UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Ana J. Vuleta EVOLUCIONA EKOFIZIOLOGIJA STRESA:ULOGA ENZIMSKIH I NEENZIMSKIH ANTIOKSIDANATA U PRIRODNIM POPULACIJAMA IRIS PUMILA L. (IRIDACEAE) doktorska disertacija Beograd, 2013 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Ana J. Vuleta EVOLUTIONARY ECOPHYSIOLOGY OF STRESS: THE ROLE OF ENZYMATIC AND NON-ENZYMATIC ANTIOXIDANTS IN NATURAL POPULATIONS OF IRIS PUMILA L. (IRIDACEAE) Doctoral Dissertation Belgrade, 2013 MENTORI: ________________________________________________ Dr Branka Tucić, naučni savetnik Institut za biološka istraživanja „Siniša Stanković“ Univerzitet u Beogradu ________________________________________________ Dr Aneta Sabovljević, docent Biološki fakultet Univerzitet u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: ________________________________________________ Dr Sanja Manitašević Jovanović, naučni saradnik Institut za biološka istraživanja „Siniša Stanković“ Univerzitet u Beogradu DATUM ODBRANE:____________________ Eksperimentalni deo doktorske disertacije urađen je u okviru projekata osnovnih istraživanja Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije „Fiziološki i evolucioni aspekti stresnog odgovora u prirodnim i laboratorijskim populacijama“ (br. 143033, rukovodilac dr Jelica Lazarević) i „Evolucija u laboratoriji i adaptacije u prirodi“ (br. 173007, rukovodilac dr Branka Tucić), u okviru Odeljenja za evolucionu biologiju, Instituta za biološka istraživanja „Siniša Stanković“, Univerziteta u Beogradu. Posebnu zahvalnost dugujem mentoru dr Branki Tucić na ukazanom poverenju, velikom razumevanju, stručnim savetima i pomoći tokom izrade ove doktorske disertacije. Veliko hvala mentoru doc. dr Aneti Sabovljević na pregledu ove disertacije i diskusiji prikazanih rezultata. Najsrdačnije se zahvaljujem članu komisije dr Sanji Manitašević Jovanović na saradnji, pomoći, i sugestijama u svim fazama ovog rada. Zahvaljujem se od srca svim kolegama i koleginicama sa projekta, kao i iz Odeljenja za evolucionu biologiju koji su mi pružali podršku tokom izrade ovog rada. Posebno se zahvaljujem porodici i prijateljima na ogromnoj ljubavi, razumevanju i podršci. Evoluciona ekofiziologija stresa: uloga enzimskih i neenzimskih antioksidanata u prirodnim populacijama Iris pumila L. (Iridaceae) Rezime U evolucionoj biologiji sredinski stres se definiše kao mehanizam koji dovodi do adaptacija i evolucije u promenljivoj sredini, i istovremeno uključuje svojstva stresora, kao sredinsku komponentu i stresiranih, kao biološku komponentu. Više biljke, kao modularni i sesilni organizmi, razvile su tokom evolucije veliki broj biohemijskih, fizioloških i anatomsko-morfoloških mehanizama koji im omogućuju povećanje individualne adaptivne vrednosti pod nestabilnim uslovima životne sredine. Kratkoročno, odnosno u ekološkoj vremenskoj skali, biljke se usaglašavaju sa variranjem biotičkih i abiotičkih faktora u svojim staništima fleksibilnošću fenotipa, koja može da obuhvati sve nivoe biološke organizacije - od molekularnog do morfološkog. Za prirodne populacije biljaka, svetlost je jedan od prostorno i vremenski najvarijabilnijih abiotičkih faktora životne sredine i, istovremeno, jedan od najvažnijih sredinskih resursa. U tom kontekstu, od izuzetne važnosti su biohemijski mehanizmi zaštite biljaka od oksidativnog stresa koje čine enzimski i neenzimski antioksidanti. Ciljevi ove doktorske disertacije su: (I) ispitivanje veličine i obrazaca sezonske fenotipske plastičnosti biohemijskih (specifična aktivnost antioksidativnih enzima superoksid dismutaze – SOD, askorbat peroksidaze – APX, katalaze – CAT, glutation reduktaze – GR, peroksidaza III klase - POD; količina neenzimskih antioksidanata, antocijana – Anth i fenola - Phen), morfološko-anatomskih (specifična površina lista - SLA i gustina stoma - SD) i fizioloških osobina lista (sadržaj suve materije u listu – LDMC, sadržaj vode u listu – LWC, relativni sadržaj vode u listu – RWC, sukulentnost – SU, količina fotosintetičkih pigmenata: hlorofila a - Chl a, hlorofila b - Chl b i karotenoida - Cars) biljaka I. pumila iz dve prirodne populacije, od kojih je jedna naseljavala otvoreno (populacija „Dina“), a druga zasenčeno (populacija „Šuma“) stanište u Deliblatskoj peščari; (II) testiranje hipoteze o lokalnim adaptacijama lista I. pumila na abiotičke uslove otvorenog i zasenčenog staništa korišćenjem recipročno-transplantacionog eksperimenta u prirodi; (III) utvrđivanje variranja u stepenu (relativna varijansa sopstvene vrednosti, rVE) i obrascima fenotipske integracije (CPC analiza) funkcionalno povezanih osobina lista I. pumila, indukovanog heterogenošću životne sredine. Obrazac sezonskog variranja funkcionalnih osobina lista kod biljaka I. pumila iz populacija Dina i Šuma bio je specifičan za svaku osobinu, kao i za svaku ispitivanu populaciju. Specifične aktivnosti većine antioksidativnih enzima, kao i količina neenzimskih antioksidanata bile su najveće tokom najstresnijeg, letnjeg perioda, koga karakterišu visok intenzitet svetlosti, povišena temperatura vazduha i nedostatak vode u podlozi, u poređenju sa drugim godišnjim dobima kao što su proleće i jesen. Tokom cele vegetacione sezone biljke iz populacije Šuma su imale više aktivnosti antioksidativnih enzima u odnosu na biljke iz populacije Dina, dok je suprotan trend utvrđen za neenzimske antioksidante, naročito antocijane, čija je količina po pravilu bila veća u listovima biljaka sa otvorenog staništa. Pored variranja u aktivnosti i količini antioksidanata, u populaciji Dina uočeno je i smanjenje količine hlorofila, kao jedan od mehanizama kojim biljke I. pumila sa otvorenog staništa regulišu nastanak reaktivnih vrsta kiseonika u hloroplastima. Testiranje adaptivnosti ispitivanih biohemijskih, fizioloških i morfološko-anatomskih osobina lista I. pumila pokazalo je da se srednje vrednosti većine ovih osobina nisu statistički značajno razlikovale između genotipova iz populacija Dina i Šuma ni na otvorenom kao ni na zasenčenom staništu. Odsustvo statistički značajnih među-populacionih razlika kod I. pumila na istom staništu ukazuje da se populacije Dina i Šuma nisu genetički diferencirale pod uticajem lokalne selekcije u njihovim svetlosnim sredinama. Dakle, pošto način variranja testiranih osobina lista (indukovanog različitim intenzitetima ambijentalne svetlosti) povećava performansu biljaka I. pumila pod datim sredinskim uslovima, ovaj tip promene fenotipa mogao bi se definisati kao adaptivna plastičnost. Veličina fenotipske plastičnosti u odnosu na svetlost, procenjena na osnovu indeksa plastičnosti, bila je specifična za svaki tip analiziranih osobina lista. Antioksidanti i fotosintetički pigmenti ispoljavali su veću fenotipsku plastičnost u odnosu na morfološko-anatomske i fiziološke osobine. Nepostojanje statistički značajnih razlika u plastičnosti većine analiziranih osobina lista, između populacija sa otvorenog i zasenčenog staništa, ukazuje da genotipovi I. pumila različitog porekla „reaguju“ na variranje intenziteta svetlosti formiranjem sličnih, adaptivnih fenotipova, sprečevajući na taj način delovanje lokalne selekcije na fenotipsku plastičnost ispitivanih osobina. Poznato je iz literaturnih podataka da porast intenziteta sredinskog stresa može da dovede do povećanja integrisanosti funkcionalno povezanih osobina ili modula organizama, što je takođe potvrđeno i u slučaju I. pumila. Najveći broj korelacija između analiziranih osobina lista konstatovan je u najnepovoljnijem, letnjem periodu kod biljaka iz obe populacije, odnosno pod uslovima povećanog intenziteta abiotičkog stresa. Broj i veličina koeficijenata fenotipskih korelacija, bili su najveći u grupi osobina koje čine antioksidanti, kao i u grupi osobina vezanih za fotosintetičke pigmente, što navodi na zaključak da bi se ove dve grupe osobina mogle tretirati kao posebni funkcionalni moduli unutar lista. Ključne reči: Iris pumila, SOD, CAT, APX, GR, POD, fenolna jedinjenja, sredinski stres, fenotipska plastičnost, recipročno-transplacioni eksperiment. Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Evoluciona biologija UDK: 575.21:577.151(043.3) 581.1:582.579.2(043.3) Evolutionary ecophysiology of stress: the role of enzymatic and non-enzymatic antioxidants in natural populations of Iris pumila L. (Iridaceae) Abstract In evolutionary biology, environmental stress is defined as a mechanism that leads to adaptation and evolution in a variable environment and includes properties of stress, as an environmental component, and stressed, as the biological component. During the evolution higher plants, as sessile and modular organisms, have developed a number of biochemical, physiological and morpho-anatomical mechanisms that enable them to increase individual fitness under unstable environmental conditions. Short-term, in ecological time scale, plants adjust to varying biotic and abiotic factors in their habitat by phenotype flexibility, which may include all levels of biological organization - from the molecular to the morphological. For natural populations of plants, light is the most heterogeneous abiotic factor, both spatially and temporally, and at the same time, one of the most important environmental resources. In this context, antioxidative enzymes and non-enzymatic antioxidants, as specific biochemical mechanisms, are of grat importance for plants protection against oxidative stress. The aims of this doctoral dissertation were: (I) to investigate the size and patterns of seasonal phenotypic plasticity of biochemical (specific activities of antioxidative enzymes superoxide dismutase - SOD; ascorbate peroxidase – APX, catalase – CAT, gluthatione reductase - GR, class III peroxidase – POD; content of non-enzymatic antioxidants, anthocyanins - Anth and phenolics - Phen), morpho-anatomical (specific leaf area - SLA, stomatal density - SD) and physiological leaf traits (leaf dry matter content - LDMC, leaf water content - LWC, relative leaf water content - RWC, succulence – SU, concentration of photosynthetic pigments: chlorophyll a - Chl a, chlorophyll b - Chl b and carotenoids - Cars) in two I. pumila populations, one inhabiting open site (“Dune” population) and the other one from woodland understory (“Wood” population) in Deliblato sand; (II) testing the local adaptation hypothesis of I.pumila to abiotic conditions at the open and shaded habitat, using reciprocal transplant experiment in nature (III) to determine the variation of degree (relative variance of eigen-value, rVE) and patterns of phenotypic integration (CPC analysis) of functionally linked traits in the I.pumila leaves, induced by heterogeneous environment. The seasonal variation pattern of functional leaf traits of I.pumila from two populations, Dune and Wood, was specific for each trait, as well as for the population tested. Specific activities of antioxidative enzymes and content of non-enzymatic antioxidants were the highest during the most stressful, summer period, with high light intensities, elevated atmospheric temperature and water deficit, in comparison to other seasons, such as spring or autumn. During the whole vegetation period, plants from the Wood population had higher antioxidative enzymes activities than those from the Dune population, while an opposite trend was observed for non-enzymatic antioxidants, especially anthocyanins, whose content was, in general, higher in the leaves of plants from the open habitat. Besides the variation in the activities and contents of antioxidants, a decrease in the chlorophyll concentration was observed in plants from Dune population, which could be a means for regulating reactive oxygen species generation in the chloroplasts of these plants. Testing the adaptability of the biochemical, physiological and morpho- anatomical leaf traits in the I. pumila showed that average values for most of the traits investigated did not differ significantly between the Dune and Wood population, neither in the open nor in the shaded habitat. No statistically significant differences among I. pumila populations at the same habitat implicate there was no genetic differentiation between Dune and Wood populations due to local selection in their light environments. Therefore, as the pattern of variation of tested leaf traits (induced by different intensities of ambient light) increases the performance of I. pumila under the given environmental conditions, this type of phenotypic changes could be defined as adaptive plasticity. The size of light-induced phenotypic plasticity, estimated by the plasticity index, was specific for each type of leaf traits considered. Antioxidants and photosynthetic pigments showed higher phenotypic plasticity compared to morpho-anatomical and physiological traits. The absence of statistical significance in the plasticity of the most of the leaf traits analyzed indicates that I. pumila genotypes of different origin respond to light intensity variation by forming similar, adaptive phenotypes, thus preventing the effect of local selection on phenotypic plasticity of the investigated leaf trait. According to the literature data, increased environmental stress intensity can be followed by an increase in the integrity of functionally related traits or organism modules, which was also confirmed in I.pumila. The highest number of correlation between analyzed leaf traits was obtained in the least favourable, summer period in the plants from both populations, that is, under increased intensity of abiotic stress. The size and number of phenotypic correlation coefficients were the highest in the group of antioxidants, as well as in the group of traits related to photosynthetic pigments, leading to the conclusion that these two groups of traits could be treated as separate leaf functional modules. Key words: Iris pumila, SOD, CAT, APX, GR, POD, natural plant populations, environmental stress, phenotypic plasticity, reciprocal-transplant experiment. Scientific field: Biology Specific scientific field: Evolutionary Biology UDC: 575.21:577.151(043.3) 581.1:582.579.2(043.3) SADRŽAJ: 1 UVOD ................................... 1 1.1 Svetlosna staništa biljaka ...................................................................................... 2 1.2 Sredinski stres ........................................................................................................ 4 1.2.1 Svetlost kao uzročnik stresa ............................................................................... 6 1.3 Odgovor biljaka na sredinski stres ...................................................................... 8 1.4 Fenotipska plastičnost – usaglašavanje biljaka sa heterogenim uslovima staništa ................................................................................................................... 10 1.4.1 Fenotipska integracija – ekološke i evolucione implikacije ........................... 16 1.5 Koncepcija lokalnih adaptacija i način testiranja ............................................ 18 1.6 Mehanizmi antioksidativne zaštite i njihova uloga u odgovoru na stres..... 20 1.6.1 Enzimski mehanizmi antioksidativne zaštite: struktura, funkcija, lokalizacija i regulacija ...................................................................................... 23 1.6.2 Neenzimski mehanizmi antioksidativne zastite ............................................. 28 1.7 Iris pumila L. kao model-organizam .................................................................. 30 2 CILJEVI RADA .................... 33 3 MATERIJAL I METODE ........ 34 3.1 Opis staništa .......................................................................................................... 34 3.2 Eksperimentalni dizajn ....................................................................................... 35 3.2.1 Sezonsko i intraklonalno variranje morfološko-anatomskih i fiziološko-biohemijskih osobina lista I. pumila: in situ eksperimenti ........... 35 3.2.2 Recipročno-transplantacioni eksperiment ...................................................... 37 3.3 Biohemijske metode za analizu biljnog materijala ......................................... 39 3.3.1 Ekstrakcija solubilnih proteina i određivanje specifične aktivnosti antioksidativnih enzima ................................................................................... 39 3.3.2 Merenje aktivnosti antioksidativnih enzima .................................................. 40 3.3.3 Nativna elektroforeza: vizuelizacija aktivnosti i određivanje izoformi antioksidativnih enzima ................................................................................... 42 3.3.4 Ekstrakcija i određivanje ukupne količine neenzimskih antioksidanata - fenola i antocijana ................................................................. 43 3.3.5 Ekstrakcija i merenje koncentracije fotosintetičkih pigmenata ..................... 44 3.3.6 Određivanje oksidativnog oštećenja membrane merenjem količine malondialdehida ............................................................................................... 45 3.4 Merenje morfološko-fizioloških osobina lista ................................................. 46 3.4.1 Merenje specifične površine lista (SLA), sadržaja vode u listu (LWC), sadržaja suve mase lista (LDMC), relativnog sadržaja vode (RWC) i sukulentnosti (SU) ............................................................................................. 46 3.4.2 Određivanje gustine stoma (SD) ...................................................................... 47 3.5 Statističke analize ................................................................................................. 47 3.5.1 Sezonska dinamika morfološko-anatomskih i fiziološko-biohemijskih osobina lista I. pumila ........................................................................................ 47 3.5.2 Recipročno-transplantacioni eksperiment ...................................................... 48 3.5.3 Indeksi fenotipske plastičnosti i integracije .................................................... 50 4 REZULTATI ......................... 52 4.1 Sezonska dinamika osobina lista I. pumila u različitim svetlosnim staništima .............................................................................................................. 52 4.1.1 Sezonska dinamika antioksidanata u različitim svetlosnim stanišima ........ 52 4.1.2 Sezonsko variranje morfološko-anatomskih i fizioloških osobina lista u populacijama I. pumila sa otvorenog i zasenčenog staništa ........................ 69 4.1.3 Kvantifikovanje fenotipske plastičnosti osobina lista I. pumila: unutar-populaciona i među-populaciona sezonska dinamika ..................... 77 4.1.4 Fenotipska integracija lista I. pumila: unutar-populaciono i među-populaciono sezonsko variranje ........................................................... 83 4.2 Recipročno-transplantacioni eksperiment ........................................................ 87 4.2.1 Testiranje hipoteza o lokalnim adaptacijama I. pumila .................................. 