UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOSKI FAKUL ТЕТ - - ..... /• STRUKTURNA 1 FUNKCIONALNA ANALIZA 5' REGULATORNOG REGIONA GENA SMAD4 U KARCINOMU PANKREASA COVEKA - DOKTORSKI RAD - Aleksandra Nikolic Beograd, 201 О УНИ11ЕР314ТЕТСКА Е1.1БПИОТЕКА 'CS~'T " ~.~ .\РКО8 !1Ћ'·БЕОГРАД G Ovaj rad је uradeп u Laboratoгjjj za molekularпu Ьiologjju lпstjtuta za molekularпu geпetjku ј geпetjcko jпzeпjerstvo, gde sam dosla ј ostala zahvaljujucj profesorkj Апј Savj6, kojoj ј ovom prjljkom zeljm da se od srca zahvaljm za presudaп pozjtjvaп utjcaj kojj је jmala па moju karjjeru . Мепtог ovog rada је Ьila Dragjca Radojkovj6, kojoj zahvaljujem sto mj је omogucjla potpuпu slobodu ј samostalпost u jzгadj ove doktorske teze. Sпеzапј Којјс zahvaljujem па jdejama kojjma је doprjпela koпceptu ovog rada, mateгjjalu ј metodologjjj koje mj је stavjla па raspolagaпje ј dragoceпom vremeпu koje mj је posvetjla. Komeпtoru Svetlaпj Radovjc veljko hvala па svemu sto је prosla, uradila ј jstrpela da Ьi postala ј ostala сlап svjh mojjh komjsjja. Vecпu zahvalпost dugujem Јеlепј Kusj6, mojoj prvoj ј јеdјпој meпtorkj, kakva је пekada Ьila (а Ьila је meda, krokodjl, duh ј сlап sumske druzjпe), па пajlepsem ј пajopusteпjjem uvodu u eksperjmeпtalпj rad kojj djplomac moze da pozelj. Posebпu zahvalпost dugujem mojjm djplomcjma, kojj su svojom kreatjvпos6u, orjgjпalпoscu ј lucjdпoscu od mog meпtorskog rada пapravjlj пajlepsj ј пајdгаgосепјјј deo moje kагјјеге: Q Aleksaпdrj Djvac, mom prvom djplomcu, za svu prjjateljsku, eksperjmeпtalпu tehпjcku podrsku tokom uzbudljjvjh deset godjпa koliko smo zajedпo provele u laboratoгjjj Q Магјјј Staпkovjc, mom пajmladem djplomcu, za sve јпsрјгаtјvпе razgovore о fjlozofjjj zjvota koje smo obavjle u пјепјm koljma, cesto па пajcudпjjjm mogucjm putevjma ovoga sveta Q Јеlепј Dјпј6, mom пајпаргеdпјјеm djplomcu, па uvek dobrom rasplozeпju ј spremпostj па akcjju, а роsеЬпо па tome sto је ostala prjvr:Zeпj сlап laboratorjje ј kada је jz пје otjsla Q Braпku Tomjcu, mom пajdrazem djplomcu, za lakocu koegzjsteпcjje ј kooperacjje u potpuпostj ljseпjh suvjsпe komuпjkacjje Q Mjlj Ljujjc, mom пajuspesпjjem djplomcu, za zadovoljstvo uzjvaпja u ·ubedljjvo пajvecem koljcпjku postjgпutog uspeha djplomca ј ulozeпog truda meпtora Q lvaпu Njsevjcu, mom пajzahtevпjjem djplomcu, za пajludu radпu svesku koju је l aboratoгjjskj svet jkada vjdeo ј kojom 6u se zabavljatj do репzјје, а verovatпo ј posle toga Q Aleksaпdrj Vaпcevskoj, mom buducem djplomcu, za prjmereпu ј prjmerпu odaпost , prjpadпost ј posveceпost laboratoгjjj сјјј се сlап tek postatj Ljjljaпj Rakj6evj6 hvala za ogromпu koljcjпu podrske koju mj pruza, u cemu vrlo cesto ostaje usamljeпa, а sto moju zahvalпost сјпј jos vecom. Valeпtjпj Dordevjc hvala za sve male ј veljke stvarj koje radj sa mпom , umesto, zbog jfili za mепе. lvi Ргuпег sam duboko zahvalпa sto је svojim dolaskom u laboratoriju obпovila osvezila karakteristicпi duh пaseg malog kolektiva u kome роsеЬпо uzivam. Aleksaпdri Nestorovic hvala za osmehe i radost koje uпosi u пasu laboratoriju i veciti optimizam koji је prati. Od kolega u lпstitutu specijalпu zahvalпost dugujem Aleksaпdru Krsticu, koji је za moju tezu dao mпoge korisпe savete, Ьгојпе sugestije, eksperimeпtalпu pomoc, bakterije, humaпe celije, proteiпe, ili, krace гесепо, sve od sebe. Posebпu zahvalпost dugujem mom direktorskom taпdemu, Braпki Vasiljevic i Gordaпi Nikcevic, za beskrajaп priliv ljubavi i podrske, koji пeskromпo ocekujem i u godiпama koje dolaze. Od ostalih kolega u lпstitutu posebпu zahvalпost zasluzuju опi sa kojima sam imala cast i zadovoljstvo da saucestvujem i saradujem u razпim пеоЬiспim , zaпimljivim i cesto пе bas sasvim пaucпim poduhvatima: Miloje Savic, cije је duhovпo prisustvo u lпstitutu sasvim пеоkгпјепо udaljeпoscu па kojoj se пalazi, moja З praseta za osmeh, osmeh, osmeh, Вгапkа Zukic, пajdrazi od svih pacijeпata, i moja Mileva, јеdпа u milioп. Claпovima Ьiljkaske laboratorije hvala za razdragaпe godiпe koje smo proveli zajedпo, а роsеЬпо пjihovoj sefici Vesпi Maksimovic па pazljivom praceпju i podrsci od prvog dапа u laboratoriji . Beskrajпu zahvalпost za uzorke i podatke bez kojih ove teze пе Ьi Ьilo dugujem kolegi Momcilu Ristaпovicu, koji se bavio пjihovim sakupljaпjem ро Kliпickom ceпtru , discipliпom koja zasluzuje status ekstremпog sporta. Sпezaпi Lukic hvala па uspesпoj dugogodisпjoj poslovпoj saradпji, koja је odavпo prerasla u iskreпo prijateljstvo. Natasi Petrovic i Mariпi Aпdel i 6-Jeli6 hvala sto su me u ovih deset godiпa mazile, pazile i (sa)cuvale mi zdravlje. Mojim dragim kolegiпicama i prijateljicama u rasejaпju sirom sveta, Jovaпi Baпkovic, Jeleпi Urosevic i Апi Kostic, iskreпo sam zahvalпa za prijateljstvo, pomoc i podrsku па koje sam uvek mogla da racuпam. Мојој porodici Brkljacic, Апјi, Војапu, Jelki i Luki, hvala sto su zdusпo Ьil i uz mепе, cak i kada su Ьili vап zemlje ilili vап sebe. Мојој porodici Staпkovic, Sпezaпi , Dragaпu i Dodi, hvala па bezrezervпoj ljubavi i podrsci koje пista пе moze ugroziti. Мојој porodici Strojic, Vaпesi i Alisi, hvala za kопаспu i пeosporivu potvrdu teorije da гоdЬiпа moze i treba da bude izborпa fuпkcija. Najboljem prijatelju па svetu, Jeleпi Arпautovic (АКА Oskaru) hvala па парогu koji ulaze da Ьi to i ostala, јег i pokusaji se racuпaju. Beskrajпo hvala mojim roditelj ima, Malisi i Miloradu, sto su mi omogucil i da budem bas ovakva kakva sam, па radost пekih, а па uzas пekih drugih ... ABSTRACT Pancгeatic caгcinoma is one of the most invasive and pгogгess ive human malignant neoplasms. This malignancy is chaгacteгized Ьу activation of KRAS oncogene and inactivation of р16 , р53 and SMAD4 tumoг supгessoг genes. Recent гesults show association between KRAS activation and SMAD4 inactivation in pancгeatic caгcinogenesis . The stгucture of the SMAD4 gene ргоmоtег has not been cleaгly defined and little is known about the tгanscгiption гegulatory mechanisms of this gene. This study was aimed at analyzing genetic and epigenetic changes in the 5' гegulatory гegion as potential mechanisms of SMAD4 gene inactivation in pancгeatic caгcinoma and theiг coexistance with KRAS codon 12 mutation in malignant tissues. Stгuctural analysis of SMAD4 gene ргоmоtег has shown that two mononucleotide гереаt elements, -462Т(15) and -4Т(12), аге polymoгphic in pancгeatic caгcinoma and coloгectal саnсег tissues, while functional analysis indicated that -4Т(12) element may Ье important fог tгanscгiptional гegulation. The haplotype 14/1 О was the most common haplotype in pancгeatic caгcinoma tissue, pгesent in 88% of cases. Haplotypes 10/12 and 9/12 wеге detected in 4% of coloгectal саnсег tissues each. ln majoгity of pancгeatic caгcinoma cases (98%) eitheг KRAS codon 12 mutation ог SMAD4 gene ргоmоtег haplotype 14/1 О was pгesent. These findings suggest that haplotypes 14/10, 10/12 and 9/12 in the SMAD4 gene ргоmоtег гepгesent genetic maгkeгs that might Ье associated with specific malignancy and potentially exploited fог diagnostics and monitoгing of disease, alone ог in comЬination with KRAS codon 12 mutation testing. ABSTRACT Pancгeatic caгcinoma is one of the most invasive and pгogгessive human malignant neoplasms. This malignancy is chaгacteгized Ьу activation of KRAS oncogene and inactivation of р16 , р53 and SMAD4 tumoг supгessoг genes. Recent гesults show association between KRAS activation and SMAD4 inactivation in pancгeatic caгcinogenesis. The stгuctuгe of the SMAD4 gene ргоmоtег has not been cleaгly defined and little is known about the tгanscгiption гegulatory mechanisms of this gene. This study was aimed at analyzing genetic and epigenetic changes in the 5' гegulatory гegion as potential mechanisms of SMAD4 gene inactivation in pancгeatic caгcinoma and theiг coexistance with KRAS codon 12 mutation in malignant tissues. Stгuctuгal analysis of SMAD4 gene promoteг has shown that two mononucleotide гереаt elements, -462Т(15) and -4Т(12), аге polymoгphic in pancгeatic caгcinoma and coloгectal саnсег tissues, while functional analysis indicated that -4Т(12) element may Ье important fог tгanscгiptional гegulation . The haplotype 14/1 О was the most common haplotype in pancгeatic caгcinoma tissue, pгesent in 88% of cases. Haplotypes 10/12 and 9/12 wеге detected in 4% of coloгectal саnсег tissues each. ln majoгity of pancгeatic caгcinoma cases (98%) eitheг KRAS codon 12 mutation ог SMAD4 gene ргоmоtег haplotype 14/1 О was pгesent. These findings suggest that haplotypes 14/1 О, 10/12 and 9/12 in the SMAD4 gene promoteг гepгesent genetic maгkeгs that might Ье associated with specific malignancy and potentially exploited fог diagnostics and monitoгing of disease, alone ог in comЬination with KRAS codon 12 mutation testing. ABSTRAKT Karcjnom pankreasa spada u najjnvazjvnjje najprogresjvnjje humane maljgne bolestj. Genetske promene karakterjstjcne za ovu bolest su aktjvacjja onkogena KRAS ј jnaktjvacjja tumor supresor gena р16 , р53 ј SMAD4. Novjja jstrazjvanja ukazuju па povezanost aktjvacjje onkogena KRAS ј jnaktjvacjje tumor supresor gena SMAD4 u pankreasnoj kaгcjnogenezj. Struktura promotora gena SMAD4 nedovoljno је proucena ј malo se zna о mehanjzmjma regulacjje transkгjpcjje ovog gena. Ova studjja је jmala za cjlj da jstrazj genetske ј epjgenetske promene u 5' regulatornom regjonu gena SMAD4 kao potencjjalne mehanjzme njegove jnaktjvacjje u karcjnomu pankreasa, kao ј njjhovu udruzenost sa prjsustvom mutacjje u kodonu 12 gena KRAS u maljgnom tkjvu. Strukturna analjza promotora gena SMAD4 је pokazala da su dva mononukleotjdna ponovka, -462Т(15) and -4Т(12), poljmorfna u karcjnomu pankreasa ј kolorektalnom kanceru , dok је funkcjonalna analjza pokazala da broj tjmjna u elementu -4Т(12) moze Ьitj od znacaja za regulacjju transkrjpcjje. Haplotjp 14/1 О је Ьiо najcescj haplotjp u tkjvu kaгcjnoma pankreasa, pгjsutan u 88% slucajeva. Haplotjpovj 10/12 ј 9/12 su otkrjvenj u ро 4% slucajeva u tkjvu kolorektalnog kancera. U najvecem broju tkjva kaгcjnoma pankreasa (98%) Ьila је pгjsutna jlj mutacjja u kodonu 12 gena KRAS ilj haplotjp 14/1 О u promotoru gena SMAD4. Rezultatj ovog jstrazjvanja ukazuju da haplotjpovj 14/1 О, 10/12 ј 9/12 u promotoru gena SMAD4 predstavljaju genetjcke markere kojj mogu Ьitj povezanj sa specjfjcnom maljgnom bolescu, а njjhova analjza potencjjalno jskorjscena za djjagnostjkovanje ј pracenje bolestj , pojedjnacno jlj u komblnacjjj sa anal jzom mutacjje u kodonu 12 gena KRAS. SADRZAJ 1. UVOD 1 1. 1. KARCINOM PANKREASA 1 1. 1. 1. Pankreas 1 1. 1. 2. Epidemiologija karcinoma pankreasa з 1. 1. з. Biologija karcinoma pankreasa 4 1. 1. 4. Molekularna genetika karcinoma pankreasa 6 1. 2. SMAD4 10 1. 2. 1. Gen SMAD4 10 1. 2. 2. Struktura proteina SMAD4 10 1. 2. з. Funkcija proteina SMAD4 12 1. 2. 4. Regulacija ekspresije gena SMAD4 15 1. 2. 5. Fizioloska uloga proteina SMAD4 16 1. 2. 6. lnaktivacija gena SMAD4 u patofizioloskim stanjima 17 1. 2. 7. Mehanizmi inaktivacije gena SMAD4 u karcinomu pankreasa 18 1. з. CILJ RADA 20 2. MATERIJAL 1 METODE 22 2. 1. ISPIТANICI 22 2. 2. MATERIJAL 27 2. 2. 1. Uzorci tkiva karcinoma pankreasa 27 2. 2. 2. Uzorci periferne krvi 27 2. 2. з. Uzorci DNK 27 2. 2. 4. Vektori 28 2. 2. 5. Bakterijski sojevi 28 2. 2. 6. Celijske linije 29 2. 2. 7. Oligonukleotidi 29 2. з. METODE з о 2. з. 1. Deparafinizacija kalupa tkiva pankreasa з о 2. з. 2. lzolacija DNK iz tkiva pankreasa з о 2. з. з . Jzolacija DNK iz periferne krvi З1 2. з. 4. Elektroforeza DNK u gelu od agaroze З1 2. з. 5. Amplifikacija genoma З2 2. з. 6. Reakcija lancanog umnozavanja DNK (PCR) З2 2. з. 7. Digestija DNK restrikcionim enzimima З4 2. з. 8. Elektroforeza DNK u gelu od poliakrilamida З4 2. з. 9. Bojenje DNK u gelu od poliakrilamida srebro-nitratom З5 2. з. 10. Kapilarna elektroforeza DNK З5 2. з. 11. Preciscavanje DNK fragmenata З6 2. з. 12. Sekvenciranje DNK З7 2. з. 1З. Ligacija З8 2. з. 14. Kultivacija bakterija З9 2. з. 15. Priprema kompetentnih celija za transformaciju toplotnim З9 sokom 2. з. 16. Transformacija bakterija toplotnim sokom З9 2. з . 17. lzolacija plazmidne DNK 40 2. з. 18. Preciscavanje DNK fragmenata iz gela od agaroze 40 2. з. 19. Priprema plazmidne DNK za transfekciju celija u kulturi 41 2. з. 20. Kultivacija humanih celijskih linija 42 2. з . 21. Transfekcija humanih celijskih linija 42 2. з. 22. Priprema celijskih ekstrakata 4З 2. з. 2З. Luciferazni esej 4З 2. з. 24. lzolacija jedarnih proteina 44 2. з. 25. Dezoksiribonukleazni esej 45 2. з. 26. Statisticka analiza 45 з. REZULTATI 46 з. 1. lzolacija DNK iz tkiva pankreasa i periferne krvi 46 з. 2. Analiza mutacije u kodonu 12 gena KRAS 47 з. з. Analiza gena SMAD4 49 з. з. 1. Analiza metilacije u nekodirajucem egzonu 1 gena SMAD4 50 з . з. 2. Analiza strukture promotora gena SMAD4 51 з. з . з. Analiza polimorfizama -462Т(15) i -4Т(12) u promotoru gena 52 SMAD4 з. з. 4. Analiza haplotipova varijanti -462Т(15) i -4Т(12) u promotoru 59 gena SMAD4 з. з. 5. Analiza aktivnosti varijanti promotora gena SMAD4 62 з. з. 6. Analiza vezivanja proteina za varijante promotora gena SMAD4 6З з. 4. Korelacija karakteristika ispitanika i promena u genima SMAD4 i 65 KRAS з. 5. Rezultati analize gena SMAD4 i KRAS u grupama ispitanika 68 4. DISKUSIJA 72 4. 1. Analiza DNK iz tumorskog tkiva pankreasa 7З 4. 2. Analiza mutacije u kodonu 12 gena KRAS u karcinomu 75 pankreasa 4. з. Analiza metilacionog statusa promotora gena SMAD4 77 4. 4. Strukturna i funkcionalna analiza promotora gena SMAD4 78 4. 5. Funkcionalni znacaj mononukleotidnih ponovaka u promotoru 8З gena SMAD4 4. 6. Mononukleotidni ponovci u promotoru gena SMAD4 kao 88 potencijalni molekularni markeri u karcinomu pankreasa 5. ZAKLJUCCI 9З 6. LITERATURA 95 1. UVOD 1. 1. Karcinom pankreasa 1. 1. 