UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Tatjana R. Stević Komparativna analiza agenasa za biološku kontrolu patogenih gljiva izolovanih sa lekovitih biljaka Doktorska disertacija Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Tatjana R. Stević Comparative analysis of agents for biological control of pathogenic fungi isolated from medicinal plants Doctoral Dissertation Belgrade, 2013. . Doktorska disertacija je urađena na Katedri za mikrobiologiju, Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Najveći deo eksperimentalnog istraživanja urađen je u laboratoriji za mikrobiološku kontrolu Instituta za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“, a manji na Institutu za hemiju, tehnologiju i metalurgiju Univerziteta u Beogradu i Institutu za biološka istraživanja „Dr Siniša Stanković“ u Beogradu. Mentori: ___________________________________________ Dr Tanja Berić, docent, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu _____________________________________________ Dr Katarina Šavikin, naučni savetnik, Institut za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“, Beograd Članovi komisije: ______________________________________________ Dr Slaviša Stanković, vanredni profesor, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu ______________________________________________ Dr Marina Soković, naučni savetnik, Institut za biološka istraživanja „Dr Siniša Stanković“, Beograd ______________________________________________ Dr Dejan Gođevac, viši naučni saradnik, Institut za hemiju, tehnologiju i metalurgiju, Beograd Datum odbrane: __________________________________________ . Za ostvarenje ove doktorske disertacije zahvaljujem se svojim mentorima dr Tanji Berić i Dr Katarini Šavikin. Dr Tanji Berić, docentu Biološkog Fakulteta, Univerziteta u Beogradu, na izboru problematike, za vođenje rada, sugestijama pri sumiranju rezultata, kritičkoj oceni rada, velikoj moralnoj podršci i strpljenju. Dr Katarini Šavikin, naučnom savetniku Instituta za lekovito bilje "Dr Josif Pančić" u Beogradu, na ukazanom poverenju i inicijalnoj ideji za rad, ogromnoj podršci tokom izrade kao i konstruktivnim primedbama koje su uticale da krajnji oblik ovog rada dobije na kvalitetu. Dr Slaviši Stanković, vanrednom profesoru Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, na ukazanom poverenju, izboru problematike, angažovanju oko pregledanja i korigovanja rukopisa i savetima koji su doprineli uobličavanju zaključaka i konačnog teksta ovog rada. Dr Marini Soković, naučnom savetniku Instituta za biološka istraživanja "Dr Siniša Stanković" iz Beograda, na stručnim sugestijama i savetima pri utvrđivanju aktivnosti etarskih ulja, detaljnom upoznavanju njihovih aktivnih principa, kao i prijateljskoj podršci tokom izrade ovog rada. Dr Dejanu Gođevcu, višem naučnom saradniku Instituta za hemiju, tehnologiju i metalurgiju, iz Beograda, na stručnoj pomoći u hemijskoj analizi etarskih ulja i kritičkom razmatranju rezultata. Najtoplije se zahvaljujem dr Snežani Pavlović, za uvođenje u čudesni svet gljiva i nesebičnu pomoć koju mi je pružila prilikom njihove determinacije. Iskrenu zahvalnost dugujem Milošu Nikolić na nesebičnoj pomoći pri eksperimentalnom radu pri izolaciji spora gljiva i Dr Goradani Zdunić u okviru hemijske analize etarskih ulja. Posebnu zahvalnost dugujem Ivici Dimkić na uloženom trudu, vremenu i strpljenju pri statističkoj obradi rezultata. Svojim koleginicama iz laboratorije najtoplije se zahvaljujem na nesebičnoj i prijateljskoj podršci koju su mi pružale tokom izrade disertacije, kao i svim kolegama iz Instituta koji su bili uz mene. Svom saputniku bezgranično sam zahvalna na razumevanju, strpljenu, odricanju i podršci, kao i tehničkoj pripremi rada. Veliko hvala mojoj porodici i prijateljima na toplini i podršci koja mi je pomogla da istrajem do kraja. . i Komparativna analiza agenasa za biološku kontrolu patogenih gljiva izolovanih sa lekovitih biljaka Rezime Primena lekovitog bilja i njihovih preparata u prevenciji i lečenju različitih poremećaja u ljudskom organizmu može biti ograničena njihovom mogućom kontaminacijom fitopatogenim gljivama i mikotoksinima. Saznanja o riziku pri primeni hemijskih fungicida po rukovaoca, potrošača i životnu sredinu, dovela su do povećanja interesa za uvođenje alternativnih mera u zaštiti bilja, gde posebno mesto pripada preparatima prirodnog porekla tzv. agensima biološke kontrole. Biološka kontrola podrazumeva primenu korisnih mikroorganizama (bakterija, kvasaca, gljiva) ili produkata njihovog metabolizma, kao i primenu biljnih ekstrakata i etarskih ulja u zaštiti biljaka. Ispitivanjem preko 40 vrsta lekovitog bilja najlošiji mikrobiološki kvalitet utvrđen je za sledeće droge: kukuruznu svilu, list i herbu nane, list koprive, herbu rastavića i cvet nane. Iako su na svim biljnim drogama utvrđene mešovite infekcije gljivama iz različitih rodova, većina izolovanih vrsta gljiva pripada rodu Fusarium, a potom Aspergillus i Alternaria. Osim pomenutih, identifikovani su i predstavnici rodova: Penicillium, Phoma, Cephalosporium, Nigrospora, Cladosporium, Epicoccum, Gliocladium, Myrothecium, Cercospora, Phomopsis, Verticillum, Dreschlera (=Bipolaris), Rhizoctonia, Septoria, Trichoderma, Curvularia, Stahybotrys, Trichotecium, Puccinia, Botrytis, Mucor i Rhizopus sp., u zavisnosti od biljne droge. U cilju pronalaženja efikasnog biokontrolog agensa ispitivali smo mogućnost primene etarskih ulja i izolata Bacillus sp. u kontroli odabranih identifikovanih gljiva. U tom smislu, odabrali smo sledeće vrste gljiva: Fusarium solani, F. equiseti, F. oxysporum (izolovani sa kukuruzne svile i nevena), F. tricinctum, F. semitectum, F. sporotrichioides, F. subglutinans, Aspergillus flavus, A. niger, Alternaria alternata, Penicillium sp., Chaetomium sp., Curvularia lunata, Trichoderma viride, Trichotecium roseum, Gliocladium roseum, Myrotechium verrucaria, Phoma sp., Phomopsis sp. i Verticillium dahliae. . ii Ispitivan je kvalitativni i kvantitativni sasatav, kao i antifungalna aktivnost 22 etarska ulja (čubra, origana, timijana, ruže, anisa, čajnog drveta, zdravca, lavande, korijandera, bergamota, ljubičice, ruzmarina, bibera, cimeta, bosiljka, dalmatinske i španske žalfije, eukaliptusa, limuna, narandže, kamilice i vetivera). Antifungalna aktivnost etarskih ulja određivana je u in vitro testu, mikrodilucionom metodom na mikrotitracionim pločama. Određivane su minimalne inhibitorne i minimalne fungicidne koncentracije (MIC i MFC). Sva testirana etarska ulja su pokazala antifungalnu aktivnost na sve fitopatogene gljive izolovane sa biljnih droga, ali sa različitim stepenom inhibitorne aktivnosti. Etarska ulja čubra, origana i timijana, sa fenolima kao dominantnim komponentama, pokazala su najveći antifungalni potencijal na sve testirane gljive, pri najnižim koncentracijama. Etarska ulja vetivera i kamilice, sa seskviterpenima kao dominantnim komponentama, su pokazala najslabiju antifungalnu aktivnost, kao i etarska ulja eukaliptusa, limuna i narandže u kojima preovladavaju monoterpenski ugljovodonici. Ostala ulja ispoljila su od veoma dobre do umerene antifungalne aktivnosti. Među vrstama roda Fusarium, F. subglutinans, F. semitectum i F. sporotrichioides, generalno su najotpornije gljive na većinu analiziranih etarskih ulja, a od predstavnika drugih rodova to su T. viride, A. alternata, A. flavus i Chaetomium sp. Najosetljivije gljive na većinu etarskih ulja su F. oxysporum izolovan sa kukuruzne svile, kao i M. verrucaria i T. roseum. Prema rezultatima ispitivanja sinergističke aktivnosti odabranih etarskih ulja može se reći da su kombinacije etarskih ulja ispoljile bolju antifungalnu aktivnost nego kada su ulja ispitivana pojedinačno. U in situ ispitivanjima, najveću efikasnost u redukciji ukupnog broja gljiva u uzorcima biljne droge, ispoljila su ulja timijana, origana i ruže. Primenom in vitro testa dvojne kultivacije ispitivana je antagonistička aktivnost 14 izolata Bacillus sp. prema odabranim gljivama. Testirani izolati ispoljili su različit stepen inhibicije prema različitim vrstama testiranih gljiva. Najbolji antagonizam prema odabranim fitopatogenim gljivama ispoljili su izolati SS-12.6, SS-13-1, kao i SS-27.7, SS-38.3, SS-38.4 i SS-40.2. Izolati SS-39.1 i SS-39.3 su ispoljili najslabiju inhibitornu aktivnost na gotovo sve testirane gljive. Slabiji antagonizam u odnosu na većinu gljiva ispoljili su i Bacillus sp. izolati SS-10.7 i SS-21.7. Ostali izolati (SS-6.2, SS-35.4, SS- . iii 38.2, SS-40.6) ispoljili su različite antifungalne potencijale u zavisnosti od testirane gljive. Uporednom analizom dobijenih rezultata može se reći da su Fusarium vrste nešto otpornije na Bacillus sp. izolate od vrsta drugih rodova gljiva. Ispitivanjem antifungalne aktivnosti lipopeptidnih ekstrakta izolovanih iz Bacillus sp. SS-12.6 i SS-13.1, može se uočiti da je ekstrakt izolata SS-12.6 veoma efikasan u inhibiciji rasta većine testiranih gljiva, dok ekstrakt izolovan iz izolata SS- 13.1 nije ispoljio značajniji antagonizam na većinu testiranih gljiva, izuzev Penicillium sp. Ispitivanjem potencijalnog sinergizma između Bacillus sp. izolata SS-12.6 i SS- 13.1 i etarskih ulja timijana, čubra i ruže, na vrste roda Fusarium utvrđeno je da su izolati uglavnom jače inhibirali rast većine ispitivanih gljiva u prisustvu ovih etarskih ulja, nego kada su ispitivani sami kao antagonisti, uz pojedine izuzetke. Na osnovu rezultata dobijenih u ovom radu može se reći da etarska ulja čubra, origana, timijana i ruže, kao i Bacillus sp. izolat SS-12.6 i njegov lipopeptidni ekstrakt, predstavljaju dobru osnovu za potencijalnu formulaciju preparata sa efikasnošću u kontroli fitopatogenih gljiva, bilo prevencijom kontaminacije u polju, ili dekontaminacijom u zatvorenom prostoru. Ključne reči: fitopatogene gljive, biološka kontrola, etarska ulja, antifungalna aktivnost, izolati Bacillus sp., ekstrakti izolata antagonista, antagonizam Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Biologija mikroorganizama UDK broj: [[633.7+579.852.1]:[581.135.5:581.573]]:582.282.123 (043.3) . iv Comparative analysis of agents for biological control of pathogenic fungi isolated from medicinal plants Abstract The application of medicinal plants and their preparations for the prevention and treatment of various disorders in humans may be limited by the possible contamination with phytopathogenic fungi and mycotoxins. Risk of using chemical fungicides for the operator, the consumer and the environment, have led to increasing interest in the introduction of alternative measures in plant protection. Lately, preparations of natural origin, so-called biological control agents are in the focus of investigation. Biological control involves the use of beneficial microorganisms (bacteria, yeasts, fungi) or the products of their metabolism, as well as the application of plant extracts and essential oils in plant protection. Examining over 40 stored dried medicinal plant species the lowest microbial quality were determined for next herbal drugs: Maydis stigmata (corn silk), Mentha leaf and herb (mint herb and leaf), Urtica leaf (nettle leaf), Equisetum herb (horsetail herb) and Calendula flower (marigold flower). Although mixed infections was recorded with different types of fungus the Fusarium was noted as the most dominant genera for most tested drugs, followed by Aspergillus and Alternaria. Twelve species of the genus Fusarium was identified. In addition, species from the following genera were identified: Phoma, Cephalosporium, Nigrospora, Cladosporium, Epicoccum, Gliocladium, Myrothecium, Cercospora, Phomopsis, Verticillum, Dreschlera (=Bipolaris), Rhizoctonia, Septoria, Trichoderma, Curvularia, Stahybotrys, Trichotecium, Puccinia, Botrytis, Mucor and Rhizopus sp. depending on plant species. In order to find an effective biological control agent, we investigated the possibility of applying the essential oils and isolates of Bacillus sp. in the control of selected identified fungi. In this regard, we chose the following fungal species: Fusarium solani, F. equiseti, F. oxysporum (isolated from corn silk and marigold flower), F. tricinctum, F. semitectum, F. sporotrichioides, F. subglutinans, Aspergillus flavus, A. niger, Alternaria alternata, Penicillium sp., Chaetomium sp., Curvularia . v lunata, Trichoderma viride, Trichotecium roseum, Gliocladium roseum, Myrotechium verrucaria, Phoma sp., Phomopsis sp. and Verticillium dahliae. The antifungal activity and the qualitative and quantitative content of 22 essential oils were investigated (savory, oregano, thyme, rose, anise, tea tree, geranium, lavender, coriander, bergamot, violet, rosemary, pepper, cinnamon, basil, dalmatian and spanish sage, eucalyptus, lemon, orange, chamomile and vetiver). Microdilution method on microtitration plates was used for monitoring the antifungal activity of essential oils and for determination of their minimum inhibitory and fungicide concentration (MIC and MFC) in vitro. All tested essential oils showed antifungal activity on pathogenic fungi isolated from herbal drugs, but with varying degrees of inhibitory activity. Essential oils of savory, oregano and thyme, with phenols as the dominant component, were the most effective, at the lowest concentration, while chamomile and vetiver oils, and those from Citrus species, with dominant monoterpen hydrocarbons, were the least effective against pathogenic fungi. Other oils had expressed from very good to moderate antifungal activity. Among all Fusarium species, F. subglutinans, F. semitectum and F. sporotrichioides, and T. viride, A. alternata, A. flavus i Chaetomium sp. among other genera, showed very good resistance to all oils investigated. F. oxysporum (from corn silk), M. verrucaria and T. roseum were the most susceptible pathogenic fungi. According to the results of tested synergistic activity of selected essential oils, combination of essential oils exhibited better antifungal activity than when they were tested individually. Using in situ tests, we showed that the highest efficacy in reducing the total number of fungi in samples of herbal drugs exhibited essential oils of thyme, oregano and rose. Using in vitro, dual cultivation assay, we have investigated antagonistic activity of 14 Bacillus sp. isolates, against selected fungal species. Tested isolates showed various degree of inhibition against different types of plant pathogenic fungi. The best antagonism against selected phytopathogenic fungi showed isolates SS-12.6, SS-13-1, as well as SS-27.7, SS-38.3, SS-38.4 and SS-40.2. Bacillus sp. isolates SS-39.1 and SS- 39.3 manifested the weakest antagonistic effect against almost all fungi tested. Minor antagonism against most fungi exhibited Bacillus sp. isolates SS-10.7 and SS-21.7. The . vi rest of isolates (SS-6.2, SS-35.4, SS-38.2 and SS-40.6) exhibited different antifungal potential depending on the test fungi. According to the comparative analysis of the obtained results it can be said that Fusarium species were more resistant to Bacillus sp. isolates from other genera of fungi. Evaluation of lipopeptide extracts isolated from Bacillus sp. SS-12.6 and SS- 13.1 isolates showed that the lipopeptide extract from SS-12.6 was very effective in inhibition of the growth of most fungi tested, while the lipopeptide extract from isolate SS-13.1 did not exhibit a significant antagonism against the majority of tested fungi, except Penicillium sp. Examining the potential synergism between Bacillus sp. isolates SS-12.6 and SS-13.1 and the essential oils of thyme, savory and roses, against the Fusarium species, showed that the isolates were more effective in the presence of essential oils, than when tested individually, with particular exceptions. Based on the results obtained in this work we conclude that the essential oils of savory, oregano, thyme and roses, as well as Bacillus sp. isolate SS-12.6 and its lipopeptide extract, represent a good basis for the formulation of products with potential efficacy in the control of plant pathogenic fungi, either in preventing the contamination in the field, or via indoors decontamination. Key words: pathogenic fungi, biological control, essential oils, antifungal activity, Bacillus sp. isolates, lipopeptide extracts of isolates, antagonism. Scentific area: Biology Specific scientific research area: Biology of microorganisms UDK number: [[633.7+579.852.1]:[581.135.5:581.573]]:582.282.123 (043.3) . vii SADRŽAJ 1. UVOD ....................................................................................................................... 1 1.1. Kontaminacija lekovitog bilja odnosno biljne droge ......................................... 2 1.1.1. Kontaminacija fitopatogenim gljivama ...................................................... 4 1.1.2. Kontaminacija biljne droge mikotoksinima ............................................... 5 1.2. Biološka kontrola patogenih gljiva .................................................................... 9 1.2.1. Etarska ulja u biološkoj kontroli fitopatogenih gljiva ................................ 9 1.2.1.1. Antifungalna aktivnost etarskih ulja i njihovih komponenata .......... 10 1.2.1.2. Različiti oblici primene etarskih ulja ................................................ 12 1.2.2. Mikroorganizmi kao antagonisti ............................................................... 14 1.2.2.1. Mehanizmi antagonističke aktivnosti biokontrolnih agenasa ................. 15 1) Kompeticija za prostor i hranljive sastojke ................................................. 16 2) Proizvodnja antibiotika i litičkih enzima ..................................................... 17 3) Indukcija imunog odgovora biljke ............................................................... 19 4) Inhibicija enzima uključenih u patogenezu gljiva ....................................... 20 1.2.2.2. Unapređenje efikasnosti antagonista ...................................................... 20 2. CILJ ........................................................................................................................... 22 3. MATERIJAL I METODE ....................................................................................... 23 3.1. MATERIJAL ....................................................................................................... 23 3.1.1. Biljne droge ................................................................................................... 23 3.1.2. Etarska ulja .................................................................................................... 23 3.1.3. Sintetički fungicid ......................................................................................... 24 3.1.4. Kolekcija prirodnih izolata Bacillus sp. ........................................................ 24 3.1.5. Podloge .......................................................................................................... 24 3.2. METODE ............................................................................................................. 25 3.2.1. Identifikacija gljiva ....................................................................................... 25 . viii 3.2.2. Određivanje hemijskog sastava etarskih ulja ................................................ 26 3.2.3. Pripremanje koncentracije spora za mikrodilucionu metodu ........................ 26 3.2.4. In vitro test za određivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja.................. 27 3.2.5. Test za utvrđivanje sinergističke aktivnosti etarskih ulja .............................. 28 3.2.6. ISO 21527-2 metoda za brojanje kvasaca i plesni korišćena u in vitro ispitivanjima uticaja etarskih ulja na ukupan broj gljiva u biljnim drogama .......... 29 3.2.7. In vitro i in situ test za određivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja..... 29 3.2.7.1. In vitro test .............................................................................................. 29 3.2.7.2. In situ test ............................................................................................... 29 3.2.8. In vitro ispitivanje antagonističke aktivnosti izolata Bacillus sp. na fitopatogene gljive ................................................................................................... 30 3.2.9. Ispitivanje sinergističke aktivnosti etarskog ulja i izolata Bacillus sp. ......... 31 3.2.10. Statistička analiza ........................................................................................ 31 4. REZULTATI I DISKUSIJA .................................................................................... 32 4.1. Identifikacija gljiva sa biljnih droga .................................................................... 32 4.1.1. Rod Fusarium ................................................................................................ 34 4.1.1.1. Fusarium verticillioides /Sacc./ Nirenberg (sin: F. moniliforme Sheldon) ............................................................................................................................. 35 4.1.1.2. Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend. Snyder & Hasen ............ 36 4.1.1.3. Fusarium sporotrichioides Sherbakoff ................................................... 37 4.1.1.4. Fusarium tricinctum (Corda) Saccardo ................................................. 37 4.1.1.5. Fusarium subglutinans (Wollenw. & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas comb. Nov. ............................................................................................ 38 4.1.1.6. Fusarium semitectum Berkeley & Ravenel ............................................ 39 4.1.1.7. Fusarium solani Martius ........................................................................ 39 4.1.1.8. Fusarium equiseti (Corda) Saccardo ...................................................... 40 4.1.2. Rod Alternaria............................................................................................... 41 4.1.2.1. Alternaria alternata (Fries) Keissler ...................................................... 41 . ix 4.1.2.2. Alternaria tenuissima (Kunze) Wiltshire ............................................... 42 4.1.3. Rod Phoma .................................................................................................... 42 4.1.4. Rod Phomopsis .............................................................................................. 43 4.1.5. Curvularia lunata (Wakker) Boedijn ............................................................ 44 4.1.6. Trichoderma viride Persoon C.H. ................................................................. 45 4.1.7. Rod Aspergillus ............................................................................................. 46 4.1.7.1. Aspergillus flavus Link H.F. .................................................................. 46 4.1.7.2. Aspergillus niger Arthur de Cock ........................................................... 47 4.1.8. Trichothecium roseum Link H.F. .................................................................. 47 4.1.9. Verticillium dahliae Klebahn ....................................................................... 48 4.1.10. Gliocladium roseum Bainier ....................................................................... 49 4.1.11. Myrothecium verrucaria (Alb. & SCHwein.) Ditmar ................................. 49 4.1.12. Chaetomium sp. Lodha ................................................................................ 50 4.1.13. Rod Penicillium ........................................................................................... 50 4.2. Hemijski sastav i antifungalna aktivnost etarskih ulja ......................................... 52 4.2.1. Etarska ulja čubra (Satureja hortensis), origana (Origanum heracleoticum) i timijana (Thymus vulgaris)...................................................................................... 54 4.2.2. Etarska ulja ruže (Rosa damascena) i zdravca (Pelargonium graveolens) ... 60 4.2.3. Etarska ulja lavande (Lavandula angustifolia), korijandera (Coriandrum sativum) i bergamota (Citrus aurantium) ................................................................ 64 4.2.4. Etarsko ulje ploda/semena anisa (Illicum verum) ......................................... 70 4.2.5. Etarsko ulje lista čajnog drveta (Melaleuca alternifolia) .............................. 72 4.2.6. Etarsko ulje ljubičice (Viola odorata) ........................................................... 75 4.2.7. Etarsko ulje crnog bibera (Piper nigrum) ..................................................... 78 4.2.8. Etarsko ulja kore cimeta (Cinnamomum zeylanicum) ................................... 81 4.2.9. Etarsko ulje bosiljka (Ocimum basilicum) .................................................... 84 4.2.10. Etarska ulja dalmatinske žalfije (Salvia officinalis), španske žalfije .......... 87 . x (Salvia lavandulifolia) i ruzmarina (Rosmarinus officinalis) .................................. 87 4.2.11. Etarska ulja limuna (Citrus limon), narandže (Citrus aurantum) i eukaliptusa (Eucalyptus globulus) .......................................................................... 94 4.2.12. Etarsko ulje cveta kamilice (Matricaria recutita) ....................................... 98 4.2.13. Etarsko ulje vetivera (Vetiveria zizanoides) .............................................. 101 4.3. Sinergistička aktivnost etarskih ulja .................................................................. 104 4.3.1. Antifungalna aktivnost mešavine etarskih ulja ruže i lavande .................... 105 4.3.2. Antifungalna aktivnost mešavina etarskih ulja timijana i origana .............. 106 4.3.3. Antifungalna aktivnost mešavina etarskih ulja origana i lavande ............... 106 4.4. In vitro i in situ ispitivanja uticaja odabranih etarskih ulja na ukupan broj gljiva na biljnim drogama ................................................................................................... 108 4.5. Uporedna analiza antifungalne aktivnosti etarskih ulja u in vitro testovima ..... 110 4.6. Antifungalna aktivnost izolata Bacillus sp. ....................................................... 117 4.6.1. Ispitivanja antagonističkog potencijala različitih izolata Bacillus sp.......... 117 4.6.2. Sinergistički efekat Bacillus sp. izolata SS-12.6 i SS-13.1 i odabranih etarskih ulja na rast fitopatogenih ulja .................................................................. 128 4.6.3. Potencijalna primena ispitivanih etarskih ulja i izolata Bacillus sp. u kontroli fitopatogenih gljiva sa lekovitog bilja ................................................................... 131 5. ZAKLJUČCI ........................................................................................................... 135 6. LITERATURA ....................................................................................................... 138 PRILOG 1 ................................................................................................................... 162 PILOG 2 ...................................................................................................................... 165 PRILOG 3. .................................................................................................................. 180 . Uvod 1 1. UVOD Lekovite biljke su se od davnina koristile u narodnoj medicini u prevenciji, tretmanu i lečenju različitih poremećaja i oboljenja. Koriste se i za izradu savremenih farmaceutskih preparata i dijetetskih suplemenata. Biljne lekovite sirovine (biljne droge), su osušeni delovi lekovitog bilja (cvet, list, herba, koren, seme, plod) u užem smislu reči, a u širem predstavljaju i proizvode koji se kao takvi javljaju u biljkama (masna ulja, etarska ulja, smole itd.). Mnoge biljne droge koriste se i dalje kao takve, neke kao sirovine za izradu standardizovanih ekstrakata, od kojih se kasnije izrađuju fitopreparati definisanog sastava (kapsule, tablete, masti, sirupi i dr.), dok se značajan broj droga koristi za izolaciju određenih hemijskih jedinjenja, koje dalje služe kao polazna sirovina u sintezi nekih lekova (Tasić et al., 2001). Uprkos svom prirodnom poreklu, biljne droge se moraju posmatrati kao polazne sirovine za izradu farmaceutskih proizvoda koji moraju biti efikasni i bezbedni za upotrebu, što je određeno zakonskom regulativom (Calixto et al., 2000). Premisa da upotreba ovih proizvoda garantuje i njihovu bezbednost nije tačna jer prirodno poreklo ne garantuje bezbednost i efikasnost. Utvrđen je moguć negativan efekat duže upotrebe biljaka i njihovih proizvoda usled nepravilne upotrebe i prekoračene doze, prisustva toksičnih jedinjenja u pojedinim biljnim vrstama kao i kontaminacije patogenim mikroorganizmima i toksinima (Tassaneeyakul, 2004; Mandeel, 2005). Kontaminiranost mikroorganizmima značajno utiče na ukupan kvalitet biljnih preparata te je procena rizika mikrobiološke kontaminacije lekovitog bilja postala važan subjekt uspostavljanja HACCP sistema u proizvodnji fitopreparata (Hazard Analysis and Critical Control Point – Analiza opasnosti i kritične kontrolne tačke) (Kneifel et al., 2002). Povećana potražnja za preparatima na bazi lekovitog bilja u poslednje vreme uzrokovala je i zainteresovanost javnosti za ispravnost, odnosno neškodljivost, efikasnost i pravilnu upotrebu. Kako je dostupnost lekovitog bilja iz prirodnih resursa nedovoljna za potrebe farmaceutske industrije, sve veća pažnja poklanja se gajenju lekovitog bilja. Komercijalno gajenje dramatično je povećalo problem oboljenja lekovitog bilja zbog . Uvod 2 uslova gajenja u monokulturama. Zbog toga je neophodno sveobuhvatno izučiti svako oboljenje i pronaći način njenog kontrolisanja (Janardhanan, 2002). Iako je Svetska zdravstvena organizacija (WHO-World Health Organization) razvila direktive za kontrolu kvaliteta biljnih droga, koje bi trebalo da obezbede detaljne opise tehnika i mera neophodnih za odgovarajuće tj. adekvatno gajenje i sakupljanje lekovitog bilja, i dalje postoji jaz između ovih direktiva i njihove implementacije na plantažama (WHO, 2005). Često se radi bez primene mera kontrole kvaliteta, što sve rezultuje u lošem kvalitetu bilja u smislu prisutva različitih kontaminanata, mikroorganizama, pesticida, hemijskih toksina i teških metala. 1.1. Kontaminacija lekovitog bilja odnosno biljne droge Kontaminacija sirove biljne droge mikroorganizmima je target problem u distribuciji biljnih preparata. Problem predstavlja kontaminacija biljne droge bilo patogenim bakterijama, bilo gljivama (kvascima i plesnima) i njihovim mikotoksinima. Konzumiranje ovakvih fitopreparata može štetno uticati na ljudsko zdravlje, što zavisi od obima kontaminacije tj. tipa i brojnosti mikroorganizma, vrste fitopreparata, načina primene i otpornosti pacijenta na infekcije. Pokazano je da je više kontaminiran sirov biljni materijal od ekstrakata i tinktura zbog prisustva alkohola u njima (Stević, 2009). Fitopatogene gljive, gljive prouzorkovači bolesti biljaka, veoma su raznovrsne i uzrokuju oboljenja na različitim delovima biljaka kao što su koren, stablo, listovi, cvetovi i plodovi. Pokazano je da su više zaraženi list i nadzemni delovi biljaka (posebno mladih biljaka, jer su tada puni vode), koren i cvet, a manje plod, semena i kora. Stepen kontaminacije takođe zavisi i od aktivnosti vode u biljnoj sirovini, dužine stajanja pre prerade, oblika prerade, načina čuvanja i dr. (Stević et al., 2004; Bugno et al., 2006). Zemlja i vazduh su glavni izvori kontaminacije biljaka. Gljive su svuda prisutne u prirodi i njihove se spore mogu naći u atmosferi čak i na velikim visinama nošene i raznošene putem vetra, insekata i drugih životinja (Kungulovski et al., 2011). Pod određenim, pogodnim uslovima temperature i vlažnosti, mogu rasti na žitaricama, voću, začinskom i lekovitom bilju (Škrinjar et al., 2011). . Uvod 3 Pored kontaminacije na samom izvorištu tj. u polju, nestručna žetva, prikupljanje, transport, rukovanje, skladištenje, proizvodnja i distribucija, kao i prodaja pod nehigijenskim uslovima su procesi tokom kojih biljna droga može biti sekundarno kontaminirana različitim mikroorganizmima, posebno gljivama (Moorthy et al., 2010). Kako se gajenjem lekovitog bilja često bavi i stručno neupućeni ljudi, malo se vodi računa o rukovanju tokom branja i transporta tako da su moguća razna oštećenja. Transportuje se često u neadekvatnim transporterima, u polietilenskim ili jutenim džakovima, baca se na zemlju, a skladišti u otvorenim i prljavim kontejnerima, što sve doprinosi kontaminaciji biljne droge (Khan et al., 2006). Biljke se sakupljaju jednostavnim metodama i najčešće su izložene kontaminaciji pre sušenja koje bi sprečilo rast mikroorganizama. Tokom sušenja biljaka znatan deo populacije mikroorganizama biva uništen, mada izvestan deo ostaje, kao i produkti njihovog metabolizma. Kvalitet droge takođe zavisi i od načina čuvanja tj. skladištenja, pošto kontaminaciji doprinosi i prašina u vlažnim skladištima bogata sporama patogenih gljiva. Mnogi uzgajivači kao i proizvođači biljnih preparata su svesni važnosti higijenskog skladištenja lekovitog bilja, ali zbog slabe kontrole sprovođenja zakonske regulative ne sprovode ih u praksi. Postžetvena kontaminacija gljivama je veoma česta na uskladištenoj biljnoj drogi, a kao posledica dolazi do promene boje, pogoršanja kvaliteta i terapeutskog potencijala (Essono et al., 2007). Prisustvo širokog spektra gljiva na uskladištenoj drogi pokazatelj je da do kontaminacije dolazi još za vreme žetve kao i post-žetvenog procesovanja, sušenja, skladištenja i transporta. Spore Aspergillus niger, A. flavus, Alternaria alternata i Rhizopus sp. su uobičajeni zagađivači vazduha prisutni u sušarama i prostorijama za pakovanje (Gautam and Bhadauria, 2009). Prisustvo u vazduhu u manjem broju ne mora da znači da će obavezno kontaminirati biljni materijal. Ali, sa porastom vlage u prostorijama pa i u biljnom materijalu, može doći do kontaminacije i proliferacije gljiva, pa i do sinteze mikotoksina. Zabeleženi su slučajevi da je procenat kontaminacije gljivama veći kod droge upakovane u ambalažu nego kod neupakovane. To može biti posledica povećane vlažnosti u samom pakovanju kao i neodgovarajuće metode tj. načina pakovanja, čuvanja i skladištenja pakovanja (Abou-Arab et al., 1999). . Uvod 4 1.1.1. Kontaminacija fitopatogenim gljivama Prema Aziz et al., (1998) i Jay et al., (2005), gljive se prema mestu gde inficiraju biljke dele na dve ekološke kategorije: gljive polja i skladišne gljive. Vrste roda Fusarium su dominantni predstavnici gljiva polja kojima pogoduje veća vlažnost i hladnije vreme. Tu pripadaju i vrste roda Alternaria, Helminthosporium, Cladosporium i dr. Razvoj skladišnih gljiva najviše podstiču visoka temperatura i vlažnost u skladišnim prostorijama kao i produženo vreme čuvanja droga. Vrste rodova Aspergillus i Penicillium su tipični predstavnici skladišnih gljiva, mada u ovu kategoriju, prema pomenutim autorima, spadaju i vrste rodova Chaetomium, Rhizopus, Mucor i Absidia. Treba naglasiti da ova podela nije striktna. Tako, manja količina spora tzv. skladišnih gljiva može biti doneta sa polja ili mogu biti prisutne na priboru za žetvu, rukovanje i obradu. Ispitivanja Hitokoto et al., (1978) ukazala su da na biljnoj drogi dominiraju gljive rodova Aspergillus i Penicillium, među kojima su i vrste potencijalni producenti mikotoksina, ali su prisutne i vrste rodova Fusarium, Mucor, Rhizopus i Cladosporium. Kasnija, brojna istraživanja su potvdila prisustvo različitih populacija gljiva na biljnim drogama i začinima sa dominacijom vrsta rodova Aspergillus, Fusarium i Penicillium (Rizzo et al., 2004; Bugno et al., 2006, Gautam and Bhadauria 2009). Ispitivanja lekovitog i začinskog bilja su pokazala da je najveći nivo kontaminacije u uzorcima kamilice i nane i to pretežno vrstama roda Aspergillus i Fusarium (Canafoglia et al., 2007; Tournas and Katsoudas, 2008; Stević et al., 2012). Od začinskih biljaka najveći afinitet za kontaminaciju gljivama utvrđen je za đumbir, piskavicu, morač, biber, kim i anis (Abou Donia, 2008; Moorthy et al., 2010; Kungulovski et al., 2011). Interesantan je podatak da su i timijan i žalfija, biljke bogate etarskim uljima sa izraženim antimikrobnim potencijalom, u istraživanjima Grigoryan et al., (2011), takođe bile kontaminirane vrstama istih rodova. Ono što zabrinjava je podatak ovih istraživanja da su, potencijalni producenti mikotoksina, vrste roda Aspergillus, najčešće u uzorcima gotovo svih ispitivanih biljnih droga. Mikrobiološka kontrola čajeva u prodavnicama, kako u rimfuzu, tako i upakovanih, ukazala je da je većina bila kontaminirana gljivama, ali da je veći broj vrsta bio izolovan iz upakovanih čajeva nego iz neupakovanih (Rezačova and Kubatova, Uvod 5 2005; Škrinjar et al., 2011). To je ove autore navelo na zaključak da gljive kolonizuju biljne droge tokom procesa obrade. Ova hipoteza potvrđena je ne samo vrstama gljiva koje su identifikovane (mahom saprobne vrste koje preferiraju osušene biljke), već i postojanjem razlike u sastavu izolovanih gljiva iz zemlje ispod samih lekovitih biljaka i žive neobrane lekovite biljke sa jedne strane i osušene biljne droge sa druge. Prisustvo većeg stepena kontaminacije različitih biljnih droga potencijalno toksigenim, skladišnim, gljivama ukazuje da je neophodno preduzeti mere za unapređenja uslova tokom postžetvenog skladištenja, kao i da je potrebno učiniti sve na prevenciji kontaminacije biljaka tokom žetve i obrade. 1.1.2. Kontaminacija biljne droge mikotoksinima Prisustvo gljiva na lekovitom bilju osim što umanjuje njihovu mogućnost upotrebe i kvalitet, pod određenim uslovima, može takođe dovesti i do produkcije toksičnih metabolita, mikotoksina. Mikotoksini su prirodni sekundarni metaboliti gljiva koji mogu prouzrokovati toksikološke reakcije, tzv. mikotoksikoze, kada su i u niskim koncentracijama prisutni u prirodnom lancu ishrane životinja i ljudi. Veliki broj gljiva izolovanih sa lekovitog bilja imaju sposobnost produkcije mikotoksina. Iako prisustvo gljiva ne mora da bude uvek praćeno produkcijom mikotoksina, mnogi literaturni podaci ukazuju na njihovo prisutvo u biljnim drogama, čajevima i drugim biljnim preparatima (Reddy et al., 2008; Trucksess and Scott, 2008). Smatra se da najpoznatije i najvažnije mikotoksine sintetišu gljive iz rodova Aspergillus, Fusarium i Penicillium (Rizzo et al., 2004; Bugno et al., 2006; Grigoryan et al., 2011). Pojava i koncentracija mikotoksina uslovljeni su osnovnim činiocima spoljašnje sredine kao što su velika vlažnost u polju i skladištima, visoka temperatura, kao i mehanička oštećenja biljaka tokom berbe i insektima. Brojni fizički, agrotehnički, kao i klimatski činioci utiču na geografsko i sezonsko variranje pojave gljiva producenata mikotoksina, a otuda i na vrstu i nivo biosinteze mikotoksina (Lević and Stojkov, 2002). Sinteza mikotoksina zavisi i od svojstva supstrata na kojima gljiva producent raste (sastav, aktivnost vode, stepen kontaminacije). Mikotoksini se u prirodi pojavljuju pojedinačno ili u kombinacijama dva, tri ili više njih zajedno s aditivnim ili sinergističkim dejstvom (Alli et al., 1998). Jedna vrsta . Uvod 6 gljive može da sintetiše različite toksine, a različite vrste mogu da stvaraju iste mikotoksine. Termostabilni su i ne mogu se uništiti kuvanjem; imaju kumulativni efekat i teško se eliminišu iz organizma (Hashem and Alamri, 2010). Prema hemijskoj strukturi mikotoksini se dele na: aflatoksine, ohratoksine, fumonozine, trihotecene i zearalenone (Rischard, 2007). Među svim mikotoksinima, aflatoksin B1, fumonizin B1 i ohratoksin A su najtoksičniji za sisare i ispoljavaju nefrotoksičnu, hepatotoksičnu, teratogenu i mutagenu aktivnost, uzrokujući oštećenja kao što su toksični hepatitis, hemoragiju, edem i imunosupresiju (Dubey et al., 2008). U novijim istraživanjima dovode se u direktnu vezu sa primarnim karcinomom jetre i jednjaka (Reddy et al., 2008). Primarna mesta za apsorpciju mikotoksina su probavni trakt, pluća (udisanje spora) i koža (direktan kontakt s kontaminiranim materijalom ili čistim mikotoksinima), dok su jetra i bubrezi glavni organi za metabolizam i izlučivanje mikotoksina (Reddy et al., 2008). Utvrđeno je da pojedine vrste roda Aspergillus produkuju aflatoksine, ohratoksin proizvode vrste rodova Aspergillus i Penicillium, dok Fusarium vrste produkuju fumonozine, toksin zearalenon i strukturno blisku grupu trihotecene. Aflatoksine primarno proizvodi A. flavus (aflatoksin B1, B2, G1 i G2) i neki sojevi A. parasiticus, A. nomius i A. niger. Prema literaturnim podacima A. flavus je najzastupljenija gljiva na biljnim drogama što predstavlja opasnost od moguće kontaminacije aflatoksinima. Analizom čajeva iz prodavnica u Velikoj Britaniji, aflatoksin B1 je detektovan u uzorcima nane, kamilice, kima, lipe, pelena, timijana i morača, najviše u moraču i kamilici (Gautam and Bhadauria, 2009; Grigoryan et al., 2011). Međunarodna agencija za istraživanje kancera (IARC, 1993) je aflatokisn B1 klasifikovala u Grupu 1 humanih karcinogena i proglasila ga najjačim poznatim karcinogenom prirodnog porekla. Duže konzumiranje kod dece može uzrokovati zakržljalost u rastu, a kod odraslih ljudi povećati rizik nastajanja kancera jetre (Abbas, 2005). Metaboliti ovog mikotoksina mogu se umetnuti u DNK i alkilirati baze preko svog epoksidnog dela (Oyero and Oyefolu, 2009). Smatra se da to izaziva mutacije na p53 genu, važnom u prevenciji progresije ćelijskog ciklusa kada postoje mutacije na DNK, ili u signalizaciji apoptoze. Prema Aguilar et al., (1993) pojedina mesta tj. bazni parovi u p53 genu su osetljiviji na mutacije indukovane aflatoksinima (npr. 249 kodon). Eksperimentalno je dokazano, na različitim model sistemima, da AF-B1 mikotoksin �Ϝ Uvod 7 inhibira sintezu DNK, aktivnost RNK polimeraze, sintezu mRNK i sintezu proteina (Wang and Groopman, 1999). Vrste roda Aspergillus mogu sintetisati i druge mikotoksine kao što su patulin, sterigmatocistin, citrinin, citreoviridina i dr. u zavisnosti od vrste (Kamei and Watanabe, 2005; Bugno et al., 2006). Ochratoxin A produkt je metabolizma pojedinih vrsta rodova Aspergillus u toplijim krajevima sveta i Penicillium u hladnijim krajevima. Njegova hemijska stabilnost na visokim temperaturama i tokom prerade droge čini ga jednim od najprostranjenijih mikotoksina. Prema Međunarodnoj agencija za istraživanje kancera (IARC, 1993) ohratoksin A spada u Grupu 2 kancerogena. Smatra se da je potencijalni nefrotoksin kod ljudi, a embritoksičnost i teratogenost je dokazana kod mnogih eksperimentalnih životinja (Wyatt, 2005). Predstavnici roda Penicillium su uobičajeni kontaminanti različitih supstrata i potencijalni su producenti i drugih mikotoksina: patulin, citrinin, citreoviridin, gliotoksin, rubratoksin, sterigmatocistin i dr. (Moss, 2002). Treću grupu najčešće izolovanih mikotoskina sa biljnih droga čine fumonozini (A, B i C) koji su najpotentniji mikotoksini vrsta roda Fusarium. Stabilni su na temperaturama koje se primenjuju u termičkoj obradi biljne droge i hrane (Marasas, 2001). Proučavanja uzroka visokog stepena pojavljivanja karcinoma jednjaka u centralnoj Kini i južnoj Africi, ukazala su na prisustvo neuobičajeno visokih koncentracija fumonizina u kukuruzu, ali i pšenici, koji se koriste u ishrani ljudi u tim regionima. Fuzarin C je najznačajniji u grupi fumonozina jer se smatra da ovaj mikotoksin u većoj koncentraciji ispoljava mutagena svojstva i da prouzrokuje karcinom jednjaka ljudi (Bryden et al., 2001). Fumonozini potencijalni karcinogeni efekat ostvaruju kroz nekoliko mehanizama: prekidom biosinteze sfingolipida, poremećajima u ćelijskim lipidima, kao i indukcijom proliferacije ćelija, oksidativnog stresa, peroksidacijom lipida i proliferacijom peroksizoma (Yin et al., 1998). Zearalenoni su metaboliti nekih vrsta roda Fusarium sa estrogenim dejstvom. Potencijalno su i kancerogeni (karcinom prostate muškaraca i cervikalni kancer kod žena) jer imaju mogućnost vezivanja za lanac DNK i RNK menjajući sintezu proteina (Abid-Esefi et al., 2004). ꋠ3 Uvod 8 Predstavnici rodova Trichoderma, Trichotecium, Myrotechium, kao i neke vrste roda Fusarium mogu produkovati trihotecene koji na ćelijskom nivou inhibiraju sintezu proteina u eukariotskim ćelijskim linijama, rezultujući u inhibiciji DNK sinteze (Konishi et al., 2003). Pored pomenutih, predstavnici nekih rodova gljiva mogu sintetisati i druge vrste mikotoksina. Tako na primer vrste roda Alternaria mogu produkovati alternariol (AOH) i alternariol monometil etar (AME) za koje postoje podaci o mutagenom potencijalu (Ostry, 2008), kao i da mogu uzrokovati karcinom debelog creva ljudi. Takođe, imaju udela u etiologiji kancera jednjaka u jednoj oblasti u Kini što je povezano sa ishranom bogatom zrnastim usevima koji su u visokom procentu bili kontaminirani sa A. alternata kao i njenim toksinima (Zhang et al., 2007). Kako je potpuna eliminacija mikotoksina nemoguća, potrebno je obezbediti njihovo minimalno prisustvo u proizvodima, koje neće ugroziti zdravlje ljudi. Postoji nekoliko procedura za postžetvenu kontrolu i dekontaminaciju voća, povrća, hrane uopšte, ali gotovo nijedna adekvatna za biljne droge. Jedan od važnih uzroka je osetljiva priroda biljne droge. Kako su aflatoksini otporni čak i na temperaturu od 260°C, ni priprema čajeva na temperaturi ključanja vode ne utiče značajno na njihovu redukciju (Hashem and Alamri, 2010). Prevencija kontaminacije i rasta patogenih gljiva na lekovitom bilju je važan korak u prevenciji kontaminacije mikotoksinima. Inhibicija rasta gljiva može se postići fizičkim, hemijskim i biološkim tretmanom. Od fizičkih tretmana značajno je, brzo i dovoljno sušenje biljaka, održavanje niske temperature i vlažnosti u kontejnerima i skladišnim prostorima. Tretman biljnih droga hemijskim sredstvima (npr. sirćetna kiselina, amonijum gas i soli, vodonik peroksid, natrijum bikarbonat koji se koriste u dekontaminaciji voća i povrća) nije dozvoljen zbog osetljive prirode droge, nemogućnosti njihove eliminacije sa biljnog materijala i štetnog uticaja na ljudsko zdravlje. Usled toga, sve veća pažnja poklanja se preparatima (fungicidima) prirodnog porekla za prevenciju kontaminacije ili dekontaminaciju (Dubey et al., 2008). ꋠ3 Uvod 9 1.2. Biološka kontrola patogenih gljiva U zaštiti lekovitog bilja, useva uopšte, dominiraju hemijske mere borbe, odnosno korišćenje hemijskih sredstava u samom polju. Upotreba sintetičkih pesticida je dovedena u pitanje zbog potencijalne visoke i akutne toksičnosti, potencijalnog karcinogenog i teratogenog efekta na ciljne organizme uz postojanje mogućnosti da štetno utiču i na korisne mikroorganizme (Grahovac et al., 2009). Pored toga, zagađivači su životne sredine, zemljišta i vode, imaju dug period raspadanja i može doći do njihove akumulacije u lancu ishrane, a međuprodukti degradacije često su perzistentniji od polaznog jedinjenja (Satish et al., 2009). Saznanja o riziku pri primeni nekih insekticida i fungicida po rukovaoca, potrošača i životnu sredinu, kao i brza pojava rezistentnih jedinki u populaciji nekih štetnih vrsta, doprinela su uvođenju regulativa za zabranu ili kontrolisano korišćenje. Takođe, usled učestalog neuspeha pri rešavanju nekih oboljenja podzemnih i nadzemnih organa biljaka hemijskim fungicidima dovela su do povećanja interesa za uvođenje alternativnih mera u zaštitu lekovitog bilja, gde zasluženo mesto nalaze biološki preparati koji se smatraju bezbednim, tzv. biopesticidi (Šovljanski et al., 2004; Brar et al., 2012; Singh et al., 2012). Upotreba komponenti prirodnog porekla kao biopesticida, tzv. biološka kontrola podrazumeva primenu biljnih ekstrakata i etarskih ulja, kao i korisnih mikroorganizama ili produkata njihovog metabolizma u zaštiti bilja (Pal and Gardener, 2006). Biofungicidi, posebna grupa biopesticida, koja se koristi za suzbijanje gljiva, mogu biti na bazi korisnih gljiva i bakterija, koji kontrolišu razvoj biljnih patogena, kao i na bazi etarskih ulja ili biljnih ekstrakata. Sposobnost biofungicida da zaštiti domaćina od patogena i održi se na različitim biljkama u različitim uslovima, osnov je njihovog komercijalnog uspeha. 