Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet Ninoslav M. Mitić Bioinformatička i glikobiohemijska analiza modularne organizacije CA125 antigena čoveka doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE Faculty of Biology Ninoslav M. Mitić Bioinformatic and glycobiochemical analysis of human CA125 antigen modular organization Doctoral Dissertation Belgrade, 2012 MENTORI: Dr Aleksandra Korać, redovni profesor, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu. Dr Miroslava Janković, nauĉni savetnik, Institut za primenu nuklearne energije – INEP, Univerzitet u Beogradu. ĈLANOVI KOMISIJE: Dr Aleksandra Korać, redovni profesor, Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu. Dr Miroslava Janković, nauĉni savetnik, Institut za primenu nuklearne energije – INEP, Univerzitet u Beogradu. Dr Bojana Milutinović, nauĉni saradnik, Institut za primenu nuklearne energije – INEP, Univerzitet u Beogradu. Datum Odbrane: Eksperimentalni deo ovog rada urađen je u Institutu za primenu nuklearne energije – INEP, Univerziteta u Beogradu, u okviru projekta 173010 - Strukturna heterogenost i efekti kompleksnih ugljenih hidrata (glikani) kao ključnih komponenti molekulskog raspoznavanja u biološkim sistemima, koji je finansiran od strane Ministarstva za prosvetu i nauku Republike Srbije. Ova doktorska disertacija izrađena je pod rukovodstvom dr Miroslave Janković, naučnog savetnika INEP-a, kojoj dugujem najveću zahvalnost za neizmerno strpljenje, razumevanje i veliku podršku tokom svih faza izrade ovog rada. dr Aleksandri Korać, redovnom profesoru Biološkog fakulteta, Univerziteta u Beogradu, zahvaljujem na savetima i ukupnoj oceni ovog rada. Zahvalnost dugujem i dr Bojani Milutinović, naučnom saradniku INEP-a, na korisnim sugestijama. Takođe se zahvaljujem svim naučnim, stručnim i tehničkim saradnicima instituta, koji su mi pružali podršku i pomoć tokom rada na ovoj tezi. Porodici se najtoplije zahvaljujem na ljubavi, razumevanju i pružanju oslonca, koji mi je toliko značio, tokom svih ovih godina. BIOINFORMATIĈKA I GLIKOBIOHEMIJSKA ANALIZA MODULARNE ORGANIZACIJE CA125 ANTIGENA ĈOVEKA REZIME CА125 antigen, poznat kao marker seroznog karcinoma ovarijuma, predstavlja ekstracelularni deo mucina 16 (MUC16), koji nastaje njegovom proteolitiĉkom degradacijom. МUC16 pripada grupi transmembranskih proteina tipa I, i eksprimiran je u velikom broju embrionalnih, ali i adultnih tkiva. Njegovu primarnu strukturu karakteriše prisustvo tri regiona: N-terminalni region i region tandemskih ponovaka, koji su smešteni ekstracelularno, i C-terminalni region, koji se sastoji od transmembranskog dela i kratkog citoplazmatskog repa. Ekstracelularni region je intenzivno glikozilovan, a u intracelularnom regionu se nalazi potencijalno mesto fosforilacije. Fosforilacija predstavlja signal za proteolizu i oslobaĊanje ekstracelularnog dela molekula (СА125 antigen), koji se kao takav može detektovati u razliĉitim telesnim teĉnostima. Biološka uloga MUC16/CA125, još uvek nije razjašnjena. Dosadašnja ispitivanja funkcije MUC16 (membranska forma) su, uglavnom, bila bazirana na in vitro model sistemu ćelija ovarijalnog karcinoma, dok su literaturni podaci o aktivnosti CA125 antigena (solubilna forma) veoma retki. Solubilna forma predstavlja funkcionalni analog i kompetitor membranskoj formi i, u cirkulaciji, ona prva dospeva u kontakt sa razliĉitim tipovima normalnih ili patološki izmenjenih ćelija, ali ne postoje eksperimentalni dokazi o mogućem uticaju na njihovu adhezivnost, kao i imunomodulatorna svojstva. U ovom radu je ispitivana modularna organizacija MUC16/CA125 na bioinformatiĉkom i glikobiohemijskom nivou, sa ciljem da se bliže definišu biološki kapacitet i posebnosti prezentacije ovog molekula u kontekstu interaktoma ĉoveka. Bioinformatiĉka analiza, kao deo strategije za otkrivanje moguće biološke uloge MUC16/CA125, do sada nije korišćena u ispitivanjima ovog antigena. Pored toga, u kontekstu diskretnih bioloških funkcija, bez obzira na izuzetan biomedicinski znaĉaj, ne postoje eksperimentalni podaci o interakcijama MUC16/CA125 sa specifiĉnim klasama receptora na ćelijama krvnog sistema. In silico analiza modularne organizacije MUC16/CA125, vršena je na osnovu podataka koji su preuzeti sa UniProtKB baze podataka, a koji se odnose na molekul izolovan iz ćelijske linije ovarijalnog karcinoma ĉoveka, OVCAR-3. Bioinformatiĉka analiza je obuhvatila: odreĊivanje homologije (korišćenjem BLAST, Basic Local Alignment Search Tool alatke); ispitivanje prisustva obrazaca, strukturnih motiva i konzerviranih domena (korišćenjem baza podataka kao što su Bgee: a dataBase for Gene Expression Evolution i Gene Ontology, CDD, ELM, BLOCKS, InterProScan, MyHits i iProClass); odreĊivanje fiziĉko- hemijskih osobina, globularnosti i odstupanja od pretpostavljene tercijarne strukture (korišćenjem ProtParam, ProtScale i GLOBPLOT v2.3 alatki); i predviĊanje funkcije pomoću alatki koje koriste nekoliko programa: JAFA, ProtFun 2.2 i GeneOntology. Glikobiohemijska analiza je obuhvatila ispitivanje uticaja CA125 antigena na adhezivnost i agregabilnost eritrocita, kao i moguće interakcije sa razliĉitim tipovima leukocitnih lektina tj. sigleka (Siglec - sialic acid-binding immunogobulin (Ig)-like lectin) i receptora sliĉnih lektinima tipa C (selektini, DC-SIGN - dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing non- integrin 1, MMR - macrophage mannose receptor). Ispitivanje efekta CA125 antigena na eritrocite ĉoveka odreĊivano je u testovima na ĉvrstoj fazi ili primenom svetlosne mikroskopije. Interakcija CA125 antigena sa leukocitnim receptorima ispitivana je pomoću lektinskog- i imunoblota, kao i u testovima vezivanja i inhibicije na ĉvrstoj fazi, sa imobilisanim antigenima. Glikobiohemijskom analizom su, pored antigena iz ćelijske linije ovarijalnog karcinoma ĉoveka (clCA125), bili obuhvaćeni i antigen kancerskog porekla iz pleuralne teĉnosti (pfCA125) kao i antigen fetalnog porekla (pCA125), koji se sintetiše tokom trudnoće. Rezultati in silico analize proteinske sekvence MUC16/CA125, stavili su ovaj molekul u kontekst modularnih proteina sa anotiranom ulogom u adheziji i srodnim procesima. Uvid u sekvence koje pokazuju sliĉnost sa sekvencom MUC16/CA125, pokazao je da se one, uglavnom, nalaze u ekstracelularnom regionu MUC16, koji je bogat serinom i treoninom. Ove sliĉnosti se nisu mogle povezati sa anotiranim domenima iz dostupnih baza podataka, osim parcijalno, ali statistiĉki znaĉajno sa BLLF1, multidomenom karakteristiĉnim za glikoproteine omotaĉa virusa iz familije Herpesviridae. Bioinformatiĉka analiza je ukazala i na moguću korelaciju funkcionalnih aktivnosti, koje se pripisuju domenima bogatim serinom/treoninom kod identifikovanih proteina u okviru ispitivanih taksona, i moguće funkcije CA125 antigena. Na osnovu dobijenih rezultata, uloga CA125 antigena u procesima adhezije bi mogla ukljuĉiti i interakcije posredstvom konzerviranih proteinskih sekvenci, odgovornih za jonski transport, i interakcije sa šećernim supstratima. Polazeći od mucinske prirode CA125 antigena, kao i fizioloških stanja u kojima je njegova koncentracija u serumu povećana, u prvom delu glikobiohemijske analize, ispitan je uticaj CA125 antigena na eritrocite ĉoveka. Dobijeni rezultati su ukazali da pCA125 i pfCA125 umereno povećavaju agregaciju eritrocita, i uspešno inhibiraju njihovu adheziju. Za razliku od njih, clCA125 je pokazao neznatan uticaj na modulaciju ovih osobina eritrocita. Sumarni rezultati drugog dela analize, koja se odnosila na interakcije sa leukocitnim receptorima, pokazali su da CA125, kao ligand, može stupiti u interakcije sa razliĉitim tipovima proteina koji vezuju sijalinsku kiselinu. Pokazano je da postoje specifiĉni obrasci vezivanja sigleka za ispitivane CA125 antigene, kojima se ovi antigeni, uspešnije, razlikuju u odnosu na njihovo poreklo, nego što se to ĉini na osnovu obrazaca vezivanja biljnih lektina, takoĊe specifiĉnih za sijalinsku kiselinu. Najuoĉljivija razlika je zapažena u odnosu na ligandni kapacitet CA125 antigena fetalnog porekla prema sigleku-7, prisutnom na dendritskim ćelijama, NK (natural killer cell) ćelijama, monocitima i CD8+ T ćelijama i clCA125 antigena kancerskog porekla prema sigleku-9 i sigleku-10, prisutnim na B ćelijama, NK ćelijama, monocitima, neutrofilima i CD8+ T ćelijama. Za razliku od sigleka, sva tri ispitivana selektina: L-selektin, E-selektin i P-selektin su, na dozno-zavisan naĉin, interagovali sa pfCA125 i u manjoj meri pCA125, ali ne i clCA125. Pored toga, zapaženo je i da je P-selektin reagovao na znatno nižim koncentracijama nego L- i E-selektin. Na osnovu uoĉenog visokog afiniteta P-selektina, CA125 antigen bi pre stupio u interakcije sa aktiviranim endotelnim ćelijama ili krvnim ploĉicama, na kojima je ovaj selektin prisutan, nego sa ćelijama na kojima su prisutni drugi tipovi selektina. Ispitivanje interakcije CA125 antigena i DC-SIGN, koji je eksprimiran na površini dendritskih ćelija (DC) i koji vezuje manan i visoko-manozne glikane kao i glikane sa terminalnim Le x /Le y /Le a /Le b antigenima, pokazalo je da on prepoznaje pCA125 i pfCA125 antigen. Rezultati inhibicije su ukazali da je vezivanje DC-SIGN za pCA125 zavisno od prisustva glikana bogatih manozom, za razliku od vezivanja pfCA125, koje je nezavisno od prisustva N- ili O-glikana, što bi moglo uticati na njegove diskretne receptorske funkcije. Manozni receptor makrofaga (MMR), koji je prisutan na makrofagama i DC i koji vezuje terminalnu manozu i fukozu i SLe x , nije reagovao ni sa jednim od ispitivanih CA125 antigena. Receptori sliĉni lektinima tipa C imaju važnu ulogu u imunskom sistemu, u smislu posredovanja u interakcijama tipa ćelija-ćelija, tj. u meĊusobnom kontaktu leukocita ili u njihovom kontaktu sa endotelom, kao i u vezivanju patogena. Promene u glikozilaciji liganada za receptore sliĉne lektinima tipa C, direktno utiĉu na njihovu aktivnost i specifiĉnost i imaju važne posledice na razvoj, preživljavanje i reaktivnost ćelija krvnog i imunskog sistema. Rezultati ovoga rada ukazuju da bi razlike u strukturi/glikozilaciji CA125 antigena, koje se vezuju za posebna fiziološka i patološka stanja, mogle menjati njegov uticaj na ćelije krvnog sistema ĉoveka i imati znaĉajne biomedicinske posledice u razliĉitim mikrosredinama. Dalji uvid u prirodu i mehanizme multifunkcionalnosti CA125 antigena zahteva interdisciplinarni pristup baziran na kompleksnim interakcijama koje su posredovane razliĉitim strukturnim domenima. Kljuĉne reĉi: CA125 antigen, in silico analiza, glikobiohemijska analiza, eritrociti, adhezija, leukocitni receptori, sigleci, selektini, DC-SIGN, manozni receptor makrofaga Nauĉna oblast: Biologija Uža nauĉna oblast: Glikobiologija UDK broj: 57.087:[577.112.85:[611.651:616-006.04]](043.3) BIOINFORMATIC AND GLYCOBIOCHEMICAL ANALYSIS OF HUMAN CA125 ANTIGEN MODULAR ORGANIZATION ABSTRACT CA125 antigen, a well known tumour marker for serous ovarian cancer, is an extracellular part of the mucin 16 (MUC16) molecule. This antigen arises from proteolytic degradation of MUC16, a type I transmembrane protein, expressed in both embrional and adult tissue. The primary structure of MUC16 consists of three characteristic parts: an N-terminal region and a series of tandem repeats, which are located extracellularly, and a C-terminal region, which consists of the transmembrane part and a short cytoplasmic tail. The extracellular peptide is extensively glycosylated, and there is a potential phosphorylation site in the intracellular chain. Phosphorylation is a signal for proteolysis and release of the extracellular part of the molecule (CA125 antigen), which can be detected as such in various body fluids. The biological role of MUC16/CA125 is not yet understood. Previous investigations of MUC16 (membrane form) functions were generally based on in vitro cell model systems of ovarian cancer, whereas published data on the activity of CA125 antigen (soluble form) are very rare. The soluble form is a functional analog and competitor to the membrane form, and, in the circulation, it first contacts different types of normal or pathologically altered cells. However, there is no experimental evidence on its possible impact on their adhesion nor immunomodulatory properties. In this work, the modular organization of human CA125 antigen was analyzed bioinformatically and glycobiochemically, aiming at closer definition of the biological capacity and presentation of this molecule in the context of the human interactome. As part of a strategy to detect a possible biological role for MUC16/CA125, bioinformatics analysis has never been used in studies of this antigen. In addition, in the context of discrete biological functions, regardless of its great biomedical importance, there are no experimental data on the interactions of MUC16/CA125 with specific classes of receptors on cells of the blood system. The modular organization of MUC16/CA125, was analyzed in silico using data taken from the UniProtKB database, which refers to a molecule isolated from the human ovarian cancer cell line, OVCAR-3. Bioinformatic analysis included: determination of homology (using BLAST, Basic Local Alignment Search Tool Tool); investigation of patterns, structural motifs and conserved domains (using databases such as Bgee: a database for Gene Expression and Gene Ontology Evolution, CDD, ELM, BLOCKS, InterProScan and MyHits iProClass); determination of physical and chemical properties, globularity and deviations from the assumed tertiary structure (using ProtParam, ProtScale and GLOBPLOT v2.3 tools); and function prediction using tools that employ several programs: JAFA, ProtFun 2.2 and GeneOntology. Glycobiochemical analysis comprised examination of the influence of CA125 on adhesion and aggregation of erythrocytes, as well as on interactions with different types of leukocyte lectins, namely siglecs [sialic acid-binding immunogobulin (Ig)-like lectin] and C-type lectin-like receptors [selectins, dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing non-integrin 1 (DC-SIGN) and macrophage mannose receptor (MMR)]. The effect of CA125 antigen on human erythrocytes was determined using solid phase tests and light microscopy. The interaction of CA125 with leukocyte receptors was investigated employing lectin-blot and immunoblot, as well as binding and inhibition solid phase assays. Cancer antigen isolated from human pleural fluid (pfCA125) and pregnancy-associated antigen (pCA125) were included in the glycobiochemical analysis in addition to antigen from the human ovarian carcinoma cell line (clCA125). The results of in silico analysis placed MUC16/CA125 in the context of modular proteins with an annotated role in adhesion-related processes. They pointed to similarities within extracellular serine/threonine rich regions of MUC16 to protein sequences expressed in evolutionarily distant taxa. No relation to annotated domains from available databases appeared, except for BLLF1, a multidomain characteristic of virus envelope glycoproteins of the Herpesviridae family. Bioinformatics analysis also pointed to a possible correlation between functional activities, which are attributed to serine/threonine rich domains of proteins identified in the studied taxa, and possible CA125 antigen function. Based on these results, the role of CA125 antigen in adhesion processes could involve interactions through conserved protein sequences responsible for ion transport, and for interactions with sugar substrates. Considering the mucin nature of CA125 antigen, as well as physiological conditions in which its concentration in serum is increased, the effect of this antigen on human erythrocytes was investigated in the first part of glycobiochemical analysis. The results showed that pCA125 and pfCA125 moderately increased aggregation of erythrocytes, and successfully inhibited their adhesion. In contrast, clCA125 showed little to no modulation of these properties. The second part of the glycobiochemical analysis related to interactions with leukocyte receptors. This showed that, as a ligand, CA125 may interact with different types of proteins that bind sialic acid. Siglecs were found to have specific binding patterns, which more effectively distinguished CA125 antigens of fetal from those of cancer origin, in contrast to the binding patterns of sialic acid-specific plant lectins. The most obvious difference was the ligand capacity of pCA125 antigen towards siglec-7, expressed on dendritic cells, NK (natural killer cells), monocytes and CD8+ T cells, and clCA125 towards siglec-9 and siglec-10 on B cells, NK cells, monocytes, neutrophils and CD8+ T cells. Unlike siglecs, all three investigated selectins: L-selectin, E-selectin and P-selectin, interacted in a dose-dependent manner with pfCA125, and to a lesser extent with pCA125, but not with clCA125. Moreover, P-selectin reacted at significantly lower concentrations than L- or E-selectin. Thus, CA125 antigen would preferentially interact with activated endothelial cells or platelets expressing P-selectin, compared to cells expressing the other types of selectin. The interaction of CA125 antigen and DC-SIGN, which is specific for mannan, high- mannose glycans and glycans with terminal Le x / Le y / Le a / Le b antigens was studied. DC- SIGN is expressed on dendritic cells (DC) and recognized pCA125 and pfCA125 antigen. Inhibition of DC-SIGN binding to pCA125 was dependent on the presence of mannose-rich glycans, in contrast to the binding to pfCA125, which was not affected by the presence of N- or O-linked glycans, all which can modify their discrete receptor functions. Macrophage mannose receptor (MMR), which is expressed on macrophages and DC, and which binds terminal mannose, fucose and sialyl Le x , did not react with any of the tested CA125 antigens. C-type lectin-like receptors play an important role in the immune system, mediating in cell- cell interactions, i.e. contacts between leukocytes or between leukocytes and endothelium, and in the binding of pathogens. Glycosylation changes in ligands for C-type lectin-like receptors directly influence their activity and specificity and have important effects on the development, survival and reactivity of cells of the blood and immune systems. Based on the results of this study, differences in the structure/glycosylation of CA125 antigens associated with different physiological or pathological conditions, could alter their influence on the human blood cells, and have important biomedical implications in different microenvironments. Further insight into the nature and mechanisms of CA125 multifunctionality requires an interdisciplinary approach, based on complex interactions that are mediated by its different structural domains. Key words: CA125 antigen, in silico analysis, glycobiochemical analysis, erythrocytes, adhesion, leukocyte receptors, siglecs, selectins, DC-SIGN, macrophage mannose receptor Scientific field: Biology Special topic: Glycobiology UDC number: 57.087:[577.112.85:[611.651:616-006.04]](043.3) 1. UVOD ________________________________________________________________ 1 1.1 Mucini ____________________________________________________________ 1 1.1.1. Mucini: opšte odlike i klasifikacija _________________________________ 1 1.1.1.1. Sekretorni mucini ____________________________________________ 2 1.1.1.2. Transmembranski mucini _____________________________________ 4 1.1.1.3. Evolucija sekretornih i transmembranskih mucina _________________ 6 1.1.1.4. MUC16 (CA125) _____________________________________________ 8 1.1.1.4.1 Muc16 gen _______________________________________________ 9 1.1.1.4.2 MUC16: Struktura i organizacija domena _____________________ 10 1.1.1.5. Funkcionalna svojstva mucina ________________________________ 12 1.1.1.5.1. Funkcije mucina u normalnim fiziološkim uslovima _____________ 13 1.1.1.5.1.1. Izgradnja fizičke barijere i održavanje homeostaze lokalne mikrosredine __________________________________________________ 13 1.1.1.5.1.2. Oslobađanje aktivnih molekula iz mukusnih slojeva __________ 14 1.1.1.5.1.3. Odbrana od patogenih mikroorganizama __________________ 15 1.1.1.5.1.4. Signalna transdukcija _________________________________ 16 1.1.1.5.2 Funkcija mucina u kanceru _________________________________ 18 1.2. Bioinformatika ____________________________________________________ 23 1.2.1. Pojam i definicija ______________________________________________ 23 1.2.2. Ciljevi bioinformatike __________________________________________ 23 1.2.3. Oblasti bioinformatike __________________________________________ 24 1.2.4. Primena bioinformatike _________________________________________ 25 1.2.5. Ograniĉenja bioinformatike _____________________________________ 26 1.2.6. Baze podataka _________________________________________________ 26 1.2.6.1. Biološke baze podataka_______________________________________ 29 1.2.6.2 Alatke u bioinformatici _______________________________________ 33 2. CILJ ________________________________________________________________ 35 3. MATERIJALI I METODE ______________________________________________ 37 3.1. Materijali ________________________________________________________ 37 3.1.1. Reagensi ______________________________________________________ 37 3.1.2. Uzorci biološkog materijala ______________________________________ 39 3.1.2.1 Uzorci placenti prvog trimestra _________________________________ 39 3.1.2.2. Eritrociti __________________________________________________ 40 3.2. Metode __________________________________________________________ 40 3.2.1. In silico analiza ________________________________________________ 40 3.2.1.1. Ispitivanje homologije proteinske sekvence _______________________ 41 3.2.1.2. Ispitivanje modularne organizacije MUC16 ______________________ 41 3.2.1.3. Ispitivanje fizičko-hemijskih osobina, globularnosti i odstupanja od pretpostavljene tercijarne strukture ___________________________________ 43 3.2.1.4. Predikcija funkcije MUC16 ___________________________________ 44 3.2.2. Glikobiohemijska analiza________________________________________ 44 3.2.2.1. Gel filtracija ekstrakta placente na koloni Sefaroza 4B _____________ 44 3.2.2.2. Test agregacije eritrocita _____________________________________ 45 3.2.2.3. Test adhezije eritrocita _______________________________________ 45 3.2.2.4. Test hemolize _______________________________________________ 46 3.2.2.5. Testovi vezivanja na čvrstoj fazi ________________________________ 46 3.2.2.5.1. Vezivanje biljnih lektina za imobilisane CA125 antigene _________ 46 3.2.2.5.1.1. Vezivanje SNA (Sambucus nigra agglutinin) i MAA II (Maackia amurensis agglutinin II) _________________________________________ 46 3.2.2.5.1.1.1. Perjodatni tretman_________________________________ 47 3.2.2.5.1.2. Vezivanje LTL (Lotus tetragonolobus lektin) _______________ 47 3.2.2.5.2. Vezivanje rekombinantnih molekula tipa Fc himera za imobilisane CA125 antigene _________________________________________________ 48 3.2.2.5.2.1. Vezivanje rekombinantnih humanih sigleka ________________ 48 3.2.2.5.2.2. Vezivanje rekombinantnih humanih selektina i DC-SIGN _____ 49 3.2.2.5.2.2.1. Inhibicija vezivanja selektina i DC-SIGN ______________ 50 3.2.2.5.3. Vezivanje rekombinantnog humanog manoznog receptora makrofaga (MMR) za CA125 antigen __________________________________________ 50 3.2.2.6. CA125 – imunoreaktivnost viralnih antigena _____________________ 51 3.2.2.7. Obeležavanje CA125 antigena radioaktivnim izotopom joda (125I) ____ 51 3.2.2.8. Dot-blot ___________________________________________________ 52 3.2.2.8.1. Lektinski dot-blot ________________________________________ 52 3.2.2.8.2. Imuno dot-blot __________________________________________ 53 4. REZULTATI _________________________________________________________ 54 4.1. Bioinformatiĉka analiza sekvence MUC16 _____________________________ 54 4.1.1. Ispitivanje homologije sekvence MUC16 ___________________________ 54 4.1.1.1. BLAST analiza _____________________________________________ 54 4.1.1.2. CLUSTALW analiza _________________________________________ 58 4.1.2. Ispitivanje prisustva domena i strukturnih motiva ___________________ 59 4.1.2.1. CDD analiza _______________________________________________ 59 4.1.2.2. BLOCKS analiza ____________________________________________ 63 4.1.2.3. Prosite i iProClass analiza ____________________________________ 64 4.1.2.4. MyHits analiza _____________________________________________ 66 4.1.3. Fiziĉko-hemijske osobine, globularnost i odstupanje od pretpostavljene tercijarne strukture proteinske sekvence MUC16 ________________________ 67 4.1.3.1. ProtParam _________________________________________________ 67 4.1.3.2. ProtScale __________________________________________________ 67 4.1.3.3. GLOBPLOT _______________________________________________ 70 4.1.4. Predikcija funkcije MUC16 ______________________________________ 71 4.1.4.1. ProtFun analiza ____________________________________________ 71 4.1.4.2. JAFA analiza ______________________________________________ 71 4.1.4.3. PFP analiza ________________________________________________ 75 4.1.4.4. GeneOntology analiza _______________________________________ 78 4.2. Glikobiohemijska analiza ___________________________________________ 80 4.2.1. Uticaj CA125 antigena na eritrocite ĉoveka _________________________ 80 4.2.1.1. Uticaj CA125 antigena na agregaciju eritrocita ___________________ 80 4.2.1.2. Uticaj CA125 antigena na adheziju eritrocita _____________________ 83 4.2.1.3. Hemoliza eritrocita u prisustvu CA125 antigena __________________ 87 4.2.2. Interakcija CA125 antigena sa lektinima i receptorima lektinskog tipa eksprimiranim na ćelijama krvnog sistema ĉoveka _______________________ 88 4.2.2.1. Vezivanje sigleka za CA125 antigen ____________________________ 88 4.2.2.2. Vezivanje receptora lektinskog tipa C za CA125 antigen ____________ 94 4.2.2.2.1. Vezivanje selektina za CA125 antigen ________________________ 94 4.2.2.2.2. Vezivanje DC-SIGN za CA125 antigen _______________________ 97 4.2.2.2.3. Vezivanje MMR za CA125 antigen __________________________ 102 5. DISKUSIJA _________________________________________________________ 103 5.1. Bioinformatiĉka analiza ___________________________________________ 103 5.2. Glikobiohemijska analiza __________________________________________ 108 6. ZAKLJUČCI ________________________________________________________ 127 7. LITERATURA _______________________________________________________ 131 1. UVOD 1 1.1 Mucini 1.1.1. Mucini: opšte odlike i klasifikacija Mucini su glikoproteini velike molekulske mase (masa mucina se kreće i preko 106 Da), sa visokim sadržajem glikana, pretežno O-tipa. Oni predstavljaju glavnu proteinsku komponentu mukusa - površinskog, zaštitnog sloja epitela (Hollingsworth i Swanson, 2004). Sintetišu se kao monomeri, u formi apomucina, a zatim se posttranslaciono modifikuju intenzivnom glikozilacijom. Zreli molekuli mucina sastoje se iz dva regiona (slika 1). Jedan region ĉine amino- i karboksi-terminalni krajevi, koji su slabo glikozilovani, ali su bogati cisteinom, koji najverovatnije uĉestvuje u stvaranju disulfidnih veza unutar i izmeĊu monomera (Kufe, 2009). Drugi region ĉini centralni deo molekula, koji predstavlja glavnu odliku mucina, kojom se oni razlikuju od drugih molekula (Kufe, 2009). Njega karakteriše veliki broj tandemskih ponovaka (od 10 do 80 aminokiselina), sa visokim sadržajem prolina, treonina i serina (PTS domeni). U okviru PTS domena, na serinskim i treoninskim ostacima, dolazi do intenzivne O-glikozilacije. Glikani N-tipa mogu biti, takoĊe, prisutni, ali u znatno manjoj meri. Slika 1. Šematski prikaz strukture monomera mucina. 2 Familija humanih mucina (MUC) se sastoji od proteina oznaĉenih kao MUC1 – MUC21, i svi oni su podklasifikovani u sekretorne i transmembranske mucine. Sekretorni mucini (npr. MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6 i MUC19) formiraju fiziĉku barijeru u formi mukoznog gela. On pruža zaštitu epitelnim ćelijama, koje oblažu respiratorni i gastrointestinalni trakt, kao i površine kanala, koji se nalaze kod organa kao što su jetra, grudi, pankreas i bubrezi. Transmembranski mucini (npr. MUC1, MUC4, MUC13 i MUC16), imaju jedan region koji prolazi kroz membranu i ogromne ekstracelularne domene sa O-glikozilovanim tandemskim ponovcima, koji doprinose strukturi protektivnog mukoznog gela. 1.1.1.1. Sekretorni mucini Postoje dve klase sekretornih mucina: mucini koji formiraju gel (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6 i MUC19) i mucini koji ne formiraju gel (MUC7, MUC9). Njihova uloga se sastoji u zaštiti ćelija od razliĉitih uticaja spoljašnje sredine (bakterije, toksini uneti u organizam, reaktivni oblici kiseonika - ROS, ili proteolitiĉki enzimi u gastrointestinalnom traktu), a mogu i suprimirati inflamatorni odgovor (slika 2). Mucini koji formiraju gel su veliki polimerni molekuli, ĉiji polipeptidni deo sadrži i preko 5000 aminokiselina. Za razliku od njih, mucini koji ne formiraju gel, su monomeri i imaju manje molekulske mase (Moniaux i sar., 2001, 2004; Van Seunigen, 2008). Sekretorni mucini su kodirani grupom gena koji se nalaze na hromozomskom lokusu 11p15, i smatra se da dele zajedniĉko poreklo sa von Willebrand-ovim faktorom (vWF), glikoproteinom koji omogućava adheziju krvnih ploĉica za zidove krvnih sudova (Desseyn i sar., 1998, 2000). 3 Slika 2. Distribucija sekretornih mucina. (Preuzeto iz Donald W. Kufe, Nature Reviews Cancer 2009.) Njihova polimerizacija je omogućena prisustvom vWF domena tipa C ili D, kao i domena cisteinskih ĉvorova, koji su odgovorni za dimerizaciju u endoplazmatiĉnom retikulumu. Pored toga, ova grupa mucina ima glikozilovane PTS domene, kao i SEA domene. SEA domen je dobio naziv prema proteinima kod kojih je prvi put identifikovan (Sea urchin sperm protein, Enterokinaza i Agrin). On se sastoji od oko 120 aminokiselina i uglavnom se javlja kod proteina koje karakteriše visok nivo glikozilacije, a koji su po svojoj funkciji veoma razliĉiti (Bork i Patthy, 1995). Pretpostavlja se da on ima regulatornu funkciju ili funkciju vezivanja boĉnih ugljenohidratnih lanaca. Najbolje prouĉen sekretorni mucin je MUC2. On je protein gastrointestinalne mukoze, a dovodi se u vezu sa inflamatornim procesima i kancerom. Pokazano je da on sadrži veliki, veoma glikozilovan, centralno postavljen PTS domen, kao i domene bogate cisteinom u 4 amino- i karboksi-terminalnom regionu. Karboksi-terminalni region ovog molekula doprinosi formiranju homodimera u endoplazmatiĉnom retikulumu, i nakon O-glikozilacije u Goldžijevom aparatu, MUC2 formira trimere, preko disuflidnih veza na amino-terminusu, koji su otporni na proteaze (Asker i sar., 1998; Herrmann i sar., 1999; Godl i sar., 2002; Lidell i sar., 2003). Smatra se da MUC2 ima ulogu u suprimiranju inflamatornih procesa u crevnom traktu i da to može inhibirati razvoj intestinalnih tumora (Velcich i sar., 2006). 1.1.1.2. Transmembranski mucini U transmembranske mucine spadaju MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17 i MUC20 (Moniaux i sar., 2001, 2004; Van Seunigen, 2008). Njihova veliĉina varira izmeĊu 334 aminokiselina (MUC15) do više od 22000 aminokiselina (MUC16). Ovi mucini imaju transmembranski domen i relativno kratak citoplazmatski rep, a SEA domeni su karakteristiĉno locirani izmeĊu O-glikozilovanih PTS ponovaka i transmembranskog domena. MUC4, za razliku od drugih transmembranskih mucina, ne poseduje SEA domene, ali ima nidogenski domen, kao i AMOP domen (naĊen kod većeg broja proteina a koji korelira sa njihovim adhezivnim svojstvima) i vWF domen u ekstracelularnom regionu (Duraisamy i sar., 2006). MUC13 pokazuje strukturnu sliĉnost sa MUC4, a sadrži N-terminalne tandemske ponovke, tri domena sliĉna EGF-u (epidermal growth factor, epidermalni faktor rasta) i SEA domen. Domen sliĉan EGF-u, sadrže i MUC3, MUC12 i MUC17 (Duraisamy i sar., 2006). Za razliku od njih, MUC16 poseduje veći broj SEA domena, ali ne i domene sliĉne EGF-u. 5 Aberantna ekspresija MUC4, MUC13 i MUC16 se povezuje sa razliĉitim metastatskim promenama kod ĉoveka. Transmembranski mucini se nalaze na apikalnoj membrani epitelnih ćelija, tako da se njihovi glikozilovani tandemski ponovci bogati prolinom, serinom i treoninom (PTS domeni) pružaju iza glikokaliksa (ugljenohidratnog sloja na površini ćelija koji se sastoji od oligosaharidnih komponenata boĉnih lanaca glikoproteina i glikolipida prisutnih u membrani ćelija) (slika 3). Slika 3. Transmembranski mucini. (Preuzeto iz Donald W. Kufe, Nature Reviews Cancer 2009.) MUC1 i MUC4, a moguće i MUC13, su heterodimerni molekuli. Translacijom njihovih RNK nastaju pojedinaĉni polipeptidi, koji se isecaju, i nastaju amino- i karboksi-terminalne podjedinice, koje formiraju stabilni kompleks u kom nisu meĊusobno kovalentno vezane. 6 N-terminalne podjedinice ovih mucina, koje sadrže PTS domene, se mogu osloboditi od transmembranskih podjedinica, koje kao receptori mogu signalizirati prisustvo inflamacije ili drugih promena, u unutrašnjost ćelije. Iako i MUC16 podleže autoproteolitiĉkom isecanju, nije poznato da li se MUC16 eksprimira kao heterodimerni kompleks, ili se oslobaĊanje N-terminalnog regiona MUC16 odigrava nakon njegovog pozicioniranja na apikalnoj membrani ćelije (Kufe, 2009). Jedan od najbolje prouĉenih transmembranskih mucina je MUC1. On je lokalizovan na apikalnoj membrani normalnih sekretornih epitelnih ćelija (Kufe i sar., 1984). Neoplastiĉnom transformacijom ovih ćelija, i gubitkom njihove polarizovanosti, ekspresija MUC1 se drastiĉno povećava. Pokazano je da razlika izmeĊu normalne i aberantne forme MUC1, ne leži u promenama u sekvenci proteina, već u njegovoj glikozilaciji, koja je promenjena kod MUC1, koga sintetišu tumorske ćelije. Glikozilacija tandemskih ponovaka aberantne forme MUC1 je takva da se sastoji od samo jednog šećera, GalNAc (poznatog kao Tn antigen), ili od dva šećera, Galβ1,4GalNAc (poznatog kao T antigen) (Finn, 2008). 1.1.1.3. Evolucija sekretornih i transmembranskih mucina Ĉlanovi familije humanih mucina klasifikuju se prema homologiji u njihovoj zajedniĉkoj biološkoj strukturi tj. PTS domenu, a ne prema njihovoj evoluciji od zajedniĉkih predaĉkih gena. Evolucija mucina i njihovih domena prikazana je na slici 4. Dostupni podaci ukazuju da su se sekretorni mucini pojavili rano tokom evolucije metazoa, i da su geni MUC5AC i MUC5B evoluirali od zajedniĉkog predaĉkog gena MUC5ACB. Gen MUC5ACB je nastao od predaĉkog gena od kog je nastao i MUC2 gen (slika 4a) (Duraisamy i sar., 2006, 2007; Lang i sar., 2007). Sekvence MUC1 gena, koje se nalaze 7 uzvodno od njegovih SEA domena, kao i MUC1 citoplazmatski domen (MUC1-CD), evoluirali su od MUC5B gena (slika 4b). Slika 4. Evolucija sekretornih i transmembranskih mucina. (Preuzeto iz Donald W. Kufe, Nature Reviews Cancer 2009.) CT - C-terminalni domen cisteinski ĉvor; ED - ekstracelularni domen; EGF - epidermalni faktor rasta; TIL - domen bogat cisteinom koji je sliĉan inhibitoru tripsina; TM - transmembranski domen; TR - tandemski ponovci; vWF - von Willebrand-ov faktor; HSPG2 - heparan-sulfat proteoglikan 2; VWD - vWF domen tipa D; VWC - vWF domen tipa C; NIDO – nidogenski domen; AMOP - adhezioni domen naĊen kod MUC4 i drugih proteina; SEA - Sea urchin sperm protein, Enterokinaza i Agrin. 8 Na osnovu analize sekvenci SEA domena, naĊeno je da su oni kod MUC1 i MUC13 evoluirali od heparan-sulfat proteoglikana 2 (HSPG2), dok su kod MUC16 evoluirali od agrina (Duraisamy i sar., 2006). Nidogenski domen (NIDO) MUC4 je evoluirao od pretka zajedniĉkog za nidogenski i adhezioni domen naĊen kod MUC4 i drugih proteina (AMOP). Osim NIDO, kod MUC4 naĊen je i vWF domen tipa D (VWD), koji vodi poreklo od proteina 2 koji sadrži Sushi domen (SUSD2) (slika 4c) (Duraisamy i sar., 2006). 1.1.1.4. MUC16 (CA125) Mucin 16 (MUC16), poznat još i kao CA125 antigen (kancer antigen 125), je primarno identifikovan kao antigen koga prepoznaje antitelo OC125. Zahvaljujući doktorima Robertu Bast i Robertu Knap, kao i njihovom istraživaĉkom timu, 1981. godine, tehnikom somatske hibridizacije ćelija slezine miša imunizovanih ćelijskom linijom ovarijalnog karcinoma OVCA 433, dobijeno je ovo monoklonsko antitelo (Bast i sar., 1981). Studije koje su usledile, sugerisale su da je CA125 antigen po svojoj strukturi ugljenohidratni epitop, sijalilsaharid u sastavu mucina ili membranski epitop, a njegova ekspresija je dovedena u vezu sa epitelnim kancerom ovarijuma (Hanish i sar., 1985; Nustad i sar., 1998; Yin i sar., 2001). Na osnovu rezultata dobijenih 2001. godine, CA125 antigen je svrstan u familiju mucina i oznaĉen kao MUC16 (Yin i sar., 2001). MUC16 je transmembranski protein, koji je u ekstraćelijskom regionu intenzivno glikozilovan, tako da 24-28 % molekulske mase ĉine ugljeni hidrati, a danas je poznato da CA125 antigen predstavlja njegov ekstraćelijski deo. 9 1.1.1.4.1 Muc16 gen Muc16 gen je lokalizovan na hromozomu 19 (19p13.2) a ukupna dužina gena iznosi približno 179 kbp (slika 5). Slika 5. Šematski prikaz hromozoma 19. Položaj gena Muc16. (preuzeto sa http://www.genecards.org) Smatra se da Muc16 gen najverovatnije sadrži 90 introna, ali postoje neslaganja u vezi sa ukupnim brojem egzona koji ulaze u njegov sastav. Ovo je posledica odsustva/prisustva nekih delova sekvenci (naroĉito u ponavljajućim regionima) u dostupnim genomskim bazama podataka. Amino-, odnosno karboksi-terminalni domen MUC16 su kodirani sa po 9 egzona smeštenih na 5’, odnosno 3’ kraju gena. Pretpostavlja se da 5 sukcesivnih egzona kodira svaki tandemski ponovak centralnog regiona, dok su dva poslednja egzona nepreklapajuća i nikad ne podležu transkripciji u isto vreme. Muc16 gen podleže alternativnom splajsingu, i smatra se da, na taj naĉin, može nastati osam razliĉitih transkripata, koji mogu kodirati osam izoformi proteina. Ekspresija Muc16 gena je, najverovatnije, regulisana putem dva, uzvodno postavljena gena. 10 1.1.1.4.2 MUC16: Struktura i organizacija domena U humanom MUC16 izdvajaju se tri regiona: N-terminalni region i region tandemskih ponovaka, koji su smešteni ekstracelularno, i C-terminalni region, koji se sastoji od transmembranskog dela i kratkog citoplazmatskog repa. S obzirom da mu se N- i C- terminusi nalaze na suprotnim stranama ćelijske membrane, kao i da sadrži jedan transmembranski domen, MUC16 pripada grupi transmembranskih proteina tipa I. Prema dostupnim literaturnim podacima, u sastav MUC16 ulaze 22152 aminokiseline (O’Brien i sar., 2001, 2002; Perez i Gipson, 2008). U ekstracelularnom regionu MUC16 dolazi do intenzivne glikozilacije a prisutni su N-glikani i, naroĉito O-glikani. Fosforilacijom intracelularnog C-terminusa, indukuje se proteolitiĉko isecanje i oslobaĊanje ekstracelularnog domena u ekstracelularni prostor. Sekretorne forme MUC16 mogu meĊusobno interagovati, preko interlanĉanih disulfidnih veza, što dovodi do formiranja velikog matriksa nalik gelu, u ekstracelularnom prostoru ili u lumenu sekretornih kanala. MUC16 može imati 7-60 parcijalno konzerviranih tandemskih ponovaka, u zavisnosti od alternativnog splajsinga, tj. može postojati u većem broju izoformi. Svaki tandemski ponovak se sastoji od 156 aminokiselina (Maeda i sar., 2004). U svakom tandemskom ponovku nalaze se dva konzervirana cisteinska ostatka, koji formiraju disulfidni most, stvarajući tako petlju od 19 aminokiselina, ĉime se stabilizuje struktura MUC16 (O'Brien i sar., 2001). U regionu tandemskih ponovaka su identifikovani razliĉiti proteinski domeni kao što su: SEA, ankirinski (ANK) i domeni bogati leucinom (leucine rich repeat - LRR), kao i mesto podložno proteolizi, koje se nalazi bliže ćelijskoj membrani. SEA domen obiĉno sadrži 120 aminokiselina, od kojih je 80 visoko konzervirano. MUC16, 11 za razliku od drugih mucina, sadrži veći broj SEA domena. Ovi domeni pokazuju znatno veći stepen meĊusobne strukturne homologije nego homologije sa istim domenima kod drugih mucina (Maeda i sar., 2004). Jedan od identifikovanih SEA domena, kod MUC16, smešten je van regiona tandemskih ponovaka (Yin i Lloyd, 2001). Trodimenzionalna struktura SEA domena, dobijena NMR spektroskopijom, otkriva da je ovaj domen organizovan u vidu jedinstvenog α/β sendviĉa, sa N- i C-terminusima na istoj strani molekula. α/β sendviĉ se sastoji iz dva sloja. Prvi sloj se sastoji od ĉetiri β-naborane antiparalelne ploĉe i jednog kratkog α-heliksa, dok se drugi sloj sastoji od dva dugaĉka α- heliksa i dve kratke β-naborane ploĉe (Maeda i sar., 2004). Na β ploĉi SEA domena se nalaze epitopi koje prepoznaju monoklonska antitela prema CA125 antigenu. Postoje dva dominantna epitopa, oznaĉena kao A i B, koja prepoznaju OC125 i M11 antitelo. Ostala monoklonska antitela, koja prepoznaju ove epitope, oznaĉavaju se kao antitela sliĉna OC125, tj. antitela sliĉna M11. Ankirinski domeni (ankirinski ponovci, ANK) su jedni od najrasprostranjenijih motiva u prirodi, koji uĉestvuju u interakcijama protein-protein. Oni se sastoje od oko 33 aminokiseline, koje formiraju dva α-heliksa i jednu β ploĉu (Gorina i sar., 1996). Ovi ponovci su naĊeni kod velikog broja funkcionalno razliĉitih proteina, kao što su proteini koji zapoĉinju transkripciju, regulatori ćelijskog ciklusa, proteini citoskeleta, transporteri jona i proteini koji uĉestvuju u signalnoj transdukciji. Domeni bogati leucinom (leucin rich repeats, LRR) su proteinski strukturni motivi, koji formiraju α/β potkovicu-nabor, i sastoje se od ponavljajućih nizova od 20-30 aminokiselina (Kobe i Deisenhofer, 1994; Enkhbayar i sar., 2004). α/β potkovica ima β paralelne ploĉe 12 postavljene ka unutrašnjosti potkovice i seriju spoljašnje postavljenih α-heliksa. Na površinama α-heliksa i β ploĉa dominiraju hidrofilni boĉni lanci aminokiselina, dok region izmeĊu α-heliksa i β ploĉa ĉini hidrofobno jezgro bogato leucinom. Smatra se da je uloga ovih domena u ostvarivanju interakcija protein-protein (Kobe i Kajava, 2001; Gay i sar., 1991). Na region tandemskih ponovaka nastavlja se transmembranski deo. Ovaj deo je hidrofoban, zahvaljujući visokom sadržaju lizina. Intracelularni deo C- terminusa ĉini 256 aminokiselina, meĊu kojima je i sekvenca RRRKKEGEY, za koju se zna da je potencijalno mesto fosforilacije. Jedan od tirozinskih ostataka u citoplazmatskom repu nalazi se u okviru sekvence YTNP. Ovaj motiv je homolog Src-2 domenu, koji je prisutan u proteinima koji uĉestvuju u signalnoj transdukciji (Hansen i sar., 1995). 