UNIVERZITET U BEOGRADU " BIOLOSIO FAKULTET Radmila N. Jankovic DETEKCIJA МUTACIJA U р53 GENU KOD BOLESNICA SA PRIMARNIM OPERAВILNIМ КARCINOMOM DOJKE Doktorska disertacija Beograd, 2004. Ovaj rad је uradjen u Laboratoriji za molekularnu genetiku Odeljenja za eksperimentalnu onkologiju Instituta za onkologiju i radiologiju SrЬije (IORS) u saradnji sa Odeljenjem za klitlicku i eksperimentalnu molekularnu genetiktt ј gensko inZenjerstvo Institjta za medjcinska istraZivanja УМА. Iskreno se zahvaljujem Dr Mirjani-Brankovjc-Magic, VNS, sefu Laboratorije za molekularnu genetiku kako na nesebicnoj i stalnoj strucnoj pomoci pri izradi ovog rada, tako ј na iskazanom prijateljstvu. Rukovodiocи projekta "Кiinicka implikacija molekttlarne heterogenosti soljdnih tumora", и okvirи koga је uradjen ovaj rad, Dr Sioisi RadиloviCi, N Sav, zahvaljujem se na zalaganjи za uspostavljanje materijalnih иslova za izradи ovog rada, kao i na permanentnoj podrsci mladim istraZivacjma na IORS-u. Svom mentorи, prof. dr Stanki Romac sa Bioloskog fakulteta, zahvaljиjem se na pruzenoj samostalnosti pri izradi ovog rada, kao i na korisnim sиgestijarna koje su mi naroCito pomogle tt zavrsnoj fazj izrade teze. Takodje se zahvaljнjem doc. dr Marini Radak sa Bioloskog fakulteta, na Iicnom angaZovanju, naroCito и zavrsnoj fazi izrade ove teze. Zahvaljujem se nacelniku Odeljenja za klinicku i eksperimentalnu molekиlarnu genetiku i gensko inzenjerstvo УМА, prof. dr Zvonku Magicu, na pomoci koju mi је pruzio и savladavanju prvih koraka u oЫasti molckulaшe genetike kancera. Takodje se zahvaljujem svim saradnicima ovog Odeljenja na pruzenoj pomoci. VМL Т Је\ ici Perovic, laboratorij skom tehnicaru Laboratorije za molekularnu genetiku, kao i glavnom Jaboratorij skom tehnicaru Odeljenja za eksperimentalnu onkologiju, VМL Т Miljci Matas, zahvaljujem se na pomoci u eksperimentalnom radu i pripremi podataka tokom izrade tcze. Dragani ВаЬiс, dipl.ecc-statisticaru Data centra JORS-a, zahvaljujem se na pomoci pri statistickoj obradj rezultata. Svim saradnicima Odeljenja za eksperiшentalnu onkologiju, zahvaljujem se na pruzenoj podrsci. DETECТION OF р53 GENE МUТА ТION IN OPERABLE BREAST CANCER PATIENTS Background: the main function of nonnal р53 gene product is to preserve genome integrity Ьу acting as the "guardian ofthe genome". It has been shown that in p53-defective cells DNA aberrant replication is followed Ьу genome instability. Loss of р53 function seems to Ье connected not only with abrogation of DNA reapair, but also with abrogation of apoptosis. The evidence indicates that р53 play а critica\ role in implementing apoptosis in response to treatment with different chemotherapeutics in breast cancer. Тlte aim of this study was to evaiuate whether tнmor's р53 mutations affect response to chemotherapy, and whether р53 mut.ations provide prognostic infonnation for breast cancer patients. Patients and methods: 1 ОО breast cancer patients, among 70 lymph node-positive and 30 lymph node-negative were included. All except one node-positive patients underwent chemotherapy as adjuvant treatment. 65/70 patients received CMF (cyclophospllamide, methotrexate, 5-fluorOllfacil) modified intravenous protocol, and 5/70 F АС (5-flurouracil, adriablastine, cyclophospl1an1ide) protocol. The patients were followed-up from 6 to 127, median 48 months. DNA was isolated Ьу phenol extraction from samples routinely collected for steroid receptor detenninations. Specific DNA regions corresponding to exons 5-8 were amplified Ьу polimerase chain reaction (PCR). Detection or mutations was done Ьу single stranded conformation polymorphism - SSCP - electrophoresis. Gels were silver stained. C-myc amplificatio11 was detected Ьу differential PCR. Steroid receptors were measured Ьу five- point dextrane coated charcoal (ОСС) assay. Chi-square and Fisher exact test, as well as Kaplan-Meir and Log-Rank tests were used for statistical evaluation. Results: р53 mutations were detected in 2111 ОО patients. Totally 25 mutatio11s were found (i n 4 patients douЬie mutations were detected). They were not equally spread within examined exons- 1 О in exon 5, 6 in exon 6, 8 in exon 7 and only one mutation in exon 8. The incidence of р53 mutations was significantly higher in lymph пode-positive than iп lyph node-negative patients. Further, р53 mutations were predominantly located in invasive ductal histological type. Since the node-negative patients only one mutatio11 was found, tће correlation between detected mutations and the course of disease was examined in lympћ node-positive group of patients. Among them, 32/70 patients developed relapse of disease. ln the first 24 months of follow-up, patients with р53 mutations had significantly shorter diseasc free intervaJ (DFI), than the patients without р53 mutations. AJso, significantly shorter progression free interval (PFI) in relapsed patients with р53 mutations than in relapsed patients without р53 mutation was found. Conceming overall survival (OS), significantly shorter OS was found in the patients with р53 and/or c-myc gene alterations than in the patients without gene alterations. Conclusion: In conclusion, occurrence of early relapse in chemotherapy treated patients witћ р53 mutations, supports data about р53 predictive valllc. Тhе rcsults obtained for OS indicate importance of simuJtaneous screening for multiple gene alterations in attempt to define specific tumor molecular profile , finally resuJting with individual therapeutic approach. DETEKCIJA МUTACIJA U р53 GENU КОО BOLESNICA SA PRIМARNIМ OPERABILNJM КARCINOMOM ООЈКЕ Uvod: Zbog svoje uJoge u ocuvanju genomskog integritcta, produkt normalnog р5 3 gena se cesto пaziva i "cuvar genoma". Pokazano је da u celjaina gde је р53 izmenjen dolazj do aberantne replikacije DNK, sto је praceno genomskom nestaЬilnoscu. GuЬitak funkcije р53 povezan је ne samo sa nemogu6nos6u popravke DNK, vec i sa apoptozom. Podaci ukazuju da р53 ima kriticnu ulogu u aktiviranju apotoze pri odgovoru na razlicite vidove hemjoterapije u karcinomu dojke. Cilj ovog rada Ьiо је da se utvrdi da li р53 mutacije uticu na odgovor na hernioterapiju i da li р53 mutacUe mogu dati informaciju о prognozi bolesnjca sa karcinomom dojke. Bo/esuice i metode: U rad је Ьilo ukljuceno 100 bolesпica, od toga 70 sa rnetastazama u regionalnim lirnfnim cvorovima ј 30 bolesnica bez metastaza u regionalnim limfnjm cvorovjma. Sve osim jedne bolesnice sa metastazama u limfnjm cvorovima su prjmile adjuvantnu hemjoterapjju. 65/70 bolesnicaje prjmilo CMF (ciklofosfamid, metotreksat, 5- tluorouracjJ) ро modifikovanom intravenoznom protokolu, i 5/70 је prirnilo F АС (5- fluorouracil , adriaЬiastjn , ciklofosfamid). Bolesnice su pracene u jntervalu 6-127 mesecj , medjjana 48 meseci. DNK је jzolovana fenolskom ekstrakcijom iz uzoraka rutjnskj prikupljanih za odredjivanje receptora za steroidne hormone. Specificni DNК regioni р53 gena koji odgovaraju eksonima 5-8, umnozeni su lancanom reakcjjom polimeraze (PCR). Detekcjja mutacija izvrsena је SSCP (konformacioni polimorfizam jednolancane DNK) elcktroforezom. Gelovi su bojenj srebrom. Amplifikacija c-myc gena odredjena је djfcrenjjalnim PCR-om. Receptorj za steroidne hormone odredjivani su Ьiohemjj skom saturacjoлom metodom sa aktjvnim ugljem. Hi-kvadrat i Fisher-ov egzaktni test, kao ј Kaplan-Mejr-ov ј Log-Rank test su korisceni za statistjcku obradu podataka. Rezu/tati: р53 mutacjje detektovane su kod 211100 bolesnjca. Ukupno је pronadjeno 25 mutacija (ро dve mutacijc detektovane su kod 4 bolesnjce), ј njihova raspodela ро ispitjvanim eksonima nije Ьila jednaka: 10 u eksonu 5, 6 u eksonu 6, 8 u eksonu 7 ј samo jcdna mutacija u eksonu 8. Uccstalost р53 mutacija Ьila је znatno visa kod bolesnica sa metastazama u lirnfnim cvorovjma u odnosu na bolesnice bez metastaza u Jjmfnim cvorovjma. р5 3 mutacjje Ьile su predominantno locirane kod bolesnjca sa invazivnim duktalnim tjpom karciпoma dojke. S obzirom da је kod bolesnica bez metastaza u regionalnim limfnim cvorovima pronadjena sanю jcdna mutacija, korelacija izmedju detektovanih mutacija i klnickog toka bolesti analizirana је samo kod bolcsnjca sa metastazama u limfnim cvorovjma. Od ovih bolesnica, 32/70 је imalo ponovno javljanje bolesti (relaps). U prvih 24 meseci praeenja, bolesnjce sa р53 mutacjjama su imale znacajno kraci period do ponovnog javljanja bolesti (OFI), u odnosu na bolesnice bez р53 mutacjja. Takodje, u grupj bolesnica sa relapsom pokazan је znacajno kraci perjod do progresjje bolesti (PFI) kod bolesnica sa р53 mutacijama u odnosu na bolesnice bez пшtасiја. U odnosu na ukupno prezivljavanje (OS), znacajno krace pre:Zivljavanje zabelezeпo је kod bolesnica sa р53 i/ili c-myc alteracjjama u odnosu na bolesnice bez detektovanih genskih altet-acjja. Zakljucak: Pojava ranog rclapsa kod bolesnica sa р53 mutacijama koje su primjJe hcmjoterapiju, ukazuje na prediktjvлi znacaj р53. Rezultatj doЬijeni za OS, istictt znacaj istovremenog odredjivanja aJteracija vjse gena u nastojanju da se defшise molekularni profil svakog tumora, sto za krajnji сј Јј ima individualni terapjjski pristup. SADRZAJ 1. UVOD 1.1. Evolucija kancera 1 1.1.1. c-myc indukovana apoptoza 2 1.2. р53 tumor supt·esomi gen 4 1.2.1. Stukturne osoЬine р53 proteina 4 1.2.2. OsoЬine mutiranog р53 7 1.2.3. Bazalna p53-Mdm2 sprega 1 1 1.2.4. Aktivacija р53 onkogenima 11 1.2.5. p53-Akt-Mdm2 sprega 12 1.3. Koriscenje р53 signalnog риЈа и cilju poboljsnja anti-kancerskih tretmana 14 1.3 .\. Regulacija funkcije р53 staЬi 1 izacijom proteina 15 1.3.2. Agensi koji ostecllju DNK 16 1.3.3. lnhiЬitori transkripcije 17 1.3.4 InhiЬitori metabolizma RNK Ј 7 1.3.5 lnћiЬitori otpremanja р53 izjedra 17 1.3.6. Hipoksija 17 1.3.7. Agensi koji ostecuju mikrotubule 18 1.4. Mиtirani р53 kao terapeutski cilj и celijama tumora 18 1.4.1 Genska terapija sa р53 18 1.4.2. Korisccnje malih molekula inhi Ьitora р53 odgovora 19 1.4.3. lmitiranje funkcije nishodnog gena 19 1 .4.4. Reaktivirajuci р53 nшtanti 19 1.4.5. Tretman tumora sa wt 53 20 1.4.6. InhiЬicija ekspresije Mdm2 21 1.5. Apoptoza: veza izmedju genetike kancera i odgovora па hemioterapiju 21 2. CILJ 25 3. МА TERIJAL 1 METODE 26 3.1 . Bolesnice sa primarnim operaЫlnim karcinomom dojke 26 3.1. 1. Grupa bolesnica bez metastaza u regionalnim limfnim cvorovima (N0) 27 З. 1 .2. Grupa bolesnica sa metastazama u regionalnim limfni cvorovima (N+) 28 3.2. Odrecljivanje koncenu·acije receplot·a za estrogen i progesteron 29 3.2.1. Uzimanjc i cuvanje uzoraka karcinoma dojke 30 3.2.2. Homogenizacija tkiva i izdvajanje citosolne frakcije 30 3.2.3. Reakcija vezivanja hormona za receptore u citosolu maligniћ celija 30 3.2.4. Odvajanje viska nevezanog (slobodnog) hormona 31 3.2.5. Odredjivanje radioaktiviteta u ~ scintilacionom brojacu 32 3.2.6. Analiza rezultata - izracunavanje koncentracije 32 3.2.7. Odredjivanje koncentracije proteina 32 3.3. Izolacija DNK iz uzoraka karcinoma dojke 33 3.3.1. Digestijajedarnog taloga sa proteinazom К 33 3.3.2. lzo1acija DNK feno1-hJoroformskom metodom 3.3.4. Odredjivanje koncentracije izolovane DNК 3.4. Lancana reakcija polimeraze (PCR) 3.4.1. Optimizacija PCR sistema 3.4.2. PCR procedura- umnozavanje 5, 6, 7 i 8 eksona р53 gena 3.4.3. Diferencija1ni PCR - ampliftkacija c-myc gena 3.5. Detekcija PCR prodиkata agaroznom ge1 e1ektroforezom 3.5.1. Agarozna geJ elektroforeza- procedиra 3.5.2. Raz1ivanje gela па nosac gela 3.5.3. Priprema i nanosenje иzoraka 3.5.4. Detekcija produkata UV-zracima 3.6. Detekcija izmenjenih sekvenci SSCP metodom 3.6.1. SSCP- eksperimenta1na procedura 3.6.2. Priprema poliakri1amidnog ge1a 3.6.3. Mesanje uzoraka DNK sa bojom i nj ihova denaturacija 3.6.4. Optimizacija us1ova za SSCP e1ektroforezи 3.6.5. Bojenje gela srebrom 3.6.6. Detekcija izmenjen ih sekvenci 33 34 34 35 37 38 39 39 40 40 40 42 43 43 43 44 44 44 4. REZUL Т А TI 46 4.1 . Ucestalost р53 mиtacija и tиmorskom tkivи bolesnica sa karcinomom dojke 46 4.1 а). Zavisnost pojave mutacija и eksonima 5-8 р53 gena od velicine tumora 47 4.1 Ь). Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od prisиtnosti metastaza u regionalnim limfnim cvorovima 47 4.1 с). Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od histoloskog tipa tumora 48 4.1 d). Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od statusa steroidnih receptora 49 4.1 е) . Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od histoloskog gradиsa tumora 49 4.1.1 Ucestalost р53 mutacija и tumorskom tkivu bolesnica bez rnetastaza tl regionalnim limfnim cvorovima 50 4.1.2. Ucestalost р53 mиtacija u tиmorskom tkivu bo1esnica sa prisutnim metastazama u regionalnim limfnim cvorovima (N+) 51 4.1.2 а) . Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od veliCine tumora kod N+ bolesnica 51 4.1.2 Ь ). Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od histoloskog tipa tumora kod N~ bolesnica 52 4.1.2 с). Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od statusa steroidnih receptora kod N+ bo1esnica 53 4.1.2 d). Zavisnost pojave mutacija u eksonima 5-8 р53 gena od histoloskog gradиsa tumora kod N+ bolesnica 54 4.2. Ucesta/ost c-myc amplijikacije и lumorskom tkivu bofesnica sa prisutnim melastazama и regiona/nim limfnim e--"oгovima 54 4.2 а) . Zavisnost amplifikacije c-myc gena od velicine tumora 55 4.2 Ь). Zavisnost amplifikacije c-myc gena od histoloskog tipa tumora 55 4.2 с). Zavisnost ampliflkacije c-myc gena od statusa steroidnih receptora 56 4.2 d). Zavisnost amplifikacije c-myc gena od l1istoloskog gradusa tumora 59 4.3. Korelacija ispitivanih alteracija gena (р53, c-myc) sa tokom maligne bolesti и N+ grupi bolesnica 59 4.3.1. Period bez ponovnogjavljanja bolesti (OFI) kod bolesnica sa i bez mutacija u р53 genu 60 4.3.2. Period bez ponovnogjavljanja bolesti u prvih 24 meseci pracenja bolesnica sa i bez mutacija u р53 genu 61 4.3.3. Period bez ponovnogjavUanja bolesti u prvih 36 meseci pracenja bolesnica sa i bez mutacija u р53 genu 62 4.3.4. Period bez ponovnogjavJjanja bolesti nakon 36 meseci pracenja bolesnica sa i bez mutacija u р53 genu 63 4.3.5. Period do progresije bolesti kod boJesnica sa ponovnimjavljanjem bolesti u odnosu na prisustvo/odsиstvo р53 mиtacija 64 4.3.6. Period bez ponovnogjavljanja bolesti kod ispitivane tri grupe bolesnica ofoлnljcne u odnosu na prisustvo/odsustvo р53 mutacija i ampli fikacije c-myc onkogena 65 4.3.7. Poredjenje ukиpnog preZ.ivljavanja bolesnica sa (p53+/c-myc+) ili bez (p53-/c-myc-) detektovanih genskih aJteracija 66 5. DISKUSIJA 68 5.1. Ucestalost р53 mutacija и tumorskom tkivu bofesnica sa karcinomom dojke 69 5.2. Zavisnost ucestalosli mulacija и р53 genu od paramelara lumora 71 5.3. c-myc i karcinom dojke 74 5.4. Korelacija ispitivanih a/teracija gena (р53, c-myc) sa tokom maligne bolesti и N+ fjl'upi bolesnica 76 5.4.1. р53 kao prognosticki faktor и karcinomи dojke 76 5.4.2. р53 kao prediktivni faktor и karcinornu dojke 80 6. ZAКLJUCAK 89 7. LITERA TURA 90 1. UVOD 1.1. Evolucija kancera Od svojih pocetaka, molekиlarne stиdjje kancera sи vodjene и smjsJи definisanja precjznUe i efikasnije terapije kancera. lmajиci и vidu da se kancer razvija iz razliCitih vrsta tkiva sa visestruЮm etiologijama, i da dalja progresija tumora podrazиmeva beskrajne komЬinacije geпetskih i epigenetskih promena, dajuci sansu razvitkи velikom broju vrsta kancera, jasno је da antikancerski agensi moraju Ьiti raznovrsni kao i sama bolest. Kancer nije jedinstvena bolest i nemoguce је definisati jedinstveni lek za njegovo izleeenje te su s toga jasni napori koji se moraju uloziti za otkrivanje novih vrsta terapija. Medjиtim, iako је kancer izrazito heterogeno oboljenje, p.retpostavlja se da и osnovi te varijaЬilnosti lezi relativno mali broj kriticпih dogadjaja cija је koпvergencija neophodпa za razvice svih tipova kancera. Mada kancer ukljucuje i mnoge druge procese koji takodje predstavljajи ciljeve antikancerske terapije, deregulisana 6elijska proliferacija i suprimirana celijska smrt, zajedno obezbedjujи temelj neoplasticnoj progresiji. Izazov kojj se postavlja pred sve istraijvace је jdentjfikacjja ј razиmevanje molekularne anatomjje prvih koraka u tиmorskoj progresijj , kao i razvice terapija koje direktno dеЈији na odredjene ci ljeve. NekontroJjsana klonalna ekspanzija somatskjh сеЈ јја kod kancera, dovodi do ostecenja okolnog normalnog tkiva. Pokretacka snaga razvica kancera su mutacije somatskih сеЈјја и genima ukljuceпim u kontrolu ceJjjskog rasta. Prosesj koji upravljaju genezom i progresjjom kancera su evolucjoni i u njirna prirodna selekcija deluje nasuprot nasledne ili stecene raznovrsnosti razJjcjtjh klonova somatskjh celija, ubrйlvajucj prekomerni rast onih klonova koji poseduju selektivnu prednost rasta. zjvjm organizmima neophodnaje znatna i kontint1irana celijska proliferacUa, kako za razvjce ј odiiavanje orgaл izma tako i za popravkи eventualnih gresaka. Evolucionj jmperativ organizmirna је nalaienje nacina kako omoguciti celijsku proliferaciju опdа kada је potrebna, а и isto vreme suprjmirati genezu mutjranih celija koja bi dovela do nekontrolisaлog rasta. Kada se poremeti ravnoteZa jzmedju ovih dogadjaja, razvitak kancera је neizbeZaп. Svesnost о evolиcionoj prirodi kancera omogиcava zanacajan иvid u osobine maJjgnog procesa. Kancer predstavlja bolest neregt1l isane 6elijske prol iferacjje. Svaki od signalnih puteva ukljucenih u proliferativni odgovor normalnih celijaje izmenjen и vecini kancera. Јеdпа grupa mutacija neophodnih za razvi6e tumora deluje tako sto prekida potrebu somatskih celija za eksternim mjtogenim signalirna (Hиnter et al., 2000). Ovaj tjp mutacjja moze ukljucivatj autokrinи produkcUu normalno ljmjtjranog mitogena, aktjviranjem mиtacija u prenosjocjma sjgnala protejna, kao sto је Ras, ili ukljиcиje mutacije koje deluju na jedan od mnogih intermedijamjh signalnih molekula koji prenose mitogene signale do njihovih иnutarcelij skih ciljeva. Drнga klasa mutacija koje narusavajи rast obuhvata one mutacije ciji је ci lj glavna, kasna-G 1 signalna tacka regиlisana sa рRВ (Harbour et al., 2000). Poremecajj и ovom signalnom putu, kojj nюgи Ьitj univerzalni и humanjm kancerirna, ukljucuju delecjju samog RВ gena, kao i deregulaciju CDKs, koje fosforiJjsu i funkcionalno inaktivirajи рRВ , Ьilo kroz direktnи aktivaciju CDКs, ili kroz genski gиЬitak njihovih jЬhЉjtora. Druga, cesto zastupljena proliferativna lezija koja moze da dovede do deregulacije celijskog ciklusa је nekontrolisana ekspresija Мус (Baudino et аЈ. , 2001). Ekspresija Мус је strogo kontrolisana u normalnim celijama, ali је ekspresija и tumorskim celijama izmenjena i to uglavnom u smislu пjegove povecane ekspresije. Pretpostavlja se da је Мус strateski kontrolor 6elijske proliferacijc koji deluje plejotropno u smislu koordinacije celij skog rasta (Johnston et al., 2000; Evan and Vousden, 2001 ), i dalje progresije kroz 6elijski ciklus (Eilend et а\. , 1999). 1. 