UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Jasmina D. Debeljak Martačić Uticaj N-acetil-L-cisteina in vitro na proliferaciju i diferencijaciju matičnih ćelija zubne pulpe mlečnih zuba dece Doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Jasmina D. Debeljak Martacic Effect of N-acetil-L-cysteine in vitro on proliferation and differentiation of children deciduous teeth dental pulp stem cells Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 Ĉlanovi komisije, Mentor: Dr Milica Kovaĉević Filipović, vanredni profesor Fakulteta veterinarske medicine, Univerziteta u Beogradu ____________________________________________________________ Mentor: Dr Gordana Matić, redovni profesor Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu ____________________________________________________________ Dr Sunĉica Borozan, redovni profesor Fakulteta veterinarske medicine, Univerziteta u Beogradu ____________________________________________________________ Dr Vera Todorović, redovni profesor Stomatološkog fakulteta u Panĉevu, Univerziteta „Privredna akademija“ u Novom Sadu, ____________________________________________________________ Dr Tamara Popović, nauĉni saradnik Instituta za madicinska istraţivanja, Univerziteta u Beogradu ____________________________________________________________ Datum odbrane: ZAHVALNICA Zahvaljujem se svima koji su sa naučnog, materijalnog i/ili moralnog aspekta pomogli izradu ove teze. Posebnu zahvalnost dugujem: Dr Milici Kovačević Filipović, mom mentoru, koja je sa neverovatnim strpljenjem radila sa mnom, kako tokom eksperimentalnog dela, tako i tokom pisanja i formiranja finalne verzije ove teze, Dr Gordani Matić, mom mentoru sa fakulteta, profesorki koja mi je pruţala konstantnu pomoć i iskrenu podršku tokom doktorskih studija i same izrade teze, Dr Veri Todorović, na izuzetnoj naučnoj i materijalnoj pomoći kojom je omogućeno definisanje i finalizacija teze, Dr Sunčici Borozan, na izuzetnoj pomoći tokom izrade eksperimntalnog dela, kao i tokom pisanja teze, Dr Tamari Popović, koleginici i prijatelju bez čije nesebične pomoći i konstantne podrške ova teza ne bi bila realizovana. Veliko hvala i: Šefici laboratorije u kojoj sam zaposlena, dr Mariji Glibetić, na razumevanju i podršci koju mi je pruţila tokom pisanja teze, Koleginicama dr Aleksandri Arsić, mr Mariji Takić i dipl. farmaceutu Danici Ćujić na korisnim sugestijama i konkretnoj pomoći tokom same izrade teze, Kolegi mr Slavku Mojsiloviću na konkretnoj pomoći tokom izrade teze kao i korisnim sugestijama tokom sređivanja rezultata, Koleginicama sa Veterinarskog fakulteta Jeleni Francuski, Tijani Lužajić i dr Aniti Radovanović tokom obrade histoloških preparata, Zahvaljujem se i dr Gordani Petrović Oggiano, kao i ostalim koleginicama iz laboratorije na podršci tokom izrade teze. Bez pomoći i iskrene podrške članova moje uţe i šire porodice nikako ne bih uspela da privedem kraju ovaj veliki posao. U tom smislu sam zahvalna i svojoj doktorki Aleksandri Potrebić jer mi je njena podrška pomogla da odrţim ravnoteţu koja mi je bila neophodna da tezu privedem kraju. Na kraju, nemerljivu zahvalnost dugujem svom suprugu, jer samo on zna koliko je bilo teško biti uz mene tokom svih ovih godina. „Uticaj N-acetil-L-cisteina in vitro na proliferaciju i diferencijaciju matiĉnih ćelija zubne pulpe mleĉnih zuba dece“ REZIME Zubna pulpa vodi poreklo od embrionalnog ektomezenhima i potencijalno je vaţan izvor mezenhimalnih matiĉnih ćelija (MMĆ) za regeneraciju svih tkiva kraniofacijalne regije koja su, takoĊe, poreklom od ektomezenhima. N-acetil-L-cistein (NAC) je antioksidant koji moţe da ima uticaj na terapijsku primenu MMĆ. Cilj ovog rada je bio da utvrdi da li ćelije izolovane iz zubne pulpe mleĉnih zuba dece i ekspandirane in vitro, imaju karakteristike MMĆ i da ispita dejstvo NAC-a na njihovu proliferaciju i diferencijaciju, kao i da se utvrdi da li NAC utiĉe na aktivnost enzima antioksidativne zaštite, oksidativno oštećenje razliĉitih ćelijskih struktura i metabolizam glukoze. Metodom tkivnog eksplanta, iz šest pulpi mleĉnih zuba dece, je dobijena poĉetna populacija adheretnih ćelija. Za procenu broja CFU-F (eng. Colony Forming Unit – Fibroblast), ćelije su zasejavane u maloj gustini. Proliferativni potencijal i vreme udvajanja broja ćelija u kulturi je praćeno brojanjem ćelija posle tripsinizacije subkonfluentnih kultura, svaka 4 dana, tokom 40 dana. Protoĉna citometrija je korišćena za imunofenotipizaciju ex vivo umnoţenih ćelija, odreĊivanje aktivnosti aldehid- dehidrogenaze (ALDH), brzinu ulaska ćelija u sintetsku (S) fazu ćelijskog ciklusa, odreĊivanje broja ćelijskih deoba i detekciju apoptoze. Aktivnost -galaktozidaze (SA- β-Gal), odreĊivana je korišćenjem citohemije. Diferencijacija ekspandiranih ćelija u smeru osteogeneze, hondrogeneze i adipogeneze izvedena je korišćenjem komercijalnih medijuma. Promene na ćelijama tokom osteogene diferencijacije su praćene preko aktivnosti alkalne fosfataze spektrofotometrijski, deponovanja kalcijuma u ekstracelularni matriks (bojenje alizarin crvenim) i pojave osteokalcina (imunocitohemija). Hondrogena diferencijacija u peletama je praćena odreĊivanjem kolagena tip I (in situ hibridizacija), kolagena tip 2 (imunohistohemija) i odreĊivanjem koncentracije glikozaminoglikana (spektrofotometrija). Adipogena diferencijacija je ispitana vizuelizacijom masnih kapljica (Oil red O bojenje). Aktivnost katalaze i superoksid-dismutaze (SOD) u ćelijskom lizatu je odreĊena spektrofotometrijski. Koncentracija malondialdehida (MDA) je odreĊena reakcijom sa tiobarbiturnom kiselinom (TBA). Karbonilni derivati proteina odreĊivani su reakcijom sa 2,4 - dinitrofenilhidrazinom. Posle ekstrakcije ukupnih lipida i metilovanja masnih kiselina, metil-estri masnih kiselina su razdvajani gasno-teĉnom hromatografijom (GLC), a koncentracija zasićenih (SFA), mononezasićenih (MUFA) i i polinezasićenih masnih kiselina (PUFA) je izraţena procentualno u odnosu na ukupne masne kiseline. Izoenzimski oblici laktat-dehidrogenaze (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 i LDH5) su odreĊivani vertikalnom elektroforezom. Sva navedena merenja su izvedena bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC-a (0,1 mM, 1 mM i 2 mM). Naši rezultati su pokazali da je iz zubne pulpe mleĉnih zuba dece dobijena populacija ćelija koja formira znaĉajan broj CFU-F (4% izolovanih ćelija) i kontinuirano proliferiše tokom 40 dana, bez opadanja vremena potrebnog za udvajanje njihovog broja u kulturi. Ipak, dobijena populacija ćelija je bila heterogena po brzini deoba. Oko 12% ćelija je posle tri dana kultivacije bilo podeljeno manje od ĉetiri puta, dok se ostatak ćelija podelio više od ĉetiri puta. Vijabilitet ćelija je bio u proseku oko 95%, a svega 3% ćelija je bilo pozitivno na β-galaktozidazu. Tokom ĉitavog vremena kultivacije kapacitet za diferencijaciju u osteoblaste, adipocite i hondrocite se nije menjao. Gotovo sve ćelije su u pasaţi ĉetiri eksprimirale CD44, CD73, kolagen tipa I, CD29, CD90 i osteonektin. Deo ćelija je eksprimirao STRO-1, CD146 i CD106. Marker matiĉnih ćelija hematopoeze nije detektovan u našem sistemu kultivacije. Opseg u kome se kretao procenat ćelija koje pokazuju povišenu aktivnost ALDH je iznosio od 4% do 24% i bio je u negativnoj korelaciji sa vremenom udvajanja ćelija u kulturi. Naši rezultati su pokazali da uticaj NAC-a na izolovane ćelije zavisi od njegove koncentracije. Naime, posle 72 sata od primene niţih koncentracija NAC-a (0,1 mM i 1 mM) povećavao se broj ćelija u kulturi za 20% i to najverovatnije zbog ubrzanja ćelijskog ciklusa jedne manje populacije ćelija. Primena 2 mM NAC-a smanjivala je broj ćelija u kulturi. Osim toga, rastuća koncentracija NAC-a je stimulisala osteogenezu i hondrogenezu, a inhibirala adipogenezu. TakoĊe, primena 0,1 mM NAC-a je povećala procenat ćelija u kojima se mogla detektovati visoka aktivnost ALDH, a smanjivala procenat SA β-gal pozitivnih ćelija. Primena 2 mM NAC je dovela do povećanja broja SA β-gal pozitivnih ćelija. Niţe koncentracije NAC-a su smanjivale oksidativno oštećenje razliĉitih ćelijskih makromolekula (smanjena lipidna peroksidacija kao i formiranje karbonilnih derivata proteina), a to je bilo praćeno i smanjenjem aktivnosti SOD i katalaze. Osim toga, pokazano je i da je po dodavanju 0,1 mM NAC-a postojao porast aktivnosti LDH izoformi 4 i 5 što bi moglo da ukaţe na povećanje obima glikolize. Nakon sveobuhvatnog sagledavanja naših rezultata, moţemo zakljuĉiti da je primenjenom metodom, iz pulpe mleĉnih zuba dece, izolovana heterogena populacija ćelija, meĊu kojima su se nalazile i one ćelije koje su po svojim karakteristikama odgovarale matiĉnim ćelijama poreklom iz zubne pulpe. Niţe koncentracije NAC-a su stimulisale proliferaciju izolovanih ćelija u kulturi, smanjujući njihovo oksidativno oštećenje i verovatno povećavajući obim glikolize, dok su sve koncentracije NAC-a stimulisale osteogenezu i hondrogenezu. Zbog toga smatramo da bi niske koncentracije NAC-a mogle da naĊu primenu u kulturama matiĉnih ćelija zubne pulpe, posebno ukoliko je potrebno stimulisati njihovu proliferaciju i diferencijaciju u pravcu osteogeneze i hondrogeneze. Kljuĉne reĉi: matiĉne ćelije zubne pulpe, N-acetil-L-cistein, proliferacija, diferencijacija, katalaza, superoksid-dismutaza, laktat-dehidrogenaza, oksidativno oštećenje Nauĉna oblast: biologija Uţa nauĉna oblast: matiĉne ćelije UDK broj: 602:611.314.18.018]:616-092.4:[615.279:576.36](043.3) „Effect of N-acetil-L-cysteine in vitro on proliferation and differentiation of children deciduous teeth dental pulp stem cells“ Abstract Dental pulp originates from the embryonic ectomesenchyme and represents potentially important source of mesenchymal stem cells (MSCs) with the ability to regenerate all tissues of the craniofacial region, originating from the ectomesenchyme, too. N-acetyl-L-cysteine (NAC) is an antioxidant that may have an impact on the therapeutic use of MSCs. The aim of this study was to determine whether the cells isolated from the dental pulp of children deciduous teeth of children and expanded in vitro, have the characteristics of MSC, to examine the effect of NAC on their proliferation and differentiation and to determine whether NAC influences the metabolism of glucose, the activity of antioxidant enzymes and whether it reduces oxidative damage of various cellular macromolecules. The initial cell population was obtained from six pulps of deciduous teeth using ex vivo tissue explants method. The number of colonies (Colony Forming Unit – Fibroblast; CFU-F) was determined by seeding the low density cell culture. Proliferative potential and population doubling time of the cells in culture were followed by counting the cells after tripsinization of subconfluent cultures, every 4 days, respectively, during 40 days of cultivation. Flow cytometry was used for cell immunophenotypisation, aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity determination, number of cells in different phases of cell cycle, number of cell divisions and percentage of cells in apoptosis. Activity of β-galactosidase (SA-β-Gal), was determined using cytochemistry. Osteogenesis, chondrogenesis and adipogenesis were induced using complete commercial mediums. Osteogenic differentiation was monitored via alkaline phosphatase activity (spectrophotometry), deposition of calcium in the extracellular matrix (Alizarin red staining) and the appearance of osteocalcin (immunocytochemistry). Chondrogenic differentiation was followed by measuring collagen type I (in situ hybridization), collagen type 2 (immunohistochemistry) and the determination of the concentration of glycosaminoglycans (spectrophotometry). Adipogenic differentiation was examined by visualization of fat droplets (Oil Red O staining). Activity of catalase and superoxide dismutase (SOD) in cell lysates was determined spectrophotometrically. Malondialdehyde (MDA) was determined by reaction with thiobarbituric acid (TBA). Carbonyl derivatives of proteins were determined by reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine. After total lipid extraction and methylation of fatty acids, fatty acid methyl esters were separated by gas-liquid chromatography, and the concentration of saturated fatty acids, monounsaturated fatty acids and polyunsaturated fatty acids was expressed as percentage of total fatty acids detected in the sample. Isoenzyme forms of lactate dehydrogenase (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 and LDH5) were determined by vertical electrophoresis. All the above measurements were made with and without different concentrations of NAC (0,1 mM, 1 mM and 2 mM). Our results showed that the dental pulp of deciduous teeth of children had population of cells that formed a significant number of CFU-F (4% of the isolated cells) and continually proliferated for 40 days without decrease in the population doubling time. However, the resulting cell population was heterogeneous in terms of the division velocity. After three days of cultivation, around 12% of the cells were divided less than four times, while the remaining cells divided more than four times. Viability of cells was in average 95%, and only 3% of the cells were positive for β-galactosidase. During the entire time of the cultivation, expanded cells retained the ability to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes. Almost all cells expressed CD44, CD73, collagen type I, CD29, CD90 and osteonectin. Part of the cells expressed STRO-1, CD146 and CD106. Marker of hematopoietic stem cells have not been detected. Elevated ALDH activity ranged from 4% to 24% and was negatively correlated with the population doubling time. Our results showed that the effect of NAC on isolated cells dependeds on its concentration. In fact, after 72 hours of application of lower NAC concentrations (0,1 mM and 1 mM) the number of cells in culture increased by 20%, most probably due to the acceleration of the cell cycle of a small population of cells. Application of 2 mM NAC decreased the number of cells in culture. In addition, the growing concentration of NAC stimulated osteogenesis and chondrogenesis and inhibited adipogenesis. Also, the application of 0,1 mM NAC increased the percentage of cells which expressed high ALDH activity, and reduced the percentage of SA-β-gal positive cells. Application of 2 mM NAC led to an increase in the number of SA-β-gal positive cells. Lower concentrations of NAC reduced oxidative damage to various cellular macromolecules (reduced lipid peroxidation and the formation of carbonyl derivatives of proteins), and this was accompanied by reduced activity of SOD and catalase. In addition, it was shown that by adding 0,1 mM NAC the activity of LDH isoforms 4 and 5 increased, which could indicate an increase in the glycolitic activity, and at least in part explain the rapid proliferation of cells. After a comprehensive review of our results, we could conclude that by the method we applied, we isolated heterogeneous population of cells from the pulp of children deciduous teeth. Isolated cells had characteristics of dental pulp stem cells. Lower concentrations of NAC stimulated proliferation of cells in culture, reducing their oxidative damage and possibly increasing the volume of glycolysis, while all concentrations of NAC stimulated osteogenesis and chondrogenesis. We believe that the low concentration of NAC could find application in dental pulp stem cell expansion protocols, esspecially if necessary to stimulate their differentiation toward osteoblasts and chondrocytes. Keywords: dental pulp stem cells, N acetyl-L-cysteine, proliferation, differentiation, catalase, superoxide dismutase, lactate dehydrogenase, oxidative damage Scientific field: biology Narrow scientific field: stem cells UDC number: 602:611.314.18.018]:616-092.4:[615.279:576.36](043.3) LISTA SKRAĆENICA ALDH – aldehid-dehidrogenaza AP - alkalna fosfataza aP2 – eng. Adipocyte Protein 2 APE1/Ref-1 - eng. Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease/Redox Effector Factor-1 NFE2L2 (Nrf2) - eng. Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 ATP – adenozin-trifosfat BAA - bodipi-aminoacetate BAAA - bodipi-aminoacetaldehid Cu,Zn-SOD – bakar, cink-superoksid-dismutaza BCA – bicinhoniniĉna kiselina (eng. Bicinchoinic Acid) bFGF – baziĉni faktor rasta fibroblasta (eng. Basic Fibroblast Growth Factor) BMP2 - eng. Bone Morphogenetic Protein 2 BSA – goveĊi serum albumin BrdU- 5-bromo-2-deoksiuridin CDK – ciklin-zavisne kinaze CFDA-SE - karboksifluorescein-sukcinimidil-estar (eng. carboxyfluorescein succinimidyl ester) CFU-F - eng. Colony Forming Unit- Fibroblasts DEAB - dietilamino-benzaldehid DFC – ćelije poreklom iz zubnog folikula (eng. Dental Follicle Cells) DIG - digoksigenin DPSC – matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe (eng. Dental Pulp Stem Cells) DTSC – matiĉne ćelije poreklom iz dentalnih tkiva (eng. Dental Tissue derived Stem Cells) ECM - ekstracelularni matriks EcSOD - ekstracelularna superoksid-dismutaza FBS - fetalni goveĊi serum (eng. Fetal Bovine Serum) GAG - glikozaminoglikani GFP - eng. Green Fluorescent Protein GLC- gasno-teĉna hromatografija (eng. Gas-liquid Chromatography) GPx – glutation-peroksidaza GSH - glutation GVHD – reakcija kalema protiv domaćina (eng. Graft versus host disease) HEMA - 2-hidroksietil-metakrilat HA/TCP - hidroksipatit/trikalcijum-fosfat HIF-1 – hipoksija-inducibilni faktor 1 (eng. Hypoxia-Iinducible Factor 1) HIF-1α – hipoksija-inducibilni faktor 1, α subjedinica (eng. Hypoxia-Inducible Factor 1, alpha subunit) HIF-1β – hipoksija-inducibilni faktor 1, β subjedinica (eng. Hypoxia-Inducible Factor 1, beta subunit) HNE - 4-hidroksi-nonenal IBMX - izobutil-metil-ksantin IDPSC – nezrele matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe (eng. Immature Dental Pulp Stem Cells) IGF-1 – insulinu sliĉan faktor rasta-1 (eng. Insulin-like growth factor 1) IDO – indoleamin-dioksigenaza ISCT – MeĊunarodno udruţenje za ćelijsku terapiju (eng. International Society for Cellular Therapy) ISH - in situ hibridizacija JNK - eng. c-Jun N-terminal kinase CAT - katalaza LDH – laktat-dehidrogenaza LPO - lipidna peroksidacija Mn-SOD – mangan-superoksid-dismutaza MĆH - matiĉne ćelije hematopoeze MĆK - matiĉne ćelije kancera MĆ - matiĉne ćelije MDA - malondialdehid MK - masne kiseline MMĆ - mezenhimalne matiĉne ćelije MMSĆ - multipotentne mezenhimalne stromalne ćelije MSC - eng. Mesenchymal stem cells/Mesenchymal stromal cells MTA - eng. Mineral trioxide aggregate mTOR - eng. Mammalian Target of Rapamycin MUFA - mononezasićene masne kiseline (eng. Monounsaturated Fatty Acids) NAC - N-acetil-L-cistein NADPH – Nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat NFκB - eng. Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NOX4 – NADPH-oksidaza, izoforma 4 PBS - fosfatni pufer (eng. Phosphate Buffered Saline) PDLSCs – matiĉne ćelije poreklom iz periodontalnog ligamenta (eng. Periodontal Ligament Stem Cells) PDT – vreme udvajanja broja ćelija u kulturi (eng. Population Doubling Time) PGE2 - prostaglandin E2 PHD – prolil-hidroksilaza PI – propidijum-jodid PI3K - fosfatidil-inozitol 3-kinaza PKB - protein-kinaza B pNPP - p-nitrofenil-fosfat PPAR-γ2 - eng. Peroxisome Proliferator - activated Receptor γ2 PUFA - polinezasićene masne kiseline (eng. Polyunsaturated Fatty Acids) RhoA - eng. Ras Homolog Gene Family, Member A ROS – reaktivne vrste kiseonika RUNX2 - eng. Runt-related Transcription Factor 2 SA-β-gal - eng. Senescence- assosiated β-galactosidase SAHF - eng. Senescence-associated Heterochromatic Foci SCAP – matiĉne ćelije poreklom iz apikalne papile (eng. Stem Cells from Apical Papilla) SFA - zasićene masne kiseline SHED – matiĉne ćelije poreklom iz humanih eksfoliranih zuba (eng. Stem Cells From Human Exfoliated Deciduous Teeth) SHH - eng. Sonic Hedgehog SOD – superoksid-dismutaza TAZ - eng. Transcriptional Coactivator with PDZ binding motif TBA - tiobarbiturna kiselina TGF-β - eng. Transforming Growth Factor-β SH - tiolne grupe TIP - proteini eng. Tension-Induced/Inhibited Proteins TRX - tioredoksin VEGF - vaskularni endotelni faktor rasta (eng. Vascular Endothelial Growth Factor) VHL - eng. von Hippel Lindau Proteine Wnt – eng. Wingless-type MMTV integration site family SADRŢAJ 1. UVOD ........................................................................................................................... 1 2. PREGLED LITERATURE .......................................................................................... 4 2.1. Pojam i podela matiĉnih ćelija ............................................................................. 4 2.2. Mezenhimalne matiĉne ćelije ................................................................................ 5 2.2.1. Izolacija i karakterizacija mezenhimalnih matiĉnih ćelija ............................. 5 2.2.2. Potencijal za diferencijaciju mezenhimalnih matiĉnih ćelija in vitro........... 15 2.3. Starenje mezenhimalnih matiĉnih ćelija u kulturi ............................................... 20 2.4. Imunomodulatorna uloga mezenhimalnih matiĉnih ćelija .................................. 22 2.5. Matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe .............................................................. 23 2.5.1. Formiranje zubne pulpe tokom embriogeneze kod ljudi .............................. 24 2.5.2. Karakteristike DPSC, SHED i IDPSC in vitro ............................................. 26 2.5.3. Potencijal za diferencijaciju DPSC, SHED i IDPSC posle transplantacije .. 28 2.5.4. Regulacija proliferacije i diferencijacije matiĉnih ćelija poreklom iz zubne pulpe ....................................................................................................................... 29 2.5.5. Pretkliniĉke i kliniĉke studije ....................................................................... 31 2.6. Oksidativni stres i antioksidativna zaštita .......................................................... 32 2.6.1. Oksidativni stres ........................................................................................... 32 2.6.2. Mehanizmi antioksidativne zaštite na nivou ćelije ....................................... 35 2.7. Dejstvo N-acetil-L-cistein-a ................................................................................ 38 3. CILJ I ZADACI ISTRAŢIVANJA ....................................................................... 41 4. MATERIJAL I METODE .......................................................................................... 42 4.1. Izolacija ćelija ...................................................................................................... 42 4.2. OdreĊivanje CFU-F ............................................................................................. 43 4.3. Analiza efekta NAC na populaciju ekspandiranih ćelija poreklom iz zubne pulpe .................................................................................................................................... 43 4.3.1. Vreme udvajanja broja ćelija u kulturi ......................................................... 43 4.3.2. OdreĊivanje fenotipa ekspandiranih ćelija ................................................... 44 4.3.3. OdreĊivanje aktivnosti aldehid-dehidrogenaze ............................................ 45 4.3.4. Analiza ćelijskog ciklusa propidijum-jodidom............................................. 45 4.3.5. OdreĊivanje broja deoba testom sa karboksifluoresceinom ......................... 46 4.3.6. Procena ćelijske proliferacije pomoću BrdU eseja ....................................... 46 4.3.7. OdreĊivanje broja ţivih ćelija „Trypan Blue” testom .................................. 47 4.3.8. OdreĊivanje broja apoptotiĉnih ćelija........................................................... 47 4.3.9. OdreĊivanje aktivnosti β-galaktozidaze ....................................................... 48 4.3.10. Diferencijacija ćelija in vitro ...................................................................... 49 4.3.11. Alizarin Red S bojenje ................................................................................ 50 4.3.12. Oil Red O-bojenje i kvantifikacija adipogene diferencijacije .................... 50 4.3.13. Histohemijska i imunohistohemijska analiza hondrogenih peleta ............. 51 4.3.14. Kolorimetrijsko odreĊivanje aktivnosti enzima alkalna fosfataza u ćelijskom lizatu ....................................................................................................... 51 4.3.15. In situ hibridizacija ..................................................................................... 52 4.3.16. OdreĊivanje koncentracije glikozaminoglikana ......................................... 52 4.3.17. Kvantifikacija DNK .................................................................................... 53 4.4. OdreĊivanje stepena oksidativnog oštećenja i aktivnosti enzima antioksidativne odbrane ....................................................................................................................... 53 4.4.1. Liziranje ćelija i odvajanje ćelijskih proteina ............................................... 53 4.4.2. Koncentracija proteina u ćelijskom lizatu .................................................... 54 4.4.3. OdreĊivanje aktivnosti katalaze.................................................................... 54 4.4.4. OdreĊivanje aktivnosti superoksid-dismutaze .............................................. 54 4.4.5. OdreĊivanje koliĉine malondialdehida (MDA) ............................................ 55 4.4.6. OdreĊivanje ukupnih tiolnih (-SH) grupa ..................................................... 55 4.4.7. OdreĊivanje relativne zastupljenosti LDH izoenzimskih oblika u supernatantu ............................................................................................................ 55 4.4.8. OdreĊivanje sadrţaja karbonilnih grupa u oksidovanim proteinima u supernatantu ............................................................................................................ 56 4.5. Analiza masno-kiselinskog profila ukupnih ćelijskih lipida gasno-teĉnom hromatografijom ......................................................................................................... 56 4.5.1. Ekstrakcija ukupnih lipida iz ćelija .............................................................. 56 4.5.2. Ekstrakcija ukupnih lipida iz FBS ............................................................... 57 4.5.3. Gasno-teĉna hromatografija ......................................................................... 57 4.6. Statistiĉka analiza ................................................................................................ 58 5. REZULTATI .............................................................................................................. 59 5.1. Izolacija poĉetne populacije ćelija ....................................................................... 59 5.2. Proliferacija ćelija tokom dugotrajne kultivacije................................................. 59 5.3. Ekspresija površinskih antigena tokom kultivacije ............................................. 61 5.4. OdreĊivanje apoptoze tokom kultivacije ćelija ................................................... 64 5.5. Detekcija HIF-1α tokom kultivacije ćelija .......................................................... 65 5.6. OdreĊivanje aktivnosti β-galaktozidaze tokom kultivacije ćelija........................ 65 5.7. Diferencijacija ..................................................................................................... 67 5.7.1. Osteogena diferencijacija ............................................................................. 67 5.7.2 Adipogena diferencijacija .............................................................................. 70 5.7.3. Hondrogena diferencijacija .......................................................................... 71 5.8. Uticaj N-acetil-L-cisteina na proliferaciju ćelija u kulturi .................................. 72 5.9. Uticaj N-acetil-L-cisteina na procenat ćelija u apoptozi ..................................... 76 5.10. Uticaj N-acetil-L-cisteina na ekspresiju antigena na površini ćelija ................. 78 5.11. Uticaj N-acetil-L-cisteina na broj ćelija koje eksprimiraju ALDH ................... 79 5.12. Uticaj N-acetil-L-cisteina na aktivnost β-galaktozidaze ................................... 80 5.13. Uticaj N-acetil-L-cisteina na diferencijaciju ćelija izolovanih iz pulpe zuba ... 81 5.13.1. Uticaj N-acetil-L-cisteina na osteogenu diferencijaciju ............................. 81 5.13.2. Uticaj N-acetil-L-cisteina na adipogenu diferencijaciju ............................. 83 5.13.3. Uticaj N-acetil-L-cisteina na hondrogenu diferencijaciju ......................... 85 5.14. OdreĊivanje oksidativnog oštećenja lipida i proteina........................................ 86 5.14.1. Stepen lipidne peroksidacije ....................................................................... 86 5.14.2. Profil masnih kiselina ................................................................................. 86 5.14.3. Sadrţaj karbonilnih grupa ........................................................................... 89 5.14.4. Sadrţaj -SH grupa ....................................................................................... 90 5.14.5. Aktivnost enzimskih antioksidanata: superoksid-dismutaze i katalaze ...... 91 5.15. Uticaj NAC-a na ekspresiju HIF-1α .................................................................. 94 5.16. Uticaj NAC-a na relativnu aktivnost ukupne LDH i relativnu zastupljenost LDH izoformi ...................................................................................................................... 94 6. DISKUSIJA ................................................................................................................ 98 6.1. CFU-F test i proliferacija ćelija tokom dugotrajne kultivacije ............................ 99 6.2. Ekspresija površinskih antigena tokom kultivacije ........................................... 101 6.3. Diferencijacija DTSC ........................................................................................ 103 6.4. NAC povećava broj ćelija u kulturi ................................................................... 104 6.5. NAC povećava aktivnost ALDH u jednoj populaciji ćelija u kulturi................ 106 6.6. NAC smanjuje aktivnost SA-β-gal in vitro ....................................................... 107 6.7. NAC stimuliše osteogenu i hondrogenu, a inhibira adipogenu diferencijaciju 108 6.8. NAC smanjuje oksidativno oštećenje proteina i lipida ..................................... 110 6.9. NAC smanjuje aktivnost enzima antioksidativne zaštite .................................. 111 6.10. NAC povećava relativnu aktivnost LDH4 i LDH5 .......................................... 112 7. ZAKLJUĈAK ........................................................................................................... 115 8. LITERATURA ......................................................................................................... 