1.1.1.5. Funkcionalna svojstva mucina Organizacija i struktura mucinskog polipeptida, u normalnim, kao i njihove modifikacije u patološkim stanjima, odražavaju veliki broj mogućih funkcija. Osnovna uloga mucina je da održavaju homeostazu, i na taj naĉin omogućavaju ćelijama da opstanu pri promenama uslova spoljašnje sredine. Zahvaljujući strukturi i biohemijskom sastavu, mucini doprinose zaštiti površine, kao i regulaciji lokalne mikrosredine ćelija. Molekularni sastav i formiranje struktura višeg reda, omogućava im i specijalizovane funkcije, kao što je npr. selektivna difuzija HCl u želucu. Osim toga, mucini mogu uĉestvovati u signalnoj transdukciji i patogenezi kancera, naroĉito adenokarcinoma. 13 1.1.1.5.1. Funkcije mucina u normalnim fiziološkim uslovima 1.1.1.5.1.1. Izgradnja fizičke barijere i održavanje homeostaze lokalne mikrosredine Primarna funkcija velikog broja mucina je da zadrže vodu na površinama, koje su izložene sredinskim uticajima, a nisu zaštićene slojevima nepropusnim za vlagu, kao što su slojevi u koži. Intenzivna sijalinizacija u PTS domenima, koja doprinosi jakom negativnom naelektrisanju, omogućava im veliki kapacitet za vezivanje vode. Pored toga što uĉestvuju u održavanju hidratacije, mucini predstavljaju fiziĉku barijeru za mikroorganizme i nerastvorne materije, a i konfigurišu jonski sastav, koncentraciju i dostupnost pojedinih molekula (Hollingsworth i Swanson, 2004). Na ovaj naĉin, mucini održavaju homeostazu lokalne mikrosredine. Njihova funkcija na površini ćelije sastoji se i u selekciji molekula, koja nastaje kao rezultat regulacije efluksa i influksa specifiĉnih molekula. Ova funkcija mucina se pripisuje njihovim tandemskim ponovcima. Zahvaljujući svojoj stehiometriji, oni omogućavaju lokalno koncentrisanje neutralnih i naelektrisanih oligosaharidnih struktura, koje mogu funkcionisati kao jonoizmenjivaĉi ili mogu omogućiti ili inhibirati difuziju molekula. Na površini epitela želuca, npr., mukus (prvenstveno MUC5AC i MUC6) formira zaštitni sloj i predstavlja barijeru koja selektivno omogućava difuziju HCl (Bhaskar i sar., 1992). Epitelne ćelije želuca luĉe bikarbonatne jone, koji se zadržavaju u sloju mukusa, i na taj naĉin se stvara gradijent od pH 2 u lumenu želuca, do pH 6-7 na površini epitelnih ćelija (Bhaskar i sar., 1992). HCl interaguje sa slojem mukusa želuca na razliĉite naĉine, u zavisnosti od pH vrednosti. Injekciranjem HCl u sloj mukusa, na vrednostima iznad pH 4, dolazi do formiranja kanala ili struktura u obliku prstiju kroz koje HCl prolazi, dok na vrednostima ispod pH 4, HCl ne može da prodre kroz mukusni sloj (Bhaskar i sar., 14 1992). U želucu, ove karakteristike mucina omogućavaju da HCl, koju sintetišu žlezde, proĊe kroz sloj mukusa u lumen, a u isto vreme, predstavljaju barijeru koja onemogućava da izluĉena HCl dospe nazad do epitelnih ćelija želuca. Na ovu funkciju mucina znaĉajno utiĉe njihov nivo sijalinizacije, kao i prisustvo drugih proteina i komponenata u samom mukusu, koji mogu modifikovati njegove biohemijske osobine (Tanaka i sar., 1997; Fujita i sar., 2000). Povećanjem sijalinizacije mucina, u mukusnom sloju želuca, smanjuje se propustljivost protona a povećava se protok HCl. 1.1.1.5.1.2. Oslobađanje aktivnih molekula iz mukusnih slojeva Kompleksni mucinski gelovi mogu da interaguju i zadržavaju biološki aktivne molekule iz okolne sredine. Po oslobaĊanju, koje može biti uzrokovano oštećenjem epitela, ovi molekuli mogu pokrenuti inflamatorne procese, popravku oštećenih slojeva mucina ili zaceljivanje epitela. Najbolje okarakterisan primer ovih molekula su faktori tri petlje – trefoil factors (TFFs), relativno konzervirana familija peptida koja sadrži motiv tri petlje – trefoil motif (TF) (Sands i Podolsky, 1996; Sommer i sar., 1999). TF motiv nastaje kada se formiraju tri petlje, intralanĉanim disulfidnim vezama izmeĊu šest konzerviranih cisteinskih ostataka, u konfiguracijama 1-5, 2-4, 3-6. Većina ćelija epitela, koje produkuju mucine, eksprimira TFFs, ukljuĉujući epitelne ćelije respiratornog i gastrointestinalnog trakta, pljuvaĉnih žlezda, oĉne površine i uterusa (Hoffmann i Jagla, 2002). TFFs se vezuju za D domene mucina i, zahvaljujući svojim biološkim osobinama, doprinose viskozitetu mukusa i obezbeĊuju zaštitu epitelnim ćelijama (Hoffmann i Jagla, 2001; Thim i sar., 2002). Po oslobaĊanju, TFFs pokreću rekonstituciju oštećenog mukusa na mestima njegovog oštećenja (Tran i sar., 1999; Taupin i sar., 1999). Specifiĉne biološke aktivnosti, koje se 15 povezuju sa TFFs su: anti-apoptoza, podsticanje ćelijske pokretljivosti, kao i podsticanje diferencijacije ćelija (Wright i sar., 1997; Lalani i sar., 1999). Smatra se da mucini i mukusni gelovi, pored TFFs, mogu da vezuju i otpuštaju citokine, faktore rasta i diferencijacije, kao i medijatore koji uĉestvuju u inflamaciji. Pokazano je da interleukini ĉoveka IL-1, IL-4, IL-6 i IL-7, poseduju specifiĉne lektinske aktivnosti (vezivanje ugljenih hidrata) koje im omogućavaju da se vežu za oligosaharide koji su prisutni na PTS domenima mucina (Cebo i sar., 2001). Generalno, molekuli koji se vezuju za mucine, mogu predstavljati biohemijsku barijeru pojedinim ćelijama koje migriraju, a njihovo prisustvo ĉini i osnovu za pokretanje imunskog odgovora. Indikatori oštećenja mukusa, mogu biti i sami fragmenti mucina. Ovi fragmenti mogu imati odreĊene biološke aktivnosti, kao npr., fragment MUC7, koji poseduje široki spektar anti- gljiviĉnih aktivnosti. Pojedine komponente drugih mucina mogu, verovatno, iskazivati kako probiotiĉku aktivnost, prema normalnoj flori, tako i antimikrobnu aktivnost prema odreĊenim patogenima (Bobek i sar., 2003; Situ i sar., 2003). 1.1.1.5.1.3. Odbrana od patogenih mikroorganizama Mucini mogu ispoljavati antibakterijska svojstva na više razliĉitih naĉina. Prostorno organizovan spektar antitela, koja se nalaze u mukusu, doprinosi odbrani od patogenih mikroorganizama. Pokazano je da su ugljenohidratne strukture sekretorne komponente (SC) imunoglobulina (Ig) A, odgovorne za njegovu lokalizaciju u taĉno odreĊenim delovima mukusa (Phalipon i sar., 2002). Ova lokalizacija, kao i biohemijska stabilnost kojoj SC doprinosi, neophodna je za antimikrobnu aktivnost sekretornog IgA. 16 Dostupni podaci ukazuju da terminalni domeni nekih mucina imaju specifiĉan afinitet za površinu bakterijske ćelije, što može biti povezano sa pokretanjem imunskog odgovora protiv vezanih mikroorganizama. Mehaniĉka svojstva mucina i mukusa omogućavaju im i da, fiziĉki, zarobe potencijalne patogene. 1.1.1.5.1.4. Signalna transdukcija Mucini mogu da uĉestvuju u signalnoj transdukciji putem promene konformacije ili promene dostupnosti mesta vezivanja liganada, u njihovim ekstracelularnim domenima (Hollingsworth i Swanson, 2004). Pokazano je da, npr., ekstracelularni domeni MUC4 sliĉni EGF-u, mogu interagovati sa ERBB2 (receptor epidermalnog faktora rasta 2, poznat još kao NEU i HER2) (slika 6a). Ovo vezivanje, kao i vezivanje citoplazmatske podjedinice MUC4 za ERBB2, povećava fosforilaciju ERBB2 i indukuje signale ćelijske diferencijacije preko KIP1 inhibitora ciklin-zavisne kinaze (poznatog i kao p27) (Jepson i sar., 2002). Interakcija MUC4-ERBB2, takoĊe, onemogućava interakciju ERBB2 sa ERBB3, koji signalizira ćelijsku proliferaciju zavisnu od MAPK (mitogen-activated protein kinase) signalnih puteva (Zhu i sar., 2000). Aktivacija MUC1, fosforilacijom njegovog citoplazmatskog repa, takoĊe, dovodi do promena u MAPK signalizaciji (slika 6b). Pored toga, MUC1 može modulisati signalni put β-katenina (slika 6c), za koga se zna da reguliše nekoliko gena, koji se dovode u vezu sa proliferacijom i diferencijacijom ćelija. Nakon proteolitiĉkog isecanja citoplazmatskog repa MUC1, on se zajedno sa β-kateninom može transportovati u nukleus ćelije, i na taj naĉin uticati na transkripciju proteina preko TCF/LEF i/ili drugih transkripcionih faktora. MUC1 može uticati na β-katenin signalni put 17 i zadržavanjem β-katenina u citosolu, što spreĉava njegovu interakciju sa kadherinima ili drugim molekulskim kompleksima. Slika 6. Mucini u signalnoj transdukciji. (Preuzeto iz Hollingsworth i Swanson, Nature Reviews Cancer 2004) EGF, epidermalni faktor rasta; ERBB, receptor epidermalnog faktora rasta (ERBB ili EGFR - Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene) KIP1, inhibitor ciklin-zavisne kinaze. Nakon oštećenja DNK ili anti-mitogenskih signala, KIP1 se vezuje za ciklin-zavisne komplekse kinaza, i inhibira njihovu funkciju, ĉime se zaustavlja ćelijski ciklus. Vezivanje MUC4 za ERBB2 povećava ekspresiju KIP1, što može dovesti do zaustavljanja ćelijskog rasta MAPK signalni put. Mitogenom-aktiviran protein kinazni signalni put se sastoji od nekoliko kinaza, koje reaguju na brojne spoljašnje stimuluse, kao što su faktori rasta, faktori diferencijacije i dr. TCF-LEF, transkripcioni faktori β-katenin ima kljuĉnu ulogu u prenosu morfogenetskih signala, i reaguje sa nekoliko kadherina (adhezionih molekula na površini membrane) kao i sa citoplazmatskim repom MUC1. 18 1.1.1.5.2 Funkcija mucina u kanceru Ćelije kancera, naroĉito adenokarcinoma, imaju veoma povećanu ekspresiju aberantnih formi mucina. One nastaju tokom transformacije tumorskih ćelija, kao posledica deregulacije ekspresije proteinskih jezgara mucina, i/ili enzima koji ih modifikuju. Ekspresija razliĉitih oligosaharidnih struktura na tumorskim ćelijama, zajedno sa raznovrsnom glikozilacijom proteinskih jezgara mucina, dovodi do izmenjene interakcije sa velikim brojem potencijalnih liganada (Hollingsworth i Swanson, 2004). Mucini doprinose biološkim osobinama tumora na nekoliko naĉina. Oni kontrolišu lokalnu mikrosredinu tumorskih ćelija, regulišu njihovu diferencijaciju i proliferaciju, utiĉu na inflamatorne procese i imunski odgovor, a uĉestvuju i u supresiji, i/ili invaziji i metastazi. Ćelije kancera koriste mucine, na sliĉan naĉin, kao što ih koriste i normalne epitelne ćelije: kao zaštitnu barijeru, ili za kontrolu lokalne molekularne mikrosredine. Mukusni slojevi tumorskih ćelija zadržavaju biološki aktivne molekule, kao što su faktori rasta ili citokini, što im omogućava proliferaciju. Aberantne forme transmembranskih mucina tumorskih ćelija, takoĊe, kontrolišu lokalnu mikrosredinu, tako što utiĉu na interakcije izmeĊu ćelija ili izmeĊu receptora i solubilnih liganada. Ekstracelularni domeni mucina mogu se, npr., vezati za proteine ili receptore na istoj ćeliji i tako blokirati pristup drugih liganada ovim molekulima. Ovakve autokrine interakcije se dešavaju izmeĊu EGF domena mucina i ERBB, izmeĊu oligosaharidnih struktura na tandemskim ponovcima i molekula sliĉnih lektinima na površini ćelije, i izmeĊu proteinskih domena razliĉitih mucina i drugih molekula. Na tandemskom ponovku MUC1, tako, postoji mesto koje vezuje ICAM-1, intracelularni adhezioni molekul-1 (ĉlan superfamilije imunoglobulinskih adhezionih 19 molekula, naĊen kod epitelnih ćelija i pojedinih limfocita i monocita) (Brinkman-Van der Linden i Varki, 2000; Hayashi i sar., 2001; McDermott i sar., 2001; Jepson i sar., 2002). Znaĉajno povećana produkcija aberantno glikozilovanog MUC1 je naĊena kod nekoliko razliĉitih tipova adenokarcinoma. Prve studije MUC1, pokazale su da je njegov citoplazmatski rep fosforilovan, i da promene u ovoj fosforilaciji korelišu sa razlikama u ćelijskoj adheziji (Zrihan-Lichti sar., 1994). Fragment citoplazmatskog repa MUC1 molekula, u asocijaciji sa β-kateninom, kao što je već pomenuto, može se transportovati u nukleus ćelija, što sugeriše da MUC1 može direktno uticati na status transkripcionih ko- aktivatora β-katenina. Potencijalni uticaj mucina na supresiju nastanka i rasta tumora, pokazan je na primeru inaktivacije genskog produkta mišijeg Muc2 gena, koji se, uglavnom, eksprimira u crevima. Njegova inaktivacija dovodi do nastanka sojeva miševa, od kojih 65 % spontano razvija tumor tankog creva, kolona i rektuma (Velcich i sar., 2002). Invazija i metastaza tumora obuhvata veliki broj procesa u kojima se ostvaruju kontakti izmeĊu tumorskih ćelija koje vrše invaziju, i okolnih tumorskih ćelija i strome. Oni su omogućeni koordiniranom kontrolom ekspresije mucina, proteaza i drugih molekula. Mucini doprinose invaziji i metastazi, tako što konfigurišu adhezivne i anti-adhezivne osobine tumorskih ćelija, a mogu modulisati i proteolitiĉku aktivnost. Transmembranski mucini, na apikalnoj površini normalnih epitelnih ćelija, omogućavaju adheziju izmeĊu ćelija i izmeĊu ćelija i ekstraćelijskog matriksa (ECM) (slika 7a). Kod tumorskih ćelija, aberantne forme mucina, nisu rasporeĊene samo na apikalnoj strani ćelija, već po njihovoj celoj površini (slika 7b). Ovim se, na dva naĉina, može blokirati adhezija tipa ćelija-ćelija i 20 ćelija-ECM. S jedne strane, cis interakcije izmeĊu transmembranskih mucina i receptora koji posreduju u adheziji, mogu onemogućiti njihovu interakciju sa drugim ćelijama. S druge strane, transmembranski mucini mogu, sternim smetnjama, nespecifiĉno blokirati adheziju preko njihovih velikih, glikozilovanih tandemskih ponovaka. Slika 7. Transmembranski mucini u interakcijama ćelija-ćelija i ćelija-ECM. (Preuzeto iz Hollingsworth i Swanson, Nature Reviews Cancer 2004) Adhezivne, kao i anti-adhezivne osobine transmembranskih mucina su najbolje prouĉene na primeru MUC1. Pokazano je da glikozilovani tandemski ponovci MUC1, putem sternih smetnji doprinose njegovoj anti-adhezivnoj funkciji (Wesseling i sar., 1996). Ovo su potvrdili i nalazi da povećana ekspresija MUC1, smanjuje interakcije tipa ćelija-ćelija i 21 ćelija-ECM (Ligtenberg i sar., 1992; van de Wiel-van Kemenade i sar., 1995; Kondo i sar., 1998). MUC1 može uĉestvovati u adhezionim procesima i vezivanjem za ICAM-1, E- selektin i sigleke (siglecs, sialic-acid-binding immunoglobulin like lectins) (Zhang i sar., 1996; Nath i sar., 1999; Brinkman-Van der Linden i Varki, 2000; McDermott i sar., 2001; Hayashi i sar., 2001). Aberantne forme mucina, takoĊe, mogu uĉestvovati u inflamaciji i imunskom odgovoru. Pokazano je da MUC1 može da indukuje apoptozu aktiviranih T ćelija, kao i da ima imunosupresivni efekat na njihovu proliferaciju (Gimmi i sar., 1996; Agrawal i sar., 1998a). MUC1 eksprimiraju aktivirane T ćelije i dendritske ćelije, a pokazano je da pojedine populacije T ćelija Muc1-deficijentnih miševa, imaju defektan razvoj (Agrawal i sar., 1998b; Wykes i sar., 2002). Generalno, povećano koncentrisanje solubilnih mucina, na mestima oko tumora ili na metastatskim lezijama, može praviti barijeru (visoka koncentracija adhezionih liganda i supresornih citokina) za leukocite, i na taj naĉin onemogućiti njihovu aktivaciju i prilaz tumoru (Chan i sar., 1999; Kim i sar., 1999; Cohen i sar., 2001). Pored ovoga, visoke koncentracije solubilnih mucina u krvotoku, limfnom ili intestinalnom tkivu, mogu uticati na mobilnost i aktivaciju leukocita, u šta su ukljuĉene interakcije izmeĊu selektina i oligosahardnih struktura mucina (slika 8) (Chan i sar., 1999; Kim i sar., 1999; Cohen i sar., 2001). 22 Slika 8. Anti-imunski i anti-inflamatorni efekti mucina u kanceru. (Preuzeto iz Hollingsworth i Swanson, Nature Reviews Cancer 2004) Na ovaj naĉin, može se spreĉiti prilaz antigen-prezentujućih ćelija, koje su neophodne za aktivaciju imunskog odgovora, ili efektornih ćelija (NK ćelija ili citotoksiĉnih T limfocita), koje su neophodne da unište tumorske ćelije, ciljnom tkivu (slika 8). 23 1.2. Bioinformatika 1.2.1. Pojam i definicija Bioinformatika (engleski: bioinformatics ili computational biology) je oblast nauke koja prouĉava molekularnu biologiju pomoću statistike i kompjutera. Ona se bavi informatiĉkim osnovama, kao i beleženjem, organizacijom i analizom bioloških podataka. Prvobitno, bioinformatika se koristila u genomici i genetici, prvenstveno, za ĉuvanje i obradu rezultata sekvenciranja DNK, ali se danas koristi za mapiranje i analizu sekvenci DNK i proteina, za poreĊenje razliĉitih sekvenci DNK i proteina, prouĉavanje njihove funkcije i interakcije, kao i za modeliranje i prouĉavanje 3-D strukture proteina. Simulacija i proraĉun bioloških eksperimenata i podataka se naziva i in silico (“pomoću kompjutera”) proraĉun. Pojam bioinformatika su prvi put uveli Paulien Hogeweg i Ben Hesper 1978. godine istažujući procese u biološkim sistemima (Hogeweg, 1978; Hogeweg i Hesper, 1978). 1.2.2. Ciljevi bioinformatike Osnovni cilj bioinformatike je da omogući bolje razumevanje ćelije i njenog funkcionisanja na molekulskom nivou. Bioinformatika treba da organizuje podatke tako da istraživaĉi mogu lako da doĊu do postojećih informacija, kao i da objave nove podatke; da razvije nove metode i alatke koje pomažu u istraživanju i analizi podataka; kao i da omogući upotrebu ovih alatki za analiziranje podataka i interpretaciju rezultata na biološki znaĉajan naĉin. 24 1.2.3. Oblasti bioinformatike Bioinformatika obuhvata tehnologije koje koriste kompjutere za ĉuvanje, nalaženje, manipulaciju i distribuciju informacija/podataka vezanih za biološke makromolekule (DNK, RNK, proteini) (Luscombe i sar., 2001). Da bi se ispitalo kako se normalna aktivnost ćelija menja u razliĉitim fiziološkim stanjima, kao npr. kod bolesti, biološki podaci se moraju grupisati kako bi se dobila šira slika. Oblasti bioinformatike su se, stoga, razvijale, tako, da danas obuhvataju analizu i interpretaciju razliĉitih podataka, ukljuĉujući nukleotidne i proteinske sekvence, proteinske domene i proteinske strukture. Glavne oblasti istraživanja u bioinformatici su: analiza sekvenci, anotacija genoma, „computational“ evoluciona biologija, analiza genske ekspresije i regulacije, analiza proteinske ekspresije, analiza mutacija, komparativna genomika, modeliranje bioloških sistema, predviĊanje funkcije i strukture proteina kao i molekularnih interakcija. Važne poddiscipline bioinformatike obuhvataju razvoj i implementaciju alatki koje omogućavaju uspešno uvoĊenje razliĉitih tipova informacija, njihovo korišćenje i klasifikaciju, kao i razvoj novih algoritama (matematiĉkih formula) i statistike sa kojima se može: a) pristupiti odnosima izmeĊu ĉlanova u okviru niza podataka (npr. metode lociranja gena unutar sekvence); b) predvideti struktura i/ili funkcija proteina; c) vršiti grupisanje proteinskih sekvenci u familije srodnih sekvenci. 25 1.2.4. Primena bioinformatike Bioinformatika je našla široku primenu u osnovnim genomskim i molekularno-biološkim istraživanjima, u biomedicinskim istraživanjima, kao i u biotehnologiji, forenzici i poljoprivredi. Bioinformatika ima znaĉajnu primenu u analizama sekvenci. Od kako je, 1977. godine, sekvenciran fag Φ-X174, sekvence DNK hiljade organizama su dekodirane i saĉuvane u bazama podataka (Sanger i sar.,1977). Informacije o sekvencama su analizirane, kako bi se odredili geni koji kodiraju polipeptide (proteine), RNK geni, regulatorne sekvence, strukturni motivi i ponavljajuće (repetitivne) sekvence. UporeĊivanje gena unutar vrste ili izmeĊu vrsta, sada, može pokazati sliĉnosti u funkciji proteina, ili odnose izmeĊu vrsta (korišćenjem molekularne sistematike za konstrukciju filogenetskih stabala). Sa porastom koliĉine podataka, postalo je nepraktiĉno analizirati DNK sekvence manuelno, tako da danas to rade kompjuterski programi kao što je npr. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul i sar., 1990), koji analizira sekvence, kako bi identifikovao one koje su srodne, ali ne i identiĉne (sequence alignment). Jedna varijanta ovog poreĊenja sekvenci se koristi i za sam proces sekvenciranja (Fleischmann i sar., 1995). Bioinformatika se koristi i za anotaciju sekvenci koje se analiziraju, tako što postoje alatke koje traže gene koje kodiraju proteine, RNK gene i druge funkcionalne sekvence unutar genoma. U genomici, anotacija gena je proces pronalaženja gena i drugih funkcionalnih osobina unutar genoma. U otkrivanju novih lekova, identifikaciji njihove strukture i moguće funkcije, bioinformatika je našla široku primenu. Na internetu danas postoji veliki broj dostupnih hemijskih podataka, kao što su registrovane hemijske strukture sa stereohemijom, podaci o 26 sintezama jedinjenja, spektralna analiza supstanci, ukljuĉujući i NMR (Nuclear Magnetic Resonance) analizu, odreĊivanje ĉistoće supstanci, kao i odreĊivanje fiziĉko-hemijskih osobina jedinjenja. Bioinformatika u glikobiološkim istraživanjima se, koristeći klasiĉne alatke, primenjuje u analizi sekvenci DNK i proteina koji su usko povezani sa ugljenim hidratima: enzima koji uĉestvuju u sintezi i modifikaciji oligosaharida, ili lektina koji prepoznaju pojedine šećerne epitope. TakoĊe, bioinformatika se koristi za opis procesa prepoznavanja ugljeni hidrat- protein na atomskom nivou, kao i za opis strukture glikana (Clus-Wilhelm i sar., 2009). 1.2.5. Ograniĉenja bioinformatike Bioinformatika ima i veći broj ograniĉenja. Ona koristi baze podataka koje sadrže eksperimentalne rezultate, gde se ĉesto javljaju greške, kao što su npr. greške u sekvenciranju. Kvalitet predviĊanja u bioinformatici (npr. strukture, funkcije i organizacije sekvenci DNK i proteina) zavisi od sofisticiranosti algoritama i kompjuterske tehnologije. Naime, vremenom, sa porastom koliĉine dostupnih podataka, prilikom ispitivanja velikog broja sekvenci došlo je do potrebe uvoĊenja jednostavnijih algoritama, koji su manje taĉni, ali daleko brže daju rezultate. TakoĊe, ne retko, sami programi i alatke sadrže greške što dodatno ograniĉava in silico istraživanja. 1.2.6. Baze podataka Baza podataka (BP) je kompjuterizovana arhiva za ĉuvanje i organizovanje podataka, tako da se oni lako mogu naći traženjem po razliĉitim kriterijumima. BP sadrže sva znanja iz 27 date oblasti, koja potiĉu od razliĉitih izvora. Glavne osobine BP su: a) većina njih (BP) se mogu naći na internetu tako da se lako mogu pretraživati i dostupni su širim masama; b) uobiĉajen naĉin pretraživanja BP je pomoću kljuĉnih reĉi; c) korisnici imaju mogućnost da biraju da li će dobijene podatke samo gledati ili saĉuvati na kompjuteru; d) reference dodatno olakšavaju prelaz sa jednih BP na druge. Osnovi pojmovi koji se koriste u bazama podataka su: zapis/unos (entry), koji sadrži odreĊen broj polja (fields) sa podacima tj. vrednostima (value). Nalaženje odreĊenog zapisa (u celosti) u bazi podataka, na osnovu dela informacije, tj. vrednosti odreĊenog polja naziva se pretraživanje (query). BP se prema strukturi podataka i menadžment sistemima, tj. prema naĉinu ĉuvanja podataka, dele na: flat files/format BP; relacijske BP; objekat-orijentisane BP. Flat files/format opisuje bazu podataka kao jedinstvenu datoteku (npr. kao .txt ili .ini; slika 9) Slika 9. Izgled BP u flat files/format obliku. Relacijske BP daju grupe podataka koje su organizovane, i za mnoge ljude lakše za razumevanje (slika 10). 28 Slika 10. Izgled relacijske BP. Objekat-orijentisane BP su sliĉne relacijskim BP, ali sa modelom podataka, koji je orijentisan prema objektu, gde se klase i objekti vide kao shematski podaci (slika 11). Slika 11. Izgled BP orijentisane prema objektu. 29 1.2.6.1. Biološke baze podataka Biološke BP (BBP) su kolekcije informacija prirodnih nauka, sakupljenih od objavljene literature, nauĉnih eksperimenata, tehnoloških eksperimenata i bioinformatiĉkih analiza. One sadrže informacije iz istaživaĉkih oblasti genomike, genske ekspresije, proteomike, metabolomike i filogenetike (Altman, 2004). Dizajn, razvoj i stalno osvežavanje bioloških baza podataka predstavlja srž bioinformatike (Bourne, 2005). Informacije u BBP obuhvataju gensku funkciju, strukturu, lokalizaciju (i ćelijsku i hromozomsku), kliniĉke efekte mutacija, kao i sliĉnost izmeĊu bioloških sekvenci i struktura. Biološki podaci u BBP se ĉuvaju u razliĉitim formatima: u vidu tekstualnih podataka, u vidu sekvenci, proteinske strukture i linkova. Svaki od ovih formata se može naći kod pojedinih baza podataka, npr., formati u obliku teksta se nalaze u PubMed (U.S. National Library of Medicine National Institutes of Health) i OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) bazama, podaci o DNK i proteinskim sekvencama kod GenBank i UniProt, a proteinske strukture kod PDB (Protein Data Base), SCOP (Structural Classification of Proteins) i CATH (Protein Structure Classification) bioloških baza podataka (Murzin i sar., 1995; Berman i sar., 2000; Orengo i sar., 2002). Glavni tipovi bioloških baza podataka prema informacijama koje sadrže prikazani su u tabeli 1. 30 Tabela 1. Glavni tipovi bioloških baza podataka prema informacijama koje sadrže. Tipovi baza podataka (BP) Informacije koje sadrže Bibliografske BP Literatura Taksonomske BP Klasifikacija BP nukleinskih kiselina DNK informacije Genomske BP Informacije o genskim nivoima BP proteina Informacije o proteinima Familije proteina, domeni i funkcionalna mesta Klasifikacija proteina i identifikacija domena Enzimi/metaboliĉki putevi Metaboliĉki putevi Prema sadržaju BBP se dele na: 1. Primarne BP, predstavljaju arhive sekvenci i struktura, koje su eksperimentalno dobijene. Primarne BP sa neobraĊenim (raw) sekvencama nukleinskih kiselina su GenBank, u sklopu NCBI (The National Center for Biotechnology Information), EMBL (European Molecular Biology Laboratory) BP i DDBJ (DNA Data Bank of Japan) (slika 12). NCBI je osnovan 1988. godine, a bavi se istraživanjima na polju bioinformatike, razvija alatke za istraživanje genoma i upotpunjava i proširuje biomedicinska istraživanja, kako bi se bolje razumeli molekularni procesi u zdravlju i bolestima ĉoveka. Primarne BBP proteina su SWISS-Prot (sekvence iz TrEMBL BP - transkribovane nukleotidne sekvence deponovane u EMBL), PIR BP (Protein Information Resources), UniProt BP (koja se sastoji od SWISS- Prot+TrEMBL+PIR) (slika 13). Primarna BP sa 3-D strukturama bioloških makromolekula (i proteina i nukleinskih kiselina) je PDB (Protein Data Bank). 31 Slika 12. Primarne baze podataka nukleinskih kiselina. Svaka BP prikuplja i obraĊuje podatke o novim sekvencama i važne informacije nauĉnika iz odgovarajućeg geografskog regiona. Na primer, EMBL prikuplja podatke iz Evrope, GenBank iz Amerike. Ove baze podataka se automatski meĊusobno dopunjavaju sa novo prikupljenim sekvencama svaka 24 sata, tako da sadrže iste informacije. Ove tri baze podataka saraĊuju od 1982. godine. 2. Sekundarne BP, poznate i kao baze podataka obrazaca, sadrže rezultate dalje analize podataka iz primarnih BP i tu spadaju: Prosite (Database of protein domains, families and functional sites), PRINTS (Compendium of protein motif fingerprints), Pfam (Protein families database), Blocks, DALI itd (Attwood i sar., 1994; Henikoff i sar., 1999; Finn i sar., 2010; Holm i sar., 2010). 32 Slika 13. Baze podataka za analizu proteina i metaboliĉkih puteva kod razliĉitih organizama. UniProt je sveobuhvatan izvor podataka za sekvence proteina i njihovu anotaciju. Uniprot baze podataka su UniProtKB (UniProt Knowledgebase), UniRef (UniProt Reference Clusters), i UniParc (UniProt Archive). UniProt je rezultat saradnje EBI (European Bioinformatics Institute), SIB (Swiss Institute of Bioinformatics) i PIR (Protein Information Resource). Kjoto enciklopedija gena i genoma (KEGG) je integrisana baza podataka koja se sastoji od 16 BP koje su podeljene u odnosu na informacije o sistemima, informacije o genomima, i o hemijskim osobinama. Informacije o genomima i hemijskim osobinama, odnose se na molekularne gradivne jedinice živog sveta, a informacije o sistemima se odnose na funkcionalne aspekte bioloških sistema, kao što su ćelija i organizam, koje su izgraĊene od gradivnih jedinica. 3. Specijalizovane BP sadrže podatke proistekle iz specifiĉnih istraživanja ili su fokusirane na odreĊen organizam (mogu se preklapati sa primarnim BP), i tu spadaju: Flybase (A Database of Drosophila Genes & Genomes), baza podataka o sekvencama HIV virusa, 33 RDP (Ribosomal Database Project) (Tweedie i sar., 2009; http://www.hiv.lanl.gov/; Cole i sar., 2009). Glavni nedostaci BBP su preveliko oslanjanje na sekvence, duplikacija informacija (NCBI- National Center for Biotechnology Information formirao RefSeq - sekundarnu BP) i pogrešne anotacije. 1.2.6.2 Alatke u bioinformatici Bioinformatiĉke alatke su softverski programi koji služe za ĉuvanje i analizu bioloških podataka, iz kojih se, kasnije, mogu generisati biološka znanja. Ove alatke se grubo mogu grupisati u nekoliko kategorija: alatke za prouĉavanje homologije i sliĉnosti, alatke za analizu funkcije proteina, analizu strukture i analizu sekvence (http://www.roseindia.net/bioinformatics/bioinformatics_tools.shtml). Glavni izvori bioinformatiĉkih alatki su NCBI, EBI i ExPASy. U okviru NCBI, može se naći veliki broj alatki, kao što su Genbank, i Entrez gene, za pretrazivanje gena; OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), za dobijanje informacija o naslednim oboljenjima (odnos izmeĊu genotipa i fenotipa); RefSeq (Reference sequence collection), za pronalaženje sekvenci DNK, RNK i proteina; BLAST (Basic Alignment Tool), za pronalaženje sliĉnih regiona izmeĊu sekvenci; kao i MMDB (The molecular modeling database), PubVAST (Vector Alignment Search Tool), PubChem i CDD (Conserved Domain Database), za analizu molekulske strukture i funkcije (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/tools/). 34 EBI nudi veliki broj alatki za analizu sekvenci proteina i nukleinskih kiselina (ENA search, BLAST, PSI-search, Ssearch genomes i Ssearch proteomes), za višestruko poravnjanje sekvenci (ClustalW2, Clustal Omega, WEBPrank, T-Cofee, MUSCLE), za analizu funkcije proteina (InterProScan, Pratt, Phobius, Radar), za funkionalnu genomiku (Gene Expression Atlas, EFO Tools), za molekularnu strukturu (PDBeFold, QuaternaryStructure) i druge (http://www.ebi.ac.uk/Tools/). ExPASy je SIB-ov portal za bioinformatiĉke resurse, preko koga se može naći ogroman broj alatki za analizu proteomike, genomike, filogenije, sistemske biologije, populacione genetike, transkriptomike i druge (http://expasy.org/). 2. CILJ 35 CА125 antigen, poznat kao marker seroznog karcinoma ovarijuma, predstavlja ekstracelularni deo mucina 16 (MUC16), koji nastaje njegovom proteolitiĉkom degradacijom. Biološka uloga MUC16/CA125, još uvek nije razjašnjena. Dosadašnja ispitivanja funkcije MUC16 (membranska forma) su, uglavnom, bila bazirana na in vitro model sistemu ćelija ovarijalnog karcinoma, dok su literaturni podaci o aktivnosti CA125 antigena (solubilna forma) veoma retki. Solubilna forma predstavlja funkcionalni analog i kompetitor membranskoj formi i, u cirkulaciji, ona prva dospeva u kontakt sa razliĉitim tipovima normalnih ili patološki izmenjenih ćelija, ali ne postoje eksperimentalni dokazi o mogućem uticaju na njihovu adhezivnost, kao i imunomodulatorna svojstva. S obzirom na izrazitu strukturnu heterogenost i polidomensku organizaciju MUC16/CA125, postoji potreba za interdisciplinarnom analizom njegove multifunkcionalnosti, koja će obuhvatiti interakcije posredovane specifiĉnim proteinskim i glikanskim domenima. U ovom radu je ispitivana modularna organizacija MUC16/CA125 na bioinformatiĉkom i glikobiohemijskom nivou, sa ciljem da se bliže definišu biološki kapacitet i posebnosti prezentacije ovog molekula u kontekstu interaktoma ĉoveka. Bioinformatiĉka analiza, kao deo strategije za otkrivanje moguće biološke uloge MUC16/CA125, do sada nije korišćena u ispitivanjima ovog antigena. Pored toga, u kontekstu diskretnih bioloških funkcija, bez obzira na izuzetan biomedicinski znaĉaj, ne postoje eksperimentalni podaci o interakcijama MUC16/CA125 sa specifiĉnim klasama receptora na ćelijama krvnog sistema. Radi postizanja zadatih ciljeva, neposredni zadaci ovog rada su podeljeni u dve celine. Prva od njih se odnosila na in silico analizu modularne organizacije CA125/MUC16, na osnovu podataka o ovom molekulu koji su preuzeti sa UniProtKB baze podataka (pristupni broj 36 Q8WXI7). OdreĊivana je homologija i prisustvo obrazaca, strukturnih motiva i konzerviranih domena, a vršena je i predikcija funkcije na osnovu zadate aminokiselinske sekvence. U tu svrhu, korišćene su BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) alatke i razliĉite baze podataka kao što su Gene Ontology i Bgee. Druga celina se odnosi na glikobiohemijsku analizu koja je obuhvatila ispitivanje uticaja CA125 antigena na adhezivnost i agregabilnost eritrocita, kao i moguće interakcije sa razliĉitim tipovima leukocitnih lektina tj. sigleka (Siglec - sialic acid-binding immunogobulin (Ig)-like lectin) i receptora sliĉnih lektinima tipa C (selektini, DC-SIGN - dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing non-integrin 1, MMR - macrophage mannose receptor). Glikobiohemijskom analizom su, pored antigena iz ćelijske linije ovarijalnog karcinoma ĉoveka (clCA125), bili obuhvaćeni i antigen kancerskog porekla iz pleuralne teĉnosti (pfCA125) kao i antigen fetalnog porekla (pCA125), koji se sintetiše tokom trudnoće. 3. MATERIJALI I METODE 37 3.1. Materijali 3.1.1. Reagensi Antitela: Mišija monoklonska antitela na humani CA125 antigen, klonovi X-306 i X-325, klasa IgG1, afinitivno preĉišćena (Hy Test, PharmaCity, Turku, Finland) Kozija biotinilizovana antitela na mišiji IgG (H+L) i na mišiji IgM (specifiĉa za mµ lanac), afinitivno preĉišćena (Vector Laboratories, Burlinghame, USA) Mišija monoklonska antitela na humane Lewisx, Lewisy i sijalil-Lewisx antigene, klasa IgM, (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Germany) Mišije monoklonsko antitelo na humani hCG, klon 5008-SP-5, klasa IgG1 (Medix Biochemica, Kauniainen, Finland) Antigeni: CA125 antigen, A32303H, (calibrator grade) iz pleuralne teĉnosti ĉoveka (Biodesign, Meridian Life Science, Inc., Saco, ME, USA) CA125 antigen, A97180H, (antigen grade) iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka (Biodesign, Meridian Life Science, Inc., Saco, ME, USA) Biotinilizovani biljni lektini: LTL (Lotus tetragonolobus lectin), SNA (Sambucus nigra agglutinin) i MAA II (Maackia amurensis agglutinin II) (Vector Laboratories, Burlingame, USA) Rekombinantni lektini: Rekombinantni humani manozni receptor makrofaga (MMR-macrophage mannose receptor) (CD206), (R&D Systems, Inc, Minneapolis, Minnesota, USA) 38 Rekombinantni humani molekuli tipa Fc himera: DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing non-integrin 1) (CD209)/Fc himera, E-selektin (CD62E)/Fc himera, L-selektin (CD62L)/Fc himera, P-selektin (CD62P)/Fc himera, siglec-2 (CD22β)/Fc himera, siglec-3 (CD33)/Fc himera, siglec-6/Fc himera, siglec-7/Fc himera, siglec-9/Fc himera, siglec-10/Fc himera, (R&D Systems, Inc, Minneapolis, Minnesota, USA) Kompleti reagenasa: Elite Vectastain ABC komplet (Vector Laboratories, Burlingame, USA) DAB (3,3’-diaminobenzidin) supstrat-komplet (Vector Laboratories, Burlingame, USA) Kompleti za kvantitaciju: ELSA CA125 II komplet (Cis-bio international-Schering, Germany) Epstein-Barr Virus (EBV) VCA IgG komplet (Virion/Serion GmbH, Wurzburg, Germany) Herpes simplex virus tipa 1 (HSV1) IgG komplet (Human GmbH, Wiesbaden, Germany) Ĉvrsta faza: Immobilon-PVDF (poliviniliden fluorid) membrana (Millipore, Bedford, USA) Polistirenske ploĉe MaxiSorp sa 96 bunarića sa zvezdastim dnom (Nunc, Rosklide, Denmark) Polistirenske ploĉe sa 96 bunarića (COSTAR, Corning International, New York, USA) Hromatografski medijumi: Sefadeks G-75 (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) Sefaroza 4B (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 39 Hemikalije: EDTA (natrijumova so etilendiaminotetrasirćetne kiseline) (Reanal, Budapest, Hungary) Glukoza (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) GoveĊi serumski albumin (bovine serum albumin, BSA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) Heparin (ICN Biochemicals, Cleveland, Ohio, USA) Heparan-sulfat (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) Manan (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) Natrijum dodecil sulfat (SDS) (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) Natrijum perjodat (ICN Biomedicals, Cleveland, USA) Polietilenglikol, PEG (Sigma, St.Louis, USA) Poli-L-lizin (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) Protein A-HRPO konjugat (INEP, Beograd, Srbija) Radioaktivni izotop joda ( 125 I) (Institute of isotope Co, Ltd, Budapest, Hungary) 3,3’,5,5’- tetrametilbenzidin (TMB) (HUMAN GmbH, Wiesbaden, Germany) TRIS (2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol) (ICN - Biomedicals, inc., Aurora, Ohio, USA) Sve ostale hemikalije su bile ĉistoće p.a. 3.1.2. Uzorci biološkog materijala 3.1.2.1 Uzorci placenti prvog trimestra Uzorci placenti prvog trimestra, korišćeni u ovom radu, su pribavljeni u skladu sa protokolom za nauĉno-struĉnu saradnju izmeĊu Instituta za ginekologiju i akušerstvo Kliniĉkog centra Srbije i Instituta za primenu nuklearne energije - INEP. Placente su 40 prikupljene od pacijentkinja koje su se dobrovoljno podvrgle prekidu trudnoće, a starost tkiva je procenjena na 6-12 nedelja, prema datumu poslednje menstruacije. Placente su donete u laboratoriju u hladnom 0.1M fosfatnom puferu pH 7,2 koji sadrži 0,9 % NaCl (PBS) i isprane od krvi i kontaminirajućeg tkiva: decidue i placentnog ležišta. Pul tkiva placenti prvog trimestra je homogenizovan u 0.1M PBS-u, pH 7,2, homogenizerom Silverstone machines Ltd. (Buckinghamshire, England). Citosolna frakcija je odvojena centrifugiranjem na ultracentrifugi Beckman L8-60M (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA, USA), jedan sat na 36000 rpm. Dobijeni ekstrakt je do upotrebe ĉuvan na -20°C. 3.1.2.2. Eritrociti Ispitivanja su vršena na uzorcima krvi uzetih od zdravih dobrovoljaca sa razliĉitim krvnim grupama, u skladu sa lokalnim standardima i procedurama za rukovanje uzorcima biološkog materijala. Krv je sakupljena u kivete koje sadrže EDTA, a eritrociti su izolovani centrifugiranjem (10 minuta na 2000 rpm) i ispirani tri puta fiziološkim rastvorom. Ćelije su izbrojane pomoću Mythic 18 analizatora krvi (CZ diagnostic, France). 3.2. Metode 3.2.1. In silico analiza Za in silico („pomoću kompjutera“) istraživanja, korišćeni su podaci dostupni za humani mucin 16 (MUC16) (Ovarian cancer-related tumor marker CA125), pristupni broj IPI00103552 (IPI, The International Protein Index), pristupni broj NP_078966.2 (NCBI 41 RefSeq, National Center for Biotechnology Information Reference Sequence) i pristupni broj Q8WXI7 (UniProtKB, The Universal Protein knowledgebase). Proteinska sekvenca MUC16, preuzeta iz UniProtKB baze podataka (http://www.uniprot.org) u FASTA formatu (FAST AYE, FAST ALL, format nukleinskih ili proteinskih sekvenci u obliku teksta, gde su nukleinske kiseline/aminokiseline prikazane kodovima u vidu pojedinaĉnih slova), je analizirana korišćenjem većeg broja odgovarajućih servera na internetu (http://www.expasy.org/). Ovi serveri koriste razliĉite algoritme i metode uporeĊivanja za analizu sliĉnosti proteinskih sekvenci i strukturnih motiva. 3.2.1.1. Ispitivanje homologije proteinske sekvence Za ispitivanje homologije MUC16 sa proteinima koji su deponovani u nr (non-redundant) proteinskoj bazi podataka NCBI koja obuhvata GenBank, UniProt, RefSeq, PRF (Protein Research Foundation) i PDBSTR (Protein Data Base Stripped) korišćene su BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) alatke: ClustalW2 v1.83 program (Multiple Sequence Alignment Program, http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) i BLASTP 2.2.20 program (http://blast.genome.jp/) (Altschul i sar., 1990; Chenna i sar., 2003). Pretraživanje je vršeno u bazama podataka za sledeće taksonomske kategorije: ĉovek, virusi, bakterije, gljive i eukariota. Kandidati sa najvećom ocenom su rangirani pod razliĉitim setovima relevantnih parametara (threshold, matrix, filtering, gapped sequence). 