788-8795. 232. Kordali, S., Cakir, A., Sutay, S. (2007). Inhibitory effects of monoterpenes on seed germination and seedling growth. Zeitschrift für Naturforschung, 62c: 207-214. 188 233. Kranner, I., Grill, D. (1993). Content of low-molecular weight thiols during the imbibition of pea seeds. Physiologia Plantarum, 88: 557-562. 234. Kranner, I., Roach, T., Beckett, R.P., Whitaker, C., Minibayeva, F.V. (2010). Extracellular production of reactive oxygen species during seed germination and early seedling growth in Pisum sativum. Journalof Plant Physiology, 167: 805-811. 235. Kratchanova, M., Denev, P., Ciz, M., Mihailov, A.L. (2010). Evaluation of antioxidant activity of medicinal plants containing polyphenol compounds. Comparison of two extraction systems. Acta Bioclinica Polomica, 57(2): 229- 234. 236. Kraujalis, P., Rimantas, P., Ragazinskiene O. (2011). Antoxidant activities and phenolic composition of extract from Nepeta plant species. Proceedings of the 6th Baltic Conference on Food Science and Technology, Faculty of Food Technology, Latvia University of Agriculture, Jelgava, Latvia. 237. Krzyzanowska, J., Pecio, J.B., Stochmal, L., Wieslaw. O., Czubacka, A., Przybys, M., Doroszewska, T. (2011). Determination of polyphenols in Mentha longifolia and M. piperita field-grown and in vitro plant samples using UPLC- TQ-MS. Journal of AOAC International, 94(1): 43-50. 238. Kubo, A., Aono, M., Nakajima, N., Saji, H., Tanaka, K. Kondo, N. (1999). Differential responses in activity of antioxidant enzymes to different environmental stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Research, 112: 279-290. 239. Kuhlaman, A., Rӧhl, C. (2006). Phenolic antioxidant compounds produced by in vitro. Cultures of Rosemary (Rosmarinus officinalis) and their anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide-activated microglia. Pharmaceutical Biology, 44 (6): 401-410. 240. Kundaković, T., Milenković, M., Topić A., Stanojković, T., Juranić, Z., Lakušić B. (2011). Cytotoxicity and antimicrobial activity of Teucrium scordium L. (Lamiaceae) extracts. African Journal of Microbiology Research, 5(18): 2692-2696. 189 241. Kusunose, E., Ichihara, K., Noda, Y., Kusunose, M. (1976). Superoxide dismutase from Mycobacterium tuberculosis. Journal of Biochemistry, 80: 1343- 1352. 242. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 680. Nature, 227: 680-685. 243. Laguerre, M., López-Giraldo, L.J., Lecomte, J., Baréa, B., Cambon, E., Tchobo, P.F., Barouh, N., Villeneuve, P. (2008). Conjugated autoxidizable triene (CAT) assay: a novel spectrophotometric method for determination of antioxidant capacity using triacylglycerol as ultraviolet probe. Analytical Biochemistry, 380: 282-290. 244. Lamaison, J.L., Patitjean-Freytet, C., Carnat, A. (1991). Medicinal Lamiaceae with antioxidant properties, a potential source of rosmarinic acid. Pharmaceutica Acta Helvetiae, 66(7):185-188. 245. Lambert, R.J.W., Skandamis, P.N., Coote, P.J., Nychas, G.J.E. (2001). A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, 91: 453- 462. 246. Lasure, A., Van Poel, B., Pieters, L., Claeys, M., Gupta, M., Vanden Berghe, D., Vlietinck, A.J. (1994). Complement-inhibiting properties of Apeiba tibourbou. Planta Medica, 60: 276-277. 247. Lawrence, BM. (1992). Chemical components of Labiatae oils and their exploitation. In: Advances in Labiatae Science (Harley RM, Reynolds T, Eds.). Royal Botanical Gardens. pp. 399-436. 248. Leather, G.R. (1983). Weed control using allelopathic crop plants. Journal of Chemical Ecology, 9(8): 983-990. 249. Lee, J.S., Lee, C.Y., Eom S.H., Kim J.K. Park, N.I., Park, S.U. (2010b). Rosmarinic acid production from transformed root culturs of Nepeta cataria. Scientific Research and Essays, 5(10): 1122-1126. 250. Lee, K.P., Piskurewicz, U., Tureĉková, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. (2010a). A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(44): 109-113. 190 251. Lee, T.T. (1977). Role of phenolic inhibitors in peroxidase-mediated degradation of indole-3-acetic acid. Plant Physiology, 59(3): 372-375. 252. Lee, Y.P., Baek, K.H., Lee, H.S., Kwak, S.S., Bang, J.W., Kwon, S.Y. (2010c). Tobacco seeds simultaneously over-expressing Cu/Zn superoxide dismutase and ascorbate peroxidase display enhanced seed longevity and germination rates under stress conditions. Journal of Experimental Botany, 61(9): 2499-2506. 253. Lefer, D.J., Granger, D.N. (2000). Oxidative stress and cardiac disease. The American Journal of Medicine, 109: 315-323. 254. Leja, L., Thoppil, J.E. (2007). Antimicrobial activity of methanol extract of Origanum majorana L. (Sweet Marjoram). Journal of Environmental Biology, 28(1): 145-146. 255. Lemke, T.L. (2003). Review of organic ffunctional Groups, Introduction to medicinal organic chemistry, Lippincott Williams & Wilkins. 256. Leopoldini, M., Marino, T., Russo, N., Toscano, M. (2004a). Antioxidant properties of phenolic compounds: H-atom versus electron transfer mechanism. The Journal of the Physical Chemistry A, 108(22): 4916-4922. 257. Leopoldini, M., Marino, T., Russo, N., Toscano, M. (2004b). Density functional computations of the energetic and spectroscopic parameters of quercetin and its radicals in the gas phase and in solvent. Theoretical Chemistry Accounts, 111(2-6): 210-216. 258. Leopoldini, M., Prieto Pitarch, I., Russo, N., Toscano, M. (2004c). Structure, conformation, and electronic properties of apigenin, luteolin, and taxifolin antioxidants. A first principle theoretical study. The Journal of Physical Chemistry A, 108(1): 92-96. 259. Letchamo, W., Korolyuk, E.A., Tkachev, A.V. (2005). Chemical screening of essential oil bearing flora of Siberia IV. Composition of the essential oil of Nepeta sibirica L. tops from Altai region. Journal of Essential Oil Research, 17: 487-489. 191 260. Liblikas, I., Santangelo, E.M., Sandell, J., Baeckström, P., Svensson, M., Jacobsson, U., Unelius, C.R. (2005). Simplified isolation irocedure and interconversion of the diastereomers of nepetalactone and nepetalactol. Journal of Natural Products, 68: 886-890. 261. Linkies, A., Graeber, K., Knight, CLeubner-Metzger, G. (2010a). The evolution of seeds. New Phytologist, 186: 817–831. 262. Linkies, A., Schuster-Sherpa U., Tintelnot S., Leubner-Metzger G., Müller K. (2010b). Peroxidases identified in a subtractive cDNA library approach show tissue-specific transcript abundance and enzyme activity during seed germination of Lepidium sativum. Journal of Experimental Botany, 61(2): 491–502. 263. Litvinenko, V.I., Popova, T.P., Simonjan, A.V., Zoz, I.G., Sokolov, V.S. (1975). ‗‗Gerbstoffe‘‘ und Oxyzimtsa¨ ureabko¨ mmlinge in Labiaten. Planta Medica, 27: 372–380. 264. Liu, P.P, Koizuka, N, Homrichhausen, T.M., Hewitt, J.R., Martin, R.C., Nonogaki, H. (2005). Large-scale screening of Arabidopsis enhance-rtrap lines for seed germination-associated genes. The Plant Journal, 41: 936-944. 265. Ljaljević Grbić, M., Stupar, M., Vukojević, J., Grubišić, D. (2011a). Inhibitory effect of essential oil from Nepeta rtanjensis on fungal spore germination. Central European Journal of Biology, 6(4): 583-585. 266. Ljaljević Grbić, M., Stupar, M., Vukojević, J., Grubišić, D. (2011b). In vitro antifungal and demelanizing activity of Nepeta rtanjensis еssential оil against the human pathogen Bipolaris spicifera. Archives of Biological Sciences, 63(3): 897-905. 267. Ljaljević Grbić, M., Stupar, M., Vukojević, J., Soković, M., Mišić, D., Grubišić, D., Ristić, M. (2008). Antifungal activity of Nepeta rtanjensis essential oil. Journal of Serbian Chemical Society, 73: 961-965. 