117 BIOGRAFIJA PRILOZI 1 1. UVOD Razvoj nauke i nauĉne misli u biologiji nekada ide ispred tehnološkog napretka, a nekada mora da saĉeka razvoj razliĉitih tehnologija da bi uhvatio zamah i napravio kvalitativan pomak napred. Poĉetak XXI veka je u biologiji i medicini obeleţen obimnim radom na prouĉavanju matiĉnih ćelija, izolovanih iz razliĉitih tkiva ljudi i ţivotinja u svim fazama njihovog rasta i razvoja. Osobine koje poseduju ove za ţivot strateške ćelije, ĉine ih jedinstvenim za razvoj regenerativne medicine i daju nadu da bi kvalitet ţivota ljudi i ţivotinja, sa mnogim hroniĉnim bolestima, mogao da bude bolji ukoliko bi terapija matiĉnim ćelijama postala dostupna u rutinskoj praksi. Veliki nauĉnici kao što su Rudolph Virchow, Artur Pappenheim, Ernst Neumann, Alexandar Maximov i drugi su još sredinom XIX i poĉetkom XX veka oblikovali savremeni koncept obnove i odrţanja homeostaze tkiva pomoću matiĉnih ćelija (rev: Huntly i Gilliland, 2005). MeĊutim, tek je XXI vek sa sobom doneo tehnologije (genetski inţinjering, bioreaktori, nanotehnologija) koje bi mogle da budu baza realnih mogućnosti primene matiĉnih ćelija u terapiji razliĉitih oboljenja. Brojne kontroverze oko terapijske upotrebe embrionalnih matiĉnih ćelija i indukovanih pluripotentnih matiĉnih ćelija, ĉine da su matiĉne ćelije odraslog organizma najaktuelnija populacija ćelija za terapijsku primenu. Osim matiĉnih ćelija hematopoeze (MĆH) koje su suvereno vladale poljem ćelijske terapije više od 50 godina, i koje su na jedan naĉin dogmatski oblikovale naš pogled na koncept matiĉnosti, kroz veliki broj istraţivaĉkih poduhvata, poslednjih desetak godina, se probila druga velika i znaĉajna populacija matiĉnih ćelija: mezenhimalne matiĉne ćelije (MMĆ). Prema bazi podataka Nacionalnog instituta za zdravlje u Sjedinjenim Ameriĉkim Drţavama, trenutno su u svetu odobrene 324 kliniĉke studije, koje imaju za cilj evaluaciju dejstva MMĆ u regeneraciji i reparaciji razliĉitih tkiva (juni 2013 godine). Tako je 180 studija usmereno na stimulaciju regeneracije koštanog tkiva, 44 studije na regeneraciju/reparaciju srĉanog mišića, 40 studija na regeneraciju jetre i 20 studija na poboljšanje reparacije zglobne hrskavice (http://www.clinicaltrials.gov). TakoĊe, 20 studija je posvećeno ublaţavanju posledica reakcije kalema protiv domaćina posle terapijske primene MĆH (http://www.clinicaltrials.gov). Osnovna osobina koja MMĆ odraslih organizama ĉini znaĉajnim za kliniĉku praksu je ĉinjenica da tokom postnatalnog ţivota zadrţavaju 2 svojstvo da po adekvatnoj stimulaciji proĊu ĉitav embrionalni put razvoja pojedinih tkiva da bi u sluĉaju oštećenja ćelija tih tkiva mogle na odgovarajući naĉin da uĉestvuju u reparaciji i regeneraciji. Koštana srţ je tradicionalno osnovni izvor MĆH i MMĆ za kliniĉku praksu. Altrenativni izvor MMĆ sa izrazitom sposobnošću in vitro ekspanzije su pulpa mleĉnih i stalnih zuba. Naime, matiĉne ćelije koje se nalaze u pulpi mleĉnih i stalnih zuba potiĉu od ektomezenhima koji je postnatalno zadrţao svojstva sliĉna embrionalnim matiĉnim ćelijama (Kerkis i Caplan, 2012). Iako matiĉnih ćelija u zubnoj pulpi ima malo, one su lako dostupne posle vaĊenja zuba (poţeljno je da je zub za obradu dobijen posle vaĊenja iz ortodontskih razloga), njihova izolacija je jednostavna, rast u kulturi brz i imaju antiinflamatorno i/ili imunosupresivno dejstvo (Tomić i sar., 2011; Djokić i sar., 2012). TakoĊe imaju mogućnost diferencijacije u odontoblaste, osteoblaste, hondrocite, adipocite, mišićne ćelije, neurone i ćelije pankreasa (Kerkis i Caplan, 2012) te predstavljaju idealnu populaciju ćelija za regenerativnu medicinu. TakoĊe, na prostoru Evrope, postoji nekoliko privatnih banaka za dugotrajno deponovanje matiĉnih ćelija izolovanih iz zubne pulpe. Postojanje banaka omogućava njihovu lakšu primenu za autologu/alogenu transplantaciju. Iako dentalna medicina prednjaĉi u istraţivanjima i primeni inovativnih biotehnoloških rešenja, do juna 2013. godine prijavljeno je regrutovanje kandidata za samo jednu kliniĉku studiju ĉiji je cilj regeneracija zubne pulpe transplantacijom autologih matiĉnih ćelija izolovanih iz zubne pulpe mleĉnih zuba (http://www.clinicaltrials.gov). S druge strane, više radova je posvećeno pretkliniĉkim ispitivanjima na miševima i pacovima koja imaju za cilj definisanje metoda koje bi dovele do in vivo regeneracije svih struktura zuba i njegovo adekvatno uzglobljavanje u alveolarnu kost (Yamamoto i sar., 2013; Duailibi i sar., 2004; Oshima i sar., 2011). Nezaobilazna faza u svim biotehnološkim rešenjima u regenerativnoj medicini i ćelijskoj terapiji je dobijanje zadovoljavajućeg broja MMĆ koje imaju potencijal da se diferenciraju u ţeljeni tip ćelije. Najveći broj laboratorija koje se bave matiĉnim ćelijama i tkivnim inţinjeringom ekspandira MMĆ u nefiziološkim uslovima sa 20% O2. Visoke koncentracije kiseonika mogu da dovedu do oksidativnog oštećenja razliĉitih ćelijskih struktura, promena u metabolizmu ekspandiranih ćelija (Vacanti i Metallo, 2013), ali mogu da poremete i finu signalizaciju usmerenu na balans procesa kao što su samoobnova, proliferacija i diferencijacija ćelija (Hermitte i sar., 2006; 3 Kovaĉević Filipović i sar., 2007). S druge strane, danas je već višestruko potvrĊeno da je kultivacija MMĆ, kao i MĆH u uslovima u kojima je koncentracija kiseonika bliska fiziološkim mnogo bolja za oĉuvanje matiĉnosti (Ivanović i Boiron, 2009; Kovaĉević Filipović i sar., 2007) i za dobijanje boljih rezultata prihvatanja kalema po transplantaciji ćelija (Jaussaud i sar., 2013). TakoĊe je pokazano da postoji mogućnost da se kultivacija ćelija na niskim koncentracijama O2 zameni dodavanjem antioksidanasa u kulture. N-acetil-L-cistein (NAC) je antioksidans koji se već koristi u medicini kao pomoćno lekovito sredstvo (Kelly, 1998). Njegova primena in vitro na matiĉnim ćelijama se još uvek ispituje, a dosadašnji rezultati pokazuju da NAC ima pozitivan efekat u smislu inhibicije nastanka oksidativnih oštećenja i poboljšanja ekspresije adhezivnih molekula obezbeĊujući in vitro uslove u kojima je transplantacija MMĆ efikasnija (Song i sar., 2010). MeĊutim, koncentracija NAC koja moţe da ima pozitivno dejstvo na proliferaciju i/ili diferencijaciju matiĉnih ćelija zubne pulpe nije do sada ispitana. Zbog toga je cilj ovog rada bio da ispita in vitro efekte NAC na proliferaciju i diferencijaciju matiĉnih ćelija zubne pulpe dece. 4 2. PREGLED LITERATURE 2.1. Pojam i podela matiĉnih ćelija Matiĉne ćelije su nediferencirane ćelije jednog organizma koje imaju sposobnost samoobnove, visok proliferativni potencijal i mogućnost diferencijacije u razliĉite tipove zrelih ćelija. Matiĉne ćelije moţemo podeliti prema periodu ţivota u kom vrše odreĊenu funkciju, na embrionalne, fetalne i adultne matiĉne ćelije. Embrionalne i fetalne matiĉne ćelije su neophodne za embrionalni razvoj i organogenezu. Embrionalne matiĉne ćelije su pluripotentne, odnosno od njih nastaju ćelije endoderma, mezoderma i ektoderma. Fetalne matiĉne ćelije se smatraju multipotentnim ćelijama, odnosno njihov potencijal za diferencijaciju je ograniĉen na razvoj ćelija jednog klicinog lista, mada u zavisnosti od anatomske lokalizacije i perioda uzorkovanja, ove ćelije pokazuju veliku plastiĉnost i još uvek nisu dovoljno ispitane (Pojda i sar., 2005). Matiĉne ćelije koje su prisutne u tkivima postnatalno se nazivaju adultne matiĉne ćelije. One su takoĊe multipotentne i imaju ulogu u odrţavanju homeostaze pojedinih tkiva kao i ulogu u regeneraciji i reparaciji razliĉitih tkiva. Osim embrionalnih, fetalnih i adultnih matiĉnih ćelija koje su neophodne za normalan rast i razvoj organizma i odrţavanje homeostaze tkiva, smatra se da postoje i matiĉne ćelije tumora koje su odgovorne za nastanak i rast tumora (Chen i sar., 2013). Matiĉne ćelije se takoĊe mogu podeliti prema anatomsko/histološkoj lokalizaciji i samoj funkciji. Najbolji primer matiĉnih ćelija, i hijerarhijske organizacije nezrelih i zrelih ćelija jednog tkiva, je svakako hematopoetsko tkivo. Tokom procesa hematopoeze od malog broja nediferenciranih MĆH, preko niza progenitora koji su opredeljeni za pojedine krvne loze, svakog sekunda u organizmu nastaju milioni zrelih ćelija krvi (Dzierzak i Philipsen, 2013). Epitelna tkiva koja se kontinuirano obnavljaju, takoĊe poseduju definisanu funkcionalnu hijerarhijsku organizaciju koja podrazumeva da od malog broja primitivnih ćelija nastaje veliki broj diferenciranih, zrelih ćelija neophodnih za funkciju tkiva. U epitelnim tkivima je ĉak i anatomsko/histološka lokalizacija matiĉnih ćelija definisana (Freeman, 2008). MeĊutim, anatomska lokalizacija MMĆ još uvek nije sa sigurnošću pokazana. MMĆ koje se zapravo in vivo najviše aktiviraju tokom oštećenja tkiva, in vitro pokazuju zadivljujući proliferativni 5 potencijal, ali i mogućnosti diferencijacije kakva nije pokazana za MĆH i matiĉne ćelije epitela. Od svih MMĆ, ćelije zubne pulpe pokazuju najveću plastiĉnost, što je najverovatnije povezano sa ĉinjenicom da one nastaju od ćelija koje su tokom embrionalnog razvoja prošle ektomezenhimalnu tranziciju (Kerkis i Caplan, 2012). Zbog toga je ova ćelijska populacija od posebnog znaĉaja za regenerativnu medicinu. 2.2. Mezenhimalne matiĉne ćelije 2.2.1. Izolacija i karakterizacija mezenhimalnih matiĉnih ćelija Mezenhimalne matiĉne ćelije (MMĆ) se postnatalno mogu izolovati iz razliĉitih tkiva koja imaju vezivno tkivne komponente (Tabela 1). One vode poreklo od mezoderma/ektomezenhima i za sada je jasno definisano da je njihova in vivo uloga da omoguće sporo, ali kontinuirano, obnavljenje koštanog tkiva, umnoţavanje adipocita, obezbede apozicioni rast hrskavice ukoliko je prisutan odgovarajući stimulus i obezbede adekvatnu mikrosredinu za neometano odvijanje hematopoeze (Pittenger i sar., 2000). U uslovima fiziološke ravnoteţe, biološki aktivni molekuli omogućavaju da se paralelno sa retkim proliferacijama odvija i diferencijacija MMĆ u ćelije pojedinih tkiva. Nasuprot tome, intenzivan stimulus za aktivaciju MMĆ je svako oštećenje tkiva koje pokreće inflamatornu reakciju. Inflamatorna reakcija s jedne strane ukljuĉuje aktivaciju razliĉitih vrsta leukocita koji uništavaju i uklanjaju štetni agens, a sa druge strane obezbeĊuje aktivaciju MMĆ koje proliferišući i stvarajući fibroblaste popunjavaju defekt tkiva i vode rezoluciji inflamacije (Caplan i Correa, 2011). Iako su navedene uloge MMĆ jasne, njihova tkivna lokalizacija i taĉan fenotip na osnovu koga bi se razlikovale od zrelijih ćelija potomaka još uvek nisu sa sigurnošću pokazane (Frenette i sar., 2013). Zapravo, većina autora koji se bave problematikom MMĆ istiĉe da se o funkcionalnim i fenotipskim karakteristikama ovih ćelija više zna na osnovu njihovih in vitro karakteristika nego na osnovu zapaţanja in vivo (da Silva Meirelles i sar., 2008). 6 Tabela 1. Tkiva i organi iz kojih su izolovane MMĆ Izvor MMĆ Diferencijacija in vitro Reference Koštana srž Osteoblasti, hondroblasti, stromalne ćelije 1 Osteoblasti, adipociti, hondroblasti 2 Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, neuroni, miociti3 Friedenstein i sar., 1966 1 Pittenger i sar., 1999 2 Bianco i sar., 2001 3 Masno tkivo Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, mioblasti 1 Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, neuroni, endotelne ćelije2, kardiomiocitima sliĉne ćelije3, ćelije koje produkuju insulin 4 Zuk i sar., 2002 1 Nakagami i sar., 2006 2 , Dave i sar., 2013 3 , Léobon i sar., 2009 4 Perihondrium Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, ćelije strome Arai i sar., 2002 Mišići Mišićne ćelije, adipociti, hondroblasti,osteoblasti, fibroblasti,endotelne ćelije Young i sar., 2001 Pupĉanik krv Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, neuroni, ćelije sliĉne endotelnim ćelijama1, ćelije koje produkuju insulin 2 Li i sar., 2012 1 Boroujeni i sar., 2013 2 Pupĉanik stroma Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, hepatocitima 1 i neuronima 2 sliĉne ćelije Zhang i sar., 2009 1 , Ma i sar., 2005 2 Korneal stroma Hondroblasti, nervne ćelije Du i sar., 2005 Jetra (stelatne ćelije) Adipociti, osteoblasti Kordes i sar., 2013 Pankreas Osteociti, adipociti, neuroni, ćelije pankreasa Gopurappilly i sar., 2013 Koža Neuroni, glija, glatkomišićne ćelije, adipociti Toma i sar., 2001 Folikuli dlake Adipociti, osteoblasti 1 Neuroni, glija, keratinociti, glatkomišićne ćelije, melanociti 2 Jahoda i sar., 2003 1 Amoh i sar., 2008 2 Tetive adipociti, osteoblasti, hondroblasti Bi i sar., 2007 Zubna pulpa Odontoblasti, adipociti, nervne ćelije 1 Osteoblasti, odontoblasti 2 Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, neuroni, miociti 3 , endotelne ćelije4, hepatocitima sliĉne ćelije5 Miura i sar., 2003 1 Gronthos i sar., 2000 2 Kerkis i sar., 2006 3 , Bento i sar., 2013 4 , Ishkitiev i sar., 2012 5 Periodontalni ligament Cementoblasti, adipociti, ćelije koje sintetišu kolagen Seo i sar., 2004 Placenta Adipociti, osteoblasti Fukuchi i sar., 2004 Endometrium Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, glatkomišićne ćelije Gargett i sar., 2009 Zglobna hrskavica Osteoblasti, adipociti, hondroblasti 1 Hondroblasti 2 Alsalameh i sar., 2004 1 Williams i sar., 2010 2 Sinovium Adipociti, osteoblasti, hondroblasti Sakaguchi i sar., 2005 Amnionska teĉnost Adipociti, osteoblasti, mišićne ćelije, endotelne, nervne ćelije, hepatociti1 Osteoblasti, adipociti, hondroblasti, neuroblasti 2 De Coppi i sar., 2007 1 Mareschi i sar., 2009 2 Alexandar Friedenstein (Friedenstein i sar., 1966, 1970) je, uz pomoć nekoliko razliĉitih eksperimentalnih pristupa, pokazao da se meĊu ćelijama izolovanim iz koštane srţi, osim MĆH, nalaze i ćelije koje in vivo mogu da se diferenciraju u stromu koštane srţi, osteoblaste i hondrocite, a in vitro formiraju kolonije fibroblasta. Analogno tada 7 već uvedenoj terminologiji za opisivanje ranih prethodnika krvnih ćelija, ćelije koje formiraju kolonije sastavljene od fibroblasta nazvane su Colony Forming Unit - Fibroblasts (CFU-F). Njihova klonalna priroda pokazana je pozitivnom linearnom zavisnošću broja zasaĊenih ćelija koštane srţi i broja nastalih CFU-F (Friedenstein i sar., 1970). Ovaj funkcionalni test je i do danas ostao osnova za definisanje proliferativnog potencijala MMĆ izolovanih iz pojedinih tkiva. Što je još znaĉajnije, Friedenstein je u svojim eksperimentima pokazao da CFU-F nakon serije transplantacija singenim ţivotinjama zadrţavaju mogućnost ektopiĉnog formiranja koštanog tkiva, odnosno pokazao je mogućnost samoobnove MMĆ (Friedenstein i sar., 1974). Paralelno sa ispitivanjima Alexandra Friedensteina, u laboratoriji Arnolda Caplana prouĉavan je osteogeni i hondrogeni potencijal mezenhima pilećih embriona starih nekoliko dana. Posle duţeg niza eksperimenata koji su imali za cilj da pokaţu da osteoblasti nastaju od hondroblasta, uoĉeno je da su nezavisne progenitorske/prekursorske ćelije odgovorne za nastanak hondroblasta, osteoblasta i mioblasta, na osnovu ĉega je postavljena hipoteza o postojanju multipotentnih mezenhimalnih matiĉnih ćelija (Caplan i sar., 1991). TakoĊe je pretpostavljeno da se i kod odraslih organizama u tkivima zadrţavaju ćelije sa karakteristikama mezenhimalnih ćelija, te je Arnold Caplan popularisao termin mezenhimalne matiĉne ćelije za sve ćelije koje imaju potencijal istovetan onom koji je utvrĊen kod pilećih embriona. Šema 1 prikazuje originalan crteţ ovog nauĉnika koji se odnosi na potencijal diferencijacije MMĆ (šema 1). Kako je izolacija adherentnih ćelija koje se karakterišu visokim proliferativnim potencijalom i mutipotentnošću, relativno jednostavna za izvoĊenje, a široka paleta mogućnosti njihove kliniĉke upotrebe stimulativna, veliki broj laboratorija je svoju paţnju usmerio na istraţivanja ovog tipa ćelija. Da bi se ćelije odreĊene ćelijske populacije smatrale matiĉnim, moraju da pokazuju sposobnost samoobnove. Termin samoobnova oznaĉava deobu ćelije na dve ćelije ćerke od kojih najmanje jedna ima istovetne kapacitete za samoobnovu, proliferaciju i diferencijaciju kao i ćelija majka. 8 Šema 1. Mezenhimalne matiĉne ćelije (MMĆ) in vitro imaju veliki potencijal za proliferaciju i diferencijaciju. Na ovoj šemi su prikazani putevi diferencijacije MMĆ u razliĉite zrele ćelije (Šema preuzeta iz rada Caplan i sar., 1994) Klasiĉan i elegantan pristup dokazivanju svojstva samoobnove ostvaren je prilikom ispitivanja matiĉnih ćelija za hematopoezu (MĆH). Naime, zlatni standard za dokazivanje samoobnove MĆH je dugotrajna/doţivotna repopulacija hematopoeze primaoca sa mijeloablacijom, tokom serijskih transplantacija MĆH (Till i McCulloch, 1961; Nibley i Spangrude, 1998). Kako su eksperimenti sa transplantacijom MMĆ izuzetno zahtevni u odnosu na transplantaciju MĆH, ovaj vid ispitivanja nikada nije preporuĉen kao deo nezaobilaznih procedura prilikom definisanja MMĆ. Iz tog razloga, veliki broj istraţivaĉa smatra da je MMĆ zapravo bolje definisati kao mutipotentne ćelije strome, jer taj naziv u potpunosti opisuje njihovo poreklo, kao i njihov potencijal za diferencijaciju koji se moţe pokazati in vitro. MeĊutim, kako u engleskom govornom podruĉju Mesenchymal Stem Cells i Multipotent Stromal Cells imaju isti akronim – MSCs, opšte je prihvaćeno da su i sami nazivi sinonimi (Bianco i sar., 2008). Ipak, nedavno je samoobnova humanih MMĆ potvrĊena eksprimentalnim pristupom koji u osnovi ima isti funkcionalni pristup kao eksperimenti koje je izveo A. Friedenstein 9 (Sacchetti i sar., 2007). Naime, serijskim ksenotransplantacijama CD146+ ćelija poreklom od jedne CFU-F izolovane iz koštane srţi, pokazano je da humane adventicijalne retikularne ćelije uĉestvuju u ektopiĉnom formiranju krvnih sudova i koštanog tkiva primaoca, odnosno da mogu da se samoobnavljaju i da se diferenciraju u osteoblaste (Sacchetti i sar., 2007). Proliferativni potencijal MMĆ se prevashodno procenjuje brojem deoba koje se mogu odigrati in vitro, pre nego što doĊe do ćelijskog starenja i prekida deoba ćelija. Za kliniĉku primenu je veoma vaţno proceniti optimalan broj deoba, koji treba da omogući dobijanje dovoljnog broja ćelija za terapiju, u odnosu na oĉuvanje njihovog kapaciteta za diferencijaciju u funkcionalne ćelije razliĉitih tkiva. Pojedine procene u literaturi ukazuju da se ekspanzija ćelija mora prekinuti u trećoj pasaţi (oko 15 dana kultivacije) dok se neke studije baziraju na upotrebi ćelija ekspandiranih do osme pasaţe (oko 40 dana kultivacije) s obzirom na to da je i u osmoj pasaţi pokazana visoka proliferativna sposobnost, stabilnost fenotipa i pluripotentnost MĆ poreklom iz koštane srţi (Khoo i sar., 2008). Neţeljeni efekat dugotrajne kultivacije ćelija je njihova spontana imortalizacija (Brandl i sar., 2010). Veliki broj kliniĉkih studija se ograniĉava na primenu ćelija izolovanih iz vezivnih tkiva bez prethodne manipulacije in vitro (Martin i sar., 2012) Hijerarhijska organizacija i plastiĉnost mezenhimalnih matiĉnih ćelija: Pretpostavka o hijerhijskoj organizaciji MMĆ se zasniva na analogiji izmeĊu MĆH i MMĆ i na eksperimentalnim dokazima takve organizacije. Naime, mali broj primitivnih multipotentnih matiĉnih ćelija koje imaju svojstvo samoobnove, proliferiše i diferencira se u veći broj bipotentnih i/ili unipotenih progenitorskih ćelija koje gube sposobnost samoobnove i ĉiji se proliferativni potencijal smanjuje (Caplan i sar., 1991; Aubin i sar., 1998). Tako je pokazano, da se jedna trećina CFU-F iz koštane srţi sastoji od ćelija koje imaju sposobnost diferencijacije u adipocite, osteoblaste i hondrocite i da se oko dve trećine ćelija mogu diferencirati u pravcu osteoblasta i hondrocita (Pittenger i sar., 1999; Muraglia i sar., 2000). Nijedna CFU-F nije imala ćelije koje su mogle istovremeno da se diferenciraju u osteoblaste i adipocite ili hondrocite i adipocite, a posle dugotrajne kultivacije ćelije su zadrţavale samo osteogeni potencijal (Muraglia i sar., 2000). U istim ispitivanjima nisu pokazani unipotentni progenitori za adipocite (Muraglia i sar., 2000). Noviji podaci ukazuju da MMĆ kao i zrele ćelije potekle od MMĆ imaju 10 sposobnost unutar tkivne i meĊutkivne plastiĉnosti. Plastiĉnost je definisana kao mogućnost jedne ćelije da poprimi morfološke i funkcionalne karakteristike drugog tipa ćelija i da te karakteristike trajno zadrţi i posle transplantacije odreĊenom primaocu (Lakshmipathy i Verfaillie, 2005). Ukoliko se preobraţaj odigrava u ćelije koje nastaju od iste multipotentne matiĉne ćelije onda se govori o unutartkivnoj plastiĉnosti, a ukoliko su u pitanju ćelije koje pripadaju drugoj lozi matiĉnih ćelija ili drugom klicinom listu onda je u pitanju meĊutkivna plastiĉnost (šema 2). Mehanizmi plastiĉnosti leţe u epigenetskom reprogramiranju ćelija i ukljuĉuju dediferencijaciju i transdiferencijaciju ćelija (Wagers i Weissman, 2004). Dediferencijacija ćelija je proces u kome diferencirana ćelija prestaje da eksprimira gene karakteristiĉne za njenu terminalnu funkcionalnu aktivnost, a eksprimira gene koji su bili aktivni u progenitorskoj ili matiĉnoj ćeliji od koje je ta zrela ćelija nastala. Na primer, hondrociti izolovani iz hrskavice digestijom, in vitro se dediferenciraju i proliferišu, a po transplantaciji u defekt hijaline hrskavice ponovo diferenciraju u hondrocite što je iskorišćeno u terapijske svrhe (Brittberg i sar., 1994). TakoĊe, dediferencirani hondrociti poreklom iz hijaline hrskavice u kulturi sintetišu kolagen tipa I, a ne sintetišu kolagen tip II (Schnabel i sar., 2002). Transdiferencijacija je direktno pretvaranje jedne ćelije u drugu ćeliju poreklom od istog ili drugog klicinog lista (Wagers i Weissman, 2004). U prisustvu odgovarajućih biološki aktivnih molekula kao što su, deksametazon i IBMX-a (3-isobutil-1-metilksantin), osteoblasti se u kulturi mogu transdiferencirati u adipocite (Nutall i sar., 1998), dok se adipociti mogu transdiferencirati u osteoblaste (Park i sar., 1999). Iako in vitro nalazi ukazuju na izuzetnu unutartkivnu plastiĉnost ćelija koje vode poreklo od mezenhimalnih ćelija, znaĉaj tih nalaza in vivo ostaje da se utvrdi. Intrigantan i još uvek nedovoljno prouĉen fenomen je meĊutkivna plastiĉnost koja se pripisuje samim MMĆ ili ćelijama potomcima MMĆ. Transfekcija ćelija u kulturi odgovarajućim transkripcionim faktorima i ekspresija odreĊenih mikro-RNK molekula, dovodi do konverzije fibroblasta u neurone (Yoo i sar., 2011). Pokazano je i da se MMĆ in vitro mogu diferencirati i/ili transdiferencirati u kardiomiocite (Martin- Rendon i sar., 2008), glija ćelije (Radtke i sar., 2009), hepatocite (Snykers i sar., 2009), endotelne ćelije (Nakashima i sar., 2009) i ćelije endokrinog pankreasa (Zulewski, 2009). 11 Šema 2. Šema prikazuje sposobnost samoobnove MMĆ, kao i markere koje se najĉešće koriste tokom identifikacije i karakterizacije MMĆ in vitro. Na šemi je prikazana sposobnost multipotentne diferencijacije u ćelije mezoderma, ali i plastiĉnost MMĆ u smislu diferencijacije/transdiferencijacije u ćelije koje pripadaju drugim klicinim listovima (preuzeto uz modifikacije iz Kuhn i Tuan, 2010) Preporuke za definisanje mezenhimalnih matiĉnih ćelija in vitro: Da bi rezultati razliĉitih studija bili uporedivi i da bi se kvantitet objavljenih rezultata pretvorio u kvalitativnu spoznaju o pojedinim fenomenima, a to dovelo do napretka kako u baziĉnim istraţivanjima tako i u kliniĉkoj praksi, MeĊunarodno udruţenje za ćelijsku terapiju (ISCT – International Society for Cellular Therapy) je 2006. godine (Dominici i sar.) predloţilo uniformnu karakterizaciju ovih ćelija. Preporuke ovog udruţenja su da sve ćelije koje in vitro mogu da adheriraju za plastiĉnu podlogu treba da nose naziv multipotentne mezenhimalne stromalne ćelije (MMSĆ). Podgrupa ovih ćelija koja ispunjava minimalne kriterijume koji potvrĊuju primitivnost in vitro treba da nosi naziv MMĆ. Ti kriterijumi su sledeći: 1. Adhezija za plastiĉnu podlogu 2. Ekspresija površinskih markera CD105, CD73 i CD90, odnosno nedostatak površinskih markera koji karakterišu hematopoetske ćelije: CD34, CD14, CD 45, HLA DR ili CD11b i CD79a ili CD19. 3. Mogućnost in vitro diferencijacije u adipocite, hondrocite i osteoblaste Adhezija za plastiĉnu podlogu: Maximov (1928) je prvi uoĉio i opisao fibroblaste u kulturi ćelija izolovanih iz krvi zamorca. Podloga tih kultura je bio 12 fibrinski koagulum (Maximov, 1928). Friedenstien i sar., (1970) su razvili sistem kutivacije CFU-F u plastiĉnim flask-ovima, sa i bez sloja ozraĉenih ćelija. Ova prva istraţivanja adherentnih ćelija prisutnih u koštanoj srţi su dovela do razvoja kultura sa tzv. adherentnim feeder slojem u kojima se tokom više meseci odrţavala kontinuirana proizvodnja hematopoetskih ćelija koje su se nalazile u suspenziji (Dexter i sar., 1977). Na ovaj naĉin je poĉelo oblikovanje ideje o nerazdvojnom jedinstvu MĆH i MMĆ u koštanoj srţi. Brojni kasnije objavljeni radovi su pokazali da razliĉite komponente ekstracelularnog matriksa (ECM) mogu selektivno da dovedu do adhezije pojedinih populacija mezenhimalnih ćelija sveţe izolovanih iz razliĉitih tkiva (Chen i sar., 2010). Paralelno, industrija koja podrţava razvoj ćelijskih kultura je proizvela i proizvodi sve širu paletu plastiĉnih materijala koji stimulišu adheziju mezenhimalnih (matiĉnih) ćelija. Na taj naĉin je izolacija adherentnih ćelija iz razliĉitih tkiva postala jednostavna za rutinski rad u laboratoriji, iako još uvek nisu postignuti uslovi u kojima bi se znaĉajno povećao broj primitivnih MMĆ. Zanimljivo je da postoje radovi u kojima je pokazano da MMĆ mogu da se odrţe u nediferenciranom stanju kada se nalaze u kulturi u obliku suspenzije (Baksh i sar., 2007). Fenotip mezenhimalnih matiĉnih ćelija in vitro: Fenotipska karakterizacija odreĊene ćelijske populacije je vaţna sa aspekta jasnog povezivanja fenotipa i funkcije ćelija koje su izolovane iz pojedinih tkiva i njihove moguće kliniĉke primene. Kako je veliki broj istraţivanja izveden na MMĆ izolovanim iz koštane srţi, najvaţnija potreba prilikom njihove karakterizacije je jasno razdvajanje od hematopoetskih ćelija. Tako se definisanje fenotipa MMĆ in vitro bazira na identifikaciji kombinacije antigena koji ukazuju da ćelije imaju mezodermalno poreklo (CD44, CD106, STRO-1, CD146), i da ne pripadaju hematopoetskoj lozi ćelija (nema ekspresije CD34, CD14 i CD45). Istraţivanja sprovedena poslednjih godina ukazuju da ekspresija CD146 molekula na MMĆ in vitro i na pericitima in vivo ukazuje da su periciti MMĆ. Mnoge studije su pokazale da periciti imaju sve karakteristike MMĆ (Baksh i sar., 2007; Sacchetti i sar., 2007; Covas i sar., 2008) Aktivnost aldehid-dehidrogenaze kao potencijalni marker matiĉnosti:. Fenotipska karakterizacija ne ukazuje uvek na funkcionalne osobine ćelija, te je za baziĉna i primenjena istraţivanja vaţno utvrditi i metaboliĉke/funkcionalne osobine matiĉnih ćelija. Pretpostavlja se da matiĉne ćelije (MMĆ i MĆH) kao i tumorske ćelije 13 imaju visoku aktivnost podklase 1 aldehid-dehidrogenaze (ALDH) (izoformi ALDH1A1 i ALDH1A3), enzima koji je ukljuĉen u metabolizam retinoiĉne kiseline. Retinoiĉna kiselina je mali molekul, morfogen koji svoje delovanje ostvaruje posredstvom specifiĉnih receptora, aktivirajući transkripcione faktore koji regulišu brojne razvojne procese u organizmu (Dolle, 2009; Mark, 2009). TakoĊe se smatra da su ove izoforme vaţne u antioksidativnoj zaštiti ćelija (Marchitti sar., 2008). Kako su MMĆ vaţne za odrţanje homeostaze razliĉitih tkiva tokom ĉitavog ţivota jedinke, moţe se pretpostaviti da je sa evolutivnog stanovišta znaĉajno da matiĉne ćelije imaju aktivirane sve enzime koji uĉestvuju u antioksidativnoj zaštiti, ukljuĉujući i ALDH1. Tako je ALDH1 visoko eksprimirana u embrionalnim tkivima, kao i u adultnim matiĉnim ćelijama poreklom iz koštane srţi, mozga, mišića i brojnih drugih tkiva (Moreb i sar., 2012) 14 Tabela 2. Izoforme ALDH i njihova uloga u MĆ, normalnim i kancerskim (preuzeto uz modifikacije iz Muzio i sar., 2012) MĆ-matiĉne ćelije; MĆK-matiĉne ćelije kancera; LPO-lipidni peroksidi Familija Izoforme Lokalizacija Najznačajniji supstrat MĆ/MĆK uloga ALDH1 ALDH1A1 citoplazma Retinal, acetaldehid, LPO MĆ citoprotektivna uloga, modulacija diferencijacije i proliferacije ALDH1A2 citoplazma Retinal MĆ, MĆK citoprotektivna uloga, modulacija diferencijacije i proliferacije ALDH1A3 citoplazma Retinal MĆ, MĆK citoprotektivna uloga, modulacija diferencijacije i proliferacije ALDH1A7 citoplazma Retinal MĆ, MĆK citoprotektivna uloga, modulacija diferencijacije i proliferacije ALDH1B1 mitohondrije Acetaldehid, LPO MĆ, MĆK detoksikacija ALDH1L1 citoplazma 10- formiltetrahidrofolat ALDH1L2 citoplazma - ALDH2 ALDH2 citoplazma Acetaldehid MĆK detoksikacija ALDH3 ALDH3A1 citoplazma, nukleus Srednjelanĉani alifatiĉni aldehidi MĆ, MĆK proliferacija ALDH3A2 mikrozomi, peroksizomi Dugolanĉani alifatiĉni aldehidi ALDH3B1 mitohondrije LPO ALDH3B2 mitohondrije - ALDH4 ALDH4A1 mitohondrije Metabolizam prolina MĆK , p53-zavisna aktivacija ALDH5 ALDH5A1 mitohondrije Sukcinatni semialdehid MĆK , hemiorezistencija ALDH6 ALDH6A1 mitohondrije Metilmalonat semialdehid MĆK ALDH7 ALDH7A1 mitohondrije, citosol Betain aldehid, LPO MĆK ALDH8 ALDH8A1 citoplazma Retinal ALDH9 ALDH9A1 citoplazma Aminoaldehidi MĆK ALDH16 ALDH16A1 nepoznata - ALDH18 ALDH18A1 mitohondrije Glutamatski γ- semialdehid 15 2.2.2. Potencijal za diferencijaciju mezenhimalnih matiĉnih ćelija in vitro Najvaţnija funkcionalna karakteristika MMĆ in vitro, je njihova sposobnost diferencijacije u osteoblaste, hondrocite i adipocite. Naime, kada se in vitro ekspandirana, nediferencirana populacija MMĆ izloţi dejstvu odreĊenih biološki aktivnih jednjenja, u vremenskom periodu od dve do tri nedelje istovremeno dolazi do postepenog gubitka proliferativne aktivnosti i sticanja morfoloških i funkcionalnih karakteristika navedenih ćelijskih tipova. Nediferencirane, in vitro ekspandirane MMĆ, se diferenciraju u osteoblaste kada se tri nedelje inkubiraju u medijumu u koji je dodata askorbinska kiselina, - glicerofosfat i deksametazon (Chamberlain i sar., 2007). Gen koji se smatra glavnim regulatorom osteogeneze je RUNX2 (eng. Runt-related transcription factor 2). Stimulacija njegove ekspresije pokreće ekspresiju ostalih gena koji omogućavaju definitivnu osteogenu diferencijaciju (Ducy i sar., 1997). Osteogeneza in vitro se odvija u tri faze koje se donekle preklapaju: proliferacija, sinteza i sekrecija matriksa, sazrevanje ili mineralizacija matriksa. Prva faza podrazumeva proliferaciju ćelija i inicijalno formiranje matriksa. Drugu fazu karakteriše ekspresija ranih osteogenih markera kao što su alkalna fosfataza, osteonektin i osteopontin. Finalno se odigrava sazrevanje matriksa u smislu ekspresije osteokalcina i koštanog sijaloproteina koji zajedno sa prethodno izraţenom aktivnošću alkalne fosfataze omogućavaju mineralizaciju deponovanog ECM (Dragoo i sar., 2003). BMP2 (eng. Bone Morphogenetic Protein 2) je vaţan osteogeni signalni molekul koji posredstvom acetilovanja RUNX2 potencira njegovu sposobnost transaktivacije ĉime se stimuliše BMP2 zavisna diferencijacija osteoblasta (Jeon i sar., 2006). Wnt (eng. Wingless-type MMTV integration site family member) signalni molekuli imaju vaţnu modulatornu ulogu u procesu osteogene diferencijacije. Uticaj Wnt-liganada na procese osteogeneze zavisi od njihove koncentracije. Visoke doze endogenih Wnt-liganada promovišu osteogenu diferencijaciju, dok niske doze deluju inhibitorno na diferencijaciju (Gaspar i sar., 2004). Na stimulaciju osteogene diferencijacije pozitivno utiĉu i ĉlanovi TGF superfamilije. Naime, TGF-β (eng. Transforming Growth Factor-β) i BMP-ligandi deluju sinergistiĉki u pogledu transaktivacije gena koji potenciraju diferencijaciju MMĆ u osteoblaste (Kolf i sar., 2007) 16 Faktori koji in vitro stimulišu adipogenu diferencijaciju su deksametazon, insulin, izo-butil-metil-ksantin i indometacin. Uspešnu adipogenu diferencijaciju morfološki karakteriše nakupljanje masnih kapljica u ćelijama, dok se na molekularnom nivou javlja ekspresija gena koji kodiraju PPARγ2 (eng. Peroxisome Proliferator - Activated Receptor γ2), lipoprotein lipazu, i protein koji vezuje masne kiseline - aP2 (Pittenger i sar., 1999). Transkripcioni faktor PPARγ se smatra glavnim regulatorom adipogene diferencijacije. Pokazano je da bipotentni koregulator TAZ (eng. Transcriptional Coactivator with PDZ Binding Motif) funkcioniše kao koaktivator gena za RUNX2, odnosno korepresor gena za PPARγ, na taj naĉin favorizuje osteogenezu na raĉun adipogeneze. Osim toga, identifikovan je i set transkripcionih regulatora - TIP proteina (eng. Tension-Induced/-Inhibited Proteins) sa ulogom u miogenoj, odnosno, adipogenoj diferencijaciji. Pokazano je da mehanostimulacija MMĆ aktivira specifiĉne izoforme TIP proteina koji usmeravaju diferencijaciju MMĆ ka miogenezi (Kolf i sar., 2007). Sa aspekta adipogeneze, zanimljiv je TIP1 koji obezbeĊuje potencijalni mehanistiĉki osnov za citoplazmatsku indukciju adipogeneze posredstvom male GTP- aze RhoA (eng. Ras Homolog Gene Family, Member A). Naime, zaokrugljivanje ćelija je proces koji prethodi adipogenoj diferencijaciji MMĆ. TIP1 utiĉe na reorganizaciju citoskeleta u odsustvu mehanostimulacije, što dalje vodi do zaokrugljivanja ćelija, i indukcije RhoA signalizacije koja promoviše adipogenu diferencijaciju (McBeath i sar., 2004). Wnt-ligandi regulišu razliĉite razvojne procese, pa su izmeĊu ostalog ukljuĉeni i u regulaciju diferencijacije u smeru osteogeneze, odnosno adipogeneze. Grupa kanonskih Wnt signala (Wnt1, Wnt3a, Wnt5b, Wnt7a, Wnt10b, itd.) kao i druga grupa liganada koja je ukljuĉena u proces nekanonske signalizacije (Wnt11, Wnt4a i Wnt5a), uĉestvuje u formiranju kostiju tokom ontogeneze. Sa sigurnošću je pokazano da Wnt5a utiĉe na osteogenu diferencijaciju MMĆ, supresijom funkcije PPARγ (Takada i sar., 2012). Wnt10b takoĊe doprinosi inhibiciji adipogeneze. Preciznije, Wnt signali odrţavaju preadipocite u nediferenciranom stanju putem inhibicije adipogenih transkripcionih faktora C/EBPα i PPARγ. Zanimljivo je da inhibiranjem Wnt signala dolazi do transdiferencijacije mioblasta u adipocite, što doprinosi zakljuĉku da ovaj put ima vaţnu ulogu u determinaciji sudbine ćelija poreklom od mezoderma (Ross i sar., 17 2000). Iz navedenih primera je jasno da brojni faktori mikrosredine, u skladu sa potrebama organizma, utiĉu na pravac diferencijacije multipotentnih MMĆ in vivo. Kako bi se MMĆ uspešno diferencirale u pravcu hondrocita, potrebno je u kulturu zasejati ćelije u velikoj koncentraciji i to u prisustvu deksametazona, L-prolina i TGF-β1. Faktori rasta znaĉajni za hondrogenzu su i TGF-β1, TGF-β2 i TGF-β3, BMP- 2, BMP-4 i BMP-7, kao i insulinu sliĉan faktor rasta-1 (IGF-1). Najznaĉajniji transkripcioni faktor za odvijanje hondrogeneze je SOX9. Prilikom hondrogene diferencijacije, ukoliko je u pitanju hijalina hrskavica, izmeĊu ćelija se stvara ECM graĊen od kolagena tipa 2, sulfatisanih glikozaminoglikana i proteoglikana (Mackay i sar., 1998). FGF, Wnt i SHH (eng. Sonic Hedgehog) –su plejotropni medijatori proliferacije i diferencijacije MMĆ, koji su takoĊe ukljuĉeni u regulaciju hondrogeneze. Na mišjim C3H10T1/2 ćelijama je pokazano da Wnt3a pojaĉava hondrogenezu indukovanu sa BMP-2 (Fischer i sar., 2002), dok je na ATDC5-mišjoj hondrogenoj ćelijskoj liniji Wnt3a ligand delovao inhibitorno na hondrogenezu bilo putem negativne sekvestracije hondrostimulatora ili direktnom represijom ciljnih gena (Reinhold i sar., 2006). Brojne studije su potvrdile da se MMĆ u adekvatnim uslovima in vitro uspešno diferenciraju i u tenocite, glatkomišićne ćelije, neurone kao i ćelije visceralnog mezoderma (endotelne ćelije) (rev: Chamberlain i sar., 2007). Metabolizam nediferenciranih MMĆ i diferenciranih ćelija: Neke od promena koje se dešavaju tokom diferencijacije ukljuĉuju i promene vezane za metabolizam ćelija kao i promene na nivou sistema antioksidativne zaštite ćelija. Naime, analizom metaboliĉkih promena do kojih dolazi tokom diferencijacije MMĆ došlo se do nekoliko vaţnih zakljuĉaka. Metabolizam (sinteza ATP-a) nediferenciranih MMĆ se zasniva na glikolizi, na šta ukazuje viši nivo ekspresije gena koji su ukljuĉeni u glikolizu, kao i veća produkcija laktata (Chen i sar., 2008). U radu Pattappa i saradnika (2011) metabolizam MMĆ je oznaĉen kao „mešani“, u smislu da se za stvaranje ATP-a predominantno koristi glikoliza uz oko 30% energije koja proistiĉe iz oksidativne fosforilacije (šema 3). 18 Šema 3. Metaboliĉki fenotip matiĉnih ćelija, pretpostavljeni mehanizmi koji leţe u osnovi proliferacije, mirovanja i diferencijacije matiĉnih ćelija (preuzeto uz modifikacije iz Vacanti i Metallo, 2013). TCA-ciklus trikarbonskih kiselina; crvene strelice ukazuju na predominantni put biosinteze ATP-a, zelene strelice ukazuju na put koji je znaĉajno manje aktivan tokom biosinteze ATP-a Pretpostavlja se da matiĉne ćelije stvaraju najviše energije procesom glikolize kako bi izbegle formiranje slobodnih kiseonikovih radikala (eng. Reactive Oxygen Species - ROS) i nastanak oštećenja koja prate oksidativni stres. To je još od ranije poznato i pokazano za proliferišuće somatske ćelije (timociti) u kulturi (Brand i Hermfisse, 1997). Nedavno je pokazano da MĆ poreklom iz deĉije kostne srţi i krvi pupĉanika u skladu sa pojaĉanom ekspresijom gena ukljuĉenih u proces glikolize i samim intenziviranjem glikolize pokazuju i normoksiĉnu stabilizaciju HIF-1α (Palomaki i sar., 2013). HIF-1α je jedna od dve subjedinice hipoksija inducibilnog faktor-a 1 (HIF-1) koji je oznaĉen kao glavni regulator ćelijskog odgovora na hipoksiju (Semenza i Wang, 1992). HIF-1 transkripcioni faktor je heterodimer koga ĉine konstitutivno eksprimirana subjedinica HIF-1β i jedna od tri HIF-α izoforme, ĉija je stabilnost zavisna od unutarćelijske koncentracije kiseonika, ali i od nekih drugih faktora (Yee Koh i sar., 2008). U uslovima kada je koncentracija kiseonika u skladu sa potrebama ćelije dolazi do hidroksilacije HIF-1α subjedinice od strane specifiĉnih prolil-hidroksilaza (PHD) koje pripadaju familiji α-ketoglutarat i i Fe (II)-zavisnih 19 dioksigenaza (Ivan i Kaelin, 2001). HIF-1α hidroksilacija stimuliše vezivanje von Hippel Lindau (VHL) proteina koji formira multiproteinski kompleks koji funkcioniše kao ubikvitin-ligaza. Formirani kompleks ubikvitin-ligaza E3 vrši ubikvitinaciju HIF- 1α, nakon ĉega dolazi do njegove degradacije u proteozomu 26S (Ohh i sar., 2000). Brojni faktori rasta (bFGF, EGF, IGF) kao i citokini stimulišu aktivnost HIF-1 nezavisno od koncentracije kiseonika (Zhou i Brune, 2006). U odreĊenim okolnostima, povećanje sinteze HIF-1α je stimulisano aktivacijom signalne transdukcije preko fosfatidil-inozitol 3-kinaze (PI3K), protein-kinaze B (PKB/AKT) i sisarskog targeta za rapamicin mTOR, i u ovom sluĉaju nezavisno od koncentracije kiseonika (Zhou i Brune, 2006). Brojne in vitro studije su pokazale da je HIF-1 prevashodno ukljuĉen u regulaciju ekspresije glikolitiĉkih gena (Marín-Hernández i sar., 2009). HIF-1 stimuliše kako preuzimanje, tako i metabolizam glukoze kroz proces glikolize, putem stimulacije ekspresije transportera za glukozu i glikolitiĉkih enzima, na primeru kancerskih ćelijskih linija (Yee Koh i sar., 2008). Smatra se i da je ekspresija LDH-A gena pozitivno regulisana od strane HIF i Myc u ćelijama kancera (Fan i sar., 2011). Koncentracija laktata, odnosno aktivnost enzima laktat-dehidrogenaze (LDH) se ĉesto koristi kao marker intenziteta glikolize in vitro i in vivo. U hipoksiji, piruvat se redukuje u laktat uz pomoć laktat-dehidrogenaze (LDH5 izoforme), a NADH je donor H+ jona. LDH postoji u pet izoenzimskih oblika koji imaju razliĉite kombinacije H (heart) i M (muscle) subjedinica koje su kodirane razliĉitim genima. M subjedinica je kodirana LDHA genom, a H subjedinica je kodirana LDHB genom. LDH1 ima 4 H subjedinice i nalazi se u kardiomiocitima, dok LDH5 ima 4 M subjedinice i nalazi se u mišićima i jetri. LDH2 (3H i 1M subjedinica) je uglavnom koncentrisana u leukocitima, LDH3 (2H i 2M subjedinice) je najviša u plućima, dok je aktivnost izoenzimske varijante LDH4 (1H i 3M subjedinice) najizraţenija u bubregu, placenti i pankreasu. TakoĊe, izoforme LDH1 i LDH2 karakterišu dobro oksigenisana tkiva, dok su LDH3, LDH4 i LDH5 izoforme prisutne u uslovima slabije oksigenacije. Izoforma LDH5 katališe prevoĊenje piruvata u laktat, dok izoforma LDH1 katališe prevoĊenje laktata u piruvat. Izoenzimski oblici LDH se razlikuju na osnovu elektroforetske pokretljivosti, koja zavisi od kombinacije subjedinica koje ih ĉine. Pojaĉana ekspresija gena LDHA je ĉesto karakteristiĉna za intenzivno proliferišuće kancerske ćelije in vitro i predstavlja 20 marker skretanja biosinteze ATP-a iz procesa oksidativne fosforilacije ka glikolizi, iako je prisutna visoka koncentracija kiseonika (21%) (Fan i sar., 2011). U homogenatima tkiva poreklom iz zubne pulpe mleĉnih i stalnih zuba dominiraju izoforme LDH 3 i 4. Kombinovani metabolizam se u zubnoj pulpi objašnjava primitivnošću i niskom specijalizacijom ovog mezenhimalnog vezivnog tkiva (Linde i Ljunggren, 1970). Rezultati dobijeni merenjem aktivnosti enzima ukljuĉenih u proces antioksidativne zaštite pre i posle diferencijacije MMĆ, ukazuju na znaĉajno niţu aktivnost nekih enzima antioksidativne zaštite kod nediferenciranih ćelija (Chen i sar., 2008). Tokom osteogene diferencijacije dolazi do dramatiĉnog sniţenja ROS u ćelijama uprkos intenziviranoj oksidativnoj fosforilaciji i povećanom obimu biogeneze mitohondrija. Pretpostavlja se da do sniţenja ROS dolazi zahvaljujući pozitivnoj regulaciji nekih od enzima ukljuĉenih u proces antioksidativne zaštite (Chen i sar., 2008). Sliĉno kao tokom osteogeneze, i tokom adipogene diferencijacije dolazi do pojaĉane biogeneze mitohondrija i intenziviranja oksidativne fosforilacije. Jedan od uzroka pojaĉanog stvaranja ROS je aktivacija NADPH-oksidaze, izoforme 4 (NOX4) (Hofmann i sar., 2012). Velika gustina ćelija u kulturi, koja je neophodna da se postigne hondrogena diferencijacija, znaĉajno utiĉe na dostupnost kiseonika pojedinaĉnim ćelijama, te je oksidativna fosforilacija suprimirana tokom hondrogeneze in vitro (Pattappa i sar., 2011). Kako hrskavica nema krvne sudove, hondrociti, in vivo, dobijaju ATP putem razlaganja glukoze (Shikhman i sar., 2004). 