Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet Ana M. Vuletić Funkcionalne i imunofenotipske karakteristike NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma i njihova in vitro aktivacija IL-2 i IL-15 Doktorska disertacija Beograd, 2013. University of Belgrade Faculty of biology Ana M. Vuletić Functional and immunophenotypic characteristics of NK cells from regional lymph nodes of melanoma patients and their in vitro activation with IL-2 and IL-15 Doctoral dissertation Belgrade, 2013. Podaci o mentorima i članovima komisije Mentori: prof dr Gordana Matić redovni profesor, Biološki fakultet, Univerzitet u Beograd naučni savetnik, Institut za biološka istraživanja Siniša Stanković prof dr Gordana Konjević naučni savetnik, Institut za onkologiju i radiologiju Srbije, vanredni profesor, Medicinski fakultet, Univerzitet u Beogradu Članovi: dr Nikola Tanić naučni savetnik, Institut za biološka istraživanja Siniša Stanković prof dr Milena Kataranovski redovni profesor, Biološki fakultet, Univerzitet u Beograd naučni savetnik, Institut za biološka istraživanja Siniša Stanković Datum odbrane: _________________ Zahvalnica Ovaj doktorski rad je urađen u Laboratoriji za imunologiju na Odeljenju za eksperimentalnu onkologiju Instituta za onkologiju i radiologiju Srbije, pod neposrednim rukovodstvom prof dr Gordane Konjević. Ovaj rad je realizovan u okviru projekata Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja broj 145056 „Izučavanje regulatornih mehanizama vezanih za imunomodulaciju u malignim bolestima“ kojim je rukovodila prof dr Gordana Konjević i broj 4103 „Identifikacija molekulskih markera za predikciju, progresiju tumora, odgovora na terapiju i ishoda bolesti“ kojim rukovodi n sav dr Nikola Tanić. Želim da se zahvalim svom mentoru prof dr Gordani Konjević na svemu što me je naučila tokom ovih godina rada u Laboratoriji za imunologiju. Prof Gordani Matić, mentoru ove doktorske teze zahvaljujem se na sugestijama tokom pisanja ovog rada. Zahvaljujem se i članovima Komisije: Dr Nikoli Taniću, na pomoći tokom završne faze eksperimentalnog rada, a prof dr Mileni Katarnovski na veoma korisnim ispravkama teksta ove doktorske teze. Koleginici iz moje laboratorije dr Katrini Mirjačić Martinović zahvaljujem se na pruženoj podršci i ohrabrenju, kao i na korisnim savetima tokom pisanja tesksta. Mojim kolegama iz sobe: dr sci Emini Mališić i dr sci Milanu Markićeviću zahvaljujem se na podršci i strpljenju, a dr sci Željku Žižku pored toga i na pomoći u izradi ilustracija. Dr Sandri Radenković zahvaljujem se na mnogbrojnim prijateljskim savetima i podršci. Zahvaljujem se Jasni Popovoć Basić, laboratorijskom tehničaru koja mi je tokom ovih godina bila nezamenljiva pomoć i oslonac u laboratorijskom radu. I naravno hvala Pavlu, Mileni, Vladimiru i mojim roditeljima na neizmernoj podršci i strpljenju. Funkcionalne i imunofenotipske karakteristike NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma i njihova in vitro aktivacija IL-2 i IL-15 Sažetak Uvod: Melanom, maligni tumor melanocita, iako ima brojna imunogenična svojstva, predstavlja tumor kože sa najvišom incidencom smrtnosti. Za anititumorsku imunost u melanomu posebno su značajne ćelije prirodne ubice (NK ćelije), efektorske ćelije sistema urođene imunosti koje mogu neposredno da prepoznaju maligno transformisane ćelije i da ih liziraju citolitičkim enzimima (perforin i granzimi) kao i da produkcijom citokina i hemokina regulišu adaptivnu i urođenu amtitumorsku imunost. NK ćelije su prisutne u mnogim tkivima i organima. Kod melanoma su uglavnom proučavane NK ćelije u perifernj krvi i u tumorskom tkivu, dok NK ćelije regionalnih limfnih čvorova (LČ) obolelih nisu do sada ispitivane. NK ćelije su CD3-CD56+ i obuhvataju dve funkcionalno različite subpopulacije, imunoregulatornu, CD3-CD56sjajno+ i citotoksičnu, CD3-CD56potmulo+. Funkcija NK ćelija je regulisna balansom signala koji potiču od aktivacionih i inhibitornih NK- ćelijskih receptora. Aktivacioni receptori prepoznaju stresogene ligande na tumorskim ćelijama, dok inhibitorni ubilački receptori slični imunoglobulinima (engl. Immunoglobulin-like Killer Receptors, KIR) vezivanjem za MHC molekule klase I inhibiraju NK ćelijsku funkciju i pored toga omogućavaju toleranciju NK ćelija na ćelije sopstvenog organizma. NK ćelije su prisutne u T ćelijskoj zoni LČ, gde se odvija njihovo sazrevanje i diferencijacija. U fiziološkim uslovima u LČ perifernom cirkulacijom dospeva uglavnom nezrela (CD3-CD56sjajno+) NK ćelijska subpopulacija koja čini veći deo NK ćelijske populacije u mirujućim limfnim čvorovima. Pod uticajem endogenih citokina u LČ ova subpopulacija sazreva u citotoksičnu CD3-CD56potmulo+ perforin+CD16+KIR+ subpopulaciju koja zatim napušta LČ. U patološkim stanjima dolazi do povećane zastupljenosti CD16+KIR+ NK ćelija u reaktivnim LČ što može biti posledica povećane produkcije citokina urođene imunosti od strane dendritičnih ćelija, kao i Th1 citokina od strane stimulisanih T ćelija antigenima u LČ, kao i selektivne migracije CD16+KIR+ NK ćelija u LČ. Među citokinima γc familije, interleukini IL-2 i IL-15 su posebno značajni za diferencijaciju i sazrevanje NK ćelija, a takođe su pokazali i najizraženiji stimulativni efekat na citotoksičnu aktivnost NK ćelija. Ciljevi rada: S obzirom na to da regionalni LČ predstavljaju prvu barijeru u limfogenom širenju tumora kao i na značaj uticaja mikrosredine na funkciju i fenotip NK ćelija, cilj ovog rada bio je da se uporede funkcionalne i imunofenotipske karakteristike CD3-CD56+ NK ćelija u tumor-infiltrisanim (infiltirsanim) i neinfiltrisanim regionalnim LČ bolesnika sa melanomom. S obzirom na to da je melanom imunogeničan tumor koji je slabo osetljiv na zračnu i na hemioterapiju, cilj ovog rada bio je da se ispita sposobnost IL-2, citokina koji se već više od dve decenije primenjuje u lečenju metastatskog melanoma i citokina novije generacije IL-15, koji je neophodan za razvoj i sazrevanje NK ćelija, da indukuju ciototoksičnu aktivnost NK ćelija ispitivanih regionalnih LČ. Materijal i metode: Uzorci tkiva regionalnih LČ 45 bolesnika sa melanomom kože u kliničkim stadijumima bolesti II-IV uzeti su neposredno nakon hirurške intervencije. Iz uzetih uzoraka tkiva LČ izolovane su mononukleane ćelije (MNĆ). Citotoksična aktivnost NK ćelija određivana je u odnosu na NK-osetljivu K562 tumorsku ćelijsku liniju radioaktivnim 51Cr testom iz sveže izolovanih MNĆ kao i nakon 72 h i 7 dana in vitro tretmana medijumom za ćelijsku kulturu, medijumom sa IL-2 (200 IU/ml) i medijumom sa IL-15 (25 ng/ml) na 37ºC u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2. Metodom protočne citometrije određivani su: produkcija IFNγ u CD3- CD56+ NK ćelijama, procenat CD3-CD56+ NK ćelija, CD3-CD56potmulo+ i CD3- CD56sjajno+ subpopulacija, kao i ekspresija aktivacionih (NKG2D, CD16), inhibitornih KIR (CD158a, CD158b) receptora kao i aktivacionih antigena (CD25, CD69, HLA-DR) na CD3-CD56+ NK ćelijama i njihovim subpopulacijama. RT- PCR metodom nakon 72 h in vitro tretmana ovim citokinima je praćena transkripcija gena za perforin, a Western blot metodom ekspresija perforina, pSTAT1, pSTAT5 i Bcl-2 molekula. Za poređenja ispitivanih parametra infiltrisanih u odnosu na neinfiltrisane LČ korišćen je statistički Mann Whitney test, a značajnost promena nakon tretmana citokinima je utvrđivana Wilcoxon testom sume rangova. U statističkoj analizi korelacione povezanosti korišćen je Spearman test. Rezultati: U neinfiltrisanim i i infiltrisanim regionalnim LČ bolesnika sa melanomom dobijena je slična niska citotoksična funkcija NK ćelija. Produkcija IFNγ kao drugog merila funkcionalnosti NK ćelija, snižena u ukupnoj populaciji CD3-CD56+ NK ćelija samo u tumor-infiltrisanim LČ što može biti posledica prisustva imunosupresivnih citokina i drugih biološki aktivnih molekula koji kod ovih bolesnika mogu biti kako lokalnog, tako i sistemskog porekla. U infiltrisanim LČ nađena je veća zastupljenost CD3-CD56+ NK ćelija usled povećanja zastupljenosti CD3-CD56potmulo+ subpopulacije. Ovaj rezutat zajedno sa povećanjem zastupljenosti CD16+ i CD158b+ CD3-CD56+ NK ćelija u infiltrisanim LČ ukazuje na zreliji fenotip NK ćelija usled ulaska tumora u LČ. Nađena povećana ekspresija CD69 antigena na CD3-CD56+ NK ćelijama u infiltisanim LČ ukazuje na aktivaciju ove populacije sa invazijom tumora u LČ, pri čemu ekspresija NKG2D citotoksičnog receptora ostaje nepromenjena. Ove razlike u imunofenotipskim parametrima usled infiltrisanosti LČ tumorskim ćelijama su više ispoljene kada je zahvaćen veći broj LČ kao i kada je stepen invazije primarnog tumora u kožu veći. Nakon in vitro tretmana citokinima pokazano je da za razliku od tretmana interleukinom IL-15, tretman interleukinom IL-2 dovodi do porasta ukupne populacije CD3-CD56+ NK ćelija uvećanjem CD3-CD56sjajno+ subpopulacije u neinfiltrisanim i u infiltrisanim regionalnim LČ bolesnika sa melanomom. In vitro tretmani interleukinima IL-2 i IL-15 višestruko povećavaju nisku citotoksičnost NK ćelija, kao i transkripciju i sintezu perforina u obe grupe regionalnih LČ. Ova dva citokina na CD3-CD56+ NK ćelijama obe grupe regionalnih LČ povećavaju ekspresiju ranog aktivacionog antigena CD69, citotoksičnog NKG2D receptora, a povećanjem ekspresije CD16 i CD158b inhibitornog KIR-a doprinose njihovom zrelijem fenotipu. Uočeni efekti ispitivanih citokina praćeni su povećanjem nivoa fosforilisanog STAT5 signalnog molekula. Zaključak: U ovom radu opisani su funkcija i fenotip do sada neispitivane populacije NK ćelija regionalnih LČ bolesnika sa melanomom. Dobijeni rezultati ukazuju na to da metastiziranje melanoma u regionalne LČ nije dovelo do promene citotoksične funkcije prisutnih NK ćelija, već do povećane zastupljenosti CD3- CD56+ NK ćelija zrelijeg CD16+CD158b+ fenotipa. In vitro tretmanima sa IL-2, citokinom koji se primenjuje u terapiji ovog tumora i sa IL-15, citokinom čija se terapijska primena još uvek ispituje, postignuto je višestruko povećanje citotoksične aktivnosti NK ćelija regionalnih LČ bolesnika sa melanomom koje može da ukaže na potencijalni značaj ove populacije NK ćelija u novijim terapijskim pristupima kao što je adoptivni tarnsfer NK ćelija kod bolesnika sa melanomom. Ključne reči: NK ćelije, limfni čvorovi, melanom, citotoksičnost, perforin, NKG2D, CD16, KIR, IL-2, IL-15 UDK broj: 616-006-076.5-097 Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Imunologija tumora Maligni tumori NK ćelije Imunološki parametri Functional and immunophenotypic characteristics of NK cells from regional lymph nodes of melanoma patients and their in vitro activation with IL-2 and IL-15 SUMMARY Introduction: Melanoma, malignant neoplasm of melanocytes, despite of its immunogenicity is skin cancer with the highest mortality rate. In antitumor immunity im melanoma, natural killer (NK) cells as innate immune system effector cells play an important role as they are able to recognize malignantly transformed cells, lyse them by cytolitic enzymes (perforin and gramzymes) and also regulate adaptive and innate antitumor immunity by production of cytokines and chemokines. NK cells are present in many tissues and organs. In melanoma NK cells have been studied mostly in peripheral blood and in tumor tissue, while NK cells in regional lymph nodes (LN)s have not been investigated. NK cells are CD3-CD56+ and comprise two functionally distinct subsets, immunoregulatory, CD3-CD56bright+ and cytotoxic, CD3-CD56dim+. NK cell function is regulated by the balance of signals mediated by activating and inhibitory NK cell receptors. Activating receptors recognize stress induced ligands on tumor cells, while the inhibitory immunoglobulin-like killer receptors (KIR) by binding to MHC class I molecules inhibit NK cell function and enable self tolerance. NK cells are located mostly in T cell zone of LNs, where NK cell differentiation and maturation may occur. In physiological conditions, by peripheral circulation mostly immature CD3-CD56bright+ NK cell subset migrates to LNs and represents the majority of NK cell population in resting LNs. Endogenous cytokines in LN mediate maturation of this subset into cytotoxic CD3-CD56dim+ perforin+CD16+KIR+ subset that subsequently leaves LN. In pathological conditions, increase in CD16+KIR+ NK cell population in reactive LNs may be the consequence of increased production of innate immunity cytokines by dendritic cells, as well as Th1 cytokine production by antigen stimulated T cells in LNs, or selective migration of CD16+KIR+ NK cells into LNs. Among γc cytokines, IL-2 and IL-15 are most important for NK cell differentiation and maturation, and are also the most potent stimulators of NK cell cytotoxic activity. Objectives: As regional LNs represent first barrier to lymphogenic tumor invasion and considering the importance of microenvironment in shaping NK cell function and phenotype, the aim of this study was to compare functional and immunophenotypic characteristics of CD3-CD56+ NK cells from tumor-infiltrated (infiltrated) and not infiltrated regional LNs of melanoma patients. Since melanoma is an immunogenic tumor insensitive to irradiation and chemotherapy, the aim of this study was to investigate the ability of IL-2, cytokine that has been used more than two decades in metastatic melanoma treatment and IL-15, cytokine of novel generation which is essential for NK cell differentiation and maturation, to induce cytotoxic activity of NK cells from investigated regional LNs. Material and methods: Tissue samples of regional LNs were obtained from 45 melanoma patients in clinical stages II-IV immediately after surgical intervention. Mononuclear cells (MNC) were isolated from obtained LN samples. NK cell cytotoxic activity was evaluated against NK-cell sensitive K562 tumor cell line using radioactive 51Cr test on freshly isolated MNC as well as after 72 h and 7 day in vitro treatments in cell culture medium alone, medium supplemented with IL-2 (200 IU/ml) and with IL-15 (25 ng/ml) on 37ºC in humid atmosphere with 5% CO2. Flow cytometry method was used for evaluation of: IFNγ production in CD3- CD56+ NK cells, percentage of CD3-CD56+ NK cells, CD3-CD56dim+ and CD3- CD56bright+ NK cell subsets, as well as the expression of activating receptors (NKG2D, CD16), inhibitory KIRs (CD158a, CD158b) and activation antigens (CD25, CD69, HLA-DR) on CD3-CD56+ NK cells and their two subsets. After 72 h in vitro cytokine treatments perforin transcription was estimated by RT-PCR, while perforin, pSTAT1, pSTAT5 and Bcl-2 expression was estimated by Western blot. The investigated parameters between infiltrated and not infiltrated regional LNs were compared by statistical Mann Whitney test, while the significance of differences after cytokine in vitro treatments was evaluated by Wilcoxon rank sum test. For correlation analysis Spearman's correlation coefficient was evaluated. Results: In both not infiltrated and tumor- infiltrated regional LNs of melanoma patients were shown similar low levels of NK cell cytotoxic activity. Production of IFNγ, as another aspect of NK cell function, in entire CD3-CD56+ NK cell population was lower only in tumor-infiltrated LNs which could be influenced by immunosupresive cytokines and other biologically active molecules that might be of local or systemic origin. Tumor-infiltrated LNs also show higher percentage of CD3-CD56+ NK cells due to the increased presence of CD3-CD56dim+ subpopulation. This finding, together with increased percentage of CD16+ and CD158b+ CD3-CD56+ NK cells in tumor-infiltrated LNs, indicates more mature NK cell phenotype in LNs invaded by tumor cells. Furthermore, CD3-CD56+ NK cells in infiltrated LNs show increased expression of CD69 antigen which may indicate NK cell activation alongside with tumor invasion into LNs, while the expression of NKG2D cytototoxic receptor remained similar. The obtained differences in immunophenotypic parameters caused by tumor infiltration of LN are more apparent when more regional LNs are involved as well as if the degree of primary tumor invasion into skin was higher. After cytokine in vitro treatments it was shown that unlike IL-15, IL-2 treatment increased the percentage of CD3-CD56+ NK cell population by increasing CD3-CD56bright+ subset in both not infiltrated and tumor-infiltrated regional LNs of melanoma patients. Both IL-2 and IL-15 in vitro treatments increased low NK cell cytotoxicity, as well as perforin transcription and synthesis in both groups of regional LNs. These two cytokines on CD3-CD56+ NK cells in both regional LN groups increased the expression of early activating antigen CD69, cytotoxic NKG2D receptor, and also by increasing the expression of CD16 receptor and CD158b inhibitory KIR contributed to more mature NK cell phenotype. The effects of investigated cytokines are followed by increased level of phosphorylated STAT5 signaling molecule. Conclusion: In this study were analyzed the function and immunophenotype of NK cell population from regional LNs of malanoma patients which have not been investigated before. The obtained results indicate that metastatic invasion of melanoma into regional LNs did not alter cytotoxic function of resident NK cells, while it increased the percentage of CD3-CD56+ NK cells of more mature CD16+CD158b+ phenotype. In vitro treatments with IL-2, cytokine that has been used in melanoma treatment and IL-15, cytokine that is still under investigation for its therapeutic application, strongly induced the increase in NK cell cytotoxic activity which may indicate the therapeutic potential of this NK cell population in novel approaches such as adoptive NK cell transfer in melanoma patients. Key words: NK cell, lymph nodes, melanoma, cytotoxicity, perforin, NKG2D, CD16, KIR, IL-2, IL-15 Spisak skraćenica ADCC- citotoksičnost zavisna od antitela ATM- ataxia telangiektazia mutirana kinaza CMV- citomegalovirus DNK- dezoksiribonukleinska kiselina EBV- Epstin- Bar virus EGFR- receptor za epidermalni faktor rasta FITC- fluorescein izotiocijanat GM-CSF- granuloctno moncitni faktor rasta HSP- heparin sulfat proteoglikani ICAM-1- interćelijski adhezioni molekul-1 IFN- interferon Ig- imunoglobulini IL- interleukin IL-15R- interleukin-15 receptor IL-2R- interleukin- 2 receptor JAK- Janus tirozin kinaza KIR- ubilački receptori slični imunoglobulinima LAK- limfokinima aktivirane ćelije ubice LFA-1- limfoctini funkcionalni antigen-1 MAPK- mitogenom aktivirana protein kinaza MDSC mijeloidne supresivne ćelije MEK- mitogenom aktivirana kinaza protein kanaze MMP-matriks metaloproteinaza MNĆ- mononuklearne ćelije NCR- prirodni citotoksični receptori NK ćelije- ćelije prirodne ubice NKG2DL- ligand NKG2D receptora NSCLC- nesitnoćelisjki karcinom pluća PCR- polimerazna lančana reakcija PE- fikoeritrin PerCP- peridinin hlorofil protein PGE2- prostaglandin E2 PI3K- fosfatidil inozitol 3 kinaza PIP3- fosfatidil inozitol-3,4,5-trifosfat PMA- forbol-12-miristat-13-acetat RNK- ribonukleinska kiselina ROS- reaktivne kiseonične vrste RT-PCR- reakcija reverzne transkripcije pri polimeraznoj lančanoj reakciji SCF- faktor rasta matičnih ćelija STAT- aktivator signalne transdukcije i transkripcije TAM- tumor asocirani makrofagi TCR- T ćelijski receptor TGF-β- transformišući faktor rasta- β TIL- tumor infiltrišući limfociti TNF-α- faktor nekroze tumora-α Treg- regulatorne T ćelije VEGF- vaskularni endotelni faktor rasta Sadržaj 1 Uvod ...................................................................................................................................... 1 1.1 NK ćelije i njihove subpopulacije ................................................................................. 1 1.2 Razvoj NK ćelija ........................................................................................................... 3 1.3 Limfni čvorovi .............................................................................................................. 6 1.4 NK ćelijski receptori ................................................................................................... 12 1.4.1 Aktivacioni receptori ........................................................................................... 12 1.4.2 Inhibitorni receptori ............................................................................................. 18 1.5 Efektorske funkcije NK ćelija ..................................................................................... 23 1.6 Citokini značajni za razvoj i funkciju NK ćelija ......................................................... 28 1.6.1 Citokini γc familije .............................................................................................. 28 1.6.2 Imunosupresivni citokini ..................................................................................... 38 1.7 Melanom ..................................................................................................................... 39 1.7.1 Melanom i imunski odgovor ............................................................................... 41 1.7.2 Terapija melanoma .............................................................................................. 45 2 Ciljevi rada .......................................................................................................................... 50 3 Materijal i metode ............................................................................................................... 52 3.1 Pacijenti i klasifikacija ................................................................................................ 52 3.2 Izolocija mononuklearnh ćelija iz regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma 52 3.3 Određivanje citotoksične aktivnosti NK ćelija ............................................................ 53 3.4 Određivanje intraćelijskog IFNγ u CD3-CD56+ NK ćelijama ..................................... 54 3.5 Protočna citometrija .................................................................................................... 55 3.6 Westen blot .................................................................................................................. 56 3.7 Izolacija RNK .............................................................................................................. 59 3.8 RT-PCR ....................................................................................................................... 60 3.9 Statističke analize ........................................................................................................ 61 4 Rezultati .............................................................................................................................. 62 4.1 Funkcionalne karakteristike NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma ................................................................................................................................ 62 4.2 Zastupljenost NK ćelija i njihovih CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacija u regionalnim limfnim čvorovima obolelih od melanomoma ................................................... 63 4.3 Produkcija IFNγ u CD3-CD56potmulo+i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanomoma ......................................................... 64 1 4.4 Imunofenotipske karakteristike CD3-CD56+ NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma ............................................................................................................. 64 4.5 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na citotksičnu funkciju i imunofenotip NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma ...................................................... 73 4.5.1 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na citotoksičnu funkciju NK ćelija ....... 73 4.5.2 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na transkripciju perforina ..................... 75 4.5.3 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na sintezu perforina .............................. 75 4.5.4 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na zastupljenost NK ćelija i njihovih CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacija .............................................................. 77 4.5.5 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama regionalnih limfnih čvorova ........................................................................... 78 4.5.6 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na zastupljenost receptora u CD3- CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija ................................................. 83 4.6 Poređenje efekta interliukina IL-2 i IL-15 na citotoksičnu aktivnost NK ćelija neinifiltrisanih i tumor-infiltrisanih limfnih čvorova .............................................................. 87 4.7 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju STAT1 i STAT5 signalnih molekula .................................................................................................................................. 89 4.8 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju Bcl-2 molekula ....................... 90 5 Diskusija .............................................................................................................................. 92 6 Zaključci ............................................................................................................................ 115 7 Literatura ........................................................................................................................... 117 1 1 Uvod 1.1 NK ćelije i njihove subpopulacije Ćelije prirodne ubice, NK ćelije (engleski „natural killer cells“) su subpopulacija ćelija sistema urođene imunosti čija je osnovna uloga da eliminišu kako virusima i intracelularnim bakterijama inficirane tako i maligno transformisane ćelije (Robertson i Ritz, 1990). Prvi put su opisane 1975. godine (Herberman et al.,1975; Kiessling et al., 1975). Na osnovu svoje morfologije, mnogobrojnih limfoidnih antigena koje ispoljavaju i porekla koje vode od zajedničkih limfoidnih progenitorskih ćelija u kostnoj srži, NK ćelije se svrstavaju u populaciju limfocita. Morfološki, većina NK ćelija su veliki granulirani limfociti sa bubrežastim jedrom i obilnom citoplazmom u kojoj se nalaze granule ispunjene citolitičkim enzimima perforinom i granzimima. NK ćelije mogu neposredno da prepoznaju izmenjene ćelije i da brzo na njih bez prethodne stimulacije deluju citotoksično po čemu su i dobile ime- prirodne ubice (Robertson i Ritz, 1990). Pored citotoksične, NK ćelije imaju i imunoregulatornu ulogu i sintetišu brojne citokine i hemokine i tako utiču na adaptivnu i na urođenu imunost (Vivier et al., 2011). NK ćelije mogu da posredstvom svojih aktivacionih receptora, neposredno prepoznaju stresogene ligande na maligno transformisanim kao i na ćelijama koje su inficirane virusima, što dovodi do aktivacije NK ćelijske citotoksičnosti. Pored toga, svojim inhibitornim receptorima NK ćelije mogu da prepoznaju molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I (MHC molekule klase I) koji inhibiraju NK ćelijsku citotoksičnost. Prema hipotezi “missing self” koju su postavili Karre i saradnici još 1986. godine (Karre et al., 1986), ustanovljeno je da NK ćelije prepoznaju sopstvene MHC molekule klase I i da vezivanje za njih dovodi do inhibicije aktivnosti NK ćelija. Na taj način, NK ćelije liziraju samo one ćelije koje ne ispoljavaju ili slabije ispoljavaju MHC molekule klase I, a sopstvene ćelije u organizmu su zaštićene od lize NK ćelijama. Molekularna osnova ove pojave potvrđena je devedesetih godina identifikacijom grupe ubilačkih receptora sličnih imunoglobulinima, KIR (engl. Immunoglobulin-like Killer Receptors) koji se vezuju za MHC molekule klase I 2 (Colonna i Samaridis 1995; Yokoyama, 1995; Moretta et al., 1995) i inhibiraju citotoksičnu funkciju NK ćelija. NK ćelije se odlikuju prisustvom CD56 antigena, neuralnog adhezionog molekula koji ima ulogu u uspostavljanju veze između NK i ciljnih ćelija, (Cooper et al., 2001). S obzirom da je pokazano njegovo prisustvo i na subpopulacijama dendritičnih ćelija koje imaju citotoksični potencijal, u novije vreme CD56 antigenu se pripisuje uloga u citotoksičnoj funkciji mada njegova uloga u tom procesu nije do sada u potpunosti definisana (Roothans et al., 2013). Za razliku od T limfocita NK ćelije nemaju CD3 molekul, te se mogu fenotipski odrediti kao CD3-CD56+. Na osnovu gustine CD56 antigena NK ćelije se mogu podeliti na dve subpopulacije koje se razlikuju po svojim funkcionalnim karakteristikama: citotoksičnu, CD3-CD56potmulo+ subpopulaciju, sa nižom gustinom CD56 antigena i imunoregulatornu, CD3-CD56sjajno+ subpopulaciju, sa većom gustinom CD56 antigena koja sintetiše citokine, a slabo je citotoksična (Cooper et al., 2001). CD3-CD56sjajno+ subpopulacija se odlikuje brojnim granulama ispunjenim proteolitičkim enzimima pomoću kojih mogu brzo delovati citotoksično prema izmenjenoj ciljnoj ćeliji, kao i visokim nivoom ekspresije CD16 aktivacionog receptora. Imunoregulatorna CD3- CD56sjajno+ subpopulacija se smatra nezrelijom i odlikuje se smanjenom citotoksičnošću i nižom ekspresijom CD16 receptora. U početku je imunoregulatorna funkcija pripisivana isključivo CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija, da bi novija istraživanja De Maria i saradnika 2011. Godine (De Maria et al., 2011) pokazala da se i u dominantno citotoksičnoj, CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija, ubrzo nakon kontakta sa izmenjenom ćelijom indukuje sinteza IFNγ koji se brzo izlučuje i nije ga moguće detektovati pri kasnijim praćenjima. Prema najnovijem linearnom modelu diferencijacije NK ćelija, slabo citotoksična CD3-CD56sjajno+ , a nezrelija subpopulacija može se pod određenim uslovima diferencirati u zreliju CD3-CD56potmulo+ subpopulaciju NK ćelija (Freud et al., 2006; Mujaj et al., 2011; Eissens et al., 2012). NK ćelije su osim u perifernoj krvi prisutne u mnogim drugim organima: koži, organima limfnim organima, mukozi creva, jetri, uterusu, plućima... Poznato je da su u limfocitnoj populaciji NK ćelije najzastupljenije u perifernoj krvi (10-20%) i slezini (5- 15%), a manje u limfnim čvorovima (0.5-7%) i krajnicima (manje od 0.4%) (Ferlazzo et 3 al., 2004). S obzirom na to da limfni čvorovi sadrže 40% svih limfocita, a periferna krv svega 2%, NK ćelije u ovim sekundarnim limfoidnim organima predstavljaju većinu NK ćelija u ljudskom oraganizmu. U perifernoj krvi čoveka zastupljenija je CD3- CD56potmulo+ subpopulacija koja čini oko 95% ukupnih NK ćelija, dok u limfnim čvorovima dominira imunoregulatorna CD3-CD56sjajno+ subpopulacija NK ćelija. Osim u krvi i sekundarnih limfnih organa, specifične subpopulacije NK ćelija su prisutne i u drugim organima poput jetre, creva, materice, pluća i drugih (Cooper et al., 2009). 1.2 Razvoj NK ćelija Proces razvoja NK ćelija je regulisan urođenim signalima kao i brojnim spoljnim i unutrašnjim stimulusima koji mogu delovati aktivirajuće i inhibitorno. Kod ljudi, razvojni put NK ćelija počinje od hematopoetske progenitorske ćelije zajedničke za limfoidnu lozu, a koja je po svom fenotipu CD34+Lin-CD10+ (Di Santo, 2006). Prvobitno se smatralo da se razvoj NK ćelija odvija samo u kostnoj srži što je opovrgnuto kada su u sekundarnim limfnim organima identifikovane CD34+CD45RA+ hematopoetske progenitorske ćelije koje mogu da se diferenciraju u NK ćelije, T ćelije i mijeloidne dendritične ćelije (Freud et al., 2005). Ovaj stadijum razvoja NK ćelija označen je kao stadijum pro-NK ćelija i predstavlja prvi od pet stadijuma razvoja (Slika 1). Pro-NK ćelije tokom svog daljeg razvoja stiču CD117(c-Kit) receptor za faktor rasta matičnih ćelija (SCF, engl. Stem Cell Factor) i prelaze u drugi razvojni stadijum pre-NK ćelija (CD34+CD117+). U stadijumu pre-NK ćelija dolazi do pojave β subjedinice (interleukin-2) IL-2 i (interleukin-15) IL-15 receptora (IL-2/15Rβ) CD122, čime ove ćelije postaju osetljive na citokin IL-15 koji uslovljava njihov dalji razvoj i na IL-2, koji sa IL-15 ima zajednički β lanac receptora (Freud et al., 2006; Eissens et al., 2012). U trećem razvojnom stadijumu označenom kao nezrele, iNK ćelije (engl. immature) dolazi do gubitka CD34 markera nezrelosti, te ove CD34-CD117+ ćelije gube sposobnost da se diferenciraju u ćelije drugih limfoidnih loza, već se mogu diferencirati isključivo u NK ćelije. iNK ćelije pokazuju i varijabilnu ekspresiju CD94/NKG2A inhibitornog receptora čiji je ligand HLA-E (MHC molekul klase Ia), koja se u ovom stadijumu postepeno povećava da bi ovaj receptor bio prisutan na svim ćelijama u sledećem, CD56sjajno+ razvojnom stadijumu. 4 Ekspresija CD56 antigena koji predstavlja obeležje fenotipa NK ćelija počinje postepeno, od stadijuma iNK ćelija i povećava se, da bi ovaj antigen bio prisutan na CD56sjajno+ NK ćelijama. NK ćelije CD56sjajno+ stadijuma mogu da sintetišu citokine, najčešće nemaju granule sa perforinom i nisu citotoksične. Mada je ekspresija CD56 antigena obeležje svih NK ćelija, peti krajnji CD56potmulo+ stadijum razvoja NK ćelija odlikuje se nižom gustinom ekspresije CD56 antigena u odnosu na CD56sjajno+, kao i smanjenom ekspresijom inhibitornog CD94/NKG2A receptora. Najvažnija promena u ovom stadijumu razvoja koja doprinosi funkcionalnoj zrelosti NK ćelija je pojava CD16 aktivacionog receptora i KIR receptora kao i povećanje nivoa citotoksičnog medijatora perforina (Freud et al, 2005; 2006). Ekspresija gena za KIR receptore je suprimirana u manje zrelim razvojnim stadijumima (Chan et al., 2003; 2005; Cichocki et al., 2011), a KIR receptori se u procesu razvoja NK ćelija pojavljuju istovremeno sa granulama ispunjenim citotoksičnim medijatorima (perforin i granzimi). Slika 1. Pet stadijuma razvoja NK ćelija. Pro-NK ćelije migriraju iz kostne srži u sekundane limfne organe i diferenciraju se u pre-NK ćelije, koje se zatim diferenciraju u i-NK (nezrele) ćelije koje pojavom gusto raspoređenog CD56 antigena prelaze u stadijum CD56sjajno+ NK ćelija. CD56sjajno+ NK ćelije sa pojavom KIR receptora, CD16 aktivacionog receptora i granula sa perforinom postaju funcionalno zrelije citotoksične CD56potmulo+ NK ćelije. Na osnovu dužih telomera NK ćelija CD56sjajno+ subpopulacije kao i na osnovu toga što se pod određenim uslovima u cirkulaciji i u perifernim tkivima mogu diferencirati u citotoksičnu CD56potmulo+ subpopulaciju, smatra se da je CD56sjajno+ nezrelija subpopulacija NK ćelija (Romagnani et al., 2007; Chen et al., 2007). Ove dve CD34+ CD117- CD122+ CD117+ CD34+ pro-NK ćelija pre-NK ćelija i-NK ćelija CD94- CD122+ CD34- CD117+/- KIR- CD16- Perforin+- CD94/NKG2A+ KIR+ CD16+ Perforin++ CD94/NKG2A+- CD56sjajno+ CD56potmulo+ 5 subpopulacije se razlikuju ne samo po citotoksičnosti i produkciji citokina, već i po sposobnosti da proliferišu. CD56sjajno+ subpopulacija NK ćelija koja ima pretežno imunoregulatornu ulogu, nije citotoksična i bolje proliferiše u prisustvu interleukina IL- 2 (Caligiuri et al., 1990). Diferencijacija CD56sjajno+ u CD56potmulo+ NK ćelije se odvija povećanjem njihove citotoksičnosti i ekspresije CD16 i KIR receptora, a smanjenjem proliferativnog potencijala (Slika 2). Pokazano je da CD56potmulo+ NK ćelije koje ispoljavaju CD57 marker terminalne diferencijacije, slabo proliferišu i izarazito su citotoksične (Lopez-Vergès et al., 2010; Moretta, 2010). Slika 2. Model diferencijacije CD56sjajno+ u CD56potmulo+ subpopulaciju NK ćelija. Smanjenje sposobnosti proliferacije i povećanje citotoksičnosti praćeni su pojavom KIR i CD16, a smanjenjem ekspresije CD94/NKG2A receptora (Moretta, 2010). Prema novijim saznanjima prelazak iz CD56sjajno+ u CD56potmulo+ razvojni stadijum obuhvata nekoliko među-faza u kojima dolazi i do gubitka adhezionog molekula L- selektina (CD62L), koji se vezuje za sijalinske glikoproteine na ćelijama endotela krvnih sudova i omogućava ekstravazaciju ovih ćelija u tkiva i organe, a zastupljeniji je na CD56sjajno+ NK ćelijama. Na osnovu prisustva CD62L molekula identifikovana je CD56potmulo+CD62L+ subpopulacija NK ćelija (Moretta et al., 2010) koja može da sintetiše citokine i citotoksična je, pa iz tih razloga kao i zbog dužine telomera KIR- CD16- Perforin+/- CD94/NKG2A+++ KIR- CD16+- Perforin+ CD94/NKG2A++ KIR+/- CD16+ Perforin++ CD94/NKG2A+ CD57+ KIR+ CD16++ Perforin+++ CD94/NKG2A+/- CD56sjajno+ CD56potmulo+ CD56potmulo+ CD56potmulo+ proliferacija citotoksičnost 6 predstavlja intermedijarni stadijum između manje zrele CD56sjajno+ i zrele CD56potmulo+ subpopoluacije (Juelke et al., 2010; Malhotra i Shanker, 2011). 1.3 Limfni čvorovi Limfni čvorovi su periferni organi imunskog sitema koji imaju važnu ulogu u imunskom odgovoru na strane antigene. Limfni čvor se sastoji od fibroznog omotača koji zalazi u unutrašnjost limfnog čvora i formira brojne trabekle, parakortikalne oblasti (zone T ćelija) u kojoj naivne T ćelije iz susednih venula dolaze u kontakt sa antigen prezentujućim dendritičnim ćelijama i zone B ćelija koju čine germinativni folikuli smešteni u spoljašnjem korteksu, gde naivne B ćelije stiču sposobnost da sintetišu specifična antitela. Limfni čvorovi su smešteni svuda u telu osim u centralnom nervnom sistemu, a posebno na čvorištima limfnih sudova kojima limfa dospeva iz određenih delova tela (regionalni limfni čvorovi). Aferentnim sudovima limfnog sistema dendritične ćelije iz perifernih tkiva zajedno sa antigenima, makrofagima, memorijskim T ćelijama i NK ćelijama dospevaju u subkortikalnu zonu limfnog čvora (Randolph et al.,2005; Martin-Fortecha et al., 2009). Dendritične ćelije u limfnom čvoru pored toga što imaju važnu ulogu u prezentovanju antigena naivnim T ćelijama, su značajne i u aktivaciji NK ćelija (Lucas et al., 2007; Chijioke i Münz, 2011). U infekcijama i u tumorima vezivanje antigenih determinanti virusa, bakterija i tumora za TLR (engl. TOLL-like receptors) receptore na dendritičnim ćelijama dovodi do njihovog sazrevanja tj. do povećanja ekspresije MHC molekula klase I, kostimulatornih i adhezionih molekula, receptora za hemokine kao i do sinteze citokina u dendritičnim ćelijama. U tim uslovima aktivirane dendritične ćelije mogu iz perifernih tkiva u kojima se odvija susret sa patogenom i zapaljenjski proces da zahvaljući receptorima za hemokine koje su stekle u procesu sazrevanja migriraju u drenirajuće limfne čvorove. Naime, tokom sazrevanja dendritičnih ćelija dolazi do povećanja ekspresije CCR7 hemokinskog receptora čiji su ligandi CCL21, koga produkuju endotelne ćelije limfnih sudova i CCL19, ligand koga produkuju ćelije strome i dendritičnih ćelija limfnog čvora. Ovim je omogućena migracija dendritičnih ćelija u subkortikalnu zonu drenirajućeg limfnog čvorova (Martin-Fortecha et al., 2009). 7 Limfni čvorovi ljudi sadrže većinu svih NK ćelija u organizmu pri čemu je zastupljenija CD56sjajno+ subpopulacija NK ćelija koja se aktivira u kontaktu sa zrelim dendritičnim ćelijama. U tom smislu, zrele mijeloidne dendritične ćelije sekrecijom interleukina IL-12 i IL-18 stimulišu sintezu citokina interferona γ (IFNγ), faktora nekroze tumora-α (TNF-α, engl. Tumor Necrosis Factor α) i granulocitno monocitnog faktora rasta (GM-CSF) u NK ćelijama (Chijioke i Münz, 2011). Ova interakcija dendritičnih i NK ćelija u limfnom čvoru nije jednosmerna, pa tako IFNγ i TNF-α koga sintetišu CD56sjajno+ NK ćelije dovode do sazrevanja nezrelih dendritične ćelije u limfnom čvoru (Vitale et al., 2005). GM-SCF koji sintetišu NK ćelije stimuliše diferencijaciju CD14+ monocita u makrofage (Ferlazzo i Munz, 2009). Pored toga, sintezom IFNγ, NK ćelije stimulišu sintezu interleukina IL-12 u dendritičnim ćelijama kao i eskpersiju IL-12 receptora na naivnim T ćelijama, a time i sintezu Th1 citokina i adaptivni imunski odgovor. Pri virusnim infekcijama, zrele plazmacitoidne dendritične ćelije sintezom IFN tipa I dovode do povećanja citotoksične aktivnosti NK ćelija. Zrele dendritične ćelije su u limfnom čvoru zaštićene od lize NK ćelijama povećanom ekspresijom MHC molekula klase I koji se vezuju za inhibitorne KIR i CD94/NKG2A receptore na NK ćelijama i time inhibiraju NK ćelijsku citotoksičnost (Ferlazzo i Munz, 2009) Dendritične ćelije i ćelije strome limfnog čvora, sintetišu IL-15 koji se vezuje za α lanac IL-15 receptora na membrani ovih ćelija i na taj način stimulišu sazrevanje CD56sjajno+ NK ćelija u zrelije citotoksične CD56potmulo+ NK ćelije (Chijioke i Münz, 2011). U novije vreme pokazano je i da NK ćelije posredstvom svojih NKp30, NKp46 i DNAM 1 receptora uništavaju nezrele dendritične ćelije, dok su zrele dendritične ćelije zaštićene od lize NK ćelijama povećanom eskpresijom MHC molekula klase I (Morandi et al., 2012). Migracija NK ćelija najvećim delom je uslovljena ekspresijom hemokinskih receptora. U toku zapaljenskih procesa kao što su infekcije i prisutvo TLR liganada na patogenim mikroorganizmima, aktivirane mijeloidne i plazmacitoidne dendritične ćelije sekretuju različite hemokine koji utiču na migraciju NK ćelijskih subpopulacija u zavisnosti od toga koje receptore za hemokine ispoljavaju. Tako, CD3-CD56potmulo+ NK ćelije ispoljavaju CXCR1 i CX3CR1 receptore za hemokine IL-8 (CXCL8) i CXCL1. 