268. Ljaljević-Grbić, M., Vukojevć, J., Soković, M., Grubišić, D., Ristić, M. (2007). The Effect of Nepeta rtanjensis essential oil on test micromycetes micelya growth. Zbornk Matice Srpske za Prirodne Nauke, 113: 173-177. 269. Loir, Y.L., Baron, F., Gautier, M. (2003). Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetics and Molecular Research, 2(1): 63-76. 192 270. Macháĉková, I., Zmrhal, Z. (1981). Is peroxidase involved in ethylene biosynthesis? Physiologia Plantarum, 53(4): 479-482. 271. Madheswaran, R., Balachandran, C. Murali Manohar, B. (2004). Influence of dietary culture material containing aflatoxin and T2 toxin on certain serum biochemical constituents in Japanese quail. Mycopathologia, 158: 337- 341. 272. Madinez, M.V., Whitaker, J.R. (1995). The biochemistry and control of enzymatic browning. Trends in Food Science and Technology, 6: 195-200. 273. Mahboubi, M., Kazempour, N., Ghazian, F. Taghizadeh M. (2011). Chemical composition, antioxidant and antimicrobial activity of Nepeta persica Boiss. essential oil. Herbapolonica, 57(1): 63-71. 274. Mahmoud, S.S., Croteau, R.B. (2002). Strategies for transgenic manipulation of monoterpene biosynthesis in plants. Trends in Plant Science, 7(8): 366-373. 275. Mancini, E., Apostolides, A.N., Feo, V., Formisano, C., Rigano, D., Piozzi, F., Senatore, F. (2009). Phytotoxic effects of essential oils of Nepeta curviflora Boiss. and Nepeta nuda L. subsp. albiflora growing wild in Lebanon. Journal of Plant Interactions, 4(4): 253-259. 276. Maness, P.C., Smolinski, S., Blake, D.M., Huang, Z., Wolfrum, E.J., Jacoby, W.A. (1999). Bactericidal activity of photocatalytic TiO2 reaction: toward an understanding of its killing mechanism. Applied and Environmental Microbiology, 65(9): 4094-4098. 277. Marin, P. (2003). Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK Internacional, Beograd. 278. Martin, K.R., Appel, C.L. (2010). Polyphenols as dietary supplements: A double-edged sword. Nutrition and Dietary Supplements, 2: 1-12. 279. Mathela, C.S., Kharkwal, H., Laurent, R. (1994). Investigations on Himalayan Nepeta Species. VI. Essential Oil of Nepeta discolor Benth. Journal of Essential Oil Research, 6(5): 519-521. 193 280. Matsuno, M., Nagatsu, A., Ogihara, Y., Ellis, B.E., Mizukami, H. (2002). CYP98A6 from Lithospermum erythrorhizon encodes 4-coumaroyl-40- hydroxyphenyllactic acid 3-hydroxylase involved in rosmarinic acid biosynthesis. FEBS Letters, 514: 219-224. 281. Mayer, A.M, Harel, E. (1979). Polyphenol oxidases in plants. Phytochemistry, 18: 193-215. 282. Mayer, A.M. (2006). Polyphenol oxidases in plants and fungi: Going places? Phytochemistry, 67: 2318-2331. 283. McDonald, M.B. (1999). Seed deterioration: physiology, repair and assessment. Seed Science and Technology 27: 177‑237. 284. McElvain, S.M., Eisenbraun, E.J. (1955). The constituens of the volatile oil of catnip. The structure of nepetalic acid and related compounds. Journal of the American Chemical Society, 77(6): 1599-1567. 285. Mehrabani, M., Asadipour, A., Amoli, S. (2004). Chemical constituens of the essential oil of Nepeta depauperata Benth. From Iran. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 12(3): 98-100. 286. Meloni, D.A., Oliva, M.A., Martinez, C.A., Cambraia, J. (2003). Photosynthesis and activity of superoxide dismutase, peroxidase and glutathione reductase in cotton under salt stress. Environmental and Experimental Botany, 49: 69-76. 287. Meyer, K., Cusumano, J.C., Somerville, C., Chapple, C.C.S. (1996). Ferulate-5-hydroxylase from Arabidopsis thaliana defines a new family of cytochrome P450-dependent monooxygenases. Proceedings of the National Academi of Sciences USA, 93: 6869-6874. 288. Miao, Y., Lv, D., Wang, P., Wang, X.C., Chen J., Miao, C., Songa C.P. (2006). An Arabidopsis glutathione peroxidase functions as both a redox transducer and a scavenger in abscisic acid and drought stress responses. The Plant Cell, 18: 2749-2766. 289. Miceli, N., Taviano, M.F., Giuffrida, D., Trovato A., Tzakou O., Galati E.M. (2005). Anti-inflammatory activity of extract and fractions from Nepeta sibthorpii Bentham. Journal of Ethnopharmacology, 97: 261-266. 194 290. Milkowski, C., Strack, D. (2010). Sinapate esters in brassicaceous plants: biochemistry, molecular biology, evolution and metabolic engineering. Planta, 232: 19-35. 291. Milkowski, C., Strack, D. (2004). Serine carboxypeptidase-like acyltransferases. Phytochemistry, 65:517-524. 292. Mishra, B.B., Gautam, S., Sharma, A. (2012). Purification and characterization of polyphenol oxidase (PPO) from eggplant (Solanum melongena) Food Chemistry, 134: 1855-1861. 293. Mišić, D. (2003.) Micropropagation of Nepeta rtanjensis Diklić & Milojević as the efficient method for ex situ protection. MsC Thesis, Facutly of Biology. - Beograd. 294. Mišić, D., Maksimović, V., Todorović, S., Grubišić, D., Konjević, R. (2005a). Influence of carbohydrate source on Nepeta rtanjensis growth, morphogenesis and nepetalactone production in vitro. Israel Journal of Plant Sciences, 53:103–8. 295. Mišić, D.M, Ghalawenji, N.A, Grubišić, D.V, Konjević, R.M. (2005b). Micropropagation and reintroduction of Nepeta rtanjensis, an endemic and critically endangered perennial of Serbia. Phyton-Annales Rei Botanicae, 45: 9- 20. 296. Mitić, N., Dmitrović, S., ĐorĊević, M., Zdravković-Korać, S., Nikolić, R., Raspor, M., ĐorĊević, T., Maksimović, V., Ţivković, S., Krstić-Milošević, D., Stanišić, M., Ninković, S. (2012). Use of Chenopodium murale L. transgenic hairy root in vitro culture system as a new tool for allelopathic assays. Journal of Plant Physiology, 169(12): 1203-1211. 297. Modnicki, D, Tokar, M, Klimek, B. (2007). Flavonoids and phenolics acids of Nepeta cataria L. var. citriodora (Becker) Balb. (Lamiaceae). Acta Poloniae Pharmaceutic Drug Research, 64: 247-225. 298. Mohagheghzadeh, A., Shams-Ardakani, M., Ghannadi, A., Minaeian, M. (2004). Rosmarinic acid from Zataria multiflora tops and in vitro cultures. Fitoterapia, 75: 315-321. 299. Molisch, H. (1937). Der Einfluss einer Pflanze auf die andere- Allelopathie. Fischer, Jena 64-67. 195 300. Moller, I.M. (2001). Plant mitochondria and oxidative stress: Electron transport, NADPH turnover, and metabolism of reactive oxygen species. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 52: 561‑91. 301. Morohashi, Y. (2002). Peroxidase activity develops in the micropylar endosperm of tomato seeds prior to radicle protrusion. Journal of Experimental Botany, 53: 1643‑1650. 302. Morris, K., Linkies, A., Müller, K., Oracz,K., Wang, X., Lynn, J., Metzger. G., Finch-Savage, W. (2011). Regulation of seed germination in the close Arabidopsis relative Lepidium sativum: A global tissue-specific rranscript analysis 1[C][W][OA] . Plant Physiology, 155: 1851-1870. 303. Mothana, R.A. (2012). Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oil of Nepeta deflersiana growing in Yemen. Records of Natural Products, 6(2): 189-193. 304. Motohashi, N., Shirataki, Y., Kawase, M., Tani, S., Sakagami, H., Satoh, K., (2002). Cancer prevention and therapy with kiwifruit in Chinese folklore medicine: a study of kiwifruit extracts. Journal of Ethnopharmacology, 81: 357- 364. 305. Müller, K., Linkies, A., Vreeburg, A.M., Fry, S.C., Liszky, A., Metzger, G.L. (2009). In vivo cell wall loosening by hydroxyl radicals during cress seed germination and elongation growth. Plant Physiology, 150: 1855-186. 