87 4.2.2 Fenotipska plastičnost osobina lista I. pumila u dve prirodne populacije sa otvorenog i zasenčenog staništa ............................................... 97 4.2.3 Fenotipska integracija osobina lista I. pumila u dve prirodne populacije sa otvorenog i zasenčenog staništa ............................................. 109 5 DISKUSIJA ........................ 115 5.1 Sezonska dinamika funkcionalnih osobina lista ........................................... 115 5.1.1 Uloga antioksidanata u odgovoru na abiotički stres ................................... 115 5.1.2 Variranje morfoloških i fizioloških osobina lista izazvano nestabilnošću svetlosnih uslova staništa ....................................................... 125 5.2 Lokalne adaptacije na prostorno variranje ekoloških činilaca staništa ...... 130 5.3 Svetlost i fenotip ................................................................................................ 134 5.3.1 Fenotipsko variranje osobina lista u odnosu na sezonsku i prostornu fluktuaciju intenziteta svetlosti: adaptivna ili pasivna plastičnost izazvana stresom? ........................................................................................... 134 5.3.2 Integrisani fenotip - odgovor na sredinski stres ........................................... 139 6 ZAKLJUČCI ....................... 143 7 LITERATURA .................... 146 8 PRILOZI ............................ 175 1 „It is not the strongest of species that survive or the most intelligent but the ones most responsive to change“ Charles R. Darwin (1859) 1 UVOD Prirodna staništa bioloških vrsta čini veliki broj različitih faktora – fizičkih, hemijskih i bioloških – koji, zbog svoje prostorno-vremenske nestabilnosti i različite stope variranja, indukuju kako kratkoročne ili ekološke, tako i dugoročne ili evolucione odgovore organizama. Za sve organizme u načelu, a posebno za one sa sesilnim stilom života kao što su biljke, uspešno usaglašavanje sa neravnomernom raspodelom osnovnih resursa životne sredine, uključujući svetlost, nutrijente i vodu, ali i različite patogene, jedan je od najvećih ekoloških izazova (Stuefer, 1996; Larcher, 1995). Heterogenost životne sredine je opšti termin koji objedinjuje veći broj fenomena i koji se opisuje kroz više aspekata, kao što su skala, kontrast, predvidivost promene i prostorno-vremensko variranje (Wiens, 1976; Kotliar i Wiens, 1990; Stuefer, 1996;). Skala, sa prostornog aspekta, predstavlja meru veličine površine koju karakterišu sredinski faktori određenog kvaliteta, dok se sa vremenskog aspekta odnosi na trajanje delovanja tih faktora. Skala variranja sredinskih faktora se po pravilu definiše u odnosu na način na koji organizmi koriste određeno stanište. Ukoliko je skala sredinskog variranja velika u odnosu na veličinu i disperzionu sposobnost organizma, tj., ukoliko organizmi provode znatno više vremena u jednom nego u drugim staništima, teorijski se očekuje da će se evolucija u takvim populacijama odvijati formiranjem konstitutivnih ili lokalno adaptiranih fenotipova (Levins, 1963; Banta i sar, 2007; Ghalambor i sar, 2007). Nasuprot tome, ukoliko je skala variranja sredinskih faktora mala, odnosno ako organizmi koriste sredinske resurse proporcionalno njihovoj prostorno-vremenskoj zastupljenosti u datom staništu, očekuje se evolucija adaptivne fenotipske plastičnosti, jer omogućuje fino usklađivanje genotipova 2 sa promenom u njihovim mikro-sredinama (Stuefer, 1996; Wijesinghe i Hutchings, 1997; Tucić i sar, 1998; Donohue i sar, 2001; Griffith i Sultan, 2004; Benz i sar, 2007). Vremenska heterogenost životne sredine može biti unutar- generacijska - kada fluktuacije uslova sredine traju kraće od vremena generacije ili među-generacijska - kada se promene odvijaju u vremenskom periodu dužem od vremena generacije. Heterogena staništa čine prostori koje karakterišu sredinski faktori različitog kvaliteta. Stepen razlike između ovih površina se naziva kontrast (Kotliar i Wiens, 1990). Kontrast koji je neophodan za indukciju fenotipskog odgovora jedinke zavisi, pre svega, od načina na koji jedinka koristi određeni sredinski faktor (Stuefer, 1996; Kotliar i Wiens, 1990). Predvidivost je najkompleksniji aspekt heterogenosti životne sredine koja, takođe, igra značajnu ulogu u evoluciji odgovora jedinki na sredinska variranja (Oborny, 1994). Ukoliko je životna sredina varijabilna na predvidiv način, prirodna selekcija će favorizovati adaptivnu fenotipsku plastičnost jedinki date populacije (Scheiner, 1993). 1.1 Svetlosna staništa biljaka Sunčevo elektromagnetno zračenje je primarni izvor energije koji omogućuje promet organske materije i regulaciju temperature i balansa vode na Zemlji, obezbeđujući tako uslove neophodne za opstanak živih organizama (Larcher, 1995; Valladares, 2003). Termin „svetlost“ odnosi se na vidljivi deo spektra (380 - 750 nm) elektromagnetnog zračenja, čiji se opseg znatno širi i kreće od gama zraka (λ < 1 nm) pa sve do radiotalasa (λ > 1 mm) (Larcher, 1995; Valladares, 2003). Više biljke apsorbuju i za fotosintezu koriste samo uski deo spektra, od 400 do 700 nm, koji se naziva fotosintetički aktivno zračenje, PAR (eng. Photsyntheticaly Active Radiation). Iako se ne koriste u procesu fotosinteze, od biološkog značaja su i ultraljubičasto (UV, 290 – 380 nm), kao i infracrveno zračenje (750 – 4000 nm). Međutim, dok UV zračenje ima izrazito 3 fotodestruktivan efekat na organizme, infracrvena i dugotalasna zračenja (4000 - 100000 nm), pored termalnog efekta, regulišu i fotomorfogenetske procese biljaka (Larcher, 1995; McDonald, 2003). Svetlost je jedan od najvarijabilnijih sredinskih resursa, kako u prostornom tako i u vremenskom smislu (Pearcy, 1999; Valladares, 2003). Količina sunčevog zračenja na nekom staništu najviše zavisi od njegove geografske širine i nadmorske visine. Najveća količina zračenja koje dopire do zemljine površine nalazi se u blizini ekvatora, dok ka polovima postepeno opada; na velikim nadmorskim visinama zračenje je takođe intenzivnije, zbog proređne atmosfere, u poređenju sa područjima koja se nalaze na malim nadmorskim visinama (Larcher, 1995). Biljke koje naseljavaju velike geografske širine su izložene visokim intenzitetima UV zračenja i drastičnom variranju fotoperioda, u zavisnosti od sezone. Planinske biljke su takođe izložene visokim intenzitetima svetlosti, ali je u njihovim staništima variranje fotoperioda manje izraženo. Šumska senka i vodena staništa karakteristična su po smanjenom intenzitetu i izmenjenom spektralnom sastavu ambijentalne svetlosti (Larcher, 1995; Nilsen i Orcutt, 1996). Postoje staništa koja se odlikuju visokim i relativno uniformnim intenzitetom svetlosti, kao što su pustinje i planinski vrhovi, ali i druga (npr., šumska senka), koje karakterišu nizak intenzitet i izražena promenljivost količine svetlosti. Količina fotosintetički-aktivne svetlosti (PAR) veoma zavisi od strukture biljne zajednice i može da varira između 50-80% od pune sunčeve svetlosti, u listopadnim šumama tokom perioda bez lišća do 10-15%, u četinarskim šumama, pa i manje od 0.1%, u gustim tropskim šumama. (Valladares, 2003). Zbog ovako izraženog variranja intenziteta svetlosti biljke su razvile brojne anatomske, morfološke, fiziološke i biohemijske mehanizme pomoću kojih obezbeđuju dovoljnu količinu svetlosne energije i smanjuju oštećenja do kojih dovodi višak apsorbovane svetlosti (Nilsen i Orcutt, 1996; Valladares, 2003). 4 1.2 Sredinski stres U naučnoj literaturi, pojam stres (lat. stringere – zategnuti, stegnuti, ograničiti) se definiše na različite načine i koristi u različitim kontekstima. Ovo je razumljivo ako se ima u vidu da definisanje ovog pojma zavisi od oblasti istraživanja (fiziologija, ekologija ili evoluciona biologija), kao i od biološkog nivoa (molekularni, fiziološki, organizamski ili populacioni) na kome se stres istražuje (Bijlsma i Loeschcke, 2005). U ekološkom konteksu, stres se definiše kao značajno odstupanje sredinskih uslova od optimalnih za život organizama. Ono indukuje promene na svim funkcionalnim nivoima organizma, u početku reverzibilne, dok kasnije mogu postati i trajne (Larcher, 1995; Nilsen i Orcutt, 1996, Lambers, Chapin i Pons, 2008). Pošto se pojam stres koristi za označavanje kako sredinskih faktora - užročnika stresa, tako i stanja organizma uzrokovanog stresom, neophodno je razgraničiti pojam stresor, odnosno stimulus koji je izazvao stres od pojma stresiranost, tj. odgovor organizma na delovanje određenog stresora (Larcher, 1995). U fiziologiji pod pojmom stres obuhvaćen je skup sredinskih uslova koji dovode do takvih promena u fiziološkim procesima čiji je rezultat oštećenje biljke. Drugim rečima, stres nastaje kada stresor indukuje dovoljno veliku promenu u fiziološkim procesima koja dovodi do smanjenja rasta, sposobnosti fiziološke aklimatizacije ili prinosa biljaka. Intenzitet stresa nije uvek jednostavno kvantifikovati. Ako je stres niskog intenziteta, čineći uslove životne sredine marginalno suboptimalnim, odgovor biljke može u potpunosti izostati ili će biti neznatan. Međutim, ako stres slabog intenziteta traje duži vremenski period, tj. ako preraste u hroničan stres, promene u fiziologiji biljke biće neizbežne. Stres visokog intenziteta (akutni stres) nastaje usled naglih promena u životnoj sredini, i u kratkom vremenskom periodu može da dovede do dramatičnih fizioloških promena kod biljaka. Zbog različitih efetaka koji ispoljava na funkcionisanje biljnog organizma, u fiziologiji stresa primenjuje se koncepcija doze (engl. dose), koja se definiše kao proizvod intenziteta i trajanja stresa. Tako na primer, odgovor biljaka na hronični stres može biti veoma 5 različit od odgovora na akutni stres, čak i kada su izložena istoj dozi stresa (Nilsen i Orcutt, 1996; Lambers, Chapin i Pons, 2008). U evolucionoj biologiji stres se definiše kao mehanizam koji dovodi do adaptacija i evolucije u promenljivoj sredini, i istovremeno obuhvata svojstva stresora (sredinska komponenta) i stresiranih (biološka komponenta). Zbog toga, sredinski stres i njegov nivo mogu biti definisani samo u odnosu na organizam ili populaciju koja je izložena datom sredinskom faktoru. U tom smislu, stresor je sredinski faktor, dovoljnog intenziteta i trajanja, koji dovodi do promene u biološkom sistemu, delujući ograničavjuće na preživljavanje i/ili reprodukciju (Hoffman i Parsons 1991; Bijlsma i Loeschcke, 2005). Pretpostavlja se da su za neku jedinku ili populaciju najmanje stresni oni uslovi životne sredine kojima je najčešće izložena, dok će nivo stresiranosti jedinke ili populacije, odnosno intenzitet stresa, biti najviši u sredini koja im je nova ili strana (Hoffman i Parsons 1991; Bijlsma i Loeschcke, 2005). Promene u genetičkoj strukturi populacije mogu takođe drastično izmeniti način percepcije sredinskih faktora, dovodeći do tzv. „genetičkog stresa“. Na primer, ukrštanje u srodstvu, u okviru jedne populacije, može dovesti do toga da uobičajena variranja uslova životne sredine postanu stresna za datu populaciju (Bijlsma i sar, 1997; Bijlsma i sar, 2000). Kod biljaka, veliki broj faktora životne sredine može izazvati stres. Stresori se mogu svrstati u tri grupe: fizičke, koji obuhvataju fizičke karakteristike životne sredine (npr. suša, ekstremne temperature, svetlost, vetar, poplave), hemijske, u koje spadaju sva hemijska jedinjenja koja su neuobičajena za datu sredinu (teški metali, pesticidi) ili se nalaze u relativno visokim koncentracijama (pH zemljišta, salinitet) i biološki stresori, koji obuhvataju različite interakcije između živih organizama (kompeticija, herbivori, različiti patogeni) (Nilsen i Orcutt, 1996; Lambers, Chapin i Pons, 2008). U prirodi, na biljke retko deluje samo jedan stresor. Uglavnom se javljaju u kombinacijama od dva ili više stresora, koji mogu imati sinergistički, 6 neutralan ili antagonistički efekat. Na primer, na otvorenim staništima sinergistički deluju visok intenzitet svetlosti, povišena temperatura i suša, dovodeći do pregrevanja listova biljaka. Antagonistički interaguju deficit vode i niske temperature, jer se eksperimentalno pokazalo da biljke izložene suši bolje podnose niske temperature (Nilsen i Orcutt 1996). 1.2.1 Svetlost kao uzročnik stresa Intenzitet, trajanje i spektralni sastav svetlosti su važni faktori životne sredine biljke. Svetlost utiče na svaki aspekt rasta, razvića, diferencijacije i reprodukcije biljaka. Visoki intenzitet, deficit ili neodgovarajući spektralni sastav svetlosti predstavlja stres za biljku (Larcher, 1995; McDonald, 2003). Na primer, tokom izloženosti visokim intenzitetima svetlosti, višak apsorbovane energije koja ne može da se iskoristi u procesu fotosinteze obično dovodi do povećane proizvodnje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), i posledično tome, do oksidativnog stresa. Da bi izbegle fotookstidativna oštećenja biljke su razvile brojne zaštitne mehanizme na svim hijerarhijskim nivoima organizacije (Logan i sar, 1998; Valladares, 2003). Zbog izraženog prostorno-vremenskog variranja svetlosti i velikog značaja koji ima za biljke, aklimatizacija i adaptacija na svetlosne uslove životne sredine su ključni mehanizmi za preživljavanje biljaka u nekom ekosistemu (Larcher, 1995; McDonald, 2003). Prema prilagođenosti na svetlosni režim staništa, razlikuju se biljke sunca i biljke senke (Givnish, 1988; Valladares i sar, 2005). Biljke sunca rastu na staništima koja se odlikuju visokim intenzitetom svetlosti, dok su biljkama senke za rast i reprodukciju neophodna staništa sa niskim intenzitetom svetlosti. Samo mali broj vrsta su isključivo biljke senke ili sunca i najveći broj biljaka može, u određenoj meri, da se prilagodi alternativnim svetlosnim staništima (McDonald, 2003). U odnosu na biljke senke, za biljke sunca karakteristične su visoke vrednosti odnosa između korena i stabla, manji i deblju listovi, kao i deblja kutikula (Evans i Poorter, 2001). Manji i deblji listovi omogućavaju smanjenje 7 energetskog opterećenja izazvanog apsorpcijom prevelike količine svetlosne energije i efikasnije regulisanje temperature lista. Deblja kutikula predstavlja efikasnu zaštitu od UV zračenja i gubitka vode. Takođe, deblji listovi imaju veću površinu mezofila u odnosu na površinu epidermisa, čime se obezbeđuje veći broj hloroplasta po jedinici površine i poboljšava/olakšava difuzija CO2 do hloroplasta (Anderson i Osmond, 1987; Murchie i Horton, 1997; Chen i sar, 2002). Biljke senke povećavaju površinu lista kako bi apsorbovale dovoljnu količinu svetlosne energije. Odlikuju ih tanki listovi sa manje slojeva palisadnog tkiva i većim intercelularnim prostorom, dok su hloroplasti veći i sa izraženim granumom. Biljke senke imaju visok odnos hlorofila i Rubisco proteina, nizak odnos između hlorofila a i hlorofila b, manju provodljivost stoma, nižu tačku kompenzacije fotosinteze, visoku tačku saturacije fotosinteze i nisku stopu respiracije, u poređenju sa listovima sunca (Anderson i Osmond, 1987; Terashima i Hikosaka, 1995; Chow i sar, 2005; Anderson i sar, 2008). Biljke sunca i biljke senke apsorbovanu svetlost prerađuju na različite načine. Iako imaju isti kvantni prinos fotosinteze (inicijalni nagib krive odgovora fotosinteze u zavisnosti od intenziteta svetlosti), glavna razlika između ove dve grupe biljaka je u kapacitetu sistema za sakupljanje svetlosti i transportu elektrona (Lambers, Chapin i Pons, 2008). Biljke sunca imaju veći kapacitet za fotosintetički transport elektrona jer poseduju veću količinu komponenti lanca za transport elektrona, kao što su citohrom i plastokinon. Takođe, ispoljavaju i veći kapacitet za ATP sintezu po jedinici hlorofila, u poređenju sa biljkama senke (Evans i Poorter, 2001; Lambers, Chapin i Pons, 2008). Biljke senke, s druge strane, proizvode veću količinu hlorofila ali imaju manje vrednosti odnosa hlorofila a i b, što znatno povećava njihov kapacitet za sakupljanje svetlosne energije i njen transfer do reakcionih centara fotosistema (Givnish, 1988; Demmig-Adams i Adams, 1992). Međutim, u uslovima visokih intenziteta svetlosti ograničava ih kapacitet za transport elektrona. Nasuprot njima, biljke sunca su veoma efikasne u transportu elektrona ali u uslovima 8 senke ne mogu sakupiti dovoljno svetlosne energije (Boardman, 1977; Osmond i Förster, 2006; Lambers, Chapin i Pons, 2008). 1.3 Odgovor biljaka na sredinski stres U svom životnom okruženju biljke se susreću sa brojnim stresorima, koji mogu delovati pojedinačno ili istovremeno. Na fiziološkom nivou, biljke mogu odgovoriti na stres tolerancijom (eng. tolerance) ili izbegavanjem (eng. avoidance). U prvom slučaju, biljke imaju razvijene mehanizme pomoću kojih održavaju fiziološke procese na istom nivou kao i u odsustvu stresora ili ih neznatno redukuju, npr. biljke mediteranske vegetacije podnose nizak sadržaj vode u listovima (Osmond i sar. 1987; Lambers, Chapin i Pons, 2008). Mehanizam izbegavanja stresa uključuje i redukciju svih metaboličkih aktivnosti, rezultirajući dormantnim stanjem. Ova dva mehanizma nisu međusobno isključena, i mogu se javiti kod iste biljke u zavisnosti od ekoloških uslova (Nilsen i Orcutt, 1996). Posmatrano na vremenskoj skali, možemo razlikovati tri načina odgovora biljaka na stresore (Slika 1.3.1.). Odgovor na stres (eng. stress response) je trenutni štetni efekat stresora na fiziološke procese biljke, koji se javlja u roku od nekoliko sekundi ili dana, dovodeći do redukcije svih metaboličkih procesa; ukoliko biljka ne poseduje mehanizme tolerancije veoma brzo će doći do akutnih oštećenja i senescencije (Lichtenthaler, 1998). Nakon odgovora na stres, kod biljaka koje poseduju mehanizme tolerancije, dolazi do aklimatizacije. Aklimatizacija je skup morfoloških i fizioloških modifikacija kojima biljka kompenzuje negativne efekte nastale tokom inicijalnog odgovora na stres. Do aklimatizacije na novonastale uslove životne sredine dolazi putem promene u aktivnosti ili sintezi novih biohemijskih komponenti, kao što su npr. enzimi. Ove biohemijske promene pokreću prenos signala, dovodeći do promena na svim nivoima, uključujući rast, razviće, kao i fiziologiju i morfologiju cele biljke. Aklimatizacija na stres je proces koji može trajati nekoliko dana ili nedelja, ali se uvek dešava u toku života jedinke, odnosno u ekološkom vremenu. Adaptacija 9 SLIKA 1.3.1. Vremenska skala odgovora biljaka na stres. Trenutni odgovor na stres dovodi do redukcije fizioloških procesa. Aklimatizacijom biljka uspeva da kompenzuje efekat stresa i fiziološki procesi se vraćaju na normalan nivo. Tokom evolucije, populacije se adaptiraju na sredinske stresore, što vraća sve biološke procese na isti nivo kao kod nestresiranih i neadaptiranih biljaka. U prirodnim populacijama, kao posledica aklimatizacije i adaptacije izazvane stresom, dolazi do uspostavljanja kompenzacione homeostaze (prema Lambers, Chapin i Pons, 2008). je, za razliku od aklimatizacije, „odgovor“ biljke na stresne uslove životne sredine nastao kao rezultat promena u genetičkoj strukturi populacije pod delovanjem prirodne selekcije, i odvija se tokom velikog broja generacija, tj. u evolucionoj vremenskoj skali (Lambers, Chapin i Pons, 2008). Pojam adaptacija ima dvostruko značenje: označava proces pomoću kog nastaju adaptacije organizama, ali i samu osobinu, koja predstavlja proizvod tog procesa (Bijlsma i Loeschcke, 2005; Lambers, Chapin i Pons, 2008; Tucić i sar, 2011). U evolucionoj biologiji, adaptacija se definiše kao proces promene organizma ili grupe organizama, tokom kojeg oni stiču nove karakteristike na nivou morfologije, fiziologije ili ponašanja. Ove promene omogućavaju im bolju usaglašenost sa novim uslovima životne sredine, čime su povećani preživljavanje i reproduktivni uspeh organizama u toj životnoj sredini (Bijlsma i Loeschcke, 2005; Stojković i Tucić, 2012), i stoga se nazivaju genetičke ili evolucione adaptacije 10 (David i sar, 2005; Sørensen i sar, 2005). Promene na fenotipskom nivou, mogu da nastanu i kao rezultat sposobnosti jednog genotipa da menja fenotip u zavisnosti od sredinskih uslova, tj. fenotipske plastičnosti, i nazivaju se adaptivna fenotipska plastičnost (Andersen i sar, 2005; Gabriel i sar, 2005). Veličina (eng. amount) fenotipske plastičnosti, kao i obrazac (eng. pattern) plastičnosti, su uslovljeni genetičkom osnovom datog organizama. Mogućnost nastanka adaptacija zavisi od veličine genetičke varijabilnosti populacije, a njena brzina od prisustva mutacija, efekta koji te mutacije imaju na adaptivnu vrednost jedinki date populacije, i intenziteta prirodne selekcije (de Visser i Rozen, 2005; Bijlsma i Loeschcke 2005; Stojković i Tucić, 2012). 