1. Pankreas Paпkreas је orgaп digestivпog sistema smesteп u abdomeпu posteriorпo u odпosu па zeludac i povezaп је sa duodeпumom (slika 1А). Morfoloski se moze podeliti u tri regioпa: glavu, telo i rep. Prema fuпkciji koju vrsi tkivo paпkreasa se deli па egzokriпi i eпdokriпi paпkreas (1 ). Egzokriпi paпkreas ima ulogu u procesu vагепја. Njega сiпе aciпusi , grupacije celija ciji se izvodпi kaпalici spajaju u zajedпicki izvodпi kaпal, а koji se uliva u duodeпum (slika 1 В). Асiпагпе celije сiпе veci deo paпkreasпog tkiva i proizvode zimogeпe, пeaktivпe forme paпkreasпih eпzima, koji se izlucuju u izvodпe kaпalice . Epitelпe celije kaпalica alkalizuju eпzimsku mesaviпu dodavaпjem mukusa, vode i Ьikarboпata i tako se formira paпkreasпi sok koji se izlucuje u duodeпum. U iпtestiпalпom sistemu eпteropeptidaza prevodi zimogeпe u aktivпe eпzime odsecaпjem aktivacioпog peptida. Eпdokriпi paпkreas vrsi regulaciju metabolizma glukoze luceпjem hormoпa u krvotok. Eпdokriпo tkivo paпkreasa сiпе cetiri specijalizovaпa tipa celija (а, Ь , d i РР) koje su orgaпizovaпe u kompaktпa Laпgerhaпsova ostrvca okruzeпa aciпarпim egzokriпim tkivom (slika 1 В). Eпdokriпe celije paпkreasa se medusobпo пе razlikuju morfoloski, vec su klasifikovaпe ро tipu hormoпa koje luce: tip а - glukagoп, tip Ь - iпsuliп , tip d - somatostatiп, tip РР - paпkreasпi pol ipeptid. Celije tipa а i Ь regulisu metabolizam glukoze, а celije tipa РР i d moduliraju sekretorпa svojstva drugih tipova paпkreasпih celija. А POPREl.'Nr PRE ... ЕК РА~ .KR:EASA GLЛVA Slika 1. Pankreas А - polozaj pankreasa u organizmu В - grada pankreasnog tkiva 2 Poremecaji funkcije pankreasa mogu Ьiti uzrokovani promenama u egzokrinom il i endokrinom tkivu , ali se cesto javljaju udruzeno. Poremecaj Ьi lo egzokrinog, Ьilo endokrinog tkiva pankreasa znacajno povecava rizik za ostecenje drugog tipa pankreasnog tkiva. Najcesce bolesti pankreasa su diabetes mellitus, pankreatitis i karcinom pankreasa. Diabetes mellitus predstavlja poremecaj endokrine funkcije pankreasa. Postoje dva tipa ove bolesti : tip 1 koji podrazumeva nemogucnost proizvodnje insulina i tip 2 koji podrazumeva rezistenciju na insulin. Pankreatitis predstavlja inflamaciju egzokrinog pankreasa, koja moze Ьiti akutna ili hronicna. Karcinom pankreasa је maligni tumor koji nastaje od egzokrinih pankreasnih celija. 1. 1. 2. Epidemiologija karcinoma pankreasa Karcinom pankreasa (duktalni adenokarcinom pankreasa, adenokarcinom pankreasa, kancer pankreasa) је najcesca pankreasna neoplazma i cini priЫizno 80% svih maligniteta pankreasa (2) . Ovu bolest karakterisu izrazita progresivnost i invazivnost, а rezistentna је na vecinu dostupnih terapija. Ucestalost karcinoma pankreasa iznosi 3-9 па 100000 osoba godisnje, pri cemu је ucestalost niza u razvijenim, а visa u nerazvijenim zemljama (3). Karcinom pankreasa је trinaesti kancer ро ucestalosti i osmi vodeci uzrok smrtnosti od kancera u svetu, а ucestalost ove bolesti i njom uzrokovan mortalitet su skoro istovetni. Petogodisnja stopa prezivljavanja nakon postavljanja dijagnoze iznosi samo 3%, а prosecno prezivljavanje је manje od 6 meseci (2) . Usled nespecificnih simptoma i ogranicenja dostupnih dijagnostickih metoda bolest se retko dijagnostikuje u pocetnim stadijumima i metastaze su oblcno prisutne vec pri inicijalnoj dijagnozi. Operativno uklanjanje tumora је indikovano kod svega 15- 20% pacijenata, pri cemu su samo tumori glave pankreasa resektabllni , а petogodisnja stopa prezivljavanja nakon ove intervencije iznosi samo 20% (2). Hemioterapija ima slab efekat usled snazne otpornosti ovog kancera na postojece terapijske protokole. Primenom dostupnih terapijskih protokola za з karcinom pankreasa kod vecine pacijenata se postize samo olaksavanje simptoma bolesti. Etiologija karcinoma pankreasa је nedovoljno poznata. U faktore koj i mogu da moduliraju rizik za pojavu ove bolesti spadaju godine starosti, pol, pusenje, nepravilna ishrana, dugotrajno izlaganje izvesnim karcinogenima, hronicni pankreatitis, diabetes i nasledni pankreatitis (4, 5) . Glavni epidemioloski faktor koji utice па nastanak i razvoj karcinoma pankreasa su godine starosti. Bolest se retko javlja pre 40. godine, а sa stareпjem se povecava i rizik, koji kulmiпira oko 80. godiпe, kada је 40 puta роvесап. Bolest se пesto cesce javlja kod muskaraca пеgо kod zепа. Puseпje је povezaпo sa dvostrukim povecaпjem rizika za пastaпak karciпoma paпkreasa, usled prisustva karcinogeпih supstaпci u duvaпskom dimu. lshraпa bogata mastima povecava rizik za пastaпak karciпoma paпkreasa, dok ga ishraпa koja se uglavпom sastoji od povrca i voca smaпjuje. Pretpostavlja se da iпteпzivпo dugogodisпje koпzumiraпje alkohola takode predstavlja faktor rizika. Dugotrajпo izlagaпje karciпogeпim supstaпcama u okviru profesije se smatra odgovorпim za mапје od 5% slucajeva karcinoma paпkreasa. Kod osoba obolelih od hroпicпog paпkreatitisa rizik је роvесап za 30- 40%, kod diabetesa tipa 2 dva puta, а kod hereditarпog oЫika hroпicпog paпkreatitisa, koji је uzrokovan mutacijama u geпu za katjoпski tripsiпogeп, cak 50 puta (2). Smatra se da је 3-10% slucajeva karciпoma paпkreasa posledica пasledпe predispozicije. 1. 1. З. Biologija karcinoma pankreasa Celije karciпoma paпkreasa su teпotipski slicпe duktalпim celijama i duktalпog su porekla, ali пiје pozпato od kog tipa celija nastaje ovaj maligпitet. Pretpostavlja se da karciпom pankreasa moze пastati od paпkreasпih stem celija ili traпsdifereпciraпih egzokriпih ili eпdokriпih celija (4). Najпoviji podaci ukazuju па mogucпost da karciпom paпkreasa nastaje od paпkreasпih stelatпih celija, subpopulacije celija пormalпog paпkreasпog tkiva sa karakteristikama fibroЬiasta (6). Kod ovih celija su u eksperimeпtalпim modelima kao odgovor па osteceпje 4 pankreasnog tkiva zapazene proliferacija, migracija na mesta ostecenja, kontraktilnost, fagocitoza i sinteza komponenti ekstracelijskog matriksa, ра је verovatno da ove celije u aktiviranom stanju mogu imati Ьitnu ulogu u fibrozi kod hronicnog pankreatitisa i karcinoma pankreasa. Kroz brojne histopatoloske i klinicke studije pankreasnih neoplazmi identifikovana је serija karakteristicnih lezija u pankreasnom tkivu koje imaju potencijal da dovedu do invazivnog maligniteta (7, 8). Ovi patoloski stadijumi se nazivaju pankreasna intraepitelijalna neoplazma (PaniN, pancreatic intraepithelial neoplasm), mucinozna cisticna neoplazma (MCN, mucinous cystic neoplasm) i intraduktalna papilarna mucinozna neoplazma (IPMN, intraductal papillary mucinous neoplasm) (slika 2). OUKTALNI ADENOKARCINOM PANKREASA Slika 2. Stadijumi razvoja duktalnog adenokarcinoma pankreasa PaniN-1, 2, З- stadijumi pankreasne intraepitelijalne neoplazme MCN - stadijum mucinozne cisticne neoplazme IPMN- stadijum intraduktalne papilarne mucinozne neoplazme Najbolje proucen i najcesci tip prekursornih lezija u karcinomu pankreasa su PaniN stadijumi, koji se odlikuju nizom morfoloskih razlika u odnosu na 5 normalno tkjvo. Okarakterjsana su tгј PaniN stadjjuma, prj cemu se PaniN 1 odljkuje pojavom mucjnoznog epjtela, dok kroz stadjjume PaniN 11 ј PaniN 111 dolazj do sve jntenzjvnjje celjjske ј jedarne dezorganizacjje. Tkjvo u visjm PaniN stadjjumima moze da se transformise u invazjvni karcinom pankreasa. Pretpostavlja se da se proces maljgne transformacije tkiva u stadijumjma MCN i IPMN odvjja na slican nacjn kao ј u PaniN lezjjama. 1. 1. 4. Molekularna genetika karcinoma pankreasa Progresjja premalignjh lezija u invazivnj pankreasni adenokarcinom objasnjava se povecanjem broja genetskjh ostecenja sa progresjjom PaniN stadijuma (9, 1 О). Najcesci poremecajj genomske DNK u kaгcjnomu pankreasa su hromozoms~e аЬегасјје, aktivacjja onkogena, jnaktivacjja tumor supresor gena, epigenetsko utisavanje, poremecajj duzjne telomera mutacije mjtohondrijalne DNK. U najvecem broju slucajeva karcjnoma pankreasa dolazj do aktivacije KRAS onkogena i jnaktivacije tumor supresor gena р16, р53 ј SMAD4 (9, 1 0). Najcesce hromozomske aberacije u kaгcjnomu pankreasa su gublci hromozoma 9, 17 i 18, na kojjma se nalaze upravo tumor supresor geni р16, р53 ј SMAD4. Navedene genetske promene se zbog vjsoke ucestalostj u karcjnomu pankreasa smatraju molekularnjm markerjma pankreasne karcinogeneze, dok su sve ostale genetske promene relatjvno retke jli sporadicne (tabela 1) (1 О, 11 ). т ь 1 1 uv t 1 t k"h а еа ces а ost gene s 1 promena u k k arc~nomu pan reasa GEN UCESTALOST MUTACIJA (%) р16 (cyclin-dependent kinase inhiЬitor 2А (melanoma, inhiЬits CDK4)) 80-95 р53 (ТР53, tumor protein р53) 50-75 SMAD4 (SMAD family member 4) 55 KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 75-90 BRAF (V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog 81) 5-10 hMLH1 (mutl homolog 1, colon cancer, nonpolyposis type 2 (Е. coli)) 4 hMSH2 (mutS homolщ:j 2, colon cancer, nonpolyposis type 1 (Е. coli)) BRCA2 (breast cancer 2, early onset}_ 7-10 6 Vaznu ulogu u karcjnogenezj pankreasa moze jmatj ј poremecena ekspresjja maljh RNK, koje ucestvuju u regulacjj j ekspresjje drugjh gena na njvou translacjje. Na njjhov potencjjalnj znacaj ukazuje podatak da је preko 50% gena za male RNK lokalizovano u regjonjma za koje se zna da su genetskj nestaЬilnj ј da su cesto pogoden j rearanzmanjma u kanceru (12). U karcjnomu pankreasa od gena za male RNK najcesce је prekomerno eksprjmjran gen za mjR-221 , а poznato је da ova ј druge male RNK mogu da utjcu na ekspresjju gena KRAS ј р53 . Tjpjcan profjl mutacjja u karcjnomu pankreasa obuhvata mutacjje u genjma za KRAS, р53 ј р16, dok se jnaktjvacjja gena SMAD4 najcesce javlja u komЬinacjjj sa sve trj prethodno navedene mutacjje (1 3). Оо pomenutjh genetskjh promena u karcjnomu pankreasa najcesce dolazj odredenjm redosledom, prj cemu se aktjvacjja KRAS onkogena ј jnaktjvacjja р16 tumor supresor gena mogu· smatratj ranjm , а jnaktjvacjja tumor supresor gena za р53 ј SMAD4 kasnjm dogadajjma u pankreasnoj karcjnogenezj (sljka З). 'NORMAl:NO PANRЁASNO TKIVO Pa;nJN-1 PaniN·2 Pa.niN-3 ADENOКARCINOM PANKREASA к~ -----------------------------------------------------р16 ----------------------------------------- - AKTIVACIJA р53 ------------------------------- - •JNAKTIVACUA SМAD~ -------------------- Sljka З . Hronologjja molekularnjh dogadaja u karcjnomu pankreasa Onkogen KRAS se akt jvjгa u skoro svjm slucajevjma karcjnoma pankreasa ј mutacjje u geпu KRAS predstavljaju пајсеsсј geпetskj poremecaj u ovoj bolestj . Mutacjje koje aktjvjraju опkоgеп KRAS javljaju se u 75-90% slucajeva karcjnoma paпkreasa ј пајсеsсе pogadaju kodoп 12, а u maпjem broju slucajeva kodoпe 1 З ј 61 gепа KRAS. Gеп KRAS kodjra membraпskj GTP- vezujucj protejп koj j ucestvuje u sjgпalпoj transdukcjjj posredovaпoj faktorjma rasta. Mutacjje dovode do pojave koпstjtutjvпo aktjvпe forme ргоtејпа , koja se регmапепtпо пalazj u GTP-vezaпom staпju, ј tjme do koпstjtutjvпe aktjvacjje j пtraceljjske sjgпalпe traпsdukcjje. Mutacjje koje dovode do aktjvjгacjje опkоgепа KRAS predstavljaju јеdап od пајгапјјјh molekulaгnjh dogadaja u Ьепјgпјm ј гапјm maljgпjm lezjjama u paпkreasпom tkjvu . Prjsutпe su u ргјЬiјzпо 30% PaпiN 1 lezjja (1 0). Tumor supresor р16 је jпaktjvjraп u 80-95% slucajeva karcjпoma paпkreasa. Cjkljп-zavjsпa kjпaza р16 (CDKN2A/INK4A) ucestvuje' u regulacjjj celjjskog cjklusa ј пајсеsсе је jпaktjvjraп tumor supresor u kaгcjпomu paпkreasa . Ovaj protejп jпteraguje sa CDK4/CDK6 kompleksom, cjme sprecava formjraпje aktjvпog cjkljп D-CDK4/CDK6 kompleksa ј tjme sprecava ulazak u S-fazu celjjskog cjklusa. Do gubltka fuпkcjje protejпa р16 moze docj zbog homozjgotпe delecjje gепа (oko 40% slucajeva), gubltka heterozjgotпostj praceпog mutacjjom па preostalom alelu (oko 40% slucajeva) jlj epjgeпetskjm utjsavaпjem usled hjpermetjlacjje promotora (oko 10-15% slucajeva). Gubltak пuklearnog ргоtејпа р 16 uocen је kod 30% PaniN 1, 55% PaпiN 11 ј 70% PaпiN llllezjja (10). Tumor supresor р53 је jпaktjvjraп u 50-75% slucajeva karcjnoma paпkreasa. Protejп р53 је traпskrjpcjoпj faktor kojj reguljse celjjskj cjklus kroz regulacjju traпskrjpcjje u smeru zaustavljaпja celjjskog cjklusa jlj apoptoze kao odgovor па osteceпja DNK. Do gubltka fuпkcjje ргоtејпа р53 skoro jskljucjvo dolazj usled gubltka heterozjgotпostj praceпog mutacjjom па preostalom alelu. lnaktjvacjju gепа р53 пајсеsсе uzrokuje mutacjja u egzoпjma 5-8 kojj kodjгaju DNK-vezjvпj domeп ovog protejпa . Akumulacjja mutjгanog protejпa р53 u jedru uосепа је u PaпiN 111 lezjjama, ра se gubltak funkcjje р53 smatra kasпjm dogadajem u patogeпezj karcjпoma paпkreasa (1 0). 8 Tumor supresor SMAD4 se jпaktjvjra vjsoko specjficпo u karcjпomu paпkreasa, ра se пjegova jпaktjvacjja smatra geпetskjm dogadajem kojj је karakterjstjcaп za ovu bolest. Na osпovu dosadasпjjh jstrazjvaпja ргосепјепо је da је gеп SMAD4 jпaktjvjraп u 55% slucajeva kагсјпоmа paпkreasa , ргј cemu se u 30% slucajeva radj о homozjgotпoj delecjjj , а u 25% slucajeva о guЬitku heterozjgotпostj praceпom mutacjjom па preostalom alelu. lпaktjvacjja gепа SMAD4 је verovatпo u vесјпј maljgпjteta kasпj molekularпj dogadaj , sto је, osjm za karcjпom paпkreasa, pokazaпo ј za kolorektalпj kапсег (14). GuЬitak fuпkcjje ргоtејпа SMAD4 se desava relatjvпo kasпo tokom patogeпeze karcjпoma paпkreasa ј uосеп је ј u пekjm tjpovjma пemaljgпjh lezjja u paпkreasu (15, 16, 17). Расјјепtј kod kojjh је potvrdeпa ekspresjja SMAD4 u paпkreasпom tkjvu jmaju vjsu stopu prezjvljavaпja od опјh kod kojjh је gеп SMAD4 jпaktjvjraп (18, 19). lпaktjvacjja tumor supresor gепа SMAD4 u komЬiпacjjj sa aktjvacjjom опkоgепа KRAS karakterjstjcпa је za vecjпu slucajeva kагсјпоmа paпkreasa. Selektjvпa delecjja gепа SMAD4 u epjtelu paпkreasa пеmа zпасајап efekat па razvjce jlj fjzjologjju paпkreasa. Medutjm, ekspeгjmeпtj па mjsevjma su pokazalj da defjcjjeпcjja SMAD4 omogucava brzu progresjju пeoplazmj u kojjma је vec prjsutпa јеdпа od пekoliko razljcjtjh mutacjja otkrjveпjh u geпu KRAS, G12D (20, 21) . Dok samo prjsustvo mutacjje KRAS G12D dovodj do пastaпka premaljgпe PaпiN lezjje, koja lagaпom progresjjom dovodj do аdепоkагсјпоmа, komЬiпacjja mutacjje KRAS G12D ј defjcjjeпcjje SMAD4 dovodj do brzog razvoja tumora пaljk IPMN lezjjj, koja predstavlja prekursor аdепоkагсјпоmа . Ргоtејп SMAD4 kao tumor supresor karcjпoma paпkreasa Ыokjra progresjju пeoplazmj koje su jпdukovaпe KRAS G12D mutacjjom, ра gubltak ргоtејпа SMAD4 u tkjvu koje је vec pogodeпo mutacjjom KRAS G12D dovodj do progresjje bolestj. КоmЬiпоvапј efekat aktjvacjje опkоgепа KRAS ј jпaktjvacjje tumor supresor gепа SMAD4 zapazeп је ј u MCN lezjjama (22). Nj jhovo komЬiпovaпo prjsustvo је uосепо ј u tkjvu paпkreasa zahvaceпom hгопјспјm paпkreatjtjsom , kojj cesto predstavlja osпovu za razvoj karcjпoma paпkreasa (23). 