8 Hemokin CXCL1 posreduje u adheziji ćelija za endotel kapilara i stimuliše sledstvenu hemotaksičnu migraciju prema IL-8. CD3-CD56sjajno+ NK ćelije ispoljavaju CCR5, CXCR3 i CXCR4 hemokinske receptore koji im omogućavaju da se kreću prema CCL5 (RANTES), CCL4 (MIP-1β), CXCL11 i CXCL10, hemokinima koje produkuju dendritične ćelije. Na ovaj način, tokom zapaljenskih procesa može doći do migracije NK ćelija obe subpopulacije u limfni čvor (Ferlazzo i Munz, 2009). Slika 3. Dinamika NK ćelijskih subpopulacija u limfnom čvoru infiltrisanom tumorom. U subkortikalnoj T-ćelijskoj zoni limfnog čvora u fiziološkim uslovima zastupljenija je CD3-CD56sjajno+ subpopulacija NK ćelija i smatra se da je to posledica povećane ekspresije CD62L (Frey et al., 1998; Chen et al., 2005) adhezionog molekula i CCR7 receptora za hemokine koji se vezuje za CCL19 i CCL21 ligande, kao i CXCR3 receptora koji se vezuje za CXCL9, CXCL10, i CXCL11 ligande (Campbell et al., 2001; Ferlazzo et al., 2004). Ekspresija ovih hemokinskih receptora reguliše migraciju i pospešuje nakupljanje ove subpopulacije NK ćelija u sekundarnim limfnim organima. Značajno je da CCR7+ NK ćelije učestvuju u uništavanju tumorskih ćelija koje sintetišu hemokine CCL19 i CCL21 (Robertson, 2002). T cell zone Eferentni limfni sud Aferentni limfni sud Venula visokog endotela CD3-CD56sjano+ NK ćelija CD3-CD56potmulo+ NK ćelija CD3- CD56sjajno+NK ćelija Dendritična ćelija Ćelije tumora CD3-CD56potmulo+ NK ćelija Zona T ćelija 9 2005. godine opisana je subpopulacija hematopoetskih ćelija koja odgovara razvojnom stadijumu pro-NK ćelija i ispoljava CD45RA marker i β7 integrine (CD34potmulo+CD45RA+ β7sjajno+) i koja zahvaljujući prisutvu CD62L i α4β7 integrina migrira u sekundarne limfne organe (Freud et al., 2005). Ova subpopulacija pro-NK ćelija je visoko-zastupljena u limfnim čvorovima i u prisutvu endogenih citokina limfnog čvora diferencira se najpre u CD56sjajno+ subpopulaciju (Ferlazzo et al., 2004), a zatim u fukcionalno zrelije CD56potmulo+ subpopulaciju NK ćelija koje postepeno gube CD62L i β7 integrine i kasnije napuštanju sekundarne limfne organe (Campbell et al., 2001; Malhotra i Shanker, 2011). Edukacija NK ćelija NK ćelije mogu da prepoznaju izmenjene ćelije i liziraju ih, a tolerantne su prema ćelijama sopstvenog organizma. Ovo svojstvo NK ćelija omogućeno je prisustvom aktivacionih receptora koji neposredno prepoznaju ligande na izmenjenim ćelijama i inhibitornih receptora koji prepoznaju MHC molekule klase I na ćelijama sopstvenog organizma. Inhibitorni receptopri i njihovi ligandi (MHC I molekuli) su izrazito polimorfni i kodiraju ih familije gena sa velikim brojem alela koji se nesleđuju nazavisno. U procesu koji se naziva edukacija ili drugačije licenciranje NK ćelija, ove ćelije stiču sposobnost da obavljaju svoje efektorske funkcije, a pored toga stiču i toleranciju prema ćelijama vlastitog organizma. Proces edukacije odvija se interakcijom-kontaktom inhibitornih receptora NK ćelija sa MHC molekulima klase I ispoljenim na vlastitim ćelijama u organizmu. Edukacija NK ćelija se najčešće odvoja u sekundarnim limfnim organima, mada se može odvijati i u tkivima mnogih drugih organa (Elliott i Yokoyama, 2011). Istraživanja vršena na MHC I deficijentnim miševima (Höglund et al., 1991; Liao et al., 1991) i ljudima (Zimmer et al., 1998) pokazala su slabu reaktivnost NK ćelija ovih organizama nakon stimulacije aktivacionih receptora, pri čemu su usled slabe reaktivnosti ove NK ćelije tolerantne u odnosu na ćelije organizma u kome se razvijaju. Ove NK ćelije se odlikuju niskom citotoksičnošći i slabom produkcijom IFNγ. Smatra se da u uslovima MHC I deficijencije usled nedostatka inhibitornih stimulusa koji 10 potiču od aktiviranih inhibitornih KIR receptora, česte stimulacije aktivacionih receptora na NK ćelijama dovode do desenzitizacije i slabe reaktivnosti NK ćelija (Fernandez et al.,2005; Kim et al.,2005). Vezivanje inhibitornih KIR receptora za MHC molekule klase I pored toga što određuje prepoznavanje i toleranciju na sopstvene ćelije, neophodan je uslov da bi NK ćelije mogle da postanu funkcionalno kompetentne. Sa tim u vezi, predložena su dva osnovna modela edukacije NK ćelija i još dva iz njih izvedena modela (Holgrund et al., 2010). Model koji su predložili Yokoyama i saradnici (Yokoyama et al., 2006) označen je kao model „licenciranja“, a drugačije se naziva i model naoružavanja (engl. „arming model“). U ovom modelu presudan značaj u dostizanju pune funkcionalne kompetentnosti NK ćelija se pridaje vezivanju inhibitornih KIR receptora za MHC molekul klase I. Nasuprot ovom modelu, model razoružavanja (engl. „disarming model“) koji su predložili Raulet i saradnici (Fernandez et al., 2005) podrazumeva da za dostizanje funkcionalne kompetentnosti je potrebna stimulacija aktivacionih receptora njihovim ligandima kao i inhibitornih KIR receptora MHC molekulima klase I, dok hronična stimulacija aktivacionih receptora dovodi do smanjene sposobnosti NK ćelija da budu funkcionalno aktivne. Treći model, izveden iz modela „licenciranja“ je model cis interakcije. Prema ovom modelu, za razliku od „arming“ modela koji podrazumeva vezivanje inhibitornog KIR receptora samo za MHC I molekul na susednoj ćeliji (trans vezivanje) tokom edukacije NK ćelija, dovoljan uslov za punu funkcionalnu kompetentnost NK ćelija je vezivanje inhibitornog KIR receptora za sopstveni MHC molekul klase I (cis vezivanje). Ovaj model je našao eksperimentalnu potvrdu samo kod miševa (Andersson et al., 2007). Četvrti model sticanja funkcionalne kompetentnosti NK ćelija je model reostata koji predstavlja dinamički pogled na edukaciju NK ćelija i u izvesnom smislu objedinjuje „arming“ i „disarming“ modele. Model reostata podrazumeva da je funkcionalnost NK ćelija uslovljena inhibitornim stimulusima koji potiču vezivanjem za MHC I molekule koji moraju da prevladaju aktivacione signale nastale vezivanjem liganda za aktivacione receptore na NK ćelijama (Borodin et al., 2009; Holgrund et al., 2010). U eksprimentima transfera funkcionalno nekompetetnih NK ćelija iz MHC I deficijentnih u normalne miševe pokazano je da NK ćelije u oraganizmu primaoca 11 postaju funkcionalno kompetentne (Joncker et al, 2010). Slično tome, pokazano je da pri transferu NK ćelija iz normalnih u MHC I deficijentne miševe NK ćelije gube funkcionalnu kompetentnost (Elliott et al., 2010). Ovi podaci ukazuju na to da NK ćelije mogu biti ponovo edukovane u zavisnosti od prisustva MHC molekula klase I u okruženju, kao i da edukacija NK ćelija predstavja reverzibilan proces. Tokom edukacije dolazi do promene na nivou lipidnog dvosloja plazma membrane NK ćelije, pri čemu nakon kontakta KIR receptora na NK ćeliji sa MHC I ligandom na ćeliji organizma, na membrani NK ćelije dolazi do grupisanja aktivacionih receptora u tzv. nanodomene koji su smeštinu u ekstracitoplazmatskom sloju membrane i predstavljaju regione membrane koji su pogodni za „prijem“ i transdukciju spoljašnjih signala (Guia et al., 2011). Mada edukacija dovodi do generisanja NK ćelija koje imaju izražena efektorska svojstva prema izmenjenim ćelijama, aktivnost NK ćelije zavisi od prisustva liganada za aktivacione receptore na izmenjenoj ćeliji kao i od citokina u okruženju. U tom smislu kod miševa je pokazano mnogo izraženije citotoksično dejstvo „needukovanih“ u poređenju sa „edukovanim“ NK ćelijama, prema ćelijama koje su inficirane citomegalovirusom (CMV) (Orr et al., 2010; Jaeger i Vivier, 2012). Bolje citotoksično dejstvo ovih „needukovanih“ NK ćelija može da bude uslovljeno time što se aktivacioni Ly49 mišiji receptori vezuju direktno za virusne proteine i time stimulušu NK ćelijsku aktivnost (Kielczewska et al., 2007; Murphy et al., 2012). Ispitivanjem uticaja edukacije na antitumorsku citotoksičnost NK ćelija, pokazano je da kod neuroblastoma NK ćelije obolelih koje ne ispoljavaju KIR receptore za sopstvene MHC molekule klase I (needukovane NK ćelije) pokazuju veću citotoksičnost prema ovom malignom tumoru u odnosu na NK ćelije koje su edukovane kontaktom sa MHC molekulima klase I (Tarek et al., 2012). Ovi podaci ukazuju na to da u uslovima stresa, kao što su tumori i virusne infekcije, NK ćelije koje nisu edukovane pokazuju bolje citotoksično dejstvo. "Priming"-senzibilizacija NK ćelija Prema važećim teorijama da bi NK ćelije bile funkcionalno kompetentne, pored edukacije koja se ostvaruje kontaktom inhibitornih KIR receptora NK ćelija sa MHC molekulima klase I, potrebno je da NK ćelije budu senzibilisane interleukinima IL-15 ili IL-18. Smatra se da se ovaj proces najčešće odvija u limfnim čvorovima i ostalim 12 sekundarnim limfnim organima. Ovaj proces se označava kao "priming" pri čemu IL-15 vezan za α subjedinicu IL-15 receptora (IL-15Rα) na dendritičnim ćelijama se vezuje za komplementarne βγ subjedinice IL-15 receptora na NK ćeliji. Za razliku od IL-15 koji je u ovom procesu trans prezentovan vezivanjem za dendritične ćelije, IL-18 deluje na NK ćelije kao solubilan molekul. Proces "priming"-a je neophodan za citotoksičnu funkciju NK ćelija i za sposobnost produkcije IFNγ samo kod onih organizama koji ispoljavaju MHC molekule klase I, dok nije za sada poznato da li se "priming" odvija i kod MHC I-deficijentnih organizama čije NK ćelije nisu edukovane (Long 2007; Hoglund i Borodin, 2010). 1.4 NK ćelijski receptori Za razliku od ćelija adaptivnog imunskog sistema T i B limfocita, NK ćelije kao efektorske ćelije sistema urođene imunosti, nemaju klonski rasprostranjene receptore specifične za određeni antigen. NK ćelije ispoljavaju aktivacione i inhibitorne receptore posredstvom kojih su regulisane njihove efektorske funkcije. 1.4.1 Aktivacioni receptori Aktivacioni receptori stimulišu efektorske funkcije NK ćelija i obuhvataju više strukturno različitih familija. U ove receptote ubraja se nekoliko grupa: NKG2D, predstavnik C-lektinima sličnih receptora (NKG2) (engl. Natural Killer cell lectin-like receptor 2), CD16 receptor niskog afiniteta za Fc fragment Ig (FcRIIIa), prirodni citotoksični receptori NCR (engl. Natural Cytotoxicity Receptors), aktivacioni KIR receptori i DNAM- 1. Pored ovih receptora brojni koreceptori kao što su 2B4, CD48 i NKp80 mogu takođe da doprinesu aktivaciji NK ćelija. Pojedini receptori kada su pojedinačno stimulisani ne dovode do citotoksične aktivnosti NK ćelija, ali snižavaju prag aktivacije NK ćelija (Moretta et al., 2002) te se NK ćelije mogu aktivirati istovremenom stimulacijom više receptora (Bryceson et al., 2006). Aktivacioni receptori ne sadrže u svojoj strukturi aktivacioni domen, već su svojim citoplazmatskim domenom povezani sa adaptorskim molekulima koji sadrže ITAM (engl. Immunodominant Tyrosine based Activation Motif) aktivacioni domen sa aminokiselinom tirozinom (Y) u određenom, YXX(I/L) redosledu, koji učestvuje u 13 prenosu aktivacionih signala. Aktivacioni receptori mogu da budu povezani sa više adaptorskih molekula što omogućava bolju regulaciju aktivacije NK ćelija u različitim fiziološkim uslovima (Lanier, 2008). NKG2D NKG2D aktivacioni receptor po svojoj strukturi pripada NKG2 (engl. Natural Killer cell lectin-like receptor 2) familiji C-lektina tipa II zavisnih od kalcijuma. Prisutan je na NK ćelijama i na γδ T, αβ CD8+ i NKT ćelijama ljudi (Eagle i Trowsdale, 2007). Vezivanjem za svoje ligande NKG2D receptor može da aktivira citotoksičnu funkciju i sintezu citokina u NK ćelijama samostalno i nezavisno (Zafirova et al., 2011). Ligandi NKG2D receptora (NKG2DL) nisu prisutni na ćelijama zdravih tkiva osim na ćelijama epitela timusa i mukoze gastrointinalnog trakta. Patološki uslovi kao što su virusne infekcije i maligna transformacija dovode do povećanog ispoljavanja ovih molekula. Kod ljudi postoje dve familije NKG2DL: daleki homologi MHC molekula klase I (MICA i MICB) i familija ULBP proteina koji se vezuju za UL16 protein virusa CMV, a koja obuhvata 5 članova (ULBP1-4 i REAT1G) (Raulet, 2003; Spear et al., 2013). MIC geni imaju 28-35% nukleotidnih sekvenci sličnih MHC I genima, veoma su polimorfni i obuhvataju 60 MICA i 25 MICB alela (Eagle i Towsdale, 2007). Slično MHC molekulima klase I, MICA/B u svojoj strukturi poseduju α1, α2 i α3 vanćelijske domene i transmembranski rep, ali se ne vezuju za β2 mikroglobuline i ne učestvuju u prezentaciji antigena (Groh et al., 1996). Stresni uslovi kao što su toplotni šok, oksidativni stres, genotoksični agensi i zaustavljena replikacija DNK u ćeliji, povećavaju ekspresiju NKG2DL (Gasser et al., 2005). Inducibilnost gena za NKG2DL u stresnim uslovima je prvobitno pokazana za protein toplotnog šoka Hsp70 koji se vezuje za promotore MICA i B gena i indukuje njihovu transkripciju. Transkripciju ovih gena indukuju i oštećenja DNK molekula nastala usled dejstva jonizujućeg zračenja ili alkilirajućih agenasa koji stvaraju prekide u DNK molekulu. U tom smislu, ATM (engl. Ataxia Telangiectasia Mutated) kinaza koja se aktivira usled pojave dvolančanih prekida u DNK molekulu i ATR (engl. Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein) kinaza koja se aktivira usled zaustavljene replikacije DNK, povećavaju ekspresiju NKG2DL (Gasser et al., 2005). Značajno je da 14 terapija malignih tumora jonizujućim zračenjem i hemioterapijskim agensima koji dovode do oštećenja DNK molekula, povećava ekspresiju NKG2DL i na taj način pospešuje NKG2D zavisnu eliminaciju malignih klonova (Spear et al., 2013). Pokazano je i da inhibitori proteazoma koji se primenjuju u terapiji multiplog mijeloma takođe posredstvom ATM/ATR signalnog puta dovode do povećane ekpresije ULBP1 liganda na ćelijama tumora (Krieg i Ullrich, 2013). Pored toga pokazano je i da produkti virusa CMV koji deluju kao inhibitori histon deacetilaza povećavaju ekspresiju iRNK za MICA. Na ekspresiju NKG2DL slično deluju i inhibitori histon deacetilaza i all trans retinoična kiselina koje se primenjuju u terapiji akutne mijeloidne leukemije, promijelocitne leukemije i hepatocelularnog karcinoma (Lopez-Larrea et al., 2008; Spear et al., 2013). Nivo NKG2DL je regulisan i na nivou translacije, a iRNK za MICA i MICB su prisutne i u ćelijama zdravih tkiva koja, u fiziološkim uslovima, ne ispoljavaju ove proteine. Translaciju NKG2DL regulišu male iRNK (miRNK) koje vezujući se za 3’ UTR region iRNK ovih liganada inhibiraju ekspresiju ovih proteina i održavaju je ispod određenog praga, a pri stresnim uslovima u ćeliji omogućavaju njihovu sintezu (Stern- Glossar i Mandelboim, 2009). Ovakva regulacija ekspresije NKG2DL je značajna jer sprečava neželjenu NK ćelijsku lizu ćelija sopstvenog organizma. Pokazano je i da virusi CMV takođe produkuju miRNK koje inhibiraju ekspresiju NKG2D L (Stern- Glossar, et al., 2008). Već u prvim fazama maligne transformacije usled oštećenja DNK molekula dolazi do ekspresije NKG2DL (Diefenbach et al., 2000; Champsaur i Lanier, 2010). Međutim, u uznapredovalim stadijumima rasta tumora pokazano je da povećan nivo NKG2DL može da doprinese internalizaciji i degradaciji NKG2D receptora, kao i da može doći do odbacivanja ovih liganada sa površine maligne ćelije delovanjem proteolitičkih enzima matriks metaloproteinaza (MMP), što čini maligne ćelije manje podložnim lizi od strane NK ćelija (Groh et al.,2002; Dubrovina et al., 2003). Pored toga, maligne ćelije kao i imunoregulatorne ćelije koje su prisutne u tumorima, sintetišu transformišući faktor rasta-β (engl. Transforming Growth Factor-β, TGF-β) koji sprečava ispoljavanje samog NKG2D receptora i na taj način omogućavaju otpornost malignih ćelija na lizu NK ćelijama (Castracioni et al., 2003). NKG2D receptor aktivirajuću funkciju ostvaruje posredstvom DAP10 adaptorskog molekula monomer NKG2D receptora formiran je heksamerni kompleks Vezivanje NKG2D receptor fosforilacijom tirozina (Y) fosfatidil inozitol 3 kinazu protein 2) (Slika 4). S obzirom na to da je intracit dugačak svega 21 aminokiselinu i da se sekvence aminokiselina koje vezuju domen p38 subjedinice PI3 molekul može da veže samo jedan od ovih molekula molekul indukuje fosforilaciju Vav1, SLP Slika 4. Signalni put NKG2D receptora aktivacije NK ćelija: vezivanjem PI3 aminokiselinu tirozin (pY) u YINM Vav1 molekul se nalazi uzvodno u ovom formiranja imunološke sinapse sa ciljnom filamenata u citoskeletu, otpuštanj putem disulfidnih veza formira homodimere udružuje se sa po 2 DAP10 molekula koji se aktivira vezivanjem liganda (Slika a za ligand dovodi do aktivacije DAP10 molekul u YXXM domenu koji zatim može da veže i aktivira (PI3K) ili Grb2 protein (engl. Growth factor receptor binding oplazmatski domen DAP10 K i Grb2 proteina međusobno preklapaju, svaki DAP10 (Lanier, 2008). -76 i fosfolipaze C-γ (PLC-γ). . Stimulacija NKG2D receptora dovodi do K i Grb2-Vav1-Sos1 compleksa strukturnom motivu ( ) citoplazmatskog signalnom putu i kada je aktiv ćelijom, dovodi do reorganizacij a Ca2+ kao i do pokretanja i sekrecij 15 i svoju . Svaki i na ovaj način 4). a molekula SH2 Aktivirani Grb2 za fosoforilisanu domena DAP10. iran, prilikom e aktinskih e citotoksičnih 16 granula. Aktivirana p85 subjedinica PI3K fosforiliše membranski fosfatidil inozitol(4,5) bifosfat i time ga prevodi u sekundarni glasnik fosfatidil inozitol-3,4,5-trifosfat (PIP3) i aktivira Akt kinazu u imunološkoj sinapsi formiranoj formiranoj između NK ćelije i ciljne ćelije koja ispoljava NKG2DL. Pokazano je da je Grb2 aktiveran kada je u Sos1- Vav1-Grb2 kompleksu i da tada odlazi ka delu membrane bogatom PIP3 koji nastaje delovanjem PI3K (Upshaw et al., 2006). Procesi koji se odvijaju u NKG2D signalnoj putanji nizvodno od PI3K i Grb2-Vav1 kompleksa nisu u potpunosti razjašnjeni, ali je pokazano da vezivanjem NKG2DL mogu da se aktiviraju i Akt, mitogenom aktivirana kinaza protein kanaze (MEK)/ mitogenom aktivirana protein kinaza (MAPK) i Janus tirozin kinaza 2 (JAK2), a takođe i STAT5 signalni molekul. Pokazano je da i PI3K i i Grb2 molekuli podjednako doprinose citotoksičnosti NK ćelija kao i da mutacije u jednom od njih umanjuju NK ćelijsku citotoksičnost (Upshaw et al., 2006; Lanier, 2008; Zafirova et al., 2011). Pored uloge u citotksičnosti, NKG2D/ DAP10 signalni put učestvuje i izlučivanju citokina, a smatra se de aktivacija PI3K–Akt signalnog puta može da stimuliše i preživljavanje NK ćelija (Lanier, 2009). NK ćelije, tokom svog razvoja, ispoljavaju NKG2D receptor relatvino rano, već u stadijumu iNK ćelija. Ovaj receptor je podjednako prisutan i na CD56potmulo+ i na CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija (Zafirova et al., 2011). NCR NCR receptori su po svojoj strukturi membranski proteini tipa I koji u svom vanćelijskom domenu sadrže jedan ili dva Ig slična domena. Ova grupa obuhvata NKp46 i NKp30, receptore koji su konstitutivno eksprimirani na svim NK ćelijama i NKp44, receptor koji je prisutan na NK ćelijama aktiviranim sa IL-2 i na plazmacitoidnim dendritičnim ćelijama (Fusch et al., 2005; Hudspeth et al., 2013). NKp46 i NKp30 receptori su interspecijski prisutni, te se smatraju markerima NK ćelija. Ligandi za NCR receptore nisu precizno definisani, ali je pokazano da se visokim afinitetom vezuju za heparin sulfat proteoglikane (HSP) hemaglutinina različitih virusa, kao i za njima slične antigene determinante na tumorskim ćelijama (Bloushtain et al., 2004). U novije vreme identifikovani su i drugi logandi ovih receptora kao što su BAT3 (engl. nuclear factor HLA-B-associated Transcript 3), ligand koga putem egzozoma izlučuju dendritične ćelije i tako aktiviraju NK ćelije, kao i B7-H9 ligand koji je 17 prisutan na ćelijama tumora. NCR receptori učestvuju u ubjanju malignih ćelija putem citotoksičnosti pri čemu je NKp46 najmoćniji aktivator citotoksičnosti NK ćelija (Brandt et al., 2009). NKp30 i NKp46 ineteraguju i sa dendritičnim ćelijama i dovode do njihovog sazrevanja posredstvom citokina koje sintetišu na ovaj način stimilsane NK ćelije, a pored toga učestvuju i u procesu ubijanja nezrelih dendritičnih ćelija (Ferlazzo, 2005; Morandi et al., 2012; Hudspeth et al., 2013). Iako je do sada uglavnom pokazana izrazito aktivirajuća uloga NCR receptora, postoje novi podaci o postojanju različitih alela NKp30 od kojih produkt NKp30c forme inhibira funkciju NK ćelija (Delahaye et al., 2011). CD16 CD16 je po svojoj funkciji receptor niskog afiniteta za Fc fragment IgG (FcγRIII). Strukturu CD 16 čini α lanac koji u svom vanćelijskom regionu sadrži dva Ig slična domena i koji prepoznaje Fc fragmente IgG1 i IgG3 antitela. Kod ljudi postoje dva gena za FcγRIII molekul: A i B. Produkt A gena je FcγRIIIA isoforma koja je prisutna na NK ćelijama, a podukt B gena je FcγRIIIB izoforma koja se prisutna na neutrofilima. CD16 receptor na NK ćelijama se niskim afinitetom vezuje za Fc fragment IgG na ciljnoj ćeliji koja je obeležena antitelima i tako sprovodi citotoksičnost zavisnu od antitela-ADCC (engl. Antibody Dependant Cellular Cytotoxicity) (Lanier et al., 1986). Ovim putem aktivirane NK ćelije sintetišu i sekretuju citokine ili oslobađaju perforin i granzime iz citotoksičnih granula i liziraju ciljne ćelije. Pored toga što učestvuje u ADCC, pokazano je da CD16 može da se direktno veže za ćelije tumora i da time dovodi do citototoksične aktivnosti NK ćelija (Mandelboim et al.,1999; Grier et al., 2012). CD16 receptor je nekovalentno vezan sa homodimerom koga čine FcRγ lanci ili homodimerom TCRζ lanaca ili heterodimerom FcRγ i TCRζ koji su značajni u signalnom putu CD16 receptora. Vezivanjem liganda za CD16 receptor dolazi do aktivacije NK ćelija preko Src-tirozin kinaze, koja fosforiliše tirozin ITAM-a u citoplazmatskom delu FcRγ i TCRζ lanaca (Vivier et al.,1991). Aktivaciojm CD16, takođe dolazi i do fosforilacije i aktivacije ZAP70 signalnog molekula, koji aktivira fosfolipazu C, kao i do aktivacije PI3K i MAPK protein kinaza i translokacije nuklearnog faktora aktiviranih T ćelija (engl. Nuclear Factor of Activated T-cells, 18 NFAT) (Lanier, 1998). Zastupljen ja najviše na zrelijoj i citotksičnoj CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija. Pokazano je da CD16 od svih aktivacionih NK ćelijskih receptora poseduje najveći potencijal da aktivira citotoksičnu funkciju NK ćelija i sintezu citokina (Bryceson et al., 2006). DNAM-1 DNAM-1 (CD226) po strukturi pripada superfamiliji Ig i osim NK ćelija ispoljavaju ga T i B ćelije, monociti i trombociti (Lanier, 2005). Prepoznaje ligande CD155 (receptor za Polio virus) i CD112 (nektin-2) (Bottino et al.,2003) i pospešuje antitumorsku citotoksičnu funkciju NK ćelija i produkciju citokina, a pored toga i lizu nezrelih dendritičnih ćelija (Pende et al., 2006; Morandi et al., 2012). 1.4.2 Inhibitorni receptori Postoje dve grupe inhibitornih receptora na NK ćelijama u zavisnosti od liganada koje prepoznaju: MHC I zavisni inhibitorni receptori koji se vezuju za klasične i neklasične MHC molekule klase I i receptori koji se vezuju za ostale ligande. Kod ljudi su na osnovu strukture identifikovane dve familije MHC I-zavisnih inhibitornih receptora: Ig superfamilija receptora koja obuhvata KIR receptore i leukocitne Ig slične receptore (engl. Leukocyte Immunoglobulin-like Receptors, LIR) i familija receptora sličnih C-lektinima. Inhibitorni receptori pokazuju različitu specifičnost za MHC I molekule, pa u tom smislu neki prepoznaju samo određene alele antigenih determinanti za MHC molekule klase I, dok drugi prepoznaju širok spektar MHC I liganda (Stern- Ginossar i Mandelboim, 2010). Za urođeni imunski odgovor je važno da svaka NK ćelija ispoljava više inhibitonih receptora u različtim kombinacijama, tako da su različite subpopulacije NK ćelija u mogućnosti da prepoznaju gubitak nekog od MHC I molekula (Moretta et al., 1996; Gazit et al., 2004). KIR receptori KIR receptori su familija inhibitornih receptora koji po svojoj strukturi pripadaju superfamiliji imunoglobilina i specifično intereaguju sa MHC molekilima klase I. Ispoljavaju ih uglavnom NK ćelije i mali broj αβ+ i γδ+ T ćelija (Lanier, 2005). 19 KIR receptori predstavljaju najpolimorfniju familiju NK ćelijskih receptora. Vezujući se za svoje ligande, MHC molekule klase I (HLA-A, -B i –C ) koji su prisutni na gotovo svim nukleisanim somatskim ćelijama, omogućavaju toleranciju NK ćelija na sopstvene ćelije u organizmu. U patološkim stanjima kao što su tumori i virusne infekcije često dolazi do gubitka MHC molekula klase I čime je onemogućena aktivacija citotoksičnosti T ćelija prepoznavanjem antigena vezanih za ove molekule posredstvom TCR. U tim uslovima NK ćelije deluju citotoksično prema izmenjene, MHC I- deficijentne, ćelije. Takođe, prethodno je već u ovom tekstu opisana i uloga KIR receptora reaktivnih u odnosu na sopstvene MHC molekule klase I u procesu dostizanja pune funkcionalne zrelosti NK ćelija u procesu njihove edukacije. KIR receptori se prema CD (engl. Cluster of Diffrentiation) nomenklaturi označavaju sa CD158. Ovi receptori su transmembranski glikoproteini koji u svom vanćelijskom regionu sadrže 2 ili 3 C2 tipa Ig slična domena koji učestvuju u vezivanju liganda. Na osnovu broja Ig domena u vanćelijskom regionu KIR receptori se mogu podeliti na subfamilije KIR2D, sa 2 i KIR3D, sa 3 Ig slična domena (Moretta et al.,1996). Inhibitorne KIR receptore odlikuje dugačak (engl. long, L) citoplazmatski region (KIRDL) koji sadrži jedan ili dva strukturna motiva sa aminokiselinom tirozinom (engl. Immune Tyrosine-based Inhibitory Motif, ITIM) u određenom redosledu (Ile/Val/Leu/Ser-X-Tyr-X-X-Leu/Val) i koji je odgovoran za prenos inhibitornih signala (Cambell et al., 2011). Inhibitorni KIR receptori svojim vanćelijskim Ig domenima se specifično vezuju samo za određene alele podgrupa MHC molekula klase I. Tako, KIR2DL receptori prepoznaju alotipove HLA-C grupe MHC molekula klase I pri čemu posredstvom svoja 2 Ig domena formiraju vodinične veze sa α1 i α2 domenima teških lanaca HLA-C molekula. Na taj način, KLR2DL1(CD158a) receptor prepoznaje HLA-C molekule C2 tipa koji na osamdesetom mestu u α1 domenu teškog HLA lanca sadrže aminokiselinu lizin (HLA-Cw2, HLA-Cw4, HLA-Cw5 i HLA-Cw6), a KIR2DL2/3 (CD158b1/2) receptori prepoznaju HLA-C molekule C1 tipa koji na ovom mestu u α1 domenu sadrže asparagin (HLA-Cw1, HLA-Cw3, HLA-Cw7 i HLA-Cw8) (Mandelboim et al.,1996). KIR3DL receptori prepoznaju HLA-A i HLA-B alotipove. KIR3DL1 gen je najpolimorfniji KIR gen i prepoznaje najčešći Bw4 epitop HLA-B molekula koji je takođe najpolomorfniji MHC molekul klase I u humanoj populaciji (Campbell et al., 2013) a pored toga i HLA svijih visoko-specifičnih HLA liganada mogu i da molekule. U tom smislu KIR2DL2/3 niskim afinitetom veže i C2 alotipove HLA HLA-B molekule. Ovo svojstvo KIR2DL2/3 doprinese inhibiciji efektorskih funkcija KIR2DL2/3 koje ispoljavaju C2 HLA-C molekule (Older većina HLA-A i HLA-B molekul kao HLA-C, smatra se da su HLA oraganizmu bile zaštićene od citotoksi Slika 5. Signalni put inhibtornog vanćelijske Ig sličane domene citoplazmatskog regiona koju vrši se nakon toga aktivira i defosforil Vezivanje odgovarajućeg MHC I aktivacije Src kinaze koja fos dolazi do premeštanja specifi membrane posredstvom β arestina tirozin. U ovu grupu specifi fosfataza (SHIP) koje odlikjuj tirozin i prelaze u katalitič -A3 i –A11 molekule. Značajno je da KIR receptori pored niskim afinitetom vežu pored visoko-afinitetnog vezivanja -C molekula, a takođe prepoznaje i neke receptora je značajno jer može da + NK ćelija prema Aguillar et al., 2010). S obzirom na to da a ne može biti prepoznata pomoću KIR2D receptor -C molekuli evoluirali da bi sopstvene čne aktivnosti NK ćelija (Thielens KIR receptora. Vezivanje HLA ( )KIR2DL dovodi do fosforilacije tirozina u Src kanaza. Zatim dolazi do vezivanja SHP iše Vav1 i inhibira ga . liganda za inhibitorni KIR receptor foriliše tirozin u ITIM strukturnom domenu KIR čne tirozin fosfataze u neposrednu 2 (Yu et al., 2008) i njenog vezivanja čnih fosfataza ubrajaju se SHP-1, SHP e prisustvo SH2 domena, kojim se vezuju ki aktivnu, otvorenu, konformaciju (Bakker 20 i druge HLA C1 može da ciljnim ćelijama a ćelije u et al., 2012). -C liganda za ITIM ( )domenu -1 fosfataze koja dovodi do -a. Zatim blizinu ćelijske za fosforilisani -2 i inozitol-5 za fosforilisani et al., 2000). 21 Aktivirane fosfataze defosforilišu mnoge signalne molekule (TCR, Syk, Zap-70, PLCγ, Lat i SLP-76) kao i aktivacione receptore i koreceptore (NKG2D i 2B4) koji sadrže fosforilisan tirozin i na taj način ometaju signalne puteve aktivacionih receptora (Long, 2008). Najvažniji supstrat SHP-1 je Vav1 čijom defosforilacijom su inhibirana sekrecija citotoksičnih granula i signalni putevi mnogih aktivacionih receptora (Long et al., 2001; Stebbins et al., 2003). Pri kontaku NK ćelije sa ciljnom ćelijom dolazi do vezivanja adhezionih molekula, limfoctinog funkcionalnog antigena-1 (LFA-1) i interćelijskog adhezionpg molekula-1(ICAM-1) što dovodi do fosforilacije Vav-1 koja je nezavisna od aktivacije NKG2D i drugih aktivacionih receptora koji sadrže ITAM, a koja takođe može da bude inhibirana vezivanjem inhibtornog KIR-a za HLA-C ligand (Riteau et al., 2003). Osim inhibitornih, postoje i aktivacioni KIR receptori koji pospešuju aktivnost NK ćelija, a čija svojstva su slabije proučena. Smatra se da imaju ulogu u reprodukciji i u odgovorima na virusne infekcije, kao i u osetljivosti na autoimunske bolesti (Hiby et al., 2004; Alter et al., 2007; Kulkarni et al.,2008). Za razliku od inhibiotrnih, aktivacioni KIR receptori u svom transmembranskom domenu imaju aminokiselinu lizin sa pozitivnim električnim nabojem (Biassoni et al., 1996) kojim su prostorno povezani sa DAP12 adaptorskim proteinom koji sadrži aktivacioni ITAM strukturni motiv sa negativnim električnim nabojem i kratak (engl. short, S) citoplazmatski rep. Smatra se da su aktivacioni postali od inhibitornih KIR receptora duplikacijom i konverzijom gena (Abi-Rached i Parham, 2005) i u tom smislu je pokazano da za gotovo svaki aktivacioni KIRDL postoji njegov inhibitorni KIRDS parnjak (Campbell et al., 2011). U humanoj populaciji postoje 2 osnovna KIR haplotipa A i B i oba sadrže inhibitorne KIRL specifične forme za HLA-C1 i –C2 molekule, a razlikuju se po prisustvu KIR-S formi. A za razliku od B KIR haplotip ne sadrži većinu KIR2DS formi (Perham, 2008). S obzirom na homologiju vanćelijskih domena aktivacionih KIR receptora sa svojim inhibitornim parnjacima, smatra se da aktivacioni KIR receptori mogu da se slabim afinitetom vežu za MHC I ligande svojih aktivacionih parnjaka, mada je biohemijski i funkcionalno ovo sa sigurnošću utvrđeno samo za KIRD2S1 koji vezujući se za HLA-C1 ligand na ciljnim ćelijama aktivira NK ćelijsku efektorsku funkciju (Pende et al., 2009) 22 KI2DL4 (CD158d) KIR receptor je jedini KIR koji ima dugačak citoplazmatski rep koji sadrži inhibitorni ITIM strukturni motiv, a koji aktivira efektorske funcije NK ćelija. Ovaj KIR najčešće je prisutan na NK ćelijama uterusa gde se vezuje za HLA-G, neklasičan MHC molekula klase I koga produkuju ćelije trofoblasta embriona i deluje na angiogenezu i remodelovanje krvnih sudova u procesu formiranja krvo tkivne placentalne barijere (Rajagopalan i Long, 2012). Za razliku od ostalih pripadnika KIR familije receptora koji su najvećim delom prisutni na CD56potmulo+ NK ćelijama, KI2DL4 je prisutan ugalvnom samo na nezrelim, CD56sjajno+ NK ćelijama i aktivira sintezu citokina, a slabije NK ćelijsku citotoksičnost (Campbell et al., 2011). Inhibitorni receptori slični C-lektinima Ovu grupu inhibitornih C lektinskih receptora zavisnih od kalcijuma čine heterodimeri sastavljeni CD94 molekula i od NKG2-A ili NKG2-–B molekula NKG2 grupe (engl. Natural Killer cell lectin-like receptor 2). Ovi receptori se u ontogenetskom razvoju NK ćelija ranije javljaju u odnosu na KIR receptore i u većoj gustini su prisutni na CD56sjano+ subpopulaciji NK ćelija, a slabije na terminalno diferenciranim CD56potmulo+ NK ćelijama (Yu et al., 2010). Slično inhibitornim KIR receptorima, inhibitorni lektinski receptori sadrže ITIM strukturni motiv u svom citoplazmatskom domenu koji učestvuje u prenošenju inhibitornih signala. Važan predstavnik ove gupe receptora je CD94/NKG2A, hetrodimer koji prepoznaje HLA-E, neklasični MHC molekul I klase (Carretero et al., 1998; Malhotra i Shanker, 2011) koji se formira u endoplazmatičnom retikulumu od vodećih peptidnih sekvenci HLA-A, HLA-B i HLA-C molekula te njegova ekspresija zavisi od ekspresije ovih klasičnih MHC I molekula. Smatra se da ovaj mehanizam sinteze HLA-E omogućava NK ćelijama da prepoznaju promenu u ekspresiji MHC molekula klase I. Pri infekcijama virusima grupe CMV, UL40 protein povećava vezivanje HLA-E molekula za površinu inficirane ćelije, što inhibira citotoksičnu funkciju NK ćelija, a time pospešuje preživljavanje inficirane ćelije (Tomasec et al., 2000). MHC I- nezavisni inhibotorni receptori Prema „missing self“ hipotezi MHC molekuli klase I imaju važnu ulogu u inhibiciji citotoksične aktivnosti NK ćelija. Međutim pokazano je da NK ćelije MHC I 23 deficijentnih miševa i ljudi ipak ne liziraju sopstvene, a mogu da liziraju ćelije tumora. Stoga se pretpostavilo se da osim inhibitornih receptora koji prepoznaju MHC molekule klase I postoje i inhibitorni receptori koji prepoznaju druge ligande i omogućavaju da NK ćelije budu tolerantne na autologne ćelije koje nemaju MHC molekule klase I. U ovu grupu recepotra ubrajaju se protein sličan karcino-embrionalnom antigenu 1 (CECAM1) koji je prisutan na većini ćelija imunskog sistema. Ovaj molekul posredstvom homotipskih interakcija inhibira funkciju NK ćelija, a njegov značaj u održavanju periferne tolerancije pokazan je kod MHC I deficijentnih ljudi (Maerkel et al., 2002). Ostali značajni inhibitorni receptori ove grupe su: KLRG1 (engl. Killer cell Lectin-Like Receptor G1) receptor koji inhibira funkciju NK ćelija vezivanjem za proteine iz grupe kadherina, CD161 receptor iz grupe C lektinih receptora koji prepoznaje LLT1 (engl. Lectin Like Transript) i LIAR1 (engl. Leukocyte-Associated Ig- like Receptor 1) koji se visokim afinitetom vezuje za kolagen (Maerkel et al., 2002; Ito et al., 2006; Meyaard, 2008). 1.5 Efektorske funkcije NK ćelija Postoje dve osnovne efektorske funkcije NK ćelija: citotoksična i imunoregulatorna. Citotoksična funkcija NK ćelija je usmerena prema izmenjenim malgno transformisanim ćelijama i ćelijama inficiranim virusima, kao i prema ćelijama koje su pretrpele različita hemijska i fizička oštećenja. NK ćelijska citotoksična aktivnost može biti direktna koja podrazumeva lizu izmenjenih ćelija proteolitičkim enzimima kao i izazivanjem smrti ovih ćelija apotozom. Pored direktne, NK ćelije sprovode i citotksičnost zavisnu od antitela (ADCC), a sintezom bronih citokina i hemokina utiču na urođenu i na adaptivnu imunost. Citotoksična funkcija NK ćelija NK ćelije direktnu citotoksičnost funkciju vrše kao i citotoksične CD8+ T ćelije lučenjem granula sa citolitičkim enzimima i posredstvom Fas liganda iz TNF familije receptora. Za razliku od citotoksičnih T limfocita, da bi NK ćelija prepoznala i lizirala ciljnu ćeliju nije potrebno prepoznavanje antigena u sklopu MHC molekula. 24 Citotoksična aktivnost NK ćelija regulisana je balansom signala koji potiču sa aktivacionih i inhibitornih NK ćelijskih receptora. Kada ciljne ćelije na svojoj površini ispoljavaju ligande za aktivacione NK ćelijske receptore, a ne poseduju MHC molekule klase I ili kada ligandi za aktivacione receptore (NKG2DL, NCR ligandi) preovlađuju u odnosu na MHC I molekule na ciljnim ćelijama, dolazi do citotoksične aktivnosti NK ćelija. Nakon specifičnog vezivanja NK ćelijskih receptora za ligande na ciljnim ćelijama, NK ćelije posredstvom adhezionih molekula LFA-1 i ICAM-1 formiraju sa ciljnom ćelijom imunološku sinapsu čime je omogućeno izlučivanje citotoksičnih granula i citokina (McCann et al., 2003; Voskoboinik et al., 2010). U aktiviranoj NK ćeliji dolazi do polarizacije mikrotubula i na taj način do usmeravanja granula sa citolitičkim enzimima, koje nakon fuzionisanja sa plazma membranom oslobađaju citolitičke enzime (perforin) i serin proteaze (granzimi) u međućelijski prostor. NK ćelije CD56potmulo+ subpopulacije karakteriše obilno prisustvo citotoksični granula, a sledstveno tome i izražena citotoksičnost, za razliku od CD56sjajno+ subpopulacije koja je slabo citotoksična (Konjevic et al., 1995; Cooper et al., 2001). Perforin je prvobitno uočen u granulama CD8+ T, a kasnije i NK ćelija. Ovaj protein sprovodi svoju ubilačku funkciju tako što polimeriše i formira pore prečnika 16 nm u lipidnom dvosloju plazma membrane ciljne ćelije (Dannert i Podack, 1983). Humani perforin se sintetiše u nekativnoj formi u lumenu endoplazmatičnog retikuluma i kao glikoprotein molekulske mase 70KD prelazi u Goldžijev kompleks da bi se aktivirao prelaskom u sekretorne granule u kojima se skladišti. U tom smislu, u endozomima dolazi do proteolitičkog otkidanja C-terminalne signalne sekvence dugačke 21 aminokiselinu sa asparaginom u glikozilovanoj formi, a koja „prekriva“ katalitički centar molekula. Ovakvom enzimskom degradacijom nastaje funkcionalno zrelija, aktivna forma proteina molekulske mase 60KD koja se skladišti u sekretornim granulama (Uellner et al., 1997; Voskoboinik et al., 2010). Pored toga što se sintiše u neaktivnoj formi, nepoželjno destruktivno dejstvo preforina na membranu ćelije koja ga sintetiše sprečava povećana kiselost u sekretornim granulama koja dovodi do nakuplajnja pozitivnog naelektrisanja na asparaginu u C2 domenu perforina i time sprečava vezivanje jona Ca2+ (Voskoboinik et al., 2005; Voskoboinik et al., 2010). U prostoru imunološke sinapse koja se odlikuje neutralanim 25 pH i visokom koncentracijom jona Ca2+, oko 6500 puta većom nego u ćeliji, dolazi do vezivanja Ca2+ i do promene konformacije perforina, njegove polimerizacije i formiranja pora na plazma membrani ciljne ćelije, što dovodi do osmotske lize ciljne ćelije. Na delovima membrane u kojima je ciljna ćelija oštećena dolazi do pinocitoze kojom granzimi i druge litičke komponente prisutne u imunološkoj sinapsi dospevaju u unutarćelijski prostor (Arma i Podack, 2010; Voskoboinik et al., 2010). Nepoželjnu proteolitičku aktivnost perforina u odnosu na NK ćeliju koja ga sintetiše sprečava katepsin B takođe uskladišten u sekretornim granulama sa perforinom koji nakon egzocitoze vrši proteolizu monomera perforina da bi sprečio njihovu destruktivnu spontanu difuziju u NK ćeliju (Balaji et al., 2002; Krzewski i Coligan, 2013). Mutacije u PRF1, genu za perforin, kod ljudi dovode do oboljenja hamofagocitne limfohistiocitoze. Usled ove mutacije NK i ostale ćelije obolelih se odlikuju nedostatkom perforina ili prisustvom njegove izmenjene nefunkcionalne forme ili malom količinom perforina, pa je sledstveno tome veoma niska citotoksičnost NK i T ćelija. Smatra se da je hemofagocitoza kod obolelih koji nose ovu mutaciju najčešće neposredno izazvana EBV i CMV virusnim imfekcijama (Risma et al., 2006). Granzimi su serinske proteaze koje direktno ulaze u ciljnu ćeliju i delujući na različite supstrate dovode do apoptotske smrti ćelije. Kod ljudi je do sada opisano pet vrsta granzima: A, B, H, M i triptaza-2/ granzim 3 (Hameed et al.,1988). Granzim B je najbolje opisan enzim ove grupe koji pored toga što posredno izaziva apoptozu aktivacijom kaspaza može i da ošteti DNK molekul i time direktno dovede do apotoze (Russell i Lay, 2002). Granzim A direktno deluje proapoptotski praveći jednolančane prekide u molekulu DNK (Trapani i Suttom, 2003), dok u mitohondrijama generiše reaktivne kiseonične vrste (engl. Reactive Oxygen Species, ROS) i na taj način dovodi do smrti ciljne ćelije nekrozom (Martinval et et al., 2008; Krzewski i Coligan, 2013). Pored citotoksičnosti koju NK ćelije sprovode posredstvom perforina, NK ćelije mogu da unište ciljne ćelije apopotozom, posredstvom liganda TNF familije receptora (TRAIL) i FasL. Ovi procesi često se odvijaju istovremeno. Vezivanjem TRAIL molekula za TNF receptor kao i FasL molekula za Fas (CD95) dovodi do apototske smrti ciljne ćelije. Značajno je da usled povećane sinteze IFNγ koga izlučuju NK ćelije može doći do povećanja nivoa Fas molekula na ćelijama tumora čime one postaju 26 podložnije lizi od strane NK ćelija (Screpanti et al., 2001). Međutim, maligne ćelije takože mogu da ispoljavaju FasL što može da dovode do apotoze NK ćelija i time do izbegavanja imunskog odgovora (Khar et al., 1998). Stululacije citokinima kao što su IL-2, IL-15 i IFN-α povećavaju nivo TRAIL receptora na NK ćelijama (Smyth et al., 2005). Imunoregulatorna funkcija NK ćelija NK ćelije mogu da sintetišu brojne citokine i hemokine i tako regulišu urođenu i adaptivnu imunuost. U početku je smatrano da isključivo NK ćelije CD56sjajno+ subpopulacije mogu da produkuju citokine, a kasnije je pokazano da i CD56potmulo+ subpopulacija sintetiše citokine neposredno nakon kontakta sa izmenjenom ćelijom (DeMaria et al., 2010). Pored IFNγ koga najviše sintetišu, NK ćelije produkuju i brojne druge pro-inflamatorne citokine kao što su TNF-α, IL-5 i IL-13, imunosupresivne citokine kao što je IL-10 i faktore rasta kao što su GM-CSF i IL-3. NK ćelije sintetišu i brojne β hemokine CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP1-α), CCL4 (MIP1-β), CCL-5 (RANTES) i α hemokine XCL1 (limfoatraktin) i CXCL (IL-8) (Walzer et al., 2005; Viver et al., 2011) kojima utiču na migraciju i drugih ćelija imunskog sistema i posredstvom kojih mogu da u zapaljenskim procesima dospeju u periferna tkiva i stupe u kontakt sa hematopoetskim i antigen prezentujućim ćelijama (Martín-Fontecha et al., 2004; Vivier et al., 2011). Ulogu posrednika između ćelija nespecifične i specifične imunosti, NK ćelije sprovode intereakcijom sa dendritičnim ćelijama. NK ćelije lizirajući tumorske ćelije ostavljaju za sobom ostatke ćelijskih antigena, koji dendritične ćelije prezentuju na svojoj površini i aktiviraju T limfocite. Isto tako, NK ćelije putem citokina koje sintetišu i to prvenstveno IFNγ deluju na T limfocite i na antigen prezentujuće ćelije i stimulišu sintezu Th1 citokina i dovode do aktivacije i sazrevanja monocita i dendritičnih ćelija (Walzer et al., 2005). Aktivirane dendritične ćelije sintetišu citokine od kojih IL-12 direktno indukuje oslobađanje IFNγ iz NK ćelija i aktiviranih T limfocita i indirektno stimuliše razvoj Th1 adaptivnog imunskog odgovora. Pored toga, NK ćelije dodatno stimulišu Th1 odgovor posredstvom IFNγ koji u sinergiji sa T ćelijskim receptorom povećava ekspresiju IL-12 receptora na naivinim CD4+ T ćelijama (Afkirian et al., 2002) i time pospešuje efekat IL-12 (Chijioke i Münz, 2011). 