1.1. с-тус- indukcvana apoptoza C-myc protoonkogen kodjra c-myc transkripcioni faktor, prvj рнt identifikovan kao celijski homolog viralnog onkogena (v-myc) pticjeg retrovjrusa (Vennstrom et а\., 1982). U novijim istra2jvanj ima pokazano је da је povecana ili neregulisana ekspres jja c-myc detektovana u sirokorn spektru humanjh kancera, i cesto је povezana sa agresivnim i slabo di ferentovan jm tumorjma. Fiz joJoskj, c-myc se eksprimira u visokim nivoima tokom embriogeneze kao i u tkivima odraslih osoba sa vjsokjm proJjferativnim kapacjtetom (kao sto su cpidermjs koze i zeluca). Njegova ekspresija snaino korelise sa celijskom pro\jferac jjom. U in vilro uslovima, c-myc se brzo indukuje u odgovoru na razne mitogene stimuluse. Uporedo sa ubrzavanjem 6elijskog rasta i proliferacije, c-myc inhiЬira terminalnu djferenc ij aciju ve6ine tjpova celija ј senzibllise celije za apoptozu. Ova poslednja funkcija povezana sa apoptozom, pod Iupom је istra:livaca poslednj ih godina, zbog moguce uloge c-myc u supresiji rasta tumora. Postavlja se pitanje kako c-myc ostvaruje ovako razlicite celijske ishode? Da Јј su ovi celijskj dogadjaji u zavjsnosti od transkripcjje j[i represije specificnog seta c-myc ci ljnih gena? C-myc aktivira razno\jku grupu gena kao deo heterodimemog kompleksa sa svoj im partnerom, proteinom max. Karboksj- terminaJni domen c-myc se vezuje za max ј formiraju se myc-max heterodimeri koji jmaju sposobnost vezivanja za specificne DNK-sekvencc, kao sto је E-boks sekvenca CACGTG (Blackwood et al., 1991 ). Amino-terminaJni regjon od Ј 50 arnjno kiselina c-myc sadгZi dva visoko konzervirana elementa, myc boks I (MBI) ј MBll, koj i su neophodni za transaktivaciju ci lj njh gena. Mutacije u c-myc transaktjvacjonom regionu kao ј u karboksi- terminalnom domenu, ponistavaju delovanje c-myc na 6elijsku pro\jferaciju, transformaciju i apoptozu (Amati et аЈ. 1993). Jedna od kljucnih Ьioloskih funkcija c-myc је ubrzavanje progresije celijskog ciklusa (Amatj et al., 200 l ). U mirujucim celijama, u in vitro uslovima, ekspresija c-myc је nedetektaЬilna. Posle rnitogene stimulacije, ubrzo se indukuje c-myc mRNK ј protein i celije ulaze u G 1 fazu 6elij skog ciklusa. Nakoп toga, nivoi mRNK i proteina su niski ali rnogu da se detektuju, sto odrzava stanje ravnote:Ze u proliferisucim celijama. Ako se uklone faktori rasta, пivo c-rnyc pada ispod tacke detekcije, ј stopira se dalja proliferacija celija. Рте desetak god ina, vise laboratorjja је doslo do intrigantnog otkrica: onkoproteini kao sto Stl c-rnyc i adenovirus Е 1 А, оЬа potentni induktori celijske proliferacije, poseduju i apoptotske aktivnosti (Evan et a l., 1992). Ekspresija c-myc u fibroЬ\astima gajenjm u odsustvu faktora prezivljavanja dovodi do apoptoze, sa potencijalnim gubltkom cele celijske populacije. Onkogeni aktivjraju apoptozu ako је пjihov proljferativni signalni put na neki nacin Ьlokiran. Naj prihvacenija teorija о apoptozi aktivjranoj onkoproteinima је da jndukcjja ulaska u 6elijski cikl us, senzjbl\ise cclije na apoptozu: apoptotski ј proJjferativni signalni putevi su povezani. Apoptotski put је suprimjran sve dok odgovaraju6j faktori prezjvJjavanja salj u anti-apoptotske signale. Prema tome, koji се od ova dva kontradiktorna procesa prcovladati zavisice od raspolozivosti faktora prezivljavanja. 2 • .. .. ·· 8 1 ...... ..... . .... .. .... . . .. : .· ... · .· . е ............ . .. .. .. · CO%/IдS d Slika 1. c-myc-indukovana apoptoza (Pelengaris et al., 2002). Poeev od ovib ranih eksperimenata, otkriveno је da i drugi pokretaci celijske proliferacije (kao sto је E2F), poseduju pro-apoptotsku aktivnost (Shan et al., 1994). Cinjenica da celije sa mutacijama koje uticu na poremecaj regulacije rasta, in vivo poseduju tumor-supresornu funkciju, sto pokriva ekspanziju potencijalnih malignih celija, privukJa је veliku pa.Znju. Ovakva eelijska populacija nece moci da preraste svoje parakrino okruzenje ukoliko apoptoza nije inhiЬirana. lndirektni podaci podrZavaju ovu ideju, sto је pokazano jakim sinergizmo m izmedju proteina kao sto је c-myc i mehanizama koji suprimiraju apoptozu - na primer, poveeana ekspresija anti-apoptotskih proteina kao Sto su bcl-2 ili bci-X2, ili guЬitak tumor supresora ARF ili р53 . Neka novija istraZivanj a su pokazala da c-myc sna.Zno korel ise sa gubitkom рSЗ (Вlyth et al., 1995), ili guЬitkom Arf (Jacobs et al., 1999), јег је inhiЬirana c- myc- indukovana apoptoza. Interesantno је da stimulacija apoptoze c-myc-om ne mora uvek Ьiti direktno povezana са celijskim ciklusom; takodje more Ьiti posledica indirektnih dogadjaja koji dovode do ostecenja DNK Novi podaci in vitro istra.Zivanja povezuju c-myc sa reaktivnim jedinjenjima kiseonika (reactive oxygen species, ROS) kroz E2Fl-posredovanu inhibiciju nukleranog faktora kВ (NF- kВ). Кrajnji ishod ovih dogadjaj a, apoptoza ili zastoj u celij skom rastu, zavisice od vrste celij a з (Yafa et al., 2002). Mehanizmj ukljuceni u c-myc jndt•kovanи apoptozu prjkazaпj sи па Slici 1. Као sto se vidi sa slike, ekspresija c-myc seпziЬilise celije na citav spektar pro-apoptotskih stimulиsa, kao sto sи hipoksija, ostecenje DNК, ili uklanjanje faktora preZivljavanja, а takodje omogucava protok signala kroz CD95, tumor пekroticni faktor (ТNF), kao ј kroz ТNF­ apoptotski ligand (TRAIL - ТNF-related apoptosis-indиcing ligand-TRAIL). Prvi иvid u c- myc iпdukovanu apoptozu potice od studija kojc su pokazale da c-myc moze da iпdиkuje oslobadjanje citohroma с iz mjtohondrija и tokи apoptoze, а ova ekspresija citohroma с dodatno senzjtjse celije па apoptozu (Juin et al., 1998). Kada se jednom oslobodi u citoplazmи, citohrom с se povezиje sa jedniш drugim proteiпom, apoptotskim proteaza aktivirajucim faktorom 1 (APAFl) pri сети se stvara apoptozom, kompleks koji aktivira prokaspazи-9. U prjsиstvu citohroma с i АТР ili ADP, kaspaza 9 se aиtokataliticki aktjvira. i aktjvjra nizvodпu kaskadи kaspaza koja иkljucujc kaspaze 2,3,6,7,8 ј 10. Elektroпskom mikroskopijom је utvrdjeno da se nekoliko molekula kao sto sи Apaf l ј cjtohrorn с organjzиju u oЬlik koji (јсј па naboran zjd (tzv. zid smrti) koji slиzi kao sjdю za v jse molekula prokaspaze-9 koj ј se vezuju za njegov rиЬ. Ovo omogucava svakoj prokaspazi-9 da se veze za drиgи prokaspazu-9 i formira par koji konstituise aktjvпu formu enzima. Postojanje indivjdualпih tuшora sa visestrukim mutacijama koje pogadjajи svaki od prethodno navedenjh s jgnalnih puteva, ukazujи na to da svaki pomenиti ptlt па neki nacin doprinosi proliferativnoj funkciji malignog tumora. Medjиtim, precizna priroda te funkcije kao i nacin na koji one interagujи medjиsobno ostaje za sada nepozпat U nekim slucajevima pojedjпacni tip proliferativne lezije је dovoljan za drugacije upravljanje celijskom proliferacjjom. Na primer, cak i mala promena и regиlaciji c-myc, је barem kod miseva, dovoljna sama ро seЬi da iпdиkије i odriava proljferacijи vjse tipova somatskih celija in vit1·o ј in vivo (Pelengaris et al., 1999). 1.2. р53 tumor supresorni gen 1.2.1. Strukturne osoblne р53 proleina Hwnani р53 protein sastojj se od 393 aminokjseljne, i rnoze se podeliti и pet strиktw-nih i funkcionalnih domena. N-termjпalni region proteina interaguje sa komponentama bazalnog transkripcionog mehanjzma ј ima funkcijи transkripcionog aktivacionog domena. N-termiпalni regjon takodje jma vezujиce mcsto za Mdm2 protein, koji regulise funkcijи р53, kroz prckid transkripcione aktivnosti i degradaciju р53 protcjna tl proteozomjma. Centralni domen р53 pr·oteiпa se vezuje za specificпu sekvencи DNK. Takodje, kroz visc vezujucih mesta preko kojjh se р53 protcin vezuje za vj se celijskih promotora, ovaj regioп ucestvuje и p53-zavisnoj aktjvaciji transkripcije (Field et а\ ., 1990). Izmedju transaktivacjoпog i DNK vezujuceg domena postoji oЬlast bogata pro\jnom, koja funkcionise kao vezujuce mesto za druge proteine. C-terminalni regioп sadrZ.i signale za nuklearnu loka\izacijи kao i oligomerizacjoni domen, koji omogucava р53 protei nu da formira tetramere, sto dovodj do efikasnog vezivanja za DNК i realizacije transkripcione aktjvnosti (Wang et al., 1994). Na krajnjem C-termjrшsu proteina, desno od oligomerizacionog regiona, na\azi se jos јеdап domen, za koj ј se pretpostavlja daje odgovaran za regulaciju DNK-vezujuce aktivnosti centralnog domeпa. 4 Uporedjivanjern strukture р53 proteina izmedju razlicitih vrsta, doslo se do saznanja da postoji pet regiona Cija se struktura sacuvala kroz evoluciju. Cetiri od pet regiona locirano је u okviru centralnog DNК -vezuj uceg domena (Soussi et аЈ ., 1990). 1 nteresantno је da је vecina mutacija (uglavnom tackastih mutacija), kod hurnanih kancera, locirana upravo u ovim regionima. Za razliku od mutacija u drugim tumor supresornim genima koje esencijalno elirninisu ckspresiju datog proteina, rnutacije u р53 genu rezultiraju ekspresijom visokih nivoa mutirane forrne р53 proteina koja ne moze da se veze za DNK i na taj nacin ostvari svoju funkciju. Vecina do sada otkrivenih tackastih mutacija u р53 genu ne pogadja oligornerizacioni domen. U eksperimentalnirn sistemima је pokazano da ovakvi р53 mutanti mogu da ol igornerisu i na taj nacin inaktiviraju divlji tip (wt) р53. Sposobnost mutiranog р53 proteina da Гunkcionise na dominantno negativni nacin, moze rezuJtirati selektivnom prednoscu celija koje eksprirnirajн jedan rnutantni i jedan wt tip a le l, iako gubitak wt alela kod vecine kancera ukazuje da dominantno-negativni efekat nije kompletan. Postojanje nшtiranog р53 protei na u celijama kancera, sugerise da mutacije u р53 genu mogu rezultirati pokretanjem pozitivne traпsforrnisuce aktivnosti, nezavisno od dorninantno negativnog efekta da se inhiЬira Гuпkcija wt р53 proteina (Vousden and Lu, 2002). 1979. godine р53 protein је identiflkovan kao 53-kDa protein koji se vezuje za veliki Т antigen sarkoma virusa SV 40 (Lane et al., 1979). Bilo је potrebno deset godina da se р53 prepozna kao turnor supresomi gen i da stvaranje kompl eksa sa Т antigenom inaktivira р53 (Lane, Genes Dev, 90). Viralni protein maskira DNK-vezujucu povrsinu р53, sprecavajuCi na taj nacin njegovu funkciju transkripcionog faktora za gene uljucene u popravku DNK, zaнstavljanje rasta i apoptozu. Kod cervikalnog kance ra, u 90% slucajeva, drнgi viralni protein-human papiloma virus Еб, aktivira degradaciju р53 (Scheffner et al., 1990). Povecana ekspresija protoonkogena mdm2 utice na degradaciju wt р53. Mdm2 protein norrnalno regulise celijski nivo р53 sprecavajuci nepotrebnu p53-indukovanu apoptozu. Prema tome, suvise male koliCine р53 dozvoljavaj u celijama kancera da proliferisu, dok prevelika koncentracija р53 moze Ьiti letalna, sto је pokazano u eksperimentima sa rnisevima deficijentnim za mdm2 gen (de Rozieres et а\. , 2000). Funkcionalno, р53 је u centпa siroke mreze prenosnika signala i efcktora, povezanih sa G 1 i G2 restrikcionim tackama celijskog ciklнsa (S iika 2), i diktira nj ihovo medjusobno interreagovanje, sto razvice kancera cini kompleksnim, visestepenim procesom (Vogelstein et al., 2000). Slika 2; negativna regulatorna povratna sprega kontrolise celijske nivoe р53. U norrnalnim celijama, p53-zavisna transkripcija mdm2, ubrzava degradacij u р53. Onkogena aktivacija, ostecenje ОNК, npr. hemioterapij skim agensima, aktivira proteinske kinaze (АТМ ili АRМ), koje kroz DNК-zavisnu kinazu DNК-PK i kazei n-kinazu 2(СК11), fosforilisu amino- terminalni deo р53 , sto sprccava vezivanje rndm2. Ovi dogadjaji dovode do povecanja nivoa р53 koji potom akti vira transkripciju svojih ciljnih gena. р21 i 14-3-3 dovode do zastoja ce!Uskog ciklusa u G 1 i G2 kontrolnim tackama inhiЬiranj em ciklin-zavisnih protein kinaza (СОК); F AS, ВАХ i р53 AIP ubrzavaju apoptozu, ukoliko пiје rnoguce нkloniti nastalo ostecenje DNK. 5 Oncogene ac:tivation р5З degraoatюn DNAd:~mage Chemotheropy 1 1 N р5З tOtgct~ Rcsponsc G 1 ~t G2 arm>t Др:х:tо:;$ DNA ·срМ Nature Revlews l Cancer Slika 2. Uloga р53 kao tumor supresornog gena (Вullock et al., 2001) Prva mutacija u р53 genu kod osobe obolele od kancera, zabelezena је 1989 (Вaker et а\ ., 1989). Sada se zna da vise od polovine svih kancera ima mutirani рSЗ gen. Kanceri sa inaktivniщ mutiranim рSЗ su agresivni i cesto rezistentni na zracnu i hemioterapiju. Losa prognoza ovih kancera је rezultat nepostojanja pSЗ-zavisne apoptoze, а sto ima va.zne implikacije za druge vrste antikancerskih terapija. Jasno је da mutirani рSЗ predstavlja jedan od najva.Zilljih klinickih targeta za delovanje novih terapija, mada tu postoji mnogo nepoznanica. Jedno od najcesce postavljanih pitanja је kako toliko razlicitih tackastih mutacija izaziva isti inhЉitomi efekat i da li је uopste moguce vratiti proces unazad? 6 1.2.2. Osohine mutiranog р53 Као sto smo ranije pomenuli, struktura р53 proteina ima sve odlike transkripcioлog faktora, sa amino-terminalnim transaktivacionim domenom, centralrlim DNК-vezujucim domenom i karboksi-terrrllлalnim oligomerizacionim i regulatornim domenom (Slika 3). Nature Rev.ews 1 сапе« Slika З . Struktura eetiri р53 domena (ЗD) (Bullock et аЈ . , 2001) а) Amiлo-terminalni domen za koji se vezuje mdm-2 protein Ь) Centralru domen р53 vezan za DNК с) р53 domen odgovoran za tetramerizaciju d) Karboksi-teпninalni domen Do danas је identifikovano vise od 10 000 razlicitih somatskih mutacija и р53 genu (0\ivier et al., 2002). Oko 95% svih mutacija, lokalizovano је u centralnom DNK-vezuju6em domenu (Siika 4), sto potvrdjuje da је kljucna uloga р53 u aktivaciji transkripcije. 75% mutacija su tackaste mutacije, dok ostatak cine, ali u mnogo manjoj meri delecije, insercije ili ftameshift mutacije. Р248 R273 Codon ACidic SIIЗ Telt& transactl\"&t.on 1 g;mn (',.nre (D'IA·Ьnnng) rf'ef r.:~tion 1 11 11 ..;..ГI/;...__ Nature Reviews 1 Cancer S\jka 4. Ucestalost i djstriЬиcija р53 mutacjja (Виllock et al., 2001) Кristalna struktura sredisnjeg DNК-vezujиceg domena р53 proteina, potvrdjena је 1994 godjne (Cho et al., 1994), sto је stvorilo novu osnovu za razumevanje funkcije mutiranog р53 . Ovaj domen cine jezgro sastavljeno od Р- sendvic struk:tumih motiva ј DNК-vezujиca povrsjna, koja иkljucиje LSH motiv (engl. Loop-sheet-helix; petlja-ravna struktura-he1iks) i dve petlje (L2 i LЗ), spojene jednim atomom Zn. Moze se definjsati sest tzv. «vrucih zona» gde se mиtacije najcesce javljaju: dve sи u direktnom kontaktu sa DNК, mиtacije R248 (LЗ) i R273 (LSН), dok se preostalih cetiri nalazi и okruZujиeoj strukturi, mиtacjje Rl75 (L2), G245 (LЗ), R249 (LЗ) ј R282 (LSН), (SJjka 4). Iz ove podele proizilaze dve klase mиtacjja : DNК­ kontaktne mиtacjje ј strukturne mиtacjje. Ove dve klase mutacjja mogu se razlikovatj i роmоси dva po\jklonska antjtela, РАЬ1620 i РАЬ240, sintetisana na osnovu nativnog i denaturisanog р53 . Kontaktni mutanti иglavnom vezujи РАЬ1620 zato sto роsеdији intaktno nativno иvijanje, dok stru.kturni mиtantj specificno vezujи РАЫ40 kontinиirani epjtop delirnicno razgradjen ј nepristupacan и nativnom stanjи (Mj lner et al., 1995) . Struktиrni mиtanti centralлog regiona р53, bez obzira na vrstu mиtacj e, imaju istu konformacijи . Terrnodinamicke studjje sirokog spektra mиtacjja centralnog regiona р53 иkаzији na postojanje tri tipa mиtacjja odnosno tri vrste fenotipa и odnosu na иvijanje DNК: DNК-kontaktne mutacije koje и maloj meri јmаји ili иopste nemaju efekat na иvijanj e Mиtacije koje narusavajи lokalnu strukturu ј Mиtacije koje uzrokujи denaturacjjи DNК (vise od 50% lanaca DNК је и odmotanoj formj) (Виllock et al., 2000). Mиtacije и okviru Р- sendvic strukture sve pripadajи poslednjoj grupi, раје denaturacija jedini mehanizam kojim one inaktivirajи р53 . Nasuprot njima mutacije na DNК-vezujиcoj povrsini mogu se svrstati и sve tri kategorije, sto obja8njava njihovu dominantnost kod kancera. Ova razlika se moze vjdeti иporedjjvanjem mиtacija и okviru Р- sendviea sa mutacijama и delu koj i okruZuje vezиjuce mesto za Zn: svi Р- sendvic mиtanti vezuju se za promotor DNК na 20"С, temperaturi koja је optimalna za uvijanje, dok mutant j Zn-vezuju6eg mesta imajи narusenu strukturu koja onemogucava njihovo vezivanje za DNК (Вullock et al., 2000). ОЬа tipa mutacija denaturisи protein na ЗТС. Podela pomenиta tri fenotipa na kompetentne, 8 odnosпo пekompeteпtпe и оdпоsи па vezivanje za DNК, defin_ise јеdап wt ceпtralni region р53 i pet grupa mиtanata. Ove grиpe mogи predstavljati potencijalпa ciljпa mesta и р53 , cija se funkcioпalnost moze povratiti. Povracaj funkcionalnosti mиtantima predstavlja veliki izazov: kako uciniti reverziЬilnim proces supstitucije jednc amino kiscliпe и ceпtralnom domeпu р53? Koriscenjem racionalnog dizajna (Wieczorek et а\. , 1996) i genske selekcije (Brachmann ct al., 1998), ideпtifikovana sи tri tipa supresomih mutacija: mutacije koje uvode nove kontaktne povrsine sa DNК mutacije koje korigиju lokalne strukturne distorzije i mutacije koje povecavajи ukupnu termodinamicku staЬilnost centralnog domeпa Prve dve grupe mutacija mogu delovati samo u slucaju specificruh genskih alteracija. Na primer, T248R mиtacija povecava afшitet vezivanja za DNK R273H mиtanta, dok Hl68R omogucava R249S mиtantu da sprcci preturbaciju L3 petlje (Nikolova et al., 2000) Treca grupa mutacija obuhvata opste supresore koji mogu vratiti funkcionalnost Ьilo kom mнtantu osetljivom na promenи temperature. Pronadjene sн dve takve mнtacije N239Z i N268D. Zajedno ove mнtacije povecavaju stabilnost centralnog domena р53 i obnavljaju funkciju mнtanta V 143А (Вrachmanл et al., 1998). Obnavljanje ceпtralлog domena tretira defektni р53 na njegovom najva2nijem mestu, ali kako se ovaj model uklapa u sirи slikи р53 tetramera? Vec smo pomenиli da germinativna mutacija н samo jednom od dva р53 alela, narиsava funkciju р53 i stvara predispozicijи za nastanak kancera (Li-Fraumeni sindrom). Dominantno negativni efekat mиtanata implicira da mutant i wt protein formiraju funkcionalno neaktivne hetero-oligomere. DNK-koпtaktпi mLLtanti i kao koпstrukti bez centralnog domena, takodje ispoljavaj и dominantпo пegativni efekat, ukazиjиci da smапјепје afiniteta tetramera za vezivanje za DNK nije dovoljno za domiпantnost (Сhепе et al., 2000). Dominantпo negativпi efekat moze onemogиciti jedan drugi pristup obnavljanjи funkcij e р53 - gensktl terapiju (Ghaneh et al., 2001). Negativna dominatnost и ovim slиcajevima moze nadvladati efekat genske terpije, иvodjenjem varijanti koje imajи nove tctramerizacione domene koji hibridizujи sarru sa sobom (Маtеи et al., 1999). р53 tetramcr normalno se nalazi и lateпtnoj inaktivnoj kvartenamoj formi (Нирр et al. , 1994). Ekstremni C-terminalni domen inhiЬira aktivnost proteiпa vezivanjem za DNК bez specificпosti sekvence i verovatno regиlacijom proteinskih kontakata tшиtar tetramera. Aktivacija podrazumeva N-terminalпи fosforilacijи koja inhiЬira vezivanj e za mdm2, а samim tin1 povecava polиzivot proteina i modifikaciju C-terminusa (fosforilacija i acetilacija), sto anиlira aktivnost negativnog regиlatornog domena. Dodavanje sintetickog peptida пapravljeпog па osnovи C-terminalпog domena takodje ima stimulatorпi efekat. DNK- kontaktпi mutant R273H ima naj s laЬiji domiпantno negativпi efekat ра dodavanje ovog aktivirajuceg peptida moze omoguciti vezivanje za DNK i iлdukovati apoptozu in vivo (Kim et al., 1999). Analiza efekta mиtacija па drugom mestu koje mogи povratiti funkcijи mиtanta sa hot spot mиtacijama, implicira da је moguce stabilizovati na genericki пacin mnoge destaЬilizovane р53 mиtante. Dalje, specificne mиtacije koje narиsavaju nativnи strиktиrи takodje mogu Ьiti revertirane. Aktivacija р53 tetrarnera peptidom koji se vezuje za C-termiпus mozc Ьiti dovoljпa za vracanje funkcije kontaktnom mиtantи R273H koji је zaddao iпtaktno, пativno иvijanjc. Postavlja se pitanje koji Ьi od od ovih pristupa Ьiо najиspesniji и odredjivanjи terapije lekovima. Verovatno је najprihvatljiviji pristup pronaci male molekиle koji imitiraju efekat globalnih sиpresornih mиtacija. Ovi molekиli se morajи snazno vezivati za nativnu 9 formu а slabo za denaturisanu. Kakva је teorijska osnova ovog pristupa? U svakom slucaju terapeutska sredstva imaju pristup i zdravim i malignim celijama, sto povecava stabilnost i wt i mutantnog proteina. Stтatcgija pociva na tri funkcionalne razlike izmedju wt i mutantnog р53: prvo, na akumulaciji mutantnog р53 u odsustvu mdm2; drugo, na aktivaciji р53 kvartenarпe strukture u odgovoru па ostecenje DNK; i trece na aktivaciji drugih 6elijskih proteina kao sto је E2F-1 koji deluje sinergisticki sa р53. Ovi faktori mogu stimulisati p53-zavisan apoptoticki odgovor koji је tumor specifican. Wt р53 protein ima nativnu strukturu, svaka promena konformacijc а samim tim i aktivnosti ukazuje na prisustvo mutiranog р53 u celiji. Stepen u kojem su norma1ne 6elije senzitivпe na apoptozu zavisice od komЬinacija t1-adicionalnih terapija (hernio i radioterapije) i р53 specificnih tretmana. Mutacije u P-nabranoj strukturi cine 25% svih tackastih mutacija i uzrok su pojave temperaturno osetljivog fenotipa cija se funkcija moze povratiti gore navedenim pristupom. Posto otprilike jedna petiпa pacijenata sa р53 mutacijama razvija ovaj tip mutantnog р5 3, ova klasa predstavlja znacajaп terapeutski cilj. Neke mutacije koje pogadjaju DNК-vezujucu povr5inu proteina takodje mogu destabilizovati protein malim strukturnim distorzijama i na taj nacin omoguciti strategiju povracaja funkcionalпosti. Mutacije u Zn-vezujucem mestu ne pripadaju ovoj kategoriji, one izazivaj u promeпe koje su suvise velike da Ьi Ьile reverziЬilne (ВuJlock ct al., 200 1 ). Zahva1juju6i velikom interesovanju za р53 poslednjih godina rasvetljen је skoro svaki aspckt njegove Ьiologije i Ьiohernije. Najveca saznanja su svakako da је р53 za sekvencu specifican transkripcioni faktor i da kao takav nakon vezivanja za definisane konsenzusne DNK sekvence aktivira transkripciju odredjenЉ, ciljnih gena. Broj potvrdjenih i pretpostavljenih р53 ciljnih gena staJпo raste, а karakterizacija proteina kodiranih ovim genima omogucava uvid u funkciju р53. Takodje р53 moze suprimirati ekspresiju nekih gena, mada su mehanizrni takvog delovanja rnnogo manje poznati. Sa Ьioloske tacke gledista, р53 је sposoban za izazivanj e dramaticnih promena u ce1iji, pocev od zastoja rasta, permancntnog prekida celijskog cikJusa, terminalпe diferencijacije do apoptoze. Glavna osobina р53 је da је on u normalnim celijama esencijalno u latentnom stanju i nema uticaja па sudЬinu celije. Kada celije budu izlozene razlicitim vidovima stresa, р53 se brzo prebacuje u aktivno stanje, sto rezultira sna:lnim fenotipsk im efektima. Ova aktivacija је kljuc funkcije р53 kao tt1mor supresora. Istrazivaцja Ьiohemijske osnove prebacivanja р53 iz latentne u aktivnu formu otkrila su c itavu mrczu mo1ekularni11 interakcija koje pozicioniraju р53 u centar kompleksne mreze sigпalne transdukcije (Vogelstein et al., 2000). Uprkos velikom broju informacija о р53 , preostaje jos rnnogo klj ucnih pitanja. Nastojanja da se definisu precizni odgovori na ova pitanja formiraju Гokus rnnogih aktuelnih р53 istra:livanja. Neka od tih pitanja sн: Na koji nac in р53 "oseea" da treba da se aktivira i umesa u sudbinu celije? U cemu se aktivirana р53 forma razlikuje od "Jatentne" forme? Kako aktivacija р53 dovodi do razlicitih Ьioloskih ishoda, ili na koji naCin aktivirani р53 u nekim slucajevima dovodi do zastoja u celijskom ciklusu а u drugim do apoptoze? Zasto neki individualni tumori zadr:lavaju wt р53 gen, dok u isto vreme drugi tumori sa s licnim patoЬioloskim karakteristikama podlefu mutacionoj inaktivacUi оЬа alela р53 gena? 10 Da li mutantne forme р53 koje se и visokim nivoima nagomilavaju u mnogim tumorima, doprinose osoЬinama tumora? Da li odredjivanje р53 statusa tumora moze biti osnova za donosenje preciznijih terapeutskih odluka? 