2.3. Starenje mezenhimalnih matiĉnih ćelija u kulturi MMĆ, poput somatskih ćelija, imaju ograniĉen ţivotni vek. Nakon odreĊenog broja deoba MMĆ podleţu starenju koje odlikuju razliĉite morfološke i funkcionalne specifiĉnosti. Glavna karakteristika ćelijskog starenja u kulturi je usporavanje ćelijskih deoba i na kraju njihov prekid. Ovaj fenomen je poznat još od 1960. godine i nazvan je Hajflikov limit, po Leonardu Hayflick-u, nemaĉkom istraţivaĉu koji je zasluţan za njegovo definisanje (Hayflick, 1965). Preciznija definicija ćelijskog starenja podrazumeva ireverzibilno zaustavljanje ćelija u G1 fazi ćelijskog ciklusa, uz represiju gena ukljuĉenih u progresiju ćelijskog ciklusa i aktivaciju inhibitora ćelijskog ciklusa kao što su p53/p21 i Rb/p16 (Sethe i sar., 2006). MMĆ, tokom dugotrajne kultivacije in vitro, pokazuju ograniĉen replikativni i smanjen potencijal za diferencijaciju, kriva rasta 21 dobija oblik hiperbole, a same ćelije akumuliraju lizozomalni enzim SA-β-gal (eng. Senescence Assosiated β-galactosidase) (Heo i sar., 2009). TakoĊe je evidentna i promenjena struktura hromatina u vidu pojave heterohromatinskih fokusa SAHF (eng. Senescence-Associated Heterochromatic Foci) (Kuilman i sar., 2010). Ostarele MMĆ karakteriše i zaokrugljena i zaravnjena/ploĉasta morfologija, hipertrofija i granulirana citoplazma kao posledica akumulacije ćelijskog debrisa. Nakon dugotrajne in vitro propagacije evidentno je smanjena adherencija za plastiku, kao i pojava aktinskih stres vlakana u višku i povećan nivo autofluorescencije usled akumulacije lipofuscina (Ksiazek, 2009). Marker SA-β-gal se odnosi na aktivnost enzima β-galaktozidaza koja se detektuje na pH 6.0 u ćelijama u kulturi koje podleţu procesima starenja (Dimri i sar., 1995; Lee i sar., 2006). Aktivnost ovog enzima se detektuje i u organima i tkivima ostarelih jedinki, sugerišući da se stare ćelije sa godinama akumuliraju u tkivima tokom starenja in vivo (Dimri i sar., 1995; Melk i sar., 2003). Postoje najmanje dve hipoteze koje objašnjavaju promene koje se dešavaju tokom starenja ćelija u kulturi i koje ne iskljuĉuju jedna drugu (Wagner i sar., 2008): 1. Starenje se odvija prema specifiĉnom, unapred definisanom programu, tokom koga dolazi do smanjenja ekspresije gena koji su ukljuĉeni u kontrolu ćelijskog ciklusa, DNK replikaciju i mitozu. Faktori koji u tome uĉestvuju još uvek nisu jasno definisani, ali je verovatno da promene na epigenetskom nivou mogu imati znaĉajnu ulogu (Noer i Boquest, 2007). Ukoliko se ima na umu da matiĉne ćelije imaju daleko veći proliferativni potencijal od zrelih ćelija pojedinih tkiva, ideja programiranog starenja bi mogla da se primeni na ovu populaciju ćelija. 2. Starenje se dešava pod dejstvom faktora mikrosredine što dovodi do akumulacije oštećenja svih ćelijskih struktura ukljuĉujući i DNK (Tower, 2012). Promene vezane za ovaj vid starenja se mogu primeniti i na ćelije u kulturi i na uslove in vivo prilikom razliĉitih patoloških stanja. Najverovatnije je, da su oba mehanizma ukljuĉena u ćelijsko starenje, s obzirom na to da je sasvim jasno da se radi o kompleksnom procesu sa gotovo potpuno nepoznatim redosledom molekularnih dogaĊaja (Wagner i sar., 2008). Skraćivanje telomera je jedan od najbolje okarakterisanih mehanizama ukljuĉenih u proces starenja (Harley i sar., 1990). Telomere predstavljaju 22 specijalizovane strukture koje sadrţe ponovljene DNK sekvence koje se nalaze na krajevima eukariotskih hromozoma. Telomere spreĉavaju potencijalne nekompletne replikacije, i samim tim odrţavaju stabilnost krajeva linearne DNK (Harley i sar., 1990). UtvrĊena je korelacija izmeĊu replikativnog kapaciteta i inicijalne duţine telomera humanih fibroblasta (Allsopp i sar., 1992). Za proces odrţavanja duţine telomera odgovoran je enzim telomeraza. Humane MMĆ nemaju dovoljnu aktivnost telomeraze kako bi mogle da prevaziĊu progresivno skraćivanje telomera, što rezultuje blokom u proliferaciji i starenjem tokom in vitro kultivacije. Vaţnost telomeraze u inhibiciji starenja potvrĊuje ĉinjenica da prekomerna ekspresija telomeraze spreĉava replikativno starenje i produţava ţivot humanih MMĆ u kulturi (Simonsen i sar., 2002). 2.4. Imunomodulatorna uloga mezenhimalnih matiĉnih ćelija Smatra se da se imunomodulatorna svojstva MMĆ zasnivaju na direktnom meĊućelijskom kontaktu i na sintezi i sekreciji solubilnih medijatora. MMĆ eksprimiraju MHC molekule I klase, ali ne eksprimiraju kostimulatorne molekule niti MHC molekule II klase. Upravo iz tog razloga alogena transplantacija MMĆ ne zahteva imunosupresivnu terapiju. Naime, po transplantaciji, odgovarajuće T ćelije primaoca, po kontaktu sa MMĆ, usled nedostatka kostimulatornih signala, ostaju anergiĉne (Javazon i sar., 2004). MMĆ deluju i imunosupresivno luĉeći citokine koji inhibiraju proliferaciju T i B limfocita (Jiang i sar., 2005; Corcione i sar., 2006; Kode i sar., 2009). Osim studija in vitro, ograniĉene in vivo studije ukazuju da MMĆ po transplantaciji takoĊe luĉe citokine koji deluju u pravcu rezolucije inflamacije i reparacije ili regeneracije tkiva (Yagi i sar., 2010). MMĆ utiĉu na imunski sistem i tako što usporavaju sazrevanje i inhibišu funkciju dendritiĉnih ćelija (Jiang i sar., 2005). Od antinflamatornih i imunosupresivnih solubilnih medijatora pokazano je da MMĆ luĉe TGF-β, PGE2, IL10, kao i da aktiviraju na makrofagima enzim indoleamin-dioksigenazu (IDO) koji je prvi enzim koji reguliše katabolizam triptofana. Aktivacija IDO smanjuje koliĉinu triptofana ĉime se ograniĉava proliferacija limfocita (Yagi i sar., 2010). MMĆ takoĊe stimulišu sintezu inducibilne NO sintaze kao i hem oksigenaze-1 (Abdi i sar., 2008) Navedeni mehanizmi verovatno nisu uzajamno iskljuĉivi i relativan doprinos svakog od njih tokom modulacije imunskog odgovora in vivo razliĉit je u razliĉitim eksperimentalnim modelima. Treba imati na umu da nedostatak standardizacije u 23 pogledu izolacije i gajenja MMĆ moţe dovesti do razliĉitih, ĉesto kontradiktornih, podataka koji sa sobom kao posledicu nose i neadekvatne interpretacije rezultata (Ryan i sar., 2005) Ipak, navedene specifiĉne karakteristike MMĆ predstavljaju osnov za njihovu primenu u terapiji bolesti kao što su autoimunska oboljenja ili reakcija kalema protiv domaćina (eng. graft versus host disease - GVHD). Razumevanje mehanizama ukljuĉenih u procese imunosupresije predstavlja kljuĉan element za bezopasnu i uspešnu primenu nediferenciranih MMĆ u terapiji pojedinih oboljenja. 2.5. Matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe Matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe se razlikuju od drugih mezenhimalnih matiĉnih ćelija jer vode poreklo od ektomezenhima, odnosno nastaju od populacije ćelija nervnog grebena koja tokom embriogeneze prolazi kroz fazu ektomezenhimalne transformacije. Ektomezenhimalne ćelije uĉestvuju u graĊi mnogih delova kraniofacijalne regije, što se odraţava na specifiĉnosti patogeneze razliĉitih patoloških stanja te regije, kao i mogućnosti njihove terapije (Akintoye i sar., 2006). Do sada su matiĉne ćelije u vezi sa razvojem zuba, a poreklom od ektomezenhima izolovane iz: 1. zubne pulpe stalnih zuba (Gronthos i sar., 2000); uobiĉajen naziv u literaturi je DPSC (eng. Dental Pulp Stem Cells), 2. zubne pulpe mleĉnih zuba posle enzimske digestije pulpe (Miura i sar., 2003); uobiĉajen naziv u literaturi je SHED (eng. Stem Cells From Human Exfoliated Deciduous Teeth) 3. zubne pulpe mleĉnih zuba metodom tkivnog eksplanta (Kerkis i sar., 2006); uobiĉajen naziv u literaturi je IDPSC (eng. Immature Dental Pulp Stem Cells), 4. periodontalnog ligamenta (Seo i sar., 2004); uobiĉajen naziv u literaturi je PDLSCs (eng. Periodontal Ligament Stem Cells), 5. zubnog folikula (Morsczeck i sar., 2005); uobiĉajen naziv u literaturi je DFC (eng. Dental Follicle Cells), 24 6. apikalne papile zuba (Sonoyama i sar., 2008); uobiĉajen naziv u literaturi je SCAP (eng. Stem Cells from Apical Papilla). Slika 1. Populacije matiĉnih ćelija zuba u zavisnosti od stadijuma razvića zuba (preuzeto uz modifikacije iz Karamzadeh i Eslaminejad, 2013) DFC-dentalne folikularne ćelije; SHED, IDPSC-matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe mleĉnih zuba; DPSC- matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe stalnih zuba; PDLSC- matiĉne ćelije poreklom iz periodontalnog ligamenta; SCAP- matiĉne ćelije poreklom iz apikalne papile. Za razliku od prethodno navednih populacija, matiĉne ćelije zubnog epitela potiĉu od ektoderma. Kod glodara, ove ćelije su aktivne tokom ĉitavog ţivota i obezbeĊuju kontinuiran rast sekutića (Harada i sar., 1999). Terapijski potencijal svih navedenih matiĉnih ćelija zuba leţi, pre svega, u njihovoj sposobnosti da formiraju dentin, tkiva periodoncijuma i alveolarnu kost (Morsczeck i sar., 2008). 2.5.1. Formiranje zubne pulpe tokom embriogeneze kod ljudi Tokom ĉetvrte nedelje embriogeneze, ektodermalne ćelije poreklom od nervnog grebena migriraju ka primitivnoj usnoj duplji. Tokom šeste nedelje embriogeneze, nakon migracije ćelija poreklom od nervnog grebena u mezenhim glave i vrata, ektoderm koji se nalazi preko stomodeuma poĉinje da proliferiše formirajući primarne epitelne trake (lamina dentalis). Od njih će nastati gleĊni organi mleĉnih, a znaĉajno kasnije (od 20-e nedelje gestacije do 10-og meseca ţivota) i stalnih zuba. Kao rezultat kontakta ćelija lamina-e dentalis i ektomezenhima (mezenhim koji vodi poreklo od 25 ćelija nervnog grebena), dolazi do proliferacije i kondenzacije ćelija ektomezenhima. Ove ćelije potom formiraju zubnu papilu od koje tokom daljeg razvoja nastaje zubna pulpa i zubna kesica. Zubna kesica se kasnije transformiše u folikul zuba. Tokom nekoliko faza razvoja zuba, koje se definišu kao faza pupoljka, faza kape, faza zvona i faza razvoja krunice i korena zuba, formira se histološki prepoznatljiva struktura mleĉnih i stalnih zuba. Zubnu pulpu ĉini rastresito vezivno tkivo krunice i korena zuba, smešteno u zubnoj duplji oiviĉenoj dentinom. Posmatrajući od sloja dentina ka središtu duplje, pulpu krunice zuba ĉine ĉetiri zone: 1. zona odontoblasta; 2. zona siromašna ćelijama (Vejlova bezćelijska zona) koja je graĊena od kapilara, nervnih vlakana i ECM; 3. zona bogata ćelijama (Heklova multicelularna zona) i 4. centralna zona kroz koju se prostire centralni neurovaskularni snop (slika 2). Slika 2. Histološka graĊa pulpe krunice zuba. (Preuzeto iz Laĉković i sar., 2012) Zonu bogatu ćelijama ĉine fibroblasti, odontoblasti, makrofagi, granulociti, limfociti, plazmociti, dendritiĉne ćelije, antigen-prezentujuće ćelije, mastociti kao i nediferencirane mezenhimalne ćelije. Ta zona je takoĊe bogato vaskularozovana. U ekstraćelijskom matriksu dominiraju kolagen tipa I i III, proteoglikani i glikozaminoglikani. Iako je postojanje matiĉnih ćelija u zubnoj pulpi pokazano pre 13 godina (Gronthos i sar., 2000), njihova lokalizacija je još uvek predmet polemika. zona odontoblasta zona siromašna ćelijama zona bogata ćelijama centralna zona 26 Pojedini autori navode da su matiĉne ćelije smeštene uz krvne sudove i da imaju karakteristike pericita, jer eksprimiraju Stro-1 i CD146 (Shi i Gronthos, 2003; Miura i sar., 2003). Znaĉajno je naglasiti da se smatra da su i periciti u zubnoj pulpi ektomezenhimalnog porekla (Shi i Gronthos, 2003). Drugi autori smatraju da se matiĉne ćelije nalaze u zoni bogatoj ćelijama, kao i zoni koja sadrţi odontoblaste (Jo i sar., 2007). Moguće je pretpostaviti da su matiĉne ćelije zubne pulpe smeštene u razliĉitim zonama i da pulpa sadrţi razliĉite subpopulacije matiĉnih ćelija, jer je pokazano da postoje fenotipske razlike izmeĊu pojedinih CFU-F izolovanih iz jedne pulpe (Gronthos i sar., 2000, Lizier i sar., 2012). Relativno skoro je nedvosmisleno pokazano, posebnim naĉinom izolacije i kultivacije, prisusutvo malog broja epitelnih matiĉnih ćelija u zubnoj pulpi (Nam i Lee, 2009). 2.5.2. Karakteristike DPSC, SHED i IDPSC in vitro Matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe su po prvi put izolovane iz pulpe stalnih zuba (DPSC) i to posle ekstrakcije umnjaka mlaĊim osobama iz ortodontskih razloga (Gronthos i sar., 2000). DPSC imaju karakteristike sliĉne MMĆ izolovanim iz koštane srţi, mada je koncentracija CFU-F posle izolacije ćelija zubne pulpe veća nego posle izolacije ćelija iz koštane srţi, proliferativni potencijal veći, a vreme udvajanja ćelijske populacije u kulturi kraće (Gronthos i sar., 2000). TakoĊe je pokazano da DPSC, in vitro, imaju kapacitet za osteogenu/odontogenu diferencijaciju (Gronthos i sar., 2000). Metodom enzimske digestije iz zubne pulpe mleĉnih zuba izolovane su SHED (Miura i sar., 2003), a metodom tkivnog eksplanta izolovane su IDPSC (Kerkis i sar., 2006). Iako su poĉetna ispitivanja ukazivala da se radi o razliĉitim ćelijskim populacijama, danas je jasno da su njihove in vitro karakteristike veoma sliĉne i da se najverovatnije radi o istoj populaciji ćelija ĉije se karakteristike donekle razlikuju zbog razliĉitih uslova kultivacije (Kerkis i Caplan, 2012). Sve populacije matiĉnih ćelija izolovane iz mleĉnih zuba imaju veći proliferativni potencijal i veću plastiĉnost u odnosu na DPSC, a odlikuje ih ekspresija markera embrionalnih matiĉnih ćelija: Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 i TRA-1-81 (Kerkis i sar., 2006, Huang i sar., 2008). SHED su se uspešno diferencirale u odontoblaste, osteoblaste, adipocite, nervne ćelije (Miura i sar., 2003, Nourbakhsh i sar., 2011) i hondrocite (Koyama i sar., 2009). Uz dodatak VEGF (eng. vascular endothelial growth factor), SHED su se diferencirale 27 u ćelije koje eksprimiraju VEGFR2 (eng. vascular endothelial growth factor receptor 2) i CD31, odnosno ćelije koje morfološki i fenotipski odgovaraju endotelnim ćelijama (Bento i sar., 2013). Nakon kultivacije u specifiĉno definisanom medijumu SHED su se uspešno diferencirale u ćelije koje imaju karakteristike hepatocita (Ishkitiev i sar., 2012). IDPSC su se diferencirale u odontoblaste, osteoblaste, adipocite, nervne ćelije i ćelije glatkih i skeletnih mišića (Kerkis i sar., 2006). Posle navedenih obimnih istraţivanja, zakljuĉeno je da se ćelije koje pripadaju SHED i IDPSC populaciji mogu obuhvatiti terminom DTSC (eng. dental tissue derived stem cells) (Kerkis i Caplan, 2012). Fenotipske karakteristike DPSC, SHED i IDPSC u odnosu na matiĉne ćelije poreklom iz koštane srţi su date u tabeli 3. Tabela 3. Fenotipske karakteristike MMĆ poreklom iz pulpe zuba i koštane srţi. Antigen DPSC IDPSC SHED BMSC CD14 - - - - CD29 ++ ++ na/++ ++ CD34 - - - - CD44 ++ ++ ++ ++ CD45 - - - - CD73 ++ ++ ++ ++ CD105 ++ ++ ++/+/- ++ CD106 + - +/- ++ CD146 ++/+/- + ++/+/- ++/+/- 3G5 +/- / +/- +/- Stro-1 ++/+/- + ++/+/- ++/+/- A-SMA ++/- / ++/- ++/+/- Kolagen tip 1 ++ ++ ++ ++ Kolagen tip 3 ++/+ / ++/+/- ++/+ Alkalna fosfataza ++/+/- ++ ++/+/- ++/+/- Osteonektin ++/+ + ++/+ ++/+ Osteopontin +/- / +/- +/- 28 2.5.3. Potencijal za diferencijaciju DPSC, SHED i IDPSC posle transplantacije Najveći broj in vivo ispitivanja matiĉnih ćelija zubne pulpe usmeren je na mogućnosti primene njihovog potencijala za diferencijaciju u cilju formiranja same pulpe, odnosno dentina, u formiranju koštanog i nervnog tkiva. Subkutana transplantacija pet miliona nediferenciranih humanih DPSC pomešanih sa hidroksiapatit/trikalcijum-fosfatom (HA/TCP) imunokompromitovanim miševima (beige mice), posle šest nedelja, dovela je do fomiranja vaskularizovane strukture sliĉne pulpi zuba, sa zonom odontoblasta koji imaju citoplazmatske procesuse projektovane u dobro organizovane tubule dentina (Gronthos i sar., 2000). Kontrolne ţivotinje kojima su u istim uslovima transplantirane MMĆ izolovane iz koštane srţi su na mestu aplikacije formirale koštano tkivo (Gronthos i sar., 2000). Posle ovog poĉetnog rada Gronthosa i saradnika (2000), ova grupa autora, kao i nekoliko drugih grupa objavila je više radova koji se odnose na potencijal za diferencijaciju nakon transplantacije ćelija poreklom iz zubne pulpe. Tako je odgovarajućem soju miševa, pod kapsulu bubrega, transplantirana pulpa GFP (eng. green fluorescent protein) miševa koja je sadrţala sve delove pulpe osim samih odontoblasta. Nakon 14 dana ćelije pulpe su se diferencirale u odontoblaste koji sekretuju reparativni dentin i osteocite koji formiraju atubularni mineralizovani matriks nalik onom u kostima (Braut i sar., 2003). Sliĉno DPSC, nakon subkutane transplantacije imunokompromitovanim miševima, SHED su pokazale sposobnost diferencijacije u odontoblaste, ali nisu stvarale kompleks dentin - pulpa poput DPSC. Pokazale su i sposobnost osteoindukcije, ali ne i diferencijacije u osteoblaste (Miura i sar., 2003). Dalji eksperimenti, koji su ukljuĉivali implantaciju kombinacije biodegradabilnih nosaĉa u kombinaciji sa SHED, potkoţno, imunokompromitovanim miševima, pokazali su da dolazi do formiranja kompleksnog tkiva koje se karakterisalo postojanjem mineralizovanog matriksa i tubula oiviĉenih odontoblastima, kao i nastankom vezivnog tkiva sa krvnim sudovima. Nakon ultrastrukturnih analiza i tipizacije markera došlo se do zakljuĉka da su se SHED diferencirale u odontoblaste i endotelne ćelije (Cordeiro i sar., 2008; Sakai i sar., 2010). Drugi vaţan pravac istraţivanja je potencijal matiĉnih ćelija zubne pulpe da se in vivo, uz odgovarajuće nosaĉe diferenciraju u osteoblaste. Naime, neki radovi ukazuju da je za rekonstrukciju kostiju lica i glave bolje koristiti nosaĉe sa ćelijama koje su istog 29 embrionalnog porekla kao i tkivo koje se rekonstruiše (Akintoye i sar., 2006). Tako, SHED predstavljaju odliĉan izvor ćelija za korekciju velikih kraniofacijalnih defekata kod miša (Seo i sar., 2008), pacova (de Mendonça Costa i sar., 2008) i svinje (Zheng i sar., 2009). Naime, 6 meseci nakon transplantacije SHED u defekte kalvarije imunokompromitovanih miševa, došlo je do potpune reparacije kosti. SHED su osim osteoinduktivnog delovanja, kako je pokazano od strane Miure i saradnika (2003), aktivno doprinosile formiranju kosti (Seo i sar., 2008). Jedan od pravaca istraţivanja je mogućnost in vivo diferencijacije IDPSC u neurone i glija ćelije. Transplantacija nediferenciranih IDPSC, u kiĉmenu moţdinu miša, na mesto ozlede, nakon sedam i 28 dana dovodi do poboljšanja lokomotornih sposobnosti ţivotinja. Histološkim analizama je utvrĊeno da je kod transplantiranih ţivotinja nivo ekspresije trofiĉkih faktora u tkivu bio veći, dok je defekt bele mase bio manji uz prisustvo brojnih mijelinizovanih aksona i pojavu zdravih intaktnih neurona sa novoformiranim sinapsama (de Almeida i sar., 2011). Tri meseca nakon intraperitonealne aplikacije ekspandiranih IDPSC imunokompromitovanim miševima, poliklonskim antitelima (na IDPSC) je njihovo prisustvo pokazano u jetri, slezini, mozgu, bubrezima i drugim tkivima (Kerkis i sar., 2006). Ova konstatacija navodi na zakljuĉak da su se IDPSC po transplantaciji uspešno ugradile u odgovarajuće niše, u kojima su moţda proliferisale i diferencirale se, stvarajući ćelije sposobne za odrţavanje homeostaze navedenih organa. 2.5.4. Regulacija proliferacije i diferencijacije matiĉnih ćelija poreklom iz zubne pulpe Nekoliko faktora rasta je vaţno za potpuno ispoljavanje potencijala za proliferaciju i diferencijaciju DTSC. Samoobnova: Jedan od najvaţnijih fakora je bFGF (eng. Basic Fibroblast Growth Factor) koji stimuliše proliferaciju i samoobnovu DTSC (Morito i sar., 2009). U kulturama DPSC, bFGF je stimulisao formiranje CFU-F, kao i ekspresiju embrionalnih markera: Oct4, Rex-1 i Nanog. Tokom kultivacije u medijumu za osteogenu diferencijaciju, stimulacija bFGF-om je dovela do sniţavanja aktivnosti alkalne fosfataze, odnosno inhibicije mineralizacije (Osathanon i sar., 2011). Pokazano je da bFGF inhibira osteogenu diferencijaciju DTSC aktivirajući ERK1/2 put, odnosno 30 inhibirajući /utišavajući kanonski Wnt/β-catenin put (Li i sar., 2012). Kanonski Wnt1 protein inhibira odontogenu diferencijaciju DPSC, omogućavajući oĉuvanje matiĉnih ćelija u nediferenciranom stanju (Scheller i sar., 2008). Ovakvi rezultati delom koreliraju sa zakljuĉkom da signalizacija putem kanonskih Wnt proteina promoviše proliferaciju i samoobnovu MMĆ, nasuprot nekanonskoj Wnt signalizaciji koja stimuliše osteogenu diferencijaciju (Boland i sar., 2004). TakoĊe, niske doze kanonskih Wnt proteina stimulišu proliferaciju MMĆ, dok su efekti visokih doza potpuno suprotni (de Boer i sar., 2004). Za samoobnovu DTSC je vaţna i Notch signalizacija (Zhang i sar., 2008). Naime, pokazano je da Notch-ligand, Jagged-1, negativno reguliše diferencijaciju DPSC u odontoblaste in vitro (Zhang i sar., 2008). Delta-1 je Notch- ligand koji stimuliše proliferaciju DPSC (povećava procenat BrdU-pozitivnih ćelija, kao i procenat ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa) (He i sar., 2009). Inhibicija ekspresije Delta- 1 liganda, dovela je do znaĉajnog smanjenja proliferacije tokom ekspanzije DPSC, odnosno stimulacije odontogeneze tokom gajenja u medijumu za odontogenu diferencijaciju (Wang i sar., 2011). Novija istraţivanja ukazuju da su niske koncentracije O2 u kulturi jedan od kljuĉnih faktora koji utiĉe na odrţavanje nediferenciranog stanja i plastiĉnost MMĆ (Sakdee i sar., 2009, Iida i sar., 2010, Basciano i sar., 2011). Sa druge strane, brojni ĉlanovi familije TGF-β, sinergistiĉki sa drugim autokrinim i parakrinim faktorima rasta stimulišu diferencijaciju DTSC ka odontoblastima i to putem aktivacije ALK/Smad2/3 (Tai i sar., 2008, He i sar., 2008). U tom smislu, tokom diferencijacije DTSC, TGF-β1 povećava aktivnost alkalne fosfataze, ekspresiju sialoproteina dentina (DSP), osteopontina (OPN) i kolagena tip I, utiĉući na adekvatnu mineralizaciju ECM (Li i sar., 2011). Osim toga, nakon oštećenja dentina i zubne pulpe, odontoblasti, pod dejstvom TGF-β1 i 3 pojaĉano stvaraju pojedine komponente ECM. TakoĊe, TGF-β1 i 3 deluju mitogeno na ćelije pulpe, dok TGF-β3 deluje induktivno na diferencijaciju ćelija pulpe u pravcu odontoblasta (Sloan i sar., 1999). Pokazano je i da humane DTSC in vitro sintetišu nekoliko neurotrofiĉkih faktora kao što su NGF, BDNF, GDNF, NT-3 i NT-4/5 ĉime bi se delimiĉno mogao objasniti njihov potencijal za diferencijaciju u ćelije nervnog tkiva (Almeida i sar., 2011). 31 2.5.5. Pretkliniĉke i kliniĉke studije Preduslov za bioinţinjering zuba je identifikacija odgovarajuće ćelijske populacije, kreiranje biodegradabilnih nosaĉa i identifikacija specifiĉnih signala koji doprinose indukciji ćelija koja vodi regeneraciji izgubljenih tkiva (Telles i sar., 2011). Zub kreiran bioinţinjeringom bi trebalo da ima sve karakteristike pravog zuba i koren koji bi putem periodontalnog ligamenta bio vezan za alveolarnu kost što bi spreĉilo preranu resorpcju alveolarne kosti i obezbedilo adekvatno uzglobljavanje zuba. Za sada se ispitivanja koja imaju za cilj regeneraciju dela zuba ili celog zuba sprovode na modelu miša (Yamamoto i sar., 2003; Oshima i sar., 2011) i na modelu pacova (Duailibi i sar., 2004). Na modelu miša je pokazano da kada se epitelne i mezenhimalne ćelije izolovane iz zametka zuba u fazi zvona (embrion miša star 14,5 dana) ekspandiraju in vitro i potom sjedine u odgovarajućim kalupima, tokom narednih 60 dana, transplantirane pod kapsulu bubrega, mogu da formiraju kompletan zub (Oshima i sar., 2011). TakoĊe, tako formiran zub je uspešno transplantiran u alveolarnu kost miša (Oshima i sar., 2011). Korak dalje je napravljen u studiji u kojoj je pokazano da se kompletan zub moţe formirati i kada se zajedno kultivišu ekspandirane epitelne ćelije gingive ljudi i mezenhimalne ćelije zametka zuba miša (Angelova Volponi i sar., 2013). Na taj naĉin je bioiniţinjering zuba pribliţen mogućnostima rutinske kliniĉke primene, jer najmanje jedna populacija ćelija koja je korišćena za formiranje „biozuba“ nije bila embrionalnog porekla. Kliniĉka studija: U februaru 2013. godine u Kini je prijavljena kliniĉka studija pod nazivom „Revitalizacija nezrelih stalnih zuba sa nekrotiĉnom pulpom uz pomoć SHED peleta“. Planirano je da u studiju budu ukljuĉena deca od 7 do 12 godina koja još uvek imaju mleĉne zube ĉija pulpa bi se mogla iskoristiti kao izvor SHED, a istovremeno imaju stalne zube koji nemaju u potpunosti formiran koren zuba, a imaju nekrozu pulpe zuba. Posle primene SHED peleta, uz pomoć kompjuterizovane tomografije bi se pratila eventualna revaskularizacija pulpe i brzina rasta korena zuba (www.clinicaltrials.gov). Pretpostavka je da će se u bliskoj budućnosti pojaviti veći broj kliniĉkih studija koje će imati za cilj stvaranje „biozuba“ kod ljudi. 32 2.6. Oksidativni stres i antioksidativna zaštita 2.6.1. Oksidativni stres Terapijski potencijal MMĆ izolovanih iz postnatalnih tkiva (bez obzira na tkivo iz kog su izolovane) je ograniĉen njihovim malim brojem i ĉinjenicom da tokom ex vivo ekspanzije dolazi do promena koje mogu negativno uticati na njihov potencijal za diferencijaciju, a posle primene in vivo, regeneraciju tkiva. U te promene se ubraja gubitak multipotentnih (primitivnih) klonova ćelija i starenje ćelija. Poznato je da DTSC imaju znaĉajno veći proliferativni potencijal i kraće vreme udvajanja u kulturi u odnosu na MMĆ poreklom iz koštane srţi (Huang i sar., 2009), ali, kao i ostale MMĆ imaju ograniĉen replikativni potencijal tokom dugotrajne kultivacije in vitro. Kultivacija ćelija se najĉešće izvodi u atmosferi koja sadrţi fiziološku koncentraciju CO2 (5%) i izuzetno visoku koncentraciju kiseonika koja ne postoji u tkivima, već odgovara atmosferskim uslovima (20%). Pretpostavlja se da fiziološki relevantna mikrosredina MMĆ ima procenat kiseonika izmeĊu 2% i 7%. To znaĉi da 20% O2 ĉini mikrosredinu prezasićenu kiseonikom. Kiseonik kao dvoatomski molekul nije previše reaktivan, ali je supstrat za stvaranje slobodnih kiseonikovih radikala (ROS) koji mogu biti izvor oštećenja razliĉitih ćelijskih struktura. U ROS spadaju reaktivni molekuli (vodonik- peroksid) i slobodni radikali sa jednim ili više nesparenih elektrona u poslednjoj orbitali (npr. superoksid-anjon-radikal, hidroksil-radikal, peroksil-radikal). Tri glavna mesta stvaranja ROS unutar ćelija su transportni lanac elektrona na nivou mitohondrija, multienzimski sistem NADPH-oksidaze vezan za membrane ćelija, kao i endoplazmatski retikulum. Veća koncentracija O2 u medijumu u kome se gaje ćelije, odraţava se i na koncentraciju O2 u mitohondrijama u kojima se višak kiseonika redukuje u superoksid- anjon-radikal (O2 .- ). U zavisnosti od tipa slobodnih kiseonikovih radikala koji se stvaraju, u ćeliji nastaju razliĉite promene koje ukljuĉuju oštećenja na nivou DNK u vidu dvostrukih DNK prekida, i/ili oštećenja na proteinskim, lipidnim i ugljeno-hidratnim komponentama u ćelijama (Ksiazek, 2009). Oksidativno oštećenje proteinskih molekula koje izazivaju slobodni radikali podrazumeva seriju promena meĊu kojima vaţno mesto ima razvoj „karbonilnog stresa". Oksidativnim razlaganjem proteina obrazuju se peptidi ĉije su N-terminalne amino-kiseline blokirane α-ketoacilnim proizvodima. U sastavu proteina se, izmeĊu 33 ostalih aminokiselina, nalaze lizin, arginin, prolin i treonin, ĉijom oksidacijom mogu nastati karbonilni derivati (Baynes, 1991; Levine i sar., 1994). Pored toga karbonilne grupe mogu da nastanu reakcijom sa aldehidima (malondialdehid), koji nastaju tokom lipidne peroksidacije ili sa reaktivnim karbonilnim derivatima kao što su ketoamini i ketoaldehidi (jedinjenja se stvaraju u reakciji redukujućih šećera kao što je glukoza) ili njihovih oksidacionih proizvoda sa lizinskim ostacima u proteinima. IzmeĊu redukujućih šećera i proteina dolazi do reakcija glikozilovanja i oksidacije (Baynes, 1991). Iz tog razloga se prisustvo karbonilnih grupa u proteinima koristi kao marker proteinskog oštećenja uzrokovanog ROS. Ovi proizvodi imaju kao posledicu promenu konformacije proteina, što se neminovno odraţava i na njihove funkcije. UtvrĊeno je da je oksidacija proteina, koju izmeĊu ostalog, procenjujemo na osnovu prisustva karbonilnih grupa, povezana sa starenjem i brojnim bolestima meĊu kojima se ĉesto spominje i kancer (Imbesi i sar., 2013). Lipidi su estri masnih kiselina i alkohola - glicerola i sfingozina, kao i estri masnih kiselina i holesterola. Masne kiseline (MK) su karboksilne kiseline koje imaju dug, ugljovodoniĉni lanac. Lipidi predstavljaju izvor energije, strukturni su, ali i funkcionalni elementi ćelijskih membrana i imaju vaţu ulogu u procesima ćelijske signalizacije. Fosfolipidi su glavna komponenta ćelijskih membrana, a duţina ugljovodoniĉnih lanaca MK koje ulaze u njihov sastav, kao i stepen nezasićenosti, znaĉajno utiĉu na fluidnost i funkcionalnost samih membrana. U zavisnosti od prisustva dvogubih veza, MK se dele na zasićene (SFA) i nezasićene. Nezasićene MK se u zavisnosti od broja dvogubih veza dele na mononezasićene (MUFA) i polinezasićene (PUFA) MK. Poznato je da su PUFA, za razliku od SFA i MUFA, izuzetno osetljive na oksidaciju, kao i da stepen oksidacije zavisi od broja dvogubih veza u lancu viših masnih kiselina (Cosgrove i sar, 1987). Tokom oksidativnog stresa, procesom interakcije ROS sa lipidima dolazi do lipidne peroksidacije-LPO (Marnett, 2000), odnosno formiranja lipidnih peroksil- radikala i lipidnih hidroperoksida. Reakcija lipidne peroksidacije je lanĉana reakcija koja poĉinje formiranjem alkil, peroksil i alkoksil radikala PUFA tokom koje kao krajnji (sekundarni) proizvodi nastaju dugoţiveći aldehidi kao što su 4-hidroksi nonenal – HNE i malondialdehid - MDA (Marnett, 1999). 4-HNE je potentan alkilujući agens koji reaguje sa DNK i proteinima formirajući adukte (Kong i Kotraiah, 2012). MDA 34 moţe da reaguje sa slobodnim amino-grupama proteina, dovodeći do nastanka oštećenja na proteinima. Pokazano je da i MDA formira DNK adukte, ispoljavajući tako mutageni efekat na nivou bakterija i sisarskih ćelija (Marnett, 1999). Pretpostavlja se da je lipidna peroksidacija (LPO) jedan od glavnih uzroka nastanka DNK oštećenja koja znaĉajno doprinose pojavi kancera i drugih humanih oboljenja (Marnett i sar., 2002). S obzirom na to da su lipidi glavne komponente ćelijskih membrana, lipidna peroksidacija dovodi do znaĉajnih promena na nivou bioloških membrana. LPO indukuje promene u pogledu fluidnosti i funkcionisanja ćelijskih membrana, inaktivaciju proteina i enzima koji su vezani za ćelijsku membranu kao i pojaĉanu nespecifiĉnu propustljivost membrane za jone kao što je jon kalcijuma (Halliwell i Chirico, 1993). Stepen lipidne peroksidacije se moţe odreĊivati na osnovu masno-kiselinskog profila putem gubitka nezasićenih masnih kiselina, putem detekcije primarnih (hidroperoksidi) ili sekundarnih proizvoda lipidne peroksidacije (MDA i 4- HNE) (Halliwell i Chirico, 1993). Slobodni kiseonikovi radikali su za ćeliju vaţni i kao signalni molekuli ukljuĉeni u procese proliferacije, diferencijacije, regulacije energetskog metabolizma i odgovora ćelije na stres (Finkel, 2011). U sluĉaju matiĉnih ćelija je pokazano da ROS imaju vaţnu ulogu kako tokom procesa proliferacije tako i tokom diferencijacije (Carriere i sar., 2003). 