9 1. 2. SMAD4 1. 2. 1. Gen SMAD4 Gеп SMAD4 је otkriveп 1996. godiпe , kao geпski lokus koji је de letiraп u tkivu karciпoma paпkreasa , zbog cega је izvorпo оzпасеп kao gеп DPC4 (homozygously deleted iп paпcreatic carciпoma, locus 4) (24). Aпaliza tkiva karciпoma paпkreasa је pokazala da u oko 90% slucajeva dolazi do homozigotпe delecije regioпa q21.1 па hromozomu 18, u kome је potom mapiraп gеп veliciпe 54803Ьр, koji se sastoji od 11 egzoпa (25, 26). Utvrdeпo је da је gеп DPC4 strukturпi homolog gепа Mad Drosophi/a melanogaster i gепа sma-2 , sma-3 i sma-4 Caenorhabditis e/egans (27, 28) . Geпi Mad i sma u пavedeпim orgaпizmima predstavljaju vazпe ucesпike sigпalпog puta koji је пalik humaпom sigпalпom putu familije TGF-13 (traпsformiпg growth factor-13), па osпovu cega је pretpostavljeпo, а kasпije i potvrdeпo, da i gеп DPC4 vrsi slicпu fuпkciju (29). Na osпovu strukturпe i fuпkcioпalпe homologije predlozeпa је vazeca пomeпklatura, ра kojoj је svim pripadпicima ove familije gепа dat пaziv SMAD, пastao spajaпjem пaziva gепа sma i Mad, раје gеп DPC4 preimeпovaп u SMAD4 (30). Ozпaka ovog gепа ро vazecoj пomeпklaturi (SMAD4) u upotrebl је tek od пеdаvпо, zbog cega пjegovo obelezavaпje u literaturi jos uvek пiје uпiformпo . 1. 2. 2. Struktura proteina SMAD4 Proteiп SMAD4 pripada familiji SMAD proteiпa , iпtracelu l arпih proteiпa visoko koпzerviraпe strukture koj i ucestvuju u sigпalпim putevima familije TGF-13. Ove proteiпe kodira osam gепа u humaпom i misjem geпomu , cetiri gепа u geпomu Drosophila melanogaster i tri gепа u geпomu Caenorhabditis elegans (31 ). Od osam sisarskih SMAD proteiпa pet su supstrati za kiпaze iz familije TGF-13 receptora i оzпасепi su kao receptorom regulisaп i ili R-SMAD proteiпi. U ovu grupu SMAD proteiпa spadaju SMAD1 , SMAD2, SMAD3, SMAD5 i SMAD8. Proteiпi SMAD6 i SMAD7 su оzпасеп i kao iпhiblto rп i ili 1-SMAD proteiпi , ј е г 10 interferiraju sa interakcijom SMAD proteina i TGF-~ receptora ili sa medusobnim interakcijama SMAD proteina (32). Protein SMAD4, oznacen kao zajednicki SMAD ili Co-SMAD (common SMAD), је kljucni intermedijerni molekul u svim signalnim putevima familije TGF-~ i ostvaruje ligand-zavisnu interakciju sa svim R-SMAD proteinima (33, 34). Svi SMAD proteini su molekuli od oko 500 amino-kiselina, koje karakterisu dva visoko konzervirana globularna domena razdvojena linker regionom (slika 4). Protein SMAD4 ima visok stepen primarne strukturne homologije sa drugim SMAD proteinima, ali se znacajno razlikuje u sekundarnoj strukturi sva tri domena i njihovim funkcionalnim karakteristikama. R-Sma Smadl, Smad2, Smad3, SmadS, Smad8 BETA·HAIRPIN STRUКТURA ("UKOSNICA") HIDROFOBNI REGION Co-Smad Smad4 SIGNALZA NUKLEARNI дКТIVдCIONI EKSPORT (NES) DOMEN (SAD) BEТA·HAIRPIN STRUКТURA ("UKOSNICA" ) 1-Smad Smadб Smad7 SIGNALZA UBIKVIТINACIJU 1 Slika 4. Shematski prikaz strukture SMAD proteina Aminoterminalni МН1 (Mad-homology 1) domen proteina SMAD4 ima ulogu u interakciji sa DNK i autoinhiЬiciji, а staЬilizuje se cvrstim vezivanjem atoma cinka. Kontakt МН1 domena sa DNK se ostvaruje preko visoko konzervirane "beta-hairpin" strukture ("ukosnice"), koja se nalazi u regionu L43- R1 35. Mutacije u ovom regionu dovode do promena u afinitetu vezivanja proteina SMAD4 za DNK (35). Ljnker regjon је fleksjbllnj segment protejna SMAD4 sa vjsokjm sadrzajem amjno kjseljne proljna. Ovaj regjon sadrzj sjgnal za nukleaгnj eksport (nuclear export sjgnal, NES). Karboksjtermjnalnj МН2 (Mad-homology 2) domen је vjsoko konzervjran u svjm SMAD protejnjma. Efektorska funkcjja protejna SMAD4 је locjrana u ovom domenu, а omogucava је regjon bogat baznjm amjno-kjseljnama, kojj jnteraguje sa fosforjljsanjm regjonom R-SMAD protejna. Aktjvacjonj domen, SAD (SMAD4 actjvatjon domajn), zahvata delove ljnker regjona ј МН2 domena, а cjnj ga 47 amjno-kjseljna. Ovaj domen је kljucan za sjgnalnj odgovor protejna SMAD4, јег posreduje jnterakcjje sa aktjvatorjma ј represoгjma transkrjpcjje (34). Regjon kojj omogucava ljgand-zavjsnu aktjvacjju SAD nalazj se u МН1 domenu protejna SMAD4. 1. 2. З. Funkcija proteina SMAD4 Protejn SMAD4 је zajednjckj jntracelularnj medjjator sjgnalnjh puteva famj ljje TGF-13, kojj kod coveka obuhvataju ukupno 42 protejna (31, 36). Ovaj sjgnalnj put se aktjvjra preko famjljje cjtokjna TGF-13. Sjgnal se prenosj preko transmembranskjh receptornjh seгjn/treonjn kjnaza, а glavnj efektornj molekulj u cjtoplazmj su SMAD protejnj, kojj Ьivaju fosfoгjljsanj aktjvjгanjm TGF-13 receptorjma prenose sjgnal kroz medusobne homooljgomerne heterooljgomerne jnterakcjje (37) (sljka 5). 12 .LIGAND Sljka 5. Shematskj prjkaz molekularnjh dogadaja u sjgnalnom putu TGF-f3 TBR-1- TGF-~ receptor tipa 1 TBR-11- TGF-~ receptor tipa 11 Р - mesto fosforilacije R-SMAD- regulatorni SMAD protein Clanovj famjljje cjtokjna TGF-f3 su djmeгnj ljgandj kojj se ро aktjvacjjj sjgnalnog puta vezuju za homodjmere TGF-f3 receptora ј promovjsu stvaranje heterotetramernjh kompleksa. Kjnaza TBR-11 (TGF-f3 type 11 receptor) ро aktjvacjjj ljgandom fosforjljse molekul TBR-1 (TGF-f3 type 1 receptor), kojj jndukuje fosforjlacjju R-SMAD protejna, njjhovu translokacjju u jedro ј nastanak heterooljgomernjh kompleksa jzmedu fosfoгjljsanjh protejna R-SMAD ј SMAD4 (38, 39) (sljka 5). Protejn SMAD4 је konstjtutjvno fosforjljsan u cjtoplazmj ј njvo njegove fosforjlacjje se ne menja nakon stjmulacjje celjja sa TGF-f3 (38). Fosforjlacjja R-SMAD protejna, koj j se u neaktjvnom nefosfoгjljsanom stanju neprekjdno krecu jzmedu cjtoplazme ј jedra, dovodj do njjhove akumulacije u 13 jedru i interakcije sa proteinom SMAD4. U kompleks formiran od proteina R- SMAD i SMAD4 se potom inkorporiraju odredeni kofaktori za vezivanje za DNK, koji vrse selekciju gena za ciji се se regulatorni region kompleks vezati i regrutaciju odgovarajucih transkripcionih koaktivatora ili korepresora. Dejstvo signalnog puta TGF-~ se prekida defosforilacijom R-SMAD proteina, ali tacan mehanizam ovog procesa jos uvek nije poznat. Na opisani nacin је regulisano nekoliko stotina gena, pri cemu se oko dve trecine od ovog broja ро aktivaciji signalnog puta TGF-~ aktivira, а oko jedne trecine reprimira (36). Protein SMAD4 ima centralnu ulogu u svim signalnim putevima familije TGF-~, kao heterooligomerizacioni inetrakcioni partner svih drugih SMAD molekula. Protein SMAD4 ima ulogu i u aktivaciji transkripcije u jedru, koju ostvaruje u kompleksu sa drugim SMAD proteinima (29). Preko domena МН1 protein SMAD4 omogucava vezivanje kompleksa za DNK molekul, dok se preko domena МН2 ostvaruje aktivacija neophodna za stimulaciju transkripcije (40, 41, 42, 43, 44). Overekspresija gena SMAD4 је dovoljna da indukuje aktivaciju ekspresije gena koji dovode do zastoja u celijskom ciklusu, sto predstavlja karakteristicnu posledicu aktivacije TGF-~ signalnog puta (45, 46, 47). Nukleotidne sekvence za koje se vezuju SMAD proteini oznacene su kao SBE (SMAD Ьinding element) sekvence. Nije precizno odredeno koja mesta u genomskoj DNK prepoznaju SMAD proteini, ali se smatra da se uglavnom vezuju za sekvencu GTCTG i komplementarnu CAGAC, а cesto i za regione bogate GC parovima nukleotida (48) . Za visok afinitet i selektivnost proteina TGF-~ signalnog puta odgovorno је prisustvo mesta vezivanja za odgovarajuce kofaktore u Ыizini SBE sekvence (49). Odredene mutacije koje mapiraju u domenu МН 1 proteina SMAD4 dovode do smanjenja ili potpunog odsustva ekspresije gena koji sadrze SBE, usled narusavanja vezivanja proteina SMAD4 za DNK (50). 14 1. 2. 4. Regulacija ekspresije gena SMAD4 Bazalnj njvo ekspresjje protejna SMAD4 је utvrden u svjm tkjvjma. Sa ovog gena se prepjsuje jnformacjona RNK duzjne 8789 nukleotjda, а protejn је veljcjne 552 amjno-kjseljne (25, 26). О regulacjjj ekspresjje gena SMAD4 u ljteraturj postojj vrlo malo podataka. Promotor gena SMAD4 okarakteгjsan је 1998. godjne, alj su njegova struktura ј funkcjja jos uvek nedovoljno jzucene (51) (sljka 6). Mesto sa kog otpocjnje transkrjpcjja mapjrano је 1 32Ьр uzvodno od mesta sa kog otpocjnje translacjja, а bazalnj promotor obuhvata oko 1 ,4kb, od -1 ,2kb do +0,2kb u odnosu na mesto sa kog otpocjnje transkrjpcjja. Ovaj promotor ne sadгzj ТАТА boks ј GC ostrvca, alj sadгzj strukturu naljk ТАТА boksu (ТААААТ), koja se nalazj 32Ьр uzvodno od mesta sa kog otpocjnje transkrjpcjja. Softverska analjza promotora gena SMAD4 ukazala је da se u okvjru ovog regjona nalaze potencjjalna mesta vezjvanja za protejne АР-1, Pjt-1, F2F ј НохА-5 , kojj ucestvuju u regulacjjj 6eljjskjh sjgnalnjh puteva. Protejn АР-1 (actjvator protejn 1) је unjverzalnj transkrjpcjonj faktor kojj ucestvuje u regulacjjj djferencjjacjje, proljferacjje ј apoptoze 6eljja u odgovoru na raznovrsne 6eljjske stjmuluse (25). Protejnj Pjt-1 (pjtujtary-specjfjc posjtjve transcrjptjon factor 1) ј F2F (prolactjn receptor) su tkjvno-specjfjcnj transkгjpcjon j faktorj kojj jmaju ulogu u razvj6u endokгjnog sjstema ј sjntezj hormona (25) . Protejn НохА-5 (homeobox protejn А5) spada u grupu Нох protejna kojj jmaju vaznu ulogu u morfogenezj, segmentacjjj ј djferencjjacjjj embгjona, а za koje ј е karakterjstjcna tkjvno- ј vremenskj-specjfjcna ekspresjja u embrjonalnom razvjcu (25). U promotoru gena SMAD4 pгjsutno је vjse od deset ТМТ boksova za koje se mogu vezatj mnogj protejnj jz Нох famjljje , ра se pretpostavlja da se ј drugj protejnj osjm НохА-5 vezuju u ovom regjonu ј reguljsu ekspresjju gena SMAD4 tokom embrjonalnog razvjca. 15 . TGTGCAACCA ТСАССАТТАТ CAATTTTTAG GACTTTTTCA ТТАТААСААА ААААСАССАТ ACCCATTAGC AGTCATTCCT -1126 АР-1 САТТССССТТ CCTCCCAGGC CCTGGCAACC ACTGATTTAC ТТТСТGТСТС ТGTGGATTTG AATATTCTGT АТАТТТСАТА -1 046 TAAATCGGGA ТТАТ~ ТGTGACCTTT TGTCACTGAC ТТСТТТСАСТ TAGCATGTGT TTCCGAGGCT TATCCATGTA - 966 ~TGTT TAGTACTTTA ТТСТТТТТТА TGGTTG~TTTCGTT GTATGGAATT TTATCTATGC ATTCATCAGT - 886 TGATGGACAT TTGAGTTGTA TCCATTATGA ACAACGCTGC TATGAACATT CAТGTACAGG TTTGTGTGGA CATGGGTTTT - 806 САТТТСССТС AAGTACAAGT GTGAAGAGTA CAATTGCTGG GTCATATTTA CTCTGTTTAA CATTTTGTAT ITAAT~CCAGA -726 СТGТТТСССА AAGTACCTGT GCCATTTT~CCAGCA CCAAGGAGTG AGGGTCCAAT TTCTCGGCTT СТТСААТАСТ - 646 TATTATTGTC TTTTTGATAT АТССАТСТСА GTAGGTATGA AGTAGCAGCT CATTGTGGTT TTGATTTTCA TTTCCдlfAAтl -566 Pit-1 GT~TC GAGCATCTTT CATGTGCTTA TTGGCCATCG TCTTTGGAGA AGТGTCCTTT АААТССТТТТ GTTCATTTCT - 486 AAATTGGGGT ТТТТТТТТТТ TTTT~G GTCTCTTTTA ACAAAGGTGA GTGTTAACTG CTAGGTAGAA ТТТСАТАССА -406 GGCGATGGTA ААТТТТТСАТ AAATATTAGT AATAGACTTT TAGGTTTAAC TAGTGCTGAT ССТСАТАА~СТТТАА - 326 Pit-1 AAAAGTGCTG GTAAGATTTT CCTTTAAGGT GACCAGTAAA GCCAGTAAGA CTTGATTGAG CATGCCACTA TCGifAAтpAG - 246 AAGACCTAAC Т~ТТТ TTGGAAТGTC AAAAACAGТG АСАТТТТААТ ТАА~Т ТАТТТТТААА ААТТАТТТТТ - 166 F2F F2F НохА-5 AATGGdТAAтl ATTTTGTAAG AATTTTAAGT ААТТТТСААС TCTGAGCATC АААТТТТААТ TATGТGCATT GAATCTCTGA - 86 F2F F2F CTTAACCAGA GCAATTTCAT СТТТТСССАА GTAGTCAGAT CTACTTCGTA AAAТGTGTTC ТGATGТGTGT СТТТТТТТТТ - 6 ~ Transcription start site TATA-like Ьох ТТСТТТТТТА GGTTATCCTG AATACATGTC ТААСААТТТТ CCTTGCAACG TTAGCTGTTG TTTTTCACTG TTTCCAAAGG +75 +1 ATCAAAATTG CTTCAGAAAT TGGAGACATA TTTGATTTAA AAGGAAAAAC ТТGААСАААТ GGACAATATG ТСТАТТА .. . +155 Slika 6. Prikaz sekvence DNK promotora gena SMAD4 tf АА lj- potencijalna mesta vezivanja proteina Н ох familije АР- 1 , Pit-1 , F2F i НохА-5- potencijalna mesta vezivanja proteina +1 - mesto sa kog otpocinje transkripcija TATA-Iike Ьох- struktura nalik ТАТА boksu Nedavno је pokazano da region od 655Ьр uzvodno od prvog nekodirajuceg egzona gena SMAD4 i 16kb uzvodno od mesta sa kog otpocinje translacija takode ima promotorsku aktivnost, ali njegova uloga jos uvek nije razjasnjena (52). Ovaj region sadrzi ТАТА boks i GC ostrvca, kao i potencijalno mesto vezivanja za transkripcioni faktor SP1 . 1. 2. 5. Fizioloska uloga proteina SMAD4 Signalni putevi familije TGF-13 regulisu vazne celijske procese: deobu, diferencijaciju, migraciju, adheziju i umiranje cel ija. Као ucesnik signalnog puta 16 TGF-13 protejn SMAD4 jma veoma vaznu ulogu u razvjcu , sto је potvrdeno eksperjmentjma na mjsevjma, сјјј protejn SMAD4 jma 88% homologjje sa humanjm (53). Sjgnalj posredovanj molekulom SMAD4 su kod mjsa neophodnj za proljferacjju epjЬiasta , formacjju jajnog cjljndra ј jndukcjju mezoderma (54). Mjsevj kojj su homozjgotj za mutacjje u genu SMAD4 umjru sedmog dana embrjogeneze, dok heterozjgotnj mutantj razvjjaju gastrojntestjnalne poljpe ј tumore u peгjodu od 6 do 12 mesecj starostj (55, 56, 57). Molekulj famjljje TGF-13 su potentnj jnhjbltorj celjjske proljferacjje ј mnoge maljgne celjje jmaju smanjenu osetljjvost na jnhjblcjju rasta posredovanu ovjm molekuljma. Gubltak funkcjje protejna SMAD4 dovodj do gubltka jnhjblcjje procesa rasta ј povecanja proljferacjje celjja kroz povecanu aktjvnost TGF-13 sjgnalnog puta (58). Uloga gena SMAD4 kao tumor supresora је potvrdena u eksperjmentjma na mjsevjma (59). Da је protejn SMAD4 deo sjgnalnog puta TGF-13 ј da posreduje njjme jndukovanu jnhjblcjju rasta dokazano је ј eksperjmentjma na humanjm celijama u kulturj (60). Uvodenje protejna SMAD4 u celjjsku ljnjju humanog kaгcjnoma pankreasa, jako ne dovodj do obnavljanja senzjtjvnostj na TGF-13, suprjmjгa formjranje tumora in vivo ј utjce na angjogenezu kroz smanjenje ekspresjje vaskularnog endoteljjalnog faktora rasta ј povecenje ekspresjje trombospondjna-1 (61 ). Celije sa homozjgotnom delecjjom gena SMAD4 mogu deljmjcno da prevazjdu nedostatak protejna SMAD4 u sjgnaljzacjjj kroz jos uvek neobjasnjen mehanjzam, sto ukazuje na verovatno postojanje ј SMAD4-nezavjsnog TGF-13 sjgnalnog puta (62). 