1.4 Fenotipska plastičnost – usaglašavanje biljaka sa heterogenim uslovima staništa Jedan od centralnih problema evolucione ekologije je razumevanje evolucije kompleksnih (multivarijantnih) fenotipova u heterogenoj životnoj sredini. Biljke, kao modularni i sesilni organizmi, usaglašavaju se sa variranjem uslova životne sredine pomoću fleksibilnosti odgovora kao što su: praćenje sredinske promene, aklimatizacija i plastičnost (Bazzaz, 1996). Praćenje promene čine kratkotrajne reverzibilne modifikacije koje obezbeđuju usklađivanje fizioloških procesa biljke sa naglim i brzim promenama sredine. Promena provodljivosti stoma izazvana menjanjem raspoložive količine vode, brza aktivacija i deaktivacija Rubisco, u zavisnosti od intenziteta svetlosti, samo su neki od brojnih primera praćenja sredinskih promena (Bazzaz, 1996). Aklimatizacija je sposobnost genotipa da na promene uslova sredine odgovori modifikacijom biohemijskih, fizioloških i morfoloških karakteristika već formiranih modula, dok se plastičnost odnosi na sposobnost jednog genotipa da u različitim sredinama ispolji različite fenotipske vrednosti određene karakteristike (Bazzaz, 1996). Na primer, ako jedan genotip na otvorenom staništu formira listove sunca, a u zasenčenom listove senke, smatra se da je ovaj genotip fenotipski plastičan. Nasuprot tome, ako se listovi neke biljke 11 razvijaju na otvorenom, ali ih tokom vremena zasenče drugi listovi, i kao posledica toga izmene se njihove fiziološke i morfološke karakteristike, smatra se da je došlo do aklimatizacije. Fenotipska plastičnost je jedan od najvažnijih mehanizama kojim se biljke, kao sesilni organizmi, usaglašavaju sa heterogenošću različitih činilaca životne sredine (Bradshaw, 1965; Schlichting, 1989a; Sultan, 2003). Takođe, fenotipska plastičnost je izvor fenotipske varijabilnosti populacije koja može da dovede do adaptivne divergencije, kao i specijacije biljaka (West-Erberhard, 2003). Fenomen fenotipske plastičnosti značajniji je i rasprostranjeniji među biljnim nego među životinjskim vrstama (Niklas, 2009). Biljkama ovaj mehanizam doprinosi povećanju adaptivne vrednosti više nego životinjama iz nekoliko razloga. Prvo, biljke su sedentarni organizmi i tokom životnog ciklusa, koji može biti veoma dug, suočavaju se sa promenama sredinskih uslova bez mogućnosti da ih izbegnu promenom svog staništa. Drugo, za razliku od životinja, sve kopnene biljke se odlikuju izrazito „otvorenom“ ontogenijom, tj. modularnošću, što znači da se različiti moduli produkuju sekvencijalno tokom sezona pa mogu iskusiti različite uslove sredine tokom razvića. I kao treće, karakteristika je svih fotoautotrofnih organizama da putem usklađivanja fizioloških procesa sa uslovima sredine obezbeđuju esencijalne nutrijente i svetlosnu energiju (Niklas, 2009). Biljke pokazuju plastičnost za veliki broj ekološki važnih osobina, uključujući morfološke, fiziološke i anatomske karakteristike, vreme reprodukcije, sistem razmnožavanja i razvojne obrasce potomaka (Sultan, 2000). Plastičnost se može ispoljiti na biohemijskom, fiziološkom, morfološkom, razvojnom ili bihejvioralnom nivou. Svi ovi različiti oblici plastičnosti značajno se razlikuju na osnovu stepena reverzibilnosti. Biohemijski i fiziološki odgovori često nastaju u relativno kratkom vremenskom periodu i reverzibilni su, za razliku od razvojne plastičnosti koja je uglavnom ireverzibilna i za njenu reverzibilnost je potreban zantno duži vremenski period (Pigliucci i sar, 2006). 12 Međutim, nije svaka uočena fenotipska plastičnost adaptivna, tj. ne omogućava nužno povećanje adaptivne vrednosti i reproduktivnog uspeha biljke (van Kleunen i Fischer, 2005), a postoje i primeri maladaptivne plastičnosti (Sánchez-Gómez i sar, 2006; Ghalambor i sar, 2007). Neke osobine su plastične usled neizbežnih ograničenja nametnutih biohemijskom, fiziološkom ili razvojnom biologijom samog organizma (Sultan, 1995) ili su genetički korelisane sa drugim osobinama koje podležu selekciji (Pigliucci i sar, 2006). I pored brojnih primera neadaptivne plastičnosti, rezultati većine recipročno- transplantacionih i „common garden“ eksperimenata pokazuju da su promene osobina biljaka jedne vrste izazvane sredinskim uslovima mnogo češće posledica plastičnosti nego genetičke diferencijacije, što potvrđuje značaj fenotipske varijabilnosti (Niklas, 2009). Evolutivni značaj fenotipske plastičnosti proizilazi iz načina na koji plastičnost može da modulira efekte prirodne selekcije (Sultan, 1987). Fenotipska plastičnost može da onemogući genetičku diferencijaciju populacije na lokalne uslove sredine omogućavanjem adaptivne diverzifikacije fenotipova pojedinačnih genotipova. Takođe, plastičnost održava genetičku varijabilnosti pod uslovima uniformnog selekcionog pritiska, tako što omogućava različitim genotipovima da konvergiraju u isti adaptivni fenotip. Adaptivna fenotipska plastičnost je specifičan tip interakcije genotipa i sredine koji smanjuje precizno podudaranje genotipova i sredinskih uslova, a prikazuje se pomoću normi reakcije (Sultan i Bazzaz, 1993; DeWitt i Scheiner, 2004). Za bilo koju fenotipsku osobinu, svaki genotip ispoljava karakterističan odgovor u različitim sredinama, što se ogleda u različitim normama reakcija (Schmalhausen, 1949; DeWitt i Scheiner, 2004). Na Slici 1.4.1. prikazani su različiti obrasci normi reakcija dva genotipa analizirana u dve stredine. Odsustvo nagiba normi reakcije ukazuje na nepostojanje plastičnosti (Slika 1.4.1, A). Paralelne norme reakcija, sa izraženim nagibom (Slika 1.4.1, B) ukazuju na postojanje plastičnostii genetičke varijabilnosti za posmatranu osobinu, ali bez interakcije između genotipa i sredine. Različiti nagibi normi reakcije (Slika 1.4.1, C) 13 SLIKA 1.4.1. Različiti obrasci normi reakcija. Prikazane su srednje vrednosti fenotipskih osobina dva genotipa u dve različite sredine, 1 i 2. Na panelima A – D masnim slovima su označene G - genetička i E - sredinska varijansa, kao i GxE - varijansa zbog interakcije između genotipa i sredine (prema DeWitt i Scheiner, 2004). ukazuju na genetičku varijabilnost za plastičnost, tj. postojanje interakcije između genotipa i sredine, kao i na uticaj sredine na fenotipsku vrednost date osobine. Slika 1.4.1, D ilustruje primer kada genotipovi imaju različite odgovore na sredinske uslove iako se prosečne vrednosti osobine između populacija ne razlikuju. U ovom slučaju postoji značajna interakcija između genotipa i sredine ali ne i efekat genotipa na srednju vrednost date osobine. Pošto se jedinke populacije genetički razlikuju u stepenu plastičnosti ovakav obrazac normi 14 reakcija može dovesti do evolucije plastičnosti, tj. diferencijacije populacije između različitih staništa koja je izazvana selekcijom, ali pod uslovom da odsustvuje protok gena (Sultan, 2007; DeWitt i Scheiner, 2004). Populacije biljnih vrsta mogu da ispolje velike razlike u sposobnosti plastičnog odgovora na promenu uslova životne sredine. Ove razlike u plastičnosti su posledica ekološkog i unutrašnjeg limita (Slika 1.4.2.). Termin limit obuhvata ograničenja koja onemogućavaju maksimalnu plastičnost, i cenu plastičnosti, koja se odnosi na takve vrednosti fenotipskih odgovora koji ne doprinose ili čak imaju negativne efekte na adaptivnu vrednost datog organizma (DeWitt i sar, 1998; van Kleunen i Fischer, 2005; Valladares i sar, 2007). Razlika između ograničenja i cene plastičnosti najlakše se uočava na primeru poređenja fenotipa dva biljna organizma i njihove adaptivne vrednosti, u slučaju kada je genotip jednog od njih plastičan, a drugog fiksan, odnosno kada se odlikuje kanalisanim razvićem. O ceni plastičnosti govorimo kada oba biljna organizma formiraju listove iste debljine i veličine u posmatranoj svetlosnoj sredini, ali onaj koji plastično odgovara na različite sredine, ima nižu stopu reprodukcije u posmatranoj sredini. Ograničenjem plastičnosti se smatra pojava da fenotipski plastični biljni organizam, u posmatranoj svetlosnoj sredini, ne dostiže favorizovanu veličinu i debljinu lista, za razliku od onog sa kanalisanim razvićem (DeWitt i sar, 1998; Valladares i sar, 2007). Cena plastičnosti je najčešće posledica cene proizvodnje i održavanja fenotipskih karakteristika nastalih pod uticajem sredine, cene pribavljanja informacija o promenama sredinskih faktora, razvojne nestabilnost fenotipskih osobina nastale usled delovanaja sredine i genetičke cene. Genetička cena može biti izazvana vezanošću gena, tj. tendencijom gena da se nasleđuju zajedno zbog iste lokacije na hromozomu (npr. geni koji doprinose plastičnosti mogu biti povezani sa genima koji u datoj sredini dovode do redukcije adaptivne vrednosti), plejotropijom, jer jedan gen ima uticaja na nekoliko nepovezanih aspekata fenotipa (geni koji doprinose plastičnosti mogu negativno delovati na 15 neke druge osobine) ili epistazom, koja dovodi do maskiranja fenotipskogefekta jednog alela dejstvom drugog alela (DeWitt i sar, 1998; Valladares i sar, 2007). U ograničenja plastičnosti spadaju: niska pouzdanost informacije o promenama u sredini, period koji je neophodan da se nakon percepcije promene formira fenotipska osobina i ograničenje raspona razvića, tj. sposobnost fiksnog genotipa da proizvede ekstremne fenotipe. Cena i ograničenja plastičnosti variraju u intenzitetu u zavisnosti od uslova sredine, ali imaju većeg uticaja u stresnom okruženju organizma (DeWitt i sar, 1998; Steinger i sar, 2003; Valladares i sar, 2007). SLIKA 1.4.2. Unutrašnji i spoljašnji (ekološki) faktori koji utiču na kapacitet biljke da odgovori plastično na neki od sredinskih faktora (prema Valladares i sar, 2007). 16 1.4.1 Fenotipska integracija – ekološke i evolucione implikacije U poslednje vreme postoji saglasnost među evolucionim biolozima u odnosu na koncepciju fenotipske integracije i koncepciju modularnog variranja oblika organizma, ali takođe i o modularnosti, za koju se smatra da je preduslov evolucije složenih adaptacija (Mitteroecker i Bookstein, 2007). Do nedavno se čak smatralo da su ove dve koncepcije međusobno ekvivalentne, pošto oba fenomena utiču na obrazac variranja i kovariranja pojedinačnih osobina određenog organizma (Armbruster i sar, 2004; Klingerberg, 2008). Međutim, detaljnim razmatranjem oba fenomena otkriveno je da se modularnost odnosi na sposobnost (eksperimentalnog) razdvajanja (eng. dissociability) ontogenetskih, funkcionalnih i evolucionih procesa, dok bi fenotipska integrcija označavala „razgradnju (eng. decomposition) morfoloških osobina u zavisnosti od njihove (fenotipske) kovarijanse, koje bi se zatim poredile između adultnih jedinki određenog taksona ili između više različitih taksona“ (Mitteroecker i Bookstein, 2007). Prema datoj definiciji, biološki modul bio bi određeni biološki entitet (struktura, proces, ili put) unutar koga su osobine snažno integrisane, a koji je relativno nezavisan od sličnih entiteta istog organizma (Bolker, 2000; Magwene, 2006; Klingenberg, 2008). Osobine se, na osnovu funkcionalne grupisanosti, mogu posmatrati kao integrisane ili neintegrisane (Wagner, 2001; Pigliucci i Preston, 2004). Integrisane osobine su uzajamno visoko korelisane usled zajedničke genetičke osnove, razvojnog puta i/ili slične funkcije (Pigliucci, 2003). Nasuprot tome, neintegrisane osobine su funkcionalno i razvojno nezavisne jedne od drugih (Wagner, 2001). Interakcija između osobina može se menjati tokom razvića i u zavisnosti od sredinskih faktora (Murren, 2002). Fenotipsku integraciju određuju intenzitet i obrazac korelacija između fenotipskih osobina (Schlichting i Pigliucci, 1998; Pigliucci i Preston, 2004; Pavlicev i sar, 2009). Ova koncepcija se zasniva na ideji da u okviru skupa fenotipskih osobina postoje podskupovi osobina koji se odlikuju visokim stepenom fenotipskih korelacija, dok je korelisanost između karaktera različitih podskupova nizak (Mitteroecker i 17 Bookstein, 2007). Integracija se uvek meri na nivou funkcionalnih grupa osobina ili modula jednog organizma (a ne na nivou organizma), pri čemu su neke grupe osobina manje ili više integrisane (Pigliucci, 2003). Stepen u kom osobine čine integrisanu jedinicu može imati dve implikacije na evoluciju i adaptacije kompleksnog fenotipa. Kao prvo, delovanje stabilizacione selekcije na integrisane osobine olakšaće razvijanje genetičkih korelacija, konzistentnih sa njihovom već postojećom funkcionalnom povezanošću. Ovo omogućava da se na osnovu obrazaca fenotipske integracije može ustanoviti koji tip selekcije je oblikovao fenotip. Kao drugo, poznavanje integracije osobina omogućava predviđanje kapaciteta kompleksnog fenotipa da se prilagodi uslovima nove sredine (Lande i Arnold, 1983; Wagner, 2001; Pigliucci i Preston, 2004; Mallit i sar, 2010). Fenotipska integracija može biti rezultat adaptivnih procesa jer umanjuje sredinsku varijansu, odnosno smanjuje uticaj sredine na grupe osobina složenog fenotipa. Međutim, integrisanost osobina koja je posledica stabilnih razvojnih procesa, značajno umanjuje raspoloživu genetičku varijansu i tako ograničava kapacitet kompleksne strukture organizma da odgovori na selekciju (Arnold, 1992; Mallit i sar, 2010). 18 1.5 Koncepcija lokalnih adaptacija i način testiranja Biljke koje naseljavaju prostorno heterogena staništa često se nalaze pod različitim selekcionim pritiskom koji, ukoliko dovoljno dugo traje, može dovesti do nastanka adaptacija na lokalne uslove staništa, tj. do diferenciranja različitih ekotipova (Kawecki i Ebert, 2004; Ramírez-Valiente i sar, 2010). U odsustvu drugih evolucionih mehanizama, ovakva divergentna selekcija dovodi do evolucije funkcionalnih osobina kod svake lokalne populacije (deme) koja im obezbeđuje prednost pod lokalnim ekološkim uslovima, bez obzira na posledice koje izmenjene osobine mogu imati na adaptivnu vrednost populacije u drugim staništima. Kao rezultat ovog procesa koji se naziva lokalna adaptacija, genotipovi svake deme imaju veće adaptivne vrednosti na lokalnom staništu, u poređenju sa genotipovima iz drugih staništa (Williams, 1966; Kawecki i Ebert, 2004). Prema Kawecki i Ebert (2004) termin „lokalna adaptacija“ obuhvata obrazac i proces adaptacija koji se odvijaju u okviru populacija između kojih postoji protok gena, što kod biljaka prevashodno obuhvata disperziju polena i semena, čime se ističe istovremeno delovanje dva suprotna evoluciona mehanizma: divergentne selekcije i protoka gena. Lokalne adaptacije nisu nužno odgovor populacija na varijabilne uslove staništa jer mogu biti ograničene ili sprečene delovanjem drugih evolucionih mehanizama, kao što su: protok gena, genetički drift, nedostatak genetičke varijabilnosti ili genetičkom osnovom funkcionalnih osobina. Preduslov za nastanak lokalnih adaptacija je postojanje interakcije između genotipa i sredine u odnosu na adaptivnu vrednost i dovoljno velika genetička varijabilnost na koju prirodna selekcija može da deluje (Kawecki i Ebert, 2004; Dorman i sar, 2009). Osim toga, prostorno variranje intenziteta selekcije mora biti veće od vremenskog variranja i u skladu sa tom tvrdnjom brojni teorijski i eksperimentalni podaci su pokazali da vremensko variranje u intenzitetu selekcije favorizuje fenotipski plastične genotipove, generaliste (Gillespie, 1974; Kassen, 2002; Dorman i sar, 2009). Kada je plastičnost adaptivna, ona doprinosi održavanju visoke adaptivne vrednosti genotipova pod različitim ekološkim 19 uslovima i time onemogućava genetičku diferencijaciju populacija. Međutim, ukoliko je fenotipska plastičnost ograničena ili je cena plastičnosti visoka, u sredinama koje favorizuju alternativne fenotipove doći će do diferencijacije na lokalno specijalizovane ekotipove (Sultan i Spencer, 2002). Postojanje lokalnih adaptacija se može utvrditi poređenjem normi reakcije za funkcionalne osobine ili komponente adaptivne vrednosti istih genotipova u više sredina (Pigliucci, 2001). Za detektovanje lokalnih adaptacija koriste se dva tipa eksperimenata: recipročno-transplantacioni i ‚‚common-garden“ eksperiment (Kawecki i Ebert, 2004). U recipročno- transplantacionom eksperimentu testiraju se performanse genotipova u svojim prirodnim staništima i staništima nativnim za druge genotipove, odnosno između nativnih i transplantiranih genotipova u istom staništu. Pošto se izvodi u prirodi, ovaj tip eksperimenta je najpogodniji za testiranje lokalnih adaptacija jer su svi ekološki činioci različitih staništa neizmenjeni. Glavni nedostatak recipročno-transplantacionog eksperimenta je njegova neizvodljivost iz praktičnih razloga (Kawecki i Ebert, 2004; Dorman i sar, 2009). Alternativno rešenje predstavlja ‚‚common-garden“ eksperiment, u kome se najvažnija svojstva različitih staništa rekonstruišu u laboratorijskim uslovima i zatim se svi genotipovi testiraju pod različitim tretmanima ispitivanog faktora staništa. Pored praktičnosti ovakvog pristupa, prednost ‚‚common-garden“ eksperimenta je što omogućava direktno ispitivanje uloge određenog faktora sredine kao uzročnika divergentne selekcije koja dovodi do nastanka lokalnih adaptacija. Međutim, ukoliko se testira hipoteza o uticaju samo jednog faktora staništa ili se izostavi neki važan aspekt sredine, rezultati eksperimenta neće dati realnu sliku o procesu adaptacija koji se odvija u prirodi (Kawecki i Ebert, 2004; Dorman i sar, 2009). Na primer, jedan genotip može imati veću adaptivnu vrednost u svim tretmanima, u poređenju sa drugim genotipovima, jer je bolje prilagođen laboratorijskim uslovima; ili biljke sa staništa sa višom temperaturom, koje više resursa ulažu u odbranu od herbivora, mogu imati 20 manji broj semena na svim temperaturama, ukoliko se eksperiment izvodi u odsustvu herbivora (Kawecki i Ebert, 2004). 