35 2.6.2. Mehanizmi antioksidativne zaštite na nivou ćelije Fina ravnoteţa izmeĊu oksidanasa i antioksidanasa obezbeĊuje oĉuvanje strukture i funkcije ćelijskih makromolekula (DNK, proteina i lipida), i do izvesne mere štiti ćelije od daljih oštećenja. Sistem antioksidativne zaštite na nivou ćelije ĉine enzimske (superoksid-dismutaza, katalaza, glutation-peroksidaza, glutation-reduktaza) i neenzimske komponente (vitamini C i E, GSH (glutation), TRX (tioredoksin) i redoks senzitivni molekuli npr. APE1/Ref-1 – eng. apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox effector factor-1, NFE2L2 (Nrf2) – eng. nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2). Unutarćelijska koncentracija ROS zavisi od aktivnosti sistema antioksidativne zaštite. Ćelije imaju veliki broj antioksidanasa ĉiji je cilj prevencija nastanka i uklanjanje već nastalih oštećenja uzrokovanih ROS, ali i uĉestvovanje u procesu regulacije redoks senzitivnih signalnih puteva. Smatra se da su tri enzima veoma vaţna za sve ćelije koje ţive pod aerobnim uslovima: superoksid-dismutaza (SOD), katalaza i supstrat specifiĉna peroksidaza, odnosno glutation-peroksidaza (GPx). Superoksid- dismutaze (SOD) su široko rasprostranjeni ĉinioci sistema antioksidativne odbrane, koje su McCord i Fridovich definisali kao proteine koji katalizuju višak superoksid-anjon- radikala u vodonik-peroksid, te na taj naĉin štite redoks senzitivne ćelijske makromolekule od oštećenja (McCord i Fridovich, 1969). Do sada su na nivou sisarskih ćelija identifikovane tri izoforme ovog enzima: bakar,cink-superoksid-dismutaza (Cu,Zn-SOD), mangan-superoksid-dismutaza (Mn-SOD) i ekstracelularna superoksid- dismutaza (EcSOD) (Zelko i sar., 2002). MnSOD izoforma je jedina neophodna za opstanak aerobnih organizama, što je potvrĊeno korišćenjem Mn-SOD-knockout miševa, za koje je pokazano da uginu ubrzo nakon roĊenja sa izraţenim poremećajima na nivou nervnog sistema i srca (Lebovitz i sar., 1996, Zhang i sar., 1996). Zanimljivi su rezultati Shi i sardnika iz 2013. godine, koji su pokazali da dugoţiveće miševe (Peromyscus leucopus) u odnosu na obiĉne laboratorijske miševe (Mus musculus) odlikuje povećanje aktivnosti Cu,Zn-SOD i katalaze dok su mladi, kao i manje oksidativno oštećenje ćelijskih makromolekula u starosti. Katalaza i peroksidaza prevode nascentni vodonik-peroksid u vodu (u sluĉaju katalaze kiseonik i vodu). Krajnji rezultat delovanja svih pomenutih enzimskih komponenti sistema antioksidativne zaštite je uklanjanje dve vrste radikala i njihova 36 konverzija u vodu (slika 3) (Weydert i Cullen, 2010). Schriner i saradnici (2005) su pokazali da miševi sa povećanom ekspresijom katalaze imaju ţivotni vek duţi za 20%, kao i smanjeno oštećenje mitohondrija. Pokazano je da ekspresija katalaze koja sadrţi sekvencu koja omogućuje efikasniji import u peroksizome, na modelu ostarelih fibroblasta u kulturi, ponovno uspostavlja narušenu redoks ravnoteţu i obnavlja integritet mitohondrija u ćelijama uz znaĉajno smanjenje broja ostarelih ćelija u populaciji (Koepke i sar., 2007). SOD i katalaza ne zahtevaju kofaktore kako bi funkcionisale, dok GPx ne samo da zahteva kofaktore, već ima i 5 izoenzimskih formi. Glutation-reduktaza i glukozo-6- fosfat dehidrogenaza nemaju direktnu ulogu u uklanjanju ROS, ali su neophodne u cilju regeneracije kofaktora (GSH i NADPH) koji omogućuju funkcionisanje GPx (Liu i sar., 2004). Slika 3. Ilustracija odrţavanja redoks homeostaze u ćeliji (preuzeto iz Wang i sar., 2013) ETC (elektron transportni lanac), SOD1 (Cu,Zn-SOD), SOD2 (Mn-SOD), SOD3 (EcSOD), NOS (NO-sintaza), NOX (NADPH-oksidaza), ER (endoplazmatiĉni retikulum), Gpx (glutation-peroksidaza), GR (glutation-reduktaza), Prx (peroksiredoksin) Za enzime koji su ukljuĉeni u sistem antioksidativne zaštite je karakteristiĉna njihova lokalizacija u pojedinim ćelijskim odeljcima. Tako je katalaza uglavnom koncentrisana u peroksizomima, Mn-SOD se nalazi u mitohondrijama, Cu,Zn-SOD 37 (koja ĉini 90% SOD aktivnosti u eukariotskoj ćeliji) u citoplazmi i nukleusu, dok se ekstraćelijska SOD nalazi van ćelija u nekim tkivima. Izoforme GPx mogu da se naĊu u nekoliko subćelijskih odeljaka, na primer u mitohondrijama ili nukleusu. Na taj naĉin ovi enzimi regulišu redoks status u razliĉitim delovima ćelija (Weydert i Cullen, 2010; Liu i sar., 2004). Tokom in vitro kultivacije, disbalans izmeĊu oksidanasa i antioksidanasa u samim ćelijama moţe izazvati ireverzibilna oštećenja ĉija je posledica starenje, apoptoza pa ĉak i neoplastiĉna transformacija ćelija (Kirkwood i Austad, 2000). Dugotrajna in vitro kultivacija za posledicu ima promenjenu morfologiju mitohondrija, smanjen antioksidativni kapacitet koji prati povećanje koncentracije ROS i smanjenje koncentracije ATP-a. Disfunkcionalne mitohondrije na taj naĉin utiĉu na starenje matiĉnih ćelija in vitro, poreklom i od mladih i od starih donora (Geißler i sar., 2012). Rezultati dobijeni na MMĆ poreklom iz koštane srţi pacova su pokazali da tokom starenja, posredstvom Wnt/β-katenin signalnog puta, dolazi do indukcije stvaranja ROS, povećanja stepena lipidne peroksidacije i inhibicije aktivnosti SOD (Hao i sar., 2013, Zhang i sar., 2013). U skladu sa svim prethodno navedenim efektima su i uoĉene korelacije u pogledu povećane aktivnosti nekih od enzima koji su ukljuĉeni u sistem antioksidativne zaštite sa produţenjem ţivota jedinke (Sun i Tower, 1999; Schriner i sar., 2005). Zbog toga, istraţivanja koja se sprovode na matiĉnim ćelijama i razliĉitim ćelijskim linijama kao krajnji cilj imaju definisanje onih ex vivo uslova koji će uz minimalno oštećenje ćelija obezbediti brzo umnoţavanje i dobijanje velikog broja vijabilnih ćelija ĉiji potencijal za diferencijaciju neće biti ugroţen. Vaţno je naglasiti postojanje tendencija koje ukazuju na to da ćelije koje in vitro intenzivno proliferišu svoj metabolizam skreću sa procesa oksidativne fosforilacije u smeru glikolize (Warburg-ov efekat). Ovaj fenomen je izgleda primenljiv i na pluripotentne ćelije u kulturi koje odlikuje intenzivna proliferacija. Najnovija istraţivanja pokazuju da i ćelije koje se smatraju pluripotentnim (in vitro), odlikuje niska koncentracija slobodnih kiseonikovih radikala, kao i mali broj slabo razvijenih mitohondrija, što ukazuje na mogućnost da je sniţenje ROS posledica smanjene aktivnosti mitohondrija u nediferenciranim ćelijama (Vacanti i Metallo, 2013). Jedan od mogućih naĉina prevazilaţenja negativnih efekata ROS in vitro je kultivacija ćelija na niskim koncentracijama O2 ili primena razliĉitih antioksidanasa. N- 38 acetil-L-cistein (NAC) je antioksidant koji se već koristi kao terapijski molekul u medicini, ali se ĉesto primenjuje i u in vitro biološkim sistemima. 2.7. Dejstvo N-acetil-L-cistein-a NAC je acetilovana forma L-cisteina koja je ćelijama vaţna kao prekursor u sintezi glutationa (Kelly, 1998). NAC moţe da bude vaţan izvor sulfhidrilnih (-SH) grupa tokom kultivacije ćelija, ali je vaţan i kao acetilovani prekursor redukovanog glutationa i kao agens koji direktno neutrališe ROS i slobodne radikale azota (Zafarullah i sar., 2003). Efekat NAC-a je opseţno ispitivan in vitro, na razliĉitim primarnim ćelijskim kulturama ili imortalizovanim ćelijskim linijama i u ograniĉenoj meri na MMĆ. Osnovni pravci istraţivanja kada se radi o ćelijskoj kulturi su usmereni na uticaj ovog molekula na proliferaciju i starenje ćelija, dok su njegovi efekti na diferencijaciju ćelija posebno vaţni prilikom ekspanzije MMĆ. Efekat NAC na proliferaciju ćelija: Efekat NAC-a na proliferaciju razliĉitih ćelijskih tipova je zanimljiv u smislu da su u literaturi zabeleţeni i pozitivni i negativni efekti. Primeri negativnog efekta NAC-a na proliferaciju ćelija u kulturi su dozno zavisna inhibicija proliferacije epitelnih ćelija sluznice usne duplje (Sato i sar., 2009) kao i inhibicija proliferacije fibroblasta. Pretpostavlja se da se inhibicija proliferacije zasniva na sniţavanju koncentracije ciklina D1, kao i povećanju aktivnosti Mn-SOD (Menon i sar., 2007). Sa druge strane, dodatak NAC-a u kulture MMĆ poreklom iz masnog tkiva ljudi i nekih ţivotinja, povećava njihov proliferativni potencijal, bez znakova starenja ćelija, uz oĉuvanje sposobnosti diferencijacije (Lin i sar., 2005, Wang i sar., 2008). TakoĊe, NAC dozno zavisno povećava preţivljavanje i broj pacovskih L6 mioblasta in vitro (Kim i sar., 2006). NAC takoĊe poboljšava preţivljavanje MMĆ iz kostne srţi pacova po transplantaciji (Song i sar., 2010). Objašnjenje stimulacije proliferacije moţe biti u vezi sa ĉinjenicom da dodavanje NAC-a u medijum za kultivaciju, na 20% O2 znaĉajno smanjuje starenje MMĆ iz koštane srţi pacova uzrokovano prekomernom aktivacijom Wnt-β katenin signalne kaskade, što je pokazano smanjenim procentom SA-β-gal pozitivnih ćelija (Zhang i sar., 2013). Dodavanje NAC je takoĊe smanjilo oštećenje DNK molekula i 39 ekspresiju p16, p53 i p21 (Zhang i sar., 2013). Još jedna studija je ukazala na pozitivno delovanje NAC-a na matiĉne ćelije. Prisustvo NAC-a in vitro poboljšava adheziju i migraciju DPSC na MTA (eng. mineral trioxide aggregate) nosaĉima. Ovaj biološki efekat je povezan sa poboljšanjem redoks statusa u ćelijama nakon tretmana NAC-om (Minamikawa i sar., 2011). TakoĊe, NAC spreĉava apoptozu, a stimuliše proliferaciju DPSC nakon korišćenja kompozitnih materijala sa smolama (Kojima i sar., 2008). Pretretman humanih embrionalnih MMĆ NAC-om je znaĉajno poboljšao njihov antioksidativni kapacitet u smislu povećanja nivoa glutationa u ćelijama, kao i sposobnost ćelijske adhezije i širenja nakon izlaganja oksidativnom stresu in vitro. Administracija NAC-om pretretiranih ćelija imunokompromitovanim miševima kod kojih je izazvana povreda pluća primenom bleomicina, je dovela do znaĉajno poboljšane retencije, ali i proliferacije, injektovanih MMĆ u povreĊenom tkivu, pa samim tim i preţivljavanja u odnosu na NAC-om netretirane miševe (Wang i sar., 2013). Efekat NAC na diferencijaciju ćelija: Osim radova koji govore o efektu NAC- a na proliferaciju ćelija, u literaturi postoje podaci koji opisuju uticaj NAC-a na diferencijaciju ćelija. HEMA (2-hidroksietil-metakrilat) je jedan od materijala koji se koristi u dentalnoj medicini i koji ima izraţeno citotoksiĉno dejstvo. Dodavanje NAC-a u kulture DPSC / HEMA, štiti DPSC od apoptoze, indukujući njihovu diferencijaciju u odontoblaste (Paranjpe i sar., 2007). Protektivni efekat NAC-a se zasniva na aktivaciji gena ukljuĉenih u proces odontogene diferencijacije. NAC promoviše diferencijaciju DPSC putem aktivacije NFκB (eng. Nuclear Factor Kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) i inhibicijom JNK (eng. c-Jun N-terminal kinase) (Paranjpe i sar., 2007). Dodavanje NAC u medijum za diferencijaciju znaĉajno je povećavalo osteogenu diferencijaciju, kako tokom rane induktivne faze, tako i tokom faze mineralizacije i to stimulacijom Wnt5a ekspresije (Ji i sar., 2011). NAC takoĊe stimuliše osteoblastnu diferencijaciju ćelija poreklom iz kalvarije miša, mehanizmom koji najverovatnije ukljuĉuje pojaĉanu sintezu glutationa (Jun i sar., 2008). NAC stimuliše i neurogenu diferencijaciju DPSC putem aktivacije serin/treonin protein-kinaze PKB/Akt (Noh i sar., 2012). S druge strane, dodavanje NAC-a u medijum za diferencijaciju inhibira adipogenezu MMĆ izolovanih iz kostne srţi (Ji i sar., 2011). Navedeni rezultati se 40 mogu povezati sa ĉinjenicom da su u proces adipogene diferencijacije ukljuĉeni ROS, ĉiji se nivo smanjuje dodavanjem NAC (Kanda i sar., 2011). Rezultati dobijeni na embrionalnim matiĉnim ćelijama ukazuju na to da suplementacija NAC-om inhibira diferencijaciju u pravcu kardiomiocita. Prooksidativna sredina predstavlja vaţan preduslov tokom diferencijacije u pravcu kardiomiocita embrioidnih tela jer je pokazano da je tretman embrioidnih tela sa antioksidansima znaĉajno smanjio proces kardiomiogeneze (Sauer i sar., 2000). NAC je antioksidant koji ima potencijalno znaĉajan uticaj na terapijsku primenu MMĆ. Podaci navedeni u literaturi pokazuju da efekat NAC, u zavisnosti od doze i tipa ćelije na koju deluje, moţe biti potpuno razliĉit, ukljuĉujući efekte od smanjenog vijabiliteta ćelija do stimulacije proliferacije. U literaturi nema podataka o dejstvu razliĉitih koncentracija NAC-a na osnovne funkcionalne osobine matiĉnih ćelija zubne pulpe mleĉnih zuba dece, niti o njegovom dejstvu na mehanizme antioksidativne zaštite ovih ćelija u kulturama na 20% O2. 41 3. CILJ I ZADACI ISTRAŽIVANJA Istraţivanja vezana za matiĉne ćelije poreklom iz zubne pulpe su vaţna s obzirom na mogućnost njihove kliniĉke primene. Ekspanzija ćelija pre njihove kliniĉke primene se najĉešće izvodi u prisustvu nefiziološki visoke koncentracije kiseonika, a njihovo preţivljavanje po transplantaciji zavisi od uslova u kojima su kultivisane. NAC je antioksidans koji moţe da spreĉi nastanak oksidativnih oštećenja, ali i da utiĉe na proliferaciju i diferencijaciju ćelija in vitro. Još uvek nije ispitano koja koncentracija NAC efikasno spreĉava oksidativno oštećenje matiĉnih ćelija zubne pulpe, i kakav efekat ta koncentracija ima na proliferaciju i/ili diferencijaciju ovih ćelija. Cilj ove disertacije je bio da se tokom višenedeljne kultivacije ćelija izolovanih iz zubne pulpe mleĉnih zuba dece ispita njihov proliferativni potencijal kao i potencijal za diferencijaciju u osteoblaste, hondrocite i adipocite. Drugi cilj je bio da se utvrdi uticaj razliĉitih koncentracija NAC na oksidativni status i proliferaciju i/ili diferencijaciju matiĉnih ćelija zubne pulpe. Zbog toga su postavljeni zadaci da se bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC (0,1 mM, 1 mM i 2 mM) odredi: 1. proliferativni potencijal ćelija i njihovo vreme udvajanja u kulturi, 2. vijabilitet i procenat apoptotiĉnih ćelija, 3. relativna brzina ulaska ćelija u aktivan ćelijski ciklus, 4. ekspresija pozitivnih i negativnih markera MMĆ (CD34, CD29, CD44, CD73, CD106, CD90, CD146, Col1A, STRO-1), 5. prisustvo SA-β-galaktozidaze, 6. aktivnost enzima ALDH, 7. ekspresija HIF-1α, 8. zastupljenost pojedinih izoformi LDH tokom kultivacije, 9. oĉuvanje multipotentnosti, odnosno mogućnost diferencijacije u ćelije koštanog, hrskaviĉavog i masnog tkiva, 10. aktivnost enzima antioksidativne zaštite (SOD i katalaze) i stepen oksidativnog oštećenja intracelularnih proteina i lipida. 42 4. MATERIJAL I METODE 4.1. Izolacija ćelija U ovom radu su korišćene ćelije zubne pulpe zdravih mleĉnih zuba dece starosti od 6 do 8 godina. Za korišćenje ćelija zubne pulpe u cilju uspostavljanja ćelijskih kultura i izvoĊenja in vitro eksperimenata dobijen je pristanak roditelja. Neposredno pre ekstrakcije, krunica zuba je premazivana sa 0.3% hlorheksidin gelom. Svi zubi su bili u trećoj i ĉetvrtoj fazi resorpcije korena i vaĊeni su zbog regularne smene mleĉnih zuba. Zubi su vaĊeni u lokalnoj anesteziji uobiĉajenom stomatološkom metodom. U svim etapama rada pre uspostavljanja ćelijske kulture, manipulacija sa zubima i zubnom pulpom se odvijala u rastvoru antibiotika i antimikotika (Antibiotic-Antimycotic solution, Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY 14072, USA) u koncentraciji od 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina i 0.25 µg/ml amfotericina B (AA rastvor) u fosfatnom puferu (PBS, Invitrogen Life Technologies, Grand Island, NY 14072, USA). Najkasnije 6 sati nakon ekstrakcije zuba, zubna pulpa je izdvajana pomoću dentalnog ekskavatora, zatim isprana 2 puta u PBS-u i preneta u Petri šolju (BD Biosciences, San Jose, CA 9513, USA) u kojoj je usitnjena na delove manje od 1 mm. Ćelije zubne pulpe su dobijene metodom tkivnog eksplanta (Kerkis i sar., 2006) u DMEM/F12 (Advanced DMEM/F-12, Gibco) medijumu sa 10% FBS (MSC-Qualified FBS, Gibco) i AA rastvorom. Ćelije su gajene u ovim uslovima 10 do 15 dana (nulta pasaţa – P0), nakon ĉega su tripsinizovane i subkultivisane u sledeće pasaţe u dvogasnom CO2 inkubatoru na 5% CO2 i 21% O2 (Thermo Electron Corporation, Valtham, MA, USA). Tripsinizacija je vršena sa TrypLE™ Express (Gibco) kada su kulture dostizale 70 do 80% konfluence. Ćelije su zasejavane u gustini od 5000 ćelija po cm2 u T-25 flaskovima (Primaria, BD Biosciences). Medijum je menjan svakog trećeg dana, a ćelije su analizirane u pasaţama 4, 6 i 8. 43 4.2. OdreĊivanje CFU-F Za procenu broja CFU-F, ćelije su u prvu pasaţu zasejavane u koncentraciji od 400 ćelija / cm2 u flaskove T-25 (Primaria, BD Biosciences). Nakon sedam dana ćelije su isprane PBS-om, fiksirane metanolom i obojene 0,5% kristal-violetom. Agregati sa više od 50 ćelija su brojani kao kolonije. 4.3. Analiza efekta NAC na populaciju ekspandiranih ćelija poreklom iz zubne pulpe Da bi se utvrdilo dejstvo razliĉitih koncentracija NAC (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA) na proliferaciju ćelija, 24 sata posle saĊenja ćelija u kulture je dodat NAC u finalnoj koncentraciji od 0,1 mmol/L, 1 mmol/L i 2 mmol/L. Efekat NAC na diferencijaciju je ispitivan tako što su ćelije gajene u uslovima sa NAC-om tokom 72 sata, nakon ĉega je regularni medijum zamenjen medijumom za diferencijaciju (osteogenu, hondrogenu i adipogenu). 4.3.1. Vreme udvajanja broja ćelija u kulturi Vreme udvajanja broja ćelija u kulturi (eng. Population Doubling Time – PDT) odreĊeno je na osnovu broja zasaĊenih ćelija i broja ćelija koje su dobijene po tripsinizaciji kultura u momentu kada su ćelije dostigle oko 80% konfluence. Ţive ćelije su brojane manuelnom metodom uz pomoć hemocitometra i uz korišćenje boje tripan plavo. Ćelije su zasejavane u triplikatu. PDT je dobijen primenom formule: PDT= t log 2 / log Nt- log N0 Nt je broj ćelija u po tripsinizaciji, N0 je zasaĊeni broj ćelija, a t je duţina kultivacije u danima. Broj ţivih ćelija u suspenziji je odreĊen uz pomoć tripan plavog. Metoda je zasnovana na principu da ţive ćelije ne apsorbuju boju, dok se mrtve oboje plavo u 0,2 % rastvoru tripan plavog, jer boja prodire u ćeliju kroz oštećenu ćelijsku membranu. Podjednake koliĉine komercijalne boje (Gibco) i ćelijske suspenzije se pomešaju, a broj ţivih ćelija se prebroji u komorici. Primenom odgovarajuće formule, broj ćelija se izrazi na mililitar suspenzije. Sve analize su uraĊene bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC-a. 44 4.3.2. OdreĊivanje fenotipa ekspandiranih ćelija Imunofenotipizacija ex vivo umnoţenih ćelija, od ĉetvrte do osme pasaţe, je izvršena sa sledećim mišjim antihumanim antitelima CD34 (PE konjugovano), CD29 (PECy5 konjugovano), CD73 (PE konjugovano), CD90 (PE konjugovano), CD146 (PE konjugovano) i CD106 (FITC konjugovano). Sva antitela su proizvedena u BD Biosciences (San Jose, CA, SAD). Nakon tripsinizacije i ispiranja u hladnom PBS / 0.5% FCS, ćelije (2 × 105) su inkubirane sa odgovarajućim monoklonskim antitelima 30 minuta na 4 o C, potom su tri puta isprane (1500 o/min (400 g), 5 minuta) i resuspendovane za konaĉnu analizu. U cilju odreĊivanja stepena nespecifiĉnog vezivanja antitela, korišćene su odgovarajuće izotipske kontrole (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD). Sve analize su raĊene na protoĉnom citometru CyFlow CL (Partec, Münster, Germany). Osim protoĉnom citometrijom, ekspresija površinskih markera je odreĊena i primenom imunocitohemije. Ćelije u ĉetvrtoj pasaţi su posaĊene u komorice za ćelijsku kulturu (eng. Multiwell Glass Chamber Slides, BD Biosciences) i nakon postizanja semikonfluence, fiksirane su metanolom i formaldehidom u odnosu 1: 9 (10 minuta, sobna t) i dva puta ispirane u PBS-u. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana sa 0,5% H2O2 (10 minuta, sobna t). Nakon svakog sledećeg koraka inkubacije, ćelije su ispirane sa TBS / 0,5% goveĊi serum albumin (BSA, Sigma) / 0.05 % Tween-20 (Sigma), 5 min. Uzorci su zatim inkubirani sa kozjim serumom (20 minuta, sobna t) i isprani PBS-om. Zatim su uzorci inkubirani sa primarnim monoklonskim antitelima 60 minuta na sobnoj t. Za analize su korišćena sledeća antitela: anti-CD73 (Santa Cruz), anti-STRO-1 (Millipore Chemicon), anti-CD29 (Millipore Chemicon), anti-CD44 (Santa Cruz), anti-collagen I (Millipore Chemicon), anti-VCAM1/CD106 (Millipore Chemicon), anti-osteonektin (Santa Cruz Biotech), anti-CD34 (Millipore Chemicon). Primarna antitela su vizelizovana korišćenjem senzitivnog EnVision+ kita (Dako), na naĉin kako je preporuĉio proizvoĊaĉ. DAB ili AEC (Dako) su korišćeni kao hromogen. Kontrole su podrazumevale iskljuĉivanje primarnog antitela ili korišćenje nespecifiĉnog antitela. Preparati su kontrastirani hematoksilinom, montirani Keiser-ovim gelom i analizirani na svetlosnom mikroskopu. Na isti naĉin je detektovano prisustvo HIF-1α u ćelijama, korišćenjem anti-HIF-1α antitela (Millipore Chemicon). 45 4.3.3. OdreĊivanje aktivnosti aldehid-dehidrogenaze Aktivnost aldehid dehidrogenaze (ALDH) je odreĊena korišćenjem Aldefluor kita (Stem Cell Technologies Inc, Vancouver, Canada) u skladu sa uputstvima proizvoĊaĉa. Nakon tripsinizacije ćelija i ispiranja u PBS-u, ćelije (2x106) su resuspendovane u odgovarajućem puferu koji se nalazi u sastavu kita. U ćelijske suspenzije je dodavano jedinjenje bodipi-aminoacetaldehid (BAAA) koje predstavlja substrat za ALDH i koje nije fluorohrom. BAAA je dodavan u koncentraciji od 1,5 μM/mL. Princip testa se bazira na ĉinjenici da ALDH, prisutan u ćelijama, konvertuje BAAA u bodipi-aminoacetate (BAA), koji fuorescira i koji se zadrţava u unutrašnjosti ćelija zbog ukupnog negativnog naelektrisanja. Posle inkubacije od 45 minuta na 37 °C, kao rezultat reakcije, ćelije sa viskom aktivnošću ALDH, su intenzivno fluorescirale. Reakcija je zaustavljena dodavanjem odgovarajuće koliĉine ALDH inhibitora, dietilamino-benzaldehid (DEAB). Sve analize su raĊene na protoĉnom citometru CyFlow CL (Partec, Münster, Germany). Sve analize su uraĊene bez i sa 0,1 mmol/L NAC. 4.3.4. Analiza ćelijskog ciklusa propidijum-jodidom U cilju odreĊivanja brzine ulaska ćelija u sintetsku (S) fazu ćelijskog ciklusa, ćelije u kulturi su prvo sinhronizovane (usklaĊena im je faza ćelijskog ciklusa u kojoj se nalaze) kultivacijom u 0,5% FBS u DMEM/F12 tokom 24 sata. Ćelije su potom tretirane razliĉitim koncentracijama NAC-a, tokom 12 sati. Ćelije su po isteku tretmana tripsinizovane, isprane dva puta u PBS-u i fiksirane u 80% etanolu (ohlaĊen na -20 ºC) preko noći na -20 ºC. Pre bojenja propidijum-jodidom (PI) ćelije su isprane u PBS-u (1500 o/min (400 g), 10 minuta) i resuspendovane u 500 µL rastvora: 50 µg/mL PI/PBS (Sigma-Aldrich), 0,1 mg/mL Ribonukleaze A (Sigma-Aldrich) i 0,05% Igepala (Sigma-Aldrich). Potom su ćelije inkubirane 40 minuta na 37 °C, isprane (1500 o/min (400g), 5 minuta), resuspendovane u 500 µL PBS-a i analizirane protoĉnom citometrijom. Sve analize su uraĊene bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC. 46 4.3.5. OdreĊivanje broja deoba testom sa karboksifluoresceinom U cilju odreĊivanja broja ćelijskih deoba sa i bez tretmana NAC-om, korišćena je intraćelijska fluorescentna boja CFDA-SE (eng. carboxyfluorescein succinimidyl ester - CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit, Invitrogen). Princip testa se zasniva na ĉinjenici da CFDA-SE difunduje u ćelije, u kojima se, pod dejstvom esteraza, konvertuje u CFSE koji ima intenzivnu fluorescirajuću aktivnost. Po deobi ćelije, koliĉina boje se podjednako raspodeljuje na obe ćerke ćelije, što omogućuje detekciju do osam ćelijskih ciklusa protoĉnom citometrijom. Posle tripsinizacije i ispiranja (PBS / 2% FCS, 1500 o/min, 5 minuta), u ćelijsku suspenziju (5 x 105 ćelija) dodat je CFDA- SE u finalnoj koncentraciji od 2,5 mM, 10 minuta, sobna t, u mraku (Lyons i Parish, 1994). Reakcija je zaustavljena dodavanjem ohlaĊenog medijuma (DMEM / F12 / 10% FCS) i inkubacijom na +4 °C u trajanju od 5 minuta. Nakon dvostrukog ispiranja u kompletnom medijumu (DMEM / F12 / 10% FCS), uzorak ćelija je analiziran protoĉnom citometrijom, dok su ostale ćelije zasejane u T-25 flaskove, i nakon 24 sata tretirane razliĉitim koncentracijama NAC-a. Nakon 72 sata tretmana, ćelije su tripsinizovane, isprane i analizirane na protoĉnom citometru. Sve analize su uraĊene bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC. 4.3.6. Procena ćelijske proliferacije pomoću BrdU eseja Analog timidina BrdU 5-bromo-2-deoksiuridin je reagens koji se ĉesto koristi u cilju procene ćelijske proliferacije. BrdU je analog timidina, pa se tokom tretmana ugraĊuje u DNK tokom S faze ćelijskog ciklusa, pa na taj naĉin sluţi kao marker proliferacije. Ćelije obeleţene BrdU-om mogu se na razliĉite naĉine detektovati, u našem sistemu je korišćeno specifiĉno antitelo koje je detektovano imunocitohemijski (BrdU In-Situ Detection Kit II, BD Pharmingen™). Nakon tripsinizacije ćelije su zasejavane u predmetna stakalca za tkivnu kulturu s komoricama (eng. Culture glass chamber slides, BD Falcon™). Rastvor za bojenje je pripremljen tako što je stok solucija u koncentraciji od 1 mM BrdU u 1× PBS puferu) 100 puta razblaţena u kompletnom medijumu koji je korišćen za uzgajanje ćelija. Nakon što su se ćelije preko noći zalepile, medijum u kome su se nalazile zamenjen je rastvorom za bojenje. Ćelije 47 su inkubirane 12 sati, dva puta isprane u PBS-u i fiksirane u 4% puferovanom formaldehidu (pH 7.4). BrdU inkorporacija je vizualizovana korišćenjem anti-BrdU antitela, streptavidin HRP i DAB-a kao hromogena. U cilju odreĊivanja procenta ćelija koje su inkorporirale BrdU, ukupno je brojano 300 ćelija, pa je procenat BrdU pozitivnih ćelija preraĉunavan. 4.3.7. OdreĊivanje broja živih ćelija „Trypan Blue” testom Broj ţivih ćelija u suspenziji je odreĊen „Trypan Blue” testom, brojanjem vijabilnih ćelija u hemocitometru. Metoda je zasnovana na principu da ţive ćelije ne apsorbuju boju, dok se mrtve oboje plavo u 0.2% rastvoru tripan plavog, jer boja prodire u ćeliju kroz oštećenu ćelijsku membranu. Postupak je sledeći: pomešano je 50 μL 0,4 % tripan plavog i 50 μL suspenzije ćelija dobijene tripsinizacijom adherentnih ćelija, stavljeno u komoru, nakon nekoliko minuta pauze ţive ćelije su izbrojane u hemocitometru. Brojanje je vršeno u poljima za brojanje leukocita i po istoj proceduri. Broj ćelija je odreĊivan pomoću sledeće formule: Br. Ć/ml=Br. Ć / kvadratu x R x 10000 Ć- ţive ćelije, R razblaţenje suspenzije ćelija 4.3.8. OdreĊivanje broja apoptotiĉnih ćelija Za odreĊivanje broja apoptotiĉnih ćelija korišćen je komercijalni kit za detekciju apoptoze (Beckman Coulter, Fullerton, California). Sve procedure su izvedene u skladu sa uputstvom proizvoĊaĉa. Ukratko, ćelije su nakon tripsinizacije dva puta isprane u ohlaĊenom PBS-u (1500 o/min, 5 minuta) i resuspendovane u ohlaĊenom odgovarajućem puferu u koncentraciji od 1 x 106 ćelija / mL. U 100 mikrolitara ćelijske suspenzije je dodat 1 L aneksin-FITC i propidijum-jodid (PI) u finalnoj koncentraciji od 50 µg/mL. Ćelijska suspenzija je inkubirana 15 minuta na ledu u mraku. Potom su ćelije isprane dva puta (1500 o/min, 5 minuta) i analizirane na protoĉnom citometru. Opisani test se bazira na ĉinjenici da u poĉetnoj fazi apoptoze dolazi do premeštanja fosfatidil-serina iz unutrašnjosti lipidnog dvosloja na spoljašnju stranu ćelijske membrane. In vivo, ta strukturna transformacija omogućava fagocitima prepoznavanje apoptotiĉnih ćelija i njihovo uklanjanje bez izazivanja upalnog procesa. 48 Aneksin V je protein koji se specifiĉno vezuje za fosfatidil-serin. Kada se za aneksin V veţe fluorescentna boja, broj apoptotiĉnih ćelija za koje se veţe ovaj konjugovani molekul se moţe odrediti pomoću protoĉne citometrije. Aneksin V se vezuje i za fosfatidil-serin s unutrašnje strane ćelijske membrane ukoliko je membrana oštećena, kao u sluĉaju nekroze ćelija. Kako bi se mogle razlikovati nekrotiĉne, ţive i ćelije u apoptozi, ćelije se dodatno boje sa PI koji zbog velike molekulske mase ne prolazi kroz ćelijsku membranu ţivih ćelija. Ako je ćelijska membrana oštećena PI ulazi u ćeliju i vezuje se za jedarni materijal zbog specifiĉnog afiniteta prema nukleinskim kiselinama. Zato je moguće istovremenim bojenjem ćelija aneksin V - FITC (zelena fluorescenca) i PI (crvena fluorescenca) razlikovati ţive ćelije (FITC negativne, PI negativne), apoptotiĉne ćelije (FITC pozitivne, PI negativne) i ćelije u kasnoj apoptozi (nekrozi) (FITC pozitivne, PI pozitivne). Sve analize su uraĊene bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC. 4.3.9. OdreĊivanje aktivnosti β-galaktozidaze Aktivnost -galaktozidaze (eng. Senescence-associated β-galactosidase - SA-β- Gal) za koju se smatra da je marker starenja ćelija, odreĊena je korišćenjem komercijalnog kita Senescence Cells Histochemical Staining kit (Sigma-Aldrich) prema instrukcijama proizvoĊaĉa. Ćelije (2x103) su kultivisane u komoricama (eng. Multiwell Glass Chamber Slides, BD Biosciences) bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC-a tokom 72 sata. Nakon ispiranja u PBS-u ćelije su fiksirane komercijalnim fiksativom 5 minuta na sobnoj temperaturi, inkubirane na 37 °C tokom noći u sveţe pripremljenom rastvoru za bojenje koji je sadrţao X-Gal (5-brom-4-hlor-3-indolil P3-D-galaktozidu) u rastvoru ĉiji je pH 6.0. Ćelije su potom isprane u PBS-u i kontrastirane bojom Neutral Red (Merck). Citoplazma ćelija koje sadrţe SA-β-Gal se bojila zeleno. Procenat obojenih ćelija je odreĊivan na uzorku od 300 ćelija. Prema nivou aktivnosti - galaktozidaze, sve pozitivne ćelije su oznaĉene kao slabo (+), umereno (++) ili visoko pozitivne (+++). Sve analize su uraĊene bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC. 49 4.3.10. Diferencijacija ćelija in vitro Diferencijacija ekspandiranih ćelija u smeru osteogeneze, hondrogeneze i adipogeneze izvedena je korišćenjem komercijalnih medijuma (Stem PRO Osteogenesis Kit, Stem PRO chondrogenesis Kit, Stem PRO Adipogenesis Kit Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Osteogeneza: nakon prvih 48 sati po saĊenju ćelija (5x103) u komorice, kompletan medijum za ekpanziju je zamenjen sa Stem PRO Osteogenesis medijumom (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Medijum je menjan dva puta nedeljno tokom trajanja osteogene diferencijacije. Pojedine kulture su prekidane posle 5 i 10 dana da bi se utvrdila aktivnost alkalne fosfataze (detaljan opis metode naveden u daljem tesktu materijala i metoda). Preostale kulture su nakon tri nedelje prekinute, ćelije oprane PBS- om i obojene Alizarin red S (Sigma-Aldrich). Detaljan opis bojenja se nalazi u daljem tekstu materijala i metoda. Adipogeneza: prvih 48 sati po saĊenju ćelija (5x103) u komorice, kompletan medijum za ekpanziju je zamenjen sa Stem PRO Adipogenesis medijumom (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Medijum je menjan dva puta nedeljno tokom trajanja adipogene diferencijacije. Posle tri nedelje kultivacije ćelije su obojene Oil red O bojom (Sigma- Aldrich) kojom se dokazuje prisustvo masnih kapljica u ćelijama (detaljan opis metode naveden u daljem tekstu materijala i metoda). Hondrogeneza: posle tripsinizacije, ćelije su isprane i resuspendovane u Stem PRO Hondrogenesis medijumu (Invitrogen) i kultivisane na dva naĉina. Prvi naĉin je podrazumevao kultivaciju ćelija (2x105) u polipropilenskim epruvetama posle centrifugiranja na 1000 o/min 5 minuta da bi se dobio takozvani ćelijski “pellet”. Tokom dve nedelje kultivacije i menjanja medijuma dva puta nedeljno, došlo je do stvaranja trodimenzionalne strukture loptastog oblika veliĉine 1,5 mm. Formirane pelete su potom fiksirane, ukalupljne i dalje procesuirane klasiĉnim histološkim tehnikama kojima je pokazana graĊa ovih tvorevina. Drugi naĉin je podrazumevao kultivaciju ćelija u hondrogenom medijumu u već opisanim komoricama. Posle dve nedelje ćelije su lizirane i odreĊena je koncentracija glikozaminoglikana, proteina i DNK. Istovremeno su za kontrolu svih navedenih uslova, ćelije gajene u medijumu za ekspanziju. 50 4.3.11. Alizarin Red S bojenje Nakon tri nedelje osteogene diferencijacije, ćelije su isprane u PBS-u, fiksirane u formaldehidu (30 minuta) i dva puta isprane destilovanom vodom. Ćelije su potom obojene sa 2% rastvorom Alizarin Red S, pH 4,2 (Sigma Aldrich), 20 minuta na sobnoj t i nekoliko puta isprane destilovanom vodom. Crvena boja ECM je ukazivala na prisustvo deponovanih soli kalcijuma. Pet reprezentativnih polja iz svakog uslova je slikano na invertnom mikroskopu LEICA (LEICA DMIL LED, Leica Microsystems, Wetzlar, Nemaĉka). 4.3.12. Oil Red O-bojenje i kvantifikacija adipogene diferencijacije Posle tri nedelje adipogene diferencijacije, ćelije su isprane u PBS-u, fiksirane formaldehidom (30 minuta) i dva puta isprane destilovanom vodom. Zatim je na ćelije dodat 60% izopropanol u trajanju od 5 minuta. Nakon toga su ćelije obojene 5% rastvorom Oil red O boje (Sigma-Aldrich) u 60% izopropanolu. Nakon 10 minuta kulture su detaljno isprane vodom iz ĉesme, pa destilovanom vodom i slikane na invertnom mikroskopu Leica (LEICA DMIL LED, Leica Microsystems, Wetzlar, Nemaĉka). Potom su preparati slikani na svetlosnom mikroskopu pod imerzijom. Za kvantifikovanje stepena diferencijacije ekspandiranih ćelija u adipocite, Oil- red O je eluiran rastvorom 10% Igepala (Sigma-Aldrich) u izopropanolu (Baker J.T.) tokom 10 minuta na 37 °C. Dobijeni supernatant je centrifugiran 5 minuta na 12000 o/min (15000g) kako bi se uklonile ćelije. Optiĉka gustina rastvora je odreĊena na 490 nm spektrofotometrijski. UporeĊivanjem optiĉkih gustina rastvora diferenciranih i nediferenciranih ćelija dobijen je odnos koji je dalje analiziran. 51 4.3.13. Histohemijska i imunohistohemijska analiza hondrogenih peleta Pelete su fiksirane 24h u 10% neutralnom formalinu, dehidratacija je uraĊena kroz seriju alkohola (50%, 70%, 96% etanol i 100% izopropanol) i ksilol. Tkivo je uklapano u parafin sa taĉkom topljenja 42 ºC, a iseĉci debljine 5 µm bojeni su alcian- plavim da bi se utvrdilo prisustvo glikozaminoglikana (GAG). Procedura bojenja alcian- plavim: Nakon deparafinizacije iseĉaka u ksilolu i hidratacije kroz alkohole razliĉitog razblaţenja (100%, 96% etanol) i destilovanu vodu, iseĉci su bojeni vodenim rastvorom alcian-plavog (0,1%). Kao medijum za montiranje pokrovnog stakla korišćen je DPX (DPX mounting medium, Fisher scientific®). Sinteza kolagena tip 2 u peletama je potvrĊena imunocitohemijski, korišćenjem antitela na kolagen tip 2 (Abcam). 4.3.14. Kolorimetrijsko odreĊivanje aktivnosti enzima alkalna fosfataza u ćelijskom lizatu Da bi se uporedila sposobnost osteogene diferencijacije izmeĊu razliĉitih uslova kultivacije, merena je aktivnost alkalne fosfataze (AP) u ćelijskom lizatu 5 i 10 dana nakon dodatka osteogenog medijuma. Aktivnost AP je neophodna za hidrolizu β- glicerofosfata ĉime in vitro zapoĉinje proces mineralizacije. Kolorimetrijska metoda za odreĊivanje aktivnosti AP kao hromogeni supstrat koristi p-nitrofenil-fosfat (pNPP, eng. p-nitrophenylphosphate, (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Pod dejstvom AP, pNPP prelazi u p-nitrofenol, rastvorljiv, ţuto obojeni proizvod, ĉiji je intenzitet boje proporcionalan aktivnosti enzima. U navedenim vremenima, ćelije su tri puta isprane u PBS-u, a potom je u svaku komoricu dodato po 200 μL pufera za lizu ćelija (1% Igepal, pH 7,5, Sigma-Aldrich). Posle inkubacije od 12 ĉasova (4 °C), sadrţaj je prenešen u ependorfice i na 4 °C centrifugiran 10 minuta na 10000 g (10000 o/min). Izdvojeni supernatant je korišćen za analizu. Aktivnost AP je odreĊivana u mikrotitarskim ploĉama po sledećem postupku. U svaki bunarĉić je dodato po 5 μL uzorka, 15 μL pufera za lizu ćelija i 180 µl p-NPP rastvora u puferu za substrat (5 mM p-nitrofenil-fosfat u 50 mM glicinu, 1 mM MgCl2, pH 10,5). Uzorci su inkubirani 15 minuta na 37 °C i reakcija je prekidana dodavanjem 1 52 M NaOH. Potom su apsorbance oĉitavane na optiĉkom ĉitaĉu (Labsystems Multiskan PLUS, Finska) na talasnoj duţini od 405 nm. Aktivnost AP je izraĉunataa korišćenjem jednaĉine izvedene iz standardne krive i izraţena je kao µg p-nitrofenola/mg proteina/minuti. 4.3.15. In situ hibridizacija In situ hibridizacija (In situ hybridization - ISH) je sprovedena u cilju detekcije ćelija koje sintetišu kolagen tip I u hondrogenim peletama. Na iseĉcima hondrogenih peleta debljine 5 µm sprovedene su Riboprobe (RNK probe) oznaĉene digoksigeninom (DIG) za kolagen tip I. Za pozitivnu kontrolu, prilikom izvoĊenja ISH za kolagen tip I, korišćeno je koštano tkivo mišijih embriona. Hibridizacija sa sintetisanim RNK probama vršena je preko noći na 60 ºC u vlaţnoj sredini. Nakon inkubacije preparati su oprani da bi se odstranili nevezani molekuli i slabo vezane sekvence i reakcija je blokirana sa 10% FBS u 1% blokirajućem puferu u PBS-Tween-u. Da bi se vizuelizovali DIG-om oznaĉeni oligonukleotidi, nakon hibridizacije je dodato, anti-DIG antitelo konjugovano sa AP u blokirajućem puferu. Reakcija se odvijala preko noći na temperaturi od 4 ºC. Posle inkubacije, dodat je supstrat za vizuelizaciju AP aktivnosti, NBT / BCIP (Nitroblue tetrazolium soli / 1,5-dibrom-4 hlor-3-fosfat-indolil) koji formira tamno plavi ili braon u vodi nerastvorljiv talog na mestima gde postoji aktivnost AP nakon ikubiranja na 37 0C. Preparati su potom slikani optiĉkim mikroskopom. 4.3.16. OdreĊivanje koncentracije glikozaminoglikana Za odreĊivanje koncentracije glikozaminoglikana korišćen je Blyscan kit (Biocolor, UK) po uputstvima proizvoĊaĉa. Nakon papainske digestije po 100 μl uzorka je kombinovano sa reagensom koji sadrţi blyscan boju, inkubirano pola sata i centrifugirano na 12000 o/min (15000 g) 10 minuta kako bi se istaloţio kompleks boje i glikozaminoglikana. Nakon resuspendovanja kompleksa u reagensu za disocijaciju u mikrotitarskim ploĉama odreĊivana je apsorbanca na 650 nm. Rezultati su izraţeni kao μg GAG/μg DNK. 53 4.3.17. Kvantifikacija DNK Ukupna DNK u uzorcima ćelijskih lizata je kvantifikovana fluorimetrijskim testom (FluoReporter ® Blue Fluorometric dsDNA Quantitation Kit, Invitrogen, Molecular Probes). Ovaj kit sadrţi DNK-specifiĉnu bisbenzimidazol boju Hoechst 33258. U 100 µl papainske suspenzije je dodato 100 µL rastvora Hoechst 33258 boje u TNE (10 mM Tris, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) puferu. Finalna koncentracija je Hoechst 33258 je bila 0.35 μg/mL. Fluorimetrijsko merenje DNK standarda i uzoraka je uraĊeno u triplikatu. Standardi i uzorci su ekscitirani na 355 nm na spektrofluorimetru (1420-040 VICTOR3V multilabel counter, Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Singapore), dok je emisija merena na 460 nm. DNK koncentracija je izraĉunata na osnovu standardne krive i izraţena kao μg DNK/ml papainske suspenzije. 