27 NK ćelije mogu da sintetišu i Th2 citokine IL-5 i IL-13 kada su stimulisane sa IL-4. Produkcijom ovih citokina NK ćelije mogu da doprinosu povećanju sinteze antitela na vanćelijske patogene indukujući Th2 ćelije. Pored toga povećana produkcija IL-5 može da dodovede do povećanje nivoa IgE antitela, a time i do alergijske reakcije. Pokazano je da pri infekcijama bakterijskim patogenima u uslovima sistemske inflamacije, stimulacija NK ćelija interleukinom IL-12 produkovanim od strane dendritičnih ćelija dovodi do sinteze IL-10 u NK ćelijama koji deluju antiinflamatorno i inhibira Th1 odgovor (Vivier i Ugolini, 2009; Chambers, 2010). NK-22 subpopulacija NK ćelija U limfoidnim tkivima mukoze digestivnog trakta i u krajnicima ljudi opisana je NK-22 imuoregulatorna subpopulacija NK ćelija koja za razliku od ostalih NK ćelija ne sintetše IFNγ i nije citotoksična. NK-22 ćelije ispoljavaju NKp44 NCR receptor, a slično Th17 T ćelijama i RORγ transkripcioni faktor. Za razliku od ostalih NK ćelija za razvoj ove subpopulacije nije neophodan IL-15, već IL-7. Stimulacijom sa IL-23 koga produkuju dendritične ćelije mukoze digestivnog trakta, NK-22 ćelije sintetišu IL-22, IL-26 i LIF koji se svrstavaju u citokine Th17 familije, ali ne sintetišu IL-17. IL-22 deluje antiinflamtorno stimulišući sintezu IL-10 i štiti epitelijalnu barijeru gastrointestinalnog trakta kao i kože povećanjem nivoa antitpoptotoskih molekula i baktericidnih proteina. Pokazano je da se u Th17 polarizujućim uslovima NK ćelije periferne krvi mogu diferencirati u NK-22 subpopulaciju (Cooper et al., 2009). Memorijske NK ćelije Novija istraživanja su pokazala da NK ćelije mogu da imaju i karakteristike adaptivne imunosti i da mogu da ispoljavaju imunološku memoriju. Memorijska svojstava NK ćelija su prvobitno uočena kod miševa inficiranih CMV kod kojih je pokazano da Ly49H aktivacioni receptora iz grupe c-lektina pokazuje antigensku specifičnost za virusni protein m157, kao i da se Ly49H+ NK ćelije umnožavaju nakon infekcije i pokazuju povećanu citotoksičnu aktivnost i produkciju IFNγ pri ponovnom susretu sa antigenom. Memorijske NK ćelije su nakon virusnih infekcija opisane i kod ljudi pri čemu je ova subpopulacija po fenotipu NKG2C+ NK ćelije (Min-Oo et al., 2013). Imunološka memorija je pokazana i kod NK ćelija miševa deficijentnih za T 28 ćelije u reakciji kontaktne preosetljivosti, pri čemu nakon ponovnog susreta sa haptenom koji je izazvao ovu reakciju NK ćelije ispoljavaju pojačanu citotoksičnost (Paust et al., 2010). Smatra se da je ovo memorijsko svojstvo NK ćelija zavisno od ekspresije mišijih analoga inhibitronih KIR receptora (Ly49C) i MHC I zavisne edukacije NK ćelija, a pokazano je i da memorijske NK ćelije ispoljavaju CXCR6 hemokinski receptor koji dovodi do njihovog nakupljanja u jetri (Paust et al., 2010). U novije vreme i kod NK ćelija aktiviranih sa inflamatornim citokinima IL-1, IL-12, IL-15 i IL-18 koje produkuju antigen prezentujuće ćelije, nakon ponovnih stimulacija pokazana je pojačana produkcija IFNγ kao i proliferacija NK ćelija koje ga produkuju, što takođe predstavlja vid imunološke memorijes (Cooper et al., 2009; Romee et al., 2012; Min-Oo et al., 2013). 1.6 Citokini značajni za razvoj i funkciju NK ćelija Citokini su proteini koje sekretuje veliki broj ćelija kako nespecifične tako i specifične imunosti pod uticajem mikroorganizama i drugih antigena. Citokini vrše ulogu prenosioca međućelijskih signala i imaju važnu ulogu u razvoju, aktivaciji i regulaciji adaptivne i urođene imunosti. Kao pozitivni regulatori razvoja NK ćelija, njihove aktivacije, preživljavanja i efektorskih funkcija značajni su sledeći citokini: IL- 2, IL-15, IL-18, IL-21 i IFN-α. U novije je proučavan efekat IL-23 i IL-27, citokina koji po strukturi i po svojim receptorima pripadaju IL-12 familiji, na aktivnost NK ćelija pri čemu su dobijeni kontroverzni rezultati. Efektorske funkcije NK ćelija su negativno reguisane imunosupresivnim citokinima TGF-β i IL-10 (Zwirner i Domaica, 2010). 1.6.1 Citokini γc familije U citokine γc familije ubrajaju se IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i IL-21. Od ovih citokina za razvoj, sazrevanje i aktivaciju NK ćelija posebno su značajni IL-2 i IL-15. Strukturu ovih citokina čine 4 antiparalelana α heliksa. Receptori svih citokina ove familije sadrže istu γc subjedinicu (CD132). Pored toga što mogu da deluju zajedno i regulišu imunski odgovor i održavaju homeostazu limfnog sistema, svaki od ovih citokina ima i svoja specifična biološka dejstva (Rochman et al., 2009; Meazza et al., 2011). 29 Za razliku od ostalih članova γc familije, IL-2 i IL-15 mogu da se vežu visokim afinitetom za svoje receptore koji se sastoje od 3 subjedinice (lanca) α, β i γ. Ovi receptori se razlikuju u α subjedinici, pa tako IL-2 receptor (IL-2R) ima IL-2Rα (CD25) a IL-15 receptor (IL-15R) IL-15Rα, specifičnu α subjedinicu. Za razliku od α subjedinica koje su specifične za IL-2R i za IL-15R, IL-2/15 Rβ (CD122) i γc subjedinice su zajedničke za IL-2R i IL- 15R (Bamford et al.,1994) (Slika 6). Prenos signala sa IL-2R i IL-15R se odvija putem γc subjedinice koja intereaguje sa JAK-3 (Ghoreschi et al., 2009) kinazom koja fosforiliše specifične molekule aktivatore signalne transdukcije i transkripcije (engl. Signal Transducer and Activator of Transcription, STAT) (O'Shea et al., 2002). Prenos signala sa IL-2R i IL- 15R vrši se najvećim delom posredstvom γc subjedinice i posredovan je uglavnom STAT5 molekulom. Naime, kinaza JAK-3 forsofiliše specifičan tirozin u aminokiselinskom lancu receptora za citokin i formira mesto za vezivanje STAT monomera koji se vezuju za receptorski kompleks preko svojih SH2 domena. Fosforililisani STAT moleukuli formiraju dimere koji odlaze u jedro i vezuju se za promotore gena čiju transkripciju regulišu. γc lanac receptora i JAK-3 su neophodni za funkciju svih receptora γc familije citokina, a mutacije u njihovim genima su pogubne za razvoj ćelija imunskog sitema i dovode do deficijencije T, B i NK ćelija kod miševa i ljudi (Gilmour et al., 2001; Buckley, 2004). Pokazano je da γc subjedinica receptora pored STAT5 molekula aktivira i Syk i Zap-70 tirozin kinaze kao i Ras/Raf/MEK/MAPK signalni put. IL-2/15Rβ subjedinica, pak, aktivira JAK-1 kinazu koja, pored STAT5 može da fosforiliše i da aktivira STAT3 i STAT1 signalne molekule, kao i Src familiju kinaza (Lck, Fyn i Lyn), Ras/Raf/MEK /MAPK i PI3K/Akt signalne puteve i da indukuje ekspresiju c-Fos, C-Jun, NF-κB transkripcionih faktora (O'Shea et al., 2002; Ghoreschi et al.; 2009, Jakobisiak et al., 2011). IL-2 i IL-15 ispoljavaju slična biološka dejstva s obzirom da oba citokina imaju zajedničke dve (IL-2Rβ i γc) od ukupno 3 subjedinice receptora kao i da dele istu signalnu putanju. Oba citokina stimulišu proliferaciju, preživljavanje i funkciju NK ćelija i aktiviranih T i B ćelija. Ipak, svaki od ova dva citokina ispoljava svoja specifična dejstva koja su uslovljena njihovom sintezom u različitim tipovima ćelija, 30 različitom regulacijom sinteze, različitom rasprostranjenošću, a prvenstveno funkcionalno različitim IL-2Rα i IL-15Rα subjedinicama (Meazza et al., 2011). Slika 6. Receptori za IL-2 i IL-15. Vezivanje interleukina IL-2 za visokoafinitetni IL- 2Rαβγ receptor na ciljnoj ćeliji i vezivanje IL-15 trans prezentovanog na IL-15Rα subjedinici antigen prezentujuće ćelije za IL-15Rβγ na ciljnoj NK ili T ćeliji (Steel et al., 2012). Pored interleukina IL-2 i IL-15 kao najvažnijih citokina γc familije, za razvoj i funkciju NK ćelija značajan je i IL-21 koji stimuliše preživljavanje i efektorske funkcije NK ćelija. IL-21 sintetišu CD4+ T ćelije u odgovoru na antigensku stimulaciju dendritičnih ćelija tokom adaptivnog imunskog odgovora. Naime, ovaj citokin nakon delovanja interleukina IL-12 i IL-15 koje produkuju dendritične ćelije stimuliše proliferaciju NK ćelija, sintezu IFNγ, ekspresiju preforina i granzima, a time i citotoksičnost NK ćelija. Pored toga IL-21 povećava eskpresiju CD16 receptora na NK ćelijama, a time i ADCC citotoksičnost. IL-21 takođe povećava ekspresiju NKG2D aktivacionog receptora, ali i nekih inhibitornih KIR receptora na NK ćelijama (Zwirner i Domaica, 2010). IL-4, citokin γc familije koji je prvenstveno značajan u razvoju i funkciji Th2 T ćelija, na NK ćelije deluje tako što inhibira njihovu citotoksičnu funkciju, produkciju IFNγ i snižava ekspresiju NKG2D aktivacionog receptora. Pokazano je da IL-4 31 negativno utiče na interakciju NK ćelija sa dendritičnim ćelijama i inhibira Th1, a stimuliše tolerogeni Th2 odgovor. Za razliku od prethodno opisanih citokina γc familije koji uglavnom regulišu imunski odgovor, IL-7 ima važnu ulogu u održavanju homeostaze i u razvoju imunskog sitema. IL-7 reguliše razvoj NK ćelija u timusu i ima centralnu ulogu u razvoju NK-22 subpopulacije u krajnicima i limfoidnim tkivima mokoze creva (Meazza et al., 2011). IL-2 IL-2 je prvi citokin iz γc familije koji je detaljno proučen. Otkriven je 1965. godine i opisan kao faktor rasta T ćelija da bi kasnije bila pokazana i ostala njegova svojstva (Kasakura i Lowenstein, 1965; Gordon i MacLean, 1965; Smith, 2006). Humani IL-2 je mali globularni protein mase 15.5 KD i sastoji se od 133 aminokiseline. Po svojoj strukturi IL-2 je tipičan tip I citokin. Sintetišu ga uglavnom T limfociti pri čemu su glavni izvor ovog citokina aktivirani CD4+ T limfociti, a najviše Th1 limfociti nakon CD4+ diferencijacije. Takođe, određenu, znatno manju količinu sekretuju i aktivirani CD8+ limfociti, dok B limfociti i dendritične ćelije produkuju veoma male količine ovog interleukina (Liao et al., 2013). IL-2 deluje posredstvom receptora sačinjenog od 3 nekovalentno vezana lanca- subjedinice (α, β i γ). U zavisnosti od toga koje subjedinice ulaze u njegov sastav postoje tri vrste IL-2 receptora. α subjedinica (IL-2Rα) najčešće nije prisutna na mirujućim T i NK ćelijama, već se može indukovati na T ćelijama stimulacijom TCR kao i na T i NK ćelijama stimulacijom samim interlekinom IL-2. IL-2Rα subjedinica vezuje IL-2 veoma niskim afinitetom. Drugi receptorski kompleks koga čine β i γ subjedinice (IL-2Rβγc) ima srednji afinitet vezivanja liganda i zastupljen je na malom procentu T ćelija i na većini NK ćelija periferne krvi (Tsudo et al.,1987; Meazza et al., 2011). Receptorskih kompleks koji je sastavljen je od sve tri subjedinice (IL-2Rαβγc) vezuje IL-2 visokim afinitetom (Slika 6). Visoko afinitetni IL-2 receptori su prisutni uglavnom na aktiviranim T i na NK ćelijama imunoregulatorne CD3-CD56sjajno+ subpopulacije koje proliferišu i pri niskim, pikomolarnim, koncentracijama ovog citokina (Caligiuri et al.,1990). 32 IL-2Rα subjedinica, bez obzira na to što vezuje svoj ligand slabim afinitetom i ne učestvuje u prenosu signala sa receptora, neophodna je za formiranje visokoafinitetnog trimernog receptorskog kompleksa. Značajno je da se ekspresija IL- 2Rα (CD25) povećava na T ćelijama tokom aktivacije, ali i da ovu subjedinicu konstitutivno ispoljavaju sve imunosupresivne T regulatorne ćelije (Treg) (Itoh et al., 1999) koje imaju ulogu u održavanju periferne tolerancije, a nepoželjno dejstvo u antitumorskom imunskom odgovoru (Malek et al., 2010). IL-2 ispoljava svoja biološka dejstva uglavnom kao slobodan molekul koji se vezuje za svoje receptore srednjeg i visokog afineteta. Noviji podaci ukazuju da IL-2, slično kao i IL-15, može delovati putem trans prezentacije koja podrazumeva da IL-2 koji je vezan za IL-2Rα i to najčešće na ćeliji koja ga sintetiše, se vezuje za IL-2Rβγc na susednoj ćeliji (Wuest et al., 2011). Smatra se da IL-2 deluje putem trans prezentacije samo kada je prisutan u visokim koncentracijama. IL-2Rα lanac, pored toga što je uglavnom prisutan na ćelijskoj membrani, u patološkim stanjima može da se „otkine“ sa membrane i da se nađe u slobodnoj formi kao što je pokazano u infekcijama, u transplantacijama pri odbacivanju kalema, u autoiminskim inflamatornim stanjima i u hematološkim malignitetima. IL-2Rα lanac može da bude prisutan i na plazmacitoidnim dendritičnim ćelijama nakon stilulacije CD40 koreceptora, na mijeloidnim dendritičnim ćelijama nakon stimulacija pomoću TNF-α i porstaglandina E2 i na tumor asociranim dendritičnim ćelijama. Dendritične ćelije na taj način mogu da vezuju IL-2 i time smanje nivo slobodnog interleukina IL-2 raspoloživog za prolifereciju T ćelija i tako deluju imunosupresivno. Pored toga pokazano je i da dendritične ćelije mogu da vezani IL-2 trans prezentuju susednim ćelijama i tako da deluje agonistički (Liu et al., 2013). Ekspresija svakog od tri lanca IL-2R je nazavisno regulisana. Ekspresija IL-2Rα se može indukovati stimulacijm TCR, dejstvom citokina (IL-1, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, TNF-α, TGF-β) i stimulatorima protein kinaze C (Kim et al., 2006). IL-2Rβ subjedinica je prisutna na: NK ćelijama, neaktiviranim T ćelijama, monocitima, neutrofilima, T ćelijama kako nakon stimulacije TCR tako i nakon stimulacija pomoću PMA i interleukina IL-2 i IL-4 (Kim et al., 2006) i na populacijama hematopoetskih ćelija. Kao i IL-2Rβ, γc subjedinica je konstitutivno prisutna na većini limfocita i ostalih leukocita i 33 može da se poveća stimulacijama pomoću IL-2 i IFN-γ, dok TGF-β inhibira njegovu ekspresiju na monocitima (Liu et al., 2013). Nakon vezivanja IL-2 za receptor, kompleks receptor-ligand brzo ulazi u ćeliju, a nakon ulaska u ćeliju IL-2Rα subjedinica recirkuliše i vraća se na površinu ćelije, dok IL-2Rβ i γc subjedinice podležu degradaciji. IL-2 može da dovode do aktivacije nekoliko signalnih puteva. U tom smislu, vezivanje ovog citokina za IL-2Rβγc heterodimer aktivira JAK1 (posredstvom IL-2Rβ) i JAK3 (posredctvom γc). JAK kinaze aktiviraju jedna drugu i fosforilišu tirozin 338 u IL-2Rβ lancu receptora čime je omogućeno vezivanje Shc adaptorskog molekula što zatim dovodi do aktivacije Ras/Raf/MEK/MAPK signalnog puta, a time i do proliferacije i rasta ciljne ćelije. JAK1 kinaza fosforiliše tirozin na 392 i 510 mestu polipeptidnog lanca STAT1, STAT3, STAT5A i STAT5B signalnih molekula i aktivira ih, pri čemu je najviše i najduže aktiviran STAT5 molekul (Lin et al., 2012). Fosforilisani STAT5A i STAT5B molekuli dimerizuju i odlaze u jedro gde se vezuju za promotore gena koji regulišu proliferaciju, diferencijaciju i efektorske funkcije T i NK ćelija. U tom smislu, IL-2 deluje uglavnom kao aktivator transkripcije s obzirom na to da više gena aktivra nego što suprimira. Osim toga što dimerizuju, STAT5 signalni molekuli preko svojih N-terminalnih domena mogu da formiraju tetramere i druge oligomere. Pokazano je da miševi čiji su STAT5 molekuli izmenjni tako da ne mogu da formiraju tertramere imaju smanjen broj CD8+ T i NK ćelija kao i poremećenu ekspresiju gena koje regulišu interleukini IL-2 i IL-15 (Lin et al., 2012; Liao et al., 2013). IL-2 pokazuje veliki broj različitih biološki dejstava od kojih su najbrojnija njegova dejstva na T ćelije. U tim smislu, IL-2 dovodi do aktivacije, proliferacije i diferencijacije CD8+ limfocita i povećava njihovu citotoksičnost posredstvom povećanja sinteze perforina i granzima i stimuliše sekreciju IFN-γ (Pipkin et al., 2012). IL-2 dovodi i do proliferacije mirujućih CD8+ T ćelija koje ispoljavaju IL-2 receptor srednjeg afiniteta i to svoje dejstvo ostvaruje posredstvom STAT5 tetramera (Lin et al., 2012). Takođe, pored naivnih, IL-2 indukuje i proliferaciju memorijskih CD8+ limfocita. IL-2 aktivira CD4+ T ćelije i dovodi do njihove proliferacije posredstvom c-myc i c-fos transkripcionih faktora kao i do oslobađanja citokina iz ovih ćelija. U tom smislu, u prisustvu IL-12, interleukina koji deluje preko STAT4 molekula i povećava ekspresiju 34 svog IL-12Rβ2 receptora (Afkarian et al., 2002), IL-2 posredstvom STAT5 molekula stimuliše sintezu IFN-γ i dovodi do Th1 diferencijacije. Pored toga i sam IL-2 povećava ekspresiju IL-12Rβ2 receptora i time pojačava dejstvo interleukina IL-12 u smeru Th1 diferencijacije (Liao et al., 2012). Međutim, pokazano je i da IL-2 delujući posredstvom STAT5 molekula može da poveća ekspresiju IL-4Rα receptora i samog IL-4 i na taj način stimuliše Th2 diferencijaciju CD4+ T ćelija. Ovakvo dejstvo pokazano je i za interleukine IL-7 i IL-15 koji pripadaju γc familiji (Liao et al., 2008). IL-2 delijue i na B ćelije i stimuliše njihovu proliferaciju kao i sintezu IgE antitela u B ćelijama (Waldmann, 2006). IL-2 ima značajnu ulogu u održavanju homeostaze imunskog sistema time što stimuliše diferncijaciju i funkciju Treg, uvodi T ćelije u post-aktivacionu smrt apoptozom (Rafaeli et al.,1998) povećavajuči ekspresiju FasL na površini aktiviranih T limfocita i povećava ekspresiju citotoksičnog T limfocitnog antigena 4-CTLA4 (engl. Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) koji je antagonista kostimulatornog molekula CD28. Osim dejstva na T ćelije, IL-2 stimuliše proliferaciju NK ćelija i pospešuje njihovu citotoksičnu tzv. "ubilačku", LAK funkciju (engl. Lymphokine Activated Killer). Pored toga, IL-2 sam ili u kombinaciji sa IL-12 i povećava sintezu i oslobađanje citokina IFN-γ, TNF-α i GM-CSF iz aktiviranih NK ćelija. Pokazano je da in vitro stimulacije interleukinom IL-2 dovode do povećanja ekspresije aktivacionog NKG2D receptora na NK ćelijama, a time i do povećanja NK ćelijske citotksičnosti (Konjević et al., 2009). IL-15 IL-15 je otkriven 1994. godine od strane dve nezavisne laboratorije, nepune tri decenije nakon otkrića IL-2. Prvobitno je, kao i IL-2, opisan kao faktor rasta T limfocita (Burton et al., 1994; Grabstein. et al., 1994). Humani IL-15 je glikoprotein mase 14 do 15 KD, a po svojoj strukturi je takođe tip I citokin. IL-15 sintetišu uglavnom antigen prezentujuće ćelije i to najviše dendritične ćelije, monociti, makrofagi, ali i stromalne ćelije kostne srži i sekundarnih limfnih 35 organa (Carson et al.,1995; Jonuleit et al, 1997; Lodolce et al., 1998). iRNK za IL-15 je prisutna i u ćelijama mnogih tkiva fibroblastima, mišićnim ćelijama, keratinocitima, ćelijama bubrega (Jakobisiak et al., 2011), a i u ćelijama tumora koje usled veoma složene regulacije translacije veoma retko sitntetišu funkcionalan IL-15 molekul (Meazza et al., 1996; 2011). Postoje dve forme IL-15 koje se razlikuju u dužini signalne sekvence peptida: sa dužom signalnom sekvencom LSP (engl. Long Signalling Peptide) i sa kraćom signalnom skvencom SSP (engl. short signalling peptide). LPS forma IL-15 se izlučuje van ćelije, dok SSP forma (Tagaya et al., 1997) ostaje u ćeliji i po princupu negativne povratne sprege reguliše transkripciju IL-15 gena (Nashimuri et al., 2005). IL-15 se u veoma niskoj koncentraciji (reda veličine 1 pg/ml) može naći u međućelijskom prostoru i vezati se za visoko-afiniteteni IL-15 receptor. U fiziološkim uslovima najdominatnija forma ovog citokina u organizmu je IL-15 vezan za α lanac svog receptora na ćelijskoj membrani pri čemu formira IL-15/IL-15Rα kompleks, koji zatim biva prepoznat posredstvom komplementarnih hetrodimera βγ lanaca receptora (IL-15Rβγc) na ciljnoj ćeliliji (Slika 6). Ovakav način biološkog dejstva IL-15 vezanog za membranu naziva se trans prezentacija. Značajno je da se IL-15, već u endoplazmatičnom retikulumu ćelije koja ga sintetiše, vezuje za IL-15Rα i nakon toga transportuje na površinu membrane i prezentuje ciljnim ćelijama. Značajno je i da ovaj kompleks može da recirkuliše što omogućava efikasnije dejstvo ovog citokina na susedne ciljne (NK ili T) ćelije (Dubois et al.,2002). Trans prezentovani IL-15 stimuliše diferencijaciju i sazrevanje NK ćelija (Anderson et al., 1995), a pokazano je da pored dendritičnih ćelija i monocita mogu da je vrše i stromalne i epitelijalne ćelije limfoidnih organa (Lucas et al., 2005, Huntington et al., 2009). Delovanjem enzima MMP može doći do otkidanja IL-15Rα lanca sa površine ćelije koji tada kao slobodan molekul može da deluje antagonistički i inhibira dejstvo ovog citokina u IL-15/IL-15Rα kompleksu na susednim ćelijama (Mortier et al., 2004). Pokazano je i da prisutvo solubilnog α lanca korelira sa progresijom tumora (Badoual et al., 2008). Nasuprot ovom antagonističkom dejstvu, rekombinantni IL-15Rα koji sadrži u svom vanćelijskom N terminalnom regionu modifikovan tzv. “suši” domen može da veže slobodan IL-15 izuzetno visokim afinitetom i da deluje kao veoma dobar 36 stimulator funkcije NK i T ćelija (Mortier et al., 2006). U tom smislu, u terapijske svrhe se ispituje i primena solubilnih kompleksa interleukina IL-15 sa rekombinantnom IL- 15Rα∆ formom koji vezuje IL-15 visokim afinetom i koji deluju kao „super-agonisti“ i pojačavaju efekat interleukina IL-15 na ćelije koje ispoljavaju komplementarni IL-15Rβ γc heterodimer (Giron-Michel et al., 2005). Osim delovanja na susedne ćelije trans prezentacijom, IL-15 može da deluje na ćeliju koja ga sintetiše cis prezentacijom tj. vezivanjem IL-15/IL-15Rα kompleksa za IL-2/15Rβγ heterodimer na istoj ćeliji (Olsen et al., 2007). Smatra se da cis prezentovani IL-15 pored uloge u fiziološkim procesima može da učestvuje i u patogenezi limfoproliferativnog poremećaja krupnih granuliranih limfocita koji se odlikuje proliferacijom CD3- i CD3+ neoplastičnih ćelija koje na svojoj površini imaju IL-15 vezan za IL-15Rα (Zambello et al., 1997). Smatra se da ovi maligni klonovi koji ispoljavaju IL-15Rα i proliferišu pod dejstvom interlekina IL-15, mogu da za svoj IL- 15Rα vežu IL-15 iz spoljne sredine i putem cis prezentacije pospeše efekat ovog citokina (Meazza et al., 2011). Nakon vezivanja kompleksa IL-15/IL-15Rα za dimer βγ na ciljnoj ćeliji dolazi do aktivacije STAT signalnih molekula. Naime, β lanac aktivira JAK1, a γ lanac JAK3 kinazu koje dovode do aktivacije STAT3 i STAT5 signalnih molekula. β lanac takođe može da aktivira i Src familiju protein tirozin kinaza, Ras/Raf/MEK i PI3K signalne puteve, a γ lanac Syk/Zap70 familiju protein tirozin kinaza (Jakobisiak et al., 2011). Međutim, pokazano je da sam kompleks IL-15/IL-15Rα može da deluje i recipročno tj. da aktivira procese u ćeliji koja ga ispoljava kao i da tom prilikom aktivira signalne putanje Rho familije (Rac) kinaza i MAPK signalnog puta, kao i da može da aktivira međućelijsku adheziju i sintezu interleukina IL-8 u monocitima (Neely et al.,2004). Pored toga, pokazano je da trans prezentovan IL-15 može i da recipročnom signalnom putanjom dovede do diferencijacije hematopoetskih prekursora NK ćelija u necitotoksične zrele regulatorne NK ćelije (NKireg) koje ispoljavaju imunosupresivni molekul HLA-G. Pokazano je da se ova malobrojna subpopulacija NKp46+HLA-G+IL- 10+ imunosupresivnih NK ćelija nalazi u tkivu placente (Giuliani et al.,2008). 37 IL-15 ispoljava mnogobrojna slična dejstva kao i IL-2. Ima važnu ulogu u razvoju, održavanju homeostaze i funkcije CD8+ T, NK, i NKT ćelija (Kennedy et al., 2000; Lodolce et al., 1998; Waldmann, 2006). IL-15 idukuje proliferaciju naivnih CD8+ i momorijskih CD4+ i CD8+ T ćelija. Pored toga pokazano je i da IL-15 svojim hemotaksičnim dejstvom utiče na migracju T ćelija. Mada ne aktivira mirujuće B ćelije, IL-15 stimuliše proliferaciju aktiviranih B ćelija i zajedno sa CD40L stimuliše sekreciju Ig. Pored toga IL-15 deluje i na ćelije koje ga sintetišu, pa tako tako stimuliše proliferaciju, produkciju citokina, ekspresiju MHC II, C40 i CD86 kostimulatornih molekula i sazrevanje dendritičnih ćelija (Gil et al., 2010). IL-15 aktivira monocite i makrofage, indukuje sintezu hemokina u monocitima i time pospešuje migraciju inflamatornih ćelija i eliminaciju bakterija i parazita (Musso et al., 1998). IL-15 ima posebno važnu ulogu u razvoju i sazrevanju NK ćelija. U tom smislu, kod transgenih miševa je pokazano da nedostatak samog interleukina IL-15 (Kennedy et al., 2000), lanaca njegovih receptora IL-15Rα (Lodolce et al., 1998), IL-2/IL-15Rβ (Suzuki et al., 1997), γc (DiSanto et al., 1997), molekula njegovog signalnog puta JAK- 3 i STAT5 (Park et al., 1995), dovode do gubitka NK ćelija ili do smanjenja njihovog broja. Kod ljudi nisu opisane mutacije koje dovode do deficijencije IL-15Rα, dok mutacije u genima za JAK-3, kao i za IL2/IL-15Rβ i γc subjedinice zajedničke za IL-2 i IL-15 receptore, onemogućavaju razviće NK ćelija ili dovode do smanjenja njihovog broja (Buckley, 2004). Pored toga što reguliše razvoj NK ćelija, IL-15 stimuliše i sintezu citotoksičnih medijatora perforina i granzima B, a time i NK ćelijsku citotoksičnu funkciju (Fehniger et al., 2007). Za razliku od IL-2 koji uvodi aktivirane T ćelije u apoptozu, IL-15 inhibira apoptozu ne samo T već i ostalih limfocitnih subpopulacija i granulocita povećavajući ekspresiju antiapoptoskih molekula (Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1), a snižavajući ekspresiju apoptotskih molekula (Bax, Bad, Bid) Bcl-2 familije (Huntington et al., 2007). IL-15 deluje antiapoptotski i stimulacijom aktivnosti NF-κB i inhibicijom kaspaza -3 i -8 (Bouchard et al., 2004). Pored dejstva na ćelije imunskog sistema, IL-15 utiče i na druge tipove ćelija kao što su adipociti, miociti, andotelijalne i nervne ćelje. U tom smislu, IL-15 deluje 38 anabolički na mišićne ćelije kod kojih pospešuje sintezu kontraktilnih proteina i diferencijaciju, pospešuje angiogenezu i rast mikroglije (Budagian et al., 2006). S obzirom da stimuliše proliferaciju i sprečava apoptozu NK, T i B ćelija, IL-15 može da ima ulogu u patogenezi hematoloških maligniteta što je i pokazano kod T ćelijskih leukemija i limfoma, kod miševa (Sato et al., 2011). Isto tako pokazano je da IL-15 može da utiče na preživljavanje malignih klonova i u tom smislu povećana ekspresija IL-15 u ćelijama akutne limfoblastne leukemije dovodi do lošijeg preživljavanja obolelih (Wu et al., 2010). U novije vreme pokazano da membranski interleukin IL-15 u IL-15/IL-15Rα kompleksu vezivanjem za slobodni IL-15Rα lanac stimuliše epitelijalno-mezenhimsku tranziciju u patogenizi karcinoma bubrega (Khawam et al., 2009). U tom smislu na ćelijama karcinoma bubrega, tokom maligne transformacije dolazi do gubitka γ lanca IL-15R i JAK3 kinaze kao i da može doći i do fuzionisanja α i β lanca IL-15R u αβ dimer koji pri fiziološkim koncentracijama citokina IL-15 smanjuje ekspresiju E katherina i time stimuliše epitelijalno mezenhimsku tranziciju (Giron-Michel et al., 2012). 1.6.2 Imunosupresivni citokini Citotksična aktivnost NK ćelija u fizološkim uslovima regulisana tako da ne dođe do oštećenja zdravih tkiva u oraganizmu pri čemu centralnu ulogu u negativnoj regulaciji NK ćelija imaju citokini TGF-β i IL-10. Međutim, za razliku od fizioloških uslova ovi citokini inhibicijom efektorskih funkcija NK ćelija imaju nepoželjno dejstvo u tumorima. TGF-β je familija pleiotropnih imunosupresivnih citokina koju čini nekoliko veoma sličnih formi (TGF-β1, -β2 i -β3) koje ispoljavaju isto inhibitorno dejstvo na proliferaciju i aktivaciju limfocita i ostalih leukocita, a pored toga stimulišu i rast tumora. Najveći izvori TGF-β su Treg i mijeloidne supresivne ćelije (Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSC), a sintetišu ga i maligne ćelije. Najzastupljenija forma je TGF-β1 koju sintetišu ćelije imunskog sitema. TGF-β deluje imunosupresivno na NK ćelije tako što inhibira njihovu proliferaciju, citotoksičnu funkciju, a takođe i sintezu IFNγ. TGF-β deluje na NK ćelije kada je vezan za membranu ćelija koje ga sintetišu i snižava ekspersiju NKp30 i NKG2D aktivacionih receptora, receptora za IFNα, CD25 39 (IL-2Rα) (Flavell et al., 2010). Ovaj citokin pored toga što direktno inhibira signalni put NKG2D receptora, snižava i nivo NKG2DL na tumorskim ćelijama (Allan et al., 2010). Pored toga, sam TGF-β delujući zajedno sa IL-21 stimuliše diferencijaciju Treg, a samim tim i sopstvenu sintezu (Zwirner i Domaica, 2010). IL-10 je tip II citokin značajan po svom antiinflamantornom dejstvu. Ovaj citokin ispoljava svoje imunosupresivno dejstvo delujući na aktivirane makrofage i dendritične ćelije. IL-10 produkuju maligne ćelije, tumor asocirani makrofagi (TAM), Treg, a pored njih i same NK ćelije kada je njihov inhibitorna forma NKp30c receptora stimulisana kontaktom sa nezrelom dendritičnom ćelijom (Delahaye et al., 2012; Schiavoni et al., 2013) i u hroninim inflamatornim stanjima pri bakterijskim i virusnim infekcijama (Vivier i Ugolini, 2009). IL-10 ne inhibira efektorske funkcije NK ćelija direktno, već putem inhibicije sinteze citokina IL-12, IL-15 i IL-18 u antigen prezentujućim ćelijama što u organizmu sprečava prekomernu aktivaciju NK ćelija i doprinosi održavanju njihove homeostaze (Zwirner i Domaica, 2010). 1.7 Melanom Melanom je maligni tumor melanocita, pigmentnih ćelija koje vode poreklo od neuroektodermalnih ćelija neuralne kreste i tokom embrionalnog razvoja migriraju u bazalni sloj epidermisa. Melanom je i veoma agresivan tumor sa visokim metastatskim potencijalom usled visoke pokretljivosti ćelija od kojh melanocite vode embrionalno poreklo (Gray-Schopfer et al., 2007). Melanom je prvenstveno tumor kože, ali se može naći i na očima, ušima, leptomeningeama, sluznicama gastrointestinalnog i genitourinarnog trakta. Bez obzira na zaštitnu ulogu koje melanocite imaju u koži u odnosu na ultravioletno (UV) zračenje, dosadašnje epidemiološke studije pokazuju da melanom kože predstavlja tumor kože sa najlošijom prognozom preživljavanja i da čini 75% svih umrlih od karcinoma kože (Garbe i Leiter, 2009). Proces maligne transformacije normalnih melanocita je veoma složen i uključuje brojne mutacije u genima koji regulišu proliferaciju, diferencijaciju i apoptozu kao i mutageno dejstvo UV zračenja. Proces patogeneze melanoma je multifaktorijalan, a faktori rizika su pre svega, preterana izloženost sunčevim zracima naročito u mlađem životnom dobu, fenotipske karakteristike same osobe kao što je svetao ten, pozitivna 40 porodična anamneza za melanom i druge karcinome kože, kao i postojanje tzv. prekursorskih pigmentnih lezija kod same osobe. Postoji pet kliničkopatoloških tipova melanoma kože. Najčešćca forma je površinsko šireći melanom koji čini oko 70% obolelih, a sledeći po učestalosti je nodularni melanom koji se odlukuje lošijom prognozom preživljavanja. Poseban oblik nodularnog tipa melanoma je amelatonični mlanonom koji je agresivniji i karakteriše ga odsustvo melanina. Treći tip melanoma po učestalosti (5 do 10% ) je lentigo melanom i obično se javlja na regijama kože koje su izložene suncu kao što su lice i vrat i ima bolju prognozu lečenja. Akralni lentiginozni melanom je najređa forma melanoma a ujedno i jedini tip melanoma koji se javlja u pripadnika bele i u crne rase. Tipična lokalizacija ove forme melanoma su dlanovi, tabani i podnokatna regija. Mukozno lentiginozni melanom se javlja u svega oko 3% u odnosu na sve melanome pojavljujući se najcešce na epitelnim mukozama respiratornog, gastrointestinalnog i genitourinarnog trakta kao i na bilo kojoj mukoznoj površini uključujući i konjuktive i svrstava se u izuzetno agresivnu formu melanoma. Debljina tumora je najznačajniji klinički prognostički faktor kod bolesnika sa primarnim melanomom kože. U tom smislu, kod melanoma kože na osnovu histopatološke analize određuju se klinički parametri koji opisuju invazivnost tumora: Klark klinički prametar koji ukazuje na nivo anatomsko-histološke invazije tumora u slojeve kože (epidermis, dermis, i subcutis) (Clark et al., 1969) i Breslow klinički parametar koji je uveden godinu dana kasnije i označava debljinu primarnog tumora u mm (Breslow, 1970). Pored kliničkih parametara koji opisuju debljinu tumora epidemiološka istraživanja su ukazala i na značaj lokalizacije primarnog tumora za prognozu toka bolesti. Prema TNM (engl. Tumor-Node-Metastasis) sistemu klasifikacije koji se najviše primenjuje u svetu, a koji je 2002. godine ustanovilo Američko udruženje za rak-AJCC (engl. American Joint Committee on Cancer Staging) kod melanoma su ustanovljena IV klinička stadijuma. Prema ovom sistemu prognoza melanoma prvenstveno zavisi od debljine primarnog tumora. Debljina tumora do 1mm označava I, a preko toga II klinički stadijum, dok metastaze u tegionalnim limfnim čvorovima označavaju III a udaljene metastaze IV klinički stadijum. Kada se govori o primarnom melanomu veoma značajni negativni prognostički faktori su visok mitotski indeks, nepostojanje tumor 41 infiltrišućih limfocita-TIL (engl. Tumor-Infiltrating Lymphocytes), postojanje patološke regresije tumora, ulceracija primarne lezije, lokalizacija primarne lezije na glavi, vratu ili leđima kao i muški pol (Garbe i Leiter, 2009). Ispitivanja iz oblasti molekularne onkologije pokazala su značajnu ulogu prekomerne aktivacije Ras/Raf/MEK/MAPK signalnog puta u procesu maligne transformacije melanocita. Ovaj signalni put se aktivira pod uticajem faktora rasta posredstvom receptorskih tirozin kinaza i stimuliše proliferaciju i preživljavanje ćelija, a konstitutivno je aktivan kod oko 90% malenoma. Dva najčešća načina aktivacije MAPK signalnog puta u melanomu su mutacije u B-Raf genu (40% do 60%) i N-Ras onkogenu (15% do 30% tumora) (Chapman et al., 2011). Ova saznanja našla su svoju terapijsku primenu, te se u lečenju bolesnika sa B-Raf mutacijom usprešno primenjuje B-Raf inhibitor sorafenib. S obzirom na to da može doći do pojave rezistencije na B-Raf inhibitor u novije vreme uz ovaj inhibitor se primenjuju i molekularni terapeutici koji inhibiraju nizvodne komponente MAPK signalnog puta od kojih je MEK inhibitor pokazao dobar terapijski efkat (Cifola et al., 2013). U ćelijama melanoma takođe može doći i do konstitutivne aktivacije PI3K/Akt/mTOR signaling puta u kome su najčešće mutirani Akt kinaza i mTOR serin/treonin kinaza koji fosforililacijom brojnih supstrata stimulišu proliferaciju, preživljavanje i metastaziranje. Osim navedenih mutacija u 30% do 60% melanoma je nađena delecija PTEN tumor supresora, specifične fosfataze koja defosforilacijom PIP3 poništava dejstvo PI3K (Monzon i Dancey, 2012). U ćelijama melanoma nađene su i aktivacione mutacije u genima za receptor faktora rasta c-Kit (CD117) i u genu za ciklin zavisnu kinazu 4 (CDK4) koje koegzistiraju sa mutacijama u genu za MEK kinazu MAPK signalnog puta (Posch i Ortiz-Urda, 2013). 1.7.1 Melanom i imunski odgovor Postoji više svojstava melanoma na osnovu kojih se on može smatrati imunogeničnim tumorom. Identifikovani su brojni melanoma specifični antigeni (Barrow et al., 2006), a pokazani su i slučajevi spontane regresije ovog tumora (Kalialis et al., 2009). Na imunogeničnost melanoma ukazuje i postojanje TIL u tumorskom tkivu što predstavlja pozitivan prognostički faktor kod obolelih od melanoma (Cipponi et al., 2011). Pored toga, u melanomskom tumorskom tkivu prisutne su i brojne tumor 42 infiltrišuće dendritične ćelije koje su najčešće mijeloidenog, a ređe plazmacitoidnog tipa i koje prezentuju tumorske antigene naivnim T limfocitima (Gerlini et al., 2013; Schiavoni et al., 2013). U uznapredovalim stadijumima bolesti nađena i visoka zastupljenost memorijskih CD8+ cirkulišućih T limfocita specifičnih za Melan- A/MART-1, MAGE-10 i NY-ESO-12 melanomske antigene (Fuertes et al., 2011). S obzirom na imunogenična svojstva melanoma ispitivana je primena različitih imunoterapijskih pristupa zasnovanih na antigen-specifičnoj, kao i na nespecifično,j imunostimulaciji i na adoptivnom transferu T ćelija aktiviranih melanoma specifičnim antigenima (Umansky i Sevko, 2012). Međutim, u melanomu dolazi i do imunosupresije koja je uslovljena različitim mehanizmima koji obuhvataju kako promene na ćelijama tumora tako i promene u stromalnim ćelijama. Pokazano je da na ćelijama melanoma dolazi do gubitka kostimulatornih molekula kao što su molekuli B7 familije, smanjenja ekspresije tumorskih antigena, MHC molekula klase I i liganda za aktivacione NK ćelijske receptore, a pored toga u ćelijama melanoma je pokazana i intenzivna sekrecija imunosupresivnih molekula kao što su TGF-β i IL-10, angiogenog faktora (engl.Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF), biološki aktivnih molekula kao što su azot oksid (NO), ROS i prostaglandina E2 (PGE2) (Umansky i Sevko, 2012). Mada su hemokini prvobitno opisani kao faktori koji utiču prvenstveno na migraciju limfocita, pokazano je da mogu da regulišu rast tumora, angiogenezu, metastaziranje i migraciju ćelija u tumorskom okruženju, a pored toga i da mogu da ih sintetišu ćelije tumora (Telmadge, 2011). U tom smislu, pokazano je i da ćelije melanoma sintetišu brojne β (CCL2, CCL5) i α (CXCL1-3,5-8, 10) hemokine (Richmond i Yang, 2009). Isto tako, ćelije melanoma ovime mogu da stimulišu sintezu hemokina (CCL2, CXCL8 i CXCL12), TGF-β i inflamatornih citokina (IL-1, IL-6, IL-8) u okolnim fibroblatima i stromalnim ćelijama koje zatim stimulišu sintezu hemokina u ćelijama tumora što rezultuje autorkilnom stimulacijom rasta tumora (Umansky i Sevko, 2012). Naime, Ras/Raf signalni put koji je veoma često konstitutivno aktiviran u ćelijama melanoma, posredstvom NF-κB transkripcionog faktora indukuje produkciju hemokina i drugih proinflamatornih medijatora kao što su TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, ciklooksigenaze, kao i produkciju MMP i VEGF i da na taj način stimuliše progresiju tumora. Prisustvo ovih faktora u tumorskom tkivu dovodi do nakupljanja imunosupresivnih ćelija kao što su 43 MDSC, Treg, tumor asocirani makrofagi (TAM), N2 polarizovani neutrofili i regulatorne/tolerogene dendritične ćelije (Gabrilovich i Nagaraj, 2009; Umansky i Sveko, 2012). MDSC produkuju NO, s imaju pojačanu aktivnost arginaze i time inhibiraju funkciju T ćelija i uvode ih u apoptozu, a posredtvom sinteze IL-10 i TGF-β aktiviraju Treg dok je sinteza IL-12 u dendritičnim ćelijama snižena i time suprimirana aktivnost T i NK ćelija (Umansky, 2012; 2013). U uznapredovalim kliničkim stadijumima melanoma u perifernoj krvi kao i u tumori-infiltrisanim limfnim čvorovima obolelih pokazan je da povećan nivo TGF-β i IL-10 dovodi do povećanja ekspresije inhibitornih molekula na T, a ređe i na NK ćelijama (Kubica i Brewer, 2012). Na T ćelijama bolesnika sa melanomom pokazana je povećana ekspresija citotoksičnog T limfocitni antigena-4 (CTLA-4) svojstvenog funkcionalno iscrpljenim T ćelijama koji inhibitora njihovu funkciju sprečavajući vezivanje CD28 molekula za B7 kostimulatorne molekule na antigen prezentujućim ćelijama kao i aktivaciju TCR-a. Primena monoklonskog antitela koje sprečava interaciju CTLA-4 sa B7 sprečava ovaj negativni signal i indukuje antitumorski imunski odgovor. Promena IgG1 monoklonskog anti-CTLA-4 antitela (ipilimumab) je pokazala dobar terapijski efekat kod metastatskog melanoma. Najnoviji podaci ukazuju da CTLA-4 antigen može biti ispoljen i na ćelijskim linjama melanoma. U tom smislu, primena anti-CTLA-4 antitela čiji Fc fragment stimulipe ADCC citotoksičnost NK ćelija doprinosi uništavanju ovih malignih ćelija (Laurent et al., 2013). Na tumor infiltrišućim i cirkulišućim antigen specifičnim T ćelijama, a ređe i na NK ćelijama, kod melanoma je pokazana i povećana ekspresija imunisupresivnog PD-1 molekula koji vezivanjem za PD-1 ligand dovodi do apoptoze ovih ćelija. Ovo saznanje je doprinelo uvođenju blokirajućeg anti-PD-1 antitela u imunoterapiju melanoma (Lipson, 2013). Na T ćelijama bolesnika sa melanomom je pokazana i povećana ekspresija i T ćelijskog Ig mucina 3 (TIM3) inhibitornog molekula koji u fiziološkim uslovima terminalno diferencirane Th1 CD4+ i CD8+ T ćelije vezivanjem e za galektin-9 uvodi T ćelije u apotozu (Sakuishi et al., 2013). Za imunost u melanomu posebno su značajne NK ćelije kako zbog toga što mogu da direktno unište tumorske ćelije putem citotoksičnosti i produkiju citokine, tako i zbog njihove sposobnosti da ubijaju tolerogene dendritične ćelije (engl. DC editing) (Morrandi et al., 2012). Citotoksična aktivnost NK ćelija periferne krvi ispitivana je kod 44 mnogih maligniteta, a kod melanoma je pokazano njeno smanjenje u uznapredovalim kliničkim stadijumima (Sibbitt et al., 1984; Seidel et al., 1998; Konjevic et al., 2007; 2009). Uz smanjenu citotoksičnu aktivnost kod bolesnika sa metastatskim melanomom, pokazana je i smanjena produkcija IFNγ u NK ćelijama u odnosu na zdrave kontrolne osobe (Konjević et al., 2007; 2009). U perifernoj krvi bolesnika sa metastatskim melanomom pokazana je veća zastupljenost nezrele CD56sjajno+, a smanjenje zrele citotoksične CD56potmuo+ subpopulacije NK ćelija u odnosu na perifernu krv zdravih osoba (Konjević et al., 2009). Pokazana je važna uloga ekspresije NKG2D, CD16, DNAM-1, NKp46, NKp30 aktivacionih receptora na NK ćelijama u antitumorskoj imunosti (Levy et al., 2011), a smanjenje ekspresije NKG2D aktivacionog receptora kod obolelih od metastatskog melanoma korelisano je sa njihovom sniženom citotoksičnošću (Konjević et al., 2010). Takođe je u eksperimentalnim uslovima na miševima pokazano da imunosupresivni molekuli koji su prisutni u tumorskoj mikrosredini (TGF-β, indoleamin 2,3-dioksigenaza i PGE2) dovode do smanjenja nivoa aktivacionih NK ćelijskih receptora NKp30, NKp44, i NKG2D kao i do snižene citotoksične funkcije NK ćelija (Pietra et al., 2012). Pored toga što ćelije melanoma modifikuju funkciju i fenotip NK ćelija pokazano da NK ćelije kultivisane sa ćelijama melanoma produkcijom IFNγ dovode do povećanja ekspresije MHC molekula kalse I (Balsamo et al., 2012) kao i do sniženja nivoa NKG2DL (Schwinn et al., 2009) na ćelijama tumora, što doprinosi stvaranju NK- rezistentnog fenotipa timora. Pokazano je da IFNγ povećanjem sinteze PGE2 suprimira NK ćelijsku citotoksičnost tako što snižava ekspresiju aktivacionih NKG2D i NCR receptora te predstavlja loš prognostički parametar kod obolesnika sa malignitetima. Kao još jedno imunosupresivno dejstvo ne samo IFNγ, već i ostalih medijatora koje sintetišu NK ćelije (GM-CSF i IL-10), javlja se i povećavanje nivoa imunosupresivnog HLA-G molekula na malignim ćelijama. Naime, HLA-G, neklasični MHC I molekul, svojim vezivanjem za inhibitorni ILT-2 receptor iz grupe LIR receptora na NK ćelijama povećava prag aktivacije NK ćelija, a pored toga može da uvede NK ćeliju u apoptozu (Stojanović et al., 2012). Pored toga, HLA-G molekul može da sa membrane antigen prezentujuće ćelije pređe na NK ćeliju stvarajući na taj način HLA-G+ NK ćeliju sa regulatornom funkcijom (Rouas-Freiss et al., 2007). 