1.2.1. Etarska ulja u biološkoj kontroli fitopatogenih gljiva Biljke su bogat izvor metabolita za koje je dokazano da poseduju fungitoksičan efekat na rast micelija raznih fitopatogenih gljiva kao i na germinaciju spora. Posebno raste interesovanje za etarskim uljima kao mogućoj zameni konvencionalnih sintetičkih 魀' Uvod 10 fungicida u cilju zaštite kultivisanih biljaka od fitopatogenih gljiva, zbog njihove opšte prihvaćenosti od potrošača, relativne bezbednosti za upotrebu i ekološke prihvatljivosti (Abdel-Kader, 2011). Takođe, komponente etarskih ulja su zbog svog prirodnog porekla razgradive i većina od njih nema rezidua u prirodi (Klokočar-Šmit et al., 2006). Etarska ulja, sekundarni metaboliti biljaka, definišu se kao kompleksne smeše aromatičnih isparljivih komponenti. Lipofilna su i generalno se ne rastvaraju u vodi. Terpeni, ugljovodonici sa različitim brojem izoprenskih jedinica (izo-C5), su osnovni sastojci etarskih ulja koje čine monoterpeni, seskviterpeni, diterpeni i triterpeni (Chamorro et al., 2012). U monoterpene se ubrajaju monoterpenski ugljovodonici (npr. limonen, a-pinen, β-pinen, p-cimen, γ-terpinen), alkoholi (npr. linalol, geraniol, citronelol, terpinen-4-ol, borneol), epoksidi (1,8-cineol), fenoli (npr. karvakrol, timol), aldehidi (geranial, neral, citronelal), ketoni (kamfor, tujon, fenhon, menton, karvon) i estri (linalil i bornil acetat). Seskviterpeni mogu biti: ugljovodonici (hamazulen, β-farnesen, β-kariofilen), alkoholi (bisabolol), aldehidi (npr. valerenal), ketoni (npr. valeranon, akoron). Diterpeni mogu biti bicikični, triciklični i tetraciklični, dok su triterpeni tetraciklični i pentaciklični. Od ostalih, neterpenskih, komponenata važni su još različiti fenilpropanski derivati (npr. eugenol, trans-anetol, metilhavikol, cimetaldehid, miristicin), kao i isparljive supstance koje sadrže azot ili sumporna jedinjenja (Jančić, 1995; Chamorro et al., 2012). 1.2.1.1. Antifungalna aktivnost etarskih ulja i njihovih komponenata Mehanizam antifungalnog delovanja etarskih ulja je različit i zavisi od vrste ulja i njegove koncentracije. Smatra se da inhibitorna aktivnost etarskih ulja i njihovih komponenata na mikroorganizme umnogome zavisi od njihovog hidrofilog ili lipofilnog karaktera, ali i od vrste mikroorganizma, posebno od strukture ćelijskog zida i plazma membrane (Kalemba and Kunicka, 2003). Efekat etarskih ulja na gljive se može pratiti na morfološkom nivou i na nivou ćelije. Neke od morfoloških promena su izostanak sporulacije, gubitak pigmenta, aberantni razvoj konidiofora, promena u broju konidija, povećano grananje hifa ili promena u njihovoj veličini. Smatra se da su ove promene posledica delovanja ulja na 魀' Uvod 11 enzimatske reakcije sinteze ćelijskog zida što utiče na rast gljive i na morfogenezu, kao i na povlačenje citoplazme u hifama što dovodi do smrti micelijuma (Rasooli and Abyaneh, 2004; Carmo et al., 2008a). Na nivou ćelije gljiva etarska ulja najčešće deluju ili inhibicijom sinteze ćelijskog zida ili na nivou citoplazmatične membrane jer im lipofilni karakter omogućava nesmetani prolaz kroz membranu ili inkorporaciju u nju (Sikkema et al., 1995). Takođe, mogu reagovati sa proteinima ćelijske membrane (Stanković et al., 2011). Etarska ulja mogu da remete aktivnost membrane mitohondrija, odnosno aktivnost enzima u respiratornom lancu tako što ometaju transport protona i elektrona kroz membranu i potom prekidaju fosforilaciju ADP-a (Carmo et al., 2008b). Granulacija citoplazme, ruptura citoplazmatične membrane, hiperaciditet citoplazme su još neki od mehanizma vezanih za antifungalnu aktivnost etarskih ulja (Carmo et al., 2008b). Dokazano je da etarska ulja mogu inhibirati i sintezu DNK, RNK, proteina i polisaharida u ćelijama bakterija i gljiva u kojima izazivaju promene slično delovanju antibiotika (Kalemba and Kunicka, 2003). Jedan od mehanizama antifungalne aktivnosti etarskih ulja (npr. bosiljka) je i povećanje aktivnosti kataboličkih enzima diamin oksidaze (DAO) i poliamin oksidaze (PAO). Povećanjem aktivnosti ovih enzima dolazi do generisanja vodonik peroksida i naknadno do aktiviranja programirane ćelijske smrti (Griffin et al., 1999; Oxenham and Svoboda, 2005). Inhibitorna aktivnost etarskih ulja zavisi od složenih interakcija između komponenti koje ulaze u njihov sastav. Krajnji rezultat može biti aditivan, sinergistički ili antagonistički (Bakkali et al., 2008). Utvrđeno je da pojedinačno fenolne komponente etarskih ulja poseduju najjači antifungalni potencijal, a za njima po aktivnosti slede alkoholi, aldehidi, ketoni, dok najmanju aktivnost pokazuju monoterpenski ugljovodonici (Carmo et al., 2008). Fenolne komponente ostvaruju antifungalnu aktivnost pravljenjem oštećenja na ćelijskim zidovima i membranama, povećavaju osetljivost citoplazmatične membrane što dalje vodi ka povećanju njene propustljivosti, a i izazivaju precipitaciju ćelijskih proteina (Isman and Machial, 2006; Carmo et al., 2008). Utvrđeno je da inhibiraju i produkciju mikotoksina (Koul et al., 2008). Pošto su fenolne komponene i potencijalni antioksidansi, pretpostavka je da inhibiraju produkciju mikotoksina delujući na odbrambeni sistem oksidativnog stresa u mitohondrijama ćelija gljiva. Kako su Uvod 12 mitohondrije glavne za obezbeđivanje acetil-CoA, glavnog prekursora u sintezi aflatoksina, prekid respiratornog lanca u mitohondrijama se može smatrati mogućim mehanizmom inhibicije sinteze aflatoksina fenolnim komponentama (Carmo et al., 2008; Lodama, 2010). Od ostalih terpenskih komponenata, smatra se da monoterpenski alkoholi antifungalnu aktivnost ostvaruju interakcijom sa ćelijskom membranom tj. indukcijom promena u propustljivosti membrane, kao i inhibicijom respiracije (Uribe et al., 1985; Imelouane et al., 2009). Sa druge strane, oksidovani monoterpeni, kao tipične lipofilne komponente, prolaze kroz citoplazmatičnu membranu gljivičnih ćelija, remete njenu strukturu kao i transport jona, a ometaju i procese disanja na membranama mitohondrija (Deba et al., 2008). 1.2.1.2. Različiti oblici primene etarskih ulja Osim brojnih radova o antifungalnoj aktivnosti u in vitro uslovima, u novije vreme sve više je potvrda o efikasnosti etarskih ulja u prevenciji postžetvenih patogena (in situ) i efikasnosti u praktičnoj primeni (Isman and Machial, 2006). Međutim, veoma malo je studija o efikasnosti etarskih ulja u zaštiti lekovitog bilja u in vivo uslovima. Najveći broj ispitivanja posvećen je mogućoj primeni etarskih ulja u redukciji kontaminacije uskladištenog voća i povrća. Rezultati ovakvih istraživanja ukazuju da etarska ulja različitih biljnih vrsta redukuju nivo kontaminacije na takvom voću i povrću bilo njihovim prskanjem i premazivanjem, ili potapanjem u rastvor etarskog ulja. U tom smislu veliku efikasnost su ispoljila etarska ulja timijana, čajnog drveta, koprive, nane, cimeta, žalfije i eukaliptusa (Tripathi and Dubey, 2004; Abbo et al., 2009; Survilienė et al., 2009; Nabigol and Morshedi, 2011; Hadizadeh et al., 2009; Abdel-Kader, 2011). Dosadašnja istraživanja su ukazala i na druge, potencijalne oblike primene etarskih ulja u biološkoj kontroli gljiva sa voća i povrća: u procesu fumigacije voća, inkorporaciji u pakovanja sa modifikovanom atmosferom, u tretmanu zemlje u kojoj će biljka rasti, prskanjem listova biljaka u polju i dr. Fumigacija, proces dezinfenkcije gasom (fumigant), je jedan oblik moguće primene etarskih ulja. Fumigacija voća etarskim uljima i njihovim komponentama, ispoljila je veliki potencijal u kontroli fitopatogenih gljiva. U tom smislu veliku 4 Uvod 13 efikasnost pokazalo je etarsko ulje timijana, kao i timol, njegova dominantna komponeta (Liu et al., 2002). Malobrojnim istraživanjima pokazano je da se etarska ulja mogu koristiti i u fumigaciji biljaka tj. biljne sirovine u cilju biološke kontrole skladištenih gljiva (Lee et al., 2007; Dubey et al., 2008). Primena etarskih ulja je atraktivan metod u kontroli postžetvenih oboljenja u zatvorenim sistemima. Naime, zbog ograničene mogućnosti sanacije kontaminacije biljne droge tečnim agensima s jedne strane, i zadržavanja bioaktivnosti etarskih ulja u isparljivoj fazi s druge, fumigacija se nameće kao dobar metod (Tzortzakis, 2007). Potencijalna primena etarskih ulja u vidu isparljivih fungicida u suzbijanju skladišnih patogena zahteva detaljna ispitivanja njihove biološke aktivnosti i disperzije u biljnim tkivima, kao i razvoja formulacije koja će inhibirati rast patogena bez fitotoksičnih efekata (Shukla et al., 2000). Kao fumiganti, etarska ulja se mogu upotrebiti u vidu granularnih formulacija ili u vidu spreja. U Izraelu je patentirana tehnologija za postepeno, odnosno odloženo oslobađanje etarskih ulja i njihovih komponenata iz kapsula što produžava vreme njihove moguće primene (Koul et al., 2008). Inkorporacija etarskih ulja, kao i individualnih komponenata, u pakovanja sa modifikovanom atmosferom je još jedan od načina njihove moguće primene kao agensa biokontrole (Nakatsu et al., 2000). U tom smislu pokazano je da je za dugoročno čuvanje, u cilju prevencije i redukcije gljivične infekcije, najbolja polietilenska ambalaža, dok u pamučnoj i jutenoj dolazi do razvoja skladišnih gljiva (Shukla et al., 2000). In vivo istraživanja ukazuju i na efikasnost primene etarskih ulja u samom polju i to tretiranjem zemlje u kojoj će biljka rasti rastvorom etarskog ulja (Nguefack et al., 2008), ili prskanjem listova biljaka. Prskanjem listova ukrasnog bilja, ili krompira, tokom sezone, etarskim uljima karanfilića, cimeta, majorana i morača u polju primećeno je znatno smanjenje infekcije fitopatogenim gljivama (El-Mougy, 2009). U poslednje vreme, utvrđena je efikasnost kombinacije agenasa biološke kontrole sa drugim hemijskim komponentama i fizičkim tretmanima u cilju povećanja njihove aktivnosti u prevenciji i redukciji oboljenja uzrokovanih fitopatogenim gljivama. Tako je potvrđeno povećanje efikasnosti etarskih ulja u kombinaciji sa hemijskim sredstvima, kao na primer solima, kalijum sorbatom i natrijum benzoatom, ili fizičkim merama (npr. blagim povećanjem temperature) (Karatzas et al., 2000; El- ̳躰 Uvod 14 Mougy et al., 2009). Takođe su se pokazala kao efikasni agensi biokontrole u kombinaciji sa mikroorganizmima antagonistima, bilo da su u pitanju bakterije, kvasci ili gljive (Abdel-Kader et al., 2011). Za komercijalnu primenu etarskih ulja neophodno je obezbediti dovoljnu količinu standardizovanog etarskog ulja, kao i odobren patent. Potrebne su veće količine standardizovanog etarskog ulja; sastav ulja može varirati zavisno od geografskih, genetičkih, klimatskih, godišnjih ili sezonskih faktora, tako da je teže obezbediti konzistentnost. U formulaciji ovih proizvoda problem može predstavljati i održivost aktivnosti jer je pokazano da kombinacija nekih ulja sa emulgatorima može da umanji njihov antifungalni potencijal. Neophodni su takođe odgovarajući organoleptički testovi pre formulacije preparata, jer tretman ne sme da utiče na parametre kvaliteta tretirane sirovine. U pojedinim zemljama već se koriste neka etarska ulja, kao na primer ruzmarina, karanfilića i timijana kao insekticidi, fungicidi i herbicidi u poljoprivredne i industrijske svrhe i za široku potrošnju na tržištu. Tako se komercijalni proizvod SporanTM (EcoSMART Technologies), baziran na etarskom ulju ruzmarina prodaje kao fungicid, a MatranTM (EcoSMART Technologies) sa etarskim uljem karanfilića i eugenolom kao dominantnim komponentama, za kontrolu korova i patogenih gljiva (Koul et al., 2008). 1.2.2. Mikroorganizmi kao antagonisti Među različitim pristupima biološke kontrole, upotreba korisnih mikroorganizama tzv. biokontrolnih agenasa, kao što su bakterije, kvasci i gljive, je najviše ispitivana i postignuto je najviše uspeha (Droby, 2006; Sharma et al., 2009). Eksperimentalno je dokazano da filogenetski različiti mikroorganizmi deluju kao prirodni antagonisti raznih biljnih patogena. Među bakterijama to su predstavnici rodova Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas i Streptomyces, a od gljiva rodovi Ampelomyces, Candida, Coniothyrium i Trichoderma (Gravel et al., 2005; Grahovac et al., 2009; Alwathnani and Perveen, 2012; Stanković et al., 2012). Od bakterija agenasa biokontrole najviše su proučavane vrste rodova Pseudomonas i Bacillus. Vrste roda Bacillus su vrlo atraktivni mikroorganizmi za praktičnu primenu jer produkuju stabilne endospore koje im obezbeđuju otpornost na 4 Uvod 15 visoku temperaturu, isušivanje, UV zračenje i organske rastvarače (Arrebola et al., 2010). Uspeh mikrobioloških antagonista u laboratorijskim uslovima i pilot testovi sprovedeni u in vivo uslovima povećali su interes raznih agrohemijskih kompanija za razvoj i komercijalizaciju bioproizvoda koji sadrže mikroorganizme antagoniste u kontroli postžetvenih oboljenja voća i povrća. Neki od antagonista su patentirani, prihvaćeni za komercijalnu upotrebu i već se intezivno koriste. Tako, brojni sojevi, posebno vrste B. subtilis, su komercijalizovani kao biopesticidi, pri čemu su nosioci ovih preparata bakterijske ćelije ili njihovi produkti (Marone, 2002; Tomlin, 2006; Grahovac et al., 2009). Produkti metabolizma nekih mikroorganizama su kristali i antibiotici, koji štite biljke delujući antagonistički na prouzrokovače bolesti, fitopatogene mikroorganizme, štetne insekte, nematode i korove, pri čemu su bezopasni za ljude i ekološki su bezbedni. Takođe, korisni mikroorganizmi produkuju i vitamine, enzime i biljne hormone koji mogu delovati na imunski sistem biljaka, povećavajući njihovu otpornost (Pal and Gardener, 2006). Do sada formulisani biofungicidi, uglavnom se primenjuju u suzbijanju fitopatogenih gljiva sa povrtarskih biljaka u polju, ili sa uskladištenog voća i povrća. Međutim, kada je u pitanju zaštita lekovitog bilja tj. biljnih droga, gotovo da nema radova na ovu temu. Ispitivanja ovog tipa na lekovitom bilju su jako limitirana osetljivom prirodom biljnog tkiva kao i ograničenim setom metoda koje se mogu primeniti: visoka temperatura može uništiti aktivne principe u biljnom materijalu, a potapanje u vodenom rastvoru različitih agenasa je nemoguće. Kao i u slučaju etarskih ulja, prskanje biljnog materijala mikroorganizmima kao agensima biokontrole mora biti strogo kontrolisano i obavezno je organoleptičko ispitivanje nakon tretmana. 1.2.2.1. Mehanizmi antagonističke aktivnosti biokontrolnih agenasa U formulaciji bioproizvoda veoma je važno da se što bolje upozna mehanizam antagonističke aktivnosti u cilju selekcije što boljeg soja antagoniste sa što efikasnijim delovanjem. Mikroorganizmi, biokontrolni agensi, ostvaruju svoju antagonstičku aktivnost na sprečavanju razvoja ili smanjenju populacije fitopatogenih gljiva kroz 炰) Uvod 16 nekoliko mehanizama: 1) kompeticija za prostor i hranljive sastojke, 2) produkcija antibiotika i litičkih enzima, 3) indukcija rezistentnosti kod biljaka i 4) inhibicija enzima patogeneze (Gardener and Fravel, 2002). Jedan agens biokotrole može ispoljiti svoju aktivnost kroz različite mehanizme. Smatra se da se najbolji rezultati u praktičnoj primeni biokontrole postižu upotrebom dva ili više mehanizma mikrobnog antagoniste (Chiou and Wu, 2001). 1) Kompeticija za prostor i hranljive sastojke Mikroorganizmi koji nastanjuju korenov sistem biljaka su u kompeticiji za odgovarajuće mesto ali i za resurse kao što su kiseonik ili izvor azota. Biokontrola može uključiti i supresiju patogena kompeticijom za hranljive sastojke sa antagonistom, posebno za ugljenik, ali i za elemente u tragovima kao što su gvožđe, cink, bakar, magnezijum i dr. (Handelsman and Stabb, 1996). Dobar primer je kompeticija za gvožđe. Gvožđe je esencijalni elemenat za rast svih organizama i oskudnost njegove bioraspoložive forme u zemljištu rezultuje u žestokoj konkurenciji među mikroorganizmima. Zastupljeno je svuda u zemlji ali u nerastvornom obliku u vidu feri hidroksida u kojoj je nedostupan za većinu organizama. Specifični mikroorganizmi, kolonizatori korenovog sistema biljaka, su u mogućnosti da poboljšaju rast biljke i kontrolišu određene zemljišne patogene produkcijom sistema za usvajanje gvožđa tzv. siderofora. Siderofore predstavljaju jedinjenja male molekulske mase koja transportuju trovalentno gvožđe sa velikim afinitetom (Cawoy et al., 2011). Tretmanom zemljišta sojevima koje produkuju siderofore redukuje se nivo patogena tako što siderofore usvajaju gvožđe i čine ga nedostupnim za fitopatogene gljive. Siderofore mogu inhibirati klijanje hlamidospora što dalje vodi u redukciju kolonizacije i infekcije korena biljaka fitopatogenim gljivama (Buchenauer, 2005). Vezivanje antagonista za hife patogena predstavlja takođe važan faktor neophodan za kompeticiju za hranu. In vitro ispitivanja takvih interakcija su otkrila da su zahvaljujući direktnim vezivanjem za hife patogena, bakterije i kvasci antagonisti mnogo brže apsorbovali hranljive sastojke nego target patogeni i na taj način sprečili klijanje spora i rast patogena (Buchenauer, 2005). �Ϭ Uvod 17 2) Proizvodnja antibiotika i litičkih enzima Rizosferne bakterije mogu produkovati antibiotike, enzime i isparljiva jedinjenja koja mogu imati važnu ulogu u kontroli zemljišnih patogena biljaka. Antimikrobna jedinjenja, kao bakterijski agensi biokontrole, su heterogena grupa organskih jedinjenja male molekulske težine (Raaijmakers et al., 2002). Za bakterije antagoniste iz roda Bacillus je pokazano su u stanju da produkuju širok spektar sekundarnih metabolita sa antimikrobnom aktivnošću što se smatra najpoznatijim mehanizmom njihove antagonističke aktivnosti u redukciji patogena u biljnom tkivu (Ruckert et al., 2011). Ti metaboliti mogu biti: 1) toksini sa antibakterijskom aktivnošću, 2) bakteriolitički enzimi kao što su lizostafin, fosfolipaza A i hemolizini, 3) bakteriofagi i defektni bakteriofagi, 4) nusprodukti primarnog metabolizma kao što su amonijak, organske kiseline i vodonik peroksid, i različiti drugi sekundarni metaboliti koje proizvode bakterije koje imaju dokazanu antibakterijsku aktivnost, 5) antibiotske supstance kao što su gramicidin, valinomicin i bacitracin koji se sintetišu uz učešće multienzimskih kompleksa gde spadaju i lipopeptidi mikosubtilizin, iturin, surfaktin i plipastatin, i 6) bakteriocini ili molekuli koji liče na bakteriocine koji se direktno proizvode kao ribozomalno sintetisani polipeptidi (Kleinkauf and von Dohren, 1990; Venema et al., 1993; Jack et al., 1995; Walsh, 2004). Antimikrobna jedinjenja lipopeptidne strukture koje proizvode bakterije roda Bacillus su pokazala značajnu antibakterijsku i posebno antifungalnu aktivnost (Yu et al., 2002; Sicuia et al., 2011; Zhang et al., 2012). Lipopeptidi se sintetišu neribozomalno pomoću multienzimskih sistema, tzv., neribozomalnih peptidnih sintetaza (Finking and Marahiel, 2004). Mogu varirati u tipu i sekvencama aminokiselina kao i dužini i granjanju lanca masnih kiselina. Tri su glavne familije ovih antibiotika: surfaktini, iturini i fengicini, pri čemu su surfaktini i iturin A najčešće sintetisani među vrstama roda Bacillus (Ongena and Jacques, 2008). Pored ove tri glavne familije, identifikovani su i kurstakini kao bioaktivni lipopeptidi (Ritter and Washington, 2003; Stein, 2005). Lipopeptidi iz familije surfaktina imaju cikličnu strukturu građenu od sedam amino kiselina vezanu za β-hidroksi masnu kiselinu različite dužine ugljovodoničnog lanca. Ovu familiju čine surfaktin i njegovi analozi lihenizin i pumilacidin. Surfaktini Uvod 18 ispoljavaju niz bioloških aktivnosti kao što je antibiotska, antitumorska, hemolitička i anti-HIV, a i inhibiraju stvaranje fibrinskog ugruška (Maget-Dana and Ptak, 1995; Kracht et al., 1999). Smatra se da je biološka aktivnost surfaktina rezultat njihove amfifilne prirode usled koje prodiru u lipidni sloj membrane i remete njen integritet, odnosno indukuju katjonske kanale u lipidnom sloju membrane što dovodi do njene destabilizacije (Maget-Dana et al., 1992). Specifična površinska i membranska aktivnost surfaktina olakšava bakterijama stvarnje biofilma. Smatraju se najsnažnijim poznatim biosurfaktantima koji ispoljavaju aktivnost nalik deterdžentima na biološkoj membrani (Carillo et al., 2003). Biosurfaktanti su prirodna, površinski aktivna jedinjenja u čijoj se strukturi razlikuju dva dela, hidrofilni i hidrofobni. Ovakva struktura im omogućava da emulguju (sjedinjuju) supstance koje se inače ne bi mešale. Prema ranijim istraživanjima, surfaktini ne poseduju antifungalnu aktivnost. Međutim, otkriće da se surfaktini koprodukuju sa iturinom A u istom soju B. subtilis i da ispoljavaju važan sinergistički efekat na biološku aktivnost iturina A (Maget-Dana et al., 1992) izazvalo je ogromno interesovanje za oba lipopetida. Najnovija istraživanja su pokazala da pojedini lipopeptidi iz familije surfaktina, izolovani iz B. amyloliquefaciens, ispoljavaju značajnu antifungalnu aktivnost na F. oxysporum izolovanu sa korena paradajza (Vitullo et al., 2012). Fengicini A i B, takođe poznati kao plipastatini, su lipodekapeptidi sa unutrašnjim laktonskim prstenom u peptidnoj polovini i sa lancem β-hidroksi masne kiseline (C14 do C18) koji može biti zasićen ili ne. Zbog svoje amfifilne prirode, deluju kao biosurfaktanti. Fengicini antifungalnu aktivnost ostvaruju kroz inhibiciju klijanja konidija i izduživanja germinativnih tuba, kao i remećenjem strukture zida hifa (Toure et al., 2004). Na ćelijskom nivou, smatra se da fengicini reaguju sa lipidnim slojevima ćelijske membrane i da imaju mogućnost da menjaju njenu strukturu i propustljivost (Ongena and Jacques, 2007). Familiju lipopeptida tipa iturina čine iturini A-E, mikosubtilin i bacilomicin D, F i L. To su ciklični lipopeptidi koji se sastoje od sedam aminokoselinskih ostataka vezanih za β-amino masnu kiselinu u lancu dužine od C14 do C17. Za bacilomicin D je utvrđena antitumoralna, hemolitička i antifungalna aktivnost (Moyne et al., 2001), a za iturin A jaka antifungalna i hemolitička aktivnost (Ongena et al., 2007; Athukorala et al., 2009). Fungitoksična aktivnost iturina povezana je sa inhibicijom germinacije spora. Uvod 19 Na ćelijskom nivou može se reći da je osnovni mehanizam fungitoksičnosti iturina osmotski poremećaj u ćelijama putem formiranja pora za provođenje jona (Etchegaray et al., 2008; Romero et al., 2007). Za razliku od surfaktina ne prave prekide na citoplazmatičnoj membrani (Ongena and Jacques, 2008). Za lipopeptidne antibiotike je poznato da deluju sinergistički što je utvrđeno za kombinaciju surfaktina i iturina, surfaktina i fengicina, kao i iturina i fengicina (Ongena et al., 2007). Najnovija istraživanja su pokazala da antifungalna aktivnost Bacillus sp., posebno B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis i B. amyloliquefaciens, prema fitopatogenim gljivama vrsta roda Fusarium, Aspergilus i Bipolaris, na različitom voću i povrću, može biti povezana sa koprodukcijom tri ili više lipopeptidnih antibiotika (surfaktin, iturin, fengicin, bacilomicin)(Ongena and Jacques, 2008; Velho et al., 2011). Prisustvo operona za iturin i surfaktin potvrđeno je u mnogim prirodnim izolatima Bacillus sp. izolovanim iz zemljišta sa različitih lokaliteta Srbije, koji su ispoljili antimikrobnu aktivnost na fitopatogene bakterije (Berić et al., 2012, Stanković et al., 2012). Međutim, determinacija određenih antimikrobnih biosintetskih operona u određenom soju bakterije ne mora uvek da znači da će do sinteze tog antibiotika i doći (Athukorala et al., 2009). Osim antibiotika, pokazano je da mikroorganizmi antagonisti produkuju litičke enzime kao što su glukonaza, hitinaza i proteinaza što olakšava degradaciju ćelijskog zida patogenih gljiva (Huang et al., 2005). 3) Indukcija imunog odgovora biljke Neki biokontrolni agensi indukuju promene u biljci povećavajući njenu toleratnost prema patogenu, fenomen poznat kao indukovana otpornost. Bakterije antagonisti mogu da aktiviraju više mehanizama rezistencije na fitopatogene gljive, uključujući akumulaciju antimikrobnih komponenata manje molekulske mase (fitoaleksini) i stimulišu sintezu protektivnih bipolimera (kaloze). Takođe dolazi do ubrzane sinteze odbrambenih litičkih enzima, kao što su hitinaze i β-1,3-glukanaze, peroksidaze i fenilalanin amonijum liaze (Fernando et al, 2007). Pokazano je da fengicini i surfaktini mogu da ostvare interakciju sa biljnim ćelijama kao determinante 4 Uvod 20 za uključivanje imunog odgovora kroz stimulaciju fenomena indukovane sistemske rezistencije. Smatra se da ovi lipopeptidni antibiotici uzrokuju poremećaje u plazma mebrani što zauzvrat aktivira kaskadu biohemijskih procesa koji vode ka odbrambenom odgovoru (Ongena and Jacques, 2007). Indukovana otpornost ne obezbeđuje potpunu zaštitu, ali je dugotrajan fenomen i ne pogoduje razvoju rezistencije kod patogena što predstavlja dobru strategiju u biokontroli (Ongena et al., 2008). 4) Inhibicija enzima uključenih u patogenezu gljiva Sinteza hidrolitičkih enzima fitopatogenih gljiva tokom prve faze interakcije sa biljkom domaćinom je ključna u procesu infekcije. To su enzimi razgradnje ćelijskog zida kao što su pektolitički enzimi (egzo i endo poligalakturonaze, pektin liaze, pektin metil esteraze) i kutinaze koji su važni faktori patogeneze. Inhibicija sinteze ovih enzima je jedan od mehanizama agenasa biokontrole (Cawoy et al., 2011). 1.2.2.2. Unapređenje efikasnosti antagonista Primena proizvoda na bazi mikroorganizama antagonista ponekad nudi samo parcijalnu zaštitu biljaka od patogena usled povremene nedoslednosti u efikasnosti. Kako su aktivne komponente ovih proizvoda živi organizmi njihova efikasnost zavisi od uslova aplikacije, mnogo više nego za konvencionalne pesticide. Potencijalni mikrobijalni antagonist trebalo bi da ima određene željene karakteristike da bi bio efikasan u biokontroli: da bude genetički stabilan, efikasan pri niskim koncentracijama, da nema posebne nutritivne zahteve, da je efikasan u odnosu na širok spektar patogena pod različitim uslovima, rezistentan na pesticide, da ne sintetiše metabolite štetne po ljudsko zdravlje, da nije patogen za domaćina, da se može pripremiti u formi koja se efikasno može čuvati i nanositi i da je kompatibilan sa ostalim hemijskim i fizičkim tretmanima (Cawoy et al., 2011). Takođe, bakterija antagonist bi trebalo da ima adaptivnu prednost u odnosu na specifičnog patogena. Tako na primer, većina voća se skladišti na niskim temperaturama te je za kontrolu njihovih postžetvenih patogena na zadovoljavajućem nivou nepohodno da mikrobijalni antagonist može da preživi i funkcioniše pri tim temperaturama. 䑐Ϫ Uvod 21 Veoma je teško selektovati jedan soj mikroorganizma antagoniste sa širokim spektrom dejstva na razne biljne patogene. Dakle, neophodni su kompatibilni sojevi da bi se obezbedio neophodni spektar aktivnosti za efikasnu kontrolu patogena. Istovremena implementacija nekoliko aktivnih sastojaka u jednom komercijalnom proizvodu garantuje njegovu efikasnost pod različitim uslovima. U novijim istraživanjima, mešana kultura dva ili više antagonista biokontrole je pokazala veću efikasnost u biološkoj kontroli postžetvenih oboljenja u odnosu na pojedinačne (Mishra et al., 2011). U skorije vreme, osim tretmana živim bakterijama roda Bacillus ili suspenzijom njihovih spora kojima se prska bilo zemljište bilo koren biljke, započeti su in vivo tretmani biljaka sa ekstraktima peptidne strukture (Mateescu et al., 2005). Touré et al. (2004) su takođe ukazali na visoku efikasnost B. subtilis GA1 soja u inhibiciji rasta micelija gljiva uzrokovača truljenja jabuka, bilo da se u tretmanu koriste vegetativne ćelije, bilo endospore, ali i lipopeptidni ekstrakt ovog soja. Podjednako dobra efikasnost lipopeptidnog ekstrakta kao i vegetativnih ćelija ukazuje na njegovu ulogu u aktivnosti kompletnog soja kao agensa biokontrole. Osim navedenog, integracija mikrobioloških antagonista sa fizičkim metodama kao što su sušenje, tretman toplotom i nejonizujuće UV-C zračenje (od 190-280 nm), može da poboljša efikasnost antagonista u kontroli kontaminacije. Takođe, efikasnost mikroorganizama antagonista može se poboljšati ukoliko se koriste sa manjom dozom fungicida i derivatima soli (Sharma et al., 2009). Efikasnost u biološkoj kontroli postžetvenih patogena na uskladištenom voću postignuta je i kombinovanim tretmanom voća sa dva biološka agensa, bakterijom antagonistom i etarskim uljem sa antifungalnim potencijalom (Akila et al., 2011). Primena mešavine agenasa biokontrole ima određenih prednosti: a) širenje spektra aktivnosti različitih agenasa rezultuje u kontroli dva i više patogena, b) unapređenje efikasnosti i pouzdanosti biokontrole kao posledica toga da komponente u smeši deluju preko različitih mehanizama kao što je antagonizam, parazitizam i indukcija odbrambenog odgovora kod domaćina i c) teže stvaranje rezistentnih patogenih sojeva (Singh and Sharma, 2007). 䡰ϩ Cilj 22 2. CILJ Kontaminacija fitopatogenim gljivama je target problem u distribuciji biljnih preparata, kako zbog uticaja na kvalitet, tako zbog mogućnosti sinteze mikotoksina koji mogu imati teratogeni, mutageni i kancerogeni potencijal. Saznanja o riziku pri primeni nekih fungicida po rukovaoca, potrošača i životnu sredinu, dovela su do povećanja interesa za uvođenje alternativnih mera u zaštitu bilja, gde posebno mesto pripada preparatima prirodnog porekla tzv. agensima biološke kontrole koji podrazumevaju primenu korisnih mikroorganizama (korisnih bakterija, kvasaca, gljiva) ili produkata njihovog metabolizma, kao i primenu biljnih ekstrakata i etarskih ulja u zaštiti biljaka. Prepoznajući probleme i uvažavajući iznete činjenice definisani su i ciljevi ovog rada: - izolacija i identifikacija gljiva sa odabranih biljnih droga - hemijska analiza odabranih etarskih ulja - standardizacija testova za analizu antifungalne aktivnosti etarskih ulja in vitro, kao i određivanje minimalnih inhibitornih (MIC) i minimalnih fungicidnih koncentracija (MFC) - ispitivanje antagonističkog potencijala različitih izolata Bacillus sp. prema odabranim fitopatogenim gljivama - ispitivanje potencijalnog sinergističkog efekta različitih bioloških agenasa - poređenje efekata biokontrolnih agenasa. 䡰ϩ Materijal i Metode 23 3. MATERIJAL I METODE 3.1. MATERIJAL 3.1.1. Biljne droge Uzorci biljnih droga iz kojih su izolovane i identifikovane gljive obezbeđeni su iz Instituta za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“. Korišćeni su uzorci usitnjenih biljnih droga pre ulaska u proizvodni proces, kao i gotovi proizvodi tj. monokomponentni čajevi. Biljne droge u kojima je determinisana mikopopulacija su: - herba i listovi nane (Mentha piperita L.) - listovi koprive (Urtica dioica L.) - cvetovi nevena (Calendula officinalis L.) - herba rastavića (Equisetum arvense L.) - kukuruzna svila (Maydis stigmata). 3.1.2. Etarska ulja Ispitivana etarska ulja, nabavljena od kompanije Frey + Lau GmbH, Henstedt- Ulzburg, Germany, prikazana su u Tabeli1. Tabela 1. Ispitivana etarska ulja Srpski naziv ulja Latiski naziv biljke od koje je dobijeno etarsko ulje specifikacija Ulje kore cimeta Cinnamomum zeylanicum P0125285 Ulje narandže Citrus aurantium amara P0104578 Ulje bergamota Citrus aurantium bergamia P0112136 Ulje kore limuna Citrus limon P0110499 Ulje korijandera Coriandrum sativum P0112145 Ulje lista eukaliptusa Eucalyptus globulus S0100180 Ulje ploda/semena anisa Illicium verum S0100154 Ulje herbe lavande Lavandula angustifolia P0123527 Ulje cveta kamilica (plavo) Matricaria recutita P0115610 Ulje lista čajnog drveta Melaleuca alternifolia P0123084 Ulje bosiljka Ocimum basilicum P0118460 Ulje origana ** Origanum heracleoticum Srbija Ulje zdravca Pelargonium graveolens P0114231 Ulje crnog bibera Piper nigrum P0123085 Ulje ruže (parfimisano) Rosa damascena P0100578 Ulje lista ruzmarina Rosmarinus officinalis P0124476 Ulje lista španske žalfije Salvia lavandulifolia P0107205 Ulje dalmatinske žalfije Salvia officinalis P0114240 Ulje čubra Satureja hortensis P0118884 Ulje timijana Thymus vulgaris P0123774 Ulje korena vetivera Vetiveria zizanoides P0114231 Ulje ljubičice (parfimisano) Viola odorata P0105637 䡰ϩ Materijal i Metode 24 **Etarsko ulje origana dobijeno je firme Herba, Beograd. 3.1.3. Sintetički fungicid „Diflucan“ – antimikotik sa aktivnom supstancom flukonazolom (50 mg), Pfizer, Francuska. Dodavano je od 10 µl/bunaru do 50 µl/bunaru što predstavlja od 0.2 mg/ml do 2 mg/ml aktivne supstance. 3.1.4. Kolekcija prirodnih izolata Bacillus sp. Korišćeni prirodni izolati Bacillus sp., izolovani sa različitih lokaliteta u Srbiji deo su kolekcije Katedre za mikrobiologiju, Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. To su: SS-6.2, SS-10.7, SS-12.6, SS-13.1, SS-21.7, SS-27.7, SS-35.4, SS- 38.2, SS-38.3, SS-38.4, SS-39.1, SS-39.3, SS-40.2 i SS-40.6. 3.1.5. Podloge Sve podloge korišćene u ovom radu sterilisane su u autoklavu na 120°C, pri pritisku od jednog bara u trajanju od 15 minuta. Sterilnost podloga je testirana prekonoćnom inkubacijom na 37°C. Krompir-dekstrozni-agar (Potato dextrose agar - PDA) - agar………………...17g - krompir……………200g - D-glukoza………….20g - destilovana voda……1l pH = 7 (reguliše se 1N NaOH) Sabouraud - agar (SBA) - glukoza........…….....40 g - pepton...……............10 g - agar……...................18 g - destilovana voda......1l pH=5,6 (reguliše se 1N NaOH) 亐ϩ Materijal i Metode 25 Tryptic bile Soy Broth (TSB) - kazein .......................20.g - žučne soli ...................1,50g - X-B-D glukuronska kiselina ...................... 0,075g - Dimetil sulfoksid ...... 3,0g - destilovana voda……1l Muller-Hinton agar - kazein hidrolizat........ 17,5g - mesni ekstrakt ........... ..2,0g - skrob ............. ..............1,5g - agar ......................... 17g - destilovana voda……1l Za mikrodilucionu metodu, kao i za prekonoćnu kulturu Bacillus sp. izolata, korišćena je tečna podloga, bez dodavanja agra (Sabouraud maltose bujon i Muller Hinton bujon). Dihloran 18% glicerol agar (DG 18) - Kazein.........................5,0g - D-glukoza.................. 10,0g - Kalijum dihidrogen fosfat...........................1,0g - Magnezijum sulfat......0,5g - Dihloran......................0,002g - Glicerol................... 200g - Agar ......................... 12 do 15g - Hloramfenikol ...........0,1g - destilovana voda……1l 3.2. METODE 3.2.1. Identifikacija gljiva Determinacija kolonija gljiva, formiranih na medijumu, vršena je na osnovu makroskopskih i mikroskopskih karakteristika izolata. Makroskopske odlike podrazumevaju izgled i brzinu razvoja kolonija na PDA podlozi, pigmentaciju supstrata Տ墀 Materijal i Metode 26 i izgled kolonije na pozadini. Mikroskopske odlike podrazumevaju prisustvo ili odsustvo mikrokonidija, oblik i način formiranja mikrokonidija i konidiogenih ćelija, izgled makrokonidija, prisustvo ili odsustvo hlamidospora, sklerocija, biometrijske vrednosti osobina reproduktivnih organa gljiva u kulturi i na domaćinu (Indeks pojmova prikazan je u Prilogu 1). Korišćeni su standardni determinatori Booth (1971); Ainsworth et al., (1973); Pitt (1979); Gerlach i Nirenberg (1982), Brown (1987), Burgess et al. (1994); Elis i Elis, (1997), Lević (2008). Pri identifikaciji najzastupljenijih Fusarium vrsta vođeno je računa o nekim opšte prihvaćenim principima (Nelson et al., 1983). 3.2.2. Određivanje hemijskog sastava etarskih ulja Za određivanje kvalitativnog i kvantitativnog sastava etarskih ulja korišćene su GC-FID (gasna hromatografija sa plameno jonizacionim detektorom) GC-MS (gasna hromatografija sa masenom spektrometrijom) tehnike. Korišćen je gasni hromatograf Agilent 7890A opremljen split/splitless injektorom, koji je uz pomoć tehnologije kapilarnog protoka povezan na dva detektora (plameno jonizacioni i maseni). Kapilarna kolona je povezana direktno na dvokanalni razdelnik, na koji je takođe povezana po jedna kapilara (bez stanionarne faze) koje idu prema detektorima. Tokom analiza korišćena je HP-5MSI kapilarna kolona dimenzija (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) uz helijum kao noseći gas, u modu sa konstantnim pritiskom (16.255 psi). Korišćen je temperaturni program sa početnom temperaturom od 60°C i lineanim porastom od 3°C u minutu sve do 300°C, pri čemu je poslednjih 10 minuta analize temperatura zadržana na 300°C. Maseni detektor je takođe Agilent-ov kvadrupolni detektor, 5975C inert XL EI/CI MSD, a maseni spektri su snimani tehnikama elektronske jonizacije (70 eV). Uzorci su analizirani u splitless modu. Injekciona zapremina je bila 1 µl. Temperatura izvora za elektronsku jonizaciju bila je 230°C, a temperatura kvadrupola 150°C. Snimanje masenih spektara je bilo započeto 3 minuta nakon injektovanja. 3.2.3. Pripremanje koncentracije spora za mikrodilucionu metodu Gljive su gajene na PDA podlozi, u periodu od 10 do 21 dana, u zavisnosti od izolovane vrste gljive, na sobnoj temperaturi i stornirane na +4°C do daljne upotrebe (Booth, 1971). Վꠀ Materijal i Metode 27 Inokulum je pripremljen tako što su isprane spore sa površine agarnih ploča sterilnim rastvorom 0.85% NaCl-a koji sadrži 0.1% Tween 80 (vol/vol). Suspenzija spora je sterilnim rastvorom NaCl dovedena do konačne koncentracije od 1.0 x 105 CFU/ml medijuma. Tako pripremljen inokulum držan je na +4°C do upotrebe. Radi provere validnosti inokuluma, kao i odsustva kontaminacije, vršena je inokulacija na čvrstu podlogu (PDA). U epruvetu sa kulturom mikromicete sipana je određena zapremina fiziološkog rastvora i Tween 80 (oko 3 ml za slabo sporulišuće vrste, i do 5 ml za dobro sporulišuće). Sterilnim štapićem za bris pokupljene su zaostale spore sa kulture i proceđene kroz duplu sterilnu gazu u sterilnu epruvetu. Nanešeno je 50 µl inokuluma na pločicu za brojanje i prekriveno pokrovnim staklom. Na mikroskopu su pronalažene mrežice pločice i prebrojavane spore u 2-3 polja. Izračunavana je aritmetička sredina. Preračunavano je koliko µl inokuluma treba dodati u "bunarčić" mikrotitracione ploče za svaku gljivu, da bi broj spora bio približno 1 x 105 . Ukoliko je broj spora po polju bio izuzetno mali (što se vidi po velikoj zapremini inokuluma koju bi trebalo dodati u bunarčić da bi dobili željenu koncentraciju spora), sa već spranim inokulumom spirana je još jedna kultura kako bi ukoncentrisali spore. Ponavljao se ceo postupak brojanja. Ukoliko je broj spora po polju suviše veliki, da se ne može izbrojati po jednom polju, pristupalo se razblaživanju 10 ili više puta (u zavisnosti od toga koliko su spore koncentrisane), tako što se 100 µl inokuluma spora sipa u ependorf sa 900 µl fiziološkog rastvora i Tween 80 i pristupa se ponovnom računanju. 3.2.4. In vitro test za određivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja Mikrodiluciona metoda Za ispitivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja korišćena je mikrodiluciona metoda na mikrotitracionim pločama, 96-sistem (Hanel i Raether, 1988; Daouk et al., 1995). Određivanje minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC) vršeno je dodavanjem različitih, rastućih, koncentracija etarskih ulja u tečni medijum. Za svaku koncentraciju rađeno je po dve kolone, u pet ponavljanja. Na kraju je dodavan određen volumen Վ조 Materijal i Metode 28 suspenzije sa inokulumom, za svaku gljivu drugačiji, tako da konačna koncentracija bude 1,0 x 105 CFU/ml medijuma. Mikroploče inkubirane su na 28°C u trajanju od 72 sata. Najmanja koncentracija na kojoj nije bilo rasta mikromiceta uzimana je za MIC. Minimalne fungicidne koncentracije (MFC) određivane su reinokulisanjem po 2 µl iz bunarčića u kome je određen MIC u 100 µl tečnog medijuma i inkubirane sledećih 72 h na 28°C. Ukoliko nije bilo rasta, te koncentracije uzimane su za MFC. Stepen aktivnosti etarskih ulja, jak, umeren i slab, utvrđivan je u odnosu na inhibitornu aktivnost komercijalnog antibiotika, kao i literaturnih podataka. Kao kontrola je korišćen komercijalni mikotik - flukonazol. 3.2.5. Test za utvrđivanje sinergističke aktivnosti etarskih ulja Za ispitivanje potencijalne sinergističke aktivnosti između dva ulja korišćene su mikrotitracine ploče, 96-sistem. „Bunari“ mikrotitracionih ploča prvo se ispune Tryptic Soy Broth (TSB) medijumom (zapremina hranljive podloge zavisi od količine ulja koja se dodaje u bunar i od zapremine inokuluma koji drugačiji za svaku gljivu ponaosob), a zatim i etarskim uljma u koncentracijama od 1/16 × MIC do 8 × MIC i kombinuju međusobno u šahovskom stilu. Ispitivane koncentracije ulja su 1/16 ×, 1/8 ×, 1/4 ×, 1/2 ×, 1 ×, 2 × , 4 × i 8 × MIC za oba ulja, u kombinaciji svako sa svakim. Inokulum za svaku ispitivanu gljivu bio je 1.0 x 105 CFU/bunaru. Mikrotitracione ploče su inkubirane 72 h na 26°C (Jacqueline et al., 2005). Frakciona inhibitorna koncentracija (FIC - fractional inhibitory concentration) je izračunavana na sledeći način: FIC ulja A (MIC ulja A kada je u kombinaciji sa uljemB / MIC ulja A) FIC ulja B (MIC ulja B kada je u kombinaciji sa uljem A / MIC ulja B) Interakcija dva ulja, FiCindeks (FiCi), ili frakcioni inhibitorni koncentracioni indeks, se dobija po formuli: FiCi = FIC ulja A + FIC ulja B Interakcija dva ulja se definiše kao sinergizam kada je frakcioni indeks inhibitorne koncentracije FiCindeks ≤ 0,5; indiferntni efekat kada je FiCindeks 0.5-2 i antagonistički kada je FICindeks ≥ 2 (da Silva et al., 2011). ඐՏ Materijal i Metode 29 3.2.6. ISO 21527-2 metoda za brojanje kvasaca i plesni korišćena u in vitro ispitivanjima uticaja etarskih ulja na ukupan broj gljiva u biljnim drogama Pripremi se osnovno razblaženje uzorka (10-1), upotrebom 90 ml 0.1% peptonske vode kao rastvarača i 10g suve droge i homogenizuje. Odatle se pripreme ostala decimalna razblaženja. Iz poslednjeg se otpipetira 0.1ml u Petrijeve šolje sa prethodno pripremljenim DG 18 agarom i utrlja u podlogu. Podloga se okrene naopako, na poklopac, i inkubira 5 do 7 dana na temperaturi 25ºC ± 1. Posle inkubiranja, izbroje se izrasle kolonije i iskazuju kao broj kvasaca i plesni u jednom gramu ili po mililitru. 