4.4. OdreĊivanje stepena oksidativnog oštećenja i aktivnosti enzima antioksidativne odbrane 4.4.1. Liziranje ćelija i odvajanje ćelijskih proteina Nakon inkubacije bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC-a, ćelije isprane sa PBS-om i lizirane dodavanjem 1 mL pufera u T-25 flasku. Nakon inkubacije u trajanju od 30 minuta na ledu, lizirane ćelije su centrifugirane na 10000g (10000 o/min) 15 minuta na +4 °C. Supernatant je ĉuvan na -80 °C do izvoĊenja analiza koje su imale za cilj da pokaţu stepen oksidativnog oštećenja i nivo antioksidativne zaštite. Pufer za lizu (pH 7,5) je sadrţao 1% nejonskog deterdţenta Igepal-a, 50 mM Tris-a (tris(hidroksimetil)aminometan), 150 mM NaCl, 1 mM Na-ortovanadata (inhibitor tirozinskih proteinskih fosfataza), 10 mM NaF (inhibitora serinskih i treoninskih proteinskih fosfataza), i koktel inhibitora proteaza (1 mM PMSF fenilmetilsulfonilfluorid), 10 mM ε-aminokapronske kiseline, 2 µg/ml aprotinina A, 40 µg/ml leupeptina i 1 µM pepstatina A). Sve komponente pufera su nabavljene od Sigma-Aldrich kompanije. 54 4.4.2. Koncentracija proteina u ćelijskom lizatu Koncentracija proteina u citosolnoj frakciji liziranih ćelija je odreĊena upotrebom komercijalnog BCA testa (SERVA BCA Protein Assay Macro Kit, Heidelberg, Germany) uz modifikacije. Princip testa se zasniva na sposobnosti proteina da uz prisustvo BCA (eng. Bicinchoinic Acid) redukuje dvovalentne jone bakra stvarajući proizvod ljubiĉaste boje (Smith, 1985). U mikrotitarskim ploĉama (96 bunarića sa ravnim dnom) pomešano je 200 µl radnog rastvora BCA reagensa sa 10 µl ćelijskog lizata. Nakon 30 sekundi intenzivnog mešanja, rastvor je inkubiran 30 minuta na 37 °C. Posle hlaĊenja na sobnoj temperaturi odreĊivana je apsorbanca na 540 nm na automatskom ĉitaĉu za mikrotitarske ploĉe (Labsystems Multiskan PLUS, Finska). Koncentracija proteina je odreĊena na osnovu standardne krive za goveĊi serum albumin (BSA, Bovine Serum Albumine). Senzitivnost ovog testa omogućuje detekciju proteina u opsegu koncentracija od 25 – 1000 µg proteina / mL. 4.4.3. OdreĊivanje aktivnosti katalaze Aktivnost katalaze (CAT) u ćelijskom lizatu je odreĊena na osnovu funkcije ovog enzima da katalizuje razgradnju vodonik-peroksida do vode i molekulskog kiseonika. Smanjenje koncentracije vodonik-peroksida praćeno je merenjem apsorbance na 240 nm, kinetiĉkom metodom analize. Jedinica aktivnosti CAT izraţena je brojem μmol-a vodonik-peroksida koji se razlaţe u jednom minutu po miligramu proteina u ćelijskom lizatu (μmol/mg/min). (Aebi, 1984) 4.4.4. OdreĊivanje aktivnosti superoksid-dismutaze Za odreĊivanje aktivnosti superoksid-dismutaze (SOD) korišćena je „adrenalinska metoda“ koja pripada grupi metoda negativnog tipa, koja prati smanjenje brzine autooksidacije adrenalina u alkalnoj sredini, koji je zavistan od superoksid-anjon- radikala. Brzina autooksidacije adrenalina prati se spektrofotometrijski (CECIL CE 2021UV/VIS) preko promene absorbance na 480 nm. Porast absorbance na 480 nm je posledica akumulacije adrenohroma. SOD aktivnost je izraţena kao U/mg proteina u 55 ćelijskom lizatu (supernatantu). Jedinica SOD aktivnosti je definisana kao zapremina, odnosno koliĉina proteina koja uzrokuje 50% inhibicije brzine autooksidacije adrenalina u linearnom delu porasta apsorbance. Mn-SOD je odreĊivana nakon preinkubacije ćelijskog lizata sa 5 mM KCN. Aktivnost Cu,Zn-SOD je izraĉunavana na osnovu razlike izmeĊu aktivnosti ukupne SOD i Mn-SOD. (Misra i Fridovich, 1972) 4.4.5. OdreĊivanje koliĉine malondialdehida (MDA) Koncentracija malondialdehida je odreĊena reakcijom sa tiobarbiturnom kiselinom (TBA), pri ĉemu se formira obojeni proizvod. Intenzitet boje nastalog proizvoda odreĊuje se spektrofotometrijski (CECIL CE 2021UV/VIS) merenjem apsorbance na 535 nm. Koncentracija MDA je izraĉunata na osnovu molarnog ekstinkcionog koeficijenta bojenog proizvoda (a=1.56x10 5 mol -1 cm -1) i izraţena u nM na miligram proteina u ćelijskom lizatu (nm MDA / mg proteina). (Cynamon i sar., 1985) 4.4.6. OdreĊivanje ukupnih tiolnih (-SH) grupa Broj ukupnih tiolnih grupa u ćelijskom lizatu (proteinskih i neproteinskih) odreĊen je spektrofotometrijski sa 5,5-ditiobis-2-nitrobenzoevom kiselinom i merenjem apsorbance na talasnoj duţini od 412 nm na spektrofotometru (CECIL CE 2021UV/VIS), korišćenjem apsorpcionog koeficijenta a=14150mol-1cm-1. Dobijeni rezultati su izraţeni u μmol/mL. (Ellman, 1959) 4.4.7. OdreĊivanje relativne zastupljenosti LDH izoenzimskih oblika u supernatantu Izoenzimski oblici laktat-dehidrogenaze (LDH1, LDH2, LDH3, LDH4 i LDH5) su odreĊivani vertikalnom elektroforezom na 7,5% PAGE-gelu (HOEFFER MINI VE, Amersham, LKB, 2117, Bromma, Uppsala Sweden), uz primenu TRIS-glicinskog pufera, po metodi Yoshida i Takakuwa (1997). Trake su vizualizovane u prisustvu litijum-laktata kao supstrata, NADH kao kofaktora i tetrazolijum plavog. Intenziteti traka LDH izozima mereni su denzitometrijski korišćenjem Scion Image Beta 4.02 56 software (scion corp., 2007). Koncentracija ukupne LDH je izraţena kao P (površina na gelu) normalizovana na koncentraciju proteina. Intenzitet svake trake koja predstavlja odreĊenu izoenzimsku varijantu je izraţen kao procenat u odnosu na ukupnu površinu. Kako su Rf vrednosti LDH4 i LDH5 izoformi tokom elektroforeze bile pribliţne, u analizama je prikazana zbirna vrednost obe izoforme. 4.4.8. OdreĊivanje sadržaja karbonilnih grupa u oksidovanim proteinima u supernatantu Karbonilni derivati proteina odreĊivani su reakcijom sa 2,4- dinitrofenilhidrazinom (DNPH) (Levine i sar., 1990). Kao proizvod reakcije nastaju 2,4- dinitrofenilhidrazoni koji se detektuju spektrofotometrijski na 370 nm. Korišćenjem 30% trihlorsirćetne kiseline nastao je talog koji je pomešan sa 10 mM DNPH (2,4- dinitrophenilhidrazin) u 2 M HCl. Uzorci su inkubirani 1 h na sobnoj temperaturi, isprani tri puta sa rastvorom etanol-butilacetata (1:1 v/v), rastvoreni u 6 M gvanidin- HCl na 37 °C 15 minuta uz mešanje na vorteksu. Koliĉina karbonilnih grupa je izmerena spektrofotometrijski i odreĊena iz absorbance na 370 nm uz upotrebu molarnog ekstinkcijskog koeficijenta a=22x10 3 mol -1 cm -1. Vrednosti su izraţene u nM karbonilnih derivata po miligramu proteina. 4.5. Analiza masno-kiselinskog profila ukupnih ćelijskih lipida gasno-teĉnom hromatografijom 4.5.1. Ekstrakcija ukupnih lipida iz ćelija Ukupni lipidi iz ćelija su izolovani smešom organskih rastvaraĉa. Svi korišćeni rastvaraĉi u postupku ekstrakcije lipida su bili J.T. Baker p.a. kvaliteta. Nakon metilovanja, metil-estri masnih kiselina su razdvajeni gasno-teĉnom-hromatografijom (GLC). Princip metode: Ukupni lipidi iz ćelija su izolovani uz primenu izopropil- alkohola i hloroforma u koji je dodat 0.005% BHT (antioksidant) (Sigma-Aldrich) po metodi Rose i Oklander (1965). Ćelijska suspenzija u PBS-u (100 μL) je intenzivno 57 mešana 60 minuta sa 2,2 mL izopropanola. Zatim je dodato 1,7 mL hloroforma i uzorci su inkubirani na sobnoj temperaturi uz povremeno mešanje tokom narednih sat vremena. Dobijeni lipidni ekstrakt je propušten kroz disk natrijum-sulfata i uparen u struji azota. Priprema uzoraka za gasno-teĉnu-hromatografiju: Suvi preĉišćeni ekstrakti su rastvoreni u 300 μl smeše hloroform-methanol 2:1 (v/v) upareni do suva u struji azota, resuspendovani u 1,5ml n-heksana i intenzivno mešani. Masne kiseline su esterifikovane po modifikovanoj metodi transesterifikacije Christopherson i Glass-a (Christopherson i Glass, 1969). Naime, u preĉišćeni ekstrakt, resuspendovan u 1,5 ml n- heksana, je dodavano 0.2 ml 1 M H2SO4 u metanolu i inkubirani 2 sata na 85 °C. Nakon hlaĊenja smeša je centrifugirana na 3000 o/min (1600 g) i odvojeni heksanski sloj uparen do suva u struji azota. 4.5.2. Ekstrakcija ukupnih lipida iz FBS Princip metode: Ukupni lipidi fetalnog goveĊeg seruma su ekstrahovani smešom organskih rastvaraĉa hloroform - metanol 2:1 (v/v). U 0,5 ml seruma je dodato 3 puta po 1,5 ml smeše organskih rastvaraĉa hloroform - metanol 2:1 (v/v) i 50 mg% BHT. IzmeĊu dodavanja porcija hloroform – metanol, ekstrakt je snaţno vorteksovan oko 1 minut. Dobijeni lipidni ekstrakt je propušten kroz disk natrijum sulfata, pa uparen do suva. Suvi preĉišćen ekstrakt rastvoren je u 0,2 ml hloroform - metanola 2:1 (v/v), uparen do suva i korišćen za metilovanje. Masne kiseline se direktno esterifikuju po modifikovanoj metodi transesterifikacije (Christopherson i Glass, 1969). 4.5.3. Gasno-teĉna hromatografija Uzorci pripremljenih metil-estara rastvoreni su u oko 10 μL n-heksana (u zavisnosti od koliĉine suvog ostatka) neposredno pre analize, a od toga je injektovano 0,5 μL uzorka. Masne kiseline su identifikovane na osnovu retencionih vremena standarda masnih kiselina (Sigma, Chemical Co, st.Louis, MO, USA) i/ili Supelco Inc., Belleforte, PA, USA) dobijenim pri istim uslovima. Sadrţaji pojedinaĉnih masnih 58 kiselina izraţeni su u procentima od ukupno detektovanih masnih kiselina, na osnovu površine njihovih pikova. Masne kiseline ukupnih lipida su analizirane gasno-teĉnom hromatografijom na aparatu Shimadzu GC 2014 sa jonizacionim detektorom. Korišćena je semikapilarna kolona DB-23. Debljina filma stacionarne faze je bila 0,25 mm. Protok nosećeg gasa (helijuma) je bio 5 mL/min, protok vazduha 320 mL/min, a vodonika 30 mL/min. Temperatura detektora je bila podešena na 250 °C, a injektora na 220 °C. Temperaturni profil kolone je izgledao na sledeći naĉin: 5 minuta na 140 °C, zatim je temperatura postepeno povećavana za 3 °C/minuti do 190 °C, odnosno 1 °C/minuti do 220 °C, i na kraju 15 minuta na 220 °C. 4.6. Statistiĉka analiza Rezultati su obraĊeni i prikazani kao srednja vrednost ( X ), medijana (MD), standardna devijacija (SD), interkvartilni raspon (IR), minimum (Min), maksimum (Max). Za poreĊenje rezultata dobijenih posle kultivacije ćelija u razliĉitim uslovima korišćeni su Šapiro-Vilk (eng. Shapiro-Wilk) za ispitivanje normalne distribucije podataka; Studentov t-test za ispitivanje razlika izmeĊu dve grupe podataka (za parametre koji pokazuju normalnu distribuciju); Vilkoksonov test oznaĉenih rangova (eng. Wilcoxon signed ranks test) za analizu dve grupe podataka koji su rezultat ponovljenih merenja (ne-parametarska analiza). Minimalni nivo statistiĉke znaĉajnosti bio je p<0,05. Statistiĉka obrada podataka je uraĊena korišćenjem softverskog paketa Prisma 5.0. Neke od analiza su uraĊene u Excell-u. 59 5. REZULTATI 5.1. Izolacija poĉetne populacije ćelija U ovom radu su metodom tkivnog eksplanta izolovane ćelije poreklom iz zubne pulpe eksfoliranih zuba dece stare od 6 do 8 godina. Nakon 2 do 3 dana iz eksplanta su poĉinjale da migriraju ćelije koje su istovremeno i proliferisale stvarajući ostrvca bogata ćelijama (slika 1A). Nakon deset do ĉetrnaest dana, ćelije su tripsinizovane, prebrojane i presejane u nove plastiĉne posude. Vreme kultivacije posle prve tripsinizacije je oznaĉeno kao prva pasaţa (P1). Broj presejanih ćelija se kretao od 30000 do 300000 ćelija. U P1 broj CFU-F je iznosio 470 ± 52 na 10000 zasejanih ćelija (slika 1B). Ćelije su uzgajane do osme pasaţe nakon ĉega je kultivacija prekidana. PDT kao i ostale funkcionalne karakteristike izolovanih ćelija (proliferacija, diferencijacija, starenje, apoptoza) su evaluirane u P4, P6 i P8. 5.2. Proliferacija ćelija tokom dugotrajne kultivacije Vreme duplikacije ćelija je u proseku bilo 23,23 sata i tokom ĉitavog perioda kultivacije koje je od prve do osme pasaţe izosilo 31 dan, se nije znaĉajno razlikovalo (grafikon 1). Ukupan broj deoba tokom kultivacije (ne raĉunajući nultu pasaţu) je bio 30,67 ± 2,42. Dominirale su ćelije fibroblastoidne morfologije, dok su pljosnate, velike ćelije, bile retke (slika 1C). A B C Slika 1. Nediferencirane ćelije zubne pulpe u kulturi. A) Rast ćelija iz eksplanta. U uglu dole levo se vidi tkivo zubne pulpe, a celo polje je prekriveno ćelijama koje migriraju i proliferišu (invertni mikroskop, uveliĉanje objektiva ×20). B) Colony forming unit – fibroblast obojene kristal violet bojom, sedmi dan kultivacije u P1 (uveliĉanje objektiva ×10). C) Fibroblastoidne ćelije u kulturi (P2), obojene May-Grünwald Giems-a bojom (uveliĉanje objektiva ×100). 60 0 5 10 15 20 25 30 P4 P5 P6 P7 P8 P D T ( sa ti ) Grafikon 1. Vreme duplikacije broja ćelija u kulturi (PDT) kroz pasaţe, izraţeno u satima. Na grafikonu su prikazane X SD (n=6) BrDU test je pokazao da je tokom 12 sati kultivacije u P4, kroz S fazu ćelijskog ciklusa, u proseku prošlo 70 ± 15% ćelija. U P8, je za isti vremenski period kroz S fazu prošao nešto veći broj ćelija (78 ± 33%). Grafikon 2. A) Procenat ćelija (P4 i P8) koje nakon 12 sati kultivacije prolaze kroz S fazu ćelijskog ciklusa. Na grafikonu su prikazane X SD (n=3). B) Reprezentativno polje na kome se vide BrDU pozitivne (braon jedro) i BrDU negativne ćelije (plavo jedro). Uveliĉanje objektiva ×40. B A 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P4 P8 B r d U + /- ć e li je ( % ) BrdU- BrdU+ 61 5.3. Ekspresija površinskih antigena tokom kultivacije Ekspresija površinskih antigena tokom kultivacije ćelija izvedena je primenom imunocitohemije i protoĉne citometrije. Primenom imunocitohemije je pokazano da je oko 10% ćelija u pasaţi ĉetiri eksprimiralo STRO-1 (slika 2A). Gotovo sve ćelije su u pasaţi ĉetiri eksprimirale CD44, CD73, kolagen tip I, CD29 i osteonektin (slika 2B, 2C, 2D, 2E i 2F). Slika 2. Reprezentativne slike ekspresije pojedinih markera karakteristiĉnih za fenotip ćelija poreklom od mezoderma, P4. A) ekspresija STRO-1; B) ekspresija CD29; C) ekspresija CD73; D) ekspresija kolagena 1; E) ekspresija CD44; F) ekspresija SPARC (osteonektin) markera (uveliĉanje objektiva ×40). 62 Kada su ćelije u P4, P6 i P8 analizirane protoĉnom citometrijom, pokazano je da su antigeni CD29 i CD73 zastupljeni podjednako tokom ĉitavog perioda kultivacije. Istovremeno, populacija ćelija koja eksprimira antigene CD90, CD106 i CD146 imala je trend opadanja tokom ispitivanog vremena (grafikon 3). 0 20 40 60 80 100 120 CD29 CD73 CD90 CD146 CD106 B ro j će li ja P4 P6 P8 Grafikon 3. Procenat ćelija koje eksprimiraju navedene markere tokom kultivacije u P4, P6 i P8. Na grafikonu su prikazane X SD (n=6). Na grafikonu 4 su prikazani reprezentativni histogrami ekspresije CD29, CD73, CD90, CD146, CD106 i CD34 molekula iz pasaţe 4. 63 Grafikon 4 A-E. Reprezentativni histogrami ekspresije pojedinih površinskih antigena na ekspandiranoj populaciji ćelija. Izotipske kontrole su prikazane kao neobojene površine ispod pune linije, dok je intenzitet fluorescence ćelija prikazan sivo obojenim površinama. 64 5.4. OdreĊivanje apoptoze tokom kultivacije ćelija Tokom kultivacije ćelija u P4, P6 i P8 je pokazano da posle tripsinizacije nema znaĉajnih razlika izmeĊu broja ćelija u ranoj apoptozi, kasnoj apoptozi i potpuno razgraĊenih ćelija (grafikon 4A, B i C). TakoĊe, broj ţivih ćelija je bio podjednak tokom ĉitavog perioda kultivacije (grafikon 4D). A B 0 1 2 3 4 5 P4 P6 P8 A n n ex in -V -p o zi ti v n e će li je ( % ) 0 2 4 6 8 10 P4 P6 P8 A n n e x in -V -P I p o z it iv n e ć e li je (% ) C D 0 4 8 12 16 20 P4 P6 P8 P I p o z it iv n e ć e li je ( % ) 0 20 40 60 80 100 P4 P6 P8 Ž iv e ć e li je ( % ) Grafikon 5. Procenat ćelija u razliĉitim fazama apoptoze i procenat ţivih ćelija tokom dugotrajne kultivacije ćelija. A) Procenat ćelija u ranoj apoptozi. B) Procenat ćelija u kasnoj apoptozi) Procenat nekrotiĉnih ćelija i D) Procenat ţivih ćelija. Na grafikonu su prikazane X SD (n=6). (PI – propidijum-jodid) 65 5.5. Detekcija HIF-1α tokom kultivacije ćelija Tokom kultivacije ćelija u svim navedenim pasaţama, pokazano je da veoma visok procenat ekspandiranih ćelija (95,6 ± 2,3% ) pokazuje imunoreaktivnost na HIF- 1α u jedru (slika 3A i B). A B Slika 3 A, B. Kultivisane ćelije, P4, 80% konfluence. Braon obojena jedra su pozitivna na anti- humano HIF-1α antitelo A) uveliĉanje ×20. B) uveliĉanje ×40. 5.6. OdreĊivanje aktivnosti β-galaktozidaze tokom kultivacije ćelija Rezultati koji su dobijeni ispitivanjem aktivnosti SA-β-Gal u ćelijama tokom P4, P6 i P8 pokazuju da se tokom dugotrajne kultivacije ćelija izolovanih iz zubne pulpe mleĉnih zuba dece aktivnost -galaktozidaze ne menja znaĉajno, odnosno kod većine ćelija aktivnost ovog enzima nije prisutna (grafikon 6A, slika 4). Ipak, prisutan je uoĉljiv trend porasta ćelija koje imaju najniţi i srednji stepen aktivnosti ovog enzima, dok procenat visoko pozitivnih ćelija blago raste (grafikon 6B). 66 A B 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 P4 P6 P8 b et a -g a la k to zi d a za n eg a ti v n e će li je ( % ) 0 2 4 6 8 10 P4 P6 P8 b et a -g a la k to zi d a za p o zi ti v n e će li je ( % ) β-gal. + β-gal. ++ β-gal. +++ Grafikon 6. A) Procenat ćelija kod kojih se ne moţe utvrditi aktivnost SA-β-Gal tokom dugotrajne kultivacije ćelija. B) Procenat ćelija koje imaju slabu, umerenu i visoku akivnost SA- β-Gal tokom dugotrajne kultivacije ćelija. Na grafikonu su prikazane X SD (n=6). A B Slika 4 – Ćelije obojene na SA-β-Gal. Zeleno obojena citoplazma ukazuje da ćelije imaju povišenu aktivnost SA-β-Gal. A) uveliĉanje ×10. B) uveliĉanje ×40 67 5.7. Diferencijacija Tokom dugotrajne kultivacije ćelija, u P4, P6 i P8 izvedeni su testovi koji su imali za cilj da pokaţu sposobnost diferencijacije nediferenciranih, ekspandiranih ćelija u osteoblaste, adipocite i hondrocite. Osim toga, razliĉitim testovima su kvantifikovane pojedine funkcionalne karakteristike diferenciranih ćelija i rezultati su meĊusobno uporeĊivani da bi se utvrdilo da li se sposobnost diferencijacije menja tokom ekspanzije ćelija. 5.7.1. Osteogena diferencijacija Kultivacijom ekspandiranih ćelija u osteogenom medijumu pokazano je da se one u P4, P6 i P8 diferenciraju u pravcu osteoblasta. U samom toku osteogene diferencijacije, već posle pet dana dolazi do porasta aktivnosti alkalne fosfataze (grafikon 7A), a ona ostaje povišena i desetog dana kultivacije (grafikon 7B). TakoĊe je pokazano da je nakon dve nedelje kultivacije u osteogenom medijumu, osim povećane aktivnosti alkalne fosfataze, pojaĉana i sinteza osteokalcina (slika 5C). Nakon tri nedelje kultivacije ćelija u kontrolnom i osteogenom medijumu, bojenjem Alizarin crvenim pokazano je da se u kontrolnom medijumu nisu formirali kristali kalcijum-fosfata u ECM, dok su se u osteogenom medijumu formirali (slike 5B i D). 68 0 20 40 60 80 100 P4 P6 P8 m ic r o g r a m p N P /m g p r o te in a /m in . kontrola osteogeneza * ** * A 0 10 20 30 40 P4 P6 P8 m ik r o g r a m p N P /m g p r o te in a /m in . kontrola osteogeneza *** *** *** B Grafikon 7. Aktivnost alkalne fosfataze u nediferenciranim i diferenciranim ćelijama nakon perioda inkubacije od A) pet i B) deset dana. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=6).*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. 69 A B C D Slika 5. Osteogena diferencijacija A) Konfluentne ćelije posle dve nedelje kultivacije u kontrolnom medijumu, negativne na osteokalcin. Ljubiĉasta boja potiĉe od hematoksilina (uveliĉanje objektiva × 10). B) Konfluentne ćelije posle dve nedelje kultivacije u ostegenom medijumu, pozitivne na osteokalcin. Ljubiĉasta boja potiĉe od hematoksilina, dok braon nijansa potiĉe od pozitivnog bojenja sa anti-humanim osteokalcin antitelima (uveliĉanje objektiva × 10). C) Konfluentne ćelije posle tri nedelje kultivacije u kontrolnom medijumu. Posle bojenja Alizarin crvenim, ekstracelularni matriks je ostao neobojen (uveliĉanje objektiva × 10, invertni mikroskop) D) Konfluentne ćelije posle tri nedelje kultivacije u osteogenom medijumu. Posle bojenja Alizarin crvenim, ekstracelularni matriks je intenzivno crven zbog depozita kalcijum fosfata (uveliĉanje objektiva × 10, invertni mikroskop). 70 5.7.2 Adipogena diferencijacija Kultivacijom ekspandiranih ćelija u adipogenom medijumu tokom tri nedelje, pokazano je da se jedan broj ćelija u P4, P6 i P8 diferencira u pravcu adipocita. Nediferencirane ćelije nisu imale uoĉljive masne kapljice (grafikon 8A). Na grafikonu 8B se moţe videti da se aproksimativno jedna petina ćelija diferencirala i da ima u sebi masne kaljice. Posle eluiranja boje i merenja optiĉke gustine rastvora utvrĊeno je da izmeĊu pasaţa nema znaĉajne razlike u broju ćelija koji se diferencirao u adipocite (grafikon 8C). A B C 0 2 4 6 8 P4 P6 P8 O d n o s p re m a n ed if er en ci ra n im će li ja m a Grafikon 8. Adipogena diferencijacija ekspandiranih ćelija. A) Oil Red O bojenje nedirenciranih ćelija. B) Oil Red O bojenje diferenciranih ćelija. C) Normalizovane vrednosti intenziteta Oil Red O boje (450 nm) prikazane kao X SD (n=6) posle tri nedelje adipogene diferencijacije u razliĉitim pasaţama. 71 C B A 5.7.3. Hondrogena diferencijacija Kultivacijom ekspandiranih ćelija u hondrogenom medijumu u uslovima u kojima je gustina ćelija bila veoma visoka, već nakon dva do tri dana su se formirale trodimenzionalne pelete u kojima su se ćelije diferencirale stvarajući karakteristiĉan ECM. Posle dve nedelje kultivacije u hondrogenom medijumu, u ECM su bili prisutni GAG (slika 6A) i kolagen tip 2 karakteristiĉan za hijalinu hrskavicu (slika 6B). Osim toga, po obodu peleta, in situ hibridizacijom je pokazana ekspresija gena za kolagen tip 1 (slika 6C). Slika 6. Reprezentativne pelete dobijene posle dve nedelje kultivacije 2 x 10 5 ćelija (P4) u hondrogenom medijumu. A) Bojenje Alcian plavim. Glikozaminoglikani u ekstracelularnom matriksu se boje svetlo plavo. Jasno se uoĉavaju obojena jedra ćelija u peleti (uveliĉanje ×20). B) Crvena boja pokazuje homogenu distribuciju kolagena tip 2 u ekstracelularnom matriksu pelete (uveliĉanje ×10). C) Crna boja po obodu pelete predstavlja vizuelizovanu RNK za kolagen tip 1 (uveliĉanje ×10). OdreĊivanjem koliĉine glikozaminoglikana posle digestije peleta kroz sve tri pasaţe, pokazano je da postoji znaĉajna razlika u pogledu njihove biosinteze u odnosu na ćelije gajene u kontrolnom medijumu, ali da izmeĊu pasaţa nema razlika (grafikon 9). 72 0 5 10 15 20 25 30 P4 P6 P8 G A G /D N K kontrola hondrogeneza * * * Grafikon 9. Koliĉina glikozaminoglikana (GAG) u ekstracelularnom matriksu posle dve nedelje hondrogene diferencijacija. Koliĉina GAG je izraţena na koliĉinu DNK. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=6) *p<0,05 5.8. Uticaj N-acetil-L-cisteina na proliferaciju ćelija u kulturi Da bi se odredilo koja koncentracija NAC-a ima pozitivan ili negativan uticaj na proliferaciju ćelija, kulture su tretirane sledećim koncentracijama ovog molekula: 0,1 mM, 1 mM i 2 mM. Uvek je zasejavana i kontrolna kultura bez NAC-a. Efekat NAC-a na broj ćelija u kulturi je ispitivan posle 72 sata od njegovog dodavanja, dok su razliĉiti testovi kojima je ispitivan mehanizam njegovog dejstva raĊeni u razliĉitim, kraćim, periodima po njegovom dodavanju. Pokazano je da 0,1 mM i 1 mM NAC znaĉajno povećava broj ćelija u kulturi i to na istovetan naĉin u svim ispitivanim pasaţama, odnosno tokom celokupnog ispitivanog perioda (grafikon 10). TakoĊe, pokazano je da 2 mM NAC smanjuje broj ćelija u kulturi u P8 (grafikon 10). 73 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 P4 P6 P8 N o rm a li zo v a n b ro j će li ja 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC *** ** *** *** ** ** *** Grafikon 10. Uticaj NAC-a na broj ekpandiranih ćelija, izolovanih iz zubne pulpe, u razliĉitim pasaţama. Broj ćelija posle 72 sata kultivacije sa NAC-om je izraţen kao jediniĉna vrednost u odnosu na zasaĊeni broj ćelija i prikazane kao X SD (n=6) *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. Direktan uticaj NAC-a na broj ćelijskih deoba je odreĊivan korišćenjem CFSE- a, kao i odreĊivanjem brzine ulaska ćelija u S fazu ćelijskog ciklusa, nakon 24 sata deprivacije seruma (gajenjem ćelija u 0.5% FCS). CFSE bojenjem je pokazano da 0,1 mM i 1 mM NAC, u P6, znaĉajno povećavaju broj ćelija koje su se podelile više od 6 puta, dok 2 mM znaĉajno smanjuje njihov broj (grafikon 11). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 <4 deobe 4-6 deoba >6 deoba Ć el ij e k o je s u p ro šl e k ro z o d re Ċ en i b ro j d eo b a ( % ) 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC * * *** Grafikon 11. Procenat ćelija (P6) koje su prošle kroz odreĊeni broj deoba tokom 72h. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=12) *p<0,05, ***p<0,001. 74 1 2 3 4 5 6 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC M F I * * Grafikon 12. Srednji intenzitet fluorescence (MFI) nakon 72 sata kultivacije ćelija obojenih sa CFSE (P6), uz tretman razliĉitim koncentracijama NAC. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=12). *p<0,05 TakoĊe, posle 72h nakon tretmana 0,1 mM NAC-om, došlo je do znaĉajnog smanjenja srednjeg intenziteta fluorescence (MFI) ćelija, dok je nakon tretmana 2 mM NAC-om MFI bio znaĉajno veći u odnosu na ćelije bez NAC-a. Analiza procenta ćelija u pojedinim fazama ćelijskog ciklusa, 12 sati posle dodavanja razliĉitih koncentracija NAC-a, je pokazala da u kulturama sa 0,1 mM koncentracijom NAC-a, ima manje ćelija u G1 fazi, a više ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa, u odnosu na netretirane ćelije (grafikoni 13 i 14). 0 20 40 60 80 100 G1 S G2/M B ro j ć el ij a 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC * * Grafikon 13. Procenat ćelija u G1, S i G2/M fazi ćelijskog ciklusa 12 sati nakon dodavanja 0,1 mM, 1 mM i 2 mM NAC. Ćelije su prethodno sinhronizovane kultivacijom u medijumu sa 0,5 % FCS tokom 24 sata. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=12).* p<0,05. 75 A B C D Grafikon 14. Reprezentativni histogrami koji prikazuju ćelije u pojedinim fazama ćelijskog ciklusa. A) Bez NAC-a. B) 0,1 mM NAC, C) 1 mM NAC, D) 2 mM NAC. Uoĉiti da je površina zone obeleţene kao M2, koja predstavlja broj ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa, najmanja u uslovu bez NAC-a. Data.008 0 200 400 600 800 1000 FSC-H Data.008 0 200 400 600 800 1000 FL2-A M1 M2 M3 Data.008 200 400 FL2-A R1 Histogram Statistics Marker Lef t, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch All 0, 1023 9095 100.00 90.95 230.08 223.52 27.58 205.00 203 M1 178, 229 7382 81.17 73.82 202.77 202.59 4.20 202.00 203 M2 232, 363 721 7.93 7.21 288.34 285.51 14.13 281.00 232 M3 366, 443 942 10.36 9.42 396.84 396.50 4.11 397.00 395 File: Data.008 Log Data Units : Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: Untitled Panel: Untitled Ac quis ition Tube List Acquisition Date: 26-Ju l-11 Gate: G1 Gated Events: 9095 Total Events: 10000 X Parameter: FL2-A (Linear) Data.006 0 200 400 600 800 1000 FSC-H Data.006 0 200 400 600 800 1000 FL2-A M1 M2 M3 Data.006 200 400 FL2-A R1 Histogram Statistics Marker Lef t, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch All 0, 1023 7944 100.00 79.44 232.25 225.50 27.62 205.00 204 M1 178, 229 6309 79.42 63.09 203.11 202.94 4.15 203.00 204 M2 232, 363 762 9.59 7.62 292.68 289.88 13.82 291.00 235 M3 366, 443 831 10.46 8.31 396.34 396.04 3.89 396.00 397 File: Data.006 Log Data Units : Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: Untitled Panel: Untitled Ac quis ition Tube List Acquisition Date: 26-Ju l-11 Gate: G1 Gated Events: 7944 Total Events: 10000 X Parameter: FL2-A (Linear) Data.005 0 200 400 600 800 1000 FSC-H Data.005 0 200 400 600 800 1000 FL2-A M1 M2 M3 Data.005 200 400 FL2-A R1 Histogram Statistics Marker Lef t, Right Events % Gated % Total Mean Geo Mean CV Median Peak Ch All 0, 1023 9221 100.00 92.21 226.52 220.98 26.01 206.00 204 M1 178, 229 7872 85.37 78.72 204.56 204.43 3.65 204.00 204 M2 232, 363 504 5.47 5.04 285.51 282.53 14.64 274.50 232 M3 366, 443 810 8.78 8.10 400.86 400.59 3.73 401.00 396 File: Data.005 Log Data Units : Linear Values Sample ID: Patient ID: Tube: Untitled Panel: Untitled Ac quis ition Tube List Acquisition Date: 26-Ju l-11 Gate: G1 Gated Events: 9221 Total Events: 10000 X Parameter: FL2-A (Linear) 76 5.9. Uticaj N-acetil-L-cisteina na procenat ćelija u apoptozi Analiza vijabiliteta i apoptoze u ekspandiranoj ćelijskoj populaciji pokazuje da je, posle tripsinizacije ćelija, od P4 do P8, njihov vijabilitet bio preko 95%, odnosno, pokazuje da se jako mali procenat ćelija nalazio u ranoj i kasnoj apoptozi. Prikazani rezultati predstavljaju zbirne rezultate dobijene izmeĊu P4 i P8. Moţe se uoĉiti da izmeĊu kultura sa i bez NAC-a nema razlike, osim što je u kulturama sa 2 mM procenat ćelija u apoptozi znaĉajno veći (grafikoni 15 i 16). Grafikon 15. Uticaj razliĉitih koncentracija NAC-a (nakon 24 h inkubacije) na procenat ćelija u apoptozi (ranoj i kasnoj). Vrednosti su prikazane Tukijevim (eng. Tukey) „box and wisker“ dijagramima na kojima je horizontalnom linijom prikazama medijana, pravougaonikom interkvartilni raspon, veritikalnim linijama minimum i maksimum. (n=12).* p<0,05 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC 0 2 4 6 8 10 A n n + P I- /A n n + P I+ p o z it iv n e æ e li je ( % ) * 77 A B C D Grafikon 16. Reprezentativni dot-blotovi koji prikazuju uticaj razliĉitih koncentracija NAC-a (nakon 24 h inkubacije) na procenat ćelija u apoptozi A) Bez NAC-a. B) 0,1 mM NAC, C) 1 mM NAC, D) 2 mM NAC. Uoĉiti da je efekat 2 mM NAC-a na procenat ćelija u apoptozi najizrazitiji 78 5.10. Uticaj N-acetil-L-cisteina na ekspresiju antigena na površini ćelija Analiza ekspresije antigena na površini ćelija je uraĊena samo sa 0,1 mM NAC- om. Nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u pogledu ekspresije ispitivanih markera (grafikon 17). A B 97 98 99 100 101 P4 P6 P8 Ć e li je k o je e k sp r im ir a ju C D 2 9 ( % ) 0 mM NAC 0.1 mM NAC 97 98 99 100 101 P4 P6 P8 Ć e li je k o je e k sp r im ir a ju C D 7 3 ( % ) 0 mM NAC 0.1 mM NAC C D 0 20 40 60 80 100 120 P4 P6 P8 Ć el ij e k o je e k sp ri m ir a ju C D 1 4 6 ( % ) 0 mM NAC 0.1 mM NAC 0 4 8 12 16 20 P4 P6 P8 Ć el ij e k o je e k sp ri m ir a ju C D 1 0 6 ( % ) 0 mM NAC 0.1 mM NAC Grafikon 17. Ekspresija pojedinih površinskih antigena bez i sa 0,1 mM NAC-om. A) CD29, B) CD73, C) CD146, D) CD106. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=6). 79 5.11. Uticaj N-acetil-L-cisteina na broj ćelija koje eksprimiraju ALDH Naši rezultati su pokazali da je 0,1 mM NAC, nakon 72 sata kultivacije ćelija, u P6 povećavao procenat ćelija koje eksprimiraju ALDH. Opseg u kome se kretao procenat ćelija koje pokazuju povišenu aktivnost ALDH (ukupno, sa ili bez NAC-a) je bio veoma razliĉit izmeĊu pojedinih zuba i iznosio od 4,01 do 24,1 bez NAC-a, odnosno 3,15 do 34,5 sa NAC-om. Tokom P4 i P6, NAC je uticao na povećanje broja ćelija koje pokazuju pozitivnu ALDH aktivnost (ALDH+ ćelije). Znaĉajno povećana vrednost za ALDH je pokazana u P6 (grafikon 18). 0 1 2 3 P4 P6 P8 A L D H + ć el ij e 0 mM NAC 0.1 mM NAC ** Grafikon 18. Odnos procenta ALDH+ ćelija izmeĊu kontrole i tretmana 0,1 mM NAC-om. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=6). **p<0,01 Uzorci populacije ćelija koje su imale veći procenat ALDH+ ćelija pokazivali su kraće vreme duplikacije (tabela 1). Tabela 1. Broj ćelija koje eksprimiraju ALDH i vreme udvajanja u kulturi ALDH (%) PDT (sati) Medijana (min-max) 7.1 (4.0 - 24.1) 23.3 (19.2 - 28.5) ALDH/PDT r= - 0.7** Vrednosti aldehid-dehidrogenaze (ALDH) i vremena udvajanja ćelija u kulturi (PDT) nalaze se u negativnoj korelaciji. **p<0,01 80 5.12. Uticaj N-acetil-L-cisteina na aktivnost β-galaktozidaze Daljim ispitivanjim testiran je efekat NAC-a na aktivnost SA-β-Gal. Prethodnim eksperimentima je pokazano da se njegova aktivnost tokom ekspanzije ćelija od P4 do P8 ne menja znaĉajno. Ćelije su tretirane NAC-om u P8 u trajanju od 72 sata. Pokazano je da je 0,1 mM NAC znaĉajno smanjio procenat ćelija kod kojih se moţe detektovati SA-β-Gal, dok je 2 mM NAC doveo do povećanja procenta ovih ćelija (grafikon 19). Grafikon 19. Uticaj razliĉitih koncentracija NAC-a (nakon 72 h inkubacije) na procenat ćelija koje su SA-β-Gal pozitivne. Vrednosti su prikazane Tukijevim (eng. Tukey) „box and wisker“ dijagramima na kojima je horizontalnom linijom prikazama medijana, pravougaonikom interkvartilni raspon, veritikalnim linijama minimum i maksimum (n=12).* p<0.05 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC 0 5 10 15 20 25 B G A L p o z it iv n e æ e li je ( % ) * * 81 5.13. Uticaj N-acetil-L-cisteina na diferencijaciju ćelija izolovanih iz pulpe zuba 5.13.1. Uticaj N-acetil-L-cisteina na osteogenu diferencijaciju Osteogena diferencijacija: Nakon pretretmana NAC-om u trajanju od 72 sata ćelije su gajene u kontrolnom, odnosno osteogenom medijumu. Nakon pet i deset dana, kvantifikovana je aktivnost alkalne fosfataze, a nakon tri nedelje je deponovanje kalcijum-fosfata dokazivano bojenjem Alizarin crvenim. Nakon pretretmana NAC-om u trajanju od 72 sata, ćelije su dostigle konfluencu. Posle pet dana kultivacije u osteogenom medijumu, pokazano je da kulture pretretirane sa 1 i 2 mM NAC-om imaju povećanje aktivnosti AP u odnosu na kultivaciju u osteogenom medijumu bez pretretmana (grafikon 20A). Desetog dana kultivacije u osteogenom medijumu, efekat pretretmana 1 mM i 2 mM NAC-om se i dalje odrţava (grafikon 20B). Na slici 7 je prikazana jedna ploĉa od 26 polja sa kombinacijom svih primenjenih uslova tokom osteogene diferencijacije (P6) kao i kontrolne kulture. Slika 7. Alizarin Red bojenje tokom osteogene diferencijacije. Kontrolne kulture gajene u DMEM/F12 10% FCS su sasvim desno. Kulture bez i sa 0,1, 1 i 2 mM NAC-om su postavljene odozgo na dole. Uoĉiti da je intenzitet boje Alizarin crvenog najslabiji bez pretretmana NAC- om, a najjaĉi sa 2 mM NAC-om. 82 A 0 9 18 27 36 45 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC m ic ro g ra m p N P /m g p ro te in a /m in * * B 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC m ic ro g ra m p N P /m g p ro te in a /m in ** * Grafikon 20. Aktivnost alkalne fosfataze nakon A (5 dana) i B (10 dana) kultivacije bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC-a. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=12), *p<0.05, **p<0.01 83 5.13.2. Uticaj N-acetil-L-cisteina na adipogenu diferencijaciju Da bi pokazali efekat razliĉitih koncentracija NAC-a na adipogenezu, ćelije su pretretirane sa NAC-om 72 sata i nakon toga je dodat adipogeni medijum u trajanju od tri nedelje. Kvantifikacijom Oil red O bojenja, pokazano je da pretretman NAC-om u sve tri koncentracije znaĉajno inhibira formiranje lipidnih kapljica (grafikon 21). Osim toga, pokazano je da se i broj diferenciranih ćelija smanjuje (slika 8A-H). 0 2 4 6 8 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC K o n ce n tr a ci ja O il R ed O ( n o rm a li zo v a n a v re d n o st ) * * * Grafikon 21. Intenzitet Oil Red O boje posle njenog eluiranja iz masnih kapljica. Uoĉiti da se sa povećanjem koncentracije NAC-a, smanjuje intenzitet boje. Vrednost Oil Red O je normalizovana na vrednosti kontrolnog uzorka i prikazana kao X SD (n=12). *p<0.05 84 Slika 8. Oil Red O bojenje ćelija diferenciranih u pravcu adipogeneze, sa razliĉitim koncentracijama NAC-a. A i B) bez NAC-a; C i D) 0,1 mM NAC; E i F) 1 mM NAC; G i H) 2 mM NAC. Uoĉiti smanjenje broja diferenciranih ćelija sa povećanjem koncentracije NAC. 85 5.13.3. Uticaj N-acetil-L-cisteina na hondrogenu diferencijaciju Nakon pretremana NAC-om u trajanju od 72 sata i zasejavanja ćelija u formi peleta u hondrogeni, odnosno kontrolni medijum, evaluiran je uticaj NAC-a na hondrogenu diferencijaciju ekspandiranih ćelija. Nakon dve nedelje, pelete su digestirane i odreĊena je koncentracija GAG. Pokazano je da se sa povećanjem koncentracije NAC-a povećava i koliĉina stvorenih GAG, odnosno da je stimulisano stvaranje ECM (grafikon 22). Pelete nastale u razliĉitim uslovima kultivacije su se bojile Alcian plavim i sadrţale su kolagen tip 2, ali rezultati nisu prikazani jer se svetlosnom mikroskopijom nije videla razlika izmeĊu pojedinih uslova. 