1.2.3. Bazalna p53-Mdm2 sprega U celijama koje njsu izloiene stresnim situacijama aktivnost р53 је subjekat efektivne represije, koja protein odriava u ЬiolosЮ latentnom stanju. Represija р53 aktivacije је vecim delom rezultat akcije Mdm2 proteina, produkta proto-onkogena. Mdm2 је sa р53 povezan mnogim speciticnim naCinima. S jedoe strane Mdm2 protein se vezuje za р53 i deluje kao njegov glavni celijsЮ antagonist. Ovo se postiie delom kroz direktnu interferencu vezanog Mdm2 sa transkripcjonim aktivnostima р53, а uglavnom kroz sposobnost Mdm2 da ucjni р53 podlo:lnim brzoj proteolizi. Mdm2 moze da funkcjonise kao p53-specjficna ЕЗ uЬikvitin Jjgaza, koja pricvrscuje uЬikvtin ostatke na р53 ј salje ga na degradaciju u 26S proteozom. S drнge strane mdm2 gen је direktni cilj za pozitivnu transkripcionu aktivaciju sa р53. Ova medjusobna povezanost izmedju р53 i Mdm2 definise bazalntt p53-Mdm2 spregu, koja predstavlja samo "srce" р53 regulacione mreze (Siika 2). Sve dokje petlja potpuno zatvorena, ravnoteia izmedju р53 i Mdm2 nagjnje ka Mdm2, sto rezultira kontjnuiranom represijom aktjvnosti р53 i njegovim odriavanjem u Ьioloski inertnom stanju. Svaka promena u ovoj delikatnoj ravnotezi, narocito promene koje redukuju interakcjju izmedju dva proteina, mogu povecati celijsktt р53 aktivnost i potencijalno povecati fenotipski р53 odgovor. Zajednicko је da veliЮ broj stres signala utice na bazalnu spregu na razliSite nacinc, ali svi u krajnjem slucaju srnanjuju restriktivni efekat Mdm2, sto za posledicu ima indukciju р53 aktivnosti (Oren et al., 2002). 1.2.4. Aklivac!ja р53 onkogenima Jedna od situacUa koja se cesto javlja pri narusavanju aktivnosti р53, је nedozvoljena, konstitutivna aktivacija signalnih puteva kojj stumulisu rast, kao u slucaju kad odredjeni proto- onkogeni usled aktivirajuce mutacjje postanu aktivni onkogeni Kada se onkogen nepravilno aktivira u nai zgled norrnalnoj celiji, р53 se alarmira i pokrece fcnnotipsЮ odgovor koji sprecava takvu potencijalno neoplasticnu 6eliju od daljeg napredovanja do maligne celije. U 6elijama u kojima је pokazana povezanost jzmedju onkogene aktivacjje i indukcije р53, aktivirani onkogen се slobodno ispoljiti svoj aberantni efekat i dovesti do konverzije ka neoplazmi. Sprega izmedju onkogene aktivacije i indukcije р53 , definise k.ljucnu ulogu р53 kao turnor supresora. Iako aktjvjrani onkogeni verovatno izazivaju odgovor р53 na vjse nacina, najbolje prouceni mehanizam uklttcuje ARF tumor supresorni protein (Lowe et al., 1999). fNK4a/ ARF lokus је odmah posle р53 ро frekvenci nadjeniћ mutacija u humanim kancerima. Ovaj lokus kodira p161NK4a, inhiЬitor ciklin-zavjsne kinaze, koji deluje posle retinoЬiastoma proteina (Rb), ј dovodi do zastoja celijskog cjkJusa. Dok postojeci podaci ukazuju da је р 16JNK4a vafni tumor supresor, INK4al ARF lokus kodira i drugi protejn, translatovan iz drugog okvjra citanja, ј oznacen kao р 1 9лRЈ' (Quelle et al., 1995). р 161Nк4а i р 19лRF su cesto zajedno deletirani и tumorskim celijama, mada је pokazano da su misevi samo bez р 19лRF ekstremno prijemcivi za kancer. Vise istrazivanja sugerise da pl ~F moze funkcionisati kroz genske i Ьiohemijske puteve koji ukJjucuju р53 . Na nivou organizma, posledice delecjje р53 i р 1 9лRF su jzrazito slicne (Kamjjo et al., 1997). Mutirani mis se razvija normalno, ali ima vjsoku predjspozjciju za maJjgne tumore sl icnjh osoЬina. Na celijskom njvou, pojacana ekspresija р 19лRF moze indukovati zastoj celijskog cjkJusa u celijama koje imaju wt р53 ali ne i u ceJjjama koje eksprimiraju mutirani р53. S druge strane p19лRF mote Ьiti fizjcki povezan sa samim р53, sa Mdm2 i na taj nacin menjati nivoe р53 i njegovu aktivnost (Kamijo et al., 1998). ARF se vezuje za Mdm2 i inhiЬira njegovu aktivnost, sto omogucava р53 da se otrgne Mdm2- posredovanoj represiji i akumtJ\jra u nivoirna koji StJ dovoljni da izazovu р53 zavisпi odgovor. Ranije studjje su identifikovaJe odredjeni broj onkogena Cija је aktivacij a povczana sa indukcjjom р53 ; tu se ubrajaju myc, Ras, adenovirus ElA i E2Fl (Lowe ct al., 1999). Novija jstrazivanja pokazџju da sljcna povezanost postoji u sltJcaju jos jednog onkogena, beta katenina. Dok је beta katenin u normalnirn uslovima strukturna komponenta t1 mestima adhezije celija-celija, on ponekad moze imati иlogu transkripcionog faktora u nukleusu. Ovo se normalno dogadja u odredjenim fazama razvica, а abnormalno u celijama kancera kad tJsled mutacija dolazj do deregulacije beta katenina. Deregulisani beta katenin ne samo da нpravlja procesima koji dovodc do kancera, vec i omogucava akнmulacjju transkripciono aktivnog р53. Као i drugi onkogeni, izmenjeni beta katenin mote da stimulise transkripciju ARF mRNК, sto dovodi do inhi Ьicije Mdm2 i konsekventne akumulacije aktjvnog р53 (Damalas et al., 200 Ј ) . Jmajuci u vidu da povezanost izrnedju beta katenina i р53 ima Гunkciju anti kancerskog mehanizma, visak beta katenina ispoljava inhiЬitorne efekte u celijama sa intaktnom funkcijom р53. Kako u stvari beta katenin dovodi do stvaranja kancera? Jedan nacin је mutaciona inaktivacija р53. Ova inaktivacija primecena је u mnogim tumorima sa deregulisanim beta kateninom (Esteller et aL., 2000). Inaktjvacija ARF omogџcava celjjama kancera da izbegnu protektjvni р5 3 odgovor. Neka novija istraziva11ja па kolorektalnim tиmorima otkrila su znacajnu proporcjju celija koje ne eksprjшjrajtl ARF usled gasenja transkripcije zbog metilacije promotora (Esteller et al., 2000). Izgleda da se gasenje funkcjje ARF desava rano и progтesjj i tumora, paralelno sa deregulacijom beta kateniпa, sto zajedno Cini inicijalni dogadjaj u progresiji ovog tipa kaпcera. Као i kod svih regulatornih mreza ј ovde postoji niz nerazjasnjenih pitanja. ZзSto је neophodna direktna inaktivacjja р53 ako ga povezivanje sa deregulisaпim beta kateninom ionako razara? Jedan od verovatnijih odgovora је da takvi tнmori imaju vise karakteristika genomske nestaЬilnosti , ukljucujuci velike hromozomske aberacije ј aneuploidjjн. Posto ovakva genska ostecenja mogu indukovati р53 cak i u odsustvu ARF, pretpostavka је da је mogнca direktna inaktjvacija р53 nezavisno od statusa ARF. Gasenje funkcije ARF desava se rano u kancerogenezi tako da nije н mogнcnosti da inhjЬira aktiviranje dereguljsanog beta katenina, dok se mutacije р53 gena javljaju u kasnijim fazama paralelno sa postepenim povecanjem ukupne genomske nestabilnosti. Atraktivnije obja8njenje za pojavu р53 mutacija u kasnijjm fazama tumorske progresije omoguceno је otkricem drugog kraka petlje beta katenin-p53. Visoki nivoi aktiviranog wt р53, kao odgovor na vece ostecenje DNK, mogu dovesti do proteolize beta kateпina verovatno kroz dejstvo visestrukih ЕЗ иЬikvitin \jgaza (Sadot et al., 200 Ј). U slucaju kad se р53 н proliferisнcim tumorima aktivira и odgovoru na 12 akumulirana genska ostecenja, on smanjиje aktivnost hiperaktivnog beta katenina i na taj nacin ponistava signal koji је inicirao neoplasticni proces. Takodje, mиtiraпi р53 prote jni kojj se akиmuJirajи u tumorskim celijama mogи biti mnogo vise od "mrtvog" р53. Postoje podaci da posle ponistavanja tumor sиpresome funkcije wt р53, mиtacije u р53 genu koje sи ceste и kancerskim celijama, dаји nove, onkogene osoЬine mutiranirn proteinima (Sigal et al., 2000). Ovo "povecanje funkcije" moze Ьiti dodatna pokretacka snaga za ројаvи р53 mutacija u kasnijim fazama tumorske progres jje. Za razJikи od apoptoskog odgovora koji cesto prati indukcUи ARF ј aktivacijи р53 drugim onkogenima, deregulisani beta katenin favorizuje viaЬilni izlaz iz 6elijskog ciklusa. Ovo sugerise da paralelno sa pozitivnom regulacijom р53, beta katenin takodje moze ispoljavati anti-apoptotski efekat koji sprecava letalni ishod. Ovu pretpostavku potvrdilo је skorasnje otkrice proteina WlSP-1 , cija је ekspresija pod tltjcajem deregulisanog beta kateruna а koji posedиje potentna anti-apoptoska svojstva (Su et al., 2002). Aktivnost WISP-1 је uslovljena aktivacijom Akt protein kinaze koja је komponenta jos jedne p53-zavisne autoregulatome petlje. Ovim objзSnjenjem prica se ne zavrsava. Osjm promena r1a р53 i beta kateninu, prosecna 6elija kancera sadrii znacajan broj dodatruh genskih alteracija. Veliki broj njih moze imati uticaja na petlju beta katenin-p53, menjajuCi ravnotezu razJicitih komponenata. Relevantni primer је Ras onkogen, koji је cesto aktiviran u humanim tumorima. Pronadjeno је da Ras moze pokrenuti transkripciju mdm2 gena, povecavajиci nivo Mdm2 i tako uticati na aktivnost р53 (Ries et al., 2000). Znacajno је i da Ras indukuje ekspresjjи ARF. Pokazaпo је da u celij ama kojiшa nedostaje ARF, Ras sиprimira funkciju р53 tako sto poziti vno regulise Mdm2; s druge strane ako је ARF funkcionalan ј eksprimiran и dovoljnoj koljcinj moze nadvladati funk:ciju Mdm2 i onemoguciti protektivni р53 odgovor. 1.2.5. p53-Akt-Mdm2 sprega lzucavanja posvecena regиlacij j p53-posredovane apoptoze, identj fikovala su jos jednu kontrolnи Spregu koja moze jgratj VaZllи ulogu U Odredj ivanju ishoda celjjskih dogadjaja posredovanih р53. Ova sprega ukljucuje Аkt/РКВ protejn kinazu, za koju se zna da favorizuje anti-apoptotske efckte i posreduje u s jgnalima prezjvljavanja (Datta et al. , 1999). Aktjvacija Akt-a signalima prezivljavanja postize se uglavnom kroz kinaznu kaskadu koja ukljиcuje PB- kinazu i nishodпe protein kinaze. Noviji radovi otkrili su da Akt jma preklapanja sa р53 signalnim putem. U tom slucaju kao sto је slucaj i sa ARF, direktnj сј Јј nije sam р53 vec pre Mdm2. Akt mo:le da se veze za Mdm2, i fosforj(j se ga na najmanj e dva mesta u okvjru centralnog domena Мdш2 (Gottljcb et al., 2002). Ovo onemogucava Mdm2 da se translocira jz cjtoplazn1e tr jedro, gde treba da se veze za р53 ј na taj nacin obezbedj nj egovu inaktivaciju, uЬikvitinaciju ј degradacUи. Prema tome Akt је neophodan za punu aktivnost Mdm2. Signali prczivljavanja koji povecavajи Akt aktivnost mogu potencirati inhiЬitorni efekat Mdm2 ј smaпjiti р53 odgovor, sto objasnjava sposobnost Лkt-a da interfer·ira sa p53-posredovarюm apoptozom (Sabbatjru et al., 1999). S druge strane kad se р53 aktivira odgovarajuciш signalima, moze negativno da regulise celijske nivoe Akt-a. Ро ovom scenariu, indukcija visoke aktivnost р53, sto se desava kad se celije jzloze velikim ostecenjirna DNК, pokrece brzo i efikasno proteoliticko cepanje Akt-a posredovano kaspazama, sto rezultira dramaticnim padom ukupnog nivoa Akt-a. Kaspazama posredovana degradacija Akt-a cesta је u kasпijim fazama apoptotskog procesa, i prctpostavlja se da predstavlja sekиndamu posledicu masovne aktivacije kaspaza koja је karakteristicna za ovaj proces. U slucaju aktiviranog р53 ova 13 degradacija se desava znatno ranije, sto podrZava cinj enicu da ovaj proces ima kriticnu ulogu u omogucavanju p53-zavisne apoptoze. Slican sled dogadjaja postoji i u slucaju рRВ tumor supresornog proteina, cija p53-zavisna brza degradacija kaspazama takodje olaksava apoptozu u nekim tipovima celija. SledeCi ucesnik ove sprege је PTEN. PTEN, takodje tumor supresorni gen kodira fosfatid il inozitid fosfatazu koja ucestvuje u delovanju РВ kinaze (Simpson et а\. , 2001). РТЕN sprecava aktivaciju Akt-a, sto omogucava apoptozu. Novija istraZivanja su pokazala da р53 moze da transaktivira PTEN gen (Stambolic et al., 2001). То imp\icira, da kad р53 postane aktiviran on moze uzrokovati povecanje celijskЉ nivoa PTEN, na taj nacin smanjujuci aktivnost Akt i omogucavajuCi apoptozu. U stvari pokazano је da PTEN moze efikasno da stiti р53 od inhiЬitornih efekata Mdm2 i poveeava p53-zavisno uЬijanje celija hemioterapijom (Мауо et al., 2002). P53-Mdm2-Akt sprega moze predstavljati s jedne strane mesto integracije signala prezivljavaлja, а s druge strane mesto integracije pro-apoptotski\1 stresnih sigлala. Ova petlja defшise drugu vrstu balansa, gde sudbina celije moze dramaticno varirati, u zavisnosti od celijskog sadrZaja. U odsustvu signala prezivljavanja, inteлzivni stres се dovesti do uspesne aktivacij e р53, inaktivacije i proteoliticke degradacije Akt-a, i eventualne apoptoze. S druge strane, potentni signali prezivljavaлja aktivirace Akt, potencirati Mdm2, i eventualno smanjiti funkciju р53 onemogucavajuCi njegov Ьioloski efekat. Prema tome, ravпoteza izmedju razliCitih komponeпata sprege odredice izbor izmedju celijskog zivota i smrti. Potpuno је jasno da se р53 nalazi u centru kompleksne rnreze regulatomih puteva. Deo ove rnreze predstavljen autoregulatornim petljama prethodno је opisan. U svakom slucaju, ma kako komplikovano izgledale ove sprege, one Sll znatno pojednostavljene. Yerovatno је da poznati regulatomi putevi interkaliraju sa dodatnim, jos neotkriveпim, kao sto је ilustrovano WISP-1 proteinom koji indukovan deregulisanim beta kateniпom, inhiЬira p53-zavisnu apoptozu. Nemoguce је predvideti eventualni Ьioloski ishod р53 odgovora jednostavnirn praceпjem јеdпе ili nekoliko komponenti. Trenutno raspolozive iпformacije ukazuju da је u normaln im celijama, ukupпa ravnoteza izmedju suprotnih signalnih puteva, uspostavljcna tako da р53 оЫсnо "pobedi". То omogucava proteinu р53 da bude eftkasni integrator strcsnih signa\a i uspesni tumor supresor. Cak i u takvim normalnim celijama, ova delikatna ravnote:la moze Ыti poremecena mnostvom faktora, ukljucujuCi i signale iz spoljasnje sredine. U ovim slucajevima, inhiЬicija aktiviraпja р53 је pozeljna, jer dopusta neophodnu cel ijsku proliferaciju i spasava celije пezeljene smrti. Medjutim, ravnoteza u nekim slucajevima moze Ьiti permanentno pomerena, kao sto se desava kada је funkcija ARF-a smanjena, ili је PTEN deletiran ili је sam р5З mutiran. U takvim situacijama celija је lisena protektivnog delovanja р53, ostavljajuci otvoren put nastanklt kancera. 1.3. Koriscenje р53 signalnog puta и cilju poboljsanja anti-kancerskilt tretmana Analize moguCib genskih alteracija р53 uveliko se koriste u evaluaciji efikasnosti anti- kancerskih tretшana. Yise od polovine pozпatih mutacija u р53 genu, inaktivira normalnu funkcUu proteina. Germinativne mutacije u р53 karakteristicne su za nasledno оЬоlјепје, Li- Frauшeni sindrom. р53 protein је sna:lan transkripcioni faktor koji se vezujc za vise od 300 razlicitih promotorskih elemenata, menjajuci na taj nacin ekspresiju шnogih gena (Zbao et al., 2000). Put p53-indнkovane genskc ekspresije moze uzrokovati zastoj celij skog ciklusa i/ili apoptozu. Skorasпja istra:livanja ukazuju da indukcija р53 poCiva na osetljivoj ravnotezi 14 jzmedju procesa starenja ј razvjca kancera. Na primer, mjsevj sa visoko ak:tivnjm р53 lokusom njkad ne dоЬiјаји kancer a lj pokazиju znak:e preranog starenja, dok misevj sa redukovanom р53 aktjvnoscu razvijajн kancer u ranoj doЬi i umiru (Tyner et al., 2002). lako је р53 bez sumnje tunюr supresorni gen, on ne podrzava doslovce Knudsen-ov modeJ za funkcjonisanje tumot· supresornjh gena, ро kome оЬа genska alela moraju bjtj inaktivisana da Ьi doslo do razvica tumora. Kod Li-Fraumeni sindroma i и р53 pozitjvnim/negatjvnirn misevima, jedan wt alel nije uvek izguЬljen, ukazujuci da haplo-insиficijencija (redиkovana forma р53 gena), moze biti dovoljna za neoplasticnu transformaciju. Kompleksnost gensЮh alteracija р53 potice i od toga sto sи mnoge i germinativne i somatske mutacije u р53 genи tackaste mutacije. Izmenjeni protein је cesto eksprjmiran u visoЮm nivoima u tumorima i moze imatj negativno dominantnj efekat na endogeni normalni р53, ili delovatj nezavisno na druge celjjske procese. Ovu postavku podrazava otkrice da sи odredjene germinatjvne tackaste mиtacije povezane sa retkom naslednom prijemcivoscu za adreno-kortikalni kancer (Varley et al., 1999). U proteklih deset godina, genske i Ьiohemijske anaJize р53 signalnog риtа kojj vodi od celijskih signala stresa (preko aktivacije р53), do zastoja celijskog rasta ј apoptoze, jdcntifikovale sи mnoge c jJjeve za razvice novih terapij skih pristupa. Takodje, vrsena sи mnoga istral.ivanja koja su potvrdila da su toksicnost i efikasnost mnogih rutinski koriscenih anti-kancerskih terapija visoko uslovljene р53 regulatornom pиtanjom. Мnogj cjtotoksicni lekovi indиkиjи р53 odgovor u normaJnom tkivu, dok su tumori koji zadгZavaju normaJnu funkciju р53 и mnogim slucajevima osetljiviji na tretman. Transkripciona aktivnost р53 indukovana је raznim vrstama signala, ukljиcujuci hemijske oksidanse (slobodni radikali), niski ekstraceJularni рН , hipoksijи i visokн temperaturu. UoЬicajeni antikancerski agensi koji na slican пacin ostecujtt celiju, иkljиcujиci adrjamicin, 5- fltюrouracil , jonizujuce zraceпje i etopozid, mogu jndukovatj р53 ak:tivnost, иkazиjucj da ovaj tumor supresorni pttt rnoze odgovarati na egzogene agense koji suprimirajи rast tumora (Нирр et аЈ. , 2000). Uprkos cinjenici da razliciti ageлsj kojj ostecuju ceJiju ј same celij ske komponente pokazuju sJ jcne osobine u regulacij i funkcije р53, ne moze se uzeti nijedan pojedinacni primer da Ьi se spoznale sve komponente р53 regulatorne pиtanje. Konstruisanje genskog profila koriscenjem oligonukleotidnih mikroareja jasno је pokazalo razlike i sljcnosti н produktima gena indukovanih ili represiranih delovanjem р53 proteina н razlicjtim tipovima ccljja pod razliCitim uslovjma (Zhao R, Genes Dev 2000). rstral.ivanja па celijskim linijarna kolorektalnog karcinoma pokazala su da је za 5-flнorOLlracil-indukovanu apotozu neophodan wt р53 ali ne i пjegov efektorni protein р21 WAFI , dok adrjamjcin-zavisna apotoza moze Ьiti jnhiЬirana medjusobnim delovanjem р53- р21 wдF I (Bunz et al., 1999). Ovi rezultati jasno ukazuju na neophodnost precizne analize р53 gena (gensko profiJ isanje) u ci lj u najboljeg odabira optimalne terapije za svakog pacijenta. Ј. З. Ј. Regulacija fimkcije р53 stabilizacijom proteina Aktivnost wt р53 uglavnom је regulisana degradacijom р53 proteina (Oren et al., 1999). Pod normaJnim uslovima, wt р53 se brzo razgradjuje proteozomima, agensima kojj ostecuju DNK, inhiЬjtorima transkripcije ј u manjem stepenu agensima koji izazivaju hipoksiju kao ј agensima koji deluju na mjkrotubule jer uzrokuju staЬilizaciju р53 i samim tjm i njegovu akumulaciju. Za razliku od р53 proteina, р53 mRNA u ovim slucajevima njje jлdukovana. Nakon translacije р53 mRNK, Ьlokiranje degradacije р53 rezuJtira ak:umulacijom р53. Kada se degradacija р53 i sinteza р53 (translacija) simultano Ьlokirajи, nemoguca је akumulacija 15 ovog kratko z iveceg proteina. Postoji pogresno verovanje da inhiЬitori translacije indukuju р53. InhiЬitori translacije smanjuju ekspresiju р53. Za razliku od njih inhibitori transkripcije ne specavaju akumulaciju р53 zato sto је vec postojeea RNК и mogucnosti da izvrsi sintezu DNК. InhiЬiranjem degradacije р53, aktinornicin D na primer иzrokuje staЬilizaciju р53. Wt р53 indиkuje transkripciju vise gела ukljucujucj Mdm2. Mdm2 protein, regulator degradacije р53, vezuje se za N-tcrmina.lni deo р53 protejna, prouzrokujucj uЬikvjtjnacjju i degradaciju р53 proteozomjma. Vezavsj za sebe vjse molekula uЬikvjtjnina (UЬ), р53 Ыvа oznacen za degradaciju posredovanu proteozomima. lmajucj и vjdu da је Mdm2 produkt p53- jndиciЬilnog gепа, uspostavlja se negativna povratna sprega: р53 aktivjra sopstvenu degradaciju (Biagosklonny, 2002). Mutirani р53 se cksprimira u visokim nivojma zato sto nije u mogucnosti da transaktivjra Mdm2. Aлtikancerskj Jekovj ne mogu dalje povecavati nivoe mutiranog р53. U slucajevima visoke ekspres jje, egzogeni mutiraлi р53 moze inhjЬirati transfunkcioni sanje р53 (domiпantno negativni efekat). U svakom slucaju endogeni mutiraлi р53 ne ispoljava dorninantno пegativni efekat (Blagosklonny et а\. , 200 Ј). GuЫtak drugog aJela р53 gena neophodan је za potpunu eliminaciju funkcjja wt р53 u ceJjjama kancera. То rezultira staЬi\jzacjjom i overekspresijom mutiranog р53, kojj zadoЬija nove funkcije razJ jcjte od wt р53. 