45 1.7.2 Terapija melanoma Pored hirurške terapije koja predstavlja osnovni vid lečenja melanoma, kod metastatskih melanoma i kod obolelih sa visokim rizikom za pojavu metastaza primenjuje se i adjuvantna terapija. Melanom je maligni tumor neosetljiv na zračenje i slabo osetljiv na hemioterapiju usled niskog stepena kako spontane apotoze tako i apoptoze indukovane dejstvom hemioterapijskih agenasa maligno transformisanih melanocita (Gray-Shopfer et al., 2007). Kao zvanični hemioterapeutik u lečenju metastatskog melanoma koji je prihvaćen od strane Američke administracije za hranu i lekove-FDA (engl. the Food and Drug Administration), je alkilirajuči agens dakarbazin (DTIC). Međutim, pokazani klinički odgovor ovog hemioterapiutika je manji od 10% (Monzon i Dancey, 2012). Osim hemioterapije, kako uz hemioterapiju tako i samostalno se primenjuje i nespecifična imunoterapija citokinima kao i specifična imunoterapija terapijskim vakcinama. Postoji i relativno nov podatak da hemioterapeutik DTIC povećava ekpsresiju NKG2DL na ćelijama melanoma (Hervieu et al., 2012) što doprinosi boljem terapijskom efektu pri istovremenoj primeni ovog hemioterapeutika i citokina koji stimulišu ekspresiju NKG2D aktivacionog receptora na NK i T ćelijama. U imunoterapiji melanoma se kod visoko-rizičnih bolesnika u visokim dozama primenjuje IFN-α, a pokazan je i povoljan efekat ovog citokina na citotoksičnu aktivnost NK ćelija (Konjević et al. 2007, Jiang et al., 2013). U lečenju bolesnika sa metastatskim melanomom kao zvanični terapeutik, prihvaćen od strane FDA, se primenjuje IL-2 u visokim dozama. Dugogodičnja primena ovog citokina pokazala rekativno nizak klinički odgovor od 16% kao i da kod 6% bolesnika dovodi do kompletne ili dugotrajne remisije (Monzon i Dancey, 2012). Međutim, ozbiljan problem u primeni ove terapije predstavlja velika toksičnost interleukina IL-2. Iz tog razloga se danas u mnogim pretkliničkim i kliničkim studijama IL-2 u nižim dozama kombinuje sa drugim citokinima (IFN-α, IL-12, IL-18), monoklonskim antitelima, pepetidnim vakcinama. Pored IL-2 i mnogi citokini novije generacije (IL-12, IL-15 i IL-18) se još uvek ispituju kako samostalno tako i u kombinacijama (IL-12 i IL-15; IL-12 i IL-18) (Capitini et al., 2009; Fewkes i Mackall, 2010). 46 Kliničkom primenom rekombinantnog humanog IL-2 (rhIL-2), kako samostalnog tako i sa LAK ćelijama, pokazano je da aktivacijom imunskog sistema može doći do smanjenja tumora čak i kod uznapredovale bolesti (Atkins et al.,1999). U tom smislu, IL-2 predstavlja prekretnicu u imunoterapiji malignih bolesti i više od dve decenije se primenjuje u lečenju metastatskog melanoma i karcinoma bubrega. Poželjno terapijsko dejstvo ovog citokina kod tumora zasniva se na povećanju citotoksične funkcije NK i CD8+ T ćelija, povećanju proliferacije memorijskih CD8+ i proliferacije i aktivacije CD4+ T ćelija. IL-2 dovodi i do proliferacije imunoregulatorne CD56sjajno+ subopopulacije NK ćelija koja ispoljava visokoafinitetni trimerni receptor IL2Rαβγ i odgovorna je za sintezu citokina TNF-α i IFNγ. Kao nepoželjno dejstvo interleukina IL- 2, pored visoke sistemske toksičnosti, je i povećanje broja imunosupresivnih Treg (Atkins et al., 1999). Istraživanja u oblasti imunoterapije tumora razvijala su se u smeru ipitivanja dejstava novih rekombinantnih citokina koji bi se pokazali što bolje antitumorsko dejstvo, a što manje neželjenih dejstava na sisteme organa i što nižu toksičnost (Capitini et al., 2009; Fewkes i Mackall, 2010). S obzirom da za razliku od IL-2, IL-15 ne stimuliše Treg i s obzirom na njegovu nižu sistemsku toksičnost u odnosu na IL-2 pokazanu na mišijim modelima (Munger et al., 1995, Meazza et al., 2011), IL-15 se smatra dobrim potencijalnim kandidatom za primenu u terapiji ne samo melanoma već malignih tumora uopšte. IL-15 aktivira brojne antitumorske mehanizme od kojih je najvažnija citotoksična aktivnost CD8+ T i NK ćelija, a stimuliše i diferencijaciju, proliferacju i preživljavanje ovih ćelija. Pored toga IL-15 ima ulogu i u održavanju homeostaze plazmacitoidnih dendritičnih ćelija koje produkuju IFN tipa I i na taj način stimulišu antitumorsku citotoksičnost NK ćelija. Antitumorski efekat IL-15 se ispoljava i kroz stimulaciju produkcije TNF-α i IFNγ (Avice et al., 1998; Comes et al., 2002; Jakobisiak et al., 2011). Pokazano je da transfekcija IL-15 u trajne tumorske ćelijske linije smanjuje sposobnost ovih ćelija da generišu tumore u eksperimentalnim životinjama (Meazza et al., 2000). Najveći biološki efekat u organizmu IL-15 ostvaruje kada je vezan za α lanac IL-15R na dendritičnim ćelijama pa se stoga u toj formi ispituje i terapijska primena ovog citokina. U tom smislu je kod melanoma na eksperimentalnim modelima pokazan izražen antitumorski efekat IL-15/IL-15Rα kompleksa u fromi kada je konjugovan sa 47 IgG1 antitelom koje svojim Fc fragmentom stimuliše ADCC aktivnost NK ćelija, a time dovodi i do efikasnijeg uništavanja malignih ćelija (Epardaud et al., 2008; Bessard et al., 2009). Da bi se postigao veći afinitet vezivanja IL-15 za za IL-15Rβγ subjedinicu receptora na ciljnoj ćeliji, a time i bolji biološki efekat ispitvane su i forme IL-15 različitih aminokiselinskih sekvenci. U tom smislu, veći afinitet vezivanja IL-15 za za IL-15Rβγ subjedinicu na ciljnoj ćeliji postignut je zamenom asparagina na 72 poziciji u polipeptidnom lancu IL-15 čime se biološka aktivnost IL-15 petostruko povećava (Zhu et al., 2009). In vivo ispitivanja vršena na primatima pokazala su da IL-15 dovodi do povećanja procenta tumorocidnih NK i CD8+ T ćelija (Lugli et al., 2010), dok se primena ovog citokina na bolesnicima sa metastatskim melanomom i karcinomom bubrega još uvek ispituje. U kliničkim studijama poslednjih godina ispituje se primena IL-15 kod pedijatrijskih sarkoma kako samostalno, tako i kao stimulatora TIL ćelija koje se nakon in vitro aktivacije ovim citokinom primenjuju u terapiji (Meazza et al., 2011; Steel et al., 2012). Pored toga, ispitivana je primena IL-15 kod melanoma kao dodatka imunoterapijskim vakcinama sa dendritičnim ćelijama s obzirom na njegovo svojstvo da stimuliše ekspresiju MHC molekula klase II, CD40 i CD86 kostimulatornih molekula na dendritičnim ćelijama (Steel et al., 2012). Terapijska primena IL-15 ispitivana je i u kombinaciji sa drugim citokinima. U tom smilslu, IL-15 primenjen istovremeno sa IL-21 se pokazao kao dobar in vitro stimulator citotoksičnosti i produkcije IFNγ u TIL obolelih od melanoma (Huarte et al., 2009), a njegovom in vivo primenom istovremenom sa IL-12 na mišijim modelima melanoma takođe je dobijeno povećanje NK ćelijske citotoksičnosti i produkcije IFNγ (Jakobisiak et al., 2011). IL-15 ispoljava i neželjena dejstva koja mogu da budu uzrokovana povećanom sintezom proinflamatornih hemokina icitokina kao što su TNF-α, IL-1, IL-6 i GM-CSF, a isto tako i aktivacijom auto-reaktivnih T ćelija koja dovodi do autoimunskih reakcija. Smatra se da autoimunskom dejstvu IL-15 doprinosi i njegov antiapoptotski efekat s obzirom na to da apoptoza može biti jedan od perifernih mehanizama sprečavanja autoimunosti (Jakobisiak et al., 2011). 48 Primena adoptivnog transfera NK ćelija u terapiji se sve intenzivnije ispituje kako kod hematoloških tako i kod solidnih malignteta. Kod hematoloških maligniteta, a posebno kod akutne mijeloine leukemije i mijelodisplastičnog sindroma, adoptivni transfer NK ćelija donora različitih MHC molekulima klase I u odnosu na primaoca se pokazao veoma uspešnim (Giebel et al., 2003; Hsu et al., 2005). U ovakvim uslovima, koji se označavaju kao “KIR missmatch" transplantacija, pospešena je eliminacija malignih klonova usled nepodudarnosti MHC I liganda na ćelijama tumora primaoca i inhibitornog KIR-a na NK ćelijama donora. Ovakav vid adoptivnog transfera NK ćelija je ispitivan i kod melanoma u in vitro pretkliničkim ispitivanjima, pri čemu je primena alogenih NK ćelija in vitro stimulisanih interleukinom IL-2 takođe pokazala veću citotoksičnost prema ćelijama melanoma u uslovima kada se MHC I profil donora ne podudara sa MHC I profilom tumora (Besser et al., 2013). Međutim, za sada kod melanoma klinička primena autolognih NK ćelija koje su u in vitro uslovima stimulisane sa IL-2 nije dovela do poželjnog terapijskog ishoda (Parkhurst et al., 2011). Radi poboljšanja citotoksičnog dejstva NK ćelija prema tumoru u adoptivnom transferu NK ćelija korišćene su NK ćelije donora koje ispoljavaju aktivacione receptore za ligande na ćelijama tumora (Markel et al., 2009).U ciljanoj terapiji malignih tumora sve više primenjuju blokirajuća monoklonska antitela kao što su anti HER-2 kod karcinoma dojke, anti- EGFR kod karcinoma kolona i anti-CD19 kod Hodgkin limfoma koja svojim Fc fragmentom vezivanjem za CD16 receptor na NK ćelijama stimulišu ADCC aktivnost (Siedel et al., 2013). U tom smislu je u in vitro uslovima kod melanoma ispitivano antitelo za GD3 melanomski antigen pri čemu je takođe došlo do povećanja ADCC aktivnosti NK ćelija i postignuto antitumorsko dejstvo (Besser et al., 2013). Primena blokirajućih antitela u imunioterapiji melanoma predstavlja jedan relativno nov pristup u lečenju. Pored CTLA-4 i PD-1 blokirajućih antitela koja se od skoro primenjuju u terapiji melanoma u kliničkim studijama se ispituje i primena anti- KIR i anti-TGF-β antitela (Vahlne et al., 2010; Mellero et al., 2013). U preliminarnim pretkliničkim ispitivanjima dobre rezultate je pokazala primena humanizovanog mišijeg blokirajućeg antitela koje prepoznaje grupu KIR2DL1/L2/L3 inhibitornih KIR receptora koji su prisutni na više od polovine NK ćelija. Primena ovog antitela sprečava inhibiciju 49 NK ćelijske funkcije do koje bi došlo prepoznavanjem bilo kog HLA-C alela. Iz tih razloga se ovo antitelo može primenjivati bez obzira na KIR i HLA genotip bolesnika (Vahne et al., 2010; Thielenes et al., 2012). Sprečavajući dejstvo inhibitornih KIR receptora ovo antitelo povećava citotoksičnost NK ćelija prema tumorima koji ispoljavaju ligande za aktivacione receptore, a pored toga sprečava i autoimunske reakcije u odnosu na „zdrave“ ćelije koje ne ispoljavaju ligande za aktivacione receptore. Pored toga, pokazano je da više-nedeljna primena ovog antitela na miševima nije narušila NK-citotoksičnost te se stoga smatra da nije time ometena edukacija NK ćelija (Vivier et al., 2012). U dosadašnjim ispitivanjima samo kod hematoloških maligniteta je pokazan poželjan terapijski efekat NK ćelija koje su aktivirane prethodno već pomenutim citokinima u in vitro uslovima. In vitro aktivacija NK ćelija radi njihove primene u terapiji solidnih tumora, pa i melanoma se još uvek ispituje. Poznato je da IL-2, citokin koji stimuliše citotksičnu aktivnost NK ćelija i zvanično se primenjuje u terapiji melanoma i IL-15, citokin novije generacije, povećavaju antitumorsku citotoksičnost NK ćelija ali njihov efekat na do sada slabo ispitvanu populaciju NK ćelija regionalnih limfnih čvorova nije ispitivan. S obzirom na značaj regionalnih limfnih čvorova u sprečavanju limfogenog širenja tumora i formiranja metastaza u visceralnmi organima, povećanje citotoksične funkcije ovih NK ćelija može biti od značaja za potencijalno terapijsko tretiranje tumora. 50 2 Ciljevi rada Regionalni limfni čvorovi predstavljaju prvu barijeru u limfogenom širenju tumora. NK ćelije kao nosioci urođene antitumorske imunosti su do sada u malignitetima najviše proučavane u perifernoj cirkulaciji i u tumorskom tkivu, a manje u regionalnim limfnim čvorovima. Uvidom u funkcionalna i imunofenotipska svojstva NK ćelija regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom i njihovim poređenjem između neinfiltrisanih i tumor-infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova mogu da se dobiju novi podaci o uticaju tumorskog okruženja na ova svojstva NK ćelija. Cilj ovog istraživanja je stoga da se na sveže izolovanim mononuklearnim ćelijama neinfiltrisanih i tumor-infiltrisanin regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom ispitaju i uporede: 1. funkcionalna svojstva NK ćelija: citotoksična aktivnost i intraćelijska produkcija IFNγ 2. zastupljenost CD3-CD56+ NK ćelija, kao i CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ NK ćelijskih subpopulacija 3. ekspresija aktivacionih (NKG2D i CD16) i inhibitornih KIR (CD158a i CD158b) receptora, aktivacionih antigena (CD25, CD69, HLA-DR) na NK ćelijama i u njihovim subpopulacijma Drugi cilj ovog istraživanja je da ispita efekat IL-2, citokina γc familije koji stimuliše citotoksičnu aktvnost NK ćelija i već dve decenije se primenjuje u terapiji metastatskog melanoma i IL-15, takođe citokina γc familije koji je neophodan za razvoj i sazrevanje NK ćelija, na citotoksičnu funkciju i fenotip NK ćelija regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom. U tom smislu ciljevi ovog rada su da se nakon in vitro tretmana citokinima IL-2 i IL-15 kod neinfiltrisani i tumor-infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova ispitaju: 1. citotoksična aktivnost NK ćelija i procenat NK ćelija i njihovih CD3- CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacija. 2. transkripcija i nivo sintetisanog citotoksičnog medijatora perforina 51 3. nivo fosforilisanih i aktiviranih STAT1 i STAT5 molekula uključenih u signalne putanje ovih citokina 4. ekspresija aktivacionih (NKG2D i CD16) i inhibitornih (CD158a i CD158b) KIR receptora i CD69 aktivacionog antigena na NK ćelijama i u njihovim subpopulacijma neinfiltrisanih i tumor-infiltrisanih limfnih čvorova 52 3 Materijal i metode 3.1 Pacijenti i klasifikacija U ovom istraživanju korišćen je materijal regionalnih limfnih čvorova odstranjenih u cilju hirurškog lečenja 45 bolesnika sa melanomom u kliničkim stadijumima bolesti II-IV (Tabela 1). Za potrebe patohistološke analize u Institutu za onkologiju i radiologiju Srbije, tkivo regionalnih limfnih čvorova je parafinizirano. Sečenjem dobijenih prafinskih kalupa mikrotomom načinjeni su preseci debljine 5µm koji su zatim podvrgnuti standardnom hamatoksilin/eozin bojenju (Kiernan, 2008). Nakon analize bar dva preseka utvrđeno je da li je ispitivani regionalni limfni čvor infiltrisan tumorskim ćelijama. Tabela 1. Opis i kliničko-patološke karakteristike ispitivanih bolesnika sa melanomom Klinički stadijum I-II III IV 20 20 5 Godište Opseg 33-84 36-73 37-60 Medijana 58 59 42 Pol Muški 10 11 3 Ženski 10 9 2 Primarni tumor Glavai vrat 1 4 Trup 7 9 5 Gornji ekstremiteti 5 4 Doni ekstremiteti 7 3 Vulva 1 3.2 Izolocija mononuklearnh ćelija iz regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma Deo svežeg tkiva regionalnog limfnog čvora je u RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, Nemačka) hranljivoj podlozi za ćelijsku kulturu mehanički isitnjen, a zatim je 53 potiskivanjem kroz mrežicu dobijena jednoćelijska suspenzija. Iz dobijene suspenzije ćelija izolovane su mononuklearne ćelije (MNĆ) nakon 30 minuta centrifugiranja na 1600 obrtaja u minutu (rpm) na gustinskom gradijentu Histopaque (Sigma-Aldrich, Nemačka). Dobijeni talog MNĆ je zatim 2 puta ispiran u po 2 ml medijuma za ćelijsku kulturu centrifugiranjem na 1800 rpm u trajanju od 10 minuta. In vitro tretmani Izolovane MNĆ su kultivisane 72 sata i 7 dana u RPMI1640 hranljivom medijumu za ćelisku kulturu, medijumu sa 200 IU/ml rekombinantnog humanog IL-2 (Sigma-Aldrich, Nemačka) i medijumu sa sa 25ng/ml IL-15 (BD Pharmingen, SAD) na 37ºC u inkubatoru u vlažnoj atmosferi sa 5% ugljen-dioksida. Kod sedmodnevih in vitro tretmana, četvrtog dana kultivacije ćelijma je dodavana podloga sa citokinima u navedenim koncentracijama. 3.3 Određivanje citotoksične aktivnosti NK ćelija Kod sveže izolovanih i in vitro tretitanih MNĆ regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom citotoksična aktivnost NK ćeliija određivana je, standardnim 51Cr testom (Brown et al.,1985). Za potrebe ovog testa, K562 ćelije eritromijeloidne leukemije osetljive na lizu NK ćelijama su prethodno obeležene 51Cr (Na2Cr6O4, Amersham, Vel. Britanija) specifičnog aktiviteta As=3.7 MBq. Ovom metodom se na posredan način, merenjem oslobođenog γ zračenja nastalog otpuštanjem radioaktivnog 51Cr u toku lize obeleženih K562 ćelija od strane NK ćelija, određuje citotoksična aktivnost NK ćelija. Naime, ovim testom se određuje procenat lize K562 ćelija NK ćelijama u odnosu na količinu radioaktivnog 51Cr koji se oslobađa tretiranjem K562 ćelija detredžentom (Triton X 100) koji razgrađuje njihovu ćelijsku membranu. U ovom testu K562 ćelije koncentracije 0.05 x 106 ćelija/ ml medijuma su kultivisane sa ispitivanim MNĆ izolovanim iz limfnih čvorova (Brown et al., 1985). Napravljeno je osnovno razblaženje MNĆ- efektorskih ćelija (E) koncentracije 4 x 106 ćelija/ml medijuma koje je dva puta sukcesivno razblaženo u odnosu 1:1 da bi se ostvarila tri odnosa efektorskih prema ciljnim ćelijama (E:T): 80:1, 40:1 i 20:1. Naime, u mikropločama, po 100µl suspenzije MNĆ je pomešano sa po 100µl obeleženih K562- ciljnih ćelija (T). Za svako razblaženje test je postavljen u triplikatu. Nakon 4 sata 54 inkubacije na 37ºC u inkubatoru u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2, mikroploče su kratko centrifugirane. Nakon centrifugiranja 100µl supernatanta uzeto je iz svakog uzorka i aktivnost radioaktivnog 51Cr otpuštenog iz liziranih K562 tumorskih ćelija, merena je kao broj otkucaja u minutu (cpm) na γ-brojaču (Berthold, Nemačka). Procenat specifične citotoksične aktivnosti NK ćelija izračunat je prema formuli: 100)otpuštanje (spontanocpm)otpuštanje o(maksimalncpm )otpuštanje (spontanocpm)otpuštanje ntalno(eksperimecpm X − − gde je spontano otpuštanje dobijeno inkubacijom ciljnih K562 tumorskih ćelija u medijumu a maksimalno otpuštanje je dobijeno tretiranjem K562 ćelija 5% rastvorom Triton-a X 100. 3.4 Određivanje intraćelijskog IFNγ u CD3-CD56+ NK ćelijama Za određivanje prisustva sintetisanog IFNγ u CD3-CD56+ NK ćelijama metodom protočne citometrije pripremljen je uzorak od 5x105 MNĆ izolovanih iz regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom koje su resuspendovane u 500µl medijuma. Ovako prpremljene MNĆ kultivisane su na temperturi od 37°C u polistirenskim epruvetama za protočnu cetometriju sa 50 ng/ ml forbol-12-miristat-13-acetata (PMA) (Sigma, SAD) i 500 ng/ml jonomicina (Sigma, SAD) koji stimulišu sintezu IFN-γ. Nakon 1 sat inkubacije sa PMA i jonomicinom dodavano je 10 g /ml brefeldina A (Sigma, SAD) da bi se sprečio transport sintetsanih proteina iz ćelija u spoljašnju sredinu. Nakon dodatnih 3 sata (ukupno 4 sata) tretmana, spoljašnji antigeni koji određuju imunofenotip NK ćelija obeleženi su sa po 10 µl monklonskih antitela konjugovanih sa fluorescentnim bojama CD56PE i CD3PerCP (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) i inkubirani 30 minuta na 4ºC. Nakon toga uzorci su po dva puta ispirani centrufugiranjem na 1600 rpm u hladnom rastvoru fosfatnog pufera (CellWASH, Becton Dickinson, SAD). Nakon bojenja spoljašnjih antigena, prema standardnom postupku za premeabilizaciju talog MNĆ je izlagan dejstvu komercijalnog BD FACS rastvora 2 za permeabilizaciju ćelija koji sadrži deterdžent saponin (BD Biosciences, SAD) i nakon toga za obležavanje unutarćelijskog IFNγ svakom uzorku dodavano je po 10 µl anti-IFNγ FITC (Becton Dickinson, SAD) monoklonskog antitela. Nakon dva ispiranja u u hladnom rastvoru fosfatnog pufera, za analizu na protočnom 55 citometru FACSCalibur (Becton Dickinson, SAD) uzorci su rastvoreni u 1% paraformaldehidu (CellFIX, Becton Dickinson, SAD). U populaciji limfocita koja je na protočnom citometru prepoznata na osnovu veličine i granularnosti ćelija, određivan je procenat CD3-CD56+ NK ćelija koje sadrže IFNγ. 3.5 Protočna citometrija Zastupljenost CD3-CD56+ NK ćelija u populaciji limfocita kako u sveže izolovanim, tako i u kultivisanim MNĆ poreklom iz regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma, određivana je metodom protočne citometrije korišćenjem monoklonskih antitela obeleženih fluorescentnim bojama. Uzorci za analizu su pripremljeni po metodi Jacson-a i saradnika (Jackson et al, 1985). Naime, 5 x 105 sveže izolovanih MNĆ u suspenziji od 100 µL (koncentracija 5 x 106 ćelija/ml) su inkubirani 30 minuta na 4ºC sa 10µl odgovarajuće kombinacije monoklonskih antitela i nakon toga ispirani dva puta centrufugiranjem na 1600 rpm u hladnom rastvoru fosfatnog pufera i za analizu na protočnom citometru resuspendovani u 1% paraformaldehidu. Analiza procentualne zastupljenosti ispitivanih receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama vršena je u CellQuest programu pri čemu je sakupljano 50000-100000 događaja (ćelija po uzorku). Tom prilikom, limfocitna populacija je određivana na osnovu veličine i granularnosti i unutar nje na CD3-CD56+ NK ćelijama praćen procenat ekspresije CD16 i NKG2D aktivacionih receptora, CD158a i CD158b inhibitornih KIR receptora i procenat CD25, CD69 i HLA-DR aktivacionih antigena. U radu su korišćene sledeće kombinacije monoklonskih antitela koja su obeležena fluorescentnim bojama: • CD56FITC/CD16PE/CD3PerCP, • CD56FITC/CD25PE/CD3PerCP, • CD56FITC/CD69PE/CD3PerCp, • CD56FITC/NKG2DPE/CD3PerCP, • CD56PE/CD158aFITC/CD3PerCP, • CD56FITC/CD158bPE/CD3PerCP, • CD56FITC/HLA-DRPE/CD3PerCP (Becton Dickinson, SAD, R&D, SAD). Procenat zastupljenosti ispitivanih receptora analiziran je unutar populacije CD3-CD56+ NK ćelija. 56 CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacije NK ćelija su na protočnom citometru na osnovu MFI (engl. Mean Fluorescence Intensity) parametra koji opisuje srednji intenzitet fluorescence CD56 površinskog antigena, odnosno gustinu ekspresije po ćeliji. Naime, CD3-CD56potmulo+ NK ćelije se odlikuju nižom gustinuom CD56 antigena u odnosu na CD3-CD56sjajno+ subpopulaciju, a procenat ekspresije ispitivanih receptora određiivan je unutar CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacija NK ćelija. Za analizu intenziteta ekspresije CD56 antigena (CD56potmulo+ i CD56sjajno+) na protočnom citometru prikupljeno je od 50000 do 100000 pojedinačnih događaja. 3.6 Westen blot Izolacija proteina Na talog od oko 5x106 MNĆ ćelija izolovanih iz regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma dodavano je 150 µl RIPA pufera (50mM Tris pH7.5, 150mM NaCl, NP-40 1%, Na-deoksiholat 0.5%, SDS 0.1%) za liziranje ćelija. Ova smesa je nakon 30 minuta inkubacije na ledu centrifugirana 30 minuta pri brzini od 12000 rpm na temperaturi od 4°C i izdvojen je supernatant sa rastvorenim proteinima. Ovako izolovani proteini čuvani su na temperaturi od –20°C do sledećeg korišćenja. Na ovaj način su izolovani proteini iz MNĆ regionalnih limfnih čvorova nakon 72 sata in vitro tretmana RPMI 1640, RPMI 1640 sa 200 IU IL-2 i sa 25 ng/ml IL-15. Određivanje koncentracije proteina metodom po Lowry-ju Određivanje proteina Lowry metodom se zasniva na reaktivnosti Cu2+ jona sa peptidnim vezama u baznoj sredini i sledstvenom redukcijom folina. Ova reakcija se manifestuje pojavom plave boje usled oksidacije aromatilnčih aminokiselinskih ostataka u proteinu u reakciji koju katalizuje Cu2+. Apsosorbanca dobijenog rastvora izmerena na 600nm talasne dužine proporcionalna je koncentraciji proteina. U ovom radu proteini izolovani iz regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanima rastvoreni u RIPA puferu su razblaženi 10 puta u destilovanoj vodi. Reganesi za određivanje koncentracije proteina rastvor A (2% Na2CO3, 0.02% Na K tartarat rastvoreni u 0.1N NaOH, 2g Na2CO3, 0,02685 NaK tartarata x 4H2O rastvorenih u 100 ml 0,1N NaOH) i rastvor B (0.5% CuSO4 x 5 H2O) sjedinjeni su u odnosu 50:1 (20 ml 57 A : 0,4 ml B). 0.8 ml tako dobijenog rastvora AB je dodavano na 0.2 ml vodenog rastvora proteina i inkubirano na sobnoj temperaturi 10 minuta. Nakon toga dodavano je 0.1 ml 1 N rastvora folana i inkubirano na sobnoj temperaturi sat vremena. Apsorbanca je merena na 660 nm talasne dužine a koncentracije rastvorenih proteina su očitane sa standardne prave. Korišćena standardna prava konstruisana je tako što su na apcisu nanošene poznate koncentracije proteina goveđeg serum albumina (BSA) a na ordinatu izmerene apsorbance. Prava je povučena kroz osam tačaka koje predstavljaju apsorbance rastvora BSA u rasponu koncentracija od 0.25 x 10-4 g/ml do 2.5 x 104 g/ml. Elektroforeza proteina Uzorci proteina u RIPA puferu su pomešani sa puferom za nanošenje uzorka (Tris pH 6.8, glicerol, 10% SDS, 2-merkaptoetanol, 1% Bromphenol-blue) u zapreminskom odnosu uzorka prema puferu 1:1 i nakon toga denaturisani kuvanjem 5 minuta na 100°C a zatim ohlađeni na ledu. Proteini su razdvajani SDS denaturišućom elektroforezom na 8% poliakrilamidnom gelu. Nakon polimerizacije 8% poliakrilamidnog gela za razdvajanje (5.3 ml 1.5M Tris pH 8.8, 5.3 ml 30 % bis/akrilamid (29:1), 200 µl 10% SDS, 200 µl 10%APS, 12 µl TEMED, 9.3ml destilovane vode) naliven je 5% gel za koncentrisanje (6.8 ml 1.5M Tris pH 6.8, 1.7 ml 30 % akrilamid/bis-akrilamid (29:1), 100 µl 10% SDS, 100 µl 10%APS, 10 µl TEMED) nakon čije polimerizacije je u bunarčiće naneto po 25 µg proteina po uzorku. Elektroforeza proteina je vršena u puferu za elektroforezu pH 8.3 (Tris baza 25mM, glicin 192mM i 0.10% SDS) razblaženom 10 puta u destilovanoj vodi na 100 V. Elektrotransfer proteina na membranu Nakon eklektroforeze odsečen je gel za koncentrisanje a gel sa razdvojenim proteinima i nitrocelulozna (NC) membrana čija površina odgovara dimenzijama gela su potopljeni u pufer za transfer pH8.3 (25mM Tris baza, glicin 192mM) sa 20% metanola koji je 10 puta razblažen u destilovanoj vodi. Da bi se obavio elektrotransfer proteina, NC membrana i gel su u orijentisani tako da je gel smešten do negativne elektrode u sistemu za elektrotransfer a NC membrana do pozitivne. Transfer je vršen 1 sat u ohlađenom puferu za transfer pri naponu od 100 V uz hlađenje. Da bi se proteini čvrsto vezali za NC memebranu, membrana je uranjana u vodeni rastvor za fiksaciju koji 58 sadrži 45% metanola i 7% glacijalne sirćetne kiseline i nakon 15 minuta inkubacije nekoliko puta ispirana destilovanom vodom. Da bi se proverila uspešnost transfera proteina sa poliakrialamidnog gela na NC membranu, vršeno je reverzibilno bojenje 1% komercijalnom Ponceau S bojom (Sigma-Aldrich, Nemačka) sa 5% glacijalne sirćetne kiseline, 2 do 3 minuta na sobnoj temeperaturi na mešalici. Na taj način sve trake proteina su nespecifično obojene u crveno i nakon bojenja NC membrane su ispirane destilovanom vodom. Imunodetekcija proteina Da bi se sprečila pojava nespecifičnog vezivanja antitela za proteine, NC membrane su potopljene u rastvor 5% obranog mleka u prahu (Sigma-Aldrich, Nemačka) u TBS puferu (20 mM Tris, 150 mM NaCl) pH7.6 razblaženom 10 puta u koji je dodat deterdžent Tween-20 u kranjoj koncentraciji 0.1% (TBST) i inkubirane sat vremena na sobnoj temperaturi uz mešanje. Na ovaj način se postiže da protein kazein iz mleka sprečava nespecifično vezivanje antitela za protein. Inkubacija NC membrane sa primarnim antitelom je vršena preko noći u hladnoj sobi na mešalici. Monoklonska antitela rastvorena su u 1 x TBST-u u zapremini rastvarača od 150 µl po cm2 površine NC membrane. Nakon 72 sata tretmana MNĆ izolovanih iz regionalnih limfnih čvorova oboleliih od melanoma u medijumu sa 200 IU/ml, medijumu sa 25 ng/ml IL-15 praćena je indukcija fosforilisanih formi STAT1 i STAT5 signalnih moleakula kao i indukcija perforina (PRF1) u odnosu na kontrolne tretmane medijumu. Na ovaj način su korišćena sledeća monoklonska antitela u odgovarajućim razblaženjima: mišje anti-PRF1 (Sigma, SAD) razblaženo 0.5 : 1000 puta; mišje anti-Bcl-2 izotipa IgG1 (Sigma, SAD) razblaženo 1:2000 puta; mišje anti- STAT1 (Becton Dickinson, SAD) specifično za fosforilisanu formu STAT1 molekula (PY701) razblaženo 1:1000; mišje anti-STAT5 (Becton Dickinson Transduction laboratories, SAD) specifično za fosforilisanu formu STAT1 molekula (PY694) razblaženo 1:1000. Nakon toga membrane su ispirane 3 puta po 10 minuta u TBST-u na sobonoj temperaturi na mešalici. Korišćeno je anti-mišje IgG sekundarno antitelo konjugovano sa peroksidazom rena (Sigma-Aldrich, Nemačka) rastvoreno u TBST-u razblaženo 1:5000. 59 Detekcija traka sa ispitivanim proteinima hemiluminiscencijom, zasniva se na emitovanju svetlosnog signala koji nastaje usled reakcije enzima peroksidaze vezane za sekundarno antitelo i supstrata (vodonik peroksid i luminol). Ukratko, nakon ispiranja viška sekundarnog antitela TBST-om i odlivanja viška tečnosti na NC membranu je nanošena tečnost za detekciju. Korišćen je reagens za hemiluminiscenciju SuperSignal West PICO (TMO Pierce Protein, SAD) sadrži supstrat za enzim peroksidazu i luminol. Nakon 60 s inkubacije u mraku, odliven je višak reagensa i NC membrana uvijena u providnu celofansku foliju i nakon toga prekrivena rentgen filmom (Kodak X-Omat Blue). Nakon 1 do 5 minuta ekspozicije u mraku, film je uronjen u rastvor za razvijanje sve dok nisu uočene trake sa specifičnim proteinima a nakon toga u rastvor za fiksaciju. Filmovi koji su dobijeni na prethodno opisan način su skenirani i dobijeni dokument je preveden u tif format. Ova slika je zatim analizirana u Image J programom gde je intenzitet- debljina trake obeležene odgovarajućim antitelom za određivani protein određivana u odnosu na kontrolu dobijenu u istom uzorku. Kao unutrašnja kontrola korišćen je β aktin. 3.7 Izolacija RNK Nakon 72 sata kultivacije 5x106 ćelija u pločama za gajenje ćelija u kulturi sa 6 bunarčića, u 2 ml medijuma sa ili bez 200 IU/ml IL-2, sa ili bez 25 ng/ml IL-15 je izolovana RNK korišćenjem monofaznog rastvora fenola i guanidinizotiocianata (Trizol, Sigma, SAD). Nakon 72 sata tretmana, suspenzija MNĆ prebačna je u plastičnu Ependorf epruvetu i centrifugirana 10 minuta na 2000 rpm. Na preostale MNĆ koje su se vezale za plastičnu podlogu posuda za gajenje ćelija sipano je po 1ml Trizol-a i onakon 5 minuta na sobnoj temperaturi sadržaj prebačen u plastičnu epruvetu u kojoj su već prethodno istaložene ćelije. Zatim je dodato po 200 µl hlorofrma (odnos hloroform:trizol 1:5), sadržaj dobro promućkan epruveta na vorteksu i posle 20 minuta inkubacije na 4˚C centrifugiran 15 minuta na 12000 rpm na temperaturi od 2 do 8˚C. Izdvojena je gornja bezbojna faza sa RNK i dodata ista zepremina izopropanola, sadržaj promućkan i ostavljen 30 minuta na sobnoj temperaturi. Posle 15 minuta centrifugiranja na 12000 rpm odliven je supernatant i dodato je 1ml 75% etanola i nakon toga vršeno centrifugiranje 15 minuta na 12000 rpm. Posle toga ponovo je dodat 1ml etanol i centrifugirano 5 minuta na 12000 rpm. Tako pripremljen talog RNK čuvan je u 60 zamrzivaču na -20˚C do očitavanja koncentracije na spektrofotometru. Talog RNK je za merenje rastvaran u 20 µl demineralizovane vode a koncentracija očitavana na spektrofotometru (Eppendorf BioPhotometer, Velika Britanija) na 260/280nm. 3.8 RT-PCR Za prevođenje u cDNK rt-PCR metodom uzeto je po 1 µg izolovane RNK i dodato po 4 µl 5 x pufera za MuLV reverznu transkriptazu (Fermantas, SAD) (krajnja koncentracija 1x), 2 µl 10nm dNTP smese (krajnja koncentracija 1mM), 1 µl inhibitora ribonukleaze (20 U) i dodata voda do zapremine od 19 µl. Ova smesa inkubirana je 5 minuta na 25˚C a zatim joj je dodat po 1µl MuLV (1U) . Prevođenje RNK u komplementarnu DNK (cDNA) vršeno je u sledećim uslovima: 10 minuta na 25˚C, 60 minuta na 42 ˚C i 10 minuta na 70˚C i uzorci nakon toga ohlađeni na ledu. PCR PCR reakcija je rađena u 20µl ukupne rakcione zapremine. Za umnožavanje ciljne sekvence perforina koja je dugačka 436 bp, korišćene su sledeće sekvence prajmera uzvodni (engl. upstream) 5’AAAGTCAGCTCCACTGAAGCTGTG3’ i nizvodni (engl. Downstream) 3’AGTCCTCCACCTCGTTGTCCGTGA5’. Radi kvantifikacije nivoa transkripcije PRF1 gena umnožena je ciljna sekvenca β aktina duga 685 bp korišćenjem sledeće sekvence prajmera: 5’ TGGGTCAGAAGGATTCCTAT i 3’AAGGAAGGCTGGAAGAGT. Na 1 µl cDNA po uzorku dodavano je 5.7 µl vode, 2 µl 5xPCR pufera (Fermentas, SAD), 1.2 µl MgCl2, 2 µl 2mM smese dNTP, 0.8µl 5’ i 3’ prajmera za β aktin (kranja koncentracija 0.8mM) i po 1.2 µl 5’ i 3’ prajmera za PRF1 (krajnja koncentracija 1.2mM) i.4 µl (2U) Taq polimeraze (Fermentas, SAD). cDNA je dalje umnožena pod sledećim uslovima: denaturacija 5 minuta na 95°C, aniling 30 s na 56°C, ekstenzija 45 s na 72°C i završna ekstenzija 7 minuta na 72°C. Za ekspresiju PRF1 i β aktina nađen je optimalan broj od 35 ciklusa a PCR produkti su provereni elektroforezom na 1.5% agaroznom gelu. Intenzitet traka je izmeren densitometrom i semi-kvantifikovan korišćenjem Scion Image programa. Intenzitet traka dobijen imnožavanjem PRF1 svakog uzorka izražen je u odnosu na intenzitet odgovarajuće trake dobijene umnožavanjem β aktina. 61 3.9 Statističke analize Vrednosti ispitivanih parametara kod tumor-infiltrisanih u odnosu na neinfiltrisane limfne čvorove poređene su Mann Whitney neparametrijskim statističkim testom. Za utvrđivanje značajnosti promena ispitivanih parametrima kod tumor-neinfiltrisanih i kod infiltrisanih limfnih čvorova nakon 72 sata i nakon 7 dana in vitro tretmana IL-2 i IL-15 u odnosu na kontrolne tretmane vršena je Wilcoxon testom sume rangova. U statističkoj analizi korelacione povezanosti između imunofenotipskih svojstava NK ćelija u regionalnim limfnim čvorovima sa brojem regionalnih limfnih čvorova zahvaćenih tumorom i stepena invazije primarnog tumora u kožu korišćen je Spearman test. 62 4 Rezultati 4.1 Funkcionalne karakteristike NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma Citotoksična aktivnost NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma određivana je u odnosu na ciljnu tumorsku K562 ćelijsku liniju standardnim četvoročasovnim radioaktivnim 51Cr testom koji je pokazao kod tumor-infiltrisanih limfnih čvorova (infiltrisani LČ) i kod limfnih čvorova koji nisu infiltrisani tumorom (neinifiltrisani LČ) slične niske vrednosti citotoksične aktivnosti NK ćelija (vrednosti su 9.17 ± 1.20 % za neinifiltrisane i 10.97 ± 1.57 % za infiltrisane LČ) (Slika 1a). 0 5 10 15 20 25 30 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ C it ot o ks ič n os t (% ) 0 5 10 15 20 25 30 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ In tr a će lij sk i I FN γ (% ) p≤0.05 a) b) Slika 1. a) Slična citotoksična aktivnost NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova (LČ) obolelih od melanoma za odnos efektorskih (E) prema ciljnim ćelijama (C) 80:1 (E:C, 80:1). b) Sniženi nivo produkcije IFNγ u CD3-CD56+ NK ćelijama infiltrisanih u odnosu na neinfiltrisane regionalne LČ obolelih od melanoma (p≤0.05, MannWhitney test). Predstavljene su srednje vrednosti sa standardnim greškama. Sposobnost NK ćelija regionalnih LČ obolelih od melanoma da sintetišu IFN-γ je praćena nakon 4 sata standardne in vitro stimulacije PMA i jonomicinom, metodom protočne citometrije. Određivanjem procenta CD3-CD56+ NK ćelijama koje sadrže IFNγ u infiltrisanim LČ pokazana je statistički značajno niža (p≤0.05, Mann Whitney test) produkcija IFNγ u odnosu na neinfiltrisane LČ (vrednosti su 7.02 ± 1.79 % za infiltrisane i 16.54 ± 3.21 % za neinfiltrisane LČ) (Slika 1b). 63 4.2 Zastupljenost NK ćelija i njihovih CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacija u regionalnim limfnim čvorovima obolelih od melanomoma Analizom zastupljenosti CD3-CD56+ NK ćelija u limfocitnoj populaciji regionalnih LČ obolelih od melanoma, metodom protočne citometrije, je dobijen statistički značajno veći (p≤ 0.05, Mann Whitney test) procenat NK ćelija u infiltrisanim (2.76 ± 0.33 %) u odnosu na neinfiltrisane (1.34 ± 0.12 %) LČ (Slika 2). Dobijena je statistički značajno veća (p≤0.05, Mann Whitney test) zastupljenost citotoksične CD3- CD56potmulo+ subpopilacije NK ćelija u infiltrisanim (1.71 ± 0.39 %) u odnosu na neinfiltrisane (0.64 ± 0.17 %) LČ, a slična zastupljenost imunoregulatorne CD3- CD56sjajno+ NK ćelija u infiltrisanim (0.9± 0.21 %) i neinfiltrisanim (0.8 ± 0.16 %) regionalnim LČ (Slika 2a,b). Slika 2. a) Veći procenat CD3-CD56+ NK ćelija i CD3-CD56potmulo+ subpopulacije u infiltrisanim LČ u odnosu na neinfiltrisane regionalne LČ obolelih od melanoma (p≤0.05, MannWhitney test). Predstavljene su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezentativni tačkasti dijagrami dobijeni protočnom citometrijom. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ 64 4.3 Produkcija IFNγ u CD3-CD56potmulo+i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanomoma Analizom produkcije IFNγ u subpopulacijama NK ćelija regionalnih LČ obolelih od melanoma nakon 4 sata stimulacije PMA i jonomicinom dobijen je sličan procenat NK ćelija CD3-CD56potmulo+ subpopulacije koje sadrže IFNγ i u neinifiltrisanim (25.91 ± 6.26 %) i u infiltrisanim (25.90 ± 4.42 %) LČ, dok je procenat IFNγ pozitivnih imunoregulatornih CD3-CD56sjajno+ NK ćelija statistički značajno niži (p≤ 0.05, Mann Whitney test) u infiltrisanim (7.69 ± 5.63 %) u odnosu na neinfiltrisane (22.78 ± 6.26 %) LČ (Slika 3). Slika 3. Snižena produkcija IFNγ u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija infiltrisanih u odnosu na neifiltrisane regionalne LČ. Rezultati su prikazani kao procenat IFNγ pozitivnih NK ćelija u NK ćelijskoj subpopulaciji. Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama (p≤ 0.05, Mann Whitney test). 4.4 Imunofenotipske karakteristike CD3-CD56+ NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma Ekspresija aktivacionih receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma Analiza zastupljenosti aktivacionih receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija metodom protočne citometrije je za NKG2D receptor pokazala sličan procenat ekspresije u neinfiltrisanim (59.60 ± 3.61 %) i infiltrisanim (50.18 ± 4.24 %) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ regionalnim LČ, dok je za zastupljenost (p≤0.05, Mann Whitney test) neinfiltrisane (17.52 ± 1.91 Slika 4. a) Povećan procenat infiltrisanih u odnosu na neinfiltrisane regionalne L su srednje vrednosti sa standardn protočnom citometrijom Ekspresija aktivacionih antigena na CD3 regionalnih limfnim Analizom zastupljenosti ćelija regionalnih LČ obolelih od slična ekspresija u neinfiltrisanim ( 48.03 ± 5.15 %) i infiltrisanim ( ± 4.66 %) regionalnim LČ antigen je statistički značajno (p 0 10 20 30 40 50 60 70 80 P ro ce n at ( % ) CD16 aktivacioni receptor dobijena statistički zna u infiltrisanim (27.55 ± 3.34 %) LČ (Slika 4a,b). ekspresije CD16 receptora u populaciji CD3 Č (p≤0.05, Mann Whitney test im greškama. b) Reprezentativni tačkasti dijagram -CD56+ NK ćelijama čvorovima obolelih od melanoma aktivacionih antigena u populaciji CD3 melanoma za CD25 i HLA-DR antigene vrednosti za CD25 i HLA-DR su vrednosti za CD25 i HLA-DR su 8.30 ± 2.90 % . Za razliku od ova dva antigena, CD69 rani aktivacioni ≤0.05, Mann Whitney test) više zastupljen neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ 65 čajno veća %) u odnosu na -CD56+ NK ćelija ). Prikazane i dobijeni -CD56+ NK je dobijena 5.90 ± 0.77 % i i 50.60 u populaciji 66 NK ćelija infiltrisanih (29.41 ± 4.08 %) u odnosu na neinfiltrisane (17.67 ± 1.7 %) regionalne LČ (Slika 5a,b). Slika 5. a) Povećan procenat ekspresije CD69 aktivacionog antigena u populaciji CD3- CD56+NK ćelija infiltrisanih u odnosu na neinfiltrisane regionalne LČ (p≤0.05, Mann Whitney test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezentativni tačkasti dijagrami dobijeni protočnom citometrijom . Ekspresija inhibitornih KIR receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma Analiza zastupljenosti CD158a i CD158b inhibitornih KIR receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija regionalnih LČ je pokazala sličnu ekspresiju CD158a receptora u obe grupe isptivanih regionalnih LČ (vrednosti su 6.52 ± 0.99 % u neinfiltrisanim i 8.85 ± 2.179 % u infiltrisanim LČ), dok je za CD158b dobijena statistički značajno veća ekspresija (p≤0.05, Mann Whitney test) u infiltrisanim (16.33 ± 2.36 %) u odnosu na neinfiltrisane (8.19 ± 0.59 %) LČ (Slika 6a, b). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 P ro ce n at ( % ) neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ p≤0.05 CD3 - CD25 + CD56 + CD3 - CD56 + CD69 + CD3 - CD56 + HLA-DR + a) b) CD3-CD56+CD69+ 11.53% CD3-CD56+CD69+ 66.99% CD3-CD56+ CD3-CD56+ neinfiltrisan LČ infiltrisan LČ 67 Slika 6. a) Povećan procenat ekspresije CD158b inhibitornog KIR receptora u populaciji CD3- CD56+NK ćelija infiltrisanih u odnosu na neinfiltrisane regionalne LČ (p≤0.05, Mann Whitney test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezentativni tačkasti dijagram dobijen protočnom citometrijom. Ekspresija receptora u CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija Analiza zastupljenosti NKG2D aktivacionog receptora u subpopulacijama NK ćelija, pokazala je njegovu sličnu ekspresiju u citotoksičnoj, CD3-CD56potmulo+, subpopulaciji neinfiltrisanih (39.17 ± 3.25 %) i infiltrisanih (39.00 ± 5.05 %) LČ kao i u imunoregulatornoj, CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija obe grupe regionalnih LČ (vrednosti su 67.87± 4.29 % za neinfiltrisane i 61.86 ± 8.65 % za infiltrisane LČ) (Slika 7). Za CD16 aktivacioni receptor dobijena je veća zastupljenost u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji tumor-infiltrisanih LČ (24.46 ± 3.89 %) u odnosu na neinfiltrisane (19.26 ± 3.09 %) LČ koja, međutim, nije statistički značajno različita (p≥0.05, Mann Whitney 0 5 10 15 20 25 30 P ro ce n at ( % ) neinfiltrisani LČ infiltrisani LČp≤0.05 CD3 - CD56 + CD158a + CD3 - CD56 + CD158b + a) b) CD3-CD56+CD158b+ 7.84% CD3-CD56+CD158b+ 23.60% CD3-CD56+ CD3-CD56+ neinfiltrisan LČ infiltrisan LČ 68 test). U imunoregulatornoj CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji obe grupe isptivanih LČ dobijena je slična ekspresija CD16 receptora (vrednosti su 25.95 ± 3.46 % za neinfiltrisane i 28.40 ± 3.00% za infiltrisane LČ) (Slika 7). Slika 7. Procenat ekspresije NKG2D i CD16 aktivacionih receptora u CD3-CD56potmulo+ i CD3- CD56sjajno+subpopulacijama NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ obolelih od melanoma. Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. Analizom zastupljenosti inhibitornih KIR receptora u subopulacijama NK ćelija, za CD158a KIR receptor dobijene su slične vrednosti ekspresije u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji neinfiltrisanih (10.19 ± 1.54 %) i infiltrisanih (9.83± 2.27 %) LČ, a i u CD3-CD56sjajno+subpopulaciji NK ćelija obe grupe ispitivanih regionalnih LČ (vrednosti su 3.77 ± 0.67 % za neinfiltrisane i 7.7 ± 4.95 % za infiltrisane LČ) (Slika 8). Zastupljenost CD158b KIR-a u CD3-CD56potmulo+ populaciji NK ćelija je niža u neinfiltrisanim (14.30 ± 1.31 %) nego u infiltrisanim (19.05 ± 4.63%) LČ, mada ne statistički značajno (p≥0.05, Mann-Whitney test), a u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji je slična i u neinfiltrisanim (3.85 ± 0.50 %) i u infiltrisanim regionalnim LČ (6.76 ± 2.34 %) (Slika 8). CD3 -CD56 potm ulo+ CD3 -CD56 sjajn o+ CD3 -CD56 potm ulo+ CD3 -CD56 sjajn o+ 0 10 20 30 40 50 60 70 80 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ NKG2D CD16 69 Slika 8. Procenat ekspresije CD158a i CD158b inhibitornih KIR receptora u CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+subpopulacijama NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ obolelih od melanoma. Prikazane su su srednje vrednosti sa standardnim greškama. Analizom zastupljenosti aktivacionih antigena u funkcionalnim subpopulacijama NK ćelija regionalnih LČ pokazana je sličnan nivo ekspresije CD25 antigena u CD3- CD56potmulo+ subpopulaciji neinfiltrisanih (9.23 ± 1.21 %) i infiltrisanih (7.58 ± 1.66 %) LČ kao i u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji obe grupe regionalnih LČ (vrednosti su 3.93 ± 0.86 % za neinfiltrisane i 4.67 ± 1.87 % za infiltrisane LČ) (Slika 9). Za CD69 rani aktivacioni antigen pokazan je sličan procenat ekspresije u CD3- CD56potmulo+ subpopulaciji neinfiltrisanih (34.08 ± 6.41 %) i infiltrisanih (34.85 ± 3.96 %) LČ, dok je u CD3-CD56sjajno+subpopulaciji dobijena statistični značajno veća (p ≤ 0.05,Mann Whitney test) zastupljenost CD69 antigena u infiltrisanim (31.05 ± 4.62 % ) u odonosu na neinfiltrisane (15.53 ± 2.72 %) regionalne LČ (Slika 9). Slično CD25 antgenu i za HLA-DR aktivacioni antigen dobijena je slična zastupljenost u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih (60.19 ± 6.66 %) i infiltrisanih (62.06 ± 5.70 %) LČ, a takođe i u CD3-CD56sjajno+subpopulaciji obe ispitivane grupe regionalnih LČ (vrednosti su 45.28 ± 5.54 % za neinfiltrisane i 43.71 ± 4.99 % za infiltrisane LČ) (Slika 9). 0 5 10 15 20 25 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ CD3 - CD56 potm ulo+ CD3 - CD56 sjajno + CD3 - CD56 potm ulo+ CD3 - CD56 sjajno + CD158a CD158b P ro ce n at ( % ) 70 Slika 9. Procenat ekspresije CD25, CD69 i HLA-DR aktivacionih antigena u CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija regionalnih LČ obolelih od melanoma. Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. Korelacija broja tumor-infiltrisanih limfnih čvorova i kliničkog Klark parametra sa procentom i fenotipom NK ćelija u limfnom čvoru Na osnovu AJCC sistema kalsifikacije 2001. godine za melanom kože je na osnovu broja broja regionalnih LČ koji su infiltrisani tumorom određuje se N klinički stadijum bolesti. Prema ovom sistemu klasifikacije sa N0 se označavaju tumori kod kojih regionalni LČ nisu infiltrisani tumorom, sa N1 se označavaju tumori gde je jedan LČ od svih patohistološki pregledanih regionalnih LČ infiltrisan tumorom, sa N2 tumori kod kojih su 2 do 3 regionalna LČ infiltrisana tumorom i sa N3 oni kod kojih je 4 i više regionalnih LČ infiltrisano tumorom. Spearman statističkim testom ispitivana je korelaciona povezanost N kliničkog stadijuma bolesti sa procentom CD3-CD56+ NK ćelija u LČ kao i sa procentom ekspresije receptora u CD3-CD56+ populaciji NK ćelija regionalnih LČ. Na ovaj način je kod obolelih od melanoma pokazana pozitivna korelacija između broja tumor- infiltrisanih regionalnih LČ (N) i procenta CD3-CD56+ NK ćelija u regionalnim LČ (p=0.0060, r=0.4375, Spearman test) (Slika 10a). Ispitivanjem korelacije procenta ekspresije aktivacionih receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija LČ sa N, za CD16 0 10 20 30 40 50 60 70 80 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ P ro ce n a t (% ) 71 receptor pokazana je statistički značajna pozitivna korelacija (p=0.0449, r=0.3317, Spearman test) (Slika 10b), dok za NKG2D receptor nije pokazana korelacija sa N (p=0.4049, r=-0.4049, Spearman test) (Slika 10c). Daljom analizom, za ekspresiju CD158a KIR-a na CD3-CD56+ NK ćelijama nije pokazana korelacija (p=0.4375, r= - 0.1411, Spearman test), dok je za CD158b KIR receptor pokazana izražena pozitivna korelacija sa N (p=0.0007, r=0.53193, Spearman test) (Slika 10d, e). Pokazana je i pozitivna korelacija između eskpresije ranog CD69 aktivacionog antigena na CD3- CD56+ NK ćelijama sa N (p=0.0227, r=0.3736, Spearman test) (Slika 10f). Dobijene vrednosti za r Spearman-ov koeficijent korelacije ukazuju na najizraženiju pozitivna korelaciju N sa ekspresijom CD158b inhibitornog KIR receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama LČ (r≥0.5 označava umerenu do dobru korelacionu povezanost). Od dobijenih statistički značajnih (p≤0.05) korelacionih povezanosti sledeća po veličini dobijene vrednosti r je korelacija N sa procentom CD3-CD56+ NK ćelija u regionalnim LČ, zatim sledi korelacija sa ekspresijom CD69 antigena na NK ćelijama, da bi najniži koeficijent r ukazao na najslabiju korelaciju sa eskpresijom CD16 na NK ćelijama regionalnih LČ. Prema AJCC klasifikaciji melanoma klinički stadijum bolesti po Klark-u je patohistološki parametar koji opisuje nivo anatomske invazije melanoma u kožu i dugo je korišćen kao primarni faktor u ranijoj klasifikaciji melanoma. Prema Klarku, postoji pet anatomskih nivoa invazije tumora: 1. melanom je ograničen na epidermis kože 2. invazija melanoma u papilrni dermis 3. invazija melanoma u prostor između papilarnog i retikularnog dermisa 4. invazija melanoma u potkožno masno tkivo (Clark et al., 1969). 72 Slika 10. Korelacija broja tumor infiltrisanih regionalnih LČ (N) sa a) procentom CD3-CD56+ NK ćelija u regionalnim LČ i sa ekspresijom b) CD16, c) CD158a, d) CD158b i e) CD69 receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama ( *p≤0.05, **p≤0.01, Spearman test). Ispitivanjem korelacije između kliničkog stadijuma bolesti po Klarku koji opisuje invazivnost melanoma i procenta CD3-CD56+ NK ćelija u LČ pokazana je statistički značajna (p=0.0082, r=0.5067, Spearman test) “umerena do dobra” pozitivna korelaciona povezanost (Slika 11a). Analizom korelacione povezanosti kliničkog Klark parametra sa zastupljenosću receptora na NK ćelijma regionalnih LČ obolelih od melanoma pokazano je postojanje statistički značajne korelacije sa ekspresijom CD16 receptora (p=0.0248, 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 y = 0.348x + 1.805 R² = 0.111 Spearman r=0.4375 p=0.0060** Broj infiltrisanih LČ (N) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 y = 3.61x + 17.73 R² = 0.156 Spearman r=0.3317 p=0.0449* 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 y = -3.487x + 59.07 R² = 0.052 Spearman r= -0.1411 p=0.4049 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 y = 0.121x + 7.830 R² = 0.000 Spearman r= -0.1411 p=0.4049 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 y = 3.513x + 8.281 R² = 0.231 Spearman r= 0.53193 p=0.0007*** 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 1 2 3 y = 4.875x + 17.61 R² = 0.159 Spearman r=0.3736 p=0.0227* a) b) c) d) e) f) Broj infiltrisanih LČ (N) Broj infiltrisanih LČ (N) Broj infiltrisanih LČ (N) Broj infiltrisanih LČ (N) Broj infiltrisanih LČ (N) 73 r=0.4769, Spearman test) (Slika 11b) i sa ekspresijom CD158b inhibitornog KIR receptora (p=0.00468, r=0.3033, Spearman test) (Slika 11c) u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija regionalnih LČ. Slika 11. Pozitivna korelacija između kliničkog stadijuma bolesti po Klarku i a) procenta CD3- CD56+ NK ćelija u regionalnom LČ i ekspresije b) CD16 i c) CD158b receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama (*p≤0.05, **p≤0.01, Spearman test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. 4.5 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na citotksičnu funkciju i imunofenotip NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma 4.5.1 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na citotoksičnu funkciju NK ćelija Citotoksična aktivnost NK ćelija je određivana u odnosu na ciljnu tumorsku K562 ćelijsku liniju nakon 72 sata i 7 dana in vitro kultivacije MNĆ regionalnih LČ obolelih od melanoma u RPMI 1640 medijumu za ćelisku kulturu (medijum) sa 200 IU/ml IL-2 i u medijumu sa 25 ng/mlIL-15. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1 2 3 4 5 74 Nakon 72 sata in vitro tretmana citokinima IL-2 i IL-15 citotoksična aktivnosti NK ćelija obe grupe regionalnih LĆ se višestruko i visoko statistički značajnog povećala (p≤0.01, Wilcoxon test) u odnosu na kontrolnu vrednost dobijenu u medijumu. NK ćelijska citotoksičnost neinfiltrisanih LČ povećala se sa 8.67 ± 1.88 % u medijumu na 50.92 ± 7.85 % nakon tremana sa IL-2 i na 45.50 ± 2.69 % nakon tretmana sa IL-15, a infiltrisanih LČ sa 8.95 ± 1.46 % u medijumu na 44.60 ± 5.47 % nakon tretmana sa IL-2 i na 29.67 ± 4.14 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 12). Nakon 7 dana in vitro tretmana citokinima takođe je došlo do statistički značajnog povećanja (p≤0.05, Wilcoxon test) citotoksične aktivnosti NK ćelija obe grupe regionalnih LČ se u odnosu na kontrolu. Vrednosti citotoksičnosti dobijene za neinfiltrisane LČ su 10.59 ± 2.23 % u medijumu, 52.39 ± 2.22 % nakon tretmana sa IL- 2 i 57.06 ± 7.95 % nakon tretmana sa IL-15, a za infiltrisane LČ su 11.13 ± 2.67 % u medijumu, 44.54 ± 9.34 % nakon kultivacije sa IL-2 i 47.96 ± 9.99 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 12). Slika 12. Povećanje citotoksične aktivnost NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ obolelih od melanoma nakon 72h i 7 dana in vitro tretmana interleukinima IL-2 (200 IU/ml) i IL-15 (25 ng/ml) u odnosu na kontrolu (medijim) (**p≤0.01, *p≤0.05, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 medijum IL-2 IL-15 C it o to ks ič n o st ( % ) neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ 72h 7 dana ** ** ** ** * * * * 75 4.5.2 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na transkripciju perforina Nakon 72 sata in vitro kultivacije MNĆ regionalnih LČ bolesnika sa melanomom interleukinima IL-2 i IL-15 rt-PCR metodom pokazano je statistički značajno (p≤0.05, Wilcoxon test) trostruko povećanje nivoa transkripcije PRF1 gena za perforin u odnosu na kontolni tretman medijumom kod neinifltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ (Slika 13a,b). Slika 13. a) Povećanje transkripcije PRF1 izraženo u odnosu na β aktin gen nakon 72 sata in vitro tretmana MNĆ neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ interleukinima IL-2 (200 IU/ml) i IL-15m (25 ng/ml) u odnosu kontrolu (medijum) (*p≤0.05, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezantativna elektroforeza rt-PCR produkata na agaroznom gelu. 4.5.3 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na sintezu perforina Nakon 72 sata in vitro kultivacije izlovani su proteini i podvrgnuti su denaturišućoj SDS elektroforezi na poliakrilamidnom gelu da bi se razdvojile teža 70KD frakcija glikozilovanog i funkcionalno nezrelijeg perforina i lakša frakcija 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 medijum IL-2 IL-15 76 funkcionalno zrelog perforina mase 60KD (Uellner et al., 1997). Western blot metodom nakon tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 detektovano je statistički značajno (p≤0.05, Wilcoxon test) povećanje ekspresije ukupnog perforina u odnosu na kontrolni tretman medijumom i kod neinfiltrisanih i kod tumor-infiltrisanih regionalnih LČ (Slika 14a). Nakon elektroforeze u neredukujućim uslovima, u uzorku proteina izlovanih iz MNĆ kultivisanih u medijumu uočava se intenzivna traka težine 70KD nezrelijeg i slabo uočljiva traka 60KD frakcije funkcionalno zrelog perforina, dok se nakon tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 nivo zrelije (60KD) frakcije povećava kod uzoraka poreklom iz obe grupe regionalnih LČ (Slika 14b). Slika 14. Povećamje nivoa ukupnog proteina perforina izraženog u odnosu na β aktin nakon 72 sata in vitro tretmana MNĆ neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ obolelih od melanoma interleukinima IL-2 (200 IU/ml) i IL-15 (25 ng/ml) u odnosu na kontrolni tretman (medijum) (*p≤0.05, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezentativni Westrn blot rezultat ekspresije funkcionalno zrelije (60KD) i nezrelije (70KD) forme perforina 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 medijum IL-2 IL-15 77 4.5.4 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na zastupljenost NK ćelija i njihovih CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacija Nakon 7 dana in vitro tretmana MNĆ regionalnih LČ obolelih od melanoma citokinima IL-2 i IL-15 procenat NK ćelija i njihovih subpopulacija analiziran je na protočnom citometru i poređen u odnosu na kontrolne tretmane medijumom. Nakon tretmana interlekinom IL-2 došlo je do statistički značajnog povećanja (p≤0.05,Wilcoxon test) procenta CD3-CD56+ NK ćelija u odnosu na kontrolu i to kod neinfiltrisanih LČ sa 1.02 ± 0.09 % u kontroli na 1.32 ± 0.12% nakon tretmana, a kod infiltrisanih LČ sa 1.88 ± 0.34 % u kontroli na 2.32 ± 0.34 % nakon tretmana ovim interleukinom (Slika 15a). Za razliku od IL-2, tretmani interleukinom IL-15 nisu doveli do značajne promene procenata CD3-CD56+ NK ćelija u odnosu na kontrolu kod obe grupe ispitivanih regionalnih LČ (Slika 15a). Slika 15. a) Povećanje procenta CD3-CD56+ NK ćelija i njihove b) CD3-CD56sjajno+ subpopulacije neinfiltrisanih i infiltrisaih regionalnih LČ obolelih od melanoma nakon 7 dana in vitro nakon tretmana interleukinom IL-2(200 IU/ml) u odnosu na kontrolu (medijum) (* p≤0.05, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 medijum IL-2 IL-15 C D 3 - C D 5 6 + (% ) neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ * * 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 medijum IL-2 IL-15 CD3-CD56potmulo+ CD3 -CD56sjano+ CD3-CD56potmulo+ CD3 -CD56sjano+ neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ * * P ro ce n at ( % ) a) b) 78 Procenat CD3-CD56potmulo+ subpopulacije NK ćelija kod obe grupe regionalnih LČ se nije značajno promenio u odnosu na kontrolu nakon tretmana interleukinima IL-2 i IL- 15, dok se procenat CD3-CD56sjajno+ subpopulacije nakon tretmana interleukinom IL-2 statistički značajno povećao (p≤0.05,Wilcoxon test) kod neinfiltrisanih LČ sa 1.05 ± 0.08 % u kontroli na 1.41 ± 0.09 % i kod infiltrisanih LČ sa 0.92 ± 0.16 % u kontroli na 1.40± 0.34 % (Slika 15b), 4.5.5 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju receptora na CD3- CD56+ NK ćelijama regionalnih limfnih čvorova Nakon 7 dana in vitro kultivacije MNĆ izolaovanih iz regionalnih LČ obolelih od melanoma citokinima IL-2 i IL-15, na protočnom citometru je analizirana ekspresija nekoliko receptora u CD3-CD56+ populaciji NK ćelija i poređena u odnosu na kontrolni tretman medijumom. Efekti interleukina IL-2 i IL-15 na zastupljenost CD16 i NKG2D aktivacionih receptora Nakon 7 dana tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 došlo je povećanja ekspresije NKG2D aktivacionog receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija obe grupe regionalnih LČ obolelih od melanoma i to kod neinfiltrisanih LČ do statistički značajnog povećanja (p≤0.05, Wilcoxon test) sa 53.13 ± 5.32 % u kontroli na 66.87 ± 4.78 % nakon tretmana sa IL-2 i na 65.07 ± 4.55 % nakon tretmana sa IL-15, a kod tumor-infiltrisanih LČ do visoko statistički značajnog (p≤0.01, Wilcoxon test) povećanja sa 54.04 ± 4.72 % u kontroli na 66.65 ± 6.07 % nakon tretmana sa IL-2 i na 67.78 ± 6.23 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 16a, b). Ekspresija CD16 aktivacionog receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija obe grupe regionalnih LČ bolesnika sa melanomo se nakon tretmana citokinima povećala i to kod neinfiltrisanih LČ sa 22.71 ± 3.40 % u kontroli nakon tretmana sa IL-2 statistički značajno (p≤0.05, Wilcoxon test) na 33.78 ± 5.14 % i visoko statistički značajno (p≤0.01, Wilcoxon test) na 38.92 ± 5.32 % nakon tretmana sa IL-15. Kod infiltrisanih LČ ekspresija CD16 se sa 23.51 ± 3.72 % u kontroli visoko statistički značajno (p≤0.01, Wilcoxon test) povećala na 32.87 ± 4.45 % nakon tretmana sa IL-2 i statistički značajno (p≤0.05, Wilcoxon test) na 37.62 ± 7.04 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 16a, c). 79 Slika 16. a) Povećanje procenta ekspresije NKG2D i CD16 aktivacionih receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisaih regionalnih LČ nakon 7 dana in vitro tretmana interleukinima IL-2(200 IU/ml) i IL-15 (25ng/ml) u odnosu na kontrolu (medijum) (*p≤0.05, **p≤0.01, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) i c) Reprezentativni tačkasti dijagrami dobijeni protočnom citometrijom. b) CD3-CD56+ CD3-CD56+NKG2D+ 56.17% CD3-CD56+ CD3-CD56+NKG2D+ 74.86% CD3-CD56+NKG2D+ 80.60% CD3-CD56+ neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ CD3-CD56+NKG2D+ CD3-CD56+CD16+ ** *** * * *** ** P ro ce n at (% ) a) medijum IL-2 IL-15 c) CD3-CD56+ CD3-CD56+CD16+ 44.10% CD3-CD56+ CD3-CD56+CD16+ 60.14% CD3-CD56+CD16+ 72.03% CD3-CD56+ medijum IL-2 IL-15 0 10 20 30 40 50 60 70 80 medijum IL-2 IL-15 80 Efekti interleukina IL-2 i IL-15 na zastupljenost CD158a i CD158b inhibitornih KIR receptora Nakon 7 dana in vitro tretmana citokinima IL-2 i IL-15 nije došlo do promene ekspresije CD158a inhibitornog KIR-a u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija neinifiltrisanih LČ, dok se na NK ćelijama infiltrisanih LČ nakon tretmana interleukinom IL-15 ekspresija ovog receptora dvostruko i visoko statistički značajno (p≤0.01,Wilcoxon test) povećala sa 12.89 ± 2.14 % u medijumu na 24.52 ± 4.96 % (Slika 17a, b). Ekspresija CD158b inhibitornog KIR receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija neinfltrisanih LČ se nakon 7 dana tretmana visoko statistički značajno (p≤0.01,Wilcoxon test) povećala sa 15.48 ± 3.69 % u kontroli nakon tretmana sa IL-2 na 32.06 ± 5.23 %, a nakon tretmana sa IL-15 na 32.67 ± 5.56 % (Slika 17a, c). Kod infiltrisanih LČ takođe je dobijeno statistički značajno (p≤0.05,Wilcoxon test) povećanje ekspresije CD158b KIR-a sa 14.31±2.49 % u kontroli nakon tretmana sa IL-2 na 20.46 ± 3.99 %, a nakon tretmana sa IL-15 visoko statistički značajno povećanje (p≤0.01,Wilcoxon test) na 26.99 ± 5.96 % (Slika 17a ,c). 81 Slika 17. a) Povećanje procenata ekspresije CD158a inhibitornog KIR receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija infiltrisanih LČ nakon 7 dana in vitro tretmana interleukinom IL-15(25 ng/ml) i CD158b KIR-a neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ nakon tretmana interleukinima IL-2(200IU) i IL-15 u odnosu na kontlolu (medijum) (*p≤0.05, **p≤0.01, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) i c) Reprezentativni tačkasti dijagram dobijeni na protočnom citometru. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 medijum IL-2 IL-15 P ro ce n at ( % ) 82 Efekti interleukina IL-2 i IL-15 na zastupljenost ranog aktivacionog antigena CD69 Procenat ekspresije CD69 ranog aktivacionog antigena u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih LČ se nakon 7 dana tretmana interleukinom IL-2 statistički značajno povećao (p≤0.05,Wilcoxon test) sa vrednosti u medijumom (45.03 ± 5.83 % kod neinfiltrisanih i 35.29 ± 3.74 % kod infiltrisanih LČ) na 69.52 ± 5.30 % kod neinfiltrisanih LČ i na 41.50 ± 3.46% kod infiltrisanih LČ. Nakon tertmana intterleukinom IL-15 ekspresija CD69 se visoko značajno (p≤0.01,Wilcoxon test) povećala na 74.49 ± 3.09 % kod neinfiltrisanih LČ i na 48.31 ± 3.32 % kod infiltrisanih LČ (Slika 18a,b). Slika 18. Povećanje procenta ekspresije ranog aktivacionog antigena CD69 u populaciji CD3- CD56+ NK ćelija regionalnih LČ nakon 7 dana in vitro tretmana interleukinima IL-2 (200 IU/ml) i IL-15 (25 ng/ml) u odnosu na kontrolu (medium) (*p≤0.05, **p≤0.01, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezentativni tačkasti dijagrami dobijeni na protočnom citometru. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 medijum IL-2 IL-15 83 4.5.6 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na zastupljenost receptora u CD3- CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija Osim efekata interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju receptora u populaciji ukupnih CD3-CD56+ NK ćelija, praćeni su i efekti ovih citokina na ekspresiju receptora u funkcionalno različitim CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija. Ekspresija NKG2D aktivacionog receptora u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija se nakon 7 dana in vitro kultivacije statistički značajno povećala (p≤0.05, Wilcoxon test) kod neinfiltrisanih LČ sa 46.21 ± 7.01 % u kontroli na 62.96 ± 4.54 % nakon tretmana sa IL-2, i na 62.16 ± 4.59 % nakon tretmana sa IL-15. Kod tumor- infiltrisanih LČ, u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija se takođe povećala ekspresija NKG2D receptora sa 43.70 ± 4.40 % u kontroli na 60.02 ± 5.18% nakon tretmana sa IL-2 i na 62.55 ± 7.01 % nakon tretmana sa IL-15, pri čemu su ove promene visoko statistički značajne (p≤0.01,Wilcoxon test) (Slika 19). Za razliku od CD3- CD56potmulo+, u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija ekspresija NKG2D receptora se nije značajno promenila u odnosu na kontrolu nakon tretmana pomoću ispitivanih citokina u obe grupe regionalnih LČ obolelih od melanoma (Slika 19). Slika 19. Povećanje procenta ekspresije NKG2D aktivacionog receptora u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ nakon 7 dana in vitro kultivacije interleukinima IL-2 (200 IU/ml) i IL-15 (25 ng/ml) u odnosu na kontrolu (medijum) (*p≤0.05, **p≤0.01, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 medijum IL-2 IL-15 84 Nakon 7 dana tretmana, ekspresija CD16 aktivacionog receptora u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih regionalnih LČ se nakon tretmana sa IL-15 visoko statistički značajno povećala (p≤0.01,Wilcoxon test) sa 31.00 ± 4.73 % u medijumu na 45.35 ± 5.65 %, a kod infiltrisanih LČ statistički značajno (p≤0.05,Wilcoxon test) sa 23.71± 4.38 % u kontroli na 38.11 ± 7.27% (Slika 20). Za razliku od IL-15, tretman sa IL-2 nije statistički značajno (p≥0.05,Wilcoxon test) povećao ekspresiju CD16 recptora u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija (Slika 20). Nakon 7 dana in vitro tretmana ekspresija CD16 u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih LČ se statistički značajno (p≤0.05,Wilcoxon test) povećala sa 14.92 ± 4.07 % u medijumu nakon tretmana sa IL-2 na 21.84 ± 3.77%, a nakon tretmana sa IL-15 na 25.10 ± 3.90%. Kod infiltrisanih LČ u ovoj subpopulaciji tretman sa IL-2 je statistički značajno (p≤0.05,Wilcoxon test) povećao ekspresiju CD16 sa 25.29 ± 6.04% u kontroli na 28.72 ± 4.16% (Slika 20). Slika 20. Povećanje procenta ekspresije CD16 aktivacionog receptora u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ nakon 7 dana in vitro kultivacije sa IL-15 (25 ng/ml) u odnosu na kontrolu (medijum). Povećanje ekspresije CD16 receptora u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji neinfiltrisanih LČ nakon tretmana sa IL-2 (200 IU) i IL-15 i infiltrisanih LČ nakon tretmana sa IL-2, u odnosu na kontrolu (*p≤0.05, **p≤0.01, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. 0 10 20 30 40 50 60 medijum IL-2 IL-15 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČneinfiltrisani LČ infiltrisani LČ CD3-CD56potmulo+ CD3 -CD56sjajno+ * ** * * * 85 Nakon 7 dana tretmana kod tumor-infiltrisanih LČ došlo je do povećanja ekspresije (p≤0.01,Wilcoxon test) CD158a inhibitornog KIR receptora u CD3- CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija sa 12.88 ± 2.15 % u medijumom na 24.52 ± 4.96 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 21), dok se kod neinifiltrisanih LČ ekspresija CD158a u ovoj subpopulaciji NK ćelija nije značajno promenila. Ekspresija CD158a KIR-a u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija obe grupe regionalnih LČ obolelih od melanoma se nije značajno promenila nakon tretmana ispitivanim citokinima u odnosu na kontrolu (Slika 21). Slika 21. Povećanje procenta ekspresije CD158a inhibitornog KIR receptora u CD3- CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija infiltrisanih regionalnih LČ nakon 7 dana in vitro tretmana sa IL-15 (25 ng/ml) u odnosu na kontrolu (medijum) (**p≤0.01, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. Ekspresija CD158b inhibitornog KIR receptora se nakon 7 dana tretmana sa IL- 2 statistički značajno povećala (p≤0.05,Wilcoxon test) u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih LČ sa 30.42 ± 7.12 % u kontroli na 40.73 ± 5.78 %, a kod infiltrisanih LČ sa 23.25 ± 5.18 % u kontroli na 30.53 ± 5.18 % (Slika 22). Nakon tretmana sa IL-15 kod obe grupe LČ dobijena su povećanja ekspresije koja nisu statistički značajna u odnosu na kontrolu (p≥0.05,Wilcoxon test) (Slika 22). Ekspresija CD158b KIR receptora u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija se nakon tretmana sa IL-15 kod neinfiltrisanih LČ statistički značajno 0 5 10 15 20 25 30 35 40 medijum IL-2 IL-15 P ro ce n at C D 1 5 8 a+ (% ) 86 povećala(p≤0.05,Wilcoxon test) sa 7.52 ± 4.09 % u medijumu na 15.32 ± 3.36 %, a kod tumor-infiltrisanih LČ visoko statistički značajno (p≤0.01,Wilcoxon test) sa 4.85 ± 1.14 % medijumu na 18.75 ± 8.43 % (Slika 22). Nakon tretmana sa IL-2 kod neinfiltrisanih LČ povećanje ekspresije CD158b na 11.29 ± 2.79 % nije dostiglo statističku značajnost (p≥0.05,Wilcoxon test), dok je kod infiltrisanih LČ povećanje na 8.56 ± 1.59% visoko statistički značajno (p≤0.01,Wilcoxon test) (Slika 22 ). Slika 22. Povećanje procenta ekspresije CD158b inhibitornog KIR receptora u CD3- CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih regionalnih LČ nakon 7 dana in vitro tretmana sa IL-2 (200 IU/ml) u odnosu na kontrolu (medijum). Povećanje ekspresije CD158b KIR-a u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih LČ nakon 7 dana tretmana sa IL-15 (25 ng/ml) i infiltrisanih LČ nakon tretmana interleukinima IL-2 i IL-15, u odnosu na kontrolu (*p≤0.05, **p≤0.01, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. Ekspresija CD69 ranog aktivacionog antigena u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih regionalnih LČ se statistički značajno povećala (p≤0.05, Wilcoxon test) sa 53.17 ± 7.00% u medijumu na 70.61 ± 5.47 % nakon tretmana sa IL-2 i na 70.52 ± 4.42 % nakon tretmana sa IL-15. Slično tome kod tumor-infiltrisanih regionalnih LČ dobijenoi je visoko statistički značajno povećanje (p≤0.005,Wilcoxon test) ekspresije CD69 antigena sa 40.58 ± 3.74 % u medijumu na 49.31 ± 3.32 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 23). 0 10 20 30 40 50 60 medijum IL-2 IL-15 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČneinfiltrisani LČ infiltrisani LČ CD3-CD56potmulo+ CD3 -CD56sjajno+ P ro ce n a t C D 1 5 8 b + (% ) ** ** * * * 87 U CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih regionalnih LČ ekspresija CD69 aktivacionog antigena se statistički značajno povećala (p≤0.01,Wilcoxon test) sa 33.41 ± 4.37 % u kontroli na 69.16 ± 3.32 % nakon tretmana sa IL-2 i na 75.03 ± 7.09 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 23). Slični rezultati dobijeni su i kod infiltrisanih LČ gde se ekspresija CD69 antigena sa 30.97 ± 3.74 % u kontroli visoko statistički značajno (p≤0.01,Wilcoxon test) povećala nakon tretmana sa IL- 2 na 51.07 ± 3.46 % i statistički značajno (p≤0.05,Wilcoxon test) na 51.52 ± 0.01 % nakon tretmana sa IL-15 (Slika 23). Slika 23. Povećanje procenta ekspresije ranog aktivacionog antigena CD69 u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih LČ nakon 7 dana in vitro tretmana sa IL-2 (200IU/ml) i IL-15 (25ng/ml) i infiltrisanih regionalnih LČ nakon tretmana sa IL-15, u odnosu na kontrolu (medijum). Povećanje ekspresije CD69 antigena u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija neinfiltrisanih i infiltrisanih LČ nakon 7 dana tertmana sa IL-2 i IL-15, u odnosu na kontrolu (*p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.005, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. 4.6 Poređenje efekta interliukina IL-2 i IL-15 na citotoksičnu aktivnost NK ćelija neinifiltrisanih i tumor-infiltrisanih limfnih čvorova Da bi se nivo povećanja citotoksične aktivnosti NK ćelija uporedio između dve grupe regionalnih LČ obolelih od melanoma izračunati su indeksi dobijeni kada se vrednost NK ćelijske aktivnosti u svakoj grupi posle tretmana citokinom podeli sa 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 medijum IL-2 IL-15 P ro ce n at C D 6 9 + (% ) 88 vrednošću NK ćelijske aktivnosti dobijene posle tretmana samom medijumom prema sledećoj formuli: Citotoksična aktivnost NK ćelija posle tretmana citokinom Citotoksična aktivnost NK ćelija u medijumu Nakon 7 dana tretmana interleukinom IL-2 dobijen je sličan indeks promene citotoksične aktivnosti NK ćelija kod neinfiltrisanih (4.69 ± 1.01) i kod infiltrisanih (5.23 ± 1.31) LČ, dok je nakon 7 dana tretmana interleukinom IL-15 kod neinfiltrisanih LČ (5.87± 1.01) dobijen statistički značajno (p≤0.05, Mann Whitney test) veći indeks povećanja NK-citotoksičnosti u odnosu na tumor-infiltrisane (3.62± 0.24) regionalne LČ (Slika 24). Slika 24. Veći indeks povećanja citotoksične aktivnosti NK ćelija neinfiltrisanih u odnosu na infiltrisane LČ nakon 7 dana tretmana interleukinom IL-15 (* p≤0.05, Mann Whitney test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. Indeks promene ekspresije receptora nakon tretmana citokinima je izračunavan po istom principu kao i za citotoksičnu aktivnost NK ćelija. Analizom indeksa promene ekspresije CD158a inhibitornog KIR receptora u CD3-CD56+ populaciji NK ćelija nakon tretmana interleukinom IL-15 kod tumor-infiltrisanih LČ dobijen je statistički u značajno veći (p≤0.05, Mann Whitney test) indeks promene ekspresije u odnosu na neinifiltrisane LČ (vrednosti indeksa su 1.21 ± 0.21 za neinfiltrisane i 2.23 ± 0.58 za infiltrisane LČ) (Slika 25). Sličan nalaz dobijen je i analizom indeksa promene 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ 89 ekspresije CD158a inhibitornog KIR receptora u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija gde je indeks promene ekspresije dobijen u infiltrisanim LČ (2.19 ± 0.44) statistički u značajno veći (p≤0.05, Mann Whitney test) u odnosu na indeks dobijen kod neinfiltrisanih LČ (1.17 ± 0.19) (Slika 25). Slika 25. Veći indeks promene ekspresije CD158a inhibitornog KIR receptora u populaciji CD3-CD56+ i u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija infiltrisanih regionalnih LČ u odnosu na neinfiltrisane regionalne LČ nakon 7 dana in vitro tretmana interleukinom IL-15 (p≤0.05, Mann Whitney test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. 4.7 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju STAT1 i STAT5 signalnih molekula Western blot metodom nakon 72h in vtiro kultivacije praćena je indukcija fosforilisane forme STAT1 i STAT5 signalnih molekula u regionalnim LČ bolesnika sa melanomom. Ekspresija STAT1p i STAT5p signalnih molekula izražena je u odnosu na β aktin i pokazano je da nakon tretmana interleukinom IL-2 dolazi do statistički značajnog (p≤0.05, Wilcoxon test) povećanja nivoa pSTAT1 i pSTAT5 molekula u odnosu na kontrolni tertman medijumom, dok tretman interleukinom IL-15 aktivira specifično povaćava nivo pSTAT5 molekula kod ispitivanih regionalnih LČ obolelih od melanoma (Slika 26a,b). 0 1 2 3 4 5 6 7 8 neinfiltrisani LČ infiltrisani LČ p≤0.05 p≤0.05 CD3-CD56+CD158a+ CD3-CD56potmulo+CD158a+ 90 Slika 26. Povećanje ekspresije fosforilisanih formi signalnih molekula u regionalnim LČ izraženo u odnosu na β aktin: pSTAT1 nakon 72 sata in vitro tretmana interleukinom IL-2 (200 IU/ml) i pSTAT5 nakon 72 sata tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 (25 ng/ml) (*p≤0.05, Wilcoxon test) u odnosu na kontrolu (medijum). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezentativni Western blot rezultat. 4.8 In vitro efekti interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju Bcl-2 molekula Da bi se dobio bolji uvid u delovanje ovih citokina na apoptozu nakon 72 sata Western blot metodom je praćena ekspresija antiapoptotoskog Bcl-2 molekula i izražena u odnosu na β aktin. Nakon 72 sata tretmana pokazano je povećanje ekspresije Bcl-2 molekula nakon tretmana interleukinom IL-15, dok tretman interleukinom IL-2 nije promenio nivo ovog molekula u odnosu na kontrolni tretman (medijum) s(Slika 27 a,b). 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 medijum IL-2 IL-15 p ST A T /β a kt in M e d ij u m IL -2 IL -1 5 M e d ij u m IL -2 IL -1 5 91 Slika 27. a) Povećanje ekspresije Bcl-2 antiapototskog molekula u odnosu na β aktin nakon 72 h in vitro tretmana MNĆ regionalnih LČ obolelih od melanoma IL-15 ( 25 ng/ml) u odnosu na kontrolu (medijum) (*p≤0.05, Wilcoxon test). Prikazane su srednje vrednosti sa standardnim greškama. b) Reprezantativni Western blot rezultat. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 92 5 Diskusija NK ćelije kao efektorske ćelije sistema urođene imunosti predstavlaju prvu liniju odbrane organizma od malignih tumora te su funkcija i fenotipska svojstava NK ćelija bolesnika sa malignitetima često proučavani. Kod obolelih od malignih bolesti do sada su NK ćelije izučavane uglavnom u perifernoj krvi (Sibbitt et al., 1984; Siedell et al., 1998; Konjević et al., 2007; 2010; 2012; Szczepanski et al., 2009) dok su NK ćelije regionalnih limfnih čvorova obolelih, slabo ispitivane bez obzira na značaj limfnih čvorova kao prve barijere u limfogenom širenju tumora. Malobrojni podaci o NK ćelijama regionalnih limfnih čvorova su dobijeni na životinjskim modelima (Chen et al., 2005), dok efekat prisustva ćelija tumora u limfnom čvoru na funkciju i fenotip NK ćelija do sada nije u potpunosti razjašnjen. Usled etičkih i praktičnih problema tkivo regionalnih limfnih čvorova zdravih osoba je teško dostupno. Iz tih razloga prave kontrolne vrednosti za funkciju NK ćelija, zastupljenost subpopulacija NK ćelija i fenotip NK ćelija u limfnim čvorovima zdravih osoba nisu još uvek precizno ustanovljene. Dosadašnje studije koje su vršene na ljudima prikazivale su fenotip NK ćelija limfnih čvorova u fiziološkim uslovima, a da su pri tome uzorci tkiva uzimani uglavnom nakon različitih hirurških intervencija (Frerlazzo et al., 2004; Romagnani et al., 2007). Do sada nisu vršena poređenja u funkcionalnim i imunofenotipskim karakteristikama NK ćelija između tumor-infiltrisanih i neinfiltrisanih regionalnih limfnih čvorova obolelih od malignih tumora, te su rezultati dobijeni u ovom radu na obolelima od melanoma prvi podaci te vrste dobijeni za regionalne limfne čvorove ne samo kod melanoma, već i kod malignih tumora uopšte. U ovom istraživanju poređene su dve važne funkcionalne karakteristike NK ćelija u tumor-infiltrisanim i neinfiltrisanim regionalnim limfnih čvorova obolelih od melanoma: citotoksična funkcija NK ćelija i produkcija IFNγ u CD3-CD56+ NK ćelijama. U malignitetima je do sada ispitivana citotoksična funkcija uglavnom NK ćelija periferne krvi, pri čemu je pokazano da je NK ćelijska citotoksičnost često snižena u odmaklim stadijumima bolesti u odnosu na zdrave osobe (Sibbitt et al., 1984; Siedell et al., 1998; Konjevic et al., 2012). Značaj očuvane citotoksične funkcije NK ćelija u sprečavanju pojave maligniteta je pokazan u retrospektvinim epidemiološkim 93 istraživanjima koja su pokazala da snižena NK-citotoksičnost predstavlja faktor rizika za pojavu malignih tumora (Imai et al., 2000). U ovom radu ispitivanjem citotoksične aktivnosti NK ćelija prema NK-osetljivoj K562 ćelijskoj liniji eritromijeloidne leukemije kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova dobijenje su slične vrednosti NK- citotoksičnosti. Dobijeni rezultati za citotoksičnost NK ćelija regionalnih limfnih čvorova kod melanoma su u saglasnosti sa niskom citotoksičnošću ove subpopulacije limfocita u limfnim čvorovima u odnosu na citotoksičnost NK ćelija u perifernoj krvi (Ferlazzo et al., 2004; Romagnano et al., 2007). Isto tako, ove vrednosti citotksičnosti dobijene za regionalne limfne čvorove su niže od citotoksičnosti NK ćelija periferne krvi bolesnika sa melanomom koje su dobijene u našim prethodnim istraživanjima (Konjević et al., 2007). Za razliku od NK ćelija periferne krvi gde je kod metastatskog melanoma pokazano smanjenje citotoksične funkcije NK ćelija u odnosu na zdrave osobe i na manje uznapredovale kliničke stadijume bolesti (Sibbitt et al., 1984; Siedell et al., 1998; Konjević et al., 2007; Mirjačić Martnović et al., 2011), invazija tumora u regionalne limfne čvorove nije dovela do smanjenja citotoksične aktivnosti NK ćelija tumor-infiltrisanih u odnosu na neinifiltrisane regionalne limfne čvorove. Pored citotoksične aktivnosti, druga funkcionalna karakteristika važna za antitumorsko dejstvo NK ćelija, je njihova imunoregulatorna uloga čiji je jedan od aspekata sinteteza IFNγ čime NK ćelije deluju na sintezu Th1 citokina i na sazrevanje dendritičnih ćelija (Biron et al., 1999; Martín-Fontecha et al., 2004; Morandi et al., 2006). Analizom na protočnom citometru nakon stimulacije PMA i jonomicinom, dobijen je niži procenat CD3-CD56+ NK ćelija koje produkuju IFNγ u infiltrisanim u odnosu na neinfiltrisane limfne čvorove obolelih od melanoma. Detaljna analiza produkcije IFNγ u CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija, pokazala je da je snižen nivo ovog citokina u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima uslovljen smanjenom sposobnošću sinteze IFNγ u imunoregulatornoj CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija. Produkcija IFNγ dobijena u subpopulaciji citotoksičnih CD3- CD56potmulo+ NK ćelija koja se prema najnovijim saznanjima odlikuje sposobnošću da ubrzo nakon stimulacije sintetišu IFNγ (DeMaria et al., 2010) je slična kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova. 94 Smanjena produkcija IFNγ u NK ćelijama tumor-infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova najverovatnije je uslovljena prisutvom imunosupresivnih molekula IL-10, TGF-β i PGE2 koje mogu da sintetišu i luče tumorske ćelije (Yue et al. 1997; Kubica i Brewer, 2012) u limfnom čvoru kao i imunosupresivne ćelije imunskog sistema kao što su MDSC, Treg, TAM i tolerogene dendritične ćelije (Geissmann et al., 2002; Cochran et al., 2006; Umansky i Sevko, 2013). Ovi imunosupresivni citokini inhibiraju sazrevanje dendritičnih ćelija, stimulišu stvaranje imunosupresivnih tolerogenih dendritičnih ćelija, sprečavaju aktivaciju T ćelija i na taj način, posredno, i sintezu IFNγ u NK ćelijama (Takayama et al., 2001). Pored toga, u ćelijama melanoma konstitutivno aktivan Ras/Raf signalni put, posredstvom NF-κB transkripcionog faktora indukuje produkciju hemokina i drugih proinflamatornih medijatora kao što su TNF-α, IL-1, IL- 6, IL-8. Prisustvo ovih faktora u tumorskom tkivu dovodi do nakupljanja imunosupresivnih ćelija koje sintezom mogu da IL-10 i TGF-β inhibiraju sintezu IFNγ (Gabrilovich i Nagaraj, 2009; Umansky i Sveko, 2012). Snižen procenat NK ćelja koje sintetišu IFNγ u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima koji je dobijen u ovom radu u saglasnosti je sa objavljenim podacima o sniženom nivou IFNγ u celokupnoj populaciji mononuklearnih ćelija u limfnim čvorovima sa metastatskim promenama (Leong et al., 2002). U literaturi takođe postoje podaci o sniženom nivou produkcije IFNγ i u NK ćelijama u tumor-infiltrišućim limfocitima (TIL) (Platonova et al., 2011). Za sniženu produkciju IFNγ u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima koja je dobijena u ovom radu značajan je i podatak dobijen u jednoj studiji koji govori o povećanom nivou Th2 citokina (IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13) kao i hemkina (CCLl5, CCL11 i CXCL-10) u perifernoj krvi bolesnika sa metastatskim melanom u odnosu na serume zdravih kontrolenih osoba i bolesnika na kojima je izvršena hirurška resekcija melanoma, a u kojima preovlađuju Th1 citokini. Prema ovoj studiji Th2 citokinski profil nađen kod metastatkog melanoma je posledica