306. Müller, K., Tintelnot, S., Leubner-Metzger, G. (2006). Endosperm limited Brassicaceae seed germination: abscisic acid inhibits embryo induced endosperm weakening of Lepidium sativum (cress) and endosperm rupture of cress and Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology, 47: 864-877. 307. Müller, W.H. (1986). Allelochemical mechanisms in the inhibition of herbs by chaparral shrubs. In The science of allelopathy (Putnam, A.R., Tang, C.S. Eds.).Wiley-Interscience, New York. pp. 189-199. 308. Müller, W.H., Müller, C.H. (1964). Volatile growth inhibitors produced by Salvia species. Bulletin of the Torrey Botanical Club, 91: 327-330. 309. Murashige, T., Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, 15: 473-497. 196 310. Muthuswamy, S. Rupasinghe, H.P.V. (2007). Fruit phenolics as natural antimicrobial agents: Selective antimicrobial activity of catechin, chlorogenic acid and phloridzin. Journal of Food, Agriculture & Environment 5(3-4): 5-8. 311. Mutlu, S., Atici, O. (2009). Allelopathic effect of Nepeta meyeri Benth. extract on seed germination and seedling growth of some crop plants. Acta Physiologiae Plantarum, 31: 81-93. 312. Mutlu, S., Atici, O.¸ Esim, N., Mete, E. (2011). Essential oils of catmint (Nepeta meyeri Benth.) induce oxidative stress in early seedlings of various weed species. Acta Physiologiae Plantarum, 33: 943–951. 313. Nair, R.B., Joy, R.W., Kurylo, E., Shi, X.H., Schnaider, J., Datla, R.S.S., Keller, W.A., Selveraj, G. (2000). Identification of a CYP84 family of cytochrome P450-dependent mono-oxygenase genes in Brassica napus and perturbation of their expression for engineering sinapine reduction in the seeds. Plant Physiology, 123: 1623-1634. 314. Nair, R.B., Xia, Q., Kartha, C.J., Kuryl,o E., Hirji, R.N., Datla, R., Selvaraj, G. (2002). Arabidopsis CYP98A3 mediating aromatic 3-hydroxylation. Developmental regulation of the gene, and expression in yeast. Plant Physiology, 130: 210-220. 315. Nascimento, G.G.F., Locatelli, J., Freitas, P.C., Silva, G.L. (2000). Antibacterial activity of plant extracts andphytochemicals on antibiotic-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology, 31(1): 247-56. 316. Nedelkova, Y.Y., Dimitrova, M.A., Yordanova, Z.P., Kapchina-Toteva, V.M. (2011). Micropropagation of Nepeta nuda ssp. nuda (Lamiaceae)- influences of auxins and cytokinins. I International Symposium on Medicinal, Aromatic and Nutraceutical Plants from Mountainous Areas. 317. Nedorostova, L. Kloucek, P., Stolcova, M., Pulkrabek, J. (2009). Antimicrobial properties of selected essential oils in vapour phase against foodborne bacteria. Food Control, 20(2): 157-160. 318. Neill, S., Desikan, R. Hancock, J. (2002). Hydrogen peroxide signalling. Current Opinion in Plant Biology, 5: 388-395. 319. Nešković, M., Konjević R., Ćulafić Lj. (2003). Fiziologija biljaka, NNK- International, Beograd. 197 320. Nestorović, J., Mišić, D., Šiler, B., Soković, M., Glamoĉlija, J., Ćirić, A., Maksimović, V., Grubišić D. (2010). Nepetalactone content in shoot cultures of three endemic Nepeta species and the evaluation of their antimicrobial activity. Fitoterapia, 81: 621-626. 321. Nestorović, J., Mišić, D., Šiler, B., Ţivković, S., Malović, G., Perišić, M., Stojić, A., Grubišić, D. (2010): Application of PTR-MS in detection of volatile compounds: in vitro culture of three Nepeta species. 20th European Conference on the Atomic and Molecular Physics of Ionized Gases (20th ESCAMPIG), Novi Sad, Serbia, Proceedings: WPM P3.57. 322. Nestorović, J., Mišić, D., Šiler, B., Ţivković, S., Stojić, A., Perišić, M., Grubišić, D. (2009b): PTR-MS detection of nepetalactone in shoot cultures of three Nepeta species under different carbohydrate source. 2nd International Symposium „New Researches in Biotechnology“, Bucharest, Romania, Proceedings: 138-145. 323. Nestorović, J., Mišić, D., Stojić, A., Perišić, M., Ţivković, S., Šiler, B., Aniĉić, M., Malović, G., Grubišić, D. (2009a): In vitro selection of nepetalactone-rich genotypes of Nepeta rtanjensis by using HPLC and PTR-MS. 4th International Conference on Proton Transfer Reaction Mass Spectrometry and Its Applications, Innsbruck, Austria, Proceedings: 263-267. 324. Ni, B.R. Bradford K.J. (1993). Germination and dormancy of abscisic acid- and gibberellin-deficient mutant tomato seeds: Sensitivity of germination to abscisic acid, gibberellin, and water potential. Plant Physiology, 101: 607- 617. 325. Nishida, N., Tamotsu, S., Nagata, N., Saito, C., Sakai, A. (2005). Allelopathic effects of volatile monoterpenoids produced by Salvia leucophylla inhibition of cell proliferation and DNA synthesis in the root apical meristem of Brassica campestris seedlings. Journal of Chemical Ecology, 31(5): 1187-1203. 326. Noguchi, H.K., Ino, T. (2005). Possible involvement of momilactone B in rice allelopathy. Joutnal of Plant Physiology, 162: 718-721. 327. Nori-Shargha, D., Baharvand, B. (2005). The volatile constituents of Nepeta elymatica Bornm. from Iran. Journal of Essential Oil Research, 17(3): 329-330. 198 328. Nostro, A., Germanò, M.P., D‘Angelo, A., Marino, A., Cannatelli, M.A. (2000). Extraction methods and bioautography for evaluation of medicinal plant antimicrobial activity. Letters in Applied Microbiology, 30(5): 379-384. 329. Nurmann, G., Strack, D. (1979). Sinapine esterase. Part I. Characterization of sinapine esterase from cotyledons of Raphanus sativus. Zeitschrift für Naturforschung, 34c: 715-720. 330. Nurmann, G., Strack, D. (1981). Formation of 1-sinapoylglucose by UDP glucose: sionapic acid glucosyltransferase from cotyledons of Raphanus sativus. Eitschrift fur Pflanzenzuchtung-Journal of Plant Breeding 102: 11-17. 331. Ober, D., Hartmann, T. (1999). Homospermidine synthase, the first pathway-specific enzyme of pyrrolizidine alkaloid biosynthesis, evolved from deoxyhypusine synthase. Proceedings of the National Academi of Sciences USA, 96: 14777-14782. 332. Obroucheva, N.V., Antipova, O.V. (1997). Physiology of the initiation of seed germination. Russian Journal of Plant Physiology, 44: 250-264. 333. Ogawa, M., Hanada, A., Yamauchi, Y., Kuwahara, A., Kamiya, Y., Yamaguchi S. (2003). Gibberellin biosynthesis and response during Arabidopsis seed germination. The Plant Cell, 15: 1591-1604. 334. Oracz, K., Bailly, C., Gniazdowska, A., Côme, D., Corbineau, F., Bogatek, R. (2007). Induction of oxidative stress by sunflower phytotoxins in germinating mustard seeds. Journal of Chemical Ecology, 33: 251-264. 335. Oracz, K., El-Maarouf-Bouteau, H., Kranner, I., Bogatek R, Corbineau, F., Bailly, C. (2009). The mechanisms involved in seed dormancy alleviation by hydrogen cyanide unravel the role of reactive oxygen species as key factors of cellular signaling during germination. Plant Physiology, 150: 494-505. 336. Oracz, K., Voegele, A., Tarkowská, D., Jacquemoud, D., Tureĉková, V., Urbanová, T., Strnad, M., Sliwinska, E., Leubner-Metzger, G. (2011). Myrigalone A iInhibits Lepidium sativum seed germination by interference with gibberellin metabolism and apoplastic superoxide Production required for embryo extension growth and endosperm rupture. The Plant Cell, 18: 2749- 2766. 199 337. Osakabe, K., Tsao, C.C., Li, L., Popko, J.L., Umezawa, T., Carraway, D.T., Smeltzer, R.H., Joshi, C.P., Chiang, V.L. (1999). Coniferyl aldehyde 5- hydroxylation and methylation direct syringyl lignin biosynthesis in angiosperms. Proceedings of the National Academi of Sciences USA, 96: 8955- 8960. 