1.3.2. Agensi koji oS:tecuju DNK Wt р53 se indukuje zracenjem (gama ј UV -zracenje) i hemioterapeuticima koji ostecuju DNK ukljucujuei one koji se koriste u klinickoj praks j: doksoruЬicin, daunomjciл, daktjnornicin (aktjnomicin D), etopozid, topotekan, mitomjcjn С, cis-platina, karboplatina, melfalan, hlorambucil , Ьisнlfan, ciklofosfamjd, jfosfarnid, ј njtrozoшea. Ovj brojni lekovj su osnova standardne hemioterapjje. Visestп.tki i preklapajuci mehanizmi delovanja ovih lekova ukJjucuju interkalaciju DNК (doksoruЬicin, daunomicin i daktiпonlicin), inhjЬiciju topojzomeraze 11 ( doksoruЬicjп, daunomicjn ј etopozid), inhjЬiciju topoizomeraze 1 (topotekan) ј umreiavanje DNК (cis-platjna ј karboplatina). Melfalan, hlorambucil, Ьisulfan, cjklofosfamjd, jfosfamjd i nitrozoшea su svj aJkj\jrajuci agensj kojj svije citotoksicne efekte ostvaruju kroz kovalentno vezjvanje alkil grupa za DNK. Мnogi lekovj kojj jzazivaju promene na DNK (posebno u visokim koncentracijama), inhiЬiraju transkrjpciju. Prekjd u lanctl DNK је najcesca lczija koja indukuje aktivacijи р53. lz laganje limfocita slobodnim t-adjkalima azotnih oksida uzrokuje staЬilizaciju wt р53 pretezno u celijarna koje se пalaze u G 1 fazi celijskog ciklusa, sto dovodi do zastoja u Gl i apoptoze u celijarna ciji se celijski c jklus nalazi posle tacke prekida (S i 02/М celije) (Bhatia et a l. , 1995). Nakon snainog ostecenja DNK, interakcije izmedju р53 i Mdm2 dovode do oscilaranja ravnoteze izmedju dva proteina. А ТМ preko kinaza Chk2/Cds 1 fosforilj sc р53 па serinskjm ostacima 20, 15 ј 37, onemogucavajuci vezivanje za Mdm2. Fosforilacjja Mdm2 је jedan od пасјnа za rcgulaciju staЬilnostj р53. Medjutjm, rezultatj vjse studija su pokazali da fosforjlacija р53 ne mora Ьiti neophodna za staЬilizaciju р53 (Blattner et а\., 1999). Da Ьi se objasnjle ove protjvurecnosti, pretpostavka је da neki agensi koji ostecиju DNK indukuju р53 ne ponistavanjem njegovog vezjvanja za Mdm2, vec negativnom regulacjjom Mdm2, odnosno inhiЬicijom transkripcije. 16 Ј. З. З. lnhibltori t1·anskripcije Svi signalni putevi koje reguljse р53 konvergjraju u jednoj tackj ; Mdm2- posredovanoj degradacijj р53. Mutjranj р53 је stabilan zato sto је transkripciono neaktjvan i и nemogucnostj da jndukиje Mdm2 kojj је neophodan za degradacjju р53 (Blagosklonny, 2002). Wt р53 se staЬilise и prisиstvu inhiЬitora transkripcije jer inhЉitori transkripcije smanjuju nivoe Mdrn2. Aktinomjcin D је antitumorski antjЬiotjk sa osoЬinama DNK-ostecujuceg agensa, ј snazni inhjЬitor transkrjpcjje. On interkalira u DNK i jnterferira sa RNK polimerazama ј DNK polimerazama 1 ј П. Flavopjrjdol, inЬiЬitor cjklin-zavisnih kjnaza, takodje jnf1iЬira transkripciju (ВјЬlе et al., 2000). Flavopiridol se vezuje za dvolancanu DNК i indukuje wt р53. UV-zracenje i visoke koncentracjje agenasa kojj ostecuju DNK inhiЬiraju transkripciju. Etopozid, inhjЬitor topoizomeraze ll negativno regиlise Mdm2 (Arriola et al., 1999). 1.3.4. lnhibltori metabolizma RNK InhiЬitori RNК ј DNK metaboljzma, ukljucujucj 5-fluorouracil (5-FU), cjtozin araЬinozjd (AraC), metotreksat i hidroksjureu (НU), sи standardno korisceru hemioterapeиticj u lecenju kancera. lnhjЬitorj metabolizma RNK uzrokuju p53-zavisni ј p21-zavisni reverzjЬilnj Gl zastoj u odsustvu detektovanog ostecenja DNК (Ljnke et al., 1996). Iako 5-FU dovodi do izmena u metabolizmu ј DNK ј RNK, promene u metabolizmu RNK jnjcjraju dogadjajc koji kulmjniraju ekspresijom р53. Slicnjm mehanizmom ј UV-zracenje jnhЉira transkripcjju (Zeng et al., 2000). Pretpostavlja se da su meharuzrru staЬilizacije р53 , uzrokovaru antimetabolitima prj dejstvu UV -zracenja i transkrjpcionih inЬiЬitora skoro identicni, jer sve ove supstance redukuju nivoe Mdrn2. 1.З.5. lnhibltori otpremanja р5З izjedra Prema prihvace11im modelima delovanja, sиbceljjska lokalizacija р53 је kriticna za njegovu degradaciju. Otpremanje р53 jz nukleusa је prvj neophodni korak u degradaciji р53. Mdm2 sadrzi sjgnal za uklanjanje р53 jz nukleusa ј predstavlja sponu izmedju jedra ј cjtoplazme (Vousden et al., 2000). Degradacija р53 odigrava se u citoplazrni, iako su i р53 ј Mdm2 jedarni proteini. UЬikvitin-ligazna aktivnost Mdm2 neophodna је za otpremanje р53 , jer se ubikvitinacijom oslobadja sekvenca odgovoma za uklanjanje iz jedra а koja se nalazi na C- terminalnom kraju р53. Leptomicjn В (LМВ), antiЬiotik, inЬiЬira otpremanje iz jedra onih proteina koj ј sadrl.e karakteristjcщ1 signalnu sekvencu odgovornu za ovaj proces. LMB dovodi do akumulacjje р53 ujedru i njegovc staЬilizacjje (Smart et al., 1999). 1 . З.6. Hipoksija lndukovanjem hipoksije, inhiЬitori angiogeneze suprimiraju rast tumora. Jaka hipoksija dovodi do staЬilizacije wt р53, preko hipoksijom-induciЬilnog faktora r (НЈF-1) (An et al., 1998). Takodje, hipoksija negativno regulise Mdm2, sto dovodi do akumulacije р53. Као р53 ј Mdm2, HIF-la se degradиje proteozomima tako sto Mdm-2 obelezi HIF-1a za degradaciju (Ravi et аЈ. , 2000). ImajuCi u vidu cinjenicu da se Mdm2 pozitivno regulise sa р53 i da Mdrn2 17 obelezava za degradaciju ј НIF-1 а ј р53, moze da se predvjdj sledeci redosled dogadjaja: а) НIF-1 а dovodi do staЬilizacije wt р53 uklaлjaлjem Mdm2 i Ь) wt р53 uzrokuje destaЬili zaciju НIF-la zato sto wt р53 indukuje Mdm2. 1.3.6. Agensi koji deluju па mikrotubule Wt р53 је ukljucen u mitotickн kontrolnu tackн celijskog ciklusa i postmjtoticki zastoj . lnhiЬicijom dinamike mikrotubнla, lekovi koji deluju na njih нzrokuju mitoticki zastoj i celijsku smrt. Ni mitotickj zastoj ni 6elijska smrt ne zahtevajн wt р53. Lekovi koji deluju na mikrotubule kao sto su paclitaksel i vinkristin indukuju wt р53 u nekim celijskim linijama kaлcera (А549 i MCF-7) i u normalnim fibroЬiastima (Torres et al., 1998). Као ј drugi DNК-oste6нju6i agensi, lekovi koji deluju na mikrotubule staЬi l izuj u wt р53. Za razliku od DNК-oste6нju6ih agenasa, lekovi koji deluju na mikrotнbule ne mogu da iпdukuju wt р53 u prisustvll «heat shock» proteina 90, geldanamiciпa (Blagosklonny et al., 1995). Postavlja se pitaлje sta је tacni mehanizam staЬilizacije р53 lekovima koji deluju na mikrotнbule? а) U mitotickom zastoju, brojni proteini su hiperfosforilisaлi na ostatku serina (Blagosklonny et а\. , 1999). Pretpostavlja se da fosforilacija р53 moze spreciti interakciju izmedju р53 i Mdm2. Ро ovom scenariju, lekovi koji deluju na mikrotubule ne indukнju р53 u mirujucim celijama koje ne ulaze u mjtozu. Ь) Delovaлjem na traлsport р53 posredovaл mikrotubнlama, lekovi koji deluju na mikrotubule mogu spreciti degradaciju р53 (Giannakakoн et а\. , 2000). Na kraju, mitoticki zastoj је povezan sa inhiЬicijom transkripcije koja pak sa svoje strane dovodi do staЬilizacije р53. Ova tri mehanizma ne moraju Ьiti uzajamпo iskljuciva. lndukovanjem р53 , niske koncentracije paclitaksela mogu zaustaviti А549 ce\ije u G 1 i/ili 02 fazi celijskog ciklusa (Giannakakou et аЈ. , 2001). Paclitaksel indнkuje Gl Ьlok u fibroЬiastima, ali ne i u Т aлtigen-traлsformisaлim celijama sa inaktivnim р53, gde selektivno izaziva smrt transformisanih celija (Trielli et al., 1996). 1.4. Mutirani р53 kao terapeutski cilj и celijama tumora 1.4.1. Gensko. terapija sa р53 Genska terapija u kojoj se normalni р53 gen (wt р53) uvodi u tumorske celije koriscenjem Ьilo fizickih Ьilo viralnih vektora, intenzivno se izucava u preklinickim i klini ckim modelima. VeCiпa radova ko6stila је adenoviruse sa poremecajem replikacije, koji humane р53 cONK sekvence povezuju sa jakim viralnim promotorima (Merrit et al., 2001 ). Iako је efikasnost bez nespeci ficne toksjcnostj detektovaлa i u celijskjm kulturama ј u zivotinjskjm model sistemima, odgovori na ovu vrstu tcrapije jos nisu mnogo obecavajuci. U svakom slucaju, u preklinickim studijama izucavaju se razliciti modeli. Ovo podrazumeva koriscenje poboljsanih vektora koji mogu da menjaju tropi zam tkiva, kao i alternativne varijante р53 sekvence. Mutacije u р53 za koje је pokazano da sprecavaju njegovu oligomerizaciju sa endogenim dominantno negativnim mutantnim р53 proteinima, pove6avaju njegov otpomost degradaciji, pobolj savaju termodinarnicku staЬilnost molekula, pospesuju njegovo uvijanje, i menjaju njegovu DNK- vezujucu aktivnost tako da interaguje mnogo sna.Znije sa promotorskim sekvencama pro- apoptotskih gena. Opisana је fuzija р53 sa VP22 proteinom herpesvirusa, sto rezultira 18 aktivnim р53 fuzionim protejnom koji moze da se siri na neinficjrane okolne celije (Phellan et al., 1998). KomЬinacija ovakvih varijantj р53 mozc produkovati molckul koji је terapeutskj aktivniji а ipak zadriava neoplюdnu specificnost. 1.4.2. Koristenje malih molekula inhiЫtora р53 odgovora Gudkov i saradnici (Komarov et al. , 1999), pokazalj su da su konvencionalna hemioterapija ili zracenje tumora sa mutiranjm р53 limjtirane p53-zavisnom toksicnoscu, indukovanoj u normalnom tkivu. Iz tih razloga trзZeni su inhjЬitori p53-indukovane transkripcije koris6enjem p53-reporter celijskih linjja u kojima se staЬilno jntegrisani reporter gen aktivjra tretmanom doksoruЬicinom. BiЫioteka sa vise od 16000 malih molekula detaljno је skenirana u cilju nalai.enja molekula koji omogucavaju normalni celijski rast ali se Ьlokiraju indukcjjom reporter gena hcmioterapeutskim ageпsjma. Na ovaj nacjn jdcntifikovano је jedinjenje pifitllrin-a. koje iskazuje gore navedene karakterjstike. Ovo jedinjenje је aktivno in vivo i moze za.Stititj rniseve od letalnog efekta jonizujuceg zracenja. Takodje sprecava guЬitak dlaka kod rniseva jzlo:lenih zracenju. Ovaj pristup је veoma atraktivan jer ovakva vrsta molekula moze uЬlaZiti sporedne efekte hemioterapije: guЬitak kose, rnijelosupresiju iJj ostecenje intestjnalnog trakta. Poteskoca u ovom pristupu је sto ovi molekuli mogu imati promutagena svojstva. Ро pred lozenom modeltl, celije su Ьile iz lozene visokim dozama hemioterapeutsk ih agenasa, ј mada su prezivele, imale su vecu incidencu mutacija. Jasno је da treba pronaci ravnotezu izmedju ova dva fenomena. U svakom slucaju kod starijih pacijenata, ova ravnotez.a се favorizovati koriscenje ovakvog tipa р53 regulatora (Lane et al., 2002). 1.4.3. !mitiranjefunkcije nishodnog gena Jedna od najatraktivnijih i najvise proucavanjh oЫasti razvoja novjh terapeutskih sredstava је nalai.enje molekula koji imitiraju funkciju produkata gena cija је sjnteza indukovana р53. Ova odredjena gena zaokupila su posebnu pafuju. Prvi је gen koji kodjra р21 (Wafl /Sdi /CjpJ ). Ovaj mali protein interaguje sa ciklinima ј cjklin-zavisnjm kinazama kao ј sa ostalim clanovima СОК fam ilije. Sintetisan је mali molekul koji irnitira funkciju р21 Ьilo vezivanjem u ATP-vezujuci dzep СОК enzimske subjedinice, Ьilo vezivanjem za povrsinu cikl inskog substтata. Nekoliko ovih molekula vec је uslo u klinicke trajale (Lane et al., 2002). Oruga aktivna oЬlast istrai.ivanja ukljucuje nastojanja da se irnitira aktivnost pro-apoptotskog gena koji kodira Вах. Вах deluje, makar delom kao inhiЬitor anti-apoptotskih proteina bcl-2 familije. Mali peptidi izvedeni iz Вах-а pokazali su aktivnost u velikom broju in vit1·o eseja, а nedavno su karakterisani mali molekuli nalik lekovima kojj imitiraju interakciju Вах sa Bcl-2. Jedan od njih, antimicin А jasno pokazuje selektivnu i specificnu toksicnost prema celijama koje imaju povecanu ekspresiju bcl-2 (Tzung et al., 2001 ). /.4.4. Reaktivirajuti р53 mutanli Мnoge mutacije р53 gena protei11a dovode do promene samo jedne amino kjseline. Ove mutacije su cesto senzitivne na temperaturru (ts) i imaju samo male efekte na staЬilпost sredjsnjeg, ONК-vezujuceg domeпa proteina. Mutirani proteini se akumuliraju u visokom 19 пivoima u mnogim tumorima. Vec је dugo atraktivпa misao о pronala.Zeпju molekula kojj mogu da se vezuju za р53 ј omogucavaju njegovo uvijanje u pravilnu konformacjju. Neki ranjjj radovj jdentifikovalj su peptide sa C-teпninusa р53 kao i anti-p53 antitela koja u in vitro uslovjma mogu obnovjtj specjficпost vezivanja za DNK rnlltiranih р53 proteiпa. Osetljivim :fizickim analizama DNК-vezujuceg domena proteina, identjfikovanj su i karakterisaпj peptidi izvedeni jz poznatog p53-vezujuceg proteina koji mogu staЬi lizovati jczgro uvijanjem mutiranjh р53 proteina (Friedler et al., 2002). Saznanja о naCinjma uvUanja proteina omoguCila su novi pristup dizajnu koji се utjcati па uvijanje u toku sjnteze р53. U poslednje vreme otkriveno је i drugo mesto reverzjje р53 ts mutanta sredisnjeg domena (Liu et al., 2001). DeJecija amino kiselina 15-18 р53 dovesce do toga da valin 135 ts mutant bude potpuno aktivan na temperatllri od 39·с, koja njje optimalna za uvijanje. Mutacjje N- termjnusa uticu na uvjjanje sredisnjeg DNК-vezujuceg domena proteina, ukazujucj па to da postoje interakcije izmedju razljcitih domena р53 proteina koje jos пisu potpuno objasnjene. 1.4.5. Tretman tumora sa wf р53 U slucajevima kada р53 gen nije mutiran, terapeutske strategije su usmerene na aktivjranju funkcije endogenog р53 gena u tumorima. Pretpostavlja se da је р53 signalni put narusen drugim alteracjjama u tumoru. Ova pretpostavkaje potvrdjena u vise razlicitih slucajeva. Prvo, kod humanih papilomavjrusom (llPV)-indukovanih kaпcera, gde ekspresija viralno kodiranog HPV Еб protejna dovodi do vezivanja ЕбАР Е Jjgaze u Е6-р53 kompleks (Thomas et al., 1999). Stvaranje ovog kompleksa rezultira ub jkvj.tinacijom i degradacijom р53. Drugi slucaj је definisaп otkricem povecanc ckspresije celijskog Mdm2 proteina и humanim sarkomima (Freedman et al., 1999). Mdm2 proteiп se vezuje za N-termjnalnj deo р53 i jnaktjvjra njegovu funkciju kako Ьlokiranjem funkcije transkripcionog aktivnog domena protejna tako i preuzimanjem funkcije ЕЗ uЬikvjtjn ligaze koja obeleZзva р53 za proteozomsku degradacjju. Pokazano је da mutacije u sjgnalnjm kinazama u okviru p53-signalnog puta mogu da onemoguce р53 odgovor (Casparj et al., 2000). Najjaca podrska ovom zapa.Zanju potjce od studija АТМ gena (ataxia-telengjectasja). Inaktivacjja А ТМ gena redukuje intenzjtet aktjvacije р53 jonizujucjm zracenjem, dok jos uvek omogucavaju indukovanje р53 odgovora UV- zracenjem. Jos јеdап signalni put роусzап sa р53 koji је cesto narusen u humanim tumorima је ekspresija p14ARF proteiпa (p19ARI· kod miseva) (Sherr et al., 2001). Siпteza ovog malog, visoko пaelektrisanog proteina indukovana је mnostvom onkoge11a koji ubrzavaju rast i proto- onkogena, ukljucujucj c-myc, ras i adenovirus El А. р 14ARF rrotein aktivira р53 odgovor inhiЬiranjem funkcjje Mdm2. Delecija gena koji kodjra р 19дR · kod miseva dovodi do ve6e verovatnoce za pojavu tumora, а takodje su moguce ј druge delecije ovog lokusa. Ove delecije najcesce pogadjaju lokus kojj kodjra р16 Ink4a protejn. Razllmevanje puteva regulacije njvoa i aktivnosti р53 sugerise brojne farmaceutske mete za jnterveпciju. Mdm2 protejn је ll fokusu nekoliko predlozenjh pristupa јег predstavlja glavni пegativni regulator р53 sjgnalпog puta, а i prjrodnj aktivatori odgovora funk.cionisu Ьlokiranjem degradacje р53 kroz Mdm2. АТМ i СНК2 kinaze Ьlokiraju degradaciju р53 Љsforilacijom ј р53 i Mdm2, dok se р 14ARF protein vezuje za Mdm2 i inhjЬira пjegovu sposobnost da degraduje р53. 20 1.4.6. JnhiЫcija ekspt·esije Mdm2 lnhibicija ekspresije Mdm2 moze dovesti do aktivacije р53 odgovora. Pokazano је da inhiЬicija ekspresije Mdm2 indukuje p53-zavisnu apoptozu i moze jmatj in vivo antjtumorsku aktjvnost (Wang et al. , 2001). Interesantno је da su razni generalni jл.hjЬitori transkrjpcjje, kao ј СОК inhiЬitor roskovitin snafnj aktjvatori p53-zavisne transkripcjje jer u umerenim dozama smanjuju ekspresjju Md.rn2 (Lu et al., 2001 ). p53-odgovor u ovim slucajevima moze Ьiti pracen senzjtjvnoscu Mdm2 transkripcije na ovakve inhiЬitore, kao ј kratkim poluzjvotom Mdm2 protejna ј rnRNK. 1.5. Apoptoza: veza izmedju genetike kancera i otlgovora 110 ltemioterapiju Hemioterapjja kao nacin lecenja kancera uvedena је u klinicku praksu pre vise od pedeset godina. lako је ovaj vid terapjje Ьiо uspesan za tretman nekih tumora kao sto su kancer testjsa ј neke vrste leukemija, njena efikasnost za lecenje epjtelnih tumora dojke kolona ј pluca Ьilaje manje obe6avaju6a. U idealnom slucaju ћemjote.rapjjska sredstva tt·eba samo da delt1ju na neoplasticne 6eljje smanjujuCi sirenje tumora jndukovanjem citotoksjcnih i/ili citostatickih efekata sa mjnjmalnom "kolateralnom stetom" u odnosu na normalne celije. U rcalnim uslovima efektjvnost hemioterapjje smanjena је utjcajem citavog spektra faktora ukljucujuci: sistemsku toksicnost usled nedostatka specificnosti, suvise brz metabolizam leka, kao i postojecu i stecenu rezistentnost na lekove. ProЬiem rezistentnosti na vise \ekova (multidrug resjstance-MDA), је do sada najmanje razjasnjen ј prcdstavlja najnepredvid\jjviji faktor koji utjce na efikasnost hemioterapije. [majuci u vjdu adaptiЬilnost tumorskj\1 6еЈјја, verovatno је da се rezistentпost na lekove ј dalje predstavljatj vaian klinicld proЬiem, cak ј u vreme savrenmenih cj Jjanih terapeutika ј jndividualnih terapijskih tretmana. Da li su tumori u startu rezis1entni na hemjoterapjjska sredstva, j\i to postaju posle prvog cjk\usa tretmana? Oanasnje razumevanje rezistcntnosti na lekove potice od boljeg razumevanja nacina na koji koпvencionalni lekovi zapravo uЬijaju tLJmorske 6elije. U pocetku, Iazvoj hemioterapijskih agenasa Ьiо је baziran na zapaianju da celije tumora prolifer jsu brze od normalnih celija. Na osnovu toga jzabrani su lekovi koji interferiraju sa replikacijom DNK ili celijskim metabolizmom. Oceldvano, ovi agensi su ubrzavali i deobu normalnih celija kostiju i zeluca, smanjujuci na taj nacin terapeutski opseg u okviru kog ovi lekovi mogu Ьiti korisceni. U to vreme mislilo se da rezistentnost na lekove potice od molekularnih promena koje inhiЬirajн interakcijн lek-meta. Otkrice da su pumpe za lekove kao na primer P- glikoprotein ј intra6elijski detoksifikatori kao sto su antioksidansi (glutation) pojacano eksprimirani u rezistentnim tumorskjm celijama potvrdilo је ovu pretpostavku. (Johnstone et al., 2000). lako protejni kojj interferiraju Ьilo sa akumulacijom lekova ili njjhovom staЬilnoscu mogu doprineti klinjckoj rezistentnosti na lekove, drugi faktori koji delнju posle inicijalnog lekom- indнkovanog «napada» takodje imaju vaznu ulogu. Hemioterapijski agensi mogu indukovati seriju celijskih odgovora koji im~u нticqja na proljferaciju tumorskjh celija i prezivljavanje (Lowe et al., 2000). Verovatno пајЬоlје proucen od ovih celjjskjh odgovora је apoptoza, fi ziolosld program celijske smrti kojim se kontroli se normalni broj celija u toku razvica i 21 bolesti. Sada su poznati mnogi molekulami dogadjajj neophodni za aktivaciju, amplifikaciju i izvrsenje apoptotskih procesa, ј evjdentno је da razlicitj lekovi mogu uЬijatj tumorskc celije aktiviranjem zajednickih apoptotskih puteva. Zakljucak је da pojedinacne mutacjje koje onemogucavaju apoptozu mogu dovesti do МDR. Realizacija kojom apoptoza doprinosi antitumorskoj aktivnosti mnogih hemoterapjjskih agenasa moze pomoci u razumevanju nastanka rezistentnosti na \ekove. Da Ьi tнmorska celija usla u progresijll, ona mora prezjveti drasticne strukturne i/ili metabolicke alteracije, kao i jzrazito stresno mikrookruzenje (hipoksija i nedostatak nutrienata. Takodje mora se jzbeci antitumorski jmunj odgovor domacina. Izшenjena ekspresija