3.2.7. In vitro i in situ test za određivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja 3.2.7.1. In vitro test Potencijalna redukcija ukupnog broja gljiva u uzorku biljne droge, delovanjem odabranih etarskih ulja, određivana je dodavanjem određene koncentracije etarskog ulja (MIC vrednost preračunata za zapreminu podloge i PŠ) u ohlađenu PDA podlogu i određeno decimalno razblaženje uzorka droge u kome se prati redukcija patogena. Petrijeve šolje sa etarskim uljima i uzorcima droge gajene su na 25°C 3 do 5 dana. Nakon perioda inkubacije utvrđivan je broj gljiva na PŠ. 3.2.7.2. In situ test U in situ ispitivanjima korišćena je modifikovana metoda isparavanja etarskog ulja sa filter papira u zatvorenoj kesici sa ispitivanom drogom, tzv. „pad delivery system“ tj. „soaking pad system“ (Plaza et al., 2004; Arrebola et al., 2010). Sterilni Whatman filter diskovi, isečeni u prečniku 1 cm, nakapani su određenom koncentracijom ispitivanih etarskih ulja. Korišćene su koncentracije etarskih ulja od 10 µl/filter disku do 100 µl/filter disku. Filter papiri sa aplikovanim etarskim uljem stavljani su u sterilne kesice za filter čajeve sa koncem, a one u papirne ambalaže sa drogom koje se koriste pri pakovanju čajeva, da vise bez dodirivanja droge. Ambalaža je zatvarana i postavljena u sterilnu plastičnu kesu sa uzorkom droge. Posle 5 i 7 dana, utvrđivan je ukupan broj gljiva u uzorcima prema navedenoj, ISO metodi. �ϣ Materijal i Metode 30 3.2.8. In vitro ispitivanje antagonističke aktivnosti izolata Bacillus sp. na fitopatogene gljive Prekonoćna kultura Bacillus sp. izolata pravljena je zasejavanjem kolonije u Mueller-Hinton bujon i inkubacijom 24h na 30°C. Skrining test: Na početku je urađen skrining test u kome je ispitivana osetljivost gljiva, na sve Bacillus sp. izolate (korišćena prekonoćna kultura). Antagonistički efekat izolata Bacillus sp. testiran je in vitro, primenom metode dvojne kultivacije u Petrijevim šoljama sa PDA agarom (Fokkema,1978). PDA podloga je korišćena za kultivaciju gljiva izolovanih sa biljnih droga, dok je za kultivaciju potencijalnih antagonista, izolata Bacillus sp. korišćen Muller-Hinton agar. Disk micelijuma (6 mm u prečniku) određene gljive uziman je sa periferije kulture stare 7 dana i aseptično prenesen i postavljen naopačke na PDA podlogu, oko 25 mm od centra Petrijeve šolje. Ovako zasejana podloga inkubirana je na 25°C tokom 24h. Nakon 24h u iste Petrijeve kutije, bakteriološkom ezom su naneti ispitivani antagonisti tj. izolati Bacillus sp. na udaljenosti od 3 cm od isečka (diska) test gljive. Kontrolu su predstavljale kulture ispitivanih patogena, bez prisustva Bacillus sp. izolata. Sve kombinacije zasejanih gljiva i izolata Bacillus sp. kao antagonista, inkubirane su u termostatu 7 dana, na temperaturi od 25°C. Eksperiment je ponovljen 2 puta sa 5 uzoraka za jednu gljivu i jedan izolat Bacillus sp. Pokazatelj stepena antagonističkog delovanja bila je razlika u porastu kolonija gljiva u odnosu na kontrolu. Procenat inhibicije porasta (percent growth inhibition, PIG) je izračunat pomoću formule (Korsten et al., 1995): PIG (%) = KR – R1/KR x 100, gde je KR dužina micelije gljive (merena u mm) od mesta inokulacije do ivice (margine) kolonije u kontrolnoj Petri šolji, a R1 je dužina micelije od mesta inkulacije do margine kolonije u pravcu antagoniste tj. Bacillus izolata u test Petrijevim šoljama. Vrednosti PIG su svrstane u odgovarajuće kategorije tzv. kategorije inhibicije rasta (growth inhibition category, GIC), od 0 do 4 i to: 0 - bez inhibicije rasta; 1 - აϤ Materijal i Metode 31 inhibicija rasta 1-25%; 2 - inhibicija rasta 26-50%; 3 - inhibicija rasta 51-75; 4 - inhibicija rasta 76-100% (Korsten et al., 1995). 3.2.9. Ispitivanje sinergističke aktivnosti etarskog ulja i izolata Bacillus sp. U ispitivanjima potencijalnog sinergizma izolata Bacillus sp. i etarskog ulja u inhibiciji rasta patogene gljive primenjena je izmenjena metoda za ispitivanje antagonističke aktivnosti izolata Bacillus sp. Cela procedura je ista izuzev što su ovde u ohlađenu PDA podlogu dodavana etarska ulja određene koncentracije. Rast gljiva, kao i Bacillus sp. izolata, na podlozi sa određenom koncentracijom etarskog ulja korišćen je kao kontrola. 3.2.10. Statistička analiza Osnovni statistički parametri, standardna devijacija i standardna greška, su izračunati i predstavljeni histogramima. Podaci su analizirani standardnom analizom varijanse (ANOVA test). Srednje vrednosti MICa testiranih supstanci su dobijeni korišćenjem Dankanovog testa višestrukog opsega. Statistička značajnost primenjena u svim testovima je p<0.05. Statistička analiza je izvršena primenom softverskih programa STATISTICA v.7 (StatSoft, Inc.) i IBM SPSS Statistics v.19 (SPSS, Inc.). ?Ϥ Rezultati i diskusija 32 4. REZULTATI I DISKUSIJA 4.1. Identifikacija gljiva sa biljnih droga Biljne sirovine koje se koriste za proizvodnju različitih lekovitih biljnih preparata, obezbeđuju se ili iz spontane flore ili iz plantažne proizvodnje. U oba slučaja mogu biti mikrobiološki kontaminirane na samom izvorištu tj., mestu gajenja ili prilikom daljeg preuzimanja, distribucije, skladištenja, prerade i pakovanja. Prisustvo gljiva na lekovitom bilju osim što umanjuje njihovu mogućnost upotrebe i kvalitet, pod određenim uslovima, može takođe dovesti do produkcije toksičnih metabolita, mikotoksina. Mikotoksini su termostabilni i ne mogu se uništiti kuvanjem; imaju kumulativni efekat i teško se eliminišu iz organizma. Smatra se da najpoznatije i najvažnije mikotoksine sintetišu gljive iz rodova Aspergillus, Fusarium i Penicillium (Rizzo et al., 2004; Bugno et al., 2006; Grigoryan et al., 2011). Kada je u pitanju mikrobiološki kvalitet biljnih droga najveći problem predstavlja kontaminacija gljivama. Jedan od ciljeva ovog istraživanja bio je da se izoluju i identifikuju gljive sa biljnih droga koje se u Institutu za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“ najviše koriste u proizvodnji različitih proizvoda, posebno čajeva. Uzorci, u vidu biljnih droga, su uzeti iz magacinskih prostora pre procesa proizvodnje, ili su uzimani njihovi gotovi proizvodi (čajevi). Odabrane su biljne droge za koje se u ranijim istraživanjima, pri ispitivanju mikrobiološke ispravnosti, utvrdilo da su najviše kontaminirane različitim mikroorganizmima, posebno gljivama. Najlošiji mikrobiloški kvalitet, kada su u pitanju gljive, utvrđen je za sledeće biljne droge: kukuruzna svila (Maydis stigmata) - 82% uzoraka je bilo kontaminirano, listovi i herba nane (Mentha folium et herba) - 74% kontaminiranih uzoraka, herba rastavića (Equiseti herba) - 62%, cvetovi nevena (Calendula flos) - 56% i listovi koprive (Urtica folium) - 52% (Stević, 2009; Stević et al., 2012). Zbog lošeg mikrobiološkog statusa i zbog činjenice da su to biljne droge koje se, uglavnom koriste u proizvodnji različitih čajnih mešavina u Institutu za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“ izabrane su za dalji rad tj., za izolaciju i identifikaciju fitopatogenih gljiva. Odabrane su: nana (Mentha piperita L.), kopriva (Urtica dioica L.), neven (Calendula officinalis L.), rastavić (Equisetum arvense L.) i kukuruzna svila (Maydis stigmata). ) Rezultati i diskusija 33 Sa odabranih droga, izolovano je ukupno 48 vrsta gljiva prikazanih u Tabeli 2. prema učestalosti pojavljivanja tj., izolovanja. Tabela 2. Identifikovane gljive izolovane sa odabranih biljnih droga Biljne droge Identifikovane gljive Maydis stigmata Mucor sp. Rhizopus sp. Fusarium sp., F. proliferatum, F. vericillioides (=F. moniliforme), F. taphsinum, F. subglutinans, F. graminearum, F. nygamai, F. oxysporum, F. semitectum Alternaria sp. Aspergillus niger, A. flavus Penicillium sp. Myrothecium verrucaria Cephalosporium sp. Cladosporium sp. Nigrospora sp. Menthae folium i herba F. verticillioides, F. sporotrichioides, Fusarium sp., F. proliferatum, F. tricinctum A. flavus, A. niger, Aspergillus sp. Alternaria alternata Penicillium notatum, Penicillium sp. Phoma sp. Phomopsis sp. Verticillium dahliae, V. cynobarinum Trichoderma viride Gliocladium roseum Mucor sp. Curvularia lunata Drechslera (=Bipolaris) tetramera Rhizoctonia solani Septoria sp. Cladosporium sp. Rhizopus sp. Cercospora sp. Equiseti herba F. solani, F.equiseti, F. tricinctum, F. graminearum, F. oxysporum, Fusarium sp. A. niger, A. flavus, Aspergillus sp. Penicillium sp. Chetomium sp. Alternaria sp. Cladosporium sp. (hrebarum) Stahybotris sp Epicoccum sp. Myrothecium sp. Urtica folium F. semitectum, F. vericillioides, F. sporotrichioides, F. graminearum A. alternata, A. tenuissima Trichotecium roseum Phoma sp. Gliocladium roseum Aspergillus niger Septoria sp. Puccinia sp. Botrytis sp. Rhizopus sp. Calendulae flos Mucor sp. Rhizopus sp. Penicillium sp. A. alternata, A. teneuissima, Alternaria sp. Myrothecium verrucaria F. proliferatum, F. oxysporum, F. verticillioides Dreschlera (=Bipolaris) tetramera ꠀϤ Rezultati i diskusija 34 Iako su na svim biljnim drogama utvrđene mešovite infekcije gljivama iz različitih rodova, većina izolovanih vrsta gljiva pripada rodu Fusarium. Ranija israživanja su pokazala da od ukupnog broja identifikovanih gljiva na lekovitim biljkama 35,5% vrsta pripada ovom rodu (Pavlović, 2008). Sledeće po brojnosti u ovom radu su predstavnici rodova Aspergillus i Alternaria. Osim pomenutih, identifikovani su i predstavnici rodova: Penicillium, Phoma, Cephalosporium, Nigrospora, Cladosporium, Epicoccum, Gliocladium, Myrothecium, Cercospora, Phomopsis, Verticillum, Dreschlera (=Bipolaris), Rhizoctonia, Septoria, Trichoderma, Curvularia, Stahybotrys, Trichotecium, Puccinia, Botrytis, Mucor i Rhizopus sp., u zavisnosti od biljne droge. Ukupno je determinisano 12 vrsta roda Fusarium i to: F. vericillioides, F. graminearum, F. oxysporum, F. proliferatum, F. tricinctum, F. semitectum, F. sporotrichioides, F. taphsinum, F. subglutinans, F. nygamai, F. solani i F. equiseti. One dominiraju prema učestalosti na nani, rastaviću i koprivi, dok na osušenoj drogi nevena i kukuruzne svile prema učestalosti pojavljivanja dominiraju predstavnici rodova Rhizopus i Mucor. Od rodova Aspergillus, Alternaria i Verticillium identifikovano je po dve vrste, a od ostalih rodova po jedna (Tabela 2.). Na svim odabranim biljnim drogama identifikovani su i predstavnici roda Alternaria, dok vrste roda Aspergillus nisu izolovane i identifikovane samo iz uzoraka cveta nevena. Slično ovome, predstavnici roda Penicillium identifikovani su u svim biljnim drogama sem koprive. Pojedine gljive determinisane su samo do nivoa roda; za detaljniju determinaciju bila bi neophodna PCR analiza. Za dalji rad, prema zastupljenosti na biljnim drogama, izabrane su vrste koje će biti opisane. 4.1.1. Rod Fusarium Rod Fusarium kolektivno predstavlja najvažniju grupu biljnih patogena uzrokujući različita oboljenja na skoro svakoj, ekonomski važnoj, biljnoj vrsti. Ovaj rod sadrži veliki broj vrsta. Među vrstama roda Fusarium u našem radu najveći broj izolovan je i identifikovan sa kukuruzne svile (8 vrsta) i herbe rastavića (6 vrsta), sa nane i koprive 4, a sa nevena 3 vrste. Rezultati i diskusija 35 F. verticillioides je dominantni predstavnik na izabranim biljnim drogama, izolovan sa svih sem sa herbe rastavića. F. graminearum, F. oxysporum i F. proliferatum su izolovani sa tri biljne droge, F. tricinctum, F. semitectum i F. sporotrichioides sa dve, a ostale, F. taphsinum, F. subglutinans, F. nygamai, F. semitectum, F. solani i F. equiseti, sa jedne biljne droge (Tabela 2.). 4.1.1.1. Fusarium verticillioides /Sacc./ Nirenberg (sin: F. moniliforme Sheldon) F. verticillioides (do skora F. moniliforme) je izolovana i identifikovana iz uzoraka svih biljnih droga sem herbe rastavića. To je kosmopolit, patogen mnogih biljnih vrsta, voća i žita. Formira obilnu, vunastu, beličastu vazdušnu miceliju koja kasnije poprima nijanse svetlo i tamno ljubičaste (Slika 1a). Boja micelije i pigmentacija podloge znatno varira u zavisnosti od izolata. Na PDA podlozi micelija raste veoma brzo, obrazuje kolonije prečnika 7,5 – 8 cm nakon 6 dana pri 25°C, u tami. Mikrokonidije su jednoćelijske, retko sa jednom septom, ovalne, hijalinske, formiraju se na vrhu monofijalida, u vidu dužih ili kraćih nizova ili lažnih glavica. Makrokonidije (Slika 1b) se formiraju retko na monofijalidama, prave su ili blago povijene, tankih zidova, vršna ćelija je sužena pri vrhu, bazalna sa petom, sa 3-5 septi, hijalinske su. Hlamidospore su odsutne kod svih izolata. a) b) Slika 1. Fusarium verticillioides - izolat sa nevena, izgled: a) vazdušne micelije i b) mikro- i makrokonidija (uveličanje 400 ×) ꠀϤ Rezultati i diskusija 36 4.1.1.2. Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend. Snyder & Hasen F. oxysporum je izolovana iz uzoraka cvetova nevena, kukuruzne svile i herbe rastavića. To je kosmopolitska vrsta, ali njeni različiti oblici imaju različite stepene distribucije. Uzrokuje vaskularno uvenuće biljaka kao i truljenje korena. Vazdušna micelija raste veoma brzo, obrazuje kolonije prečnika 7,5 – 8 cm nakon osam dana, pri optimalnoj temperaturi od 25°C, u tami. Na PDA podlozi mogu da se razviju različite forme F. oxysporum tj., postoji velika varijabilnost između izolata ove vrste u pogledu strukture i boje vazdušne micelije i pigmentacije supstratne micelije (Pavlović, 2008). Boja micelije izolata vrste F. oxysporum varira od svetle, bledoljubičaste do boje crvenog vina u zavisnosti od porekla izolovane kulture tj., vrste biljne droge sa koje je izolovana (Slika 2a i b). Zbog obrazovanja brojnih plavih sklerocija ili svetložutih, mrkih ili narandžastih sporodohija, kolonije mog imati i ove boje. Pigment u podlozi je bež, tamnoplav, tamno ljubičastocrven, i samo ponekad nije prisutan. F. oxysporum produkuje tri tipa aseksualnih spora: mikrokonidije, makrokonidije i hlamidospore (Slika 2c). Mikrokonidije su jedno- ili dvoćelijske i njih ova vrsta produkuje najčešće i najobilnije, pod svim uslovima. Ovaj tip spora se najčešće produkuje unutar sudova inficirane biljke. Makrokonidije su neznatno savijene, skoro prave, kratke sa 3 do 5 septi. Ove spore se uobičajeno nalaze na površini biljaka na kojima se nastanila ova gljiva. Hlamidospore su okrugle, debelih zidova koje se sintetišu bilo terminalno ili interkalarno na starijem micelijumu ili u makrokonidiji. F. oxysporum može da preživi ili u vidu micelijarne forme ili u vidu spora. a) b) c) Slika 2. Fusarium oxysporum – izgled vazdušne micelije izolata sa: a) nevena i b) kukuruzne svile i c) izgled hlamidospora (izolat sa nevena), pri uveličanju od 400 × Rezultati i diskusija 37 4.1.1.3. Fusarium sporotrichioides Sherbakoff Ova vrsta izolovana je i identifikovana sa listova nane i koprive. Nalazi se uglavnom u oblastima sa hladnom i umerenom klimom. Na PDA podlozi micelija raste veoma brzo, obrazuje kolonije prečnika 7,5 – 8 cm nakon četiri dana, pri 25°C, u tami. Vazdušna micelija je rastresita do gusta, beličasta ili ružičasta do crvenkastosmeđa u starijim kolonijama (Slika 3a.). Obrazuje obilno mikrokonidije, dok su makrokonidije savijene, srednje dužine, postepeno sužene prema krajevima, sa 3 do 5 poprečnih pregrada. Hlamidospore su loptaste žutosmeđe, pojedinačne ili u nizovima (Slika 3b). a) b) Slika 3. Fusarium sporotrichioides - izolat sa koprive, izgled: a) vazdušne micelije i b) makrokonidija (uveličanje 400 ×) 4.1.1.4. Fusarium tricinctum (Corda) Saccardo Izolovana je iz uzoraka herbe rastavića, kao i lista i herbe nane. Široko rasprostranjena vrsta, posebno u oblastima sa umerenom klimom, izolovana sa mnogih kultivisanih biljaka. Na PDA podlozi micelija raste srednje brzo, obrazuje kolonije prečnika 4,5 – 6 cm nakon 10 dana, pri 25°C, u tami. Ivica kolonije je više-manje nepravilna. Vazdušna micelija je obilna, pamučasta, gusta, bela i ružičasto-bela, dok je u starijim kulturama intezivno karmin crvena ili narandžasto-smeđa (Slika 4.). Obrazuje mikrokonidije, dok su makrokonidije savijene ili srpaste, srednje duge, sa 3 do 5 pregrada. ) Rezultati i diskusija 38 Slika 4. Fusarium tricinctum – izgled vazdušne micelije izolata sa nane 4.1.1.5. Fusarium subglutinans (Wollenw. & Reinking) Nelson, Toussoun & Marasas comb. Nov. Kosmopolitska vrsta, izolovana sa kukuruzne svile, preovlađuje u oblastima sa umerenom klimom u kojima prouzrokuje bolesti različitih biljnih vrsta, posebno žitarica. Kolonije ove gljive obrazuju retku, belu vazdušnu miceliju, koja kod nekih izolata vremenom postaje ljubičasta ili sivo ružičasta (Slika 5.). Pigmentacija u podlozi varira od svetlo smeđe, svetlo ljubičaste do tamno purpurne, skoro crne. Na PDA podlozi micelija raste veoma brzo, obrazuje kolonije prečnika 7,5 – 8 cm nakon osam dana, pri 25°C u tami. Obrazuje ovalne ili cilindrične, uglavnom neseptirane, ili sa jednom septom, mikrokonidije. Makrokonidije su duge hijalinske, blago savijene ili ravne, uglavnom sa vršnom ćelijom u obliku kuke i bazalnom u obliku stopala. Makrokonidije su najčešće sa tri do pet septi. Svi izolati F. subglutinans formiraju mezokonidije. Slika 5. Fusarium subglutinans - izgled vazdušne micelije izolata sa kukuruzne svile Rezultati i diskusija 39 4.1.1.6. Fusarium semitectum Berkeley & Ravenel U ovom radu izolovana je sa kukuruzne svile i koprive. Kosmopolitska vrsta, nalazi se u zemljištu u oblastima tropske i umerene klime. Na PDA podlozi micelija raste veoma brzo, obrazuje kolonije prečnika 7,5 – 8 cm nakon osam dana, pri 25°C, u tami. Micelija je vazdušna bela, gusta, bujna i vunasta. Vremenom dobija boju breskve (Slika 6a.). Pigment u podlozi je bledosmeđ do tamnosmeđ, nikada crven, ljubičast ili plavičast. Konidiofori ove vrste su tipa mono- i polifijalida. Ne obrazuje mikrokonidije, dok su makrokonidije prave do blago savijene, relativno duge, najčešće sa 3-5 septi (Slika 6b.). Hlamidospore su loptaste, pojedinačne, ili u vidu kratkih nizova. a) b) Slika 6. Fusarium semitectum - izolat sa koprive, izgled: a) vazdušne micelije i b) makrokonidija (uveličanje 400 ×) 4.1.1.7. Fusarium solani Martius F. solani, izolovana je sa herbe rastavića. Kosmopolitska vrsta, najčešće prisutna u zemljištu, a prouzrokuje trulež korena i uvenulost brojnih biljnih vrsta. Na PDA podlozi micelija raste veoma brzo, obrazuje kolonije prečnika 7,5 – 8 cm nakon osam dana, pri 25°C, u tami. Vazdušna micelija je razređena, pamučasta, obično bela do svetložuta (Slika 7.). Može biti i plavozelene boje zbog sporodohija. Pigment u podlozi je odsutan ili bledo do tamnnoljubičast, mrkožut s plavom nijansom ali nikada narandžast. Makrokonidije su blago savijene, valjkaste, krupne, sa 3 do 5 poprečnih septi, ređe 7, formiraju se na monofijalidama na razgranatim konidioforama u sporodohijama, a u manjoj meri na monofijalidama na hifama. Mikrokonidije se obilno formiraju nakon 䁀Ϥ Rezultati i diskusija 40 tri dana u "lažnim glavicama" na dugačkim monofijalidama. Hlamidospore su poluloptaste ili loptaste, uglavnom pojedinačne ili u parovima. Slika 7. Fusarium solani - izgled vazdušne micelije izolata sa rastavića 4.1.1.8. Fusarium equiseti (Corda) Saccardo F. equiseti izolovana je sa herbe rastavića. To je kosmopolit, preovlađuje u oblastima sa suvom klimom, kao saprob u zemljištu i biljni patogen; prouzrokuje trulež korena različitih vrsta biljaka. Vazdušna micelija raste brzo na PDA podlozi, obrazuje kolonije prečnika 6 – 8 cm nakon 6 dana, pri 25°C, u tami. Ujednačeno je pamučasta, bela do ružičasta i bež do žutosmeđa u starijim kulturama (Slika 8a.). Pigment u podlozi je bež, oker, svetložut, a nikada crven, ljubičast ili plavičast. Mikrokondije ne obrazuje, dok su makrokonidije srpaste, karakteristične savijenosti, najčešće sa 3 do 5 ili 7 pregrada (Slika 8b.) Vršne ćelije su više ili manje izdužene, ponekad kao bič što ističe savijenost konidija. Brojne hlamidopsore, loptaste u grupama, ređe pojedinačne, obrazuje veoma brzo te ih je lako uočiti pri mikroskopiranju kultura in situ. a) b) Slika 8. Fusarium equiseti - izolat sa rastavića, izgled: a) vazdušne micelije i b) makrokonidija (uveličanje 400 ×) ) Rezultati i diskusija 41 4.1.2. Rod Alternaria Gljive roda Alternaria su sveprisutni patogeni i saprofiti. Vrste ovog roda su uglavnom izolovane iz biljaka, zemljišta, uskladištene hrane i vazduha prostorija. Mnoge vrste roda Alternaria najčešće prouzrokuju kvarenje različitih useva na polju ili propadanje posle berbe. Zbog njihove sposobnosti rasta čak i pri niskim temperaturama (od – 2 do 5°C), odgovorne su i za kvarenje ovih useva tokom transporta i skladištenja u hladnjačama. Nekoliko vrsta ovog roda proizvode toksične sekundarne metabolite – Alternaria mikotoksine. Predstavnici ovog roda izolovani su i identifikovani iz svih biljnih droga ispitivanih u ovom radu. 4.1.2.1. Alternaria alternata (Fries) Keissler Vrsta je ekstremno česta kao saprob na biljkama, prehrambenim proizvodima, tekstilu i zemljištu. Spore su često prisutne u vazduhu, kućnoj prašini, vlažnim zidovima itd. Ova vrsta je identifikovana iz uzoraka nane, koprive i nevena. Gljiva brzo raste na PDA podlozi, ispunjavajući Petri kutiju u toku 7-10 dana. Kolonije su ravne, paperjaste do vunaste, postaju pokrivene sivkastim, kratkim, vazdušastim hifama tokom vremena. Površina je sivkasto bela na početku a kasnije tamni i postaje zelenkasto crna ili maslinasto braon sa svetlim granicama (Slika 9a.). Zadnja strana kolonije je tipično braon, do crna. Tamna obojenost posledica je pigmenta melanina koja im obezbeđuje rezistentnost na UV-zrake. Konidiofore su svetlo do maslinasto braon boje, individualne su, rastu direktno iz supstrata formirajući duge lance konidija, dok su sekundarne konidiofore kratke. Konidije (Slika 9b.) su svetlo braon boje. Zbog veoma velikog broja spora, A. alternata spada u mikromicete koje najčešće izazivaju alergije koje mogu dovesti do astme umerenog tipa. Takođe, mođe uzrokovati polensku groznicu, pneumonitis, sinuzitis; veoma retko može izazvati oštećenje mozga. 㢰Ϥ Rezultati i diskusija 42 a) b) Slika 9. Alternaria alternata – izolat sa nane, izgled: a) vazdušne micelije i b) spora (uveličanje 400 ×) 4.1.2.2. Alternaria tenuissima (Kunze) Wiltshire Vrsta je izolovana iz uzoraka koprive i nevena. A. tenuissima je biljni patogen koja na PDA podlozi nakon 4 do 5 dana inkubacije, pri 26°C, i fotoperiodom od 12h, formira ravne kolonije sa hrapavom gornjom površinom. Periferija kolonije je maslinasto zelena sa crnim centrom sa belim mrljama (Slika 10.). Konidiofore su kratke. Broj horizontalnih septi u konidijama varira od 1 do 6, a vertikalnih od 0 do 2. Ovo su morfološke karaktiristike konidiofora i konidija po kojima se identifikuje ova vrsta. Slika 10. Alternaria tenuissima - izgled vazdušne micelije izolata sa koprive 4.1.3. Rod Phoma Vrste ovog roda su filamentozne gljive, kosmopoliti, nastanjuju zemljište i česti su biljni patogeni. U ovim istraživanjima Phoma sp. determinisana je u uzorcima koprive i nane. Rezultati i diskusija 43 Kolonije roda Phoma rastu veoma brzo pri temperaturi 25ºC, praškastog su ili baršunastog izgleda i velikim delom uronjene u medijum. Sa prednje strane boja kolonije je inicijalno bela čije središte postepeno tamni i postaje maslinasto siva do crna (Slika 11a.). Na poleđini, kolonija je tamno braon do crna. Neke vrste, posebno Phoma cruris-hominis i Phoma herbarum, produkuju crvenkasto-ružičaste do žućkasto-braon pigmente. Mikroskopski su vidljive septirane hife, piknidije, konidije i hlamidospore koje se formiraju samo kod nekih vrsta. Hife su hijalinske do braon, a crne sferične piknidije su koncentrično raspoređene (Slika 11b.) i formiraju se nakon 10 dana. Konidije su jednoćelijske, hijalinske, dok samo pojedine vrste produkuju hlamidospore koje su jedno- ili višećelijske. a) b) Slika 11. Phoma sp. – izolat sa koprive, izgled: a) vazdušne micelije i b) piknidija 4.1.4. Rod Phomopsis Široko rasprostranjen rod, poznat kao patogen raznih biljaka npr. suncokreta i kruški (Živković et al., 2007), u našem radu izolovan sa listova nane. Gljiva ne poseduje kutinaze, dakle ni sposobnost da prodre kroz intaktnu kutikulu, već je neophodna rana na biljci da bi u nju prodrla. Bolesti izazvane ovom gljivom su retko viđene na zelenom voću u polju, uobičajenije je na voću koje je potpuno sazrelo. Podaci ukazuju da vrste ovog roda mogu uzrokovati truljenje voća nakon berbe, posebno na oštećenom voću (Luongo et al., 2011). ) Rezultati i diskusija 44 Brzo razvija vunastu ili pamučastu miceliju koja je inicijalno bela i postepeno se pretvara u svetlo sivu ili svetlo braon boju na PDA podlozi (Slika 12a.). Piknidije se formiraju na PDA podlozi pod kontinualnim fluorescentnim svetlom u roku od tri nedelje i gljiva sporuliše jednu do dve nedelje kasnije. Konidije su srpaste, jednoćelijske, tzv., β-konidije a α-konidije su ovalne (Slika 12b.). a) b) Slika 12. Phomopsis sp. – izolat sa koprive, izgled: a) vazdušne micelije i b) α- i β- konidija (veličanje 400 ×) 4.1.5. Curvularia lunata (Wakker) Boedijn Vrste roda Curvularia su uglavnom suptropski i tropski biljni paraziti, mada ima i predstavnika koji su svuda rasprostranjeni (Curvularia lunata, C. pallescens i C. geniculata). C. lunata je najčešća vsta ovog roda, široko rasprostranjena na različitim usevima; česta je na podovima, u prašini dušeka, tapetama i obojenim zidovima. Izolovana je sa listova nane. Produkuje veoma brzo vunaste kolonije na temperaturi od 25°C na PDA podlozi. Kolonije su bele boje do ružičasto-sive na početku a zatim prelaze u maslinasto-braon ili crnu, kako kolonije sazrevaju (Slika 13a.). Na zadnjoj strani je tamno braon do crne boje. Konidije su svetlo braon sa tri ili više transverzalnih septi, cilindrične ili blago zakrivljene, sa jednom centralnom ćelijom koja je veća i tamnija (Slika 13b.). Rezultati i diskusija 45 a) b) Slika 13. Curvularia lunata – izolat sa nane, izgled: a) vazdušne micelije i b) konidija (uveličanje 400 ×) 4.1.6. Trichoderma viride Persoon C.H. Trichoderma je jedan od najrasprostranjenijih zemljišnih rodova gljiva, uglavnom je neškodljivi saprofit, mada postoji izvestan broj biljnih patogena. U vlažnim kućama izolovana je iz vazduha i prašine, mada se može naći na tapetama i na pločicama. Može da sintetiše više različitih litičkih enzima uključujući celulaze i hitinaze, te zbog toga vrste ovog roda mogu živeti direktno na drvetu, parazitirati na gljivama, a i jedan je od prvih kolonizatora stelje. Čest je uzročnik postžetvenog truljenja različitih biljnih vrsta, voća i povrća. T. viride ima karakterističan širok rast, dostiže 7 cm za 5 dana, pri 25°C. Izolovana je sa listova nane. Kolonije su beličaste do svetlo zelene, poleđina je svetla ili žućkasta (Slika 14.). Konidiofore su obilno granate i često formiraju koncentrične krugove. Fijalide su tipično uvećane (proširene) u sredini, mogu biti cilindrične ili približno okrugle. Konidije se formiraju za nedelju dana, zelene, žute ili ređe bele. Konidije su kod većine vrsta elipsoidne. Slika 14. Trichoderma viride – izgled vazdušne micelije izolata sa nane 䌐Ϥ Rezultati i diskusija 46 4.1.7. Rod Aspergillus Aspergillus flavus i Aspergillus niger su predstavnici ovog roda koji su, uz predstavnike roda Fusarium, najčešće izolovani iz svih uzoraka biljnih droga, sem cvetova nevena. Prema literaturnim podacima, ove dve vrste su, uz pojedine predstavnike roda Penicillium, dominantni kontaminanti uzoraka lekovitog i začinskog bilja (Bugno et al., 2006). Prisustvo vrsta Aspergillus i Penicillium na biljnim drogama može značiti da su biljke kontaminirane pre kompletnog sušenja. 4.1.7.1. Aspergillus flavus Link H.F. A. flavus je u ovom radu izolovana i identifikovana iz uzoraka nane, kukuruzne svile i rastavića. Ima široko rasprostranjenje i normalno se pojavljuje kao saprofit u zemlji i na raznim oblicima organskih materija u raspadanju, na hrani, drvetu, pticama, pamuku, građevinskom materijalu i dr. Koristi se za proizvodnju različitih enzima, amilaze, keratinaze, lipaze i dr. Poseduje mogućnost razlaganja karboksimetil-celuloze i n-alkana. Kolonije na PDA podlozi brzo rastu, maslinaste su do limun zelene sa krem naličjem; sa starenjem postaju tamno žuto-zelene (Slika 15a.). Vunaste ili pamučne je teksture, ponekad granularne. Sklerocija, kada je prisutna, je najpre bele, kasnije braon- crne boje. Hife su septirane i hijalinske, konidiofore su grubo hrapave, neobojene, loptaste; konidije su loptaste (Slika 15b.). a) b) Slika 15. Aspergillus flavus - izolat sa rastavića, izgled: a) vazdušne micelije i b) konidija (uveličanje 400 ×) ) Rezultati i diskusija 47 4.1.7.2. Aspergillus niger Arthur de Cock A. niger je jedna od najčešćih vrsta roda Aspergillus koja se veoma lako identifikuje i koja brzo raste na svim podlogama pri 25°C. Izolovana je sa svih biljnih droga osim nevena. Micelijum se sastoji od kompaktne bele ili žute osnove prekrivene gustim slojem tamno-braon do crnih glavica, konidijama (Slika 16.). Konidijalne glave su velike, loptaste, tamno braon. Konidiofore su glatkih zidova. Sklerocije su kremaste. Slika 16. Aspergillus niger – izgled vazdušne micelije izolata sa koprive 4.1.8. Trichothecium roseum Link H.F. T. roseum je filamentozna gljiva rasprostranjena širom sveta i često se izoluje sa biljnog materijala koji truli, trulog voća, semenja, iz zemljišta, prehrambenih namirnica (posebno proizvoda od brašna). Gljiva je izolovana sa listova koprive. Kolonije rastu umerenom brzinom na PDA pri 25°C, ravne su, prašnjavog izgleda (Slika 17a.). S prednje strane bele je boje u početku, sa sazrevanjem postaju bledo ružičaste do boje breskve, a pozadina je bleda. Obrazuje hijalinske hife, konidiofore i konidije. a) b) Slika 17. Trichothecium roseum – izolat sa koprive, izgled: a) vazdušne micelije i b) konidija (uveličanje 400 ×) 㪐Ϥ Rezultati i diskusija 48 Konidiofore su duge i negranate, često septirane blizu osnove, manje ili više grubih zidova i nose cik-cak lance konidija na vrhu (apeksu). Konidije su dvoćelijske, elipsoidne, blago debelih zidova, hijalinske do svetlo obojene (Slika 17 b.). 4.1.9. Verticillium dahliae Klebahn V. dahliae je široko rasprostranjena filamentozna gljiva koja nastanjuje zemlju i stelju. Izolovana je sa nane. V. dahliae ima širok spektar domaćina, preko 300 vrsta drvenastih i zeljastih biljnih vrsta je osetljivo na ovaj patogen. Veoma retko izazivaju bolesti kod ljudi. V. dahliae pripada klasi gljiva koje nemaju seksualnu fazu. Na PDA podlozi, pri 25°C, vegetativni micelijum raste umereno brzo, baršunastog do vunastog je izgleda, bele do bledo žute boje, vremenom postaje ružičasto-braon, crven, zelen ili žut (Slika 18a.). Na poleđini je beo ili žut. Konidiofore su obično dobro diferencirane, vertikalno razgranate sa vitkim, šilu nalik, fijalidama. Grananje konidiofora se javlja u nekoliko nivoa i nose fijalide koje su veoma duge. Svaka fijalida nosi masu konidija koje su svetle, jednoćelijske, pojedinačne ili u klasterima (Slika 18b.). Fijalide su specijalizovane hife formirane u spirali oko svake konidiofore. Rod Verticillium je dobio ime po spiralnom (pršljenastom) aranžmanu fijalida na konidioforama. a) b) Slika 18. Verticillium dahliae – izolat sa nane, izgled: a) vazdušne micelije i b) konidiofora sa fijalidama (uveličanje 400 ×) V. dahliae može da prezimi u vidu micelijuma u višegodišnjim biljkama, u biljnom otpadu. U zemlji može da preživi 10 godina i više u vidu tanke, crne, semenu 䑰Ϥ Rezultati i diskusija 49 nalik, strukture tzv. mikrosklerocije, što predstvalja ogroman problem u kontroli ove gljive. Mikrosklerocije mogu da se razviju čak i na korenu mnogih rezistentnih biljaka a da ne izazovu simptome. 4.1.10. Gliocladium roseum Bainier Vrste roda Gliocladium su rasprostranjene svuda po svetu i mogu se izolovati iz širokog spektra biljnog otpada i zemljišta. U našim ispitivanjima izolovana je G. roseum sa herbe i listova nane, kao i listova koprive. Gliocladium roseum ima brzorastuće kolonije, paperjaste teksture, bele u početku, ponekad roze do losos tamne, postajući vremenom, sa sporulacijom, bledo do tamno zelene (Slika 19.). Jedna od najvažnijih karakterističnih tvorevina roda je posebno izgrađene guste konidiofore sa fijalidama koje nose sluzave jednoćelijske konidije glatkih zidova. Slika 19. Gliocladium roseum – izgled vazdušne micelije izolata sa koprive 4.1.11. Myrothecium verrucaria (Alb. & SCHwein.) Ditmar M. verrucaria je najčešća vrsta roda Myrothecium. Prirodno stanište su pečurke, trava i zemljište. Izolovana je sa kukuruzne svile i herbe rastavića. Biljni je patogen i visoko potentni je razlagač celuloze. Slika 20. Myrotechium verrucaria - izgled vazdušne micelije izolata sa rastavića ) Rezultati i diskusija 50 U pitanju je spororastuća vrsta čiji je talus baršunasto beo sa zelenkasto crnim sporama (Slika 20.). Pozadina je žućkasta, kremkasta do ružičasta na periferiji. Fijalide su cilindrične, prikupljene u klustere od po 2 ili 6, konidije su maslinaste, jednoćelijske. Rast ove vrste blago modifikuje pH medijuma do 5.5. 4.1.12. Chaetomium sp. Lodha Predstavnici roda Chaetomium su filamentozne gljive, kosmopolitski rasprostranjene, nastanjene na različitim supstratima koji sadrže celulozu, uključujući i papir i biljni kompost. Najčešće rastu u zemlji, semenju, celuloznim supstratima, đubrivu, drvenom i slamastom materijalu, ali i vazduhu. Izolovana je sa rastavića. Rod Chaetomium ima nekoliko vrsta, najčešće su C. atrobrunneum, C. funicola, C. globosum i C. strumarium. Kolonije brzo rastu, u početku su pamučaste i bele boje, dok zrele kolonije postaju sive do maslinaste boje (Slika 21a.). Na poleđini, boja je drap do crvena ili braon-crna. Hife su septirane, poseduju peritecije, askus i jednoćelijske askospore u obliku limuna (Slika 21b.) te se veoma lako identifikuju. a) b) Slika 21. Chaetomium sp. – izolat sa rastavića, izgled: a) vazdušne micelije i b) askospora (uveličanje 400 ×) 4.1.13. Rod Penicillium Vrste roda Penicillium izolovane su iz uzoraka kukuruzne svile, herbe i lista nane, kao i herbe rastavića. Vrste su rasprostranjene u zemljištu, najviše u zoni hladne i umerene klime, svuda gde je organski materijal dostupan. 㮀Ϥ Rezultati i diskusija 51 Poznate kao plesni, vrste ovog roda su glavni uzročnici kvarenja hrane. Mnoge vrste mogu produkovati visoko toksične mikotoksine. Sposobnost Penicillium vrsta da rastu na semenima i uskladištenim namirnicama tj. hrani pripisuje se njihovoj mogućnosti da napreduju pri niskoj vlažnosti i da se brzo disperzuju kroz vazdušni prostor dok su semena dovoljno vlažna (Pitt et al., 2000). Penicillium vrste su prisutne i u vazduhu i prašini unutar stanova ili javnih zgrada. Mogu rasti čak i kad je vlažnost vaduha vrlo niska. Micelija se tipično sastoji od vrlo razgranatih višejedarnih, septiranih, obično bezbojnih hifa. Razgranate konidiofore niču na miceliji noseći zelene konidiospore koje su glavni put rasprostranjena ove gljive (Slika 22a.). Seksulana reprodukcija podrazumeva produkciju askospora. Mikroskopski, lanci jednoćelijskih konidija se razvijaju od specijalizovanih konidiogenih ćelija nazvanih fijalide. U ovim nizovima najmlađe konidije su na bazalnom ili proksimalnom kraju lanca. Kod vrsta roda Penicillium fijalide se mogu stvarati pojedinačno, u grupi ili formirati razgranate „metlice“ formirajući tvorevine nalik četki. Grananje može biti bilo jednostavno (negranate ili monoverticilate); u jednom nivou (biverticilate-simetrično); grananje u dva nivoa (bivericilate-asimetrično); u tri i više nivoa. Konidiofore su hijalinske i mogu biti glatkih ili rapavih zidova. Fijalide se obično sastoje od cilindričnog bazalnog dela i posebog vrata. Konidije su loptaste ili cilindrične, hijalinske ili zelenkaste, glatkih ili rapavih ivica (Slika 22b.). Neke vrste mogu produkovati sklerocije. a) b) Slika 22. Penicillium sp. – izolat sa herba rastavića, izgled: a) vazdušne micelije i b) konidiofora sa fijalidama i konidijama (uveličanje 400 ×) 䗠Ϥ Rezultati i diskusija 52 4.2. Hemijski sastav i antifungalna aktivnost etarskih ulja Rezultati dobijeni u ovom radu ukazuju na obimnu i raznovrsnu mikopopulaciju izolovanu sa biljnih droga, nane, kukuruzne svile, rastavića, koprive i nevena, koje su se u ranijim istraživanjima pokazale kao droge sa najvišim stepenom kontaminacije fitopatogenim gljivama (Stević, 2009). Ovakvi rezultati ukazuju na potrebu pronalaženja novih metoda dekontaminacije koje će biti uključene u sve segmente proizvodnje fitopreparata, počev od gajenja i žetve u polju, obrade, skladištenja, pakovanja i transporta. To mora biti u saglasnosti sa Kontrolom kvaliteta kritičnih tački, Dobrom poljoprivrednom i proizvođačkom praksom, kao i nacionalnim i/ili međunarodnim uputstvima za eliminaciju patogenih mikroorganizama, primenjivih u industriji. Kao što je ranije rečeno, poslednjih godina povećano je interesovanje za zaštitom bilja preparatima prirodnog porekla tzv. agensima biološke kontrole u koje spadaju korisni mikroorganizmi ili produkti njihovog metabolizma, kao i biljni ekstrakti i etarska ulja. Poznato je da etarska ulja mogu biti efikasna u suzbijanju gljiva na voću i povrću kao i neka hemijska sredstva (Bajpai and Kang, 2012). I pored navedenog, mali je broj radova objavljen o primeni etarskih ulja u zaštiti lekovitog bilja, a gotovo da ih i nema vezano za zaštitu suvih biljnih droga. U cilju ispitivanja mogućnosti primene etarskih ulja u biokontroli patogenih, zemljišnih ili postžetvenih, odnosno skladišnih gljiva, izolovanih i identifikovanih sa biljnih droga, ispitivan je antifungalni potencijal odabrana 22 etarska ulja. Prvo je određen kvalitativni i kvantitativni sastav svih etarskih ulja primenom GC-FID i GC-MS tehnika u cilju utvrđivanja uticaja hemijskog sastava na antifungalnu aktivnost etarskih ulja. Literaturni podaci ukazuju da pojedina jedinjenja etarskih ulja, kao na primer fenolna, utiču na ispoljavanje izuzetnog antifungalnog potencijala etarskih ulja u kojima su ista dominantna (Dikkbas et al., 2008). Za ispitivanje antifungalne aktivnosti etarskih ulja korišćena je mikrodiluciona metoda kojom je određivana minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) i minimalna fungicidna koncentracija (MFC) za svako od njih. Antifungalni potencijal etarskih ulja ispitivan je na 21 odabranoj gljivi. Od odabranih gljiva samo su predstavnici rodova ) Rezultati i diskusija 53 Aspergillus i Penicillium saprofitne gljive, dok su ostale tzv. fitopatogene, uzrokovači različitih bolesti na biljkama. U Tabeli 3. su date odabbrane gljive izolovane i identifikovane sa biljnih droga u ovom radu. Navedene gljive odabrane su na osnovu učestalosti pojavljivanja na biljnim drogama, značajnosti oboljenja koje uzrokuju, mogućnosti sinteze mikotoksina, kao i brojnosti i veličini spora koje obrazuju, što olakšava in vitro ispitivanja. Tabela 3. Odabrane gljive izolovane sa biljnih droga Gljive polja Fusarium solani – herba rastavića F. verticillioides – cvetovi nevena F. tricinctum - herba rastavića F. oxysporum – cvetovi nevena F. oxysporum – kukuruzna svila F. semitectum - kukuruzna svila F. subglutinans - kukuruzna svila F. equiseti - herba rastavića Alternaria alternata - listovi i herba nane Gliocladium roseum – listovi koprive Chaetomium sp. - herba rastavića Curvularia lunata - listovi i herba nane Myrotechium verrucaria – kukuruzna svila Trichoderma viride - listovi i herba nane Trichotecium roseum – listovi koprive Phoma sp. – listovi koprive Phomopsis sp. – listovi nane Verticillium dahliae – listovi i herba nane Skladišne gljive Aspergillus flavus – herba rastavića A. niger – listovi koprive Penicillium sp. – cvetovi nevena 㱰Ϥ Rezultati i diskusija 54 4.2.1. Etarska ulja čubra (Satureja hortensis), origana (Origanum heracleoticum) i timijana (Thymus vulgaris) Kvalitativnom i kvantitativnom hemijskom analizom utvrđena je velika sličnost etarskog ulja čubra i origana, kao i ulja timijana. Kompletan kvalitativan i kvantitativan sastav etarskih ulja čubra, origana i timijana dat je u Prilogu 2. (Tabela 23). Jedinjenja koja ulaze u sastav ova tri etarska ulja možemo podeliti na četiri grupe: 1) ugljovodonični monoterpeni, 2) oksidovani monoterpeni, 3) ugljovodonični seskviterpeni i 4) fenoli. Fenolna jedinjenja su dominantne komponente u ovim etarskim uljima, sa karvakrolom, odnosno timolom, kao predstavnicima za koje dokazana dobra antimikrobna aktivnost (Dikkbas et al., 2008). Dominantni predstavnik ugljovodoničnih monoterpena je p-cimen, od oksidovanih monoterpena je linalol, dok je β-kariofilen jedini seskviterpen ovih ulja. Udeo dominantnih komponenti u sva tri ulja prikazan je na Slici 23. Etarska ulja čubra i origana karakteriše ista dominantna komponenta, karvakrol sa različitim procentualnim udelom (50% u etarskom ulju čubra i 76% u etarskom ulju origana). a) b) c) Slika 23. Udeo dominantnih komponenti u etarskim uljima: a) čubra, b) origana i c) timijana Timol je, po procentualnom udelu, drugo važno fenolno jedinjenje u oba ulja (9,65% odnosno 3,71%)(Slika 23.). karvakrol p-cimen timol γ-terpinen E-kariofilen borneol linalol ostalo karvakrol timol E- kariofilen γ-terpinen linalol p-cimen ostalo timol p-cimen γ-terpinen linalol 1,8-cineol E-kariofilen karvakrol α-terpinen 䝀Ϥ Rezultati i diskusija 55 Od 99,99% identifikovanih komponenti u etarskom ulju čubra, osim dominantnog karvakrola i timola, visokim procentualnim udelom izdvajaju se p-cimen (12,20%), γ-terpinen (6,50%), E-kariofilen (5,17%), a nešto manje borneol (2,41%) i linalol (1,63%). U etarskom ulju origana udeo ponutih terpenoidnih komponenti je nešto manji: p-cimen (2,11%), γ-terpinen (2,61%), E-kariofilen (2,76%), linalol (2,54%) i sa oko 1% β-pinen, 1,8-cineol i borneol. U slučaju etarskog ulja timijana dominantna komponenta je timol sa 43,70% i njegov prekursor p-cimen, sa 23,22%. Sličnost sa prethodna dva ulja ogleda se u sadržaju manje zastupljenih komponenti: γ-terpinen (6,50%), linalol (4,95%), 1,8-cineol (3,71%), E-kariofilen (3,11%), karvakrol sa 2,95%. Za razliku od prethodna dva, u ulju timijana je, procentualno manje utvrđeno prisustvo α-terpinena (2,47%), kamfena (1,81%) i mircena (1,35%). Sličnost u hemijskom sastavu sva tri etarska ulja, bez obzira na izvesne razlike u procentualnom udelu pojedinačnih komponenti, verovatno utiče i na sličnost u antifungalnoj aktivnosti. Ujednačenost delovanja, posebno etarskih ulja čubra i origana, ogleda se kroz sličnu osetljivost većine gljiva. Rast najvećeg broja testiranih gljiva inhibiran je istom koncentracijom, od 0,14 mg/ml. Ovo je MIC i etarskog ulja timijana za izvestan broj gljiva. Iz rezultata prikazanih u Tabeli 4. može se videti da nema značajnije razlike u MIC i MFC vrednostima, kao i da su sva tri etarska ulja bila efikasnija u inhibiciji rasta patogenih gljiva od komercijalnog antibiotika, flukonazola. Analizirano pojedinačno, najveći antifunglani potencijal utvrđen je za etarsko ulja čubra. Iako ovo ulje ujednačeno deluje na testirane gljive, nešto veću osetljivost ispoljile su F. oxysporum (izolovan sa nevena) i A. niger za čiju je potpunu inhibiciju rasta neophodna najniža testirana koncetracija od 0,07 mg/ml. Veću tolerantnost na ovo ulje (MIC od 0,27 mg/ml) ispoljile su A. flavus i F. sporotrichioides, dok su najotpornije gljive bile F. equiseti (MIC 0,62 mg/ml) i F. subglutinans (0,95 mg/ml) (Tabela 4., Slika 24.). Slično ulju čubra, ispitivanjem inhibitorne aktivnosti etarskog ulja origana, utvrđeno je da su koncentracija od 0,14 mg/ml, odnosno 0,28 mg/ml bile dovoljne za kompletnu inhibiciju rasta najvećeg broja testiranih gljiva (MIC ujednačen sa MFC). Najveću osetljivost na ulje origana ispoljio je, kao u slučaju etarskog ulja čubra, F. oxysporum ali izolovan sa kukuruzne svile, i Phomopsis sp. (MIC, kao i MFC je 0,07 ) Rezultati i diskusija 56 mg/ml). Jedino odstupanje od ovako niskih inhibitornih vrednosti zabeleženo je za F. subglutinans koja je ujedno i najotpornija gljiva na etarsko ulje origana čija je potpuna inhibicija rasta ostvarena pri koncentraciji od 1,16 mg/ml. Dobijeni rezultati ukazuju na to da su testirane gljive ujednačeno osetljive na etarska ulja čubra i origana, odnosno da nema statistički značajne razlike u delovanju ovih ulja na sve gljive osim na F. subglutinans (Slika 24.) i F. equiseti u slučaju ulja čubra. Među testiranim gljivama, F. oxysporum je najosetljivija, a F. subglutinans najotpornija na oba etarska ulja. Tabela 4. MIC i MFC vrednosti etarskih ulja (eu) čubra, origana i timijana (mg/ml) Testirane gljive eu čubra MIC eu čubra MFC eu origana MIC eu origana MFC eu timijana MIC eu timijana MFC flukonazol F. solani 0,14 0,14 0,14 0,14 0,16 0,20 1,8 F. verticillioides 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 1,4 F .tricinctum 0,14 0,14 0,14 0,14 0,19 0,24 0,8 F. oxysporum- neven 0,07 0,07 0,28 0,28 0,14 0,14 0,8 F. oxysporum- k.svila 0,14 0,14 0,07 0,07 0,14 0,14 0,8 F. semitectum 0,14 0,14 0,28 0,28 0,19 0,24 1,6 F. subglutinans 0,95 1,14 1,16 1,16 2,07 2,35 1,6 F. sporotrichioides 0,27 0,27 0,28 0,28 0,61 0,90 1,0 F. equiseti 0,62 0,91 0,28 0,28 0,98 0,98 1,0 A. flavus 0,27 0,27 0,14 0,14 1,18 1,18 1,0 A. niger 0,07 0,07 0,14 0,14 0,28 0,28 1,8 Penicillium sp. 0,14 0,14 0,28 0,28 0,14 0,14 1,8 A.alternata 0,14 0,14 0,28 0,28 0,34 0,56 1,8 Chaetomium sp. 0,14 0,14 0,14 0,14 0,41 0,41 1,6 G. roseum 0,14 0,14 0,14 0,14 0,34 0,34 2,0 C. lunata 0,14 0,14 0,28 0,28 0,17 0,19 0,6 V. dahliae 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 1,0 T. viride 0,14 0,14 0,28 0,28 0,34 0,56 1,0 T. roseum 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 2,0 Phomopsis sp. 0,14 0,14 0,07 0,07 0,21 0,21 0,8 Phoma sp. 0,14 0,14 0,14 0,14 0,14 0,16 0,8 M. verrucaria 0,14 0,14 0,14 0,14 0,17 0,14 0,8 I etarsko ulje timijana ispoljilo je dobru antifungalnu aktivnost, nešto slabiju od ulja čubra i origana. Ovi rezultati su u saglasnosti sa literaturnim podacima (Lee et al, 2007). U našem radu određeni broj gljiva jednako je osetljiv na ulje timijana, tj. njihova minimalna inhibitorna koncentracija iznosila je 0,14 mg/ml. Među vrstama roda Fusarium, to su F. verticillioides i F. oxysporum (izolovan sa nevena i kukuruzne svile), a od ostalih, Penicillium sp., C. lunata, V. dahliae, T. roseum, Phoma sp. i M. verrucaria. F. solani i F. semitectum su ispoljile neznatno manju osetljivost na ulje 㵠Ϥ Rezultati i diskusija 57 timijana sa minimalnim inhibitornim koncentracijama od 0,16 do 0,19 mg/ml, kao i F. sporotrichioides (MIC iznosi 0,61 mg/ml). Za inhibiciju rasta F. equiseti i A. flavus potrebna je koncentracija ulja timijana od oko 1 mg/ml, a najmanju osetljivost ispoljio je F. subglutinans, za čiju je inhibiciju bila neophodna koncentracija od 2,07 (MIC) odnosno 2,35 mg/ml (MFC). Na osnovu ovih rezultata može se reći da je F. subglutinans najotpornija gljiva na sva tri etarska ulja. Statističkom analizom dobijenih rezultata (Slika 24.) može se reći da nema statistički značajne razlike u delovanju etarskog ulja timijana na testirane gljive osim na F. subglutinans, F. equiseti i A. flavus. Ovako izrazito niske minimalne inhibitorne i fungicidne vrednosti sva tri ulja ukazuju na njihovu izuzetnu antifungalnu aktivnost u odnosu na sve testirane fitopatogene gljive i njihov ogromni potencijal u praktičnoj primeni u biokontroli istih. Posebno važna je činjenica da ova ulja podjednako dobro inhibiraju rast gljiva koje su potencijalni producenti mikotoksina kao što je A. flavus i F.verticillioides. Dobijeni rezultati su u saglasnosti sa brojnim literaturnim podacima koji ukazuju na to da ova etarska ulja ispoljavaju veoma jaku antifungalnu aktivnost na gotovo sve ispitivane gljive, često najjaču u odnosu na druga etarska ulja, kao i u našem ispitivanju (Hadizadeh et al., 2009; Soković et al., 2009; Arslan and Dervis, 2010). Pokazano je da etarska ulja čubra, origana i timijana ispoljavaju izuzetno visoku antifungalnu aktivnost na fitopatogene gljive, kao i gljive uzrokovače kvarenja hrane, posebno na vrste roda Aspergillus, inhibirajući rast micelijuma pri niskim koncentracijama od 0,05 do 1 µl/ml, u in vitro i in vivo uslovima (Dikkbas et al., 2008; Ownagh et al., 2010). Osim inhibicije rasta micelije, ulje origana i čubra inhibiraju germinaciju spora svih testiranih vrsta Aspergillus (ulje čubra i kod pojedinih vrsta roda Penicillium), a spore koje klijaju produkuju manje germinativnih tuba (rano rastuće hife) (Azaz, 2002; Carmo et al., 2008). Smatra se da u ovoj aktivnosti dominantnu ulogu imaju fenolne komponente karvakrol i timol, ali doprinos imaju i druge komponente ovih ulja, kao npr. seskviterpeni (Dikkbas et al., 2008). 