1. 2. 6. lnaktivacija gena SMAD4 u patofizioloskim stanjima lnaktjvacjja gena SMAD4 је karakteгjstjcna za karcjnom pankreasa, ргј cemu se cesce javlja u celjjskjm ljnjjama u odnosu na prjmarnj adenokarcjnom (24, 63). Mutacjje u genu SMAD4 njsu otkrjvene u slucajevjma famjljjarnog karcjnoma pankreasa, сјја se genetska osnova razljkuje u odnosu na nefamjljjaгnj oЬijk bolestj (64). 17 Famjljjarпj juveпjlпj poljposjs је оЬоlјепје koje se пasleduje autozomпo­ domjпaпtпo ј uzrokovaпo је pгjsustvom mutacjja u geпu SMAD4. Ovu bolest karakteгjsu razvoj poljpa gorпjeg ј doпjeg gastrojпtestjпalпog trakta u гапој mladostj , kao ј povjseпj rjzjk za razvoj gastгojпtestjпalпjh kапсега (65). Kod расјјепаtа oboleljh od ove bolestj mutacjje gепа SMAD4 pгjsutпe su u geгmjпatjvпjm celjjama ј uglavпom dovode do пekompletпe traпskrjpcjje ј do skracjvaпja ргоtејпа SMAD4 u karboksjtermjпalпom regjoпu , cjme је osteceпa пjegova погmаlпа fuпkcjja (66, 67, 68). Mutacjje u geпu SMAD4 se javljaju ј u drugjm maljgпjtetjma, alj u relatjvпo malom broju slucajeva (<10%) (69). Qsjm u karcjпomu paпkreasa, do jпaktjvacjje gепа SMAD4 пајсеsсе dolazj u kolorektalпom kaпceru (70, 71, 72, 73, 74, 75). Mutacjje u geпu SMAD4 su takode otkгjveпe, alj sa vrlo malom ucestaloscu, u tumorjma prostate, dojke, јајпјkа, pluca, Ьiljjarпog trakta, stjtпe zlezde, vrata ј glave (71, 76, 77, 78, 79, 80) . Otkгjveпo је da su mutacjje u geпu SMAD4 takode prjsutпe u пeoplazjjama udruzeпjm sa hroпjcпjm ulcerozпjm koljtjsom ј Kroпovom bolescu (81). U пeuroЫastomu traпskгjpt gепа SMAD4 moze da se jskraja па razljcjte пасјпе ј uосепе su dve varjjaпte kojjma пedostaju egzoпj 5 ј 6, оdпоsпо egzoпj 4-6 (82) . lпaktjvacjja gепа SMAD4 је vrlo redak dogadaj u tumorjma eпdokrjпog paпkreasa, sto ukazuje па пjjhovo razljcjto geпetjcko poreklo (83, 84, 85). 1. 2. 7. Mehanizmi inaktivacije gena SMAD4 u karcinomu pankreasa Fuпkcjja tumor supresor gепа u maljgпoj celjjj moze Ьitj poremeceпa usled geпetskjh ј epjgeпetskjh promeпa. Geпetske promeпe podrazumevaju delecjju kompletпog gепа jlj prjsustvo geпskih mutacija, dok epjgeпetske promeпe podrazumevaju promeпe пasledeпog staпja geпske ekspresjje. Тгј пајсеsса пасiпа iпaktivacije tumor supresor gепа su homozjgotпa delecija gепа jli hromozoma, gubltak jedпog gепа ili hromozoma (gubltak heterozigotnosti) ргасеп mutacijom па preostalom alelu i hipermetilacija promotora (86). 18 Homozigotna delecija је najcesci mehanizam inaktivacije tumor supresor gena SMAD4. U karcinomu pankreasa uglavnom dolazi do homozigotne delecije kompletnog hromozoma 18, а nesto rede do delecije hromozomskog regiona q21, u kome se nalazi gen SMAD4. Mutacije u genu SMAD4 su cest dogadaj u karcinomu pankreasa, а njihovo prisustvo је uoceno u razlicitim regionima gena (26, 87). Konzervirani karboksiterminalni domen proteina SMAD4 odgovoran је za vecinu ligand- specificnih efekata, ра је stoga i primarni target tumorigene inaktivacije. Karboksiterminalni domen proteina SMAD4 formira trimer kroz konzervirane meduproteinske interakcije, ра upravo u regionima koji ucestvuju u interakciji mapira velika vecina mutacija karakteristicnih za tumore, koje ometaju homooligomerizaciju in vitro i in vivo (88). Dok mutacije u karboksiterminalnom domenu direktno pogadaju efektorsku funkciju proteina SMAD4, mutacije u aminoterminalnom domenu dovode do povecanja afiniteta ovog domena za karboksiterminalni domen, cime posredno inhiЬiraju interakciju proteina SMAD4 sa drugim SMAD proteinima (89). Mehanizam inaktivacije tumor supresor gena putem hipermetilacije podrazumeva metilovanje GC ostrvaca u 5' nekodirajucem regionu, koja su u normalnom fizioloskom stanju nemetilovana (90, 91 , 92). Do aberantne metilacije moze da dode vec u najranijim stadijumima progresije tumora, sto moze dalje dovesti do guЬitka kontrole celijskog ciklusa, promena funkcije transkripcionih faktora, narusavanja normalnih celijskih interakcija, inaktivacije puteva signalne transdukcije, guЬitka signala za apoptozu genetske nestaЬilnosti. Hipermetilacija 5' regulatornog regiona gena SMAD4 do sada nije uocena u karcinomu pankreasa. 19 1. З. CILJ RADA Mehaпjzmj jпaktjvacjje gепа SMAD4 u karcjпomu paпkreasa su relatjvпo slabo prouceпj. Pozпato је da u vjse od polovjпe slucajeva karcjпoma paпkreasa dolazj do jпaktjvacjje gепа SMAD4 usled gubltka оЬе kopjje jlj delecjje јеdпе kopjje gепа ргасепе pojavom mutacjje па drugoj kopjjj, Do sada пjsu otkrjveпj drugj mehaпjzmj jпaktjvacjje gепа SMAD4 u karcjпomu paпkresa, alj su u drugjm maljgпjm bolestjma (eпdometrjjalпom kaпceru ј karcjпomu prostate) otkгjveпe geпetske ј epjgeпetske ргоmепе u 5' regulatorпom regjoпu gепа SMAD4, za koje se pretpostavlja da dovode do poremecaja пjegove ekspresjje (93, 94) . О ekspresjjj gепа SMAD4 postojj vrlo malo podataka u ljteraturj . Okarakterjsaп је promotor odgovoraп za оsпоvпј пјvо ekspresjje ovog gепа, ali rezultatj пekjh skorjjjh jstrazjvaпja ukazuju da је regulacjja пjegove ekspresjje verovatпo mпogo slozeпjja пеgо sto se do sada smatralo (51, 52). Ovaj rad је Ьiо usmereп па aпaljzu geпetskjh ј epjgeпetskjh promeпa u delovjma 5' regulatorпog геgјопа gепа SMAD4 kao poteпcjjalпjh mehaпjzama jп aktjvacjje gепа SMAD4 u karcjпomu paпkreasa . Апаlјzјгапо је ј prjsustvo mutacjje u kodoпu 12 gепа KRAS. Rad је takode obuhvatjo jzucavaпje пavedeпjh ргоmепа u kolorektalпom kaпceru, bolestj u kojoj је, uz karcjпom paпkreasa, gеп SMAD4 пајсеsсе jпaktjvjraп. Cjljevj ovog rada su sledecj: 1. Aпaljza tkjva karcjпoma paпkreasa па prjsustvo geпetskjh varjjaпtj u promotoru gепа SMAD4, u regjoпu ргјЬiјzпе veljcjпe 800Ьр kojj obuhvata okoljпu prvog kodjrajuceg egzoпa, а u okvjru kog se пalazj bazalпj promotor. 2. Aпaljza tkjva karcjпoma paпkreasa па pгjsustvo metilacjje u delu 5' regulatorпog regjoпa gепа SMAD4 prjЬijzпe veljcjпe 400Ьр kojj obuhvata prvj пekodjгajucj egzoп bogat poteпcjjalпjm mestjma metjlacjje. З. Aпaljza tkjva kolorektalпog kапсега па prjsustvo geпetskjh varjjaпtj otkrjveпjh u geпu SMAD4 u karcjпomu paпkreasa. 20 4. Funkcionalna analiza otkrivenih genetskih varijanti promotora SMAD4 i procena njihovog znacaja za molekularne mehanizme koji leze u osnovi karcinoma pankreasa i kolorektalnog kancera. 5. Analiza uticaja prisustva otkrivenih genetskih varijanti u promotoru gena SMAD4 па vezivanje jedarnih proteina za ovaj region i procena njihovog znacaja za regulaciju ekspresije gena SMAD4. 6. Analiza prisustva mutacije u kodonu 12 gena KRAS u tkivu karcinoma pankreasa u korelaciji sa prisustvom genetskih varijanti u promotoru gena SMAD4. 7. Procena primenljivosti otkrivenih genetskih varijanti kao molekularnih markera u dijagnostici i pracenju toka karcinoma pankreasa. 21 2. MATERIJAL 1 METODE 2. 1. lspitanici Ovo istrazivaпje је obuhvatilo 55 ispitaпika koji su u periodu od 2004. do 2008. godiпe па osпovu kliпicke dijagпoze karciпoma paпkreasa podvrgпuti proceduri -operativпog uklaпjaпja tumora па Prvoj hirurskoj kliпici Kliпickog сепtга SrЬije u Beogradu, а od kojih su za aпalizu uzeti uzorci odstraпjeпog paпkreasпog tkiva. lstrazivaпje је takode obuhvatilo 50 ispitaпika kod kojih је u periodu od 2002. do 2006. godiпe postavljeпa kliпicka dijagпoza karciпoma paпkreasa па Odeljeпju za gastroeпterologiju Kliпickog сепtга SrЬije u Beogradu, а od kojih su za aпalizu uzeti uzorci periferпe krvi. Kod svih ispitaпika ukljuceпih u studiju kliпicka dijagпoza karciпoma paпkreasa је postavljeпa па osпovu пalaza abdomiпalпog ultrazvuka i rezultata skeпiraпja metodom spiralпe kompjuterizovaпe tomografije. Dostupпi podaci za sve ispitaпike sa dijagпostikovaпim karciпomom paпkreasa ukljuceпe u istrazivaпje dati su u tabelama 2 i З. U ovo istrazivaпje је Ьilo ukljuceпo 50 ispitaпika koji su u periodu od 2004. do 2006. godiпe па osпovu kliпicke dijagпoze kolorektalпog kапсега podvrgпuti proceduri operativпog uklaпjaпja tumora па Prvoj hirurskoj kliпici Kliпickog сепtга SrЬije u Beogradu. Od ispitaпika sa kolorektalпim kaпcerom Ьili su dostupпi uzorci DNK izolovaпi iz tkiva kolorektalпog kапсега i periferпe krvi . Kod svih i spitaпika ukljuceпih u studiju kliпicka dijagпoza kolorektalпog kапсега је postavljeпa па osпovu aпalize Ьiopsije uzorka kolorektalпog tkiva doЬijeпog koloпoskopijom. Dostupпi podaci za sve ispitaпike sa kolorektalп im kaпcerom ukljuceпe u istrazivaпje dati su u tabeli 4. 22 Nakoп operativпog zahvata uzorci tkiva odstraпjeпog tumora aпaliziraпi su histopatoloski radi potvrde kliпicke dijagпoze. Stadijum tumora za karciпom paпkreasa i kolorektalпi kапсег је odredivaп па osпovu TNM klasifikacije maligпih tumora zasпovaпoj па kriterijumima predlozeпim od straпe udruzeпja Americaп Joiпt Committee оп Сапсег (АЈСС) (95). U okviru histopatloske TNM klasifikacije odreduju se tri parametra: stepeп u kome је tkivo zahvaceпo tumorom i пjegova veliciпa (Т1-Т4), stepeп iпfiltracije lokalпih limfпih cvorova tumorom (N1-NЗ) i metastaze tumora u udaljeпa tkiva (М1) . U tabelama su za sve pacijeпte dati parametri Т i N, dok је parametar М izostavljeп, јег se za karciпom paпkreasa i kolorektalпi kапсег пајсеsсе пе moze odrediti rutiпskom histopatoloskom aпalizom. Za sve ispitaпike su Ьili dostupпi podaci о polu i starosti па postavljaпju dijagпoze. Za ispitaпike sa karciпomom paпkreasa i kolorektalпim kaпcerom ciji su uzorci tkiva aпaliziraпi Ьili su dostupпi podaci о histopatoloskoj dijagпozi i stadijumu tumora. Za ispitaпike sa karciпomom paпkreasa ciji su uzorci periferпe krvi aпaliziraпi Ьili su dostupпi podaci о porodicпoj aпamпezi i prisutпim pozпatim faktorima rizika za karciпom paпkreasa. 23 Tabela 2. Karakteristike ispitanika sa klinickom dijagnozom karcinoma pankreasa ciji su uzorci tumorskog tkiva analizirani OZNAКA POL STAROST NA HISTOPATOLOSКA TNM STADIJUM UZORКA DIJAGNOZI DIJAGNOZA TUMORA А1 м 50 karcinom pankreasa ТЗ N1 К2 м 64 karcinom pankreasa Т2 N1 дЗ z 59 karcinom pankreasa ТЗ N1 А4 z 52 karcinom pankreasa ТЗ N1 А5 z 49 karcinom pankreasa ТЗ N1 Аб м 61 karcinom pankreasa Т4 NX А? м 44 karcinom pankreasa ТЗ NO А8 z 42 karcinom_pankreasa ТЗ N1 А9 м 5З karcinom pankreasa ТЗ NO А10 м 67 karcinom pankreasa ТЗ N1 А11 м 62 benigni tumor pankreasa - А12 м 51 karcinom pankreasa ТЗ N1 А1З z 52 karcinom pankreasa ТЗ NO А14 м 44 karcinom pankreasa ТЗ N1 А15/А16 м 70 karcinom pankreasa ТЗ N1 А17 м 51 karcinom pankreasa ТЗ N1 А18/А19 м 62 karcinom pankreasa ТЗ NO К2.0 м 51 karcinom pankreasa ТЗ N1 К2.1 м 54 karcinom pankreasa ТЗ N1 К22/К2З z 64 karcinom pankreasa ТЗ N1 К24 z 5З karcinom pankreasa ТЗ NO К2.5 z 72 karcinom pankreasa ТЗ NO К26/К27 м 69 karcinom pankreasa ТЗ N1 К28 м 62 karcinom pankreasa ТЗ N1 К2.9 м 42 hronicni pankreatitis - АЗО z 6З karcinom pankreasa Т1 NO АЗ1 z 47 karcinom pankreasa ТЗ N1 АЗ2 м 5З karcinom pankreasa ТЗ N1 АЗЗ/АЗ4 z 49 karcinom pankreasa ТЗ N2 АЗ5 м 70 karcinom pankreasa Т2 N1 АЗ6 м 54 karcinom pankreasa Т2 N1 дЗ? z 62 karcinom pankreasa ТЗ N1 АЗ8 м 61 karcinom pankreasa ТЗ N1 АЗ9 м 67 cisticna distrofija pankreasa - А40 м 49 cisticna distrofija pankreasa - А41 z 52 hronicni pankreatitis - А42 z 55 karcinom pankreasa ТЗ N1 А4З м 47 karcinom pankreasa ТЗ N1 А44 м 5З karcinom pankreasa Т4 N1 А45 z 62 karcinom pankreasa ТЗ N1 А46 z 49 karcinom pankreasa ТЗ N2 А47 м 71 karcinom pankreasa Т4 N2 А48 м 54 karcinom pankreasa ТЗ N2 А49 м 57 karcinom pankreasa Т4 N2 А50 z 69 karcinom pankreasa ТЗ N1 А51 м 65 karcinom pankreasa ТЗ N2 А52 м 45 karcinom pankreasa ТЗ N2 А5З z 52 karcinom pankreasa ТЗ N2 А54 м 5З karcinom pankreasa Т4 N2 А55 м 6З karcinom pankreasa ТЗ N1 А56 м 65 karcinom pankreasa ТЗ N1 А57 z 49 karcinom pankreasa ТЗ N1 А58 м 64 karcinom pankreasa ТЗ N1 А59 м 54 karcinom pankreasa Т4 N2 Аб О м 48 karcinom pankreasa ТЗ N2 24 Tabela З. Karakteristike ispitanika sa klinickom dijagnozom karcinoma pankreasa ciji su uzorci periferne krvi analizirani OZNAКA POL STAROST NA PORODICNA ANAMNEZA POZNATI FAКТORI RIZIКA ZA UZORКA DIJAGNOZI КARCINOM PANKREASA 1А м 54 - diabetes 2А м 75 - hronicni pankreatitis 4А м 76 - hronicni pankreatitis 5А м 63 - hronicni pankreatitis БА z 56 - hronicni pankreatitis 7А z 41 - holecistektomija ВА z 70 - - 11А z 65 - - 13А м во - holecistektomiia 14А м 56 - - 15А м 54 - - 17А z 71 - kalkuloza holeciste 18А м 66 - - 20А м 67 - - 22А м 62 - diabetes 23А z 43 - duodenalni ulkus 24А м 41 - diabetes, hronicni pankreatitis 27А z 78 - karcinom besike 30А м 74 - diabetes, holecistektomija 31А м 58 sestra karcinom iainika diabetes 32А м 61 otac karcinom jetre - 33А z 52 - - 34А м 46 - - 35А z 66 - - 36А м 52 - - 37А м 57 - - 38А м 53 otac karcinom pluca - 39А м 65 majka holecistektomija - 40А м 68 - - 41А м 62 - - 43А м 70 - - 44А z 61 - - 46А м 54 - holecistektomiia 47А z 58 - diabetes 49А м 51 - - 50А м 69 - - 51А м 77 - - 52А z 61 - - 53А м 36 - - 54А z 70 - - 55А z 71 - holecistektomiia 56А м 56 majka karcinom uterusa diabetes 57А z 68 - - 58А z 55 - diabetes 59А z 65 - diabetes 60А м 69 sestra karcinom jetre diabetes 61А м 40 - - 62А z 46 - - 63А м 77 otac karcinom besike holecistektomДa 64А z 71 - duodenalni ulkus 25 Tabela 4 . Karakteristike ispitanika sa histopatoloskom dijagnozom kolorektalnog kancera ciji su uzorci tumorskog tkiva i periferne krvi analizirani OZNAКA POL STAROST NA TNM STADIJUM UZORКA DIJAGNOZI TUMORA CRC1 м 62 Т3 NO CRC2 м 59 Т1 NO CRC3 z 57 Т1 N1 CRC4 м 63 Т3 NO CRC5 м 72 Т2 NO CRC6 м 71 Т1 NO CRC7 z 67 Т3 NO CRC8 z 52 Т1 N1 CRC9 м 69 Т1 NO CRC10 м 61 Т3 NO CRC11 м 57 Т1 N1 CRC12 z 46 Т3 NO CRC13 z 74 Т2 NO CRC14 z 59 Т3 N1 CRC15 м 57 Т2 N1 CRC16 м 80 Т3 NO CRC17 м 85 Т3 N1 CRC18 z 65 Т2 NO CRC19 z 75 Т2 N2 CRC20 z 46 73 N1 CRC21 м 66 Т2 N1 CRC22 z 58 Т2 N1 CRC23 м 62 Т1 N1 CRC24 м 65 Т3 NO CRC25 z 70 Т3 NO CRC26 м 63 Т3 N1 CRC27 м 53 Т3 NO CRC28 z 69 Т4 N1 CRC29 м 54 Т3 NO CRC30 z 77 Т4 N2 CRC31 м 51 Т3 NO CRC32 м 74 Т3 NO CRC33 м 70 Т2 NO CRC34 м 69 Т3 N3 CRC35 z 58 Т2 NO CRC36 м 82 Т3 N1 CRC37 м 61 Т3 NO CRC38 z 73 Т3 NO CRC39 м 65 Т3 N1 CRC40 м 70 Т3 NO CRC41 м 63 Т4 NO CRC42 z 60 Т4 N1 CRC43 м 76 Т2 NO CRC44 м 64 Т2 N1 CRC45 z 64 Т1 N1 CRC46 м 53 Т1 NO CRC47 м 56 Т2 N1 CRC48 м 59 Т2 N1 CRC49 м 60 Т1 NO CRC50 м 68 Т2 N1 26 2. 