ilj mutacjje u genjma kojj kodiraju kljucne apoptotske proteine omogucuju celijama tumora povecanн mogucnost prezivljavanja ј urodjenu rezistentnost na hemoterapijske agense. Ova dvostruka prednost rezнltira rastom ј ekspanzijom neoplasticnih celija ј moze ugroziti efekat naknadne terapjje. Ukupan doprjnos apoptotskih defekata klinickoj MDR је jos uvek pod znakom pitanja. U svakom slucaju prihvacena је hjpoteza da postoj i uzrocno-posledicna veza izmedju apoptoze i \ekovima-indukovaлe citotoksicnosti ј da ta povezanost moze imatj razlicite implikacije. Prvo, slicnost jzmedju fizioloske i lekovima-indukovane apoptoze uspostavlja jasпu vezu izmedju razvi(:a tumora i unutrasnje rezistentnosti na antikancerski tretman, na taj nacin omogucavajuci Ьiolosku osnovu za objasnjenje kako genotip tumora moze odreditj ishod terapjje. Drugo, 6njenica da poremecaji u procesu apoptoze mogu ubrzati stvaranje rezjstentnostj na lckove posle interakcije lek-meta, otvara mogнcnost da genotoksickj agensi mogu indukovati nove genske mutacije zbog tzv. "ostecenja bez smrti" (Johnstone et al, 2002). Tre6e, efikasnost kojom apoptoza moze eliminisati tumorske celjje u slucaju njene indukcjje konvencjonalnim agensjma obezbedjuje jaku racionalu za terapeutske strategjje koje deluju direktnjje na sam proces apoptoze. Na kraju, senzitivnost normalnЉ celjja na lekovima-indukovanu apoptozu moze objasniti toksjcne efekte konvencionalne bemjoterapije ј ukazati na nacine kako iЬ svesti na najmanju meru. Sam.o potpuno razumevanje nacina na koji antjkancerski agensi indukuju celijsku smrt, i nacina na koji greske u ovim putevjma ubrzavaju pojavu rezistentnosti, moCi 6е da unapredi upotrebu hemoterapijskil1 agenasa do racionalnjje strategjje koja Ьi Ьila usmerena na svakog pacijenta individualno. lmajuci u vidu da su mnogi antikancerski lekovj identifikovanj korjscenjem empjrjjskih modela, molekularnj dogadjajj odgovorni za njihovo dejstvo su nedovoljno pozпatj. Poslednjih deset godina nasc razumevanje celijskjh mel1anizama kojj dovode do fi zjoJoske 6elijske smrti se u mnogome poboljsalo. Lekovj razljcjtih struktura ј specificnosti iпdukuju karakteristicпe morfoloske promeпe povez.ane sa apoptozom, i danas se zna da apoptotski putevi doprjnose citotoksjcnom delovanju mnogjh hemioterapeutjka (Lowe and Lin, 2000). Dosadasnja zapa:lanja ukazuju da celije interpretjraju lekovjma indukovan napad па isti пасјn kao ј fizioloski stres, uzrokovan hipoksijom ili odsustvom faktora rasta. Posto eflkasnost apoptoze zavisi od integriteta pomenute molekularne mreze, нЬiјаnје tumorskih celija antikancerskim lekovima moze Ьiti u velikoj merj jndirektno. Mutacjje и р53 genu ili u okviru р53 signa1nog puta produkuju MDR in vivo i in ''ilro, а ponovno uvodjenje wt р53 u tumorske (:е\јје deficijentne za р53 moze ропоvо uspostaviti hemosenzitivпost (WaHace-Brodeur et al., 1999). U svakom slucaju р5 3 status nije univerzalni prediktor odgovora na terapeнtskj tretmaл, delom i zbog toga mnogi lekovj ne zahtevaju jntaktaп р53 za svoju apoptotsku funkciju, а и nekim slucajevjma gнbitak р53 moze cak i ubrzati lekovima indukovaлн celijsku smrt (Неп et а!., 2001 ). 22 Genske alteracjje koje indukиju tumorogenezи takodje posredиjи и stvaranju иnиtrasnje rezistentnosti па fizioloske iJj nelizioloske stirnиlиse (lekovi) kojj dovode do celijske srnrti. Као rezultat toga, tumori kojj пjkad nisи Ьili izlozeni dejstvu lekova nюgu bjti nasledno rezistentni na konvencionalna hemioterapijska sredstva. Jedostavan zaklиCak Ьi Ьiо da је tumorski genotip najavafuij i parametar od koga zavisi иspesnost hemioterapije. Ovakav koncept ima znacajne posledice za bиdиcnost иspostavljanja dijagnoze ј tretmana kancera, sto podrazumeva racionalдiji pristиp hemjoterapij ј sto zahteva kako poznavanje geпskih lezija koje ucestvujи и razvi6и tиmora, tako i potpuno razumevanje nюlekиlarne osnove delovanja leka. Kakve Ьi Ьile implikacjje svih ovih sazпanja и smislи bиdиteg tretmana kancera citotoksicnim lekovima? Ako је jnhiЬicija apoptoze neophodan dogadjaj u tumorogenezi а poznato је da vecjna hemioterapjjskih sredstava koristi intaktne apoptotske puteve u indukciji celijske smrti, jznenadjlljиce је da је rezistentnost na lekove predstavlja tako velikj klinicki proЬlem. Zbog toga nova znanja о molekularnim vezama izrnedju tumorogeneze i apoptoze otvaraju nove mogucnosti za bolje defitlisan pristup hemjoterapiji. Mnogi konvencjoпaJni antikancerskj agensi produkuju neke oЬlike celijskih ostecenja ј па taj nacin djrektno jJi jлdirektno ostecuju DNК. Studjje koje su istrafjvale povezanost jzmedju pove6anja frekvcnce mutacija р53 gena i ostecenja DNK su pokazale mogucnost da rezistentnost na apoptozu moze produkovati genetski izmenjene celije. Jedno istrazjvanje је pokazaJo da gиЬi tak funkcije р53 povecava frekvencи genskih mиtacija kod pacjjenata tretiranih UV zraceпjem (Corbet et al. , ] 999), dok drиge grupe nisu pokazale takvu znacajnost (Griffiths et al., 1999). ОЬа jstrafjvanja su ipak pokazala da gиЬitak р53 povecava prezivljavanje 6еЈјја posle ostecenja DNК а takve сеЈјје nose dodatпe шutacije. U svakom slueaju, Ьilo da р53 utice ili ne иtice direktno na ucestalost mutacija, on jasno eliminise potencijalno mиtirane celije. Bolje razumevanje molekиlarnih veza izшedju tumorogeneze, apoptoze i rezistencij e na lekove obezbedjиje osnovu za novu generacijи cjljane terapije kancera. Na primer, informacije koje se ticи kljucпjh apoptotskjh proteina, njihove regulacije, i nacina na koji su izmenjeni u tumorskim celjjama mogu Ьitj koriscene и selekcjjj dizajna novjh antjkancerskjh lekova. Potpuno poznavanje proteina i sjgnalnih pиteva neophodnih za cjtostatsko delovanje datog leka, kao ј razиmevanje molekularne osnove rezistencije na lekove, moze obezbedjti neophodnu inЉrmaciju za defini sanje terapija иsmerenjh ka indivjdualnim tumorima. lako su neophodnj jos mnogj podaci, оЬе strategije оЬесаvаји rezиltate. Jedna od varjjacjja na temu racjonalпog dizajna је jdeja о individualпoj terapiji gde lek zavjsi od uzroka. Teoretskj , ciljaniji prjstиp hemioterapjjj ukljuCivace genotjpjzaciju indjvjduaJnih tumora i odredjjvanje profila njjhove rezistentnost j na lekove nakon cega је moguc odabir agenasa kojj се efektivno delovatj uprkos identjfikovanih antjapoptotskih lezija. Potencijal ovakvog pristupa ilustrovan је stиdjjom koja је pokazala da su tumorske celije sa povjsenim nivoima c-myc ј wt р53 selektivno senzitivne na 5-FU (Arango et а\ . , 200 1 ). 5-FU ne indukuje apoptozu и celijama karcinoma kolona koje nemaju р53 gen (Bиnz et al., 1999), а tumori koji eksprimiraju niske nivoe c-myc ili imaju mutirani р53 su relativno rezistentni na tretman sa 5- FU (Arrango et al., 200 Ј ) . U skladu sa rezultatima ovih studija sи i rezltati faze Ш klinickih trajala koji su pokazali da sarno oni pacijenti sa karcinomom kolona koji sadrie povisene nivoe c-myc i wt р53 znacajno odgovaraju na 5-FU tretman. lako је rиtinska genotipizacija tumora godinarna daleko od иpotrebe u klinickoj praksi. koriscenje markera rezistentnosti na lekove u smis lu boljeg usmeravanja terapije kancera, vec 23 је и manjoj ili vecoj meri primenjeno. Koriscenje markera za usmeravanje terapije ili za predvidjanje odgovora na tretmaп је zasnovano na kompatiЬilnosti gena, а uspesnost ovakvog pristupa povecace se sa dobijanjem informacija о svakom tumoru pojedinacno. Vremenski okvir za aplikaciju ovakve racionalne terapije zavisice u najvecoj meri od postojece klasifikacije molekulamЉ mehanizama delovanja lekova kao i od sposobnosti da se brzo definise genski profil svakog tumora ponaosob. Noviji eksperimenti koji su koristili mikroareje da Ьi klasifikovali tumore па osnovu puteva genske ekspresije na pravi nacin su denюnstrairali prednosti nove tehnologije koja се omoguciti brzo i precizno profilisanje tumora (Sorlie et al., 2001 ). 24 2. CILJ CiJjevi ovog rada Ьili su: l. Da se utvrdi ucestaJost р53 mutacija u na5oj populaciji bolesnica obolelih od karcinoma dojke, kao i njihova raspodela u okviru ispitivanih eksona. 2. Da se utvrdi povezanost р53 mutacija sa parametrima prognoze - patoЬioloskim osoЬinama tumora: limfonodalnim statusom, velicinom tumora, histoloskim gradusom, histoloskim tipom tllmora, i statusom receptora za steroidne hormone. З. Da sc sagleda klinicka upotreЫjivost р53 mutacija i to u odt1osu na njihov moguci prognosticki i prediktivni znacaj. Prognosticki znacцj је procenjivan kroz odnos sa parametrima prognoze i kroz povezanost р53 mutacija sa duzinom ukupnog prezivljavanja (OS). Prediktivnj znacaj је procenjivan u odпosu na odgovor na adjuvantnll hemioterapiju, odnosno povezanoscu р53 mutacija sa duzinom perioda bez ponovnog javljanja bolesti (OFI). 25 3. МATERIJAL 1 МЕТОDЕ 3.1 Bo/esnice sa primarnim operahilnim karcinomom dojke U radu је analizirano 1 ОО bolesnica sa primarnim operaЬilnim karcinomom dojke. Sve bolesnice su prosle hirurgiju kao primarni antitumorski vid lecenja. Kod svih bolesnica је prisustvo maligniteta potvrdjeno histoloski. U ispitivanu grupu је bilo ukljuceno 30 bolesnica bez prisutnih metastaza u regionalnim limfnim cvorovima (N0) i 70 bolesnica koje su imale mctastaze u regionalnim limfnim cvorovima u istostranoj pazusnoj jami (N+). Karakteristike bolesnica и odnosu па parametre domacina tumora bile su sledece: starost se kretala u raspoпu od 3 1 do 51 godine, medijana 45 godina i sa ukupno 7 bolesnica mladje zivotne doЬi do 35 godina. U odnosu na menopauzпj status 95 bolesnica је u momentu postavljanja dijagnoze Ьilo u preшenopauzi, dokje 5 bolesпica Ьilo u perimenopauzi. Karakteristike bolesnica и ollnosu па parametre tumora prikazane su u Tabeli 1. Za svrstavanje bolesnica u odredjene grupe koriscena је ТNМ klasifikacija UICC-a (velicina tumora, limfonodalni status, odsustvo udaljenih metastaza) i klasifikacija ро Ricardson i Blumu (histoloski gradus) (Bloom and Richardson, Ј 975). U TN klasiflkaciju uvrsceni su podaci doЬijeni histoloskim пalazom. Odsustvo udaljenil1 metastaza је kod svih bolesnica utvrdjeno klinicki i pregledima koji se zahtevaju ProLokolom za dojku (radiografija kostiju i pluca, ultrazvukjetre itd). Pracenje bolesnica: bolesnice su pra6ene u vremenskom intervalu od 6 do 127 meseci, sa medijanom od 48 meseci. Adjuvantna terapija: 69170 bolesnica sa prisutnim regionalnim metastazama u limfnim cvorovima Ьilo је podvrgnuto adjuvantnoj hemioterapiji, dok је jedna bolesnica sa prisutnim jednim metastatskim limfnim cvorom (N+) Ьila ostavljena bez dodatne sistemske terapije. Mcdjutim, jedna od bolesnica bez prisutnih metastaza u limfnim cvorovima (N0) Ьila је ukljucena na adjuvaлtnu hcmioterapiju, s obzirom da se radilo о bolesлici sa vel icinom tumora Т3, tako da је grupu bolesnica koja је primala adjuvantnu hemioterapiju cinilo ukupno 70 bolesnica. 65/70 bolesnica је primilo СМF intravenski modiflkovani tretman (ciklofosfamid 600 mg/m2, metotreksat 40 mg/m2 i 5-fluorouraci l 600 mg/m2) u б ciklusa, dok је 5 bolesnica Ьilo podvrgnuto FAC adjuvantnoj hemioterapiji (5-fluorouracil 500 mg/m2, adriaЬlastin 50 mg/m2 i ciklofosfamid 500 mg/m2 u takodje 6 ciklusa. Lecenje је obavljeno ро rezimu p1·edvidjenom Protokolom za /ecenje karcinoma dojke (IORS). F АС hernioterapiji su Ьi Је podvrgnute one bolesnice koje su prema klasicnim paran1etrima prognoze imaJe agresivniju formu bolesti (vise od 4 regionalna metastatska limfna cvora) i Ьile su u mladjem zivotnom dobu u momentu uspostavljanja dijagnoze karcinoma dojkc. 26 Tabela 1. Karakteristike bolesnica u odnosu na parametre tumora Broj (n) Velicina tumora т\ 52 Ђ 45 Ostalo з Limfonodalni status {N) No 30 N+ 70 Histoloski tip lnvazivnj duktalni tip 61 Invazivni lobularn i tip 26 Ostalo 13 Histoloski gradus 1 1 1 п 79 ш 10 Status steroidnih receptora ER+PR+ 34 ER-PR+ 11 ER+PR- 17 ER-PR- 38 Prisustvo udaljenih metastaza Мо 100 м+ о 3.1.1. Grupa bolesnica bez metastaza и regionalnim limfnim cvorovima (No) U ovu grupu је Ьilo ukljuceno ukupno 30 bolesnica. Starost bolesnica se kretala u intervalu od 31 do 51 godine, mediana 45 godine. Svih 30 bolesruca је Ьi lo premenopauzno u momentu uspostavljanja dijagnoze karcinoma dojke. Bolesruce su Ьile pracene u intervalu od 10 do 120 meseci sa medijanom 49 meseci. Karakteristike bolesruca u odnosu na parametre tumora prikazane su u Tabeli 2. 27 Tabela 2. Karakteristike No bolesnica u odnosu na parametre tumora Broj (n) Velicina tumora Т1 19 т2 1 1 Ostalo о Нistoloski tip Jnvazivni duktalni tip 17 Invazivni lobularni tip 8 Ostalo 5 Histoloski gradus I 6 п 22 ш 1 Ostaio 1 Status steroidnih receptora ER+PR+ 9 ER-PR+ 5 ER+PR- 4 ER-PR- 12 Prisustvo udaljenih metastaza Мо 30 м+ о 3.1.2. Grupa bolesnica sa prisutnim metastazama и regionalnim limfnim cvorovima (N+) U ovoj grupi smo anaiiziral i 70 bolesnica. Parametri domacina tumora ukljucivali su godine starosti (opseg izmedju 31 i 59 godina, medijana 44 godine) i menopauzni status (65 premenopauznih i 5 perimenopauznih bolesnica). Bolesnice su bile pracene u intervalu od 6 do 127 meseci, medijana 47 meseci. Parametri tumora u isp itivanoj grupi prikazani su u Tabeli З. 28 Tabela З. Karakteristike N+ bolesnica u odnosu na parametre tumora Bro j (n) Velicina tumora ТЈ з з т2 З4 Ostalo з Hjstoloskj tig Invazivni duktalni tip 44 Invazjvnj lobularni tip 18 Ostalo 8 Вistolosk j gradus 1 5 11 56 ш 9 Status steroidnih recegtora ER+PR+ 25 ER-PR+ 6 ER+PR- 13 ER-PR- 26 Prjsustvo udaljenjh metastaza Мо 70 м+ о 3.2. Odredjivanje koncentracije receptora za estrogen i progesteron Koncentracija receptora za estrogen i progesteron karcinoma dojke odredjjvana је Ьiohemijskom metodom na osлovu stavova i preporuka EORTC (Ешореал Organization for Research and Treatment of Cancer - Evropska organjzacjja za istraZivanje ј lecenje raka) (EORTC, 1980). Metoda se bazjra na vezivanju rad joaktjvno obelezenog sterojdnog hormona za receptore prisutne u citosolu malignih celija dojke. Ovo vezivanje karakterise se konstantom asocijacije/djsocijacije koja izraZava specjficnost reakcije ј predstavlja meru afiniteta vezivanja hormona za receptor. Ovom metodom mogu se detektovati samo slobodni receptori tj. oni receptorj za koje nisu vezani odgovarajuci endogeni steroidп i honnoni. Intra-laboratorijska standardizacija metode radjena је periodjcno pod rutinskim laboratorijskim uslovima sa uzorcima tkiva uterusa krave (Nikolic-Vukosavljevic et al, 1998). Tkivo је prethodno pretvoreno u prah i tako је cuvano na -196°С. 29 Bioћemijska metoda za odredjivanje steroidnih ћormona obuhvata sledece postupke: • uzimanje i cuvanje uzoraka karcinoma dojke • homogenizaciju tkiva i izdvajanje frakcije citosola malignih celija • reakciju vezivanja hormona za receptore prisutne u citosolu malignih celija • odvajanje viska nevezanog (slobodnog) hormona • odredjivane radioaktiviteta u ~- scintilacionom brojacu • analizu rezultata uz upotrebu Scatchard-ovog modela za izraclmavanje koncentracije steroidnih hormona • Odredjivanje koncentracije proteina и uzorku З. 2.1. Uzimanje i cuvanje uzoraka karcinoma dojke Neposredno ро ћirurskom odstranjenju iz dojke, pregledom materijala patolog izdvaja reprezentativni uzorak malignog tkiva mase od 200 mg do 1 g za analizu sadrzaj a steroidnih receptora. U tom vremenskom intervalu koji ne traje du:le od 15 min tkivo karcinoma se nalazi na ledenoj ploci zbog termolabilnosti receptora. Do momenta odredj ivanja sadriaja receptora, uzorci tumora se cuvaju u tecnom azotu. 3.2.2. Homogenizacija Jkiva i izdvajanje citosolnefrakcije karcinoma dojke Zbog termolabilnosti receptora za estrogen pulverizacija tkiva zaledjenog u azotu pokazala se kao metod izbora (Нahnel, 1986). Homogenizacija је postupak razaranja integriteta tumorskog tkiva. Prethodno se na temperaturi tecnog azota uzorak mehanickim putem pretvori u prah а zatim se homogenizuje и fosfatnom pufcru pll 7,4- 7,7 ( 5х10"3 М fosfatni pufer , 20% gl icerol, 1 mМ monotiogJicerol i 1,5 mM EDTA) na temperaturi od О do 4°С u mikrodismembranatoru. Dobijena suspenzija нzorka tнmora prebacllj e se ll fosfatni pufer istog sastava na temperaturi Jedenog kupati la а potom centrifнgira na 800 - 1000 g na +4°С u toku od 30 min.Supernatant doЬijen ovim centrifugiranjem sadrzi nepreciscenu 'frakciju citosola dok se 11а dпu nalazi gruЬi jedarni talog. Nakon ultracentrifugiranja na 100 000 g/ 60 min/ +4°С (ultraceпtrifuga ВЕСКМАN , L-5-50) doЬijaj u se membranska frakcija u talogu Uedarпi talog koji је dalje koriscen za izolaciju DNK), i citosolna frakcija u supernatantu. Sadrzaj receptora za steroidne hormone odredjuje se u citosolnoj frakcij i karcinoma. 3.2.3. Reakcija vezivanja hormona za·receptore prisutne и citosolu malignih i:e/ija Odredjivanje receptora za steroidne hormone biohemijskom metodom omogucila је komercijalna upotreba radioaktivno obelezenih hormona visoke speci ficne aktivnosti. 30 Za odredjivanje koncentтacije receptora za estтogen koriscen је tricijumom obelezeni 17 P- estradiol (AМERSHAM, England) specificne akti vnosti oko 1 ОО Cilmmol u rastucim koncentтacijama od 2 do 32 х 1 o·IO м. Као kompetitivni honnon koriscen Је sintetski estrogen dietilstiiЬestтol (DSB) u 1 ОО puta vecim koncentтacijama ( od 2 do 32 х 1 о· М). Receptor za progesteron odredjivan је u prisustvu tтicijumom obelezenog sintetskog progesterona ORG 2058 (АМЕRSНАМ, England) specificne aktivnosti oko 50 Ci/mmol. U eseju su upotreЬ\j avane rastuce koncentтacije 3 Н - ORG 2058 od 4 do 64 х 10-10 М. Neobelezeni ORG 2058 u 200 puta vecim koncentтacijama korjscen је kao kompetitivni homюn ( od 2 do 32 х 1 о·8 М). Citosol tumorskjh се\јја tumora sadrii protejne sa vjsokjm afinjtetom (Kd < 1 nM) ј protejпe sa niskim a:fiojtetom (Kd > 30 nM) vezivanja za steroidne hormone. Ukupno vezivaпje honnoпa је vezivanje za proteiпe kako sa vjsokjm tako i sa njskim afinitetom vezivanja. Nespecificno vezivanje hormona је vezivanje za proteine sa niskim afiпjtetom. Raz\jka izmedju ukupnog i nespecjficnog vezivanja hormona је specificno vezivanje hormona za receptore, odnosno proteine koje karakterise visoka konstanta afiniteta vezivanja hormona. Odredjivanje ukupnog i nespecificnog vezivanja hormona zasniva se па kompetitivnoj inhiЬjciji , odnosno medjusobno iskljucivom vezivanju obelezenog sa neobelezenim hormonom za molekule receptora. Ukupno vezjvanje hormona odredjivano је u 0,200 ml citosola poznate koncentracije proteina (0,3 - 2 mg/ml) u prisustvu 0,025 ml pet razliCitih rastucih koncentracija visokospecificno obelezenog hormona i 0,025 ml fosfatnog pufera. Nespecificno vezjvanje horrnona odredjivano је u jdenticnim uslovima u pogledu obelezenog horrnona, ali umesto 0,025ml fosfatnog pufcra u sistem se dodaje ро 0,025 ml pet rastucih koncentracija neobelezenog hormona. Ova reakcija mesanja receptora iz citosola ј hormona odvija se па temperaturi bladnog vodenog kupatila (О do 4°С). Potom sledi inkubacija u trajanju od 18 h na +4°С, а to је vreme neophodno za odigravanje reakcije vezivanja hormon-receptor, јег је pokazano da је reakcija izmedju estradiola ј njegovog receptora zavisna od temperature i vremena (Hahnel, 1986). 3.2.4. Odvajanje viska nevezanog (slobodnog) hormona Za razdvajanje vezanog ј nevezanog horrnona koristi se aktivni ugaJj (norit А, SIGMA, Germany) koji је oЬiozen dekstranom Т-70 (PHARMACIA, Swcde). OЬ\aganje uglja dekstranom se vrsj da Ьi se sprecjo pristup velikih moleku\a povrsinj aktivnog uglja ј da Ьi se dozvolilo samo malim molekulima da budu adsorbovanj. Postupak oЬ\aganja uglja sa dekstranom se izvodi na temperaturi od 4°С oko 12 h uz mesanje na magnetnoj mesalici. Dodavanjem 0,500 ml reagensa (0,25 % norit А, 0,025 % dekstran u 0,01 М Tris puferu р Н = 8,00) u 0,250 ml jgpjtjvanog uzorka u okviru ana\jze ukupnog, tako ј ana\jze nespecificnog vezjvanja, jzvodi se adsorpcija slobodnog horrnona. Reakcjja razdvajanja jzvodj se na temperaturi vodenog kupatila (О - 4°С) u trajanju od 30 min uz povremeno mesanje, ј zasniva se na adsorpciji slobodnog hormona na cvrstu fazu Norit-A oЬ\ozenog dekstranom Т-70. Duzina jnkubacije koja omogucava razdvajanje kritican korak u ovoj analizi. EkviliЬrijum se postize posle 20 mjn. 31 Talozenje aktivnog uglja koji је adsorbovao nevezani hormon postize se centrifugiranj em na 2000- 3000 g/30 min/+4°C. Alikvoti supematanta ( 0,200 m1) koji sadr:le kompleks hormon- receptor odvajaju se za scintilaciono merenje radioaktiviteta. 