1.6 Mehanizmi antioksidativne zaštite i njihova uloga u odgovoru na stres Reaktivne vrste kiseonika (ROS – eng. Reactive Oxygen Species) su delimično redukovane forme atmosferskog kiseonika. Formiraju se ili ekscitacijom O2, pri čemu nastaje singletni kiseonik (1O2), ili sukcesivnim monovalentnim redukcijama tokom kojih nastaju superoksid (·O2-), hidrogen peroksid (H2O2), i hidroksil radikal (OH-). Za razliku od atmosferskog kiseonika, ROS mogu nerestriktivno oksidovati različite biomolekule i tako izazvati oštećenje ćelije (Mittler, 2002; Apel i Hirt, 2004). Zbog velike reaktivnosti prema svim ćelijskim komponentama, ROS se, generalno, smatraju štetnim sporednim produktima aerobnog metabolizma, čija produkcija bi trebalo da se po svaku cenu umanji ili onemogući. Međutim, danas je poznato da su ROS veoma moćni signalni molekuli koji regulišu brojne biološke procese kao što su rast, ćelijski ciklus, ćelijska programirana smrt i aklimatizacioni odgovor na abiotički i biotički stres (Dat i sar, 2000; Mittler, 2002; Apel i Hirt, 2004; Desikan i sar, 2005; Gechev i sar, 2006; Foyer i Shigeoka, 2011). Naročito je važna produkcija ROS indukovana svetlošću, jer obezbeđuje biljnoj ćeliji esencijalnu informaciju o neravnoteži između procesa proizvodnje i procesa potrošnje energije (Foyer i Shigeoka, 2011). Zbog dvostruke uloge koju ROS imaju u biljnoj ćeliji, kao veoma reaktivne toksične vrste i kao signalni molekuli, neophodna je precizna regulacija njihovog nastanka i razgradnje (Tabela 1.6.1.). Mehanizmi koji omogućavaju smanjenje proizvodnje ROS tokom stresa uključuju: anatomske adaptacije (pokreti listova, različite zaštitne epidermalne stukture ili zaštita stoma u specifičnim strukturama), fiziološke adaptacije (C4 i CAM metabolizam) i molekularne mehanizme koji omogućavaju rearanžman fotosintetskog aparata u skladu sa dostupnom količinom svetlosti ili potpunu 21 supresiju fotosinteze (Mooney i sar, 1977; Coupe i sar, 2006; Mittler, 2006; Miyazawa i sar, 2006; Lambers, Chapin i Pons, 2008). Mehanizmi koji omogućavaju aktivno uklanjanje ROS sastoji se iz enzimske i neenzimske komponente (Mittler, 2002; Mittler, 2006). U enzimske mehanizme spadaju: superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), askorbat peroksidaza (APX), glutation reduktaza (GR), peroksidaze III klase (POD), monodehidroaskorbat reduktaza (MDHAR), dehidroaskorbat reduktaza (DHAR), glutation peroksidaza (GPX) i glutation S-transferaza. Neenzimsku komponentu čine: askorbat, glutation, α-tokoferol, karotenoidi i fenolna jedinjenja (Mittler, 2002; Apel i Hirt, 2004; Grace, 2005). 22 TABELA 1.6.1. Mehanizmi proizvodnje, uklanjanja i izbegavanja ROS kod biljaka (prema Mittler, 2002). Mehanizam Lokacija ROS Proizvodnja Fotosintetski ET, PSI, PSII Chl ·O2- Ekscitovani hlorofil Chl 1O2 Mitohondrijski ET Mit ·O2- Glikolat oksidaza Per H2O2 NADPH oksidaza Chl ·O2- β-oksidacije masnih kiselina Per H2O2 Oksalat oksidaza Apo H2O2 Xantin oksidaza Per ·O2- Peroksidaze III klase CW H2O2, ·O2- Amin oksidaza Apo H2O2 Uklanjanje Superoksid dismutaza Chl, Cyt, Mit, Per, Apo ·O2- Askorbat peroksidaza Chl, Cyt, Mit, Per, Apo H2O2 Katalaza Per H2O2 Glutation peroksidaza Cyt H2O2, ROOH Peroksidaze III klase CW, Cyt, Mit H2O2 Tioredoksin peroksidaza Chl, Cyt, Mit H2O2 Askorbinska kiselina Chl, Cyt, Mit, Per, Apo H2O2, ·O2- Glutation Chl, Cyt, Mit, Per, Apo H2O2 α-tokoferol Membrane ROOH, 1O2 Karotenoidi Chl 1O2 Izbegavanje Anatomske adaptacije List, epidermis 1O2, H2O2, ·O2- C4 ili CAM metabolizam Chl, Cyt, Vac H2O2, ·O2- Pokreti hloroplasta Cyt 1O2, H2O2, ·O2- Supresija fotosinteze Chl H2O2, ·O2- Modifikacije PS Chl 1O2, ·O2- Alternativne oksidaze Chl, Mit ·O2- Skraćenice: Apo, apoplast; Chl, hloroplast; CW, ćelijski zid; Cyt, citoplazma, ET, transport elektrona; Mit, mitohondrije; Per, peroksizom; PM, plazma membrana; PS, fotosistem; Vac, vakuola. 23 1.6.1 Enzimski mehanizmi antioksidativne zaštite: struktura, funkcija, lokalizacija i regulacija Biljke aktivno proizvode ROS kao signalne molekule koji učestvuju u regulaciji odgovora na abiotički stres, programiranu ćelijsku smrt i odbranu od patogena. Kako bi održale delikatnu ravnotežu u produkciji ROS, koji imaju signalnu ulogu, i uklanjanju viška ROS, koji nastaju kao posledica oksidativnog stresa, biljke su razvile složenu mrežu antioksidativnih enzima (Slika 1.6.1). Najznačajniji antioksidativni enzimi su: SOD, CAT, APX, GR i POD (Mittler, 2002; Suzuki i Mittler, 2006; Foyer i Shigeoka, 2011). SLIKA 1.6.1. Uloga ROS i antioksidanata u regulaciji redoks-homeostaze ćelije tokom odgovora na stres. Povećana oksidacija dovodi do programirane ćelijske smrti (A) ili povećane otpornosti na stres (B), u zavisnosti od intenziteta signala i prirode signalnog puta koji se aktivira (prema Foyer i Shigeoka, 2011). 24 Tokom delovanaj abiotičkog i biotičkog stresa dolazi do akumulacije ROS, ali se ćelijski odeljci u kojima se formiraju ROS, kao i dinamika nastanka i razgradnje ROS veoma razlikuju. U toku trajanja stresa, povećana količina ROS u ćeliji ne mora biti samo simptom disfunkcionalnosti ćelije, već predstavlja signal koji pokreće odgovor na stres i prilagođava ćelisku mašineriju na izmenjene uslove staništa. ROS moduliraju brojne puteve prenosa signala, kao što su kaskadna transdukcija signala regulisana proteinskim kinazama koje aktivira mitogen i aktivnost transkripcionih faktora (Suzuki i Mittler, 2006; Jaspers i Kangasjärvi, 2010; Foyer i Shigeoka, 2011). 1.6.1.1 Superoksid dismutaza Superoksid dismutaza (SOD, EC 1.15.1.1) je metaloenzim koji predstavlja prvu liniju odbrane od toksičnih efekata povišenog nivoa ROS (Scandalios, 1993). SOD katalizuje dismutaciju ·O2- pri čemu nastaju H2O2 i O2: ·O2- + ·O2- + 2H+ → 2H2O2 + O2; Uklanjanjem ·O2- SOD umanjuje mogućnost nastanka ·OH putem Haber- Weiss reakcije koja je katalizovana metalima. Na osnovu metala koji sadrži kofaktor SOD se dele na tri forme: Cu/Zn-SOD, Fe-SOD i Mn-SOD. Kod viših biljaka Cu/Zn-SOD i Fe-SOD su dimeri, dok je Mn-SOD tetramer (Bowler i sar, 1994; Alscher i sar, 2002). Mn-SOD se nalazi u mitohondrijama i peroksizomima, Cu/Zn-SOD je karakteristična za citoplazmu i hloroplaste, dok se Fe-SOD nalazi u hloroplastima ali nije univerzalno prisutan kod svih viših biljaka. Sva tri tipa SOD su proteini kodirani jedarnim genima i mogu se identifikovati na osnovu osetljivosti prema inhibitorima KCN i H2O2. Mn-SOD je otporan na oba inhibitora, Cu/Zn-SOD je osetljiv na oba inhibitora, dok je Fe-SOD osetljiv na H2O2 i otporan na KCN. Zastupljenost SOD u skoro svim ćelijskim odeljcima je neophodna zbog nepropustljivosti fosfolipidnih membrana za superoksid (Takahashi i Asada, 1983). SOD je prisutna kod svih aerobnih organizama i smatra se da ima centralnu ulogu u zaštiti od oksidativnog stresa (Scandalios, 1993; Bowler i sar, 1994; Alscher i sar, 2002). Na 25 osnovu poređenja sekvenci aminokiselina, smatra se da Mn-SOD i Fe-SOD imaju slično poreklo i da su nastale mnogo pre Cu/Zn-SOD, koja je evoluirala nezavisno kod eukariota (Kanematsu i Asada, 1990). Do danas, brojne studije su pokazale da se aktivnost SOD povećava kao odgovor na različite stresore (visok intenzitet svetlosti, suša, parakvat, teški metali). 1.6.1.2 Askorbat peroksidaza Superfamilija peroksidaza deli se na tri klase. Zajedničko za sve tri klase je postojanje hem grupe koju čine protoporfirin IX i Fe3+, kao i slična trodimenzionalna struktura (Welinder i sar, 2002). Peroksidaze klase I, u koje spada i askorbat peroksidaza, prisutne su kod svih organizama izuzev životinja, i njihova osnovna uloga je detoksifikacija H2O2 (Passardi i sar, 2007). Klasa II peroksidaza karakteristična je za gljive. Peroksidaze III klase (POD, EC 1.11.1.7), glikoproteini koji sadrže hem grupu, prisutne su kao velike multigenske familije kod svih terestričnih biljaka. Askorbat peroksidaza (APX, EC 1.11.1.11) ima ključnu ulogu u finoj modulaciji količine H2O2 kod biljaka, za razliku od katalaze koja uklanja višak H2O2 tokom stresa (Mittler, 2002). Ova peroksidaza uklanja H2O2 koristeći askorbat (Asc) kao donor elektrona, pri čemu nastaje dehidroaskorbat (DHA): H2O2 + Asc → 2H2O + DHA; Askorbat peroksidaza je veoma osetljiva na smanjenu koncentraciju Asc. Na primer, ukoliko je koncentracija askorbata manja od 20 µM izoforme APX karakteristične za hloroplaste brzo gube aktivnost (Mittler i Zilinskas, 1993; Shigeoka i sar, 2002; Foyer i Shigeoka, 2011). Postoji najmanje pet izoformi APX koje se nalaze u različitim ćelijskim odeljcima, citoplazmi, membrani tilakoida, stromi hloroplasta i membrani peroksizoma (Scandalios, 1993; Asada, 1999; Logan i sar, 2006). Izoforme APX razlikuju se po molekulskoj težini, optimalnoj pH, stabilnosti i specifičnosti za supstrate. Do povećane ekspresije gena koji kodiraju askorbat peroksidaze dolazi u uslovima stresa kao što su mehaničke 26 povrede, patogeni, zračenje, vodni deficit, atmosfersko zagađenje i toksični efekti metala (Mittler i Poulos, 2005; Logan i sar, 2006). 1.6.1.3 Katalaza Katalaza (CAT, EC 1.11.1.6) je tetramerni enzim koji sadrži hem kao kofaktor i vrši uklanjanje H2O2 iz ćelije: 2H2O2 → H2O + O2; Ovaj enzim predominantno se nalazi u peroksizomima i učestvuje u razgradnji H2O2 koji nastaje tokom glioksalatnog ciklusa fotorespiracije, katabolizma purina i kao posledica aktivnosti oksidaza uključenih u β–oksidaciju masnih kiselina (Willekens i sar, 1997; Feierabend, 2005; Engel i sar, 2006). CAT ima veoma nizak afinitet prema H2O2 (u mM opsegu) i veliku brzinu reakcije (Mittler, 2002; Engel i sar, 2006). CAT je veoma fotosenzitivan enzim i ima visoku stopu sinteze i razgradnje slično kao i D1 protein fotosistema II (Hertwig i sar, 1992; Feierabend, 2005). Zbog toga stresni uslovi koji dovode do smanjene sinteze proteina kao što su osmotski stres, visoke i niske temperature dovode do smanjenja aktivnosti CAT. Dosadašnja istraživanja su utvrdila postojanje tri klase CAT, koje su kodirane različitim genima kod viših biljaka. Prema podeli koju su predložili Willekens i sar (1995) klasu I čine katalaze koje se eksprimiraju u fotosintetičkim tkivima, CAT klase II su aktivne u vaskularnim tkivima, dok su CAT klase III specifične za reproduktivna tkiva i semena (Mhamdi i sar, 2010; Hu i sar, 2010). 1.6.1.4 Glutation reduktaza Glutation reduktaza (GR, EC 1.6.4.2) je po strukturi homodimerni flavoprotein. Ova oksidoreduktaza zastupljena je i kod prokariota i eukariota (Edwards i sar, 1990; Lascano i sar, 2003). Spada u enzime askorbat-glutation ciklusa. Ima ključnu ulogu u održavanju količine redukovanog glutationa (GSH) i na taj način reguliše redoks status ćelije. GR katalizuje redukciju oksidovanog glutationa zavisnu od NADPH: GSSG + NADPH → 2GSH + NADP+; 27 Ovaj enzim se predominantno nalazi u hloroplastima ali su poznate i mitohondrijalne i citosolne izoforme (Creissen i sar, 1995; Chew i sar, 2003; Lascano i sar, 2003). 1.6.1.5 Peroksidaze III klase Peroksidaze III klase (POD, EC 1.11.1.7) su glikoproteini koji kod terestričnih biljaka čine veliku multigensku familiju. Smatra se da su imale važnu ulogu u kolonizaciji kopnenih staništa, preko formiranja rigidnih potpornih struktura, i u adaptaciji na sredinu obogaćenu kiseonikom (Passardi i sar, 2004; Cosio i Dunand, 2009). Nalaze se u vakuolama, ćelijskom zidu i endoplazmatičnom retikulumu i odlikuje ih visoka termalna stabilnost (Takahama i Egashira, 1991; Passardi i sar, 2005). Peroksidaze klase III katalizuju redukciju H2O2, a kao donore elektrona mogu da koriste različite supstrate, kao što su fenolna jedinjenja, prekursori lignina i auksin (Takahama i Oniki, 1997; Hiraga i sar, 2001; De Gara, 2004; Passardi i sar, 2005). Takođe, dovode i do produkcije H2O2 putem oksidacije NADH tokom oksidativnog praska i izduživanja ćelije (Otter i Polle, 1997; Passardi i sar, 2005; Cosio i Dunand, 2009). Kod viših biljaka POD imaju višestruku ulogu. Učestvuju u metabolizmu ćelijskog zida, rastu ćelija, detoksifikaciji H2O2, katabolizmu auksina, oksidaciji toksičnih jedinjenja, zaštiti od patogena, mehaničkih povreda i oksidativnog stresa, simbiozi i senescenciji (Passardi i sar, 2005; Cosio i Dunand, 2009). Raznovrsnost procesa koje katalizuju peroksidaze III klase kao i veliki broj gena koji ih kodira ukazuju na postojanje funkcionalne specijalizacije ovog enzima, što potvrđuje činjenica da sekvence peroksidaza imaju i konzervativne i varijabilne regione (Welinder i sar, 2002; Cosio i Dunand, 2009). 28 1.6.2 Neenzimski mehanizmi antioksidativne zaštite Oksidacione reakcije su osnova metaboličkih procesa ali istovremeno mogu dovesti do oštećenja ćelija, zbog čega su biljke razvile veliki broj različitih neenzimskih antioksidanata koji se još nazivaju i antioksidanti male molekulske mase. Neenzimski antioksidanti se dele na dve grupe: hidrofilne i hidrofobne. Hidrofilni antioksidanti (glutation, askorbinska kiselina i fenolna jedinjenja) su rastvorljivi u vodi i omogućavaju uklanjanje reaktivnih vrsta kiseonika u citosolu biljne ćelije. Hidrofobni antioksidanti (tokoferoli i karotenoidi) su rastvorljivi u lipidima i štite ćelijske membrane od oksidativnih oštećenja (Noctor i Foyer, 1998; Dias i sar, 2011; Foyer i Shigeoka, 2011). Biljke proizvode veliki broj organskih jedinjenja, tzv. sekundarnih metabolita, koja ne učestvuju direktno u rastu i razviću, ali posreduju u interakcijama između biljaka i njihove životne sredine i značajno doprinose otpornosti biljaka na nepovoljne sredinske uslove. Takođe, utvrđeno je da neka od ovih jedinjenja imaju antioksidativna svojstva, tj. mogu učestvovati, direktno ili posredno, u zaštiti biljaka od reaktivnih vrsta kiseonika. Na osnovu biosintetskog puta, sekundarni metaboliti se dele na: alkaloide, terpenoide i fenolna jedinjenja. Glavne grupe fenolnih jedinjenja su: hidroksicinamične kiseline, flavonoidi, antocijani i tanini. Najveći procenat fenolnih jedinjenja čine strukturni polimeri, kao što su lignin i suberin, koji obezbeđuju mehaničku potporu biljkama. Funkcija nesrukturnih fenolnih jedinjenja je manje očigledna, ali sve je više studija koje ukazuju na njihovu važnu ulogu u aklimatizaciji biljaka na stresne uslove sredine (Sakihama i sar, 2002; Grace, 2005; Li i sar, 2006). 1.6.2.1 Fenolna jedinjenja kao antioksidanti Terminom fenolna jedinjenja (eng. phenolics, polyphenols, phenolic compounds) označavaju se sva hemijska jedinjenja koja sadrže najmanje jedan aromatični ugljovodonični prsten za koji je vezana jedna ili više hidroksilnih grupa (Sakihama i sar, 2002). Kod biljaka, solubilna fenolna jedinjenja su jedna 29 od najzastupljenijih i najraznovrsnijih grupa supstanci koja po strukturi variraju od malih, relativno jednostavnih molekula (npr. salicilna kiselina) do složenih polimera kao što su suberin i lignin (Sakihama i sar, 2002; Grace, 2005; Li i sar, 2006). Spadaju u neenzimske antioksidante i veoma su važni za očuvanje fizioloških funkcija biljke tokom stresnih ekoloških uslova sredine (Grace, 2005). Poznato je da fenolna jedinjenja predstavljaju glavnu zaštitu biljaka od patogena, ali su novija istraživanja pokazala da imaju podjednako važnu ulogu i u sprečavanju štetnih posledica oksidativnog stresa. Fenoli su veoma efikasni u apsorpciji viška svetlosne energije, naročito u UV delu spektra, čime ublažavanju negativne posledice oksidativnog stresa (Grace i sar, 1998; Grace, 2005; Neill i Gould, 2003). Takođe, fenolna jedinjenja mogu uklanjati ROS direktno, delujući kao antioksidanti, ili indirektno, kao supstrati antioksidativnih enzima (Sakihama i sar, 2002; Grace, 2005). Antocijani su grupa pigmenata flavonoida rastvorljivih u vodi koji, zavisno od pH, mogu biti crvene, ljubičaste ili plave boje (Harborne, 1988). Mogu se naći u svim tkivima viših biljaka, uključujući cvetove, plodove, listove, izdanke i korenove. Sintetišu se u citoplazmi, a zatim se akumuliraju u vakuolama (Conn i sar, 2003). Antocijani daju karakterističnu boju cvetovima i plodovima, čime doprinose privlačenju životinja koje su vektori za oprašivanje i rasejavanje semena. Ekološka i fiziološka funkcija antocijana u vegetativnim strukturama je manje poznata (Gould i sar, 2002; Steyn i sar, 2002; Close i Beadle, 2003; Hughes i Smith, 2007; Hatier i Gould, 2008). Ekspresija antocijana u vegetativnim strukturama varira u zavisnosti od biljne vrste. Kod nekih vrsta su stalno prisutni, dok se kod drugih sintetišu samo u određenim ontogenetskim fazama listova, ili u uslovima stresa (Chalker-Scott, 1999; Steyn i sar, 2002; Merzlyak i sar, 2008). Generalno, antocijani se akumuliraju u fotosintetskim tkivima izloženim visokim intenzitetima svetlosti, kao što su adaksijalni sloj epidermisa i gornji slojevi mezofila listova (Neill i Gould, 2003; Hughes i Smith, 2007). Sve je više studija koje ukazuju da antocijani imaju važnu funkciju u zaštiti biljnih ćelija od brojnih abiotičkih stresora (visoki 30 intenzitet svetlosti, UV radijacija, ekstremne temperature, deficit vode i teški metali) koji dovode do oksidativnog stresa (Chalker-Scott 1999, Neill i Gould, 2003; Steyn i sar, 2002; Hughes i Smith, 2007). Antocijani ublažavaju oksidativni stres na dva načina: direktno ukljanjaju ROS, delujući kao antioksidanti ili apsorpcijom svetlosti štite biljaku od štetnih efekata visokih intenziteta vidljive i UV svetlosti (Neill i Gould, 2003; Petrini i sar, 2002). 1.7 Iris pumila L. kao model-organizam Patuljasta bradata perunika Iris pumila L. je monokotiledona višegodišnja, klonalna biljka iz porodice Iridaceae (Slika 1.7.1.). Prirodna staništa ove biljke su livadsko-stepski predeli centralne i jugoistočne Evrope. U Srbiji se može naći u severnim i istočnim oblasima, a naročito je brojna u Deliblatskoj peščari, sistemu peščanih dina koji se nalazi u južnom Banatu. Ova biljka u prirodi formira klonove karakterističnog kružnog oblika koji mogu imati u prečniku i više od 1 m. Specifičan kružni oblik klonova je posledica rasta rizoma koji se bočno granaju uodnosu na roditeljski izdanak. Na osnovu prečnika klona može se proceniti njegova starost, imajući u vidu da je godišnji prirast klona oko 50 mm (Tucić i sar, 1989). U Deliblatskoj peščari, prirodne populacije I. pumila naseljavaju dva tipa staništa koja se karakterišu različitim intenzitetom i kvalitetom svetlosti. Dinske populacije naseljava otvorene površine, obrasle jednogodišnjim i višegodišnjim zelastim biljkama i niskim žbunjem. Šumske populacije se mogu naći u delovima peščare koji su pošumljeni bagremom (Robinia pseudoacacia), belim borom (Pinus silvestris) i crnim borom (Pinus nigra). Sezonsko variranje intenziteta i kvaliteta ambijentalne svetlosti, kao i temperature lista u prirodnim staništima I. pumila prikazani su u Tabeli 1.7.1. Klonalne biljke se odlikuju sposobnošću aseksualnog razmnožavanja putem vegetativne reprodukcije organa, kao što su rizomi i stolone. Nova jedinica nastala vegetativnim putem, koja se naziva ramet, u početku je morfološki i fiziološki vezana za materinski klon, ali posle izvesnog vremena 31 (par godina) može prekinuti vezu sa biljkom od koje je nastala i nastaviti da postoji kao nezavisna, ali genetički identična biljka. Klonalne biljke zapravo postoje kao skup genetički identičnih jedinica, koje su potpuno ili delimično autonomne. U zavisnosti od starosti, jedan klon ili genet može da se sastoji od velikog broja rameta. Dok jedan ramet može nastati i uginuti za relativnokratko vreme, genet (klonalni genotip) može opstajati veoma dugo (Stuefer i Huber, 1998; Stuefer i sar, 2004; Gómez i sar, 2007). Zbog mogućnosti dobijanja velikog broja genetički identičnih jedinki, klonalne biljke su veoma pogodni model-organizmi za ekološko-evoluciona istraživanja. SLIKA 1.7.1. Izgled jednog rameta Iris pumila. 