2. Materijal 2. 2. 1. Uzorci tkiva karcinoma pankreasa Za ovo istrazivaпje korisceп је deo uzorka tkiva karciпoma dobljeп resekcijom paпkreasa prilikom hirurske iпterveпcije . Uzorci А 1-А 11 i АЗ5-А60 su Ьili dostupпi u oЫiku parafiпskog kalupa tkiva, а uzorci А 12-АЗ4 su Ьili dostupпi kao delovi svezeg tkiva paпkreasa odstraпjeпog prilikom operacije. Uzorci dostupпi kao parafiпski kalupi tkiva se cuvaju па sоЬпој temperaturi. Svezi uzorci tkiva paпkreasa (=1 g) se паkоп resekcije potope u 1 ml fizioloskog rastvora (0,9% NaCI) i traпsportuju u laboratoriju, gde se potom ceпtrifugiraju 5min па 2000rpm, паkоп cega se supernatant odbaci, а talog zamrzne i cuva па -80°С . 2. 2. 2. Uzorci periferne krvi Uzorci periferпe krvi ispitaпika sa karciпomom paпkreasa se uzimaju sa 3,8% Na-citratom kao antikoagulaпsom i cuvaju па -20°С. 2. 2. З. Uzorci DNK Uzorci DN К izolovani iz tkiva kolorektalпog kапсега i periferne krvi i spitaпika sa kolorektalпim kaпcerom su dobljeпi od lnstituta za humaпu geпetiku Medicinskog fakulteta Uпiverziteta u Beogradu. Uzorci su Ьili dostupni u vidu vodenog rastvora DNK koпcentracija 1 00-500ng/1JL. U radu su korisceпa i dva kontrolпa uzorka DNK dobljeпa od Division of Oпcology , Uп iversity Hospital Basel . Ovi uzorci DNK izolovaпi su iz tkiva ispitanika sa kolorektalпim kaпcerom i u оЬа је prethodпo aпaliz i rano prisustvo mutacija u kodirajucem regioпu gena SMAD4. U jednom uzorku su prisutne dve mutacije u kodirajucem regionu (С931Т i G1237T), а u drugom ј е prisutпa 27 mutacija u intronu 7 koja dovodi do poremecaja obrade RNK. Uzorci su Ьili dostupni u vidu vodenog rastvora DNK koncentracije 31JQ/1JL. 2. 2. 4. Vektori U ovom radu su korisceni vektori pGEM-T Easy dva pGL4 vektora, pGL4.1 O[luc2] i pGL4. 70[hRiuc] (Promega) (Siika 7). Vektor pGEM-T Easy, velicine 3015Ьр, је prokariotski vektor sa ampicilinskom rezistencijom. Vektori pGL4 su eukariotski ekspresioni vektori sa ampicilinskom rezistencijom. Vektor pGL4.1 O[luc2], velicine 4242Ьр, sadrzi reporterski gen za luciferazu Photinus pyralis, dok vektor pGL4.70[hRiuc], velicine 3522Ьр, sadrzi reporterski gen za luciferazu Renilla reniformis. рGЕМЧЕWј Vttltr (~ ISDp) ' --!1.. ) • А · 1 ~ ~' ~ 1-1·' ( ~ t • Н•: 1 ·1 ! · ' ""'!- 1 ITI Slika 7. Shematski prikaz vektora pGEM-T Easy i pGL4 2. 2. 5. Bakterijski sojevi U ovom radu је koriscen bakterijski soj XL 1-Biue Е. coli (genotip: recA 1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 re/A1 /ас [F' proAB lacfoZ[j,M15 Tn10 (Tetr)]). 28 2. 2. 6. Celijske linije U ovom radu su koriscene sledece humane permanentne 6elijske linije: • SaOS-2, poreklom iz primarnog osteosarkoma • NTERA-2, poreklom iz pluripotentnog embrionalnog karcinoma • К562, poreklom iz hronicne mijelogene leukemije • Hela, poreklom iz epiteloidnog karcinoma cerviksa 2. 2. 7. Oligonukleotidi U ovom radu su korisceni sledeci oligonukleotidi: Р1Х Р2Н Р1 5'-GCGCGCTATACTCGAGATTTCTCGGCTTCTTCAA ТА-З' 5' -CCGCCGAA ТТ AAGCTTTGTTCAAGTTTTTCCTTTTA-3' 5' -ATTTCTCGGCTTCTTCAA Т А-3' P2f 15TF 15Tv 12TF Hm1 Hm2 KRAS12 5'-6-FAM-TGTTCAAGTTTTTCCTTTTA-3' 5' -AAGTGTCCTTTAGAATCCTT -3' 5'-VIC-CCTAAAAGTCTATTACTAAT-3' 5'-ATCTTTTCCCAAGTAGTCAG-3' 5'-CAAGTTGGCAGCAACAACAC-3' 5'-ACATGGCGCGGTTACCT -3' 5'-TCAAAGAA TGGTCCTGGACC-3' KRAS 12psm 5'-ACTGAATAT AAACTTGTGGTAGTTGGACCT -3' 29 2. З. Metode 2. З. 1. Deparafinizacija kalupa tkiva pankreasa U epruvetu od 1 ,5ml se odvoji deo parafiпskog kalupa priЫizпe zapremiпe О, 1 cm3 iseceп sterilпim skalpelom (96) . U epruvetu se zatim doda 1 ml ksilola, smesa se vorteksuje 5miп i ceпtrifugira 5miп па 1 3000rpm. Nakoп sto se superпataпt ukloпi, talog se ропоvо ispere sa 1 ml ksilola, smesa vorteksuje 5miп i ceпtrifugira 5miп па 1 3000rpm. Nakoп uklaпjaпja superпataпta deparafiпisaпo tkivo se dva puta ispira etaпolom. U svakom ispiraпju u epruvetu se doda 1 ml etaпola, smesa se vorteksuje 1 miп, ceпtrifugira 5miп па 1 3000rpm i superпataпt ukloпi. U talog se zatim doda 1 ml 70% etaпola, smesa se vorteksuje 1 miп i ceпtrifugira 5miп па 1 3000rpm. Kada se superпataпt ukloпi, preostali talog se susi 1 h па 37°С. 2. З. 2. lzolacija DNK iz tkiva pankreasa lzolacija DNK se vrsi iz 20-1 OOmg deparafiпisaпog ili svezeg tkiva paпkreasa (97). Tkivo se пајрге dva puta ispere u ро 1 ml pufera Tris-EDTA (0, 15М Tris рНВ,О, 0,07М EDTA), ceпtrifugira 2miп па 1500rpm i superпataпt ukloпi. Tkivo se zatim resuspeпduje u 1401-JL pufera Tris-EDTA, ра se u smesu doda 201-JL proteiпaze К (20mg/ml) i 401-JL 10% SDS. Smesa se zatim iпkublra 1 h-3h па 50°С, sa povremeпim vorteksovaпjem, do potpuпog razlagaпja tkiva. U 2001-JL smese se zatim doda 3001-JL feпola, smesa se promucka i ceпtrifugira 5miп па 1 3000rpm. Superпataпt se prebaci u пovu epruvetu i u пјеgа se doda 3001-JL smese feпol:hloroform:izoamilalkohol (25:24:1). Nakoп muckaпja i ceпtrifugiraпja 5miп па 1 3000rpm, superпataпt se ропоvо prebaci u пovu epruvetu i u пјеgа se doda 3001-JL smese hloroform:izoamilalkohol (24:1). Smesa se promucka, ceпtrifugira 5miп па 1 3000rpm i superпataпt ропоvо prebaci u пovu epruvetu. U superпataпt se zatim doda 51-JL 3М пatrijum-acetata i 7501-JL etaпola. Nakoп mesaпja i ceпtrifugiraпja 5miп па 1 3000rpm, superпataпt se 30 odbacj , а talog jspere sa 3001-JL 70% etanola. Nakon centгjfugjranja 5mjn na 1 ЗOOOrpm , supernatant se odbacj, а talog osusj na sobnoj temperatuгj ј potom rastvorj u 501-JL sterilne vode. 2. З. З. lzolacija DNK iz periferne krvi Za jzolacjju DNK jz ljmfocjta perjferne krvj korjstj se komercjjalnj kjt GFX Genomjc Blood DNA Purjfjcatjon Кit (Amersham Bjoscjences). lzolacjja se vгsj jz 1 001-JL perjferne venske krvj uzete sa Na-cjtratom kao antjkoagulansom, u koju se dodaje 5001-JL Extractjon Solutjon. Smesa se zatjm jnkublra 5mjn na sobnoj temperaturj, а potom nanese na prethodno sklopljeпu kolonu ј epruvetu za sakupljaпje ј ceпtгjfugjra 1 mjn na 8000rpm. Tecnost sakupljeпa u epruvetj za sakupljanje se odljva, а na koloпu se doda 5001-JL Extractjoп Solutjoп. Nakoп centrjfugjгaпja od 1 mjn па 8000rpm sakupljeпa tecnost se odbacuje. Nakoп toga se па koloпu doda 5001-JL Wash Solutjoп ј vrsj se ceпtrjfugjгaпje Зmjn na 1 ЗОООгрm. Коlопа se zatjm ргеЬасј u epruvetu od 1 ,5ml ј па nju se doda 1 001-JL sterilпe vode, prethodпo zagrejaпe na 70°С. Ovako prjpremljena kolona se jпkublra 1 mјп па sоЬпој temperaturj ј zatjm centrjfugjra 1 mjn па 8000rpm. Nakon ceпtгjfugjraпja koloпa se odbacj, а u epruvetj ostaje 1 001-JL rastvora DNK. 2. З. 4. Elektroforeza DNK u gelu od agaroze Aпaljza ргјпоsа ј kvaljteta DNK jzolovane jz tkjva pankreasa ј perjferne krvj ј analjza prjnosa plazmjdne DNK jzolovane jz bakteгjjskjh kultura vrse se pomocu elektroforeze u 1% gelu od agaroze. Provera fragmeпata DNK dobljeпjh reakcjjom lancanog umnozavaпja vгsj se elektroforezom u 2% gelu od agaroze. Za ргјргеmu gelova ј elektroforezu se koгjstj 1хТАЕ pufer (40mM Trjs, 20mM Na-acetat, 1mM Na2EDTA). Elektroforeza se vrsj ргј паропu 7-10V/cm. Vjzueljzacjja DNK se omogucava dodavanjem etjdjjum bromjda u gel (0,51-Jg/ml) ј osvetljavaпjem gela UV svetloscu. 31 2. З . 5. Amplifikacija genoma Amplifikacija genoma se vrsi pomocu komercijalnog kita GenomiPhi DNA Amplification Kit (GE Healthcare). Metoda se zasniva na koriscenju polimeraze visoke preciznosti Phi29, koja ima sposobnost uklanjanja novosintetisanih lanaca sa DNK matrice, i heksamernih oligonukleotida, koji vezivanjem za nasumicna mesta u genomu omogucavaju njegovo nespecificno umnozavanje (slika 8). Ova metoda se primenjuje za povecanje ukupne kolicine DNK u uzorcima koji је sadrze u maloj kolicini ili u tragovima (1 ng/џl) КОМ PON ENTE R EAKCIJ Е • + -._ + dNТPs ... DNK ONK I'OLIMERAZA HEKIAMERI diПPSMEIA MATRICA РН~З - - - - _ , - __..,. __..,. VEZI\IANJE HEKSAMERA РОСЕТАК POL IM ER IZACIJ Е ZA ON К MATR ICU ' NAIТ AV АК POL IM ER IZACU Е • ~ ~~ +- ...... .>--__ ........___': - ' U К LANJAN Ј Е NOV1Н LAN АСА POLIMERIZACIJA NA DN К IA MATR ICE VEZI\IANJE HEKSAMERA NСММ LANCIMAONK ZA NO\/E LANCE ON К Slika 8. Shematski prikaz reakcije amplifikacije genoma U 9џL Sample Buffer se doda 1џl rastvora DNK minimalne koncentracije 1 ng/џL. Smesa se inkuЬira Зmin na 95°С i potom ohladi na 4°С. U smesu se zatim doda 9џL Reaction Buffer i 1џl Enzyme Mix. Smesa se zatim inkuЬira 18h na 30°С, nakon cega se inkuЬira 1 Omin na 65 °С i potom cuva na 4°С. 2. з. 6. Reakcija lancanog umnozavanja DNK (PCR) Reakcija lancanog umnozavanja DNK (polymerase chain reaction - PCR) omogucava umnozavanje segmenta DNK definisanog oligonukleotidima koji su 32 komplementarni njegovim krajevima. Sastavi reakcionih smesa uslovi umnozavanja korisceni u ovom radu za pojedine fragmente dati su u tabeli 5 . а еа as av1 smesa 1 us ov1 геа CIJe ancanog umnozavanJa т ы 5 s t k .. 1 . DNK FRAGMENT ZAPREMINA 1 SASTAV REAKCIONE SMESE USLOVI UMNOZAVANJA (DUZINA) KRAS 251-JL 94°С 1 5mjn egzon 2 1Х Reactjon buffer В (Soljs BjoDyne) 94°С 1 1mjn (157Ьр) 2,5mM MgCI2 35 cjklusa 55°С 1 1mjn 0,2mM dNTP smesa пос 1 1mjn ро 5pmol oljgonukleotjda KRAS12 ј KRAS12psm пос 1 10mjn 1 U FIREPol DNA Polymerase (Solis BjoDyne) 250ng DNK SMAD4 251-JL 95°С 1 10mjn nekodjrajucj 1Х Reactjon buffer В (Soljs BjoDyne) 95°С 1 30sec egzon 1 2,5mM MgCI2 40 cjklusa 60°С 1 45sec (408Ьр) 0,2mM dNTP smesa пос 1 45sec 10% DMSO пос 1 10mjn ро 10pmol oljgonukleotjda Hm1 ј Hm2 2,5U 'FIREPol DNA Polymerase (Soljs BjoDyne) 500ng DNK SMAD4 501-JL 94°С 1 5mjn promotor 1Х GeneAmp PCR Gold Buffer (Applied Bjosystems) 94°С 1 1mjn (832Ьр) 2,5mM MgCI2 35 cjklusa 55ос 1 1mjn 0,2mM dNTP smesa пос 1 1mjn ро 1 Opmol oljgonukleotjda Р1 Х ј Р2Н пос 1 10mjn 2U AmpljTaq Gold DNA Polymerase (Appljed Bjosystems) 250ng DNK deo SMAD4 12,51-JL 94°С 1 5mjn promotora 1Х Reactjon buffer В (Soljs BjoDyne) 94°С 1 30sec (153Ьр) 2,5mM MgCI2 40 cjklusa 55ос 1 30sec obelezen bojom 0,2mM dNTP smesa пос 1 30sec VIC ро 2,5pmol oljgonukleotjda 15TF ј 15Tv пос 1 10mjn 0,5U FIREPol DNA Polymerase (Soljs BjoDyne) 100ng DNK deo SMAD4 12,51-JL 94°С 1 5mjn promotora 1Х Reactjon buffer for HotStar Taq (QIAGEN) 94°С 1 30sec (198Ьр) 2,5mM MgCI2 40 cjklusa 50°С 1 30sec obelezen bojom 0,2mM dNTP smesa пос 1 30sec 6-FAM ро 2,5pmol oljgonukleotjda 12TF ј P2f пос 1 10mjn 0,5U HotStar Taq DNA Polymerase (QIAGEN) 500ng DNK SMAD4 501-JL 94°С 1 5mjn promotor 1Х GeneAmp PCR Gold Buffer (Applied Bjosystems) 94°С 1 1mjn (800Ьр) 2,5mM MgCI2 35 cjklusa 55°С 1 1mjn obelezen bojom 0,2mM dNTP smesa пос 1 1mjn 6-FAM ро 10pmol oljgonukleot jda Р1 ј P2f пос 1 10mjn 2U AmpljTaq Gold DNA Polymerase (Appljed Bjosystems) 250ng DNK 33 2. З. 7. Digestija DNK restrikcionim enzimima Djgestjja PCR fragmeпta egzoпa 2 gепа KRAS restrjkcjoпjm eпzjmom BstNI radj detekcjje mutacjje u kodoпu 12 se vгsj u геаkсјопој smesj od 201JL koja sadrzj 15,51-JL umпozeпog fragmeпta, 21JL 10Х NE Buffer 2 (New Eпglaпd Bjolabs), 21JL BSA (1 mg/ml) ј 0,51-JL eпzjma BstNI (1 OU/IJL, New Eпglaпd Bjolabs). Reakcjoпa smesa se jпkublra preko посј па 60°С. Djgestjja geпomske DNK restгjkcjoпjm eпzjmjma Mspl ј Hpall radj detekcjje metjlacjje u promotoru gепа SMAD4 se vгsj u геаkсјопој smesj od 1 01JL koja sadrzj 500пg geпomske DNK, 11JL 1 ОХ Buffer Тапgо (Fermeпtas) ј 0,51-JL eпzjma Mspl jlj Hpall (1 OU/IJL, Fermeпtas). Reakcjoпa smesa se jпkublra preko посј па 37°С . Djgestjja plazmjda pGEM sa jпsertom promotora gепа SMAD4 ј plazmjda pGL4.10 restrjkcjoпjm eпzjmjma Hindlll ј Xhol se vгsj u геаkсјопој smesj od 201JL koja sadrzj 21Jg plazmjda, 21JL 1 ОХ NE Buffer 2 (New Eпglaпd Bjolabs), 21JL BSA (1 mg/ml), 11JL eпzjma Hindlll (1 OUIIJL, New Eпglaпd Bjolabs) ј 11JL eпzjma Xhol (1 OU/IJL, New Eпglaпd Bjolabs). Reakcjoпa smesa se jпkublra preko посј па 37°С. 2. З. 8. Elektroforeza DNK u gelu od poliakrilamida Za aпaljzu produkata djgestjje PCR fragmeпta gепа KRAS radj detekcjje mutacjje u kodoпu 12 koгjste se пedeпatuгjsucj 10% poljakгjlamjdпj gelovj (9, 7% akгjlamjd, 0,3% N,N'-metjleпblsakгjlamjd, 1 OOmM Trjs, 83mM Ьогпа kjseljпa, 1 mM EDTA рНВ , О, 1% amoпjjumpersulfat , 0,01% TEMED). Elektroforeza se vrsj u 1хТВЕ puferu (100mM Trjs, 83mM Ьогпа kjseljпa, 1mM EDTA рНВ) ргј паропu 1 OV/cm. Gelovj se ро zavrseпoj elektroforezj Ьоје srebro-пjtratom. 34 2. З . 9. Bojenje DNK u gelu od poliakrilamida srebro-nitratom Poliakrilamidni gelovi se ро zavrsenoj elektroforezi fiksiraju 20min u rastvoru 10% etanola i 0,5% sircetne kiseline (98). Gelovi se Ьоје 1 Omin u О, 1% rastvoru srebronitrata, а potom dva puta isperu destilovanom vodom radi uklanjanja viska rastvora srebronitrata. Razvijanje se vrsi 20min u rastvoru 1 ,5% natrijumhidroksida, 0,01% natrijumborhidrida i 0,048% formaldehida. Gelovi se potom drze 1 Omin u rastvoru О, 75% natrijumkarbonata radi fiksiranja doЬijenih traka. 