3.2.1.2. Ispitivanje modularne organizacije MUC16 Za ispitivanje modularne organizacije MUC16 – obrazaca, strukturnih motiva i konzerviranih domena korišćene su razliĉite web alatke koje su povezane sa Bgee: a dataBase for Gene Expression Evolution (http://bgee.unil.ch/bgee/bgee) i Gene Ontology 42 (GO, http://www.geneontology.org/) (Ashburner i sar., 2000; Bastian i sar., 2008). Bgee je baza podataka za pretraživanje i poreĊenje obrazaca genske ekspresije izmeĊu animalnih vrsta. GO baza podataka sadrži opise genskih produkata u smislu njihove povezanosti sa biološkim procesima, ćelijskim komponentama i molekulskim funkcijama, bez obzira na biološku vrstu. Konzervirani domeni su funkcionalne jedinice u okviru proteina koje deluju kao gradivni blokovi tokom molekulske evolucije i rekombinuju se u razliĉitim aranžmanima da bi se formirali proteini sa razliĉitim funkcijama. CDD (Conserved Domain database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi), povezuje nekoliko zbirki višestruko poravnatih sekvenci (multiple sequence alignment) koje predstavljaju konzervirane domene (Marchler-Bauer i sar., 2004; 2009; 2011). ELM Server (Eukaryotic Linear Motif, http://elm.eu.org/), je alatka za predviĊanje funkcionalnih mesta u eukariotskim proteinima (Puntervol i sar., 2003). Blokovi su višestruko poravnati segmenti (bez gap-ova) koji odgovaraju visoko konzerviranim regionima proteina, a oni su pretraživani pomoću BLOCKS (http://blocks.fhcrc.org/blocks/blocks_search.html; http://motif.genome.jp/) (Henikoff i Henikoff, 1994). InterProScan je alatka koja sumira baze podataka o proteinskim domenima i funkcionalnim mestima (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/) (Apweiler i sar., 2001). Ona integriše sledeće baze podataka: Prosite obrasci (biološki znaĉajni obrasci aminokiselina, http://expasy.org/tools/scanprosite/) i Prosite profili (familije i strukturni domeni sa ekstremnom divergencijom sekvenci), Pfam (baza podataka familija proteinskih domena), SMART (Simple Modular Architecture Research Tool, identifikacija i anotacija genetiĉki mobilnih domena i analiza arhitekture domena), PIR superfamilije (Protein Information 43 Resource, klasifikacioni sistem koji se bazira na evolutivnim odnosima svih proteina), SUPERFAMILY (baza podataka koja sadrži sve poznate proteinske structure), Gene3D (baza podataka proteinskih sekvenci koja sadrži proteine iz kompletnih genoma koji su grupisani u proteinske familije i kojima su dodeljeni CATH domeni, Pfam domeni i funkcionalne informacije iz KEGG, GO, COG, Affymetrix i STRINGS), PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships; klasifikacioni sistem dizajniran da klasifikuje proteine i njihove gene) i HAMAP (High-quality Automated and Manual Annotation of microbial Proteomes, baza podataka koja se kopristi za identifikaciju proteinskih familija iz bakterija i Archaebacteria). MyHits (http://myhits.isb-sib.ch/cgi- bin/index) je baza podataka proteinskih domena koja služi za ispitivanje odnosa izmeĊu proteinske sekvence i pripadajućih motiva (Pagni i sar., 2007). iProClass database (http://pir.georgetown.edu/iproclass/) je baza podataka koja sumira podatke iz 90 izvora a koji se odnose na familije proteina, funkcije i puteve, interakcije, strukture i strukturne klasifikacije, gene i genome i taksonomiju (Wu i sar., 2001). 3.2.1.3. Ispitivanje fizičko-hemijskih osobina, globularnosti i odstupanja od pretpostavljene tercijarne strukture Fiziĉko-hemijske osobine proteina MUC16 (zastupljenost pojedinih aminokiselina, polu- život molekula, indeks nestabilnosti, GRAVY indeks - koji govori o solubilnosti proteina, indeks alifatiĉnosti i hidrofobnost) odreĊivane su pomoću ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html) i ProtScale alatki, (http://expasy.org/tools/ protscale.html) (Gasteiger i sar., 2005). GLOBPLOT v2.3 (http://globplot.embl.de/) alatka bazirana na Russell/Linding-ovim vrednostima omogućava ispitivanje proteina u smislu identifikacije ureĊenih/globularnih 44 regiona, kao i regione koji odstupaju od pretpostavljene tercijarne strukture (Intristic disorder of proteins) (Linding i sar., 2003). “NeureĊeni” regioni ĉesto sadrže kratke linearne peptidne motive koji su znaĉajni za proteinsku funkciju, a koji su deponovani u ELM bazi podataka. 3.2.1.4. Predikcija funkcije MUC16 PredviĊanje funkcije MUC16 vršeno je pomoću alatki koje koriste nekoliko programa za predviĊanje funkcije proteina na osnovu zadate aminokiselinske sekvence: JAFA metaserver (Joined Assembly of Function Annotations; http://jafa.burnham.org/); ProtFun 2.2 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/, Jensen i sar., 2002; 2003); PFP (Automated Protein Function Prediction; http://dragon.bio.purdue.edu/pfp; Hawkins i sar., 2006) i GeneOntology (GO) domeni i termini. 3.2.2. Glikobiohemijska analiza 3.2.2.1. Gel filtracija ekstrakta placente na koloni Sefaroza 4B Gel filtracija ekstrakta placenti prvog trimestra je vršena na koloni Sefaroza 4B (36mL). Kolona je uravnotežena i eluirana 0,05 M PBS-om, pH 7,2. Za kalibraciju su korišćeni interni standardi molekulskih masa: BSA (66kDa) i tireoglobulin (660kDa). Na kolonu je nanet 1 mL uzorka, a sakupljene su frakcije zapremine 1 mL. Optiĉka gustina (optical density, OD) svake frakcije je izmerena na spektrofotometru CE594 CECIL (Cambridge, England), na talasnim dužinama 280 nm i 260 nm. Paralelno je vršena imunoradiometrijska detekcija CA125 antigena u svakoj frakciji. Frakcije u kojima je detektovan CA125 antigen 45 su spojene, koncentrovane u PEG-u i dijalizovane 18 sati prema 0,05 M PBS-u, pH 7,2. Uzorci su alikvotirani i ĉuvani na -20°C do upotrebe. 3.2.2.2. Test agregacije eritrocita Ispitivanje agregacije eritrocita je vršeno prema metodi Ueda i Takeichi, sa malim modifikacijama (Ueda i Takeichi, 1976; Takeichi, 1977). Na mikroskopske ploĉice je naneta 0.1 % suspenzija eritrocita (1x10 5ćelija/25 μL), u kapima, a zatim su dodati odgovarajući CA125 antigeni (25 μL) u koncentracijskom opsegu od 500 do 20000 IU/mL. Kao referentna kontrola, korišćena je suspenzija ćelija bez dodatih CA125 antigena. Ćelije su posmatrane pod svetlosnim mikroskopom (Reichert-Jung sa Leica DC150 Digital Camera System, Wetzlar, Germany) u vremenskim intervalima u toku 30 minuta, od strane dva nezavisna posmatraĉa. Reprezentativna polja su uslikana pomoću fotoaparata Canon s50. 3.2.2.3. Test adhezije eritrocita Test adhezije eritrocita je raĊen prema metodi Tas-a, sa malim modifikacijama (Tas i sar., 1999). Za ovaj test je korišćena 10 % suspezija eritrocita u 8 mM TRIS-HCl, pH 7,4 koji sadrži 0.1 M NaCl, 0,14 M glukozu, 0,45 mM CaCl2 i 0,17 mM MgCl2 (adhezioni pufer). Eritrociti su naneti na staklene ploĉice (1x107ćelija/25 μL/kapi) ili dodati u polistirenske ploĉe (1x107ćelija/25 μL/bunariću) koje su prethodno obložene 0.1 % poli-L-lizinom i blokirane 1 % BSA. Inkubacija je vršena 60 minuta, na sobnoj temperaturi, u prisustvu odgovarajućeg CA125 antigena (50-20000 IU/mL; 12,5 μL). Ćelijska suspenzija bez dodatih CA125 antigena je korišćena kao referentna kontrola. Neadherirani eritrociti su uklonjeni nežnim ispiranjem, ĉetiri puta, sa po 200 μL adhezionog pufera. Ćelije adherirane 46 na staklene ploĉice su posmatrane svetlosnim mikroskopom, na uvećanju 20x i 40x i reprezentativna polja su uslikana. Ćelije koje su adherirale na ploĉe su lizirane destilovanom vodom (50 μL/bunariću). Kao mera ukupnog broja adheriranih ćelija, merena je absorbanca na 405 nm, koristeći ĉitaĉ ploĉa 5060-006 (LKB, Austria). Test adhezije u ploĉama je raĊen u duplikatu i izraĉunata je srednja vrednost +/- SD za tri nezavisno uraĊena eksperimenta sa razliĉitim serijama uzoraka eritrocita. Rezultati su prikazani kao procenat referentnog uzorka (arbitrarno 100 %). 3.2.2.4. Test hemolize Test hemolize je uraĊen prema metodi Timoshenko-a (Timoshenko i sar., 2003). 1 % suspenzija humanih eritrocita (5x10 6ćelija/50μL/bunariću) je inkubirana sa 125 μM SDS (225 μL/bunariću) i sa ili bez dodatog odgovarajućeg CA125 antigena (500-2000 IU/mL; 25 μL), 3 sata, na 25°C, uz konstantno mućkanje. Absorbanca na 670 nm je merena u intervalima od 15 minuta. 3.2.2.5. Testovi vezivanja na čvrstoj fazi 3.2.2.5.1. Vezivanje biljnih lektina za imobilisane CA125 antigene 3.2.2.5.1.1. Vezivanje SNA (Sambucus nigra agglutinin) i MAA II (Maackia amurensis agglutinin II) Serijska razblaženja CA125 antigena (50 μL/bunariću; 7-500 IU/mL) u 0,05 M karbonatnom puferu, pH 9,5, su adsorbovana na polistirensku ploĉu, fiziĉkom adsorpcijom, 18 sati, na +4°C. Neadsorbovani antigeni su uklonjeni aspiriranjem i ispiranjem, tri puta sa 0,3 mL 0,05 M PBS-a, pH 7,2. Slobodna mesta su blokirana 0,5 % BSA u 0,05 M PBS, pH 7,2 (200 μL/bunariću), dva sata, na sobnoj temperaturi. Nakon blokiranja, sadržaj je 47 aspiriran, a ploĉa je isprana tri puta, po istoj proceduri. U bunariće su dodati biotinilizovani lektini: SNA ili MAA II (50 μL/bunariću, 2,5 μg/mL). Nakon inkubacije od dva sata, na sobnoj temperaturi, nevezani biotinilizovani lektini su uklonjeni aspiriranjem i ispiranjem tri puta sa 0,3 mL 0,05 M PBS-a, pH 7,2. Dodat je Vectastain Elite ABC reagens, koji je posle 30 min inkubacije aspiriran i ploĉa je isprana tri puta, po istoj proceduri. Dodat je rastvor TMB/substrat, i nakon inkubacije od 10 min, i ispiranja, reakcija je stopirana sa 0,16 M H2SO4. Izmerena je absorbanca sadržaja svakog bunarića na 450 nm, na Wallac 1420 Multilabel brojaĉu (Perkin Elmer, Monza, Italy). Nespecifiĉno vezivanje (NSB) je odreĊeno kao vezivanje SNA i MAA II za kontrolne bunariće, na koje nije adsorbovan CA125 antigen. 3.2.2.5.1.1.1. Perjodatni tretman Imobilisani CA125 antigeni (500 IU/mL) su podvrgnuti blagom perjodatnom tretmanu (Bock i Kelm, 2006). Pre blokiranja, oni su oksidovani 30 min, sa 2 mM NaIO4 (150 μL/ bunariću). Reakcija je stopirana 8 % glicerolom (20 μL/bunariću). Nakon aspiriranja i jednog ispiranja 0,05 M PBS, pH 7,2, antigeni su inkubirani 30 min sa 20 mM NaBH4 (150 μL/bunariću). Nakon ispiranja, vezivanje biljnih lektina za tretirane imobilisane CA125 antigene je raĊeno po gore opisanoj proceduri za netretirane antigene. 3.2.2.5.1.2. Vezivanje LTL (Lotus tetragonolobus lektin) CA125 antigeni (50 μL/bunariću), u serijskim razblaženjima (15-1000 IU/mL), u 0,05 M karbonatnom puferu, pH 9,5, su adsorbovani na polistirensku ploĉu, fiziĉkom adsorpcijom, 18 sati, na +4°C. Višak proteina je uklonjen aspiriranjem i ispiranjem tri puta sa 300 μL TSM-a, pH 7,4. Slobodna mesta su blokirana 1 % BSA u TSM puferu, pH 7,4 (200 48 μL/bunariću), dva sata, na sobnoj temperaturi. Nakon blokiranja, sadržaj je aspiriran, a ploĉa je isprana tri puta, po istoj proceduri. U bunariće je dodat biotinilizovani LTL (50 μL/bunariću, 0.07 μg/mL). Nakon inkubacije od jednog sata, na sobnoj temperaturi, nevezani biotinilizovani LTL je uklonjen aspiriranjem i ispiranjem tri puta sa 300 μL 0,05 M PBS-a, pH 7,2. Dodat je Vectastain Elite ABC reagens, koji je posle 30 min inkubacije aspiriran i ploĉa je isprana tri puta, po istoj proceduri. Dodata je smeša TMB/supstrat, i nakon inkubacije od 10 minuta, i ispiranja, reakcija je stopirana 0,16 M H2SO4. Izmerena je absorbanca 450 nm, na Wallac 1420 Multilabel brojaĉu (Perkin Elmer, Monza, Italy). Nespecifiĉno vezivanje (NSB) je odreĊeno kao vezivanje LTL za kontrolne bunariće, na koje nisu adsorbovani CA125 antigeni. 3.2.2.5.2. Vezivanje rekombinantnih molekula tipa Fc himera za imobilisane CA125 antigene 3.2.2.5.2.1. Vezivanje rekombinantnih humanih sigleka Vezivanje siglek/Fc himera za CA125 antigene, raĊeno je prema metodi Bock i Kelm-a, sa malim modifikacijama (Bock i Kelm, 1996). Serijska razblaženja CA125 antigena (50 μL/ bunariću), u 0,05 M karbonatnom puferu, pH 9,5, su adsorbovana na polistirensku ploĉu, 18 sati, na +4°C. Višak proteina je uklonjen aspiriranjem i ispiranjem tri puta sa 0,3 mL 0,05 M PBS-a, pH 7,2. Slobodna mesta su blokirana 0,5 % BSA u 0,05 M PBS, pH 7,2 (200 μL/bunariću), dva sata, na sobnoj temperaturi. Nakon blokiranja, sadržaj je aspiriran, a ploĉa je isprana tri puta, po istoj proceduri. U bunariće je dodato po 50 μL odgovarajućih siglek/Fc himera (2,5 μg/mL) i oni su inkubirani dva sata, na sobnoj temperaturi. Nevezani sigleci su aspirirani i ploĉa je isprana tri puta. U svaki bunarić je dodato po 50 μL protein 49 A-HRPO konjugata (0,3 μg/mL). Nakon inkubacije od dva sata i ispiranja, dodat je rastvor TMB/supstrata. Posle 10 min, reakcija je stopirana 0,16 M H2SO4 i izmerena je absorbanca sadržaja svakog bunarića na 450 nm, na Wallac 1420 Multilabel brojaĉu. NSB je odreĊeno kao vezivanje sigleka za kontrolne bunariće, bez imobilisanog CA125 antigena. CA125 antigeni su, paralelno, tretirani perjodatom (kao što je opisano u poglavlju 3.2.1.5.1.1.1.), i vezivanje sigleka je analizirano na isti naĉin, kao i nativni, netretirani antigeni. 3.2.2.5.2.2. Vezivanje rekombinantnih humanih selektina i DC-SIGN Serijska razblaženja CA125 antigena (50 μL/bunariću; 4-500 IU/mL) u 0,05 M karbonatnom puferu, pH 9,5, su adsorbovana na polistirensku ploĉu, fiziĉkom adsorpcijom, 18 sati, na +4°C. Neadsorbovani antigeni su uklonjeni aspiriranjem i ispiranjem, tri puta sa 300 μL 0,05 M PBS-a, pH 7,2. Slobodna mesta su blokirana 1 % BSA u 0,05 M PBS, pH 7,2, (200 μL/bunariću), dva sata, na sobnoj temperaturi. Nakon blokiranja, sadržaj je aspiriran, a ploĉa je isprana tri puta, sa 20 mM Tris-HCl puferom, pH 7,4, koji sadrži 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2 i 2 mM MgCl2 (TSM pufer). U bunariće su dodati odgovarajući selektini (L-selektin/Fc himera, E-selektin/Fc himera - 5 μg/mL, P-selektin/Fc himera - 0,3 μg/mL), ili DC-SIGN/Fc himera - 5 μg/mL, svi 50 μL/bunariću, rastvoreni u TSM puferu. Nakon inkubacije od tri sata, na sobnoj temperaturi, nevezani lektini su uklonjeni aspiriranjem i ispiranjem tri puta sa 300 μL TSM-a, pH 7,4. U svaki bunarić je dodato po 50 μL protein A-HRPO konjugata (0,3 μg/mL). Nakon dva sata, bunarići su isprani tri puta, sa 0,05 M PBS, pH 7,2 i dodata je smeša TMB/supstrat. Posle 20 minuta, reakcija je stopirana 0,16 M H2SO4. Izmerena je absorbanca na 450 nm, na Wallac 1420 Multilabel 50 brojaĉu (Perkin Elmer, Monza, Italy). Nespecifiĉno vezivanje (NSB) je odreĊeno kao vezivanje lektina za kontrolne bunariće, na koje nisu adsorbovani CA125 antigeni. 3.2.2.5.2.2.1. Inhibicija vezivanja selektina i DC-SIGN Specifiĉnost i priroda vezivanja selektina i DC-SIGN za CA125 antigene je analizirana u testu inhibicije. Imobilisani CA125 antigeni (500, 250, 31 IU/mL) su inkubirani sa DC- SIGN, L-selektinom, E-selektinom (50 μL/bunariću, 5 μg/mL) i P-selektinom (50 μL/bunariću, 0.3 μg/mL), u prisustvu odgovarajućih inhibitora: manana (50 µg/mL), 10 mM EDTA, heparan-sulfata (100 µg/mL) ili heparina (1 mg/mL), tri sata, na sobnoj temperaturi. Dalji postupak, koji je ukljuĉivao inkubaciju, ispiranja i detekciju vezanih lektina, raĊen je po gore opisanoj proceduri (3.2.2.5.2.2.). 3.2.2.5.3. Vezivanje rekombinantnog humanog manoznog receptora makrofaga (MMR) za CA125 antigen Serijska razblaženja MMR (0.15-20 µg/mL, 100 µL/bunariću) u 0,05 M karbonatnom puferu, pH 9,5, su adsorbovana na polistirensku ploĉu, fiziĉkom adsorpcijom, 18 sati, na +4°C. Neadsorbovani lektin je uklonjen aspiriranjem i ispranjem, tri puta sa 300 μL TSM-a, pH 7,4. Slobodna mesta su blokirana 1 % BSA u TSM, pH 7,4 (200 μL/bunariću), dva sata, na sobnoj temperaturi. Nakon blokiranja, sadržaj je aspiriran, a ploĉa je isprana tri puta, po istoj proceduri. U bunariće je dodato po 100 μL rastvora 125I-CA125 antigena u TSM puferu (300000 cpm/bunariću). Posle šestoĉasovne inkubacije, sadržaj bunarića je aspiriran, i nakon tri ispiranja sa 300 μL 0,05 M PBS-a, pH 7,2, vezana radioaktivnost je merena na Wallac Wizard 1470 automatic γ-brojaĉu (Perkin Elmer, Waltham, USA). 51 3.2.2.6. CA125 – imunoreaktivnost viralnih antigena Za ovaj test su korišćeni imobilisani viralni antigeni iz komercijalno dostupnih testova za dokazivanje Epštajn-Bar virusa (Epstein-Barr virus, EBV) i Herpes simplex virusa tipa 1 (HSV1). U bunariće sa imobilisanim antigenom kapsida (CA) Epštajn-Bar virusa ili antigenom Herpes simplex virusa tipa 1 (HSV1), iz ćelijske kulture, dodata su monoklonska anti-CA125 antitela: klon X325 (M-11 sliĉna) i klon X306 (OC-125 sliĉna). Nakon inkubacije od tri sata, na sobnoj temperaturi, sadržaj je aspiriran i ploĉa je ispirana tri puta sa 0,3 mL 0,05 M PBS-a, pH 7,2. Dodato je biotinilizovano kozije antitelo na mišiji IgG i inkubirano jedan sat, a nakon toga je procedura ispiranja ponovljena po istom postupku. Dodat je Vectastain Elite ABC reagens, koji je posle 30 min inkubacije aspiriran i ploĉa je isprana tri puta, po istoj proceduri. Dodat je rastvor TMB/supstrat, i nakon inkubacije od 10 min, i ispiranja, reakcija je stopirana sa 0,16 M H2SO4. Izmerena je absorbanca sadržaja svakog bunarića na 450 nm, na Wallac 1420 Multilabel brojaĉu (Perkin Elmer, Monza, Italy). Kako bi se odredila specifiĉnost vezivanja antitela, uraĊen je kontrolni esej sa irelevantnim monoklonskim anti-hCG antitelom, klon 5008-SP-5 (Medix Biochemica, Kauniainen, Finland). 3.2.2.7. Obeležavanje CA125 antigena radioaktivnim izotopom joda (125I) Obeležavanje CA125 antigena, raĊeno je po metodi Greenwood-a (Greenwood i sar., 1963) sa 0.5 mCi radioaktivnog izotopa joda ( 125I). Jodovanje je raĊeno u prisustvu hloramina T, a reakcija je, nakon 60 sekundi, prekinuta dodavanjem 100 μL L-cisteina, 10 μL KI i 200 μL 0,05 M PBS pufera, pH 7,2 koji je sadržao 0,05 % BSA. Reakciona smeša je naneta na kolonu Sefadeks G-75, i eluiranje je vršeno 0,05 M PBS puferom, pH 7,2 koji je sadržao 52 0,05 % BSA. Frakcije od 1 mL su sakupljane, pri protoku od 0,5 mL/min. Radioaktivnost eluiranih frakcija (count per minute, cpm), merena je na Wallac Wizard 1470 automatic γ- brojaĉu (Perkin Elmer, Waltham, USA). Frakcije u kojima je detektovan obeleženi antigen su spojene i korišćene u daljim eksperimentima. 3.2.2.8. Dot-blot PVDF membrana je hidrirana 100 % metanolom (10 sekundi), destilovanom vodom (5 minuta), i radnim puferom (5 minuta), i na nju su nanošeni odgovarajući uzorci CA125 antigena (1 µL/spotu; 1000-250 IU/mL). Nakon blokiranja 3 % BSA u 0,05 M PBS, pH 7,2, 30 minuta, membrana je osušena i korišćena za dalje analize. 3.2.2.8.1. Lektinski dot-blot Lektinski blot je raĊen po istom principu kao i testovi vezivanja lektina na ĉvrstoj fazi. Za lektinski blot je korišćen biotinilizovani biljni lektin LTL. Nakon transfera, membrana je inkubirana sa biotinilizovanim LTL (0,4 μg/mL), 2 sata, na sobnoj temperaturi. Nevezani lektin je uklonjen aspiriranjem i ispiranjem, tri puta po 5 minuta, sa 0,05 M PBS, pH 7,2, a zatim je dodat Elite Vectastain ABC reagens, 30 minuta, na sobnoj temeraturi. Detekcija vezanog lektina, nakon ponovnog ispiranja, raĊena je pomoću DAB supstrat kompleta, prema uputstvu proizvoĊaĉa. Inkubacija u rastvoru supstrata za peroksidazu (vodonik peroksida) i hromogena (3’,3’-diaminobenzidin, DAB), vršena je do pojave taĉaka, nakon ĉega je membrana isprana u destilovanoj vodi i osušena na sobnoj temperaturi. 53 3.2.2.8.2. Imuno dot-blot Membrana je inkubirana sa odgovarajućim monoklonskim antitelom na humane Lewisx, Lewis y i sijalil-Lewis x antigene (razblaženje 1:500), 2 sata, na sobnoj temperaturi. Nevezano antitelo je uklonjeno ispiranjem, tri puta po 5 minuta, sa 0,05 M PBS, pH 7,2. Membrana je zatim inkubirana sa kozijim biotinilizovanim antitelima na mišiji IgM (0,5 μg/mL), jedan sat, na sobnoj temperaturi, nakon ĉega je isprana po istoj proceduri i inkubirana 30 minuta sa Elite Vectastain ABC reagensom. Detekcija vezanih antitela je raĊena po istoj proceduri kao što je opisano u poglavlju 3.2.2.8.1. 