0 10 20 30 40 50 60 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC G A G /D N K *** *** ** Grafikon 22. Koncentracija glikozaminoglikana (GAG) u peletama formiranim od ćelija koje su pretretirane razliĉitim koncentracijama NAC-a. Koncentracija GAG je izraţena na koncentraciju DNK. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=12). **p<0,01, ***p<0,001 86 5.14. OdreĊivanje oksidativnog oštećenja lipida i proteina Osnovni poznati efekat NAC-a in vitro je njegovo antioksidativno delovanje. Kako bismo proverili kako NAC utiĉe na stepen oksidativnog oštećenja i na antioksidativnu zaštitu u opisanim uslovima, u kulturi ćelija, ispitali smo stepen lipidne peroksidacije, stepen oksidativnog oštećenja proteina preko nivoa karbonilnih grupa, redoks status u ćeliji na osnovu koncentracije tiolnih (-SH) grupa, kao i aktivnost enzimskih antioksidanata, superoksid-dismutaze (SOD) i katalaze (CAT). 5.14.1. Stepen lipidne peroksidacije Stepen lipidne peroksidacije je odreĊen na osnovu koncentracije malondialdehida (MDA) kao i na osnovu promena u profilu masnih kiselina. Nakon 24 sata tretmana, NAC je dozno zavisno smanjivao koncentraciju MDA, odnosno stepen lipidne peroksidacije, pri ĉemu je taj efekat bio znaĉajan sa 0,1 i 1 mM NAC-om (grafikon 23A). Efekat na smanjenje koncentracije MDA pod dejstvom 0,1 i 1 mM NAC-a se odrţao i posle 48 sati kultivacije (grafikon 23B), na istom nivou statistiĉke znaĉajnosti (p<0,05). 5.14.2. Profil masnih kiselina Pokazano je da se nakon tretmana NAC-om smanjenjuje zastupljenost MUFA (0,1 i 2 mM NAC), a povećava zastupljenost ukupnih i n-6 PUFA (0,1 mM i 1 mM NAC) u ukupnom lipidnom ekstraktu (tabela 2). Promena se pre svega odnosi na povećanje linolne (LA) i dokosaheksaenske masne kiseline (DHA), dok je zastupljenost arahidonske kiseline ostala nepromenjena (tabela 2). Tretman 2 mM NAC-om je doveo do povećanja LA i n-6 PUFA, ali to povećanje nije bilo statistiĉki znaĉajno zbog velikih varijacija izmeĊu populacija ćelija iz razliĉitih zuba. UraĊeni su i masno-kiselinski profili korišćenog seruma, gde je pokazano da je zastupljenost SFA, MUFA i PUFA 41,92%; 28,37% i 29,71%. 87 A B Grafikon 23. Koncentracija malondialdehida (MDA) nakon A (24 sata) i B (48 sati) tretmana razliĉitim koncentracijama NAC-a. Vrednosti su prikazane Tukijevim (eng. Tukey) „box and wisker“ dijagramima na kojima je horizontalnom linijom prikazama medijana, pravougaonikom interkvartilni raspon, veritikalnim linijama minimum i maksimum (n=9), *p<0,05 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC 0.0 0.2 0.4 0.6 M D A n M /m L * * 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 M D A n M /m L * * 88 Tabela 2. Uticaj razliĉitih koncentracija NAC-a na masnokiselinske profile ukupnih lipida 0 mM NAC 0,1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC 16:0 21.93±0.99 22.05± 0.85 24.02±0.45* 23.31±0.90* 16:1 7.02±1.06 5.99±0.65 4.74±1.30 5.90±2.12 18:0 18.27±1.88 19.39±0.84 19.15±1.15 19.66±1.06 18:1 n9 27.03±1.74 23.80±2.08* 24.50±0.49 24.50±1.64* 18:1 n7 4.42±0.21 5.63±1.06 5.19±0.59 5.36±1.02 18:2 7.36±0.51 8.20±0.81* 8.23±1.12 8.53±2.84 20:3 1.39±0,14 1.80±0.38 1.66±0.25 1.72±0.27* 20:4 4.05±0.05 4.40±0.30 4.18±0.48 3.92±0,15 22:4 2.80±0,14 2.70±0.31 2.52±0,15* 2.24±0.97 22:5 2.65±0.53 2.64±0.48 2.42±0.53 2.36±0.45 22:6 2.98±0.20 3.29±0.26* 3.39±0.46 2.49±0.27 SFA 40.20±2.49 41.44±1.56 43.17±0.81 42.97±1.47 MUFA 38.47±2.68 35.42±1.49* 34.42±1.18 35.76±3.15* PUFA 21.22±1.07 23.03±1.05* 22.41±1.83* 21.27±2.57 n-3 5.63±0.73 5.94±0.73 5.81±0.82 4.85±0.61 n-6 15.59±0.36 17.09±0.32*** 16.59±1.08 16.42±2.43 Vrednosti su prikazane kao X SD (n=6) *p<0,05, ***p<0,001 89 5.14.3. Sadržaj karbonilnih grupa Dvadeset ĉetiri sata posle tretmana 0,1 i 1 mM NAC-om, pokazano je znaĉajno smanjenje sadrţaja karbonilnih grupa (grafikon 24A). MeĊutim, 48 sati nakon tretmana, efekat NAC-a na pad sadrţaja karbonilnih grupa se nije odrţao, već je došlo do njihovog blagog povećanja (grafikon 24B). A 0 2 4 6 8 10 12 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC k a rb o n il n e g ru p e n M /m g p ro te in a * * B 0 2 4 6 8 10 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC k a rb o n il n e g ru p e n M /m g p ro te in a Grafikon 24. Koncentracija krabonilnih grupa, A (24 sata) i B (48 sati) nakon tretmana razliĉitim koncentracijama NAC-a. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=9), *p<0,05 90 5.14.4. Sadržaj -SH grupa Iako je NAC, znaĉajan izvor -SH grupa kao i donor cisteina za sintezu glutationa, efekat na sadrţaj -SH grupa je bio varijabilan. Nakon 24 sata, koncentracija NAC-a od 0,1 mM je znaĉajno povećala sadrţaj -SH grupa. Sadrţaj -SH grupa je pokazao tendenciju smanjenja nakon tretmana 1 mM NAC-om, nezavisno od vremena kada je odreĊivan, dok je 2 mM NAC nakon 24 i 48 sati blago povećavao broj -SH grupa (grafikoni 25A i 25B) A B Grafikon 25. Sadrţaj tiolnih grupa: A (24), B (48 sati) nakon tretmana razliĉitim koncentracijama NAC-a. Vrednosti su prikazane Tukijevim „box and wisker“ dijagramima (n=9). *p<0,05 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC 0 10 20 30 40 S H g r u p e M /m l * 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC 0 10 20 30 40 50 S H g ru p e M /m l 91 5.14.5. Aktivnost enzimskih antioksidanata: superoksid-dismutaze i katalaze Naši rezultati pokazuju da se, 24 sata nakon tretmana sa 0,1 mM i 1 mM NAC- om, aktivnost ukupne SOD smanjuje, dok se sa 2 mM NAC-om nije detektovala promena aktivnosti ovog enzima (grafikon 26A). Posle 48 sati znaĉajan je ostao jedino efekat 0,1 mM NAC-a (grafikon 26B). Kada je ukupna aktivnost SOD prikazana kao aktivnost citoplazmatske (Cu,Zn-SOD) i mitohondrijalne (Mn-SOD) superoksid- dismutaze, uoĉava se da 0,1 mM NAC smanjuje aktivnost Cu,Zn-SOD (grafikoni 26C i D), dok 1 i 2 mM NAC smanjuju aktivnost Mn-SOD posle 24 i 48 sati tretmana (grafikoni 26E i F). Nakon 24 sata od tretmana 0,1 i 1 mM NAC-om, aktivnost katalaze se smanjivala (Grafikon 27A), dok je posle 48 sati samo efekat 0,1 mM NAC na smanjenje aktivnosti ovog enzima bio znaĉajan (grafikon 27B). 92 A 24 sata B 48 sati 0 1 2 3 4 5 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC S O D a k ti v n o st U /m g p ro te in a ** * 0 1 2 3 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC S O D a k ti v n o st U /m g p ro te in a ** C D 0 20 40 60 80 100 120 140 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC C u Z n S O D a k ti v n o st (n o rm a li zo v a n a v re d n o st ) ** 0 20 40 60 80 100 120 140 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC C u Z n S O D a k ti v n o st (n o rm a li zo v a n a v re d n o st ) ** E F 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NACM n S O D a k ti v n o st ( n o rm a li zo v a n a v re d n o st ) * *** 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC M n S O D a k ti v n o st ( n o rm a li zo v a n a v re d n o st ) * *** Grafikon 26. Aktivnost superoksid-dismutaze (SOD) posle tretmana razliĉitim koncentracijama NAC-a A) aktivnost ukupne SOD posle 24 sata B) aktivnost ukupne SOD posle 48 sati; C) aktivnost Cu,Zn-SOD posle 24 sata; D) aktivnost Cu,Zn-SOD posle 48 sati E) aktivnost Mn- SOD posle 24 sata; F) aktivnost Mn-SOD posle 48 sati. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=9), *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 93 A 0 4 8 12 16 20 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC C A T a k ti v n o st U /m g p ro te in a ** * B 0 3 6 9 12 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC C A T a k ti v n o st U /m g p ro te in a ** Grafikon 27. Aktivnost katalaze (CAT) A (24 sata) i B (48 sati) posle tretmana razliĉitim koncentracijama NAC-a. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=9), *p<0,05, ** p<0,01 94 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NACR el a ti v n a a k ti v n o st u k u p n e L D H ( P /m g /m l p ro te in a ) * 0 200 400 600 800 1000 1200 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NACR el a ti v n a a k ti v n o st u k u p n e L D H ( P /m g /m l p ro te in a ) * 5.15. Uticaj NAC-a na ekspresiju HIF-1α Procenat ćelija koji je eksprimirao HIF-1α je bio podjednak posle dodavanja NAC-a kao i bez NAC-a, pa je to razlog zašto rezultati nisu prikazani. 5.16. Uticaj NAC-a na relativnu aktivnost ukupne LDH i relativnu zastupljenost LDH izoformi Naši rezultati pokazuju da relativna aktivnost laktat-dehidrogenaze (LDH) nakon 24 i 48 sati posle tretmana 0,1 mM NAC-om, porasla. Koncentracije od 1 i 2 mM NAC su imale samo blag pozitivan efekat na povećanje relativne aktivnosti LDH (grafikon 28). A B Grafikon 28. Relativna aktivnost ukupne LDH izraţena kao površina (P) na gelu / koncentracija proteina, posle A (24 sata) i B (48 sati) tretmana razliĉitim koncentracijama NAC-a. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=9), *p<0,05 Posle razdvajanja izoenzimskih oblika LDH nativnom elektroforezom (slika 9), moţe se uoĉiti da nakon 24-oĉasovnog tretmana 2 mM NAC-om, relativna aktivnost LDH2 95 opada, dok nakon tretmana 0,1 mM i 2 mM NAC-om, relativna aktivnost izoenzimskih oblika 4 i 5 (zbirno) raste. Nakon 48 sati tretmana 1 mM NAC-om, relativna zastupljenost LDH2 opada, a nakon tretmana 0,1 mM raste relativna aktivnost izoenzimskih oblika 4 i 5 (grafikon 29). A 0 20 40 60 80 100 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4+5 R el a ti v n a z a st u p lj en o st L D H i zo fo rm i % 0mM NAC 0.1mM NAC 1mM NAC 2mM NAC * * ** B 0 20 40 60 80 100 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4+5 R el a ti v n a z a st u p lj en o st L D H i zo fo rm i % 0mM NAC 0.1mM NAC 1mM NAC 2mM NAC ** * Grafikon 29. Relativna zastupljenost LDH izoformi izraţena u procentima, A (nakon 24 sata), B (48 sati) tretmana razliĉitim koncentracijama NAC-a. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=9), *p<0,05, ** p<0,01 96 Slika 9. Nativna elektroforeza LDH1-5. Reprezentativan uzorak u P6 (D15 kontrolni uzorak, bez tretmana NAC-om) nakon 24 sata od zasejavanja ćelija. Kada se uporede relativne zastupljenosti LDH izoformi nakon 24 i 48 sati, uoĉavaju se znaĉajne razlike u zastupljenosti pojedinih frakcija u uzorcima bez i sa razliĉitim koncentracijama NAC-a. Do promene relativne zastupljenosti LDH1 izoforme nije došlo (grafikon 30A), dok je relativna uĉestalost LDH2 i LDH3 znaĉajno opala (grafikoni 30 B i C). Relativna zastupljenost LDH4 i LDH5 izoforme je porasla od 24 do 48 sata u svim uslovima, osim posle tretmana 2 mM NAC-om. LDH4+LDH5 LDH3 LDH2 LDH1 97 A B 0 5 10 15 20 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC L D H 1 i zo fo rm a % 24 sata 48 sati 0 5 10 15 20 25 30 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC L D H 2 i zo fo rm a % 24 sata 48 sati *** *** ** C D 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC L D H 3 i zo fo rm a % 24 sata 48 sati * * ** * 0 20 40 60 80 100 0 mM NAC 0.1 mM NAC 1 mM NAC 2 mM NAC L D H 4 + 5 i z o fo r m a % 24 sata 48 sati * ** ** Grafikon 30. Uporedna analiza relativne zastupljenosti LDH izoformi nakon tretmana NAC-om u trajanju od 24, odnosno 48 sati A) Promene u pogledu relativne zastupljenosti LDH1 iziforme; B) Promene u pogledu relativne zastupljenosti LDH2 iziforme; C) Promene u pogledu relativne zastupljenosti LDH3 izoforme; D) Promene u pogledu relativne zastupljenosti LDH4 i LDH5 izoformi. Vrednosti su prikazane kao X SD (n=9), *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 98 6. DISKUSIJA Naši rezultati su pokazali da je iz zubne pulpe mleĉnih zuba dece, metodom tkivnog eksplanta, uzgojena populacija ćelija koja ima visok proliferativni potencijal i moţe da se diferencira u osteoblaste, adipocite i hondrocite. Osim toga, ima fenotipske karakteristike ćelija poreklom od mezoderma i tokom perioda kultivacije od dva meseca ne pokazuje znake starenja: vijabilitet ćelija je bio oĉuvan, jer je ispod 5% ćelija bilo u apoptozi posle tripsinizacije, a izrazita aktivnost -galaktozidaze je bila prisutna u svega 3% ćelija. Zbog toga smatramo da se izolovana populacija ćelija moţe okarakterisati kao populacija mezenhimalnih matiĉnih ćelija iz zubne pulpe mleĉnih zuba dece. Kako je prema literaturnim podacima, u zavisnosti od naĉina izolacije i kultivacije, ta populacija do izvesne mere heterogena, odnosno u nju spadaju ćelije nazvane SHED (Miura i sar., 2003) kao i ćelije nazvane IDPSC (Kerkis i sar., 2006), smatramo da bi naziv koji obuhvata sve populacije ćelija izolovane iz zubne pulpe mleĉnih zuba, zapravo najviše odgovarao ćelijama izolovanim u ovoj studiji. Taj naziv je Dental Tissue Stem Cells - DTSC (Kerkis i Caplan, 2012). Drugi vaţan rezultat dobijen u ovoj studiji je da NAC utiĉe na proliferaciju i diferencijaciju DTSC. Naime, koncentracija od 0,1 mM NAC povećava broj DTSC u kulturi za 20% i to najverovatnije ubrzavajući ćelijski ciklus jedne manje populacije ćelija. Osim toga, rastuća koncentracija NAC-a stimuliše osteogenezu i hondrogenezu, a inhibira adipogenezu. Iako molekularni mehanizam ovih dejstava nije prouĉavan u ovom radu, pokazano je da NAC deluje na redoks status nediferenciranih DTSC. Naime, 0,1 i 1 mM NAC smanjuju oksidativno oštećenje ćelija, ali smanjuju i aktivnost SOD i katalaze, enzima ukljuĉenih u sistem antioksidativne zaštite. Osim toga, na osnovu porasta aktivnosti LDH izoformi 4 i 5, moţemo zakljuĉiti da 0,1 mM NAC utiĉe na stimulaciju glikolize u ćelijama u kulturi, ĉime bi se barem delimiĉno mogla objasniti i njihova brţa proliferacija. 99 6.1. CFU-F test i proliferacija ćelija tokom dugotrajne kultivacije Do sada je puno puta pokazano da u adekvatnim uslovima, jedna CFU-F, nastaje od jedne ćelije, te da su ćelije potomci te jedne ćelije zapravo njeni klonovi (Menicanin i sar., 2010). Primitivnije ćelije formiraju multipotentne, bipotentne ili unipotentne ćelije potomke sa velikim proliferativnim potencijalom. U sluĉaju da ćelija koja je formirala koloniju nije primitivna, presaĊivanjem ćelija koje je saĉinjavaju, kultura se neće nastaviti jer te ćelije nemaju adekvatan proliferativni potencijal. CFU-F test je osnovni i jedinstven naĉin da se in vitro pokaţe koji broj ćelija iz izolovane populacije ćelija ima znaĉajan proliferativni potencijal. Ako CFU-F test posmatramo u svetlu hijerarhijske organizacije hematopoetskog sistema, CFU-F bi mogle da predstavljaju multipotentne progenitore. Naime, MĆH ne mogu formirati kolonije, i mogu se detektovati in vitro samo indirektno, posredstvom teĉnih kultura u kojima proliferišući, tokom duţeg vremena, stvaraju progenitore koji se dokazuju testom formiranja kolonija. Test formiranja kolonija u sistemu hematopoeze ima kliniĉki znaĉaj jer uĉestalost progenitora korelira sa uspehom transplantacije MĆH (Balint i sar., 1999). Na isti naĉin, uĉestalost CFU-F bi trebalo da predstavlja potencijal pojedinih tkiva u pogledu mogućnosti produkcije zadovoljavajućeg broja ćelija koje se mogu iskoristiti za ćelijsku terapiju. S obzirom na ĉinjenicu da su naše ćelije izolovane metodom tkivnog eksplanta, broj kolonija je odreĊivan tek posle posle 10 ili 15 dana primarne migracije ćelija iz fragmenata pulpe, odnosno broj CFU-F je odreĊivan prilikom prvog presejavanja ćelija. Proseĉan broj CFU-F je bio 470 52 na 10000 zasejanih ćelija. Naš rezultat je u skladu sa rezultatima drugih autora (Gronthos i sar., 2000; Yamaza i sar., 2010). Inaĉe je incidenca njihovog nalaza viša nego u koštanoj srţi (Gronthos i sar., 2000; Yamaza i sar., 2010). Vreme duplikacije ćelija u kulturi (PDT) je u proseku od P4 do P8 iznosilo 23,23 sata i nije bilo statistiĉki znaĉajnih razlika izmeĊu pasaţa. Ovaj podatak je u skladu sa literaturnim podacima (Pivoriuūnas i sar., 2010), ali se i razlikuje u zavisnosti od sistema kultivacije koji su primenjeni tokom eksperimenata. Pokazano je da PDT moţe da bude od 18 (Nakamura i sar., 2009) do 41,3 sata (Suchanek i sar., 2010). TakoĊe, pokazano je da su ćelije izolovane iz zubne pulpe mleĉnih zuba proliferisale brţe i imale veći kumulativni PD u odnosu na DPSC i MMĆ iz koštane srţi (Huang i 100 sar., 2009). U našem sistemu kultivacije ćelije su u periodu od 30 dana prošle u proseku kroz 31 deobu i to bez usporavanja ćelijskog ciklusa, što ukazuje da izolovane ćelije imaju visok proliferativni potencijal. Korišćenjem BrdU testa je pokazano da je u P4, tokom 12 sati kultivacije 70% ćelija prošlo kroz S fazu ćelijskog ciklusa, a u P8, 78% ćelija. Dobijene proseĉne vrednosti su u saglasnosti sa publikovanim rezultatima sliĉnih eksperimenata (Miura i sar., 2003; Nakamura i sar., 2009). Moţemo pretpostaviti da povećanje broja ćelija u S fazi ciklusa, u istom periodu, zapravo znaĉi da je došlo do ubrzanja ćelijskog ciklusa barem jedne populacije ćelija. Rezultati dobijeni praćenjem ćelijskih deoba uz pomoć boje CFSE, pokazuju da se meĊu ćelijama u kulturi nalazi oko 12% ćelija koje su se za 72 sata podelile jedan do ĉetiri puta, dok se ostatak ćelija podelio više od ĉetiri puta. Ovi rezultati su zanimljivi jer pokazuju da je izolovana populacija ćelija heterogena ne samo po ekspresiji antigena, već i po brzini proliferacije. Brzina proliferacije je funkcionalna karakteristika ćelija koja bi mogla da bude jedan od kriterijuma za razdvajanje manje i više primitivnih ćelija u kulturi, jer se moţe pretpostaviti da se primitivnije ćelije brţe dele. TakoĊe pokazuje da PDT, kao opšte prihvaćeni naĉin prikazivanja brzine ćelijske proliferacije u kulturama adherentnih ćelija, pokazuje samo prosek vremena potrebnog za deobu pojedinih ćelijskih populacija. Populacija ćelija u našem radu je bila heterogena i po ekspresiji CD146 antigena, koji je jedan od markera onih ćelija meĊu kojima je frekvenca CFU-F veća (Shi i Gronthos, 2003). Ukrštanjem bojenja CFSE i CD146 nisu dobijeni rezultati koji bi ukazali da se populacije CD146+ i CD146- ćelija razlikuju po brzini proliferacije (rezultati nisu prikazani). Podaci koji ukazuju na razliĉitu brzinu deobe MMĆ do sada nisu zabeleţeni u literaturi. U ovom radu je takoĊe pokazano da se populacije DTSC izolovane iz pojedinih zuba razlikuju na osnovu aktivnosti ALDH. U pojedinim uzorcima se aktivnost ALDH mogla detektovati u svega 4% ćelija, dok se u drugim uzorcima aktivnost detektovala u 24% ćelija. Kako je pokazano da je veća aktivnost ALDH u negativnoj korelaciji sa vremenom udvajanja ćelija u kulturi, moţe se pretpostaviti da primitivnije ćelije, koje imaju višu aktivnost ALDH, brţe proliferišu. Prema literaturnim podacima, aktivnost ALDH se razlikuje meĊu populacijama ćelija. MeĊu MMĆ poreklom iz krvi pupĉane vrpce 10% ćelija je ALDH pozitivno, odnoso 8% ćelija ima niţu, a 2% ćelija ima visoku ALDH aktivnost (Nagano i sar., 2010). Kada su u pitanju MĆH, bilo da se radi o 101 koštanoj srţi ili krvi pupĉane vrpce procenat visoko ALDH pozitivnih ćelija se kreće izmeĊu 1% i 5% (Keller, 2009), dok procenat u kancerskim ćelijskim linijama varira i moţe biti veoma visok – ĉak do 94% u sluĉaju A549-ćelijske linije poreklom od adenokarcinoma pluća (Moreb i sar., 2007). Do sada u literaturi nije opisana aktivnost ALDH u DTSC, niti je aktivnost ovog enzima dovoĊena u vezu sa brzinom proliferacije ćelija. S obzirom da je u kulturama ćelija od pojedinih zubnih pulpi aktivnost ALDH vrlo visoka, moţemo da pretpostavimo da su u tim pulpama, bile oĉuvane veoma primitivne ćelije. Ukoliko se uporedi poĉetni broj ćelija koji se moţe dobiti metodom tkivnog eksplanta iz pulpe jednog zuba (0.3 - 3 x 10 5 ćelija ukupno i od toga su 4-5% matiĉne ćelije) sa brojem ćelija koji se moţe dobiti iz koštane srţi (6 x 106 ćelija / mL, a od toga su 0.01% matiĉne ćelije) ili lipoaspirata (2 x 106 ćelija / mL, a od toga su 10% matiĉne ćelije), jasno je da je poĉetni broj ćelija u zubnoj pulpi veoma mali. MeĊutim, nakon ĉetvrte pasaţe DTSC dobija se oko 100 x 106 što predstavlja dovoljan broj ćelija za razliĉite terapijske namene (Emadedin i sar., 2012; Martin i sar., 2010). Kako je njihov proliferativni potencijal veći od MMĆ izolovanih iz koštane srţi (Gronthos i sar., 2000), a PDT kraći od MMĆ izolovanih iz masnog tkiva (naši neobjavljeni rezultati), moţe se smatrati da je zubna pulpa mleĉnih zuba dobar izvor matiĉnih ćelija za primenu u praksi. 6.2. Ekspresija površinskih antigena tokom kultivacije Naši rezultati su pokazali da je ekspresija CD44, CD29, CD90, CD73 i kolagena tip 1, homogena u izolovanoj populaciji DTSC. U odnosu na ekspresiju CD106, STRO- 1, i CD146, kultivisane ćelije su bile heterogene i manje od 10% ćelija je eskprimiralo CD106 i STRO-1, dok je ekspresija CD146 markera bila veoma varijabilna izmeĊu zuba i pokazivala trend opadanja sa povećanjem broja pasaţa. DTSC nisu eksprimirale CD34 antigen, karakteristiĉan za nezrele ćelije hematopoetske loze. Vaţnost ovog antigena je mnogo veća prilikom izolacije MMĆ iz koštane srţi, s obzirom da se prilikom uzorkovanja ćelija iz tog izvora, uvek dobije populacija koja sadrţi i MMĆ i MĆH. Bez obzira na naĉin izolacije primarne ćelijske populacije iz zubne pulpe, svi do sada opisani postupci, kao rezultat imaju umnoţavanje populacije ćelija koja je heterogena po svom fenotipu (Miura i sar., 2003; Kerkis i sar., 2006). Ćelije zubne 102 pulpe koje istovremeno imaju visok proliferativni potencijal i migratornu sposobnost su MMĆ, periciti i endotelne ćelije. Antigeni praćeni u našem sistemu kultivacije, i preporuĉeni kao markeri mezenhimalnih matiĉnih ćelija, nisu eksprimirani samo na ovoj populaciji ćelija. Tako je pokazano da CD146 u kulturi eksprimiraju i periciti i endotelne ćelije (Shi i Gronthos, 2003; Miura i sar., 2003; Siemerink i sar., 2012). STRO-1 eksprimiraju periciti zubne pulpe i koštane srţi, ali i ćelije koje formiraju CFU- F, a za koje je pokazano da su multipotentne (Kaneko i sar., 2009). CD106 je marker aktivisanih endotelnih ćelija, a eksprimiraju ga i glatko-mišićne ćelije i periciti (Garmy- Susini i sar., 2005). S obzirom da se sva tri molekula nalaze na pericitima, moţemo pretpostaviti da je u populaciji ćelija izolovanoj u našem radu svakako bila znaĉajna populacija pericita, ali se ne moţe zanemariti ni pretpostavka da su naše kulture inicijalno sadrţale i nešto endotelnih ćelija. Pretpostavka da smo metodom tkivnog eksplanta izolovali populaciju ćelija koju u znaĉajnom procentu saĉinjavaju periciti je u skladu sa sve većim brojem literaturnih podataka koji identifikuju pericite kao mezenhimalne matiĉne ćelije (Covas i sar., 2008; Chen i sar., 2009; Spath i sar., 2010). Ono što bi se sa velikim stepenom sigurnosti moglo tvrditi jeste da izolovanu populaciju ćelija ĉine multipotentni progenitori koji ne eksprimiraju markere matiĉnih ćelija hematopoeze, a koje karakterišu markeri koji u isto vreme identifikuju i pericite i MMĆ. Kultivacijom ćelija od P4 do P8 nije došlo do promena u ekspresiji navedenih antigena, osim blagog smanjenja populacije ćelija koja je eksprimirala CD146. Taj nalaz je u skladu sa literaturnim podacima koji takoĊe ukazuju da tokom dugotrajne kultivacije (od P6) dolazi do smanjenja populacije CD106 i CD146 pozitivnih ćelija (Halfon i sar., 2011). Zanimljivo je primetiti da ukoliko bi jedna od navedenih populacija ćelija (CD146+, CD146- , CD106+, CD106-, STRO-1+, STRO-1-) imala veći proliferativni potencijal od drugih populacija, odnosno ukoliko bi bila manje diferencirana, tokom dugotrajnog pasaţiranja bi njena zastupljenost trebalo da raste. Ni u našem eksperimentalnom sistemu, a ni prema literaturnim podacima takva pojava nije zapaţena i opisana. 103 6.3. Diferencijacija DTSC Naši rezultati pokazuju da su se izolovane DTSC kroz sve ispitivane pasaţe (P4 do P8) uspešno diferencirale u pravcu osteoblasta, adipocita i hondrocita. Do sada objavljeni podaci nisu konzistentni u pogledu taĉnog broja deoba koji bi ĉinio graniĉnu vrednost posle koje ćelije gube multipotenost. Verovatno je da starenje ćelija u kulturi zavisi od više faktora u koje spada kako kvalitet primarne ćelijske populacije, tako i vrsta medijuma i prisutni faktori rasta. Patel i saradnici (2009) su pokazali da iako je tokom kultivacije DPSC dolazilo do promena na nivou ekspresije razliĉitih molekularnih markera i ćelijske morfološke kompleksnosti, kapacitet za diferencijaciju tokom kultivacije (sve do pasaţe 15) se nije menjao. Ipak, u velikom broju radova, se naglašava da sa starenjem ćelija u kulturi opada potencijal hondrogene i adipogene diferencijacije, a raste potencijal ka osteogenezi. Tako je na primer, pokazano da se adipogeni i osteogeni potencial MMĆ poreklom iz koštane srţi ne menja sve do 15. pasaţe, opada oko 20. pasaţe i znaĉajno se gubi nakon 30. pasaţe (Kim i sar., 2009). Da uslovi kultivacije znaĉajno utiĉu na mogućnost diferencijacije, ukazuje i podatak, da gajenje ćelija na podlozi presvuĉenoj kolagenom tipa 1, znaĉajno produţava period u kome se uoĉava multipotentnost primarne ćelijske populacije (Ksiazek i sar, 2009). Sudeći po aktivnosti alkalne fosfataze, nakon 5 i 10 dana, ali i površini koju zauzima mineralizovani matriks tokom osteogene indukcije, diferencijacija u smeru osteogeneze je intenzivna nezavisno od pasaţe u kojoj je posmatrana. Naši rezultati su u potpunosti u korelaciji sa rezultatima iz literature. Miura i saradnici su pokazali (2003) da nakon ĉetvoronedeljne ekspanzije, SHED imaju sposobnost formiranja Alizarin Red pozitivnih nodusa, ekspresije AP, ali i drugih markera koštanog tkiva. U našim kulturama je oko 20% ćelija imalo sposobnost da se diferencira u adipocite sa prepoznatljivim masnim kapljicama. Brojni literaturni podaci ukazuju na to da SHED pokazuju slab potencijal za adipogenu diferencijaciju u odnosu na matiĉne ćelije poreklom iz koštane srţi (Miura i sar., 2003; Yamaza i sar., 2010). Nakon formiranja hondrogenih peleta u medijumu za hondrogenu diferencijaciju, dokazana je intenzivna sinteza kolagena tip 1 i tip 2, a potom i sulfonovanih glikozaminoglikana što ukazuje na potencijal izolovanih ćelija da formiraju ekstracelularni matriks karakteristiĉan za fibroznu hrskavicu. U literaturi 104 nema mnogo podataka o hondrogenom potencijalu DTSC, ali je pokazano da su se IDPSC uspešno diferencirale u hondrocite (Kerkis i sar., 2006). Diferencijacija DTSC u našim uslovima, pokazuje da tokom višenedeljne ekspanzije ove ćelije pokazuju oĉuvan trilinijski diferencijacioni potencijal. 6.4. NAC povećava broj ćelija u kulturi Poznato je da je nekontrolisano/preterano stvaranje ROS, kao i reaktivnih radikala azota (ili drugih reaktivnih molekula) osnovni faktor nastanka oštećenja razliĉitih molekula u ćelijama (Valko i sar., 2007). Gledano sa fiziološkog aspekta, ćelije koje bi trebalo da imaju najbolje mehanizme zaštite su matiĉne ćelije, ĉijom proliferacijom i diferencijacijom tokom ĉitavog ţivota jedinke (kod ĉoveka u proseku oko 70 godina), organizam obnavlja i reparira tkiva ĉije se terminalno diferencirane ćelije ne obnavljaju i koje imaju relativno kratak ţivotni vek. Na primeru MĆH, na osnovu in vivo i in vitro istraţivanja moţe se zakljuĉiti da su ove ćelije smeštene i niše sa niskom koncentracijom kiseonika od 0,1-1% (Hermitte i sar., 2006) kao i da imaju mali broj mitohondrija koje su izvor ROS (Chen i sar., 2008). In vitro je jasno pokazano da ove ćelije na 1-3% O2 mogu da se samoobnavljaju i proliferišu, dok na 20% O2 proliferišu, diferenciraju se i nestaju (Kovaĉević Filipović i sar., 2007). Mnogi aspekti fiziologije MMĆ su još uvek nejasni, pa tako i mikrosredina u kojoj se nalaze in vivo. Ukoliko je taĉna pretpostavka da se MMĆ nalaze uz zidove krvnih sudova (Ishikawa i sar., 2012), onda bi ove ćelije, in vivo, verovatno imale metabolizam u kome se ATP delom dobija i u Krebsovom ciklusu. Sa druge strane, verovatno bi imale visok stepen antioksidativne zaštite koja bi morala da obezbedi njihovo normalno funkcionisanje kako u uslovima fiziološke ravnoteţe organizma, tako i u uslovima oštećenja tkiva, kada postoji inflamacija i kada su MMĆ neophodne za ponovno uspostavljanje funkcije oštećenog tkiva. U tim uslovima koji podrazumevaju hipoksiju, stvara se više ROS i ćelije moraju da imaju aktivirane sisteme antioksidativne zaštite. TakoĊe je jasno da kultivacija ćelija menja njihove fiziološke osobine i da se rezultati dobijeni in vitro ne mogu direktno primeniti i objasniti karakteristike ćelija in vivo. MeĊutim, ekspanzija razliĉitih ćelija in vitro je fascinantna osobina, koja ĉini se, otvara vrata mnogim vrstama terapija koje ranije nisu bile moguće, ili u najmanju ruku, omogućava ispitivanje farmakoloških supstanci na brz i etiĉki prihvatljiv naĉin, što svakako moţe 105 da dovede do brţeg napretka u medicini. Uslovi u kojima se vrši ekspanzija ćelija nisu standardizovani i zavise od mnogih faktora. Iako je ekspanzija na 20% O2 najĉešće primenjivana, mnogi radovi ukazuju da je oĉuvanje „izvorne“ prirode matiĉnih ćelija, ili bilo kojih drugih ćelija organizma, moguće samo u uslovima adekvatne koncentracije O2, odnosno one koncentracije u kojoj se ispitivane ćelije nalaze i u organizmu (Ivanović, 2009). TakoĊe je pokazano da uslovi niskih koncentracija O2 mogu uspešno da se imitiraju dodavanjem NAC-a (Fan i sar., 2008). Osim toga, ukoliko se ekspandirane ćelije pretretiraju niskim koncentracijama O2 ili NAC-om, one bivaju bolje „pripremljene“ za transplantaciju i samim tim postiţu bolje efekte u regeneraciji ili reparaciji oštećenih tkiva (Song i sar., 2010; Leroux i sar., 2010). Sedamdeset dva sata posle dodavanja 0,1 mM NAC-a u kulture DTSC, broj ćelija je u proseku bio za ĉetvrtinu veći nego u kulturama bez NAC-a. Tretman 1 mM NAC-om je takoĊe povećavao broj ćelija u kulturi, ali nešto slabije u odnosu na 0,1 mM NAC. Ovi rezultati se mogu objasniti time da NAC deluje stimulativno na proliferaciju (skraćujući ćelijski ciklus) jedne ćelijske populacije u okviru heterogene grupe ćelija u našem sistemu kultivacije. Naime, u našem radu je pokazano da se posle dodavanja NAC-a, jedna populacija ćelija (obojena sa CFSE), podeli veći broj puta u odnosu na drugu populaciju. Taj nalaz je potkrepljen i rezultatima koji pokazuju da se 12 sati posle dodavanja NAC-a u kulture, povećava populacija ćelija koja se nalazi u S fazi ćelijskog ciklusa. Osim toga, pokazali smo da 0,1 mM i 1 mM NAC ne utiĉu na broj ćelija u apoptozi. I drugi autori su pokazali da NAC u koncentracijama 0,1 i 1 mM već posle drugog dana tretmana MMĆ poreklom iz koštane srţi povećava proliferaciju ćelija 1,3 odnosno 1,9 puta (Ahmadi-Ashtiani i sar., 2012). TakoĊe, NAC je u koncentracijama od 0,125 mM, 0,25 mM i 0,5 mM dozno zavisno povećavao proliferaciju MMĆ poreklom iz koštane srţi (Ji i sar., 2011). Sun i saradnici (2013) su pokazali da je povećanje proliferacije MĆ poreklom iz masnog tkiva u grupi tretiranoj bFGF-om i antioksidantima (NAC-om i askorbinskom kiselinom) praćeno znaĉajno većim brojem ćelija u S fazi ćelijskog ciklusa, rezultat smanjenja nivoa inhibitora ciklin-zavisnih kinaza (CDK), odnosno povećanja koncentracije samih CDK. MeĊutim, pozitivan efekat u pogledu povećanja broja ćelija (ćelijska linija L6) tretiranih NAC-om nije se manifestovao promenom broja ćelija koje se nalaze u S fazi ćelijskog ciklusa (Kim i sar., 2006). Moţemo pretpostaviti da upravo stimulacija proliferacije ćelijske linije ne 106 mora da ima isti mehanizam, jer je ta populacija ćelija homogena po svojim osobinama, dok je u sluĉaju primarnih ćelijskih kultura populacija heterogena i efekat NAC-a ne mora da bude isti na svim ćelijama. Dodavanje 2 mM NAC-a je u P8 smanjivalo proliferaciju matiĉnih ćelija, i taj efekat se video i kroz smanjenje broja ćelija koje prolaze kroz više od 6 deoba za 72 sata. TakoĊe, 2 mM NAC je nakon 24 sata kultivacije povećavao broj ćelija u apoptozi. U literaturi su primenjivane razliĉite koncentracije NAC-a u in vitro sistemu, i moţe se uoĉiti da je efekat zavistan ne samo od koncentracije NAC-a, već i od tipa ćelija na kojima je efekat ispitivan. Sa druge strane, ukoliko se ima u vidu da tioli male molekulske mase pokazuju bivarijantno delovanje, što znaĉi da su toksiĉni u srednjim, ali ne i u niskim i visokim dozama mogu se objasniti i donekle inkonzistentni rezultati razliĉitih studija. U radu Held i Biaglow-a (1994), na V79 ćelijama poreklom od kineskog hrĉka, je pokazano da jedino za NAC nije karakteristiĉan takav dvofazni odgovor, te da je NAC za ćelije toksiĉan u koncentracijama koje su ≥ od 2 mM. S druge strane, neke studije ukazuju da NAC ĉak i u višim koncentracijama (20 mM) ne izaziva proces apoptoze u kulturama DPSC, bilo da se radi o diferenciranim ili nediferenciranim ćelijama (Paranjpe i sar., 2007). Zapravo je pokazano da prilikom kontakta sa biomaterijalom, ima ĉak i protektivan efekat na DPSC (Paranjpe i sar., 2007). Ovi rezultati pokazuju da efekat NAC-a znaĉajno zavisi od drugih uslova kutivacije, ali da taj isti efekat moţe da se primeni u praksi. 6.5. NAC povećava aktivnost ALDH u jednoj populaciji ćelija u kulturi Naši rezultati pokazuju da je 0,1 mM NAC u P6 povećao procenat ćelija u kojima se moţe detektovati visoka aktivnost ALDH, a u isto vreme je dovodio do ubrzanja ćelijskog ciklusa jedne populacije ćelija. Razliĉite ćelije eksprimiraju razliĉite izoforme ALDH, ali koja je izoforma aktivna u ćelijama zubne pulpe nije do sada pokazano. Poznato je da visoka aktivnost ALDH3A1 izoforme stimuliše proliferaciju ćelija i da je povezana sa otpornošću ćelija na citostatske i citotoksiĉne efekte lipidnih peroksida (Muzio i sar., 2012). Mogući mehanizam se zasniva na sposobnosti ALDH da metaboliše neke endogene supstrate koji nastaju kao rezultat normalnog ćelijskog metabolizma (4-hidroksinonenal), a koji utiĉu na ekspresiju gena koji su ukljuĉeni u 107 regulaciju proliferacije (Muzio i sar., 2012). In vitro eseji enzimske aktivnosti ukazuju na to da je humana ALDH7A1 osetljiva na oksidaciju i efikasnost enzima moţe bar delimiĉno biti obnovljena dodavanjem β-merkaptoetanol-a (Brocker i sar., 2011). Kako je u našem eksperimentalnom sistemu pokazano, NAC smanjuje oksidativno oštećenje u ćelijama pa bi se na taj naĉin moglo objasniti kako dodavanje NAC-a povećava procenat ćelija koje eksprimiraju ALDH. Moguće je pretpostaviti da je aktivacija ALDH u pojedinim ćelijama povezana sa ubrzanjem njihovog ćelijskog ciklusa i povećanjem ukupnog broja ćelija u kulturama. Što se tiĉe fenotipskih markera, dodavanje NAC-a u medijum za kultivaciju nije znaĉajno uticalo na njihovu ekspresiju. 6.6. NAC smanjuje aktivnost SA-β-gal in vitro Dugotrajna kultivacija ćelija in vitro, neminovno, posle odreĊenog broja pasaţa, indukuje akumulaciju ćelija koje pokazuju znake starenja. Ako -galaktozidazu oznaĉimo kao vaţan marker starenja in vitro, onda je zakljuĉak da DTSC tokom kultivacije, do osme pasaţe, nisu pokazivale znaĉajnije znake starenja. Drugaĉija slika je dobijena nakon tretmana ćelija NAC-om. Nezavisno od pasaţe, 0,1 mM NAC je uticao da se procenat SA-β-gal pozitivnih ćelija smanji, dok je 2 mM NAC znaĉajno uticao na povećanje broja ćelija koje su SA-β-gal pozitivne. To bi moţda donekle moglo da objasni dobijeno smanjenje proliferacije, odnosno, smanjenje broja ćelija koje su prolazile kroz veći broj deoba, u uslovima tretmana 2 mM NAC-om. U literaturi je pokazano da iako je sa diferencijacijom indukovanih pluripotentnih matiĉnih ćelija došlo do povećanja broja ćelija koje su SA-β-gal pozitivne, tretman NAC-om je tokom diferencijacije znaĉajno uticao na smanjenje broja starih ćelija, što ukazuje na protektivan efekat NAC-a kada je u pitanju oksidatvni stres in vitro (Berniakovich i sar., 2012). Rezultati dobijeni primenom NAC-a u uslovima prekomerne ekspresije Wnt3a (ubrzava starenje) u MMĆ poreklom iz koštane srţi, su ukazali da ROS imaju znaĉajnu ulogu tokom starenja MĆ in vitro. NAC je, naime, smanjujući stvaranje ROS, znaĉajno smanjio procenat SA-β-gal pozitivnih ćelija, mada sam efekat NAC-a, bez indukcije starenja, nije ispitivan (Zhang i sar., 2013). Voghel i saradnici (2008) su zakljuĉili da ukoliko nije došlo do ireverzibilnog oštećenja 108 endotelnih ćelija u uslovima oksidativnog stresa, kontinuirana primena NAC-a dovodi do inhibicije starenja ćelija i to mehanizmom koji ukljuĉuje aktivaciju katalitiĉke subjedinice telomeraze i prolaznu stabilizaciju telomera. Svi navedeni rezultati ukazuju da je jedan od efekata NAC-a, svakako smanjeno nakupljanje lizozoma u ćelijama, što moţe da bude povezano, kao što je ranije objašnjeno, i sa ubrzanjem proliferacije jedne ćelijske populacije. 