2. З. 10. Kapilarna elektroforeza DNK Kapilarna elektroforeza DNK је znatno brza i jednostavnija za izvodenje od elektroforeze u gelu, јег se odvija pri daleko vecoj voltazi, а vizualizacija DNK је zasnovana na laserskoj detekciji fluorofora kojima је DNK obelezena (slika 9). ТGАПСАТС DEТёtcrOR. FШORESCENCIJE + Slika 9. Shematski prikaz kapilarne elektroforeze 35 Fragmeпti promotora gепа SMAD4 umпozeпi pomocu parova graп icпika 15TF i 15Tv i 12TF i P2f, kao i precisceпi fragmeпti dobljeпi паkоп digestije dezoksiriboпukleazom 1 aпaliziraju su kapilarпom elektroforezom па aparatu 3130 Geпetic Aпalyzer (Applied Biosystems). Рге elektroforeze uzorci se pripremaju mesaпjem odgovarajuce koliciпe uzorka (11-.JL-101-.JL) sa 0,21-.JL GепеSсап-500 LIZ Size Staпdard (Applied Biosystems) i 201-.JL HiDi Formamide (Applied Biosystems). Ovako pripremljeпi uzorci se deпaturisu iпkublraпjem 3miп па 95°С i potom cuvaju па ledu do папоsепја па aparat. Kapilarпa elektroforeza se vrsi u komercijalпom · polimeru РОР-7 (Applied Biosystems) u staпdardпim uslovima za G5 set fluorofora. Aпaliza dobljeпih rezultata se vrsi pomocu softvera GепеМаррег Software Versioп 4.0 (Applied Biosystems) korisceпjem staпdardпog modula za geпotipizaciju. 2. З. 11. Preёiscavanje DNK fragmenata Preciscavaпje PCR fragmeпata promotora gепа SMAD4 za sekveпciraпje i ligaciju u pGEM Т -Easy vektor, kao i produkata digestije dezoksiriboпukleazom 1 se vrsi pomocu komercijalпog kita QIAquick PCR Purificatioп Кit (Qiageп). U 401-.JL PCR produkta se doda 2001-.JL pufera РВ. Smesa se папеsе па prethodпo sklopljeпe koloпu i epruvetu za sakupljaпje i ceпtrifugira 1 miп па 1 3000rpm. Nakoп ceпtrifugiraпja tecпost iz epruvete za sakupljaпje se odliva, а па koloпu se sipa 7501-.JL pufera РЕ. Zatim se vrse dva ceпtrifugiraпja od ро 1 miп па 1 3000rpm, а паkоп svakog se ukloпi tecпost iz epruvete za sakupljaпje. Коlопа se potom prebaci па epruvetu od 1 ,5ml i па koloпu se sipa 301-.JL sterilпe vode. Nakoп iпkubacije od 5miп па sоЬпој temperaturi vrsi se ceпtrifugiraпje 1 miп па 13000rpm. Nakoп ceпtrifugiraпja koloпa se odbaci, а u epruveti ostaje 301-.JL precisceпih DNK fragmeпata. 36 2. З . 12. Sekvenciranje DNK Redosled nukleotida u PCR fragmentu promotora gena SMAD4 umnozenog pomocu granicnika Р1 Х i Р2Н, kao i fragmentima ukloniranim u vektor pGEM odreduje se metodom sekvenciranja DNK. Metoda se zasniva na sposobnosti DNK sekvenaze da sintetise komplementaran lanac DNK nastavljajuci oligonukleotidni lanac vezan za jednolancanu DNK. Reakcija sinteze komplementarnog lanca se zaustavlja ugradivanjem didezoksiribonukleotida (ddNTP) koji ne poseduje 3'-ОН grupu na molekulu dezoksiriboze neophodnu za elongaciju molekula DNK. Као produkti reakcije sekvenciranja doЬijaju se fragmenti DNK cije se duzine razlikuju za ро 1 nukleotid, а koji se zavrsavaju jednim od obelezenih dideoksinukleotida (slika 1 0). DN K MATRICA r.c· ___ ,;;о..;..;.;";...;.;;,;,;..;.;".;.о,;..;.;..;. ___ з· ~ -s: шю /IO[i] dNTP SMESA - - С!.\ • liil.c ddNTP SMESA PRODUK TI REAKCIJE 7~--------------А'!-_____ .....,..., ~;.....---- - t. -'~:,..- "_"_.....,.._ , _ .::---- т -- ~ li1:r- Slika 1 О. Shematski prikaz reakcije sekvenciranja DNK 37 Za sekveпciraпje se koristi BigDye Termiпator v3.1 Cycle Sequeпciпg Kit (Applied Biosystems). Као matrica u reakciji sekveпciraпja se koristi precisceпa dvolaпcaпa DNK dobljeпa u reakciji lапсапоg umпozavaпja ili precisceпa plazmidпa DNK. Odgovarajuca koliciпa precisceпog PCR produkta (1- 2пg/1 ООЬр) ili plazmida (150-300пg) pomesa se sa 3,2pmol jedпog od oligoпukleotida kojim је vrseпo umпozavaпje u zapremiпi od 51JL. U smesu se zatim doda 31JL BigDye Termiпator v3.1 Ready Reactioп Mix. Nakoп iпicijalпe deпaturacije fragmeпta od 1 miп па 96°С i 25 ciklusa umпozavaпja: 1 Osec па 96°С, 5sec па 50°С i 4miп па 60°С, produkti reakcije sekveпciraпja se precipitiraju рге папоsепја па aparat. U 81-1L smese u kojoj је vrseпa reakcija sekveпciraпja doda se 401JL О, 1 М Na-acetata рН5,2 rastvoreпog u etaпolu, ceпtrifugira se 1 Omiп па 1 3000rpm i ukloпi superпataпt. Talog se zatim ispere dva puta sa ро 2001JL 70% etaпola, а паkоп svakog ispiraпja smesa se ceпtrifugira 1 Omiп па 1 3000rpm i superпataпt ukloпi. Talog se susi пekoliko miпuta па sоЬпој temperaturi i рге папоsепја па aparat rastvori u 251JL Hi-Di Formamide (Applied Biosystems). Produkti reakcije sekveпciraпja se aпaliziraju kapilarпom elektroforezom па aparatu 3130 Geпetic Aпalyzer (Applied Biosystems) u komercijalпom polimeru РОР-7 Polymer (Applied Biosystems). Za aпalizu dobljeпih sekveпci se koristi Sequeпciпg Aпalysis Software v5.3.1 with КВ Basecaller v1.4 (Applied Biosystems). 2. З. 1 З. Ligacija Ligacija precisceпih fragmeпata DNK dobljeпih umпozavaпjem pomocu graпicпika Р1 Х i Р2Н sa vektorom pGEM-Т Easy se vrsi pomocu komercijalпog kita pGEM-T Easy Vector System (Promega). Reakcija ligacije ukupпe zapremiпe 1 Oj..JL sadrzi 1Х pufer za ligazu (Promega), 1 1-1L ligaze (1 OU/j..JL, Promega), 50пg liпearizovaпog pGEM-T Easy vektora (Promega) i 40пg precisceпog fragmeпta. Reakcioпa smesa se iпkublra preko посi па 4°С. Ligacija precisceпih fragmeпata dobljeпih isecaпjem iпserta iz pGEM-T Easy vektora sa vektorom pGL4.10[1uc2] vrsi se pomocu eпzima Т4 ligaze. 38 Reakcjja ljgacjje ukupпe zapremjпe 201JL sadrzj 1Х pufer za ljgazu (New Eпglaпd Bjolabs) , 10U Т4 ljgaze (New Eпglaпd Bjolabs), 50пg ljпearjzovaпog pGL4.1 O[luc2] vektora ј 40пg precjsceпog jпserta jseceпog jz vektora pGEM-T Easy. Reakcjja se odvjja preko посј па 16°С. 2. З. 14. Kultivacija bakterija Bakterjje soja XL 1-Biue Е. coli se gaje па 37°С u hraпljjvom medjjumu LB u tecпjm bakterjjskjm kulturama uz aeracjju jlj па cvrstoj podlozj (99). Теспј medjjum LB sadrzj 1% tгјрtоп, 0,5% ekstrakt kvasca ј 0,5% NaCI, а cvrstu podl~gu za gајепје bakterjja сјпе medjjum LB ј 1 ,5% agar. Pгjljkom gајепја bakteгjja па selektjvпoj podlozj u cvrstu podlogu ј medjjum LB se dodaje odgovarajucj aпtjЬiotjk. 2. З. 15. Priprema kompetentnih celija za transformaciju toplotnim sokom Kompeteпtпe celjje za traпsformacjju toplotпjm sokom se ргјргеmајu jz 400ml tеспе kulture bakterjja u logarjtamskoj fazj rasta (1 ОО). Ро 200ml tеспе kulture se ceпtrjfugjra 1 Оmјп па ЗОООгрm ј 4°С. Superпataпtj se odbace, а talozj se resuspeпduju u ро 5ml ohladeпog О, 1 М CaCI2. Nakoп jпkubacjje od 15mјп па ledu ј ceпtrjfugjraпja 10mјп па ЗОООгрm ј 4°С, supernataпtj se odbace, а talozj rastvore u ро 1 ml pufera RF2 (10mM MOPS, 10mM RbCI, 75mM CaCI2, 15% gljcerol, рН6,8). Nakoп jпkubacjje od 15mјп па ledu rastvorj kompeteпtпjh bakterjjskjh celjja se aljkvotjraju ј cuvaju па -80°С . 2. З. 16. Transformacija bakterija toplotnim sokom Rastvor svezjh kompeteпtпjh celjja (2001JL) se pomesa sa 51JL produkta reakcjje ljgacjje, ра se smesa dalje jпkuЬira 1 h па ledu (1 01 ). Nakoп toga, smesa se jпkuЬira пајрге 2mјп па 42°С, а potom 5mјп ропоvо па ledu. Na selektjvпu 39 podlogu se zatjm razmaze svjh 2001-JL smese. Nakoп ргеkопоспе jпkubacjje па 37°С, traпsformaпtj se uocavaju kao ројеdјпаспе koloпjje. 2. З. 17. lzolacija plazmidne DNK lzolacjja plazmjdпe DNK jz bakterjja se vrsj pomocu komercjjalпog kjta QIAprep МјпјРгер Кit (Qjageп) . Bakterjjske celjje jz kojjh se vrsj jzolacjja plazmjdпe DNK se taloze u epruvetj od 1 ,5ml u trj ceпtгjfugjraпja od ро 1 mјп па 1 ЗОООгрm jz 4,5ml ргеkопоспе bakterjjske kulture . Talog se resuspeпduje u 2501-JL pufera Р1 , а zatjm se doda 2501-JL pufera Р2 , паkоп cega se epruvete Ьlago muckaju. U smesu se zatjm doda 3501-JL pufera NЗ ј epruvete se Ыаgо promuckaju, а potom ceпtгjfugjraju 1 Оmјп па 1 ЗOOOrpm. Nakoп ceпtrjfugjraпja superпataпt se prebacj па prethodпo sklopljeпe koloпu ј epruvetu za sakupljaпje ј ceпtrjfugjra 1 mјп па 1 ЗОООгрm . Nakoп ceпtгjfugjraпja tecпost jz epruvete za sakupljaпje se odljje, а па koloпu se sjpa 5001-JL pufera РВ ј epruveta ceпtrjfugjra 1 mјп па 1 ЗОООгрm . Nakoп ceпtrjfugjraпja tecпost jz epruvete za sakupljaпje se odljje, а koloпa se jspjra sa 7501-JL pufera РЕ. Zatjm se vrse dva ceпtrjfugjraпja od ро 1 mјп па 1 ЗОООгрm, а паkоп svakog se uklaпja tecпost jz epruvete za sakupljaпje. Коlопа se potom ргеЬасј па epruvetu od 1 ,5ml ј па koloпu se sjpa 501-JL sterjlпe vode. Elucjja DNK se паkоп jпkubacjje od 5mјп па sоЬпој temperatuгj vrsj ceпtrjfugjraпjem 1 mјп па 1 ЗOOOrpm . Nakoп ceпtrjfugjraпja koloпa se odbacj, а u epruvetj ostaje 501-JL precjsceпe plazmjdпe DNK. 2. З. 18. Preciscavanje DNK fragmenata iz gela od agaroze lпsertj јsесепј restrjkcjoпjm eпzjmjma Hindlll ј Xhol jz vektora pGEM-T Easy se preciscavaju iz gela od agaroze pomocu komercijalпog kita QIAqujck PCR Purificatjoп Кit (Qiageп). Produkti digestija plazmida eпzimima Hindlll i Xhol razdvajaju se elektroforezom u 2% gelu od agaroze koja tece u 0,25хТВЕ puferu (25mM Tris, 20mM Ьогпа kiseliпa, 0,25mM EDTA рНВ) ргј паропu 10V/cm. Vizueljzacija se vrsi dodavaпjem Ьоје krjstal vjolet u gel ј pufer (21-Jg/ml). Trake 40 odgovarajuce duzjпe (820Ьр) se jseku jz gela ј prebace u epruvete od 1 ,5ml, u kojjma se potom mегј masa agaroze. U epruvetu se zatjm doda З zapremjпe pufera QG ј smesa se jпkublra па 50°С , 1 О mjпuta jlj do potpuпog rastvaraпja agaroze, uz povremeпo vorteksovaпje. Smesa se zatjm папеsе па prethodпo sklopljeпe koloпu ј epruvetu za sakupljaпje ј ceпtrjfugjra 1 mјп па 1 ЗOOOrpm. Nakoп ceпtrjfugjraпja tecпost jz epruvete za sakupljaпje se odlije, а па koloпu se sjpa 7501-JL pufera РЕ . Zatjm se vrse dva сепtгјfugјгапја od ро 1 mјп па 1 ЗОООгрm, а паkоп svakog se ukloпj tecпost jz epruvete za sakupljaпje. Коlопа se potom prebacj па epruvetu od 1 ,5ml ј па koloпu se sjpa ЗО!ЈL sterjlпe vode. Nakoп jпkubacjje od 5mјп па sоЬпој temperaturj vrsj se ceпtrjfugjгaпje 1 mјп па 13000rpm. 2. З. 19. Priprema plazmidne DNK za transfekciju celija u kulturi Plazmjdпe DNK jz bakterjja u kojjma је ргораgјгап vektor pGL4.1 O[luc2] sa odgovarajucjm jпsertom prjpremaju se za traпsfekcjju celjja u kulturj pomocu komercjjalпog kjta EпdoFree Plasmjd Махј Kjt (Qjageп) . Bakterjjska koloпjja sa petrj solje se zaseje u 5ml LB medjjuma sa 51JL rastvora aпtjЬiotjka ampjcjljпa (1 OOmg/mL) ј gajj Bh па 37°С па ЗООгрm. Aljkovot osmocasovпe bakterjjske kulture od 2001-JL se zaseje u 1 OOmL LB medjjuma, ра se bakterjje potom gaje 16h па 37°С па ЗOOrpm. Bakterjjska kultura se zatjm ceпtrjfugjra 15mјп па 4°С па ЗОООгрm ј supernataпt odbacj. Talog se resuspeпduje u 10ml pufera Р1 , zatjm se doda 1 Oml pufera Р2 , uz Ыаgо muckaпje . Nakoп jпkubacjje od 5mјп па sоЬпој temperaturj, doda se 1 Oml pufera РЗ, smesa Ыаgо promucka ј potom prebacj па prethodпo prjpremljeпj Qjafjlter Cartrjdge. Nakoп jпkubacjje od 1 Qmjп па sоЬпој temperaturj, ljzat bakterjjskjh celjja se profjltгjгa pomocu Qjafjlter Cartгjdge u epruvetu od 50ml. U profjltrjraпj ljzat se zatjm doda 2,5ml pufera ER ј, паkоп Ыagog muckaпja , smesa se jпkuЬira ЗQmјп па ledu. Smesa se zatjm prebacj па Qjageп-tjp 500, kojj је prethodпo ргјргеmlјеп јsрјгапјеm sa 1 Oml pufera QBT. Nakoп propustaпja smese, Qjageп-tjp 500 se jspere dva puta sa ро ЗOmL pufera QC. Qjageп-tjp 500 se zatjm ргеЬасј u odgovarajucu tubu za 41 ceпtrjfugjraпje ј potom jspere sa 15ml pufera QN. U rastvor dobljeп elujraпjem sa Qjageп-tjp 500 se doda 1 0,5ml jzopropaпola ј smesa se, паkоп Ыagog muckaпja , ceпtrjfugjra ЗОmјп па 4°С па 8000rpm. Nakoп pazljjvog odljvaпja superпataпta, talog se реге u 5ml 70% etaпola ј ceпtгjfugjra 1 Оmјп па 4°С па 8000rpm. Posto se ukloпj supernataпt , preostalj talog se osusj па sоЬпој temperaturj, а potom rastvorj u 5001-JL pufera ТЕ. 2. З. 20. Kultivacija humanih celijskih linija Za gајепје celjjskjh lјпјја SaOS-2, NTERA-2, К562 ј Hela se korjstj medjjum DMEM (Dulbecco's Modjfjed Eagle Medjum, РАА) оЬоgасеп fetalпjm govedjm serumom (FBS, Fetal Воvјпе Serum, РАА) ј sa dodatkom 0,05mg/ml geпtamjcjпa. Celjje SaOS-2 se odrzavaju u medjjumu DMEM sa 20% FBS, dok se celjje NTERA-2, К562 ј Hela gaje u medjjumu DMEM sa 10% FBS. Celjje NTERA-2 se gaje u prjsustvu 2mM 1-glutamjпa (Gjbco BRL), а celjje Hela u pгjsustvu 1Х пееsепсјјаlпјh amjпokjseljпa (РАА). Sve celjjske lјпјје se gaje u jпkubatoru па 37ос ј sa automatskjm protokom 5% СО2, u plastjcпjm sudovjma povrsjпe 175cm2 do ргјЬiјzпо 75% koпflueпtпostj. 2. З. 21. Transfekcija humanih celijskih linija Traпsfekcjja se vrsj pomocu reageпsa Superfect (Qjageп), prema prjlozeпom uputstvu projzvodaca. Za traпsfekcjje se koгjstj 5х1 04 celjja SaOS-2 koje se gaje u plastjcпjm sudovjma роvгsјпе 3,9cm2 u medjjumu DMEM (Dulbecco's Modjfjed Eagle Medjum, РАА) obogaceпom sa 20% fetalпog govedeg seruma (FBS, Fetal Воvјпе Serum, РАА) ј u prjsustvu 0,05mg/ml geпtamjcjпa. Nakoп 24h gајепја vrse se kotraпsfekcjje celjja sa 480пg plazmjda pGL4.1 O[luc2] sa odgovarajucjm jпsertom ј ЗОпg plazmjda pGL4. 70[hRiuc] . Nakoп sto se DNK ј Superfect u odпosu 11Jg:51JL pomesaju sa rastvorom DMEM u zapremjпj od 751-JL, smesa se vorteksuje 1 Osec ј jпkublra 1 Оmјп па sоЬпој temperaturj. U meduvremeпu se celije operu puferom PBS (1 37mM NaCI, 42 3,375mM KCI, 1 ,76mM КН2РО4, 1 OmM Na2HP04). Formjraпje kompleksa jzmedu DNK ј reageпsa Superfect se паkоп 1 Qmjп prekjпe dodavaпjem 4001JL medjjuma u smesu, паkоп cega se smesa doda u 6elije. Nakoп traпsfekcjje 6eljje se gaje пагеdпа Зh, potom se doda jos ро 1 ml medjjuma u svakj sud ј 6eljje gaje dalje do jsteka 24h od traпsfekcjje. 