32 TABELA 1.7.1. Temperatura lista, intenzitet fotosintetički aktivne radijacije (PAR) i odnos crvene i dalekocrvene svetlosti (R:FR) mereni u nivou lista klonova I. pumila 2004. godine u Deliblatskoj peščari, tokom tri godišnje sezone. OTVORENO STANIŠTE ZASENČENO STANIŠTE Proleće Leto Jesen Proleće Leto Jesen Intezitet PAR (µmol m-2 s-1) 1797 ± 16 1378 ± 44 654 ± 20 132 ± 1.8 45 ± 3.1 69 ± 5.9 R:FR odnos 1.06 ± 0.01 0.94 ± 0.01 1.08 ± 0.02 0.96 ± 0.01 0.78 ± 0.02 0.63 ± 0.01 Temperatura lista (°C) 14.6 ± 0.3 42.9 ± 0.9 18.0 ± 0.2 17.5 ± 0.5 20.2 ± 0.4 18.2 ± 0.2 33 2 CILJEVI RADA • Utvrđivanje kvantitativnih vrednosti i obrazaca sezonskog variranja aktivnosti antioksidativnih enzima (SOD, APX, CAT, GR, POD) i neenzimskih antioksidanata (fenolnih jedinjenja i antocijana) u prirodnim populacijama Iris pumila koje naseljavaju alternativna svetlosna staništa, otvoreno i zasenčeno. • Utvrđivanje razlika u aktivnosti izoformi izabranih antioksidativnih enzima (SOD, APX, CAT) u listovima istih genotipova poreklom iz ovih populacija, recipročno transplantiranih u suprotna svetlosna staništa, kao i između domaćih i stranih (transplantiranih) genotipova unutar oba staništa. • Utvrđivanje sezonskih promena fenotipskih vrednosti morfološko-anatomskih i fizioloških osobina lista kod genetički različitih klonova I. pumila, samoniklih na eksponiranim i zasenčenim staništima u prirodi. • Procena veličine i obrazaca fenotipske plastičnosti biohemijskih, morfološko-anatomskihi i fizioloških osobina lista na sezonsku promenljivost uslova životne sredine kod biljaka I. pumila iz dve prirodne populacije sa suprotnih svetlosnih staništa. • Testiranje hipoteze o lokalnim adaptacijama lista I. pumila na morfološko-anatomskom, fiziološkom i biohemijskom nivou korišćenjem recipročno-transplantacionog eksperimenta u prirodi. • Utvrđivanje uticaja variranja abiotičkih faktora životne sredine na stepen i obrazac fenotipske integracije funkcionalno povezanih osobina lista u prirodnim populacijama I. pumila: in situ eksperiment. 34 3 MATERIJAL I METODE 3.1 Opis staništa Deliblatska peščara je izolovani kompleks peščanih dina koji se nalazi u južnom Banatu, između Dunava i zapadnih padina Karpata. Ovo područje pruža se u pravcu jugoistok-severozapad između 44° 48' i 45° 12' severne geografske širine i 38° 16' i 38° 58' istočne geografske dužine i zahvata površinu od oko 300 km2. Reljef karakterišu peščane dine žutog i sivog peska koje su eolskog porekla. Pošumljavanjem Deliblatske peščare tokom poslednjih dve stotine godina mase živog peska danas su, uglavnom, vezane vegetacijom. Deliblatska peščara ima stepsku, umereno-kontinentalnu klimu. Peščaru karakterišu velike dnevne i sezonske amplitude temperature vazduha i površine zemljišta kao i rani jesenji i pozni prolećni mrazevi. Fizičke osobine peščane podloge uslovljavaju specifičnu hidrologiju i mezoklimu ovog područja, tako da površinskih vodotokova nema, a vodonosni horizonti se nalaze na većim dubinama (100 - 400 m), uz tri stalne prirodne bare u manjim depresijama jugoistočnog dela. Zbog velike propustljivosti tla, atmosferske vode brzo poniru u niže slojeve, pa površinski slojevi ostaju bez dovoljno vlage. Pesak se tokom leta dodatno isušuje usled duvanja košave, a njegova prosečna vlažnost na 0.5 m dubine iznosi oko 4% (Ducić i Milovanović, 2004; Ducić i Radovanović, 2005). Izrazito sušni period tokom leta i jeseni i intenzivna sunčeva radijacija su najizraženije karakteristike ovog područja. Dominantan vetar je košava koji često duva ogromnom brzinom (do 180 km/h). Prosečna godišnja insolacija u peščari iznosi 2150 časova, uz smanjenu oblačnost u odnosu na okolinu. Prosečna godišnja temperatura vazduha iznosi 11°C. Najhladniji mesec je januar, sa prosečnom dnevnom temperaturom ispod - 1.0°C, a najtopliji jul sa prosečnom dnevnom temperaturom oko 22°C. Temperatura vazduha se kreće od -25°C pa do +40°C, tako da apsolutna amplituda iznosi punih 65°C. Jedna od odlika Deliblatske peščare su velike dnevne temperaturne amplitude, kada se u jutarnjim časovima temperatura 35 spušta i do 0°C a u toku dana dostiže preko 20°C. Pluviometrijski režim Deliblatske peščare ima sve karakteristike kontinentalnog srednje-evropskog, sa godišnjom količinom padavina od 663 mm. Februar je mesec sa najmanjom količinom padavina, a maj je mesec sa najvećom količinom padavina (Ducić i Milovanović, 2004; Ducić i Radovanović, 2005). Specifični i ekstremni ekološki uslovi koji vladaju u Deliblatskoj peščari oblikovali su mozaik travnatih, žbunastih i šumskih staništa koje nastanjuje specifičan živi svet sa dominantnom zastupljenošću stepskih i peščarskih vrsta. U cilju zaštite ovog specifičnog područja, Deliblatska peščara je proglašena za Specijalni rezervat prirode, a od 2002. godine nalazi se na preliminarnoj listi Unesco kao područje izuzetnih prirodnih vrednosti. 3.2 Eksperimentalni dizajn 3.2.1 Sezonsko i intraklonalno variranje morfološko-anatomskih i fiziološko-biohemijskih osobina lista I. pumila: in situ eksperimenti I EKSPERIMENT. Sezonsko variranje morfološko-anatomskih i fiziološko-biohemijskih osobina lista I. pumila praćeno je u dve prirodne populacije koje naseljavaju različita svetlosna staništa u Deliblatskoj peščari. Opis skraćenica ispitivanih osobina lista prikazan je u Tabeli 3.2.1. Jedna od populacija, nazvana „Dina-Sasa“, raste na otvorenom staništu, vrhu i padini jedne relativno veće dine površine oko 5 ha, dok druga populacija nazvana „Šuma“, površine oko 3 ha, nastanjuje sastojinu belog bora, Pinus sylvestris (Slika 3.2.1.). Rastojanje između ova dva staništa iznosi ~ 2.5 km. Tokom sezone cvetanja, u aprilu 2003. godine, odabrano je na osnovu boje cveta (genetički marker za klonove I. pumila; Tucić i sar, 1988) i označeno drvenim kočićima sa identifikacionim brojem (radi bolje vidljivosti i očuvanja genetičkog identiteta) 17 klonova dinske populacije i 14 klonova šumske populacije. Sa ovih klonova uzimani su uzorci listova tokom 2007. godine, jedanput u svakoj od sledećih sezona:proleće (15. i 16. april), leto (1. i 2. juli) i 36 TABELA 3.2.1 Opis skraćenica korišćenih u ovoj studiji. SKRAĆENICA PUN NAZIV SKRAĆENICE (JEDINICA MERE) SOD Superoksid dismutaza (U mg-1 prot) APX Askorbat peroksidaza (µmol min-1 mg-1 prot) CAT Katalaza (mmol min-1 mg-1 prot) GR Glutation reduktaza (µmol min-1 mg-1 prot) POD Peroksidaze III klase (µmol min-1 mg-1 prot) PHEN Fenolna jedinjenja (mg g-1) ANTH Antocijani (µg g-1) OSI Indeks oksidativnog stresa MDA Malondialdehid (nmol g-1) SLA Specifična površina lista (cm2 g-1) SD Gustina stoma (#/mm2) LDMC Sadržaj suve mase lista (g g-1) RWC Relativni sadržaj vode lista (%) SU Sukulentnost (g1 cm-2) LWC Sadržaj vode lista (g g-1) Chl a Hlorofil a (µg cm-2) Chl b Hlorofil b (µg cm-2) Chl ukupni Ukupni hlorofil (µg cm-2) Chl a:b Odnos hlorofila a i b Cars Karotenoidi (µg cm-2) jesen (29. i 30. septembar). Kao eksperimentalni materijal korišćeni su prvi potpuno razvijeni listovi I. pumila. Listovi su odmah nakon odsecanja zamrzavani i transportovani u tečnom azotu do laboratorije, gde su čuvani na temperaturi od -70°C do pripreme ekstrakta za biohemijske analize. II EKSPERIMENT. Istraživanje uticaja smanjenog intenziteta svetlosti, bez promene kvaliteta, tj. bez izmenjenog R:FR odnosa, na funkcionalne osobine lista I. pumila vršeno je na 6 odabranih dinskih klonova. U aprilu 2007. godine polovina svakog klona je pokrivena neutralnom PVC mrežom koja propušta oko 35% od pune sunčeve svetlosti. U julu 2007. godine, sa svakog klona prikupljeni su uzorci prva dva potpuno formirana lista sa otvorene i sa zasenčene polovine. 37 3.2.2 Recipročno-transplantacioni eksperiment Za ovaj eksperiment su takođe korišćene dve lokalne populacije I. pumila, jedna iz otvorenog i druga iz zasenčenog staništa. Dinska populacija, koju smo nazvali Dina-Cveta, bila je izložena punom intenzitetu sunčeve svetlosti i prostirala se vrhom i jugoistočnom padinom jedne relativno veće dine. Šumski klonovi korišćeni u ovom eksperimentu potiču iz iste populacije, dakle populacije Šuma, kao i oni iz prethodnog eksperimenta, što znači da su naseljavali vegetacionu senku sastojine belog bora, Pinus sylvestris. Ove dve populacije bile su međusobno udaljene oko 3.5 km. Prosečan intenzizet svetlosti (PAR) i odnos crvene prema tamno-crvenoj svetlosti (R:FR), izmereni 24. septembra 1998. godine između 10 i 12 h po potpuno vedrom vremenu, iznosili su 505.06 µmol m-2 s-1 i 1.076 na otvorenom i 55.45 µmol m-2 s-1 i 0.686 u zasenčenom staništu (Tucić i sar, 1998). Transplantacioni eksperiment započet je 1998., a postavljen 2001. godine. U aprilu 1998. godine, tokom maksimuma cvetanja I. pumila, izabrano je po principu slučajnosti u odnosu na boju cveta 12 klonova (genotipova) iz populacije Dina-Cveta i 12 klonova iz populacije Šuma, koji su zatim obeleženi drvenim kočićima sa identifikacionim brojem. Sa svakog od ovih klonova uzeta SLIKA 3.2.1. Klonovi I. pumila u prirodnom staništu. Izgled otvorenog, dinskog staništa i šumskog, zasenčenog staništa u Deliblatskoj peščari. 38 su po 24 vegetativnih rameta. U laboratoriji, delovi rizoma su podeljeni na jednu do dve falange (u zavisnosti od veličine), oprani česmenskom vodom, sterilisani 10% rastvorom varikine i posađeni u 0.5 l plastične čaše sa mešavinom supstrata za biljke i peska u odnosu 2 : 1. Biljke su u čašama gajene u sobi za rast od maja 1998. do marta 2001. godine. Raspored čaša sa biljkama na pregradama polica bio je slučajan. Biljke su gajene pod kontrolisanim ambijentalnim uslovima: dužina fotoperioda iznosila je 16 h, a temperatura vazduha se kretala od 21°C do 15°C (dan/noć). Osvetljavanje biljaka vršeno je setom od četiri neonske cevi (Philips TLD 36-W/33), tako da je intenzitet PAR iznad biljaka iznosio 110 µmol m-2 s-1, a odnos R/RFR je bio 8.2. Biljke su zalivane svakih 10 dana 0,5% rastvorom Floravit-a (N:P:K, 12:6:6, sa mikroelementima Fe, B, Cu, Mn Co, Mo; Credocommerce, Novi Sad). Čaše sa biljkama su rotirane jednom nedeljno da bi se smanjila korelacija između genotipa i sredine. U martu 2001. godine, u svakom od staništa koje naseljavaju populacije Dina-Cveta i Šuma izabrane su po 3 površine (bloka) dužine 3 m i širine 1.5 m i svaki blok je očišćen od samoniklih irisa. Na svaki blok postavljena je mreža od kanapa čija su okca iznosila 30 cm i u sredinu svakog drugog okca mreže posađena je, po principu slučajnosti, jedna replika svakog od 24 (12 dinskih i 12 šumskih) genotipova I. pumila. Biljke su presađene u čašama, sa supstratom u kome su rasle, kojima je predhodno odstranjeno dno, kako bi se smanjio transplantacioni šok. Blokovi su sa sve četiri strane imali po jedan zaštitni rubni red u koji su takođe posađene replike eksperimentalnih genotipova. U vreme transplantacije pojedinačne biljke su imale razvijena dva do tri rameta. Preživljavanje genotipova je bilo relativno uspešno, iako je rast transplantiranih biljaka bio prilično usporen u prirodnim staništima, a posebno na otvorenom staništu, u odnosu na sobu za gajenje. U periodu od 2001. do 2007. godine, eksperimentalne površine su obilažene 2-3 puta godišnje, plevljene od samoniklih irisa, a uginule eksperimentalne biljke sukcesivno zamenjivane replikama istih genotipova iz rubnih redova. U leto 2008. godine, u vreme 39 uzimanja uzoraka listova za morfološko-anatomske i biohemijske analize, u transplantacionom eksperimentu je preživelo 10 dinskih i 10 šumskih genotipova. Uzorci listova iz ovog eksperimenta uzimani su na isti način kao i u prethodnom eksperimentu, u kome je analizirano sezonsko variranje navedenih osobina (Tabela 3.2.1.). 3.3 Biohemijske metode za analizu biljnog materijala 3.3.1 Ekstrakcija solubilnih proteina i određivanje specifične aktivnosti antioksidativnih enzima Za određivanje specifične aktivnosti solubilnih antioksidativnih enzima superoksid dismutaze – SOD; katalaze – CAT; askorbat peroksidaze – APX; glutation reduktaze - GR i peroksidaza III klase - POD) zamrznuti listovi su homogenizovani do praha sa tečnim azotom u avanu, a zatim ekstrahovani u 100 mM K-fosfatom puferu pH 6.5 sa 2% polivinil pirolidonom (PVP), 0.1 mM EDTA, 0.2% Triton X-100 i 2 mM fenilmetilsulfonil fluoridom (PMSF). Odnos biljnog tkiva i pufera za ekstrakciju je bio 1:7. Za određivanje aktivnosti APX, u prethodno navedeni pufer za ekstrakciju dodat je još i 5 mM askorbat. Sonifikacija homogenata je vršena pri amplitudi od 20 MHz, dva puta po 15 sekundi, sa pauzama od 30 sekundi, korišćenjem ultrasoničnog procesora (UP 100H, Hielscher Inc, SAD). Nakon dva centrifugiranja homogenata od po 15 min na 10 000 x g, na 4°C, supernatant je alikvotiran i čuvan u zamrzivaču do korišćen za merenje količine solubilnih proteina, specifične aktivnosti i nativnu elektroforezu PAGE antioksidativnih enzima. Količina ukupnih solubilnih proteina u ekstraktima lista određivana je metodom po Bradford (1976) modifikovanoj za merenje u mikrotitar pločama. Za dobijanje standardne krive korišćen je goveđi serum albumin (BSA) u opsegu koncentracija 50 - 500 µg ml-1, a odnos uzorak : boja bio je 10 : 200. Absorbanca je merena na talasnoj dužini od 595 nm u mikrotitar pločama od 96 mesta, upotrebom spektrofotometra Multiskan Spectrum (Multiskan Spectrum, Thermo Electron Corporation, Vantaa, Finland). 40 3.3.2 Merenje aktivnosti antioksidativnih enzima Specifične aktivnosti svih antioksidativnih enzima u ekstraktima lista I. pumila, osim SOD merene su spektrofotometrijski na UV-Vis spektrofotometru (Shimadzu UV-160, Kyoto, Japan), na 30°C. Aktivnost SOD je merena upotrebom spektrofotometra Multiskan Spectrum (Multiskan Spectrum, Thermo Electron Corporation, Vantaa, Finland). Specifična aktivnost SOD je merena metodom po Beyer i Fridovich (1987) modifikovanom za merenje u mikrotitar pločama. Reakciona smeša zapremine 1 ml sadržala je 100 mM K-fosfatni pufer pH 7.8, 0.1 mM EDTA, 12 mM L-metionin, 75 µM nitroblu tetrazolijum hlorid (NBT), 2 µM riboflavin i 0, 1, 3, 5, 10, 15 i 25 µl uzorka. Ovako pripremljene reakcione smeše razlivene su u bunarčiće mikrotitar ploče i osvetljavane 15 min na 20°C. Blank smeše su bile istog sastava kao i reakcione smeše ali su držane u mraku. Mera aktivnost SOD je kapacitet određenog ekstrakta da inhibira fotohemijsku redukciju NBT u formazan, koji je plave boje. Intenzitet boje, koji je inverzno proporcionalan aktivnosti SOD uzorka, je meren kao povećanje apsorbance na 540 nm. Jedna SOD jedinica se definiše kao količina ekstrakta koja dovodi do 50% inhibicije fotohemijske redukcije NBT u poređenju sa osvetljavanom smešom bez ekstrakta. Specifična aktivnost SOD je izražena kao jedinica enzimske aktivnosti (U) po mg-1 solubilnih proteina. Specifična APX aktivnost je određivana metodom koju su opisali Miyake i Asada (1992). Reakciona smeša zapremin 1 ml sadržala je 50 mM K-fosfatni pufer pH 7.0, 1 mM EDTA, 0.1 mM H2O2, 0.5 mM askorbat (ε = 2.8 mM-1 cm-1) i 20 µl ekstrakt lista. H2O2-zavisna oksidacija askorbata je praćena kao smanjenje apsorbance na 290 nm. Specifična aktivnost APX je izražena u µmol askorbata min-1 mg-1 solubilnih proteina. Specifična CAT aktivnost je merena kao smanjenje apsorbance na 240 nm usled razgradnje H2O2 (Aebi, 1984). Promena apsorbance je praćena 3 min u reakcionoj smeši koja je sadržala 100 mM K-fosfatni pufer pH 7.5 , 30 mM H2O2 41 (ε = 0.04 mM-1 cm-1) i 5 µl ekstrakt lista. Specifična CAT aktivnost je izražena u mmol H2O2 min-1 mg-1 solubilnih proteina. Specifična aktivnosti POD merena je kao porast apsorbance na 430 nm. Reakciona smeša u kiveti od 1 ml je bila sledećeg sastava: 100 mM K-fosfatni pufer pH 6.5, 10 mM pirogalol kao elektron donor (ε = 2.47 mM-1 cm-1), 10 mM H2O2 i 10 µl ekstrakt lista. Specifična POD aktivnost je izražena u µmol H2O2 min-1 mg-1 solubilnih proteina. Aktivnost GR određivana je metodom koju su opisali Foyer i Halliwell (1976). Jedan mililitar reakciona smeše sastojao se od 50 mM K-fosfatnog pufera (pH 7.5), 1 mM oksidovanog glutationa (GSSG), 1 mM EDTA, 0.1 mM NADPH i ekstrakt lista. Praćeno je smanjenje apsorbance na 340 nm usled oksidacije NADPH (ε = 6.2 mM-1 cm-1). Specifična GR aktivnost je izražena u µmol NADPH min-1 mg-1 solubilnih proteina. Da bi se utvrdilo da li se uticaj temperature na aktivnost antioksidativnih enzima razlikuje između populacija, specifična aktivnost SOD, CAT i POD je merena na različitim temperaturama: 15, 20, 30, 40 i 50°C. U ovom eksperimentu korišćene su smeše koje su činili listovi 15 genotipova (pet genotipova po sezoni) za svaku populaciju koji su sakupljeni tokom 2004. godine. Smeše listova homogenizovane u tečnom azotu ekstrahovane su u 100 mM K-fosfatom puferu pH 6.5 sa 5% PVP i 2 mM PMSF. Odnos biljnog tkiva i pufera za ekstrakciju je bio 1:20. Nakon sonifikacije, ekstrakti su centrifugirani 15 min na 10 000 x g, na 4°C. Supernatant je alikvotiran i čuvan u zamrzivaču do korišćenja za merenje količine solubilnih proteina i specifične aktivnosti enzima. Energija aktivacije (Ea) je računata prema Arenijusovoj jednačini: ln (k) = (- Ea/R x T-1) + ln (A), pri čemu je k brzina reakcije, A predeksponencijalni faktor, R je univerzalna gasna konstanta i iznosi 8.314 x 10-3 kJ mol-1 K-1, a T je temperatura (K) (McMurry i Fay, 2003). 