䢰Ϥ Rezultati i diskusija 58 Slika 24. MIC vrednosti etarskog ulja čubra (gore), origana (u sredini) i timijana (dole) (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega. ) Rezultati i diskusija 59 Po literaturnim podacima, ova tri etarska ulja efikasno inhibiraju sintezu različitih mikotoksina u in vitro ispitivanjima. Merenjem produkcije najpotentnijeg mikotoksina, aflatoksina, od strane mnogih Aspergillus vrsta, pokazano je da ulja inhibiraju 100% produkciju aflatoksina pri koncentraciji manjoj od 0,5 mg/ml (Kalemba and Kunicka, 2003). HPLC metodom pokazano je da su karvakrol i timol odgovorni za ovu inhibitornu aktivnost. Eksperimentalno je utvrđen značajan inhibitorni efekat ulja origana i na sintezu ohratoksina A od strane A. ochraceus, kao i fumonozina B1, mikotoksina F. proliferatum (Basílico and Basílico, 1999; Velluti et al., 2005). Posmatranjem pod transmisionim elektronskim mikroskopom nakon tretmana testiranih gljiva uljem timijana i origana uočena su veća oštećenja ćelijskog zida, prekidi u plazma membrani i razaranje mitohondrija (Rasooli and Owlia, 2005; Rasooli et al., 2006). Povećanje koncentracije ulja uzrokuje curenje citoplazme iz micelijumskih ćelija, gubitak organela iz citoplazme, savijanje ovojnice jedra i tanjenje ćelijskog zida (Soylu et al., 2005). Ovakva aktivnost ulja vezuje se sa njegova lipofilna svojstva i sposobnosti da penetriraju kroz plazma membranu. Promena propustljivosti ćelijske membrane obično je praćena gubitkom osmotske kontrole ćelije, što se smatra osnovnim principom antimikrobnog delovanja etarskih ulja (Soylu et al., 2005). Visoka antifungalna aktivnost ova tri ulja (karvakrol i timol tipa) objašnjava se visokim procentulanim udelom fenolnih komponenti kao i njihovih bioloških prekursora p-cimena i γ-terpinena (Rota et al., 2007; Imelouane et al., 2009). U istraživanjima Soković (2001) timol je, kao dominantna komponenta etarskog ulja timijana, pokazao identičan antifungalni potencijal kao i ukupno etarsko ulje timijana (MIC za timol 0,125-0,5 µl/ml), dok je karvakrol, strukturni izomer timola, delovao jače na ispitivanje mikromicete sa MIC od 0,05 do 0,25 µl/ml što ukazuje da obe fenolne komponente utiču na izrazit antifungalni potencijal ukupnog etarskog ulja. Nabigol and Morshedi (2011) su takođe utvrdili da je karvakrol bio aktivniji od timola u inhibiciji rasta fitopatogenih gljiva. Ovi podaci idu u prilog objašnjenju rezultata dobijenih u ovom radu, da su etarska ulja satureje i origana, bogatija karvakrolom, aktivnija u odnosu na etarsko ulje timijana. 㹐Ϥ Rezultati i diskusija 60 4.2.2. Etarska ulja ruže (Rosa damascena) i zdravca (Pelargonium graveolens) Analizom hemijskog sastava utvrđena je sličnost etarskog ulja ruže i etarskog ulja zdravca. Kompletan kvalitativan i kvantitativan sastav ovih ulja, određen primenom GC-FID i GC-MS tehnika, prikazan je u Prilogu 2 (Tabela 24). Etarska ulja ruže i zdravca karakterišu dve dominantne komponente, citronelol i geraniol, terpenoidni alkoholi sa dokazanom antifungalnom aktivnošću (Yeon-Suk et al., 2008). Procentualni udeo oba jedinjenja je skoro dva puta veći u ružinom ulju nego u ulju zdravca: citronelol sa 51,26% u ružinom ulju u odnosu na 39,0% u ulju zdravca, a geraniol 25,84% u odnosu na 11,26% (Slika 25.). Među ostalim komponentama, u oba ulja ističu se procentualnim udelom penetil alkohol (6,05% odnosno 7,45%), linalol (1,16% odnosno 1,70%), izomenton (1,20% odnosno 3,48%), citronelil format (1,34% odnosno 5,08%) i 6,9-guaidien (1,39% odnosno 4,14%). U etarskom ulju zdravca značajniji još udeo geranil butanoata sa 4,81%. Pregled dominantnih komponenti prikazan je na Slici 25. a) b) Slika 25. Udeo dominantnih komponenti u etarskim uljima: a) ruže i b) zdravca Primenom mikrodilucione metode ispitan je antifungalni potencijal oba ulja. Dobijeni rezultati prikazani su u Tabeli 5. i na Slici 26. Oba ulja veoma su efikasna u inhibiciji rasta odabranih gljiva, znatno efikasnija od komercijalnog mikotika flukonazola, posebno etarsko ulje ruže. Najveći broj gljiva je ispoljio isti stepen citronelol geraniol penetil alkohol linalol izomenton citronelil format 6,9- guaidien citronelol geraniol penetil alkohol linalol izomenton citronelil format 6,9- guaidien 䨐Ϥ Rezultati i diskusija 61 osetljivosti na ulje ruže tj. rast najvećeg broja gljiva bio je inhibiran sličnim koncentracijama od 0,19 do 0,33 mg/ml. To su F. sporotrichioides, F. solani, F. oxysporum, F. equiseti, Penicillium sp., G. roseum, C. lunata, A. flavus, A. niger, A. alternata i T. viride (Tabela 5.). Tabela 5. MIC i MFC vrednosti za etarsko ulje (eu) ruže i zdravca (mg/ml) Testirane gljive eu ruže MIC eu ruže MFC eu zdravca MIC eu zdravca MFC flukonazol F. solani 0,29 0,29 2,28 2,28 1,8 F. verticillioides 0,14 0,14 1,91 2,28 1,4 F .tricinctum 0,14 0,14 2,09 2,28 0,8 F. oxysporum - neven 0,29 0,29 1,82 1,82 0,8 F .oxysporum – k.svila 0,29 0,29 2,28 2,28 0,8 F. semitectum 0,64 0,77 4,4 4,55 1,6 F. subglutinans 0,62 0,77 2,00 2,28 1,6 F. equiseti 0,30 0,38 0,66 0,91 1,0 F. sporotrichioides 0,29 0,33 1,82 1,82 1,0 A .flavus 0,29 0,33 1,55 1,82 1,8 A. niger 0,29 0,29 1,37 1,37 1,8 Penicillium sp. 0,31 0,31 1,18 1,37 1,8 A. alternata 0,31 0,38 1,00 1,14 1,6 Chaetomium sp. 0,35 0,38 1,82 1,82 2,0 G. roseum 0,31 0,31 2,28 2,28 0,6 C. lunata 0,31 0,31 0,62 0,73 1,0 V. dahliae 0,14 0,14 1,91 1,91 1,0 T. viride 0,31 0,38 1,90 2,28 2,0 T. roseum 0,18 0,18 2,20 2,20 0,8 Phomopsis sp. 0,19 0,19 2,37 2,73 0,8 Phoma sp. 0,17 0,17 2,37 2,37 0,8 M. verrucaria 0,14 0,14 2,11 2,3 0,8 Ulje ruže je najveću efikasnost ispoljilo na F. verticillioides, F. tricinctum, V. dahliae i M. verrucaria inhibirajući potpuno njihov rast pri najnižoj testiranoj koncetracija od 0,14 mg. Nasuprot tome, najotpornije gljive bila su dva predstavnika roda Fusarium, F. semitectum i F. subglutinans izolovani sa kukuruzne svile za čiju inhibiciju je bila potrebna koncentracija od 0,6 mg/ml. Minimalne fungicidne koncentacije kojima je potpuno inhibiran rast pojedinih gljiva bile su neznatno veće od MIC vrednosti (videti u Tabeli 5.). Statističkom analizom rezultata antifungalnog dejstva ovog ulja pokazano je da statistički značajna razlika u delovanju ovog ulja postoji samo za F. semitectum i F. subglutinans (Slika 26.). U skladu sa dobijenim rezultatima, koji potvrđuju izuzetnu antifungalnu aktivnost ulja ruže u odnosu na komercijalni antimikotik flukonazol, može se reći da ) Rezultati i diskusija 62 ovo ulje ima osobine koje ga preporučuju za dalje testiranje za primenu u biokontroli fitopatogenih gljiva. Značajan antifungalni potencijal etarskog ulja ruže može se pripisati visokom sadržaju citronelola i geraniola, monoterpenskim alkoholima, za koje je dokazan antifungalan potencijal kroz niz ranijih, in vitro, ispitivanja (Sun et al., 2007; Yaouba et al., 2010). Penetil alkohol, treća komponenta po procentualnom udelu u oba ulja (6,05% u ulju ruže i 7,45% u ulju zdravca) je u ranijim istraživanjima ispoljio slabu inhibitornu aktivnost na rast micelije, sporulaciju kao i germinaciju konidija Penicillium italicum (Li et al., 2010). I za etarsko ulje zdravca je utvrđena jaka inhibitorna aktivnost, ali za razliku od ulja ruže, testirane gljive su ispoljile različit stepen osetljivosti na ovo ulje što se može videti iz rezultata prikazanih u Tabeli 5. i na Slici 26. Minimalne inhibitorne koncentracije za ulje zdravca kretale su se od 0,6 mg/ml do 4,4 mg/ml. Najosetljivije gljive na ovo ulje su C. lunata i F. equiseti za čiju je inhibiciju rasta potrebna koncentracija od 0,62 odnosno 0,67 mg/ml (MFC 0,91 i 0,73 mg/ml). Nešto manja osetljivost utvrđena je za A. alternata, Penicillium sp., A. niger i A. flavus za koje je MIC vrednost od 1,0 mg/ml do 1,55 mg/ml. MIC i MFC za izvestan broj testiranih gljiva je isti, dok su za pojedine gljive MFC vrednosti bile neznatno veće. Rast ostalih gljiva (osim F. semitectum) inhibiran je sličnim koncentracijama ovog ulja, oko 2 mg/ml. F. semitectum je ispoljila najveću rezistentnost na etarsko ulje zdravca, kao i u slučaju ulja ruže. Koncentracijom od 4,4 mg/ml potpuno je inhibiran rast ove gljive izolovane sa kukuruzne svile. Rezultati i diskusija 63 Slika 26. MIC vrednosti etarskog ulja ruže (gore) i zdravca (dole) (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega Uporednom analizom aktivnosti etarskih ulja ruže i zdravca može se primetiti da je etarsko ulje ruže pri dvostruko nižim koncentracijama, inhibiralo rast testiranih gljiva, odnosno da je bilo dvostruko efikasnije od ulja zdravca, čak i više. Kao što se može 䮀Ϥ Rezultati i diskusija 64 videti u Tabeli 5. i na Slici 26., najniža MIC vrednost za ulje zdravca je 0,6 mg/ml što je ujedno i najviša MIC vrednost za ulje ruže. Takođe, može se primetiti da sve gljive nisu podjednako osetljive na ova hemijski slična ulja. S jedne strane, nema statistički značajne razlike u delovanju etarskog ulja ruže na većinu gljiva, odnosno ovo ulje podjednako dobro inhibira rast gotovo svih testiranih ulja. Za razliku od ovog, postoji statistički značajna razlika u delovanju ulja zdravca na različite testirane gljive. Rezultati naših istraživanja su u saglasnosti sa podacima Kalemba and Kunicka (2003), i Abo-El-Seoud and El-Tobgy (2010) prema kojima ulje zdravca ispoljava jaku antifungalnu aktivnost na rast micelijuma različitih fitopatogenih gljiva. Pored toga, potpuno inhibira sintezu aflatoksina B1 pri koncentraciji od 0,8 mg/ml. Sastav etarskog ulja, kao mešavine različitih jedinjenja, ja važan faktor koji utiče na antifungalnu aktivnost ulja. Koncentracija neke dominantne komponente određuje nivo aktivnosti ulja, ali i kombinacija većeg broja manje zastupljenih komponenti utiče na njihovu sinergističku aktivnost što dalje utiče na biološku aktivnost kompletnog ulja (Stanković et al., 2011). Iako se ne može odbaciti pretpostavka da različite komponente prisutne u etarskom ulju ruže i zdravca imaju učešće u fungicidnoj aktivnosti kompletnog ulja, značajno veća aktivnost ružinog ulja od ulja zdravca, i njihova velika hemijska sličnost, ukazuje na to da verovatno dominantne komponente, citronelol i geraniol, u ovom slučaju imaju značajniju ulogu u fungicidnoj aktivnosti ovih ulja. Verovatno se u činjenici da su obe glavne komponente procentualno dvostruko više zastupljene u ulju ruže nego u ulju zdavca, može tražiti objašnjenje za bolju aktivnost ulja ruže u inhibiciji rasta testiranih fitopatogenih gljiva. 4.2.3. Etarska ulja lavande (Lavandula angustifolia), korijandera (Coriandrum sativum) i bergamota (Citrus aurantium) Analiza hemijskog sastava etarskih ulja herbe lavande, korijandera i bergamota, ukazala je na izvesnu sličnost ova tri ulja. Kompletan sastav ovih ulja prikazan je u Prilogu 2 (Tabela 25). Etarsko ulje korijandera karakteriše jedna dominantna komponenta, linalol sa 71,18%. U etarskom ulju lavande, linalol je procentualno podjednako zastupljen sa linalol acetatom (35% za linalol i 37% za linalol acetat). Etarsko ulje bergamota ) Rezultati i diskusija 65 karakterišu dve, podjednako zastupljene, komponenete, limonen i linalol acetat sa po 37%, dok je linalol prisutan sa 13% (Slika 27.). Od ostalih jedinjenja, značajniji je udeo monoterpenskih ugljovodonika, α-pinena (sa 7,8 % u ulju korijandera i 3% u ulju lavande), γ-terpinen i kamfora sa po 4% u ulju korijandera, dok je u ulju bergamota γ- terpinen zastupljen sa 3%. a) b) c) Slika 27. Udeo dominantnih komponenti u etarskim uljima: a) lavande, b) korijandera i c) bergamota Među ove tri dominantne komponente, linalol je, u ranijim istraživanjima, pokazao najjaču antifungalnu aktivnost u mikrodilucionoj metodi, sa MIC vrednostima od 2-6 µl/ml (Soković, 2001). U istim istraživanjima limonen je ispoljio umerenu do slabu antifungalnu aktivnost, blago višu od linalol acetata. Kako je linalol procentualno najzastupljeniji u etarskom ulju korijandera, očekivali smo da će ovo ulje ispoljiti najveću inhibitornu aktivnost na rast testiranih gljiva. Naši rezultati su pokazali da su testirane gljive generalno slično osetljive na sva tri ulja (sa manjim odstupanjima). linalol linalol acetat E- kariofilen α-pinen borneol ostalo linalol α-pinen γ-terpinen kamfor geranil acetat limonen ostalo limonen linalol acetat linalol β -pinen γ -pinen ostalo 䀰Ϥ Rezultati i diskusija 66 Rezultati antifungalne aktivnosti sva tri ulja izraženi kroz minimalne inhibitorne i fungicidne koncentracije (MIC) u mg/ml prikazani su u Tabeli 6. Tabela 6. MIC i MFC vrednosti za etarska ulja (eu) lavande, korijandera i bergamota (mg/ml) Testirane gljive eu lavande MIC eu lavande MFC eu korijandera MIC eu korijandera MFC eu bergamota MIC eu bergamota MFC F. solani 1,77 1,77 0,97 1,1 1,83 2,18 F. verticillioides 1,33 1,33 2,13 2,13 2,18 2,18 F. tricinctum 2,85 3,22 2,98 3,40 2,26 2,26 F. oxysporum - neven 1,15 1,15 1,96 2,13 2,69 3,05 F. oxysporum -k.svila 1,24 1,38 1,10 1,10 1,74 2,18 F. semitectum 4,60 4,60 4,25 4,25 3,04 3,48 F. subglutinans 6,80 7,36 3,40 3,40 3,5 3,92 F. equiseti 3,40 3,68 4,08 4,08 3,74 3,92 F. sporotrichioides 1,38 1,38 2,72 3,0 1,17 1,17 A. flavus 4,60 4,60 5,10 5,10 4,35 4,35 A. niger 3,04 3,22 1,23 1,23 2,0 2,2 Penicillium sp. 2,76 3,22 3,23 3,40 4,61 4,8 A. alternata 3,31 3,68 3,65 4,25 4,8 4,8 Chaetomium sp. 3,12 3,68 4,76 5,10 4,2 4,4 G. roseum 4,78 5,5 3,74 3,74 4,5 4,5 C. lunata 2,57 2,76 2,13 2,13 1,09 1,09 V. dahliae 2,30 2,30 1,76 1,76 1,04 1,04 T. viride 3,12 3,68 2,38 2,55 3,65 3,92 T. roseum 1,19 1,19 1,10 1,10 2,8 3,05 Phomopsis sp. 1,15 1,15 2,21 2,55 1,91 2,18 Phoma sp. 1,19 1,19 1,06 1,06 2,1 2,1 M. verrucaria 2,11 2,30 2,38 2,55 1,91 2,18 Minimalne inhibitorne koncentracije sva tri ulja bile su u opsegu od 1,1 do 4,8 mg/ml (MIC i MFC vrednosti) osim za F. subglutinans koja je ispoljila najveću otpornost na ulje lavande, za koju je zabeležena najveća MIC vrednost od 6,8 mg/ml. Iz rezultata prikazanih u Tabeli 6. može se videti da je A. flavus, potencijalni producent aflatoksina, takođe veoma otporna na sva tri ulja; neophodna je koncentracija od 4,3 mg/ml do 5,1 mg/ml sva tri ulja za potpunu inhibiciju ove skladišne plesni. Etarsko ulje lavande je, ispoljilo neznatno veću antifungalnu aktivnost u odnosu na druga dva ulja. Najosetljivije gljive na ulje lavande su F. oxysporum (izolovan sa kukuruzne svile i nevena), F. verticillioides, T. roseum, Phoma sp. i Phomopsis sp. za čiju je inhibiciju bila dovoljna koncentracija od oko 1 mg/ml. Rast većeg broja testiranih gljiva inhibiran je koncentracijama oko 3 mg/ml. Najrezistentnije gljive na ulje lavande, osim pomenute F. subglutinans, su A. flavus, F. semitectum i G. roseum za 䳠Ϥ Rezultati i diskusija 67 koje je koncentracija od 4,6 odnosno 4,8 mg/ml neophodna za inhibiciju rasta micelije (MFC vrednosti su neznatno veće, videti u Tabeli 6.). Visoka efikasnost etarskog ulja lavande pre se može objasniti interakcijama pojedinačnih komponenti, pre svega interakcijama linalil acetata i linalola, nego davati značaj nekoj od njih (Lis-Balchin, 1998). Prema ovom autoru i jedna i druga komponenta su bitne u određivanju antifungalnog potencijala ulja lavande i da deluju sinergistički. Eksperimentalno je utvrđeno da je etarsko ulje lavande efikasnije u inhibiciji rasta tj. produžavanju germinativnih tuba i germinaciju konidija nekih vrsta gljiva nego na rast njihovih hifa (Cavanagh and Wilkinson, 2002; Soylu et al., 2005). Takođe, pokazano je da ovo ulje uzrokuje degeneraciju hifa, remećenje citoplazmatične membrane, citoplazmatično pražnjenje i ćelijsku smrt (Soylu et al., 2005; Zuzarte et al., 2011). U sličnim ispitivanjima utvrđeno je da je linalol acetat u mogućnosti da suprimira formiranje spora, dok linalol ne inhibira proces sporulacije već ispoljava značajnu efikasnost u inhibiciji germinacije i rasta micelije. U našim ispitivanjima, etarska ulja korijandera i bergamota su ispoljila nešto nižu, ali još uvek značajnu antifungalnu aktivnost na testirane biljne patogene gljive (Tabela 6. i Slika 28.). Najnižom koncentracijom, od oko 1 mg/ml etarsko ulje korijandera inhibiralo je rast F. solani, F. oxysporum (izolovan sa kukuruzne svile), Phoma sp., T. roseum i A. niger. Nasuprot njima, najveća koncentracija ovog ulja neophodna je za inhibiciju A. flavus (MIC i MFC su 5,1 mg/ml); blago osetljivija je Chaetomium sp. sa MIC od 4,6 mg/ml (MFC je neznatno viša, 5,1 mg/ml), kao i F. semitectum i F. equiseti čije su se MIC i MFC vrednosti kretale blago iznat 4 mg/ml. Dobijeni rezultati su u korelaciji sa istraživanjima El-Seoud and El-Tobgy (2010) koji su utvrdili visoku efikasnost ulja korijandera u kontroli fitopatogenih gljiva i sugerisali da se može koristiti u tretmanu semena i kao fumigans. Rezultati i diskusija 68 Slika 28. MIC vrednosti etarskih ulja lavande (gore), korijandera (u sredini) i bergamota (dole) (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega. 䄠Ϥ Rezultati i diskusija 69 Etarsko ulje bergamota je ispoljilo najniži antifungalni potencijal među ova tri etarska ulja (Slika 28.). Čak pet testiranih gljiva (A. flavus, A. alternata, Penicillium sp., Gliocladium roseum, Chaetomium sp.) su pokazale veću tolerantnost na ovo ulje, sa MIC vrednostima preko 4 mg/ml. Najosetljivije su C. lunata, V. dahliae i F. sporotrichioides za koje je zabeležena najniža MIC vrednost od 1 mg/ml. Uz pomenute gljive, visoku osetljivost ispoljile su i F. solani, F. oxysporum (sa kukuruzne svile) i Phoma sp., slično kao i na etarska ulja lavande i korijandera (Tabela 6. i Slika 28.). Ispitivanja drugih istraživača su sugerisala da etarsko ulje bergamota ostvaruje antifungalna svojstva kroz redukciju rasta micelije i klijanje spora na gljivama izolovanih sa pirinča (Thobunluepop et al., 2009). Niži antifungalni potencijal etarskog ulja bergamota, u odnosu na druga dva ulja, može se delimično objasniti visokim sadržajem limonena i linalol acetata, monoterpenskih komponenti sa dokazanim niskim antifungalnim potencijalom. Iako niži, još uvek dobar, antifungalni potencijal ovog ulja verovatno se može pripisati prisustvu drugih, manje zastupljenih komponenti kao što su linalol (12,84%), β-pinen (3,00%) i γ-terpinen (3,06%), za koje je dokazana relativno dobra antifungalna aktivnost (Hammer et al., 2003). Komparativnom analizom sva tri ulja može se reći da su F. solani, F. oxysporum, F. verticillioides i C. lunata ispoljile najveću osetljivost na sva tri ulja, dok je A. flavus najotporniji uz izvesna odstupanja u zavisnosti od ulja. Sa Slike 28. se može uočiti da postoje statistički značajne razlike u delovanju ova tri etarska ulja na različite testirane gljive. 乐Ϥ Rezultati i diskusija 70 4.2.4. Etarsko ulje ploda/semena anisa (Illicum verum) U etarskom ulju ploda/semena anisa, primenom GC-FID i GC-MS tehnika, identifikovano je 14 komponenata, a samo četiri sa udelom većim od 1%. To su E- anetol, koji je sa 91,78%, dominantna komponenta, metil havikol (3,62%), fenikulin (1,20%) i linalol 1,05% (Slika 29). I prema Kosalec et al. (2005) ulje anisa sadrži uglavnom 80-95% trans-anetol, praćen metil havikolom i anisaldehidom. Kompletan kvalitativan i kvantitativan sastav etarskog ulja anisa prikazan je u Prilogu 2 (Tabela 26). Slika 29. Udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju anisa Mikrodilucionom metodom utvrđen je visok antifungalni efekat etarskog ulja anisa na odabrane gljive izolovane sa biljnih droga. MIC i MFC vrednosti su se kretale od 0,7 mg/ml do 2,2 mg/ml (Tabela 7.). Najveću tolerantnost su ispoljile F. tricinctum, A. alternata i Chaetomium sp., dok su neznatno osetljivije F. subglutinans, F. oxysporum izolovan sa kukuruzne svile, C. lunata i G. roseum (MIC i MFC vrednosti oko 2,0 mg/ml). Najbolju inhibitornu aktivnost etarsko ulje anisa je ispoljilo na F. verticillioides, kao i F. solani i Phoma sp. čiji je rast inhibiran koncentracijama od 0,7 odnosno 0,9 mg/ml (Slika 30.). Za najveći broj testiranih gljiva minimalna inhibitorna koncentracija je bila između 1 i 2 mg/ml. Za pojedine testirane gljive MFC vrednosti su neznatno veće od MIC vrednosti (Tabela 7.). E-anetol metil havikol fenikulin linalol ) Rezultati i diskusija 71 Tabela 7. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja anisa (mg/ml) Testirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 0,93 1,1 1,8 F. verticillioides 0,7 0,9 1,4 F. tricinctum 2,18 2,18 0,8 F. oxysporum - neven 1,1 1,31 08 F. oxysporum – k.svila 1,83 2,18 0,8 F. semitectum 1,74 1,74 1,6 F. subglutinans 2,00 2,18 1,6 F. equiseti 1,66 2,18 1,0 F. sporotrichioides 1,22 1,2 1,0 A. flavus 1,22 1,31 1,8 A. niger 1,00 1,00 1,8 Penicillium sp. 1,00 1,0 1,8 A. alternata 2,18 2,18 1,6 Chaetomium sp. 2,18 2,18 2,0 G. roseum 1,83 2,18 0,6 C. lunata 1,92 1,9 1,0 V. dahliae 1,22 1.22 1,0 T. viride 1,57 1,74 2,0 T. roseum 1,00 1,0 0,8 Phomopsis sp. 1,22 1,31 0,8 Phoma sp. 0,92 1,1 0,8 M. verrucaria 1,6 1,74 0,8 Statističkom analizom dobijenih rezultata utvrđena je statički značajna razlika u delovanju ulja anisa na testirane gljive što se može videti na Slici 30. Slika 30. MIC vrednosti etarskog ulja anisa (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega 䈐Ϥ Rezultati i diskusija 72 Prema ovoj analizi gljive su izdvojene u nekoliko grupa među kojima postoji statistički značajna razlika u inhibitornom delovanju ulja na rast fitopatogenih gljiva. U ranijim ispitivanjima antibakterijske i antifungalne aktivnosti ulje anisa ispoljilo je snažan inhibitorni potencijal na bakterije, kvasce i dermatomicete, pri čemu je potpuno inhibiralo rast Candida albicans i A. flavus. Prema Soliman and Badea (2002), ovo ulje je kompletno inhibiralo A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus i F. moniliforme pri koncentraciji od <500 ppm. Kompletnija istraživanja Huang et al., (2010) su ukazala da je etarsko ulje anisa, pri veoma niskim koncentracijama, inhibiralo rast 11 fitopatogenih gljiva (ID50 vrednosti su išle od 0,07 mg do 0,25 mg/ml). Isti autori su dokazali podjednaku efikasnost trans-anetola, dominantne komponente ovog ulja, u odnosu na testirane gljive; ID50 vrednosti su bile gotovo iste kao i za kompletno ulje. Ovi rezultati su ukazali da je za antifungalnu aktivnost ulja anisa odgovoran trans- anetol. Daljim ispitivanjem utvrđeno je da i etarsko ulje i anetol inhibiraju germinaciju spora ispitivanih gljiva. Na osnovu ovih podataka može se pretpostaviti da je anetol, dominantna komponenta ulja anisa ispitivanog u ovom radu, odgovorna za njegov jak antifungalni potencijal. 4.2.5. Etarsko ulje lista čajnog drveta (Melaleuca alternifolia) Prema dobijenim rezultatima kvalitativnog i kvalitativnog sastava ulja čajnog drveta može se reći da je u saglasnosti sa literaturnim podacima (Straede et al., 2007). Od 97,69% izolovanih jedinjenja, sa udelom od 40,66%, dominantnu komponentu predstavlja terpinen-4-ol. Od drugih komponenti ističu se: γ-terpinen sa 17,78%, α– terpinen (7,09%), α-terpineol (4,49%), terpinolen (4,16%), limonen (3,88%), α-pinen (3,48%), p-cimen (3,13%), E-kariofilen (2,69%), i nešto manje 1,8-cineol (1,87%), β- pinen (1,72%), mircen (1,50%). Ostale komponente su zastupljene sa manje od 1%. Kompletan kvalitativan i kvantitativan sastav etarskog ulja čajnog drveta prikazan je u Prilogu 2 (Tabela 27), dok je na Slici 31. prikazan udeo dominantnih komponenti. 侰Ϥ Rezultati i diskusija 73 Slika 31. Udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju čajnog drveta Mikrodilucionom metodom utvrđena je veoma dobra antifungalna aktivnost etarskog ulja čajnog drveta pri čemu je prilično ujednačenim koncentracijama inhibiralo rast testiranih gljiva (Tabela 8., Slika 32.). Za najveći broj gljiva MIC i MFC vrednosti su oko 1 mg/ml. Najveća koncentracija, kojom je potpuno inhibiran rast F. subglutinans, F. equiseti, A. flavus i T. viride, je 1,8 mg/ml (MIC i MFC). F. subglutinans je i u ovom ispitivanju potvrđena kao jedna od otpornijih gljiva. Tabela 8. MIC i MFC vrednosti za etarsko ulje čajnog drveta (mg/ml) Testirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 1,14 1,4 1,8 F. verticillioides 0,86 1,14 1,4 F. tricinctum 1,18 1,4 0,8 F. oxysporum - neven 0,96 1,14 0,8 F. oxysporum – k.svila 0,91 0,91 0,8 F. semitectum 1,14 1,14 1,6 F. subglutinans 1,82 1,82 1,6 F. equiseti 1,82 1,82 1,0 F. sporotrichioides 1,4 1,4 1,0 A. flavus 1,82 1,82 1,8 A. niger 0,96 1,14 1,8 Penicillium sp. 1,05 1,14 1,8 A. alternata 1,4 1,4 1,6 Chaetomium sp. 1,0 1,4 2,0 G. roseum 1,4 1,4 0,6 C. lunata 1,4 1,4 1,0 V. dahliae 0,91 0,91 1,0 T. viride 1,82 1,82 2,0 T. roseum 1,14 1,14 0,8 Phomopsis sp. 0,91 0,91 0,8 Phoma sp. 1,05 1,14 0,8 M. verrucaria 0,91 0,91 0,8 γ-terpinen α –terpinen α-terpineol terpinolen limonen α- pinen p-cimen terpinen-4- ol ostalo ) Rezultati i diskusija 74 Analizom rezultata utvrđeno je da se izdvaja nekoliko grupa testiranih gljiva među kojima postoji statistički značajna razlika u delovanju etarskog ulja čajnog drveta. Rezultati statističke analize antifungalne aktivnosti ovog ulja prikazani su na Slici 32. Slika 32. MIC vrednosti etarskog ulja čajnog drveta (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega I u drugim istraživanjima etarsko ulje čajnog drveta pokazalo je veoma jaku antifungalnu aktivnost, sa MIC koncentracijama i manjim od dobijenih u ovom radu. Prema Carson et al. (2006), najmanji MIC (od 0,008 do 0.4 % (v/v)) ovo ulje je ispoljilo na Fusarium sp., Alternaria sp. i A. niger. Dalja istraživanja ovih autora pokazuju da je fluidnost membrana ćelija tretiranih ovim uljem značajno povećana. Studije, u kojima je inhibirana ATPaza plazma membrane, su ukazale da su ovakve ćelije gljiva mnogo osetljivije na etarsko ulje čajnog drveta od kontrolnih ćelija, što dalje sugeriše da ATPaza plazma membrane ima ulogu u zaštiti ćelija od destabilišućeg ili letalnog efekta ovog ulja (Carson et al., 2006). Prema ovim autorima ulje čajnog drveta takođe inhibira formiranje germinativnih tuba. U in vivo ispitivanjima, Burgiel and Smaglowski (2008) su utvrdili da se prskanjem nevena (Calendula officinalis L.) ovim uljem redukuje razvoj pepelnica 䌀Ϥ Rezultati i diskusija 75 (Erysiphe spp.). U upotrebi je preparat TimorexTM, koji sadrži 60% ulja čajnog drveta, koji se koristi u zaštiti paradajza od infekcija izazvanim gljivama iz roda Phytophthora i Alternaria (Sobolewski et al., 2006; Abbo et al., 2009). Smatra se da je visok antifungalni potencijal etarskog ulja čajnog drveta posledica visokog sadržaja terpinen-4-ola, monoterpenskog alkohola, koji je u ranijim istraživanjima pokazao veoma dobru antifungalnu aktivnost na vrste roda Aspergillus i Penicillium (Hammer et al., 2003). Na antifungalnu aktivnost ovog ulja verovatno imaju uticaj i monociklični terpeni γ-terpinen, α-terpinen, terpinolen koji su u istraživanjima (Dorman and Deans, 2000) bili manje aktivni od kompletnog ulja čajnog drveta. 4.2.6. Etarsko ulje ljubičice (Viola odorata) U etarskom ulju ljubičice identifikovano je 33 komponente što predstavlja 99,03% ulja. Dominantna komponenta je triacetin sa 53,74%, a uz nju značajnije prisustvo zabeleženo je za α-jonon (9,38%), feliletil propionat (6,84%), β-jonon (4,78%), limonen (4,03%), linalol (3,86%) i linalol acetat (3,84%). Rezultati kompletne hemijske analize etarskog ulja ljubičice prikazani su u Prilogu 2 (Tabela 28.), dok je na Slici 33. predstavljen udeo dominantnih komponenti. Slika 33. Udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju ljubičice Etarsko ulje ljubičice ispoljilo je dobar antifungalni potencijal uglavnom na sve testirane fitopatogene gljive, što se, verovatno, može pripisati visokom udelu triacetina. Najotpornije su bile F. solani i F. semitectum sa MIC od 4,6 mg/ml, odnosno 4,8 mg/ml i MFC od 5,2 mg/ml. Nešto veća osetljivost utvrđena je za F. tricinctum, G. roseum i triacetin α-jonon fenetil propionat β-jonon limonen linalol linalol acetat Rezultati i diskusija 76 Chaetomium sp. za čiju inhibiciju je potrebna koncentracija od 3,64 mg/ml, kao i F. verticillioides sa MIC od 3,53 mg/ml. Najnižom MIC (ujedno i MFC) vrednošću od 1,45 mg/ml inhibiran je rast M. verrucaria (Tabela 9.). Visoka osetljivost na ulje ljubičice utvrđena je i za A. niger, Penicillium sp., T. roseum, Phomopsis sp. sa MIC od 1,56 mg/ml i neznatno većim MFC vrednostima za pojedine gljive. Ostale gljive ujednačenije su reagovale na testirano ulje sa MIC vrednostima između 2 i 3 mg/ml. Tabela 9. MIC i MFC vrednosti za etarsko ulje ljubičice (mg/ml) Testirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 4,6 5.20 1.8 F. verticillioides 3,53 4,16 1,4 F. tricinctum 3,64 3,64 0,8 F. oxysporum - neven 2,5 2,5 0,8 F. oxysporum – k.svila 2,08 2,08 0,8 F. semitectum 4,88 5,20 1,6 F. subglutinans 3,12 3,12 1,6 F. equiseti 2,60 2,60 1,0 F. sporotrichioides 2,08 2,08 1,0 A. flavus 3,12 3,12 1,8 A. niger 1,66 2,08 1,8 Penicillium sp. 1,56 1,56 1,8 A.alternata 3,12 3,64 1,6 Chaetomium sp. 3,64 4,16 2,0 G. roseum 3,64 3,64 0,6 C. lunata 2,91 4,16 1,0 V. dahliae 2,5 3,12 1,0 T. viride 2,08 2,08 2,0 T. roseum 1,56 2,08 0,8 Phomopsis sp. 1,56 1,56 0,8 Phoma sp. 2,28 3,12 0,8 M. verrucaria 1,45 1,45 0,8 Sa Slike 34. se može videti da se testirane gljive mogu podeliti u nekoliko grupa između kojih postoji statistička značjna razlika u stepenu antifungalnog efekta ulja ljubičice. ) Rezultati i diskusija 77 Slika 34. MIC vrednosti etarskog ulja ljubičice (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega Prema literaturnim podacima, komponente sa većinskim procentualnim udelom u ovom ulju, ispoljavaju, ispitivane pojedinačno, značajnu antifungalnu aktivnost, te utiču na aktivnost kompletnog ulja. Glavna komponenta, triacetin, ili glicerin triacetat, sa 53,74%, je triestar sa dokazanim antifungalnim svojstvima koji se koristi kao lek u tretmanu površinskih gljivičnih infekcija kože kao što su gljivične infekcije noktiju, atletsko stopalo, impetigo i dr. (Gennaro, 1990). Osim triacetina i za karbonilne komponente, α- i β-jonon, prisutni u našem ulju sa 9,38 odnosno 4,78%, postoje podaci o antifungalnoj aktivnosti (Lalko et al., 2007). 䏰Ϥ Rezultati i diskusija 78 4.2.7. Etarsko ulje crnog bibera (Piper nigrum) U etarskom ulju crnog bibera identifikovano je 99,61% sastava ulja. Seskviterpen β-kariofilen (sinonim E-kariofilen) sa 19,44% i limonen sa 18,75% su dominantni, uz α-pinen i β-pinen (sa 15,49 odnosno 14,87%). Nešto manje su zastupljeni 3-karen (9,54%), sabinen (5,48%), α-felandren (2,84%), p-cimen (1,47%) i mircen (1,06%) od monoterpena, a od seskviterpena α-kopaen (1,86%) i δ-elemen sa (1,12%). Rezultati kompletne kvantitativne i kvalitativne analize etarskog ulja crnog bibera prikazani su Prilogu 2 (Tabela 29.). Na Slici 35. predstavljen je udeo dominantnih komponenti. Slika 35. Udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju crnog bibera Rezultati drugih istraživanja ukazuju na sličan sastav pojedinačnih komponenti etarskog ulja bibera samo u drugačijem odnosu tj. procentualnom udelu (Raju and Maridas, 2011). Etarsko ulje crnog bibera ispoljio je, u odnosu na komercijalni mikotik, dobar do umeren antifungalni potencijal inhibirajući rast većeg broja testiranih gljiva koncentracijama između 4 i 6 mg/ml (Tabela 10.). Najveća minimalna inhibitorna koncentracija ovog ulja potrebna je za inhibiciju T. viride (9,6 mg/ml, MFC 10,1 mg/ml) i A. alternata (MIC i MFC 7,8 mg/ml). Toleratnost na ulje bibera ispoljile su i A. flavus (7,2 mg/ml), Chaetomium sp. i C. lunata sa MIC od 6,86 mg/ml, kao i A. niger (MIC 6,5 mg/ml). Veću osetljivost na ovo ulje ispoljile su vrste roda Fusarium sa MIC vrednostima uzmeđu 3 i 4 mg/ml, pri čemu je F. subglutinans među njima bila najotpornija (MIC je 4,9 mg/ml i MFC od 5,5 mg/ml). Najmanja koncentracija ulja β-kariofilen limonen α-pinen β-pinen 3-karen sabinen ostalo 劀Ϥ Rezultati i diskusija 79 bibera potrebna za vidljivu inhibiciju rasta zabeležena je za F. oxysporum (izolovane sa nevena i kukuruzne svile), sa MIC malo iznad 3 mg/ml i F. equiseti sa 3,9 mg/ml. Tabela 10. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja bibera (mg/ml) Tastirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 3,90 3,90 1,8 F. verticillioides 3,98 4,29 1,4 F. tricinctum 4,36 4,68 0,8 F. oxysporum - neven 3,35 3,51 0,8 F. oxysporum – k.svila 2,84 3,12 0,8 F. semitectum 4,05 4,3 1,6 F. subglutinans 4,92 5,5 1,6 F. equiseti 3,12 3,12 1,0 F. sporotrichioides 3,90 3,90 1,0 A. flavus 7,17 7,41 1,8 A. niger 6,5 6,5 1,8 Penicillium sp. 4,9 5,5 1,8 A. alternata 7,80 7,80 1,6 Chaetomium sp. 6,86 7,80 2,0 G. roseum 6,0 6,24 0,6 C. lunata 6,86 6,86 1,0 V. dahliae 4,06 4,3 1,0 T. viride 9,67 10,14 2,0 T. roseum 5,77 6,24 0,8 Phomopsis sp. 5,46 5,46 0,8 Phoma sp. 6,24 6,24 0,8 M. verrucaria 3,90 3,90 0,8 Statističkom analizom dobijenih rezultata pokazano je da postoji statistički značajna razlika u stepenu inhibitorne aktivnosti etarskog ulja crnog bibera na različite testirane gljive (rezultati prikazani u Slici 36.). ) Rezultati i diskusija 80 Slika 36. MIC vrednosti etarskog ulja crnog bibera (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega I literaturni podaci o antifungalnoj aktivnosti etarskog ulja crnog bibera, kojih nema mnogo za ovu vrstu, ukazuju na dobru do umerenu aktivnost. Veći broj podataka ukazuje na dobar antibakterijski potencijal ovog ulja (Sabulal et al., 2006). Sasidharan i Menon (2010) su eksperimentalno utvrdili dobru, kako antibakterijsku, tako i antifungalnu aktivnost ulja bibera, pri čemu su A. nigrum i Penicillium spp., bile osetljivije na ovo ulje od gljive T. viride. T. viride je i u našim istraživanjima najrezistentnija gljiva što se može videti iz Tabele 10. i Slike 36. Veći broj autora je mišljenja da je dobra aktivnost ulja bibera posledica aktivnosti β-kariofilena (sinonim E-kariofilen), seskviterpena koji ima kritičnu ulogu u odbrani biljke (Ulubelen et al., 1994). β-kariofilen i kariofilen oksid su u mnogim istraživanjima bili veoma fungitoskični na različite fitopatogene gljive. Amiel et al. (2012) su objavili da β-kariofilen uz izuzetna antifungalna svojstva, ispoljava i anti- inflamatornu aktivnost kao i aktivnost lokalnog anestetika ili agensa indukcije apoptoze. Rezultati istraživanja Bitner et al., (2009) ukazuju da se inhibitorna aktivnost etarskog ulja crnog bibera može pripisati i bicikličnom monoterpenu, 3-karenu, prisutnom u našem ulju sa 9,54%. Antifungalnom potencijalu ovog ulja verovatno doprinosi i biciklični monoterpen, sabinen, za koji je dokazan inhibitorni efekat na rast gljiva 䓠Ϥ Rezultati i diskusija 81 (Kohzaki et al., 2009). O aktivnosti bicikličnih monoterpena, α- i β-pinena, prisutnih u ulju bibera sa oko 15%, postoje oprečni rezultati. Dok je u radu Soković (2001) utvrđen umeren do slab antifungalni potencijal, drugi istraživači su utvrdili dobru efikasnost α- pinena u inhibiciji vrsta Candida, Aspergilus, Penicillium i dermatomiceta (Mercier et al., 2009; Raju i Maridass, 2009). U poređenju sa α-pinenom, β-pinen se pokazao efikasniji antifungalni agens na Fusarium vrste: F. poae, F. culmorum i F. solani (Krauze-Baranowska et al., 2002). 4.2.8. Etarsko ulja kore cimeta (Cinnamomum zeylanicum) Hemijskom analizom identifikovano je 99,88% etarskog ulja cimeta sa E- cinamaldehidom (74,4%) kao dominantnom komponentom (Slika 37.). Ostale komponente su zastupljene u značajno manjem procentu: cinamil acetat (5,55%), linalol (3,70%), eugenol (3,08%), E-kariofilen (2,60%), 1,8-cineol (2,22%) i bornil acetat (2,13%) (Prilog 2, Tabela 30.). Slika 37. Udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju cimeta Dobijene minimalne inhibitorne i fungicidne koncentracije etarskog ulja kore cimeta kretale su se u opsegu od 2,8 mg/ml za Phomopsis do 6,8 mg/ml za G. roseum i C. lunata, koje su uz A. alternata (sa MIC od 6,4 mg/ml) ujedno i najotpornije gljive na ovo etarsko ulje. Najosetljivija gljiva na ulje cimeta je Phomopsis sp. (Tabela 11., Slika 38.). E- cinamaldehid cinamil acetat linalol eugenol E-kariofilen ostalo 台Ϥ Rezultati i diskusija 82 Tabela 11. MIC i MFC vrednosti za etarsko ulje kore cimeta (mg/ml) Testirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 4,34 4,34 1,8 F. verticillioides 5,30 5,30 1,4 F. tricinctum 4,66 5,30 0,8 F. oxysporum - neven 3,2 3,2 0,8 F. oxysporum – k.svila 3,60 3,60 0,8 F. semitectum 4,66 5,30 1,6 F. subglutinans 4,24 4,24 1,6 F. equiseti 3,71 3,71 1,0 F. sporotrichioides 4,77 4,77 1,0 A. flavus 5,30 5,30 1,8 A. niger 4,24 4,24 1,8 Penicillium sp. 4,24 4,24 1,8 A. alternata 6,36 6,36 1,6 Chaetomium sp. 6,02 6,36 2,0 G. roseum 6,78 7,42 0,6 C. lunata 6,5 6,9 1,0 V. dahliae 3,5 3,71 1,0 T. viride 5,83 5,83 2,0 T. roseum 4,13 4,24 0,8 Phomopsis sp. 2,75 3,18 0,8 Phoma sp. 3,81 4,77 0,8 M. verrucaria 3,18 3,18 0,8 Najveći broj gljiva pokazuje sličnu osetljivost na ovo ulje tj. MIC i MFC vrednosti su se kretale od 3,5 do 4,5 mg/ml (Tabela 11.). Prema ovim rezultatima može se reći da etarsko ulje kore cimeta ispoljava dobar do umeren antifungalni potencijal i da postoji statistički značajna razlika u njegovom delovanju na različite testirane gljive (Slika 38.). ) Rezultati i diskusija 83 Slika 38. MIC vrednosti etarskog ulja kore cimeta (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega Cinamaldehid je organsko jedinjenje koje cimetu, pa i ulju cimeta, daje miris i ukus. Identifikovana je kao glavna fungitoksična komponenta etarskog ulja cimeta (Jham et al., 2005). Carmo et al. (2008) su objavili da je etarsko ulje cimeta snažno inhibiralo rast micelije A. niger, A. flavus i A. fumigatus, ali i germinaciju spora. Glavne morfološke promene posmatrane pod svetlosnim mikroskopom, uzrokovane ovim etarskim uljem, na ćelijama gljiva su: inhibicija stvaranja konidija, nedostatak sporulacije, gubitak pigmentacije, neregularan razvoj hifa i fragmentacija. Takođe, ulje jasno uzrokuje smanjenje glava konidija, sa formiranjem izobličenih konidiofora. Na nivou ćelije vidljiv je gubitak sadržaja citoplazme, kao i poremećaj ćelijske strukture što ukazuje na degeneraciju ćelijskog zida gljive. Pretpostavka ovih autora je da su modifikacije u strukturi micelijuma uzrokovane delovanjem etarskog ulja cimeta na enzime odgovorne za sintezu ćelijskog zida. Kada su u pitanju antifungalna svojstva komponenata etarskog ulja cimeta (mono- i seskviterpena, fenola i cinamaldehida) isti autori smatraju da uzrokuju inhibiciju sinteze ekstracelularnih enzima i poremećaje u strukturi ćelijskog zida što rezultuje u gubitku citoplazme, narušavanju integriteta ćelije i konačno dovodi do uginuća micelije. Smatra se da prisustvo aldehidne grupe, konjugovane dvostruke veze i dugog CH lanca van prstena, kao što je slučaj kod cinamaldehida, obezbeđuje snažnu 䗐Ϥ Rezultati i diskusija 84 antifungalnu aktivnost (Cheng et al., 2008), te može biti potencijalno vodeće jedinjenje u razvoju antifungalnih proizvoda kroz kontrolu sinteze β-(1,3)-glukana i hitina kod kvasaca i plesni (Bang et al., 2000). Verovatno i cinamil acetat, u našem ulju prisutan sa 5,5%, svojom izrazitom antifungalnom aktivnošću (Lee at al., 2005), doprinosi inhibitornoj aktivnosti kompletnog ulja. I za eugenol, fenolnu komponentu, je dokazano da poseduje jak antifungalni potencijal, te verovatno doprinosi aktivnosti kompletnog etarskog ulja cimeta (Yen and Chang, 2008). 4.2.9. Etarsko ulje bosiljka (Ocimum basilicum) Postoji veći broj hemotipova etarskog ulja bosiljka u zavisnosti od toga koje komponente preovlađuju. Uglavnom je to linalol, te su to linalol hemotipovi ulja bosiljka. Etarsko ulje analizirano u ovom radu može se svrstati u metilhavikol hemotip, jer metilhavikol, sa 88,97%, predstavlja dominantnu komponentu, slično rezultatima Tiziana-Barrata et al., (1998). Procentualni udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju bosiljka prikazan jena Slici 39. Slika 39. Udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju bosiljka Uz metilhavikol, u daleko manjem procentu prisutni su i limonen (3,00%) i linalol (1,30%), sa 1% zastupljeni su γ-terpinen i α-bergamoten, dok su ostale komponente zastupljene sa manje od 1%. Kompletan kvalitativan i kvantitativan sastav etarskog ulja bosiljka prikazan je u Prilogu 2 (Tabela 31.). metilhavikol limonen linalol ostalo 啐Ϥ Rezultati i diskusija 85 Rezultati ispitivanja antifungalne aktivnosti etarskog ulja bosiljka prikazani su u Tabeli 12. i na Slici 40. Prema dobijenim rezultatima antifungalni potencijal etarskog ulja bosiljka može se okarakterisati kao umeren. Tabela 12. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja bosiljka (mg/ml) Rast V. dahliae i M. verrucaria je inhibiran najnižom koncentracijom ulja bosiljka od 5,1 mg/ml (MIC). MFC vrednost za M. verrucaria je nešto viša i iznosi 5,95 mg/ml. Među Fusarium vrstama, najosetljivije su bile F. suglutinans i F.oxysporum (sa kukuruzne svile), gde je nešto veća koncentracija od 5,95 mg/ml bila minimalna inhibitorna. Ista koncentracija je bila neophodna i za inhibiciju rasta Penicillium sp., A. alternata, T. roseum, Phomopsis sp. i Phoma sp. Koncentracija od 7,65 mg/ml je bila najveća zabeležena MIC vrednost etarskog ulja bosiljka kojom je inhibiran rast nekoliko testiranih gljiva: F. solani, F. tricinctum, F. equiseti, F. sporotrichioides, G. roseum, C. lunata i T. viride (MFC vrednost se kretala do 8,5 mg/ml). Na osnovu dobijenih rezultata testirane gljive se mogu svrstati u manji broj grupa unutar kojih nije bilo statističke značajne razlike u antifungalnoj aktivnosti ulja Testirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 7,65 8,5 1,8 F. verticillioides 6,8 6,8 1,4 F. tricinctum 7,65 7,7 0,8 F. oxysporum - neven 6,97 7,65 0,8 F. oxysporum – k.svila 5,95 6,80 0,8 F. semitectum 6,8 6,8 1,6 F. subglutinans 6,12 6,80 1,6 F. equiseti 7,65 8,50 1,0 F. sporotrichioides 7,65 7,65 1,0 A. flavus 6,8 6,8 1,8 A. niger 5,1 5,95 1,8 Penicillium sp. 5,95 5,95 1,8 A. alternata 6,12 6,80 1,6 Chaetomium sp. 6,8 6,8 2,0 G. roseum 7,65 7,65 0,6 C. lunata 7,65 8,5 1,0 V. dahliae 5,1 5,1 1,0 T. viride 7,65 7,65 2,0 T. roseum 5,95 5,95 0,8 Phomopsis sp. 5,95 5,95 0,8 Phoma sp. 5,95 5,95 0,8 M. verrucaria 5,1 5,95 0,8 ) Rezultati i diskusija 86 bosiljka tj. da je ovo ulje prilično ujednačeno delovalo na sve testirane gljive, što se može videti na Slici 40. Slika 40. MIC vrednosti etarskog ulja bosiljka (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega Dobijeni su interesantni rezultati za inhibiciju rasta F. subglutinans koja je u prethodno opisanim ispitivanjima bila među najotpornijim gljivama na sva ispitivana ulja. U slučaju etarskog ulja bosiljka, pokazano je da je to najosetljivija gljiva. Slabiji antifungalni potencijal ispitivanog ulja može se pripisati dominaciji metil havikola koji je u ranijim ispitivanjima ispoljio varijabilnu aktivnost u zavisnosti od test organizma. Prema Tadtong et al., (2009) ustanovljena je umerena do slaba antimikrobna aktivnost metil havikola. Nasuprot ovome, prema istraživanjima Suppakul et al. (2003) metilhavikol hemotip ulja bosiljka ispoljilo je dobru antifungalnu aktivnost na A. niger, A. ochraceus i F. culmorum (od 70 do 94%). Takođe, prema in vitro i in vivo istraživanjima Oxenham et al. (2005) etarsko ulje bosiljka, istog hemotipa, značajno je inhibiralo fitopatogenu gljivu Botrytis fabae. Eksperimentima u polju ovo ulje je redukovalo infekciju lišća boba pomenutom fitopatogenom gljivom kao i sa Uromyces fabae. Smatra se da povećanje aktivnosti kataboličkih enzima diamin oksidaze (DAO) i 䛀Ϥ Rezultati i diskusija 87 poliamin oksidaze (PAO) u gljivi B. fabae u prisustvu ulja bosiljka, može biti delimično odgovorno za antifungalnu aktivnost ulja bosiljka, verovatno preko stvaranja vodonik peroksida i pokretanjem programirane ćelijske smrti (Oxenham and Svoboda, 2005). Khan et al., (2010) smatraju da metil havikol ostvaruje fungicidnu aktivnost stvaranjem oksidativnih oštećenja na plazmamebrani gljivičnih ćelija. 