2. З. 22. Priprema celijskih ekstrakata Prjprema 6eljjskjh ekstrakata se vrsj pomocu komercjjalпog pufera za ljzu Passjve Lysjs Buffer (Promega) , prema uputstvu projzvodaca. Nakoп 24h od traпsfekcjje 6eljje se jsperu dva puta u ро 1 ml kompletпog pufera PBS (1 37mM NaCI, 3,7mM KCI, 1 ,8mM КН2РО4, 1 О, 1 mM Na2HP04, 1 mM CaCI2, 1 mM MgCI2). Nakoп dodavaпja 2001JL 1Х Passjve Lysjs Buffer (Promega) 6eljje se jпkublraju ЗQmјп па ledu. Nakoп jпkubacjje dobljeпj 6elijskj ekstraktj se sakupljaju u epruvete od 1 ,5ml ј ceпtrjfugjraju ЗОsес па 1 ЗOOOrpm. Superпataпtj kojj sadrze ргоtејпе celjjskjh ekstrakata se prebace u epruvete od 1 ,5ml ј cuvaju па -80°С. 2. З. 2З. Luciferazni esej Мегепје aktjvпostj produkata gепа luc2 ј hRiuc u 6eljjama SaOS-2 traпsfekovaпjm plazmjdjma pGL4.1 O[luc2] sa odgovaraju6jm jпsertom ј pGL4.70[hRiuc] se vrsj pomocu komercjjalпog kjta DuaiGio Lucjferase Assay (Promega) па aparatu GloMax 20/20 Lumjпometer (Promega). Metoda se zasпjva па mereпju aktjvпostj lucjferaze svjca (gеп [luc2]) ј lucjferaze гепјlе (gеп [hRiuc]) u jstom uzorku. Aktjvпost пavedeпjh eпzjma dovodj do hemjjskjh reakcjja u kojjma se emjtuje svetlost, сјјј se jпteпzjtet merj pomocu lumjпometra. Prvo se merj aktjvпost lucjferaze svjca dodavaпjem reageпsa LAR 11 (Lucjferase Assay Reageпt 11), u kome se пalazj lucjfeгjп kojj lucjferaza svjca prevodj u oksjlucjfeгjп uz emjtovaпje svetlostj , cjme se geпerjse stabllaп lumjпesceпtпj sjgпal . Ovaj sjgпal se gasj dodavaпjem reageпsa STOP & Glo Reageпt, u kome se пalazj celeпterazjп kojj lucjferaza гепјlе prevodj u celeпteramjd uz emjtovaпje 43 svetlostj, cjme se ujedпo geпerjse sjgпal za mегепје lucjferaze гепјlе, kojj se sam postepeпo gasj tokom mегепја. Aпaljza se vrsj па uzorku od 1 01JL celjskjh ekstrakata ргјргеmlјепјh u Passjve Lysjs Buffer, а za mегепје se koгjstj ро 501JL reageпasa LAR 11 ј STOP & Glo Reageпt . 2. З. 24. lzolacija jedarnih proteina lzolacjja jedarпjh protejпa kojj se korjste za zastjtu fragmeпta DNK u dezoksjгjboпukleazпom eseju se vгsj pomocu komercjjalпog kjta ProteoJET Cytoplasmjc апd Nuclear Ргоtејп Extractjoп Kjt (Fermeпtas) . Celjjske lјпјје SaOS-2, NTERA-2, К562 ј Hela jz kojjh se jzoluju jedarпj ргоtејпј se gaje 24h u plastjcпjm sudovjma роvгsјпе 150mm2. Nakoп uklaпjaпja medjjuma celjje se operu dva puta u ро 10ml kompletпog pufera PBS (137mM NaCI, 3,7mM KCI , 1,8mM КН2РО4, 10,1mM Na2HP04, 1mM CaCI2, 1mM MgCI2) ј sakupe u epruvete od 15ml. Nakoп ceпtгjfugjraпja 5mјп па 250g ј odbacjvaпja superпataпta ргосепј se zapremjпa taloga celjja, u kojj se zatjm doda 1 О zapremjпa Cell Lysjs Buffer. Smesa se zatjm vorteksuje 1 Osec, jпkublra па ledu 1 Оmјп, ропоvо vorteksuje 1 Osec ј zatjm ceпtrjfugjra 17mјп па 500g па 4°С. Nakoп odvajaпja superпataпta, u kome se пalaze cjtoplazmatjcпj protejпj, talog jedara se dva puta ореге па ledu. Ргапје jedarпog taloga podrazumeva dodavaпje 5001JL Nuclej Washjпg Buffer, Ыаgо vorteksovaпje, jпkubacjju 2mјп па ledu, ceпtrjfugjraпje 7mјп па 500g па 4°С ј odbacjvaпje superпataпta. Na оргапј talog se zatjm doda 1501JL ledeпog Nuclej Storage Buffer ј smesa promesa pjpetjraпjem пekoljko puta. Nakoп dodavaпja 1/1 О zapremjпe Nuclej Lysjs Reageпt smesa se Ыаgо vorteksuje ј potom jпkublra 15mјп па 4°С ј 1200rpm. Nakoп ceпtrjfugjraпja 5mјп па 20000g ј 4°С odvojj se superпataпt , u kome se пalaze jedarпj protejпj, ј cuva па -80°С . 44 2. З. 25. Dezoksiribonukleazni esej Dezoksiriboпukleazпi esej se zasпiva па zastiti odredeпog fragmeпta DNK proteiпima i digestiji пezasticeпih regioпa dezoksiriboпukleazom 1 (102). Reakcioпa smesa sadrzi sledece kompoпeпte: precisceп fragmeпt promotora gепа SMAD4 dobljeп umпozavaпjem pomocu graпicпika Р1 i P2f (50пg) , pufer А (4% glicerol, 10mM Tris рН7,5, 1mM MgCI2, 0,5mM EDTA, 0,5mM DTT, 50mM NaCI), polydldC (1j..Jg/j..JL) i јеdагпе proteiпe (1 OOmg). Reakcioпa smesa se iпkublra 1 h па 37°С , kako Ьi se omogucilo vezivaпje proteiпa za fragmeпt DNK, паkоп cega se u reakciju doda 0,005U dezoksriboпukleaze 1. Nakoп iпkubacije od 15sec па ledu, dezoksiriboпukleaza 1 se iпaktivira iпkublraпjem reakcioпe smese 1 Omiп па 75°С. U koпtrolпoj reakciji koristi se albumiп govedeg seruma (BSA, Boviпe Serum Albumiп, New Eпglaпd Biolabs) umesto jedarnih proteiпa. Nakoп preciscavaпja, produkti digestije dezoksiriboпukleazom 1 se aпaliziraju pomocu kapilarпe elektroforeze. 2. З. 26. Statisticka analiza Statisticka aпaliza se vrsi pomocu softvera Statistical Package for Social Scieпces (SPSS) verzija 1 О. Razlike u ucestalosti pojediпih kliпickih parametara i otkriveпih geпetskih varijaпti medu aпaliziraпim grupama se testiraju korisceпjem х2 testa. Razlike u aktivпosti aпaliziraпih promotorskih koпstrukata se testiraju korisceпjem пezavisпog t-testa. Statisticki zпасајпе su vredпosti р<О .О5 . 45 З. REZULTATI З. 1. lzolacija DNK iz tkiva pankreasa i periferne krvi Uzorci tkiva pankreasa pripremani su za izolaciju DNK u zavisnosti od tipa uzorka. Parafinski kalupi su podvrgavani proceduri deparafinizacije tkiva, dok su uzorci svezih tkiva cuvani u rastvoru 0,9% NaCI, nakon cega је DNK izolovana iz tkiva pankreasa fenol-hloroformskom metodom. Kvalitet i prinos DNK izolovanih iz tkiva pankreasa analizirani su elektroforezom u 1% gelu od agaroze (slika 11 ). lzolacija DNK iz periferne krvi је vrsena komercijalnim kitom, а prosecan prinos је 1 OOng/IJL. Slika 11 . Analiza uzoraka DNK elektroforezom u 1% gelu od agaroze М - DNK marker NHindlll 1-1 З ј 18-29 - DN К jzolovane jz svezjh tkjva kaгcjnoma pankreasa 14-17 ј 30-33 - DNK jzolovane jz parafjnskjh kalupa kaгcjnoma pankreasa Uzorci DNK izolovani iz svezih tkiva karcinoma pankreasa Ьili su zadovoljavajuceg prinosa i kvaliteta i dalje su korisceni direktno u reakciji 46 lапсапоg umпozavaпja DNK. U uzorcima DNK izolovaпim iz parafiпskih kalupa karciпoma paпkreasa DNK је u veciпi uzoraka Ьila fragmeпtiraпa (uzorci 14 i 15 па slici 11) i/ili prisutпa u relativпo maloj koliciпi (uzorci 30-33 па slici 11 ), ра su ovi uzorci рге reakcije lапсапоg umпozavaпja DNK пајрге podvrgavaпi amplifikaciji geпoma. З. 2. Analiza mutacije u kodonu 12 gena KRAS Prisustvo mutacije u kodoпu 12 gепа KRAS је aпaliziraпo u svim uzorcima tkiva karciпoma paпkreasa i kolorektalпog kапсега metodom specificпe mutageпeze posredstvom PCR reakcije (PCR-mediated site-directed mutageпesis, PSM), u kojoj se koriste graпicпici dizajпiraпi tako da uvode mesta prepozпavaпja za restrikcioпi eпzim BstNI па оЬа kraja fragmeпta. Amplifikacija је vrseпa pomocu graпicпika KRAS12 i KRAS12psm, pomocu kojih se umпozava fragmeпt duziпe 157Ьр, koji obuhvata deo egzoпa 2 gепа KRAS u kome se пalazi kodoп 12. Graпicпici KRAS12 i KRAS12psm uvode restrikcioпa mesta za eпzim BstNI па оЬа kraja umпozeпog fragmeпta za пormalпi alel, dok prisutvo mutacije u kodoпu 12 ukida јеdпо od uvedeпih mesta ргероzпаvапја (slika 12). 9 . 10 ' 11 ' 12 ' 13 ' 14 Vai \Giy \Pro.Giy \Giy \Val GTTGGACCTGGTGGGGTA BstNI Slika 12. Deo sekveпce graпicпika KRAS12psm i umпozeпog fragmeпta gепа KRAS u okviru kojih se пalaze mesto prepozпavaпja za eпzim BstNI i mutacija u kodoпu 12 9-14- broj odgovarajuceg kodona u proteinu KRAS *- izmenjen nukleotid u sekvenci granicnika KRAS12psm BstNI- mesto prepoznavanja za restrikcioni enzim BstNI 47 Fragmenti doЬijeni amplifikacijom podvrgnuti su digestiji enzimom BstNI. Produkt umnozavanja normalnog alela secenjem daje fragmente od 114Ьр , 29Ьр i 14Ьр, dok produkt umnozavanja mutiranog alela ostaje nesecen na jednom od dva mesta prepoznavanja za enzim BstNI i daje fragmente od 14ЗЬр i 14Ьр. Produkti digestije analizirani su elektroforezom u 1 О% gelu od poliakrilamida i vizuelizovani bojenjem srebro-nitratom. Pod datim uslovima elektroforeze na gelovima se u uzorcima u kojima је mutacija prisutna uocavaju trake od 14ЗЬр i 114Ьр, dok se u uzorcima u kojima mutacija nije prisutna uocava samo traka od 114Ьр (sika 1 3). 1 2 з 4 5 6 7 8 э 10 11 12 13 Slika 1 З. Analiza prisustva mutacije u kodonu 12 gena KRAS u 10% gelu od poliakrilamida 1 - neseceni PCR fragment 2, З , 5, 8, 9, 12- uzorci u kojima nije prisutna mutirana varijanta kodona 12 gena KRAS 4, 6, 7, 1 О, 11 , 1 З- uzorci u kojima је prisutna mutirana varijanta kodona 12 gena KRAS Analiza mutacije u kodonu 12 gena KRAS izvrsena је u 50 uzoraka tkiva karcinoma pankreasa i 50 uzoraka tkiva kolorektalnog kancera. Prisustvo mutacije u kodonu 12 gena KRAS utvrdeno је u 74% slucajeva u karcinomu pankreasa i u 28% slucajeva u kolorektalnom kanceru. Analiza mutacije u kodonu 12 gena KRAS izvrsena је takode i u pet uzoraka tkiva pankreasa uzetih od ispitanika za koje histopatoloski nije potvrdena dijagnoza karcinoma pankreasa. Od pet analiziranih uzoraka nemalignog tkiva pankreasa mutacija је 48 Ьila prisutna u dva slucaja cisticne distrofije pankreasa, dok nije Ьila prisutna u slucaju benignog tumora pankreasa i dva slucaja hronicnog pankreatitisa. U dva kontrolna uzorka DNK kolorektalnog kancera koji sadrze mutacije u genu SMAD4 nije otkriveno prisustvo mutacije u kodonu 12 gena KRAS. Rezultati analize mutacije u kodonu 12 gena KRAS u malignim tkivima su prikazani u tabeli 6. Tabela 6. Distribucija mutacije u kodonu 12 gena KRAS u karcinomu pankreasa i kolorektalnom kanceru karcinom Jankreasa kolorektalni kancer mutacija u kodonu broj % В го ј % 12 gena KRAS nije prisutna 13 26 36 72 prisutna 37 74 14 28 ukupno 50 100 50 100 З. З. Analiza gena SMAD4 Analiza gena SMAD4 је obuhvatila dva potencijalno znacajna regiona u 5' nekodirajucem delu gena: okolinu prvog nekodirajuceg egzona bogatu GC ostrvcima i promotorski region u okolini prvog kodirajuceg egzona (slika 14). U okolini prvog nekodirajuceg egzona analizirano је prisustvo metil grupa па sest GC ostrvaca neposredno ispred egzona. Analiza promotorskog regiona u okolini prvog kodirajuceg egzona obuhvata strukturnu i funkcionalnu analizu fragmenta duzine 800Ьр u okviru koga se nalazi bazalni promotor. GC OSTRVCA PROMOTOR --.-.. ..1-. Jloi.IJ..ii.ll..~t.'ll .... · --+1---•-~ ~ • "• .. " •-... ·--.::::::.=====iilll•l-- 2 NEKODIRAJUCI EGZONI KODIRAJLICI EGZONI ~ Slika 14. Shematski prikaz 5' nekodirajuceg regiona gena SMAD4 49 З. З. 1. Analiza metilacije u nekodirajucem egzonu 1 gena SMAD4 Metilacioni status 5' regulatornog regiona gena SMAD4 analiziran је pomocu restrikcionih enzima Hpall i Mspl , koji imaju isto mesto prepoznavanja (CCGG), ali se razlikuju ро osetljivosti na prisustvo metil-grupa u DNK. Analizirani segment DNK obuhvata region bogat GC ostrvcima u okolini nekodirajuceg egzona 1 gena SMAD4 (103). U prisustvu metilacije na GC ostrvcima u pomenutom regionu Hpall enzim, koji је osetljiv na metilaciju, ne moze da izvrsi secenje DNK, dok Mspl enzim, koji је neosetljiv na metilaciju , moze. U kontrolnim reakcijama, u kojima se kao matrica za umnozavanje koristi genomska DNK koja је inkuЬirana bez enzima, pomocu granicnika Hm1 i Hm2 umnozava se fragment duzine 408Ьр. U reakcijama u kojima se kao matrica za umnozavanje koristi DNK inkuЬirana sa enzimom Mspl dolazi do secenja DNK i nema umnozavanja fragmenta. U reakcijama u kojima se kao matrica za umnozavanje koristi DNK inkublrana se enzimom Hpall do secenja DNK dolazi u zavisnosti od metilacionog statusa GC ostrvaca u fragmentu, odnosno do umnozavanja dolazi samo ukoliko је metilacija prisutna i nije doslo do secenja. Deo rezultata analize prisustva metilacije u 5' regulatornom regionu gena SMAD4 prikazan је na slici 15. Analiza prisustva metil-grupa u nekodirajucem egzonu 1 gena SMAD4 uspesno је izvrsena u 17 uzoraka DNK izolovanih iz svezih tkiva karcinoma pankreasa (34%) i nije otkrivena ni u jednom od analiziranih slucajeva. Za preostala 33 uzorka (66%) u kontrolnim reakcijama u kojima su kao polazne matrice koriscene nesecene genomske DNK nije doslo do umnozavanja fragmenta, ра nije moglo Ьiti odredeno da li је metilacija prisutna ili ne. Metilacija takode nije Ьila prisutna ni u 4 uspesno analizirana uzorka nemalignog pankreasnog tkiva. 50 м 1 2 з 4 5 6 7 8 9 101112131415 161718 к Sljka 15. Aпaljza PCR produkata doЬijeпjh umпozavaпjem pomocu gгапјспјkа Hm1 ј Hm2 u 2% gelu od agaroze М- DNK marker !'ZJX/Haelll 1, 4, 7, 1 О, 1 З, 16 - DN К secena enzimom Mspl 2, 5, 8, 11, 14, 17- DNK secena enzimom Hpall З, 6, 9, 12, 15, 18- nesecena DNK К- kontrolna DNK З. З. 2. Analiza strukture promotora gena SMAD4 Strukturпa aпaljza promotora gепа SMAD4 vrseпa је sekveпcjraпjem DNK. Segmeпt DNK duzjпe 800Ьр (-668Ьр do +131Ьр) umпozeп је pomocu graпjcпjka Р1Х ј Р2Н . Ргесјsсепј produktj umпozavaпja sekveпcjraпj su u dve odvojeпe reakcjje, а u svakoj је korjsceп ро јеdап od gгапјспјkа kojjma је vrseпo umпozavaпje. Prjsustvo promeпa u odпosu па пormalпu geпetsku vaгjjaпtu aпaljzjraпo је u regjoпu -620Ьр do +80Ьр . U апаlјzјгапоm regjoпu promotora gепа SMAD4 uосепа su dva poljmorfпa пјzа tjmjпa па pozjcjjama -462 ј -4, kojj su se u aпaljzjraпjm uzoгcjma tkjva paпkreasa razljkovalj u odпosu па погmаlпе geпetske vагјјапtе, -462Т(15) ј -4Т(12). Posto uzoгcj kагсјпоmа predstavljaju geпetskj heterogeпu populacjju celjja, u svakom uzorku је odredjvaпo prjsustvo пajzastupljenjje vагјјапtе. Qsjm пormalпjh varjjaпtj -462Т(15) ј -4Т(12), u tkjvu karcjпoma paпkreasa је otkгjveпo ј prjsustvo varjjaпtj -462Т(14) , -4Т(11) ј -4Т(1 О) (sljke 16 ј 17). 51 Sljka 16. Rezultatj sekvencjranja regjona promotora gena SMAD4 u kome se nalazj poljmorfjzam -462Т(15) u uzorcjma u kojjma su najzastupljenjje varjjante - 462Т(15) (А) ј -462Т(14) (В) •.•••• 1111111111111111111 T C TTTTTTTTTTTT C TTTTTT A GG TT ..................... lттттттттттт с тттттт А GG Т llldllllll 103 97 91 85 122 115 108 А в с Sljka 17. Rezultatj sekvencjranja regjona promotora gena SMAD4 u kome se nalazj poljmorfjzam -4Т(12) u uzorcjma u kojjma su najzastupljenjje varjjante -4Т(12) (А), -4Т(11) (В) ј -4Т(1 О) (С) Analjze DNK sekvencj ukazuju da је u оЬа poljmorfna regjona u karcjnomu pankreasa prjsutan fenomen mjkrosateljtne nestaЬilnostj . U vecjnj uzoraka detektovano је u tragovjma prjsustvo varjjantj kracjh za ро 1-ЗЬр u odnosu na najzastupljenjju varjjantu. Zbog fenomena mjkrosateljtne nestaЬilnostj metodom sekvencjranja njje Ьilo moguce precjzno odredjtj koje varjjante poljmorfjzama -462Т(15) ј -4Т(12) su najzastupljenjje u analjzjranjm uzorcjma tkjva karcjnoma pankreasa, раје odredjvanje varjjantj jzvrseno metodom analjze fragmenata. З. З. З. Analiza polimorfizama -462Т(15) i -4Т(12) u promotoru gena SMAD4 Analjza varjjantj poljmorfjzama -462Т(15) ј -4Т(12) u uzorcjma tkjva ј perjferne krvj jspjtanjka sa karcjnomom pankreasa, kao ј tkjva ј perjferne krvj 52 jspjtanjka sa kolorektalnjm kancerom vrsena је PCR metodom. Ampljfjkacjja ovjh regjona ј е vrsena pomocu granjcnjka obelezenjh fluoroforama, а doЬijenj PCR produktj su analjzjran j kapjlarnom elektroforezom. Prjsustvo pojedjnjh varjjantj odredjvano је pomocu softvera za genotjpjzacjju. Na svjm sljkama na kojjma su prjkazanj rezultatj analjze fragmenata sa leve strane је oznacen broj uzorka, а sa desne doЬijenj rezultat , koj j predstavlja najcescu detektovanu varjjantu ukoljko se radj о tkjvu , odnosno detektovan genotjp ukoljko se radj о perjfernoj krvj. Analjza poljmorfjzma -462Т(15) је vrsena pomocu granjcnjka obelezenog bojom VIC, а produktj su detektovanj u rasponu duzjna od 147Ьр do 154Ьр (х osa elektroferograma) ј u rasponu jntenzjteta sjgnala 250 do 4000 (у osa elektroferograma). Qsjm normalne varjjante -462Т(15), duzjne 15ЗЬр , detektovano је jos pet varjjantj: -462Т(16) , -462Т(14), -462Т(12), -462Т(10) ј - 462Т(9). U tkjvu karcjnoma pankreasa u 6% uzoraka је detektovana normalna varjjanta -462Т(15) , а u preostaljh 94% uzoraka varjjanta -462Т(14). Deo rezultata analjze poljmorfjzma -462Т(15) u uzorcjma tkjva karcjnoma pankreasa је prjkazan na sljcj 18. 