povećanog nivoa VEGF koji produkuje tumor (Nevala et al., 2009). Veći procenat CD3-CD56+ NK ćelija u tumor-infiltrisanim u odnosu na neinfiltrisane limfne čvorove obolelih od melanoma koji je dobijen u ovom radu, može da ukaže na to da je metastaziranje ovog tumora u regionalne limfne čvorove praćeno i invazijom NK ćelija u limfne čvorove zahvaćene tumorom. Do sada su objavljene samo dve studije koje se bave analizom subpopulacija limfocita u regionalnim limfnim 95 čvorovima bolesnika sa malignim tumorima, a koje takođe ukazuju na veću zastupljenost celokupne CD56+ subpopulacije limfocita u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima karcinoma dojke (Morton et al., 1986) i melanoma (Farzad et al., 1990). Pored povećanog procenta CD3-CD56+ NK ćelija, analizom funkcionalnih subpopulacija NK ćelija u regionalnim limfnim čvorovima bolesnika sa melanomom pokazana je veća zastupljenost CD3-CD56potmulo+ subpopulacije u infiltrisanim u odnosu na neinfiltrisane limfne čvorove. S obzirom na to da su NK ćelije veoma pokretljive i da recirkulišu u i van limfoidnih organa (Garrod et al., 2007; Walzer i Vivier, 2011), može se pretpostaviti da kod obolelih od melanoma NK ćelije vrše invaziju u regionalne limfne čvorove zahvaćene tumorom gde mogu da liziraju maligne ćelije, intereaguju sa susednim antigen prezentujućim ćelijama, svojom citotoksičnošću i sintezom IFNγ pospeše efikasnost prezentacije antigena i deluju stimululativno na aktivaciju i sazrevanje dendritičnih ćelija (Martín-Fontecha et al., 2004). U ovom radu pored korelacione povezanosti broja tumor-infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova (N) sa zastupljenošću CD3-CD56+ NK ćelija u limfnom čvoru, pokazana je i pozitivna korelacija zastupljenosti NK ćelija u limfnom čvoru sa Klark kliničkim parametrom koji opisuje invazivnost melanoma u anatomske slojeve kože. Povećana zastupljenost CD3- CD56potmulo+ NK ćelija u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima može da se sagleda i u svetlu novijih saznanja o diferencijaciji nezrelih CD3-CD56sjajno+ u funkcionalno zrelije CD3-CD56potmulo+ NK ćelije u reaktivnim limfnim čvorovima, koje zatim napuštaju limfni čvor i cirkulišu do perifernih tkiva u kojima se odvija određeni patološki proces zapaljenje ili maligna transformacija (Romagnani et al., 2007). U tom smislu, pokazano je i da se CD3-CD56sjajno+ NK ćelije u eksperimentalnim uslovima in vitro kultivacije sa normalnim i maligno transformisanim fibroblastima diferenciraju u CD3-CD56potmulo+ NK ćelije (Chan et al., 2007, Balsamo et al., 2009). Pored diferencijacije CD3- CD56sjajno+ u CD3-CD56potmulo+ NK ćelije, povećanje procenta CD3-CD56potmulo+ NK ćelija može biti posledica i njihove migracije putem periferne krvi i limfe u limfne čvorove zahvaćene tumorom (Carrega i Ferlazzo, 2012). Sa gledišta uticaja neposrednog prisustva malignih ćelija na fenotip i funkciju NK ćelija, do sada su analizirane uglavnom NK ćelije u tumorskom tkivu. U TIL nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC, engl. Non Small Cell Lung Cancer) 96 pokazana je veća zastupljenost NK ćelija u većim u odnosu na manje tumore (Carrega et al., 2008). Međutim, postojeći podaci o subpopulacijama NK ćelija u populaciji TIL su različiti za različite vrste tumora, pa je tako kod karcinoma bubrega pokazana povećana zastupljenost CD3-CD56potmulo+ subpopulacije u TIL koji sadrže veliki procenat NK ćelija u odnosu na TIL u kojima CD3-CD56+ NK ćelije predstavljaju manji udeo populacije limfocita (Schleypen et al., 2006). Nasuprot ovim podacima, u pomenutoj studiji rađenoj na NSCLC nađena je veću zastupljenost CD3-CD56sjajno+ subpopulacije NK ćelija u TIL (Carrega et al., 2008). Analiza ekspresije NKG2D aktivacionog receptora u populaciji CD3-CD56+ NK ćelija je pokazala sličnu zastupljenost ovog receptora koji je svojstven kako funkcionalno zrelijim tako i nezrelim NK ćelijama (Yokoyama et al., 2004; Huntington et al. 2007;Zafirova et al., 2011), u neinfiltrisanim i u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima. Pored toga, u ovom radu dobijena je i slična ekspresija NKG2D receptora u obe ispitivane grupe regionalnih limfnih čvorova i u CD3-CD56potmulo+ i u CD3- CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija. Za CD16 aktivacioni receptor koji je za razliku od NKG2D svojstven zrelijim razvojnim stadijumima u ovom radu je dobijena veća zastupljenost u tumor-infiltrisanim u odnosu na neinfiltrisane limfne čvorove. Međutim, bez obzira na veću zastupljenost CD16 receptora u populaciji ukupnih CD3-CD56+ NK ćelija u infiltrisanim limfnim čvorovima nije zapažena razlika u njegovoj zastupljenosti u funkcionalno različitim CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija. Pored toga, bez obzira na povećanu ekspresiju CD16 aktivacionog receptora na NK ćelijama tumor-inifltrisanih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom i na veću zastupljenost CD3-CD56potmulo+ subpopulacije NK ćelija u ovoj grupi regionalnih limfnih čvorova, njihova citotoksična funkcija je slična kao i kod NK ćelija neinfiltrisanih limfnih čvorova. Pokazana neizmenjena citotoksičnost zajedno sa sličnom ekspresijom NKG2D aktivacionog receptora može da ukaže na veći znaćaj NKG2D u odnosu na CD16 aktivacioni receptor na citotoksičnu funkciju NK ćelija regionalnih limfnih čvorova. Do sada je ekspresija NKG2D i CD16 aktivacionih receptora na NK ćelijama u melanomu izučavana uglavnom u perifernoj krvi pri čemu je nađeno sniženje ekspresije oba receptora kod bolesnika sa metastatskim melanomom u odnosu na zdrave kontrolne 97 osobe (Konjević et al., 2007; Holtan et al., 2011). U literaturi postoje podaci uglavnom o ekspresiji receptora na NK ćelijama u tumorskom tkivu, ali ne i na NK ćelijama tumor-infiltrisanih i neinfiltrisanih regionalnih limfnih ćvorova bolesnika sa malignitetima. Jedna studija je pokazala da u TIL u melanomu CD3-CD56+ NK ćelije kako na obodima tumora tako i unutar tumora ispoljavaju NKG2D aktivacioni receptor (Maccalli et al., 2007). O ekspresiji CD16 na CD3-CD56+ NK ćelijama TIL podaci su različiti za različite tumore, pa je u TIL karcinoma bubrega pokazan veći udeo CD16+ NK ćelja u većim tumorima, a za NSCLC pored podataka o sniženoj ekspersiji CD16 na CD3-CD56+ NK ćelijama u tumoru (Platonova et al., 2011) postoje i nedavno objavljeni podaci o veoma sličnoj ekspresiji ovog receptora na NK ćelijama u tumoru i u okolnom tkivu (Gillard-Bocquet et al., 2013). Ekspresija inhibitornih KIR receptora je posebno značajna kod melanoma s obzirom na to da je njihova povećana ekspresije na CD3-CD56+ NK ćelijama periferne krvi često povezana sa većom verovatnoćom obolevanja od ovog tumora (Naumova et al., 2007). Pored toga pokazan je i uticaj ekspresije parova KIR2DL alela i njima komplemantarnih HLA-C alela na verovatnoću obolevanja od melanoma kao i na prognozu toka bolesti (Campillo et al., 2013). CD158a (KIR2DL1) i CD158b (KIR2DL2/3) su dva najzastupljenija inhibitorna KIR receptora na NK ćelijama čoveka. Poznato je da su inhibitorni KIR receptori više prisutni na NK ćelijama u perifernoj krvi u odnosu na NK ćelije u limfnim čvorovima (Ferlazzo et al., 2004; Freud i Caligiuri 2006) i da su KIR receptori svojstveniji zrelijoj CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija (Cooper et al., 2001a). U ovom istraživanju je pokazana povećana ekspresija CD158b inhibitornog KIR receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama u tumor-infiltrisanim u odnosu na neinfiltrisane regionalne limfne čvorove obolelih od melanoma, dok su za CD158a inhibitorni KIR dobijene slične niske vrednosti ekspresije u obe grupe ispitivanih limfnih čvorova. Pored toga, pokazano je i da ekspresija CD158b KIR-a na CD3-CD56+ NK ćelijama pokazuje umerenu do dobru pozitivnu korelacionu povezanost sa brojem limfnih čvorova zahvaćenih tumorom i sa Klark kliničkim parametrom invazivnosti primarnog tumora. S obzirom na to da inhibitorni KIR receptori vezivanjem za MHC molekule klase I inhibiraju lizu ciljnih ćelija, posledice povećanog prisustva inhibitronih KIR receptora na NK ćelijama tumor-infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova mogu da budu sagledavane u sklopu ekspresije MHC I liganda na 98 ćelijama tumorskih infiltrata. Mada maligne ćelije često imaju snižen nivo ekspresije MHC I molekula, dešava se i da tumorske ćelije zadržavaju MHC I molekule na svojoj površini (Rodriguez et al., 2005), a u odmaklim stadijumima melanoma je pokazan i povećan nivo MHC molekula klase I na ćelijama tumora (Campoli i Ferrone, 2011). Prema novijim teorijama kontakt inhibitornih KIR receptora na NK ćelijama sa njihovim MHC I ligandima na ćelijama sopstvenog organizma u procesu edukacije je neophodan za funkcionalnu kompetentnost i samim tim i za citotoksičnost NK ćelija. U eksprimentalnim in vitro uslovima je pokazano i da ekspresija inhibitornog KIR-a na NK ćelijama koji je komplementaran MHC I ligandu na ćelijskoj linijni melanoma nije per se dovoljna da inhibra citotoksičnu aktivnost NK ćelija (Carrega et al., 2009). Povećana ekspresija akrivacionog CD16 i inhibitornog CD158b KIR receptora koja je u ovom radu dobijena na NK ćelijama u tumor-infiltrisanim regionalnim limfnim čvorovima bolesnika sa melanomom, je u literaturi opisana u reaktivnim limfnim čvorovima koji se odlikuju prisustvom brojnih sekundarnih folikula sa izraženom proliferacijom limfocita (Romagnani et al., 2007). Rezultati koji su dobijeni u ovom radu su u saglasnosti sa nalazima iz literature, s obzirom da je ovakva morfologija izraženija kod tumor-infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova. U fiziološkim uslovima je pokazano da NK ćelije u limfnim čvorovima mogu i da de novo steknu CD16 i KIR receptore pod uticajem citokina (IL-2, IL-12 i IL-15) koje u reaktivnim limfnim čvorovima sintetišu T ćelije i dendritične ćelije i da zatim eferentnim krvnim i limfnim sudovima napuste limfni čvor kao funkcionalno zrele CD16+KIR+ NK ćelije (Freud et al., 2006; Romagnani et al., 2007; Carrega i Ferlazzo, 2012). Međutim, prisustvo CD16+ i KIR+ NK ćelija u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima može da bude i posledica njihove selektivne migracije. Kao eksperimentalna potvrda migracije NK ćelija CD16+ KIR+ zrelijeg fenotipa u reaktivne limfne čvorove u in vitro uslovima je pokazano da stimulacija CD3-CD56potmulo+ NK ćelija pomoću IL-18 može da dovede do povećanja ekspresije CCR7 hemokinskog receptora koji omogućava njihovo nakupljanje u limfnim čvorovima (Mailliard et al., 2005; Carrega i Ferlazzo, 2012;). Razlike u ekspresiji CD16 i CD158b receptora na NK ćelijama neinfiltrisanih i tumor-inifltrisanih limfnih čvrova koje su u ovom radu pokazane na celokupnoj populaciji CD3-CD56+ NK ćelija nisu dobijene analizom ekspresije ovih receptora u 99 CD3-CD56potmulo+ i CD3-CD56sjajno+ subpopulacijama NK ćelija. Izgleda kao da invazija NK ćelija u limfne čvorove zahvaćene tumorom i povećana brojnost CD3-CD56potmulo+ subpopulacije NK ćelija, ne dovodi unutar subpopulacija do porasta ekspresije ovih receptora svojstvenih zrelijim NK ćelijama. Naime, novi podaci dobijeni u ovom radu ukazuju na to da ekspresija CD16 i CD158b receptora ima sličnu raspodelu između dve subpopulacije NK ćelija, bez obzira na infiltrisanost limfnog čvora tumorom. Pored povećane ekspresije CD16 aktivacionog receptora i CD158b inhibitornog KIR receptora, NK ćelije tumor-inifltrisanih limfnih čvorova odlikuje i povećana ekspresija CD69 ranog aktivacionog antigena. Poznato je da CD69 kao kostimulatorni molekul učestvuje u proliferaciji NK ćelija, izlučivanju citokina i citotoksičnoj aktivnosti NK ćelija (Borrego et al., 1999) i ispoljava se ubrzo po njihovoj aktivaciji. Povećan nivo ekspresije CD69 u tumor infiltrisanim limfnim čvorovima i korelacija njegove ekspresije na CD3-CD56+ NK ćelijama sa brojem limfnih čvorova zahvaćenih tumorom (N) i stepenom invazije melanoma u kožu (klinički Klark parametar), može da ukaže na invaziju NK ćelija koje se ili aktiviraju u limfnom čvori koji je infiltrisan tumorom, ili na aktivaciju tu već prisutnih NK ćelija. Pored toga, dobijeni povećan nivo ekspresije CD69 u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji ali ne i u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji NK ćelija infiltrisanih limfnih čvorova, može biti posledica izraženije sposobnosti CD3-CD56sjajno+ subpopulacije da proliferiše (Fehniger et al., 2003; Romagnani et al., 2007). Povećan nivo ekspresije CD69 pokazan je i na CD3-CD56+ NK ćelijama i to na njihovoj CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji u samom tumoru u odnosu na NK ćelije u okolnom tkivu kod NSCLC i karcinoma dojke (Carrega et al., 2008; Mamessier et al., 2011; Levy et al., 2011; Stojanović et al., 2012). Analizom zastupljenosti aktivacionog antigena HLA-DR, svojstvenog nezrelijim stadijumima razvoja NK ćelija (Freud et al., 2005) i CD25 aktivacionog antigena, je pokazana njihova slična ekspresija na NK ćelijama tumor-infiltrisanih i neinfiltrisanih limfnih čvorova. Ispitivanjem distribucije dve funkcionalno različite subpopulacije NK ćelija u regionalnim limfnih čvorova obolelih od melanoma, u ovom radu je pokazano da sa inavazijom melanoma u regionalne limfne čvorove dolazi do povećane zastupljenosti CD3-CD56+ NK ćelija koje najvećim delom pripadaju CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji. 100 Analiza ekspresije NKG2D, CD16, CD158a i CD158b receptora na NK ćelijama i njihovim subpopulacijama ukazala je na povećanu ekspresiju CD16 aktivacionog receptora i CD158b inhibitornog KIR receptora na NK ćelijama u limfnim čvorovima zahvaćenim tumorom. Slična niska citotoksičnost NK ćelija tumor-infiltrisanih i neinfiltrisanih regionalnih limfnih čvorova može biti posledica slične ekspresije NKG2D aktivacionog receptora na CD3-CD56+ NK ćelija, bez obzira na povećanu ekspresiju CD16 aktivacionog receptora na ovoj populaciji u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima. Kako je u eksperimentalnim uslovima kod melanoma pokazano da su metastatske tumorske ćelije u limfnom čvoru usled ispoljavanja specifičnih stresogenih proteina podložnije lizi NK ćelijama u odnosu na tumorske ćelije koje su mestastazirale u visceralne organe (Lakshmikanth et al., 2009), novi podaci o ekspresiji grupe aktivacionih i inhibitornih receptora kod neinfiltrisanih i tumor-infiltrisanih limfnih čvorova mogu da ukažu na kompenzatornu ulogu koju NK ćelije imaju u tumor- infiltrisanim limfnim čvorovima. Melanom kože je invazivan malignim tumorom koga odlikuju neosetljivost na zračnu terapiju i slaba osetljivost na hemioterapiju usled malog stepena indukcije apopotoze ovih tumorskih ćelija pri primeni hemioterapijskih agenasa (Gray-Shopfer et al., 2007). S obzirom na imuniogeničnost melanoma, u novije vreme u lečenju melanoma, bilo samostalno, bilo u kombinaciji sa hemioterapijskim agensima sve više se primenjuje nespecifična imunoterapija citokinima (Fewkes i Mackall, 2010). U tom smislu do sada se u lečenju metastatskog melanoma već više od dve decenije primenjuje IL-2, a citiokini novije generacije se intenzivno ispituju u pretkliničkim istraživanjima. Ozbiljan kandidat za kliničku primenum u lečenju melanoma, karcinoma bubrega i pedijatrijskih solidnih tumora (Fehniger et al., 2002; Steel et al., 2012) je IL-15, citokin čija je nedvosmislena uloga u razvoju i sazrevanju NK ćelija već pokazana u fiziološkim uslovima (Kennedey et al., 2000; Huntington et al., 2009). Iako regionalni limfni čvorovi zbog svoje povezanosti sa lokalizacijom primarnog tumora imaju značajnu ulogu u sprečavanju metastaziranja, efekti citokina na NK ćelije regionalnih limfnih čvorova obolelih od malignih tumora do sada nisu izučavani. U ovom radu ispitivani su in vitro efekti citokina IL-2, koji povećava citotoksičnost NK ćelija i koristi se u lečenju melanoma i IL-15, citokina neophodnog 101 za sazrevanje NK ćelija, na imunofenotip i citotoksičnu funkciju NK ćelija regionalnih limfnih čvorova obolelih od melanoma. Dobijeni rezultati ukazuju na to da se relativno niska NK-citotoksičnost koja je pokazana kod svežih uzoraka limfnih čvorova pre tretmana, nakon 72 sata in vitro kultivacije u prisustvu interleukina IL-2 i IL-15 značajno i višestruko povećava kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova. Povećanje citotoksične aktivnosti NK ćelija u odnosu na kontrolni tertman se nastavlja i produžavanjem trajanja ovih tretmana na 7 dana. Povećanje citotoksičnosti NK ćelija regionalnih limfnih čvorova koje je dobijeno u ovom radu nakon in vitro tretmana pomoću citokina IL-2 i IL-15 je u skladu sa postojećim podacima u literaturi dobijenim nakon ispitivanja dejstava ovih citokina na citotoksičnost NK ćelija poreklom iz sekundarnih limfnih organa (krajnici, slezina i limfni čvorovi) zdravih osoba (Ferlazzo et al., 2004; Romagnani et al., 2007), kao i na mišijim modelima (Fheniger et al., 2007) i to uglavnom praćenjem sadržaja citotoksičnih medijatora perforina i granzima u NK ćelijama metodom protočne citometrije nakon tretmana slične dužine i istim koncentracijama citokina kao u ovom radu. Povećanje citotoksične aktivnosti NK ćelija pod dejstvom interleukina IL-2 u in vitro uslovima je još osamdesetih godina prošlog veka pokazano na NK ćelijama periferne krvi (London et al., 1986; Trinchieri et al., 1984) i doprinelo je uvođenju ovog citokina u terapiju melanoma i karcinoma bubrega gde se ovaj citokin primenjuje od 1992. godine (Rosenberg et al., 1994). Ovakav efekat interleukina IL-2 na citotoksičnost NK ćelija periferne krvi je dobro proučen u in vitro uslovima kod zdravih osoba i bolesnika sa malignitetima (Zhang et al., 2008; Konjević et al., 2007; 2010; 2012 ) i na trajnim NK ćelijskim linijama (Zhang et al., 2008). S obzirom na njegovu visoku toksičnost kada se direktno primenjuje kod ljudi, sve više se ispituju i načini ex vivo primene ovog citokina u cilju generisanja visoko-citotoksičnih NK ćelija radi njihove terapijske primene kod bolesnika sa malignitetima (Saito et al., 2013; Geller i Miller, 2011). U tom smislu i rezultati dobijeni u ovom radu ukazuju na potencijalni značaj ex vivo primene interleukina IL-2 na NK ćelije poreklom iz regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom. 102 Povećanje citotoksičnosti NK ćelija nakon in vitro tretmana interleukinom IL-15 je prvobitno pokazano na ćelijama periferne krvi zdravih osoba i to nakon stimulacija u trajanju od 18, 24 i 48 sata primenom iste koncentracije ovog citokina koja je korišćena u ovom radu (Siedel et al., 1998; Zhang et al., 2008; Fernandez et al., 2013). Pored ovih podataka u literaturi je pokazano i povećanje NK-citotoksičnosti primenom duplo niže koncentracije interleukina IL-15 u dužim tertmanima prema standardnoj NK-osetljivoj K562 eritromijeloidnoj ćelijskoj linji, tako i prema ćelijama Ewingovog sarkoma (Verhoven et al., 2008). Efekat interleukina IL-15 na citotoksičnu aktivnost NK ćelija periferne krvi bolesnika sa malignitetaima koja je često snižena u odnosu na NK- citotoksičnost zdravih osoba je počeo da se ispituje u novije vreme. U tom smislu, postoje objavljeni podaci o tome da IL-15 kod obolelih od akutne mijeloidne leukemije indukuje citotoksičnost NK ćelija prema K562 ciljnoj ćelijskoj liniji (Szczepanski et al., 2009), kao i kod obolelih od osteosarkoma prema ćelijama ovog malignog tumora (Buddingh et al., 2010; Cho et al., 2010; Verhoven et al., 2010). Povećanje NK citotoksičnosti pokazano je nakon transfekcije IL-15 gena u trajnu NK ćelijsku liniju, NK-92 (Zhang et al., 2004). U novije vreme, s ozirom na to da IL-15 ispoljava izraženiji biološki efekat kada je trans prezentovan, u odnosu na svoju solubilnu formu, vršeni su eksperimenti u kojima su NK ćelije kultivisane u prisustvu K562 ćelijske linije koja je modifikovana tako da na svojoj membrani poseduje IL-15 vezan za IL-15Rα lanac i 41-BBL (CD137L) kostumulatorni molekul. Pokazano je da ovako modifikovane K562 ćelije visoko-specifično aktiviraju NK ćelije (Fujisaki et al., 2009). Na ovaj način su dobijene visoko-citotoksične NK ćelije čija se terapijska primena u tumorima intenzivno ispituje (Geller i Miller, 2011). U tim uslovima IL-15 koji je trans prezentovan na IL-15Rα lancu doveo je do povećanja citotoksičnog dejstva NK ćelija prema multipnom mijelomu (Garg et al., 2012), Ewing sarkomu i rambdomiosarkomu (Cho et al., 2010). U ovom radu nakon 72 sata in vitro tretmana ineterleukinima IL-2 i IL-15 je praćena sinteza perforina, proteolitičkog enzima koji direktno učestvuje u citotoksičnom ubijanju malignih ćelija. Naime, pored povećanja NK-citotoksičnosti, nakon 72 sata Rt- PCR metodom kod obe grupe ispitivanih limfnih čvorova pokazano je povećanje transkripcije PRF1, gena za perforin. Ovakav efekat interleukina IL-2 i IL-15 na transkripciju perforina već je ranije opisan na mononuklearnim ćelijama periferne krvi 103 zdravih osoba i bolesnika sa melanomom (Gamerro et al., 1995; Zhang et al., 1999; Janas et al., 2005), a kasnije i na izolovanim NK ćelijama periferne krvi kao i na trajnim NK-ćelijskim linijama (Zhou et al., 2002; Zhang et al., 2008). Prema našim saznanjima u literaturi ne postoje podaci o efektu ovih citokina na transkripsiju PRF1 u limfocitima regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa malignitetima. Značajno je da je tokom razvoja NK ćelija PRF1 gen transkripciono neaktivan u CD34+ progenitorskim ćelijama NK ćelijske loze i da se njegova iRNK može detektovati nakon dve nedelje in vitro kultivacije u prisustvu citokina IL-15 i SCF koja dovodi do diferencijacije progenitora u zrelije stadijume NK ćelija (Meade et al., 2009). Praćenjem nivoa sintetisanog proteina perforina Western blot metodom pokazana je indukcija njegove ekspresije pomoću citokina IL- 2 i IL-15 kod obe grupe limfnih čvorova obolelih od melanoma. Najizraženiji efekat ovi citokini su pokazali na povećanje prisustva lakše i funkcionalno zrelije frakcije perforina molekulske težine 60 KD. Ova lakša frakcija predstavlja funkcionalno aktivnu formu perforina i u stanju je da se veže za fosfolipidnu membranu ciljne ćelije, da polimerizuje, formira pore, omogući ulazak granzima i dovede do sledstvene lize ciljne ćelije. U procesu translacije PRF-1 gena, kao prvi produkt nastaje polipeptid od 65KD koji ubrzo glikozilacijom prelazi u 70KD formu čiji je C2 domen koji ima ulogu u vezivanju za fosfolipidnu membranu “prekriven” i stoga neaktivan. Otkidanjem proteoglikanskog lanaca sa C-terminalnog domena u kiseloj sredini sekretornih granula dolazi do njegovog prevođenja u formu manje težine (60KD) sa “otvorenim” mestom vezivanja za membranu ciljne ćelije (Uellner et al., 1997). S obzirom da NK ćelije nastaju diferencijacijom hematopoetskih progenitora koji su dosta zastupljeni i u limfnim čvorovima kao i da se ekspresija perforina povećava prelaskom iz trećeg razvojnog stadijuma iNK ćelija u četvrti stadijum CD3-CD56sjajno+ NK ćelija (Freud et al., 2006), povećanje ukupnog nivoa perforina koje je dobijeno nakon tretmana ovim citokinima može posredno da ukaže i na diferncijaciju nezrelijih stadijuma NK ćelija poteklom iz limfnog čvora. Postoje podaci da i tokom ontogenetskog razvoja u procesu diferencijacije NK ćelija od CD34+ progenitora iz pupčane vrpce, dolazi do povećanja udela brzo-migrirajuće, lakše, frakcije perforina mase 60KD (Meade et al., 2009). Povećanje nivoa perforina je direktno pokazano u NK ćelijama limfnih čvorova nakon dužih in vitro tretmana u prisustvu interleukina IL-2 i IL-15 (Ferlazzo et al., 2004; Moretta et al., 2008), kao i 104 nakon 48 sati kultivacije NK ćelija poreklom iz slezine miša (Fehniger et al., 2007). Povećanje nivoa perforina pod uticajem ova dva citokina koje odvija u procesu diferncijacije NK ćelija (Freud i Caligiuri, 2006) pokazano je i na eksperimentalnom modelu u in vitro uslovima pri čemu CD34+ progenitori produkuju perforin nakon 20 i 30 dana kultivacije sa IL-15 slične koncentracije koja je korišćena u ovom istraživanju na regionalnim limfnim čvorovima bolesnika sa melanomom (Zamai et al., 2013). U ovom radu, prećenjem transkripcije i translacije perforina, pokazano je da je kod obe grupe limfnih čvorova prisutan bazalni nivo ove iRNK, kao i da je u netretiranim, kontrolnim limfnim čvorovima zastupljenija nezrelija i teža frakcija perforina. Stimulacije citokinima IL-2 i IL-15 dovele su kod obe grupe limfnih čvorova do povećane transkripcije PRF1 gena, kao i do povećanja nivoa proteina, što je najizraženije u zrelijoj, a po molekulskoj masi lakšoj frakciji. Na osnovu toga može da se zaključi da je dobijeno povećanje citotoksične aktivnosti NK ćelija direktno uslovljeno povećanjem transkripcije PRF-1 gena i sinteze proteina i to uglavnom povećanjem nivoa njegove funkcionalno zrelije forme. Pored povećanja citotoksične aktivnosti NK ćelija nakon 7 dana in vitro kultivacije, kod obe grupe limfnih čvorova čije su ćelije tretirane interleukinom IL-2 dobijeno je značajno povećanje procenta CD3-CD56+ NK ćelija kao i procenta CD3- CD56sjajno+ subpopulacije. Dobijena povećanja su najverovatnije posledica proliferacije CD3-CD56sjajno+ subpopulacije koja, za razliku od citotoksične CD3-CD56potmulo+ subpopulacije, ispoljava visokoafnitetni IL-2Rα receptor (Baume et al., 1992) i bolje proliferiše u prisustvu IL-2 (Fehniger et al., 2003; Takahashi et al., 2007; Zamai et al., 2013). Sličan efekat ovog citokina na brojnost CD3-CD56sjajno+ subpopulacije NK ćelija pokazan je na izolovanim NK ćelijama limfnih čvorova i krajnika nakon in vitro kultivacije interleukinom IL-2 (Romagnani et al., 2007; Ferlazzo et al., 2004). Za razliku od IL-2, IL-15 iako je pripadnik iste, γc, familije citokina nakon istog vremena kultivacije povećao je citotoksičnost, ali ne i procenat zastupljenosti NK ćelija i njihovih funkcionalnih subpopulacija kod obe grupe ispitivanih regionalnih limfnih čvorova. U literaturi, na trajnoj NK-92 NK ćelijskoj liniji nakon 48 sata tretmana interlekinom IL-15 (Zhang et al., 2008), slično kao i u ovom radu, je takođe opisan nepromenjen procenat NK ćelija i njihovih subpopulacija. 105 Dobijeni rezultati ukazuju pored povećanja citotoksičnosti NK ćelija regionalnih limfnih čvorova nakon in vitro tretmana interleukinima IL-2 i IL-15, IL-2 povećava procenat CD3-CD56+ NK ćelija i njihove CD3-CD56sjajno+ subpopulacije, dok IL-15 deluje samo na citotoksičnu funkciju NK ćelija. Značajno je da oba citokina povećavaju nivo perforina u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija koja u limfnom čvoru predstavlja većinu NK ćelijske populacije, što rezultuje u povećanju citotoksičnosti (Vukićević et al., 2010; Romagnani et al., 2007). Povećanje procenta NK ćelija samo nakon tretmana interleukinom IL-2 može da bude posledica toga što CD3-CD56sjajno+ subpopulacija NK ćelija koja predstavlja većinu NK ćelijske populacije u limfnom čvoru ispoljava visoko-afinitetni trimerni IL-2Rαβγ i proliferiše u prisustvu ovog citokina, dok ne postoji razlika u ispoljavanju IL-15R različitih afiniteta između dve subpopulacije NK ćelija (Meazza et al., 2011). Podaci iz literature ukazuju na veći značaj citokina IL-15 u održavanju homeostaze NK ćelija i njihovog preživljavanja (Carson et al., 1997, Pillet et al., 2011), kao i u regulaciji ćelijske smrti (Cooper et al., 2002; Jamieson et al., 2004). U ovom radu, nakon in vitro kultivacije u prisustvu IL-15 došlo je do povećanja ekspresije antiapopotoskog molekula Bcl-2. Slični nalazi dobijeni su na mišijim modelima gde je pokazano da IL-15 stimuliše preživljavanje NK ćelija tako što reguliše ekspresiju proteina Bcl-2 familije: snižava nivo apoptotskog Bid molekula, a povećava nivoe antiapoptotskih Mcl-2 (Huntington et al., 2007) i Bcl-2 molekula(Cooper et al., 2002; Pillet et al., 2011; Ranson et al., 2003). U ovom radu nakon 7 dana in vitro kultivacije praćeni su efekti citokina IL-2 i IL-15 na ekspresiju receptora na NK ćelijama regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom. Svaki od ova dva ispitivana citokina povećava ekspresiju NKG2D i CD16 aktivacionih receptora u celokupnoj populaciji CD3-CD56+ NK ćelija, kod obe grupe limfnih čvorova obolelih od melanoma. U okviru izučavanja aktivacije NK ćelija poreklom iz sekundarnih limfnih organa, u literaturi su opisani efekti interleukina IL-2 i IL-15 uglavnom samo na ekspresiju CD16, KIR receptora i NCR (Ferlazzo et al., 2004; Romagnani et al., 2007), ali ne i na ekspresiju NKG2D receptora. Dejstvo ovih citokina na ekspresiju NKG2D receptora do sada je najviše ispitivano na NK ćelijama periferne krvi kako zdravih osoba tako i bolesnika sa malignitetima. U literaturi postoje podaci da 106 IL-2 povećava ekspresiju NKG2D receptora na NK ćelijama periferne krvi obolelih od melanoma (Konjević et al., 2010), kontrolnih zdravih osoba (Sutherland et al., 2002; Konjević et al., 2010; Hromadnikova et al., 2013), kod miševa (Smyth et al., 2004) kao i na trajnim NK ćelijskim linijama (Zhang et al., 2005). Značajno je i da tretman interleukinom IL-2 ne povećava samo ekspresiju NKG2D receptora na NK ćelijama, već i DAP10 molekula koji predstavlja sastavni deo signalnog puta ovog receptora (Park et al., 2011). Slično kao i za IL-2, u literaturi postoje podaci i za IL-15 o povećanju ekspresije NKG2D receptora pod dejstvom ovog citokina na NK ćelijama periferne krvi zdravih osoba (Sutherland et al., 2006; Verhoeven et al., 2008; Zhang et al. 2008), bolesnika sa malignitetima (Szczepanski et al., 2009; Decot et al., 2010) i na trajnim NK ćelijskim linijama (Zhang et al., 2008). Indukcija ekspresije NKG2D receptora tretmanima interleukinima IL-2 i IL-15 dobijena je i na NK ćelijama koje su kultivisane u prisustvu ćelija melanoma (Balsamo et al., 2012). Isto tako pokazano je i da visoko-citotoksične NK ćelije koje su dobijene nakon in vitro kultivacije NK ćelija u prisustvu modifikovane K562 tumorske ćelijske linije koja poseduje trans prezentovan IL-15 imaju povećan nivo ekspresije NKG2D aktivacionog receptora (Cho et al., 2010, Fujisaki et al., 2009). Za efekat interleukina IL-15 na ekspresiju NKG2D receptora, značajno je da su signalni putevi IL-15R i NKG2D receptora međusobno povezani (Horng et al., 2007). Naime, pokazano je da JAK-3, kao deo IL-15R signalnog puta, fosforiliše i DAP10 adapterski molekul koji je povezan sa NKG2D receptorom i zatim dovodi do aktivacije STAT5 signalnog molekula. Aktivirani DAP10, slično kao i u signalnom putu NKG2D receptora, dovodi do sledstvene aktivacije PI3K i Grb2 transkripcionog faktora, koji rezultuju u citotoksičnoj aktivnosti NK ćelija (Welte et al., 2003; Bennett et al., 2010). Pored povećanja ekspresije NKG2D receptora u celokupnoj populaciji CD3- CD56+ NK ćelija, kod obe grupe limfnih čvorova nakon tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 je dobijeno i povećanje ekspresije ovog receptora unutar citotoksične CD3- CD56potmulo+ subpopulacije. S ozirom na to da je ova subpopulacija nosilac citotoksične funkcije NK ćelija i da aktivacija NKG2D receptora dovodi do optuštanja citotoksičnih granula sa perforinom (Smyith et al., 2004), povećanje njegove ekspresije u ovoj subpopulaciji može da doprinese povećanju citotoksičnosti koje je postignuto 107 tretmanima ovim citokinima. Osim rezultata dobijenih u ovom radu, povećanje ekspresije NKG2D u citotoksičnoj subpopulaciji NK ćelija nakon tretmana interleukinom IL-2 pokazano je na NK ćelijama periferne krvi zdravih osoba (Konjević et al., 2010) i obolelih od melanoma (Konjević et al., 2010), dok o efektu interleukina IL-15 na ekspresiju NKG2D unutar funkcionalnih subpopulacija NK ćelija ne postoje podaci. Pored NKG2D receptora, u ovom radu je kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom tretmanima interleukinima IL-2 i IL-15 postignuto i povećanje ekspresije CD16 aktivacionog receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama. Ovi rezultati su u saglasnosti sa podacima iz literature koji su dobijeni na NK ćelijama poreklom iz limfnih čvorova kao i na njima po imunofenotipu sličnim NK ćelijama tonzila, zdravih osoba (Ferlazzo et al., 2004; Romagnani et al., 2007). Prema podacima iz literature povećanje ekspresije CD16 aktivacionog receptora moguće je samo na NK ćelijama limfnih čvorova i tonzila, ali ne i na NK ćelijama periferne krvi (Ferlazzo et al., 2004). Povećanje ekspresije CD16 receptora koje je pokazano u in vitro uslovima u ovom radu, može da predstavlja analogiju fizioloških uslova u samom limfnom čvoru gde su NK ćelije izoložene dejstvu interleukina IL-2 poreklom iz aktiviranih T ćelija lokalizovanih u neposrednoj blizini (Martín-Fontecha et al., 2004; Ferlazzo i Münz, 2009). Kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova nakon tretmana interleukinom IL-2 dođlo je do povećanja zastupljenosti CD16 receotira u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija. Ovo može da ukaže na sazrevanje ove subpopulacije s obzirom da se prema linearnom modelu deferencijacije NK ćelija povećanje ekspresije CD16 povezuje sa prelaskom CD3-CD56sjajno+ u funkcionalno zreliju, citotoksičnu CD3-CD56potmulo+ subpopulaciju (Freud et al., 2006, Freud i Caligiuri, 2006; Romagnani et al., 2007; Caligiuri, 2008). Značaj CD16 kao molekula koji ima ulogu u citotoksičnoj aktivnosti NK ćelija je pokazan još 1999. godine (Madelboim et al., 1999), mada tada tačan mehanizam kojim CD16 učestvuje u citotoksičnoj aktivnosti NK ćelija nije pokazan i nisu identifikovani njegovi ligandi za koje se on vezuje pri formiranju imunološke sinapse. Međutim, novija istraživanja su pokazala da svoju ulogu u NK ćelijskoj citotoksičnosti CD16 receptor ispoljava cis interakcijom sa CD2 adhezionim 108 molekulom što može da dovede do fosforilacije i aktivacije ζ lanca TCR i do sledstve ne NK ćelijske citotoksičnosti (Grier et al., 2012). Osim toga, pokazano je da prisustvo CD2 adhezionog molekula na NK ćelijama je neophodno za NK-citotoksičnost prema većini tumorskih ćelijskih linija melanoma (Casado et al., 2009). Nakon tretmana interleukinom IL-15 dobijeno je povećanje ekspresije CD16 receptora kod tumor- infiltrisanih limfnih čvorova samo u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji, za razliku od neinfiltrisanih limfnih čvorova kod kojih se ekspresija CD16 povećala u obe subpopulacije NK ćelija što takođe možda može da doprinese većem povećanju NK- citotoksičnosti kod ove grupe limfnih čvorova. Dobijeni rezultati ukazuju na to da tretmani interleukinima IL-2 i IL-15 mogu da indukuju ekspresiju CD16 aktivacionog receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama limfnih čvorova obolelih od melanoma bez obzira na njihovu infiltrisanost tumorom. Ovo povećanje ekspresije CD16 aktivacionog receptora kao i povećanje citotoksičnosti i nivoa zrelog citotoksičnog molekula perforina, doprinosi sticanju pune funkcionalne zrelosti NK ćelija (Ferlazzo et al., 2004; Romagnanai et al., 2007) kod obe grupe limfnih čvorova U ovom radu nakon 7 dana tretmana citokinima IL-2 i IL-15 pokazano je i da se ekspresija CD158a inhibitornog KIR receptora na NK ćelijama povećava samo nakon tretmana interleukinom IL-15 i to samo kod tumor-infiltrisanih limfnih čvorova. Za razliku od CD158a, ekspresija CD158b inhibitornog KIR receptora na ukupnim CD3- CD56+ NK ćelijama nakon tretmana se povećava kod obe grupe limfnih čvorova pod uticajem oba ispitivana citokina. Bez obzira na to što signalni put inhibitornih KIR receptora inhibira sekreciju citotoksičnih granula, a time i citotoksičnu aktivnost NK ćelija, pokazano je da su ekspresija inhibitornih KIR receptora i njihovo vezivanje za MHC I ligande važni za dostizanje funkcionalne zrelosti, a time i za citotoksičnost NK ćelija (Fernandez et al., 2005; Yokoyama et al., 2006; Holgrund et al., 2010). Ova pojava je u novijim radovima i detaljnije objašnjenja na osnovu praćenja dinamike receptora na membrani NK ćelija. U tom smislu na miševima je pokazano da u NK ćelijama koje nisu edukovane kontaktom sa sopstvenim MHC I molekulom, inhibitorni KIR receptori kao i NKG2D i drugi aktivacioni c-lektinima slični receptori su „zatvoreni“ u aktinskoj mreži vezanoj za plazma membranu. U "needukovanim" NK 109 ćelijama nakon vezivanja inhibitornih KIR-ova za njihove MHC I ligande dolazi do premeštanja aktivacionih receptora u tzv. nanodomene koji predstavljaju regione plazma membrane pogodne za prenos signala (Guia et al., 2011). Efekti interleukina IL-2 i IL-15 na ekspresiju KIR receptora na NK ćelijama regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa malignitetima nisu do sada izučavani. U tom smislu, u literaturi postoje podaci koji su dobijeni u ispitivanjima vršenim na NK ćelijama poreklom iz limfnih čvorova i krajnika zdravih osoba. U ovim istraživanjima je korišćenjem antitela koja pored inhibitornih prepoznaju i aktivacione (S, engl. short) forme CD158a (KIR2DL1/S1) i CD158b (KIR2DL2,3/S2,3) KIR receptora, nakon tretmana interleukinima IL-2 (Ferlazzo et al., 2004; Romagnani et al, 2007) i IL-15 (Romagnani et al.,2007) takođe postignuto povećanje ekspresije KIR receptora na CD3- CD56+ NK ćelijama. Podaci iz literature ukazuju na to da se za razliku od CD16 aktivacionog receptora čija se ekspresija ne može indukovati na NK ćelijma periferne krvi (Ferlazzo et al., 2004), ekspresija CD158a i CD158b KIR receptora može povećati na ovoj populaciji NK ćelija i kraćim in vitro tretmanima (48 i 72 sata) primenom nižih koncentracija interleukina IL-2 (Kogure et al., 1999; Chrul et al., 2006) kao i interleukina IL-15 (Kogure et al., 2002) od koncentracija korišćenih u ovom radu. U novije vreme se sve više ispituju načini dobijanja većeg broja citotoksičnih NK ćelija za primenu u adoptivnoj terapiji malignih tumora i tom prilikom nakon više-nedeljnih in vitro tretmanima mononuklearnih ćelija periferne krvi interleukinom IL-2 pored povećanja ekspresije aktivacionih receptora (NKG2D i NKp46) je takođe dobijeno i povećanje nivoa CD158a i CD158b KIR receptora na NK ćelijama (Bonanno et al., 2010). Isto tako, interleukini IL-2 i IL-15 se istovremeno primenjuju u već uspostavljenim zvaničnim protokolima za dobijanje aloreaktivnih KIR+ NK ćelija koji se koriste u adoptivnoj imunoterapu akutne mijeloidne leukemije (Siegler et al., 2010; Jiang et al., 2013). Povećanje ekspresije CD158a i CD158b KIR receptora na NK ćelijama nakon in vitro tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 sa istovremenim povećanjem citotoksične aktivnosti je osim na NK ćelijama periferne krvi i lmfnih čvorova, pokazano i na NK ćelijama poreklom iz pupčane vrpce (Satwani et al., 2011). 110 Praćenjem efekata citokina na ekspresiju KIR receptora u subpopulacijama NK ćelija pokazano je da se ekspresija CD158a receptora, slično kao i na ukupnim CD3- CD56+ NK ćelijama, nakon tretmana interleukinom IL-15 povećala kod tumor- infiltrisanih limfnih čvorova i to u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji. Ekspresija CD158b KIR receptora se, kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova nakon tretmana interleukinom IL-2 povećala u CD3-CD56potmulo+ subpopulaciji, dok se nakon tretmana interleukinom IL-15 povećala u CD3-CD56sjajno+ subpopulaciji NK ćelija. Postignuto povećanje ekspresije CD158b KIR receptora može da ukaže na sazrevanje nezrelije CD3-CD56sjajno+ subpopulacije NK ćelija u prisustvu IL-15. Promene u ekspresiji KIR receptora koje su dobijene u ovom radu na subpopulacijama NK ćelija su u saglasnosti sa podacima iz literature koji ukazuju na to da tretmani interleukinima IL-2 i IL-15 mogu da indukuju ekspresiju inhibitornih KIR receptora na svim KIR- NK ćelijama obe funkcionalne subpopulacije NK ćelija poreklom iz limfnih čvorova zdravih osoba (Romagnani et al., 2007). U literaturi je slična pojava pokazana i na NK ćelijama periferne krvi nakon 7 dana kultivacije interleukinima IL-2 i IL-15 gde se KIR receptori pojavljuju de novo na KIR- NK ćelijama uglavnom nevezano za pripadnost subpopulaciji (deRham et al., 2007). Povećanja ekspresije inhibotrnih CD158a i CD158b KIR receptora koja su dobijena u ovom radu, mogu da se objasne u svetlu regulacije KIR gena. Naime, ekpresija KIR gena je uglavnom regulisana epigenetski, metilacijom promotora koja suprimira njihovu transkripciju, a pored toga pokazana je i pozitivna regulacija ovih gena c-Myc transkpripcionim faktorom koji se vezuje za distalni promotor KIR gena i bez obzira na metilaciju stimuliše njegovou transkripciju. Pored toga, pokazano je da se in vitro tretmanom NK ćelija periferne krvi interleukinom IL-15 povećava transkripcija gena za c-Myc (Cichocki et al., 2009), a time i ekspresija KIR receptora. Indukcija ekspresije KIR gena interleukinima IL-15 i IL-2 pokazana je i na NK ćelijama iz pupčane vrpce (Satwani et al., 2011), a za gen inhibitornog KIR receptora KIR3DL1 je direktno pokazano da ovi citokini stimulišu njegovu transkrpiciju posredstvom STAT5 signalnog molekula (Presnell et al., 2013). Povećanje citotokisčne aktivnosti NK ćelija nakon 7 dana in vitro tretmana interleukinima IL-2 i IL-15, praćeno je i povećanjem ekspresije ranog aktivacionog 111 antigena CD69 na NK ćelijama obe grupe regionalnih limfnih čvorova. Mada je konstitutivno prisutan na malom broju ćelija, CD69 antigen se brzo indukuje na aktiviranim NK ćelijama (Lanier et al., 1988; Testi et al., 1994), a njegova ekspresija je povezana sa proliferacijom i indukcijom citotoksične aktivnosti NK ćelija (Borrego et al., 1999; Konjevic et al., 2007). Kod NK ćelija stimulisanih interleukinom IL-2, aktivacija CD69 receptora dovodi do selektivne i brze aktivacije Syk tirozin kinaze koja fosforiliše i aktivira fosfolipazu Cγ2 i Vav1 transkripcioni faktor koji u svojoj daljoj signalnoj putanji dovodi do sledstvene aktivacije NK ćelijeske citotoksičnosti (Pisegna et al., 2002). U tom smislu, u ovom radu je pokazano povećanje ekspresije CD69 antigena nakon stimulacija interleukinima IL-2 i IL-15 na obe subpopulacije NK ćelija, kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova. U ovom radu nakon 72 sata in vitro tretmana interleukinima IL- 2 i IL-15 je kod obe grupe ispitivanih regionalnih limfnih čvorova dobijen i povećan nivo fosforilisanog STAT5 signalnog molekula kojim ovi citokini deluju na procese u ćeliji, što je u ovom radu pokazano povećanjem nivoa perforina koji kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom, dovodi do povećanja citotoksičnosti NK ćelija. Poznato je da se fosforilacija STAT5 molekula odvija posredstvom JAK-3 kinaze (Meazza et al., 2011). Nakon tretmana interleukinom IL-2 kod obe grupe regionalnih limfnih čvorova došlo je do povećanja niva fosforilisanog STAT1, dok je tretman interleukinom IL-15 povećao samo nivo fosforilisanog STAT5 molekula. U tom smislu, poznato je da IL-2 može da aktivira i JAK-1 i JAK-3 tirozin kanaze koje svojim citoplazmatskim domenima intereaguju sa IL-2Rβ i γc lancima IL-2 receptora i fosoforilišu ih, kao i da u zavisnosti od toga koji je tirozin u polipeptidnom lancu receptora ovim putem fosforilisan se aktivira određeni STAT molekul (Meazza et al., 2011). Takođe, pokazano je da se STAT5 vezuje za specifični fosforilisani tirozin510 u IL-2Rβ C-terminalnom regionu, a STAT1 i STAT3 intereaguju sa kiselim subdomenom IL-2Rβ lanca čak i u odsustvu fosforilacije tirozina (Lin i Leonard, 2000; Delespine- Carmagnat et al., 2000). Poznato je da IL-2 i IL-15 povećavaju citotoksičnost posredstvom aktivacije PRF1 gena kao i da tu funkciju ostvaruju direktno posredstvom fosforilisanog STAT5 signalnog molekula (Imada et al., 1998; Zhang et al., 1999; Pillet et al., 2011; Sahm et al., 2012) i aktivacije NF-κB transkripcionog faktora (Zhou et al., 2002). 