338. Oskabe, N, Takano, H, Sanbongi, C, Yasuda, A, Yanagisawa, R, Inoue, K., Yoshikawa, T. (2004). Anti-inflammatory and anti-allergic effect of rosmarinic acid (RA); inhibition of seasonal allergic rhinoconjunctivitis (SAR) and its mechanism. Biofactors, 21: 127-131. 339. Paré, P.W., Tumlinson, H. Parnham, M.J., Kesselring, K., (1985). Rosmarinic acid. Drugs of the Future, 10: 756-757. 340. Parr, A.J., Bolwell, G.P. (2000). Phenols in plant and man. The potential for possible nutritional enhancement of the diet by modifying the phenols content or profile. Journal of the Science of Food and Agriculture, 80: 985- 1012. 341. Perillo, M.A., Guidoti, A., Costa, E., Yu, R., Maggio, B. (1994). Modulation of phospholipase A2 and C activities against dilauroylphosphorylcholine in mixed monolayers with semisynthetic derivatives of ganglioside and sphingosine. Molecular Membrane Biology, 11: 119-126. 342. Perry, N.S.L., Bollen, C., Perry, E.K. Ballard, C. (2003). Salvia for dementia therapy: review of pharmacological activity and pilot tolerability clinical trial. Biochemistry and Behavior, 75: 651-659. 343. Petersena, M., Simmonds, M.S.J. (2003). Rosmarinic acid. Phytochemistry, 62: 121–125. 344. Peterson, C., Coats, J. (2001). Insect repellents-past, present and future. Pesticide Outlook, 12: 154–8. 345. Peterson, C.J., Nemetz, L.T., Jones, L.M., Coats, J.R. (2002). Behavioral activity of catnip (Lamiaceae) essential oil components to the German cockroach (Blattodea: Blattellidae). Journal of Economic Entomolology, 95: 377-380. 346. Peterson, M. (1997). Cytochrome P-450-dependent hydroxylation in the biosynthesis of rosmarinic acid in Coleus. Phytochemistry, 45: 1165-1172. 200 347. Peterson, M., Hausler, E., Karwatzki, B., Meinhard, J. (1993). Proposed biosynthetic pathway for rosmarinic acid in cell cultures of Coleus blumei Benth. Planta, 189: 10-14. 348. Petruzzelli, L., Müller, K., Hermann, K., Leubner-Metzger, G. (2003). Distinct expression patterns of β-1, 3-glucanases and chitinases during the germination of Solanaceous seeds.Seed Science Research, 13: 139-153. 349. Peuchant, E., Brun, J., Rigalleau, V., Dubourg, L., Thomas, M., Daniel, J. (2004). Oxidative and antioxidative status in pregnant women with either gestational or type 1 Diabetes. Clinical Biochemistry, 37: 293-298. 350. Pietta, P.G. (2000). Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products, 63: 1035-1042. 351. Polsomboon, S., Grieco, J.P., Achee, N.L., Chauhan, K.R., Tanasinchayakul, S., Pothikasikorn, J., Chareonviriyaphap, T. (2008). Behavioral responses of catnip (Nepeta cataria) by two species of mosquitoes, Aedes aegypti and Anopheles harrisoni, in Thailand. Journal of the American Mosquito Control Association, 24(4): 513-519. 352. Poser, G.L., Menut, C., Toffoli, M.E., Verin, P., Sobral, M., Bessiere, J.M., Lamaty, G., Henriques, A.T. (1996). Essential oil composition and allelopathic effect of the Brazilian Lamiaceae Hesperozygis ringens (Benth.). Journal of Agriculture and Food Chemistry, 44: 1829-1832. 353. Potter, J.D. (2005). Vegetables, fruit and cancer. Lancert, 366: 527-530. 354. Pourcel, L., Routaboul, J., Kerhoas L., Caboche M., Lepinie, L., Debeaujona I. (2005). TRANSPARENT TESTA10 encodes a laccase-like enzyme involved in oxidative polymerization of flavonoids in Arabidopsis seed coat. The Plant Cell, 17: 2966-2980. 355. Priestley, D.A. (1986). Seed aging. Implications for seed storage and persistence in the soil. Ithaca: Cornell University Press. 356. Prithiviraj, B., Perry, G., Badri, D.V., Vivanco, M. (2006). Chemical facilitation and induced pathogen resistance mediated by a root-secreted phytotoxin. New Phytolohist, 173(4): 852-860. 201 357. Proestos, C., Boziaris, I.S., Nychas, G.J.E., Komaitis, M. (2006). Analysis of flavonoids and phenolic acids in Greek aromatic plants: Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity. Food chemistry, 95: 664-671. 358. Proestos, C., Lytoudi, K., Mavromelanidou O.K., Zoumpoulakis P. Sinanoglou V.J. (2013). Antioxidant capacity of selected plant extracts and their essential oils. Antioxidants, 2:11-22. 359. Puntarulo, S., Galleano, M., Sanchez, R.A., Boveris, A. (1991). Superoxide anion and hydrogen peroxide metabolism in soybean embryonic axes during germination. Biochimica et Biophysica Acta, 1074: 277‑283. 360. Puntarulo, S., Sanchez, R.A., Boveris, A. (1988). Hydrogen peroxide metabolism in soybean embryonic axes at the onset of germination. Plant Physiology, 86: 626‑30. 361. Putnam, A.R. (1985). Weed allelopathy, In: Weed Physiology (Duke S.O. Ed.). CRC Press, Boca Raton, Florida. pp. 131-150. 362. Quiroga, M., Guerrero C., Botella, M.A., Barceló, A., Amaya, I., M.I. Medina, F.J. Alonso, S.M. de Forchetti, H. Tigier, Valpuesta, V. (2000). A tomato peroxidase involved in the synthesis of lignin and suberin. Plant Physiology, 122: 1119-1127. 363. Rabbani, M., Sajjadi, S.E., Mohammadi, A. (2008). Evaluation of the anxiolytic effect of Nepeta persica Boiss. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 5: 181-186. 364. Radulović, N., Blagojević, P.D., Rabbitt, K., Meneses, F.S. (2011). Essential oil of Nepeta x faassenii Bergmans ex Stearn (N. mussinii Spreng. x N. nepetella L.): a comparison study. Natural Product Communication, 6(7): 1015- 1022. 365. Rahnama, H., Ebrahimzadeh, H. (2006). Antioxidant isozymes activities in potato plants (Solanum tuberosum L.) under salt stress. Journal of Science, 17(3): 225-230. 202 366. Rajjou, L., Gallardo, K., Debeaujon, I., Vandekerckhove, J., Job, C., Job, D. (2004). The effect of alpha-amanitin on the Arabidopsis seed proteome highlights the distinct roles of stored and neosynthesize mRNAs during germination. Plant Physiology, 134: 1598-1613. 367. Rather, M.A., Tauheeda, H., Dar, B.A., Shawl, A.S., Qurishi M.A., Ganai, B.A. (2012). Essential oil composition of Nepeta raphanorhiza Benth. growing in Kashmir valley. Records of Natural Products, 6(1): 67-70. 368. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice- Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorisation assay. Free Radicals Biology and Medicine, 26: 1231- 1237. 369. Regnier, F.E., Waller, G.R., Eisenbraun, E.J. (1967). Studies on the composition of the essential oils of three Nepeta species. Phytochemistry, 6: 1281-1290. 370. Rice, E.L. (1984). Allelopathy. Academic Press, Orlando, Florida. 371. Richardson, A., McDougall, G.J. (1997). A laccase type polyphenol oxidase from lignifying xylem of tobacco. Phytochemistry, 44(2): 229-235. 372. Rigano, D., Arnold, N.A., Conforti, F., Menichini, F., Formisano, C., Piozzi, F., Senatore, F. (2011). Characterisation of the essential oil of Nepeta glomerata Montbret et Aucher ex Bentham from Lebanon and its biological activities. Natatural Product Research, 25(6): 614-626. 373. Rivero, R.M., Ruiz, J.M., Garc a, P.C., L pez-Lefebre, L.R., Sánchez, E., Romero L. (2001).Resistance to cold and heat stress: accumulation of phenolic compounds in tomato and watermelon plants. Plant Science, 160(2): 315-321. 374. Robbins, R.J. (2003). Phenolic acids in foods: An overview of analytical methodology. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 51: 2866-2887. 375. Romagni, J.G., Allen, S.N., Dayan, F.E. (2000). Allelopathic effects of volatile cineoles on two weedy plant species. Journal of Chemical Ecology, 26(1): 303-313. 203 376. Rustaiyan, A., Komeilizadeh, H., Monfared, A., Nadji K., Masoudi, S., Yari, M. (2000). Volatile constituents of Nepeta denudata Benth. and N. cephalotes Boiss. from Iran. Journal of Essential Oil Research, 12(4): 459-461. 