4. REZULTATI 54 4.1. Bioinformatiĉka analiza sekvence MUC16 4.1.1. Ispitivanje homologije sekvence MUC16 4.1.1.1. BLAST analiza Rezultati ispitivanja sliĉnosti MUC16, sa sekvencama proteina iz dostupnih baza podataka, pomoću BLASTP 2.2.20 programa, prikazani su na slici 14 i u tabeli 2. Oni su se bazirali na statistiĉkoj znaĉajnosti, koja se izražava na osnovu vrednosti parametra E (expectation value) ili parametra S (bit score). E vrednost predstavlja statistiĉki indikator, koja se raĉuna po formuli E = m x n x P, gde je: m – broj svih nukleotida/aminokiselina u bazi podataka (BP); n – broj nukleotida/aminokiselina u sekvenci kojom se pretražuje BP; P – verovatnoća da je HSP (high-scoring segment pair) poravnanje rezultat sluĉajnosti. Kako E-vrednost zavisi od veliĉine baze podataka (kad raste baza podataka, raste i E-vrednost), došlo se na ideju da se ona raĉuna na alternativan naĉin, preko S vrednosti. E-vrednost je mera pouzdanosti S vrednosti. S vrednost je mera sliĉnosti unete sekvence sa sekvencama u bazi podataka i nezavisna je kako od dužine unete sekvence, tako i od veliĉine baze podataka. Što je veća vrednost bit score-a to je rezultat statistiĉki verovatniji. Rezultati dobijeni pretragom celokupne NCBI baze podataka proteina nr-aa (non- redundant amino acid), koja kombinuje ažurirane podatke od GenBank, UniProt, RefSeq, PRF i PDBSTR baza podataka, su pokazali da meĊu prvih 10 pogodaka, sa najvećom sliĉnošću (većom od 70 %), spadaju sekvence koje su oznaĉene kao MUC16 i MUC16- sliĉne (slika 14). Da bi se identifikovali proteini koji imaju manji stepen sliĉnosti u aminokiselinskoj sekvenci, ali koji se na osnovu E i S vrednosti statistiĉke znaĉajnosti mogu smatrati 55 homolozima ili udaljenim homolozima, vršena je analiza sekvenci u pojedinaĉnim tasksonomskim kategorijama. U tabeli 2 su prikazani rezultati ispitivanja sliĉnosti aminokiselinske sekvence MUC16/CA125, i sekvenci proteina iz baza podataka za sledeće taksonomske kategorije: virusi, bakterije, gljive i eukariote. Entry bits E-val --------------------------------------------------------------------- ----------- Top 10 Select operation Exec 1. sp:MUC16_HUMAN [Q8WXI7] RecName: Full=Mucin-16; Short=MUC-16; Al... 3.509e+04 0.0 >sp:MUC16_HUMAN [Q8WXI7] RecName: Full=Mucin-16; Short=MUC-16; AltName: Full=Ovarian cancer-related tumor marker CA125; Short=CA-125; AltName: Full=Ovarian carcinoma antigen CA125;>gp:AF414442_1 [AF414442] ovarian cancer related tumor marker CA125 [Homo sapiens] Length = 22152 Score = 3.509e+04 bits (91077), Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 18805/22135 (84%), Positives = 18805/22135 (84%) 2. rs:NP_078966 [NP_078966] mucin-16 [Homo sapiens]. 2.088e+04 0.0 >rs:NP_078966 [NP_078966] mucin-16 [Homo sapiens]. Length = 14507 Score = 2.088e+04 bits (54204), Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 11328/14523 (78%), Positives = 11514/14523 (79%), Gaps = 110/14523 (0%) 3. tr:B5ME49_HUMAN [B5ME49] SubName: Full=Uncharacterized protein; 1.324e+04 0.0 >tr:B5ME49_HUMAN [B5ME49] SubName: Full=Uncharacterized protein; Length = 8998 Score = 1.324e+04 bits (34353), Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 7245/8983 (80%), Positives = 7254/8983 (80%), Gaps = 2/8983 (0%) 4. gp:AF361486_1 [AF361486] mucin 16 [Homo sapiens] 9670 0.0 >gp:AF361486_1 [AF361486] mucin 16 [Homo sapiens] Length = 6995 Score = 9670 bits (25093), Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 5172/7023 (73%), Positives = 5405/7023 (76%), Gaps = 100/7023 (1%) 5. rs:XP_002828663 [XP_002828663] PREDICTED: LOW QUALITY PROTEIN: m... 7807 0.0 >rs:XP_002828663 [XP_002828663] PREDICTED: LOW QUALITY PROTEIN: mucin-16-like, partial [Pongo abelii]. Length = 10241 Score = 7807 bits (20256), Expect = 0.0, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 4320/5616 (76%), Positives = 4424/5616 (78%), Gaps = 13/5616 (0%) Slika 14. Web prikaz BLAST analize sekvence MUC16 (Q8WXI7). 56 Membranski glikoprotein (039781)/glikoprotein gp2 (Q6SV6W0) konjskog herpes virusa 1, kao i glikoprotein gp350-220 (E2GKY4) Epštajn-Bar virusa (EBV) su viralni proteini koji su pokazali najveću sliĉnost sekvence sa ciljanom sekvencom. Gp2 spada u grupu integralnih proteina kapsida virusa i uĉestvuje u njihovoj reprodukciji (Whittaker i sar., 1990; Wellington i sar., 1996; Learmonth i sar., 2002). Gp350-220 (BLLF1) je najzastupljeniji u omotaĉu herpes virusa i predstavlja glavni antigen, koji je odgovoran za stimulaciju produkcije neutrališućih antitela in vivo (Janz i sar., 2000; Luo i sar., 2012). Njegovo vezivanje za ćelijski receptor CD21, smatra se esencijalnim mehanizmom kojim EBV inficira B limfocite (Tanner i sar., 1987). Protein, izolovan iz ćelijskog zida Streptococcus pneumoniae, koji pripada familiji proteina za usidravanje (B2ISC7/Q97P71), i adhezin krvnih ploĉica bogat serinom (Q4L9P0), koji je izolovan iz Staphylococcus haemolyticus, su bakterijski proteini koji imaju sekvencu, koja je sliĉna sekvenci MUC16/CA125. Prema GO anotacijama, B2ISC7/Q97P71 ima aktivnost transmembranskog transportera, dok Q4L9P0 posreduje u vezivanju za specifiĉne ćelije, tj. ispoljava virulentnu aktivnost (http://www.uniprot.org/uniprot/B2ISC7; http://www.uniprot.org/uniprot/Q4L9P0; Takeuchi i sar., 2005; Ding i sar., 2009). U taksonomskoj kategoriji Fungi, naĊeni su proteini, sa visokom sliĉnošću sa MUC16/CA125, za koje je poznato da imaju mucinska svojstva. To su: flokulin, Flo11 (E9P8M0) i Muc1p (C8ZAR8), izolovani iz kvasca Saccharomyces cerevisiae. 57 Tabela 2. Rezultati ispitivanja sliĉnosti MUC16 (Q8WXI7), sa sekvencama proteina iz dostupnih baza podataka. E-vrednost: <1e -50 - homologija; 0.01 - 1e -50 – može biti homologija; 0.01 - 10 nije znaĉajna, udaljena homologija; >10 – rezultat sluĉajnosti ili su toliko udaljene da nije moguće detektovati njihovu srodnost datom metodom * pretraživano pomoću BLAST Baza podataka Pogodak* Protein Organizam Dužina Sliĉnost Score E-vrednost Virusi O39781/ Q6SV6WO Glikoprotein membrane, gp2 Equine herpesvirus 1 806 25% 295 1e-23 E2GKY4 Glikoprotein gp350-220 Epstein Barr virus 877 26% 170 3e-9 Bakterije B2ISC7/ Q97P71 Familija proteina za usidravanje Streptococcus pneumoniae (strain GSP14) 4695 17% 669 4e-66 Q4L9PO Adhezin krvnih ploĉica bogat serinom Staphylococcus haemolyticus (strain JCSC1435) 3608 20% 625 5e-61 Gljive E9P8M0 Flokulin sa ćelijske površine Saccharomyces cerevisiae 1630 24% 499 4e-47 C8ZAR8 Muc1p Saccharomyces cerevisiae 1576 23% 429 6e-39 Eukariote E9AEM9 Proteofosfoglikan 5 Leishmania major 17392 18% 1003 6e-105 58 Poznato je da regioni ovih fungalnih proteina, koji su bogati serinom i treoninom, uĉestvuju u formiranju pseudohifa i u adheziji, vezivanjem polisaharida u prirodnim uslovima i/ili invazivnim rastom na supstratima, bogatim polisaharidima (http://www.uniprot.org/uniprot/E9P8M0; http://www.uniprot.org/uniprot/C8ZAR8; Lambrechts i sar., 1996; Lo i Dranginis, 1998; Karunanithi i sar., 2010; Veelders i sar., 2010). Osim ovih proteina, a u okviru taksonomske kategorije Eukaryota, identifikovan je proteofosfoglikan 5, iz Leishmania major (E9AEM9). Ovaj molekul pripada familiji heterogenih polipeptida neobiĉne kompozicije i strukture, i sliĉan je mucinima. On je najzastupljeniji molekul na površini ćelije promastigota (stadijum ćelije bilo kojeg roda vrste Leishmania, kad zadobiju flagele), i poznato je da uĉestvuje u priĉvršćivanju za prenosioca/vektora (Secundino i sar., 2010). Pored toga, on može aktivirati komplement, ali ima slaba imunogena svojstva, tj. ponaša se kao ugljeni hidrat (Aebischer i Harbecke 1999). 4.1.1.2. CLUSTALW analiza Kako bi se dobio uvid u homologiju proteinske sekvence MUC16 sa sekvencama drugih poznatih mucina, uraĊena je ClustalW2 analiza. Ovaj tip analize omogućava izuĉavanje evolutivnih odnosa izmeĊu ispitivanih sekvenci, a baziran je na progresivnom poravnjanju sekvenci, kod koga su homologe sekvence evolutivno srodne. Dobijeni rezultati su prikazani u formi filograma (slika 15). Filogram predstavlja filogenetsko (evolutivno) razgranato stablo (dijagram) koje prikazuje evolutivne odnose izmeĊu razliĉitih ispitivanih molekula mucina, preko sliĉnosti i razlika u njihovim sekvencama. Prema filogramu, MUC16 je najviše homolog MUC14 (Endomucin 2, UniProt pristupni broj Q9ULC0), 59 MUC15 (Q8N387) i MUC18 (P43121). MUC14 i MUC15, prema GO anotacijama, spadaju u potencijalno transmembranske i sekretorne proteine, dok je MUC18 transmembranski protein. Oni uĉestvuju u adheziji ćelija i adheziji ćelija i ekstraćelijskog matriksa. Slika 15. Filogram homologije proteinskih sekvenci humanih mucina. Filogram je konstruisan pomoću CLUSTALW2 programa iz višestruko poravnatih kompletnih sekvenci humanih mucina sa MUC16 (Q8WXI7). 4.1.2. Ispitivanje prisustva domena i strukturnih motiva 4.1.2.1. CDD analiza Rezultati analize prisustva konzerviranih domena u proteinskoj sekvenci MUC16, pomoću CDD v2.26 – 38392 PSSMs (position-specific scoring matrices), prikazani su na slikama 16 i 17. Pokazano je da proteinska sekvenca MUC16 poseduje veći broj SEA domena (65), a njihovo prisustvo je, takoĊe, pokazano i InterProScan i ScanProsite analizom. SEA domen (Sea urchin sperm protein, Enterokinaza i Agrin) je ekstracelularni domen koji je O- 60 glikozilovan. Pretpostavlja se da ima regulatornu funkciju ili funkciju vezivanja ugljenohidratnih boĉnih lanaca, a nedavno je dokazana proteolitiĉka aktivnost SEA domena. Poznato je da se ovaj domen nalazi kod humanih mucina MUC1, MUC3, MUC12, MUC13, MUC16 i MUC17. Slika 16. Grafiĉki prikaz analize konzerviranih domena u proteinskoj sekvenci MUC16. Analiza je vršena pomoću CDD v2.26 – 38392 PSSMs. Pored SEA domena, ĉije su se E-vrednosti kretale od 3.62e-18 do 7.89e-4, dobijeni rezultati su ukazali i na prisustvo domena koji bi se, na osnovu E-vrednosti, mogli ubrojati u grupu rezultata koji se definišu kao “mogu se smatrati homologim”. Identifikovana su dva multidomena: domen koji odgovara Pfam familiji glikoproteina 2 (gp2) herpes virusa konja (PF05955), E-vrednost 2.56e-6, i domen koji odgovara Pfam familiji glikoproteina spoljašnjeg omotaĉa herpes virusa, gp350-220 (BLLF1; PF05109), E-vrednost 4.81e-3. Polazeći od moguće strukturne sliĉnosti bazirane na prisustvu definisanih konzerviranih domena, eksperimentalna validacija ovog rezultata je vršena na osnovu pretpostavljene CA125-imunoreaktivnosti glikoproteina omotaĉa virusa iz familije Herpesviridae. 61 Slika 17. Web prikaz analize konzerviranih domena u proteinskoj sekvenci MUC16. Analiza je vršena pomoću CDD v2.26 – 38392 PSSMs. 62 Rezultati ispitivanja unakrsne reaktivnosti OC125-sliĉnog i M11-sliĉnog anti-CA125 antitela sa glikoproteinima kapsida Epštajn Bar virusa (EBV) ili Herpes simplex virusa (HSV1) su prikazani na slici 18. OC125-sliĉno antitelo je dalo merljivu reaktivnost prema HSV-1 antigenima, kao i antigenima kapsida EBV. M11-sliĉno antitelo je dalo merljivu reaktivnost samo prema HSV-1 antigenima, ali manju u odnosu na OC125-sliĉno antitelo. Oba antitela su imala daleko slabiju reaktivnost sa antigenima virusa, u odnosu na reaktivnost sa CA125. Slika 18. Unakrsna reaktivnost antitela na humani CA125 sa glikoproteinima virusa iz familije Herpesviridae. Monoklonska antitela na CA125, klonovi X306 (OC125-sliĉna) i X325 (M11-sliĉna) su inkubirana sa imobilisanim antigenima kapsida Epštajn Bar virusa (EBV) ili antigenima Herpes simplex virusa (HSV1). Detekcija je vršena antitelom na mišiji IgG. Izmerena je absorbanca na 450 nm. Nespecifiĉno vezivanje je odreĊeno korišćenjem irelevantnog monoklonskog antitela na humani horionski gonadotropin (C). 63 4.1.2.2. BLOCKS analiza BLOCKS analizom konzerviranih domena i motiva (blokova) u sekvenci humanog MUC16, na osnovu E vrednosti 6.2e-3, naĊena je moguća homologija, samo, za motiv sliĉan cink- prstima (Zinc-fingers-Znf), tipa A20 (tabela 3). Tabela 3. Domeni/strukturni motivi dobijeni BLOCKS analizom proteinske sekvence MUC16. Ime domena/strukturnog motiva BLOCKS E-vrednost WSG domen koji vezuje ugljene hidrate 1 od 2 0.11 Na+/H+ izmenjivaĉ domen, izoforma 1 1 of 12 0.18 dihidroksilna kiselina/6-fosfoglukonat dehidrataza domen 1 of 7 0.88 domen sliĉan O-glikozil hidrolazi 1 of 7 0.16 motiv bakterijskog formiranja jezgara leda 1 of 12 0.25 motiv vazopresin VIB receptora 1 of 9 0.28 motiv sliĉan peropsinu 1 of 11 0.31 motiv sliĉan cink-prstima, tip A20 1 of 3 0.0062 motiv velikog viralnog kapsidnog proteina 1 of 12 0.045 motiv sliĉan tipu II sekrecionom haperonu SycE Gram-negativnih bakterija 1 of 5 0.28 motiv sliĉan C-X-C hemokinskom receptoru, tip 5 1 of 8 0.36 64 Identifikovan motiv sliĉan Znf pripada tipu A20, tj. onom koji se nalazi na proteinu A20, inhibitoru ćelijske smrti koji deluje na NF-kappaB aktivaciju (nuclear factor kappa-light- chain-enhancer of activated B cells), preko signalnog puta receptora TNF (tumor necrosis factor) (Prasad, 2007). Znf motivi su, generalno, relativno mali proteinski motivi koji omogućavaju kontakte tandemskih ponovaka sa ciljnim molekulom. Neki od ovih domena vezuju cink, ali neki i druge metale, kao što je gvožĊe, ili ĉak i druge molekule (http://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR002653). Za ostale domene i strukturne motive E-vrednost je bila veća od 0.01, što ukazuje da poklapanje nije znaĉajno i moguća je jedino udaljena homologija. 4.1.2.3. Prosite i iProClass analiza Prema rezultatima pretraživanja Prosite baze podataka (slika 19), MUC16 poseduje 11 SEA domena, region sliĉan α i β subjedinici ATP sintaze (ATP synthase alpha and beta subunits signature), kao i strukturne motive sa visokom i ĉesto nespecifiĉnom uĉestalošću (tabela 4). Usaglašen obrazac (consensus pattern) α i β subjedinice ATP sintaze je P - [SAP] - [LIV] - [DNH] - {LKGN} - {F} - {S} - S - {DCPH} – S, gde prvi S ostatak može biti aktivno mesto. Od ukupnog broja pogodaka za ovaj obrazac u UniProtKB/Swiss-Prot bazi podataka (2272 pogodaka u 2272 razliĉitih sekvenci), MUC16 poseduje obrazac PALHEITSSS (aminokiseline od 10348-10357) i ubrajan je u grupu lažno-pozitivnih rezultata. iProClass analizom proteinske sekvence MUC16 pronaĊeni su isti motivi naĊeni Prosite analizom. 65 Slika 19. Šematski prikaz domena/strukturnih motiva dobijenih ScanProsite analizom proteinske sekvence MUC16. Tabela 4. Strukturni motivi sa visokom i ĉesto nespecifiĉnom uĉestalošću dobijeni ScanProsite analizom proteinske sekvence MUC16. Strukturni motivi sa visokom i ĉesto nespecifiĉnom uĉestalošću Usaglašen obrazac mesta bogata serinom mesta bogata treoninom mesta N-glikozilacije N - {P} - [ST] - {P} N je mesto glikozilacije mesta fosforilacije cAMP i cGMP zavisne protein kinaze [RK](2) - x - [ST] S i T su mesta fosforilacije mesta fosforilacije protein kinaze C [ST] - x - [RK] S i T su mesta fosforilacije mesta fosforilacije kazein kinaze II [ST] - x(2) - [DE] S i T su mesta fosforilacije mesta fosforilacije tirozin kinaze, mesta amidacije RK] - x(2) - [DE] - x(3) - Y or [RK] - x(3) - [DE] - x(2) - Y Y je mesto fosforilacije mesta N-miristilacije G - {EDRKHPFYW} - x(2) - [STAGCN] - {P} - G na N terminusu je mesto miristilacije motiv leucinski rajsferšlus L - x(6) - L - x(6) - L - x(6) - L 66 4.1.2.4. MyHits analiza Analiza MUC16 proteinske sekvence, pomoću razliĉitih parametara za skeniranje motiva i obrazaca u MyHits bazi podataka, je pored domena i motiva dobijenih ScanProsite analizom, ukazala i na motiv koji je sliĉnan motivu kod IFRD (Interferon-related developmental regulator), a koji se, na osnovu E vrednosti, može smatrati homologim. Ostali identifikovani domeni su imali E vrednosti, koje su ukazivale da poklapanje nije znaĉajno, ali je moguća daleka homologija (tabela 5). Tabela 5. Obrasci/strukturni motivi dobijeni MyHits* analizom proteinske sekvence MUC16. Strukturni motivi i obrasci E vrednost protein regulator razvića koji je srodan interferonu-IFRD 0.0015 Staphylocoagulase ponovak 0.22 Motivi sliĉni motivima familije CheC proteina. (CheC je fosfataza CheY-P proteina - chemotactic response regulator) 0.83 Protein Borrelia-ponovak 1 PAAR motiv (motiv prisutan obiĉno u parovima kod familije membranskih proteina bakterija) 1.1 Koagulacioni faktor V LSPD ponovak (ime LSPD potiĉe od konzerviranih aminokiselinskih ostataka u sredini ponovka, u okviru B domena koagulacionog faktora V, koji se iseca neposredno pre njegove aktivacije) 1.7 Motiv proteina LPxTG koji je prisutan na površini Gram-pozitivnih koka (Gram-positive cocci surface proteins LPxTG motif profile) 2.1 NUMOD3 motiv (vezuje DNK, naĊen je kod "homing" endonukleaza i njima srodnim proteinima) 3.3 Obuhvata baze podataka: PeroxiBase, HAMAP, PROSITE, More profili, PROSITE obrasci - frequent match producers, Pfam HMMs - local models i Pfam HMMs - global models 67 4.1.3. Fiziĉko-hemijske osobine, globularnost i odstupanje od pretpostavljene tercijarne strukture proteinske sekvence MUC16 4.1.3.1. ProtParam Analiza fiziĉko-hemijskih osobina sekvence MUC16, izvršena je pomoću ProtParam alatke. Ona omogućava izraĉunavanje razliĉitih fiziĉkih i hemijskih parametara unete sekvence proteina. U ove parametre spadaju molekulska masa, teorijska izoelektriĉna taĉka, atomski sastav, ekstinkcioni koeficijent, procenjen polu-život, indeks nestabilnosti, indeks alifatiĉnosti i GRAVY indeks (koji govori o solubilnosti proteina). Dobijeni rezultati prikazani su na slici 20. Rezultati pokazuju da je MUC16 sekvenca najbogatija treoninom (15.9 %), serinom (14.8 %), leucinom (9.3 %) i prolinom (8.5 %). Procenjen polu-život molekula MUC16 (vreme koje je potrebno da ostane polovina od ukupnog pula sintetisanog proteina, a koje zavisi od aminokiseline na N-terminusu) je 30 sati (sisarski retikulociti, in vitro), 20 sati (kvasac, in vivo), 10 sati (Escherichia coli, in vivo). Indeks nestabilnosti je procenjen na 42.94, što MUC16 klasifikuje u nestabilne proteine. Indeks alifatiĉnosti (termostabilnost globularnih proteina) MUC16 iznosi 68.32 (ima nisku termostabilnost, što je u saglasnosti sa drugim proteinima koji su bogati serinom i treoninom (α-amilaza, enolaza, termolizin i alkalna proteaza). GRAVY indeks (solubilnost proteina) iznosi -0.310, što MUC16 svrstava u hidrofilne proteine. 4.1.3.2. ProtScale ProtScale analiza je, na osnovu procentualno višeg sadržaja negativnih nego pozitivnih vrednosti za aminokiseline, pokazala da je MUC16 najvećim delom hidrofilan (slika 21). 68 ProtParam MUC16_HUMAN (Q8WXI7) Mucin-16 (MUC-16) (Ovarian cancer-related tumor marker CA125) (CA-125) (Ovarian carcinoma antigen CA125) Homo sapiens (Human). The parameters have been computed for the following feature: FT CHAIN 1 22152 Mucin-16. The computation has been carried out on the complete sequence (22152 amino acids). Number of amino acids: 22152 Molecular weight: canno Theoretical pI: and Amino acid composition: CSV format Ala (A) 998 4.5% Arg (R) 824 3.7% Asn (N) 655 3.0% Asp (D) 696 3.1% Cys (C) 138 0.6% Gln (Q) 460 2.1% Glu (E)1128 5.1% Gly (G)1373 6.2% His (H) 500 2.3% Ile (I) 751 3.4% Leu (L)2063 9.3% Lys (K) 574 2.6% Met (M) 434 2.0% Phe (F) 560 2.5% Pro (P)1893 8.5% Ser (S)3287 14.8% Thr (T)3533 15.9% Trp (W) 162 0.7% Tyr (Y) 412 1.9% Val (V)1090 4.9% Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0% (B) 0 0.0% (Z) 0 0.0% (X) 621 2.8% Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 1824 Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 1398 Atom composition: As there is at least one ambiguous position (B,Z or X) in the sequence considered, the atomic composition cannot be computed. Extinction coefficients: Extinction coefficients are in units of M -1 cm -1 , at 280 nm measured in water. Ext. coefficient 1513505 Abs 0.1% (=1 g/l) 0.000, assuming all pairs of Cys residues form cystines Ext. coefficient 1504880 Abs 0.1% (=1 g/l) 0.000, assuming all Cys residues are reduced Estimated half-life: The N-terminal of the sequence considered is M (Met). The estimated half-life is: 30 hours (mammalian reticulocytes, in vitro). >20 hours (yeast, in vivo). >10 hours (Escherichia coli, in vivo). Instability index: The instability index (II) is computed to be 42.94. This classifies the protein as unstable. Aliphatic index: 68.32 Grand average of hydropathicity (GRAVY): -0.310 Slika 20. Web prikaz rezultata ProtParam analize sekvence MUC16. 69 Slika 21. Hidrofobnost proteinske sekvence MUC16 bazirana na „Kyte i Doolitle“ vrednostima. Pozitivne vrednosti predstavljaju aminokiseline koje doprinose hidrofobnosti dok negativne vrednosti predstavljaju aminokiseline koje doprinose hidrofilnosti proteinske sekvence MUC16. Hphob. / Kyte & Doolittle, individualne vrednosti za 20 aminokiselina su: Ala: 1.800 Arg: -4.500 Asn: -3.500 Asp: -3.500 Cys: 2.500 Gln: -3.500 Glu: -3.500 Gly: - 0.400 His: -3.200 Ile: 4.500 Leu: 3.800 Lys: -3.900 Met: 1.900 Phe: 2.800 Pro: - 1.600 Ser: -0.800 Thr: -0.700 Trp: -0.900 Tyr: -1.300 Val: 4.200 : -3.500 : -3.500 : - 0.490. 70 4.1.3.3. GLOBPLOT GLOBPLOT analizom proteinske sekvence MUC16, pokazano je da je odstupanje od pretpostavljene tercijarne strukture najveće u ekstracelularnom regionu (1-12000 aminokiseline), a da je globularnost najviše zastupljena u regionu sekvence koji sadrži SEA domene, transmembranski domen i citoplazmatski rep (12000-22152 aminokiseline) (slika 22). Slika 22. GLOBPLOT analiza proteinske sekvence MUC16, koja se bazira na Russell/Linding-ovim vrednostima. 