42 3.3.3 Nativna elektroforeza: vizuelizacija aktivnosti i određivanje izoformi antioksidativnih enzima Razdvajanje različitih izoformi SOD, APX i CAT enzima rađeno je nativnom elektroforezom na diskontinuiranim poliakrilamid gelovima (PAGE) (Laemmli, 1970) korišćenjem Mini-Protean Tetra Cell sistema (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Pre nanošenja na gel uzorci su pomešani sa puferom za uzorke (62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 40% glicerol, 0.01% bromfenol plavo) u odnosu 2:1. Proteini su razdvajani na gelovima debljine 0.75 mm, korišćem elektrodnog pufera: 0.025 M Tris-HCl (H 8.3) i 0.192 M glicin, pri konstantnoj struji od 10 mA po gelu, na 4°C. Izoforme SOD su razdvajane na 10% gelu za razdvajanje sa 5% gelom za koncentrovanje (Tabela 3.3.1.). Vizuelizacija aktivnost izoformi SOD na gelu vršena je prema radu Beauchamp i Fridovich (1971). Po završetku elektroforeze, gelovi su inkubirani u rastvoru za bojenje koji je sadržao: 50 mM K-fosfatni pufer pH 7.8, 1 mM EDTA, 0.1 mM NBT i 0.05 mM riboflavin, u trajanju od 30 min u mraku. Nakon kratkog ispiranja destilovanom vodom, gelovi su osvetljavani do pojave bezbojnih SOD traka na plavo-ljubičastoj pozadini. Različite izoforme SOD su identifikovane nakon inkubiranja gela 15 min u rastvoru specifičnih inhibitora: 5 mM H2O2 koji inhibira Fe-SOD i Cu/Zn-SOD, i 2 mM KCN koji je inhibitor Cu/Zn-SOD. Izoforme CAT su razdvajane 4h na 9% gelu za razdvajanje sa 5% gelom za koncentrovanje. Nakon elektroforeze, gelovi su inkubirani 20 min na sobnoj temperaturi u 3.27 mM H2O2 u 50 mM K-fosfatnom puferu pH 7.5. Posle kratkog ispiranja destilovanom vodom, gelovi su bojeni rastvorom koji je sadržao 1% kalijum fericijanid (K3Fe(CN)6) i 1% hlorid gvožđa (FeCl3) (Woodbury, 1971). Izoforme APX su razdvajane na 10% gelu za razdvajanje sa 5% gelom za koncentrovanje, , uz dodavanje 2 mM askorbata u elektrodni pufer. Po završetku elektroforeze, gelovi su inkubirani 20 min u 50 mM K-fosfatnom puferu pH 7.0 koji je sadržao 4 mM askorbat, a zatim još 20 min u 50 mM K-fosfatnom puferu pH 7.0 sa 4 mM askorbatom i 2 mM H2O2. Nakon kratkog 43 ispiranja, gelovi su bojenu 10 min u rastvoru 50 mM K-fosfatnog pufera pH 7.8 sa 14 mM TEMED i 0.245 mM NBT (Mittler i Zilinskas, 1993, modifikovano). Reakcija je zaustavljena kratkim ispiranjem destilovanom vodom. TABELA 3.3.1. Formulacija poliakrilamidnih gelova različite gustine. Gustina gela DDI H2O 30% Akrilamid Pufer* Glicerol 10% APS TEMED (ml) (ml) (ml) (ml) (µl) (µl) 5% 5.8 1.7 2.5 0.0 50.0 10.0 9% 2.5 3.0 2.5 2.0 50.0 5.0 10% 2.2 3.3 2.5 2.0 50.0 5.0 *Gel za razdvajanje – 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 *Gel za koncentrovanje – 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 Nakon bojenja, gelovi su skenirani (CanoScan 8800F), a intenziteti izoformi (traka) antioksidativnih enzima određivani su densitometrijski pomoću programa ImageJ 1.43u (National Institutes of Health, USA). Da bi se izbegao uticaj varijabilnosti same tehnike bojenja na kvantitativnu analizu i da bi se omogućilo poređenje intenziteta izoenzimskih traka između različitih gelova, interni referentni uzorak (smeša svih uzoraka) je nanošen na svaki gel. Aktivnosti izoformi su standardizovane referentnim uzorkom kako bi se dobile njihove relativne vrednosti koje su izražene u arbitrarnim jedinicama (AU). 3.3.4 Ekstrakcija i određivanje ukupne količine neenzimskih antioksidanata - fenola i antocijana Ukupni sadržaj fenola određivan je kolorimetrijskom metodom (Singleton i Rossi, 1965). Biljni materijal je usitnjen do praha u avanu, a zatim ekstrahovan u 80% metanolu (FW:V = 1:15) u trajanju od 1 h. Nakon 20 min centrifugiranja na 10 000 x g, supernatant je odvojen, a talog je reekstrahovan u 80% metanolu (FW:V = 1:7) još 1 h. Nakon centrifugiranja, supernatanti su spojeni i korišćeni u daljoj analizi. Ekstrakt lista (50 µl) je pomešan sa 475 µl 0.25 N Folin–Ciocalteu reagensom, a posle 3 min je dodato 475 µl 1 M NaCO3. Apsorbanca reakcione smeše je merena nakon 1 h inkubacije na 30°C na 724 nm. 44 Standardna kriva je konstruisana na osnovu različitih koncentracija galne kiseline (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 i 0.5 mg ml-1) rastvorene u 80% metanolu. Ukupni sadržaj fenola je izražen u ekvivalentima galne kiseline po gramu sveže mase. Ukupni sadržaj antocijana je određivan metodom opisanom u radu Mancinelli i sar, (1975). Nakon homogenizacije tečnim azotom u avanu, antocijani su ekstrahovani u kiselom metanolu (1% HCl) 48 h na 5°C, uz kontinuirano mešanje. Apsorbanca supernatanta je merena spektrofotometrijski u mikrotitar pločama na 530 i 653 nm. Apsorbance antocijana su korigovane A530 – 0.24 A653 prema Murray i Hackett (1991) zbog prisustva ugljenih hidrata. Sadržaj antocijana je izražen u ekvivalentima cijanidin-3-glukozid g-1 sveže mase. Ekstinkcioni koeficient cijanidin-3-glukozida na 530 nm iznosi 26 900 L mol-1 cm-1,a molekulska masa iznosi 445. 3.3.5 Ekstrakcija i merenje koncentracije fotosintetičkih pigmenata Za određivanje koncentracija hlorofila a, hlorofila b, ukupnog hlorofila i ukupnih karotenoida listovi su, nakon zamrzavanja u tečnom azotu, homogenizovani do praha u avanu, a zatim ekstrahovanu u DMSO u odnosu 1:30 (FW:V). Homogenati su 6 h inkubirani na 60°C u termo bloku. Posle centrifugiranja (20 min na 10 000 x g) merena je apsorbanca supernatanta u mikrotitar pločama, na 665, 649 i 480 nm. Koncentracije fotosintetičkih pigmenata su računate prema sledećim formulama (Wellburn, 1994) i izražene u µg cm-2: Hlorofil a = (12.47 x A665) – (3.62 x A649) Hlorofil b = (25.06 x A649) – (6.50 x A665) Ukupni hlorofil = Hlorofil a + Hlorofil b Karotenoidi = (1000A480 – 1.12 x Hlorofil a – 53.78 x Hlorofil b)/220 45 3.3.6 Određivanje oksidativnog oštećenja membrane merenjem količine malondialdehida Lipidna peroksidacija, koja se meri kao količina MDA, i koja predstavlja pokazatelj oštećenja membrana određivana je modifikovanom TBA-MDA metodom po Hodges i sar (1999). Tkivo lista je homogenizovano u 80% etanol (FW:V = 1:15), a zatim centrifugirano na 3 000 x g, 10 min na 4°C. Supernatant (1 ml) je pomešan sa 1 ml 20% TCA ili 1 ml 0.65% TBA rastvorenom u 20% TCA i potom zagrevan 25 min na 95°C. Nakon hlađenja na ledu, tube sa reakcionom smešom su centrifugirane 10 min na 3 000 x g, na 4°C. Apsorbanca je merena u mikrotitar pločama na 440, 532 i 600 nm. Količina MDA ekvivalenata je izračunata prema sledećim formulama (Hodges i sar, 1999): A = [(A532+TBA) - (A600+TBA) - (A532-TBA - A600-TBA)] B = [(A440+TBA - A600+TBA) 0.0571] MDA ekvivalenti (nmol mL-1) = (A - B/157000) x 106 Indeks oksidativnog stresa (OSI) računat je kao količnik geometrijske sredine svih antioksidanata i količine MDA. 46 3.4 Merenje morfološko-fizioloških osobina lista 3.4.1 Merenje specifične površine lista (SLA), sadržaja vode u listu (LWC), sadržaja suve mase lista (LDMC), relativnog sadržaja vode (RWC) i sukulentnosti (SU) Za merenje morfološko-fizioloških osobina lista korišćeni su zdravi prvi i drugi potpuno formiran zdrav listovi. Površina lista (LA, eng. Leaf Area) je merena pomoću programa Image Tool, na osnovu digitalni prikazi svežih listova dobijenih skeniranjem (CanoScan 5600F). Nakon merenja sveže mase (LFM, eng. Leaf Fresh Mass) i skeniranja, listovi su inkubirani u fiolama sa destilovanom vodom 12 h, radi utvrđivanja turgidne mase (LTM, eng. Leaf Turgid Mass), a zatim su sušeni do konstantne mase u sušnici (na 60°C). Na kraju je izmerena suva masa (LDM, eng. Leaf Dry Mass) svakog pojedinačnog lista. Specifična površina lista, SLA (eng. Specific Leaf Area) je izračunata kao količnik projektovane površine svežeg lista i njegove suve mase, izražene u cm2 g-1: SLA = LA/LDM. Sadržaj suve mase lista, LDMC (eng. Leaf Dry Mass Content) je određivan kao količnik suve i turgidne mase lista (Shipley i sar, 2005) i izražena u g g-1: LDMC = LDM/LFM. Sadržaj vode u listu, LWC (eng. Leaf Water Content) je izračunat prema formuli (Garnier i Laurent, 1994) i izražen u g g-1: LWC = 1 - LDM/LFM. Relativni sadržaj vode lista, RWC (eng. Relative Water Content) predstavlja procenat trenutnog sadržaja vode u listu u odnosu na njegovu potpunu zasićenost vodom. Izračunava se prema formuli: RWC = [(LFM - LDM)/(LTM – LDM)] x 100. Sukulentnost, SU (eng. Succulence) je određivan prema sledećoj formuli: SU = (LFM – LDM)/LA. 47 3.4.2 Određivanje gustine stoma (SD) Gustina stoma, SD (eng. Stomatal Density) određivana je mikro-reljefnom metodom, kao što je opisano u radu Pazourek (1970). Srednji deo adaksijalne površine drugog potpuno formiranog lista je premazan bezbojnim lakom za nokte. Osušeni otisak je skinut sa lista selotejpom i zalepljen na mikroskopsku pločicu. Broj stoma je određivan na 20 slučajno izabranih mikroskopskih polja, pri čemu su uključene stome koje su bile potpuno vidljive. Površina polja iznosila je 0.196 mm2 pri uveličanju od 40 x. Gustina stoma je izražena kao broj stoma po mm2. 3.5 Statističke analize 3.5.1 Sezonska dinamika morfološko-anatomskih i fiziološko- biohemijskih osobina lista I. pumila Osnovni parametri deskriptivne statistike (srednja vrednost, standardna greška, koeficijent varijacije) različitih osobina unutar svake populacije, za svaku sezonu, određeni su korišćenjem PROC MEANS procedure SAS statističkog softverskog paketa (SAS Institute, verzija 9.3, 2012). Zavisne varijable korišćene za statističke analize su bile pojedinačne vrednosti različitih osobina lista I. pumila, dobijene merenjem na istim genotipovima kroz tri godišnje sezone (proleće, leto i jesen). Prosečne vrednosti svih izmerenih osobina za svaku populaciju, po sezonama, prikazane su grafički kao histogrami. Dinamika promene praćenih osobina je analizirana multivarijantnom analizom varijanse sa ponovljenim merenjima (eng. MANOVAR) (von Ende, 2001). Ovaj model uključivao je sledeće izvore variranja: između subjekata (eng. between-subjects effect), unutar subjekta (eng. within-subject effect) – stanište i sezona, kao i interakcija između sezone i staništa. Za izračunavanje je korišćena REPEATED/PROFILE opcija GLM procedure koja ponovljena merenja osobina transformiše u set „kontrasta“ koji se potom testiraju jednofaktorskim analizama varijanse (ANOVA). Analiza profila omogućava testiranje tri hipoteze: o „nivou“, „paralelizmu“ i 48 „jednoličnosti“ prosečne krive odgovora. Hipoteza o „nivou“ testira da li srednje vrednosti varijabli variraju u svakom posmatrnoj jedinici vremena (npr. Da li se razlikuju srednje vrednosti osobina dinske i šumske populacije I. pumila u svakoj od posmatranih sezona?). Hipoteza o „jednoličnosti“ testira da li ima značajnih razlika u srednjim vrednostima merenih varijabli u odnosu na prosek tretmana (npr. Da li postoji variranje srednjih vrednosti osobina u okviru svake od populacije I. pumila tokom posmatrana tri godišnja doba?). Hipoteza o „paralelizmu“ ispituje da li su promene srednjih vrednosti varijabli iste kod svih posmatranih grupa tokom vremena (npr. Da li je oblik krive odgovora isti kroz vreme za obe populacije I. pumila?). Korelacije između praćenih osobina lista I. pumila, u okviru populacije, u svakoj sezoni, procenjene su pomoću Pearson-ovog korelacionog koeficijenta (r) korišćenjem PROC CORR procedure SAS programa. Variranja obrasca korelacija između populacija u svakoj sezoni, kao i u okviru iste populacije između sezona, analizirano je pomoću Mantel testa (Pop tools, Microsoft Office Excel 2003), koji utvrđuje homogenost korelacionih matrica. 3.5.2 Recipročno-transplantacioni eksperiment Kao ulazni podaci za sve statističke analize korišćeno je 20 genotipova I. pumila: 10 genotipova iz populacije Dina-Cveta i 10 genotipova iz populacije Šuma. Osnovni parametri deskriptivne statistike (srednja vrednost, standardna greška, koeficijent varijacije) različitih osobina unutar svake populacije određeni su korišćenjem PROC MEANS procedure statističkog programskog paketa SAS. Za svaku osobinu pojedinačno konstruisane su norme reakcija između svetlosnih sredina na osnovu individualnih vrednosti genotipova. Pošto su sve osobine merene u dve različite svetlosne sredine, norme reakcija su imale linearni oblik. Da bi se ispitao uticaj sredinskih činilaca na srednje vrednosti osobina biljaka u dve prirodne populacije I. pumila korišćena je jednofaktorska ANOVA. Ovim modelom procenjen je značaj staništa kao izvora fenotipskog variranja. 49 Testiranje značajnosti genetičkog variranja između populacija na srednje vrednost analiziranih osobina lista unutar istog staništa takođe je izvršeno jednofaktorskom analizom varijanse. Ovaj model uključivao je populaciju kao izvor variranja. Korelacije između praćenih osobina lista I. pumila, u okviru populacije na svakom od dva posmatrana staništa, utvrđene su pomoću Pearson-ovog korelacionog koeficijenta (PROC CORR procedura iz SAS programa). Razlike u korelacionom obrascu određene su između populacija na istom staništu, kao i u okviru iste populacije između dva različita staništa. Svaka korelaciona matrica ima dva svojstva: veličinu (stepen, jačinu) korelacija i njihov obrazac. Veličina korelacija ukazuje na jačinu korelisanosti osobina, dok obrazac ukazuje na raspored korelacija fenotipskih osobina u korelacionoj matrici. Strukture korelacionih matrica funkcionalno povezanih fenotipskih karakteristika (biohemijske i fiziološke) genotipova I. pumila, poreklom iz dve populacije sa alternativnih svetlosnih staništa, poređene su hijerarhijski pomoću CPC testa (eng. Common Principal Component Analysis; Flury, 1988; Phillips i Arnold, 1999) koji omogućava detaljniju analizu nivoa sličnosti matrica, osim podudarnosi i nepodudarnosti. Ova statistička analiza je rađena korišćenjem CPC softvera koji je napisao Phillips (1998). Hijerarhija poređenja matrica se zasniva na testiranju hipoteze o nepodudarnosti struktura matrica, zatim sledi testiranje niza hipoteza o parcijalnom preklapanju (PCPC, matrice dele p-2 zajedničkih sopstvenih vektora, gde je p broj osobina). Sledeći nivo u hijerarhiji je CPC (sopstvene vrednosti se razlikuju, ali se ne može isključiti postojanje zajedničkih sopstvenih vektora), zatim sledi proporcionalnost struktura matrica (matrice se značajno razlikuju ali su proporcionalne, tj. sopstvenih vrednosti su pomnožene konstantom) i na kraju hijerahijskog poređenja je jednakost matrica. Za interpretaciju rezultata korišćen je „step-up“ pristup koji započinje hipotezom o nepostojanju sličnosti između matrica, a zatim prelazi na ostale hijerarhijske nivoe (CPC1, CPC2, CPCp-2 .....CPC, proporcionalnost i jednakost), pri čemu se kao nulta hipoteza koristi niži model za koji se utvrdi da je 50 ispravan. Kao parametar za evaluaciju modela koji najbolje opisuje odnos korelacionih matrica korišćen je AIC (Akaike Information Criterion), gde je najpodesniji model onaj koji ima najnižu AIC vrednost (Philips i Arnold, 1999). 3.5.3 Indeksi fenotipske plastičnosti i integracije Fenotipska plastičnost svakog klona (genotipa) morfološko-anatomskih i fiziološko-biohemijskih osobina indukovana variranjem ekoloških uslova na istom staništu zbog smene godišnjih doba ili različitim svetlosnim režimima koji su vladali na otvorenom i zasenčenom staništu u različitim godišnjim dobima izmerena je korišćenjem indeksa plastičnosti (eng. Plasticity Index), PIv (Valldares i sar, 2006): PIv = ( X1 – X2 ) / X1; u kome su X1 i X2 vrednosti osobine istog genotipa koji je rastao u dve različite svetlosne sredine ili između različitih godišnjih doba (tj. između proleća i leta i između leta i jeseni). Statistička značajnost unutar-populacionih razlika između sezonskih vrednosti indeksa plastičnosti, PI analizirana je neparametarskim Wilcoxon-ovim testom rangova (eng. Wilcoxon signed-rank test), dok je za ispitivanje statističke značajnosti među-populacionih razlika u vrednostima indeksa plastičnosti korišćen Wilcoxon Mann Whitney test (eng. Mann-Whitney–Wilcoxon (MWW) ili Wilcoxon rank-sum test). Kao mera fenotipske integracije funkcionalno povezanih osobina lista analiziranih I. pumila genotipova, iz dve prirodne populacije koje naseljavaju staništa sa različitim svetlosnim režimom, korišćena je relativna varijansa sopstvenih vrednosti (eng. eigenvalue), rVE (Pavlicev i sar, 2009). Sopstvene vrednosti su izračunate na osnovu rezultata analize glavnih komponenti (PCA), korišćenjem korelacionih matrica pojedinačnih osobina lista I. pumila. Relativna varijansa sopstvenih vrednosti je procenjena kao odnos između sopstvenih vrednosti i maksimalne moguće varijanse: rVE = VE /max VE. 51 Maksimalna varijansa sopstvenih vrednosti za korelacione matrice iznosi (N-1), tako da je relativna varijansa sopstvenih vrednosti jednaka: rVE = VE / (N – 1), gde simbol N predstavlja veličinu matrice, tj. broj posmatranih osobina. 52 4 REZULTATI 4.1 Sezonska dinamika osobina lista I. pumila u različitim svetlosnim staništima 4.1.1 Sezonska dinamika antioksidanata u različitim svetlosnim stanišima Sezonsko variranje specifične aktivnosti antioksidativnih enzima tokom jedne vegetacione sezone (proleće, leto i jesen), analizirano je enzimskim esejima ukupnih ćelijskih ekstrakata lista kod različitih klonova I. pumila iz dve prirodne populacije koje nastanjuju različita svetlosna staništa. Na Slici 4.1.1. su prikazane norme reakcije antioksidativnih enzima, neenzimskih antioksidanata i indikatora oksidativnog stresa pojedinačnih genotipova I. pumila tokom tri godišnja doba u populacijama Dina i Šuma, dok su njihove srednje vrednosti, standardne devijacije i koeficienti varijacije date u Tabelama 4.1.1. A i B. Na osnovu Slike 4.1.1. može se zaključiti da je obrazac sezonskog variranja aktivnosti antioksidativnih enzima bio specifičan za svaki enzim, kao i za svaku ispitivanu populaciju. Srednje vrednosti specifične aktivnosti većine enzima bile su najviše u letnjem periodu u obe populacije, sa izuzetkom specifičnih aktivnosti APX i CAT, kao i količine solubilnih fenola u populaciji sa otvorenog staništa, čiji su maksimumi utvrđeni u proleće, a zatim su opadale tokom leta, dostižući svoj minimum u jesen (Slika 4.1.1.). Generalno, u letnjem periodu, srednje vrednosti specifične aktivnosti antioksidativnih enzima, osim APX, u listu I. pumila bile su veće kod klonova sa zasenčenog, šumskog staništa, u odnosu na klonove sa otvorenog, dinskog staništa. Nasuprot tome, prosečne količine neenzimskih antioksidanata su bile veće tokom cele sezone u listovima biljaka iz populacije Dina, u poređenju sa vrednostima izmerenim kod biljaka iz populacije Šuma. Sezonska dinamika indeksa oksidativnog stresa, OSI bila je slična kod genotipova obe populacije – najviše vrednosti izmerene su u proleće, a najniže u letnjem periodu. Količina indikatora oksidativnih oštećenja, MDA, zavisila je od 53 0 100 200 300 SO D ( U m g- 1 p ro t) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 A P X ( µm ol m in -1 m g- 1 ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 C A T (m m ol m in -1 m g- 1 ) 0.0 0.5 1.0 1.5 G R ( µm ol m in -1 m g- 1 ) Prolece Leto Jesen 0 5 10 15 P O D ( µm ol m in -1 m g- 1 ) Prolece Leto Jesen Prolece Leto Jesen A B C 54 0 5 10 15 P H E N (m g g- 1 ) 0 5 10 15 20 A N TH ( µg g -1 ) 0 5 10 15 20 M D A (n m ol g -1 ) Prolece Leto Jesen 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 O SI Prolece Leto Jesen Prolece Leto Jesen A B C SLIKA 4.1.1. Norme reakcije za specifične aktivnosti enzimskih antioksidanata i količine neenzimskih antioksidanata u listu biljaka I. pumila iz populacija Dina (A) i Šuma (B) i njihove prosečne vrednosti sa standardnim greškama (C). Objašnjenje simbola: ∆ - populacija Dina, ● - populacija Šuma. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. 55 TABELA 4.1.1. A. Sezonsko variranje specifične aktivnosti enzimskih i količine neenzimskih antioksidanata u listu biljaka I. pumila iz populacije Dina. n = veličina uzorka, X = srednje vrednosti, SD = standradna devijacija i CV = koeficijent varijacije (%). Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. PROLEĆE (n = 17) LETO (n = 17) JESEN (n = 22) X SD CV X SD CV X SD CV SOD 26.30 6.41 24.4 145.36 32.86 22.6 136.46 41.01 30.1 APX 1.02 0.18 17.2 0.97 0.27 28.2 0.58 0.19 32.2 CAT 0.46 0.10 21.2 0.27 0.06 23.4 0.26 0.07 26.1 GR 0.13 0.03 25.6 0.51 0.13 25.6 0.49 0.13 27.0 POD 2.57 0.78 30.5 3.32 0.67 20.1 3.04 1.54 50.5 PHEN 7.48 2.72 36.4 6.44 1.24 19.3 6.36 3.59 56.5 ANTH 11.41 3.51 30.8 12.43 2.30 18.5 13.94 1.97 14.1 OSI 1.34 0.30 22.3 0.68 0.24 35.5 1.04 0.42 40.3 MDA 9.11 3.18 34.9 6.66 1.29 19.4 8.95 3.62 40.4 TABELA 4.1.1. B. Sezonsko variranje specifične aktivnosti enzimskih i količine neenzimskih antioksidanata u listu biljaka I. pumila iz populacije Šuma. n = veličina uzorka, X = srednje vrednosti, SD = standradna devijacija i CV = koeficijent varijacije (%). Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. PROLEĆE (n = 9) LETO (n = 15) JESEN (n = 15) X SD CV X SD CV X SD CV SOD 21.87 5.18 23.7 179.12 47.32 26.4 138.88 41.52 29.9 APX 0.84 0.17 20.5 0.92 0.34 36.6 0.68 0.31 46.2 CAT 0.43 0.08 19.8 0.52 0.13 24.5 0.33 0.08 24.6 GR 0.19 0.04 21.1 0.66 0.22 33.0 0.51 0.17 34.1 POD 1.38 0.23 16.6 5.20 2.36 45.4 2.94 0.91 30.9 PHEN 5.69 1.75 30.7 5.92 0.81 13.7 3.11 1.37 44.0 ANTH 9.37 0.73 7.7 10.40 1.99 19.2 11.68 2.39 20.4 OSI 1.16 0.34 29.5 0.41 0.21 50.5 0.51 0.19 37.9 MDA 6.48 2.17 33.5 5.74 0.70 12.3 4.61 1.60 34.7 56 svetlosnog staništa biljaka. Dok su kod biljaka iz populacije Dina u proleće i jesen izmerene slične prosečne vrednosti količine MDA, sa najnižim vrednostima u najstresnijem letnjem periodu, kod biljaka iz populacije Šuma uočava se blagi pad količine MDA tokom vegetacione sezone (Slika 4.1.1. i Tabela 4.1.1. A i B). Tabele 4.1.2. A prikazuje rezultate analize profila MANOVAR enzimskih i neenzimskih antioksidanata tokom proleća, leta i jeseni u listu I. pumila iz populacija Dina i Šuma. Testiranje hipoteze o „nivou“, koja uključuje kao izvor variranja stanište („between-subject“ efekat), pokazalo je da su prosečne vrednosti specifičnih aktivnosti APX, CAT, GR i količine antocijana i solubilnih, nestrukturnih fenola bile tokom cele vegetacione sezone statistički značajno različite između populacija Dina i Šuma. Tokom cele vegetacione sezone, specifična aktivnost APX je u proseku imala višu vrednost kod biljaka iz populacije Dina u odnosu na populaciju Šuma, dok je prosečna vrednost specifične aktivnosti GR bila veća kod biljaka koje naseljavaju šumsku senku u odnosu na biljke sa otvoreniog staništa. Srednje vrednosti specifične aktivnosti CAT su tokom leta i jeseni bile veće kod biljaka iz šumske senke u odnosu na one sa otvorenog staništa, za razliku od proleća kada su veće prosečne vrednosti specifične aktivnosti ovog enzima utvrđene kod biljaka iz populacije Dina u odnosu na populaciju Šuma. Količina neenzimskih antioksidanata, fenola i antocijana, bila je statistički značajno veća kod biljaka I. pumila koje rastu na otvorenom staništu, u poređenju sa biljkama koje su rasle u šumskoj senci. Međutim, u obe populacije je količina antocijana bila najmanja u proleće, a maksimalnu vrednost je dostizala u jesen. Za razliku od srednjih vrednosti antocijana, koje su imale isti trend u obe populacije, količina solubilnih fenola u biljkama iz populacije Šuma dostizala je maksimum u letnjem periodu, dok je kod biljaka sa otvorenog staništa najveća vrednost izmerena u proleće. 57 TABELA 4.1.2. A. Multivarijantna analiza varijanse sa ponavljanjima (analiza profila) za specifičnu aktivnosti enzimskih i količinu neenzimskih antioksidanata tokom proleća, leta i jeseni u listu biljaka I. pumila koje naseljavaju otvoreno i zasenčeno stanište. Testiranje statističke značajnosti izvora variranja između subjekta. df = stepeni slobode, MS = prosek kvadrata odstupanja, F = F-odnos, P = statistička značajnost. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. IZMEĐU SUBJEKATA IZVOR VARIRANJA df MS F P SOD Populacija 1 0.01 0.10 0.7525 Greška 19 0.13 APX Populacija 1 0.21 4.91 0.0390 Greška 19 0.04 CAT Populacija 1 1.37 14.73 0.0011 Greška 19 0.09 GR Populacija 1 0.13 6.53 0.0193 Greška 19 0.02 POD Populacija 1 0.02 0.15 0.7041 Greška 19 0.11 PHEN Populacija 1 1.62 8.90 0.0077 Greška 19 0.18 ANTH Populacija 1 0.40 8.68 0.0100 Greška 19 0.05 OSI Populacija 1 2.03 22.91 0.0002 Greška 15 0.09 MDA Populacija 1 122.97 27.84 0.0001 Greška 19 4.42 Oba parametra za procenu intenziteta oksidativnog stresa, OSI i količina MDA, značajno su se statistički razlikovala između populacija sa alternativnih svetlosnih staništa tokom vegetacione sezone, a njihove prosečne vrednosti su uvek bile veće u listovima biljaka sa otvorenog staništa, u poređenju sa biljkama koje su rasle u šumskoj senci. Verovatnoće F vrednosti Wilks-ovog testa λ za procenu efekta sezone (test jednoličnosti krive odgovora) multivarijantnom analizom varijanse 58 („within subject“) bile su manje od 0.05 (Tabela 4.1.2. B), što ukazuje da se oblik krivih za posmatrane enzimske i neenzimske antioksidante u listu biljaka I. pumila menjao tokom cele vegetacione sezone, na oba svetlosna staništa. Test paralelizma, koji omogućava procenu efekta interakcije između staništa i sezone (Tabela 4.1.2. B), ukazuje na statistički značajanu razliku u obliku kriva antioksidativnih enzima CAT i POD između alternativnih staništa, dok je obrazac sezonskog variranja ostalih antioksidativnih enzima i neenzimskih antioksidanata bio sličan u obe populacije. TABELA 4.1.2. B. Multivarijantna analiza varijanse sa ponavljanjima (analiza profila) za specifičnu aktivnosti enzimskih i količinu neenzimskih antioksidanata tokom proleća, leta i jeseni u listu biljaka I. pumila koje naseljavaju otvoreno i zasenčeno stanište. Testiranje statističke značajnosti izvora variranja unutar subjekta. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. UNUTAR SUBJEKTA SEZONA × POPULACIJA SEZONA Wilks λ Brojilac/ Imenilac df F P Wilks λ Brojilac/ Imenilac df F P SOD 0.742 2/18 3.14 0.0678 0.032 2/18 275 0.0001 APX 0.952 2/18 0.45 0.6417 0.304 2/18 20.60 0.0001 CAT 0.333 2/18 18.00 0.0001 0.260 2/18 25.60 0.0001 GR 0.804 2/18 2.20 0.1398 0.067 2/18 125 0.0001 POD 0.236 2/18 29.10 0.0001 0.148 2/18 52.00 0.0001 PHEN 0.779 2/18 2.56 0.1054 0.645 2/18 4.95 0.0194 ANTH 0.792 2/14 1.84 0.1953 0.564 2/14 5.42 0.0181 OSI 0.774 2/14 2.05 0.1656 0.213 2/14 25.80 0.0001 MDA 0.558 2/18 7.12 0.0053 0.723 2/18 3.45 0.0539 Da bi se utvrdilo između kojih sezona se populacije I. pumila razlikuju u aktivnosti i količini antioksidanata, urađene su pojedinačne ANOVA-e između kontrasta proleće-leto i leto-jesen (Tabela 4.1.3). Na osnovu rezultata ovih analiza zaključeno je da su se prosečne specifične aktivnosti SOD, APX, GR i POD povećavale između proleća i leta, a smanjivala između leta i jeseni, kod biljaka iz obe populacije. Statistički značajna razlika između populacija Dina i 59 Šuma u nagibima kriva odgovora ovih enzima utvrđena je za POD i CAT tokom cele vegetacione sezone (proleće-leto: P ≤ 0.0001; leto-jesen: P ≤ 0.0106 za POD, i proleće-leto: P ≤ 0.0001; leto-jesen: P ≤ 0.0033 za CAT), za SOD samo između proleća i leta (P ≤ 0.0240), i za GR samo između leta i jeseni (P ≤ 0.0443), dok se nagibi kriva za APX nisu razlikovali (P ≥ 0.05). Prosečna količina antocijana u listu I. pumila statistički se značajno povećavala u obe populacije (Tabela 4.1.3), ali samo između proleća i leta (P ≤ 0.0039), dok je između leta i jeseni ostala na istom nivou (P = 0.4609), koji je bio sličan između populacija (P = 0.0660). Nasuprot antocijanima, količina fenola nije se menjala između proleća i leta ni u populaciji Dina niti u populaciji Šuma (P ≥ 0.05), već razlike između populacija uočene su samo između leta i jeseni (P ≤ 0.0437). Radi utvrđivanja broja i aktivnosti različitih izoformi antioksidativnih enzima SOD, APX i CAT, ukupni ćelijski ekstrakti smeše listova različitih genotipova iz svake od analiziranih populacija razdvajani su nativnom PAGE elektroforezom. Vizuelno-različite izoforme SOD, APX i CAT dobijene su specifičnim bojenjem nativnih poliakrilamid gelova. Bojenjem gelova bojama specifičnim za aktivnost SOD, detektovano je 9 različitih traka, od kojih je izoforma 1 imala najveću molekulsku masu, a izoforma 9 najmanju (Slika 4.1.2.). Izoforma 1 je na osnovu neosetljivosti na inhibitore KCN i H2O2 identifikovana kao Mn-SOD. Pošto su izoforme 2, 3, 4, 6 i 8 bile osetljive na oba inhibitora, utvrđeno je daspadaju u Cu/Zn-SOD. Na osnovu osetljivosti na H2O2 trake 5, 7 i 9 identifikovane su kao Fe-SOD. Aktivnost sve tri forme enzima SOD bila je veća u listu genotipova iz populacije Šuma u poređenju sa genotipovima iz populacije Dina (Slika 4.1.3.). Procentualno najveći udeo u ukupnoj aktivnosti SOD imala je Cu/Zn-SOD, dok je udeo aktivnosti Mn-SOD bio najmanji (Slika 4.1.4). Utvrđeno je da se procentualna zastupljenost Cu/Zn-SOD i Mn-SOD u ukupnoj aktivnosti enzima SOD menjala u zavisnosti od sezone i populacije. Nasuprot tome, procentualni udeo aktivnosti forme 60 TABELA 4.1.3. Analiza varijanse kojom je testirana statistička značajnost uticaja sredinskih faktora tokom različitih sezona na specifičnu aktivnost enzimskih i količinu neenzimskih antioksidanata u listu biljaka I. pumila iz populacija koje naseljavaju različita svetlosna staništa. df = stepeni slobode, MS = prosek kvadrata, F = F-odnos, P = statistička značajnost. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. VARIJABLA KONTRASTA PROLEĆE - LETO LETO - JESEN IZVOR VARIRANJA df MS F P df MS F P SOD Srednja vrednost 1** 80.17* 555 0.0001 1** 2.46* 31.40 0.0001 Populacija 1** 0.87* 6.02 0.0240 1** 0.24* 3.11 0.0941 Greška 19** 0.14* 19** 0.08* APX Srednja vrednost 1** 1.48* 32.20 0.0001 1** 0.68* 7.31 0.0141 Populacija 1** 0.04* 0.80 0.3821 1** 0.02* 0.25 0.6242 Greška 19** 0.05* 19** 0.09* CAT Srednja vrednost 1** 0.30* 3.41 0.0805 1** 1.63* 20.30 0.0002 Populacija 1** 3.32* 37.80 0.0001 1** 0.91* 11.30 0.0033 Greška 19** 0.09* 19** 0.08* GR Srednja vrednost 1** 1.03* 101 0.0001 1** 1.42* 90.00 0.0001 Populacija 1** 3x10-3 0.32 0.5804 1** 0.07* 4.64 0.0443 Greška 19** 0.01* 19** 0.02* POD Srednja vrednost 1** 12.98* 109 0.0001 1** 4.42* 46.80 0.0001 Populacija 1** 6.76* 56.91 0.0001 1** 0.76* 8.04 0.0106 Greška 19** 0.12* 19** 0.09* PHEN Srednja vrednost 1** 0.05* 0.38 0.5468 1** 2.59* 6.87 0.0168 Populacija 1** 0.42* 2.83 0.1087 1** 1.76* 4.67 0.0437 Greška 19** 0.15* 19** 0.38* ANTH Srednja vrednost 1** 0.70* 11.60 0.0039 1** 0.01* 0.57 0.4609 Populacija 1** 0.02* 0.27 0.6139 1** 0.07* 3.93 0.0660 Greška 19** 0.06* 19** 0.02* OSI Srednja vrednost 1** 1.87* 14.40 0.0017 1** 3.43* 47.6 0.0001 Populacija 1** 0.28* 2.20 0.1589 1** 0.11* 1.54 0.2339 Greška 15** 0.13* 15** 0.07* MDA Srednja vrednost 1** 15.40* 1.90 0.1845 1** 23.88* 6.63 0.0185 Populacija 1** 6.58* 0.81 0.3793 1** 43.19* 12.00 0.0026 Greška 19** 8.12* 19** 3.60* 61 SLIKA 4.1.2. Sezonsko variranje izoformi SOD kod biljaka I. pumila iz populacija Dina i Šuma. A. Izoenzimi svih formi SOD; B. Gel bojen nakon inhibicije Cu/Zn- SOD pomoću 5 mM KCN; C. Gel bojen nakon inhibicije 5 mM H2O2, radi identifikacije Mn-SOD. Legenda: D – smeša ekstrakata lista 10 genotipova iz populacije Dina, Š - smeša ekstrakata lista 10 genotipova iz populacije Šuma. Izoforma 1 ima najveću molekulsku masu, a izoforma 9 najmanju. 62 SLIKA 4.1.3. Grafički prikaz sezonske dinamike aktivnosti različitih formi enzima SOD kod genotipova I. pumila iz populacija Dina i Šuma nakon kvantifikacije sa nativnih PAGE gelova. Objašnjenje simbola: ∆ - populacija Dina, ● - populacija Šuma. Vrednosti su izražene u arbitrarnim jedinicama (AU). 4 6 8 10 U k u p n a ak ti vn os t S O D ( A U ) 0 2 4 6 8 A k ti vn os t C u /Z n S O D ( A U ) Prolece Leto Jesen 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 A k ti vn os t M n -S O D ( A U ) Prolece Leto Jesen 0 2 4 6 A k ti vn os t Fe -S O D ( A U ) Fe-SOD bio je relativno konstantan u obe analizirane populacije. Biljke, za razliku od drugih organizama, imaju brojne forme enzima SOD, i svaka forma može imati više izoformi sa različitim stopama migracije na gelu tokom elektroforeze (Bowler i sar, 1992; Pokora i sar, 2011). U ovim istraživanjima utvrdili smo da se sezonska dinamika aktivnosti SOD na gelu (Slika 4.1.3.) nije podudarala sa promenama aktivnosti utvrđenim enzimskim esejima. U literaturi postoje dva objašćenja za ovu nepodudarnost: (1) aktivnost SOD na gelu može biti nedovoljno osetljiva i precizna u odnosu na esej i (2) grubi ekstrakt lista sadrži jedinjenja koja uklanjaju superoksid i tako interferiraju sa aktivnošću SOD tokom eseja (Alscher i sar, 2002; Chagas i sar, 2008). 63 Nakon razdvajanja proteina ukupnog ćelijskog ekstrakta lista I. pumila nativnom PAGE, izoforme APX su vizuelizovane na gelovima bojenjem specifičnim za aktivnost APX. Detektovane su dve izoforme ovog antioksidativnog enzima, izoforma 1 i izoforma 2 (Slika 4.1.5.). Kvantifikacijom dobijenih traka utvrđeno je da izoforma manje molekulske mase (izoforma 1) SLIKA 4.1.5. Sezonsko variranje izoformi APX u ukupnom ćelijskom ekstraktu lista I. pumila iz populacija Dina i Šuma. Legenda: D – smeša 10 genotipova iz populacije Dina, Š – smeša 10 genotipova iz populacije Šuma. Izoforma 1 je veće molekulske mase, u odnosu na izoformu 2. SLIKA 4.1.4. Sezonsko variranje procentualnog udela aktivnosti različitih formi enzima SOD u listu genotipova I. pumila iz populacija Dina (A) i Šuma (B). Legenda: ■ - Mn-SOD, ■ – Fe-SOD, ■ – Cu/Zn-SOD. 64 ima drugačiji obrazac promene kod biljaka sa različitih svetlosnih staništa, iako se sezonska dinamika ukupne aktivnosti APX na gelu poklapa sa rezultatima dobijenim merenjem specifične aktivnosti APX (Slika 4.1.6.). Osim u prolećnom periodu, izoforma 1 imala je veću aktivnost u listu biljaka iz populacije Šuma, uodnosu na biljke iz populacije Dina. U obe populacije maksimalnu vrednost Prolece Leto Jesen 0.5 1.0 1.5 2.0 U k u p n a ak ti vn os t A P X ( A U ) Prolece Leto Jesen 0.0 0.5 1.0 1.5 A k ti vn os t A P X 1 ( A U ) Prolece Leto Jesen 0.0 0.5 1.0 1.5 A k ti vn os t A P X 2 ( A U ) SLIKA 4.1.6. Grafički prikaz sezonske dinamike aktivnosti izoformi APX u ukupnom ćelijskom ekstraktu lista genotipova I. pumila iz populacija Dina (∆) i Šuma (●). Vrednosti su izražene u arbitrarnim jedinicama (AU). SLIKA 4.1.7. Sezonsko variranje procentualnog udela aktivnosti izoformi APX u ukupnom ćelijskom ekstraktu lista I. pumila iz populacije Dina (A) i Šuma (B). Legenda: ■ – APX izoforma 1, ■ – APX izoforma 2. 65 ova izoforma dostizala je u prolećnom periodu, aktivnost je zatim opadala tokom leta, da bi u jesen dostigla minimum. Nasuprot izoformi 1, aktivnost izoforme 2 bila je veća u populaciji Dina nego u populaciji Šuma. U obe populacije najniža aktivnost ovog enzima detektovana je u proleće, da bi u populaciji sa otvorenog staništa dostigla svoj maksimum u leto i ostala na tom nivou to jeseni, dok se u populaciji, koja je rasla u šumskoj senci, kontinuirano povećavala od proleća do jeseni (Slika 4.1.6.). Na nativnim PAGE gelovima identifikovane su tri izoforme antioksidativniog enzima katalaze (CAT) u ukupnom ćelijskom ekstraktu lista I. pumila (Slika 4.1.8.). Zbog nedovoljno jasnog razdvajanja izoformi, kvantifikovana je samo ukupna aktivnost ovog enzima. U sva tri godišnja doba, aktivnost katalaze je uvek bila veća u listu I. pumila iz populacije Šuma u odnosu na biljke iz populacije Dina (Slika 4.1.9.). SLIKA 4.1.8. Sezonsko variranje izoformi CAT u ukupnom ćelijskom ekstraktu lista I. pumila iz populacija Dina i Šuma. Legenda: D – smeša 10 genotipova iz populacije Dina, Š – smeša 10 genotipova iz populacije Šuma. Izoforma 1 je veće molekulske mase, u odnosu na izoforme 2 i 3. 66 Merenjem specifične aktivnosti antioksidativnih enzima SOD, CAT i POD na različitim temperaturama (15, 20, 30, 40, 50°C) omogućilo je utvrđivanje uticaja temperature na aktivnost ovih enzima u ukupnom ćelijskom ekstraktu lista biljaka populacija Dina i Šuma (Slika 4.1.10.). Pokazalo se da je aktivnost SOD i CAT na svim temperaturama bila veća kod biljaka koje nastanjuju zasenčeno stanište nego kod onih sa otvorenog staništa. Suprotno tome, aktivnost POD je bila veća u listu biljaka iz populacije Dina u poređenju sa populacijom Šuma. Temperaturni optimum ovih enzima je bio sličan kod biljaka iz obe populacije i iznosio 40°C za SOD i 30°C za CAT. Temperaturni optimum za aktivnost POD nije utvrđen jer je aktivnost ovog enzima rasla sa porastom temperature kod biljaka iz oba svetlosna staništa (Slika 4.1.10.). Aktivaciona energija SOD je bila neznatno veća kod biljaka iz populacije Dina u poređenju sa biljkama populacije Šuma (Ea = 14.9 kJ vs. 11.4 kJ), dok je aktivaciona energija CAT imala dvostruko veću vrednost kod biljaka iz dinske populacije u poređenju sa onim iz šumske (Ea = 6.8 kJ vs. 3.2 kJ, Dina vs. Šuma). Pošto je brzina hemijske reakcije obrnuto proporcionalna veličini aktivacione energije - Ea, niska aktivaciona energija CAT u listovima koji su rasli u senci ukazuje na veliku brzinu katalitičke reakcije ovog enzima kod šumskih klonova (Lehninger, 1982; Hochachka i Somero, 2002). Nasuprot katalazi, aktivaciona energija POD bila je znatno veća kod biljaka koje naseljavaju šumsku senku u poređenju sa biljkama sa otvorenog staništa (Ea = 40.6 kJ vs. 27.6 kJ, Dina vs. Šuma). Visoka Ea, mala brzina katalitičke reakcije i zadržavanje aktivnosti i na visokim temperaturama, omogućavaju ovom enzimu aktivnost u Prolece Leto Jesen 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 A k ti vn os t C A T ( A U ) SLIKA 4.1.9. Grafički prikaz sezonske dinamike aktivnosti CAT u listu I. pumila iz populacija Dina (∆) i Šuma (●) nakon kvantifikacije sa nativnih PAGE gelova. Vrednosti su izražene u arbitrarnim jedinicama (AU). 67 SLIKA 4.1.10. Krive temperaturne zavisnosti specifične aktivnosti antioksidativnih enzima SOD, CAT i POD u listu I. pumila poreklom iz populacije Dina (∆) i Šuma (●) (Vuleta i Tucić, 2009). širokom temperaturnom opsegu (Trasar-Cepeda i sar, 2007). Nivo temperaturnih krivih enzima SOD i CAT bio je viši kod biljaka sa zasenčenog staništa nego kod biljaka koje su rasle na otvorenom. Multivarijantnom analizom varijanse sa ponavljanjem utvrđeno je da su se krive odgovora CAT razlikovale u nivou („between subjects“ efekat - populacija: F = 165.8, df = 1, P = 0.006) između populacija Dina i Šuma, dok im je oblik bio sličan („within subject“ efekat - temperatura x populacija: F = 2.16, df = 4, P = 0.165). Krive temperaturnog odgovora POD razlikovale su se i u nivou („between subjects“ efekat – populacija: F = 365.9, df = 1, P = 0.0027) i u obliku („within subject“ efekat - temperatura x populacija: F = 76.8, df = 4, P < 0.0001) između biljaka iz dinske i šumske populacije. Analizom aktivnosti ovih enzima u listu biljaka I. pumila poreklom iz dve prirodne populacije sa alternativnih svetlosnih staništa, koje su gajene u sredinski kontrolisanim uslovima sobe za rast biljaka, nisu detektovane razlike u nivoima aktivnosti 68 između populacija, što ukazuje da su značajno različiti nivoi termalnih krivih utvrđenih kod biljaka u njihovim prirodnim životnim sredinama posledica aklimatizacije biljaka na nestabilnost ekoloških uslova, karakterističnu za prirodna staništa (Vuleta i Tucić, 2009). Dakle, u slučaju I. pumila proces aklimatizacije se odvijao povećanjem količine enzima SOD, CAT, i POD u ćelijama, a ne promenom njihovih kinetičkih svojstava (Hull i sar, 1997; Hochachka i Somero, 2002; Peltzer i sar, 2002). 