377. Rustaiyan, A., Monfared, A., Masoudi, S. (1999). Composition of the essential oil of Nepeta asterotrichus Rech. F. et Aell. from Iran. Journal of Essential Oil Research, 11(2): 229-230. 378. Rustaiyan, A., Najadi, K. (1999). Composition of the essential oils of Nepeta ispahanica Boiss. and Nepeta binaludensis Jamzad from Iran. Flavour and fragrance journal, 14: 35-37. 379. Rusydi, M.R.M., Azrina A. (2012). Effect of germination on total phenolic, tannin and phythic acid contents in soybean and peanut. International Food Research, 19(2): 673-677. 380. Safaei-Ghomi, J., Nahavandi, S., Batooli, H. (2011). Studies on the antioxidant activity of the volatile oil and methanol extract of Nepeta laxiflora Benth. and Nepeta sessilifolia Bunge. from Iran. Journal of Food Biochemistry, 35: 1745-4514 381. Safaei-Ghomia, J., Bamoniria, A., Haghania, M., Batooli H. (2006). Essential oil composition of Nepeta gloeocephala Rech. from Iran. Journal of Essential Oil Research, 18 (6): 635-637. 382. Saffar, A., Najjar, M.B., Mianabadi, M. (2009). Activity of antioxidant enzymes in response to cadmium in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Sciences, 9: 44-45. 383. Sahbaz, R., Lieberei, R., Aniszewski, T. (2009). Polyphenol oxidase (PPO, catecholase) activity during germination and early seedling growthof cicer milkvetch (Astragalus cicer L.). Journal of Applied Botany and Food Quality, 82: 163-169. 384. Sajjadi, S.E, Eskandari, B. (2005). Chemical constituens of the essential oil of Nepeta oxyodonta. Chemistry of Natural Compounds, 41(2): 175-177. 385. Sajjadi, S.E. (2005). Analysis of the essential oil of Nepeta sintenisii Bornm. from Iran. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences 13(2): 61-64. 204 386. Sajjadi, S.E., Ghassemi, N. (1999). Volatile constituents of Nepeta glomerulosa Boiss. subsp. carmanica. Flavour and Fragrance Journal, 14: 265- 267. 387. Sajjadia, S.E., Khatamsaz, M. (2001). Volatile constituents of Nepeta heliotropifolia Lam. Journal of Essential Oil Research, 13(3): 204-205. 388. Sajjadia, S.E., Mehregan, I. (2005). Chemical constituents of the essential oil of Nepeta daenensis Boiss. Journal of Essential Oil Research, 17(5): 563-564. 389. Sakagami, Y., Kajimura, K. (2002). Bactericidal activities of disinfectants against vancomycin-resistantent erococci. Journal of Hospital Infection, 50(2): 140-4. 390. Salehi, P., Sonboli, A., Allahyari, L. (2007). Antimicrobial and antioxidant properties of the essential oil and various extracts of Nepeta ispahanica from Iran. Journal of Essential Oil Bearing Plants, 10: 324-329. 391. Salin, M.L., Bridges, S.M. (1981). Absence of the iron‐containing superoxide dismutase in mitochondria from mustard (Brassica campestris). Biochemical Journal, 195: 229-233. 392. Samelis, J., Sofos, J.N., Kendall, P.A., Smith, G.C. (2001). Fate of Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium DT 104, and Listeria monocytogenes in fresh meat decontaminationf at 4 and 10°C. Journal of Food Protection, 64(7): 950-957. 393. Santos-Gomes, P.C., Fernandes-Ferreira, M. (2003). Essential oils produced by in vitro shoots of sage (Salvia officinalis L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51(8): 2260-2266. 394. Santos-Gomes, P.C., Seabra, R.M., Andrade, P.B., Fernandes-Ferreira, M. (2002). Phenolic antioxidant compounds produced by in vitro shoots of sage (Salvia officinalis L.). Plant Science, 162: 981-987. 395. Sarahroodi, S., Jafari-Najafi, R., Nasri, S., Rahampur, K., Maleki- Jamshid, A., Esmaeili, S. (2012). Effects of Nepeta menthoides aqueous extract on retention and retrieval of memory in mice. Pacistan Journal of Biological Sciences, 15(22): 1085-1089. 205 396. Sarath, G., Hou, G., Baird, L.M., Mitchell, R.B. (2007). Reactive oxygen species, ABA and nitric oxide interactions on the germination of warm‑season C(4)‑grasses. Planta, 226: 697‑708. 397. Sawai, S., Saito, K. (2011). Triterpenoid biosynthesis and engineering in plants. Fronties in Plant Science, 2(25): 1-8. 398. Saxena, J., Mathela, C.S. (1996). Antifungal activity of new compounds from Nepeta leucophylla and Nepeta clarkei. Applied an d Environmental Microbiology, 62(2): 702-704. 399. Scandalios, J.G., Guan, L., Polidoros, A.N. (1997). Catalases in plants: gene structure, properties, regulation and expression. In: Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses (Scandalios, J.G. Ed.). New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp. 343–406. 400. Scarpati, M.L., Oriente, G. (1958). Isolation and constitution of rosmarinic acid, from Rosmarinus officinalis. Ric. Sci. 28: 2329–2333. 401. Schlos, P., Walter, C., Mader, M. (1987). Basic peroxidases in isolated vacuoles of Nicotina tabacum L. Planta, 170: 225-229. 402. Schlüter, D., Chahoud, S., Lassmann, H., Schumann, A., Hof, H., Deckert-Schlüter, M. (1996). Intracerebral targets and immunomodulation of murine Listeria monocytogenes meningoencephalitis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology, 55(1): 14-24. 403. Schmid, J., Amrhein, N. (1995). The molecular organisation of the shikimate pathway in plants. Phytochemistry, 39: 739–747. 404. Schoch, G., Goepfert, S., Morant, M., Hehn, A., Meyer, D., Ullmann, P., Werck-Reichhart, D. (2001). CYP98A3 from Arabidopsis thaliana is a 3- hydroxylase of phenolic esters, a missing link in the phenylpropanoid pathway. The Journal of Biological Chemistry, 276: 36566-36574. 405. Schopfer, P., Plachy, C., Frahry, G. (2001). Release of reactive oxygen intermediates (superoxide radicals, hydrogen peroxide, and hydroxyl radicals) and peroxidase in germinating radish seed controlled by light, gibberellin, and abscisic acid. Plant Physiology, 125: 1591‑602. 206 406. Schultz, G., Simbro, E., Belden, J., Zhu, J., Coats, J. Catnip. (2004). Nepeta cataria (Lamiales: Lamiaceae)—a closer look: seasonal occurrence of nepetalactone isomers and comparative repellency of three terpenoids to insects. Environmental Entomolology, 33: 1562-1569. 407. Schulz, J.B., Lindenau, J., Seyfried, J., Dichganz, J. (2000). Glutathione, oxidative stress and neurodegeneration. European Journal of Biochemistry, 267(16): 4904-4911. 408. Schulz, M., Kussmann, F., Knop, M., Kriegs, B., Gresens., F., Eichert, T., Ulbrich, A., Marx., F., Fabricius., H., Goldbach, H., Noga, G. (2007). Allelopathic monoterpenes interfere with Arabidopsis thaliana cuticular waxes and enhance transpiration. Plant Signaling & Behavior, 2(4): 231-239. 409. Sefidkon, F., Dabiri, M., Alamshahi, A. (2002). Analysis of the essential oil of Nepeta fissa C.A. Mey from Iran. Flavour and Fragrance Journal, 17: 89- 90. 410. Sefidkon, F., Jamzad, Z., Mirza, M. (2006). Chemical composition of the essential oil of five Iranian Nepeta species (N. crispa, N. mahanensis, N. ispahanica, N. eremophila and N. rivularis). Flavour and Fragrance Journal, 21: 764–767. 411. Sefidkon, F., Shaaban, A. (2004). Essential oil composition of Nepeta meyeri Benth. from Iran. Flavour and Fragrance Journal, 19(13): 236-238. 412. Sefidkon, F., Jamzad, Z. (2007). Essential oil composition of four Iranian Nepeta Species (N. cephalotes, N. bornmuelleri, N. mirzayanii and N. bracteata). Journal of Essential Oil Research, 19(3): 262-265. 413. Sefidkona, F., Akbarinia, A. (2003). Essential oil composition of Nepeta pogonosperma Jamzad et Assadi from Iran. Journal of Essential Oil Research, 15(5): 327-328. 414. Senatorea, F., Arnoldb, N.A., Piozzic, F. (2005). Composition of the essential oil of Nepeta curviflora Boiss. (Lamiaceae) from Lebanon. Journal of Essential Oil Research, 17(3): 268-270. 