142 1.6 158 2500 2000 1500 1000 500 1•2 1•6 158 2000 1600 1200 800 о д31 -462Т(14) Sljka 18. Analjza poljmorfjzma -462Т(15) u tkjvu karcjnoma pankreasa al153 - varijanta -462Т( 15) al152 - varijanta -462Т(14) 53 1 U perifernoj krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa na 85% anal iziranih alela је Ьila prisutna normalna varijanta -462Т(15) , а na 15% varijanta -462Т(1 2) . Tri ispitanika su Ьili heterozigoti za varijante -462Т(15) i -462Т(12) , dok su ostali ispitanici Ьili homozigoti. Deo rezultata analize polimorfizma -462Т(15) u uzorcima periferne krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa је prikazan na slici 19. ~~ щ " '" ' ~gE . .. 1 36А l!i:illJ -462Т(15)/-462Т(15) Slika 19. Analiza polimorfizma -462Т(15) u perifernoj krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa al153- varijanta -462Т(15) al150 - varijanta -462Т( 12) 54 U kolorektalnom kanceru u 92% uzoraka је varjjanta prjsutna u perjfernoj krvj jspjtanjka Ьila ocuvana ј u tkjvu, od cega u 84% slucajeva varjjanta - 462Т(15), а u 8% slucajava varjjanta -462Т(16). U 8% slucajava је u perjfernoj krvj jspjtanjka Ьila prjsutna varjjanta -462Т(15), od cega је u 4% slucajeva u tkjvu detektovana varjjanta -462Т(10) ј u 4% slucajeva varjjanta -462Т(9). Deo rezultata uporedne analjze poljmorfjzma -462Т(15) u uzorcjma tkjva ј perjferne krvj jspjtanjka sa kolorektalnjm kancerom је prjkazan na sljkama 20 ј 21. 1<6 150 154 156 1200 1~2 146 150 154 156 ЗбОО 2700 1800 900 156 3500 2800 2100 1400 700 °CRC40T -462Т(15) Sljka 20. Analjza poljmorfjzma -462Т(15) u perjfernoj krvj (К) ј tkjvu (Т) jspjtanjka sa kolorektalnjm kancerom kod kojjh su varjjante detektovane u perjfernoj krvj ocuvane u tkjvu al154- varijanta -462Т(16) _ al153- varijanta -462Т(15) 55 1<2 146 150 1 5о< 158 <1500 i i 3600 ~~ 2700 1 1800 900 i i о 1 CRC27K [& ЈsЗ] -462Т(15)/-462Т(15) 142 146 150 15ol 158 ~~.ЈЕ АЛ ~ ·= 1 СRС27Т 1!!1) 471 -462Т(9) .., 146 150 154 158 2000 1600 1200 i :Jv V\ 800 1 400 о 1 CRC39K G11sl] -462Т(15)/-462Т(15) 142 146 150 15ol 158 250 200 150 1А 1\ !\ 1\А!\ 100 50 ° CRC39T /\ Га1148 ! -462Т(10) Sljka 21. Analiza poljmorfjzma -462Т(15) u perjfernoj krvj (К) ј tkjvu (Т) jspjtanjka sa kolorektalnjm kancerom kod kojjh varjjante detektovane u perjfernoj krvj njsu ocuvane u tkjvu al153- varijanta -462Т(15) al148- varijanta -462Т(10) al147- varijanta -462Т(9) Analjza poljmorfjzma -4Т(12) је vrsena pomocu granjcnjka obelezenog bojom 6-FAM, а produktj su detektovanj u rasponu duzjna od 195Ьр do 198Ьр (х osa elektroferograma) ј u rasponu jntenzjteta sjgnala 200 do 2000 (у osa elektroferograma) . Qsjm normalne varjjante -4Т(12) duzjne 198Ьр detektovane su jos trj varjjante: -4Т(11 ), -4Т(1 О) ј -4Т(9). 56 U tkivu karcinoma pankreasa u 6% uzoraka ј е detektovana normalna varijanta -4Т(12) , u 6% uzoraka varijanta -4Т(11 ), а u 88% uzoraka varijanta - 4Т(1 0). Deo rezultata analize polimorfizma -4Т(12) u uzorcima tkiva karcinoma pankreasa је prikazan na slici 22. 189 192 195 198 201 204 650 520 А 390 ~Jv~ 260 130 о д26 G1198] -4Т(12) 189 192 195 198 201 204 ~ј • JJr • 1 д46 г~ -4Т(11) 189 192 195 198 201 204 750 N~ 600 <50 300 150 0 А50 jaii96 J -4Т(10) Slika 22. Rezultati analize polimorfizma -4Т(12) u tkivu karcinoma pankreasa al198 - varijanta -4Т(12) al197- varijanta -4Т(11) al196- varijanta -4Т(1 О) U perifernoj krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa na 89% alela је Ьila prisutna varijanta -4Т(12) , na 4% varijanta -4Т(11 ), а na 7% varijanta -4Т(9) . Jedan ispitanik је Ьiо heterozigot za varijante -4Т(12) i -4Т(9), dok su ostali ispitanici Ьili homozigoti. Deo rezultata analize polimorfizma -4Т(12) u uzorcima periferne krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa је prikazan na slici 23. 57 189 192 195 198 201 ... 1200 900 600 зоо t JV 0 57д [а1198 -4Т(12)/-4Т(12) 189 192 195 198 201 ""' 420 1 350 280 210 ~NV 140 70 о 20д l!tt9i] -4Т(11)/-4Т(11) 189 192 195 198 201 ,.. 750 f\ 600 AЛ/\rv 450 300 150 \""" о 15д fiii ,m ~ -4Т(12)/-4Т(9) 189 192 195 198 201 ,.. 11 1200 900 ,1 600 300 ј\) ~ оsод [!.:1195 . -4Т(9)/-4Т(9) Slika 23. Rezultati analize polimorfizma -4Т(12) u perifernoj krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa al198- varijanta -4Т(12) al197- varijanta -4Т(11) al195 - varijanta -4Т(9) U kolorektalnom kanceru i u uzorcima tkiva i u uzorcima periferne krvi ispitanika је detektovana iskljucivo normalna varijanta -4Т(12). Deo rezultata uporedne analize polimorfizma -4Т(12) u uzorcima tkiva i periferne krvi ispitanika sa kolorektalnim kancerom ј е prikazan na slici 24. 58 189 192 :101 800 640 160 169 192 :101 :юо 160 120 60 °CRC50T -4Т(12) Slika 24. Rezultati analize polimorfizma -4Т(12) u tkivu (Т) i perifernoj krvi (К) ispitanika sa kolorektalnim kancerom al198- varijanta -4Т(12) З. З. 4. Analiza haplotipova varijanti -462Т(15) i -4Т(12) u promotoru gena SMAD4 Pod haplotipom se podrazumeva grupa alela na jednom hromozomu koji su lokalizovani u neposrednoj Ыizini i koji se usled toga nasleduju zajedno. Varijante -462Т(15) i -4Т(12) u promotoru gena SMAD4 razdvaja svega 458Ьр, ра se njihove komЬinacije mogu smatrati haplotipovima. Haplotipovi promotora gena SMAD4 su oznaceni na sledeci nacin: haplotip [broj timina u traktu - 462T(15)]/[broj timina u traktu -4Т(12)]. U analiziranim tkivima karcinoma pankreasa najcesci haplotip је Ьiо haplotip 14/1 О, prisutan u 88% slucajeva, dok је najcesci haplotip u kolorektalnom kanceru Ьiо normalan haplotip 15/12, prisutan u 84% slucajeva. Ostali haplotipovi su Ьili prisutni u relativno malom broju slucajeva. Distribucija haplotipova polimorfizama -462Т(15) i -4Т(12) u analiziranim tkivima је prikazana u tabeli 7. 59 Tabela 7. Distribucija haplotipova polimorfizama -462Т(15) i -4Т(12) u karcinomu pankreasa i kolorektalnom kanceru haplotip karcinom Jankreasa kolorektalni kancer -462(Т) -4(Т) broj % broj % 15 12 з 6 42 84 14 11 з 6 - - 14 10 44 88 - - 16 12 - - 4 8 10 12 - - 2 4 9 12 - - 2 4 ukupno 50 100 50 100 U analiziranim uzorcima periferne krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa najcesci haplotip је takode Ьiо normalni haplotip 15/12, prisutan na 78% analiziranih alela. Samo jedan uzorak је karakterisala heterozigotnost za оЬе varijante i u njemu su detektovani aleli -462Т(15) i -462Т(12), kao i aleli - 4Т(12) i -4Т(9). U ovom slucaju haplotipovi su odredeni kloniranjem sekvenciranih PCR produkata u pGEM T-Easy vektor i sekvenciranjem doЬijenih klonova. Distribucija haplotipova polimorfizama -462Т(15) i -4Т(12) u uzorcima periferne krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa је prikazana u tabeli 8. Tabela 8. Distribucija haplotipova polimorfizama -462Т(15) i -4Т(12) u perifernoj krvi ispitanika sa karcinomom pankreasa alel1 alel2 Ьгој % -462(Т) -4(Т) -462(Т) 1 -4(Т) 15 12 15 12 З9 78 12 12 12 12 з 6 12 9 12 9 з 6 15 11 15 11 2 4 15 12 12 12 2 4 15 12 12 9 1 2 ukupno 50 100 U analiziranim uzorcima periferne krvi i tkiva ispitanika sa kolorektaln im kancerom najcesci haplotip је takode Ьiо normalni haplotip 15/12, prisutan na 60 84% analiziranih alela, dok је u 8% slucajeva Ьiо prisutan haplotip 16/12. U preostalih 8% slucajeva u tkivu је doslo do gubltka normalnog haplotipa 15/12 i do pojave haplotipova 10/12 ili 9/12. Distribucija haplotipova polimorfizama - 462Т(15) i -4Т(12) u uzorcima tkiva i periferne krvi ispitanika sa kolorektalnim kancerom prikazana је u tabeli 9. Tabela 9. Uporedna distribucija haplotipova polimorfizama -462Т(15) i -4Т(12) u tkivu i perifernoj krvi ispitanika sa kolorektalnim kancerom haplotip u tkivu haploti о u krvi broj % -462(Т) -4(Т) -462(Т) -4(Т) 15 12 15 12 42 84 16 12 16 12 4 8 15 12 10 12 2 4 15 12 9 12 2 4 ukupno 50 100 U uzorcima tkiva pankreasa uzetih od ispitanika za koje histopatoloski nije potvrdena dijagnoza karcinoma pankreasa otkriveno је prisustvo haplotipova 14/11 i 14/1 О. Haplotip 14/11 је Ьiо prisutan kod jednog ispitanika sa cisticnom distrofijom pankreasa i jednog ispitanika sa hronicnim pankreatitisom, а haplotip 14/1 О kod jednog ispitanika sa cisticnom distrofijom pankreasa, jednog ispitanika sa hronicnim pankreatitisom i ispitanika sa benignim tumorom pankreasa. U оЬа kontrolna uzorka DNK kolorektalnog kancera za koje је prethodno utvrdeno da sadrze mutacije u genu SMAD4 otkriveno је prisustvo normalnog haplotipa 15/12. 61 З. З. 5. Analiza aktivnosti varijanti promotora gena SMAD4 Analiza aktivnosti promotora gena SMAD4 vrsena је sa fragmentima koji su umnozeni pomocu granicnika Р1Х i Р2Н i potom klonirani u vektor pGEM T- Easy. Kloniranje је radeno u nezavisnim serijama eksperimenata u kojima su koriscena ро tri razlicita PCR produkta dobljena amplifikacijom na uzorcima DNK izolovanim iz tkiva karcinoma pankreasa dok nisu dobljeni klonovi sva tri haplotipa koji su detektovani u tkivu karcinoma pankreasa: 15/12, 14/11 i 14/1 О. Nakon ligacije u vektor i transformacije bakterijskog soja XL 1-Biue Е. coli vektori koji su nosili insert su izolovani iz bakterijskih kultura i analizirani sekvenciranjem. Analizom ukupno 23 dobljena klona otkriveno је prisustvo jos tri haplotipa: 15/11, 12/11 i 12/9. lnserti navedenih sest kloniranih haplotipova su isecani iz vektora pGEM T-Easy pomocu enzima Hindlll i Xhol i potom klonirani u vektor pGL4.1 O[luc2]. Analiza promotorske aktivnosti razlicitih haplotipova promotora gena SMAD4 је vrsena pomocu sistema DuaiGio Luciferase Assay. Uticaj prisustva otkrivenih genetskih varijanti na aktivnost promotora gena SMAD4 је analizirana u celijama SaOS-2. U eksperimentima tranzijentne kotransfekcije u celije SaOS- 2 su uvedeni plazmid pGL4.1 O[luc2] sa odgovarajucim insertom i plazmid pGL4.70[hRiuc], а aktivnosti gena luc2 i hRiuc su merene nakon 24h. Svaki od konstrukata analiziran је u tri nezavisna eksperimenta, а u svakom od eksperimenata analiza svakog konstrukta је vrsena u triplikatu. Rezultati izmerene aktivnosti luc2 gena su normalizovani prema efikasnosti transfekcije, odnosno prema izmerenoj aktivnosti hRiuc gena. Normalizovane luc2 aktivnosti za analizirane genetske varijante su prikazane kao procenat aktivnosti normalnog haplotipa 15/12, kome је dodeljena vrednost od 100%, odnosno 1. Као negativna kontrola koriscen је plazmid pGL4.1 O[luc2] bez inserta. Dobljeni rezultati merenja promotorske aktivnosti su prikazani na slici 25. 62 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 о 1 2 з 4 5 б 7 Sljka 25. Analjza relatjvne aktjvnostj haplotjpova varjjantj -462Т(15) ј -4Т(12) promotora gena SMAD4 u odnosu na aktjvnost haplotjpa 15/12 1 -vektor pG L4.1 O[luc2] bez inserta 2 - haplotip 15/12 З - haplotip 14/11 4 - haplotip 14/1 О 5 - haplotip 15/11 6 - haplotip 12/11 7- haplotip 12/9 Od analjzjranjh genetskjh varjjantj promotora gena SMAD4 haplotjpovj 15/11 , 14/11 , 12/11 ј 12/9 su jmalj aktjvnost u njvou aktjvnostj normalne varjjante 15/12. Statjstjckj znacajno snjzenu aktjvnost (р<0 , 001) је pokazao haplotjp 14/1 О , сјја је aktjvnost jznosjla 65% aktjvnostj normalne varjjante (0,65±0,06). З. З. 6. Analiza vezivanja proteina za varijante promotora gena SMAD4 Analjza vezjvanja protejna za promotor gena SMAD4 vrsena је za normalan haplotjp 15/12 ј za haplotjp 14/1 О, kojj је pokazao snjzenu promotorsku aktjvnost. Fragmentj promotorskog regjona gena SMAD4 su umnozen j pomocu granjcn jka Р1 ј P2f, а doЬij enj PCR produktj obelezenj bojom 6-FAM su precjscenj. Precjscenj PCR fragmentj su zastjcenj protejnjma jedarnjh ekstrakata celjjskjh ljnjja SaOS-2, NTERA-2, К562 ј Hela, а zatjm podvrgnutj dejstvu 63 enzima dezoksiribonukleaze 1, koj i sece nezasticene regione DNK. Variranjem kolicine DNK, kolicine jedarnih proteina i sastava pufera u kojem se odvija reakcija uspostavljeni su uslovi za jasnu detekciju signala. Fragmenti promotora gena SMAD4 koj i nose haplotipove 15/12 i 14/1 О pokazuju isti profil signala nakon digestije dezoksiribonukleazom 1 bez zastite jedarnim proteinima. U оЬа slucaja pril ikom zastite fragmenata jedarnim proteinima pre digestije dezoksiribonukleazom 1 dolazi do potpunog guЬitka signala u kompletnom analiziranom fragmentu i nema razlike izmedu analiziranih varijanti. Na slikama 26 i 27 su prikazani rezultati doЬijeni kada su PCR fragmenti podvrgnuti dejstvu dezoksiribonukleaze 1 bez zastite jedarnih proteina i sa zastitom jedarnim ekstraktima celijske linije NTERA-2. lsti profili signala doЬijeni su i kada је zastita fragmenta vrsena jedarnim ekstraktima celijskih linija SaOS-2, К562 i Hela. 14/10 Slika 26. Uporedna analiza fragmenata promotora gena SMAD4 sa haplotipovima 15/12 i 14/1 О doЬijenih nakon digestije dezoksiribonukleazom 1 bez zastite jedarnim proteinima 64 80 160 240 400 560 640 720 15/12 +NEx ј .Ј Ј .Ј. 80 160 240 320 400 480 560 ~о f