3.2.5. Odredjivanje radioaktiviteta и f3 scintilacionom brojacu U daljem postupku odredjuje se radioaktivitet, odnosno broj dezintegracija u minuti obelezenog hormona. Scintilaciono merenje radioaktivnosti podrazumevalo је merenje alikvota supematanta u scintilacionoj tecnosti (0,4 % РРО i 0,005 % РОРОР u toluolu). Ро 0,200 ml supernatanta stavljano је u 6 ml ove tecnosti. Merenje је vrseno и ~ scintilacionom brojacu ВЕСКМАN LS 7000. Meren је i ukupni radioaktivitet dodatog obelezenog hormona u svih pet koncentracija koje su "ponudjene" svakom eksperimentalnom liZor·kll. Za merenje ovih " totala" Т u scintilacionu tecnost је dodavano ро 0,025 ml rastliCih koncentracija obelezen ih hormona. 3.2.6. Analiza rezullata- iZI"acunavanje koncentracije receptora za stroidne h01·mone Sadriaj receptora za estrogen i progesteron odredjen је ро Scatchard-ovom modelu za izracunavanje koncentracije receptora za steroidne hormone (Scatchard, 1949). Koncentracija receptora izra:lena је kao broj molova receptora ро mg proteina citosola celija malignog tumora dojke. З. 2. 7. Qd,-edjivanje koncentmcije proteina Koncentracija proteina је odredjena и citosolu ро metodi Lowry-a (Lowry et al., 1951 ). Ova mikrometoda se bazira па dve hemijske reakcije : Ьiuretskoj reakciji proteina sa bakamim jonom u baznoj sredini i redukciji fosfo-moliЬdenskog-fos:fo-volframovog reagensa (Folin- Ciocalteu-jev fenol11i reagens) tirozinom i triptofanom prisutnih u proteinu. Apsorbanca se meri spektrofotomctrijski na talasnoj duzini od 660 nm. Dobijene vrednosti se preracнnavaju pomocu standardne krive. Za doЬijanje standardne krive koriste se standardi - vodeni rastvor kristalnog bovin seГllm alЬumina (BSA) и koncentracijama 25, 50, 75, 1 ОО, 125, 150, 200 i 250 џglml. Eksperimentalne vrednosti ocitane sa standardne krive podesavaju se za koriscena razЬla:lenja i izra:lavaju se u mg/ml. 32 3.3. / zo/acija DNK iz иzoraka karcinoma dojke DNK је izolovaлa fenol-bloroformskom metodom iz jedarnog taloga uzoraka karcinoma dojke (Maniatis and Sambrook, 1989). Postupak homogenizacije tumora i dоЬiјалја jedarne frakcije prethodno је opisaл u poglavlju о odredjivaлju koncentracije steroidnih receptora. Sam postupak izolacije DNK sastoj i se iz nekoliko koraka: 3.3.1. Digestijajedarnog taloga sa proteinazom К Skalpelom se odsece deo zaledjenog jedamog taloga i prebaci u eppendorf epruvetu zapremine 1,5ml. Zatim se u ependorficu redom dodaje: • 400џl digestionog pufera (1 OOmM NaCI, 1 ОmМ Tris, 25mM EDTA, рН=8), koji lizira celijske memЬraлe • proteinaza К do finalne koncentracije О, 1џg/џl; dodato је 40џl proteinaze К koncentracije lOmg/ml • SDS do finalne koncentracije 0,5%; 20џl 10% rastvora SDS-a. SDS kao svaki deterdzent denaturise proteine i olaksava izolaciju DNК. Epruvete se zatvore i ostave da se inkuЬiraju preko noci u vodenom kupatilu na 3ТС. Sutradan se uzorcima doda ista kolicina proteinaze К i SDS, ostave se u vodenom kupatilu 1h na 56·с, potom se opet prebace na 3ТС i digestija nastavi jos jedan dan. 3.3.2. lzolacija DNKfenol-hloroformskom metodom Za sam proces izolacije DNK iz tumorskog tkiva, koriscen је komcrcijaJni fenol saturisan Tris-om, рН=8 (S igma). Smesa za izolaciju sadгZi fenol: hloroform: izoamilalkohol u odnosu 2,5 :2,4:0, 1. Postupak је podeljen u nekoliko faza : • u uzorak u kome је izvrsena digestija dodaje se 400џl (zapremiпski odnos 1: 1) gore pomenute fenolske smese. Epruvete se zatvore, promesaju na vorteksu а potom se ceпtrifugiraju 7min na 8000 rpm na sobnoj temperaturi. Posle centrifugiranja u ependorfici se jasno izdvajaju dve faze odvojene belim prstenom u kome se precipitirani proteini. Pipetom se pailjivo pokupi gornja faza (supernatant) neposredno iznad belog prstena i prebaci u cistu epruvetu. U supernatantu se nalazi izolovaлa DNK. • u ovako izdvojeni supernatant dodaje se ista kolicina fenolske smese i prethodno opisani postupak ponovi. Ovaj korak se ponavlja sve dok se ne izguЬi beli proteinski presten u medjufazi. • Sledeci korak је oslobadjanje od fenola. U supernatant se dodaje smesa hloroform: izoamilalkohol u zapreminskom odnosu 2,4:0,1 i centifugira pod istirn uslovima. Pipetom se odvoji supernatant. • Supernatant se prebaci u cistu epruvetu i u nju se doda 7,5М amonijuma acetat u deset puta manjoj kolicini u odnosu na zapreminu supernatanta (40џl) kao i 2,5 puta veca zapremina 33 hladnog apsolutnog etanola. Epruvete se ostave preko noci na -2о·с da Ьi se izvr5ilo talozenje DNK. • Uzorci se direktno iz friza рrеЬасији и minifugu i centrifugirajи 1 О min pri brzini 12000 rpm na 4 ·с. Sиpernatant se pazljivo dekantllje а u pelet se doda 1 ОО J.Li hladnog apsollltпog etanola i centrifugira З min pod istim нslovima. Supernatant se dekantиje а eprt1vete se ostave otvorene н sнvom termostatu na 3ТС kako Ьi se pelet osusio. • Izolovanoj DNK koja se nalazi u talogн, dodaje se 1 ОО J.Ll sterilne destilovane vode, i epruvete ostave preko noci u vodenom kupatilu na ЗТС, sto omogucava potpиno rastvaranje DNК. 3.3.3. Odredjivanje koncentracije izolovane DNK KoncentracUa izolovane DNK se odredjuje spektrofotometrijski merenjem apsorbance na 230, 260, 280 i 320 nm. DNK ima maksimum apsorpcije na 260 nm, proteini na 280nm, tako da odnos apsorbanci A260nпiA280nm predstavlja meru kavaliteta i cistoce izolovane DNK. Pozeljno је da odnos apsorbanci bude veci od 1 ,8. Vrednosti apsorbance na 230 i 320 nm trebalo Ьi da budи sto manje jer na ovim talasnim dиZinama apsorbиju soli i druge nereljene necistoce. Koncentracija izolovane DNK se izracunava ро formиli : A 260nm х R х 50 х ОР С (J.Lg/J.LI) - ------------------------------ 1000 R - korisceno razЫazenje ОР- opticki put = 1 50- konstanat pri izracunavanju koncentracije genomske DNK 3.4. Lancana reakcija polimeraze (PCR) Lancana reakcija polimeraze, PCR (engl. Polymerase Chain Reaction) је pionirska metoda za in vitro ampJifikaciju nukleinskih kiselina (Saiki et al, 1985) i kao takva predstavlja najpopularnijи i najcesce koriscenu tehniku, kako u cilju napretka fundamentalnih i strэZivanja tako i и komercijalne svrhe (Romac et а\. , 1999). U toku PCR reakcije ciljna sekvenca DNК amplifikuje se 106 риtа и tokи reakcije koja se sastoji iz repetitivnih ciklusa, а traje otprilike dva sata. Dva oligodeoksinukleotidna prajmera (prisutni u velikom visku u odnosи na ciljnu DNK) \ере se za suprotne Iance DNK. Prajmerima se ogranicava deo DNK koji se kopira, tako da imamo tacno dirigovanu sintezu striktno odredjenog, zeljenog dela DNК. Za replikaciju DNK је dakle potrebna DNK matrica Gednolancana denaturisana DNK) koju zelimo da kopiramo, prajmeri, gradivni elementi- nukleotidi, i enzim koji katalizuje ugradnju nukleotida ро principu komplementamosti sa ciljnom DNK. Ovaj enzim је termostaЬilna Taq polimeraza. Jedan ciklиs PCR-a cine sledece reakcije: 34 denaturacija DNK matrice hiЬridizacija prajmera sa matricom elongacija prajmera (katalizovana Taq polimerazom) Denaturacija matrice se obavlja inkubacijom DNK na 95°С. HiЬridizacija prajmera sa komplementarnom sekvencom odvija se na temperaturi od 42-65°С u zavisnosti od duzine i nukleotidne sekvence prajmera. Elongacija prajmera, tj. ugradnja nukleotida na З' krajeve prajmera se odvija na 72°С u prisustvu Taq polimeraze. Uspesnost PCR reakcUe podrazumeva pailjivo planiranje mnogih detalja, sto najvise zavisi od speci ficne sekvence koja se amplifikuje. Pre uvodjenja ove metode u laboratoriju neophodno је optimizovati PCR sistem. 3.4.1. Optimizacija PCR sistema - Odablr prajmera i ci(jnih sekvenci DNK Prajmerj su obicno nttkleotidj duzine 15-30 nukleotida ј sadr:Ze 45-55% G-C. Duijna prajmera i G-C sastav delimicno odredjuju temperaturu hibridizacije prajmera sa matrjcom. Duiina prajmera veca od 15 nukleotjda osjgurava da ne dodje do nespecificne hiЬridizacije sa ne- ciljnom DNK. - Odablt· temperaturnog profila Temperatura denaturacije mora da bude dovoljno visoka da u potpunosti denaturise cilj nu sekvencu. Та temperatura zavisi od G-C sastava i duzine ciljne sekvence. lako su za denaturaciju dovoljne sekunde, u toku PCR-a uzorcj se oЬicno dr:Ze l min na - 95°. Du:Za inkubacjja na visim temperaturama nepotrebno smaлjuje staЬilnost Taq polimeraze. Temperatura hiЬridizacije treba da bude maksimalna temperatura na kojoj је ova hiЬridjzacija moguca. Ona zavisi od dul.iпe i koncentracije prajmera, G-C sastava, koлcentracije soli (KCl i MgC\2) , i konceлtracije Taq polimeraze. Visoka temperatura hibridizacij e minimalizuje nespecificпu amplifikaciju. OЬicno је temperatura hiЬridizacije od 50-70°С. Poslednja reakcija u PCR amplifikaciji је eloлgacija prajmera ј ona se obicno izvodi na 72°С, sto је ј optimalna temperatura za zavrsnu reakciju Taq polimeraze. lmajuci u vidu da vecina polimeraza za minut produiava ekstenziju za oko 400 nukleotida , elongacija u trajanju 1-2 minuta је dovoljлa za veci deo cj\jnih sekveoci ispitivane DNК. Posto Taq polimeraza ispoljava najvecu aktivnost u temperaturnom intervalu 50-70°С, u veljkom broju slucajeva hibridizacjja prajmera i clongacija mogu Ьiti kompletirane u toku zajednjckog koraka hibridjzacije (annealing). Jednostavni dvostepeni PCR ciklus (denaturacija i anлcaliлg/elongacUa) znacajno skracuje vreme reakcije. Ukupan broj ciklusa limitiran је mjnjmalnjm brojem istih, neophodnih za detekciju nize koncentracije ciljne DNК. U svakom slucaju veci broj ciklusa nepotrebno povecava nespecificnu ampJjfikaciju, sto otezava detekcjju specificnog produkta. 35 - Reagensi i njihove optimafne koncentтacije PCRje slozenj kompleks reakcija i kao takav uslovljen је medjusobnim interakcijama mnogih reagenasa u specificnim koncentracijama. Koncentracije soli (KCL i MgC\2) delimicno odredjuju temperaturu annealing-a. U svakom slucaju koncentracije soli uticu na aktivnosti Taq poliшeraze: njeno vezivanje za DNК, stepen elongacije i procesivnosti, sto se predstavlja brojem nukleotida s jntetisanjh DNK polimerazom pre nego sto se ona odvoji od elongacionog kompleksa. Optjmalna koncentracija MgCI2 zavisi od ciljne sekvence i ona se mora odreditj ernpirijski, tj. eksperjmentalno postepeno povecavajuCi koncentraciju MgC\2 za О, 1 J..tM. Deoksinukleozid trifosfati NTP5 vezuju MgCI2 i sarnirn tim rnenjaju njegovu koncentraciju. Ukupna dNTP koncentracija је obicno 0,8J..tM. Konceпtracija termostaЬilne DNK polirneraze (u vecini slucajeva 0,5-5 jedjnjca ро uzorku), mora Ьiti dovoljno visoka da uspesno okonca e longaciju prajmera. lako Taq polimeraza u vecoj koпce11tracjjj poboljsava ekstenziju prajmera, takoЦje povecava ј nespecificntl elongaciju samog produkta, rezu\tjrajuci background ampliftkacijorn. Prcma tome kolicina DNK polimeraze treba da bude na neophodnorn minirnumu za izvrscnje reakcjje. Koncentracija prajmera od О, 1 J..tM је dovoljna za vecinu sistema, rnada је dozvoljen rang od 0,05 do 1 JlM а sto tтеЬа ispitati u svakom pojediпacпorn eksperimentalnom sjstemu. Na t:rZistu је dostupno v jse vrsta komercijalnih Taq polimeraza, mada tтеЬа voditi racuna da se kupuju proizvodj od firmi koje poseduju licencu za proizvodnju ј djstriЬucjju ovih hemikaljja. U ovom trenutku najrenomjranjjj proizvodjac reagenasa za molekularnu Ьiologjju је Applied Bjosystem, kojj stalno poboljsava performance termostaЬilne DNК polimeraze. Trenutno najprodavanjja Taq po\jmeraza је Hot Start polimeraza upravo ove fi rme koja nespecificnu arnplifikacjju svodj na najmanju mogucu meru. - Redukovanje nespecijicne ampЦfikac(je Sekvcпce prajmera SLI izabrane tako da nespecificnu amplifikaciju, poteklu od пespecjficne hiЬridizacjje za ne-ciljne sekvence ogranicene homologije, svode na minimum. Nespecificna amplifikacija se cesce javlja u uzorcima koji sadrze vjsoke koncentracije DNK (> 1 JlM). U svakom s lucaju nespecificna ampJ jfikacija moze smanjiti cj ljпo-specificnu amplifikaciju, kompeticijom za DNK polimerazu. Visoka temperatura hibridizacije (annea\ing-a) redukuje ovaj proЬlem. - Dekontaminacija ampliflkata Visoko optimjzovan PCR sistem moze detektovati 1-1 О molekula cj\jne DNК. Ovako ekstremna osetJjjvost znaci da se mora strogo paziti da ne dodje do kontamjnacije uzorka, koja је moguca cak i zaostalim ampliftkatima koji su se zadгZali u laboratorijskoj sredini. Ampliftkati predstavljaju glavni izvor kontaminacije јег se nalaze u mnogo vecoj koncentraciji od ciljne DNK. Laboratorije resavaju ovaj proЬ!em tako sto fi z jckj odvajaju prostoriju za 36 izvodjenje PCR reakcije od prostorije za detekcijи ampШikata. Ako do kontaminacije ipak dodje, razvijene sи specijalne metode dekontaminacije. 3.4.2. PCR procedura - umnoiavanje 5 ,6 , 7, i 8 eksona р53 gena Za PCR amplifikacij и 5-8 eksona, р53 gena vise od polovine иzoraka koriscen је ApliTaq GoldR PCR Master Mix (Applied Biosystems,AP). PCR Master Мјх sadrii sve hemijske reagense neophodne za reakcijи amplifikacije, osim prajmera i templata (ci ljne DNK). Upotreba ovog Master Mix-a zasniva se na Hot Start tehnjci, korj scenj em Hot Start AmpliTaq Gold DNA polimeraze. Уес dиze razvijanaod strane АР, Hot Start l1emij ska tehnika povecava senzitivnost, specificnost ј prinos PCR produkata. Zahvaljujuci cinjenici da је vecina hemikalija vec izmesana u svoj jm optimalnim koncentracijama u Master Mix-u, kontaminacija и toku PCR procesa је svedena па najmanjи mоgиси merи, sto znacajno olaksava i kontrolu kvaliteta. Korisceпjem Master Mix-a takodje se smanjнje vreme izvodjenja eksperimenta i potrosnja laboratorjjske plastike. AmpliTaq Gold је hemij ski modifikovana standardna Ampli Taq polimeraza. Nova, poboljsana polimeraza је neaktivna и dodiru sa hernijskim reagensima, иcesnicima PCR ampliftkacije. Ova neaktivnost omogucava vеси fleksiЬilnost u postavljanju eksperimenta kao ј mesanjc PCR reagenasa na sobnoj temperaturi. Zbog jnaktjvnosti enzjma u toku postavljanja reakcjje i prvog kruga PCR-a, nece docj do nespecjfiCne amplifikacjje prajmera na temperatиrama annealing-a koje su ispod optimalnih. AmpliTaq Gold DNA polimeraza se aktjvjra vjsokom temperaturom, vecom od temperature annealing-a, sto se aиtomatski posrjie tzv. «Hot» startom. Gold ONA polimeraza moze biti parcijalno ili potpиno aktivirana и toku posebпog pre-PCR koraka zagrevanja (Hot Start), ili se postepeno aktjvira и tokи termalnog ciklusa ( tzv. «Time Release» tehnika). ОЬе tehnike i Hot Start i «Time Release» poboljsavaju ampliftkacijи ve6jne DNK templata, kako smanjivanjem ncspecificne amplifikacije tako i povecanjem spccificne amplifikacije ciljnih sekvenci. Visoka nespecjficna amplifikacija ј пiska specificnost produkta mogн da se dese и PCR sistemima, kada se reakcione komponenete mesajи na niskim ili permjsjvnjm temperatиrarna ( 4-25°С), (Сћоu et al. 1992). Ovo se takodje desava i и toku prvog kruga cjklusa kada se reakcija odigrava na sнboptimalnim anлealjng temperatиrama. Na ovim temperaturama, standardni enzjm је aktivan i moguca је nespecificna ampl jfikacija prajmera. Ovakvi nespecificni konstruktj se u toku sledecih ciklusa i dalje amplifikujи, sto na kraju rezиltira oligomerima prajmera. Ovakvi produkti otezavaju detekcijtl specificnih ciljnjh traka pri analizi gela i smanjиjи preciznost kvantitativne analize PCR prodиkata ј njihovog daljeg sekvenciranja. AmpliTaq Gold Master Mix se distribuira u uoЬicajenoj 2х koncentracij i kako Ьi se omoguCilo lakse razbla.Zivanje pri dodavanju templata i prajmera. Saddi sledcce komponenete: AmpliTaq Gold DNA polimerazu, 250 U (0,05 U/J..Ll) GeneAmp PCR Gold pиfer; ЗОmМ Tris-HCI, 1 OOmM KCI, р Н 8,05 dNTP, svaki и koncentraciji 400 J..LM 37 MgC/2. 5mM StaЬilizatore. Svaku arnplifikaciju treba poceti sa dovoljnim brojem kopija templata, kako Ьi se doЬio jasni signal posle 30 ciklusa. U svakom slucaju kolicina DNК treba da bude manja od 1 J..l.g u 50J..t.l reakcione smese. U svim nasim eksperimentima, pocetna kolicina DNK tempJata Ьila је 0,6 J..t.g/50 J.!l . U ovom radu, za amplifikaciju eksona 5-8 р53 gena korisceni su prajmeri firrne Applied Biosystems. Njihova sekvenca, duiina doЬijenog amplifikata kao i uslovi pod kojim је izvrsena PCR reakcija dati su Tabeli 4. Tabela 4. Nukleotidлe sekvence prajmera, duzine arnplifikovanЉ fragmenata i uslovi PCR reakcije korisceni za umnozavanje eksona 5-8 р53 gena. Eli.~on Sek\1\.'Пca prajmera [)uziпa UsloYi PCR- aшplilikata rcakcije s, 5'ТGTTCACПGTGCCCTGACTЗ' 268Ьр 95°С 5 min s .. 5'CAGCCCTGTCGTCTCTCCAG3' 6s 5'ТGGПGCCCAGGGTCCCCAG3' 223 Ьр 35 ciklusa: 6 .. 5'GGAGGGCCACTGACAACCA3' '· 5'ACTGGCCTCATCПGGGGCT3' 171 Ьр 95°С 1 min 7as 5'ТGTGCAGGGTGGCAAGTGGC3' 8s 5'Т ААА TGGGACAGGTAGGACC3' 230 Ьр 60°С 1 min s •• 5'ТCCACCGCTTCTTGTCCTGC3' 3.4.3. Diferencijallli PCR-amplifikacija с-тус gena Amplifikacija c-myc gena i kontrolnog D2R (doparnin 02 receptor) gena izvedena је koriscenjem diferencijalnog PCR-a (Abou-EJlela et al. , 1996). DiferencijaJni PCR se zasniva na simultanoj arnplifikaciji dve ciljne sekvence u istoj reakcionoj smesi, pri cemu relativna kolicina PCR produkata ukazuje na relativni broj gena. Sekvence prajmera za c-myc i D2R, duzine arnplifikata i uslovi PCR-a dati su u Tabeli 5. 38 Tabela 5. Nuklcotidne sekvence prajmera, dиZine amplifikovanih fragmenata i us\ovi PCR reakcije kori~6eni za analizu amplifikacije c-myc. (;en SekYcвca рrајшеш DoL.iвa Uslo\·i PCR- amplifikata rcakcijc c-myc 5'GCTCCAAGACGТТGTGTGТТCG3' 95°С 2 min 150 Ьр 35 ciklusa: 5'GGAAGGACTATCCTGCTGCCAA3' 95°С 1 min D2R S'CCACTGAA TCTGTCCTGGTATG3' 50°С 1 min 11 О Ьр 72°С 1 min S'GTGTGGCATAGTAGТТGTAGTGGЗ' 3.5 Detekcija PCR produkata agaraznom gel elektroforezom Agarozna gel elektrofo reza је jednostavna i visoko efi kasna metoda za razdvajanje, identifikaciju i preciscavanje DNK fragmenata velicine 0,5-25 kb. Molekuli DNК pod uticajem clektricnog polja putuju kroz agarozni gel. Za molekul DNK, agarozni gel predstavlja set pora razlicitih velicina. Mali molekuli prolaze lako kroz vecinu pora i krecu se brie kroz gel. Veci molekuli imaju tendenciju da se saiimaju ili menjaju konformacij u pri prolasku kroz manje pore, sto rczultira njihovim sprijim kretanjem od manjih molekula. Pokretljivost molekula је uslovljena frakcijom pora kroz koje se lako prolazi, proces poznat kao «prosejavanje». Molekuli DNK veci od odredjene kriticne mase moraju se sa.Zimati i pri prolasku kroz velike pore i na taj nacin ostaju «zaglavljeni» u gelu. DNK molekuli u ovom opsegu velicina, svi migriraju istom brzinom sto se oznacava kao «limitirana pokretljivost». Kod uoЬicajene gel elektroforeze limitirana pokretljivost se de~ava kod veJicine fragmenata 20-40 kb, ~to opet 11aravno zavisi od tacnih uslova gel e lektroforcze (Schwartz and Cantor, 1984). Proces agarozпe gel elcktroforeze se oЬicno deli u tri 'faze: ( l) gel se priprema sa onom konceпtracij om agaroze koja је optimaJna za velicinu DNK fragmenata koje razdvajamo; (2) uzorci DNK se nanose u bunarice gela а uslovi elektroforeze se optimizuju kako Ьi omogucili najbolje razdvajanje; i (3) zahvaljujuCi etidijum-bromidu inkorporiranom u gel, gel se direktno vizuel izuje pod UV svetlom. З. 5. Ј Agarozna gel eleklroforeza-procedura Za proveru uspesnosti PCR amplifikacije upotreЬ\jena је 2% agaroza koja omogucava razdvajanje DNK fragmenata velicine 0,1-3 kb .. Pufer u kome se izvodila elektroforeza је 0,5ХТВЕ (Tris-boratni pufer), koji se pravi svez od postojeceg stoka 1 ОХТВЕ pufera (89mM Tris, 89mM borna kiselina, 2mМ EDTA). 39 Za jzvodjenje gel elektroforeze koriscen је aparat firrne Phannacia Biotech (model GNA-1 ОО). DeЬJjjna gela 0,4 cm је optimalna za veCinи analitickih razdvajanja, а s obzirom na velicinи nosaca gela Ьilo је dovoljno razliti 30 ml agaroze. Sam postupak agarozne gel elektroforeze sastojj se jz nekoliko koraka: З. 5. 2. Razlivanje gela па nosac gela Pre koriscenje nosac gela mora Ьitj apsolиtno cist. Slobodni krajevi nosaea se zatvore cvrsto lepUivom trakom, da Ьi se sprecilo razlivanje gela. Postave se cesljevi и odgovarajиca lezista na nosacи i nosac se polozi na, ро mogucstvи idealnи horizontalnи povrsinи. Agaroza se rastvori и риfеrи za elektroforezu (0,5ХТВЕ pufer) u malom erlenmajeru sa sjrok jm grlom i na magnetnoj mesalici zagreje do kljucanja. Zatim se rastvor agaroze ohladi izmedjи 50-60°С i doda etidjjum-bromjd и finalnoj koncentraciji 0,5~g/ml. Rastvor agaroze se razljje na nosac gela ј saceka 30 min da роtрило ocvrsne.CesUevj se izvlace pod pravim uglom da se ne Ьi ostetjJj bunari. Nosac gela zajedno sa gelom se stavlja u kadicu za elektroforezu. Za elektroforezu tzv. «sиbmarine» tipa koja se i najcesce koristi, и kad.icи se sipa pufer tako da bar 1 mm pokriva povrsinи gela. 3.5.3. Priprema i nanosenje uzoraka Maksimalna zapremina uzorka koja se moze илеti и bunar prvenstveno zavisi od deblj ine gela, Za gel debljine 4mm sa bunarjcjma dubok.im 3mm ј sjrokim Зmm, ukupna kolicina иzorka koji se nanosi је 8-9~1. S obzjrom da se zapremina Ьоје trcba da predstavlja petjnu zapremine uzorka , nanoseno је 7~Ll amplifJ.kata i 1 ,5~1 Ьоје («loading bиffer-a>>). Maksimalna koncentracija DNK koja se nanosi и bиnarice zavisi od velicine i broja fragmenata и amplifikatu. Za debljinu gela od 4mm, maksimalna kolicina DNK koja se moze izdvojiti kao jedna jasno ogranicena traka је oko 501')g. Mjnjmalna ko\jcina DNК koja se moze detektovati kao jedna traka је 21')g, u bиnaricи sirokom 3mm. Elektroforeza је vodjena pod sledecim uslovima: 30 min, pod naponom od 80V ј jaciлom struje od 25mA. З. 5. 