415. Sevon, N, Oksman-Caldentey, K.M. (2002). Agrobacterium rhizogenesmediates transformation: root cultures as a source of alkaloids. Planta Medica, 68: 859-868. 207 416. Shahidi, F., Janitha, P.K., Wanasundara, P.D. (1992). Phenolic antioxidants. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 32: 67-103. 417. Shan, B., Cai, Y.Z., Sun, M., Corke, H. (2005). Antioxidant capacity of 26 spice extracts and characterization of their phenolic constituents. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 53(2): 7749-7759. 418. Sheela, C., Ramesh, C. (2011). Engineering secondary metabolite production in hairy roots. Phytochemistry reviews, 10: 371-375. 419. Shinwari, Z.K., Ahmaid, N., Hussain, J., Urrehman, N. (2013). Antimicrobial evaluation and proximate profile of Nepeta leavigata, Nepeta kurramensis and Rhynchosia reniformis. Pacistan Journal of Botany, 45(1): 253-258. 420. Shu, J.J. (1994). Nepeta Linnaeus. Flora of Chaina 17: 107-118. 421. Sikemma, J., de Bont, J.A., Poolman, B. (1994). Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membranes. The Journal of Biological Chemistry, 269(11): 8022-8028. 422. Simontacchi, M., Caro, A., Fraga, C.G., Puntarulo, S. (1993). Oxidative stress effects, tocopherol content in soybean embryonic axes upon imbibition and following germination. Plant Physiology, 103: 949-953. 423. Simontacchi, M., Sadovsky, L., Puntarulo, S. (2003). Profile of antioxidant content upon developing of Sorghum bicolor seeds. Plant Science, 164: 709-715. 424. Singh, H.P., Batish, D.R., Kaur, S., Arora, K., Kohli, R.K. (2006a). α- pinene inhibits growth and induces oxidative stress in roots. Annals of Botany, 98: 1261-1269. 425. Singh, H.P., Batish, D.R., Kaur, S., Kohli, R.K., Arora, K. (2006b). Phytotoxicity of the volatile monoterpene citronellal against some weeds. Zeitschrift für Naturforschung C, 61: 334-340. 426. Singh, H.P., Batish, D.R., Kaur, S., Ramezani, H., Kohli, R.K. (2002). Comparative phytotoxicity of four monoterpenes against Cassia occidentalis. Annals of Applied Biology, 141: 111-116. 208 427. Singh, H.P., Batish, D.R., Kohli, R.K. (2003). Allelopathic interactions and allelochemicals: new possibilities for sustainable weed management. Critical Reviews Plant Science, 22: 239-311. 428. Singh, H.P., Batish, D.R., Kohli, R.K. (2004). Allelopathic effect of two volatile monoterpenes against bill goat weed (Ageratum conyzoides L.). Crop protection, 21: 347-350. 429. Singh, H.P., Kaur, S., Mittal, S., Batish, D.R., Kohli, R.K. (2009). Essential oil of Artemisia scoparia inhibits plant growth by generating reactive oxygen species and causing oxidative damage. Journal of Chemical Ecology, 35: 154-162. 430. Skalts, H.D., Lazari, D.M., Loukis, A.E., Constantinidis, T. (2000). Essential oil analysis of Nepeta argolica Bory & Chaub. subsp. argolica (Lamiaceae) growing wild in Greece. Flavour and Fragrance Journal, 15(2): 96-99. 431. Smith, M.A., Rottkamp, C.A., Nunomura, A., Raina, A.K., Perry, G. (2000). Oxidative stress in Alzheimer‘s disease. Biochimica et Biophysica Acta, 1502: 139-144. 432. Sokolović, M., Šimpraga, B. (2006). Survey of trichothecene mycotoxins in grains and animal feed in Croatia by thin layer chromatography. Food Control, 17: 733-740. 433. Sonboli, A., Gholipour, A., Yousefzadi, M., Mojarrad M. (2009). Antibacterial activity and composition of the essential oil of Nepeta menthoides from Iran. Natural Product Communication, 4(2): 283-286. 434. Sonboli, A., Salehi, P., Yousefdazi, M. (2004). Antimicrobial activity and chemical composition of the essential oil of Nepeta crispa Willd. from Iran Zeitschrift für Naturforschung, 59c: 653-656. 435. Soobrattee, M.A, Neergheen, V.S., Luximon-Ramma, A., Aruoma, O.I., Bahorun, T. (2005). Phenolics as potential antioxidant therapeutic agents: mechanism and actions. Mutatation Research, 579(1-2): 200-213. 436. Spero, N.C., Gonzalez, Y.I., Scialdone, M.A., Hallahan, D.L. (2008). Repellency of hydrogenated catmint oil formulations to black flies and mosquitoes in the field. Journal of Medical Entomology, 45(6): 1080-1086. 209 437. Sreejayan, N., Rao, M. (1996). Free radical scavenging activity of curcuminoids. Drug Research, 46: 169-171. 438. Stalikas, C.D. (2007). Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and flavonoids. Journal of Separation Science, 30: 3268-3295. 439. Steer, P., Milligard, J., Sarabi, D.M., Wessby, B., Kahan, T. (2002). Cardiac and vascular structure and function are related tolipid peroxidation and metabolism. Lipids, 37: 231-236. 440. Steffens, J.C. (2000). Acyltransferases in protease‘s clothing. Plant Cell, 12: 1253-1255. 441. Steffens, J.C., Harel, E., Hunt, M.D. (1994). Polyphenol oxidase. In Recent advances in phytochemistry. Genetic Engineering of Plant Secondary Metabolism, (Ellis B.E., Kuroki G.W., Stafford H.A., Eds.), Plenum Press, New York. pp. 275-312. 442. Stojanović, G., Radulović, N., Lazarević, J., Miladinović, D., Đoković, D. (2005). Antimicrobial activity of Nepeta rtanjensis essential oil. Journal of Essential Oil Research, 17: 587-589. 443. Stone, J.R., Yang, S. (2006). Hydrogen peroxide: a signaling messenger. Antioxid Redox Signal, 8: 243-270. 444. Stout, M.J., Fidantsef, A.L., Duffey, S.S., Bostock, R.M. (1999). Signal interactions in pathogen and insect attack: systemic plant-mediated interactions between pathogens and herbivores of the tomato, Lycopersicon esculentum. Physiological and Molecular Plant Pathology, 54: 115-130. 445. Strack, D. (1980). Enzymatic synthesis of 1-sinapoylglucose from free sinapic acid and UDP-glucose by a cell-free system from Raphanus sativus seedlings. Zeitschrift für Naturforschung, 35c: 204-208. 446. Strack, D. (1981). Sinapine as a supply of choline for the biosynthesis of phosphatidylcholine in Raphanus sativus seedlings. Zeitschrift für Naturforschung, 36c: 215-221. 447. Suke, S.O., Dayan F.E. (2006). Modes of action of phytotoxins from plants. In: Allelopathy: A physiological process with ecological implication (Regiosa, M.J., Pedrol, N., Gonzáles, L. Eds.), Springer, Neterlands. pp. 511- 536. 210 448. Sun, W.Q., Leopold, A.C. (1995). The maillard reaction and oxidative stress during aging of soybean seeds. Physiologia Plantarum, 94: 94-104. 449. Swarup, V., Ghosh, J., Ghosh, S., Saxena, A., Basu, A. (2007). Antiviral and anti-inflammatory effects of rosmarinic acid in an experimental murine model of Japanese encephalitis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 51: 3367-3370. 450. Takahashi, Y., Inaba, N., Kuwahara, S., Kuki, W. (2003). Antioxidative effect of citrus essential oil components on human low‐density lipoprotein in vitro. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67(1): 195-197. 451. Takeda, T., Yokota, A., Shigeoka, S. (1995). Resistance of photosynthesis to hydrogen peroxide in algae. Plant Cell Physiology, 36(6): 1089-1095. 452. Takeda, Y., Ooiso, Y., Masuda, T., Honda, G., Otsuka, H., Sezik, E. (1998). Iridoid and eugenol glycosides from Nepeta cadmea. Phytochemistry, 49(3): 787-791. 453. Takhtajan, A. (2009). Lamiaceae In: Flovering plants. Springer-Verlag, Berlin, Hamburg. pp. 511-588. 454. Tanaka, T., Morimoto, S., Nonaka, G., Nishioka, I., Yokozawa, T., Chung, H.Y., Oura, H. (1989). Magnesium and ammonium-potassiu lithospermates B, the active principles having a uremia-preventive effect from Salvia miltiorrhiza. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 37: 340-344. 