112 Poređenjem indeksa povećanja citotoksične aktivnosti NK ćelija nakon tretmana citokinima između neinfiltrisanih i tumor-infiltrisanih limfnih čvorova, pokazano je da tretman interleukinom IL-2 kod obe grupe limfnih čvorova dovodi do sličnog stepena povećanja u odnosu na kotrolu, dok tretman interleukinom IL-15 dovodi do nižeg stepena povećanja citotoksičnosti kod tumor-infiltrisanih u odnosu na neinfiltrisane limfne čvorove. Pored toga, nakon tretmana interleukinom IL-15, kod tumor- infiltrisanih limfnih čvorova dobijen je veći stepen povećanja ekspresije inhibitrong CD158a KIR receptora na ukupnim CD3-CD56+ i na CD3-CD56potmulo+ NK ćelijama u odnosu na neinfiltrisane limfne čvorove. Ipak, ovo povećanje ekspresije CD158a inhibitornog KIR-a u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima ne može se smatrati činiocem koji bi smanjio citotoksičnost u tumor-infiltrisanim limfnim čvorovima nakon tretmana interleukinom IL-15, s obzirom na to da je citotksičnost određivana prema K562 eritromijeloidnoj ćelijskoj liniji koja ne ispoljava MHC molekule klase I koji su ligandi za ove KIR receptore. Mada, s druge strane tretmani interleukinom IL-15 kod tumor-infiltrisanih limfnih čvorova povećavaju ekspresiju CD16 receptora samo u CD3- CD56potmulo+ subpopulaciji, dok kod neinfiltrisanih limfnih čvorova dovode do značajnog povećanja ekspresije CD16 receptora u obe subpopulacije NK ćelija što kod neinfiltrisanih limfnih čvorova možda utiče na veće povećanje NK ćelijske citotoksičnosti u in vitro tretmanima interleukinom IL-15. U novije vreme se intenzivno ispituje primena adoptivnog transfera NK ćelija u terapiji malignih tumora. Ova ispitvanja se već duže vreme sprovode kod hematoloških maligniteta, da bi kasnije obuhvatila i solidne tumore. Kod melanoma je do sada ispitivana citotoksičnost alogenih NK ćelija periferne krvi stimulisanih interleukinom IL-2 (Igarashi et al., 2004), kao i NK ćelija poreklom iz TIL koje su stimulisane interleukinom IL-15 (Steel et al., 2012). U tom smislu povećanje citotoksične funkcije NK ćelija poreklom iz regionalnih limfnih čvorova bolesnika i nivoa citotoksičnog molekula perforina koji su dobijeni nakon in vitro tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 mogu da ukažu na mogućnost ispitivanja terapijske primene ove populacije NK ćelija kod melanoma. S obzirom na visoku sistemsku toksičnost koju ispoljava IL-2 takođe je ispitivana i direktna lokalna primena ovog citokina u metastatske promene kod melanoma (Ridoli i Ridoli, 2002) i kod karcinoma bubrega (Vogelzang et al., 1994). U tom smislu, rezultati dobijeni u in vitro uslovima u ovom radu mogu da budu model 113 sistem i ukažu na efekat koji bi na NK ćelijsku citotoksičnost imala primena ovih citokina na NK ćelije regionalnih limfnih čvorova koje su zbog svog položaja u odnosu na primarni tumor značajne u kontroli limfogenog širenja tumora. U ovom radu su dobijeni novi podaci o do sada slabo izučavanoj subpopulaciji NK ćelija u regionalnim limfnim čvorovima koja može imati veoma važnu ulogu u sprečavanju i u kontroli širenja tumora. Poređenjem funkcionalnih svojstva NK ćelija neinifiltrisanih i infiltrisanih limfnih čvorova pokazana je slična niska citotokisčnost, a snižena produkcija IFNγ u CD3-CD56+ NK ćelijama i njihovoj imunoregulatornoj CD3- CD56sjajno+ subpopulaciji koja može da bude posledica prisusustva imunosupresivnih faktora poreklom od tumorskih ćelija kao i od ćelija imunskog sistema u tumor- infiltrisanim limfnim čvorovima. Bez obzira na sličnu citotoksičnost u tumor infiltrisanim limfnim čvorovima pokazano je povećanje procenta CD3-CD56+ NK ćelija usled povećanog prosustva njihove zrelije citotoksične CD3-CD56potmulo+ subpopulacije, kao i povećana ekspresija CD69 aktivacionog antigena, a i CD16 i CD158b receptora koji su svojstveni funkcionalno zrelijim NK ćelijama. Podaci koji su dobijeni u ovom radu nakon in vitro tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 ukazuju na to da oba citokina povećavaju inače veoma nisku citotoksičnu aktivnost NK ćelija u neinifltrisanim i u tumor-infiltrisanim regionalnim limfnim čvorovima bolesnika sa melanomom. Pored toga dobijeno je da za razliku od in vitro tretmana interleukinom IL-15, tretman interleukinom IL-2 dovodi do porasta ukupne populacije CD3-CD56+ NK ćelija uvećanjem CD3-CD56potmulo+ subpopulacije u neinfiltrisanim i u tumor-infiltrisanim regionalnim limfnim čvorovima bolesnika sa melanomom. Izražena sposobnost citokina IL-2 i IL-15 da indukuju citotoksičnu aktivnost NK ćelija u obe grupe regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom, postignuta je putem indukcije transkripcije i sinteze citotoksičnog medijatora perforina, a prevenstveno njegove funkcionalno zrele forme. Oba citokina na CD3-CD56+ NK ćelijama neinfiltrisani i tumor-infiltrisanih regionalnih limfnih čvorova povećavaju ekspresiju ranog aktivacionog antigena CD69 i citotoksičnih NKG2D receptora, a pored toga povećanjem ekspresije CD16 i CD158b receptora dorpinose zrelijem fenotipu ove populacije NK ćelija. Povećanje citotoksičnosti NK ćelija regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom koje je u ovom radu dobijeno in vitro tretmanima 114 interleukinima IL-2 i IL-15 ukazuje na potencijalni značaj NK ćelija regionalnih limfnih čvorova u novijem terapijskom pristupima kao što je adoptovni transfer NK ćelija kod bolesnika sa melanomom. 115 6 Zaključci I Funkcionalne i imunofenotipske karakteristike NK ćelija regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom Infiltrisanost tumorskim ćelijama regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom: • ne menja citotoksičnu funkciju NK ćelija u limfnom čvoru, ali je praćena sniženom produkcijom IFNγ, još jednog merila funkcionalnosti NK ćelija • praćena je povećanjem ukupne populacije CD3-CD56+ NK ćelija usled povećanja CD3-CD56potmulo+ subpopulacije • praćena je povećanom ekspresijom CD69 ranog aktivacionog antigena • ne menja ekspresiju NKG2D aktivacionog receptora • praćena je povećanom ekspresijomCD158b inhibitornog KIR receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama. Pokazane razlike u ovim imunofenotipskim parametrima su više ispoljene kada je tumorskim ćelijama infiltrisan veći broj regionalnih limfnih čvorova kao i kada je veći stepen invazije primarnog tumora u kožu. II Efekti in vitro tretmana interleukinima IL-2 i IL-15 na citotoksičnost i imunofenotipska svojstva NK ćelija regionalnih limfnih čvorova bolesnika sa melanomom Za razliku od in vitro tretmana interleukinom IL-15, tretman interleukinom IL-2 dovodi do porasta ukupne populacije CD3-CD56+ NK ćelija uvećanjem CD3-CD56potmulo+ subpopulacije u neinfiltrisanim i u infiltrisanim regionalnim limfnim čvorovima bolesnika sa melanomom. In vitro tretmani interleukinima IL-2 i IL-15 u obe grupe regionalnih limfnim čvorova bolesnika sa melanomom: 116 • povećavaju citotoksičnost NK ćelija • povećavaju transkripciju i sintezu perforina • povećavaju ekspresiju ranog aktivacionog antigena CD69, citotoksičnih NKG2D i CD16 receptora kao i CD158b inhibitornog KIR receptora na CD3-CD56+ NK ćelijama obe grupe regionalnih limfnih čvorova. Oba citokina ispoljavaju svoje efekte povećanjem nivoa fosforilisanog STAT5 signalnog molekula 117 7 Literatura Abi-Rached L, Parham P. Natural selection drives recurrent formation of activating killer cell immunoglobulin-like receptor and Ly49 from inhibitory homologues. J Exp Med. 2005; 201(8):1319-32. Afkarian M, Sedy JR, Yang J, Jacobson NG, Cereb N, Yang SY, Murphy TL, Murphy KM. T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naïve CD4+ T cells. Nat Immunol. 2002 ; 3(6):549-57. Allan DS, Rybalov B, Awong G, Zúñiga-Pflücker JC, Kopcow HD, Carlyle JR, Strominger JL. TGF-β affects development and differentiation of human natural killer cell subsets. Eur J Immunol. 2010; 40(8):2289-95 Alter G, Martin MP, Teigen N, Carr WH, Suscovich TJ, Schneidewind A, Streeck H, Waring M, Meier A, Brander C, Lifson JD, Allen TM, Carrington M, Altfeld M. Differential natural killer cell-mediated inhibition of HIV-1 replication based on distinct KIR/HLA subtypes. J Exp Med. 2007; 204(12):3027-36. Anderson DM, Kumaki S, Ahdieh M, Bertles J, Tometsko M, Loomis A, Giri J, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, et al. Functional characterization of the human interleukin-15 receptor alpha chain and close linkage of IL15RA and IL2RA genes. J Biol Chem. 1995; 270(50):29862-9. Andersson KE, Williams GS, Davis DM, Höglund P. Quantifying the reduction in accessibility of the inhibitory NK cell receptor Ly49A caused by binding MHC class I proteins in cis. Eur J Immunol. 2007;37(2):516-27. Arma LR, Podack ER. Natural Killer cytolytic activity. In: Lotze MT, Thomson AW: Natural Killer Cells-Basic Science and Clinical Application. Elsevier; 2010. p. 215-27. Atkins MB, Lotze MT, Dutcher JP, Fisher RI, Weiss G, Margolin K, Abrams J, Sznol M, Parkinson D, Hawkins M, Paradise C, Kunkel L, Rosenberg SA. High-dose recombinant interleukin 2 therapy for patients with metastatic melanoma: analysis of 270 patients treated between 1985 and 1993. J Clin Oncol. 1999;17(7):2105-16. 118 Avice MN, Demeure CE, Delespesse G, Rubio M, Armant M, Sarfati M. IL-15 promotes IL-12 production by human monocytes via T cell-dependent contact and may contribute to IL-12-mediated IFN-gamma secretion by CD4+ T cells in the absence of TCR ligation. J Immunol. 1998; 161(7):3408-15. Badoual C, Bouchaud G, Agueznay Nel H, Mortier E, Hans S, Gey A, Fernani F, Peyrard S, -Puig PL, Bruneval P, Sastre X, Plet A, Garrigue-Antar L, Quintin-Colonna F, Fridman WH, Brasnu D, Jacques Y, Tartour E. The soluble alpha chain of interleukin-15 receptor: a proinflammatory molecule associated with tumor progression in head and neck cancer. Cancer Res. 2008; 68(10):3907-14. Bakker AB, Wu J, Phillips JH, Lanier LL. NK cell activation: distinctstimulatory pathways counterbalancing inhibitory signals. Hum Immunol. 2000;61(1):18-27. Balaji KN, Schaschke N, Machleidt W, Catalfamo M, Henkart PA. Surface cathepsin B protects cytotoxic lymphocytes from self-destruction after degranulation. J Exp Med. 2002; 196(4):493-503. Balsamo M, Scordamaglia F, Pietra G, Manzini C, Cantoni C, Boitano M, Queirolo P, Vermi W, Facchetti F, Moretta A, Moretta L, Mingari MC, Vitale M. Melanoma- associated fibroblasts modulate NK cell phenotype and antitumor cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106:20847-20852. Balsamo M, Vermi W, Parodi M, Pietra G, Manzini C, Queirolo P, Lonardi S, Augugliaro R, Moretta A, Facchetti F, Moretta L, Mingari MC, Vitale M. Melanoma cells become resistant to NK-cell-mediated killing when exposed to NK-cell numbers compatible with NK-cell infiltration in the tumor. Eur J Immunol. 2012; 42(7):1833-42. Bamford RN, Grant AJ, Burton JD, Peters C, Kurys G, Goldman CK, Brennan J, Roessler E, Waldmann TA. The interleukin (IL) 2 receptor beta chain is shared by IL-2 and a cytokine, provisionally designated IL-T, that stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994; 91(11):4940-4. 119 Barrow C, Browning J, MacGregor D, Davis ID, Sturrock S, Jungbluth AA, Cebon J. Tumor antigen expression in melanoma varies according to antigen and stage. Clin Cancer Res. 2006; 12(3 Pt 1):764-71. Baume DM, Robertson MJ, Levine H, Manley TJ, Schow PW, Ritz J. Differential responses to interleukin 2 define functionally distinct subsets of human natural killer cells. Eur J Immunol. 1992; 22(1):1-6 Bennett NJ, Ashiru O, Morgan FJ, Pang Y, Okecha G, Eagle RA, Trowsdale J, Sissons JG, Wills MR. Intracellular sequestration of the NKG2D ligand ULBP3 by human cytomegalovirus. J Immunol. 2010;185:1093–1102. Berger C, Berger M, Hackman RC, Gough M, Elliott C, Jensen MC, Riddell SR. Safety and immunologic effects of IL-15 administration in nonhuman primates. Blood. 2009; 114(12):2417-26. Bessard A, Solé V, Bouchaud G, Quéméner A, Jacques Y. High antitumor activity of RLI, an interleukin-15 (IL-15)-IL-15 receptor alpha fusion protein, in metastatic melanoma and colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 2009 ; 8(9):2736-45. Besser MJ, Shoham T, Harari-Steinberg O, Zabari N, Ortenberg R, Yakirevitch A,Nagler A, Loewenthal R, Schachter J, Markel G. Development of allogeneic NK cell adoptive transfer therapy in metastatic melanoma patients: in vitro preclinical optimization studies. PLoS One. 2013;8(3):e57922. Biassoni R, Cantoni C, Falco M, Verdiani S, Bottino C, Vitale M, Conte R, Poggi A, Moretta A, Moretta L. The human leukocyte antigen (HLA)-C-specific "activatory" or "inhibitory" natural killer cell receptors display highly homologous extracellular domains but differ in their transmembrane and intracytoplasmic portions. J Exp Med. 1996; 183(2):645-50. Bloushtain N, Qimron U, Bar-Ilan A, Hershkovitz O, Gazit R, Fima E, Korc M,Vlodavsky I, Bovin NV, Porgador A. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycans are involved in the recognition of cellular targets by NKp30 and NKp46. J Immunol. 2004; 173(4):2392-401. 120 Bonanno G, Iudicone P, Mariotti A, Procoli A, Pandolfi A, Fioravanti D, Corallo M, Perillo A, Scambia G, Pierelli L, Rutella S. Thymoglobulin, interferon-γ and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures. J Transl Med. 2010; 8:129. Borrego F, Robertson MJ, Ritz J, Peña J, Solana R. CD69 is a stimulatory receptor for natural killer cell and its cytotoxic effect is blocked by CD94 inhibitory receptor. Immunology. 1999;97:159-160. Bottino C, Castriconi R, Pende D, Rivera P, Nanni M, Carnemolla B, Cantoni C, Grassi J, Marcenaro S, Reymond N, Vitale M, Moretta L, Lopez M, Moretta A. Identification of PVR (CD155) and Nectin-2 (CD112) as cell surface ligands for the human DNAM-1 (CD226) activating molecule. J Exp Med. 2003; 198(4):557-67. Bouchard A, Ratthé C, Girard D. Interleukin-15 delays human neutrophil apoptosis by intracellular events and not via extracellular factors: role of Mcl-1 and decreased activity of caspase-3 and caspase-8. J Leukoc Biol. 2004; 75(5):893-900. Brandt CS, Baratin M, Yi EC, Kennedy J, Gao Z, Fox B, Haldeman B, Ostrander CD, Kaifu T, Chabannon C, Moretta A, West R, Xu W, Vivier E, Levin SD. The B7 family member B7-H6 is a tumor cell ligand for the activating natural killer cell receptor NKp30 in humans. J Exp Med. 2009;206(7):1495–1503 Breslow, A. Thickness, cross-sectional areas and depth of invasion in the prognosis of cutaneous melanoma. Ann. Surg. 1970, 172, 902–908. Brodin P, Kärre K, Höglund P. NK cell education: not an on-off switch but a tunable rheostat. Trends Immunol. 2009; 30(4):143-9. Brown RL, Ortaldo JR, Griffith RL, Blanca I, Rabin H. The proliferation and function of human mononuclear leukocytes and natural killer cells in serum-free medium. J Immunol Methods 1985;81:207-14. Bryceson YT, March ME, Ljunggren HG, Long EO. Synergy among receptors on resting NK cells for the activation of natural cytotoxicity and cytokine secretion. Blood. 2006; 107(1):159-66. 121 Buckley RH. Molecular defects in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstitution. Annu. Rev. Immunol 2004; 22 : 625 – 655. Buddingh EP, Schilham MW, Ruslan SE, Berghuis D, Szuhai K, Suurmond J,Taminiau AH, Gelderblom H, Egeler RM, Serra M, Hogendoorn PC, Lankester AC. Chemotherapy-resistant osteosarcoma is highly susceptible to IL-15-activated allogeneic and autologous NK cells. Cancer Immunol Immunother. 2011; 60(4):575-86. Burton JD, Bamford RN, Peters C, Grant AJ, Kurys G, Goldman CK, Brennan J, Roessler E, Waldmann TA. A lymphokine, provisionally designated interleukin T and produced by a human adult T-cell leukemia line, stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells. Proc Natl Acad Sci U S A.1994; 91(11):4935-9. Caligiuri MA, Zmuidzinas A, Manley TJ, Levine H, Smith KA, Ritz J. Functional consequences of interleukin 2 receptor expression on resting human lymphocytes. Identification of a novel natural killer cell subset with high affinity receptors. J Exp Med. 1990; 171(5):1509-26. Caligiuri MA. Human natural killer cells. Blood. 2008; 112(3):461-9. Campbell JJ, Qin S, Unutmaz D, Soler D, Murphy KE, Hodge MR, Wu L, Butcher EC. Unique subpopulations of CD56+ NK and NK-T peripheral blood lymphocytes identified by chemokine receptor expression repertoire. J Immunol. 2001;166(11):6477- 82. Campillo JA, Legaz I, López-Álvarez MR, Bolarín JM, Las Heras B, Muro M, Minguela A, Moya-Quiles MR, Blanco-García R, Martínez-Banaclocha H, García- Alonso AM, Alvarez-López MR, Martínez-Escribano JA. KIR gene variability in cutaneous malignant melanoma: influence of KIR2D/HLA-C pairings on disease susceptibility and prognosis. Immunogenetics. 2013; 65(5):333-43. Campoli M, Ferrone S. HLA antigen and NK cell activating ligand expression in malignant cells: a story of loss or acquisition. Semin Immunopathol. 2011; 33(4):321- 34. 122 Campoli M, Ferrone S. Tumor escape mechanisms: potential role of soluble HLA antigens and NK cells activating ligands. Tissue Antigens. 2008;72:321-34. Capitini CM, Fry TJ, Mackall CL. Cytokines as Adjuvants for Vaccine and Cellular Therapies for Cancer. Am J Immunol. 2009; 5(3):65-83. Carrega P, Ferlazzo G. Natural killer cell distribution and trafficking in human tissues. Front Immunol. 2012;3:347. Carrega P, Morandi B, Costa R, et al. Natural killer cells infiltrating human nonsmall- cell lung cancer are enriched in CD56 bright CD16(-) cells and display an impaired capability to kill tumor cells. Cancer 2008; 112:863-875. Carrega P, Pezzino G, Queirolo P, Bonaccorsi I, Falco M, Vita G, Pende D, Misefari A, Moretta A, Mingari MC, Moretta L, Ferlazzo G. Susceptibility of human melanoma cells to autologous natural killer (NK) cell killing: HLA-related effector mechanisms and role of unlicensed NK cells. PLoS One 2009;4: e8132 Carretero M, Palmieri G, Llano M, Tullio V, Santoni A, Geraghty DE, López-Botet M. Specific engagement of the CD94/NKG2-A killer inhibitory receptor by the HLA-E class Ib molecule induces SHP-1 phosphatase recruitment to tyrosine-phosphorylated NKG2-A: evidence for receptor function in heterologous transfectants. Eur J Immunol. 1998; 28(4):1280-91. Carson WE, Fehniger TA, Haldar S, Eckhert K, Lindemann MJ, Lai CF, Croce CM, Baumann H, Caligiuri MA. A potential role for interleukin-15 in the regulation of human natural killer cell survival. J Clin Invest. 1997; 99(5):937-43. Carson WE, Ross ME, Baiocchi RA, Marien MJ, Boiani N, Grabstein K, Caligiuri MA. Endogenous production of interleukin 15 by activated human monocytes is critical for optimal production of interferon-gamma by natural killer cells in vitro. J Clin Invest. 1995; 96(6):2578-82. Castriconi R, Cantoni C, Della Chiesa M, Vitale M, Marcenaro E, Conte R, Biassoni R, Bottino C, Moretta L, Moretta A. Transforming growth factor beta 1 inhibits expression 123 of NKp30 and NKG2D receptors: consequences for the NK-mediated killing of dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003; 100(7):4120-5. Champsaur M, Lanier LL. Effect of NKG2D ligand expression on host immuneresponses. Immunol Rev. 2010 May;235(1):267-85. Chan A, Hong DL, Atzberger A, Kollnberger S, Filer AD, Buckley CD, McMichae A, Enver T, Bowness P. CD56bright human NK cells differentiate into CD56dim cells: role of contact with peripheral fibroblasts. J Immunol 2007; 179:89-94. Chan HW, Kurago ZB, Stewart CA, Wilson MJ, Martin MP, Mace BE, Carrington M, Trowsdale J, Lutz CT. DNA methylation maintains allele-specific KIR gene expression in human natural killer cells. J Exp Med. 2003; 197(2):245-55. Chan HW, Miller JS, Moore MB, Lutz CT. Epigenetic control of highly homologouskiller Ig-like receptor gene alleles. J Immunol. 2005; 175(9):5966-74. Chen S, Kawashima H, Lowe JB, Lanier LL, Fukuda M. Suppression of tumor formation in lymph nodes by L-selectin-mediated natural killer cell recruitment. J Exp Med. 2005; 202(12):1679-89. Cho D, Shook DR, Shimasaki N, Chang YH, Fujisaki H, Campana D. Cytotoxicity of activated natural killer cells against pediatric solid tumors. Clin Cancer Res. 2010; 16(15):3901-9. Chrul S, Polakowska E, Szadkowska A, Bodalski J. Influence of interleukin IL-2 and IL-12 + IL-18 on surface expression of immunoglobulin-like receptors KIR2DL1, KIR2DL2, and KIR3DL2 in natural killer cells. Mediators Inflamm. 2006;2006(4):46957. Cichocki F, Hanson RJ, Lenvik T, Pitt M, McCullar V, Li H, Anderson SK, Miller JS. The transcription factor c-Myc enhances KIR gene transcription through direct binding to an upstream distal promoter element. Blood. 2009; 113(14):3245-53. Cichocki F, Miller JS, Anderson SK. Killer immunoglobulin-like receptor transcriptional regulation: a fascinating dance of multiple promoters. J Innate Immun. 2011;3(3):242-8. 124 Cipponi A, Wieers G, van Baren N, Coulie PG. Tumor-infiltrating lymphocytes: apparently good for melanoma patients. But why? Cancer Immunol Immunother. 2011; 60(8):1153-60. Clark, WH, Jr. From L, Bernardino EA, Mihm MC. The histogenesis and biologic behavior of primary human malignant melanomas of the skin. Cancer Res. 1969; 29, 705–727 Cochran AJ, Huang RR, Lee J, Itakura E, Leong SP, Essner R. Tumour-induced immune modulation of sentinel lymph nodes. Nat Rev Immunol. 2006; 6(9):659-70. Colonna M, Nakajima H, Cella M. Inhibitory and activating receptors involved in immune surveillance by human NK and myeloid cells. J Leukoc Biol. 1999; 66(5):718- 22. Colonna M, Samaridis J. Cloning of immunoglobulin-superfamily members associated with HLA-C and HLA-B recognition by human natural killer cells. Science. 1995; 268(5209):405-8. Comes A, Di Carlo E, Musiani P, Rosso O, Meazza R, Chiodoni C, Colombo MP, Ferrini S. IFN-gamma-independent synergistic effects of IL-12 and IL-15 induce anti- tumor immune responses in syngeneic mice. Eur J Immunol. 2002; 32(7):1914-23 Cooper MA, Bush JE, Fehniger TA, VanDeusen JB, Waite RE, Liu Y, Aguila HL, Caligiuri MA. In vivo evidence for a dependence on interleukin 15 for survival of natural killer cells. Blood. 2002; 100(10):3633-8. Cooper MA, Colonna M, Yokoyama WM. Hidden talents of natural killers: NK cells in innate and adaptive immunity. EMBO Rep. 2009;10(10):1103-10. Cooper MA, Fehniger TA, Caligiuri MA. The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol 2001; 22(11): 633-40. Cooper MA, Fehniger TA, Fuchs A, Colonna M, Caligiuri MA. NK cell and DC interactions. Trends Immunol. 2004; 25(1):47-52. 125 Cooper MA, Fehniger TA, Turner SC, Chen KS, Ghaheri BA, Ghayur T, Carson WE, Caligiuri MA. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56(bright) subset. Blood 2001b; 97(10): 3146-51. De Maria A, Bozzano F, Cantoni C, Moretta L. Revisiting human natural killer cell subset function revealed cytolytic CD56(dim)CD16+ NK cells as rapid producers of abundant IFN-gamma on activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108(2):728-32. de Rham C, Ferrari-Lacraz S, Jendly S, Schneiter G, Dayer JM, Villard J. The proinflammatory cytokines IL-2, IL-15 and IL-21 modulate the repertoire of mature human natural killer cell receptors. Arthritis Res Ther. 2007; 9(6):R125. Decot V, Voillard L, Latger-Cannard V, Aissi-Rothe L, Perrier P, Stoltz JF, et al. Natural-killer cell amplification for adoptive leukemia relapse immunotherapy: comparison of three cytokines, IL-2, IL-15, or IL-7 and impact on NKG2D, KIR2DL1, and KIR2DL2 expression. Exp Hematol 2010;38:351–62. Delahaye NF, Rusakiewicz S, Martins I, Ménard C, Roux S, Lyonnet L, Paul P, Sarabi M, Chaput N, Semeraro M, Minard-Colin V, Poirier-Colame V, Chaba K, Flament C, Baud V, Authier H, Kerdine-Römer S, Pallardy M, Cremer I, Peaudecerf L, Rocha B, Valteau-Couanet D, Gutierrez JC, Nunès JA, Commo F, Bonvalot S, Ibrahim N, Terrier P, Opolon P, Bottino C, Moretta A, Tavernier J, Rihet P,Coindre JM, Blay JY, Isambert N, Emile JF, Vivier E, Lecesne A, Kroemer G, Zitvogel L. Alternatively spliced NKp30 isoforms affect the prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Nat Med. 2011; 17(6):700-7. Delespine-Carmagnat, M.,G. Bouvier, J. Bertoglio. Association of STAT1, STAT3 and STAT5 proteins with the IL-2 receptor involves different subdomains of the IL-2 receptor beta chain. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 59–68. Di Santo JP, Vosshenrich CA. Bone marrow versus thymic pathways of natural killer cell development. Immunol Rev. 2006; 214:35-46. Diefenbach A, Jamieson AM, Liu SD, Shastri N, Raulet DH. Ligands for the murine NKG2D receptor: expression by tumor cells and activation of NK cells and macrophages. Nat Immunol. 2000; 1(2):119-26. 126 DiSanto JP, Muller W, Guy-Grand D, Fischer A, Rajewsky K. Lymphoid development in mice with a targeted deletion of the interleukin 2 receptor β chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92:377-381. DiSanto JP. Natural killer cell developmental pathways: a question of balance. Annu Rev Immunol. 2006;24:257-86. Doubrovina ES, Doubrovin MM, Vider E, Sisson RB, O'Reilly RJ, Dupont B, Vyas YM. Evasion from NK cell immunity by MHC class I chain-related molecules expressing colon adenocarcinoma. J Immunol. 2003; 171(12):6891-9. Dubois S, Mariner J, Waldmann TA, Tagaya Y. IL-15Ralpha recycles and presents IL- 15 In trans to neighboring cells. Immunity. 2002; 17(5):537-47. Dubois S, Patel HJ, Zhang M, Waldmann TA, Muller JR. Preassociation of IL-15 with IL-15R alpha-IgG1-Fc enhances its activity on proliferation of NK and CD8+/CD44high T cells and its antitumor action. J Immunol 2008;180:2099– 106. Eagle RA, Trowsdale J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nat Rev Immunol. 2007; 7(9):737-44. Eissens DN, Spanholtz J, van der Meer A, van Cranenbroek B, Dolstra H, Kwekkeboom J, Preijers FW, Joosten I. Defining early human NK cell developmental stages in primary and secondary lymphoid tissues. PLoS One. 2012;7(2):e30930. Endt J, McCann FE, Almeida CR, Urlaub D, Leung R, Pende D, Davis DM, Watzl C. Inhibitory receptor signals suppress ligation-induced recruitment of NKG2D to GM1- rich membrane domains at the human NK cell immune synapse. J Immunol. 2007; 178(9):5606-11. Epardaud M, Elpek KG, Rubinstein MP, Yonekura AR, Bellemare-Pelletier A, Bronson R, Hamerman JA, Goldrath AW, Turley SJ. Interleukin-15/interleukin-15R alpha complexes promote destruction of established tumors by reviving tumor-resident CD8+ T cells. Cancer Res. 2008; 68(8):2972-83. 127 Epling-Burnette, Sheng W, Djeu JY. Signaling events in natural killer cells. In: Lotze MT, Thomson AW: Natural Killer Cells-Basic Science and Clinical Application. Elsevier; 2010. p95-112. Farzad Z, Cochran AJ, McBride WH, et al. Lymphocyte subset alterations in nodes regional to human melanoma. Cancer Res 1990;50:3585-35888. Fehniger TA, Cai SF, Cao X, Bredemeyer AJ, Presti RM, French AR, Ley TJ. Acquisition of murine NK cell cytotoxicity requires the translation of a pre-existing pool of granzyme B and perforin mRNAs. Immunity. 2007; 26(6):798-811. Fehniger TA, Cooper MA, Caligiuri MA. Interleukin-2 and interleukin-15: immunotherapy for cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2002; 13(2):169-83. Fehniger TA, Cooper MA, Nuovo GJ, Cella M, Facchetti F, Colonna M, Caligiuri MA. CD56bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2: a potential new link between adaptive and innate immunity. Blood. 2003; 101(8):3052-7. Ferlazzo G, Münz C. Dendritic cell interactions with NK cells from different tissues. J Clin Immunol. 2009; 29(3):265-73. Ferlazzo G, Pack M, Thomas D, Paludan C, Schmid D, Strowig T, Bougras G, Muller WA, Moretta L, Münz C. Distinct roles of IL-12 and IL-15 in human natural killer cell activation by dendritic cells from secondary lymphoid organs. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101(47):16606-11. Ferlazzo G, Thomas D, Lin SL, Goodman K, Morandi B, Muller WA, Moretta A, Münz C. The abundant NK cells in human secondary lymphoid tissues require activation to express killer cell Ig-like receptors and become cytolytic. J Immunol. 2004; 172(3):1455-62. Ferlazzo G, Tsang ML, Moretta L, Melioli G, Steinman RM, Münz C. Human dendritic cells activate resting natural killer (NK) cells and are recognized via the NKp30 receptor by activated NK cells. J Exp Med. 2002; 195(3):343-51. 128 Ferlazzo G. Natural killer and dendritic cell liaison: recent insights and open questions. Immunol Lett. 2005; 101(1):12-7. Fernández L, Portugal R, Valentín J, Martín R, Maxwell H, González-Vicent M, Díaz MÁ, de Prada I, Pérez-Martínez A. In vitro Natural Killer Cell Immunotherapy for Medulloblastoma. Front Oncol. 2013; 3:94.. Fernandez NC, Treiner E, Vance RE, Jamieson AM, Lemieux S, Raulet DH. A subset of natural killer cells achieves self-tolerance without expressing inhibitory receptors specific for self-MHC molecules. Blood. 2005; 105(11):4416-23. Fewkes NM, Mackall CL. Novel gamma-chain cytokines as candidate immunemodulators in immune therapies for cancer. Cancer J. 2010;16(4):392-8. Flavell RA, Sanjabi S, Wrzesinski SH, Licona-Limón P. The polarization of immune cells in the tumour environment by TGFbeta. Nat Rev Immunol. 2010; 10(8):554-67 Freud AG, Becknell B, Roychowdhury S, Mao HC, Ferketich AK, Nuovo GJ, Hughes TL, Marburger TB, Sung J, Baiocchi RA, Guimond M, Caligiuri MA. A human CD34(+) subset resides in lymph nodes and differentiates into CD56bright natural killer cells. Immunity. 2005;22(3):295 Freud AG, Caligiuri MA. Human natural killer cell development. Immunol Rev. 2006; 214:56-72. Freud AG, Yokohama A, Becknell B, Lee MT, Mao HC, Ferketich AK, Caligiuri MA. Evidence for discrete stages of human natural killer cell differentiation in vivo. J Exp Med. 2006; 203(4):1033-43. Frey M, Packianathan NB, Fehniger TA, Ross ME, Wang WC, Stewart CC, Caligiuri MA, Evans SS. Differential expression and function of L-selectin on CD56bright and CD56dim natural killer cell subsets. J Immunol. 1998;161(1):400-8. Fuchs A, Cella M, Kondo T, Colonna M. Paradoxic inhibition of human natural interferon-producing cells by the activating receptor NKp44. Blood. 2005; 106(6):2076- 82. 129 Fuertes MB, Kacha AK, Kline J, Woo SR, Kranz DM, Murphy KM, Gajewski TF. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. J Exp Med. 2011; 208(10):2005-16. Fujisaki H, Kakuda H, Shimasaki N, Imai C, Ma J, Lockey T, Eldridge P, Leung WH, Campana D. Expansion of highly cytotoxic human natural killer cells for cancer cell therapy. Cancer Res. 2009;69(9):4010-7. Gamero AM, Ussery D, Reintgen DS, Puleo CA, Djeu JY. Interleukin 15 induction of lymphokine-activated killer cell function against autologous tumor cells in melanoma patient lymphocytes by a CD18-dependent, perforin-related mechanism. Cancer Res. 1995; 55(21):4988-94. Garbe C, Leiter U. Melanoma epidemiology and trends. Clin Dermatol. 2009; 27(1):3-9. Garg TK, Szmania SM, Khan JA, Hoering A, Malbrough PA, Moreno-Bost A, Greenway AD, Lingo JD, Li X, Yaccoby S, Suva LJ, Storrie B, Tricot G, Campana D, Shaughnessy JD Jr, Nair BP, Bellamy WT, Epstein J, Barlogie B, van Rhee F. Highly activated and expanded natural killer cells for multiple myeloma immunotherapy.Haematologica. 2012; 97(9):1348-56. Garrod KR, Wei SH, Parker I, Cahalan MD. Natural killer cells actively patrol peripheral lymph nodes forming stable conjugates to eliminate MHC-mismatched targets. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(29):12081-6. Gasser S, Orsulic S, Brown EJ, Raulet DH. The DNA damage pathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor. Nature. 2005; 436(7054):1186-90. Gazit R, Garty BZ, Monselise Y, Hoffer V, Finkelstein Y, Markel G, Katz G, Hanna J, Achdout H, Gruda R, Gonen-Gross T, Mandelboim O. Expression of KIR2DL1 on the entire NK cell population: a possible novel immunodeficiency syndrome. Blood. 2004;103(5):1965-6. Geissmann F, Dieu-Nosjean MC, Dezutter C, Valladeau J, Kayal S, Leborgne M, Brousse N, Saeland S, Davoust J. Accumulation of immature Langerhans cells in 130 human lymph nodes draining chronically inflamed skin. J Exp Med. 2002; 196(4):417- 30. Ghoreschi K, Laurence A, O'Shea JJ. Janus kinases in immune cell signaling. Immunol Rev. 2009; 228(1):273-87. Giebel S, Locatelli F, Lamparelli T, Velardi A, Davies S, Frumento G, Maccario R, Bonetti F, Wojnar J, Martinetti M, Frassoni F, Giorgiani G, Bacigalupo A, Holowiecki J. Survival advantage with KIR ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors. Blood. 2003; 102(3):814-9. Gil M, Park SJ, Chung YS, Park CS. Interleukin-15 enhances proliferation and chemokine secretion of human follicular dendritic cells. Immunology. 2010; 130(4):536-44. Gillard-Bocquet M, Caer C, Cagnard N, Crozet L, Perez M, Fridman WH, Sautès- Fridman C, Cremer I. Lung tumor microenvironment induces specific gene expression signature in intratumoral NK cells. Front Immunol. 2013; 4:19. Gilmour KC, Fujii H, Cranston T, Davies EG, Kinnon C, Gaspar HB. Defective expression of the interleukin-2/interleukin-15 receptor beta subunit leads to a natural killer cell-deficient form of severe combined immunodeficiency. Blood. 2001; 98(3):877-9. Giron-Michel J, Azzi S, Khawam K, Mortier E, Caignard A, Devocelle A, Ferrini S, Croce M, François H, Lecru L, Charpentier B, Chouaib S, Azzarone B, Eid P. Interleukin-15 plays a central role in human kidney physiology and cancer through the γc signaling pathway. PLoS One. 2012;7(2):e31624. Giron-Michel J, Giuliani M, Fogli M, Brouty-Boyé D, Ferrini S, Baychelier F, Eid P, Lebousse-Kerdilès C, Durali D, Biassoni R, Charpentier B, Vasquez A, Chouaib S, Caignard A, Moretta L, Azzarone B. Membrane-bound and soluble IL-15/IL-15Ralpha complexes display differential signaling and functions on human hematopoietic progenitors. Blood. 2005; 106(7):2302-10. 131 Giuliani M, Giron-Michel J, Negrini S, Vacca P, Durali D, Caignard A, Le Bousse- Kerdiles C, Chouaib S, Devocelle A, Bahri R, Durrbach A, Taoufik Y, Ferrini S, Croce M, Mingari MC, Moretta L, Azzarone B. Generation of a novel regulatory NK cell subset from peripheral blood CD34+ progenitors promoted by membrane-bound IL-15. PLoS One. 2008; 3(5):e2241. Gordon J, MacLean LD. A lymphocyte-stimulating factor produced in vitro. Nature. 1965; 208(5012):795-6. Grabstein KH, Eisenman J, Shanebeck K, Rauch C, Srinivasan S, Fung V, Beers C, Richardson J, Schoenborn MA, Ahdieh M, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the beta chain of the interleukin-2 receptor. Science. 1994; 264(5161):965-8. Gray-Schopfer V, Wellbrock C, Marais R. Melanoma biology and new targeted therapy. Nature. 2007; 445(7130):851-7. Grier JT, Forbes LR, Monaco-Shawver L, Oshinsky J, Atkinson TP, Moody C, Pandey R, Campbell KS, Orange JS. Human immunodeficiency-causing mutation defines CD16 in spontaneous NK cell cytotoxicity. J Clin Invest. 2012; 122(10):3769-80. Groh V, Bahram S, Bauer S, Herman A, Beauchamp M, Spies T. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93(22):12445-50. Groh V, Wu J, Yee C, Spies T. Tumour-derived soluble MIC ligands impair expression of NKG2D and T-cell activation. Nature. 2002; 419(6908):734-8. Gründemann C, Bauer M, Schweier O, von Oppen N, Lässing U, Saudan P, Becker KF, Karp K, Hanke T, Bachmann MF, Pircher H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 2006; 176(3):1311-5. Guia S, Jaeger BN, Piatek S, Mailfert S, Trombik T, Fenis A, Chevrier N, Walzer T, Kerdiles YM, Marguet D, Vivier E, Ugolini S. Confinement of activating receptors at 132 the plasma membrane controls natural killer cell tolerance. Sci Signal. 2011; 4(167):ra21. Haass NK, Smalley KS, Herlyn M. The role of altered cell-cell communication in melanoma progression. J Mol Histol. 2004; 35(3):309-18. Hameed A, Lowrey DM, Lichtenheld M, Podack ER. Characterization of three serine esterases isolated from human IL-2 activated killer cells. J Immunol. 1988; 141(9):3142-7. Herberman RB, Nunn ME, Holden HT, Lavrin DH. Natural cytotoxic reactivity ofmouse lymphoid cells against syngeneic and allogeneic tumors. II. Characterization of effector cells. Int J Cancer. 1975 ;16(2):230-9. Hervieu A, Mignot G, Ghiringhelli F. Dacarbazine mediate antimelanoma effects via NK cells. Oncoimmunology. 2013; 2(4):e23714 Hiby SE, Walker JJ, O'shaughnessy KM, Redman CW, Carrington M, Trowsdale J, Moffett A. Combinations of maternal KIR and fetal HLA-C genes influence the risk of preeclampsia and reproductive success. J Exp Med. 2004; 200(8):957-65. Hodi FS. Well-defined melanoma antigens as progression markers for melanoma:insights into differential expression and host response based on stage. ClinCancer Res. 2006; 12(3 Pt 1):673-8. Höglund P, Brodin P. Current perspectives of natural killer cell education by MHC class I molecules. Nature Reviews Immunology 2010; 10:724-34. Höglund P, Ohlén C, Carbone E, Franksson L, Ljunggren HG, Latour A, Koller B, Kärre K. Recognition of beta 2-microglobulin-negative (beta 2m-) T-cell blasts by natural killer cells from normal but not from beta 2m- mice: nonresponsiveness controlled by beta 2m- bone marrow in chimeric mice. Proc Natl Acad Sci U S A.1991; 88(22):10332-6. Hromadnikova I, Pirkova P, Sedlackova L. Influence of In Vitro IL-2 or IL-15 Alone or in Combination with Hsp-70-Derived 14-mer Peptide (TKD) on the Expression of NK Cell Activatory and Inhibitory Receptors. Mediators Inflamm. 2013; 2013:405295. 133 Hsu KC, Keever-Taylor CA, Wilton A, Pinto C, Heller G, Arkun K, O'Reilly RJ, Horowitz MM, Dupont B. Improved outcome in HLA-identical sibling hematopoietic stem-cell transplantation for acute myelogenous leukemia predicted by KIR and HLA genotypes. Blood. 2005; 105(12):4878-84. Huarte E, Fisher J, Turk MJ, Mellinger D, Foster C, Wolf B, Meehan KR, Fadul CE, Ernstoff MS. Ex vivo expansion of tumor specific lymphocytes with IL-15 and IL-21 for adoptive immunotherapy in melanoma. Cancer Lett. 2009; 285(1):80-8. Hudspeth K, Silva-Santos B, Mavilio D. Natural cytotoxicity receptors: broader expression patterns and functions in innate and adaptive immune cells. Front Immunol. 2013;4:69. Huntington ND, Legrand N, Alves NL, Jaron B, Weijer K, Plet A, Corcuff E, Mortier E, Jacques Y, Spits H, Di Santo JP. IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo. J Exp Med. 2009; 206(1):25-34 Huntington ND, Puthalakath H, Gunn P, Naik E, Michalak EM, Smyth MJ, Tabarias H, Degli-Esposti MA, Dewson G, Willis SN, Motoyama N, Huang DC, Nutt SL, Tarlinton DM, Strasser A. Interleukin 15-mediated survival of natural killer cells is determined by interactions among Bim, Noxa and Mcl-1. Nat Immunol. 2007; 8(8):856-63. Huntington ND, Vosshenrich CAJ, Di Santo JP. Developmental pathways that generate natural-killer-cell diversity in mice and humans. Nature Reviews Immunology. 2007;7(9):703–714. Igarashi T, Wynberg J, Srinivasan R, Becknell B, McCoy JP Jr, Takahashi Y, Suffredini DA, Linehan WM, Caligiuri MA, Childs RW. Enhanced cytotoxicity of allogeneic NK cells with killer immunoglobulin-like receptor ligand incompatibility against melanoma and renal cell carcinoma cells. Blood. 2004; 104(1):170-7. Imada K, Bloom ET, Nakajima H, Horvath-Arcidiacono JA, Udy GB, Davey HW, Leonard WJ. Stat5b is essential for natural killer cell-mediated proliferation and cytolytic activity. J Exp Med. 1998; 188(11):2067-74. 134 Imai K, Matsuyama S, Miyake S, Suga K, Nakachi K. Natural cytotoxic activity of peripheral-blood lymphocytes and cancer incidence: an 11-year follow-up study of a general population. Lancet. 2000; 356(9244):1795-9 Ito M, Maruyama T, Saito N, Koganei S, Yamamoto K, Matsumoto N. Killer cell lectin- like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 2006; 203(2):289-95. Itoh M, Takahashi T, Sakaguchi N, Kuniyasu Y, Shimizu J, Otsuka F, Sakaguchi S. Thymus and autoimmunity: production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self- tolerance. J Immunol. 