71 4.1.4. Predikcija funkcije MUC16 4.1.4.1. ProtFun analiza Rezultati ProtFun 2.2 analize funkcije MUC16, na osnovu njegove proteinske sekvence, prikazani su na slici 23. Budući da se sekvenca MUC16 sastoji od preko 22000 aminokiselina, što je ekstremno veliki broj, ona je analizirana u delovima od 5000 aminokiselina, usled ograniĉenja kapaciteta servera. Dobijeni rezultati su prikazani u formi funkcionalnih kategorija gena i genskih produkata i GeneOntology kategorija. Verovatnoća za dobijene kategorije je bila, generalno, mala. U okviru funkcionalnih kategorija gena i genskih produkata, sa verovatnoćom 0.560 i šansom 2.305, MUC16 je homolog grupi proteina koji uĉestvuju u metabolizmu purina i pirimidina, dok je, sa verovatnoćom 0.533 i šansom 1.299, on homolog grupi proteina koji uĉestvuju u transportu i vezivanju atoma i molekula. MUC16 je, takoĊe, sa verovatnoćom 0.420 i šansom 1.465, okarakterisan kao enzim nepoznate klase. U okviru GeneOntology kategorija, sa verovatnoćom 0.219 i šansom 7.809, MUC16 je homolog grupi strukturnih proteina, a sa verovatnoćom 0.220 i šansom 1.757, homolog proteinima koji uĉestvuju u regulaciji transkripcije. 4.1.4.2. JAFA analiza JAFA analiza sekvence MUC16, prikazana je na u tabeli 6. Prikazani GO nivoi oznaĉavaju specifiĉnost GO funkcionalnog termina (što je veći GO nivo, to je i specifiĉnost GO funkcionalnog termina veća), a odgovarajuće ocene odreĊuju koliko je dobra data anotacija, balansirajući izmeĊu rezultata predviĊanja i servera koji su se saglasili za dati GO funkcionalni termin. 72 ############## ProtFun 2.2 predictions ############## >Sequence # Functional category Prob Odds Amino_acid_biosynthesis 0.024 1.071 Biosynthesis_of_cofactors 0.058 0.808 Cell_envelope 0.032 0.517 Cellular_processes 0.032 0.432 Central_intermediary_metabolis 0.060 0.945 Energy_metabolism 0.023 0.259 Fatty_acid_metabolism 0.016 1.265 Purines_and_pyrimidines => 0.560 2.305 Regulatory_functions 0.252 1.566 Replication_and_transcription 0.132 0.491 Translation 0.027 0.613 Transport_and_binding => 0.533 1.299 # Enzyme/nonenzyme Prob Odds Enzyme => 0.420 1.465 Nonenzyme 0.580 0.813 # Enzyme class Prob Odds Oxidoreductase (EC 1.-.-.-) 0.024 0.114 Transferase (EC 2.-.-.-) 0.096 0.279 Hydrolase (EC 3.-.-.-) 0.068 0.215 Lyase (EC 4.-.-.-) 0.020 0.430 Isomerase (EC 5.-.-.-) 0.010 0.321 Ligase (EC 6.-.-.-) 0.017 0.326 # Gene Ontology category Prob Odds Signal_transducer 0.143 0.667 Receptor 0.011 0.066 Hormone 0.001 0.206 Structural_protein => 0.219 7.809 Transporter 0.025 0.230 Ion_channel 0.011 0.195 Voltage-gated_ion_channel 0.005 0.212 Cation_channel 0.010 0.224 Transcription 0.075 0.586 Transcription_regulation => 0.220 1.757 Stress_response 0.017 0.196 Immune_response 0.016 0.187 Growth_factor 0.007 0.529 Metal_ion_transport 0.009 0.020 Slika 23. Sumarni web prikaz analize MUC16 sekvence pomoću ProtFun2.2 servera. 73 Tabela 6. Sumarni prikaz rezultata analize sekvence Q8WXI7 (MUC16/CA125) na JAFA serveru*. Biološki procesi Molekularna funkcija Ćelijska komponenta GO / GO-nivo Score Ime GO / GO- nivo Score Ime GO / GO-nivo Score Ime 0015986 / 6 2.00 ATP sinteza kuplovana sa transportom protona 0004339 / 6 2.00 Hidroliza terminalne D- glukoze vezane α1,4 vezom 0005886 / 3 1.00 Plazma membrana 0006030 / 6 2.00 Metabolizam hitina 0005524 / 5 1.67 Vezivanje ATP 0016469 / 2 0.67 Veliki proteinski kompleks za katalizu sinteze ili hidrolize ATP-a rotacionim mehanizmom 0000272 / 6 2.00 Katabolizam polisaharida 0008061 / 4 1.33 Vezivanje hitina 0005615 / 2 0.67 Ekstraćelijski prostor 0007160 / 4 1.33 Adhezija ćelije za matriks 0005515 / 2 0.67 Vezivanje proteina 0007124 / 3 1.00 Rast pseudohifa 0005554 / 1 0.33 Nepoznata molekularna funkcija 0001403 / 3 1.00 Invazivni rast (sensu Saccharomyces) * pretraživano pomoću http://jafa.burnham.org; izabrani rezultati. 74 Dobijeni rezultati su ukazali na sledeće GeneOntology funkcionalne termine (pristupni brojevi): u okviru domena molekularna funkcija GO:0004339 (GO nivo 6, ocena 2.00), GO:0005524 (GO nivo 5, ocena 1.67), GO:0008061 (GO nivo 4, ocena 1.33), GO:0005515 (GO nivo 2, ocena 0.67) i GO:0005554 (GO nivo 1, ocena 0.33); u okviru domena ćelijska komponenta GO:0005886 (GO nivo 3, ocena 1.00), GO:0016469 (GO nivo 2, ocena 0.67) i GO:0005615 (GO nivo 2, ocena 0.67); i u okviru domena biološki procesi GO:0015986 (GO nivo 6, ocena 2.00), GO:0006030 (GO nivo 6, ocena 2.00), GO:0000272 (GO nivo 6, ocena 2.00), GO:0007160 (GO nivo 4, ocena 1.33), GO:0007124 (GO nivo 3, ocena 1.00) i GO:0001403 (GO nivo 3, ocena 1.00). Termin GO:0004339 (1,4-alfa-D-glukan glukohidrolazna aktivnost) se odnosi na katalizu hidrolize terminalne D-glukoze vezane α1,4 vezom, sukcesivno, sa neredukujućih krajeva lanaca, sa oslobaĊanjem β-D-glukoze. Termin GO:0005524 (vezivanje ATP) se odnosi na selektivno vezivanje za ATP, adenozin 5’-trifosfat. Termin GO:0008061 (vezivanje hitina) se odnosi na selektivnu i nekovalentnu interakciju sa hitinom, linearnim polisaharidom koji se sastoji od N-acetil-D-glukozaminskih ostataka, vezanih α1,4 vezom. Termin GO:0005515 (vezivanje aminokiselina proteina), se odnosi na selektivnu i nekovalentnu interakciju sa bilo kojim proteinom ili proteinskim kompleksom (kompleksom dva ili više proteina koji mogu da sadrže i neproteinske molekule). Termin GO:0005554 je termin sa nepoznatom molekularnom funkcijom. GO:0005886 (plazma membrana) termin se odnosi na ćelijsku membranu. GO:0016469 (dvo-sektorni ATP-azni kompleks za transportovanje vodonika, hydrogen-transporting two-sector ATPase complex) termin se odnosi na veliki proteinski kompleks koji katalizuje sintezu ili hidrolizu ATP-a rotacionim mehanizmom, 75 povezanim sa transportovanjem protona kroz membranu. Ovaj kompleks se sastoji od membranskog dela, koji transportuje protone, i citoplazmatskog dela, koji katalizuje sintezu ili hidrolizu ATP-a. Termin GO:0005615 (ekstraćelijski prostor) se odnosi na prostor unutar višećelijskog organizma, koji se nalazi sa spoljne strane plazma membrane i ispunjen je teĉnošću. GO:0015986 (ATP sinteza kuplovana sa transportom protona) termin se odnosi na procese transporta protona kroz membranu, koji stvaraju elektrohemisjki potencijal, koji se koristi za sintezu ATP-a. Termin GO:0006030 (procesi metabolizma hitina) se odnosi na hemijske reakcije i metaboliĉke puteve hitina, dok se termin GO:0000272 (katabolizam polisaharida) odnosi na hemijske reakcije i metaboliĉke puteve, ĉiji je krajnji rezultat degradacija polisaharida, polimera od 10 i više monosaharida vezanih glikozidnom vezom. GO:0007160 (adhezija ćelije za matriks) termin se odnosi na vezivanje ćelije za ekstraćelijski matriks preko adhezionih molekula. GO:0007124 (rast pseudohifa) termin se odnosi na obrazac ćelijskog rasta, u uslovima ograniĉene koliĉine azota i velike koliĉine ugljenika za fermentisanje, kada ćelije postaju izdužene, zadobijaju obrazac unipolarnog pupljenja i ostaju fiziĉki meĊusobno spojene. Termin GO:0001403 (invazivni rast u nedostatku glukoze) se odnosi na obrazac rasta naĊen pri pupljenju haploidnih ćelija, pod odreĊenim uslovima, u kojima ćelije zadržavaju tipiĉno aksijalno pupljenje haploidnih ćelija, ali postaju izdužene i ne uspevaju da se razdvoje posle deobe; primer ovog procesa je naĊen kod Saccharomyces cerevisiae. 4.1.4.3. PFP analiza Rezultati analize sekvence MUC16, pomoću PFP: Automated Protein Function Prediction servera, prikazani su u tabeli 7. 76 Tabela 7. PredviĊeni GO termini za unetu Q8WXI7 (Muc16/CA125) sekvencu*. *pretraživano pomoću http://dragon.bio.purdue.edu/pfp; izabrani rezultati. Biološki procesi Molekularna funkcija Ćelijska komponenta GO Score Definicija GO Score Definicija GO Score Definicija 0006812 5363 Transport katjona 0005515 3567 Vezivanje proteina 0005624 24775 Membranska frakcija 0007155 4679 Adhezija ćelija 0004867 3371 Aktivnost inhibitora endopeptidaze 0005887 4420 Deo membrane 0007275 4273 Razvoj 0004872 3133 Aktivnost receptora 0016020 4305 Membrana 0006929 3310 Ćelijska migracija vezana za supstrat 0004672 2914 Aktivnost protein kinaze 0005622 3129 Intraćelijski 0050652 2664 Biosinteza polisaharidnih lanaca 0004674 2623 Aktivnost Ser/Thr kinaze 0016021 2363 Sastavni deo membrane 0007166 2554 Signalna transd. receptora vezanog za površinu ćelije 0005529 2445 Vezivanje šećera 0005578 2118 Extraćelijski matriks (sensu Metazoa) 0007165 2416 Signalna transdukcija 0005524 2219 Vezivanje ATP 0005634 1939 Nukleus 0006917 2213 Indukcija apoptoze 0008270 2206 Vezivanje jona cinka 0005856 1764 Citoskelet 0008228 2079 Opsonizacija 0003804 2154 Aktivnost koagulacionog faktora Xa 0009897 1633 Spoljna strana membrane 0035162 2071 Embrionalna hematopoeza 0046703 2075 Vez. receptora sliĉnog rec. NK ćelija 0005615 1531 Ekstraćelijski prostor 77 U okviru GO domena molekularna funkcija, pored termina koji su naĊeni JAFA analizom, GO:0005515 (vezivanje proteina) i GO:0005524 (vezivanje ATP), izdvajaju se sledeći GeneOntology termini: GO:0004867 (aktivnost inhibitora endopeptidaze, ocena 3371), GO:0004872 (aktivnost receptora, ocena 3113), GO:0004672 (aktivnost protein kinaze, ocena 2914), GO:0004674 (aktivnost Ser/Thr kinaze, ocena 2623), GO:0005529 (vezivanje šećera, ocena 2445), GO:0008270 (vezivanje jona cinka, ocena 2206), GO:0003804 (aktivnost koagulacionog faktora Xa, ocena 2154) i GO:0046703 (vezivanje receptora sliĉnog receptoru NK ćelija, ocena 2075). U okviru GO domena ćelijska komponenta, osim termina koji je naĊen JAFA analizom, GO:0005615 (ekstraćelijski prostor), naĊeni su i GO:0005624 (membranska frakcija, ocena 24775), GO:0005887 (deo membrane, ocena 4420), GO:0016020 (membrana, ocena 4305), GO:0005622 (unutarćelijski, ocena 3129), GO:0016021 (sastavni deo membrane, ocena 2363), GO:0005578 (ekstraćelijski matriks, sensu Metazoa, ocena 2118), GO:0005634 (nukleus, ocena 1939), GO:0005856 (citoskelet, ocena 1764), GO:0009897 (spoljna strana membrane, ocena 1633). U okviru GO domena biološki procesi, naĊeni su sledeći termini: GO:0006812 (transport katjona, ocena 5363), GO:0007155 (adhezija ćelija, ocena 4679), GO:0007275 (razvoj, ocena 4273), GO:0006929 (ćelijska migracija vezana za supstrat, ocena 3310), GO:0050652 (biosinteza polisaharidnih lanaca, ocena 2664), GO:0007166 (signalna transdukcija receptora vezanog za površinu ćelije, ocena 2554), GO:0007165 (signalna transdukcija, ocena 2416), GO:0006917 (indukcija apoptoze, ocena 2213), GO:0008228 (opsonizacija, ocena 2079) i GO:0035162 (embrionalna hematopoeza, ocena 2071). 78 4.1.4.4. GeneOntology analiza Rezultati GeneOntology analize sekvence MUC16, prikazani su na slici 24. Dobijeni rezultati, u okviru domena biološki procesi, su ukazali da se, pored GO:0007155 (ćelijska adhezija) koji je naĊen pomoću PFP, izdvajaju i sledeći termini: GO:0009987 (ćelijski procesi) i GO:0022610 (biološka adhezija). Slika 24. Web prikaz analize MUC16 sekvence u GeneOntology bazi podataka. 79 U okviru domena ćelijska komponenta, osim GO:0005615 (ekstraćelijski prostor), koji je naĊen pomoću JAFA i PFP, kao i GO:0016020 (membrana) i GO:0016021 (sastavni deo membrane) naĊeni pomoću PFP, naĊeni su sledeći termini: GO:0005576 (ekstraćelijski region), GO:0005623 (ćelija), GO:0044421 (deo ekstraćelijskog regiona), GO:0044464 (ćelijski deo), GO:0005615 (ekstraćelijski prostor), GO:0071944 (periferni deo ćelije), GO:0044425 (deo membrane), GO:0005886 (plazma membrana), GO:0019898 (spoljašnji deo membrane), GO:0031224 (unutrašnji deo membrane). U okviru domena molekularna funkcija, osim GO:0005515 (vezivanje proteina), koji je naĊen pomoću JAFA i PFP, naĊen je i termin GO:0005488 (vezivanje). 80 4.2. Glikobiohemijska analiza 4.2.1. Uticaj CA125 antigena na eritrocite ĉoveka 4.2.1.1. Uticaj CA125 antigena na agregaciju eritrocita Analiza agregacije je vršena u suspenziji eritrocita, koja je naneta na staklene ploĉice u vidu kapi. U nju su dodati odgovarajući CA125 antigeni, i nakon inkubacije od 30 minuta, na sobnoj temperaturi, reprezentativna polja sa ćelijama su posmatrana pod svetlosnim mikroskopom pri uvećanju 20 x i 40 x (slike 25, 26 i 27). Za razliku od kontrolnog uzorka, gde su ćelije individualno rasporeĊene (slika 25 c, d), u prisustvu CA125 antigena fetalnog porekla, pCA125 (slika 25 a, b), kao i u prisustvu CA125 antigena iz pleuralne teĉnosti ĉoveka, pfCA125 (slika 26 a-d) zapaženo je formiranje grozdastih agregata/miniklastera. Individualne ćelije unutar agregata su ostale okrugle, a morfologija formiranih agregata je bila sliĉna u prisustvu oba antigena. Isti efekat na agregaciju eritrocita, postignut je u prisustvu oba antigena, ali pri 40 puta manjoj koncentraciji pCA125 (500 IU/mL), u odnosu na pfCA125 (20000 IU/mL). Za razliku od pCA125 i pfCA125, CA125 iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka, clCA125 (slika 27 a, b), nije imao efekat na agregaciju eritrocita. 81 Slika 25. Uticaj pCA125 antigena na agregaciju eritrocita. Suspenzija eritrocita je naneta u vidu kapi, na staklene ploĉice, a zatim je dodat pCA125. Nakon inkubacije od 30 minuta, na sobnoj temperaturi, ćelije su posmatrane svetlosnim mikroskopom. pCA125 - antigen fetalnog porekla (a, b) 500 IU/mL pCA125 (c, d) Suspenzija eritrocita bez dodatog CA125 antigena je korišćena kao kontrola. 82 Slika 26. Uticaj pfCA125 antigena na agregaciju eritrocita. pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera (a, b) 20000 IU/mL pfCA125 (c, d) 4000 IU/mL pfCA125. 83 Slika 27. Uticaj clCA125 antigena na agregaciju eritrocita. clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka (a) 20000 IU/mL clCA125 (b) 4000 IU/mL clCA125. 4.2.1.2. Uticaj CA125 antigena na adheziju eritrocita Adhezija eritrocita na polistirenske ploĉe obložene poli-L-lizinom, u prisustvu CA125 antigena, prikazana je na slikama 28, 29 i 30. pCA125 antigen je inhibirao adheziju eritrocita na dozno zavisan naĉin (do 23 % kontrolne vrednosti) (slika 28), dok su, pri istim testiranim koncentracijama, pfCA125 (slika 29) i clCA125 (slika 30) bili znatno manje efikasni (do 83 % i do 85 % kontrolne vrednosti, redom). Na 20 do 40 puta većim koncentracijama, pfCA125 je ispoljio sliĉan efekat kao pCA125 (do 19 % kontrolne vrednosti), dok je efekat clCA125 i dalje bio mnogo manji (65 % kontrolne vrednosti). 84 Slika 28. Uticaj pCA125 antigena na adheziju eritrocita. Ploĉe su obložene poli-L-lizinom, blokirane BSA, a onda su dodati pCA125 antigen i humani eritrociti. Nakon inkubacije, neadherirane ćelije su nežno isprane adhezionim puferom, a adherirane ćelije su lizirane destilovanom vodom. Izmerena je absorbanca na 405 nm, kao mera ukupnog broja adheriranih ćelija. Rezultati su prikazani kao procenat kontrole (broj adheriranih eritrocita bez dodatog pCA125 antigena, arbitrarno 100 %). pCA125 - antigen fetalnog porekla. Slika 29. Uticaj pfCA125 antigena na adheziju eritrocita. Rezultati su prikazani kao procenat kontrole (broj adheriranih eritrocita bez dodatog pfCA125 antigena, arbitrarno 100 %). pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera. 85 Slika 30. Uticaj clCA125 antigena na adheziju eritrocita. Rezultati su prikazani kao procenat kontrole (broj adheriranih eritrocita bez dodatog clCA125 antigena, arbitrarno 100 %). clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. Paralelno sa ovim eksperimentima, raĊen je test adhezije na staklenim ploĉicama obloženim poli-L-lizinom, koji je omogućio uvid u izgled i morfologiju adheriranih ćelija (slika 31). Dobijeni rezultati su bili u skladu sa efektima zapaženim u testu na polistirenskim ploĉama. 86 Slika 31. Test adhezije eritrocita u prisustvu CA125 antigena. Staklene ploĉice su obložene poli-L-lizinom, blokirane BSA, a onda su dodati odgovarajući CA125 antigeni i eritrociti. Adherirane ćelije su posmatrane svetlosnim mikroskopom pri uvećanju 20 x (inserti 40 x). Kontrola - adhezija eritrocita bez dodatog CA125 antigena. pCA125 - antigen fetalnog porekla: b) 500 IU/mL i c) 50 IU/mL pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera: a1) 20000 IU/mL, b1) 5000 IU/mL i c1) 500 IU/mL clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka: a2) 20000 IU/mL, b2) 5000 IU/mL i c2) 500 IU/mL. 87 4.2.1.3. Hemoliza eritrocita u prisustvu CA125 antigena Uticaj CA125 antigena na hemolizu eritrocita, izazvanu SDS-om, prikazan je na slici 32. Nije uoĉena razlika izmeĊu kontrole (eritrociti bez dodatih antigena) i eritrocita inkubiranih sa ispitivanim CA125 antigenima, u koncentracijskom opsegu 500-20000 IU/mL. Slika 32. Vremenski tok hemolize eritrocita indukovane SDS-om. Suspenzija eritrocita je inkubirana sa 125 μM SDS u prisustvu odgovarajućeg CA125 antigena (500 IU/mL), na 25°C, uz konstantno mućkanje. Absorbanca na 670 nm je merena u intervalima od 15 minuta. pCA125 - antigen fetalnog porekla pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka Kontrola - suspenzija eritrocita inkubirana sa 125 μM SDS bez dodatog CA125 antigena. 88 4.2.2. Interakcija CA125 antigena sa lektinima i receptorima lektinskog tipa C, eksprimiranim na ćelijama krvnog sistema ĉoveka 4.2.2.1. Vezivanje sigleka za CA125 antigen Ispitivanje vezivanja sigleka za CA125 antigene razliĉitog porekla, vršeno je u testovima na ĉvrstoj fazi. Dobijeni rezultati su prikazani na slikama 33, 34 i 35. Svi testirani sigleci su pokazali sliĉnu, umerenu reaktivnost sa pCA125. MeĊutim, na višim koncentracijama antigena (125-500 IU/mL), siglek-3 i siglek -7, i u manjoj meri siglek-2, bili su reaktivniji od drugih sigleka (Slika 33, A). Perjodatni tretman pCA125, redukovao je vezivanje sigleka-2, sigleka-3 i sigleka-7 za 14 %, 7 % i 5 %, redom (Slika 33, B). Za razliku od pCA125, najveći nivo vezivanja za pfCA125, pokazali su siglek-2 i siglek-3, i u manjoj meri siglek-6 (Slika 34, A). Perjodatni tretman ovog antigena je smanjio vezivanje sigleka-2 za 18 %, sigleka-3 za 20 % i sigleka-6 za 3 % (Slika 34, B). Siglek-9 i siglek-10 su pokazali izrazitu selektivnost za clCA125 antigen (Slika 35, A). U odnosu na pCA125 i pfCA125, perjodatni tretman clCA125 antigena je u znatnoj meri uticao na nivo vezivanja sigleka-9 i sigleka-10, tj. doveo je do redukcije vezivanja za 40 %, odnosno 56 %, redom (Slika 35, B). 89 Slika 33. Vezivanje sigleka za pCA125 antigen. Imobilisani pCA125 antigen (7-500 IU/mL) je inkubiran sa odgovarajućim siglek-Fc himerama, nakon ĉega su vezani lektini detektovani protein A-HRPO. Izmerena je absorbanca na 450 nm. Panel A: Nativni pCA125 antigen; vezivanje sigleka je izraženo u procentima, u odnosu na nespecifiĉno vezivanje. Panel B: pCA125 antigen (500 IU/mL) tretiran perjodatom; vezivanje siglek-Fc himera je izraženo kao procenat vezivanja za nativni pCA125 antigen. Prikazani procenti su srednje vrednosti dva nezavisna eksperimenta. Standardna greška se kreće od 4 %-13 % (podaci nisu prikazani). pCA125 - antigen fetalnog porekla. S2 - siglek-2; S3 - siglek-3; S6 - siglek-6; S7 - siglek-7; S9 - siglek-9; S10 - siglek-10. 90 Slika 34. Vezivanje sigleka za pfCA125 antigen. Imobilisani pfCA125 antigen (7-500 IU/mL) je inkubiran sa odgovarajućim siglek-Fc himerama, nakon ĉega su vezani lektini detektovani protein A-HRPO. Izmerena je absorbanca na 450 nm. Panel A: Nativni pfCA125 antigen; vezivanje sigleka je izraženo u procentima, u odnosu na nespecifiĉno vezivanje. Panel B: pfCA125 antigen (500 IU/mL) tretiran perjodatom; vezivanje siglek-Fc himera je izraženo kao procenat vezivanja za nativni pfCA125 antigen. Prikazani procenti su srednje vrednosti dva nezavisna eksperimenta. Standardna greška se kreće od 6 %-10 % (podaci nisu prikazani). pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera. S2 - siglek-2; S3 - siglek-3; S6 - siglek-6; S7 - siglek-7; S9 - siglek-9; S10 - siglek-10. 91 Slika 35. Vezivanje sigleka za clCA125 antigen. Imobilisani clCA125 antigen (7-500 IU/mL) je inkubiran sa odgovarajućim siglek-Fc himerama, nakon ĉega su vezani lektini detektovani Protein A-HRPO. Izmerena je absorbanca na 450 nm. Panel A: Nativni clCA125 antigen; vezivanje sigleka je izraženo u procentima, u odnosu na nespecifiĉno vezivanje. Panel B: clCA125 antigen (500 IU/mL) tretiran perjodatom; vezivanje siglek-Fc himera je izraženo kao procenat vezivanja za nativni clCA125 antigen. Prikazani procenti su srednje vrednosti dva nezavisna eksperimenta. Standardna greška se kreće od 5 %-12 % (podaci nisu prikazani). clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. S2 - siglek-2; S3 - siglek-3; S6 - siglek-6; S7 - siglek-7; S9 - siglek-9; S10 - siglek-10. 