4.2.10. Etarska ulja dalmatinske žalfije (Salvia officinalis), španske žalfije (Salvia lavandulifolia) i ruzmarina (Rosmarinus officinalis) Analizirana su etarska ulja dve vrste roda Salvia: Salvia officinalis, poreklom iz Dalmacije i Salvia lavandulifolia, poreklom iz Španije i etarsko ulje ruzmarina, za koje je utvrđena sličnost u sastavu (Tabela 32. u Prilogu 2) U etarskom ulju dalmatinske žalfije identifikovano je 25 jedinjenja što predstavlja 78,57%. Dominantne komponente su cis-tujon (28,54%), 1,8-cineol (13,95%), kamfen (7,11%) i α-pinen (6,65%). Procentualno manje su zastupljeni borneol (3,52%), limonen (3,28%), trans-tujon (2,54%), E-kariofilen (2,31%), bornil acetat (2,20%), β-pinen (1,79%), α-terpineol (1,34%) i linalol (1,0%) (Slika 41a.). Dobijeni rezultati su donekle u korelaciji sa rezultatima drugih ispitivanja gde je cis- tujon dominantna komponenta ulja dalmatinske žalfije, ali su druge dve najzastupljenije komponente bile trans-tujon i viridiflorol (15,0% odnosno 14,2%) (Maksimović et al., 2007). Prema drugim istraživanjima etarska ulja žalfije cis-tujon hemotipa, od glavnih komponenata, uz cis-tujon i 1,8-cineol sadrže i manool i α-humulen (Bernotiene et al., 2007). Razlike u sastavu mogu se biti posledica geografskog porekla populacije kao i ekoloških uslova u kojima biljke rastu (Maksimović et al., 2007). U etarskom ulju španske žalfije identifikovano je ukupno 27 jedinjenja što čini 97,96%. Kao što se može videti na slici 41b., dominantnu komponentu sa 26,64% predstavlja kamfor. Utvrđen je i značajan je udeo α-pinena (17,14%), limonena (13,88%), 1,8-cineola (10,56%), kao i borneola (7,14%), bornil acetata (4,94%), kamfena (4,62%). Nešto manji je, ali znatan, udeo linalol acetata (3,09%), β-pinena (2,46%) i α-terpineola (2,31%). Slične vrednosti dobili su istraživači iz slovačke prema kojima je ulje S. lavandulifolia Vahl. najviše sadržalo kamfor i 1,8-cineol, a veoma malo tujon (Veverkova et al., 2004). 囀Ϥ Rezultati i diskusija 88 Etarsko ulje ruzmarina prema sadržaju monoterpenskih komponenti, slično je etarskim uljima žalfije, posebno španskoj, uz njihov različit procentualni udeo (Slika 41c.). Hemijskom analizom ulja ruzmarina, monoterpenski oksid, 1,8-cineol, je identifikovan kao dominantna komponenta sa 45,34%. Od drugih monoterpenskih komponenti u većoj količini prisutni su, monoterpenski keton, kamfor sa 13%, monoterpenski hidrokarboni α- i β-pinen sa 10,3% odnosno 7,86%, monoterpeni kamfen (4,44%), limonen (2,68%), monoterpenski alkohol borneol (2,54%), α-terpineol (1,68%), bornil acetat (1,08%) i p-cimen (1%), a od seskviterpena E-kariofilen (4,48%). Ukupno je identifikovano 29 komponenti, što predstavlja 99,84% ulja. Sastav etarskog ulja ruzmarina ispitivanog u ovom radu, u korelciji je sa podacima Faixova and Faix (2008), prema kojima je 1,8-cineol dominatna komponenta uz sličan procentualni udeo. a) b) c) Slika 41. Udeo dominantnih komponenti u etarskim uljima: a) španske žalfije, b) dalmatinske žalfije i c) ruzmarina Ispitivanjem antifungalne aktivnosti sva tri etarska ulja utvrđena je različita osetljivost testiranih gljiva. Izvesne razlike u sastavu verovatno su uticale na razliku u inhibitornoj aktivnosti ispitivanih ulja. To se posebno ogleda u aktivnosti etarskih ulja kamfor α-pinenlimonen 1,8-cineol borneol bornil acetat kamfen linalol acetat cis-tujon 1,8-cineol α-pinen kamfen borneol limonen trans-tujon E-kariofilen 1,8-cineolkamfor α-pinen β-pinen kamfen E- kariofilen limonen borneol ) Rezultati i diskusija 89 dve vrste roda Salvia, pri čemu je ulje dalmatinske žalfije ispoljilo znatno jaču antifungalnu aktivnost tj. pri nižim koncentracijama je inhibiralo rast testiranih gljiva. Dok je ulje dalmatinske žalfije ispoljilo dobru do umerenu antifungalnu aktivnost, u zavisnosti od testirane gljive, ulje španske žalfije ispoljilo je umerenu do slabu antifungalnu aktivnost. Nasuprot njima, etarsko ulje ruzmarina ispoljilo je veoma dobar inhibitorni efekat na rast testiranih gljiva. Rezultati antifungalne aktivnosti sva tri ulja prikazani su u Tabeli 13. i na Slici 42. Tabela 13. MIC i MFC vrednosti za ulja (eu) španske i dalmatinske žalfije i ruzmarina (mg/ml) Testirane gljive eu španske žalfije MIC eu španske žalfije MFC eu dalmatinske žalfije MIC eu dalmatinske žalfije MFC eu ruzmarina MIC eu ruzmarina MFC F. solani 7,33 7,33 4,50 4,50 1,5 1,5 F. verticillioides 7,52 7,52 4,60 4,60 1,2 1,2 F. tricinctum 14,10 14,10 10,3 11,94 5,4 5,4 F. oxysporum - neven 14,10 14,10 7,7 7,7 3,4 3,4 F. oxysporum – k.svila 10,94 11,28 7,2 7,2 2,3 2,3 F. semitectum 11,46 12,22 7,4 7,4 3,4 3,4 F. subglutinans 13,72 14,10 9,38 10,12 5,4 5,74 F. equiseti 7,10 7,10 4,60 4,60 4,1 4,51 F. sporotrichioides 14,10 14,10 8,09 9,20 3,51 4,10 A. flavus 14,66 15,10 5,33 5,33 5,10 5,74 A. niger 7,33 7,33 4,78 5,52 3,3 3,3 Penicillium sp. 10,24 10,24 7,0 7,0 5,2 5,74 A. alternata 9,40 9,40 5,70 6,44 3,85 4,92 Chaetomium sp. 11,84 12,22 5,55 6,44 3,6 4,10 G. roseum 9,40 9,40 8,83 8,83 5,6 5,6 C. lunata 7,90 9,40 3,86 3,86 4,8 4,8 V. dahliae 6,01 6,58 3,6 3,6 3,4 3,4 T. viride 13,72 14,10 8,1 9,20 5,2 5,74 T. roseum 9,02 9,40 3,5 3,5 2,6 2,87 Phomopsis sp. 8,64 9,40 4,05 4,60 2,9 4,0 Phoma sp. 7,14 7,52 3,7 3,7 1,9 1,9 M. verrucaria 5,60 5,60 3,5 3,5 2,2 2,46 Najniži inhibitorni potencijal etarsko ulje španske žalfije ispoljilo je na vrste A. flavus, F. sporotrichioides, F. tricinctum i F. oxysporum (izolovan sa nevena) za čiju je inhibiciju rasta bila neophodna koncentracija preko 14 mg/ml. Najveću rezistenstnost na ovo ulje ispoljila je potencijalno toksigena A. flavus za koju su utvrđene najviše MIC i MFC vrednosti (14,66 odnosno 15,10 mg/ml). Neznatno veću osetljivost na ovo ulje ispoljile su T. viride i F. subglutinans sa MIC od 13,7 mg/ml (MFC je 14,10 mg/ml). Najmanje minimalne inhibitorne koncentracije zabeležene su za M. verrucaria i V. dahliae od 5,6 odnosno 5,8 mg/ml. Veću osetljivost na ovo ulje ispoljile su i Phoma sp., ) Rezultati i diskusija 90 A. niger, F. solani, F. equiseti i F. verticillioides za koje je koncentracija od oko 7 mg/ml bila dovoljna za potpunu inhibiciju rasta (MFC). Ispitivanjem etarskog ulja dalmatinske žalfije dobijene su niže minimalne inhibitorne i fungicidne koncentracije za većinu testiranih gljiva koje su se kretale od 3,5 mg/ml do 10,3 za MIC mg/ml, odnosno od 3,5 mg/ml do 11,94 mg/ml za MFC. Na ovo ulje najosetljivije su M. verrucaria, T. roseum, V. dahliae i Phoma sp. za čiju inhibiciju je bila neophodna najniža koncentracija ulja (3,5 tj. 3,7 mg/ml). Najmanju osetljivost ispoljile su F. tricinctum, F. subglutinans, G. roseum, T. viride i F. sporotrichioides, jer su za inhibiciju njihovog rasta bile neohodne najveće koncentracije etarskog ulja dalmatinske žalfije (od 8 do 10 mg/ml, odnosno od 8,8 do 11,4 mg/ml za MFC) (Tabela 13.). Takođe se može primetiti da su vrste Fusarium manje osetljive na ovo ulje u odnosu na vrste drugih rodova. Iako je etarsko ulje dalmatinske žalfije ispoljilo bolji antifungalni potencijal od etarskog ulja španske žalfije, može se primetiti da oba ulja, u različitim koncentracijama, slično deluju na iste vrste gljiva, odnosno slične vrste gljiva su i najosetljivije i najotpornije na oba ulja. Tako su, F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. subglutinans i T. viride najotpornije gljive na etarska ulja obe žalfije, dok su M. verrucaria i V. dahliae, kao i Phoma sp. među najosetljivijim. Može se pretpostaviti da je bolja antifungalna aktivnost etarskog ulja dalmatinske žalfije posledica prisustva tujona kao glavne komponente, kao i većeg udela 1,8-cineola u ovom ulju, u odnosu na ulje španske žalfije. Smatra se da su tujonima bogatija ulja žalfije aktivnija, od onih gde dominiraju druge terpenske komponente (Baričević and Bertol, 2000). Ispitivanja aktivnosti ulja žalfije, tujon hemotipa, ukazala su na izrazit antifungalni potencijal na kliničke izolate vrsta roda Candida, dermatomicete kao i gljive iz rodova Penicillium, Aspergillus, Cladosporium i Fusarium (Pinto et al., 2007). Osim inhibitorne aktivnosti na rast micelije, potpuno redukuju produkciju aflatoksina B i G (Baričević and Bertol, 2000). Slabija antifungalna aktivnost ulja španske žalfije može se objasnti, pretežnim udelom monoterpena sa manjim antifungalnim potencijalom kao što su kamfor, α-pinen i limonen, koji među monoterpenskim komponentama ispoljavaju najniži antifungalni potencijal (Soković, 2001). I za acetate (u našem radu linalol- i bornil acetat) je pokazana slaba antifungalna aktivnost. Džamić et al. (2008) su sugerisali da postoji ) Rezultati i diskusija 91 veza između većeg prisustva linalol acetata i linalola u etarskom ulja Salvia sclarea i njegove umerene antifungalne aktivnosti. U poređenju sa etarskim uljem obe žalfije, etarsko ulje ruzmarina je efikasnije u inhibiciji rasta odabranih gljiva (Tabela 13. i Slika 42.). Ovo ulje je pokazalo umeren do dobar antifungalni potencijal sa minimalnim inhibitornim koncentracijama od 1,2 do 5,6 mg/ml. MFC vrednosti su u ospegu od 1,2 do 5,74 mg/ml. Najosetljivije gljive na ovo ulje bile su F. verticillioides i F. solani sa MIC vrednostima od 1,2 odnosno 1,5 mgl/ml. Neznatno manju osetljivost ispoljile su Phoma sp. (MIC od 1,85 mg/ml), Phomopsis sp. sa MIC 2,0 mg/ml, M. verrucaria (MIC 2,2 mg/ml), F. oxysporum (iz kukuruzne svile) i kao i T. roseum (MIC 2,6 mg/ml). Rast većeg broja gljiva bio je inhibiran koncentracijama od 3,5 do 4,3 mg/ml (Slika 42.), dok su najmanje osetljive bile G. roseum sa MIC od 5,6 mg/ml, kao i F. subglutinans i F. tricinctum sa MIC od 5,4 tj. 5,2 mg/ml. 䡐Ϥ Rezultati i diskusija 92 Slika 42. MIC vrednosti etarskog ulja španske (gore) i dalmatinske žalfije (u sredini) i ruzmarina (dole) (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega 夐Ϥ Rezultati i diskusija 93 Prema Clausen et al., (2010), ulje ruzmarina snažno je inhibiralo rast gljiva Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum i Trichoderma viride. Tretiranjem patogena Penicillium digitatum ovim uljem utvrđena je inhibicija, ne samo rasta micelije, nego i formiranja tipične boje micelijuma, procesa sporulacije kao i promena boje spora (Yigit et al., 2000). Takođe, znatno je redukovana gustina konidija i konidiofora na miceliji. Sva ova svojstva mogu uzrokovati znatno smanjenje virulencije ovih patogena, pa se time smanjuje i učestalost oboljenja na voću koji isti izazivaju. Moghtader et al., (2011) iznose podatak da ulje ruzmarina kompletno inhibira rast A. flavus kao i sintezu aflatoksina B1. Analize koje su sproveli Bartynska and Budzikur-Ramza (2001) ukazuju i na visoku toksičnost ulja ruzmarina na vrste roda Fusarium, što je pokazano i u ovom radu, pri čemu je rast najvećeg broja gljiva ovog roda bio inhibiran nižim testiranim koncentracijama. Zbog ovakve inhibitorne aktivnosti preporučuje se kao konzervans pri konzerviranju nekih namirnica u cilju zaštite od toksigenih gljivičnih infekcija (Moghtader et al., 2011). Antifungalna aktivnost ulja ruzmarina pripisuje se aktivnosti 1,8-cineola (Deabes, 2011). Prema rezultatima istraživanja Soković (2001) izolovane komonente ovog ulja, 1,8-cineol i kamfor, su ispoljile dobar do umeren antifungalni potencijal sa MIC od 2 – 8 µl/ml. U istraživanju Combrinck et al., (2011) 1,8-cineol, kao pojedinačna komponenta, je bio efikasniji u inhibiciji fitopatogenih gljiva, posebno A. alternata, od kompletnog ulja. I borneol je u inhibiciji rasta micelija gljiva ispoljio visoku efikasnost. Kada su borneol i cineol primene kao mešavina, u proporciji u kojoj su zastupljeni u kompletnom ulju, deluju efikasnije nego pojedinačno, kompletno inhibirajući rast ispitivanih gljiva, što ukazuju da ove komponente deluju sinergistički (Clausen et al., 2010). Na osnovu literaturnih podataka o aktivnosti pojedinačnih komponenti prisutnih u ulju ruzmarina testiranog u ovom radu, može se reći da je njegova umerena do dobra inhibitorna aktivnost posledica, verovatno, sinergističke aktivnosti različitih komponenti. Bolja inhibitorna aktivnost ulja ruzmarina u odnosu na etarska ulja dalmatinske i španske žalfije je verovatno posledica većeg procentualnog udela 1,8- cioneola, koji sa 45% predstavlja dominantnu komponentu. Prisustvo seskviterpena E- kariofilena sa jakim antifungalnim efektom verovatno ima svoj doprinos (Amiel et al., 2012). U etarskom ulju ruzmarina manji je sadržaj limonena i acetata, za koji je ) Rezultati i diskusija 94 pokazano da poseduju slab antifungalni potencijal, što takođe može imati uticaj na bolju aktivnost istog. 4.2.11. Etarska ulja limuna (Citrus limon), narandže (Citrus aurantum) i eukaliptusa (Eucalyptus globulus) Etarska ulja kore limuna, narandže i lista eukaliptusa izdvojena su prema, hemijskoj sličnosti, odnosno prema istoj dominantnoj komponenti, monoterpenskom ugljovodoniku, limonenu. Procentualni udeo dominantnih komponenti u etarskim uljima limuna, narandže i eukaliptusa prikazan je na Slici 43., dok je kompletan sastav sva tri ulja prikazan u Prilogu 2 (Tabela 33.). U etarskom ulju kore limuna identifikovano je 19 komponenti što čini 99,99% sastava. Uz limonen kao dominantnu komponentu (65,86%), u većem procentu identifikovane su i β-pinen sa 13,86% i γ-terpinen sa 6,19%, a zatim i geranial sa 2,29%, sabinen sa 2,25% i α-pinen sa 2,13%. Dobijeni rezultati u saglasnosti su sa literaturnim podacima po kojima su limonen, uz β-pinen i γ-terpinen dominantne komponente u etarskom ulju kore limuna (Viuda-Martos et al., 2008). a) b) c) Slika 43. Udeo dominantnih komponenti u etarskim uljima: a) limuna, b) narandže i c) eukaliptusa limonen β-pinen γ-terpinen geranial sabinen α-pinen ostalo limonen linalol acetat mircen γ-terpinen ostalo limonen γ-terpinen α-pinen p-cimen ostalo 䥀Ϥ Rezultati i diskusija 95 U etarskom ulju narandže udeo limonena je 90,88%, a svih ostalih identifikovanih komponenti svega 9%. Sa oko 1% prisutni su linalol acetat (1,64%), mircen (1,36%) i γ-terpinen (1%), dok su ostale komponente zastupljene sa ispod 1%. Dobijeni rezultati u saglasnosti sa literaturnim podacima u kojima je limonen dominantna komponenta u ovom ulju (Brien et al., 2008). U etarskom ulju lista eukaliptusa limonen je zastupljen u sličnoj koncentraciji kao i u etarskom ulju narandže, sa 89,92%. γ-terpinen je zastupljen sa 2,54%, α-pinen sa 2,14% i p-cimen sa 2,22%. Na osnovu udela dominantne komponente, limonena, ulja narandže i eukaliptusa su hemijski sličnija nego ulja dve vrste roda Citrus. Rezultati ispitivanja aktivnosti ova tri ulja ukazali su na njihov slabiji antifungalni potencijal, uz neznatno bolju aktivnost etarskog ulja eukaliptusa. Rezultati su prikazani u Tabeli 14. i na Slici 44. Tabela 14. MIC i MFC vrednosti etarskih ulja limuna, narandže i eukaliptusa (mg/ml) Testirane gljive eu limuna MIC eu limuna MFC eu narandže MIC eu narandže MFC eu eukaliptusa MIC eu eukaliptusa MFC F. solani 7,65 8,70 12,0 12,15 9,7 9,7 F. verticillioides 8,0 8,70 12,1 12,1 8,9 9,7 F. tricinctum 10,4 10,4 14,6 15,39 8,7 8,7 F. oxysporum - neven 9,57 10,88 13,3 13,77 5,8 5,8 F. oxysporum – k.svila 6,61 6,61 9,7 9,7 4,85 4,85 F. semitectum 6,94 7,83 9,7 9,7 7,76 7,76 F. subglutinans 13,0 13,0 16,2 16,2 8,7 9,7 F. equiseti 6,26 6,96 8,7 9,7 6,8 6,8 F. sporotrichioides 13,0 13,0 14,6 14,6 10,7 11,4 A. flavus 13,4 13,92 15,2 16,2 8,9 9,70 A. niger 12,7 13,4 12,1 12,1 6,6 6,6 Penicillium sp. 13,0 13,0 16,2 16,2 7,9 8,7 A .alternata 15,66 15,66 16,4 17,01 10,7 10,7 Chaetomium sp. 11,5 13,0 12,2 12,96 11,6 12,6 G. roseum 8,0 8,0 12,1 12,1 10,1 10,67 C. lunata 11,13 11,13 15,2 16,2 10,5 11,6 V. dahliae 6,09 6,96 12,15 12,15 7,4 7,76 T. viride 13,4 13,92 14,0 14,58 10,5 11,6 T. roseum 5,74 5,74 14,2 14,58 5,2 5,82 Phomopsis sp. 6,96 7,40 9,7 9,7 5,2 5,2 Phoma sp. 6,96 7,40 10,4 11,4 4,85 4,85 M. verrucaria 5,2 5,2 8,1 8,91 5,4 5,82 Minimalne inhibitorne koncentracije za ulje limuna se kreću od 5,2 mg/ml do 15,6 mg/ml, što su ujedno najmanje i najveće ne samo MIC, nego i MFC vrednosti. Najosetljivija gljiva na ovo ulje je M. verrucaria (MIC 5,2 mg/ml), dok su manje 媀Ϥ Rezultati i diskusija 96 osetljive F. equiseti, Phoma sp., Phomopsis sp., F. semitectum, F. oxysporum (sa cvetova nevena) za čiju je inhibiciju rasta potrebna koncentracija između 6 i 7 mg/ml (MFC vrednosti su neznatno veće). Najveću toleratnost na ulje kore limuna ispoljila je A. alternata za koju je zabeležena MIC vrednost od 15,6 mg/ml, što je ujedno i najveća MIC i MFC vrednost za ovo ulje. Nešto veću osetljivost ispoljile su T. viride, A. flavus, Penicillium i F. subglutinans sa MIC vrednostima oko 13 mg/ml. Za potpunu inhibiciju rasta testiranih gljiva etarskim uljima narandže potrebne su, uglavnom, veće koncentracije. Za inhibiciju rasta najvećeg broja testiranih gljiva potrebna je koncentracija iznad 10 mg/ml, pri čemu su F. subglutinans, A. flavus i Penicillium sp. sa MIC od 16 mg/ml najotpornije gljive na ovo ulje. Najmanja MIC vrednost za ulje narandže zabeležena je za M. verrucaria (8,1 mg/ml) odnosno F. equiseti (8,5 mg/ml). Ovako visoke MIC i MFC vrednosti svrstavaju ulje narandže u grupu slabo aktivnih. Salb do umeren antifungalni potencijal zabeležen je i za etarsko ulje eukaliptusa. Ipak, u odnosu na etarska ulja limuna i narandže, ulje eukaliptusa se pokazalo bolje u inhibiciji rasta testiranih gljiva. Najveće MIC i MFC vrednosti utvrđene su za inhibiciju rasta Chaetomium sp. (11,6 odnosno 12,6 mg/ml). Slabiju antifungalnu aktivnost etarsko ulje eukaliptusa je ispoljilo i na F. sporotrichioides, A. alternata, C. lunata, G. roseum i T. viride (MIC vrednosti oko 10 mg/ml). Najmanja koncentracija ulja eukaliptusa bila je potrebna za inhibiciju rasta Phoma sp. i F. oxysporum (sa kukuruzne svile)(4,85 mg/ml), kao i Phomopsis sp., T. roseum i M. verrucaria (neznatno iznad 5 mg/ml). Rezultati prikazani na Slici 44. ukazuju da postoji statistički značajna razlika u inhibitornom efektu sva tri ulja na rast testiranih gljiva. ) Rezultati i diskusija 97 Slika 44. MIC vrednosti etarskog ulja limuna (gore), narandže (u sredini) i eukaliptusa (dole) (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega 䨰Ϥ Rezultati i diskusija 98 U ranijim istraživanjima etarska ulja ovih vrsta ispoljila su slabu aktivnost u odnosu na većinu testiranih patogena kao i u našem ispitivanju. Ispitivanja etarskih ulja 4 vrste roda Eucaliptus, ispoljila su veoma slabu aktivnost na testirane gljive, iako je u nekima od njih bilo značajnije prisustvo 1,8-cineola, monoterpenskog oksida, sa dokazanom antifungalnom efikasnošću (Combrink et al., 2011). Prema ovim autorima limonen je, među svim pojedinačnim komponentama, najslabiji inhibitor rasta testiranih patogenih gljiva, koji kao dominantna komponenta utiče na slabu aktivnost kompletnog ulja. Takođe, pokazano je da etarsko ulje eukaliptusa čak stimuliše germinaciju spora u konidijama A. niger pri nižim koncentracijama (Deans, 2002). Prema rezultatima dobijenim u ovom radu etarsko ulje limuna ispoljava bolji tj. jači antifungalni efekat na testirane gljive u odnosu na etarsko ulje kore narandže. Ranija, paralelna ispitivanja ulja limuna i narandže ukazala su, kao i u ovom radu, bolju antifungalnu aktivnost ulja limuna, mada su oba ispoljila slab antifungalni potencijal (Soković, 2001). U istom radu dokazana je slaba antifungalna aktivnost limonena, dominantene komponente u sva tri ulja, čime se može objasniti njihova slabija antifungalna aktivnost. 4.2.12. Etarsko ulje cveta kamilice (Matricaria recutita) U etarskom ulju kamilice identifikovano je ukupno 95,64% sastava ulja pri čemu su dominantne komponente seskviterpeni dok su monoterpenske komponente prisutne samo u tragovima (Tabela 34. u Prilogu 2). α-bisabolol oksid A je sa 37,98% identifikovan kao dominatna komponenta, dok je značajan udeo i bisabolola sa 21,11% i farnesena sa 18,52%. Bisabolol oksid II je zastupljen sa 5,06%, Z-spiroeter sa 4,72%, hamazulen sa 2,22% i germakren D sa 1,22% (Slika 45). Ostale komponente su zastupljene sa ispod 1%. Plava boja ulja kamilice posledica je prisustva terpenoida hamazulena. 寠Ϥ Rezultati i diskusija 99 Slika 45. Udeo dominantnih komponenti u etraskom ulju kamilice Ranija istraživanja hemijskog sastava etarskog ulja kamilice pokazala su veliku varijabilnost u sastavu, posebno u procentualnom udelu dominantnih komponenata. Kao dominantne komponente preovlađuju α-bisabolol i hamazulen, mada to mogu biti i santolin alkohol, izobutil angelat ili trans-β-farnesen. Smatra se da visok sadržaj bisabolola u ulju odgovorno za većinu aktivnosti ovog ulja: antibakterijsku, antifungalnu, antiinflamatornu kao i antiulceroznou ali nisu potpuno razjašnjeni mehanizmi dejstva (Berry, 1995; Matricaria recutita, 2008). Ispitivanjem aktivnosti etarskog ulja kamilice u inhibiciji rasta fitopatogenih gljiva, pokazan je slab antifungalni potencijal. Uzimajući u obzir da je etarsko ulje bogato oksidovanim komponentama, očekivalo se da pokaže jaču antifungalnu aktivnost. Rezultati su prikazani u Tabeli 15. i na Slici 46. Minimalne inhibitorne i fungicidne koncentracije nisu ispod 10 mg/ml, dok je naveća od 28,7 mg/ml (MIC), odnosno 29,7 mg/ml (MFC) neophodna za inhibiciju rasta A. alternata. Veliku tolerantnost na ulje kamilice ispoljile su i F. semitectum, F. subglutinans, A. flavus, Penicillium sp., Chaetomium sp. i G. roseum za čiju su inhibiciju rasta bile neophodne koncentracije iznad 20 mg/ml. α-bisabolol oksid A bisabolol farnesen bisabolol oksid II Z-spiroeter ostalo ) Rezultati i diskusija 100 Tabela 15. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja kamilice (mg/ml) Testirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 11,5 12,7 1,8 F. verticillioides 10,3 10,3 1,4 F. tricinctum 18,7 21,25 0,8 F. oxysporum - neven 11,0 11,5 0,8 F.oxysporum – k.svila 11,0 11,0 0,8 F. semitectum 23,4 25,5 1,6 F. subglutinans 21,25 21,25 1,6 F. equiseti 13,4 15,30 1,0 F. sporotrichioides 10,6 11,05 1,0 A. flavus 23,5 25,5 1,8 A. niger 12,0 12,75 1,8 Penicillium sp. 25,2 25,2 1,8 A. alternata 28,7 29,7 1,6 Chaetomium sp. 26,2 27,2 2,0 G. roseum 21,25 21,25 0,6 C. lunata 17,3 17,3 1,0 V. dahliae 13,4 13,4 1,0 T. viride 16,0 17,0 2,0 T. roseum 14,8 15,3 0,8 Phomopsis sp. 14,8 15,3 0,8 Phoma sp. 14,8 15,3 0,8 M. verrucaria 13,4 13,4 0,8 Najosetljivija gljiva na ovo ulje je F. verticillioides čiji rast je potpuno inhibiran sa 10,3 mg/ml. Veću osetljivost na ulje kamilice, od ostalih testiranih gljiva, ispoljile su F. sporotrichioides sa MIC od 10,6 mg/ml, kao i F. oxysporum (izolovan sa nevena i kukuruzne svile) i F. solani za čiju inhibiciju rasta je bila neophodna koncentracija od 11 mg/ml (MFC vrednosti su neznatno više). Na Slici 46. se može videti da postoji statistički značajna razlika u inhibitornoj aktivnosti ulja kamilice na testirane gljive. 䬠Ϥ Rezultati i diskusija 101 Slika 46. MIC vrednosti etarskog ulja kamilice (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega Ranija istraživanja su dala oprečne rezultate. Rezultati istraživanja Soković (2001) su u saglasnosti sa našim rezultatima, prema kojima etarsko ulje kamilice poseduje slabiji antifungalni potencijal, mada nešto jači od utvrđenog u ovom radu. Sa druge strane, prema Jian-Yu (2012) ulje kamilice je ispoljilo visok antifungalni efekat na rast kako bakterija, tako i gljiva. Prema ovim autorima, antimikrobna aktivnost pripisuje se glavim komponentama kao što su farnesen, bisabolol oksid, bisabolol i farnesol. Istraživanjima Maria-Rose et al. (2004) i Pauli (2006) su ukazali da farnesen poseduje izrazit inhibitorni potencijal prema mikroorganizmima hrane, a α-bisabolol može da inhbira rast gljiva kroz specifičnu inhibiciju biosinteze ergosterola. Iako su pomenute komponente prisutne i u etarskom ulju kamilice ispitivanom u ovom radu, značajniji antifungalni efekat nije zabeležen. 4.2.13. Etarsko ulje vetivera (Vetiveria zizanoides) Vetiver je višegodišnja biljka, visoka trava tropskih i suptropskih područja. Ulje vetivera se dobija iz korena ove biljke. U ulju vetivera identifikovani su manje poznati seskviterpeni, seskviterpenoli i seskviterpenoni (ciklični ketoni). Najzastupljenije 嵐Ϥ Rezultati i diskusija 102 komponente su isparljivi seskviterpeni kusimol sa 18,22%, E-izovalencenol sa 14,67%, vetiselinenol sa 4,52%, kao i α- i β-vetivon sa 5,42 odnosno 4,13% što je u saglasnosti sa literaturnim podacima (Thubthimthed et al., 2000). Sa oko 3 % zastupljeni su junenol, valerianol i 10-epi-γ-Eudezmol. Udeo dominantnih komponenti predstavljen je na Slici 47., dok je kompletan hemijski sastav ulja vetivera dat u Tabeli 35. u Prilogu 2. Slika 47. Udeo dominantnih komponenti u etarskom ulju vetivera Primenom mikrodilucione metode utvrđen je veoma slab inhibitorni efekat ovog ulja na rast svih testiranih gljiva, što se može videti u Tabeli 16. i na Slici 48. Tabela 16. MIC i MFC vrednosti etarskog ulja vetivera Testirane gljive MIC MFC flukonazol F. solani 12,7 13,20 1,8 F. verticillioides 12,7 13,20 1,4 F. tricinctum 17,6 17,6 0,8 F. oxysporum - neven 11,6 12,40 0,8 F. oxysporum – k.svila 14,4 14,80 0,8 F. semitectum 20,6 21,6 1,6 F. subglutinans 22,4 22,4 1,6 F. equiseti 14,4 14,4 1,0 F. sporotrichioides 20,8 20,8 1,0 Aspergillus flavus 20,0 20,0 1,8 A. niger 10,1 10,8 1,8 Penicillium sp. 14,4 14,4 1,8 A. alternata 14,3 14,8 1,6 Chaetomium sp. 17,6 17,6 2,0 G. roseum 17,9 19,2 0,6 C. lunata 17,6 17,6 1,0 V. dahliae 12,7 13,2 1,0 T. viride 20,8 20,8 2,0 T. roseum 14,3 14,8 0,8 Phomopsis sp. 15,0 15,0 0,8 Phoma sp. 16.2 16,2 0,8 M. verrucaria 10.1 10.8 0.8 kusimol E- izovalenceno lvatiselinenolα-vetivon β-vetivon ostalo ) Rezultati i diskusija 103 MIC i MFC vrednosti su preko 10 mg/ml za sve gljive, pri čemu je najveća test koncentracija od 22 mg/ml tj. 20 mg/ml neophodna za inhibiciju rasta F. subglutinans, odnosno F. sporotrichioides i A. flavus (MFC vrednosti su neznatno veće za pojedine gljive). Statističkom analizom dobijenih rezultata antifungalne aktivnosti izdvajeno je nekoliko grupa gljiva među kojima postoje statistički značajne razlike u delovanju ovog ulja (Slika 48.). Slika 48. MIC vrednosti etarskog ulja vetivera (mg/ml) na rast odabranih gljiva. Srednje vrednosti MIC i standardna greška su prikazani. *Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega Veoma je malo podataka o antimikrobnoj aktivnosti etarskog ulja vetivera. U ispitivanjima antimikrobne aktivnosti 52 etarska ulja, etarsko ulje vetivera inhibiralo je rast samo Gram pozitivnih bakterija i C. albicans (Hammer et al., 1999) i to najslabije od svih ispitivanih ulja. Prema Dweck (1994) β-eudesmol je odgovoran za baktericidnu aktivnost ovog ulja. 䰐Ϥ Rezultati i diskusija 104 4.3. Sinergistička aktivnost etarskih ulja Iako postoji niz radova o fungitoksičnim svojstvima isparljivih komponenata etarskih ulja, manja pažnja posvećena je fungitoksičnosti ovih supstanci u kombinaciji. Ove informacije su neophodne jer je pokazano da se fungitoksični potencijal većine fungicida povećava kada se kombinuju (Pandey and Dubey, 1992). Povećanje fungitoksičnog potencijala mešavine etarskih ulja može biti posledica udružene aktivnosti dve ili više komponenta etarskog ulja (Scardavi, 1966). Ovaj sinergizam bi imao prednost u postžetvenoj zaštiti jer patogeni mikroorganizmi ne mogu lako da steknu rezistentnost na više komponenti etarskih ulja. U našem radu pratili smo aktivnost tri vrste mešavina od po dva etarska ulja na odabrane gljive: mešavinu etarskog ulja ruže i lavande, etarskog ulja origana i lavande i mešavinu etarskog ulja timijana i origana. U prve dve kombinacije ispitivali smo efekat mešavine jednog ulja koje je ispoljilo izrazit antifungalni potencijal (ulje ruže i origana), i lavandinog ulja koje je ispoljilo slabiji antifungalni potencijal u odnosu na prethodna dva. U trećoj kombinaciji pratili smo kako dva ulja sa izrazitim antifungalnim potencijalom deluju u kombinaciji na rast odabranih gljiva. Tumačenje rezultata inetrakcije dva ulja se razlikuje u zavisnosti od autora. U našem radu, za interpretaciju rezultata sinergističke aktivnosti odabranih ulja koristili smo tumačenje prema da Silva et al., (2011). Prema ovim autorima interakcija dva ulja se definiše kao sinergizam kada je frakcioni indeks inhibitorne koncentracije FiCindeks ≤ 0.5; indiferntni efekat kada je FiCindeks 0.5-2 i antagonistički kada je FICindeks ≥ 2. Ovi autori daju tumačenje efekata na sledeći način, što je korišćeno i u ovom radu: Sinergistička aktivnost kombinacije dve komponente je prisutna ukoliko je aktivnost tj. efekat te kombinacije veći od aktivnosti (efekta) pojedinačnih komponenti. Parcijalni sinergija/aditivni efekat definiše slučaj kada je efekat kombinacije dve komponente jednak zbiru efekata pojedinačnih komponenti. Indiferentni efekat definiše onu kombinaciju kada je efekat kombinacije dve komponente jednak efektu najaktivnije komponente. Antagonizam se javlja ako je efekat kombinacije dve komponente manji u poređenju sa efektom najaktivnije pojedinačne komponente. 庰Ϥ Rezultati i diskusija 105 4.3.1. Antifungalna aktivnost mešavine etarskih ulja ruže i lavande Minimalne inhibitorne vrednosti ulja lavande i ulja ruže, kao i efikasnost njihove kombinacije, ispitivane na pet gljiva, prikazane su u Tabeli 17. Aktivnosti mešavine etarskih ulja ruže i lavande praćena je na sledeće gljive: A. flavus, F. subglutinans, F. equiseti, F. sporotrichioides i Penicillium sp. Dobijeni rezultati pokazuju da je kombinacija ova dva ulja ispoljila značajan sinergističi antifungalni efekat na predstavnike roda Fusarium. Sinergistička aktivnost je utvrđena za F. subglutinans kada su ulja u odnosu 1/16 × MIC etarskog ulja ruže i 1/4 × MIC etarskog ulja lavande, dok je za druge dve Fusarium vrste sinergizam zabeležen u odnosu od 1/16 × MIC za oba ulja (Tabela 17.). Takođe, rast F. subglutinans, koja je u ovim istraživanjima među najotpornijim gljivama na većinu etarskih ulja, uspešno je inhibiran kombinacijom ova dva ulja. Za inhibiciju rasta ove gljive, potrebne su najveće inhibitorne koncentracije oba ulja, kada su se ispitivala pojedinačno, dok su u kombinaciji potrebne mnogo niže vrednosti (1/16 × MIC etarskog ulja ruže i 1/4 × MIC etarskog ulja lavande). Tabela 17. Sinergistički efekat mešavine etarskih ulja ruže i lavande Testirane gljive MIC eu ruže mg/ml FIC eu ruže MIC eu lavande mg/ml FIC eu lavande FiCi eu ruže/ eu lavande A. flavus 0,3 0,0625 4,6 1 1,0625 F. subglutinans 0,6 0,0625 6,8 0,25 0,3125 F .equiseti 0,32 0,0625 3,4 0,0625 0,125 F. sporotrichioides 0,28 0,0625 2,6 0,00625 0,0685 Penicillium sp. 0,3 0,0625 2,7 2,0 2,0625 MIC – minimalna inhibitorna koncentracija etarskog ulja (eu); FIC – frakciona inhibitorna koncentracija eu; FiCi - frakcioni indeks inhibitorne koncentracije dva etarska ulja Tumačenjem FiCi vrednosti prema da Silva et al., (2011) aktivnost mešavine ulja ruže i lavande na rast A. flavus se može okarakterisati kao aditivni efekat. Kada je u pitanju Penicillium sp., aktivnost mešavine ova dva ulja je na granici između indiferentnog i aditivizma. Može se primetiti da je MIC vrednost za ulje ruže u odnosu na sve testirane patogene gljive drastično manji, i do 50 puta kada se primenjuje u mešavini sa lavandinim uljem, osim za F. subglutinans gde je MIC vrednost smanjena 10 puta. ) Rezultati i diskusija 106 Kada je u pitanju lavandino ulje, značajno smanjenje MIC vrednosti kada je u kombinaciji sa uljem ruže, zabeleženo je za F. subglutinans, F. equiseti, a posebno za F. sporotrichioides (preko 400 puta). 4.3.2. Antifungalna aktivnost mešavina etarskih ulja timijana i origana Kada je u pitanju mešavina dva pojedinačno izrazito aktivna etarska ulja, timijana i origana, može se primetiti dalje povećanje njihove antifungalne aktivnosti u odnosu na pojedinačnu aktivnost. Sem za F. subglutinans, mešavina ova dva ulja ispoljava znatnu sinergističku aktivnost na sve testirane gljive. FiCi vrednosti se kreću od 0,125 do 0,375. Uočava se i smanjenje MIC vrednosti oba ulja (FIC u tabeli) kada su u kombinaciji u odnosu na MIC vrednosti kada se ispituju pojedinačno. Za vrlo otpornu gljivu F. subglutinans ni mešavina ova dva vrlo efikasna ulja nije ispolila poboljšanje u inhibiciji rasta, već antagonistički efekat. Rezultati aktivnosti mešavine etarskih ulja timijana i origana prikazani su Tabeli 18. Tabela 18. Sinergistički efekat mešavine etarskih ulja timijana i origana Testirane gljive MIC ulje timijana mg/ml FIC ulje timijana MIC ulje origana mg/ml FIC ulje origana FiCi Timijan/ origano A. flavus 0,65 0,0625 0,13 0,0625 0,125 F. subglutinans 0,88 2,0 0,16 4,0 6,0 F. solani 0,15 0,0625 0,13 0,0625 0,125 F. semitectum 0,18 0,125 0,27 0,25 0,375 Penicillium sp. 0,13 0,0625 0,27 0,0625 0,125 MIC – minimalna inhibitorna koncentracija etarskog ulja (eu); FIC – frakciona inhibitorna koncentracija eu; FiCi - frakcioni indeks inhibitorne koncentracije dva etarska ulja 4.3.3. Antifungalna aktivnost mešavina etarskih ulja origana i lavande Praćenjem rezultata antifungalne aktivnosti etarskih ulja origana i lavande može se reći da ova mešavina nije ispoljila tako dobru aktivnost kao prethodne. Sinergistički efekat ova dva ulja zabeležen je samo u odnosu na F. subglutinans i F. semitectum, dok se aktivnost ova dva ulja u odnosu na A. flavus i F. solani može definisati kao indiferentna. Sa FiCi vrednošću od 2,065 aktivnost mešavine ulja origana i lavande u odnosu na A. alternata je na granici između indiferentne i antagonizma (Tabela 19.). 䴀Ϥ Rezultati i diskusija 107 Tabela 19. Sinergistički efekat mešavine etarskih ulja origana i lavande Testirane gljive MIC ulje origana mg/ml FIC ulje origana MIC ulje lavande mg/mg FIC ulje lavande FiCi origano/ lavanda A. flavus 0,13 1,0 4,6 0,0625 1,0625 F. subglutinans 0,16 0,0625 6,8 0,0625 0,125 F. solani 0,13 1,0 1,7 0,0625 1,0625 F. semitectum 0,27 0,0625 4,6 0,25 0,3125 A. alternata 0,27 0,0625 3,3 2,0 2,0625 MIC – minimalna inhibitorna koncentracija etarskog ulja (eu); FIC – frakciona inhibitorna koncentracija eu; FiCi - frakcioni indeks inhibitorne koncentracije dva etarska ulja U slučaju indiferenetnog efekta mešavine ova dva ulja na gljive A. flavus i F. solani može se primetiti porast MIC vrednosti ulja origana (FIC u tabeli) u odnosu na slučaj kada se ispituje samo. Kada je u pitanju inhibicija rasta ostalih gljiva primećuje se da ulje origana efikasnije deluje kada je u kombinacije sa uljem lavande, tj. smanjuju se MIC vrednosti. Iz rezultata prikazanih u Tabeli 19. može se primetiti da se MIC vrednosti etarskog ulje lavande, takođe drastično smanjuju kada je u kombinaciji sa uljem origana (FIC ulja lavande) u odnosu kada deluje kao pojedinačno ulje. Generalno, može se reći da su etarska ulja ispitivana u kombinaciji u našem radu uglavnom efikasnija u inhibiciji rasta većine fitopatogenih gljiva, nego pojedinačna i da im se uglavnom značajno smanjuju MIC vrednosti. Važan je podatak da je sinergistički efekat kombinacije ulja ispoljen u odnosu na gljive koje su pri ispitivanjima sa pojedinačnim etarskim uljima ispoljile veliku rezistentnost: F. subglutinans, F. semitectum i A. flavus. Pojedine kombinacije ulja su ispoljile indiferentan efekat ili antagonizam na rast pojedinih testiranih gljiva, tako da su neophodna detaljna ispitivanja u ovom pravcu pri potencijalnoj formulaciji biofungicida na bazi kombinacije etarskih ulja. Ove informacije bi bile od velikog značaja jer je u praksi pokazano da se fungitoksičan potencijal fungicida značajno povećava kada se isti kombinuju (Tripathi and Dubey, 2004). 怠Ϥ Rezultati i diskusija 108 4.4. In vitro i in situ ispitivanja uticaja odabranih etarskih ulja na ukupan broj gljiva na biljnim drogama U laboratoriji za mikrobiološku kontrolu Instituta za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“, gde je obavljen najveći deo ovog rada, osnovna ispitivanja bazirana su na analizi mikrobiološke ispravnosti polu- i gotovih proizvoda, počev od osušene biljne droge kao početne sirovine za sve proizvode. Mikrobiološka ispravnost kako droge, tako i proizvoda, procenjuje se utvrđivanjem ukupnog broja aerobnih bakterija, ukupnog broja kvasaca i plesni, kao i specifičnih bakterija u odnosu na granične vrednosti zadate Pravilnikom o zdravstvenoj ispravnosti dijetetskih proizvoda ("Sl. glasnik RS", br. 45/2010, 27/2011 i 50/2012). Kao što je ranije navedeno u ovom radu, utvrđeno je da je najveći uzrok mikrobiološke nečistoće biljnih droga kontaminiranost različitim gljivama. Imajući ovo u vidu, isprobali smo efikasnost odabranih etarskih ulja, koja su pokazala dobru antifungalnu aktivnost u ovom radu, na redukciju ukupnog broja gljiva. Korišćene su droge koje su u ranijim ispitivanjima pokazale najveći stepen kontaminacije fitopatogenim gljivama: herba rastavića, herba i list nane i list koprive (Stević, 2009). Za in vitro i in situ ispitivanja odabrali smo sledeća etarska ulja: etarsko ulje timijana, čubra, origana, ruže, čajnog drveta, korijandera, zdravca, lavande i anisa. U in vitro ispitivanjima, primenili smo SRPS ISO 21527-2 metodu, zadatu navedenim Pravilnikom, za utvrđivanje ukupnog broja kvasaca i plesni u uzorku droge dobijene iz Odeljenja prerade Instituta za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“. Utvrđena je izrazita redukcija ukupnog broja gljiva u svim uzorcima droge, tretiranim svim ispitivanim etarskim uljima. Kao najefikasnija pokazala su se etarska ulja čubra, timijana i origana koja su redukovala broj gljiva i do 100%. I ostala ulja znatno su inhibirala rast gljiva. Rezultati su prikazani u Tabeli 20. ) Rezultati i diskusija 109 Tabela 20. Redukcija ukupnog broja gljiva u uzorcima biljnih droga tretiranih etarskim uljima Etarska ulja (eu) test nana kopriva rastavić k.svila neven ukupan broj gljiva pre tretmana 9x104 2x104 3x104 5x105 2x105 ukupan broj gljiva posle tretmana eu timijana in vitro 0 0 0 0 0 in situ 7x101 6x101 6x101 3x102 2x102 eu čubra in vitro 0 0 0 0 0 in situ 6x102 4x102 5x102 8x102 9x102 eu origana in vitro 0 0 0 0 0 in situ 2x102 6x101 9x101 3x102 2x102 eu ruže in vitro 0 0 0 0 0 in situ 2x102 9x101 6x101 3x102 4x102 eu čajnog drveta in vitro 0 0 0 0 0 in situ 4x102 102 9x101 5x102 5x102 eu korijandera in vitro 3x101 101 2x101 5x101 4x101 in situ 3x102 3x102 102 8x102 6x102 eu zdravca in vitro 5x101 2x101 3x101 6x101 4x101 in situ 3x103 6x102 2x103 6x103 4x103 eu lavande in vitro 2x101 2x101 101 5x101 4x101 in situ 4x102 5x102 3x102 103 6x102 eu anisa in vitro 2x101 0 0 5x101 5x101 in situ 7x102 5x102 5x102 103 7x102 Koncentracija za etarska ulja timijana, čubra, origana i ruže je 30 µl/filter disku, za čajno drvo i anis 40 µl/filter disku; za korijander i lavandu 50 µl/filter disku, za etarska ulja zdravca 80 µl/filter disku. U in situ ispitivanjima koristili smo modifikovanu metodu isparavanja etarskog ulja sa filter papira u zatvorenoj kesici sa ispitivanom drogom, tzv. „pad delivery system“ tj. „soaking pad system“ (Plaza et al., 2004; Arrebola et al., 2007). Pre tretmana i posle 3, 5 i 7 dana, utvrđivan je ukupan broj gljiva u uzorcima prema navedenoj, ISO metodi. Rezultati ovih ispitivanja su pokazala da su sva etarska ulja značajno inhibirala ukupan broj gljiva na biljnoj drogi, između 97% i 99% (Tabela 20.). Najveću efikasnost u redukciji ukupnog broja gljiva u testiranim uzorcima ispoljila su ulja timijana, origana i ruže. Neznatno manju inhibitornu aktivnost u in situ uslovima ispoljila su etarska ulja čubra, korijandera, zdravca i lavande. Aplikacijom rastućih koncentracija ispitivanih ulja na filter papir postavljen u kesicu sa drogom pokazano je da je koncentracija od 30 µl po filter disku (isečen u prečniku 1cm) ulja timijana, origana i ruže redukovala ukupan broj gljiva preko 50%. Pri istoj koncentraciji etarskog ulja čubra zapažen je neznatno veći ukupan broj gljiva što je u suprotnosti sa in vitro istraživanjima, kao i ispitivanjima minimalne inhibitorne koncentracije (MIC). Etarsko ulje čubra je pri najnižim MIC vrednostima u odnosu na sva ulja potpuno ꠀϤ Rezultati i diskusija 110 inhibiralo rast svih gljiva. Etarsko ulje čajnog drveta i anisa su redukovali broj gljiva sa oko 50% pri koncentraciji od 40 µl/filter disku, a za ulje korijandera i lavande značajna redukcija bila je zabeležena pri koncentraciji od 50 µl/filter papiru. Najveća koncentracija za značajniju redukciju gljiva u in situ uslovima bila je neophodna za ulja lavande i zdravca (80 µl/filter papiru) (Tabela 20.). Na osnovu rezultata dobijenih u našem radu, kao i literaturnih podataka, može se pretpostaviti da bi odabrana etarska ulja čubra, timijana, origana i ruže bila efikasna u biokontroli skladišnih gljiva sa biljnih droga putem fumigacije. Bilo bi neophodno, ispitati organoleptička svojstva droge nakon fumigacije, kao i utvrditi eventualno prisustvo rezidua. Primena etarskih ulja i pojedinih aktivnih komponenti na ovaj način u mnogome bi doprinelo rešavanju problema mikrobiološki nesipravne droge usled kontaminacije patogenim gljivama. 4.5. Uporedna analiza antifungalne aktivnosti etarskih ulja u in vitro testovima Na osnovu dobijenih rezultata analize antifungalnog potencijala 22 etarska ulja može se reći da su sva etarska ulja ispoljila inhibitorni efekat na rast svih odabranih gljiva izolovanih sa biljnih droga, sa značajnim razlikama u toj aktivnosti. Pojedina etarska ulja svrstana su u grupe prema hemijskoj sličnosti. Kriterijum za podelu ulja prema antifungalnoj efikasnosti je bila aktivna doza, tj., vrednost MIC. Etarska ulja čubra, origana i timijana su bila najaktivnija u smislu inhibicije svih fitopatogenih gljiva tj. ispoljla su najjači antifungalni potencijal pri najnižoj koncentraciji, znatno jači od komercijalnog mikotika, flukonazola. Neznatno manju aktivnost ispoljilo je etarsko ulje ruže, a odmah potom i ulja anisa i čajnog drveta. Po dobroj antifungalnoj aktivnosti istakla su se i etarska ulja zdravca, lavande, korijandera, bergamota, ljubičice i ruzmarina. Nešto manju, ali još uvek dobru aktivnost, ispoljila su etarska ulja cimeta i bibera. Umerenu do slabu inhibitornu aktivnost na rast testiranih gljiva ispoljila su etarska ulja bosiljka, dalmatinske i španske žalfije. U odnosu na sintetiči fungicid, slabu aktivnost pokazala su etarska ulja eukaliptusa, limuna i narandže, dok je najslabija antifungalna aktivnost zabeležena za etarska ulja kamilice i vetivera. 