4. Delekcija produkata UV-zracima Posle zavrsetka elektroforeze, gel se skida sa nosaca ј рrеЬасије и transluminator gde se zahvaljиjиci etidijum-bromidu jnkorporiranom и gel, doЬijeni produkti direktno vizuelizujи pod UV svetlom. Za svaku ana\izu neophodno је osjm uzoraka imati pozitivnu i negativnи kontrolи. Pozitivna kontrola је komercijalni tezinskj marker (Sigma) koji se pod istim uslovima elektroforeze razdvaja na trake, od kojiћ svaka odgovara produktu tacno odredjenog broja baznih parova (Ьр). Jednostavn_im poredjenjem pozicije naseg PCR-prodиkta sa odgovarajucom trakom tezinskog markera, saznajemo da li smo doЬili amplifikat odredjene duzine. Negativna kontrola је иzorak koji ne sadrzi DNK, pri cemu proveravamo da nije doslo do kontaminacije prajmera ili Master mix-a. Na Slici 5. predstavljena је detekcija PCR produkata gel-elektroforezom. 40 l 2 з 4 5 6К 7 8 9 10 11 12К Slika 5. Detekcija PCR-produkata (5 i б eksona р53) agaroznom gel-elektroforezom Kolone 1-5 predstavljaju umnozeni 5 ekson р53 gena za pet bolesnica. Kolona obelezena sa бК predstavlja komercijalni tezinski marker umnozen pod istim uslovima. Kolone 7-1 1 predstavljaju umлozeni б ekson р53 gena za pet bolesnica. Kolona 12К prestavlja teZinski marker. 41 3.6. Detekcija izmenjenilt sekvenci analizom konformacionog polimorjizma jednolancane DNK (SSCP- Single-Strand Conformation Polymorpltism) Vecina promeпa па nivou DNK kod kancera, kao sto su amplifikacije, genski rearanzmani, velikc delecije mogu Ьiti uspesno detektovane Soutl1em Ыоt hibridizacijom. Mcdjutim, detekcija finih DNK promena, kao sto su supstitucija samo jedne baze (tzv. tackaste mutacije), ili delecija i insercija jednog ili vise nukleotida, zahtevaju osetljivije metode detekcije. Ove promene su jako znacajne kod naslednih bolesti, kao i kod svih vrsta kancera. Odredjivanje nukleotidne sekvence genomske DNК direktnim sekvenciranjem PCR produkata је najpouzdaniji metod za detekciju izmena pojedinacnih baza (Gylleпsteп and Erlich, 1988; Murray, 1989). Ali sekvenciranje celog gепа је jako skup i dugotrajan proces, ра se naroCito za one gene koji poseduju tzv. «vruca mesta» gde se mutacije пajvise javljaju, preporucuju druge metode detekcije. Poznata је cinjenica da se jedпolancani fragment DNK moze potplLПO razdvojiti elektroforezom па пedeпaturisucem poliakrilamidnom gelu. Ovo razdvajanje је moguce zahvaljujuci jed.instvenoj tercijamoj strukturi, koja је odredjena primarnom strukturom (sekvencom) пukleotida. JednolanCan.i fragmeпt DNK, cija se пukleotidna sekvenca razlikuje samo ро izmeni jedne baze, putuju drugacije kroz nedenaturisuci poliakrilamidni gel od wt fragmenata. lmajuci u vidu da је ova promena pokretljivosti posledica izmeпjeпe konformacije jcdnolancane DNК usled supstitucije samo jedne baze, metoda је dobila imc konformacioni polimorfizam jednolancane DNK- SSCP (Orita et al. 1989; Welsh et al., 1997; Pooart et al., 1999). Zahvaljujuci mogucnosti visoke rezolucije, elektroforeza na poliakrilamidnom gelu (PAGE) је jedna od najosetljivijih metoda za razdvajanje i vizuelizaciju proteina i ЛltkleinskiЬ kiselina. U cilju doЬijanja zeljene specificnosti razdvajanja, poroznost gela se moze varirati u sirokom opsegu. Fragmenti DNK razdvajaju se na osnovu naelektтisanja, velicine ili komЬinacije ove dve osoЬine. Proces polimerizacije takodje ima uticaja na kvalitet razdvajanja. Poliakrilamidni gel baziranje па ko-polimerizaciji akrilarnida i Ьis-akrilamida (N- N'-metilen-Ьis-akrilamid). Polimerizacija se aktivira dodavanjem ТЕМЕD (tetrametiletilendiarniл) i APS (amonijumpersulfat), od kojih poslednji sadгZi persulfatne slobodne radikale koji aktiviraju ТЕМЕD. Oako aktivirani ТЕМЕD koji sadrzi nespareni elektron, sluzi kao inicijator polimerizacije tako sto aktivira akrilamidni monomer traпsferom nesparenog elektroпa. Reakcije aktiviranog monomera sa пeaktiviranim monomerima iniciraju polimerizacioni proces. Dugacki polimerni lanci se zatim neselektivno kroslinkttju sa Ьis­ akrilamidom. Duzina lanaca i stepen njihovog kroslinkovanja odredjuju poroznost gela. Duzina lanaca zavisi od koncentracije akrilamida u polimerizacionoj reakciji (obicno izmedju 3,5% i 20%); jedan molekul kroslinkera se nalazi u svakih 29 monomera akrilamida. Efektivni opseg razdvajanja fragmenata DNK u пedenaturisucim gelovima razlicite koncentracije se krece od 6 ра do 2000 baznih parova. Pored fizicko-hemijskih osobina polimerizacionog procesa, cistoca supstanci takodje utiee na kvalitet gela. Yelike kolicine APS i ТЕМЕD izazivaju promene рН vredпosti. Manja koliciпa ovih inicijatora dovodi do produkcije duzЉ polimemih lanaca, sto smanjuje gustinu i povecava elasticnost gela. Medjutim usporavanje polimerizacione reakcije dovodi do povecane rastvorljivosti kiseonika н smesi, cto rezultira melшnicki slabim geloш. Prcporucuje se koriscenje ekvimolarne kolicine APS i TEMED н koncentracijama 1-lOmМ. Da bi se gel potpuno polimerizovao potrebпo је oko 60 min, а sam proces polimerizacije postaje vidljiv posle 15 rnin. Polimerizacija је egzoterrnna reakcija, inicijalлo oslobodjena temperatura ubrzava reakciju. Polimerizacija na sobnoj temperaturi daje transparentne, manje porozne i vise elasticne gelove. Zato sve sнpstance treba ostaviti neko 42 vreme na sobnoj temperaturi pre pravljenja gela. Кiseonik iz vazduha rastvara se u gelu i inhiЬira proces polimerizacije. Zato је pozeUno degasirati rastvor akrilamida i Ьisakrilamida da bi se doЬili bolji rezultati. Poliakrilamidni gelovi sc prave izmedju dve staklene ploce odvojene spejserima, kako Ьi poliakri lamidni gel Ьiо sto manje izlozen vazduhu. U odnosu na agarozni gel, poliakri lamidni gelovi ima ju vise prednosti: mogucnost rezolucije је mnogo veca, tako da је moguce razdvojiti molekule DNK cija је razlika u duiini 0,2% (1 Ьр u 500 Ьр). izolovanje fragmenata DNК sa poliakrilamidnih gelova је jednostavno i pri tome se postize visoka cistoca uzorka. 3.6. Ј. SSCP- eksperimentalna procedura U nasem eksperimentalnom radu koriscen је sistem za vertikalnu elektroforezu firme BIO RAD, USA (model, PROTEANR П xi Cell), konstruisan za velicinu ploca od 20x20cm (unutra5nja ploca) i 20x22,5cm (spolja5nja ploca). Radjeno је sa gelovima debljine 1 mm i 0,75mm. Pokazalo se da su tanji gelovi pogodniji za rad јег daju ostrije i ravnijc trake DNК. Sam postupak izvodjenja SSCP metode sastoji se iz nekoliko koraka: З. 6. 2. Priprema poliakrilamidnog gela Zbog bolje postojanosti pravi se 30% stok rastvor akrilamid/Ьisakrilamid (29g akrilamida i lg N,N-meti lenЬisakrilamidllOOml Н2О). Za pripremu 50ml 8% poliakrilamidnog gcla potrebno је: 30% stok rastvor akrilamidlbisakrilamid destilovana Н20 1 ОХТВЕ pufer Ј 0% amonijum persulfat TEMED 1 3,3ml 29.0ml 2,50ml 0,35ml 0,20ml Rastvor se pravi neposredno pre nalivanja gela, а inicijatori polimerizacije se dodaju na kraju. Svaki duii kontakt sa kiseonikom iz vazduha moze usporiti proces polimerizacije. 3.6.3. Mesanje uzoraka DNK sa bojom i njihova denaluracija Као "gel loading" rastvor koriscena је smesa dve Ьоје: 0,25% ksilen cijanol i 0,25% brom fenol plavo u 20% Ficoll-u 400. Ksilen cUanol komigrira sa fragmentima DNK duzine 160 baznih parova, а brom fenol plavo sa fragmentima dliZine 45Ьр. Kolicina uzorka zavisi od deЬijine gela i broja i zapremine bunarica upotreЬijenog ceslja. Za deЬljinu gela 0,75mm koristili smo cesalj iste deЬijine sa 25 bunarica svaki zapremine бОџl. Ukupna kolicina uzorka nanosenog na gel bilaje 15џ1: 43 2,60џЈ Ьоје ("gelloading"solution) 4,60џЈ DNК uzorka (PCR produkt) 7,80џ1 sterilne Н20 Uzorci se denaturisu 5min na 95°С. Posle toga se odmah stavljaju na led da bi se sprecila renaturacija, i nanose и bиnarice gela. 3.6.4. Optimizacija uslova za SSCP elektroforezu U bunarice gela uzorci se nanose specUatno dizajniranim mikronastavcima, koji ne ostecuju zidove bunarica а istovremeno omogucavaju pravilno istiskivanje uzorka. Pre nanosenja uzoraka delimicno se montira sistem za vertikalnu elektroforezu: nosac gela se postavi u komoru и koju је sipan ohladjeni 0,5ХТВЕ pufer («rиnning buffer»), i pusti se voda da cirkulise kroz komoru kako ne Ьi doslo do renaturacije DNK иzoraka. Posle nanosenja uzoraka, zatvori se sistem i startuje elektroforeza. U nasem eksperimenta!nom radu, нslovi SSCP elektroforeze Ьili su sledeci: 165 min pri naponu od 200V i jacini strнje 15-20mA. З. 6. 5. Војепје gela sreb,-om Jedna od najcesce korisccnih metoda za vizнelizaciju gelova је njihovo bojenje srebrom (Bassam et al ., 1991 ). Sam postupak bojenja sastoji se iz nekoliko koraka. Posle zavrsetka elektroforeze, gel se pailjivo skida sa ploca i odmah stavlja u 10% etanol u trajanju od 10 minllta, pri сети se razdvojene trake ftksiraju. Gel se potom prebacuje u 1% HN03• Posle dva minuta gel se ispere vodom i prebacuje u 0,2% AgNOз. Sam proces bojenja srebrom traje pola sata i odvija se u mraku. Posle toga gel se dobro ispere vodom i stavlja u rastvor Na2C03 sa dodatkom foпnaldehida. Nakon 15-20 minuta pocinju da se uocavaju trake. Bojenje se prekida 10% glacijalnom СНзСООН. Na kraju se gel ispere vodom i pripremi za skeniranje i analizu doЬijenog rasporeda traka. З. 6. 6. Detekcija izmenjenih sekvenci Neophodno је napomenuti da za svaki uzorak DNK, za svaki ekson ponaosob postoji kontrola koja predstavlja DNK zdrave osobe. Ova DNK је umnozena i analizirana pod potpuno istim uslovima kao i ispitivani uzorci tumorske DNК. Detekcija izmenjenih sekvenci vrsena је uporedj ivanjem rasporeda traka izmedju kontrole i ispitivanih uzoraka. Svaka promena nukleotidne sekvence, makar ро jednoj bazi izmenice kretanje jednolancane DNK kroz gel, tako da se svaka genska alteracija lako uocava. Na slici 6. prikazanaje aпaliza 5,6,7, i 8 eksona р53 gena za pet razlicitih uzoraka DNK SSCP metodom. 44 Prikaz razclvajanja 5,6,7, 1 8 eksona р5З gena SSCP melodom ~ 2 3 4 , , ' 7 1 ' '18 1112 13 14 15 1' 17 11 11 21 21 22 23 24 \ Slika б. Prikaz razdvajanja 5, б , 7, i 8 eksona р53 gena SSCP metodom Kolone 1 -б : razdvajanje 5 eksona za pet razlicjtih uzoraka tumora, б - kontrolna DNК Kolone 7-12: razdvajanje б eksona. U koloni 1 О strelicom је oznacena mutacija, odnosпo traka koja пе postoji u kontroli (kolona 12) Kolone 13-18: razdvajanje 7 eksona, 18 - kontrolna DNК Kolone 19-24: razdvajanje 8 eksona, 24 - kontrolпa DNК 45 4. REZULT А TI 4.1. Ucesta/ost р53 mutacija и tumorskom tkivu ispitivanih bolesnica sa karcinomom dojke U uzorcima malignog tkiva karcirюma dojke (n=lOO) odredjivano је prisustvo mutacija u regionu od 5 do 8 eksona р53 gena. Ovaj deo р53 gena kodira DNK vezujuCi domen р53 proteina i bez njegove intaktnosti nema funkcionalnosti р53 proteina. Prema podacima iz literature, vise od 80% svih mutacija u р53 genu locirano је и ovom regionu. U grupi ispitivanih bolesnica detektovano је ukupno 25 mutacija р53 gena. Gledano ро ispitivanim eksonima, distriЬucija mutacija izgleda na sledeci nacin: 10 mutacija је detektovano u eksonu 5, 6 u eksonu 6, 8 u eksonu 7 i svega 1 mutacija u eksonu 8. D istribucija mutacij a prikazana је na Figuri 1. Raspodela mutacija u eksonima 5-8 рSЗ gena Figura 1. Raspodela mutacija u eksonima 5-8 р53 gena U cilju ispitivanja zavisnosti pojave mutacija u р53 genu od parametara tumora, u sledecim poglavljima data је distriЬucija detektovanih mutacija u funkciji : velicine tumora, statusa regionalnih limfnib cvorova, histoloskog tipa i gradusa tumora i statusa steroidnih receptora. Statisticka znacajnost oviЬ distriЬucija testirana је i testom (Petz В, Ј 985) 46 4.1 а) Zavisnost pojave mutacija и eksonima 5-8 р53 gena otl velicine tumora Od 1 ОО ispitivanih uzoraka karcinoma, 52 је bilo velicine Т , , 45 velicine Т 2 i З velicine Т з. Od 25 detektovanih rnutacija, 10 је locirano u okviru tumora velicine Т1, 14 u okviru velicine Т2 i jedna mutacija је bila locirana u okviru velicine turnora Т3 (Figura 2.). Raspodela р53 rrutacija u odnosu па velicinu tumora 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 о v ~~52 1/о '-- Т1 ·- 14145 1/3 -F ~ 1- - "--- ........... ./ 12 1З Veliёina tumora Figura 2. Raspodela р53 mutacija u odnosu na velicinu tumora Dobyena distribucija р53 mutacija u zavisnosti od veliCine tumora testirana је ·i testorn, pri cemu nije pokazana statisticki znacajna razlika u pojavi р53 mutacija u zavisnosti od velicine tumora (р>0.05) . 4.1 Ь). Zavisnost pojave mutacija и eksonima 5-8 р53 gena od prisиtnosti metastaza и regionalnim limfnim cvorovima Figura 2. prikazuje razliku u distribucij i mutacija u okviru р53 gena izmedju bolesnica sa prisutnim metastazama u regionalnim limfnim cvorovirna (N,) u odnosu na grupu bolesnica bez prisutnih regionalnih metastaza (N0). Razmatrano је 70 N+ u odnosu na 30 N0 bolesnica. Svega jedna mutacija u р53 genu detektovana је u N0 grupi, dok је 24 mutacija detektovano u N+grupi. Prikazana distriЬucija mutacija u eksonim 5-8 р53 gena u zavisnosti od prisutnosti metastaza u regionalnim Jirnfnim cvorovima testirana је х2 testom, pri cemu је doЬijena statisticki znacajna razlika u distribuciji mutacija izmedju dve pomenute grupe (р<0.025). 47 Raspodela р53 mutacija u odпosu па limfoпodalпi status р<О,О25 NO N+ Limfonodalni status Figura З . Raspodela р53 mutacija и odnosu na lirnfonodalni status 4.1 с). Zavisnost pojave mutacija и eksonima 5-8 р53 gena od histoloskog tipa tumora Figura 4. prikazuje ucestalost р53 mutacija u dva osnovna histoloSka tipa invazivnog karcinoma dojke. Pojava р53 mutacUa vezana је prevashodno za invazivni duktalni tip karcinoma dojke- 22/25 mutacija detektovano је u ovom histoloskom tipu, dok su svega dve mutacije locirane u invazivnom lobularnom histoloskom tipu tumora (р<О.О01). Raspodela р53 mutacija u odпosu па histoloski tip tumora О. О. IDC ~0.001 ILC ostalo Figura 4. Raspodela р53 mutacija u odnosu na hi stoloski tip tumora 48 DoЬijena distriЬucija mutacija u okviru histoloskog tipa tumora testirana је ( testom, pri cemu је doЬijena statisticki znacajna razlika u pojavi р53 mutacija izmedju invazivnog duktalnog i invazivnog lobularnog tipa karcinoma dojke (pO.OS). 4.1 е). Zavisnost poj ave mutacija и eksonima 5-8 р53 gena od histoloskog gradusa tumora Razmatrana је zastupljenost р53 mutacija u okviru histoloskib gradusa tumora I П i III. U okviru gradusa I (11 bolesnica), detektovana је jedna mutacija, u okviru gradusa II (79 49 slueajeva), detektovaлe su 22 mutacije i u okviru gradusa Ш (1 О bolesnica), detek:tovaлe su dve mutacije Raspodela р53 mutacija u odnosu na histoloski gradus tumora 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 о~-===~--~~~--==~~ 11 111 HistoloSki gradus tumora Figura 6. Raspodela р53 mutacija u odnosu na histoloSki gradus tumora DoЬijena distriЬucija mutacija р53 gena и odnosu na histoloski gradus tumora testirana је х2 testorn, pri cemu nije pokazana statisticki znacajna razlika u raspodeli mutacija u okviru razlicitih gradusa ci test, р>0. 05). Napominjemo da zastupljenost р53 mutacija u razlicitim histoloSkim gradusima nije Ьilo moguce adekvatno analizirati obzirom da su u istraiivanje Ьi le ukljucene vecinom bolesnice histoloskog gradusa П (7911 ОО). 4.1.1. Ucestalost р53 nшtacija и tиmorskom tkivи bolesnica bez metastaza и regionalnim linifnim cvorovima (No) U grupi bolesnica bez regionaJnih metastaza u limfnim cvorovima (n=ЗО) detektovana је samo jedna mutacija u eksonu 6 р53 gena, kod bolesnice sa karcinomom invazivnog duktaJnog tipa (ЮС) gradusa П, velicine Т2 i sa negativnim receptorima za estrogen i progesteron (ER-PR-). 50 4.1.2. Ucestalost р53 mиtacija и tиmorskom tkivи bolesnica sa prisиtnim metastazama и regionalnim limfnim cvorovima (Nt} U grupi bolesnica sa prjsutnim regionalnim metastazama u Jjmfnim cvorovima nadjene su 24 mutacjje и р53 genu kod 20 bolesnjca. Kod 4 bolesnice su detektovane duple mutacjje р53 gena i to: u 5 ј б eksonu u 2 slucaja ј u 5 i 7 eksonu, kao ј б ј 7 eksonu u ро 1 slucaju. U odnosu na jspitivane eksone, zastupljenost р53 mutacjja је bila sledeca: od 24 detektovanih mutacija 10 је nadjeno u eksonu 5, 5 u eksonu б, 8 u eksonu 7 ј svega 1 mutacija u eksonu 8 (Figura 7). Raspodela mutacija u eksonima 5-8 р53 gena kod N+ bolesnica Figura 7. Raspodela mutacija u eksonjma 5-8 р53 gena kod N+ bolesnica Као u prethodnjm poglavlj ima i и okviru grupe N+ bolesnjca, ispitivana је zavjsnost pojave mutacija u р53 genu od: veliCine tumora, histoloskog tipa tumora, statusa steroidnih receptora ј od histoloSkog gradusa tumora. 4.1.2 а). Zavisnost pojave mиtacija и eksonima 5-8 р53 gena od velicine tиmora kod N+ bolesnica Raspodela р53 mutacija kod N+ bolesnica u zavisnosti od velicine tumora, prikazana је na Figurj 8. Kod 33 uzoraka tumora velicine Т1 , detektovano је 10 mutacija, u grupj od 34 uzoraka velicine Т2, nadjeno је 13 mutacija i kod tri karcinoma velicine Тз detektovana је jedna mutacija. 51 Raspodela р53 mutacija u odnosu па veliёinu tumora kod N+ bolesnica Т1 i2 1З Velicina tumora Figura 8. Raspodela р53 mџtacija u odnosu na velicinu tumora kod N+ bolesnica Nije pokazana statisticki znacajna razlika u zastupljenosti mutacUa р53 gena и zavisnosti od vel icine tumora (х2 test, р>0.05). 4.1.2 Ь). Zavisnost pojave mutacija и eksonima 5-8 р5З gena od histol.oskog tipa tunwra kotl N+ bolesnica Kod 44 N+ bolesnice sa invazivnim duktalnim tipom karcinoma dojke, detektovana је 21 mutacija, dok su u grupi 18 N+ bolesnica sa invazivnim lobularnim tipom karcinoma dojke detektovane svega dve mutacije (Figura 9). Raspodela р53 mutacija u odnosu na histoloski tip tumora kod N+ bolesnica 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 р<О.О25 0 ~------~--------~--------r IDC ILC Ostalo HistoloSki tip tumora Figura 9 . . Raspodela р53 mutacija u odnosu na histoloski tip tumora kod N+ bolesnica 52 Statjstisticki zпacaJna razlika doЬijena је u ueestalostj р53 mutacjja jzmedju raz\jc jtih histoloSkih t jpova tumora (Fjgura 9,-ј test, р<О. 025). Da Ьismo utvrdili da li је uocena razJjka posledjca razljcite zastupljeпosti histoloskih gradusa u IDC i П..С tjpu karciпoma dojke, statist icki је testjrana ucestalost gradusa П prema gradusjma Иli u IDC ј ILC karcinornima (x2test). Statisticki znacajna razlika njje doЬijena. Bilo је nemoguce testirati ucestalost gradusa П odvojeпo prema gradusu I kao i gradusи ЈП u okviru IDC i ILC karcinoma zbog malog broja slucajeva (ukupno 3). Tabela 6. Ucestalost gradusa П vs. gradusima IIПI u IDC ј ILC karcinornima п.. с IDC Gradus П 15 36 51 Graduslfill з 8 11 18 44 62 4.1.2 с). Zavisnost p ojave mutacija и eksonima 5-8 р53 gena od statusa steroidnih receptora kod N+ bolesnica Raspodelu р53 mutacija и odпosu па status steroidnih receptora u grupi N+ bolesnica prikazuje figura 10. Kod 25 ER+PR+ bolesnica detektovaпo је 8 mutacija, u grupi 6 ER-PR+ uzoraka nadjene su 4 mutacije, kod 13 ER+PR- bolesnica 2 mutacije i и grupi od 26 ER-PR- bolesnica detektovano је 1 О mutacija. Raspodela р53 mutacija u odnosu па status steroidnih receptora kod N+ bolesnica ER+PR+ ER-PR+ ER+PR- ER-PR- Status steroidnih receptora Figura 1 О. Raspodela р53 mutacija u odnosu па status steroidnih receptora kod N+ bolesnica Nije doЬijena statisticki znacajna razlika u Ьrоји mutacija u р53 genu izmedju raz\jcjtjh feпotipa karcjпima dojke u odnosu па status steroidnih receptora (х2 test, р>0.05) . 53 4. 