1999;162(9):5317-26. Jackson A, Warner N. Preparation, staining and analysis by flow cytometry of peripheral blood leukocytes. In: Rose N, Friedmah H, Fahey J, editors. Manual of Clinical Laboratory Immunology. Washington DC: American Society for Microbiology; 1986. p. 226-35. Jakobisiak M, Golab J, Lasek W. Interleukin 15 as a promising candidate for tumor immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2011; 22(2):99-108. Jamieson AM, Isnard P, Dorfman JR, Coles MC, Raulet DH. Turnover and proliferation of NK cells in steady state and lymphopenic conditions. J Immunol. 2004; 172(2):864- 70. Janas ML, Groves P, Kienzle N, Kelso A. IL-2 regulates perforin and granzyme gene expression in CD8+ T cells independently of its effects on survival and proliferation. J Immunol. 2005; 175(12):8003-10. Jiang J, Wu C, Lu B. Cytokine-induced killer cells promote antitumor immunity. J Transl Med. 2013; 11:83. Jonuleit H, Wiedemann K, Müller G, Degwert J, Hoppe U, Knop J, Enk AH. Induction of IL-15 messenger RNA and protein in human blood-derived dendritic cells: a role for IL-15 in attraction of T cells. J Immunol. 1997; 158(6):2610-5. 135 Kalialis LV, Drzewiecki KT, Klyver H. Spontaneous regression of metastases from melanoma: review of the literature. Melanoma Res. 2009; s19(5):275-82. Kärre K, Ljunggren HG, Piontek G, Kiessling R. Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy. Nature. 1986; 319(6055):675-8. Kasakura S, Lowenstein L. A factor stimulating DNA synthesis derived from the medium of leukocyte cultures. Nature. 1965; 208(5012):794-5. Kennedy MK, Glaccum M, Brown SN, Butz EA, Viney JL, Embers M, Matsuki N, Charrier K, Sedger L, Willis CR, Brasel K, Morrissey PJ, Stocking K, Schuh JC, Joyce S, Peschon JJ. Reversible defects in natural killer and memory CD8 T cell lineages in interleukin 15-deficient mice. J Exp Med. 2000; 191(5):771-80. Khar A, Varalakshmi C, Pardhasaradhi BV, Mubarak Ali A, Kumari AL. Depletion of the natural killer cell population in the peritoneum by AK-5 tumor cells overexpressing fas-ligand: a mechanism of immune evasion. Cell Immunol. 1998; 189(2):85-91. Khawam K, Giron-Michel J, Gu Y, Perier A, Giuliani M, Caignard A, Devocelle A, Ferrini S, Fabbi M, Charpentier B, Ludwig A, Chouaib S, Azzarone B, Eid P. Human renal cancer cells express a novel membrane-bound interleukin-15 that induces, in response to the soluble interleukin-15 receptor alpha chain, epithelial-to-mesenchymal transition. Cancer Res. 2009; 69(4):1561-9. Kielczewska A, Kim HS, Lanier LL, Dimasi N, Vidal SM. Critical residues at the Ly49 natural killer receptor's homodimer interface determine functional recognition of m157, a mouse cytomegalovirus MHC class I-like protein. J Immunol. 2007; 178(1):369-77. Kiernan JA. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. 2008: 4th ed. Bloxham, UK: Scion. Kiessling R, Klein E, Wigzell H. "Natural" killer cells in the mouse. I. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Specificity and distribution according to genotype. Eur J Immunol 1975; 5(2): 112-7. 136 Kim S, Poursine-Laurent J, Truscott SM, Lybarger L, Song YJ, Yang L, French AR, Sunwoo JB, Lemieux S, Hansen TH, Yokoyama WM. Licensing of natural killer cells by host major histocompatibility complex class I molecules. Nature. 2005;436(7051):709-13. Kogure T, Fujinaga H, Niizawa A, Hai LX, Shimada Y, Ochiai H, Terasawa K. Killer- cell inhibitory receptors, CD158a/b, are upregulated by interleukin-2, but not interferon- gamma or interleukin-4. Mediators Inflamm. 1999;8(6):313-8. Kogure T, Mantani N, Goto H, Shimada Y, Tamura J, Terasawa K. The effect of interleukin-15 on the expression of killer-cell immunoglobulin-like receptors on peripheral natural killer cells in human. Mediators Inflamm. 2002; 11(4):219-24. Kogure T, Mantani N, Sakai S, Shimada Y, Tamura J, Terasawa K. Natural killer cytolytic activity is associated with the expression of killer cell immunoglobulin-like receptors on peripheral lymphocytes in human. Mediators Inflamm. 2003; 12(2):117-21. Konjevic G, Jurisic V, Jovic V, Vuletic A, Mirjacic Martinovic K, Radenkovic S, Spuzic I. Investigation of NK cell function and their modulation in different malignancies. Immunol Res. 2012; 52(1-2):139-56. Konjević G, Jović V, Vuletić A, Radulović S, Jelić S, Spuzić I. CD69 on CD56+ NK cells and response to chemoimmunotherapy in metastatic melanoma. Eur J Clin Invest. 2007; 37(11):887-96. Konjević G, Mirjacic Martinovic K, Vuletic A, Jović V, Jurisić V, Babović N, Spuzić I. Low expression of CD161 and NKG2D activating NK receptor is associated with impaired NK cell cytotoxicity in metastatic melanoma patients. Clin Exp Metastasis 2007;24:1–11. Konjević G, Mirjačić Martinović K, Vuletić A, Babović N. In-vitro IL-2 or IFN-α- induced NKG2D and CD161 NK cell receptor expression indicates novel aspects of NK cell activation in metastatic melanoma patients. Melanoma Res. 2010; 20(6):459-67. 137 Konjević G, Mirjačić Martinović K, Vuletić A, Radenković S. Novel aspects of in vitro IL-2 or IFN-α enhanced NK cytotoxicity of healthy individuals based on NKG2D and CD161 NK cell receptor induction. Biomed Pharmacother. 2010;64(10):663-71. Konjević G, Schlesinger B, Cheng L, Olsen KJ, Podack ER, Spuzic I. Analysis of perforin expression in human peripheral blood lymphocytes, CD56+ natural killer cell subsets and its induction by interleukin-2. Immunol Invest. 1995; 24(3):499-507. Kovanen PE, Leonard WJ. Cytokines and immunodeficiency diseases: critical roles of the gamma(c)-dependent cytokines interleukins 2, 4, 7, 9, 15, and 21, and their signaling pathways. Immunol Rev. 2004; 202:67-83. Krieg S, Ullrich E. Novel immune modulators used in hematology: impact on NK cells. Front Immunol. 2012;3:388. Krzewski K, Coligan JE. Human NK cell lytic granules and regulation of their exocytosis. Front Immunol. 2012;3:335. Kubica AW, Brewer JD. Melanoma in immunosuppressed patients. Mayo Clin Proc. 2012; 87(10):991-1003. Kulkarni S, Martin MP, Carrington M. The Yin and Yang of HLA and KIR in human disease. Semin Immunol. 2008; 20(6):343-52. Kündig TM, Schorle H, Bachmann MF, Hengartner H, Zinkernagel RM, Horak I. Immune responses in interleukin-2-deficient mice. Science. 1993; 262(5136):1059-61. Lakshmikanth T, Burke S, Ali TH, Kimpfler S, Ursini F, Ruggeri L, Capanni M, Umansky V, Paschen A, Sucker A, Pende D, Groh V, Biassoni R, Höglund P, Kato M, Shibuya K, Schadendorf D, Anichini A, Ferrone S, Velardi A, Kärre K, Shibuya A, Carbone E, Colucci F. NCRs and DNAM-1 mediate NK cell recognition and lysis of human and mouse melanoma cell lines in vitro and in vivo. J Clin Invest. 2009; 119(5):1251-63. Lanier LL, Le AM, Civin CI, Loken MR, Phillips JH. Therelationship of CD16 (Leu- 11) and Leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol 1986; 136:4480–86. 138 Lanier LL. DAP10- and DAP12-associated receptors in innate immunity. Immunol Rev. 2009; 227(1):150-60. Lanier LL. NK cell recognition. Annu Rev Immunol. 2005;23:225-74. Lanier LL. Up on the tightrope: natural killer cell activation and inhibition. Nat Immunol. 2008 May;9(5):495-502. Laurent S, Queirolo P, Boero S, Salvi S, Piccioli P, Boccardo S, Minghelli S, Morabito A, Fontana V, Pietra G, Carrega P, Ferrari N, Tosetti F, Chang LJ, Mingari MC, Ferlazzo G, Poggi A, Pistillo MP. The engagement of CTLA-4 on primary melanoma cell lines induces antibody-dependent cellular cytotoxicity and TNF-α production. J Transl Med. 2013; 11:108 Leong SP, Peng M, Zhou YM, Vaquerano JE, Chang JW. Cytokine profiles of sentinel lymph nodes draining the primary melanoma. Ann Surg Oncol. 2002; 9(1):82-7. Liao NS, Bix M, Zijlstra M, Jaenisch R, Raulet D. MHC class I deficiency: susceptibility to natural killer (NK) cells and impaired NK activity. Science. 1991;253(5016):199-202. Liao W, Schones DE, Oh J, Cui Y, Cui K, Roh TY, Zhao K, Leonard WJ. Priming for T helper type 2 differentiation by interleukin 2-mediated induction of interleukin 4 receptor alpha-chain expression. Nat Immunol. 2008; 9(11):1288-96 Lin JX, Li P, Liu D, Jin HT, He J, Ata Ur Rasheed M, Rochman Y, Wang L, Cui K, Liu C, Kelsall BL, Ahmed R, Leonard WJ. Critical Role of STAT5 transcription factor tetramerization for cytokine responses and normal immune function. Immunity. 2012; 36(4):586-99. Lin, JX., Leonard WJ. The role of Stat5a and Stat5b in signaling by IL-2 family cytokines. Oncogene. 2000; 19: 2566–2576. Lipson EJ. Re-orienting the immune system: Durable tumor regression and successful re-induction therapy using anti-PD1 antibodies. Oncoimmunology. 2013; 2(4):e23661. 139 Lodolce JP, Boone DL, Chai S, Swain RE, Dassopoulos T, Trettin S, Ma A. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 1998; 9(5):669-76. London L, Perussia B, Trinchieri G. Induction of proliferation in vitro of resting human natural killer cells: IL 2 induces into cell cycle most peripheral blood NK cells, but only a minor subset of low density T cells. J Immunol. 1986; 137(12):3845-54. Long EO, Barber DF, Burshtyn DN, Faure M, Peterson M, Rajagopalan S, Renard V, Sandusky M, Stebbins CC, Wagtmann N, Watzl C. Inhibition of natural killer cell activation signals by killer cell immunoglobulin-like receptors (CD158). Immunol Rev. 2001;181:223-33. Lopez-Vergès S, Milush JM, Pandey S, York VA, Arakawa-Hoyt J, Pircher H, Norris PJ, Nixon DF, Lanier LL. CD57 defines a functionally distinct population of mature NK cells in the human CD56dimCD16+ NK-cell subset. Blood. 2010; 116(19):3865-74. López-Larrea C, Suárez-Alvarez B, López-Soto A, López-Vázquez A, Gonzalez S. The NKG2D receptor: sensing stressed cells. Trends Mol Med. 2008; 14(4):179-89. Lucas M, Schachterle W, Oberle K, Aichele P, Diefenbach A. Dendritic cells prime natural killer cells by trans-presenting interleukin 15. Immunity. 2007; 26(4):503-17. Maccalli C, Nonaka D, Piris A, Pende D, Rivoltini L, Castelli C, Parmiani G. NKG2D- mediated antitumor activity by tumor-infiltrating lymphocytes and antigen-specific T- cell clones isolated from melanoma patients. Clin Cancer Res. 2007; 13(24):7459-68. Mailliard RB, Alber SM, Shen H, Watkins SC, Kirkwood JM, Herberman RB, Kalinski P. IL-18-induced CD83+CCR7+ NK helper cells. J Exp Med. 2005; 202(7):941-53. Malek TR, Castro I. Interleukin-2 receptor signaling: at the interface between tolerance and immunity. Immunity. 2010; 33(2):153-65. Mamessier E, Sylvain A, Thibult ML, Houvenaeghel G, Jacquemier J, Castellano R, Gonçalves A, André P, Romagné F, Thibault G, Viens P, Birnbaum D, Bertucci F, Moretta A, Olive D. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 2011; 121(9):3609-22. 140 Mandelboim O, Malik P, Davis DM, Jo CH, Boyson JE, Strominger JL. Human CD16 as a lysis receptor mediating direct natural killer cell cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999; 96(10):5640-4. Mandelboim O, Reyburn HT, Valés-Gómez M, Pazmany L, Colonna M, Borsellino G, Strominger JL. Protection from lysis by natural killer cells of group 1 and 2 specificity is mediated by residue 80 in human histocompatibility leukocyte antigen C alleles and also occurs with empty major histocompatibility complex molecules. J Exp Med. 1996; 184(3):913-22. Marcenaro E, Cantoni C, Pesce S, Prato C, Pende D, Agaugué S, Moretta L, Moretta A. Uptake of CCR7 and acquisition of migratory properties by human KIR+ NK cells interacting with monocyte-derived DC or EBV cell lines: regulation by KIR/HLA-class I interaction. Blood. 2009;114(19):4108-16. Markel G, Seidman R, Besser MJ, Zabari N, Ortenberg R, Shapira R, Treves AJ, Loewenthal R, Orenstein A, Nagler A, Schachter J. Natural killer lysis receptor (NKLR)/NKLR-ligand matching as a novel approach for enhancing anti-tumor activity of allogeneic NK cells. PLoS One. 2009;4(5):e5597. Markel G, Wolf D, Hanna J, Gazit R, Goldman-Wohl D, Lavy Y, Yagel S, Mandelboim O. Pivotal role of CEACAM1 protein in the inhibition of activated decidual lymphocyte functions. J Clin Invest. 2002; 110(7):943-53. Marras F, Bozzano F, De Maria A. Involvement of activating NK cell receptors and their modulation in pathogen immunity. J Biomed Biotechnol. 2011;2011:152430. Martín-Fontecha A, Thomsen LL, Brett S, Gerard C, Lipp M, Lanzavecchia A, Sallusto F. Induced recruitment of NK cells to lymph nodes provides IFN-gamma forT(H)1 priming. Nat Immunol. 2004; 5(12):1260-5. Martinvalet D, Dykxhoorn DM, Ferrini R, Lieberman J. Granzyme A cleaves a mitochondrial complex I protein to initiate caspase-independent cell death. Cell. 2008; 133(4):681-92. 141 McCann FE, Vanherberghen B, Eleme K, Carlin LM, Newsam RJ, Goulding D, Davis DM. The size of the synaptic cleft and distinct distributions of filamentous actin, ezrin, CD43, and CD45 at activating and inhibitory human NK cell immune synapses. J Immunol. 2003; 170(6):2862-70 Meade JL, Wilson EB, Holmes TD, de Wynter EA, Brett P, Straszynski L, Ballard PA, Trapani JA, McDermott MF, Cook GP. Proteolytic activation of the cytotoxic phenotype during human NK cell development. J Immunol. 2009 Jul 15;183(2):803-13. Meazza R, Azzarone B, Orengo AM, Ferrini S. Role of common-gamma chain cytokines in NK cell development and function: perspectives for immunotherapy. J Biomed Biotechnol. 2011; 2011:861920. Meazza R, Lollini PL, Nanni P, De Giovanni C, Gaggero A, Comes A, Cilli M, Di Carlo E, Ferrini S, Musiani P. Gene transfer of a secretable form of IL-15 in murine adenocarcinoma cells: effects on tumorigenicity, metastatic potential and immune response. Int J Cancer. 2000; 87(4):574-81. Meazza R, Verdiani S, Biassoni R, Coppolecchia M, Gaggero A, Orengo AM, Colombo MP, Azzarone B, Ferrini S. Identification of a novel interleukin-15 (IL-15) transcript isoform generated by alternative splicing in human small cell lung cancer cell lines. Oncogene. 1996; 12(10):2187-92. Melero I, Grimaldi AM, Perez-Gracia JL, Ascierto PA. Clinical development of immunostimulatory monoclonal antibodies and opportunities for combination. ClinCancer Res. 2013; 19(5):997-1008. Meyaard L. The inhibitory collagen receptor LAIR-1 (CD305). J Leukoc Biol. 2008; 83(4):799-803. Mirjačić Martinović K, Konjević G, Babović N, Inić M. The stage dependent changes in NK cell activity and the expression of activating and inhibitory NK cell receptors in melanoma patients. J Surg Res. 2011; 171(2):637-49 142 Moretta A, Bottino C, Vitale M, Pende D, Biassoni R, Mingari MC, Moretta L.Receptors for HLA class-I molecules in human natural killer cells. Annu Rev Immunol. 1996;14:619-48. Moretta A, Marcenaro E, Parolini S, Ferlazzo G, Moretta L. NK cells at the interface between innate and adaptive immunity. Cell Death Differ. 2008; 15(2):226-33. Moretta L, Bottino C, Pende D, Mingari MC, Biassoni R, Moretta A. Human natural killer cells: their origin, receptors and function. Eur J Immunol. 2002; 32(5):1205-11 Mortier E, Bernard J, Plet A, Jacques Y. Natural, proteolytic release of a soluble form of human IL-15 receptor alpha-chain that behaves as a specific, high affinity IL-15 antagonist. J Immunol. 2004; 173(3):1681-8. Mortier E, Quéméner A, Vusio P, Lorenzen I, Boublik Y, Grötzinger J, Plet A, Jacques Y. Soluble interleukin-15 receptor alpha (IL-15R alpha)-sushi as a selective and potent agonist of IL-15 action through IL-15R beta/gamma. Hyperagonist IL-15 x IL-15R alpha fusion proteins. J Biol Chem. 2006; 281(3):1612-9. Mortier E, Woo T, Advincula R, Gozalo S, Ma A. IL-15Ralpha chaperones IL-15 to stable dendritic cell membrane complexes that activate NK cells via trans presentation. J Exp Med. 2008; 205(5):1213-25. Morton BA, Ramey WG, Paderon H, et al. Monoclonal antibody-defined phenotypes of regional lymph node and peripheral blood lymphocyte subpopulations in early breast cancer. Cancer Res 1986; 4 Pt 2: 2121-2126.) Mujaj SA, Spanevello MM, Gandhi MK, Nourse JP. Molecular mechanisms influencing NK cell development: implications for NK cell malignancies. Am J Blood Res. 2011;1(1):34-45. Munger W, DeJoy SQ, Jeyaseelan R Sr, Torley LW, Grabstein KH, Eisenmann J,Paxton R, Cox T, Wick MM, Kerwar SS. Studies evaluating the antitumor activityand toxicity of interleukin-15, a new T cell growth factor: comparison with interleukin-2. Cell Immunol. 1995;165(2):289-93 143 Murphy WJ, Parham P, Miller JS. NK cells--from bench to clinic. Biol Blood Marrow Transplant. 2012; 18(1 Suppl):S2-7. Musso T, Calosso L, Zucca M, Millesimo M, Puliti M, Bulfone-Paus S, Merlino C, Savoia D, Cavallo R, Ponzi AN, Badolato R. Interleukin-15 activates proinflammatory and antimicrobial functions in polymorphonuclear cells. Infect Immun. 1998; 66(6):2640-7 Naumova E, Mihaylova A, Ivanova M, Mihailova S. Impact of KIR/HLA ligand combinations on immune responses in malignant melanoma. Cancer Immunol Immunother 2007;56: 95–100. Neely GG, Epelman S, Ma LL, Colarusso P, Howlett CJ, Amankwah EK, McIntyre AC, Robbins SM, Mody CH. Monocyte surface-bound IL-15 can function as an activating receptor and participate in reverse signaling. J Immunol. 2004; 172(7):4225-34. Nevala WK, Vachon CM, Leontovich AA, Scott CG, Thompson MA, Markovic SN; Melanoma Study Group of the Mayo Clinic Cancer Center. Evidence of systemic Th2- driven chronic inflammation in patients with metastatic melanoma. Clin Cancer Res. 2009; 15(6):1931-9. Older Aguilar AM, Guethlein LA, Adams EJ, Abi-Rached L, Moesta AK, Parham P. Coevolution of killer cell Ig-like receptors with HLA-C to become the major variable regulators of human NK cells. J Immunol. 2010;185(7):4238-51. Olsen SK, Ota N, Kishishita S, Kukimoto-Niino M, Murayama K, Uchiyama H, Toyama M, Terada T, Shirouzu M, Kanagawa O, Yokoyama S. Crystal Structure of the interleukin-15.interleukin-15 receptor alpha complex: insights into trans and cis presentation. J Biol Chem. 2007; 282(51):37191-204. Orr MT, Murphy WJ, Lanier LL. 'Unlicensed' natural killer cells dominate the response to cytomegalovirus infection. Nat Immunol. 2010; 11(4):321-7. O'Shea JJ, Gadina M, Schreiber RD. Cytokine signaling in 2002: new surprises in the Jak/Stat pathway. Cell. 2002 Apr;109 Suppl:S121-31. 144 Park SY, Saijo K, Takahashi T, Osawa M, Arase H, Hirayama N, Miyake K, Nakauchi H, Shirasawa T, Saito T. Developmental defects of lymphoid cells in Jak3 kinase- deficient mice. Immunity. 1995; 3(6):771-82. Park YP, Choi SC, Kiesler P, Gil-Krzewska A, Borrego F, Weck J, Krzewski K, Coligan JE. Complex regulation of human NKG2D-DAP10 cell surface expression: opposing roles of the γc cytokines and TGF-β1. Blood. 2011; 118(11):3019-27. Parkhurst MR, Riley JP, Dudley ME, Rosenberg SA. Adoptive transfer of autologous natural killer cells leads to high levels of circulating natural killer cells but does not mediate tumor regression. Clin Cancer Res. 2011; 17(19):6287-97. Pende D, Cantoni C, Rivera P, Vitale M, Castriconi R, Marcenaro S, Nanni M, Biassoni R, Bottino C, Moretta A, Moretta L. Role of NKG2D in tumor cell lysis mediated by human NK cells: cooperation with natural cytotoxicity receptors and capability of recognizing tumors of nonepithelial origin. Eur J Immunol. 2001; 31(4):1076-86. Pende D, Castriconi R, Romagnani P, Spaggiari GM, Marcenaro S, Dondero A, Lazzeri E, Lasagni L, Martini S, Rivera P, Capobianco A, Moretta L, Moretta A, Bottino C. Expression of the DNAM-1 ligands, Nectin-2 (CD112) and poliovirus receptor (CD155), on dendritic cells: relevance for natural killer-dendritic cell interaction. Blood. 2006; 107(5):2030-6. Pende D, Marcenaro S, Falco M, Martini S, Bernardo ME, Montagna D, Romeo E, Cognet C, Martinetti M, Maccario R, Mingari MC, Vivier E, Moretta L, Locatelli F, Moretta A. Anti-leukemia activity of alloreactive NK cells in KIR ligand-mismatched haploidentical HSCT for pediatric patients: evaluation of the functional role of activating KIR and redefinition of inhibitory KIR specificity. Blood. 2009; 113(13):3119-29. Pende D, Parolini S, Pessino A, Sivori S, Augugliaro R, Morelli L, Marcenaro E, Accame L, Malaspina A, Biassoni R, Bottino C, Moretta L, Moretta A. Identification and molecular characterization of NKp30, a novel triggering receptor involved in natural cytotoxicity mediated by human natural killer cells. J Exp Med. 1999; 190(10):1505-16. 145 Pillet AH, Thèze J, Rose T. Interleukin (IL)-2 and IL-15 have different effects on human natural killer lymphocytes. Hum Immunol. 2011;72(11):1013-7. Pipkin ME, Sacks JA, Cruz-Guilloty F, Lichtenheld MG, Bevan MJ, Rao A. Interleukin-2 and inflammation induce distinct transcriptional programs that promote the differentiation of effector cytolytic T cells. Immunity. 2010; 32(1):79-90. Pisegna S, Zingoni A, Pirozzi G, Cinque B, Cifone MG, Morrone S, Piccoli M, Frati L, Palmieri G, Santoni A.. Src-Dependent Syk Activation controls CD69-mediated signaling and function on human NK cells. J Immunol 2002; 169:68-74. Platonova S, Cherfils-Vicini J, Damotte D, Crozet L, Vieillard V, Validire P, André P, Dieu-Nosjean MC, Alifano M, Régnard JF, Fridman WH, Sautès-Fridman C, Cremer I. Profound coordinated alterations of intratumoral NK cell phenotype and function in lung carcinoma. Cancer Res. 2011; 71(16):5412-22. Podack ER, Dennert G. Assembly of two types of tubules with putative cytolytic function by cloned natural killer cells. Nature. 1983; 302(5907):442-5. Presnell SR, Chan HW, Zhang L, Lutz CT. IL-2/IL-15 activate the human clonally restricted KIR3DL1 reverse promoter. Genes Immun. 2013; 14(2):107-14. Rajagopalan S, Long EO. Cellular senescence induced by CD158d reprograms natural killer cells to promote vascular remodeling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109(50):20596-601 Randolph GJ, Angeli V, Swartz MA. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 2005; 5(8):617-28. Ranson T, Vosshenrich CA, Corcuff E, Richard O, Müller W, Di Santo JP. IL-15 is an essential mediator of peripheral NK-cell homeostasis. Blood. 2003; 101(12):4887-93. Raulet DH, Vance RE, McMahon CW. Regulation of the natural killer cell receptor repertoire. Annu Rev Immunol. 2001;19:291-330. Raulet DH. Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat Rev Immunol 2003; 3:781–790. 146 Refaeli Y, Van Parijs L, London CA, Tschopp J, Abbas AK. Biochemical mechanisms of IL-2-regulated Fas-mediated T cell apoptosis. Immunity. 1998; 8(5):615-23. Richmond A, Yang J, Su Y. The good and the bad of chemokines/chemokine receptors in melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2009; 22(2):175-86. Ridolfi L, Ridolfi R. Preliminary experiences of intralesional immunotherapy in cutaneous metastatic melanoma. Hepatogastroenterology. 2002; 49(44):335-9. Risma KA, Frayer RW, Filipovich AH, Sumegi J. Aberrant maturation of mutant perforin underlies the clinical diversity of hemophagocytic lymphohistiocytosis. J Clin Invest. 2006; 116(1):182-92. Riteau B, Barber DF, Long EO. Vav1 phosphorylation is induced by beta2 integrin engagement on natural killer cells upstream of actin cytoskeleton and lipid raft reorganization. J Exp Med. 2003; 198(3):469-74. Robertson MJ, Ritz J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood 1990; 76(12): 2421-38. Robertson MJ. Role of chemokines in the biology of natural killer cells. J Leukoc Biol. 2002; 71(2):173-83. Rochman Y, Spolski R, Leonard WJ. New insights into the regulation of T cells by gamma(c) family cytokines. Nat Rev Immunol. 2009; 9(7):480-90. Rodriguez T, Mendez R, Roberts CH, Ruiz-Cabello F, Dodi IA, López Nevot MA, Paco L, Maleno I, Marsh SG, Pawelec G, Garrido F. High frequency of homozygosity of the HLA region in melanoma cell lines reveals a pattern compatible with extensive loss of heterozygosity. Cancer Immunol Immunother 2005;54:141 Romagnani C, Juelke K, Falco M, Morandi B, D'Agostino A, Costa R, Ratto G, Forte G, Carrega P, Lui G, Conte R, Strowig T, Moretta A, Münz C, Thiel A, Moretta L, Ferlazzo G. CD56brightCD16- killer Ig-like receptor- NK cells display longer telomeres and acquire features of CD56dim NK cells upon activation. J Immunol 2007; 178:4947-4955. 147 Roothans D, Smits E, Lion E, Tel J, Anguille S. CD56 marks human dendritic cell subsets with cytotoxic potential. Oncoimmunology. 2013; 2(2):e23037. Rosenberg S. Lymphokine-activated killer cells: a new approach to immunotherapy of cancer. J Natl Cancer Inst 1985; 75(4): 595-603. Rosenberg SA, Yannelli JR, Yang JC, Topalian SL, Schwartzentruber DJ, Weber JS, Parkinson DR, Seipp CA, Einhorn JH, White DE. Treatment of patients with metastatic melanoma with autologous tumor-infiltrating lymphocytes and interleukin 2. J Natl Cancer Inst. 1994; 86(15):1159-66. Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, Perruccio K, Shlomchik WD, Tosti A, Posati S, Rogaia D, Frassoni F, Aversa F, Martelli MF, Velardi A. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science. 2002; 295(5562):2097-100. Russell JH, Ley TJ. Lymphocyte-mediated cytotoxicity. Annu Rev Immunol. 2002;20:323-70. Sahm C, Schönfeld K, Wels WS. Expression of IL-15 in NK cells results in rapid enrichment and selective cytotoxicity of gene-modified effectors that carry a tumor- specific antigen receptor. Cancer Immunol Immunother. 2012;61(9):1451-61. Saito S, Harada Y, Morodomi Y, Onimaru M, Yoshida K, Kyuragi R, Matsubara H, Yonemitsu Y. Ex vivo generation of highly purified and activated natural killer cells from human peripheral blood. Hum Gene Ther Methods. 2013; 24(4):241-52. Sato N, Sabzevari H, Fu S, Ju W, Petrus MN, Bamford RN, Waldmann TA, Tagaya Y.Development of an IL-15-autocrine CD8 T-cell leukemia in IL-15-transgenic mice requires the cis expression of IL-15Rα. Blood. 2011; 117(15):4032-40. Satwani P, van de Ven C, Ayello J, Cairo D, Simpson LL, Baxi L, Cairo MS. Interleukin (IL)-15 in combination with IL-2, fms-like tyrosine kinase-3 ligand and anti- CD3 significantly enhances umbilical cord blood natural killer (NK) cell and NK-cell subset expansion and NK function. Cytotherapy. 2011; 13(6):730-8. 148 Schleypen JS, Baur N, Kammerer R, Nelson PJ, Rohrmann K, Gröne EF,Hohenfellner M, Haferkamp A, Pohla H, Schendel DJ, Falk CS, Noessner E. Cytotoxic markers and frequency predict functional capacity of natural killer cells infiltrating renal cell carcinoma. Clin Cancer Res 2006;12:718-725 Screpanti V, Wallin RP, Ljunggren HG, Grandien A. A central role for death receptor- mediated apoptosis in the rejection of tumors by NK cells. J Immunol.2001; 167(4):2068-73. Seidel MG, Freissmuth M, Pehamberger H, Micksche M. Stimulation of natural killer activity in peripheral blood lymphocytes of healthy donors and melanoma patients in vitro: synergism between interleukin (IL)-12 and IL-15 or IL-12 and IL-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1998; 358(3):382-9. Seidel UJ, Schlegel P, Lang P. Natural killer cell mediated antibody-dependent cellular cytotoxicity in tumor immunotherapy with therapeutic antibodies. Front Immunol. 2013; 4:76. Sevko A, Umansky V. Myeloid-derived suppressor cells interact with tumors in terms of myelopoiesis, tumorigenesis and immunosuppression: thick as thieves. J Cancer. 2013;4(1):3-11. Sibbitt WL Jr, Bankhurst AD, Jumonville AJ, Saiki JH, Saiers JH, Doberneck RC. Defects in natural killer cell activity and interferon response in human lung carcinoma and malignant melanoma. Cancer Res. 1984; 44(2):852-6. Siegler U, Meyer-Monard S, Jörger S, Stern M, Tichelli A, Gratwohl A, Wodnar- Filipowicz A, Kalberer CP. Good manufacturing practice-compliant cell sorting and large-scale expansion of single KIR-positive alloreactive human natural killer cells for multiple infusions to leukemia patients. Cytotherapy. 2010; 12(6):750-63. Smith KA. The structure of IL2 bound to the three chains of the IL2 receptor and how signaling occurs. Med Immunol 2006; 5: 3. 149 Smyth MJ, Cretney E, Kelly JM, Westwood JA, Street SE, Yagita H, Takeda K, van Dommelen SL, Degli-Esposti MA, Hayakawa Y. Activation of NK cell cytotoxicity. Mol Immunol. 2005; 42(4):501-10. Smyth MJ, Cretney E, Kershaw MH, Hayakawa Y. Cytokines in cancer immunity and immunotherapy. Immunol Rev 2004; 202: 275-93. Smyth MJ, Swann J, Kelly JM, Cretney E, Yokoyama WM, Diefenbach A, Sayers TJ, Hayakawa Y. NKG2D recognition and perforin effector function mediate effective cytokine immunotherapy of cancer. J Exp Med 2004; 200(10): 1325-35. Spear P, Wu MR, Sentman ML, Sentman CL. NKG2D ligands as therapeutic targets. Cancer Immun. 2013; 13:8. Stebbins CC, Watzl C, Billadeau DD, Leibson PJ, Burshtyn DN, Long EO. Vav1 dephosphorylation by the tyrosine phosphatase SHP-1 as a mechanism for inhibition of cellular cytotoxicity. Mol Cell Biol. 2003;23(17):6291-9. Steel JC, Waldmann TA, Morris JC. Interleukin-15 biology and its therapeutic implications in cancer. Trends Pharmacol Sci. 2012; 33(1):35-41. Stern-Ginossar N, Elefant N, Zimmermann A, Wolf DG, Saleh N, Biton M, Horwitz E, Prokocimer Z, Prichard M, Hahn G, Goldman-Wohl D, Greenfield C, Yagel S, Hengel H, Altuvia Y, Margalit H, Mandelboim O. Host immune system gene targeting by a viral miRNA. Science. 2007;317(5836):376-81. Stern-Ginossar N, Gur C, Biton M, Horwitz E, Elboim M, Stanietsky N, Mandelboim M, Mandelboim O. Human microRNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D. Nat Immunol. 2008; 9(9):1065-73. Stern-Ginossar N, Mandelboim O. Receptors on NK cells In: Lotze MT, Thomson AW: Natural Killer Cells-Basic Science and Clinical Application. Elsevier; 2010 p.155-75. Sutherland CL, Chalupny NJ, Schooley K, VandenBos T, Kubin M, Cosman D. UL16- binding proteins, novel MHC class I-related proteins, bind to NKG2D and activate multiple signaling pathways in primary NK cells. J Immunol. 2002; 168(2):671-9. 150 Sutherland CL, Rabinovich B, Chalupny NJ, Brawand P, Miller R, Cosman D. ULBPs, human ligands of the NKG2D receptor, stimulate tumor immunity with enhancement by IL-15. Blood. 2006; 108(4):1313-9. Suzuki H, Duncan GS, Takimoto H, Mak TW. Abnormal development of intestinal intraepithelial lymphocytes and peripheral natural killer cells in mice lacking the IL-2 receptor β chain. J Exp Med. 1997; 185:499-505. Szczepanski MJ, Szajnik M, Welsh A, Foon KA, Whiteside TL, Boyiadzis M.Interleukin-15 enhances natural killer cell cytotoxicity in patients with acute myeloid leukemia by upregulating the activating NK cell receptors. Cancer Immunol Immunother. 2010; 59(1):73-9. T. Taniguchi, H.Matsui, and T. Fujita, “Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2,” Nature, vol. 302, no. 5906, pp. 305–310, 1983. Tagaya Y, Kurys G, Thies TA, Losi JM, Azimi N, Hanover JA, Bamford RN,Waldmann TA. Generation of secretable and nonsecretable interleukin 15 isoforms through alternate usage of signal peptides. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997; 94(26):14444-9. Takahashi E, Kuranaga N, Satoh K, Habu Y, Shinomiya N, Asano T, Seki S, Hayakawa M. Induction of CD16+ CD56bright NK cells with antitumour cytotoxicity not only from CD16- CD56bright NK Cells but also from CD16- CD56dim NK cells. Scand J Immunol. 2007; 65(2):126-38. Takayama T, Tahara H, Thomson AW. Differential effects of myeloid dendritic cells retrovirally transduced to express mammalian or viral interleukin-10 on cytotoxic T lymphocyte and natural killer cell functions and resistance to tumor growth. Transplantation. 2001; 71(9):1334-40. Talmadge JE. Immune cell infiltration of primary and metastatic lesions: mechanisms and clinical impact. Semin Cancer Biol. 2011; 21(2):131-8. Tarek N, Le Luduec JB, Gallagher MM, Zheng J, Venstrom JM, Chamberlain E, Modak S, Heller G, Dupont B, Cheung NK, Hsu KC. Unlicensed NK cells target 151 neuroblastoma following anti-GD2 antibody treatment. J Clin Invest. 2012; 122(9):3260-70. Thielens A, Vivier E, Romagné F. NK cell MHC class I specific receptors (KIR): from biology to clinical intervention. Curr Opin Immunol. 2012; 24(2):239-45. Tomasec P, Braud VM, Rickards C, Powell MB, McSharry BP, Gadola S, Cerundolo V, Borysiewicz LK, McMichael AJ, Wilkinson GW. Surface expression of HLA-E, an inhibitor of natural killer cells, enhanced by human cytomegalovirus gpUL40. Science. 2000; 287(5455):1031. Trapani JA, Sutton VR. Granzyme B: pro-apoptotic, antiviral and antitumor functions. Curr Opin Immunol. 2003; 15(5):533-43. Trinchieri G, Matsumoto-Kobayashi M, Clark SC, Seehra J, London L, Perussia B. Response of resting human peripheral blood natural killer cells to interleukin 2. J Exp Med. 1984; 160(4):1147-69. Tsudo M, Goldman CK, Bongiovanni KF, Chan WC, Winton EF, Yagita M, Grimm EA, Waldmann TA. The p75 peptide is the receptor for interleukin 2 expressed on large granular lymphocytes and is responsible for the interleukin 2 activation of these cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987; 84(15):5394-8. Uellner R, Zvelebil MJ, Hopkins J, Jones J, MacDougall LK, Morgan BP, Podack E, Waterfield MD, Griffiths GM. Perforin is activated by a proteolytic cleavage during biosynthesis which reveals a phospholipid-binding C2 domain. EMBO J. 1997; 16(24):7287-96 Uhrberg M, Valiante NM, Shum BP, Shilling HG, Lienert-Weidenbach K, Corliss B, Tyan D, Lanier LL, Parham P. Human diversity in killer cell inhibitory receptor genes. Immunity. 1997;7(6):753-63. Umansky V, Sevko A. Melanoma-induced immunosuppression and its neutralization. Semin Cancer Biol. 2012; 22(4):319-26. Upshaw JL, Arneson LN, Schoon RA, Dick CJ, Billadeau DD, Leibson PJ. NKG2D- mediated signaling requires a DAP10-bound Grb2-Vav1 intermediate and 152 phosphatidylinositol-3-kinase in human natural killer cells. Nat Immunol. 2006; 7(5):524-32. Vahlne G, Lindholm K, Meier A, Wickström S, Lakshmikanth T, Brennan F, Wilken M, Nielsen R, Romagné F, Wagtmann NR, Kärre K, Johansson MH. In vivo tumor cell rejection induced by NK cell inhibitory receptor blockade: maintained tolerance to normal cells even in the presence of IL-2. Eur J Immunol. 2010; 40(3):813-23. Valiante NM, Lienert K, Shilling HG, Smits BJ, Parham P. Killer cell receptors: keeping pace with MHC class I evolution. Immunol Rev. 1997;155:155-64. Valiante NM, Uhrberg M, Shilling HG, Lienert-Weidenbach K, Arnett KL, D'Andrea A, Phillips JH, Lanier LL, Parham P. Functionally and structurally distinct NK cell receptor repertoires in the peripheral blood of two human donors. Immunity. 1997;7(6):739-51 Verhoeven DH, de Hooge AS, Mooiman EC, Santos SJ, ten Dam MM, Gelderblom H, Melief CJ, Hogendoorn PC, Egeler RM, van Tol MJ, Schilham MW, Lankester AC. NK cells recognize and lyse Ewing sarcoma cells through NKG2D and DNAM-1 receptor dependent pathways. Mol Immunol. 2008; 45(15):3917-25. Vitale M, Bottino C, Sivori S, Sanseverino L, Castriconi R, Marcenaro E, Augugliaro R, Moretta L, Moretta A. NKp44, a novel triggering surface molecule specifically expressed by activated natural killer cells, is involved in non-major histocompatibility complex-restricted tumor cell lysis. J Exp Med. 1998; 187(12):2065-72. Vitale M, Falco M, Castriconi R, Parolini S, Zambello R, Semenzato G, Biassoni R, Bottino C, Moretta L, Moretta A. Identification of NKp80, a novel triggering molecule expressed by human NK cells. Eur J Immunol. 2001; 31(1):233-42. Vivier E, Morin P, O'Brien C, Druker B, Schlossman SF, Anderson P. Tyrosine phosphorylation of the Fc gamma RIII(CD16): zeta complex in human natural killer cells. Induction by antibody-dependent cytotoxicity but not by natural killing. J Immunol. 1991;146(1):206-10. 153 Vivier E, Ugolini S. Regulatory natural killer cells: new players in the IL-10 anti- inflammatory response. Cell Host Microbe. 2009; 6(6):493-5. Vogelzang NJ, Lestingi TM, Sudakoff G, Kradjian SA. Phase I study of immunotherapy of metastatic renal cell carcinoma by direct gene transfer into metastatic lesions. Hum Gene Ther. 1994; 5(11):1357-70. Voskoboinik I, Thia MC, Fletcher J, Ciccone A, Browne K, Smyth MJ, Trapani JA. Calcium-dependent plasma membrane binding and cell lysis by perforin are mediated through its C2 domain: A critical role for aspartate residues 429, 435, 483, and 485 but not 491. J Biol Chem. 2005; 280(9):8426-34. Vukicevic M, Chalandon Y, Helg C, Matthes T, Dantin C, Huard B, Chizzolini C, Passweg J, Roosnek E. CD56bright NK cells after hematopoietic stem cell transplantation are activated mature NK cells that expand in patients with low numbers of T cells. Eur J Immunol. 2010; 40(11):3246-54. Waldmann TA. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. Nat Rev Immunol. 2006; 6(8):595-601. Walzer T, Dalod M, Robbins SH, Zitvogel L, Vivier E. Natural-killer cells and dendritic cells: "l'union fait la force". Blood. 2005; 106(7):2252-8. Walzer T, Vivier E. G-protein-coupled receptors in control of natural killercell migration. Trends Immunol. 2011; 32(10):486-92. Welte SA, Sinzger C, Lutz SZ, Singh-Jasuja H, Sampaio KL, Eknigk U, Rammensee HG, Steinle A. Selective intracellular retention of virally induced NKG2D ligands by the human cytomegalovirus UL16 glycoprotein. Eur J Immunol. 2003; 33:194–203. Wu J, Chalupny NJ, Manley TJ, Riddell SR, Cosman D, Spies T. Intracellular retention of the MHC class I-related chain B ligand of NKG2D by the human cytomegalovirus UL16 glycoprotein. J Immunol. 2003; 170(8):4196-200. Wu S, Fischer L, Gökbuget N, Schwartz S, Burmeister T, Notter M, Hoelzer D, Fuchs H, Blau IW, Hofmann WK, Thiel E. Expression of interleukin 15 in primary adult acute lymphoblastic leukemia. Cancer. 2010; 116(2):387-92. 154 Wuest SC, Edwan JH, Martin JF, Han S, Perry JS, Cartagena CM, Matsuura E, Maric D, Waldmann TA, Bielekova B. A role for interleukin-2 trans-presentation in dendritic cell-mediated T cell activation in humans, as revealed by daclizumab therapy. Nat Med. 2011; 17(5):604-9. Yokoyama WM, Kim S. Licensing of natural killer cells by self-major histocompatibility complex class I. Immunol Rev. 2006; 214:143-54. Yokoyama WM. Natural killer cell receptors specific for major histocompatibility complex class I molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995; 92(8):3081-5. Yu J, Mao HC, Wei M, Hughes T, Zhang J, Park IK, Liu S, McClory S, Marcucci G,Trotta R, Caligiuri MA. CD94 surface density identifies a functional intermediary between the CD56bright and CD56dim human NK-cell subsets. Blood. 2010; 115(2):274-81. Yu MC, Su LL, Zou L, Liu Y, Wu N, Kong L, Zhuang ZH, Sun L, Liu HP, Hu JH, Li D, Strominger JL, Zang JW, Pei G, Ge BX. An essential function for beta-arrestin 2 in the inhibitory signaling of natural killer cells. Nat Immunol. 2008;9(8):898-907. Yue FY, Dummer R, Geertsen R, Hofbauer G, Laine E, Manolio S, Burg G. Interleukin- 10 is a growth factor for human melanoma cells and down-regulates HLA class-I, HLA class-II and ICAM-1 molecules. Int J Cancer. 1997; 71(4):630-7. Zafirova B, Wensveen FM, Gulin M, Polić B. Regulation of immune cell function and differentiation by the NKG2D receptor. Cell Mol Life Sci. 2011;68(21):3519-29. Zamai L, Del Zotto G, Buccella F, Galeotti L, Canonico B, Luchetti F, Papa S. Cytotoxic functions and susceptibility to apoptosis of human CD56(bright) NK cells differentiated in vitro from CD34⁺ hematopoietic progenitors. Cytometry A. 2012; 81(4):294-302. Zambello R, Facco M, Trentin L, Sancetta R, Tassinari C, Perin A, Milani A, Pizzolo G, Rodeghiero F, Agostini C, Meazza R, Ferrini S, Semenzato G. Interleukin-15 triggers the proliferation and cytotoxicity of granular lymphocytes in patients with lymphoproliferative disease of granular lymphocytes. Blood. 1997;89(1):201-11. 155 Zhang C, Zhang J, Niu J, Zhang J, Tian Z. Interleukin-15 improves cytotoxicity of natural killer cells via up-regulating NKG2D and cytotoxic effector molecule expression as well as STAT1 and ERK1/2 phosphorylation. Cytokine. 2008; 42(1):128-36. Zhang J, Scordi I, Smyth MJ, Lichtenheld MG. Interleukin 2 receptor signaling regulates the perforin gene through signal transducer and activator of transcription (Stat)5 activation of two enhancers. J Exp Med. 1999; 190(9):1297-308. Zhang J, Sun R, Wei H, Zhang J, Tian Z. Characterization of interleukin-15 gene- modified human natural killer cells: implications for adoptive cellular immunotherapy. Haematologica. 2004; 89(3):338-47. Zhou J, Zhang J, Lichtenheld MG, Meadows GG. A role for NF-kappa B activation in perforin expression of NK cells upon IL-2 receptor signaling. J Immunol. 2002; 169(3):1319-25. Zhu X, Marcus WD, Xu W, Lee HI, Han K, Egan JO, Yovandich JL, Rhode PR, Wong HC. Novel human interleukin-15 agonists. J Immunol 2009; 183:3598–607. Zimmer J, Donato L, Hanau D, Cazenave JP, Tongio MM, Moretta A, de la Salle H. Activity and phenotype of natural killer cells in peptide transporter (TAP)-deficient patients (type I bare lymphocyte syndrome). J Exp Med. 1998;187(1):117-22. Biografija Ana M Vuletić je rođena 10.12.1973 u Beogradu. Osnovne studije završila je 1999. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, studijska grupa molekularna biologija i fiziologija. Magistarsku tezu pod nazivom „Uticaj 13 cis retinoične kiseline na proliferaciju i diferencijaciju HL-60 ćelija promijelocitne leukemije“ odbranila je na Biloškom fakultetu Univerziteta u Beogradu 2007. godine. Od novembra 1999. godine zaposlena je na Institutu za onkologiju i radiologiju Srbije kao istraživač pripravnik. Od 2002. do danas učestvovala je u radu 3 projekta koje je finansiralo Ministarstvo prosvete, nauke i tehnološkog razvoja. Stručno se usavršavala na Evropskoj školi onkologije 2001. godine u Beogradu i Evropskoj letnjoj školi onkologije 2002. godine u Bordou, Francuska. Ana Vuletić je član Srpskog društva istraživača raka (SDIR), Evropskog društva za istraživanje raka (European Association for Cancer Research, EACR) i Društva imunologa Srbije. Autor je 3 rada u vrhunskim međunarodnim časopisima (M21), 5 radova u istaknutim međunardnim časopisima (M22), 2 rada u međunarodnim časopisima (M23) i 13 saopštenja sa međunarodnih skupova štampanih u izvodu (M24). .