69 4.1.2 Sezonsko variranje morfološko-anatomskih i fizioloških osobina lista u populacijama I. pumila sa otvorenog i zasenčenog staništa U Tabelama 4.1.4. A i B prikazane su srednje vrednosti, standardne devijacije i koeficienti varijacije morfoloških, anatomskih i fizioloških osobina lista u populacijama I. pumila sa otvorenog i zasenčenog staništa. Tokom cele vegetacione sezone, srednje vrednosti SLA su bile veće kod biljaka koje su rasle u šumi, u poređenju sa biljkama sa otvorenog staništa, dok je suprotan trend uočen za količinu suve materije u listu, LDMC. Količina vode u listu -LWC bila je nešto viša kod biljaka iz populacije Šuma nego kod biljaka iz populacije Dina. U obe populacije najveće vrednosti za LWC utvrđene su u jesen, u poređenju sa druga dva godišnja doba (Tabele 4.1.4. A i B). Kao i apsolutni sardržaj vode u listu, relativni sadržaj vode – RWC bio je nešto viši kod klonova I. pumila koji su rasli u vegetacionoj senci, osim u jesen, kada je bio viši u listovima biljaka saotvorenog staništa. U leto, RWC je imao minimalnu vrednost u populaciji Dina,a maksimalnu u populaciji Šuma (Tabele 4.1.4. A i B). TABELA 4.1.4. A. Sezonsko variranje osobina lista I. pumila kod biljaka iz populacije Dina. n = veličina uzorka, X = srednje vrednosti, SD = standradna devijacija i CV = koeficijent varijacije (%). Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. PROLEĆE (n = 17) LETO (n = 17) JESEN (n = 22) X SD CV X SD CV X SD CV SLA 164.12 13.51* 8.2* 160.15 11.87* 7.4* 193.46 19.92* 10.3* SD 67.98 8.66* 12.7* 81.67 8.08* 9.9* 91.60 15.90* 17.4* LDMC 0.20 0.02* 9.8* 0.19 0.01* 7.0* 0.18 0.02* 9.3* RWC 86.0 5.59* 6.5* 83.78 3.11* 3.7* 89.60 4.27* 4.8* SU 0.02 2x10-3 8.8* 0.03 4x10-3 14.9* 0.02 2x10-3 9.4* LWC 0.80 0.02* 2.5* 0.81 0.01* 1.6* 0.82 0.02* 2.1* Chl a 17.22 4.64* 26.9* 10.83 2.52* 23.3* 17.73 2.87* 16.2* Chl b 5.70 2.37* 41.6* 4.10 0.88* 21.3* 6.09 1.56* 25.6* Chl ukupni 22.92 6.90* 30.0* 14.94 3.39* 22.7* 23.82 4.41* 18.5* Chl a:b 3.14 0.40* 12.6* 2.63 0.10* 3.7* 2.98 0.31* 10.3* Cars 4.47 1.36* 30.5* 3.25 0.69* 21.1* 3.96 0.76* 19.2* 70 TABELA 4.1.4. B. Sezonsko variranje osobina lista I. pumila kod biljaka iz populacije Šuma. n = veličina uzorka, X = srednje vrednosti, SD = standradna devijacija i CV = koeficijent varijacije (%). Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. Tokom vegetacione sezone sukulentnost lista – SU bila je relativno slična u obe populacije, sa izuzetkom leta, kada je u populaciji sa otvorenog staništa dostigla maksimalnu vrednost od 0.028, dok je u šumskoj pala na minimum (SU = 0.019). Gustina stoma – SD kontinuirano se povećavala od proleća do jeseni, pri čemu je njihov broj po jedinici površine bio viši, sa izuzetkom proleća, u dinskoj u poređenju sa šumskom populacijom (Tabele 4.1.4. A i B). Obrazac sezonskih promena fizioloških osobima, Chl a, Chl b i Cars, se takođe razlikovao između populacija Dina i Šuma tokom vegetacione sezone (Tabele 4.1.4. A i B). U listovima dinskih klonova, prosečne vrednosti količine fotosintetičkih pigmenata su bile slične u proleće i jesen, dok je tokom leta došlo do značajnog smanjenja njihovih vrednosti. Međutim, u listovima biljaka šumske populacije prosečne vrednosti količine fotosintetičkih pigmenata kontinuirano su se povećavale od proleća do jeseni, sa izuzetkom odnosa između hlorofila a i hlorofila b, koji je u toku leta bio na minimumu (Tabela 4.1.4. B; Slika 4.1.11.). Utvrđeno je da su individualne razlike između klonova (CV%) bile uočljivo veće za fiziološke osobine u odnosu na morfološke i anatomske, dok je individualno variranje tokom vegetacione sezone bilo PROLEĆE (n=9) LETO (n=15) JESEN (n=15) X SD CV X SD CV X SD CV SLA 212.43 15.88* 7.5* 244.45 25.90* 10.6* 241.88 24.78* 10.3* SD 69.56 9.75* 14.0* 73.32 10.62* 14.5* 78.33 19.44* 24.8* LDMC 0.17 0.02* 10.9* 0.17 0.01* 7.4* 0.15 0.01* 6.6* RWC 84.69 6.09* 7.2* 86.58 4.13* 4.8* 85.30 2.50* 2.9* SU 0.02 2x10-3 11.9* 0.02 2x10-3 9.5* 0.02 1x10-3 6.7* LWC 0.83 0.02* 2.2* 0.83 0.01* 1.5* 0.85 0.01* 1.1* Chl a 10.47 3.10* 29.6* 11.40 1.73* 15.2* 13.35 2.48* 18.5* Chl b 3.08 0.86* 28.1* 4.16 0.65* 15.6* 4.17 0.93* 22.3* Chl ukupni 13.54 3.95* 29.2* 15.56 2.37* 15.2* 17.52 3.38* 19.3* Chl a:b 3.39 0.20* 5.9* 2.74 0.09* 3.2* 3.23 0.23* 22.1* Cars 2.17 0.65* 29.8* 2.60 0.42* 16.0* 2.79 0.62* 23.6* 71 izrazitije u proleće i jesen u poređenju sa letom, u obe populacije (Tabele 4.1.4. A i B; Slika 4.1.11.). Rezultati analize MANOVAR (analiza profila) morfoloških, anatomskih i fizioloških osobina lista I. pumila kod klonova dve prirodne populacije, Dina i Šuma, dati su u Tabelama 4.1.5. i 4.1.6. Testiranje hipoteze o „nivou“ („between subjects“ efekat: populacija) je pokazalo da su se tokom cele vegetacione sezone srednje vrednosti većine analiziranih osobina (SLA, LDMC, LWC, SU, Chl a, Chl b, Chl ukupni i Cars) statistički značajno razlikovale između populacija sa otvorenog i zasenčenog staništa, dok za srednje vrednosti RWC, SD i Chl a:b nisu uočene statistički značajne razlike (Tabela 4.1.5. A). Test „jednoličnosti“ („within subject“ efekat), ukazuje da se oblik krivih za sve posmatrane osobine lista I. pumila statistički značajno menjao tokom cele vegetacione sezone (efekat sezone) u oba svetlosna staništa (Tabela 4.1.5. B), ali i da je bio statistički značajno različit između populacija Dina i Šuma za većinu analiziranih osobina, sa izuzetkom gustine stoma – SD i sukulentnosti – SU (Test „paralelizma“: efekat interakcije populacija x sezona; Tabela 4.1.5. B). Testiranje kontrasta pojedinačnim analizama varijansi (Tabela 4.1.6) pokazalo je da se prosečne vrednosti hlorofila a, ukupnog hlorofila, SLA i SU statistički značajno razlikuju kako između sezona, tako i između dve posmatrane prirodne populacije I. pumila. Između proleća i leta, prosečne vrednosti SD, LDMC i RWC se značajno menjaju, a krive odgovora su paralelne između biljaka iz populacije Dina i Šuma; između leta i jeseni se ne uočava promena u prosečnim vrednostima ovih osobina iako postoji među- populaciona razlika. U okviru obe populacije, u periodu između proleća i leta, prosečne vrednosti LWC, količine Chl b i Cars se nisu razlikovale, dok su se između leta i jeseni značajno promenile. Nagibi krivih odgovora ovih osobina su se razlikovali između populacija sa otvorenog i zasenčenog staništa tokom cele vegetacione sezone. 72 100 150 200 250 300 350 SL A (c m 2 g- 1 ) 0 50 100 150 SD (# / m m 2 ) 0.10 0.15 0.20 0.25 LD M C (g g -1 ) 70 80 90 100 R W C (% ) 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 L W C ( g g -1 ) Prolece Leto Jesen 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 SU (g c m -2 ) Prolece Leto Jesen Prolece Leto Jesen A B C 73 SLIKA 4.1.11. Norme reakcije za funkcionalne osobine lista I. pumila iz populacija Dina (A) i Šuma (B) i njihove prosečne vrednosti sa standardnim greškama (C). Objašnjenje simbola: ∆ - populacija Dina, ● - populacija Šuma. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. 0 10 20 30 C h l a ( µg c m -2 ) 0 5 10 15 C h l b ( µg c m -2 ) 0 10 20 30 40 50 C h l u ku p n i ( µg c m -2 ) 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 C h l a :b Prolece Leto Jesen 0 2 4 6 8 C ar s ( µ g cm -2 ) Prolece Leto Jesen Prolece Leto Jesen A B C 74 TABELA 4.1.5. A. Multivarijantna analiza varijanse sa ponavljanjima (analiza profila) morfološko-anatomskih i fizioloških osobina lista biljaka I. pumila iz populacija Dina i Šuma tokom proleća, leta i jeseni. Testiranje statističke značajnosti izvora variranja između subjekta. df = stepeni slobode, MS = prosek kvadrata, F = F-odnos, P = statistička značajnost. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. IZMEĐU SUBJEKATA IZVOR VARIRANJA df MS F P SLA Populacija 1 1.27 90.80 0.0001 Greška 18 0.01 SD Populacija 1 0.01 0.25 0.6251 Greška 12 0.05 LDMC Populacija 1 0.01 54.20 0.0001 Greška 18 2x10-4 RWC Populacija 1 2.79 0.21 0.6514 Greška 12 12.99 SU Populacija 1 7x10-5 6.05 0.0243 Greška 18 1x10-5 LWC Populacija 1 0.01 56.70 0.0001 Greška 19 2x10-4 Chl a Populacija 1 200.90 25.90 0.0001 Greška 19 7.76 Chl b Populacija 1 25.21 11.40 0.0031 Greška 19 2.20 Chl ukupni Populacija 1 335.60 17.70 0.0005 Greška 19 18.99 Chl a:b Populacija 1 0.01 0.02 0.8775 Greška 19 0.41 Cars Populacija 1 26.08 35.30 0.0001 Greška 19 0.74 75 TABELA 4.1.5. B. Multivarijantna analiza varijanse sa ponavljanjima (analiza profila) morfološko-anatomskih i fizioloških osobina lista tokom proleća, leta i jeseni kod biljaka I. pumila koje naseljavaju otvoreno i zasenčeno stanište. Testiranje statističke značajnosti izvora variranja unutar subjekta. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. UNUTAR SUBJEKTA SEZONA × POPULACIJA SEZONA Wilks λ Brojilac/ Imenilac df F P Wilks λ Brojilac/ Imenilac df F P SLA 0.514 2/17 8.02 0.0035 0.329 2/17 17.40 0.0001 SD 0.834 2/11 1.10 0.3678 0.546 2/11 4.58 0.0358 LDMC 0.583 2/17 6.08 0.0102 0.489 2/17 8.88 0.0023 RWC 0.305 2/11 12.50 0.0015 0.358 2/11 9.85 0.0035 SU 0.415 2/17 12.00 0.0006 0.522 2/17 7.77 0.0040 LWC 0.534 2/18 7.85 0.0035 0.391 2/18 14.00 0.0002 Chl a 0.382 2/18 14.60 0.0002 0.353 2/18 16.50 0.0001 Chl b 0.598 2/18 6.05 0.0098 0.677 2/18 4.30 0.0298 Chl ukupni 0.455 2/18 10.80 0.0008 0.420 2/18 12.40 0.0004 Chl a:b 0.920 2/18 0.78 0.4722 0.363 2/18 15.80 0.0001 Cars 0.567 2/18 6.88 0.0060 0.737 2/18 3.21 0.0644 76 TABELA 4.1.6. Analiza varijanse za svaki kontrast izvora variranja unutar subjekta u populacijama I. pumila koje naseljavaju različita svetlosna staništa. df = stepeni slobode, MS = prosek kvadrata, F = F-odnos, P = statistička značajnost. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. VARIJABLA KONTRASTA PROLEĆE - LETO LETO - JESEN IZVOR VARIRANJA df MS F P df MS F P SLA Srednja vrednost 1 0.05 4.32 0.0521 1 0.18 16.10 0.0008 Populacija 1 0.11 9.87 0.0056 1 0.17 14.80 0.0012 Greška 18 0.01 18 0.01 SD Srednja vrednost 1 0.23 7.19 0.0200 1 0.01 0.33 0.5761 Populacija 1 0.04 1.15 0.3039 1 0.02 0.41 0.5322 Greška 12 0.03 12 0.04 LDMC Srednja vrednost 1 4x10-3 14.60 0.0012 1 6x10-4 2.73 0.1161 Populacija 1 2x10-4 0.76 0.3944 1 2x10-3 11.40 0.0034 Greška 18 3x10-4 18 2x10-4 RWC Srednja vrednost 1 149.20 7.80 0.0163 1 42.18 2.95 0.1117 Populacija 1 56.55 2.96 0.1112 1 158.60 11.10 0.0060 Greška 12 19.13 12 14.31 SU Srednja vrednost 1 2x10-4 12.90 0.0021 1 2x10-4 16.20 0.0008 Populacija 1 3x10-4 21.90 0.0002 1 2x10-4 24.20 0.0001 Greška 18 1x10-5 18 1x10-5 LWC Srednja vrednost 1 4x10-4 1.03 0.3218 1 0.01 22.90 0.0001 Populacija 1 2x10-3 4.76 0.0420 1 5x10-3 15.50 0.0009 Greška 19 4x10-4 19 3x10-4 Chl a Srednja vrednost 1 91.35 7.51 0.0130 1 450.20 33.80 0.0001 Populacija 1 354.40 29.10 0.0001 1 105.20 7.89 0.0112 Greška 19 12.17 19 13.33 Chl b Srednja vrednost 1 0.01 0.00 0.9575 1 27.20 8.86 0.0078 Populacija 1 27.91 9.36 0.0064 1 16.98 5.53 0.0296 Greška 19 2.98 19 3.07 Chl ukupni Srednja vrednost 1 151.30 5.83 0.0260 1 698.70 24.30 0.0001 Populacija 1 510.30 19.7 0.0003 1 206.70 7.20 0.0147 Greška 19 25.94 19 28.72 Chl a:b Srednja vrednost 1 0.75 1.96 0.1779 1 3.86 20.90 0.0002 Populacija 1 0.60 1.57 0.2249 1 0.12 0.66 0.4276 Greška 19 0.38 19 0.18 Cars Srednja vrednost 1 2.48 2.36 0.1411 1 5.32 6.15 0.0227 Populacija 1 15.27 14.50 0.0012 1 1.10 1.27 0.2734 Greška 19 1.05 19 0.87 77 4.1.3 Kvantifikovanje fenotipske plastičnosti osobina lista I. pumila: unutar-populaciona i među-populaciona sezonska dinamika Ukupnost fenotipova koje može ostvariti jedan genotip pod različitim uslovima životne sredine označava se kao norma reakcije (Schmalhausen, 1949, Sultan, 1987; DeWitt i Scheiner, 2004). Veličina fenotipske promene koja je ostvarena kod pojedinačnih karakteristika određenog genotipa, a koja je nastala kao odgovor na promenu ekoloških uslova, predstavlja meru plastičnosti date osobine (Bradshaw, 1965). Koncepcija fenotipske plastičnosti u različitim oblastima biologije razmatra se na različite načine. Iako se naučnici u načelu slažu da je fenotipska plastičnost jedan od načina na koji se organizmi usaglašavaju sa promenom ekoloških uslova u njihovim životnim sredinama, evolucioni biolozi fenotipsku plastičnost posmatraju kroz uticaj koji ona ima na genetičku varijabilnost i individualnu adaptivnu vrednost unutar populacija, ekofiziolozi se bave aspektom koji se odnosi na toleranciju stresa (tj. sub- ili supra-optimalnih uslova životne sredine), dok je za razvojne biologe fenotipska plastičnost posledica uticaja različitih činilaca životne sredine na razviće (osobina) organizama (Dudley, 2004). Na Slikama 4.1.1. i 4.1.11. prikazane su norme reakcije osobina lista pojedinačnih genotipova iz populacija Dina i Šuma I. pumila tokom jedne vegetacione sezone. Jasno se može uočiti da je sezonska dinamika obrazaca svih ispitivanih osobina specifična za svaku posmatranu osobinu, kao i za svaku posmatranu populaciju. Složen obrazac sezonskog variranja za većinu osobina lista, sa ukrštenim normama reakcije i velikom varijansom, ukazuje na genetičku varijabilnost za plastičnost i evolucioni potencijal plastičnog odgovora biljaka obe populacije na sezonske promene u staništu. Relativno paralelne norme reakcija utvrđene su za aktivnost antioksidativnih enzima i neke fiziološke osobine (SU i fotosintetičke pigmente) kod biljaka obe populacije. Smatra se da se uniformne i konvergentne norme reakcije javljaju za 78 osobine koje direktno doprinose prilagođavanju na ograničavajuće faktore sredine (Sultan i Bazzaz, 1993; Pemac i Tucić, 1998). U ekološkom kontekstu, veoma je značajan način kvantitativne procene fenotipske promene izazvane sredinskim uslovima, jer od toga zavise ekološke i evolucione implikacije fenotipske plastičnosti (Valladares i sar, 2006). U našoj studiji koristili smo indeks plastičnosti, PIv, po Valladares i saradnicima (2006), koji se pokazao kao najpodesniji za poređenje plastičnosti kako između funkcionalnih osobina, tako i između grupa funkcionalno povezanih osobina. Pošto se fenotipske osobine mogu razlikovati ne samo usled dejstva različitih ekoloških faktora životne sredine, već mogu biti i posledica različite ontogenetske faze u kojoj se biljka nalazi (Evans, 1972; Valladares i sar, 2007), za kvantifikovanje fenotipske plastičnost tokom tri godišnja doba (proleća, leta i jeseni) u jednoj populaciji I. pumila sa otvorenog i drugoj populaciji sa zasenčenog staništa koristili smo poslednji i pretposlednji potpuno razvijen list sa svakog od analiziranih klonova. Radi utvrđivanja uticaja sezone na dinamiku fenotipske plasičnosti, određeni su indeksi fenotipske plastičnosti, PI, između proleća i leta (PIP-L ), kao i između leta i jeseni (PIL-J). Tabele 4.1.7. A i B prikazuju srednje vrednosti i koeficijente varijacije indeksa plastičnosti morfološko-anatomskih (SLA, LDMC, SD), fizioloških (fotosintetički pigmenti, RWC, LWC, SU) i biohemijskih (enzimski i neenzimski antioksidanti) osobina lista biljaka I. pumila iz populacije Dina i populacije Šuma, između sukcesivnih godišnjih doba. Zapaženo je da su svetlosni uslovi staništa uticali na fenotipsku ekspresiju svih karakteristika lista u obe prirodne populacije I. pumila. Prosečan nivo fenotipske plastičnosti zavisio je kako od ekoloških karakteristika staništa, tako i od analizirane osobine. Generalno, listovi klonova sa otvorenog staništa imali su veće vrednost PI, u odnosu na listove šumskih klonova. Ovaj rezultat je posledica znatno veće amplitude variranja sredinskih uslova između sezona na otvorenom, u odnosu na šumsko stanište. Najveće vrednosti indeksa plastičnosti detektovane su za antioksidativne enzime između proleća i leta u obe populacije (Tabele 4.1.7. 79 A i B). Manje prosečne vrednosti plastičnosti izmerene su za neenzimske antioksidante i fotosintetičke pigmente, a najmanje plastičan odgovor uočen je za morfološko-anatomske i fiziološke osobine lista kod biljaka sa oba staništa. Unutar-populacione razlike između PIP-L i PIL-Jutvrđene su Wilcoxon-ovim TABELA 4.1.7. A. Indeksi fenotipske plastičnosti između sezona, PIP-L (proleće - leto) i PIL-J (leto - jesen), prosečna plastičnost tokom cele vegetacione sezone, PIP, i njihovi koficijenti varijacije (CV%) za morfološke, fiziološke i biohemijske osobine lista I. pumila kod biljaka iz populacije Dina. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. PIP-L CVP-L PIL-J CVL-J PIP CVP SOD 0.820 7.5 0.256 38.7 0.538 74.1 APX 0.293 39.5 0.474 19.8 0.384 33.4 CAT 0.438 29.4 0.251 35.9 0.345 38.4 GR 0.760 7.9 0.169 51.7 0.465 90.0 POD 0.196 65.2 0.220 55.6 0.208 8.2 PHEN 0.342 22.4 0.449 26.3 0.396 19.1 ANTH 0.249 57.1 0.068 73.5 0.159 80.7 OSI 0.509 37.8 0.403 52.7 0.456 16.4 MDA 0.427 29.4 0.353 45.6 0.390 13.4 SLA 0.079 49.3 0.182 47.2 0.131 55.8 SD 0.217 36.3 0.240 27.2 0.229 7.1 LDMC 0.082 38.5 0.102 65.3 0.092 15.4 RWC 0.065 47.3 0.112 38.4 0.089 37.6 SU 0.275 12.5 0.251 29.5 0.263 6.5 LWC 0.023 51.5 0.025 66.1 0.024 5.9 Chl a 0.372 40.1 0.409 29.8 0.391 6.7 Chl b 0.281 65.3 0.388 32.2 0.335 22.6 Chl ukupni 0.341 48.5 0.390 35.0 0.366 9.5 Chl a:b 0.201 20.3 0.145 53.5 0.173 22.9 Cars 0.291 52.2 0.260 42.2 0.276 8.0 80 TABELA 4.1.7. B. Indeksi fenotipske plastičnosti između sezona, PIP-L (proleće - leto) i PIL-J (leto - jesen), prosečna plastičnost tokom cele vegetacione sezone, PIP, i njihovi koficijenti varijacije (CV%) za morfološke, fiziološke i biohemijske osobine lista I. pumila kod biljaka iz populacije Šuma. Opis skraćenica je dat u Tabeli 3.2.1. testom rangova (Tabela 4.1.8). Statistički značajna razlika između PIP-L i PIL-J uočena je kod svih antioksidativnih enzima, kod biljaka obe populacije, izuzev za POD kod biljaka iz populacije Dina. Plastični odgovori neenzimskih antioksidanata na sezonske promene uslova sredine takođe su se razlikovali kod biljaka obe populacije, izuzev količine antocijana kod biljaka iz populacije Šuma. Za većinu morfološko-anatomskih i fizioloških osobina lista, kod biljaka PIP-L CVP-L PIL-J CVL-J PIP CVP SOD 0.877 6.0 0.307 44.9 0.592 68.1 APX 0.229 47.7 0.489 51.0 0.359 51.2 CAT 0.265 55.1 0.401 27.3 0.333 28.9 GR 0.731 9.7 0.348 65.3 0.540 50.2 POD 0.734 10.9 0.454 37.6 0.594 33.3 PHEN 0.190 38.4 0.477 48.8 0.334 60.9 ANTH 0.130 60.1 0.074 71.4 0.102 38.8 OSI 0.675 31.9 0.507 51.1 0.591 20.1 MDA 0.277 49.0 0.153 77.4 0.215 40.8 SLA 0.110 32.7 0.048 75.6 0.079 55.5 SD 0.202 45.4 0.164 55.6 0.183 14.7 LDMC 0.125 58.1 0.192 21.5 0.159 29.9 RWC 0.043 52.7 0.034 58.4 0.039 16.5 SU 0.112 34.4 0.060 62.8 0.086 42.8 LWC 0.024 81.3 0.040 24.3 0.032 35.4 Chl a 0.202 41.4 0.202 37.8 0.202 0.1 Chl b 0.311 41.1 0.217 40.8 0.264 25.2 Chl ukupni 0.169 52.8 0.168 24.2 0.169 0.4 Chl a:b 0.172 28.2 0.130 39.5 0.151 19.7 Cars 0.204 44.7 0.223 43.0 0.214 6.3 81 TABELA 4.1.8. Statistička značajnost razlika u veličini indeksa plastičnosti PIP-L (proleće - leto), PIL-J (leto - jesen) i PIP (prosečna plastičnost tokom cele sezone) između populacija Dina i Šuma, kao i značajnosti među-populacionih razlika u indeksima plastičnosti tokom istih sezona. * P<0.05, ** P<0.01; *** P<0.001; ms = 0.05