憀Ϥ Rezultati i diskusija 111 Prema literaturnim podacima, ispitivana etarska ulja ostvaruju antifungalnu aktivnost na morfološkom i citološkom nivou. Od morfoloških promena, pojedina ulja osim što inhibiraju rast micelije, mogu inhibirati rast germinativnih tuba kao i rast hifa, germinaciju konidija i formiranje spora (Nychas, 1995). Na nivou ćelije etarska ulja mogu ostvariti antifungalnu aktivnost kroz nekoliko mehanizama: inhibicijom sinteze ćelijskog zida, narušavanjem integriteta ćelijske membrane, inhibicijom funkcije citoplazmatične membrane, inhibicijom sinteze proteina kao i sinteze nukleinskih kiselina (Kalemba and Kunicka, 2003; Carmo et al., 2008a; Zuzarte et al., 2011). Takođe je pokazano da etarska ulja mogu remetiti aktivnost membrane mitohondrija što je povezano sa remećenjem enzimatskih reakcija kao što je transport elektrona u procesu respiracije, transport proteina i fosforilacija ADP-a (Atanda et al., 2006; Carmo et al., 2008b). Utvrđeno je da glavne komponente etarskih ulja prilično dobro reflektuju biofizičke i biološke karakteristike ulja i da intenzitet antimikrobnog delovanja ulja zavisi od koncentracija glavnih komponenata (Ipek et al., 2005). Međutim, potvrđeno je da na antimikrobnu aktivnost etarskih ulja mogu uticati procentualno manje zastupljena jedinjenja. Smatra se da na aktivnost komponenata etarskih ulja glavni uticaj ima lipofilni karakter ugljovodoničnog skeleta i hidrofilni karakter funkcionalnih grupa. Prema literaturnim podacima fenolne komponente pokazuju najjaču antifungalnu aktivnost među svim komponentama etarskih ulja. Za fenolima po antifungalnom potencijalu slede alkoholi, a za njima aldehidi i ketoni. Monoterpenski ugljovodonici i acetati poseduju najslabiju antifungalnu aktivnost. Njihova nerastvorljivost u vodi i nizak kapacitet stvaranja vodoničnih veza, uzrok je male antifungalne aktivnosti (Kalemba and Kunicka, 2003). Od fenilpropana, eugenol poseduje izrazito dobru antifungalnu aktivnost, a ostali dobru do umerenu. U odabranim etarskim uljima, ispitivanim u ovom radu, hemijskom analizom identifikovani su mono- i seskviterpeni, kao i fenilpropani. Među monoterpenima, prema procentualnom udelu, kao dominantne komponente se izdvajaju: a) fenoli (npr. karvakrol i timol), b) ugljovodonici (limonen, α- i β-pinen, p-cimen, γ-terpinen), c) alkoholi (linalol, geraniol, citrenol, terpinen-4-ol, borenol), d) oksidovani alkoholi (1,8- cineol), e) aldehidi (citronelal, geranial, neral), f) ketoni (kamfor, fenhon, tujon, karvon) ) Rezultati i diskusija 112 i acetati (npr. bornil- i linalil acetat). Od seskviterpena identifikovani su: a) ugljovodonici (npr. E ili (β)-kariofilen, hamazulen, farnesen), b) alkoholi (bisabolol), c) oksidovani alkoholi (bisabolol oksid). Fenilpropanska jedinjenja koja su identifikovana su cimetaldehid, metilhavikol, eugenol i anetol. Nivo aktivnosti etarskih ulja ispitivanih u ovom radu u skladu je sa navedenim podacima o stepenu aktivnosti pojedinačnih komponeti. Naime, može se reći da je najbolja antifungalna aktivnost etarskih ulja čubra, timijana i origana posledica aktivnosti dominantnih fenolnih komponenti, karvakrola i timola, za koje je navedeno da poseduju najviši antifungalni potencijal među svim komponentama etarskih ulja (Kalemba and Kunicka, 2003). Antimikrobna aktivnost fenolnih jedinjenja pripisuje se prisustvu aromatičnog jezgra i aktivnosti OH grupe koja formira vodonične veze sa aktivnim mestima ciljnih enzima ćelijskog zida gljiva kao što su hitinaza i α- i β-glukanaza čime posredno oštećuju hitinski sloj, a time se obezbeđuje nesmetani prolaz pojedinačnih komponenti ili etarskih ulja u unutrašnjost ćelije (Velluti et al., 2005; Amini et al, 2012). Fenoli mogu reagovati i sa proteinima citoplazmatične membrane, uzrokujući deformacije u njihovoj strukturi i funkcionalnosti, a takođe mogu narušiti enzimatske procese ćelije, uključujući i one koje učestvuju u produkciji energije i sintezi strukturnih jedinjenja (Ultee et al., 2002). Generalno, inhibitorna aktivnost fenolnih komponenata, karvakrola i timola, na rast micelije i produkciju mikotoksina može se pripisati njihovoj sposobnosti da povećavaju permeabilnost ćelijske membrane mikroorganizama omogućavajući na taj način gubitak makromolekula iz unutrašnjosti ćelije (Ultee et al., 2002; Mahmoubi and Kazempour, 2011). Prema ovim autorima karvakrol i timol direktno deluju na membranu dezintegrišući je, i u veoma malim koncentracijama (>1µl/ml) inhibiraju fosforilaciju ADP-a u ćelijama gljiva. Davidson (2001) iznosi pretpostavku da timol i karvakrol mogu da remete i funkcionalnost genetičkog materijala. Kako je dokazana sinergistička aktivnost između timola i karvakrola (Didry et al., 1993), međusobna interakcija ovih fenolnih komponenti ima važnu ulogu u ostvarenju ukupne antifungalne aktivnosti etarskih ulja u čiji sastav ulaze. Na osnovu svega navedenog, kao i u činjenici da je karvakrol, kao dominantna komponenta, zastupljeniji u etarskom ulju čubra i origana nego u ulju timijana i da ispoljava bolji 仠Ϥ Rezultati i diskusija 113 antifungalni potencijal od timola, može se tražiti objašnjenje za njihovu neznatno veću antifungalnu aktivnost od ulja timijana utvrđenu u ovom radu. Veoma dobra antifungalna aktivnost utvrđena je i za etarska ulja u kojima dominiraju monoterpenski alkoholi. Tako se dobar antifungalni efekat etarskih ulja ruže i zdravca može pripisati dominaciji citronelola i geraniola, a etarskog ulja čajnog drveta, terpinen-4-ola. Slično ovome, pretpostavlja se da visok udeo alkohola linalola utiče na dobru aktivnost ulja lavande i korijandera, dok oksidovani alkohol 1,8-cineol određuje dobru inhibitornu aktivnost ulja ruzmarina. Smatra se da su monoterpenski alkoholi posebno aktivni zbog njihove relativno visoke rastvorljivosti u vodi i prisustva alkoholne grupe (Griffin et al., 1999; Dorman and Deans, 2000), i da dobru antifungalnu aktivnost ostvaruju interakcijom sa ćelijskom membranom (Vardar et al., 2003; Imelouane et al., 2009). Pri relativno niskim koncentracijama, ove interakcije mogu dovesti do promena u propustljivosti membrane (Uribe et al., 1985; Cox et al., 2000) i inhibicije respiracije (Uribe et al., 1985). Pri većim koncentracijama može doći do totalnog gubitka homeostaze, oštećenja membrane i smrti ćelije (Carson et al. 2002). Mada se linalol razlikuje od ostalih monoterpenskih alkohola jer je acikličan, ispoljava značajnu antifungalnu aktivnost. Ovo sugeriše da prisustvo alkoholne grupe mnogo više determiniše antifungalnu aktivnost jedinjenja nego ciklična ili aciklična struktura (Adegoke et al., 2000; Cox et al., 2001; Inouye et al., 2001). Oksidovani monoterpeni, kao što je 1,8-cineol, ispoljavaju različit stepen citotoksičnosti. Kao tipične lipofilne komponente, prolaze kroz citoplazmatičnu membranu gljivičnih ćelija i remete njenu strukturu kao i transport jona. Takođe je pokazano da ometaju procese disanja na membranama mitohondrija (Deba et al., 2008). Dobru inhibitornu aktivnost na rast svih ispitivanih gljiva pokazalo je i etarsko ulje bergamota u čijem sastavu dominiraju monoterpenski ugljovodonik limonen i acetat, linalol acetat, za koje je utvrđen najslabiji antifungalni efekat među svim komponentama etarskih ulja. Može se pretpostaviti da je dobrom inhibitornom efektu ovog ulja doprinelo prisustvo manje zastupljenih komponenti, linalola i γ-terpinena za koji je potvrđen dobar antifungalni potencijal (Mahboubi and Kazempour, 2011). U grupu ulja sa veoma dobrom antifungalnom aktivnošću spada i etarsko ulje anisa sa dominantnom komponentom E-anetolom (fenilpropan) za koji je dokazana 拰Ϥ Rezultati i diskusija 114 dobra antifungalna aktivnost. Visok inhibitorni potencijal u redukciji rasta svih ispitivanih gljiva pokazalo je i etarsko ulje ljubičice u čijem sastavu dominira triacetat. U kategoriju ulja sa dobrim do umerenim antifungalnim potencijalom svrstavaju se etarska ulja cimeta i crnog bibera što se može pripisati dominaciji komponenti za koje je potvrđeno da poseduju dobar do umeren antifungalnim potencijal. Za ulje cimeta to je fenilpropan, cinamaldehid, dok je u ulju bibera skoro podjednak udeo, β-pinena i limonena, monoterpena sa umerenim do niskim antifungalnim potencijalom, i seskviterpena, E-kariofilena, sa izrazitom antifungalnom aktivnošću. Aktivnost etarskog ulja ne može se pripisati samo dominantnim komponentama, već i njihovoj složenoj inetarakciji, kao i manje zastupljenim jedinjenjima (Chang et al., 2008). Umeren do slab antifungalni potencijal etarskog ulja bosiljka može se pripisati dominaciji metil havikola, fenilpropana sa umerenim do slabim antifungalnim efektom na rast gljiva. Slabija antifungalna aktivnost metil havikola objašnjava se manjom rastvorljivosti u vodi koja je važna za mogućnost penetriranja kroz ćelijski zid bakterija ili gljiva (Suppakul et al., 2003). U etarskim uljima španske i dalmatinske žalfije, a posebno eukaliptusa, limuna i narandže, dominiraju monoterpenski ugljovodonici te se ovakvom hemijskom sastavu može pripisati i njihov slabiji inhibitorni efekat na rast testiranih ulja. Monoterpenski ugljovodonici γ-terpinen, α-terpinen, terpinolen, p-cimen, limonen i α-felandren su manje aktivni od prethodnih grupa monoterpena (fenola i alkohola). U radu Dorman and Deans (2000) α-pinen i β-pinen su ispoljili umerenu antifungalnu aktivnost, posebno β- pinen, za razliku od istraživanja Soković (2001) gde su ispoljili neznatnu antifungalnu aktivnost. Utvrđeno je da monoterpenski ugljovodonici, kao i oksidovani monoterpeni, mogu da remete ćelijski integritet, stvaraju prekide u plazma membrani i inhibiraju transport jona i proces respiracije na membrani mitohondrija (Deba et al., 2008; Imelouane et al., 2009). Tako je utvrđeno da β-pinen može da deluje na membranu kvasca dovodeći do manjka K+ i H+ jona ili oštećuje mitohondrije time što dovodi do deenergizacije organele usled prestanka respiracije (Uribe et al., 1985). Neki od pomenutih monoterpenskih ugljovodonika, kao što su α-pinen, β-pinen, γ-terpinen i limonen povećavaju propustljivost plazma membrane što dovodi do povećanja pH gradijenta i elektrohemijskog potencijala, a svaki od ovih procesa je od osnovnog značaja za energetski sistem ćelije (Sun et al., 2007). Među nabrojanim monoterpenima, ) Rezultati i diskusija 115 γ-terpinen, biološki prekursor timola i karvakrola, pokazuje najbolju antifungalnu aktivnost (Imelouane et al., 2009). S druge strane, drugi prekursor fenola, p-cimen, prisutan u etarskim uljima čubra i timijana sa 12%, odnosno 23%, ne ispoljava antimikrobnu aktivnost ali povećava antimikrobnu aktivnost fenolnih komponenti. Smatra se da p-cimen sa fenolnim komponentama ispoljava sinergističku inhibitornu aktivnost na rast gljiva (Soto- Mendivil et al., 2008; Mahmoubi and Kazempour, 2011). Naime, p-cimen uzrokuje širenje citoplazmatične membrane, a u kombinaciji sa karvakrolom inkorporira se u citoplazmatičnu membranu čime se olakšava transport karvakrola kroz istu (Mihajilov- Krstev et al., 2009). Takođe, smatra se da p-cimen deluje i na aktivnost mitohondrija tj. smanjuje potencijal membrane mithondrija, smanjuje stopu fosforilacije ADP-a i stimuliše potrošnju kiseonika posle fosforilacije ADP-a (Custódio et al., 2011). Etarska ulja žalfije, iako su izolovana iz dve vrste istog roda Salvia, ispoljila su različit stepen inhibitorne aktivnosti u odnosu na rast testiranih gljiva. Dok je ulje dalmatinske žalfije ispoljilo dobar do umeren antifungalni potencijal, etarsko ulje španske žalfije ispoljilo je umeren do slabiji potencijal. Bolja aktivnost etarskog ulja dalmatinske žalfije verovatno je posledica većeg udela komponenti sa dokazanim antifungalnim potencijalom kao što su tujoni i monoterpenski alkoholi, 1,8-cineol i borneol (Tabanca et al., 2001.). U etarskom ulju španske žalfije preovlađuju komponente sa umerenim ili slabim antifungalnim potencijalom kao što su kamfor (monoterpenski keton) i monoterpenski hidrokarboni, α-pinen i limonen (Soković, 2001), kao i acetati za koje je dokazana najslabija antifungalna aktivnost od svih komponenti etarskih ulja. Džamić et al. (2008) su sugerisali da postoji veza između većeg prisustva linalol acetata u etarskom ulja Salvia sclarea i njegove umerene antifungalne aktivnosti. Dominacija monoterpenskog ugljovodonika limonena sa slabim antifungalnim potencijalom verovatno je uzrok slabe antifungalne aktivnosti etarskih ulja eukaliptusa, limuna i narandže. Najslabiju inhibitornu aktivnost u odnosu na rast svih testiranih fitopatogenih gljiva ispoljila su etarska ulja kamilice i vetivera u kojima dominiraju seskviterpenski ugljovodonici sa slabijim antifungalnim potencijalom. 俐Ϥ Rezultati i diskusija 116 Statističkom analizom dobijenih rezultata pokazano je da su pojedina ulja delovala ujednačeno na sve testirane gljive. Izdvaja se grupa od 4 etarska ulja, čubra, origana, timijana i ruže, između kojih nema statistički značajne razlike u antifungalnoj aktivnosti na gotovo sve testirane fitopatogene gljive. Statistička analiza antifungalne aktivnosti svih ulja na pojedinačne testirane gljive prikazana je u Prilogu 3 (Tabela 36). Rezultati statističke analize (Prilog 3) delovanja svih etarskih ulja na pojedinačne gljive ukazuju na to da su među vrstama roda Fusarium, F. subglutinans, F. semitectum i F. sporotrichioides, generalno najotpornije gljive na većinu analiziranih etarskih ulja, a od predstavnika drugih rodova to su T. viride, A. alternata, A. flavus i Chaetomium sp. Najosetljivije gljive na većinu etarskih ulja su F. oxysporum izolovan sa kukuruzne svile, kao i M. verrucaria, T. roseum, V. dahliae, donekle i Phomposis sp. i Phoma sp. Takođe je uočljivo da je A. niger osetljivija na većinu etarskih ulja od A. flavus. Dobijeni rezultati su pokazali da pojedina odabrana etarska ulja predstavljaju dobru osnovu za potencijalnu formulaciju biofungicida koji bi se mogao koristiti u biološkoj kontroli fitopatogenih gljiva, najpre fumigacijom biljnih droga. Kako su etarska ulja isparljiva jedinjenja, fumigacija se prema literaturnim podacima, pokazala kao efikasan vid primene etarskih ulja u kontroli patogenih gljiva na uskladišetnom voću. 摐Ϥ Rezultati i diskusija 117 4.6. Antifungalna aktivnost izolata Bacillus sp. 4.6.1. Ispitivanja antagonističkog potencijala različitih izolata Bacillus sp. Pokazano je da bakterije iz rodova Pseudomonas, Bacillus, Cryptococcus, Enterobacter i dr., imaju sposobnost inhibicije rasta različitih fitopatogenih gljiva različitim mehanizmima (Sharma et al., 2009; Toure et al., 2004; Pal and Gardener, 2006; Protolipac et al., 2011). Rezultati istraživanja ukazuju na visoku efikasnost vrsta roda Bacillus, posebno B. subtilis i srodne B. amyloliquefaciens, u biokontroli različitih bolesti biljaka, voća i povrća uzrokovanih zemljišnim ili postžetvenim patogenim gljivama (Toure, 2004; Ćirić et al., 2011; Jošić et al., 2011; Živković, 2011). Posebna pažnja posvećena je izolatima Bacillus sp. koji svoju antagonističku aktivnost, između ostalog, ispoljavaju sintezom metabolita sa visokom antimikrobnom aktivnošću. Naša istraživanja bila su usmerena na in vitro ispitivanja antagonističkog potencijala 14 različitih izolata Bacillus sp., izolovanih sa različitih staništa Srbije, prema fitopatogenim gljivama testiranim u prethodnim ispitivanjima antifungalnog potencijala etarskih ulja. Inhibitorno delovanje različitih izolata Bacillus sp. ispitivano je testovima dvojne kultivacije gajenjem kultura fitopatogenih gljiva u kombinaciji sa odgovarajućim antagonistom na istoj Petrijevoj šolji. Na početku je urađen skrining test u kome je ispitivana osetljivost svih gljiva na sve odabrane Bacillus sp. izolate. Pokazano je da su pojedine gljive bile potpuno neosetljive, tj., da na rast micelije nije uticalo prisustvo izrasle bakterije. Najveću rezistentnost na sve izolate Bacillus sp. ispoljila je F. sporotrichioides, nezavisno od toga da li je izolovana sa koprive ili nane, a nešto manju i F. solani izolovana sa listova i herbe rastavića. Pojedine vrste gljiva ispoljile su selektivnu oseljivost na neke od testiranih bakterijskih izolata tj. ispoljile su manju ili veću osetljivost, ili su bile potpuno rezistentne na pojedine izolate. Na osnovu rezultata skrining ispitivanja odabrane su sledeće gljive za dalji rad: F. solani, F. verticillioides, F. tricinctum, F. oxysporum (izolovane sa nevena i kukuruzne svile), F. semitectum, F. subglutinans, F. equiseti, A. alternata, G. roseum, A. flavus, A. niger, Penicillium sp., Chaetomium sp. i C. lunata. Ove vrste su korišćene i u prethodnim ispitivanjima antifungalne aktivnosti etarskih ulja, ali su pojedine ) Rezultati i diskusija 118 izostavljene, npr. F. sporotrichioides, Phoma, T. roseum i dr., zbog rezistentnosti na Bacillus izolate, ili su i same antagonisti, kao što je T. viride. Rezultati ispitivanja antagonističke aktivnosti svih 14 izolata Bacillus sp. na rast odabranih fitopatogenih gljiva prikazani su na slikama 49. i 50. Antagonisti su svrstani u odgovarajuću kategoriju inhibicije rasta (GIC). Testirani Bacillus sp. izolati su ispoljili različit stepen inhibicije prema različitim vrstama testiranih gljiva. Izolati SS-39.1 i SS-39.3 u ogledima dvojne kultivacije manifestuju najslabiji antagonistički efekat prema gotovo svim patogenima. Odstupanje je zabeleženo za F. tricinctum, izolovan sa rastavića, na koji su ovi izolati ispoljili umerenu aktivnost inhibicijom rasta micelije oko 40% (GIC 2). Izvesnu osetljivost na izolat SS-39.3, ispoljila je i F. subglutinans čiji je rast bio inhibiran sa 44.6%, dok je na izolat SS-39.1 potpuno rezistentna (Slika 49). Izolat SS-21.7 nije ispoljio značajniji antagonizam prema većini testiranih gljiva. Od vrsta roda Fusarium značajnije je inhibirao rast F. subglutinans (preko 50%), nešto manje F. tricinctum. Od predstavnika drugih rodova testiranih gljiva izuzetak je zabeležen samo u slučaju Penicillium sp. čiji je rast inhibiran ovim izolatom sa 58.6% (Slika 50). Rezultati i diskusija 119 Slika 49. Efekat izolata Bacillus sp. na rast vrsta roda Fusarium. Prikazane su srednje vrednosti procenta inhibicije rasta i standardna devijacija. )Rezultati i diskusija 120 Slika 50. Efekat izolata Bacillus sp. na rast odabranih gljiva. Prikazane su srednje vrednosti procenta inhibicije rasta i standardna devijacija. Rezultati i diskusija 121 Slično, veoma različit efekat na rast ispitivanih gljiva ispoljio je i izolat SS-10.7. Visoku antagonističku aktivnost ispoljio je samo prema F. subglutinans i F. oxysporum (izolovan sa nevena) inhibicijom rasta od 67%, odnosno 52% (GIC 3), dok je prema ostalim vrstama ovog roda ispoljio blag antagonizam inhibicijom rasta njihovih micelijuma sa oko 30%, ili je efekat potpuno izostao (Slika 49). Od predstavnika drugih rodova gljiva, izolat SS-10.7 je ispoljio značajniji antagonizam samo prema Chaetomium sp. inhibicijom rasta micelije od 56% (Slika 50). Selektivna antagonistička aktivnost utvrđena je i za izolat SS-40.6 koji je od Fusarium vrsta umeren antagonizam ispoljio, kao i izolat SS-10.7, prema F. subglutinans i F. oxysporum. Ovaj izolat nije inhibirao rast micelija A. niger i Penicillium sp., dok je prema ostalim gljivama ispoljio umeren antagonistički potencijal inhibirajući rast njihovih micelija od 37% do 54%. Najjaču antagonističku aktivnost ispoljio je na rast A. alternata sa PIG od 64%. Ostali ispitivani izolati Bacillus sp., SS-6.2, SS-12.6, SS-13.1, SS-27.7, SS-35.4, SS-38.2, SS-38.3, SS-38.4 i SS-40.2 su ispoljili dobru ili jaku antagonstičku aktivnost prema fitopatogenim gljivama, inhibirajući rast micelija pojedinih gljiva i preko 70% (GIC 4). Većina ovih izolata ispoljili su, među vrstama svih rodova izuzev Fusarium, najsnažniji antagonizam prema A. alternata i Penicillium sp. inhibicijom rasta preko 70%. Obe vrste gljiva ispoljile su nešto manju osetljivost na izolat SS-6.2 (Slika 50). Najslabiji antagonistički potencijal utvrđen je prema A. niger koji je tolerantan na izolate SS-6.2, SS-35.4 i SS-38.2. Najjaču antagonističku aktivnost, na vrste roda Fusarium, ispoljili su izolati SS- 12.6, SS-13.1 i SS-27.7 inhibicijom rasta većine testiranih gljiva sa preko 50%. Ostali izolati, SS-6.2, SS-40.2, SS-35.4, SS-38.2 i SS-38.4 ispoljavaju selektivnu antagonističku aktivnost prema Fusarium vrstama, od redukcije rasta micelije do 74%, do potpunog izostanka inhibitorne aktivnosti, u zavisnosti od gljive i izolata Bacillus sp. Generalno, može se reći da su najmanju osetljivost na većinu ovih izolata ispoljile F. solani i F. verticillioides, a najveću F. subglutinans i F. equiseti (Slika 49). Interesantni rezultati dobijeni su za F. oxysporum, za koju je utvrđeno da su sojevi izolovani iz dve biljne droge (cvetova nevena i kukuruzne svile), različito osetljivi na pojedine Bacillus sp. izolate. Naime, soj F. oxysporum izolovan sa cvetova nevena potpuno je rezistentan na izolate SS-35.4, SS-40.2 i SS-40.6, dok je rast soja )Rezultati i diskusija 122 izolovog iz kukuruzne svile inhibiran sa preko 40%, istim sojevima (GIC 2). Ovaj soj je ispoljio i dvostruko veću otpornost na izolat SS-38.2 u odnosu na soj sa cvetova nevena. Antagonizam pojedinih izolata Bacillus sp. na Fusarium vrste prikazan je na Slici 49. Uporednom analizom dobijenih rezultata može se reći da su Fusarium vrste nešto otpornije na Bacillus sp. izolate od vrsta drugih rodova gljiva. F. subglutinans je najosetljivija na antagonistički najaktivije izolate SS-12.6, SS-13.1, SS-27.7 i SS-6.2. Ovi rezultati su posebno zanimljivi zato što su u suprotnosti sa rezultatima prethodnih ispitivanja etarskih ulja u kojima je ova gljiva ispoljila najveću toleratnost na najveći broj testiranih ulja. Posmatranjem micelije svih testiranih gljiva u dualnom testu pod elektronskim mikroskopom primećene su izvesne promene jedino delovanjem izolata SS-38.4 na nekim gljivama. Ovaj izolat inhibirao je klijanje konidija kod F. equiseti, dok je kod F. tricinctum uočen neobičan oblik mikrokonidija, kao i formiranje hlamidospora koje se inače stvaraju pri nepovoljnim spoljašnjim uslovima. Osim navedenog, uočeno je i smanjenje cele micelije A. alternata u interakciji sa izolatom SS-40.2 (Slika 51), kao i C. lunata sa izolatom SS-12.6 (Slika 52). a) b) Slika 51. Efekat izolata Bacillus sp. SS-40.2 prema A. alternata. a) kontrola; b) dualni test a) b) Slika 52. Efekat izolata Bacillus sp. SS-12.6 prema Curvularia lunata. a) kontrola; b) dualni test 툀ϴ Rezultati i diskusija 123 Na osnovu dobijenih rezultata in vitro ispitivanja može se reći da su najbolji antagonistički potencijal na većinu testiranih gljiva ispoljili izolati Bacillus sp. SS-12.6, SS-13.1, a zatim i SS-38.3 i SS-38.4, SS-40.2, SS-27.7, SS-38.3, SS-38.4, SS-35.4, SS- 38.2 i SS-6.2. Može se pretpostaviti da testirani izolati ispoljavaju svoj antagonizam prema odabranim gljivama produkcijom antimikrobnih supstanci, ali se ne mogu isključiti ni ostali mehanizmi antagonizma kao što su: kompeticija za nutrijente, produkcija litičkih enzima i indukcija imunog odgovora. Široki dijapazon antimikrobnih supstanci koje proizvode bakterije roda Bacillus uključuje i lipopeptide. Lipopeptidi iz familije iturina, fengicina i surfaktina koji se sintetišu uz pomoć velikih multienzimskih kompleksa, a ne ribozomalno, ispoljavaju širok antimikrobni spektar i izuzetnu surfaktantsku aktivnost (Magnet-Dana and Peypoux 1994; Vollembroich et al. 1997). Iturini i fengicini ispoljavaju jaku antifungalnu aktivnost kroz potpunu inhibiciju rasta širokog spektra biljnih patogena (Klich et al., 1994), dok surfaktini ispoljavaju izvestan sinergistički efekat na antifungalnu aktivnost iturina A (Maget-Dana et al., 1992). Prema Marrone (2002) surfaktini, u manjoj količini (10 ppm), značajno inhibiraju formiranje spora i germinativnih tuba u kombinaciji sa iturinima. Novija istraživanja ukazuju i na antifungalnu aktivnost surfaktina (Vitullo et al., 2012). Kod svih 14 testiranih izolata Bacillus sp. potvrđeno je prisustvo gena uključenih u sintezu lipopeptida iz familije iturina, surfaktina i fengicina, izuzev izolata SS-12.6 i SS-13.1 kod kojih je primećeno odsustvo gena za produkciju fengicina (Stanković et al., 2012). To daje za mogućnost da je produkcija lipopeptida odgovorna za antifungalni efekat izolata, mada se, kao što je rečeno, ne može isključiti učešće drugih mehanizama antagonizma pošto su testirane pune kulture bakterija. U cilju potvrde hipoteze da su lipopeptidni antibiotici odgovorni za dobru antifungalnu aktivnost izolata Bacillus sp., u dalja istraživanja uključili smo ekstrakte lipopeptidnog sastava izolovane iz sojeva SS-12.6 i SS-13.1, čime su eliminisani ostali potencijalni mehanizmi antagonizma. Prema literaturnim podacima, tretman voća lipopeptidnim ekstraktima B. subtilis GA1 soja ispoljio je snažan protektivan efekat sličan tretmanu kulturom bakterija, u odnosu na gljive uzročnike truljenja (Toure et al., �ϴ Rezultati i diskusija 124 2004). Podjednako dobra efikasnost lipopeptidnog ekstrakta kao i vegetativnih ćelija ukazuje na njegovu ulogu u aktivnosti kompletnog soja kao agensa biokontrole. Rezultati ispitivanja antifungalnog efekta lipopeptidnih ekstrakata izolata SS- 12.6 i SS-13.1 na testirane gljive izolovane sa lekovitog bilja prikazani su u Tabeli 21., uporedo sa antagonističkim potencijalom izolata Bacillus sp. iz kojih su izolovani. Tabela 21. Antifungalni efekat izolata Bacillus sp. SS-12.6 i SS-13.1 i njihovih lipopeptidnih ekstrakata (izraženo u % inhibicije rasta) Gljive izolat SS-12.6 ekstrakt 12.6 izolat SS-13.1 ekstrakt 13.1 F. solani 50 21 43 0 F. verticillioides 56 54 58 26 F. tricinctum- rastavić 48 1,5 52 34 F. oxysporum - neven 50 58 52 18 F. oxysporum – k.svila 48 42 44 8 F. semitectum 57 53 55 8 F. subglutinans 53 75 51 20 F. equiseti 55 56 48 34 C. lunata 61 46 56 15 A. flavus 65 6 60 0 A. niger 59 33 54 0 Penicillium sp. 65 72 65 71 A. alternata 70 70 74 26 Chaetomium sp. 56 73 52 17 G. roseum 65 9 47 0 Ispitivanjem aktivnosti lipopeptidnog ekstrakta izolovanog iz Bacillus sp. SS- 12.6 može se uočiti da je veoma efikasan u inhibiciji rasta testiranih gljiva (Tabela 21, Slika 53.). Rast micelija pojedinih gljiva inhibiran je ovim ekstraktom preko 70% (A. alternata, Penicillium sp., Chaetomium sp.i F. subglutinans). Kako je stepen inhibicije rasta micelije gljiva F. verticillioides, F. oxysporum (sa obe biljne droge), F. semitectum, F. equiseti, Penicillium sp. i A. alternata, izolatom SS-12.6 i njegovim lipopeptidnim ekstraktom sličan, može se pretpostaviti da je antagonizam ovog izolata prema navedenim fitopatogenim gljivama posledica antifungalne aktivnosti lipopeptida. )Rezultati i diskusija 125 Chaetomium sp. Alternaria alternata Fusarium oxysporum Fusarium solani Penicillium sp. Slika 53. Antifungalni efekat lipopeptidnog ekstrakta izolata SS-12.6 prema različitim gljivama. Prikazana je kontrola (leva kolona) i antagonizam ekstrakta (desna kolona) Rezultati i diskusija 126 U slučaju F. oxysporum (sa nevena), Penicillium sp., a posebno F. subglutinans i Chaetomium sp. lipopeptidni ekstrakt bio je bolji antagonist od pune kulture izolata SS- 12.6 iz koga je izolovan (videti u tabeli 21.). Nasuprot ovim nalazima, ovaj ekstrakt bio je znatno slabiji u inhibiciji rasta F. solani, a posebno G. roseum, A. flavus i F. tricinctum od pune kulture. Na osnovu dobijenih rezultata može se pretpostaviti da je za visoku inhibitornu aktivnost izolata SS-12.6 na nabrojane gljive odgovoran i neki drugi metabolit ili se ostvaruje kroz neki drugi mehanizam. Primećeno je da lipopeptidni ekstrakt izolata SS-12.6, osim što inhibira rast F. oxysporum (sa kukuruzne svile) dovodi i do promene boje micelije (Slika 53). Nasuprot lipopeptidnom ekstraktu izolata SS-12.6, aktivnost ekstrakta izolata Bacillus sp. SS-13.1 na rast istih gljiva bila je znatno slabija. Inhibicija rasta većine gljiva bila je odsutna, izuzev u slučaju Penicillium sp. čiji je rast inhibran sa 71% (Tabela 21.). Na osnovu iznetog, može se pretpostaviti da su drugi metaboliti izolata SS-13.1 odgovorni za njegov izražen antagonizam u punoj kulturi na odabrane fitopatogene gljive, ili neki drugi mehanizam. Ispitivanjem minimalne inhibitorne koncentracije lipopeptidnih ekstrakata izolata SS-12.6 i SS-13.1 donekle su potvrđeni dobijeni rezultati. MIC vrednosti oba ekstrakta prikazane su u Tabeli 22. Tabela 22. MIC vrednosti za ekstrakte izolata SS-12.6 i SS-13.1 (µl/ml) Gljive Ekstrakt 12.6 Ekstrakt 13.1 F. solani 7,8 250 F. verticillioides 3,9 125 F .tricinctum- rastavić / / F. oxysporum -neven 3,9 62,5 F. oxysporum- k.svila / / F. semitectum 5,5 500 F. subglutinans 1,25 500 F. equiseti 5,5 62,5 C. lunata 2,5 125 A. flavus >500 >500 A. niger 62,5 >500 Penicillium sp. >500 >500 A. alternata 20 250 Chaetomium sp. 2,5 250 G. roseum 125 500 F. tricinctum - nana 1,9 >500 Rezultati i diskusija 127 U slučaju lipopeptidnog ekstrakta Bacillus SS-12.6 izolata dobijene su niske MIC vrednosti izuzev za G. roseum, A. flavus i Penicillium sp. što je u korelaciji sa efektom ekstrakta na iste gljive na Petri šolji (Tabela 22.). Odstupanje od očekivanih i dobijenih rezultata utvrđeno je za MIC vrednost za Penicillium sp. Ovaj ekstrakt je znatno inhibirao rast Penicillium sp. na PDA podlozi, sa preko 70%, dok je MIC iznosila preko 500 µl/ml. Kada je u pitanju lipopeptidni ekstrakt SS-13.1, utvrđeni su visoke MIC vrednosti što je u korelaciji sa rezultatima ispitivanja inhibitornog efekta ovog ekstrakta na rast micelija na PDA agaru, koja su ukazala na njegovu slabu antifungalnu aktivnost. Očekivale se jedino mala MIC vrednost za Penicillium sp. pošto je ekstrakt inhibirao rast ove plesni sa 71%, što nije potvrđeno mikrodilucionom metodom. Za detaljnija objašnjenja dobijenih rezultata neophodna su dalja ispitivanja lipopeptidnih ekstrakata Bacillus sp. izolata u cilju determinacije aktivnih jedinjenja odgovornih za izrazitu antagonističku aktivnost. Dobijeni rezultati potvrđuju pretpostavku da je za antagonistički potencijal izolata SS-12.6 verovatno odgovoran lipopeptidni ekstrakt. S druge strane, za izolat SS-13.1 potrebna su dalja istraživanja. Iako ovaj izolat poseduje genetički potencijal za sintezu lipopeptida, da li će zaista doći do produkcije zavisi od niza faktora. Naime, ranija istraživanja produkcije lipopeptida u različitim Bacillus sojevima su ukazala da iako svi sojevi mogu imati gene za sintezu surfaktina, iturina A i bacilomicina D, u određenom trenutku samo se 1 ili 2 antibiotika sintetišu u visokim koncentracijama i da aktivnost glavnog antibiotika, pod datim uslovima može varirati od soja do soja (Athukorala et al., 2009). Prema ovim autorima, iako se sojevi izlože istim uslovima, svaki soj može različito da reaguje na ekološke signale tj. signale sredine koji indukuju ekspresiju različitih gena za antibiotike u različitim sojevima. Alternativno, produkcija nekih antibiotika može značajnije da kasni u odnosu na druge. U svetlu svega rečenog, za formulaciju proizvoda na bazi Bacillus sojeva čini se da je poželjnije koristiti čistu aktivnu supstancu, ili bar ekstrakt. Time se eliminiše faktor „neizvesnosti“ u produkciji antimikrobnog jedinjenja kada se koristi puna kultura antagonističkog soja. )Rezultati i diskusija 128 4.6.2. Sinergistički efekat Bacillus sp. izolata SS-12.6 i SS-13.1 i odabranih etarskih ulja na rast fitopatogenih ulja Upotreba Bacillus sp. kao agensa biokontrole ima nekoliko prednosti u odnosu na druge mikroorganizme antagoniste, pre svega otpornost na visoke temperature i sušu (Hou et al., 2006). Istraživanjima u ovom radu utvrđen je antagonistički potencijal više Bacillus sp. izolata sa različitih lokaliteta i mikrostaništa u odnosu na fitopatogene gljive izolovane sa biljnih droga, kao i mogućnost njihove primene u vidu agenasa biokontrole. Pri komercijalnim uslovima nijedan pristup biološke kontrole nije ispoljio dosledan nivo kontrole oboljenja u poređenju sa sintetičkim fungicidima. Sa ekonomske tačke gledišta, da bi biološka kontrola bila prihvaćena neophodno je da se poboljša konzistencija i efikasnost u kontroli postžetvenih oboljenja (El Ghaouth, 1997). U tom smislu, pokazano je da kombinacija komplementarnih bioloških pristupa sa aditivnim i/ili sinergističkim efektom može da obezbedi veću konzistenciju i efikasnost u biokontroli postžetvenih oboljenja. Za ovakvu biološku strategiju bi se očekivalo da ispolji veću stabilnost i efikasnost nego kada se koristi jedan agens biokontrole. Eksperimentalno je pokazano, da kombinacija etarskih ulja i izolata Bacillus sp. može biti vrlo efikasna u kontroli patogenih gljiva na voću. Tako je kombinacijom B. amyloliquefacijens i etarskog ulja limunske trave (Cymbopogon citrates) postignut izostanak fitopatogenih oboljenja na skladištenim breskvama sinergističkim dejstvom ovih bioloških agenasa (Arrebola et al., 2009). U ovom radu, ispitivali smo potencijalni sinergizam između Bacillus sp. izolata SS-12.6 i SS-13.1 i etarskih ulja koja su pokazala izrazit antifungalni potencijal, timijana, čubra i ruže, na vrste roda Fusarium koje su ispoljile neznatno veću otpornost na ove izolate od predstavnika drugih rodova gljiva. Rezultati su prikazani na slikama 54. i 55. 폠ϴ Rezultati i diskusija 129 Slika 54. Sinergistička aktivnost izolata SS-12.6 i etarskih ulja timijana, čubra i ruže. Prikazane su srednje vrednosti procenta inhibicije rasta vrsta roda Fusarium pojedinačnim etarskim uljima i izolatom SS-12.6, njihov sinergistički efekat i standardna devijacija. Iz rezultata prikazanih na slikama 54. i 55. može se uočiti da su izolati SS-12.6 i SS-13.1 uglavnom jače inhibirali rast većine ispitivanih gljiva u prisustvu etarskih ulja timijana, čubra i ruže, nego kada su ispitivani sami kao antagonisti, uz pojedine izuzetke. Kada je u pitanju izolat SS-12.6, bolja sinergistička aktivnost u odnosu na rast Fusarium vrsta utvrđena je za kombinaciju ovog izolata sa etarskim uljima timijana i čubra. Sinergizam je ispoljen na rast svih gljiva osim na F. oxysporum izolovan sa kukuruzne svile gde je kombinacija Bacillus izolata i ulja čubra ispoljila antagonistički efekat, odnosno inhibicija rasta micelije ove gljive je manja nego primenom samog izolata antagoniste. U kombinaciji sa etarskim uljem ruže, izolat SS-12.6 ispoljio je sinergističku aktivnost na rast F. semitectum, F. oxysporum (izolovan sa nevena) i F. tricinctum, dok je antagonizam utvrđen za rast F. equiseti, F. solani i F. oxysporum (sa kukuruze svile). Kombinacija izolata SS-12.6 i etarskog ulja ruže ispoljila je indiferentan efekat na rast F. subglutinans. Na Slici 54. se može se primetiti da su F. semitectum, F. subglutinans i F. equiseti najotpornije na samo etarsko ulje ruže, �ϴ Rezultati i diskusija 130 najosetljivije na sam izolat SS-12.6, a da su na kombinaciju ulja sa bakterijskim antagonistom ispoljile drugačije reakcije, kao što je navedeno. Slika 55. Sinergistička aktivnost izolata SS-13.1 i etarskih ulja timijana, čubra i ruže. Prikazane su srednje vrednosti procenta inhibicije rasta vrsta roda Fusarium pojedinačnim etarskim uljima i izolatom SS-13.6, njihov sinergistički efekat i standardna devijacija. Sinergistički efekat na rast najvećeg broja Fusarium vrsta utvrđen je i ispitivanjem kombinacije izolata SS-13.1 sa sva tri etarska ulja (Slika 55.). Kombinacijom ovog izolata i etarskih ulja procentualno više je inhibaran rast testiranih gljiva u odnosu na slučaj kada su ispitivani pojedinačno. Odstupanje od iznetog utvrđeno je za F. tricinctum na čiji rast je kombinacija bakterijskog izolata i etarskih ulja ruže i timijana ispoljila antagonistički efekat, a sa uljem čubra indiferentan. Antagonizam je zabeležen i prema rastu F. oxysporum (sa kukuruzne svile) kada je izložen kombinaciji izolata SS-13.1 i etarskog ulja ruže. Kombinacija izolata SS-12.6 i SS-13.1 i etarskih ulja čubra i timijana ispoljila je nešto bolji sinergistički efekat na rast vrsta roda Fusarium, nego sa etarskim uljem ruže. Takođe, ove kombinacije ispoljavaju uglavnom bolju antifungalnu aktivnost od etarskih )Rezultati i diskusija 131 ulja i bakterijskih izolata testiranih pojedinačno. Rast F. subglutinans, F. equiseti i F. semitectum, među najotpornijim vrstama gljiva na sva tri etarska ulja, značajno je inhibiran kombinacijom ulja sa bakterijskim antagonistima SS-12.6 i SS-13.1. Ovakva, paralelna, ispitivanja aktivnosti različitih agenasa biokontrole, etarskih ulja i izolata bakterije Bacillus sp., omogućavaju nam otkrivanje adekvatnog agensa, ili njihove kombinacije, za efikasno suzbijanje određene fitopatogene gljive u cilju dobijanja što aktivnijih i efikasnijih agenasa biokontrole sa širokom paletom delovanja. 4.6.3. Potencijalna primena ispitivanih etarskih ulja i izolata Bacillus sp. u kontroli fitopatogenih gljiva sa lekovitog bilja Kako su biljne droge osetljiv materijal, a do sada ne postoji prihvatljiva metoda za njihovu dekontaminaciju, nameće se potreba za iznalaženjem adekvatne formulacije, bazirane na biološkim agensima, koja ne bi uticala na njihove organoleptičke karakteristike, a posebno na aktivne principe tj. na lekovitost. U tom smislu, a na osnovu literaturnih podataka i rezultata dobijenih u ovom radu, može se razmišljati o mogućnosti primene etarskih ulja i izolata Bacillus sp., kao bioloških agenasa, u dva pravca: prevencije kontaminacije lekovitih biljaka u polju i dekontaminacije biljne droge u zatvorenom prostoru. Literaturni podaci ukazuju na efikasnost i primenu kako etarskih ulja, tako i izolata različitih vrsta roda Bacillus u zaštiti povrtarskih biljaka od fitopatogenih gljiva, bilo da se koriste tretmanom zemljišta u kome će biljka rasti, bilo prskanjem listova i korena biljka (Tomlin, 2006; Arrebola et al., 2009; Abdel-Kader et al., 2011). Uglavnom se, kada su u pitanju izolati Bacillus sp., primenjuju suspenzije vegetativnih ćelija i spora pri čemu je mehanizam delovanja zasnovan na kolonizaciji korena biljke bakterijom i kompeticiji sa patogenim organizmima (Tomlin, 2006). Etarska ulja ispitivana u ovom radu su neselektivna tj. sva ulja su ispoljila inhibitorni efekat na rast svih testiranih fitopatogenih gljiva. Razlika je u minimalnoj koncentraciji kojom pojedinačno ulje inhibiralo rast gljiva, a koja je posledica njegovog hemijskog sastava. Među svim uljima ispitivanim u ovom radu, etarska ulja čubra, origana, timijana i ruže su bila najefikasnija pri najmanjoj koncentraciji. Sva četiri etarska ulja su podjednako efikasna u inhibiciji rasta gotovo svih gljiva, odnosno imaju 퓐ϴ Rezultati i diskusija 132 najširi spektar dejstva na fitopatogene gljive testirane u ovom radu, Naime, među ova četiri ulja nema statistički značajne razlike u antifungalnoj aktivnosti na gotovo sve testirane gljive, što znači da bi svako ulje postiglo istu efikasnost u tretmanu bilo koje fitopatogene gljive ispitivane u ovom radu (Prilog 3, Tabela 36). S druge strane, od izolata Bacillus sp., visok antagonizam na sve ispitivane fitopatogene gljive ispoljili su izolati SS-12.6 i SS-13.1, kao i SS-27.7, SS-34.4, SS- 38.3 i SS-40.2. Jedan od pristupa u istraživanjima biokontrole je primena kombinacije etarskih ulja i antagoniste, bilo da su u pitanju gljive ili bakterije. Visoka efikasnost u prevenciji kontaminacijed patogenim gljivama povrtarskih biljaka postignuta je integrisanim tretmanom zemlje kombinacijom gljive antagoniste i odabranih etarskih ulja, kao što su kim, timijan, nana i geranijum (Abdel-Kader et al., 2011). S druge strane, efikasnost u prevenciji kontaminacije voća postignuta je njihovim prskanjem kombinacijom antagoniste B. amyloliquefacijens i etarskog ulja limunske trave pre skladištenja voća (Arrebola et al., 2009). Prema ovim autorima bakterija produkuje iturin A, fengicin i surfaktin, kao i neke isparljive komponente kojima ostvaruje svoju antagonističku aktivnost kao što je inhibicija klijanja konidija i formiranjem biofilma na površini voća. Ovim istraživanjima je ustanovljeno da monoterpeni etarskog ulja doprinose povećanju formiranja biofilma kod Gram pozitivnih bakterija, te je primena kombinacije bakterije antagoniste i etarskog ulja od velike koristi u kontroli razvoja postžetvenih oboljenja na voću uzrokovanih gljivama, tokom skladištenja i transporta voća, posebno u organskoj proizvodnji. Ispitivanja u našem radu su ukazala na to da je kombinacija pojedinačnih Bacillus sp. izolata SS-12.6 i SS-13.1 i etarskih ulja čubra i timijana pokazala nešto bolji sinergistički efekat, nego sa etarskim uljem ruže, na rast vrsta roda Fusarium, F. subglutinans, F. equiseti i F. semitectum, koje su ispoljile veću rezistentnost na najveći broj ispitivanih ulja u odnosu na ostale testirane gljive. Rezultati takođe ukazuju da pomenute kombinacije oba izolata Bacillus sp. i etarskih ulja pokazuju uglavnom bolju antifungalnu aktivnost od etarskih ulja i bakterijskih izolata testiranih pojedinačno. Rast F. subglutinans, F. equiseti i F. semitectum, među najotpornijim testiranim gljivama na sva tri etarska ulja, značajno je inhibiran kombinacijom ulja sa bakterijskim antagonistima SS-12.6 i SS-13.1. )Rezultati i diskusija 133 Ovakva, paralelna, ispitivanja aktivnosti različitih agenasa biokontrole, etarskih ulja i izolata bakterije Bacillus sp., omogućavaju nam otkrivanje adekvatnog agensa, ili njihove kombinacije, za efikasno suzbijanje određene fitopatogene gljive u cilju dobijanja što aktivnijih i efikasnijih agenasa biokontrole. Kombinovani tretman različitim biološkim agensima otežao bi razvoj rezistentnih patogenih sojeva. Noviji pravac u primeni Bacillus sp. kao biofungicida je primena ne samo njegovih ćelija nego i lipopeptidnih esktrakata. Formulisan je preparat sa ćelijama i peptidima Bacillus-a, kao nosiocima ovog preparata, koji sprečavaju početni proces infekcije patogenim gljivama, germinaciju spora i uništavaju germinativne tube (Marone, 2002). S tim na umu, ispitivanjem inhibitorne aktivnosti lipopeptidnih ekstrakata izolata antagonista SS-12.6 i SS-13.1, za koje smo utvrdili visoku antifungalnu aktivnost, zabeležen je visok antifungalni potencijal lipopeptidnog ekstrakta SS-12.6 na gotovo sve testirane gljive. Daljim ispitivanjem utvrđene su niske MIC vrednosti za ovaj lipopeptidni ekstrakt pa se može pretpostaviti da je on verovatno odgovoran za veoma dobru antifungalnu aktivnost Bacillus sp. izolata SS-12.6. To nam daje dobru osnovu za potencijalnu primenu lipopeptidnog ekstrakta izolata SS-12.6 u biokontroli fitopatogih gljiva na uskladištenoj drogi. Za potencijalni tretman uskladištene biljne droge, gde se zahteva niska temperatura i vlažnost, više bi odgovarali lipopoptidni ekstrakti Bacillus sp. od vegetativnih ćelija zbog mogućnosti da bakterija, pod nepovoljnim uslovima pređe u sporogeni oblik, te na taj način ne ispolji antagonističku aktivnost. Lipopeptidni ekstrakti su uputniji za primenu takođe i zbog već poznatog mehanizma dejstva kojim ostvaruju antagonizam prema fitopatogenim gljivama, dok se za bakterijske izolate ne može pouzdano tvrditi kojim će mehanizmom delovati u in vivo uslovima, i koji će se geni za sintezu metabolita sa antimikrobnom aktivnošću, eksprimirati. Primena kulture ćelija Bacillus sp. sa druge, tehnološke, strane je bolji izbor za primenu u polju zbog mogućnosti uključivanja većeg broja mehanizama antagonističkog delovanja što je poželjno zbog većeg broja različitih fitopatogenih gljiva sa kojima dolaze u dodir i kompeticiju. Bakterija antagonist bi obezbedila zaštitu od patogena tokom cele vegetacije, a spore bi im omogućile stabilnost i u periodu skladištenja. Endospore su takođe otpornije na proces sušenja za kreiranje formulacije u )Rezultati i diskusija 134 vidu praha (praška) i veoma se lako proizvode sa modernim industrijskim tehnologijama fermentacije. U smislu biološke kontrole, možda bi se najveća efikasnost postigla primenom Bacillus sp. izolata SS-12.6 kroz tretman zemljišta i korena same biljke u kombinaciji sa folijarnom primenom njegovim lipopeptidnim ekstraktom. Takođe, na osnovu rezultata dobijenih u ovom radu o sinergističkoj aktivnosti izolata SS-12.6 i etarskih ulja čubra, timijana i ruže, mogla bi se očekivati i efikasnost tretmana zemljišta ili same biljke kombinacijom oba biološka agensa. Kada su u pitanju etarska ulja, pomenuta je njihova efikasnost u dekontaminaciji voća fumigacijom kompletnim uljima, kao i njihovim komponentama. Kako su u našem radu etarska ulja timijana, čubra, origana i ruže, ispoljila najbolji inhibitorni potencijal na sve testirane gljive izolovane sa biljnih droga, buduća istraživanja treba usmeriti u pravcu njihove potencijalne primene u biološkoj kontroli fitopatogenih gljiva sa biljnih droga, procesom fumigacije. Za potencijalnu primenu kako etarskih ulja tako i ekstrakta izolata Bacillus sp. potrebna su dalja ispitivanja uticaja ovakvih preparata na organoleptička svojstva i aktivne principe biljnih droga kao i eventualnog toksičnog efekta na korisnike da bi se dodatno procenila mogućnost njihove upotrebe. 嗀Ϥ Zaključci 135 5. ZAKLJUČCI Na osnovu rezultata predstavljenih u ovom radu, mogu se doneti sledeći zaključci: 1. Na odabranim biljnim drogama (nana, kopriva, neven, rastavić i kukuruzna svila) utvrđene su mešovite infekcije gljivama iz različitih rodova, ali većina izolovanih vrsta pripada rodu Fusarium. Ukupno je determinisano 12 vrsta roda Fusarium: F. proliferatum, F. vericillioides (=F. moniliforme), F. taphsinum, F. subglutinans, F. graminearum, F. nygamai, F. oxysporum, F. semitectum, F. solani, F. sporotrichioides, F. tricinctum i F.equiseti. Na svim odabranim biljnim drogama identifikovani su i predstavnici roda Alternaria. Vrste roda Aspergillus su izolovane i identifikovane sa svih droga sem iz uzoraka cveta nevena, a vrste roda Penicillium izolovane su iz svih biljnih droga, sem koprive. Dodatno, identifikovani su i predstavnici rodova: Phoma, Cephalosporium, Nigrospora, Cladosporium, Epicoccum, Gliocladium, Myrothecium, Cercospora, Phomopsis, Verticillum, Dreschlera (=Bipolaris), Rhizoctonia, Septoria, Trichoderma, Curvularia, Stahybotrys, Trichotecium, Puccinia, Botrytis, Mucor i Rhizopus sp., u zavisnosti od biljne droge. 2. U odabrana 22 etarska ulja, ispitivana u ovom radu, hemijskom analizom identifikovani su mono- i seskviterpeni, kao i fenilpropani. Među monoterpenima, prema procentualnom udelu, kao dominantni se izdvajaju: a) fenoli (npr. karvakrol i timol), b) ugljovodonici (limonen, α- i β-pinen, p-cimen, γ-terpinen), c) alkoholi (linalol, geraniol, citrenol, terpinen-4-ol, borenol), d) oksidovani alkoholi (1,8-cineol), e) aldehidi (citronelal, geranial, neral), f) ketoni (kamfor, fenhon, tujon, karvon) i acetati (npr. bornil- i linalil acetat). Od seskviterpena identifikovani su: a) ugljovodonici (npr. E ili (β)-kariofilen, hamazulen, farnesen), b) alkoholi (bisabolol) i c) oksidovani alkoholi (bisabolol oksid). Fenilpropanska jedinjenja koja su identifikovana su cimetaldehid, metilhavikol, eugenol i anetol. 3. U okviru istraživanja antifungalne aktivnosti sva testirana etarska ulja su pokazala antifungalnu aktivnost (i fungistatičnu i fungicidnu) na sve fitopatogene gljive izolovane sa biljnih droga. 4. Antifungalni potencijal testiranih etarskih ulja, u in vitro uslovima, može se predstaviti sledećim nizom idući od najaktivnijih ka manje aktivnim uljima: ulje čubra > 浀Ϥ Zaključci 136 origana > timijana > ruže > anisa > čajnog drveta > zdravca > lavande > korijandera i bergamota > ljubičice > ruzmarina > bibera > cimeta > bosiljka > dalmatinske žalfije > španske žalfije > eukaliptusa > limuna > narandže > kamilice > vetivera. 