6.7. NAC stimuliše osteogenu i hondrogenu, a inhibira adipogenu diferencijaciju NAC je dozno zavisno, u svim ispitivanim periodima po indukciji osteogeneze povećavao kako aktivnost AP, tako i koliĉinu deponovanog kalcijum-fosfata, što znaĉi da je tokom trodnevnog pretremana NAC-om veći broj ćelija u kulturi zadrţao ili stekao potencijal da se diferencira u osteoblaste. I drugi podaci iz literature pokazuju da NAC stimuliše osteogenezu. Tako je tretman NAC-om (10-30 mM) stimulisao kako ranu tako i kasnu fazu osteoblastne diferencijacije ćelija dobijenih enzimskom digestijom frontalne i parijetalne kosti lobanje neonatalnih miševa (Jun i sar., 2008). Dodavanje NAC-a u medijum za osteogenu diferencijaciju je stimulisalo i osteogenezu MMĆ izolovanih iz koštane srţi. Došlo je do povećanja aktivnosti alkalne fosfataze, kao i mRNK za kolagen tip 1 i osteopontin (Ji i sar., 2011). Nasuprot našim rezultatima, NAC je i u bazalnom medijumu stimulisao mineralizaciju i aktivnost alkalne fosfataze (Ji i sar., 2011). Tretman DPSC samo sa NAC-om, ili NAC-om i agensima koji su ukljuĉeni u proces osteogene diferencijacije znaĉajno je povećao ekspresiju gena za osteopontin, osteoklacin i dentalni sijaloprotein. U bazalnom medijumu NAC je stimulisao proliferaciju i diferencijaciju ćelija (Paranjpe i sar., 2007). Radeći na stromalnim ćelijama poreklom iz koštane srţi, Ji sa saradnicima (2011) je pokazao da kada je NAC dodat u medijum za diferencijaciju, znaĉajno povećava osteogenu diferencijaciju, kako tokom rane induktivne faze, tako i tokom faze kada dolazi do mineralizacije. Svi navedeni podaci ukazuju na to da NAC stimuliše diferencijaciju MMĆ ka osteoblastima. Pretretman NAC-om u trajanju od 72 sata, je dozno zavisno, inhibirao diferencijaciju DTSC u adipocite. Sliĉno, Kanda i saradnici (2011), su posle petodnevnog pretretmana MMĆ poreklom iz koštane srţi, 5 mM NAC-om, dobili smanjenje adipogene diferencijacije. NAC je, mehanizmom koji se zasniva na inhibiciji 109 formiranja ROS, inhibirao i akumulaciju masnih kapljica tokom finalne diferencijacije preadipocita (Calzadilla i sar., 2011). Dodavanje NAC-a u medijum za adipogenu diferencijaciju dovelo je do inhibicije adipogeneze (Ji i sar, 2011). Naime, došlo je do smanjenja ekspresije markera adipogeneze LPL, FABP4 i PPARγ na nivou mRNK, kao i inhibicije akumulacije lipidnih kapljica u ćelijama tokom diferencijacije (Ji i sar., 2011). Zanimljivo je da je sliĉan trend u pogledu delovanja NAC-a u njihovom sistemu kultivacije primećen i nakon gajenja ćelija u bazalnom medijumu, što u našem sistemu nije bilo sluĉaj. Moţe se zakljuĉiti da je NAC u svim opisanim uslovima inhibirao adipogenezu. Pretretman NAC-om je znaĉajno, dozno zavisno, stimulisao sintezu glikozaminoglikana tokom hondrogene diferencijacije DTSC. Dve nedelje nakon formiranja hondrogenih peleta u medijumu za hondrogenu diferencijaciju, pokazana je intenzivna sinteza kolagena 2, meĊutim, poreĊenje histoloških preparata nije moglo da da jasnu sliku o efektima NAC-a. Pokazano je da primena niskih koncentracija O2 in vitro utiĉe na pojaĉanje procesa glikolize u MMĆ poreklom iz koštane srţi i da je to mehanizam koji je vaţan za stimulaciju hondrogeneze in vitro (Pattappa i sar., 2011). Ukoliko se efekti in vitro primene niskih koncentracija kiseonika i NAC-a mogu porediti, onda bi to bio naĉin da se objasni izrazito pozitivan efekat NAC-a na hondrogenu diferencijaciju. Nakon analize dinamike hondrogeneze kod miševa tretiranih NAC-om od dana roĊenja pa do druge odnosno treće nedelje ţivota, utvrĊeno je da je tretman NAC-om stimulisao sintezu proteoglikana i smanjio procenat hipertrofiĉnih hondrocita in vivo (Morita i sar., 2007). Kako je NAC i u našem eksperimentalnom sistemu, ali i in vivo stimulisao hondrogenezu, moţemo smatrati da je njegov pozitivan uticaj na hondrogenu diferencijaciju DTSC dosta izvestan. Nedavno su Sun i saradnici (2013) pokazali da je šestodnevni pretretman kombinacijom antioksidanasa (NAC i askorbinska kiselina) MMĆ poreklom iz masnog tkiva, koje su gajene u medijumu u koji je dodat bFGF, doveo do stimulacije osteogeneze, adipogeneze i hondrogeneze. Intenzivirana diferencijacija je detektovana kako histohemijski tako i na nivou povećanja ekspresije molekularnih markera diferencijacije. Efekat stimulacije diferencijacije je objašnjen ĉinjenicom da je sam bFGF uticao na stimulaciju diferencijacije, dok je dodavanje antioksidanata dodatno amplifikovalo taj proces (Sun i sar., 2013). 110 6.8. NAC smanjuje oksidativno oštećenje proteina i lipida Naši rezultati pokazuju da dodavanje NAC-a u niţim koncentracijama (0,1 i 1 mM) posle 24 sata smanjuje stepen oksidativnog oštećenja lipida (smanjena je koncentracija MDA) i proteina (smanjen sadrţaj karbonilnih grupa), dok sadrţaj SH grupa raste. Potvrdu inhibicije lipidne peroksidacije smo dobili i analizom masno- kiselinskih profila nakon tretmana NAC-om. Znaĉajno povećanje udela PUFA u ukupnom masno-kiselinskom profilu ide u prilog ĉinjenici da NAC ispoljava protektivno delovanje na lipide, direktno i/ili indirektno utiĉući na smanjenje lipidne peroksidacije. Posle 48 sati, efekat 0,1 i 1 mM NAC-a se odraţava samo na sniţenu koncentraciju MDA. NAC u koncentraciji od 2 mM u proseku ima sliĉne efekte kao i prethodne vrednosti, ali je varijacija izmeĊu pojedinih uzoraka znaĉajno veća, te rezultati nisu znaĉajni. Ovi rezultati su u skladu sa prethodnim nalazima da NAC u koncentracijama koje su veće od 10-3 mM znaĉajno smanjuje oksidativni stres, konkretno nastanak superoksid anjon-radikala (O2 ·- ) u primarnim kulturama angiotenzin II-stimulisanih vaskularnih glatko-mišićnih ćelija (Luo i sar., 2009) i O2 ·- i H2O2 u MĆH (Fan i sar., 2008). Donekle drugaĉiji su rezultati Samuni i saradnika (2013) koji su pokazali da NAC efikasno uklanja hidroksil-radikal (OH . ), dok je uticaj NAC na neutralizaciju superoksid-anjon-radikala, vodonik- peroksida i peroksinitrita ostao nedovoljno ispitan. TakoĊe je pokazano da 0,1 mM NAC znaĉajno poboljšava redoks status u ćelijama (povećava nivo -SH grupa), bilo putem direktnog povećanja koncentracije cisteina u ćelijama, ili indirektno povećanjem koncentracije glutationa (Samuni i sar., 2013), što je u saglasnosti sa našim rezultatima. Fan i saradnici (2008) su ukazali na mogućnost da je sniţavanje lipidne peroksidacije NAC-om u uslovima normoksije posledica porasta koncentracije GSH, pa samim tim i povećanja aktivnosti GSH zavisne GPx, koju je u odnosu na katalazu u uslovima normoksije lakše indukovati. U svetlu brojnih radova o efektima NAC-a na smanjenje oštećenja izazvanih slobodnim kiseonikovim radikalima, moţemo da zakljuĉimo da dobijeni rezultati ukazuju na direktno ili indirektno neutrališuće delovanje NAC-a na ROS, i poslediĉno smanjenje oštećenja lipidnih i proteinskih molekula, a povećanja tiolnih grupa u ćelijama. 111 TakoĊe je zanimljivo da je stepen oštećenja lipida i proteina, pokazan kroz ispitivane parametre, relativno nizak, ĉak i bez NAC-a, mada u literaturi postoje kontradiktorni rezultati kada su u pitanju ispitivani parametri. UporeĊujući vrednosti za MDA kontrolnih MMĆ poreklom iz koštane srţi pacova u radu Zhang i saradnika, (2013), ali i MDA vrednosti humanih MMĆ iz koštane srţi u radu Li i saradnika (2011), ispostavilo se da je lipidna peroksidacija u našem sistemu kultivacije daleko niţa. Zanimljivo je da vrednosti koje smo mi dobili, kada se preraĉunaju na 103 ćelija, u najvišem stepenu koreliraju sa rezultatima dobijenim na MMĆ poreklom iz masnog tkiva koje su u pasaţi 5 transdukovane lentiviralnim vektorom koji kodira katalitiĉku subjedinicu humane telomeraze (Estrada i sar., 2013). TakoĊe, procenat SA- -gal pozitivnih ćelija je u pasaţi 5 kod MMĆ poreklom iz masnog tkiva daleko veći (Estrada i sar., 2013) nego u našem eksperimentalnom sistemu. Ako se nisko oksidativno oštećenje sagleda i sa aspekta da je vijabilitet ćelija tokom ĉitavog perioda kultivacije izuzetno visok (mali broj ćelija u apoptozi) a aktivnost -galaktozidaze niska, moţemo da zakljuĉimo da se izolovane ćelije, tokom prve ĉetiri pasaţe, veoma dobro adaptiraju na uslove sa visokom koncentracijom O2. 6.9. NAC smanjuje aktivnost enzima antioksidativne zaštite Aktivnost enzima ukljuĉenih u sistem antioksidativne zaštite (AOS), nije detaljno obraĊivana u literaturi koja se bavi metabolizmom MMĆ. Osim toga, postojeći rezultati su donekle kontroverzni. Pojedini autori su pokazali da MMĆ imaju niţu aktivnost enzima AOS u odnosu na diferencirane ćelije, i to objašnjavaju fenomenom privilegovanih in vivo niša, koje štite MMĆ od štetnih dejstava mikrosredine (Orciani i sar., 2010). Drugi autori su pokazali da, in vitro, MMĆ poseduju najvaţnije enzimske i neenzimske mehanizme zahvaljujući kojima su sposobne da efikasno detoksikuju ROS i RNS (Valle-Prieto i Conget, 2010) kao i da nediferencirane MĆ imaju znatno niţe koncentracija ROS i u vezi sa tim veću zastupljenost nezasićenih metabolita (Vacanti i Metallo, 2013). Naši rezultati pokazuju da se in vitro, u DTSC, moţe detektovati aktivnost SOD i katalaze. Naši rezultati takoĊe pokazuju da 24 i 48 sati po dodavanju 0,1 i 1 mM NAC-a dolazi do smanjenja aktivnosti ukupne SOD i CAT i da je 0,1 mM NAC smanjio 112 aktivnost Cu,Zn-SOD (smanjenje uzrokovano 1 mM NAC-om nije bilo znaĉajno), dok su 1 i 2 mM NAC smanjivali aktivnost Mn-SOD. S obzirom da je pad aktivnosti enzima antioksidativne zaštite u korelaciji sa smanjenjem oksidativnog oštećenja ćelijskih makromolekula, efekat koji smo dobili bi se bar delom mogao objasniti kao adaptivan odgovor ćelija na smanjenje ROS, odnosno smanjeno stvaranje ROS je praćeno i smanjenjem aktivnosti enzima neophodnih za njihovu neutralizaciju. S obzirom na to da je broj ćelija sa 0,1 i 1 mM NAC-om veći posle 72 sata kultivacije, a stepen oksidativnog oštećenja manji, kao i aktivnost SOD i CAT, moţemo zakljuĉiti da su ova dva efekta meĊusobno zavisna. Jedna mogućnost je da se ćelijski ciklus, barem jedne manje populacije ćelija (kako je pokazano prethodnim rezultatima) skraćuje, zato što je potrebno manje vremena da se u pojedinim fazama ćelijskog ciklusa repariraju odreĊeni molekuli vaţni za odvijanje ciklusa ćelija koje se nalaze u stalnoj proliferaciji. Druga mogućnost je da NAC delujući na nivo ROS, zapravo utiĉe na pojedine signalne puteve koji ubrzavaju ćelijski ciklus jedne populacije DTSC. NAC je u koncentraciji od 2 mM smanjio aktivnosti Mn-SOD, i to je jedina koncentracija NAC-a koja je izazvala smanjenje broja ćelija posle kultivacije od 72 sata i to verovatno povećanjem procenta ćelija u apoptozi. Na koji naĉin su povezani smanjena aktivnost Mn-SOD i povećanje apoptoze nije lako objasniti, ali se moţe pretpostaviti da svako veće odstupanje u aktivnosti nekog enzima moţe da dovede do negativnih efekata po ćelijski ciklus u preţivljavanje ćelija. 6.10. NAC povećava relativnu aktivnost LDH4 i LDH5 Naši rezultati pokazuju da su u kulturama DTSC, kroz sve pasaţe, najaktivnije izoforme LDH3, LDH4 i LDH5. Relativna aktivnost LDH1 i LDH2 izoformi je bila veoma slaba. NAC je dozno zavisno povećavao relativnu aktivnost LDH4 i LDH5. Do sada je pokazano da linije embrionalnih matiĉnih ćelija eksprimiraju, kao i ćelije u našem eksperimentalnom sistemu, LDH3, LDH4 i LDH5, dok su primarne embrionalne ćelije imale aktivnu LDH1 i LDH5 izoformu (Gibbons i sar., 2006). S druge strane, embrioni od dve ćelije i blastociste su imali aktivnu samo LDH1, a fibroblasti LDH4 i LDH5 (Gibbons i sar., 2006). Ovi podaci bi mogli da navedu na zakljuĉak da ekspresija 113 pojedinih izoformi zavisi od duţine kultivacije ćelija, odnosno, da zavisi od toga, da li je metabolizam ćelije prilagoĊen uslovima kultivacije. Naime, embrionalne, hematopoetske i mezenhimalne matiĉne ćelije u kulturi, kontinuirano proliferišu, bez obzira da li se nalaze na 3% O2 ili na 20% O2 (Ezashi i sar., 2005; Ivanović i sar., 2000; Fehrer i sar., 2007). Taj fenomen se moţe objasniti ĉinjenicom da u kulturi nema kontaktne inhibicije, kao ni drugih regulatornih signala koji spreĉavaju nekontrolisanu proliferaciju ćelija u samom organizmu. Osim toga, ćelije u kulturi imaju na raspolaganju dovoljno faktora rasta i hranljivih materija. Komercijalni medijumi za kultivaciju MĆ najĉešće sadrţe glukozu u koncentracijama koje su više od fizioloških (5,6 mmol/L). U ovim uslovima izgleda da sve ćelije adaptiraju osnovne metaboliĉke puteve na sliĉan naĉin. Naime, vrlo je verovatno da više koncentracije kiseonika od fizioloških (20%), jednako kao i niţe koncentracije koje se definišu kao hipoksija (za pojedine ćelije verovatno ≤ 1-3%, mada ove vrednosti nisu jasno odreĊene), proizvode ROS koji su u uslovima hipoksije u organizmu okidaĉ za stabilizaciju HIF-1α i njegovu translokaciju u jedro. U našim kulturama je pokazano da praktiĉno sve ćelije (95%), imaju jedra pozitivna na HIF-1α a da se sa dodavanjem NAC-a taj procenat ne menja (rezultati nisu prikazani). Stabilizacija HIF-1α, kompatibilna našim rezultatima, pokazana je i u jedrima humanih deĉijih MMĆ poreklom iz koštane srţi i kao i iz krvi pupĉanika (Palomaki i sar., 2013). HIF-1 dalje stimuliše ekspresiju gena vaţnih za pojaĉanu glikolizu – pa se sintetišu pojedini enzimi i transporteri za glukozu kao i LDHM subjedinica laktat- dehidrogenaze (Le i sar., 2010). HIF1, takoĊe, stimuliše pentozo-fosfatni put (Zhao i sar., 2010). Dalje, sva koliĉina glukoze u medijumu koja je iznad minimalnih neophodnih vrednosti za aktivaciju ćelijskog ciklusa, se u ćeliji pretvara u laktat (aktivnošću LDH5), ili se koristi za pentozo-fosfatni put i proizvodnju nukleotida vaţnih za brzo proliferišuće ćelije (Olivotto i dello Sbarba, 2008; Vacanti i Metallo, 2013). Tako je za MMĆ, kao i za druge ćelije koje aktivno proliferišu u kulturi, pokazano da im je metabolizam zasnovan na glikolizi, na šta ukazuje visok nivo aktivnosti enzima ukljuĉenih u glikolizu, kao i visoka produkcija laktata (Chen i sar., 2010; Pottappa i sar., 2011). Zapravo se smatra da je metabolizam matiĉnih ćelija, kao i tumorskih ćelija u uslovima in vitro, zasnovan na „Warburg-ovom efektu“, koji upravo opisuje intenzivnu glikolizu u ćelijama, bez obzira na prisustvo zadovoljavajućih koliĉina kiseonika (Warburg, 1956; Pattappa i sar., 2011; Vacanti i Metallo, 2013). Na 114 osnovu podatka da koncentracija O2 (5 i 20%) ne deluje na aktivnost laktat- dehidrogenaze, kao ni na uĉestalost pojedinih njenih izoformi (Gibbons i sar., 2006), moţemo pretpostaviti da je koncentracija glukoze u kulturi primarni regulator aktivnosti ukupne LDH i njenih izoformi, a indirektno, putem svojih metabolita, moţda i samog HIF-1α. To nije nepoznati podatak u literaturi, naime povećana koncentracija glukoze u medijumu stimuliše ekspresiju HIF-1α u glomerularnim mezangijalnim ćelijama (Isoe i sar., 2010). Sa druge strane, Estrada i sar., (2013), navode podatak da fiziološka koncentracija kiseonika (3%) ima odreĊeni pozitivan uticaj na ekspresiju gena LDHA, pa tako i sintezu LDHM subjedinice, u odnosu na 21% O2 u medijumu, u MMĆ poreklom iz masnog tkiva. TakoĊe, sasvim je logiĉno da je stepen oksidativne fosforilacije nešto veći kod ćelija koje su gajene na 21% O2 (MMĆ poreklom iz koštane srţi, Pattappa i sar., 2011). Na osnovu svega izloţenog, mogli bismo da pretpostavimo da 0,1 mM NAC verovatno utiĉe na metabolizam glukoze, ili na pojedine metabolite ukljuĉene u signalne puteve koji su zavisni od glukoze, pa tako posredno povećava aktivnost LDH4 i LDH5. Istovremeno, s obzirom na to da NAC in vitro donekle imitira hipoksiju (0,1 mM NAC znaĉajno sniţava oksidativno oštećenje u svim uslovima), i to moţe biti naĉin na koji NAC povećava aktivnost izoformi LDH4 i LDH5. Ukoliko sagledamo sveukupno dejstvo NAC-a, moţemo zakljuĉiti da njegovo dodavanje u kulture u koncentraciji od 0,1 i 1 mM, ima pozitivan efekat, posebno ukoliko su ćelije posle ekspanzije namenjene daljoj diferencijaciji u osteoblaste i hondrocite. 115 7. ZAKLJUĈAK Na osnovu rezultata dobijenih prilikom izrade ove doktorske disertacije mogu se izvesti sledeći zakljuĉci: 1. Iz zubne pulpe mleĉnih zuba dece moguće je izolovati populaciju ćelija koja pripada mezenhimalnim matiĉnim ćelijama, ali je po odreĊenim karakteristikama heterogena. Ćelije izolovane iz zubne pulpe imaju visok proliferativni potencijal i mogu da se diferenciraju u osteoblaste, hondrocite i adipocite, ali su heterogene u odnosu na ekspresiju CD146, CD106 i STRO-1 markera, aktivnost ALDH i brzinu deoba tokom kultivacije. Viša aktivnost ALDH je bila u negativnoj korelaciji sa vremenom duplikacije ćelija u kulturi te se moţe pretpostaviti da su ćelije koje imaju višu aktivnost ALDH primitivnije, i da brţe proliferišu. 2. Niže koncentracije NAC-a (0,1 mM i 1 mM), in vitro, povećavaju broj ćelija u kulturi. Niţe koncentracije NAC-a stimulišu proliferaciju jedne manje populacije ćelija, povećavaju broj ALDH+ ćelija, smanjuju broj starih ćelija i povećavaju relativnu aktivnost LDH4 i LDH5 izoformi laktat-dehidrogenaze (što ukazuje na ubrzanu glikolizu). Sve navedene promene mogu indirektno objasniti ubrzanje proliferacije i povećanje broja ćelija u kulturama tretiranim niţim koncentracijama NAC-a. 3. Niže koncentracije NAC-a (0,1 mM i 1 mM), in vitro, znaĉajno smanjuju oksidativno oštećenje na nivou ćelija. Dodavanje NAC-a posle 24 sata smanjuje stepen oksidativnog oštećenja lipida (smanjena je koncentracija MDA) i proteina (smanjen sadrţaj karbonilnih grupa), dok sadrţaj -SH grupa raste. Nakon tretmana niţim koncentracijama NAC-a dolazi i do smanjenja aktivnosti SOD i katalaze. S obzirom na to da je pad aktivnosti enzima antioksidativne zaštite u korelaciji sa smanjenjem oksidativnog oštećenja ćelijskih makromolekula, efekat koji smo dobili bi se bar delom mogao objasniti kao adaptivan odgovor ćelija na smanjenje ROS, odnosno smanjeno stvaranje ROS je praćeno i smanjenjem aktivnosti enzima neophodnih za njihovu neutralizaciju. 4. Viša koncentracija NAC-a (2 mM), in vitro, smanjuje broj ćelija u kulturi. Viša koncentracija NAC-a (2 mM), in vitro, smanjuje broj ćelija u kulturi inhibirajući proliferaciju jedne manje populacije ćelija i povećavajući broj ćelija 116 u apoptozi i broj starih ćelija, iako ne utiĉe znaĉajno na njihov oksidativni status. Navedene promene mogu objasniti smanjenje broja ćelija prilikom primene 2 mM NAC-a. 5. NAC dozno zavisno stimuliše osteogenezu i hondrogenezu, a inhibira adipogenezu. Zbog toga, tretiranje matiĉnih ćelija izolovanih iz pulpe mleĉnih zuba dece niskim koncentracijama NAC-a moţe naći primenu tokom njihove ex vivo ekspanzije, ukoliko su ćelije namenjene za regeneraciju koštanog ili hrskaviĉavog tkiva. 117 8. LITERATURA 1. Abdi R, Fiorina P, Adra CN, Atkinson M, Sayegh MH. Immunomodulation by mesenchymal stem cells: a potential therapeutic strategy for type 1 diabetes. Diabetes, 2008; 57:1759-1767. 2. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzimol, 1984; 105:121-126. 3. Ahmadi-Ashtiani H, Allameh A, Rastegar H, Soleimani M, Barkhordari E. Inhibition of cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase by silymarin in proliferating mesenchymal stem cells: comparison with glutathione modifiers. J Nat Med, 2012; 66:85-94. 4. Akintoye SO, Lam T, Shi S, Brahim J, Collins MT, Robey PG. Skeletal site- specific characterization of orofacial and iliac crest human bone marrow stromal cells in same individuals. Bone, 2006; 38:758-768. 5. Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, Goldstein S, Younglai EV, Futcher AB, Greider CW, Harley CB. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992; 89:10114-10118. 6. Alsalameh S, Amin R, Gemba T, Lotz M. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Arthritis Rheum, 2004; 50:1522-1532. 7. Amoh Y, Li L, Katsuoka K, Hoffman RM. Multipotent hair follicle stem cells promote repair of spinal cord injury and recovery of walking function. Cell Cycle, 2008; 7:1865-1869. 8. Angelova Volponi A, Kawasaki M, Sharpe PT. Adult human gingival epithelial cells as a source for whole-tooth bioengineering. J Dent Res, 2013; 92:329-334. 9. Arai F, Ohneda O, Miyamoto T, Zhang XQ, Suda T. Mesenchymal stem cells in perichondrium express activated leukocyte cell adhesion molecule and participate in bone marrow formation. J Exp Med, 2002; 195:1549-1563. 10. Aubin JE. Bone stem cells. J Cell Biochem Suppl, 1998; 30-31:73-82. 11. Baksh D, Yao R, Tuan RS. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells, 2007; 25:1384-1392. 12. Balint B, Ivanović Z, Petakov M, Taseski J, Jovcić G, Stojanović N, Milenković P. The cryopreservation protocol optimal for progenitor recovery is not optimal for preservation of marrow repopulating ability. Bone Marrow Transplant, 1999; 23:613-619. 118 13. Basciano L, Nemos C, Foliguet B, de Isla N, de Carvalho M, Tran N, Dalloul A. Long term culture of mesenchymal stem cells in hypoxia promotes a genetic program maintaining their undifferentiated and multipotent status. BMC Cell Biol, 2011; 12:12. 14. Baynes JW. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes. Diabetes, 1991; 40:405-412. 15. Bento LW, Zhang Z, Imai A, Nör F, Dong Z, Shi S, Araujo FB, Nör JE. Endothelial differentiation of SHED requires MEK1/ERK signaling. J Dent Res, 2013; 92:51-57. 16. Berniakovich I, Laricchia-Robbio L, Izpisua Belmonte JC. N-acetylcysteine protects induced pluripotent stem cells from in vitro stress: impact on differentiation outcome. Int J Dev Biol, 2012; 56:729-735. 17. Bi Y, Ehirchiou D, Kilts TM, Inkson CA, Embree MC, Sonoyama W, Li L, Leet AI, Seo BM, Zhang L, Shi S, Young MF. Identification of tendon stem/progenitor cells and the role of the extracellular matrix in their niche. Nat Med, 2007; 13:1219-1227. 18. Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey PG. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells, 2001; 19:180-192. 19. Bianco P, Robey PG, Simmons PJ. Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell, 2008; 2: 313–319. 20. Boland GM, Perkins G, Hall DJ, Tuan RS. Wnt 3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem, 2004; 93:1210-1230. 21. Boroujeni Z, Aleyasin A. Human umblical cord derived mesenchymal stem cells can secret insulin in vitro and in vivo. Biotechnol Appl Biochem, 2013 May 31. doi: 10,1002/bab.1127. 22. Brand KA, Hermfisse U. Aerobic glycolysis by proliferating cells: a protective strategy against reactive oxygen species. FASEB J, 1997; 11:388-395. 23. Brandl C, Kaesbauer J, Weber BH, Morsczeck C. Spontaneous immortalization of neural crest-derived corneal progenitor cells after chromosomal aberration. Cell Prolif, 2010; 43:372-327. 24. Braut A, Kollar EJ, Mina M. Analysis of the odontogenic and osteogenic potentials of dental pulp in vivo using a Col1a1-2.3-GFP transgene. Int J Dev Biol, 2003; 47:281-292. 119 25. Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, Ohlsson C, Isaksson O, Peterson L. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med, 1994; 331:889-895. 26. Brocker C, Cantore M, Failli P, Vasiliou V. Aldehyde dehydrogenase 7A1 (ALDH7A1) attenuates reactive aldehyde and oxidative stress induced cytotoxicity. Chem Biol Interact, 2011; 191:269-277. 27. Calzadilla P, Sapochnik D, Cosentino S, Diz V, Dicelio L, Calvo JC, Guerra LN. N-Acetylcysteine reduces markers of differentiation in 3T3-L1 adipocytes. Int J Mol Sci, 2011; 12:6936-6951. 28. Caplan AI, Correa D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell, 2011; 9:11-15. 29. Caplan AI. Mesenchymal Stem Cells. J Ortho Res, 1991; 9:641-650. 30. Caplan AI. Muscle, cartilage and bone development and differentiation from chick limb mesenchymal cells. In: Ede DA, Hinchliffe JR, Balls M, editors. Vertebrate Limb and Somite Morphogenesis. Cambridge: Cambridge University Press; 1977; pp. 199-213. 31. Caplan AI. The mesengenic process. Clin Plast Surg, 1994; 21:429-435. 32. Carrière A, Fernandez Y, Rigoulet M, Pénicaud L, Casteilla L. Inhibition of preadipocyte proliferation by mitochondrial reactive oxygen species. FEBS Lett, 2003; 550:163-167. 33. Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells, 2007; 25:2739-2749. 34. Chen C, Liu Y, Liu R, Ikenoue T, Guan KL, Liu Y, Zheng P. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. J Exp Med, 2008; 205:2397-2408. 35. Chen CT, Hsu SH, Wei YH. Upregulation of mitochondrial function and antioxidant defense in the differentiation of stem cells. Biochim Biophys Acta, 2010; 1800:257-263. 36. Chen CT, Shih YR, Kuo TK, Lee OK, Wei YH. Coordinated changes of mitochondrial biogenesis and antioxidant enzymes during osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Stem Cells, 2008; 264:960- 968. 37. Chen CW, Montelatici E, Crisan M, Corselli M, Huard J, Lazzari L, Péault B. Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative 120 units, cytokine sources or both? Cytokine Growth Factor Rev, 2009; 20:429- 434. 38. Chen K, Huang YH, Chen JL. Understanding and targeting cancer stem cells: therapeutic implications and challenges. Acta Pharmacol Sin, 2013; 34:732-740. 39. Chen XD. Extracellular matrix provides an optimal niche for the maintenance and propagation of mesenchymal stem cells. Birth Defects Res C Embryo Today, 2010; 90:45-54. 40. Clinicaltrials.gov: Available at: http://www.clinicaltrials.gov 41. Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E, Giunti D, Cappiello V, Cazzanti F, Risso M, Gualandi F, Mancardi GL, Pistoia V, Uccelli A. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions. Blood, 2006; 107:367-372. 42. Cordeiro MM, Dong Z, Kaneko T, Zhang Z, Miyazawa M, Shi S, Smith AJ, Nör JE. Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth. J Endod, 2008; 34:962-969. 43. Cosgrove JP, Church DF, Pryor WA. The kinetics of the autoxidation of polyunsaturated fatty acids. Lipids, 1987; 22:299-304. 44. Covas DT, Panepucci RA, Fontes AM, Silva WA Jr, Orellana MD, Freitas MC, Neder L, Santos AR, Peres LC, Jamur MC, Zago MA. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. Exp Hematol, 2008; 36:642-654. 45. Christopherson SW, Glass RL. Preparation of milk fat methyl esters by alcoholysis in an essentially nonalcoholic solution. J. Dairy Sci, 1969; 52:1289- 1290. 46. Cynamon HA, Isenberg JN, Nguyen CH. A rapid method for erythrocyte membrane phospholipid determination. Clin Chim Acta, 1984; 144:65-70. 47. da Silva Meirelles L, Caplan AI, Nardi NB. In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells. Stem Cells, 2008; 26:2287-2299. 48. Dave SD, Vanikar AV, Trivedi HL. Extrinsic factors promoting in vitro differentiation of insulin-secreting cells from human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Appl Biochem Biotechnol, 2013; 170:962-971. 49. Dave SD, Vanikar AV, Trivedi HL. In-vitro generation of human adipose tissue derived insulin secreting cells: up-regulation of Pax-6, Ipf-1 and Isl-1. Cytotechnology, 2013 May 9. 50. de Almeida FM, Marques SA, Ramalho Bdos S, Rodrigues RF, Cadilhe DV, Furtado D, Kerkis I, Pereira LV, Rehen SK, Martinez AM. Human dental 121 pulp cells: a new source of cell therapy in a mouse model of compressive spinal cord injury. J Neurotrauma, 2011; 28:1939-1949. 51. De Boer J, Wang HJ, Van Blitterswijk C. Effects of Wnt signaling on proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng, 2004; 10:393-401. 52. De Coppi P, Bartsch G Jr, Siddiqui MM, Xu T, Santos CC, Perin L, Mostoslavsky G, Serre AC, Snyder EY, Yoo JJ, Furth ME, Soker S, Atala A. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat Biotechnol, 2007; 25:100-106. 53. de Mendonça Costa A, Bueno DF, Martins MT, Kerkis I, Kerkis A, Fanganiello RD, Cerruti H, Alonso N, Passos-Bueno MR. Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells. J Craniofac Surg, 2008; 19:204-210. 54. Dexter TM, Wright EG, Krizsa F, Lajtha LG. Regulation of haemopoietic stem cell proliferation in long term bone marrow cultures. Biomedicine, 1977; 27:344-349. 55. Dimri GP, Lee X, Basile G, Acosta M, Scott G, Roskelley C, Medrano E, Linskens M, Rubelj I, Pereira-Smith O. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1995; 92:9363–9367. 56. Djokic J, Tomic S, Cerovic S, Todorović V, Rudolf R, Colić M. Characterization and imunosupressive properties of mesenchymal stem cells from periapical lesions. J Clin Periodontol, 2012; 39:807-816. 57. Dolle P. Developmental expression of retinoic acid receptors (RARs). Nucl Recept Signal, 2009; 7:e006. 58. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Krause DS, Deans RJ, Keating A, Prockop DJ, Horwitz EM. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy, 2006; 8:315-317. 59. Du Y, Funderburgh ML, Mann MM, SundarRaj N, Funderburgh JL. Multipotent stem cells in human corneal stroma. Stem Cells, 2005; 23:1266- 1275. 60. Duailibi MT, Duailibi SE, Young CS, Bartlett JD, Vacanti JP, Yelick PC. Bioengineered teeth from cultured rat tooth bud cells. J Dent Res, 2004; 83:523- 528. 61. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, Ridall AL, Karsenty G. Osf2/Cbfa1: a transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell, 1997; 89:747-754. 122 62. Dzierzak E, Philipsen S. Erythropoiesis: development and differentiation. Cold Spring Harb Perspect Med, 2013; 3:a011601. 63. Ellman GL. Tissue sulhhydril groups. Arch Biochem Biophys, 1959; 82:70-77. 64. Emadedin M, Aghdami N, Taghiyar L, Fazeli R, Moghadasali R, Jahangir S, Farjad R, Baghaban Eslaminejad M. Intra-articular injection of autologous mesenchymal stem cells in six patients with knee osteoarthritis. Arch Iran Med, 2012; 15:422-428. 65. Estrada JC, Torres Y, Benguría A, Dopazo A, Roche E, Carrera-Quintanar L, Pérez RA, Enríquez JA, Torres R, Ramírez JC, Samper E, Bernad A. Human mesenchymal stem cell-replicative senescence and oxidative stress are closely linked to aneuploidy. Cell Death Dis, 2013; 4:e691. 66. Ezashi T, Das P, Roberts RM. Low O2 tensions and the prevention of differentiation of hES cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005; 102:4783-4788. 67. Fan J, Hitosugi T, Chung TW, Xie J, Ge Q, Gu TL, Polakiewicz RD, Chen GZ, Boggon TJ, Lonial S, Khuri FR, Kang S, Chen J. Tyrosine phosphorylation of lactate dehydrogenase A is important for NADH/NAD(+) redox homeostasis in cancer cells. Mol Cell Biol, 2011; 31:4938-4950. 68. Fan JL, Cai HB, Tan WS. Effect of regulating intracellular ROS with antioxidants on the ex vivo expansion of cord blood CD34+ cells. Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi, 2008; 24:767-770. 69. Fan J, Cai H, Yang S, Yan L, Tan W. Comparison between the effects of normoxia and hypoxia on antioxidant enzymes and glutathione redox state in ex vivo culture of CD34(+) cells. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2008;151:153-158. 70. Fehrer C, Brunauer R, Laschober G, Unterluggauer H, Reitinger S, Kloss F, Gülly C, Gassner R, Lepperdinger G. Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their lifespan. Aging Cell, 2007; 6:745-757. 71. Finkel T. Redox-dependent signal transduction. FEBS Lett, 2000; 476:52–54. 72. Fischer L, Boland G, Tuan RS. Wnt-3A enhances bone morphogenetic protein-2-mediated chondrogenesis of murine C3H10T1/2 mesenchymal cells. J Biol Chem, 2002; 277:30870–30878. 73. Freeman HJ. Crypt region localization of intestinal stem cells in adults. World J Gastroenterol, 2008; 14:7160-7162. 123 74. Frenette PS, Pinho S, Lucas D, Scheiermann C. Mesenchymal stem cell: keystone of the hematopoietic stem cell niche and a stepping-stone for regenerative medicine. Annu Rev Immunol, 2013; 31:285-316. 75. Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet, 1970; 3:393-403. 76. Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Latsinik NV, Panasyuk AF, Keiliss- Borok IV. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation, 1974; 17:331-40. 77. Friedenstein AJ, Piatetzky-Shapiro II, Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J Embryol Exp Morphol, 1966; 16:381-390. 78. Fukuchi Y, Nakajima H, Sugiyama D, Hirose I, Kitamura T, Tsuji K. Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential. Stem Cells, 2004; 22:649-658. 79. Gargett CE, Schwab KE, Zillwood RM, Nguyen HP, Wu D. Isolation and culture of epithelial progenitors and mesenchymal stem cells from human endometrium. Biol Reprod, 2009; 80:1136-1145. 80. Garmy-Susini B, Jin H, Zhu Y, Sung RJ, Hwang R, Varner J. Integrin alpha4beta1-VCAM-1-mediated adhesion between endothelial and mural cells is required for blood vessel maturation. J Clin Invest, 2005; 115:1542-1551. 81. Geißler S, Textor M, Kühnisch J, Könnig D, Klein O, Ode A, Pfitzner T, Adjaye J, Kasper G, Duda GN. Functional comparison of chronological and in vitro aging: differential role of the cytoskeleton and mitochondria in mesenchymal stromal cells. PLoS One, 2012; 7:e52700. 82. Gibbons J, Hewitt E, Gardner DK. Effects of oxygen tension on the establishment and lactate dehydrogenase activity of murine embryonic stem cells. Cloning Stem Cells, 2006; 8:117-122. 83. Gopurappilly R, Bhat V, Bhonde R. Pancreatic tissue resident mesenchymal stromal cell (MSC)-like cells as a source of in vitro islet neogenesis. J Cell Biochem, 2013; 114:2240-2247. 84. Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000; 97:13625-13630. 85. Gurusamy N, Mukherjee S, Lekli I, Bearzi C, Bardelli S, Das DK. Inhibition of ref-1 stimulates the production of reactive oxygen species and induces differentiation in adult cardiac stem cells. Antioxid Redox Signal, 2009; 11:589- 600. 124 86. Halfon S, Abramov N, Grinblat B, Ginis I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging. Stem Cells Dev, 2011; 20:53-66. 87. Halliwell B, Chirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. Am J Clin Nutr, 1993; 57:715S-724S. 88. Hao H, Chen G, Liu J, Ti D, Zhao Y, Xu S, Fu X, Han W. Culturing on Wharton's jelly extract delays mesenchymal stem cell senescence through p53 and p16INK4a/pRb pathways. PLoS One, 2013; 8:e58314. 89. Harada H, Kettunen P, Jung HS, Mustonen T, Wang YA, Thesleff I. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with notch and FGF signaling. J Cell Biol, 1999; 147:105–120. 90. Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature, 1990; 345:458-460. 91. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res, 1965; 37:614–636. 92. He H, Yu J, Liu Y, Lu S, Liu H, Shi J, Jin Y. Effects of FGF2 and TGFbeta1 on the differentiation of human dental pulp stem cells in vitro. Cell Biol Int, 2008; 32:827-34. 93. Held KD, Biaglow JE. Mechanisms for the oxygen radical-mediated toxicity of various thiol-containing compounds in cultured mammalian cells. Radiat Res, 1994; 139:15-23. 94. Heo JY, Jing K, Song KS, Seo KS, Park JH, Kim JS, Jung YJ, Hur GM, Jo DY,Kweon GR, Yoon WH, Lim K, Hwang BD, Jeon BH, Park JI. Downregulation of APE1/Ref-1 is involved in the senescence of mesenchymal stem cells. Stem Cells, 2009; 27:1455-1462. 95. Hermitte F, Brunet de la Grange P, Belloc F, Praloran V, Ivanovic Z. Very low O2 concentration (0,1%) favors G0 return of dividing CD34+ cells. Stem Cells, 2006; 24:65-73. 