455. Tawfik, A.A., Read, P.E., Cuppett, S.L. (1998). Rosmarinus officinalis (Rosemary), in vitro culture, regeneration of plant, and the level of essential oil and monoterpenoid constituents. Biotechnology in Agriculture and Forestry. Medicinal and Aromatic Plants X. (ed. Y.P.S. Bajaj). Springer Verlag Berlin Heidelberg. 456. Tepe, B., Daferera, D., Tepe, A.S., Polissiou, M., Sokmen, A. (2007). Antioxidant activity of the essential oil and varioous extract of Nepeta flavida Hub.-Mor. From Turkey. Food Chemistry, 103(4): 1358-1364. 211 457. Tepe, B., Donmez, E., Unlu, M., Candan, F., Daferera, D., Vardar-Unlu, G., Polissioud, M., Sokmen, A. (2004). Antimicrobial and antioxidative activities of the essential oils and methanol extracts of Salvia cryptantha (Montbret et Aucher ex Benth.) and Salvia multicaulis (Vahl.). Food Chemistry, 84(4): 519-525. 458. Thipyapong, P. Steffens, J.C. (1997). Tomato polyphenol oxidase. Differential response of the polyphenol oxidase promoter to injuries and wound signals. Plant Physiolyogy, 115: 409-418. 459. Thipyapong, P., Hunt, M.D., Steffens, J.C. (1995). Systemic wound induction of potato (Solanum tuberosum) polyphenol oxidase. Phytochemistry, 40: 673-676. 460. Toh, S., Imamura, A., Watanabe, A., Nakabayashi, K., Okamoto, M., Jikumaru, Y., Hanada, A., Aso, Y., Ishiyama, K., Tamura, N., Iuchi, S., Kobayash, M., Yamaguchi, S., Kamiya, Y., Nambara, E., Kawakami, N. (2008). High temperature-induced abscisic acid biosynthesis and its role in the inhibition of gibberellin action in Arabidopsis seeds. Plant Physiology, 146: 1368-1385. 461. Tolbert, N.E. (1980). The biochemistry of plants. Academic press: New York 1: 359-388. 462. Tommasi, F., Paciolla, C., de Pinto, M.C. and De Gara, L. (2001). A comparative study of glutathione and ascorbate metabolism during germination of Pinus pinea L. seeds. Journal of Experimental Botany, 52: 1647-1654. 463. Toorop, P.E., Aelst, A.C., Hilhorst, H.W.M. (2000). The second step of the biphasic endosperm cap weakening that mediates tomato (Lycopersicon esculentum) seed germination is under control of ABA. Journal of Experimental Botany, 51: 1371-1379. 464. Topal, S., Kocaçal şkan. I. (2006). Allelopathic effects of dopa against four weed species. DPU Fen Institute of science, 11: 27-32. 465. Topçu, G., Kökdil G., Yalç n S.M. (2000). Constituents of Nepeta caesarea. Journal of Natural Products, 63(6): 888-890. 212 466. Trute, A., Nahrstedt, A., (1986). Separation of rosmarinic acid enantiomers by three different chromatographic methods (HPLC, CE, GC) and the determination of rosmarinic acid in Hedera helix L. Phytochemical Analysis, 7: 204-208. 467. Tsukatani, T., Suenaga, H., Shiga, M., Noguchi, K., Ishiyama, M., Ezoe, T. (2012). Comparison of the WST-8 colorimetric method and the CLSI broth microdilution method for susceptibility testing against drug-resistant bacteria. Journal of Microbiologic Methods, 90: 160-166. 468. Tundis, R., Nadjafi, F., Menichini, F. (2012). Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity and antioxidant properties of Nepeta crassifolia Boiss & Buhse and Nepeta binaludensis Jamzad. Phytotherapy Resesearch, DOI: 10.1002/ptr.4757. 469. Turina, A.V., Perillo, M.A. (2003). Monoterpenes affect chlorodiazepoxide–micelle interaction through micellar dipole potential modifications. Biochimica et Biophysica Acta, 1616: 112-120. 470. Turner, C. (1976). Genus Nepeta, Flora Europea, Tome III. (Tutin, T., Heywood, G., Burges, N.A., Valentine, D.M., Walters, S.M., Webb D. Eds.). Cambridge University Press, Cambridge, pp: 158-160. 471. Tuteja, N., Singh, M.B., Misra, M.K., Bhalla, P.L., Tuteja, R. (2001). Molecular mechanisms of DNA damage and repair: progress in plants. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 36: 337-397. 472. Tzagoloff, A. (1963). Metabolism of sinapine in mustard plants. I. Degradation of sinapine into sinapic acid and choline. Plant Physiology, 38: 202-206. 473. Uchida, K. (2000). Role of reactive aldehyde in cardiovascular diseases. Free Radical Biology and Medicine, 28: 1685-1696. 474. Uesato, S., Ikeda, H., Fujita, T., Inouye, H., Zenk, M.H. (1987). Elucidation of iridodial formation mechanism. Partial purification and characterization of the novel monoterpene cyclase from Rauwolfia serpentina cell suspension culture. Tetrahedron Letters, 28: 4431-4434. 213 475. van Acker, S.A., van den Berg, D.J., Tromp, M.N., Griffaen D.H., van Bennekom, W.P., van der Vijgh, W.J. (1996). Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids. Free Radical Biology and Medicine, 20(3): 331-342. 476. Vandenabeele, S., Vanderauwera, S., Vuylstek, M., Rombauts, S., Langebartels, C., Seidlotz, H.K., Zabeau, M., Montagu, M.V., Inze, D., Breusegem, F.V. (2004). Catalase deficiency drastically affets gene expression induced by light in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal, 39: 45-58. 477. Vardhini B.V., Rao S.R. (2003). Amelioration of osmotic stress by brassinosteroids on seed germination and seedling growth of three varieties of sorghum. Plant Growth Regulation, 41: 25-31. 478. Vaughan, M.A., Vaughn, K.C. (1988). Mitotic disrupters from plants and their potential uses as herbicides. Weed Technology, 2: 533-539. 479. Veitch, N.C. (2004). Structural determination of plant peroxidase function. Phytochemistry Reviews, 3: 3-18. 480. Verdeguer, M., Blázquez, M.A., Boira, H. (2009). Phytotoxic effects of Lantana camara, Eucalyptus camaldulensis and Eriocephalus africanus essential oils in weeds of Mediterranean summer crops. Biochemical Systematics and Ecology, 37: 362–369. 481. Voegele, A., Linkies, A., Müller, K., Metzger, G. (2011). Members of the gibberellin receptor gene family GID1 (Gibberellin insensitive DWARF1) play distinct role during Lepidium sativum and Arabidopsis thaliana seed germination. Journal of Experimental Botany, 62(14): 5131-5147. 482. Vogt, T. (2010). Phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant, 3: 2- 20. 483. Wagner, K.H., Elmadfa, I. (2003). Biological relevance of terpenoids- overview focusing on mono‐, di and tetraterpenes. Annals of Nutrition and Metabolism, 47: 95-106. 484. Waller, G.R. (1989). Allelochemical action of some natural products. In Phytochemical Ecology: Allelochemicals, Mycotoxins and Insect Pheromones and Allomones. (Chou C.H., Waller G.R. Eds.). Institute of Botany, Academia Sinica Monograph Series No. 9, Taipei, Taiwan. pp. 129-154. 214 485. Wang, W.B., Kim, Y.H., Lee, H.S., Kim, K.Y., Deng, X.P., Kwak, S.S. (2009). Analysis of antioxidant enzyme activity during germination of alfalfa under salt and drought stresses. Plant Physiology and Biochemistry, 47: 570– 577. 486. Wang, Z., Chen, Y., Cun, L. (2007). Differences in biological responses to cold stress in two contrasting varieties of rape seeds (Brassica napus L.). Forestry Studies in China, 9(2): 142-146. 487. Webb, C.E., Russell R.C. (2007). Is the extract from the plant catmint (Nepeta cataria) repellent to mosquitoes in Australia? Journal of the American Mosquito Control Association, 23(3): 351-354. 488. Weidenbbörner, M., Hindorf, H., Jha, H.C., Tsotsonos, P. (1990). Antifungal activity of flavonoids in against storage fungi of genus Aspergillus. Phytochemistry, 29: 1103-1105. 489. Weidenbbörner, M., Hindorf, H., Jha, H.C., Tsotsonos, P., Egge, H. (1989). Antifungal activity of isoflavonoids against storage fungi of genus Aspergillus. Phytochemistry, 28: 3331-3319. 490. Weidenbbörner, M., Jha, H.C. (1994). Fungicidal activity of flavonoids mixtures against grain contaminating fungi. Medical Faculty, Landbouw Universiteit Gent, 59(3a): 1107-1022. 