1.2 d). Zavisnost pojave mиtacija и eksonima 5-8 р53 gena otl histo/oikog gradиsa tumora kod N+ holesnica Zastupljenost р53 mutacija u okviru histoloSkog gradusa, prikazuje figura 11 . Kod 56 boJesnica gradusa li detektovana је 21 mutacija, kod 5 bolesnica sa tumorima gradusa I, nadjena је jedna mutacija, i kod devet bolesnica sa tumorima gradusa III, detektovane su 2 mutacije. Као sto је vec pomenuto, s obzirom da је vecina ispitivanih karcinoma Ьila gradusa П, data analiza nije u potpunosti relevantna. Raspodela р53 mutacija u odnosu па histoloski gradus turnora kod N+ bolesnica 11 111 HistoloSki gradus tumora Figura 11. Raspodela р53 mutacija u odnosu na histoloski gradus tumora kod N+ bolesnica 4.2. Ucestalost с-тус amplifikacije и tиmorskom tkivи bolesnica sa prisиtnim metastazama и regionalnim /imfnim cvoroa,imalimfnim cvorovima (N+) Analiza amplifikacije c-myc onkogena izvrsena је u tumorskom tkivu 40 bolesnica sa prisutnim regionalnim metastazama u limfnim cvorovima. Ampliflkacija jednaka ili veea od 200% (dve ili vise kop~a gena) detektovana је kod ukupno 20 bolesnica, dok је kod 17 bolesnica detektovan opseg vrednosti amplifikacije izmedju 100 i 200%. Svega З bolesnice su imaJe vrednosti c-myc-a ispod 100% (90.9%, 77.6% i 92.6%). Distribucija ampliftkovanog c-myc onkogena ро parametrima tumora koji ukljucuju velicinu tumora, histololoski tip i gradus tumora, kao i estrogenu zavisnost tumora prikazana је u sledecim poglavljima. 54 4.2 а). Zavisnost amplifikacije c-myc gena Ol[ veliCine tumora Distribuciju ampli:fikovanog c-myc gena и odnosu ла velicinи tиmora prikazuje Fiьrura 12. Kod 19 tumora vel icine Tt, amplifikacija c-myc gena detektovana је и 11 slucajeva, kod 19 tumora velicine Ђ u dva slиcaja, i na k:rajи nije zabelezena pojava amplifikovanog c-myc gena u svega dva tumora velicine Т3. c-myc amplifikacija u odnosu na veliёinu tumora 1 0.8 -- -- 0.6 =-а 0.4 - - --0.2 012 L. 7 о Т1 12 1З Velicina tumora Figura 12. Zavisnost c-myc amplifikacije od velicine tumora Nije pokazana statisticki znacajna razlika u zastupljenosti amplifikovanog c-myc gena u zavisnosti od veJicine tumora Ci test, р>0.05). 4.2 Ь). Zavisnost amplifikacije c-myc gena od histoloskog tipll tumora Ucestalost pojave amplifikovanog c-myc gena u odnosu na histoloski tip tumora kod N+ bolesnica, prikazuje Figura 13. Kod 24 bolesnice sa invazivnim duktalnim tipom karcinoma dojke, pojava amplifikovanog c-myc gena zabelezena је u 12 slucajeva, kod I l bolesnica sa invazivnim lobularnim tipom karcinoma dojke и 5 slucajeva, i kod pet bolesnjca sa ostalim bistoloSkim tipovima, amplifikovan c-myc gen detektovan је tri puta. 55 c-myc amplifikacija u odпosu па histolo~ki t ip tumora 1 0.8 0.6 0.4 0.2 о~-===~--~~~~==~ IDC ILC Ostalo Histoloski tip tumora Figura 13 . Zavisnost c-myc amplifikacije od histoloskog tipa tumora N ije dobijena statisticki znacajoa razlika и иcestalosti amplifikovanog c-myc gena и zavisnosti od histoloskog tipa tumora (i test, p>O.OS). 4. 2 с). Zavisnost amplifikacije c-myc gena od statusa steroidnih receptora Raspodelu amplifikovaoog c-myc gела и odnosu na status steroidnih receptora и grupi N+ bolesnica prikazuje Figura 14. Kod 9 ER+PR+ bolesnica ampliflk:ovan c-myc gen detektovan је u 5 slиcajeva, grupi 2 ER-PR+ uzoraka jedan је imao amplifik:ovan c-myc, kod 12 ER+PR+ bolesnica 7, su imale amplifJ.kovan c-myc i kod 17 ER-PR- bolesnica, amplifikovani c-myc detektovan је sest puta. c-myc amplifikacija u odпosu па status steroidnih receptora 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0~~~~-=~~~==~~==~ ER+PR+ ER-PR+ ER+PR- ER-PR- Status steroidnih receptora Figura 14. Zavisnost c-myc amplifikacije od statusa steroidnih receptora 56 Nije doЬijena statisticki znacajna razlika u ueestalosti amplifikovanog c-myc gena izmedju razlicitih fenotipa karcinima dojke u odnosu na status steroidnih receptora (:i test, р>0.05). Obzirom da c-myc onkogen spada u kategoriju estrogenom iлdukovanih gena, poredjena је zastupljenost njegove amplifikacije u grupi sa funkcionalnim estrogenim receptorom, а mereno prisustvom estrogenom indukovanog receptora za progesteron (ER+PR+, ER-PR+) u odnosu na grupu sa nefunkcionalnim estrogenim receptorom (ER+P.R-, ER-PR-). Statisticka analiza је radjena х2 testom, pri cemu nije potvrdjena statisticki znacajno veca ucestalost c- myc amplifikovanih tumora u grupi tumora sa funkcionalnim estrogenim receptorima u odnosu na nefunkcionalne estrogene receptore (6 vs.l4), iako se uocava daje veci broj c-myc amplifikacija vezan za nefunkcionalne receptore za estrogen. (ТаЬеlа 7). Tabela 7. Amplifikacija c-myc u odnosu na funkcionalnost steroidnih receptora (ER,PR) Funkcionalni ER c-myc>200% (n) c-myc<200% (n) (n) ER+PR+ 6 5 11 ER-PR+ ER+PR- 14 15 29 ER-PR- (n) 20 20 40 Ukoliko se posmatra ucestalost c-myc amplifikacij a samo u odnosu na prisustvo estrogenog receptora, evidentna је veca zastupljenost c-myc amplifikacija u grupi ER+ karcinoma dojke. Medjutim, doЬijena zastupljenost c-myc amplifikacija se statisticki znaeajno ne raz1ikuje u okviru ER+ i ER- tumora (х2 test), mada se uocava da је, za razliku od ucestalosti c-myc amplifikovanih tumora medju tumorima sa nefunkcionalnim receptorima za estrogen, veci broj c-myc amplifikacija detektovan u grupi sa pozitivnim statusom receptora za estrogen (13 vs.7). Ova razlika se ne uocava kada se posmatra intaktni c-myc (9 vs.1 1 slucajeva), Tabela 8. Tabela 8. Amplifikacija c-myc u odnosu na st atus receptora za estrogen StatusER c-my<2200% (n) c-myc<200% (n) (n) ER+ 13 9 22 ER- 7 11 18 (n) 20 20 40 Takodje је analizirana i ucestalost bolesnica sa ponovnim javljanj em bolesti u grupi uzoraka sa amlifikovanim/neamplifikovanjm c-myc-om, u zavisnosti od prisustva funkcionalnih estrogenЉ receptora (ER+PR+, ER-PR+) (tabela 9), kao i u zavisnosti od prisustva samog estrogenog receptora (ER+, ER-) (tabela 10). Ako se posmatraju uzorci sa amplifikovanim с- 57 myc onkogenom bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti (n=I 0), nije dobijena statisticki znacajna razlika u broju bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti izmedju grupa sa funkcionalnim estrogenim receptorima (n=2) i nefunkcionalnim estrogenim receptorima (n=8), iako se uocava veca ucestalost ponovnog javljanja bolesti kod bolesnica sa nefunkcionalnim estrogenim receptorima (Fiserov egzaktni test, р>О.О5) . Takodje se ne uocava statisticki znacajna razlika u raspodeli bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti u okviru uzoraka sa amlifikovanim i neamplifikovanim c-myc onkogenom u tumorima sa (2 versus 2 slucaja) ili bez (8 versus 9 slucajeva) funkcionalnih estrogenih receptora (Tabela 10). Tabela 9. Ucestalost bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti u grupi sa amplifikovanirn!neamplifikovanim c-myc u odnosu na funkcionalnost sterodnih receptora Funkcionalni ER R+ (c-mye200%) R- ( c-myc<200%) ER+PR+ 2 2 ER-PR+ ER+PR- 8 9 ER-PR- (n) 10 11 *R+ broj bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti R- broj bolesnica bez ponovnogjavljanja bolesti (n) 4 17 21 Ista analiza zastupljenosti bolesnica sa ponovnim jav\janjem bolesti и okviru uzoraka sa amplifikovanim ili intaktnim c-myc onkogenom, а u zavisnosti od statusa estrogenog receptora prikazana је u Tabeli 10. lako nije doЬijena statisticki znacajna razlika u zastupljenosti bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti, vezano za uzorke sa ampliftkovanim c-myc onkogenom u odnosu na ER+/ER- tumore, uocava se veci broj ponovnih javljanja bolesti kod bolesnica sa tumorskom amplifikacijom c-myc-a u ER+ tumorima (7 vs. З slucaja). l ako se radi о grupama sa malim brojem slucajeva, ipak se uocava da ova razlika vezana za status estrogenog receptora ne postoji kod bolesnica bez tumorske amplifikacije c-myc onkogena (5 vs .б slucajeva) (Tabela 10). Tabela 10. Ucestalost bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti u grup1 sa ampliftkovanim/neamplifikovanim c-myc u odnosu na status receptora za estrogen StatusER R+ (c-mye200%) R- (c-myc<200%) ER+ 7 5 ER- з 6 (n) 10 11 *R+ broj bolesnica sa ponovnim javljanjem bolesti R- broj bolesnica bez ponovnog javljanja bolesti (n) 12 9 21 58 4.2 d). Zavisnost amplifikacije c-myc gena od histoloskog gradusa tumora Od иkupno 40 testiranih N+ bolesnica, tri је bilo sa gradиsom 1, 31 gradиsa П i sest gradиsa lП. Amplifikacija c-myc gena detektovana u 17 slucajeva u okviru gradusa П, u 6 slucajeva u okviru gradиsa Ш, i nijednom и gradusu I (Figura 15). c-myc amplifikacija u odnosu па histolo~ki gradus tumora 1 0.8 0.6 0.4 0.2 ./ 7 0~~==~--==~~~==~ 11 111 HistoloSki gradus tumora Figura 15. Zavisnost c-myc ampliftkacije od histoloskog gradusa tumora Nije pokazana statisticki znacaJna razlika и иcesta losti amplifikovanog c-myc gena od histoloskog gradиsa tиmora (х2 test, p>O.OS), mada kao sto smo vec spomenиli , s obzirom da је vecina karcinoma bila gradusa П (З 1/40), data analiza nije и potpunosti relevantna. 4.3. Korelacija ispitavanih alteracija gena (р53, c,..myc) sa tokom maligne bolesti и N+ grupi bolesnica Korelacija izmedju ispitivanih genskih alteracija i toka maligne bolesti analizirana је samo u grupi bolesnica sa prisutnim regionalnim metastazama u Iimfuim cvorovima (N+), s obzirom da је u grupi bolesnica bez pri sutnih regionalnih metastaza detektovana samo jedna mиtacija. U ispitivanoj grupi N+ bolesnica, kod 20 bolesnica sи detektovane mиtacije и р53 genu (20/70), dok је kod takodje 20 bolesnica detektovana amplifikacija c-myc onkogena (20/40). U posmatranom vremenskom intervalu (opseg 6-127 meseci, medijana 47 meseci), 32/70 59 (46%) bolesnjca su jrnale ponovno javlj anje bolestj_ Da bjsrno utvrdili da Јј ponovno javljanje bolesti koreJjse sa prj sustvom mutacija и р53 genu, uporedjjvana је ucestalost ponovnog javJjanja bolesti kod bolesnica sa prisutnirn mutacjjama (n= 20) sa ucestaloscu ponovnog javljanja bolesti kod bolesnica bez rnutacija u р53 genu (n=50). Ponovno javljanje bolesti detektovano је kod 10/20 (50%) bolesnica sa р53 mutacijama ј kod 22/50 (44%) bolesnica bez prjsutnih р53 mutacija. i testorn је pokazano da ne postoj j statisticki zanacajna razJika u иcestalosti ponovnog javljanja bolestj izrnedjи bolesnjca sa prisutnirn i odsutnirn р53 mutacjjama (Tabela 11). Tabela 11 . Ucestalost ponovnog javljanja bolesti (R+ ј R-) и grupj bolesnica sa (р53+) i bez (р53-) р53 mutacija R+ R- р53+ 10 10 20 р53- 22 28 50 32 38 70 4.3.1. Periotl bez ponovnog javljanja bolesti (DFI) kod bolesnica sa i bez mutacija и р53 genu Sve bolesnice sa prisutnim metastazarna u regionalnirn limfni rn cvorovjma Ьil e su podvrgnute adjиvantnoj (dodatnoj) hemjoterapjj j posle hirurske intervencjje. Posto је osnovni zadatak adjuvantne hemioterapjje odlaganje ponovnog javljanja bolesti, uspesnost ove vrste terapije se meri procenom du.Zine slobodnog vremenskog jntervala kod obolelih. Sa druge strane, uloga faktora predvidjanja terapijskog odgovora (prediktjvnog faktora) jeste sledeca: na osnovu njegovog statusa Ьilo Ьi moguce procenjtj ishod terapjjskog odgovora. Kod bolesnica sa prisиtnim/odsutnim mutacjjama и р53 genu, prvo sи Kaplan Meier-ovom metodom (Кaplan алd Mejer, 1958) izracиnavane funkcije preziv ljavaлja bez ponovnog javljanja bolesti. S obzirom па hipotezu da Ьi р53 zbog svoje иloge и regиJacij j apoptoze, mogao Ьiti faktor predvjdjanja terapjjskog odgovora, uporedjjvan је vremenski jnterval bez ponovnog javljanja bolestj (DFI - disease free interval) kod bolesnica sa ј bez mиtacija и р53 genu. Nije doЬijena statjstickj znaeajna razlika (Log Rank test, р>0.05, Figura 16). 60 l .O ...-- -.. 0.9 0.8 0.7 0.6 р 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Pcriod do ponovnogjavђanja bolesti (DFI) --p53+(n=20) • • • - р53- (n=SO) 0.0 +--.,---.,---т---т---т---г------,г------,г----, о 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Meseci Figura 16. Period bez ponovnog javljanja bolesti kod bolesnica sa (р53+) i bez (р53-) р53 mиtacija 4.3.2. Period bez pon.ovnog javljanja bolesti и prvih 24 meseci pracenja bolesnica sa i bez mиtacija и р53 genи Posto sи date bolesnice pracene и dиzem vremenskom intervalи, analjziran је statиs р53 gena kao potencijalnog prediktora terapijskog odgovora, u odnosu na pojavu ranog relapsa (ponovnog javljanja bolesti) do 24 meseca, и odnosu na pojavu relapsa bolesti do 36 meseca i и odnosu na pojavu ponovnogjavljanja bolesti posle 36 meseca pracenja. Kada se razmatra ponovno javljanje bolesti и okviru pracenja od 24 meseca, иосаvа se da se, и grupi bolesnica sa р53 mиtacijama (n=20), 8 od ukupno 10 relapsa bolesti, desava bas u okviru prvih 24 meseci. Medjutim, и grupi bolesnica bez р53 mиtacija, svega 8/22 ponovna javljanja bolesti desavaju se tokom prva 24 mesaca. Uocava se statisticki znacajno veca zastиpljenost ponovnog javljanja bolesti u okviru prvih 24 meseca pracenja u grupi bolesnica sa prisutnim р53 mutacijama (-/ test, р<О.О5) (Tabela 12). Tabela 12. Ucestalost ponovnog javljanja bolesti (R+ i R-) u okviru 24 meseca pracenja и grupi bolesnica sa (р53+) i bez (р53-) р53 mutacija R+ R- р53+ 8 12 20 р53- 8 42 50 16 54 70 61 Kada је analizirana pojava ranog relapsa bolesti ( do 24 meseci), uporedjivanjem vremenskog intervala bez ponovnog javljanja bolesti u grupi bolesnica sa i bez mutacija u р53 tumor supresomom genu, doЬijena је statisticki znacajna razlika (Log Rank test, р=О.О214). Bolesnice sa prisutnim mutacijama u рSЗ genu imale su znacajno kraci vremenski interval bez ponovnogjavljanja bolesti nego bolesnice bez mutacija u рSЗ genu (Figura 17). Period bcz ponovnog javUanja bolesti (<24 rreseci) 1.0 r--1:..-=-=-=-c·....:-~· - . 0.9 • • L • • • L 0.8 " • L • • 0.7 . 0.6 р 0.5 . 0.4 . 0.3 0.2 . 0.1 • р<0.005 --p53+(n=20) - - - - р53- (n=SO) 0.0 +----г-.----r.----т-.----.,-----,, о 6 12 18 24 30 Mescci Fiьrura 17. Vremenski interval bez ponovnog javljanja bolesti u pгvih 24 meseci pracenja bolesnica bez (рSЗ-) i sa (рSЗ+) рSЗ mutacijama (pO.OS) (Tabela 13). 62 Tabela 13. Ucestalost ponovnog javUanja bolesti (R+ ј R-) u ok:viru 36 mesecj pracenj a u grupj bolesruca sa (р53+) ј bez (р53-) р53 mutac jja R+ R- р53+ 8 12 20 р53 - 14 36 50 22 48 70 Uporedjivanje duzjne trajanja vremenskog intervala bez ponovnog javljanja bolesti u okviru prvjh 36 meseci pracenja ne pokazuje statisticki znacajnu razliku izmedju grupa sa prisutnim i odsutnim р53 mutacjjama (Log Rank test, р >0.05) (Figural8). Period do ponovnogjavyanja bo\esti (<36 ~sec i) l.O .,.-- -.. 0.9 0.8 0.7 0.6 р 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 --р53+ (n=20) - - - - р53- (n=50) 0.0 +--т--т--т---т---т---..-----,..---..-----, о 6 12 \8 24 30 36 42 48 54 Meseci Figura Ј 8. Vremenskj jnterval bez ponovnog javljanja bolesti u 36 mesecj pracenja bolesnica bez (р53-) i sa (р53+) р53 mutacijama 4.3.4. Period bez ponovnog javljanja bolesti nakon 36 meseci pracenja bolesnica sa i bez nшtacija и р53 genu Procena pojave ponovnog javljanja bolesti u vremenskom intervalu posle 36 meseci pracenja (kasru relaps), pokazuje da se u grupi bolesnica sa рSЗ mutacijama kasni relaps bolesti javlja u 2 od 9 slucajeva, dok se u grupi bolesnica bez р53 mutacija javlja u 9/31 slucaja. Ne uocava se statjsticki znacajna razJjka u ucestalosti ponovnog javljanja bolesti nakon 36 meseci pracenja izmedju ispitivanib grupa bolesnica (х2 test, p>O.OS) (ТаЬеlа 14). 63 Tabela 14. Ucestalost ponovnog javJjanja bolesti (R+ ј R-) nakon 36 mesecj pracenja u grupi bolesnica sa (р53+) ј bez (р53-) р53 mutacija R+ R- р53+ 2 7 9 р53- 9 22 31 11 29 40 Uporedjjvanje duzi ne trajanja vremenskog intervala bez ponovnog javljanja bolesti nakon 36 mesecj pracenja ne pokazuje statjstjcki znacajnu razliku izmedju grupa bolesnica sa prisutnim ј odsutnjm р53 mutacijama (Log Rank test, р>О.О5) (Fjgura 19). Period do ponovnogjav~anja bolesti (>36 ~reseci) 1.0 .....- ------------....--" ~_,...._"......"._....,_,...,.----, 0.9 · • L • • • 0.8 . 0.7 0.6 . р 0.5 . 0.4 0.3 . 0.2 0.1 --рSЗ+ (n=9) • • • · p53- (n=31) 0.0 ..f..----.,--...-.-...-.-....---.,----.,..---..--,-..... ---.. о 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Meseci F igura 19. Vremenski int erval bez ponovnog javljanja bolesti nakon 36 meseci pracenja bolesnica bez (р5З-) i sa (р5З+) р53 mutacijama 4.3.5. Period do progresije bolesti kod bolesnica sa ponovnimj avljanjem bolesti и odnosu па prisustvolollsustvo р53 mutacija U grupi bolesnica sa prisutnim regionalnjm metaslazama koje su kao adjuvantni tretman primale hemioterapiju, izdvojena је grupa bolesni ca kod koje је tokom vremenskog intervala pracenja doslo do ponovnog javljanja bolestj (n=32). Ova grupa bolesnica је podeljena u odnosu na prisustvo р53 mutacjja na bolesnice sa (n= lO) i bez (n=22) р53 mutacjja. Zatim је uporedjivan vremenski interval do progresije bolesб (Progressjon Free Interval - PFI) izmedju 64 datih grupa bolesnjca. Pokazan је statjstjckj znacajno kraci vremenskj interval do progresjje bolesti kod bolesnjca sa рSЗ mutacjjama u odnosu na bolesnice bez рSЗ mutacjja (Log Rank test, р=О.О442} (Fjgura 20). 1.0 ,....--.., 0.9 0.8 0.7 0.6 р 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 Period do progresye bolcs ti (PFI) p~.oos - 1 -. - 1 -. --. --p53+(n=IO) .. - -1 - - - - р53- (n=22) •1 -1 - 1 . - -· ---- .. •1 0.0 +---т----т---т---т---т---т---т--"""Т'"-...., о б 12 18 24 30 36 42 48 54 Mcseci F igura 20. Vremenski perjod do p1·ogresije bolestj kod bolesnjca sa ponovnjm javljanjem bolesti u odnosu na prjsustvo (рSЗ+} j\i odsustvo (рSЗ-) рSЗ mutacija (р<О.О5) 4.3. 6. Period bez ponovnog javfjan}tt bolesti kod ispiti1'ane tri grupe bolesnica oformljene и odnosu па prisustvol odsustvo р5З mutacija i amplifikacije c-myc onkogena U daljoj anaJjzi korelacije jzmedju isp jtjvanjh genskЉ alteracjja ј k\jnjckog toka bolesti u jspitivanoj grupj bolesnica, statusu р53 gena pridodat је i status c-myc gena. S obzirom da је praeena amplifikacjja c-myc onkogena, pod c-myc+ tumorima smatrafj smo one uzorke kod kojih је regjstrovano povecanje Ьilo jednako iJj vise od 200% u odnosu na kontrolnu vrednost. Uporedjjvana је duzina vremenskog jntervala bez ponovnog javljanja bolesti jzmedju sledeeib grupa bolesnjca: • Bolesnjca sa pri sutnim р53 mutacjjama i ampJjfikovanjm c-myc (р53+, c-myc+) (n=7); • Bolesnica bez р53 mutacija i bez c-myc amplifikacije (рSЗ-, c-myc-) (n= J4); • Bolesnica sa c-myc ampJjfikacjjom (c-myc+) (n=20}; Poredjenje duzjne vremenskog jntervala bez ponovnog javljanja bolestj izmedju р53+, c- myc+ grupe bolesnjca ј рSЗ-, c-myc- grupe bolesnjca nije pokazalo statisticki znacajnu 65 razliku (Log Rank test, р>О.О5) (Figura 21). Takodje nije nadjena statisticki znacaJna razlika ni pri poredjenju vremenskog intervala bez ponovnog javljanja bolesti izmedju p53+c-myc+ bolesnica i c-myc+ bolesnica (Log Rank test, р>О.О5) (Figura 21) Statisticki znacajna razlika nije nadjena ni pri poredjenju duzine vremenskog intervala bez ponovnog javljanja bolesti (р53-, c-myc-) bolesnica i (c-myc+) bolesnica (Log Rank test, р>О.О5) (Figura 21 ). 1.0 0.9 . 0.8 . 0.7 . 0.6 . р 0.5 . 0.4 . 0.3 . 0.2 . 0. 1 . Pcriod do ponovnog javljanja bolesti '-~L 1. .. - - L '!.-. ,_ •• - • ""'L... - .. - - - - -- - .. -· - --t p53+/crnyc+ (n=7) • - - - p53-c-myc- (n= 14) c-myc+ (n=20) 0.0 +---..--.---т-- т----r---т- ........ - --..---. . . . . . . о 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Mcseci Figura 21 . Vremenski period bez ponovnog javljanja bolesti kod ispitivane tri grupe bolesnica oformljene u odnosu na prisustvo/odsustvo р53 mutacija i ampliftk:acije c-myc onkogena 4.3. 7. Poretljenje ukupnog pretivljavanja bolesnica sa (р53+/с-тус+) ili bez (p53-/c-myc-) tletektovanih genskih alteracija Analizirano је i ukupno prezivljavanje (OS) bolesnica sa prisutnim regionalnim metastazama u limfnim cvorovima. Bolesnice su podeljene u dve g.rupe u zavisnosti od prisustva/odsustva р53 mutacUa i/ili c-myc amplifikacije. Prvu grupu su cinjle p53+/c-myc+ bolesnice (n-25), а drugu grupu su cin ile p53-/c-myc- bolesnice (n=15). u prvoj grupi p53+/c-myc+ bolesnica desilo se svih 6 smrtnih ishoda registrovanih u intervalu pracenja, dok u drugoj grupi p53-/c- myc- bolesnica nije registrovan niti јеdал smrtni ishod. 66 Poredjenje duzine uk:upnog prezivljavanja izmedju ove dve grupe bolesnica pokazalo је da је grupa bolesnica u kojoj su registrovane opisane genske alteracije imala znacajno krace uk:upno preZivljavanje u odnosu na grupu bolesnica bez genskih alteracija (Log Rank test, р=О.О286) (Figura 22). Ukupno p!Wjvljavanjc p~.OOS 1.0 0.9 . 0.8 . 0.7 . 0.6 . р 0.5 . 0.4 . --p53./c-myc- (n=25) --pSЗ+/c-myc+ (n= 1 5) 0.3 . 0.2 • 0. 1 . 0.0 . . . . о 6 12 18 24 30 36 42 48 54 Meseci Figura 22. Poredjenje ukupnog prezivljavanja bolesnica sa (p53+/c-myc+) ili bez (p53-/c- myc-) detektovanih genskih alteracija (p