96. Hofmann AD, Beyer M, Krause-Buchholz U, Wobus M, Bornhäuser M, Rödel G. OXPHOS supercomplexes as a hallmark of the mitochondrial phenotype of adipogenic differentiated human MSCs. PLoS One, 2012; 7:e35160. 97. Huang AH, Snyder BR, Cheng PH, Chan AW. Putative dental pulp- derivedstem/stromal cells promote proliferation and differentiation of endogenous neural cells in the hippocampus of mice. Stem Cells, 2008; 26:2654-2663. 125 98. Huang GT, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J Dent Res, 2009; 88:792-806. 99. Huntly BJ, Gilliland DG. Leukaemia stem cells and the evolution of cancer- stem-cell research. Nat Rev Cancer, 2005; 5:311-321. 100. Iida K, Takeda-Kawaguchi T, Tezuka Y, Kunisada T, Shibata T, Tezuka K. Hypoxia enhances colony formation and proliferation but inhibits differentiation of human dental pulp cells. Arch Oral Biol, 2010; 55:648-654. 101. Imbesi S, Musolino C, Allegra A, Saija A, Morabito F, Calapai G, Gangemi S. Oxidative stress in oncohematologic diseases: an update. Expert Rev Hematol, 2013; 6:317-325. 102. Ishkitiev N, Yaegaki K, Imai T, Tanaka T, Nakahara T, Ishikawa H, Mitev V, Haapasalo M. High-purity hepatic lineage differentiated from dental pulp stem cells in serum-free medium. J Endod, 2012; 38:475-480. 103. Isoe T, Makino Y, Mizumoto K, Sakagami H, Fujita Y, Honjo J, Takiyama Y, Itoh H, Haneda M. High glucose activates HIF-1-mediated signal transduction in glomerular mesangial cells through a carbohydrate response element binding protein. Kidney Int, 2010; 78:48-59. 104. Ivan M, Kaelin WG Jr. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein. Curr Opin Genet Dev, 2001; 11:27-34. 105. Ivanovic Z, Boiron JM. Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells: concept and clinical benefit. Transfus Clin Biol, 2009; 16:489-500. 106. Ivanović Z, Dello Sbarba P, Trimoreau F, Faucher JL, Praloran V. Primitive human HPCs are better maintained and expanded in vitro at 1 percent oxygen than at 20 percent. Transfusion, 2000; 40:1482-1488. 107. Ivanovic Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J Cell Physiol, 2009; 219:271-275. 108. Ishikawa Y, Ida-Yonemochi H, Nakakura-Ohshima K, Ohshima H. The relationship between cell proliferation and differentiation and mapping of putative dental pulp stem/progenitor cells during mouse molar development by chasing BrdU-labeling. Cell Tissue Res, 2012; 348:95-107. 109. Jahoda CA, Whitehouse J, Reynolds AJ, Hole N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp Dermatol, 2003; 12:849-859. 110. Jaussaud J, Biais M, Calderon J, Chevaleyre J, Duchez P, Ivanovic Z, Couffinhal T, Barandon L. Hypoxia-preconditioned mesenchymal stromal 126 cells improve cardiac function in a swine model of chronic myocardial ischaemia. Eur J Cardiothorac Surg, 2013; 43:1050-1057. 111. Javazon EH, Beggs KJ, Flake AW. Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging. Exp Hematol, 2004; 32:414-425. 112. Jeon EJ, Lee KY, Choi NS, Lee MH, Kim HN, Jin YH, Ryoo HM, Choi JY, Yoshida M, Nishino N, Oh BC, Lee KS, Lee YH, Bae SC. Bone morphogenetic protein-2 stimulates Runx2 acetylation. J Biol Chem, 2006; 281:16502-16511. 113. Ji H, Liu Y, Zhao X, Zhang M. N-acetyl-L-cysteine enhances the osteogenic differentiation and inhibits the adipogenic differentiation through up regulation of Wnt 5a and down regulation of PPARG in bone marrow stromal cells. Biomed Pharmacother, 2011; 65:369-374. 114. Jiang XX, Zhang Y, Liu B, Zhang SX, Wu Y, Yu XD, Mao N. Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells. Blood, 2005; 105:4120-4126. 115. Jo YY, Lee HJ, Kook SY, Choung HW, Park JY, Chung JH, Choung YH, Kim ES, Yang HC, Choung PH. Isolation and characterization of postnatal stem cells from human dental tissues. Tissue Eng, 2007; 13:767-773. 116. Jun JH, Lee SH, Kwak HB, Lee ZH, Seo SB, Woo KM, Ryoo HM, Kim GS, Baek JH. N-acetylcysteine stimulates osteoblastic differentiation of mouse calvarial cells. J Cell Biochem, 2008; 103:1246-1255. 117. Kanda Y, Hinata T, Kang SW, Watanabe Y. Reactive oxygen species mediate adipocyte differentiation in mesenchymal stem cells. Life Sci, 2011; 89:250-258. 118. Kaneko R, Akita H, Shimauchi H, Sasano Y. Immunohistochemical localization of the STRO-1 antigen in developing rat teeth by light microscopy and electron microscopy. J Electron Microsc (Tokyo), 2009; 58:363-373. 119. Karamzadeh R, Eslaminejad MB. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. In: Andrades JA, editor. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. Hampshire: InTech; 2013; pp. 95-116. 120. Keller LH. Bone marrow-derived aldehyde dehydrogenase-bright stem and progenitor cells for ischemic repair. Congest Heart Fail, 2009; 15:202-206. 121. Kelly GS. Clinical applications of N-acetylcysteine. Altern Med Rev, 1998; 3: 114-127. 122. Kerkis I, Caplan AI. Stem cells in dental pulp of deciduous teeth. Tissue Eng Part B Rev, 2012; 18:129-138. 123. Kerkis I, Kerkis A, Dozortsev D, Stukart-Parsons GC, Gomes Massironi SM, Pereira LV, Caplan AI, Cerruti HF. Isolation and characterization of a 127 population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cells markers. Cells Tissues Organs, 2000; 184:105-16. 124. Khoo ML, Shen B, Tao H, Ma DD. Long-term serial passage and neuronal differentiation capability of human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev, 2008; 17:883-896. 125. Kim GH, Song DK, Cho CH, Yoo SK, Kim DK, Park GY, Suh SI, Jang BC, Lim JG. Muscular cell proliferative and protective effects of N-acetylcysteine by modulating activity of extracellular signal-regulated protein kinase. Life Sci, 2006; 79:622-628. 126. Kim J, Kang JW, Park JH, Choi Y, Choi KS, Park KD, Baek DH, Seong SK, Min HK, Kim HS. Biological characterization of long-term cultured human mesenchymal stem cells. Arch Pharm Res, 2009; 32:117-126. 127. Kirkwood TB, Austad SN. Why do we age? Nature, 2000; 408:233–238. 128. Kode JA, Mukherjee S, Joglekar MV, Hardikar AA. Mesenchymal stem cells: immunobiology and role in immunomodulation and tissue regeneration. Cytotherapy, 2009; 11:377-91. 129. Koepke JI, Nakrieko KA, Wood CS, Boucher KK, Terlecky LJ, Walton PA, Terlecky SR. Restoration of peroxisomal catalase import in a model of human cellular aging. Traffic, 2007; 8:1590-1600. 130. Kojima N, Yamada M, Paranjpe A, Tsukimura N, Kubo K, Jewett A, Ogawa T. Restored viability and function of dental pulp cells on poly- methylmethacrylate (PMMA)-based dental resin supplemented with N-acetyl cysteine (NAC). Dent Mater, 2008; 24:1686-1693. 131. Kolf CM, Cho E, Tuan RS. Mesenchymal stromal cells. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-renewal and differentiation. Arthritis Res Ther, 2007; 9:204. 132. Kong D, Kotraiah V. Modulation of aldehyde dehydrogenase activity affects (±)-4-hydroxy-2E-nonenal (HNE) toxicity and HNE-protein adduct levels in PC12 cells. J Mol Neurosci, 2012; 47:595-603. 133. Kordes C, Sawitza I, Götze S, Häussinger D. Hepatic stellate cells support hematopoiesis and are liver-resident mesenchymal stem cells. Cell Physiol Biochem, 2013; 31:290-304. 134. Kovaĉević-Filipović M, Petakov M, Hermitte F, Debeissat C, Krstić A, Jovcić G, Bugarski D, Lafarge X, Milenković P, Praloran V, Ivanović Z. Interleukin-6 (IL-6) and low O(2) concentration (1%) synergize to improve the maintenance of hematopoietic stem cells (pre-CFC). J Cell Physiol, 2007; 212:68-75. 128 135. Koyama N, Okubo Y, Nakao K, Bessho K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. J Oral Maxillofac Surg, 2009; 67:501-506. 136. Ksiazek K. A comprehensive review on mesenchymal stem cell growth and senescence. Rejuvenation Res, 2009; 12:105-116. 137. Kuhn NZ, Tuan RS. Regulation of stemness and stem cell niche of mesenchymal stem cells: implications in tumorigenesis and metastasis. J Cell Physiol, 2010; 222:268-77. 138. Kuilman T, Michaloglou C, Mooi WJ, Peeper DS. The essence of senescence. Genes Dev, 2010; 24:2463-2479. 139. Laĉković V, Nikolić IR, Todorović V. Digestivni sistem USNA DUPLJA. U: Nikolić IR, editor. Osnovna i oralna histologija i embriologija. Beograd: Data Status; 2012; str. 208. 140. Lakshmipathy U, Verfaillie C. Stem cell plasticity. Blood Reviews, 2005; 19: 29–38. 141. Le A, Cooper CR, Gouw AM, Dinavahi R, Maitra A, Deck LM, Royer RE, Vander Jagt DL, Semenza GL, Dang CV. Inhibition of lactate dehydrogenase A induces oxidative stress and inhibits tumor progression. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010; 107:2037-2042. 142. Lebovitz RM, Zhang H, Vogel H, Cartwright J Jr, Dionne L, Lu N, Huang S, Matzuk MM. Neurodegeneration, myocardial injury, and perinatal death in mitochondrial superoxide dismutase-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996; 93:9782-9787. 143. Lee BY, Han JA, Im JS, Morrone A, Johung K, Goodwin EC, Kleijer WJ, DiMaio D, Hwang ES. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell, 2006; 5:187-195. 144. Léobon B, Roncalli J, Joffre C, Mazo M, Boisson M, Barreau C, Calise D, Arnaud E, André M, Pucéat M, Pénicaud L, Prosper F, Planat-Bénard V, Casteilla L. Adipose-derived cardiomyogenic cells: in vitro expansion and functional improvement in a mouse model of myocardial infarction. Cardiovasc Res, 2009; 83:757-767. 145. Leroux L, Descamps B, Tojais NF, Séguy B, Oses P, Moreau C, Daret D, Ivanovic Z, Boiron JM, Lamazière JM, Dufourcq P, Couffinhal T, Duplàa C. Hypoxia preconditioned mesenchymal stem cells improve vascular and skeletal muscle fiber regeneration after ischemia through a Wnt4-dependent pathway. Mol Ther, 2010; 18:1545-1552. 129 146. Levine RL, Garland D, Oliver CN, Amici A, Climent I, Lenz AG, Ahn BW, Shaltiel S, Stadtman ER. Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. Methods Enzymol, 1990; 186:464-478. 147. Levine RL, Williams JA, Stadtman ER, Shacter E. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol, 1994; 233:346-357. 148. Li B, Qu C, Chen C, Liu Y, Akiyama K, Yang R, Chen F, Zhao Y, Shi S. Basic fibroblast growth factor inhibits osteogenic differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth through ERK signaling. Oral Dis, 2012; 18:285-292. 149. Li DR, Cai JH. Methods of isolation, expansion, differentiating induction and preservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells. Chin Med J Engl), 2012; 125:4504-4510. 150. Li R, Chen B, Wang G, Yu B, Ren G, Ni G. Effects of mechanical strain on oxygen free radical system in bone marrow mesenchymal stem cells from children. Injury, 2011; 42:753-757. 151. Li Y, Lü X, Sun X, Bai S, Li S, Shi J. Odontoblast-like cell differentiation and dentin formation induced with TGF-β1. Arch Oral Biol, 2011; 56:1221-1229. 152. Lin TM, Tsai JL, Lin SD, Lai CS, Chang CC. Accelerated growth and prolonged lifespan of adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells in a medium using reduced calcium and antioxidants. Stem Cells Dev, 2005; 14:92- 102. 153. Linde A, Ljunggren A. Lactate dehydrogenase isoenzyme patterns of human dental pulp. J Dent Res, 1970; 49:Suppl:1469-1472. 154. Liu J, Hinkhouse MM, Sun W, Weydert CJ, Ritchie JM, Oberley LW, Cullen JJ. Redox regulation of pancreatic cancer cell growth: role of glutathione peroxidase in the suppression of the malignant phenotype. Hum Gene Ther, 2004; 15:239-250. 155. Lizier NF, Kerkis A, Gomes CM, Hebling J, Oliveira CF, Caplan AI, Kerkis I. Scaling-up of dental pulp stem cells isolated from multiple niches. PLoS One, 2012; 7:e39885. 156. Luo Z, Chen Y, Chen S, Welch WJ, Andresen BT, Jose PA, Wilcox CS. Comparison of inhibitors of superoxide generation in vascular smooth muscle cells. Br J Pharmacol, 2009; 157:935-943. 157. Lyons AB, Parish CR. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods, 1994; 171:131-137 130 158. Ma L, Feng XY, Cui BL, Law F, Jiang XW, Yang LY, Xie QD, Huang TH. Human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells. Chin Med J (Engl), 2005; 118:1987-1993. 159. Mackay AM, Beck SC, Murphy JM, Barry FP, Chichester CO, Pittenger MF. Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow. Tissue Eng, 1998; 4:415-428. 160. Marchitti SA, Brocker C, Stagos D, Vasiliou V. Non-P450 aldehyde oxidizing enzymes: the aldehyde dehydrogenase superfamily. Expert Opin Drug Metab Toxicol, 2008; 4:697-720. 161. Mareschi K, Rustichelli D, Comunanza V, De Fazio R, Cravero C, Morterra G, Martinoglio B, Medico E, Carbone E, Benedetto C, Fagioli F. Multipotent mesenchymal stem cells from amniotic fluid originate neural precursors with functional voltage-gated sodium channels. Cytotherapy, 2009; 11:534-547. 162. Marín-Hernández A, Gallardo-Pérez JC, Ralph SJ, Rodríguez-Enríquez S, Moreno-Sánchez R. HIF-1alpha modulates energy metabolism in cancer cells by inducing over-expression of specific glycolytic isoforms. Mini Rev Med Chem, 2009; 9:1084-1101. 163. Mark M, Ghyselinck NB, Chambon P. Function of retinoic acid receptors during embryonic development. Nucl Recept Signal, 2009; 7:e002. 164. Marnett LJ. Lipid peroxidation-DNA damage by malondialdehyde. Mutat Res, 1999; 424:83-95. 165. Marnett LJ. Oxy radicals, lipid peroxidation and DNA damage. Toxicology, 2002; 181-182:219-222. 166. Marnett LJ. Oxyradicals and DNA damage. Carcinogenesis, 2000; 21:361-370. 167. Martin I, Baldomero H, Bocelli-Tyndall C, Passweg J, Saris D, Tyndall A. The survey on cellular and engineered tissue therapies in Europe in 2010. Tissue Eng Part A, 2012; 18:2268-2279. 168. Martin-Rendon E, Sweeney D, Lu F, Girdlestone J, Navarrete C, Watt SM. 5-Azacytidine-treated human mesenchymal stem/progenitor cells derived from umbilical cord, cord blood and bone marrow do not generate cardiomyocytes in vitro at high frequencies, Vox Sang, 2008; 95:137-48 169. Maximov A. Cultures of blood leucocytes. From leucocyte and monocyte to connective tissue. Arch exp Zellforsch, 1928; 5:169-178. 170. McBeath R, Pirone DM, Nelson CM, Bhadriraju K, Chen CS. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell, 2004; 6:483–495. 131 171. McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem, 1969; 244:6049-6055. 172. Melk A, Kittikowit W, Sandhu I, Halloran KM, Grimm P, Schmidt BM, Halloran PF. Cell senescence in rat kidneys in vivo increases with growth and age despite lack of telomere shortening. Kidney Int, 2003; 63:2134–2143. 173. Menicanin D, Bartold PM, Zannettino AC, Gronthos S. Identification of a common gene expression signature associated with immature clonal mesenchymal cell populations derived from bone marrow and dental tissues. Stem Cells Dev, 2010; 19:1501-1510. 174. Menon SG, Sarsour EH, Kalen AL, Venkataraman S, Hitchler MJ, Domann FE, Oberley LW, Goswami PC. Superoxide signaling mediates N- acetyl-L-cysteine-induced G1 arrest: regulatory role of cyclin D1 and manganese superoxide dismutase. Cancer Res, 2007; 67:6392-6399. 175. Minamikawa H, Yamada M, Deyama Y, Suzuki K, Kaga M, Yawaka Y, Ogawa T. Effect of N-acetylcysteine on rat dental pulp cells cultured on mineral trioxide aggregate. J Endod, 2011; 37:637-641. 176. Misra HP, Fridovich I. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase. J Biol Chem, 1972; 247:3170-3175. 177. Miura M, Gronthos S, Zhao M, Lu B, Fisher LW, Robey PG, Shi S. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003; 100:5807-5812. 178. Mofarrahi M, Brandes RP, Gorlach A, Hanze J, Terada LS, Quinn MT, Mayaki D, Petrof B, Hussain SN. Regulation of proliferation of skeletal muscle precursor cells by NADPH oxidase. Antioxid Redox Signal, 2008; 10:559-574. 179. Moreb JS, Ucar D, Han S, Amory JK, Goldstein AS, Ostmark B, Chang LJ. The enzymatic activity of human aldehyde dehydrogenases 1A2 and 2 (ALDH1A2 and ALDH2) is detected by Aldefluor, inhibited by diethylaminobenzaldehyde and has significant effects on cell proliferation and drug resistance. Chem Biol Interact, 20125; 195:52-60. 180. Moreb JS, Zucali JR, Ostmark B, Benson NA. Heterogeneity of aldehyde dehydrogenase expression in lung cancer cell lines is revealed by Aldefluor flow cytometry-based assay. Cytometry B Clin Cytom, 2007; 72:281-289. 181. Morita K, Miyamoto T, Fujita N, Kubota Y, Ito K, Takubo K, Miyamoto K, Ninomiya K, Suzuki T, Iwasaki R, Yagi M, Takaishi H, Toyama Y, Suda T. Reactive oxygen species induce chondrocyte hypertrophy in endochondral ossification. J Exp Med, 2007; 204:1613-1623. 132 182. Morito A, Kida Y, Suzuki K, Inoue K, Kuroda N, Gomi K, Arai T, Sato T. Effects of basic fibroblast growth factor on the development of the stem cell properties of human dental pulp cells. Arch Histol Cytol, 2009; 72:51-64. 183. Morsczeck C, Götz W, Schierholz J, Zeilhofer F, Kühn U, Möhl C, Sippel C, Hoffmann KH. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biol, 2005; 24:155-165. 184. Morsczeck C, Schmalz G, Reichert TE, Volner F, Galler K, Driemel O. Somatic stem cells for regenerative dentisty. Clin Oral Invest, 2008; 12:113-118. 185. Muraglia A, Cancedda R, Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci, 2000; 113:1161-1166. 186. Muzio G, Maggiora M, Paiuzzi E, Oraldi M, Canuto RA. Aldehyde dehydrogenases and cell proliferation. Free Radic Biol Med, 2012; 52:735-746. 187. Nagano M, Kimura K, Yamashita T, Ohneda K, Nozawa D, Hamada H, Yoshikawa H, Ochiai N, Ohneda O. Hypoxia responsive mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood are effective for bone repair. Stem Cells Dev, 2010; 19:1195-1210. 188. Nakagami H, Morishita R, Maeda K, Kikuchi Y, Ogihara T, Kaneda Y. Adipose tissue-derived stromal cells as a novel option for regenerative cell therapy. J Atheroscler Thromb, 2006; 13:77-81. 189. Nakamura S, Yamada Y, Katagiri W, Sugito T, Ito K, Ueda M. Stem cell proliferation pathways comparison between human exfoliated deciduous teeth and dental pulp stem cells by gene expression profile from promising dental pulp. J Endod, 2009; 35:1536-1542. 190. Nakashima M, Iohara K, Sugiyama M. Human dental pulp stem cells with highly angiogenic and neurogenic potential for possible use in pulp regeneration. Cytokine Growth Factor Rev. 2009; 20:435-40. 191. Nam H, Lee G. Identification of novel epithelial stem cell-like cells in human deciduous dental pulp. Biochem Biophys Res Commun, 2009; 386:135-139. 192. Nibley WE, Spangrude GJ. Primitive stem cells alone mediate rapid marrow recovery and multilineage engraftment after transplantation. Bone Marrow Transplant, 1998; 21:345-354. 193. Noer A, Boquest AC, Collas P. Dynamics of adipogenic promoter DNA methylation during clonal culture of human adipose stem cells to senescence. BMC Cell Biol, 2007; 8:18. 194. Noh YH, Chob HS, Kim DH, Kim OH, Park J, Lee SA, Yang HS, Sohn DS, Kim W, Kim D, Chung YH, Kim KY, Kim SS, Lee WB. N-acetylcysteine 133 enhances neuronal differentiation of P19 embryonic stem cells via Akt and N- cadherin activation. Mol Biol (Mosk), 2012; 46:741-746. 195. Nourbakhsh N, Soleimani M, Taghipour Z, Karbalaie K, Mousavi SB, Talebi A, Nadali F, Tanhaei S, Kiyani GA, Nematollahi M, Rabiei F, Mardani M, Bahramiyan H, Torabinejad M, Nasr-Esfahani MH, Baharvand H. Induced in vitro differentiation of neural-like cells from human exfoliated deciduous teeth-derived stem cells. Int J Dev Biol, 2011; 55:189-195. 196. Nuttall ME, Patton AJ, Olivera DL, Nadeau DP, Gowen M. Human trabecular bone cells are able to express both osteoblastic and adipocytic phenotype: implications for osteopenic disorders. J Bone Miner Res, 1998; 13:371-82. 197. Ohh M, Park CW, Ivan M, Hoffman MA, Kim TY, Huang LE, Pavletich N, Chau V, Kaelin WG. Ubiquitination of hypoxia-inducible factor requires direct binding to the beta-domain of the von Hippel-Lindau protein. Nat Cell Biol, 2000; 2:423-427. 198. Olivotto M, Dello Sbarba P. Environmental restrictions within tumor ecosystems select for a convergent, hypoxia-resistant phenotype of cancer stem cells. Cell Cycle, 2008; 7:176-187. 199. Orciani M, Gorbi S, Benedetti M, Di Benedetto G, Mattioli-Belmonte M, Regoli F, Di Primio R. Oxidative stress defense in human-skin-derived mesenchymal stem cells versus human keratinocytes: Different mechanisms of protection and cell selection. Free Radic Biol Med, 2010; 49:830-838. 200. Osathanon T, Nowwarote N, Pavasant P. Basic fibroblast growth factor inhibits mineralization but induces neuronal differentiation by human dental pulp stem cells through a FGFR and PLCγ signaling pathway. J Cell Biochem, 2011; 112:1807-1816. 201. Oshima M, Mizuno M, Imamura A, Ogawa M, Yasukawa M, Yamazaki H, Morita R, Ikeda E, Nakao K, Takano-Yamamoto T, Kasugai S, Saito M, Tsuji T. Functional tooth regeneration using a bioengineered tooth unit as a mature organ replacement regenerative therapy. PLoS One, 2011; 6:e21531. 202. Palomäki S, Pietilä M, Laitinen S, Pesälä J, Sormunen R, Lehenkari P, Koivunen P. HIF-1α is Upregulated in Human Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells, 2013 Jun 6. doi: 10,1002/stem.1435. 203. Paranjpe A, Cacalano NA, Hume WR, Jewett A. N-acetylcysteine protects dental pulp stromal cells from HEMA-induced apoptosis by inducing differentiation of the cells. Free Radic Biol Med, 2007; 43:1394-1408. 204. Park SR, Oreffo RO, Triffitt JT. Interconversion potential of cloned human marrow adipocytes in vitro. Bone, 1999; 24:549-554. 134 205. Patel M, Smith AJ, Sloan AJ, Smith G, Cooper PR. Phenotype and behaviour of dental pulp cells during expansion culture. Arch Oral Biol, 2009; 54:898-908. 206. Pattappa G, Heywood HK, de Bruijn JD, Lee DA. The metabolism of human mesenchymal stem cells during proliferation and differentiation. J Cell Physiol, 2011; 226:2562-2570. 207. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 1999; 284:143–147. 208. Pittenger MF, Mosca JD, McIntosh KR. Human mesenchymal stem cells: progenitor cells for cartilage, bone, fat and stroma. Curr Top Microbiol Immunol, 2000; 251:3-11. 209. Pivoriuūnas A, Surovas A, Borutinskaite V, Matuzeviccius D, Treigyte G, Savickiene J, Tunaitis V, Aldonyte R, Jarmalavicciuūte A, Suriakaite K, Liutkeviccius E, Venalis A, Navakauskas D, Navakauskiene R, Magnusson KE. Proteomic analysis of stromal cells derived from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth. Stem Cells Dev, 2010; 19:1081-1093. 210. Pojda Z, Machaj EK, Ołdak T, Gajkowska A, Jastrzewska M. Nonhematopoietic stem cells of fetal origin-how much of today's enthusiasm will pass the time test? Folia Histochem Cytobiol, 2005; 43:209-212. 211. Radtke C, Schmitz B, Spies M, Kocsis JD, Vogt PM. Peripheral glial cell differentiation from neurospheres derived from adipose mesenchymal stem cells. Int J Dev Neurosci, 2009; 27:817-823. 212. Reinhold MI, Kapadia RM, Liao Z, Naski MC. The Wnt-inducible transcription factor Twist1 inhibits chondrogenesis. J Biol Chem, 2006; 281:1381-1388. 213. Rose H, Oklander M. Improved procedure for the extraction of lipids from human erythrocytes. J. Lipid Res, 1965; 6:428-431. 214. Ross SE, Hemati N, Longo KA, Bennett CN, Lucas PC, Erickson RL, MacDougald OA. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science, 2000; 289:950-953. 215. Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. J Inflamm (Lond), 2005; 26:2:8. 216. Sacchetti B, Funari A, Michienzi S, Di Cesare S, Piersanti S, Saggio I, Tagliafico E, Ferrari S, Robey PG, Riminucci M, Bianco P. Self renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell, 2007; 131:324–336. 135 217. Sakaguchi Y, Sekiya I, Yagishita K, Muneta T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum, 2005; 52:2521-2529. 218. Sakai VT, Zhang Z, Dong Z, Neiva KG, Machado MA, Shi S, Santos CF, Nör JE. SHED differentiate into functional odontoblasts and endothelium. J Dent Res, 2010; 89:791-796. 219. Sakdee JB, White RR, Pagonis TC, Hauschka PV. Hypoxia-amplified proliferation of human dental pulp cells. J Endod, 2009; 35:818-823. 220. Samuni Y, Goldstein S, Dean OM, Berk M. The chemistry and biological activities of N-acetylcysteine. Biochim Biophys Acta, 2013; 1830:4117-4129. 221. Sato N, Ueno T, Kubo K, Suzuki T, Tsukimura N, Att W, Yamada M, Hori N, Maeda H, Ogawa T. N-Acetyl cysteine (NAC) inhibits proliferation, collagen gene transcription, and redox stress in rat palatal mucosal cells. Dent Mater, 2009; 25:1532-1540. 222. Sauer H, Rahimi G, Hescheler J, Wartenberg M. Role of reactive oxygen species and phosphatidylinositol 3-kinase in cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. FEBS Lett, 2000; 476:218-223. 223. Scheller EL, Chang J, Wang CY. Wnt/beta catenin inhibits dental pulp stem cell differentiation. J Dent Res, 2008; 87:126-130 224. Schnabel M, Marlovits S, Eckhoff G, Fichtel I, Gotzen L, Vécsei V, Schlegel J. Dedifferentiation-associated changes in morphology and gene expression in primary human articular chondrocytes in cell culture. Osteoarthritis Cartilage, 2002; 10:62-70. 225. Schriner SE, Linford NJ, Martin GM, Treuting P, Ogburn CE, Emond M, Coskun PE, Ladiges W, Wolf N, Van Remmen H, Wallace DC, Rabinovitch PS. Extension of murine life span by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Science, 2005; 308:1909-1911. 226. Scion Corp, 2007: Available at http://www.scionimage.com 227. Shi Y, Pulliam DA, Liu Y, Hamilton RT, Jernigan AL, Bhattacharya A, Sloane LB, Qi W, Chaudhuri A, Buffenstein R, Ungvari Z, Austad SN, Van Remmen H. Reduced mitochondrial ROS, enhanced antioxidant defense, and distinct age-related changes in oxidative damage in muscles of long-lived Peromyscus leucopus. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2013; 304:R343-55. 228. Semenza GL, Wang GL. A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation. Mol Cell Biol, 1992; 12:5447-5454. 136 229. Seo BM, Miura M, Gronthos S, Bartold PM, Batouli S, Brahim J, Young M, Robey PG, Wang CY, Shi S. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. Lancet, 2004; 364:149-155. 230. Seo BM, Sonoyama W, Yamaza T, Coppe C, Kikuiri T, Akiyama K, Lee JS, Shi S. SHED repair critical-size calvarial defects in mice. Oral Dis, 2008; 14:428-434. 231. Sethe S, Scutt A, Stolzing A. Aging of mesenchymal stem cells. Ageing Res Rev, 2006; 5:91-116. 232. Shi S, Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. J Bone Miner Res, 2003; 18:696-704. 233. Siemerink MJ, Klaassen I, Vogels IM, Griffioen AW, Van Noorden CJ, Schlingemann RO. CD34 marks angiogenic tip cells in human vascular endothelial cell cultures. Angiogenesis, 2012; 15:151-163. 234. Simonsen JL, Rosada C, Serakinci N, Justesen J, Stenderup K, Rattan SI, Jensen TG, Kassem M. Telomerase expression extends the proliferative life- span and maintains the osteogenic potential of human bone marrow stromal cells. Nat Biotechnol, 2002; 20:592-596. 235. Sloan AJ, Smith AJ. Stimulation of the dentine-pulp complex of rat incisor teeth by transforming growth factor-beta isoforms 1-3 in vitro. Arch Oral Biol, 1999; 44:149-156. 236. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem, 1985; 150:76-85. Erratum in: Anal Biochem, 1987; 163:279. 237. Snykers S, De Kock J, Rogiers V, Vanhaecke T. In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art. Stem Cells, 2009; 27:577-605. 238. Song H, Cha MJ, Song BW, Kim IK, Chang W, Lim S, Choi EJ, Ham O, Lee SY, Chung N, Jang Y, Hwang KC. Reactive oxygen species inhibit adhesion of mesenchymal stem cells implanted into ischemic myocardium via interference of focal adhesion complex. Stem Cells, 2010; 28:555-563. 239. Song K, Wang Z, Li W, Zhang C, Lim M, Liu T. In vitro culture, determination, and directed differentiation of adult adipose-derived stem cells towards cardiomyocyte-like cells induced by angiotensin II. Appl Biochem Biotechnol, 2013; 170:459-70. 137 240. Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza T, Seo BM, Zhang C, Liu H, Gronthos S, Wang CY, Wang S, Shi S. Mesenchymal stem cell-mediated functional tooth regeneration in swine. PLoS One, 2006; 1:e79. 241. Spath L, Rotilio V, Alessandrini M, Gambara G, De Angelis L, Mancini M, Mitsiadis TA, Vivarelli E, Naro F, Filippini A, Papaccio G. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. J Cell Mol Med, 2010; 14:1635-1644. 242. Suchánek J, Visek B, Soukup T, El-Din Mohamed SK, Ivancaková R, Mokrỳ J, Aboul-Ezz EH, Omran A. Stem cells from human exfoliated deciduous teeth-isolation, long term cultivation and phenotypical analysis. Acta Medica (Hradec Kralove), 2010; 53:93-99. 243. Sun J, Tower J. FLP recombinase-mediated induction of Cu/Zn-superoxide dismutase transgene expression can extend the life span of adult Drosophila melanogaster flies. Mol Cell Biol, 1999; 19:216-228. 244. Tai TF, Chan CP, Lin CC, Chen LI, Jeng JH, Chang MC. Transforming growth factor beta2 regulates growth and differentiation of pulp cells via ALK5/Smad2/3. J Endod, 2008; 34:427-432. 245. Takada I, Yogiashi Y, Kato S. Signaling crosstalk between PPARγ and BMP2 in mesenchymal stem cells. PPAR Res, 2012; 2012:607141. 246. Telles PD, Machado MA, Sakai VT, Nör JE. Pulp tissue from primary teeth: new source of stem cells. J Appl Oral Sci, 2011; 19:189-194. 247. Till JE, McCulloch EA. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat Res, 1961; 14:213-222. 248. Toma JG, Akhavan M, Fernandes KJ, Barnabé-Heider F, Sadikot A, Kaplan DR, Miller FD. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol, 2001; 3:778-84. 249. Tomic S, Djokic J, Vasilijic S, Vucevic D, Todorovic V, Supic G, Colic M. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists. Stem Cells Dev, 2011; 20:695-708. 250. Toussaint O, Royer V, Salmon M, Remacle J. Stress-induced premature senescence and tissue ageing. Biochem Pharmacol, 2002; 64:1007–1009. 251. Tower J. Stress and stem cells. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol, 2012; 1:789- 802. 252. Vacanti NM, Metallo CM. Exploring metabolic pathways that contribute to the stem cell phenotype. Biochim Biophys Acta, 2013; 1830:2361-2369. 138 253. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol, 2007; 39:44-84. 254. Valle-Prieto A, Conget PA. Human mesenchymal stem cells efficiently manage oxidative stress. Stem Cells Dev, 2010; 19:1885-1893. 255. Voghel G, Thorin-Trescases N, Farhat N, Mamarbachi AM, Villeneuve L, FortierA, Perrault LP, Carrier M, Thorin E. Chronic treatment with N- acetyl-cystein delays cellular senescence in endothelial cells isolated from a subgroup of atherosclerotic patients. Mech Ageing Dev, 2008; 129:261-270. 256. Wagers AJ, Weissman IL. Plasticity of adult stem cells. Cell, 2004; 116:639- 48. 257. Wagner W, Horn P, Castoldi M, Diehlmann A, Bork S, Saffrich R, Benes V, Blake J, Pfister S, Eckstein V, Ho AD. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One, 2008; 3:e2213. 258. Wang K, Zhang T, Dong Q, Nice EC, Huang C, Wei Y. Redox homeostasis: the linchpin in stem cell self-renewal and differentiation. Cell Death Dis, 2013; 4:e537. 259. Wang KH, Kao AP, Wangchen H, Wang FY, Chang CH, Chang CC, Lin SD. Optimizing proliferation and characterization of multipotent stem cells from porcine adipose tissue. Biotechnol Appl Biochem, 2008; 51:159-166. 260. Wang Q, Zhu H, Zhou WG, Guo XC, Wu MJ, Xu ZY, Jiang JF, Shen C, Liu HQ. N-acetylcysteine-pretreated human embryonic mesenchymal stem cell administration protects against bleomycin-induced lung injury. Am J Med Sci, 2013; 346:113-122. 261. Wang XF, Zhang G, Qiu SB, He F, Tan YH, Chen Q. Effect of Notch ligand Delta1-RNA interference by lentivirus on proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, 2011; 46:730-734. 262. Warburg O. On the origin of cancer cells. Science, 1956; 123:309-314. 263. Weydert CJ, Cullen JJ. Measurement of superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in cultured cells and tissue. Nat Protoc, 2010; 5:51-66. 264. Williams R, Khan IM, Richardson K, Nelson L, McCarthy HE, Analbelsi T, Singhrao SK, Dowthwaite GP, Jones RE, Baird DM, Lewis H, Roberts S, Shaw HM, Dudhia J, Fairclough J, Briggs T, Archer CW. Identification and 139 clonal characterisation of a progenitor cell sub-population in normal human articular cartilage. PLoS One, 2010; 5:e13246. 265. Yagi H, Soto-Gutierrez A, Parekkadan B, Kitagawa Y, Tompkins RG, Kobayashi N, Yarmush ML. Mesenchymal stem cells: mechanisms of immunomodulation and homing. Cell Transplant, 2010; 19:667-79. 266. Yamamoto H, Kim EJ, Cho SW, Jung HS. Analysis of tooth formation by reaggregated dental mesenchyme from mouse embryo. J Electron Microsc (Tokyo), 2003; 52:559-566. 267. Yamaza T, Kentaro A, Chen C, Liu Y, Shi Y, Gronthos S, Wang S, Shi S. Immunomodulatory properties of stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Stem Cell Res Ther, 2010; 1:5. 268. Yee Koh M, Spivak-Kroizman TR, Powis G. HIF-1 regulation: not so easy come, easy go. Trends Biochem Sci, 2008; 33:526-534. 269. Yoo AS, Sun AX, Li L, Shcheglovitov A, Portmann T, Li Y, Lee-Messer C, Dolmetsch RE, Tsien RW, Crabtree GR. MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature, 2011; 476:228-231. 270. Yoshida M, Takakuwa Y. Method for simultaneous assay of initial velocities of lactate dehydrogenase isoenzymes following gel electrophoresis. J Biochem Biophys Methods, 1997; 34:167-175. 271. Young HE, Steele TA, Bray RA, Hudson J, Floyd JA, Hawkins K, Thomas K, Austin T, Edwards C, Cuzzourt J, Duenzl M, Lucas PA, Black AC Jr. Human reserve pluripotent mesenchymal stem cells are present in the connective tissues of skeletal muscle and dermis derived from fetal, adult, and geriatric donors. Anat Rec, 2001; 264:51-62. 272. Zafarullah M, Li WQ, Sylvester J, Ahmad M. Molecular mechanisms of N- acetylcysteine actions. Cell Mol Life Sci, 2003; 60:6-20. 273. Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ. Superoxide dismutase multigene family: a comparison of the CuZn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), and EC-SOD (SOD3) gene structures, evolution, and expression. Free Radic Biol Med, 2002; 33:337- 349. 274. Zhang C, Chang J, Sonoyama W, Shi S, Wang CY. Inhibition of human dental pulp stem cell differentiation by Notch signaling. J Dent Res, 2008; 87:250-255. 275. Zhang DY, Pan Y, Zhang C, Yan BX, Yu SS, Wu DL, Shi MM, Shi K, Cai XX, Zhou S S, Wang JB, Pan JP, Zhang LH. Wnt/β-catenin signaling induces the aging of mesenchymal stem cells through promoting the ROS production. Mol Cell Biochem, 2013; 374:13-20. 140 276. Zhang YN, Lie PC, Wei X. Differentiation of mesenchymal stromal cells derived from umbilical cord Wharton's jelly into hepatocyte-like cells. Cytotherapy, 2009; 11:548-558. 277. Zhao F, Mancuso A, Bui TV, Tong X, Gruber JJ, Swider CR, Sanchez PV, Lum JJ, Sayed N, Melo JV, Perl AE, Carroll M, Tuttle SW, Thompson CB. Imatinib resistance associated with BCR-ABL upregulation is dependent on HIF-1alpha-induced metabolic reprograming. Oncogene, 2010; 29:2962-2972. 278. Zheng Y, Liu Y, Zhang CM, Zhang HY, Li WH, Shi S, Le AD, Wang SL. Stem cells from deciduous tooth repair mandibular defect in swine. J Dent Res, 2009; 88:249-254. 279. Zhou J, Brüne B. Cytokines and hormones in the regulation of hypoxia inducible factor-1alpha (HIF-1alpha). Cardiovasc Hematol Agents Med Chem, 2006; 4:189-197. 280. Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell, 2002; 13:4279-4295. 281. Zulewski H. Differentiation of embryonic and adult stem cells into insulin producing cells. Panminerva Med, 2008; 50:73-9. BIOGRAFIJA Jasmina D. Debeljak Martaĉić je roĊena u Kraljevu, 27.9.1976.godine. Srednju školu je završilla u Vrnjaĉkoj Banji. Po završetku gimnazije upisala je studije na Biološkom fakultetu, Univerziteta u Beogradu i diplomirala februara 2004. godine sa proseĉnom ocenom 9,62. Jasmina D. Debeljak Martaĉić je od marta 2007. godine zaposlena na Institutu za medicinska istraţivanja, Univerziteta u Beogradu, kao istraţivaĉ saradnik. Koautor je 12 radova koji su objavljeni u meĊunarodnimm ĉasopisima i većeg broja radova saopštenih na meĊunarodnim i domaćim nauĉnim skupovima.