491. Weir, T.L., Park, S., Vivanco, J.M. (2004). Biochemical and physiological mechanisms mediated by allelochemicals. Plant biology, 7: 472- 479. 492. Weitbrecht, K., Müller, K., Leubner-Metzger, K. (2011). First off the mark: early seed germination. Journal of Experimental Botany, 62(10): 3289- 3309. 493. Welinder, K.G., Gajhede, M. (1992). Structure and evolution of peroxidase. In: Plant peroxidases. Biochemistry and physiology (Welinder, K.G., Rasmussen, S.K., Penel, C., Greppin, H. Eds.), Rochat-Baumann, Inprimerie Nationale, Geneva, pp. 35-42. 494. Wells, J.M., Butterfield, J.E. (1997). Salmonella contamination associated with bacterial soft rot of fresh fruits and vegetables in the marketplace. Plant Disease, 81(8): 867-872. 215 495. Weston, L.A. (1996). Utilization of allelopathy for weed management in agroecosystems. Agronomy Journal, 88(6): 860-866. 496. Weston, L.A., Duke, S.O. (2003) Weed and crop allelopathy. Critical Reviews Plant Science, 22: 367-389. 497. Whitaker, J.R. (1996). Polyphenol oxidase. In: Food Chemistry, (Fennema, O.R. Ed.). Marcel Dekker, New York. pp. 492-494. 498. Wichi, H.C. (1986). Safety evaluation of butylated hydroxytoluene (BHT) in the liver, lung and gastrointestinal tract. Food and Chemical Toxicology, 24: 1127-1130. 499. Wiseman, H., Halliwell, B. (1996). Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. Biochemical Journal, 313: 17-29. 500. Wojtyla, L., Garnczarska, M., Zalewski, T., Bednarski, W., Ratajczak, L., Jurga, S. (2006). A comparative study of water distribution, free radical production and activation of antioxidative metabolism in germinating pea seeds. Journal of Plant Physiology, 163: 1207-1220. 501. Woodbury, W., Spencer, A.K., Stahman, M.A. (1971). An improved procedure using ferricyanide for detecting catalase isozymes. Analytical Biochemistry, 44(1):301-305. 502. Woodstock, LW. (1988). Seed imbibition: a critical period for successful germination. Journal of Seed Technology, 12: 1-15. 503. Wright, J.S., Johnson, E.R., DiLabio, G.A. (2001). Predicting the activity of phenolic antioxidants: Theoretical method, analysis of substituent effects, and application to major families of antioxidants. Journal of the American Chemical Society, 123(6): 1173-1183. 504. Wu, H., Pratley, J., Lemerle, D., Haig, T. (1999). Crop cultivars with allelopathic capability. Weed Research, 39: 171-180. 505. Wyk, B.E.V., Wink, M (2004). Medicinal plants of the world. Pretoria, Briza. 216 506. Xi, D.M., Liu, W.S., Yang, G.D., Wu, C.A., Zheng, C.C. (2010). Seed- specific overexpression of antioxidant genes in Arabidopsis enhances oxidative stress tolerance during germination and early seedling growth. Plant Biotechnology Journal, 8: 796-806. 507. Xu, S., Li, J.L., Zhang, X.Q., Wei, H., Cui, L.J. (2006). Effects of heat acclimation pretreatment on changes of membrane lipid peroxidation, antioxidant metabolites, and ultrastructure of chloroplasts in two cool-season turf grass species under heat stress. Environmenal and Experimental Botany, 56: 274-285. 508. Xuan, T.D., Shinkichi, T., Khanh, T.D., Min, C.I. (2005). Biological control of weeds and plant pathogens in paddy rice by exploiting plant allelopathy: an overview. Crop Protection, 24: 197-206. 509. Yang, F., Basu, T.K., Oraikul, B. (2001). Studies on germination conditions and antioxidant contents of wheat grain. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 52: 319-330. 510. Yang, R., Shetty, K., (1998). Stimulation of rosmarinic acid in shoot cultures of oregano (Origanum vulgare) clonal line in response to proline, proline analogue, and proline precursor. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 46(7): 2888-2893. 511. Yang, Y.S, Futsuhara, Y. (1991). Inhibitory effects of volatile compounds released from rice callus on soybean callus growth: allelopathic evidence observed using in vitro cultures. Plant Science, 77(1): 103-110. 512. Yazici, S.O., Özmen, I., Celkoglu, U., Öluzcel, H., Genc, H. (2012). In vitro antioxidant activities of extracts from some Nepeta species. International Journal of Health &Nutrition, 3(1): 8-12. 513. Yu, F., Utsumi, R. (2009). Diversity, regulation, and genetic manipulation of plant mono- and sesquiterpenoid biosynthesis. Cellular and Molecular Life Sciences 66: 3049-3052. 514. Zamfirache, M.M., Burzo, I., Padurariu, C., Boz, I., Andro, A.R., Badea, L.M., Oltanu, Z., Lamban, C., Truta E. (2010). Studies regarding the chemical composition of volatile oils from some spontaneous and cultivated Lamiaceae species. Biologie vegetală, 56: 43-49. 217 515. Zenasni, L., Bouidida, H., Hancali, A., Boudhane, A., Abdelkader, H.A., Idrissi, I., Aouad, R., Bakri, Y., Benjouad, A. (2008). The essentials oils and antimicrobial activity of four Nepeta species from Morocco. Journal of Medicinal Plants Research, 2(5): 111-114. 516. Zhang, J., Kirkham, M.B. (1994). Drought stress induced changes in activities of superoxide dismutase, catalase, and peroxidase in wheat species. Plant & Cell Physiology, 35(5): 785-791. 517. Zunino, M.P., Zygadlo, J.A. (2004). Effect of monoterpenes on lipid oxidation in maize. Planta, 219: 303-309. 518. Zuzarte, M.R., Dinis, A.M., Cavaleiro, C., Salgueirob, L.R., Canhoto, J.M. (2010). Trichomes, essential oils and in vitro propagation of Lavandula pedunculata (Lamiaceae). Industrial Crops and Products, 32: 580-587. 519. Zwenger, S. Basu, C. (2008). Plant terpenoids: applications and future potentials. Biotechnology and Molecular Biology Reviews, 3(1): 1-7. 218 BIOGRAFIJA AUTORA Jasmina M. Nestorović Ţivković roĊena je 24. marta 1981. godine u Beogradu. Osnovnu školu završila je u Novim Banovcima, a srednju školu u Beogradu. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu upisala je školske 2000/2001. godine na studijskoj grupi Biologija. Fakultet je završila 2006. godine sa proseĉnom ocenom 8,78. Doktorske studije na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu u okviru studijskog programa Eksperimentalna i primenjena botanika upisala je školske 2006/2007. godine. Od februara 2007. godine zaposlena je kao istraţivaĉ pripravnik na Instituti za biološka istraţivanja „Siniša Stanković―. U zvanje istraţivaĉ saradnik izabrana je februara 2010. godine. Trenutno je Jasmina M. Nestorović Ţivković angaţovana na dva nacionalna projekta Ministarstva prosvete i nauke republike Srbije „Fiziološka, hemijska i molekularna analiza diverziteta retkih i ugroţenih biljnih vrsta u cilju ex situ zaštite i produkcije biološki aktivnih jedinjenja― (ON173024) kao i na projektu „Primena niskotemperaturnih plazmi u biomedicini, zaštiti ĉovekove okoline i nanotehnologijama― (III41011). U prethodnom periodu Jasmina M. Nestorović Ţivković je bila angaţovana na dva nacionalna projekta: „Svetlosna i hormonalna kontrola rastenja i razvića biljaka, razmnoţavanje in vitro i ex situ zaštita retkih i ugroţenih vrsta― br. 143031B (2006-2010) i „Primena plazma igle u medicinskim i biološkim istraţivanjima i brza i pouzdana detekcija volatilnih supstanci humanog i biljnog porekla―, br. TP-23016A (2009-2010). U predhodnom periodu Jasmina M. Nestorović Ţivković je bila angaţovana i na jednom meĊunarodnom projektu „Plant Terpenoids for Human Health: a chemical and genomic approach to identify and produce bioactive compounds― (Grant Agreement No. 227448) FP7. Dobitnik je nagrade za najbolji poster na meĊunarodnom simpozijumu „New Research in Biotechnology―, 2009. Jasmina M. Nestorović Ţivković je ĉlan Društva za fiziologiju biljaka Srbije i Evropskog društva za biljnu biologiju (FESPB).