5. Etarska ulja čubra, origana i timijana, sa fenolima kao dominantnim komponentama, pokazala su najveći antifungalni potencijal na sve testirane fitopatogene gljive u in vitro testu, pri čemu je etarsko ulje čubra nešto efikasnije od ulja origana i timijana. Etarska ulja vetivera i kamilice, sa seskviterpenima kao dominantnim komponentama, su pokazala najslabiju antifunganu aktivnost, kao i etarska ulja eukaliptusa, limuna i narandže, u kojima preovladavaju monoterpenski ugljovodonici. 6. Statističkom analizom dobijenih rezultata uočava se da su pojedina ulja delovala ujednačeno na sve testirane gljive. Izdvaja se grupa od 4 etarska ulja, čubra, origana, timijana i ruže, između kojih nema statistički značajne razlike u antifungalnoj aktivnosti na gotovo sve testirane fitopatogene gljive. 7. Rezultati statističke analize delovanja svih etarskih ulja na pojedinačne gljive ukazuju na to da su među vrstama roda Fusarium, F. subglutinans, F. semitectum i F. sporotrichioides, generalno najotpornije gljive na većinu analiziranih etarskih ulja, a od predstavnika drugih rodova to su Trichoderma viride, Alternaria alternata, Aspergillus flavus i Chaetomium sp. Najosetljivije gljive na većinu etarskih ulja su F. oxysporum izolovan sa kukuruzne svile, kao i Myrotechium verrucaria i Trichotechium roseum. 8. Prema rezultatima ispitivanja sinergističke aktivnosti odabranih ulja može se reći da su kombinacije etarskih ulja timijana i origana ispoljila bolju antifungalnu aktivnost nego kada su ispitivana pojedinačno. Sinergistička aktivost zabeležena je i za kombinaciju etarskog ulja ruže i lavande, prema vrstama roda Fusarium koje su pokazale najveću rezistentnost na oba ulja kada su ispitivana pojedinačno. Kombinacija etarskih ulja origana i lavande ispoljila je sinergističku aktivnost samo u odnosu na dve Fusarium vrste. 9. U in situ ispitivanjima, najveću efikasnost u redukciji ukupnog broja gljiva u uzorcima biljne droge, ispoljila su ulja timijana, origana i ruže. Manju inhibitornu aktivnost ispoljila su etarska ulja čubra, korijandera, zdravca i lavande. 10. In vitro ispitivanja antagonističkog potencijala 14 različitih izolata Bacillus sp. su pokazala da testirani izolati ispoljavaju različit stepen inhibicije prema različitim vrstama fitopatogenih gljiva. Najbolji antagonizam prema odabranim fitopatogenim )Zaključci 137 gljivama ispoljili su izolati SS-12.6, SS-13-1, kao i SS-27.7, SS-38.3, SS-38.4 i SS- 40.2. Izolati SS-39.1 i SS-39.3 su ispoljili najslabiju inhibitornu aktivnost na gotovo sve testirane fitopatogene gljive. Slabiji antagonizam u odnosu na većinu gljiva ispoljili su i Bacillus sp. izolati SS-10.7 i SS-21.7. Ostali izolati (SS-6.2, SS- SS-35.4, SS-38.2, SS- 40.6) ispoljili su različite antifungalne potencijale u zavisnosti od testirane gljive. 11. Uporednom analizom dobijenih rezultata uočava se da su Fusarium vrste nešto otpornije na Bacillus sp. izolate od vrsta drugih rodova gljiva. F. subglutinans je najosetljivija na antagonistički najaktivije izolate SS-12.6, SS-13.1, SS-27.7 i SS-6.2. To je upravo suprotno od rezultata dobijenih ispitivanjem etarskih ulja, gde je ova gljiva ispoljila najveću toleratnost na najveći broj testiranih ulja. S druge strane, najmanju osetljivost na većinu Bacillus sp. izolata ispoljila je F. solani. Od vrsta ostalih rodova najveća osetljivost na većinu ispitanih Bacillus sp. izolata utvrđena je za Penicillium sp. i A. alternata, a najmanja za A. niger. 12. Lipopeptidni ekstrakt Bacillus sp. SS-12.6 je veoma efikasan u inhibiciji rasta većine testiranih gljiva. Izuzetak su bile F. tricinctum, A. flavus i G. roseum. Lipopeptidni ekstrakt izolata SS-13.1 nije ispoljio značajniji antagonizam na većinu testiranih gljiva, izuzev Penicillium sp. 13. Rezultati ispitivanja MIC vrednosti lipopeptidna ekstrakta oba izolata (SS-12.6 i SS- 13.1), bila su u korelaciji sa dobjenim vrednostima inhibicije rasta micelije, pa se može pretpostaviti da je za aktivnost Bacillus sp. izolata odgovoran njegov lipopeptidni ekstrakt, a za izolat 13.1 neki drugi metabolit ili neki drugi mehanizam antagonizma. 14. Ispitivanjem potencijalnog sinergizma između Bacillus sp. izolata SS-12.6 i SS-13.1 i etarskih ulja timijana, čubra i ruže, na vrste roda Fusarium utvrđeno je da su izolati SS-12.6 i SS-13.1 uglavnom jače inhibirali rast većine ispitivanih gljiva u prisustvu ovih etarskih ulja, nego kada su ispitivani sami kao antagonisti, uz pojedine izuzetke. 15. Etarska ulja čubra, origana, timijana i ruže, kao i izolat Bacillus sp. SS-12.6 i njegov lipopeptidni ekstrakt, predstavljaju dobru osnovu za potencijalnu formulaciju preparata sa efikasnošću u kontroli fitopatogenih gljiva bilo prevencijom kontaminacije u polju, ili dekontaminacijom u zatvorenom prostoru. Potrebna su dalja ispitivanja uticaja ovakvih preparata na organoleptička svojstva i aktivne principe biljnih droga da bi se dodatno procenila mogućnost njihove upotrebe. 嚰Ϥ Literatura 138 6. LITERATURA Abbas H. (2005) Aflatoxin and Food Safety. CRC Press. Abbas H., Weaver M., Horn B., Carbone I., Monacell J., Shier T. (2011) Selection of Aspergillus flavus isolates for biological control of aflatoxins in corn. Toxin Reviews, 30 (2–3), 59–70. Abid-Esefi S., Ouanes Z., Hassen W., Baudrimont I., Creppy E., Bacha H. (2004) Cytotoxicity inhibition of DNA and protein synthese and oxidative damage in cultured cells exposed to zearalenone. Toxicol. Vitro, 18, 467-474. Abbo A., Idris M., Elb M. (2009) The Response of Tea Tree Oil as a Biofungicide Against Early Blight Disease in Tomato Crop (Solanum lycopersicum) in Sudan. Conference on International Research on Food Security. Natural Resource Management and Rural Development, 1-9. Abdel-Kader M., El-Mougy N., Lashin S. (2011) Essential oils and Trichoderma harzianum as an integrated control measure against faba bean root pathogens. Journal of Plant Protection Research, 51 (3), 306-313. Abou-Arab A., Soliman Kawther M., Tantawy M., Badea I., Khayria N. (1999) Quantity estimation of some contaminants in commonly used medicinal plants in the Egyptian market. Food Chemistry, 67, 357-363. Abou Donia M. (2008) Microbiological Quality and Aflatoxinogenesis of Egyptian Spices and Medicinal Plants. Global Veterinaria, 2 (4), 175-181. Abo-El-Seoud M., El-Tobgy K. (2010) Production of environmentally safe biocides from essential oils having antimicrobial activity. Archives of Phytopathology and Plant Protection, 43 (4) 324–331. Adekoge O., Iwahashi H., Obuhi K., Iwahashi Y. (2000) Inhibition of food spoilage yeasts and aflatoxigenic moulds by monoterpenes of the spice. Aframomum danieli. Flav. Fragr. J.,15, 147-150. Aguilar F., Hussain S., Cerutti P. (1993) Aflatoxin B1 induces the transversion of G-T in codon 249 of the p53 tumor suppressor gene in human hepatocytes. PNAS 90 (18), 8586–90. 溠Ϥ Literatura 139 Ainsworth C., Sparow K., Sussman A. (1973) The Fungi, Taxononomic Review with Keys: Ascomycetes and Fungi Imperfecti. Academic Press, New York and London. Akila R., Rajendran L., Harish S., Saveetha K., Raguchander T., Samiyappan R. (2011) Combined application of botanical formulations and biocontrol agents for the management of Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) causing Fusarium wilt in banana. Biological Control, 57 (3),175-183. Alli N., Sardjono A., Yamashita T., Yoshizawa T. (1998) Natural co-occurence of aflatoxins and Fusarium mycotxins (fumonisin, deoxynivalenol, nivalenol and zearalenol) in corn from Indonesia. Food Adit. Contam., 15, 377-384. Alwathnani H., Perveen K. (2012) Biological control of fusarium wilt of tomato by antagonist fungi and cyanobacteria. African Journal of Biotechnology, 11(5), 1100- 1105. Amiel E., Ofir R., Dudai N., Soloway E., Rabinsky T., Rachmilevitch S. (2012) β-Caryophyllene, a Compound Isolated from the Biblical Balm of Gilead (Commiphora gileadensis), Is a Selective Apoptosis Inducer for Tumor Cell Lines. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, (12), 1-8. Amini M., Safaie N., Salmani M., Shams-Bakhsh M. (2012) Antifungal activity of three medicinal plant essential oils against some phytopathogenic fungi. Trakia Journal of Sciences, 10 (1), 1-8. Arrebola E., Cazorla M., Romero D., Pérez-García A., de Vicente A (2007) A nonribosomal peptide synthetase gene (mgA) of Pseudomonas syringa pv. syringa is involved in mangotoxin biosynthesis and is required for full virulence. Mol Plant- Microbe Interact., 20, 500-509. Arrebola E., Sivakumar D., Bacigalupo R., Korsten L. (2010) Combined application of antagonist Bacillus amyloliquefaciens and essential oils for the control of peach postharvest diseases. Crop protection, 29 (4), 369-377. Arslan M., Dervis S. (2010) Antifungal activity of essential oils against three vegetative-compatability groups of Verticillium dahliae. World J.Microb. Biotechnol., 26, 1813-1821. ) Literatura 140 Atanda O., Akpan, I., Oluwafemi F. (2006) The potential of some essential oils in the control of A. parasiticus CFR 223 and aflatoxin production. Food Control, 18, 601-607. Athucorala S., Fernando D., Rashid K. (2009) Indetification of antifungal antibiotics of Bacillus species isolated from different microhabitatas using polymerase chain reaction and MALDI-TOF mass spectrometry. Can. J. Microbiol., 55, 1021-1032. Azaz D., Demirci F., Satl F., Kürkcüoglu M., Hüsnü Can Baser K. (2002) Antimicrobial Activity of Some Satureja Essential Oils. Verlag der Zeitschrift für Naturforschung. 57, 817-821. Aziz H., Youssef A., Moheye Z., Lofty M. (1998) Contamination of some medicinal plant samples and spices by fungi and their mycotoxins. Bot. Bull Acad. Sin. 39, 279-285. Bajpai V., Kang S. (2012) In Vitro and In Vivo Inhibition of Plant Pathogenic Fungi by Essential Oil and Extracts of Magnolia liliflora Desr. J. Agr. Sci. Tech., 14, 845-856. Bakkali F., Averbeck S., Averbeck D., Idaomar M. (2008) Biological effects of essential oils – A review. Food Chem. Toxicol., 46, 446–475. Bang H., Lee D., Park H., Rhee Y. (2000) Inhibition of fungal cell wall synthesizing enzymes by transcinnamaldehyde. Biosci. Biotech. Biochem., 64, 1061– 1063. Baričević D., Bertol T., (2000) The biological/pharmacological activity of Salvia genus. Pharmacology, 143-184. Bartynska M., Budzikur-Ramza E. (2001) Action of some essential oils on fungi. Bulletin of the Polish Academy of Sciences, Biological Sciences, 49 (4), 327-331. Basilico Z., Basilico C. (1999) Inhibitory effects of some spices essential oils on Aspergillus ochraceus NRRL 3174 growth and ochratoxin A production. Lett Appl. Microbiol., 29, 238-241. Berić T., Kojić M., Stanković S., Topisirović Lj., Degrassi G., Myers M., Venturi V., Fira Đ (2012) Antimicrobial activity of Bacillus sp. natural isolates and their potential use in the biocontrol of phytopathogenic baceria. Food Technol. Biotechnol., 50 (1), 25-31. 垠Ϥ Literatura 141 Bernotienė G., Nivinskienė O., Butkienė R., Mockutė D. (2007) Essential oil composition variability in sage (Salvia officinalis L.). Chemia, 18, (4) 38–43. Berry M (1995) Herbal products. Part 6. Chamomiles. Pharmaceutical Journal, 254, 191-193. Bittner M., Aguilera M., Hernández V., Arbert V., Becerra J., Casanueva M. (2009) Fungistatic activity of essential oils extracted from Peumus boldus Mol., Laureliopsis philippiana (Looser) Schodde and Laurelia sempervirens (Ruiz & Pav.) Tul. Chilean Journal of Agricultural Research, 69 (1), 30-37. Booth C. (1971a) The genus Fusarium, Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 1-237. Booth C. (1971b) Fungal Culture Media. In: (Eds. J. R. Norris and D. W. Ribbons), Methods in Microbiology, IV, 49 - 94. Academic Press, London and New York. Brar S., Kaur S., Dhillon G., Verma M. (2012) Biopesticides - Road to Agricultural Recovery. Journal of Biofertilizers and Biopesticides, 3 (3), 1-2. Brien C., Crandal P., Chalova V., Riscke S. (2008) Orange essential oils antimicrobial activities against Salmonella spp. Journal of Food Science, 73 (6), 264- 267. Brown U. (1987) A monograph of the Erysiphales (powdery mildews). J. Cramer Berlin- Stuttgart, 1-250. Bruch, C. W. 1972. Objectable micro-organisms in nonsterile drugs and cosmetic. Drug Cosmet. Ind., 111(4), 567-574. Bryden W., Logrieco A., Abbas H., Porter J., Vesonder R., Richard J., Cole R. (2001) Other significant Fusarium mycotoxins, In: Summerell A., LeslieF., Backhouse D., Bryden L., Burgess W. (Eds.), Fusarium: Paul E. Nelson Memorial Symposium. APS Press, St. Paul, MN, 360–392. Buchenauer H. (2005) Principles in biological control of soil-borne diseases: Colonization, antagonism, plant growth promotion and induced resistance. Proceedings of the 1st International Symposium on Biological Control of Bacterial Plant Diseases, Germany, 20-29. Bugno A., Almodovar A., Pereira T., Pinto T., Sabino M. (2006) Occurance of toxigenic fungi in herbal drugs. Brazilian Journal of Microbiology, 37, 47-51. 瀐Ϥ Literatura 142 Burgess W., Summerell A., Bullock S., Gott K., Backhouse D. (1994) Laboratory Manual for Fusarium Research. Fusarium Research Laboratory, Department of Crop Sciences, University of Sydney and Royal Botanic Gardens, Sydney, 133. Burgieł J., Smagłowski M. (2008) Fungistatic properties of tea tree oil. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln., 529, 13-18. Calixto B. (2000) Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for medicines (phytotherapeutic agents). Braz. J. Med. Biol., 33, 179-189. Canafoglia M., Comerio R., Fernández Pinto V. (2007) Putative mycotoxin- producing fungi isolated from alpataco (Prosopis flexuosa) fruits. Rev. Iberoam. Micol., 24(1), 56–8. Carmo E., de Oliveira Lima E., de Souza E. (2008a) The potential of Origanum vulgare L. (Lamiaceae) essential oil in inhibiting the growth of some food-related Aspergillus species. Brazilian Journal of Microbiology, 39, 362-367. Carmo E., Lima E., de Souza E., de Sousa F. (2008b) Effect of Cinnamomum zeylanicum blume essential oil on the growth and morphogenesis of some potentially pathogenic Aspergillus species. Brazilian Journal of Microbiology, 39, 91-97. Carrillo C., Teruel A., Aranda J., Ortiz A. (2003) Molecular mechanism of membrane permeabilization by the peptide antibiotic surfactin. Biochim. Biophys. Acta. 1611, 91- 97. Carson C., Hammer K., Riley T. (2006) Melaleuca alternifolia (Tea Tree) Oil: a Review of Antimicrobial and Other Medicinal Properties. Clinical Microbiology Reviews, 19 (1), 50-62. Cavanagh H., Wilkinson J. (2002) Biological activities of Lavender essential oil. Phytotherapy Research, 16 (4), 301–308. Cawoy H., Bettiol W., Fickers P., Ongena M. (2011) Bacillus-Based Biological Control of Plant Diseases, Pesticides in the Modern World – Pesticides Use and Management, Agricultural and Biological Sciences, 273-302. Chamorro E., Zambón S., Morales W., Sequeira A., Velasco G. (2012) Study of the Chemical Composition of Essential Oils by Gas Chromatography. In: Gas Chromatography in Plant Science, Wine Technology, Toxicology and Some Specific Applications, Edited by Bekir Salih and Ömür Çelikbıçak. )Literatura 143 Chang H., Cheng Y., Wu C., Chang S., Chang T., Su Y. (2008) Antifungal activity of essential oil and its constituents from Calosedrus macrolepis var. Formosana Florin leaf against plant pathogenic fungi. Bioresourse tehnology, 99, 6266-6270. Cheng S., Liu J., Chang E., Chang S. (2008) Antifungal activity of cinnamaldehyde and eugenol congeners against wood-rot fungi. Bioresource Technology, 99, 5145–5149. Chiou A., Wu W. (2001) Isolation, Identification and Evaluation of Bacterial Antagonists against Botrytis elliptica on Lily. Journal of Phytopathology, 149 (6), 319– 324. Clausen C., Woodward B., Yang V. (2010) Antifungal essential oil metabolites. The 41st Annual meeting of Internacional Research Group on Wood protection, France. Combrinck S., Regnier T., Kamatou G. (2011) In vitro activity of eighteen essential oils and some major components against common postharves fungal pathogens of fruit. Industrial Crops and Products, 33, 344-349. Cox D., Mann M., Markham L. (2001) Interactions between components of the essential oil of Melaleuca alternifolia. Journal of Applied Microbiology, 91, 492–497. Cox D., Mann M., Markham L., Bell C., Gustafson E., Warmington R., Wyllie G. (2000) The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). Journal of Applied Microbiology, 88, 170–175. Custódio A., Ribeiro V., Silva G., Machado M., Sousa C. (2011) The essential oils component p-cymene induces proton leak through Fo-ATP synthase and uncoupling of mitochondrial respiration. Journal of Experimental Pharmacology, 3, 69 – 76. Ćirić A., Soković M., Glamočlija J., Jošić D. (2011) Antifungal activity of indigenous Pseudomonas isolates from rhizospheric soils. Proceedings of 7th Balkan congres of Microbiology (8th Conress of Serbian microbiologists), Belgrade, Serbia. da Silva L., Araújo M., dos Santos K., Nunes A. (2011) Evaluation of the synergistic potential of vancomycin combined with other antimicrobial agents against methicillin-resistant Staphylococcus aureus and coagulase-negative Staphylococcus spp. strains. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 106 (1), 44-50. Daouk R., Dagher H., Sattout J. (1995) Antifungal activity of the essential oil of Origanum syriacum L. J. Food Protect., 58, 1147-1149. 墐Ϥ Literatura 144 Davidson M. (2001) Chemical presrvatives and naturally antimicrobial compounds. In Food Microbilogy. Fundamentals and frontiers. 2ndEd. (Beuchat M., Montville L., eds. 593-628. ASM Press, Washington DC. Deabes M., El-Soud A., El-Kassem A. (2011) In vitro Inhibition of Growth and Aflatoxin B1 Production of Aspergillus flavus Strain (ATCC 16872) by Various Medicinal Plant Essential Oils. Maced J Med Sci., 1-6. Deans S. (2002) Chapter 13. Antimicrobial activity of eucalyptus oil. In Book: Eucalyptus, The Genus Eucalyptus. Edited by John J.W.Coppen. Deba F., Xuan T., Yasuda M., Tawata S. (2008) Chemical composition and antioxidant, antibacterial and antifungal activities of the essential oils from Bidens pilosa Linn. var. Radiata. Food Control 19, 346–352. Didry N., Dubreuil L., Pinkas M. (1993) Antimicrobial activity of thymol, carvacrol and cinnamaldehyde alone or in combination. Pharmazie, 48, 301–304. Dikbas N., Kotan R., Dadasoglu F., Sahin F. (2008) Control of Aspergillus flavus with essential oil and methanol extract of Satureja hortensis. International Journal of Food Microbiology, 124, 179-182. Dorman D., Deans G. (2000) Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied microbiology, 88, 308-316. Droby S. (2006) Improving quality and safety of fresh fruit and vegetables afterharvest by the use of biocontrol agents and natural materials. Acta Horticulturae, 709, 45–51. Dubey N., Kumar A., Singh P., Shukla R. (2008) Microbial contamination of raw materials: A major reason for the decline of India’s share in the global herbal market. Current Science, 95 (6), 717-8. Dweck A. (1994) Natural preservatives. Society of cosmetic scientists symposium: Chepstow active ingredients, 1-47. Džamić A., Soković M., Ristić M., Grujuć-Jovanović S. Vukojević J., Marin P. (2008) Chemical composition and antifungal activity of Salvia sclarea (Lamiaceae) essential oil. Arch.Biol.Sci., 60 (2), 233-237. El-Gnauth A. (1997) Biologically-based alternatives to synthetic fungicides for the control of postharvest diseases. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnlogy, 19, 160-162. 煰Ϥ Literatura 145 Ellis B., Ellis J. (1997) Microfungi on Land Plants. An Identification Handbook. The Richmond Publishing Co. Ltd. El-Mougy N., El-Gamal N., Abdel-Kader M. (2009) Pre-storage application of some essential oils and food preservatives against black mould incidence of garlic cloves during storage. Archives of Phytopathology and Plant Protection, 42 (11), 1059– 1068. El-Seoud M., El-Tobgy K. (2010) Production of environmentally safe biocides from essential oils having antimicrobial activity. Archives Of Phytopathology And Plant Protection, 43 (4), 324-331. Essono G, Ayodele M, Akoa A, Foko J, Olembo S, Gockwski J. (2007) Aspergillus species on cassava chips in storage in rural areas of southern. Cameroon: their relationship with storage duration, moisture content and processing methods. African Journal of Microbiology, 001-008. Etchegaray A., Bueno C., de Melo I., Tsai S., Fiore M., Silva-Stenico M., de Moraes L., Teschke O. (2008) Effect of a highly concentrated lipopeptide extract of Bacillus subtilis on fungal and bacterial cells. Archives of Microbiology, 190 (6), 611- 622. Faixova Z., Faix S. (2008) Biological effect of Rosemary essential oil. Folia Veterinaria, 52 (3-4), 135-139. Fernando W., Nakkeeran S., Zhang Y., Savchuk S. (2007) Biological control of Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary by Pseudomonas and Bacillus species on canola petals. Crop Protection, 26 (2), 100–107. Finking R., Marahiel A. (2004) Biosynthesis of nonribosomal peptides. Annu. Rev. Microbiol. 58, 453–488. Fokkema J. (1978) Fungal antagonism in the phylosphere. Annals of Applied Biology, 89 (1), 115. Gardener B., Fravel D. (2002) Biological Control of Plant Pathogens: Research, Commercialization, and Application in the USA. Plant Health Progress, 510-60. Gautam A., Bhadauria R. (2009) Fungal Contamination Of few Common Stored herbal Fruit Samples. The Internet Journal of Nutrition and Wellness, 8 (1), DOI: 10.5580/638. )Literatura 146 Gennaro R. (1990) Remington Pharmaceutical Sciences, 18th Ed 1237, Easton, Mark Publishing Co. In: Final Report on the Safety Assessment of Triacetin. International Journal of Toxicology (2003), 22 (2), 1-10. Gerlach W., Nirenberg H. (1982) The genus Fusarium - a pictorial atlas. Mitteilungen aus der Biologischen Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft, Berlin- Dahlem, 209. Grahovac M., Inđić D., Lazić S., Vuković S. (2009) Biofungicidi i mogućnosti primene u savremenoj poljoprivredi. Pestic. Phytomed., 24(4), 245-258. Gravel V., Martinez C., Antoun H., Tweddell R. (2005) Antagonist Microorganisms with the Ability to Control Pythium Damping-off of Tomato Seeds in Rockwool. BioControl, 50 (5), 771-786. Griffin S., Wyllie S., Markham J., Leach N. (1999) The role of structure and molecular properties of terpenoids in determining their antimicrobial activity. Flavour Fragr. J.,14, 322-332. Grigorian K., Badalyan G., Sargsyan M., Harutyunian A., Pogosyan N. (2011) Mycobiota of some medicinal plants and their toxigenic potential. Acta fytotechica et zootechica, Special Number, 14-18. Handelsman J., Stabb E. (1996) Biocontrol of Soilborne Plant Pathogens. The Plant Cell, 8, 1855-1869. Hadizadeh I., Peivastegan B., Hamzehzarghani H. (2009) Antifungal Activity of Essential Oils from Some Medicinal Plants of Iran against Alternaria alternata. American Journal of Applied Sciences, 6 (5), 744-748. Hammer K., Carson C., Riley T. (1999) Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. Journal of Applied Microbiology, 86, 985-990. Hammer K., Carson C., Riley T. (2003) Antifungal activity of the components of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil. Journal of Applied Microbiology, 95(4), 853- 860. Hanel H., Raether W. (1988) A more sophisticated method of determining the fungicidal effect of water-insoluble preparations with a cell harvester, using miconazole as an example. Mycoses, 31, 148-154. 妀Ϥ Literatura 147 Hashem M., Alamri S. (2010) Contamination of common spices in Saudi Arabia markets with potential mycotoxin-producing fungi. Saudi Journal of Biological Sciences, 17, 167–175. Hitokoto H., Morozumi S., Wauke T., Saka S., Kurata H. (1978) Fungal contamination and mycotoxin detection of powdered herbal drugs. Applied and Environmental Microbiology, 36, 252-256. Hou X., Boyetchko M., Brkic M., Olson D., Ross A., Hegedus D. (2006) Characterization of the anti-fungal activity of a Bacillus spp. associated with sclerotia from Sclerotinia sclerotiorum. Appl. Microbiol. Biotechnol., 72, 644-653. anti-fungal Huang Y., Jianglin Z., Ligang Z., Jihua W., Youwen G., Xujun C., Zejian G., Qi W., Weibo J. (2010) Antifungal Activity of the Essential Oil of Illicium verum Fruit and Its Main Component trans-Anethole. Molecules, 15, 7558-7569. IARC (1993) Some naturally occurring substances: Food items and constituents, heterocyclic aromatic amines and mycotoxins. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. 56 International Agency for Research on Cancer, 489– 521. Imelouane B., Amhamdi H., Wathelet P., Ankit M., Khedid K., El Bachiri A. (2009) Chemical composition of the essential oil of thyme (Thymus vulgaris) from Eastern Morocco. Int. J. Agric. Biol., 11, 205–208. Inouye S., Tsuruoka T., Uchida K., Yamaguchi H. (2001) Effect of sealing and Tween 80 on the antifungal susceptibility testing of essential oils. Microbiology and Immunology, 45, 201–208. Ipek E., Zeytinoglu H., Okay S., Tuylu B., Kurkcuoglu M., Baser C. (2005) Genotoxicity and antigenotoxicity of Origanum oil and carvacrol evaluated by Ames Salmonella/microsomal test, Food Chem. 93 , 551––556. Isman B., Machial M. (2006) Pesticides based on plant essential oils: from traditional practice to commercialization. In M. Rai and M.C. Carpinella (eds.), Naturally Occurring Bioactive Compounds. Elsevier, BV, 29–44. Jack W., Tagg R., Ray B. (1995) Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria. Microbiol. Rev. 59, 171-200. Jacqueline C., Navas D., Batard E., Miegeville F., le Mabecque D., Kergueris F., Bugnon D., Potel G., Caillon J. (2005) In vitro and in vivo synergistic activities of 狠Ϥ Literatura 148 linezolid combined with subinhibitory concentrations of imipenem against methicillin- resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother, 49, 45-51. Janardhanan D. (2002) Diseases of major medicenal plants. Book. Daya Publishing House. Jančić R., Stošic D., Mimica-Dukic N., Lakušic B. (1995) Aromatic Plants in Serbia, Decije Novine, Gornji Milanovac. Jay J., Loessner M., Golden D., in: D.R. Heldman (Ed.) (2005), Modern Food Microbiology, Springer Science-Business Media, Inc., New York, 61-210. Jian-Yu S., Zhu L., Tian Y. (2012) Chemical composition and antimicrobial activities of essential oil of Matricaria songarica. International Journal of Agriculture & Biology, 14, 107-110. Jham G., Dhingra O., Jardim C., Valente V. (2005) Identification of major fungitoxic component of Cinnamon bark oil. Fitopat. bras., 30 (4), 404-408. Jošić D., Pivić R., Pavlović S., Stojanović S., Aleksić G., Starović M (2011) Antifungal activity of indigenous Bacillus sp. isolate Q3 against marshmallow mycobiota. Proc. Nat. Sci, Matica Srpska Novi Sad, 120, 109 - 118. Kalemba D., Kunicka A. (2003) Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Current Medicinal Chemistry, 10, 813-829. Kamei K., Watanabe A. (2005) Aspergillus mycotoxins and their effect on the host. Med. Mycol., 43, 95-99. Karatzas K., Bennit J., Smid J., Kets W. (2000) Combined action of S-carvone and mild heat treatment on Listeria monocytogenes Scott A. Journal of Applied Bacteriology, 89, 296-301. Khan S., Riaz T., Hannan A., Mukhtar I. (2006) Fungal contamination of medicinal herbs during commercial storage in Punjab. Mycopath., 4 (1), 21-25. Khan A., Ahmad A., Akhtar F., Yousuf S., Xess I., Khan A., Manzoor N. (2010) Ocimum sanctum essential oil and its active principles exert their antifungal activity by disrupting ergosterol biosynthesis and membrane integrity. Res. Microbiol. 161(10), 816-23. Kleinkauf H., von Dohren H. (1990) Nonribosomal biosynthesis of peptide antibiotics. Eur. J. Biochem. 192, 1-15. )Literatura 149 Klich A., Arthur S., Lax R., Blang M. (1994) Iturin A: a potential new fungicide for soared grains. Mycopathologia, 127, 123-127. Klokočar-Šmit Z., Šovljanski R., Inđić D. (2006) Biopreparati – alternativa u zaštiti plodovitog povrća. Biljni lekar, 34 (1), 19-30. Kohzaki K., Gomi K., Yamasaki-Kokudo Y., Ozawa R., Takabayashi J., Akimitsu K. (2009) Characterization of a sabinene synthase gene from rough lemon (Citrus jambhiri). Japan. Journal of Plant Physiology, 166 (15), 1700-1704. Konishi K., Iida A., Kaneko M., Tomioka K., Tokuda H., Nishino H., Kumeda Y. (2003) Cancer preventive potential of trichothecenes from Trichotechium roseum. Bioorganic and medicinal chemistry, 11, 2511-2518. Koul O., Walia S., Dhaliwal G. (2008) Essential Oils as Green Pesticides: Potential and Constraints. Biopestic. Int., 4 (1), 63–84. Kneifel W., Czech E., Kopp B. (2002) Microbial contamination of medicinal plants, a review. Planta Med., 68(1), 5-15. Kracht M., Rokos H., Ozel M., Kowall M., Pauli G., Vater J. (1999) Antiviral and hemolytic activities of surfactin isoforms produced by Bacillus subtilis OKB 105. J. Colloid Interface Sci., 204, 1-8. Krauze-Baranowska M., Mardarowicz M., Wiwart M., Pobłocka L., Dynowska M. (2002) Antifungal activity of the essential oils from some species of the genus Pinus. Z Naturforsch, 57(5–6), 478–82. Kungulovski D., Avramovski O., Atanasova P., Kungulovski I. (2011) Mycotoxigenic molds in spices from Macedonian stores. Proc. Nat. Sci, Matica Srpska Novi Sad. 120, 81-91. Lalko J., Lapczynski A., McGinty D., Bhatia S., Letizia S., Api M. (2007) Fragrance material review on β-ionone. Food and Chemical Toxicology, 45 (1), 241– 247. Lee H., Cheng S., Chang S. (2005) Antifungal property of the essential oils and their constituents from Cinnamomum osmophloeum leaf against tree pathogenic fungi. Journal of the Science of Food and Agriculture, 85, 2047–2053. Lee S., Choi G., Jang K., Lim H., Cho K., Kim J. (2007) Antifungal activity of five plant essential oils as fumigant against postharvest and soilborne plant pathogenic fungi. Plant Pathol. J., 23 (2) 97-102. 婰Ϥ Literatura 150 Lee Y., Kim J., Shin S., Lee S., Park I. (2008) Antifungal activity of Myrtaceae essential oils and their components against three phytopathogenic fungi. Flavour and Fragnance Journal, 23, 23-28. Lević J. (2008) Vrste roda Fusarium u oblasti poljoprivrede, veterinarske i humane medicine. Institut za kukuruz „Zemun Polje“, Beograd-Zemun. Lević J., Stojkov S. (2002) Stvaranje fuzariotoksina u uslovima proizvodnje i čuvanja kukuruza. Agroinovacije. 3, 153-161. Li Q., Ning P., Zheng L., Huang J., Li G., Hsiang T. (2010) Fumigant activity of volatiles of Streptomyces globisporus JK-1 against Penicillium italicum on Citrus microcarpa. Postharvest Biology and Technology, 58, 157-165. Liu T., Chu L., Zhou T. (2002) Thymol and acetic acid vapors reduce post- harvest brown rot of appricot and plums. Hort. Sci., 37, 151-156. Lis-Balchin M., Deans S., Eaglesham S. (1998) Relationship between bioactivity and chemical composition of commercial essential oils. Flavour Frag. J., 13, 98-104. Lodama K. (2010) Fumonisin production by and biological control of Fusarium species associated with cowpea seed. Magister Scientia: Plant Science. Faculty of Natural and Agricultural Sciences, University of Pretoria. Luongo L. Santori A., Riccioni L., Belisario A. (2011) Phomopsis sp. associated with post-harvest fruit rot of kiwifruit in Italy. Journal of Plant Pathology, 93 (1), 205-209. Maget-Dana R., Peypoux F. (1994) Iturins, a special class of pore-forming lipopeptides: biological and physicochemical properties. Toxicology, 87 (1–3), 151– 174. Maget-Dana R., Ptak M. (1995) Interactions of surfactin with membrane models. Biophysical Journal, 68, 1937-1943. Maget-Dana R., Thimon L., Peypoux F., Ptack M. (1992) Surfactin/Iturin A interactions may explain the synergistic effect of surfactin on the biological properties of iturin A. Biochimie, 74, 1047–1051. Mahboubi M., Kazempour N. (2011) Chemical composition and antimicrobial activity of Satureja hortensis and Trachyspermum copticum essential oils. Irania Journal of Mycrobiology, 3 (4), 194-200. 瑀Ϥ Literatura 151 Maksimović M., Vidić D., Miloš M., Šolić M., Abadžić S., Siljak-Yakovlev S. (2007) Effect of the environmental conditions on essential oil profile in two Dinaric Salvia species: S. brachyodon Vandas and S. officinalis L. Biochemical Systematics and Ecology, 35, 473-478. Mandeel A. (2005) Fungal contamination of some imported spices. Mycopathologia, 159, 291-298. Marasas W. (2001) Discovery and occurence of the fumonisins: A historical perspective. Environ. Health Perspect., 109, 239-243. Maria-Rose A., Elnatan B., Maria-Usileide D., Nadja A., Telma-Leda L., Edilberto R. (2004) Composition and antimicrobial activity of theessential oil from aerial parts of Baccharis trinervis Lam, Pers. Arkivoc, 6, 59-65. Marrone P. (2002) An effective biofungicide with novel modes of action. The Royal Society of Chemistry, 193-134. Mateescu R., Cornea C., Grebenisan I., Sirean O. (2005) Improvement by mutagenesis and electroporation of antifungal properties of different Bacillus spp. strains. Romania Journal of Genetics, 1 (1), 39-51. Matricaria recutita, Monograph (2008) Alternative Medicine Rewiev, 13(1), 58- 62. Mercier B., Prost J., Prost M. (2009) The essential oil of turpentine and its major volatile fractinon α- and β-pinenes): A Review. International Journal of Occupational Medicine and Environmental Health, 22 (4), 331–342. Mihajilov-Krstev T., Radnović D., Kitić D., Stojanović-Radić Z., Zlatković B. (2009) Antimicrobial activity of Satureja hortensis L. essential oil against pathogenic microbial strains. Biotechnol. & Biotechnol.Eq., 23 (4), 1492-1496. Mishra D., Gupta A., Prajapati C., Singh U. (2011) Combination of fungal and bacterial antagonists for management of root andstem rot disease of soybean. Pak. J. Bot., 43(5), 2569-2574. Moghtader M., Salari H., Farahmand A. (2011) Evaluation of the entifungal effect of rosemary oil and comparison with synthetic borneol and fungicide on the growth of Aspergillus flavus. Journal of Ecology and Natural Environment, 3(6) 210- 214. )Literatura 152 Moorthy K., Prasanna I., Thajuddin N., Arjunan S., Gnanendra T., Hussain Z. (2010) Occurrence of Mycopopulation in Spices and Herbal Drugs. Internaional Journal of Biodiversity, 1(Special Issue), 6-14. Moss M. (2002) Mycotoxin review – 1. Aspergillus and Penicillium. Mycologist, 16 (3), 116-119. Moyne L., Shelby R., Cleveland E., Tuzun S. (2001) Bacillomycin D: an iturin with antifungal activity against Aspergillus flavus. J. Appl. Microbiol., 90, 622-629. Nabigol A., Morshedi H. (2011) Evaluation of the antifungal activity of the Iranian thyme essential oils on the postharvest pathogens of strawberry fruits. African Journal of Biotechnology, 10 (48), 9864-9869. Nakatsu T., Lupo A., Chin J., Kang R. (2000) Biological activity of essential oils and their constituents. Studies in Natural Products Chemistry, 21, 571-631. Nelson E., Toussoun A., Marasas O. (1983) Fusarium species. An illustrated manual for identification. The Pennsylvania State University Press, University Park and London, 1-193. Nguefack J., Leth V., Dongmo L., Torp J., Zollo A., Nyasse S. (2008) Use of Three Essential Oils as Seed Treatments Against Seed-borne Fungi of Rice (Oryza sativa L.). American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 4 (5), 554-560. Nychas E. (1995) Natural antimicrobial from plants. New methods of food preservation, 58-69. Ongena M., Jourdan E., Adam A., Paquot M., Brans A., Joris B., Arpigny J., Thonart P. (2007) Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants. Environmental Microbiology, 9 (4), 1084–1090. Ongena M., Jacques P. (2008) Bacillus lipopeptides: versatile weapons for plant disease biocontrol. Trends in Microbiology, 16 (3), 115-125. Ostry V. (2008) Alternaria mycotoxins: an overview of chemical characterization, producers, toxicity, analysis and occurrence in foodstuffs. World Mycotoxin Journal, 1(2), 175-188. Ownagh A., Hasani A., Mardani K., Ebrahimzadeh S. (2010) Antifungal Effects of Thyme, Agastache and Satureja Essential Oils on Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus and Fusarium solani. Veterinary Research Forum, 2, 99-105. 孠Ϥ Literatura 153 Oxenham S., Svoboda K. (2005) Altered growth and polyamine catabolism following exposure of the chocolate spot pathogen Botrytis fabae to the essential oil of Ocimum basilicum. Mycologia, 97 (3), 576–579. Oxenham S., Svoboda K., Walters D. (2005) Antifungal Activity of the Essential Oil of Basil (Ocimum basilicum). Journal of Phytopathology, 153 (3), 174- 180. Oyero G., Oyefolu B. (2009) Fungal contamination of crude herbal remedies as a possible source of mycotoxin exposure in man. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 2 (5), 38-43 Pal K., Gardener B. (2006) Biological Control of Plant Pathogens. The Plant Health Instructor, 10, 1117-42. Pandey V., Dubey N. (1992) Effect of essential oils from some higher plants against fungi causing damping-off disease. Biologia Plantarum, 34, (1-2), 143-147. Pavlović S. (2008) Mikoze značajnih lekovitih biljaka u Srbiji. Doktorska disertacija. Univerzitet u Novom Sadu, Poljoprivredni fakultet. Pauli A. (2006) Anticandidal low molecular compounds from higher plants with special reference to compounds from essential oils. Medicinal Research Reviews, 26, (2), 223–268. Penčić V. (2008) Fitopatološki rečnik i pojmovnik. Institut za kukuruz, Zemun Polje, Zemun. Pinto E., Salgueiro R., Cavaleiro C., Palmeira A., Gonçalves M. (2007) In vitro susceptibility of some species of yeasts and filamentous fungi to essential oils of Salvia officinalis. Industrial Crops and Products, 26(2),135-141. Pitt I. (1979) The Genus Penicillium and Its Teleomorphic States Eupenicillium and Talaromyces. Journal of Basic Microbiology, 21 (8), 629. Pitt I., Basílico C., Abarca L., López C. (2000) Mycotoxins and toxigenic fungi. Medical Mycology, 38 (1), 41–46. Plaza P., Torres R., Usall J., Lamarca N., Vinas I. (2004) Evaluation of the potential of commercial post-harvest application of essential oils to control citrus decay. Journal of horticultural science and biotechnology, 79 (6), 935-940. Protolipac K., Jošić D., Starović M., Pavlović S., Postić D., Popović T., Stojanović S. (2011) The Effect of Pseudomonas Isolates on Growth and Pathogenicity 疰Ϥ Literatura 154 of Alternaria tenuissima. Proceedings of 7th Balkan congres of Microbiology (8th Conress of Serbian microbiologists), Belgrade, Serbia. Raaijmakers M., Vlami M., de Souza T. (2002) Antibiotic production by bacterial biocontrol agents. Antonie van Leeuwenhoek, 81, 537-547. Raju G., Maridass M. (2011) Composition, antifungal and cytotoxic activities of essential oils of Piper barberi fruits. International Journal of Biological Technology, 2 (2), 100-105. Rasooli I., Abyaneh R. (2004) Inhibitory effect of Thyme oils on growth and afltoxin production by Aspergillus parasiticus. Food Cont., 15, 479-483. Reddy K., Reddy C., Abbas H., Abel C., Muralidharan K. (2008) Mycotoxygenic fungy, mycotoxins, and management of rice grains. Toxin Rewiews, 27, 287-317. Řezaćova V., Kubatova A. (2005) Saprobic microfungi in tea based on Camellia sinensis and on other dried herbs. Czech. Mycol., 57 (1–2), 79–89. Richard L. (2007) Some major mycotoxins and their mycotoxicoses—an overview. Int. J. Food Microbiol. 119 (1–2), 3–10. Ritter S., Washington E. (2003) Green rewards, Presidential honors recognize innovative syntheses, process improvements, and new products that promote pollution prevention. Chemical & Engineering News, 81 (26), 30-35. Rizzo I., Vedoya G., Maurutto S., Haidukowski M., Varsavsky E. (2004) Assessment of toxigenic gungi on Argentinean medicinal herbs. Microbiol. Res., 159 (2), 113-120. Rosooli I., Owliab P. (2005) Chemoprevention by thyme oils of Aspergillus parasiticus growth and aflatoxin production. Phytochemistry, 66 (24), 2851–2856. Rosooli I., Rezaei B., Allameh A. (2006) Growth inhibition and morphological alterations of Aspergillus niger by essential oils of Thymus eriocalyx and Thymus x- porlock. Food control, 17, 359-364. Rota M., Herreraa A., Martínez R., Sotomayor J., Jordánb M. (2008) Antimicrobial activity and chemical composition of Thymus vulgaris, Thymus zygis and Thymus hyemalis essential oils. Food Control, 19 (7), 681–687. Romero D., de Vicente A., Rakotoaly R., Dufour S., Veening J., Arrebola E., Cazorla F., Kuipers O., Paquot M., Pérez-García A. (2007) The Iturin and Fengycin )Literatura 155 Families of Lipopeptides Are Key Factors in Antagonism of Bacillus subtilis Toward Podosphaera fusca. Molecular Plant-Microbe Interactions, 20 (4), 430-440. Rückert C., Bloma J., Chenb X., Revac O., Borrissb R. (2011) Genome sequence of B. amyloliquefaciens type strain DSM7T reveals differences to plant- associated B. amyloliquefaciens FZB42. Journal of Biotechnology, 155 (20), 78–85. Sabulal B., Dan M., Anil J., Kurup R., Pradeep N., Valsamma V. (2006) Caryophyllene-rich rhizome oil of Zingiber nimmonii from South India: chemical characterization and antimicrobial activity. Phytochemistry, 67 (22), 2469–2473. Sasidharan I., Menon A. (2010) Comparative chemical composition and antimicrobial activity of berry and leaf essential oils of Piper nigrum. Internetional Journal of Biological and Medicinal Resarch, 1 (4), 215-218. Satish S., Raghavendra M., Raveesha K. (2009) Antifungal potentiality of some plant extracts against Fusarium sp. Archives of Phytopathology and Plant Protection, 42(7), 618–625. Scardavi A. (1966) Synergism among fungicides. Ann. Rev. Phytopathol., 4, 335–348. Sharma R., Singh D., Singh R. (2009) Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: A review. Biological Control, 50, 205–221. Shukla A., Shahi S., Dikshit A., Saksena V. (2000) Plant product as fumigant for the management of stored-product pests. Proc. Int. Conf. Controlled Atmosphere and Fumigation in Stored Products, 125-132. Sicuiua O., Olteanu V., Ciuca M., Cirstea D., Cornea C. (2011) Characterization of new Bacillus sp., isolates for antifungal properties and biosynthesis of lipopeptides. Scientific Papers, UASVM Bucharest, 14, 482-491. Sikkema J., de Bont J., Poolman B. (1995) Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons, Microbiol. Rev. 59, 201–222. Singh D., Sharma R. (2007) Postharvest diseases of fruit and vegetables and their management. In: Prasad, D. (Ed.), Sustainable Pest Management. Daya Publishing House, New Delhi, India. Singh A., Khare A., Singh A. (2012) Use of Vegetable Oils as Biopesticide in Grain Protection -A Review. Journal of biofertilizers and Biopesticides, 3 (1), 1-9. 屐Ϥ Literatura 156 Sobolewski J., Robak J., Ostrowska A. (2006) Potential of organic preparations in control of Phytophthora infestans on tomatoes in field and indoor cultivation. Progr. Plant Prot. 46 (2), 704-707. Soković M. (2001) Antifungal activities of essential oil of selected aromatic and medicinal plants in vitro i in vivo, Ph.D. Thesis, Faculty of Biology, University of Belgrade, Yugoslavia. Soliman M., Badeaa I. (2002) Effect of oil extracted from some medicinal plants on different mycotoxigenic fungi. Food Chem. Toxicol. 40, 16669-1675. Soylu E., Tok F., Soylu S., Kaya A., Evrendilek G. (2005) Antifungal activities of the essential oils on post-harvest disease agent Penicillium digitatum. Pakistan Journal of Biological Science, 8 (1), 25-29. Soylu E., Yigitbas H., Tok F., Soylu S., Kurt S., Baysal Ö., Kaya A. (2005) Chemical composition and antifungal activity of the essential oil of Artemisia annua L. against foliar and soil-borne fungal pathogens. Journal of Plant Diseases and Protection, 112 (3), 229–239. Soto-Mendivil J., Moreno-Rodríguez F., Estarrón-Espinosa M., García-Fajardo E., Obledo-Vásquez J. (2008) Chemical composition and fungicidal activity of the essential oil of Thymus vulgaris against Altrernaria citri. e-Gnosis, 4, 1-7. Stanković N., Ljiljana R., Čomić B., Kocić D., Nikolić D. (2011) Odnos antibakterijske aktivnosti i hemijskog sastava etarskih ulja gajenih biljaka iz Srbije. Hem. Ind., 65 (5), 583–589. Stanković S., Mihajlović S., Draganić V., Dimkić I., Vukotić G., Berić T., Fira Đ. (2012) Screening for the presence of biosynthetic genes for antimicrobial lipopeptides in natural isolates of Bacillus sp. Arch. Biol. Sci., 64 (4), 1425-1432. Stein T. (2005) Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions. Mol. Microbiol., 56, 845-857. Stević T. (2009) Mikrobiološka kontrola lekovitog bilja. Specijalistički rad, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu. Stević T., Kostić M., Pavlović S., Runjajić-Antić D. (2004) Kontaminacija i zaražavanje lekovitog bilja mikroorganizmima. Biljni lekar, 32, 291-307. 眐Ϥ Literatura 157 Stević T., Pavlović S., Stanković S., Šavikin K. (2012) Pathogenic microorganisms of medicinal herbač drugs. Arch. Biol. Sci., Belgrade, 64 (1), 49-58, 2012. Straede A., Corran A., Bundy J., Heinisch J. (2007) The effect of tea tree oil and antifungal agents on a reporter for yeast cell integrity signalling. Yeas, 24(4), 321-334. Sun L., Gyung C., Kyoung J., He Kyoung L., Kwang C., Jin-Cheol K. (2007) Antifungal activity of five plant essential oils as fumigant against postharvest and soilborne plant pathogenic fungi. Plant Pathology Journal, 23(2), 97-102. Suppakul P., Miltz J., Sonneveld K., Bigger S. (2003) Antimicrobial Properties of Basil and Its Possible Application in Food Packaging. J. Agric. Food Chem., 51, 3197-3207. Survilienė E., Valiuškaitė A., Snieškienė V., Stankevičienė A. (2009) Effect of essential oils on fungi isolated from apples and vegetables. Sodinikysté ir Daržininkysté. Mokslo Darbai, 28(3), 227-234. Škrinjar M., Višić-Vićanović M., Blagojev N., Tatalović Z., Krunić V. (2011) Xerophilic mycopopulation of teas in bulk. Proc. Nat. Sci, Matica Srpska Novi Sad, 121, 103—113. Šovljanski R., Klokočar-Šmit Z., Inđić D. (2004) Visokorizični insekticidi i fungicidi i alternative u zaštiti povrća. Tematski zbornik III međunarodne Eko- konferencije Zdravstveno bezbedna hrana, Novi Sad, 387-392. Tabanca N., Kirimer N., Demirci B., Demirci F., Baser K. (2001) Composition and antimicrobial activity of the essential oils of Micromeria cristata subsp. phyrgia and the enantiomeric distribution of borneol. J. Agric. Food Chem., 49, 4300–4303. Tadtong S., Wannakhot P., Poolsawat W., Athicomkulchai S., Ruangrunsi N. (2009) Antimicrobial activity of essential oil from Etlingera punicea rhizome. J. Health Res., 23 (2), 77-79. Tasić S., Šavikin Fodulović K., Menković N. (2001)Vodič kroz svet lekovitog bilja. Beograd. Tassaneeyakul W., Razzazi-Fazeli E., Porasuphatana S., Bohm J. (2004) Contamination of aflatoxins in herbal medicinal products in Thailand. Mycopathologia, 158, 239-244. )Literatura 158 Thubthimthed S., Rerkam U., Suntorntanasat T. (2000) Chemical analysis of vetiver oils of five ecotypes. Abstract of poster papers, ICV-2, Cha-am, Phetchaburi, Thailand, 36. Thobunluepop P., Udomsilp J., Piyo A., Khaengkhan P. (2009) Screening for The Antifungal Activity of Essential Oils from Bergamot oil (Citrus hystrix DC.) and Tea tree oil (Melaleuca alternifolia) Against Economically Rice Pathogenic Fungi: A Driving Force of Organic Rice cv. KDML 105 Production. As. J. Food Ag-Ind., Special Issue, 374-380. Tiziana-Barrata M., Damien Dorman J., Deans G., Figueiredo C., Barroso G., Ruberto G. (1998) Antimicrobial and antioxidant properties of some commercial essential oils. Flavour and Fragrance Journal, 13, 235-244. Tomlin C. (2006) The Pesticide Manual British Crop Protection Council. Farnham, UK, 2006. Touré Y., Ongena M, Jacques P., Guiro A., Thonart P. (2004) Role of lipopeptides produced by Bacillus subtilis GA1 in the reduction of grey mould disease caused by Botrytis cinerea on apple. Journal of Applied Microbiology, 96, 1151–1160. Tournas V., Katsoudas E. (2008) Microbiological Quality of Various Medicinal Herbal Teas and Coffee Substitutes. Microbiology Insights,1, 47–55. Tripathi P., Dubey N. (2004) Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables. Postharvest Biology and Technology, 32, 235–245. Trucksess M., Scott P. (2008) Mycotoxins in botanicals and dried fruits: A rewiev. Food Additives & Contaminants, Part A, 25 (2), 181-192. Tzortzakis G. (2007). Maintaining postharvest quality of fresh produce with volatile compounds. Innovative Food sci. Emerging Technol., 8, 111-116. Ultee A., Bennık J., Moezelaar R. (2002) The phenolic hydroxyl group of carvacrol is essential for action against the foodborne pathogen Bacillus cereus. Applied and Environmental Microbiology, 68, 1561–1568. Ulubelen A., Topcu G., Eris C., Sonmez U., Kartal M., Kurucu S. (1994) Terpenoids from Salvia sclarea. Phytochemistry, 36, 971–974. Uribe S., Ramirez T., Pena A. (1985) Effects of β-pinene on yeast membrane functions. J. Bacteriol., 161,1195–200. 嵀Ϥ Literatura 159 Vardar-Ünlü G., Candan F., Sökmen A., Daferera D., Polissiou M., Sökmen M., Dönmez E., Tepe B. (2003) Antimicrobial and Antioxidant Activity of the Essential Oil and Methanol Extracts of Thymus pectinatus Fisch. et Mey. Var. pectinatus (Lamiaceae). J. Agric. Food Chem., 51 (1), 63–67. Vaverkova Š., Holla M., Takel J., Habam M., Vozar I. (2004) Sadržaj i sastav etarskog ulja tri vrste roda Salvia gajenih u Slovačkoj. Medical Plant Report, 11, 24-28. Velho R., Medina L., Segalin J., Brandelli A. (2011) Production of lipopeptides among Bacillus strains showing growth inhibition of phytopathogenic fungi. Folia Microbiologica, 56 (4), 297-303. Velluti A., Sanchis V., Ramos J., Egido J., Marin S. (2005) Inhibitory effect of cinnamon, clove, lemongrass, origano and palmarose essential oils on growth and fumonisin B1 production by Fusarium proliferatum in maize grain. Int. J. Food Microb., 89, 145-154. Venema T., Abee J., Haandrikman J., Leenhouts J., Kok W., Konings N., Venema G. (1993) Mode of action of lactococcin B, a thiol-activated bacteriocin from Lactococcus lactis. Appl.Environ. Microbiol. 59, 1041-1048. Vitullo D., Di Pietro A., Romano A., Lanzotti V., Lima G. (2012) Role of new bacterial surfactins in the antifungal interaction between Bacillus amyloliquefaciens and Fusarium oxysporum. Plant Pathology, 61(4), 689-699. Viuda-Martos M., Ruiz-Navajas Y., Fernandez-Lopez N., Perez-Alvarez J. (2008) Antifungal activity of lemon (Citrus lemon L.), mandarin (Citrus reticulata L.), grapefruit (Citrus paradisi L.) and orange (Citrus sinensis L.) essential oils. Food Control, 19 (12), 1130-1138. Vollembroich D., Pauli G., Özel M., Vater J. (1997) Antimycoplasma properties and application in cell culture of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis. Appl. Environ. Microbiol., 63, 44-49. Walsh T. (2004) Polyketide and nonribosomal peptide antibiotics: Modularity and versatility. Science, 303, 1805-1810. Wang S., Groopman D. (1999) DNA damage by mycotoxins. Mutat. Res., 424, 167-181. WHO (2005) Quality control methods for medicinal plant materials. World Health Organization. Working document CeAS/05.131/Rev.1. 碀Ϥ Literatura 160 Wyatt D., in: D.E. Diaz, (Ed.) (2005) The Mycotoxin Blue Book: Mycotoxin Interactions, Nottingham University Press, Nottingham, 269-278. Yaouba A., Tatsadjeu L., Jazet M., Etoa X., Moses M. (2010) Antifungal properties of essential oils nad some constituents to reduce foodborne pathogen. Journal of Yeast and Fungal Research., 1(1), 001-008. Yin J., Smith M., Eppley R., Page S., Sphon J. (1998) Effects of fumonisins B1 on lipid peroxidation in membranes. Biochem. Biophis. Acta – Biomembr. 1371, 134- 142. Yigit F., Özcan M., AkgüL A. (2000) Inhibitory effect of some spices essential oils on Penicillium digitatum causing postharvest rot in citrus. Grasas y Aceites, 51 (4), 237-240. Yen T., Chang S. (2008) Synergistic effects of cinnamaldehyde in combination with eugenol against wood decay fungi. Bioresource Technology, 99, 232-236. Yeon-Suk L., Junheon K., Sang-Chul S., Sang-Gil L., Il-Kwon P. (2008) Antifungal activity of Myrtaceae essential oils and their components against three phytopathogenic fungi. Flavour and Fragrance Journal, 23 (1), 23-28. Yu G., Sinclair J., Hartman G., Bertagnoli B. (2002) production of iturin A by Bacillus amyloliquefaciens supressing Rhizostonia solani. Soil Biology & Biochemistry, 34, 955-963. Zhang Q., Yang S., Dong Z., Pei L., Ding L., Song A., Gong Y., Liu G., Xue L. (2007) Determination of grain contamined by Alternaria alternata and exposure of its toxins for residents in the high incident area of esophageal cancer. Life Science Journal, 4 (4), 25-28. Zhang S., Wang Y., Meng L., Li J., Zhao X., Cao X., Chen X., Wang A., Li J. (2012) Isolation and characterization of antifungal lipopeptides produced by endophytic Bacillus amyloliquefaciens TF28. African Journal of Microbiology Research, 6 (8), 1747-1755. Zuzarte M., Gonçalves M., Cavaleiro C., Canhoto J., Vale-Silva L., Silva M., Pinto E., Salgueiro L. (2011) Chemical composition and antifungal activity of the essential oils of Lavandula viridis L'Hér. J Med Microbiol., 60 (5), 612-618. )Literatura 161 Živković S. (2011) Uporedna proučavanja izolata Colletotrichum spp. prouzrokovača antraknoze. Doktorska disertacija, Univerzitet u Novom sadu, Poljoprivredni fakulet. Živković S., Stojanović S, Balaž J., Gavrilović V. (2007) Characterictic of Phomopsis sp. Isolates of plum trees origin. Prot. Nat. Sci. Matica Srpska, 113, 83-91. Velho R., Medina L., Segalin J., Brandeli A. (2011) Production of lipopeptides among Bacillus strains showing growth inhibition of phytopathogenic fungi. Folia Microbiologica, 56 (4), 297-303. 帰Ϥ Prilog 1 162 PRILOG 1 Indeks pojmova 秠Ϥ Prilog 1 163 Askus – 1) bezbojno, plodno telo u obliku kese u kome se posle polnog procesa obrazuje osam askospora; 2) ćelija hife poput vreće u kojoj se odvija mejoza i koja sadrži askospore, obično 8 Askospora – spora polno stvorena u askusima Fitopatogene gljive – gljive prouzrokovači bolesti biljka. Patogeni deluju na biljku enzimima, toksinima ili regulatorima rasta, kako bi obezbedili hranu. Fruktifikacija – fenofaza obrazovanja plodova kod: biljaka i gljiva (obrazovanje sporonosnih organa) Fumigacija – proces dezinfekcije gasom (fumigant) prostora, materijala, semena, sadnog materijala, proizvoda. Fumigacija se odvija u zatvorenom prostiru uz posebne mere predostrožnosti Konidija – bespolna ili aseksualna spora gljive stvorena egzogeno na konidioforu od kojeg se oslobađa u zrelosti. Mogu da bude jedno- i višećelijske. Vrste roda Fusarium obrazuju makrokonidije, mezokonidije i mikrokonidije. Makrokonidije su višećelijske konidije većih razmera. Septirane su sa tri i više septi, a po obliku mogu biti: srpaste, povijene, zašiljene i dr. Mikrokonidija manja od makro, najčešće neseptirana ili sa 1-3 poprečne pregrade. Obrazuju se pojedinačno i u glavicama na konidioforama Konidiofor – specijalizovana hifa na kojoj se stvaraju jedna ili više konidija; mogu biti pojedinačni ili u grupama, nerazgranati ili razgranati. Micelija – vegetativno telo gljiva. Sastoji se od tankih niti-hifa, koje su često razgranate. Obično se razvija u supstratu (supstratna), a nekad na površini (površinska). Micelija može biti jednoćelijska, višećelijska, septirana i bez septi. Na njoj se obrazuju reprodutivni organi gljive: konidiofore, konidije i sl. Ponekad služi i za vegetativno razmnožavanje. Hifa – ogranak micelije. Vegetativni organ gljiva, septirani ili neseptirani filamenti. Cevast gradivni delovi (niti) skoro svih gljiva (pojedinačne niti somatskog tela skoro svih gljiva zovu se hife), s hitinskim zidovima kod eumikotskih gljiva i celuloznim kod oomiceta. Hlamidospora - bespolna spora, debelih zidova, stvorena modifikacijom ćelije hife gljive ili ćelije konidije. Ne rasejavaju se; stacionirane su na mestu gde su obrazovane )Prilog 1 164 do klijanja. Bogate su rezervnim materijama. Omogućava održavanje gljiva duži period u nepovoljnim uslovima spoljašnje sredine, npr. u zemljištu i biljnim ostacima. Peritecije – loptasto ili kruškasto plodno telo (askokarp) nekih rodova koje ima otvor ili poru za oslobađanje askusa Piknidija – bespolno plodonosno telo, loptastog ili kruškastog oblika u kojem se obrazju piknospore na konidioforima; konidioma mrke boje s ostilom, tankim zidovima, obično su 2-3 ćelije zbijene, al nekada i više Piknospora – bespolna spora, obrazuju se na fijalidama, ali su smeštene u piknidama. Spora - specijalizovana reproduktivna struktura gljive, koja se razvija u jedinku bez sjedinjavanja sa drugom sličnom strukturom. Nastaju polnim i bespolnim putem. Mogu biti jedno, dvo- ili višećelijske, različitog oblika, razne boje, mera. Služe za razmnožavanje, raznošenje i prezimljavanje. Sklerocija – čvrsti, višećelijski vegetativni organi za prezimljavanje gljiva. One su loptaste ili nepravilnog oblika; to je masa hifa sa ili bez prisustva tkiva domaćina, koja normalno nema spore niti na sebi niti u sebi; plodonosno telo i micelija mogu se obrazovati iz sklerocije. Obrazuju se pod nepovoljnim uslovima. Skrining test – postupak masovnog pretraživanja prisustva ili odsustva ispitivanog svojstva Sporangije – kesice ili opne oko bespolnih sporangiospora. Sporangiofore – specifične micelijske hife koje nose jednu ili više egzogenih spora (konidija) Sporangiospore – endogene, nepokretne, bespolne spore koje se obrazuju u sporangijama. Klijanjem micelija obrazuje hife. Sporodohija – plodonosna struktura koju obrazuje grupa kratkih konidiofora s konidijama; jastučasta tvorevina s konidioforima ili konidiogenim ćelijama koje prekrivaju njenu gornju površinu, a koje nisu prekrivene podlogom za vreme razvića. Sporonosno telo – kompleksna struktura gljive koja sadrži konidije, npr. peritecije kod telomorfa i sporodohija kod anomorfa mnogih vrsta Fusarium Talus – vegetativno telo gljiva koje nema diferencirane organe niti sprovodni sistem. Talus može biti jednoćelijski ili višećelijski. Telomorf – polni ili potpuni stadijum u životnom ciklusu gljive (Penčić, 2008). 张Ϥ Prilog 2 165 PILOG 2 Kompletna kvantitativna i kvalitativna analiza ispitivanih etarskih ulja određena je primenom GC-FID i GC-MS tehnike 筐Ϥ Prilog 2 166 Tabela 23. Hemijski sastav etarskih ulja (eu) čubra, origana i timijana (%) Jedinjenje RI eu čubra eu origana eu timijana Triciklen 906 0,05 - 0,14 α-Tujen 911 0,16 - - α-Pinen 919 1,19 0,37 0,94 Kamfen 938 0,88 0,16 1,81 β-Pinen 975 0,45 1,08 0,24 Mircen 991 0,86 0,12 1,35 3-Oktanol 996 0,21 0,19 - α-Felandren 1006 0,24 0,14 0,12 α-Terpinen 1017 1,23 0,43 2,47 p-Cimen 1024 12,20 2,11 23,22 Limonen 1030 0,53 0,63 0,64 1,8-Cineol 1031 0,46 1,03 3,71 Z-Ocimen 1032 0,50 - - γ-Terpinen 1055 6,50 2,61 6,98 cis-Sabinen hidrat 1063 0,18 - - Terpinolen 1084 0,10 0,09 0,29 Linalol 1094 1,63 2,54 4,95 cis-Tujon 1103 0,09 - - dihidro-Linalol 1129 - - 0,08 trans-Sabinol 1136 - 0,11 - Kamfor 1142 0,88 0,73 - Izoborneol 1155 0,21 - 0,33 Borneol 1163 2,41 1,18 0,57 Terpinen-4-ol 1177 0,74 0,78 0,68 α-Terpineol 1192 0,80 0,57 0,60 γ-Terpineol 1199 0,13 - 0,15 Citroneol 1230 0,18 - - Karvakrol, metil eter 1246 0,77 - - Geraniol 1259 0,33 - - Bornil acetat 1288 0,18 - - Timol 1293 9,65 3,71 43,70 Karvakrol 1304 50,00 75,80 2,95 Eugenol 1359 0,16 - Karvakrol acetat 1378 0,08 - - α-Kopaen 1378 - 0,08 - Geranil acetat 1386 - - 0,26 Metil Eugenol 1407 0,08 - - E-Kariofilen 1422 5,17 2,76 3,11 α-Humulen 1457 0,31 0,81 0,11 Ukupno: 99,99 99,85 99,40 RI- retencioni indeks ) 怐Ϥ Prilog 2 168 Tabela 24. Hemijski sastav etarskih ulja (eu) ruže i zdravca (%) Jedinjenje RI eu ruže eu zdravca α-Pinen 919 0,06 0,2 Oktanal 1004 0,07 - Limonen 1030 0,27 - Linalol 1094 1,16 1,7 cis-Roze oksid 1106 0,22 0,74 Fenetil alkohol 1108 6,05 7,45 trans-Roze oksid 1123 0,10 0,33 Kamfor 1142 - - Izopulegol 1143 - 0,26 Menton 1151 0,25 1,82 Izomenton 1163 1,12 3,48 2-Fenil etil format 1176 - 0,32 Terpinen-4-ol 1177 - - α-Terpineol 1192 0,18 0,13 Dihidro citronelol 1197 0,10 - trans-karveol 1219 0,62 - Citronelol 1230 51,26 39,03 Nerol 1231 0,40 - Karvon 1246 0,98 - Geraniol 1259 25,84 11,26 Geranial 1273 0,69 - Citronelil format 1277 1,34 5,08 Neril format 1283 0,29 0,80 Geranil format 1304 0,66 1,44 Citronelil acetat 1354 0,08 1,4 Eugenol 1359 1,82 - Neril acetat 1366 0,28 α-Kopaen 1378 0,08 0,22 Geranil acetat 1386 0,33 1,84 Fenil etil izobutanoat 1397 - 2,77 E-Kariofilen 1422 0,32 0,86 α-Jonon 1431 0,68 - cis-Tujopsen 1433 - 0,87 α-Gvajen 1442 0,10 0,26 6,9-Gvajadien 1447 1,39 4,14 α-Humulen 1457 0,07 0,22 allo-Aromadendren 1465 0,06 0,16 Geranil propanoat 1478 0,15 0,4 Germacrene D 1485 0,24 0,55 β-jonon 1496 0,36 - Viridiflorene 1499 0,22 0,64 γ-Kadinen 1519 - 0,24 δ-Kadinen 1528 0,18 0,5 Citronelil butanoat 1533 0,19 0,65 Geranil butanoat 1563 0,15 4,81 2-Fenil etil tiglat 1589 0,11 0,29 Kedrol 1604 - 1,26 E-Citronelil tiglat 1670 0,17 0,54 Geranil tiglat 1706 0,27 2,30 Ukupno: 99,83 99,24 RI – retencioni indeks 粰Ϥ Prilog 2 169 Tabela 25. Hemijski sastav etarskih ulja (eu) lavande, korijandera i bergamota (%) Jedinjenje RI eu lavande eu korijandera eu bergamota Triciklen 906 0,08 0,03 - α-Tujen 911 - 0,04 - α-Pinen 919 3,16 7,77 0,75 Kamfen 938 1,00 1,19 0,19 Sabinen 969 - 0,03 0,11 β-Pinen 975 1,19 0,6 3.00 3-Octanon 984 0,2 - - Mircen 991 1,49 0,92 0,95 Butil butilat 996 0,04 - - Oktanal 1004 - - 0,04 p-Menta-1(7),8-dien 1006 0,08 - - α-Felandren 1005 - - 0,08 3-Karen 1011 1,36 - 0,04 Heksil acetat 1012 0,46 - α-Terpinen 1017 - 0,09 0,16 p-Cimen 1024 1,77 0,92 0,83 Limonen 1030 0,25 2,81 36,83 1,8-Cineol 1032 0,91 - - γ-Terpinen 1055 0,1 4,16 3,06 cis-Linalil oksid 1068 0,06 0,11 - trans-Linalol oksid 1084 0,14 - - Terpinolen 1084 - 0,7 0,14 Linalol 1094 35,45 71,18 12,84 Kamfor 1142 0,65 4,32 - Izoborneol 1155 0,34 - - Borneol 1163 2,56 0,11 - Terpinen-4-ol 1177 2,06 0,1 0,07 α-Terpineol 1192 0,41 0,19 0,07 n-Heksil butanoat 1193 0,19 - - Octil acetat 1211 0,07 - 0,1 Nerol 1231 - - 0,2 Neral 1242 - - 0,28 Metil citronelat 1256 0,08 - 0,09 Geraniol 1259 - 1,13 - Linalol acetat 1259 37,2 - 37,27 Geranial 1273 - - 0,62 E-Cinamaldehid 1276 0,07 - - E-Anetol 1288 0,27 - - Iiobornil acetat 1288 - - 0,36 Lavandulil acetat 1293 1,14 - - Mirtenil acetat 1328 - 0,09 - Heksil tiglat 1333 0,05 - - Linalil propionat 1340 - - 0,05 α-Terpinil acetate 1352 - - 0,19 Neril acetat 1366 2,37 - 0,26 Geranil acetat 1386 0,38 3,23 0,37 E-Kariofilen 1422 3,21 - 0,45 α-Humulen 1457 0,11 - - Z-β-Farnesen 1461 0,15 - - Germakren D 1485 0,13 - - Lavandulil izovalerat 1514 0,1 - - γ-Kadinen 1519 0,1 - - Eugenil acetat 1532 0,05 - Citronelil butanoat 1533 - - 0,15 Ukupno: 99,43 99,72 99,55 Ri- retencioni indeks )Prilog 2 170 Tabela 26. Hemijski sastav etarskog ulja ploda/semena anisa Jedinjenja RI % α-Tujen 911 - α-Pinen 919 0,38 Kamfen 938 - β-Pinen 975 - Mircen 991 - α-Felandren 1006 0,24 3-Karen 1010 0,09 α-Terpinen 1017 - p-Cimen 1024 - Limonen 1030 - Silvestren 1030 0,35 1,8-Cineol 1031 0,14 γ-Terpinen 1055 - Linalol 1094 1,05 Terpinen-4-ol 1177 0,13 α-Terpineol 1192 0,13 γ-Terpineol 1199 - Metil havikol 1200 3,62 Citronelol 1230 - Z-Anetol 1253 0,43 E-Anetol 1288 91,78 E-Kariofilen 1422 0,23 α-Bergamoten 1438 0,22 Fenikulin 1683 1,20 Benzil benzoat 1768 - Ukupno: 99.99 RI – Retencioni indeks 愀Ϥ Prilog 2 171 Tabela 27. Hemijski sastav etarskog ulja čajnog drveta Jedinjenje RI % α-Tujen 911 0,51 α-Pinen 919 3,48 Camfen 938 Trag Sabinen 969 0,20 β-Pinen 975 1,72 Mircen 991 1,50 α-Felandren 1006 0,40 α-Terpinen 1017 7,09 p-Cimen 1024 3,13 Limonen 1030 3,88 1,8-Cineol 1032 1,87 γ-Terpinen 1055 17,78 Terpinolen 1084 4,16 Linalol 1094 0,07 dehidro-Sabinen keton 1117 0,17 trans-Sabinol 1136 0,15 Terpinen-4-ol 1177 40,66 p-Cimen-8-ol 1186 0,08 α-Terpineol 1192 4,49 γ-Terpineol 1199 0,16 α-Kopaen 1378 0,12 α-Gurjunen 1412 0,27 E-Kariofilen 1422 2,69 β-Kopaen 1431 0,05 Aromadendren 1442 0,99 α-Guaien 1447 0,05 α-Humulen 1457 0,14 allo-Aromadendren 1465 0,44 trans-Kadina-1(6),4-dien 1478 0,24 Selinen beta 1490 0,05 δ-Selinen 1496 0,08 Viridifloren 1499 0,71 Biciklogermakren 1519 0,28 α-Muurolen 1505 0,08 δ-Kadinen 1528 0,88 Zonaren 1529 0,15 trans-Kadina-1,4-dien 1537 0,11 Viridiflorol 1594 0,12 Kubeban-11-ol 1597 0,10 1-epi-kubenol 1632 0,12 Kubenol 1647 0,06 Ukupno: 97,69 RI – retencioni indeks 縠Ϥ Prilog 2 172 Tabela 28. Hemijski sastav etarskog ulja ljubičice Jedinjenje RI % α-Pinen 919 0,26 Sabinen 969 0,09 β-Pinen 975 0,66 Mircen 991 0,04 p-Cimen 1024 0,9 Limonen 1030 4,03 1,8-Cineol 1031 0,37 γ-Terpinen 1055 0,60 Linalol 1094 3,86 cis-Roze oksid 1106 0,06 Fenetil alkohol 1108 0,58 Kamfor 1142 0,28 Izomenton 1163 0,28 Borneol 1163 0,11 α-Terpineol 1192 0,15 Citronelol 1230 1,53 Linalol acetat 1259 3,84 Citronelil format 1277 0,38 E-Anetol 1288 0,25 Piperonal 1328 0,86 Feniletil propionat 1355 6,84 Triacetin 1362 53,74 Geranil acetat 1386 0,47 Vanillin 1400 0,83 E-Kariofilen 1422 1,25 α-Jonon 1431 9,38 6,9-Guaiadien 1440 0,71 α-Humulen 1457 0,18 Germacren D 1485 0,17 β-Jonon 1490 4,78 Guaiol 1601 0,56 Bulnezol 1674 0,88 Benzil benzoat 1768 0,11 Ukupno: 99,03 RI – Retencioni indeks )Prilog 2 173 Tabela 29. Hemijski sastav etarskog ulja crnog bibera Jedinjenje RI % α-Tujen 911 0,67 α-Pinen 919 15,49 Kamfen 938 0,39 Sabinen 969 5,48 β-Pinen 975 14,87 Mircen 991 1,06 α-Felandren 1005 2,84 3-Karen 1012 9,54 α-Terpinen 1017 0,42 p-Cimen 1024 1,47 Limonen 1030 18,75 1,8-Cineol 1032 Trag γ-Terpinen 1055 0,27 Terpinolen 1084 0,27 Linalol 1094 0,62 trans-Sabinol 1136 0,06 Terpinen-4-ol 1176 0,63 α-Terpineol 1192 0,06 Piperiton 1255 1,00 δ-Elemene 1340 1,12 α-Kubeben 1352 0,15 α-Kopaen 1378 1,86 β-Kubeben 1397 0,13 β-Elemen 1397 0,23 E-Cariofilen 1422 19,44 β-Kopaen 1431 0,10 α-Humulen 1457 0,80 Germacren D 1485 0,11 Biciklogermakren 1499 0,11 α-Muurolen 1505 0,17 β-Bisabolene 1513 0,37 δ-Kadinen 1528 0,53 Kariofylen oksid 1586 0,60 Ukupno: 99,61 RI – Retencioni indeks 懰Ϥ Prilog 2 174 Tabela 30. Hemijski sastav etarskog ulja kore cimeta Jedinjenje RI % α-Pinen 919 0,73 Kamfen 938 trag Benzaldehid 951 0,22 β-Pinen 975 0,16 α-Terpinen 1017 trag p-Cimen 1024 1,30 Limonen 1030 1,72 1,8-Cineol 1031 2,22 γ-Terpinen 1055 0,06 Linalol 1094 3,70 α-Terpineol 1192 0,98 γ-Terpineol 1199 0,29 (Z)-Cinamaldehid 1220 0,21 (E)-Cinamaldehid 1276 74,04 Bornil acetat 1288 2,13 Eugenol 1359 3,08 E-Kariofilen 1422 2,60 Cinamil acetat 1447 5,55 α-Humulen 1457 0,10 E-Metoksi cinamaldehid 1535 0,33 Benzil benzoat 1768 0,46 Ukupno: 99,88 RI – Retencioni indeks 羀Ϥ Prilog 2 175 Tabela 31. Hemijski sastav etarskog ulja bosiljka Jedinjenje RI % α-Pinen 919 0,14 Sabinen 969 0,07 β-Pinen 975 0,19 Mircen 991 0,09 Limonen 1030 0,15 1,8-Cineol 1032 3,00 E-β-Ocimen 1044 0,44 γ-Terpinen 1055 1,07 Terpinolen 1084 0,07 Linalol 1094 1,30 endo-Fenhol 1108 0,06 Kamfor 1142 0,18 Mentol 1170 0,17 Terpinen-4-ol 1177 0,17 α-Terpineol 1192 0,23 Metil havikol 1205 88,97 endo-Fenhil acetat 1222 0,09 Izobornil acetat 1288 0,06 Eugenol 1359 0,66 β-Elemen 1394 0,09 Metil Eugenol 1407 0,16 E-Kariofilen 1422 0,50 α-Bergamoten 1438 1,09 α-Humulen 1457 0,04 γ-Kadinen 1519 0,19 (E)-para-metoksi- Cinamaldehid 1571 0,28 epi-α-kadinol 1645 0,25 Ukupno: 99,18 RI – Retencioni indeks )Prilog 2 176 Tabela 32. Hemijski sastav etarskih ulja (eu) španske i dalmatinske žalfije i ruzmarina (%) Jedinjenje RI eu španske žalfije eu dalmatinske žalfije eu ruzmarina Triciklen 906 0,30 0,51 0,21 α-Tujen 911 0,04 - 0,12 α-Pinen 919 17,14 6,65 10,30 α-Fenhen 935 - 0,17 0,08 Kamfen 938 4,62 7,11 4,44 Sabinen 969 0,24 0,67 0,05 β-Pinen 975 2,46 1,79 7,86 Mircen 991 0,91 Trag 0,92 α-Felandren 1006 - - 0,13 3-Karen 1010 - - 0,11 α-Terpinen 1017 0,08 - 0,13 p-Cymen 1024 0,34 0,78 1,00 Limonen 1030 13,88 3,28 2,68 Silvestren 1030 - - 1,8-Cineol 1031 10,56 13,95 45,34 Z-Ocimen 1032 trag - γ-Terpinen 1055 0,16 0,09 0,78 Terpinolen 1084 - - 0,19 Linalol 1094 0,63 1,00 0,56 cis-Tujon 1103 - 28,54 - trans-tujon 1112 - 2,54 - Dehidro-sabinen keton 1117 - 0,12 - p-Ment-3-en-1-ol 1131 0,11 0,07 - trans-Sabinol 1136 0,26 0,17 - Kamfor 1142 26,64 - 13,00 Izoborneol 1155 - 0,23 0,84 Borneol 1164 7,14 3,52 2,54 Terpinen-4-ol 1177 0,10 0,71 0,48 α-Terpineol 1192 2,31 1,34 1,68 γ-Terpineol 1199 0,66 0,38 0,30 Linalol acetat 1259 3,09 - - Bornil acetat 1288 4,94 2,20 1,08 Timol 1293 - - - trans-Sabinil acetat 1293 0,60 - - α-Terpinil acetat 1351 0,40 - - Karvakrol acetat 1378 - - 0,12 Metil Eugenol 1407 - - 0,18 Longifolen 1407 0,08 - - E-Kariofilen 1422 0,21 2,31 4,48 α-Humulene 1457 0,06 0,08 0,24 δ-Kadinen 1528 - - 0,06 Kariofilen oksid 1586 - 0,36 - Ukupno: 97,96 78,57 99,84 RI – retencioni indeks 拠Ϥ Prilog 2 177 Tabela 33. Hemijski sastav etarskih (eu) ulja limuna, narandže i eukaliptusa (%) Jedinjenje RI eu limuna eu narandže eu eukaliptusa α-Tujen 911 0,42 0,06 - α-Pinen 919 2,13 0,62 2,14 Kamfen 938 0,06 - - Sabinen 969 2,25 0,22 - β-Pinen 975 13,86 0,46 0,39 Mircen 991 1,41 1,36 0,47 α-Felandren 1007 - 0,07 0,37 3-Karen 1012 - 0,05 - α-Terpinen 1017 0,12 - 0,10 p-Cimen 1024 1,42 0,47 0,22 Limonen 1030 65,86 90,88 89,92 1,8-Cineol 1032 - - - Z-Ocimen 1035 - - 0,18 E-β-Ocimen 1045 0,07 Trag 0,06 γ-Terpinen 1055 6,19 1,00 2,54 Terpinolen 1084 0,22 0,05 0,26 Linalol 1094 0,51 0,66 0,09 cis-Limonen oksid 1131 - 0,12 - trans-Limonen oksid 1134 - 0,05 - trans-Sabinol 1136 - - 0,14 Kamfor 1142 - - - Borneol 1164 - - - Terpinen-4-ol 1177 - - 0,30 α-Terpineol 1192 0,58 0,16 0,81 γ-Terpineol 1199 0,15 - n-Dekanal 1207 - 0,18 - Citronelol 1230 - 0,15 - Kumin aldehid 1242 - - Neral 1243 1,33 0,09 - Linalol acetat 1258 0,25 1,64 - Geranial 1273 2,29 0,16 - Timol 1293 - - Karvakrol 1305 - - α-Terpinil acetat 1352 - 0,12 - Citronelil acetat 1354 - 0,15 - Eugenol 1359 - - Neril acetat 1366 - 0,21 - α-Kopaen 1378 - - Geranil acetat 1386 - 0,46 - Dodekanal 1411 - 0,05 - E-Kariofilen 1422 0,87 0,48 - Ukupno: 99,99 99,92 99,99 RI- retencioni indeks 胰Ϥ Prilog 2 178 Tabela 34. Hemijski sastav etarskog ulja kamilice Jedinjenje RI % p-Cimen 1024 Trag E-Ocimen 1044 0,09 γ-Terpinen 1055 0,05 Artemisia keton 1055 0,27 Artemisia alkohol 1078 0,07 Dekanoična kiselina 1367 0,40 Farnesen 1461 18,52 dehidro-Seskvicineol 1473 0,14 Germakren D 1485 1,22 β-Selinen 1490 0,15 Biciklogermakren 1499 0,89 E,E-α-Farnesol 1513 0,73 β-Bisabolen 1513 - α-dehidro-Himahalen 1519 0,46 δ-Kadinen 1528 0,22 Citronelil butanoat 1533 - Spatulenol 1581 0,81 Cariofylene oksid 1586 - Bisabolol oksid II 1660 5,06 Bisabolol 1689 21,11 Hamazulen 1735 2,20 α-Bisabolol oksid A 1752 37,98 Z-Spiroeter 1887 4,72 E-Spiroeter 1890 0,55 Ukupno: 95,64 RI – Retencioni indeks )Prilog 2 179 Tabela 35. Hemijski sastav etarskog ulja vetivera Jedinjenje RI % α-Ilangen 1373 0,14 2-epi-β-Funebren 1413 0,12 Prezizaen 1447 0,23 Kusimen 1454 0,62 α-Amorfen 1485 1,78 cis-Eudesma-6,11-dien 1490 0,59 β-Vetispiren 1495 1,72 Hedikariol 1553 0,79 β-Vetivenen 1557 2,21 Kusimon 1604 1,10 Junenol 1621 3,57 10-epi-γ-Eudezmol 1625 3,01 α-Kadinol 1655 0,71 Valerianol 1658 3,12 7-epi-α-Eudezmol 1663 1,71 epi-Zizanon 1672 1,02 Eudesm-7(11)-en-4-ol 1703 0,88 Guaiol acetat 1719 1,45 Vetiselinenol 1728 4,52 Kusimol 1748 18,22 E-Izovalencenol 1794 14,67 Notkaton 1809 0,47 β-Vetivon 1823 4,13 α-Vetivon 1847 5,42 Ukupno: 72,20 RI – Retencioni indeks 提Ϥ Prilog 3 180 PRILOG 3. Statistička analiza inhibitornog efekta svih etarskih ulja na rast pojedinačnih ispitivanih gljiva. Prikazane su srednje vrednosti MIC i standardna greška. Vrednosti prikazane istim slovima nisu statistički značajne (p < 0,05) po Dankanovom testu višestrukog opsega. 艐Ϥ Prilog 3 181 Tabela 36. Statistička analiza inhibitornog efekta svih etarskih ulja na rast pojedinačnih ispitivanih gljiva. Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Amyris balsamifera 14,28 0,28 a Vetiveria zizanoides 12,72 0,29 a Vetiveria zizanoides 12,72 0,29 b Citrus aurantum 12,15 0,00 b Citrus aurantum 12,07 0,24 c Amyris balsamifera 11,13 0,26 c Matricaria recutita 11,48 0,52 d Matricaria recutita 10,29 0,09 d Eucalyptus globulus 9,70 0,00 e Eucalyptus globulus 8,92 0,48 e Citrus limon 7,66 0,43 f Citrus limon 8,00 0,43 f Ocimum basilicum 7,65 0,38 f Salvia lavandulifolia 7,52 0,00 g Salvia lavandulifolia 7,33 0,19 f Ocimum basilicum 6,80 0,00 h Viola odorata 4,58 0,19 g Cinnamomum zeylanicum 5,30 0,00 i Salvia officinalis 4,51 0,09 g Salvia officinalis 4,60 0,00 j Cinnamomum zeylanicum 4,35 0,11 gh Piper nigrum 3,98 0,19 k Piper nigrum 3,90 0,00 h Viola odorata 3,54 0,19 k Pelargonium graveolens 2,28 0,00 i Pelargonium graveolens 2,19 0,09 l Citrus aurantium 1,83 0,09 ij Citrus aurantium 2,18 0,00 l Lavandula angustifolia 1,75 0,09 ij Coriandrum sativum 2,13 0,00 l Rosmarinus officinalis 1,48 0,10 jk Lavandula angustifolia 1,33 0,05 m Melaleuca alternifolia 1,14 0,00 k Rosmarinus officinalis 1,23 0,00 m Coriandrum sativum 0,98 0,05 k Melaleuca alternifolia 0,86 0,13 mn Illicum verum 0,93 0,10 k Illicum verum 0,70 0,11 n Rosa damascena 0,29 0,00 l Thymus vulgaris 0,14 0,00 o Thymus vulgaris 0,16 0,02 l Origano vulgare 0,14 0,00 o Origano vulgare 0,14 0,00 l Satureja hortensis 0,14 0,00 o Satureja hortensis 0,14 0,00 l Rosa damascena 0,14 0,00 o Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Matricaria recutita 18,70 1,04 a Salvia lavandulifolia 14,10 0,00 a Vetiveria zizanoides 17,60 0,51 b Citrus aurantum 13,28 0,20 b Amyris balsamifera 17,50 0,00 b Vetiveria zizanoides 11,60 0,49 c Citrus aurantum 14,58 0,22 c Amyris balsamifera 11,34 0,09 c Salvia lavandulifolia 14,10 0,00 c Matricaria recutita 10,97 0,21 c Citrus limon 10,44 0,00 d Citrus limon 9,57 0,53 d Salvia officinalis 10,30 0,68 d Salvia officinalis 7,73 0,37 e Eucalyptus globulus 8,73 0,00 e Ocimum basilicum 6,97 0,42 f Ocimum basilicum 7,65 0,00 f Eucalyptus globulus 5,82 0,26 g Rosmarinus officinalis 5,41 0,20 g Rosmarinus officinalis 3,36 0,08 h Cinnamomum zeylanicum 4,66 0,26 gh Piper nigrum 3,35 0,10 h Piper nigrum 4,37 0,19 hi Cinnamomum zeylanicum 3,18 0,00 hi Viola odorata 3,64 0,00 ij Citrus aurantium 2,70 0,09 ij Coriandrum sativum 2,98 0,13 jk Viola odorata 2,50 0,19 jk Lavandula angustifolia 2,85 0,09 jk Coriandrum sativum 1,96 0,11 kl Citrus aurantium 2,27 0,21 k Pelargonium graveolens 1,82 0,00 l Illicum verum 2,18 0,14 k Lavandula angustifolia 1,15 0,00 m Pelargonium graveolens 2,10 0,11 k Illicum verum 1,10 0,13 m Melaleuca alternifolia 1,19 0,05 l Melaleuca alternifolia 0,96 0,05 m Thymus vulgaris 0,19 0,02 m Rosa damascena 0,29 0,00 n Origano vulgare 0,14 0,00 m Origano vulgare 0,28 0,00 n Satureja hortensis 0,14 0,00 m Thymus vulgaris 0,14 0,00 n Rosa damascena 0,14 0,00 m Satureja hortensis 0,07 0,00 n Fusarium solani Fusarium verticillioides Fusarium tricinctum-Eq. Fusarium oxysporum Calend. )Prilog 3 182 Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Amyris balsamifera 15,54 0,34 a Matricaria recutita 23,80 1,04 a Vetiveria zizanoides 14,40 0,51 b Vetiveria zizanoides 20,64 0,47 b Matricaria recutita 11,05 0,00 c Amyris balsamifera 17,78 0,28 c Salvia lavandulifolia 10,90 0,38 c Salvia lavandulifolia 11,47 0,19 d Citrus aurantum 9,72 0,22 d Citrus aurantum 9,72 0,00 e Salvia officinalis 7,18 0,18 e Eucalyptus globulus 7,76 0,00 f Citrus limon 6,61 0,21 f Salvia officinalis 7,36 0,00 fg Ocimum basilicum 5,95 0,38 g Citrus limon 6,96 0,27 fg Eucalyptus globulus 4,85 0,00 h Ocimum basilicum 6,80 0,00 g Cinnamomum zeylanicum 3,60 0,11 i Viola odorata 4,89 0,51 h Piper nigrum 2,84 0,17 j Cinnamomum zeylanicum 4,66 0,26 h Rosmarinus officinalis 2,30 0,10 jk Lavandula angustifolia 4,60 0,00 h Pelargonium graveolens 2,28 0,00 jk Pelargonium graveolens 4,37 0,18 h Viola odorata 2,08 0,00 k Coriandrum sativum 4,25 0,00 h Illicum verum 1,83 0,16 k Piper nigrum 4,06 0,10 hi Citrus aurantium 1,74 0,14 kl Rosmarinus officinalis 3,36 0,08 ij Lavandula angustifolia 1,24 0,06 lm Citrus aurantium 3,05 0,14 j Coriandrum sativum 1,10 0,04 m Illicum verum 1,74 0,14 k Melaleuca alternifolia 0,91 0,00 m Melaleuca alternifolia 1,14 0,00 kl Rosa damascena 0,29 0,00 n Rosa damascena 0,64 0,04 lm Thymus vulgaris 0,14 0,00 n Origano vulgare 0,28 0,00 m Satureja hortensis 0,14 0,00 n Thymus vulgaris 0,19 0,02 m Origano vulgare 0,07 0,00 n Satureja hortensis 0,14 0,00 m Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Vetiveria zizanoides 22,40 0,00 a Amyris balsamifera 19,60 0,19 a Matricaria recutita 21,25 0,00 b Vetiveria zizanoides 14,40 0,00 b Amyris balsamifera 21,00 0,00 b Matricaria recutita 13,43 0,50 c Citrus aurantum 16,20 0,00 c Citrus aurantum 8,75 0,40 d Salvia lavandulifolia 13,72 0,38 d Ocimum basilicum 7,65 0,38 e Citrus limon 13,05 0,00 e Salvia lavandulifolia 7,10 0,10 ef Salvia officinalis 9,38 0,18 f Eucalyptus globulus 6,79 0,00 fg Eucalyptus globulus 8,73 0,26 g Citrus limon 6,26 0,43 g Lavandula angustifolia 6,81 0,23 h Salvia officinalis 4,60 0,00 h Ocimum basilicum 6,12 0,42 i Rosmarinus officinalis 4,10 0,13 hi Rosmarinus officinalis 5,41 0,08 j Coriandrum sativum 4,08 0,17 hi Piper nigrum 4,99 0,19 j Citrus aurantium 3,74 0,11 ij Cinnamomum zeylanicum 4,24 0,00 k Cinnamomum zeylanicum 3,71 0,00 ij Citrus aurantium 3,48 0,00 l Lavandula angustifolia 3,40 0,11 jk Coriandrum sativum 3,40 0,00 l Piper nigrum 3,12 0,00 kl Viola odorata 3,12 0,00 l Viola odorata 2,60 0,00 l Thymus vulgaris 2,07 0,28 m Melaleuca alternifolia 1,82 0,00 m Illicum verum 2,00 0,11 m Illicum verum 1,66 0,21 m Pelargonium graveolens 2,00 0,11 m Thymus vulgaris 0,99 0,05 n Melaleuca alternifolia 1,82 0,00 m Pelargonium graveolens 0,66 0,09 no Origano vulgare 1,16 0,00 n Satureja hortensis 0,62 0,07 no Satureja hortensis 0,96 0,05 no Rosa damascena 0,33 0,04 o Rosa damascena 0,62 0,04 o Origano vulgare 0,28 0,00 o Fusarium subglutinans Fusarium equiseti Fusarium oxysporum Maydis Fusarium semitectum )Prilog 3 183 Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Amyris balsamifera 21,00 0,00 a Amyris balsamifera 24,50 0,00 a Vetiveria zizanoides 20,80 0,00 a Matricaria recutita 23,46 0,95 b Citrus aurantum 14,58 0,00 b Vetiveria zizanoides 20,00 0,00 c Salvia lavandulifolia 14,10 0,00 c Citrus aurantum 15,23 0,40 d Citrus limon 13,05 0,00 d Salvia lavandulifolia 14,66 0,38 d Eucalyptus globulus 10,67 0,26 e Citrus limon 13,40 0,35 e Matricaria recutita 10,63 0,13 e Eucalyptus globulus 8,92 0,48 f Salvia officinalis 8,10 0,45 f Piper nigrum 7,18 0,10 g Ocimum basilicum 7,65 0,00 g Ocimum basilicum 6,80 0,00 g Cinnamomum zeylanicum 4,77 0,00 h Salvia officinalis 5,34 0,18 h Piper nigrum 3,90 0,00 i Cinnamomum zeylanicum 5,30 0,00 h Rosmarinus officinalis 3,53 0,16 j Coriandrum sativum 5,10 0,00 hi Coriandrum sativum 2,72 0,11 k Rosmarinus officinalis 5,08 0,16 hi Viola odorata 2,08 0,00 l Lavandula angustifolia 4,60 0,00 hi Pelargonium graveolens 1,82 0,00 l Citrus aurantium 4,35 0,00 i Lavandula angustifolia 1,38 0,00 m Viola odorata 3,12 0,00 j Melaleuca alternifolia 1,37 0,00 m Melaleuca alternifolia 1,82 0,00 k Illicum verum 1,22 0,05 m Pelargonium graveolens 1,55 0,11 k Citrus aurantium 1,18 0,05 m Illicum verum 1,22 0,05 k Thymus vulgaris 0,61 0,14 n Thymus vulgaris 1,18 0,00 k Rosa damascena 0,29 0,00 n Rosa damascena 0,31 0,02 l Origano vulgare 0,28 0,00 n Satureja hortensis 0,27 0,00 l Satureja hortensis 0,27 0,00 n Origano vulgare 0,14 0,00 l Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Citrus limon 12,70 0,65 a Matricaria recutita 25,16 0,64 a Citrus aurantum 12,15 0,00 ab Amyris balsamifera 18,48 0,17 b Matricaria recutita 11,99 0,39 b Citrus aurantum 16,20 0,00 c Vetiveria zizanoides 10,08 0,29 c Vetiveria zizanoides 14,40 0,00 d Amyris balsamifera 8,82 0,26 d Citrus limon 13,05 0,00 e Salvia lavandulifolia 7,33 0,19 e Salvia lavandulifolia 10,25 0,09 f Eucalyptus globulus 6,60 0,12 f Eucalyptus globulus 7,95 0,48 g Piper nigrum 6,47 0,10 f Salvia officinalis 6,99 0,37 h Ocimum basilicum 5,10 0,38 g Ocimum basilicum 5,95 0,00 i Salvia officinalis 4,78 0,18 gh Rosmarinus officinalis 5,17 0,16 j Cinnamomum zeylanicum 4,24 0,00 h Piper nigrum 4,99 0,19 j Rosmarinus officinalis 3,28 0,00 i Citrus aurantium 4,61 0,11 jk Lavandula angustifolia 3,04 0,11 i Cinnamomum zeylanicum 4,24 0,00 k Citrus aurantium 2,00 0,08 j Coriandrum sativum 3,23 0,10 l Viola odorata 1,66 0,25 jk Lavandula angustifolia 2,76 0,46 l Pelargonium graveolens 1,37 0,00 jkl Viola odorata 1,56 0,00 m Coriandrum sativum 1,23 0,12 kl Pelargonium graveolens 1,19 0,05 m Illicum verum 1,00 0,05 l Melaleuca alternifolia 1,05 0,06 m Melaleuca alternifolia 0,96 0,05 l Illicum verum 1,00 0,05 m Rosa damascena 0,29 0,00 m Rosa damascena 0,31 0,02 n Thymus vulgaris 0,28 0,00 m Origano vulgare 0,28 0,00 n Origano vulgare 0,14 0,00 m Thymus vulgaris 0,14 0,00 n Satureja hortensis 0,07 0,00 m Satureja hortensis 0,14 0,00 n Fusarium sporotrichioides Aspergilus flavus Aspergilus niger Penicillium sp. 䙀Ϥ Prilog 3 184 Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Matricaria recutita 28,73 0,62 a Matricaria recutita 26,18 0,42 a Amyris balsamifera 22,12 0,52 b Amyris balsamifera 24,22 0,17 b Citrus aurantum 16,36 0,30 c Vetiveria zizanoides 17,60 0,00 c Citrus limon 15,66 0,00 d Citrus aurantum 12,23 0,30 d Vetiveria zizanoides 14,32 0,29 e Salvia lavandulifolia 11,84 0,23 de Eucalyptus globulus 10,67 0,00 f Eucalyptus globulus 11,64 0,26 de Salvia lavandulifolia 9,40 0,00 g Citrus limon 11,48 0,64 e Piper nigrum 7,80 0,00 h Piper nigrum 6,86 0,38 f Cinnamomum zeylanicum 6,36 0,00 i Ocimum basilicum 6,80 0,00 f Ocimum basilicum 6,12 0,42 i Cinnamomum zeylanicum 6,04 0,13 g Salvia officinalis 5,70 0,18 i Salvia officinalis 5,52 0,29 g Citrus aurantium 4,79 0,00 j Coriandrum sativum 4,76 0,21 h Rosmarinus officinalis 3,85 0,36 k Citrus aurantium 4,18 0,11 hi Coriandrum sativum 3,66 0,17 kl Viola odorata 3,64 0,23 ij Lavandula angustifolia 3,31 0,09 kl Rosmarinus officinalis 3,44 0,16 j Viola odorata 3,12 0,23 l Lavandula angustifolia 3,13 0,34 j Illicum verum 2,18 0,00 m Illicum verum 2,18 0,00 k Melaleuca alternifolia 1,37 0,00 n Pelargonium graveolens 1,82 0,00 k Pelargonium graveolens 1,00 0,06 no Melaleuca alternifolia 1,00 0,09 l Thymus vulgaris 0,34 0,06 op Thymus vulgaris 0,41 0,13 lm Rosa damascena 0,31 0,02 op Rosa damascena 0,35 0,06 lm Origano vulgare 0,28 0,00 o Origano vulgare 0,14 0,00 m Satureja hortensis 0,14 0,00 o Satureja hortensis 0,14 0,00 m Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Matricaria recutita 21,25 0,00 a Amyris balsamifera 21,00 0,00 a Amyris balsamifera 21,00 0,00 a Vetiveria zizanoides 17,60 0,88 b Vetiveria zizanoides 17,92 0,32 b Matricaria recutita 17,34 0,34 b Citrus aurantum 12,15 0,00 c Citrus aurantum 15,23 0,40 c Eucalyptus globulus 10,09 0,24 d Citrus limon 11,14 0,11 d Salvia lavandulifolia 9,40 0,00 e Eucalyptus globulus 10,48 0,48 d Salvia officinalis 8,83 0,37 f Salvia lavandulifolia 7,90 0,38 e Citrus limon 8,00 0,43 g Ocimum basilicum 7,65 0,38 ef Ocimum basilicum 7,65 0,00 g Piper nigrum 6,86 0,10 fg Cinnamomum zeylanicum 6,78 0,26 h Cinnamomum zeylanicum 6,57 0,13 g Piper nigrum 6,01 0,10 i Rosmarinus officinalis 4,76 0,10 h Rosmarinus officinalis 5,58 0,10 i Salvia officinalis 3,86 0,18 i Lavandula angustifolia 4,78 0,18 j Viola odorata 2,91 0,51 j Citrus aurantium 4,53 0,26 j Lavandula angustifolia 2,58 0,11 jk Coriandrum sativum 3,74 0,09 k Coriandrum sativum 2,13 0,00 jkl Viola odorata 3,64 0,00 k Illicum verum 1,92 0,11 klm Pelargonium graveolens 2,28 0,00 l Melaleuca alternifolia 1,37 0,00 lmn Illicum verum 1,83 0,21 lm Citrus aurantium 1,09 0,07 mno Melaleuca alternifolia 1,37 0,00 m Pelargonium graveolens 0,62 0,07 nop Thymus vulgaris 0,34 0,06 n Rosa damascena 0,31 0,02 op Rosa damascena 0,31 0,02 n Origano vulgare 0,28 0,00 op Origano vulgare 0,14 0,00 n Thymus vulgaris 0,17 0,03 p Satureja hortensis 0,14 0,00 n Satureja hortensis 0,14 0,00 p Alternaria alternata Chaetomium sp. Gliocladium roseum Curvularia lunata )Prilog 3 185 Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Matricaria recutita 13,35 0,10 a Amyris balsamifera 24,50 0,00 a Vetiveria zizanoides 12,72 0,29 b Vetiveria zizanoides 20,80 0,00 b Citrus aurantum 12,15 0,00 c Matricaria recutita 15,98 0,42 c Amyris balsamifera 8,82 0,26 d Citrus aurantum 13,93 0,40 d Eucalyptus globulus 7,37 0,24 e Salvia lavandulifolia 13,72 0,38 d Citrus limon 6,09 0,28 f Citrus limon 13,40 0,21 d Salvia lavandulifolia 6,02 0,23 f Eucalyptus globulus 10,48 0,36 e Ocimum basilicum 5,10 0,00 g Piper nigrum 9,67 0,19 f Piper nigrum 4,06 0,10 h Salvia officinalis 8,10 0,45 g Salvia officinalis 3,59 0,09 i Ocimum basilicum 7,65 0,00 g Cinnamomum zeylanicum 3,50 0,13 i Cinnamomum zeylanicum 5,83 0,00 h Rosmarinus officinalis 3,44 0,16 i Rosmarinus officinalis 5,19 0,23 i Viola odorata 2,50 0,19 j Citrus aurantium 3,66 0,11 j Lavandula angustifolia 2,30 0,00 jk Lavandula angustifolia 3,13 0,23 j Pelargonium graveolens 1,91 0,09 kl Coriandrum sativum 2,38 0,17 k Coriandrum sativum 1,79 0,09 l Viola odorata 2,08 0,00 kl Illicum verum 1,22 0,05 m Pelargonium graveolens 1,91 0,09 kl Citrus aurantium 1,05 0,04 m Melaleuca alternifolia 1,82 0,00 kl Melaleuca alternifolia 0,91 0,00 m Illicum verum 1,57 0,11 l Thymus vulgaris 0,14 0,00 n Thymus vulgaris 0,34 0,06 m Origano vulgare 0,14 0,00 n Rosa damascena 0,31 0,02 m Satureja hortensis 0,14 0,00 n Origano vulgare 0,28 0,00 m Rosa damascena 0,14 0,00 n Satureja hortensis 0,14 0,00 m Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Amyris balsamifera 14,84 0,34 a Amyris balsamifera 15,96 0,26 a Matricaria recutita 14,79 0,31 a Vetiveria zizanoides 15,04 0,10 b Vetiveria zizanoides 14,32 0,29 ab Matricaria recutita 14,79 0,31 b Citrus aurantum 14,26 0,20 b Citrus aurantum 9,72 0,00 c Salvia lavandulifolia 9,02 0,38 c Salvia lavandulifolia 8,65 0,46 d Ocimum basilicum 5,95 0,00 d Citrus limon 6,96 0,24 e Piper nigrum 5,77 0,29 d Ocimum basilicum 5,95 0,00 f Citrus limon 5,74 0,21 d Piper nigrum 5,46 0,00 fg Eucalyptus globulus 4,85 0,00 e Eucalyptus globulus 5,24 0,24 g Cinnamomum zeylanicum 4,13 0,11 f Salvia officinalis 4,05 0,23 h Salvia officinalis 3,50 0,18 g Rosmarinus officinalis 2,90 0,29 i Citrus aurantium 2,79 0,11 h Cinnamomum zeylanicum 2,76 0,26 ij Rosmarinus officinalis 2,62 0,10 hi Pelargonium graveolens 2,37 0,09 jk Pelargonium graveolens 2,19 0,09 i Coriandrum sativum 2,21 0,08 k Viola odorata 1,56 0,23 j Citrus aurantium 1,92 0,11 kl Lavandula angustifolia 1,20 0,05 j Viola odorata 1,56 0,00 lm Melaleuca alternifolia 1,14 0,00 j Illicum verum 1,22 0,05 mn Coriandrum sativum 1,10 0,04 j Lavandula angustifolia 1,15 0,00 mn Illicum verum 1,00 0,05 j Melaleuca alternifolia 0,91 0,00 n Rosa damascena 0,19 0,05 k Thymus vulgaris 0,21 0,07 o Thymus vulgaris 0,14 0,00 k Rosa damascena 0,19 0,00 o Origano vulgare 0,14 0,00 k Satureja hortensis 0,14 0,00 o Satureja hortensis 0,14 0,00 k Origano vulgare 0,07 0,00 o Trichotechium roseum Phomopsis sp. Verticillium dahliae Trichoderma viride 䚐Ϥ Prilog 3 186 Type of oil Mean St. error Sign. Type of oil Mean St. error Sign. Amyris balsamifera 16,80 0,00 a Matricaria recutita 13,35 0,10 a Vetiveria zizanoides 16,16 0,10 b Vetiveria zizanoides 10,08 0,29 b Matricaria recutita 14,79 0,31 c Amyris balsamifera 8,61 0,21 c Citrus aurantum 10,37 0,40 d Citrus aurantum 8,10 0,26 d Salvia lavandulifolia 7,14 0,23 e Salvia lavandulifolia 5,60 0,00 e Citrus limon 6,96 0,24 e Eucalyptus globulus 5,43 0,24 ef Piper nigrum 6,24 0,00 f Citrus limon 5,22 0,00 ef Ocimum basilicum 5,95 0,38 f Ocimum basilicum 5,10 0,38 f Eucalyptus globulus 4,85 0,00 g Piper nigrum 3,90 0,00 g Cinnamomum zeylanicum 3,82 0,39 h Salvia officinalis 3,50 0,11 gh Salvia officinalis 3,68 0,00 h Cinnamomum zeylanicum 3,18 0,00 h Pelargonium graveolens 2,37 0,09 i Coriandrum sativum 2,38 0,10 i Viola odorata 2,29 0,39 i Rosmarinus officinalis 2,21 0,10 i Citrus aurantium 2,09 0,09 i Lavandula angustifolia 2,12 0,18 i Rosmarinus officinalis 1,89 0,10 i Pelargonium graveolens 2,00 0,11 ij Lavandula angustifolia 1,20 0,05 j Citrus aurantium 1,92 0,11 ij Coriandrum sativum 1,06 0,00 j Illicum verum 1,57 0,11 jk Melaleuca alternifolia 1,05 0,06 j Viola odorata 1,46 0,19 k Illicum verum 0,92 0,07 j Melaleuca alternifolia 0,91 0,00 l Rosa damascena 0,17 0,03 k Thymus vulgaris 0,17 0,03 m Thymus vulgaris 0,14 0,00 k Origano vulgare 0,14 0,00 m Origano vulgare 0,14 0,00 k Satureja hortensis 0,14 0,00 m Satureja hortensis 0,14 0,00 k Rosa damascena 0,14 0,00 m Phoma sp. Myrotechium verrucaria ) BIOGRAFIJA Tatjana Stević rođena je 12.02.1970.god. u Beogradu gde je završila osnovnu školu i gimnaziju. Na Biološkom fakultetu, Univerziteta u Beogradu, na Katedri za mikrobiologiju diplomirala je 1996.god. sa prosečnom ocenom 9.54. Diplomski rad pod nazivom „Primena AMES-ovog testa za detekciju bioantimutagenog dejstva ekstrakata žalfije (Salvia officinalis L.) odbranjen je sa ocenom 10. Od 1996. god. stipendista je Ministarstva za nauku i tehnologiju Republike Srbije pri Institutu za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“ i aktivno učestvuje u realizaciji naučnih projekata pomenutog Ministarstva. Iste godine upisala je poslediplomske studije na Katedri za mikrobiologiju, Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. Magistarska tezu pod nazivom „Bioantimutageni potencijal etarskog ulja i različitih frakcija gajene žalfije (S. officinalis L.)“ odbranila je 2000.god. Od marta 2003.godine zaposlena je u Instititutu za proučavanje lekovitog bilja „Dr Josif Pančić“ u Laboratoriji za mikrobiološku kontrolu gde rukovodi kontrolom mikrobiološke ispravnosti poluproizvoda i gotovih proizvoda Instituta u kome radi. Decembra 2009.god. odbranila je specijalistički rad pod nazivom „Mikrobiološka kontrola lekovitog bilja“. Doktorski rad upisala je 2006.god. na Biološkom fakultetu, Univeriteta u Beogradu. Kao autor ili koautor objavila je veći broj naučnih i stručnih radova koji su publikovani u međunarodnim ili domaćim časopisima, kao i niz saopštenja. Član je Srpskog društva mikrobiologa. Govori engleski jezik, a služi se ruskim jezikom. 䛠Ϥ Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Татјана Стевић ______________________ број уписа / _______________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом „Koмпаративна анализа агенаса за биолошку контролу патогених гљива изолованих са лековитих биљака“ • резултат сопственог истраживачког рада, • да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа, • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, _________________ _________________________ ) Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора ____ Татјана Стевић ________________________________ Број уписа ______/____________________________________________________ Студијски програм _Биологија микроорганизама__________________________ Наслов рада „Koмпаративна анализа агенаса за биолошку контролу патогених гљива изолованих са лековитих биљака“ Ментор ______Др Тања Берић и Др Катарина Шавикин__________________ Потписани ___Татјана Стевић_____________________________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, ________________________ _________________________ 䜰Ϥ Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: „Koмпаративна анализа агенаса за биолошку контролу патогених гљива изолованих са лековитих биљака“ која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, ________________________ ____________________