92 Polazeći od specifiĉnosti sigleka, paralelno sa ovim eksperimentima, ispitivana je i reaktivnost biljnih lektina: SNA (Sambucus nigra agglutinin), koji vezuje sijalinsku kiselinu (Sia) u položaju Sia2,6Gal/GalNAc, i MAA II (Maackia amurensis agglutinin II), koji vezuje Sia u položaju Sia2,3Galβ1,4GlcNAc/Glc. Vezivanje SNA i MAA II, za imobilisane CA125 antigene, prikazano je na slici 36, A1-C1. Krive vezivanja lektina za pCA125 (Slika 36, A1) i pfCA125 (Slika 36, B1) su bile sliĉne u celom testiranom koncentracijskom opsegu, bez obzira na ispitivani lektin, ali sa većim maksimalnim nivoom za pfCA125. Razlika je, takoĊe, uoĉena i u odnosu na doznu zavisnost, tj. saturacija vezivanja SNA i MAA II je postignuta na znatno nižim koncentracijama za clCA125 (Slika 36, C1). Vezivanje MAA II za clCA125 je bilo veće od vezivanja SNA, ali nije prelazilo maksimalni nivo dobijen za pfCA125. Perjodatni tretman je redukovao vezivanje SNA za 60-70 %, bez obzira na ispitivani antigen (Slika 36, A2- C2) i MAA II za 33-42 % (Slika 36, A2-C2). 93 Slika 36. Vezivanje SNA i MAA II za CA125 antigen. Imobilisani CA125 antigeni (7-500 IU/mL) su inkubirani sa biotinilizovanim lektinima: SNA (Sambucus nigra agglutinin) ili MAA II (Maackia amurensis agglutinin II), dva sata, na sobnoj temperaturi. Nevezani materijal je aspiriran i ispran, a zatim je dodat Vectastain Elite ABC reagens i rastvor TMB/supstrata. Izmerena je absorbanca na 450 nm. Paneli A1, B1, C1: Nativni CA125 antigeni; vezivanje SNA i MAA II je izraženo u procentima, u odnosu na nespecifiĉno vezivanje. Paneli A2, B2, C2: CA125 antigeni tretirani perjodatom (500 IU/mL); vezivanje SNA i MAA II je izraženo kao procenat vezivanja za nativne CA125 antigene. Prikazani procenti su srednje vrednosti dva nezavisna eksperimenta. Standardna greška se kretala od 5 %-17 % (podaci nisu prikazani). pCA125 - antigen fetalnog porekla, pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera, clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. 94 4.2.2.2. Vezivanje receptora lektinskog tipa C za CA125 antigen Za ovo ispitivanje su korišćeni sledeći receptori: L-selektin, eksprimiran na leukocitima, E- selektin, eksprimiran na ćelijama endotela, P-selektin, eksprimiran na ćelijama endotela i krvnim ploĉicama, DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing non-integrin 1), eksprimiran na dendritskim ćelijama i manozni receptor makrofaga, MMR (macrophage mannose receptor). Interakcija je testirana u sistemima na ĉvrstoj fazi, korišćenjem imobilisanih CA125 antigena i rekombinantnih molekula tipa himera, koji se sastoje od lektinskog domena, CRD (carbohydrate recognition domain) i Fc fragmenta IgG. 4.2.2.2.1. Vezivanje selektina za CA125 antigen Krive vezivanja L-, E- i P-selektina za CA125 antigene razliĉitog porekla, su prikazane na slici 37, A-C. UtvrĊeno je da sva tri selektina reaguju sa pfCA125 i, u manjoj meri, sa pCA125, ali ne i sa clCA125 antigenom (slika 37, A-C). U poredjenju sa L- i E- selektinom, koji su reagovali pri koncentraciji 5 μg/mL, P-selektin je postigao isti efekat na nižoj koncentraciji, 0,3 μg/mL (slika 37, B i C). Vezivanje selektina za pCA125 i pfCA125 antigene nije se, meĊutim, moglo inhibirati heparan sulfatom, heparinom, kao ni helirajućim agensom EDTA (rezultati nisu prikazani). S obzirom da su selektini, izmeĊu ostalog, specifiĉni za sijalil-Lewisx antigen (SLex), njegovo prisustvo je ispitivano korišćenjem odgovarajućeg monoklonskog antitela. Lektinski blot ispitivanih CA125 antigena, je pokazao da se antitelo na SLe x antigen vezuje na dozno zavisan naĉin za pCA125, dok se za pfCA125 i clCA125 ne vezuje (slika 38). U testu na polistirenskoj ploĉi, ovo antitelo se, takoĊe, vezuje za pCA125 antigen, i u mnogo manjoj meri za pfCA125 (slika 39). 95 Slika 37. Vezivanje L-, E- i P-selektina za imobilisani CA125 antigen. Imobilisani CA125 antigeni su inkubirani sa selektin-Fc himera tri sata, na sobnoj temperaturi. Detekcija je vršena protein A-HRPO. Izmerena je absorbanca na 450 nm. pCA125 - antigen fetalnog porekla; pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera; clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. L-selektin (A); E-selektin (B); P-selektin (C). 96 Slika 38. Detekcija SLe x epitopa na CA125 antigenu. Imobilisani CA125 antigeni (1000-250 IU/mL) su inkubirani sa monoklonskim antitelom na SLe x, 2 sata, na sobnoj temperaturi, nakon ĉega je detekcija vršena sekundarnim biotinilizovanim antitelom u sistemu sa Vectastain ABC reagensom. Rezultati su vizuelizovani pomoću DAB reagensa. Slika 39. Vezivanje anti-SLe x za CA125 antigen. Imobilisani CA125 antigeni su inkubirani sa antitelom na SLe x epitop, tri sata, na sobnoj temperaturi. Detekcija je vršena sekundarnim biotinilizovanim antitelom u sistemu sa Vectastain ABC reagensom. Izmerena je absorbanca na 450 nm. pCA125 - antigen fetalnog porekla; pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera; clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. 97 4.2.2.2.2. Vezivanje DC-SIGN za CA125 antigen Vezivanje DC-SIGN za imobilisane CA125 antigene je prikazano na slici 40. Ustanovljeno je vezivanje za pCA125 i pfCA125 antigen, dok reakcija sa clCA125 nije uoĉena. Krive vezivanja DC-SIGN za pCA125 i pfCA125 antigene su pokazale meĊusobnu sliĉnost u testiranom koncentracijskom opsegu, ali je u testu inhibicije, meĊutim, uoĉena razlika u odnosu na tip inhibitora (slika 41, A-B). Slika 40. Vezivanje DC-SIGN za imobilisani CA125 antigen. Imobilisani CA125 antigeni su inkubirani sa DC-SIGN-Fc himera, tri sata, na sobnoj temperaturi, nakon ĉega je vezani lektin detektovan protein A-HRPO. Izmerena je absorbanca na 450 nm. pCA125 - antigen fetalnog porekla; pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera; clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. 98 Slika 41. Inhibicija vezivanja DC-SIGN za imobilisani CA125 antigen. Imobilisani CA125 antigeni su inkubirani sa DC-SIGN-Fc himera, sa ili bez dodatka odgovarajućeg inhibitora, dva sata, na sobnoj temperaturi. Detekcija vezanog lektina je vršena protein A-HRPO. Izmerena je absorbanca na 450 nm. Vezivanje je izraženo u procentima, u odnosu na vezivanje CA125 antigena u odsustvu inhibitora (A) pCA125 - antigen fetalnog porekla; (B) pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera. Dok se vezivanje za pCA125 antigen, moglo inhibirati mananom (55-70 %), vezivanje za pfCA125 je bilo u potpunosti oĉuvano (slika 41). Pored ovoga, helirajući agens nije pokazao efekat ni u jednom sluĉaju (slika 41). Rezultati ispitivanja vezivanja DC-SIGN za CA125 antigene su upotpunjeni analizom prisustva specifiĉnih ugljenohidratnih struktura, koje bi mogle biti odgovorne za lektinsko prepoznavanje. Polazeći od specifiĉnosti DC-SIGN za manan i terminalne Lewisx (Lex) ali i Lewis y (Le y ) antigene, njihovo prisustvo je analizirano korišćenjem monoklonskih antitela na Lewis antigene, kao i LTL (Lotus tetragonolobus lektin), biljnog lektina specifiĉnog za Le x i Le y . 99 Antitela na Le x i Le y antigene, u dot-blotu, su se vezala za pCA125 antigen, i u manjoj meri za clCA125, dok se nisu vezivala za pfCA125 (slika 42). Slika 42. Detekcija Le x i Le y epitopa na CA125 antigenu. Imobilisani CA125 antigeni (1000-250 IU/mL) su inkubirani sa odgovarajućim monoklonskim antitelima, 2 sata, na sobnoj temperaturi, nakon ĉega je detekcija vršena sekundarnim biotinilizovanim antitelom u sistemu sa Vectastain ABC reagensom. Rezultati su vizuelizovani pomoću DAB reagensa. pCA125 - antigen fetalnog porekla; pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera; clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. U testu na polistirenskoj ploĉi, oba antitela su se vezala za pCA125 antigen (anti-Lex>anti- Le y ). Vezivanje anti-Le y za pfCA125 i clCA125 je bilo veoma nisko, a anti-Le x nije dalo merljivu reakciju (slika 43). 100 Slika 43. Vezivanje antitela na Le x i Le y epitope za CA125 antigen. Imobilisani CA125 antigeni su inkubirani sa antitelima na Le x (A) ili Le y (B) epitope, tri sata, na sobnoj temperaturi. Detekcija je vršena sekundarnim biotinilizovanim antitelom u sistemu sa Vectastain ABC reagensom. Izmerena je absorbanca na 450 nm. pCA125 - antigen fetalnog porekla; pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera; clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. 101 Paralelno sa ovim, u dot-blotu je pokazano da se LTL vezuje na dozno zavisan naĉin za pCA125 i u manjoj meri za clCA125, ali ne i za pfCA125 (rezultati nisu prikazani). U testu na ĉvrstoj fazi, LTL se vezuje dozno zavisno za pCA125 i u manjoj meri za pfCA125, ali ne i za clCA125 (slika 44). Slika 44. Vezivanje LTL (Lotus tetragonolobus lektina) za CA125 antigen. Imobilisani CA125 antigeni su inkubirani sa LTL, jedan sat, na sobnoj temperaturi. Detekcija je vršena Vectastain ABC reagensom. Izmerena je absorbanca na 450 nm. pCA125 - antigen fetalnog porekla; pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera; clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. 102 4.2.2.2.3. Vezivanje MMR za CA125 antigen Vezivanje MMR za CA125 antigene je ispitivano u testu sa obeleženim antigenima. Dobijeni rezultati su pokazali da, pod datim eksperimentalnim uslovima, MMR ne vezuje ni jedan od ispitivanih antigena (slika 45). Slika 45. Vezivanje imobilisanog MMR za CA125 antigen. Imobilisani MMR je inkubiran sa radioaktivno obeleženim CA125 antigenima, 6 sati, na sobnoj temperaturi, nakon ĉega je izmerena vezana radioaktivnost (CPM, count per minute). pCA125 - antigen fetalnog porekla; pfCA125 - antigen iz pleuralne teĉnosti osoba obolelih od ovarijalnog kancera; clCA125 - antigen iz ćelijske linije ovarijalnog kancera ĉoveka. 5. DISKUSIJA 103 5.1. Bioinformatiĉka analiza Većina ekstracelularnih proteina u koje spadaju i mucini, sastavljena je od multiplih modula, tj. nezavisnih gradivnih jedinica koje se mogu naći kod funkcionalno razliĉitih proteina. Prisustvo ovih modula, tj. njihova genomska organizacija jeste rezultat kombinovanja gena/egzona. U nekim sluĉajevima, moduli zadržavaju sliĉnu funkciju kod razliĉitih proteina, ali se ĉesto koriste i kao strukturni obrasci, pa ovaj biološki princip može dovesti do njihove nove funkcije. U ispitivanju ovakvih proteina, poseban znaĉaj imaju bioinformatiĉke alatke i kompleksne baze podataka, koje ĉuvaju informacije dobijene razdvajanjem molekula u manje celine kao što su: domeni/moduli, obrasci, strukturni motivi, konzervirani domeni i sliĉno. Kompjuterske simulacije i predviĊanja, kao neizostavan deo interdisciplinarne analize modularnih proteina, tako, mogu dati znaĉajan uvid u njihovu organizaciju, evoluciju i moguću funkciju i asocijaciju sa drugim proteinima. Dobijeni rezultati in silico analize proteinske sekvence MUC16/CA125, doveli su ovaj molekul u kontekst modularnih proteina sa anotiranom ulogom u adheziji i srodnim procesima. Iako je CA125 svrstan u familiju mucina, na osnovu rezultata parcijalnog kloniranja sekvence, on se zbog svojih neobiĉnih svojstava, kao što je kompozicija N-glikana, ne uklapa u potpunosti ni u jednu od mucinskih klasa. U skladu sa ovim su i dobijeni rezultati koji su ukazali da nije naĊena znaĉajnija homologija sekvence MUC16 sa drugim sekvencama koje su svrstane u familiju mucina, ili u druge proteinske familije. Što se tiĉe prisustva specifiĉnih domena/obrazaca, detektovani su regioni koji pokazuju udaljenu homologiju sa motivima koji su sliĉni tzv. cink-prstima-Znf motivima, kao i motiv sliĉan 104 motivu kod IFRD (Interferon-related developmental regulator). Postoji veliki broj superfamilija Znf motiva koji variraju kako u sekvenci i strukturi, tako i u sposobnosti vezivanja ciljnih molekula (Laity, 2001), a što se tiĉe IFRD, pretpostavlja se da on može imati ulogu u signalnoj transdukciji (Latif i sar., 1997) i procesima rane hematopoeze (Buanne i sar., 1998). Prethodno poreĊenje sekvenci okarakterisanih mucinskih domena: SEA (Sea urchin sperm protein, Enterokinaza i Agrin), NIDO (nidogenski domen), AMOP (adhezioni domen naĊen kod MUC4 i drugih proteina) i VWD (von Willebrand-ov faktor-vWF domen tipa D) je pokazalo da MUC16/CA125 ima posebno mesto u odnosu na druge transmembranske mucine. UtvrĊeno je da je on evoluirao zasebno, pre razdvajanja ptica i sisara, i da, kao takav, ima homologe u ne-sisarskim vrstama (Duraisamy i sar., 2006). Zato je u cilju boljeg razumevanja ligandnog kapaciteta CA125 antigena i njegove interpretacije u smislu biološke relevantnosti, polazna taĉka daljih ispitivanja bila moguća evolutivna konzerviranost njegovih strukturnih/funkcionalnih domena. Dobijeni rezultati su ukazali na povezanost/sliĉnost MUC16/CA125 sa modularnim proteinima iz evolutivno udaljenih taksonomskih kategorija, na osnovu sledećih GO domena: ćelijska komponenta (GO:0005575), biološki proces (GO:0008150) i molekularna funkcija (GO:0003674). Njihove zajedniĉke karakteristike su obuvatile ekstraćelijsku lokalizaciju i uĉešće u razliĉitim tipovima adhezionih procesa, koji se baziraju na interakcijama protein-protein ili protein-ugljeni hidrat. Ove sliĉnosti se nisu mogle povezati sa anotiranim domenima iz dostupnih baza podataka, osim parcijalno, ali statistiĉki znaĉajno sa BLLF1, multidomenom karakteristiĉnim za 105 glikoproteine omotaĉa virusa iz familije Herpesviridae – herpes virusi (Marchler-Bauer i sar., 2011). Uvid u sekvence koje pokazuju sliĉnost sa sekvencom MUC16/CA125, pokazao je da se one, uglavnom, nalaze u ekstracelularnom regionu MUC16, koji je bogat serinom i treoninom. Tandemski ponovci, ĉija se sekvenca odlikuje visokim sadržajem serina i treonina i intenzivnom O-glikozilacijom, prisutni su kod svih mucina. Oni mogu biti i delovi epitopa, koje prepoznaju antitela na mucine. Za CA125/MUC16, tako, postoje dve klase monoklonskih antitela, koja prepoznaju dva razliĉita epitopa u okviru ovih tandemskih ponovaka: OC125/OC125-sliĉna antitela i M11/M11-sliĉna antitela (O'Brien i sar., 2001; Yin i Lloyd, 2001; Yin i sar., 2002). Imajući u vidu rezultate dobijene in silico analizom, kao i to da je kod nekih pacijenata sa razliĉitim tipovima limfoma B ćelija povećana koncentracija CA125, što se dovodi u vezu sa infekcijom EBV (Epstein-Barr virus), ispitivana je unakrsna reaktivnost anti-CA125 antitela (OC125-sliĉnih i M11-sliĉnih) sa glikoproteinima virusa iz familije Herpesviridae (Bairey i sar., 2003; Hsieh i sar., 2007). OC125-sliĉna, ali ne i M11-sliĉna antitela, dala su merljivu reaktivnost prema antigenima kapsida EBV, ali daleko slabiju u odnosu na reaktivnost sa CA125. Za razliku od ovoga, oba antitela su dala merljivu reaktivnost sa HSV-1 antigenima, s tim da je OC125-sliĉno antitelo pokazalo malo veću reaktivnost, u odnosu na M11-sliĉno antitelo. Poznat je fenomen da organizmi koji nisu filogenetski bliski, mogu posedovati antigene koji su strukturno sliĉni (Albert i sar., 1999; Rose i Mackay, 2000; Welsh i Fujinami, 2007). Dosadašnja ispitivanja su ukazala na unakrsnu reaktivnost EBV antigena i antigena ovĉijih i konjskih eritocita, a postoje i eksperimentalni pokazatelji o unakrsnoj reaktivnosti 106 antigena iz familije Candida i humanih ovarijalnih karcinoma (Schneider i sar., 1998; Hsieh i sar., 2007). Pokazano je da 4 % od 600 ispitivanih monoklonskih antitela na razliĉite viruse imaju unakrsnu reaktivnost sa tkivom zdravih domaćina (Srinivasappa i sar., 1986). Poznato je, takoĊe, i da se heterologa imunost može indukovati ĉak i veoma kratkom sekvencom (npr. šest aminokiselina), zajedniĉkom za antigene virusa i domaćina. Biološki smisao ovakve unakrsne reaktivnosti, tj. heterologe imunosti uopšte, nije poznat, kao ni to da li ona može imati neke posledice na funkciju odgovarajućih antigena. Korišćenje BLAST alatke, kao deo strategije za odreĊivanje postojanja opisanih strukturnih/funkcionalnih domena, polazi od osnovne pretpostavke da, što je jedna sekvenca sliĉnija drugoj sekvenci, to su sliĉnije i njihove funkcije (Punta i Ofran, 2008; Sleator i Walsh, 2010). Homologija, meĊutim, ne znaĉi uvek i sliĉnost u funkciji. Stoga su, pored BLAST alatki, za bioinformatiĉku analizu CA125 antigena korišćeni softveri za predviĊanje funkcije, koji se baziraju i na funkcionalnim terminima u GO (Gene Ontology) bazi podataka. Dobijeni rezultati su ukazali na nekoliko GO termina, koji su bili u skladu sa rezultatima BLAST analize. U GO domenu molekularna funkcija, GO termin: vezivanje (GO:0005488), odnosi se na vezivanje nukleotida purina (GO:0017076), jona metala/jona (GO:0046872/GO:0043197) ili šećera (GO:0005529). PredviĊena sposobnost vezivanja šećera se odnosi na 1,4 alfa D- glukan (GO:0004339) i hitin (GO:0008061) (http://amigo.geneontology.org/cgi- bin/amigo/term-details.cgi?term=GO:0004339; http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GTerm ?id=GO:0008061). Pored toga, u GO domenu biološki procesi, GO termin: ćelijski proces 107 (GO:0009987) se odnosi na adheziju tipa ćelija-matriks (GO:0007160), a GO termin: fiziološki proces (GO:0007582) se odnosi na rast ćelije (GO:0016049), transport (GO:0006810) i metabolizam (GO:0008152). GO:0016049 je bliže opisan GO terminom: invazivni rast (GO:0001403). Za GO:0006810, anotiran je GO termin: transport katjona (GO:0006812), kao što je npr. transport protona povezan sa ATP sintezom (GO:0015986), dok je za GO:0008152, anotiran GO termin: metabolizam polisaharida (GO:0000272) (http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term-details.cgi?term=GO:0006812; http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term-details.cgi?term= GO:0015986). Bioinformatiĉka analiza je ukazala na moguću korelaciju funkcionalnih aktivnosti, koje se pripisuju domenima bogatim serinom/treoninom kod identifikovanih proteina u okviru ispitivanih taksona, i funkcije CA125 antigena. Ovi domeni, npr., kod identifikovanih proteina kvasca, predstavljaju senzore za ekstraćelijski osmotski pritisak, a kod transmembranskih mucina, u koje spada i CA125, imaju ulogu u monitoringu ekstraćelijskog gradijenta jona i pH (Lo i Dranginis, 1998; Tatebayashi i sar., 2007; Pelaseyed i Hansson, 2011). Ove pretpostavke se mogu potkrepiti postojećim eksperimentalnim podacima, koji ukazuju na vezu izmeĊu adhezije i transporta jona. Pokazano je da, lokalno, ekstraćelijski nivo pH vrednosti na mestima fokalne adhezije tumora, moduliše jaĉinu ćelijske adhezije, u smislu da veća koncentracija protona dovodi do jaĉe adhezije i smanjenja migracije (Özkucur i sar., 2010). Ovi procesi mogu ukljuĉiti razliĉite molekule, a eksperimenti su potvrdili postojanje proteina, koji ima 40 % identiĉnu aminokiselinsku sekvencu kao beta subjedinica Na/K-ATPaze, i koga prepoznaju antitela na ovu subjedinicu (Gloor i sar., 1990). Smatra se da adhezivne ili anti-adhezivne osobine 108 nekog molekula mogu poticati od njegovog uticaja na razliĉite sisteme za transport, kao što su npr. jonske pumpe, kanali ili nosaĉi (Gloor i sar., 1990). Pored toga, dobijeni rezultati sugerišu moguću vezu filamentoznog rasta i formiranja pseudohifa, koji se ostvaruju preko interakcija tipa šećer-supstrat, i polarizovanog rasta i usmerenog kretanja, u kojima uĉestvuju mucini, u toku normalnog ili neoplastiĉnog rasta (Cullen i Spraguem, 2002; Bozzuto i sar., 2010). Vršeno je više eksperimenata u kojima je pokazano da MUC16/CA125 antigen uĉestvuje u adhezivnim procesima tokom progresije kancera ili embrionalnog razvića, ali odgovarajući mehanizmi nisu, još uvek, u potpunosti razjašnjeni (Seelenmeyer i sar., 2003; Rump i sar., 2004; Patankar i sar., 2005; Gipson i sar., 2008). Na osnovu dobijenih rezultata, uloga CA125 antigena u procesima adhezije bi mogla ukljuĉiti i interakcije posredstvom konzerviranih proteinskih sekvenci, odgovornih za jonski transport, i interakcije sa šećernim supstratima, ali o tome ne postoje eksperimentalni podaci. S obzirom da funkcija proteina ima mnogo razliĉitih aspekata, rezultati bioinformatiĉke analize bi se mogli razmatrati na nivou generalnih principa, na osnovu kojih su razliĉiti proteini, koji mogu biti, a u ovom sluĉaju i jesu filogenetski udaljeni, srodni na nivou odreĊene GO kategorije (Sleator i Walsh, 2010). 5.2. Glikobiohemijska analiza Polazeći od mucinske prirode CA125 antigena, kao i fizioloških stanja u kojima je njegova koncentracija u serumu povećana, u prvom delu glikobiohemijske analize, ispitan je uticaj 109 CA125 antigena na agregaciju, adheziju i hemolizu eritrocita ĉoveka, o ĉemu ne postoje literaturni podaci. Proces agregacije eritrocita ukljuĉuje tri koraka: formiranje kratkih linearnih ,,rouleaux“ (fr. rolne) od nekoliko ćelija, formiranje dugih ,,rouleaux“ a zatim i razgranatih mreža (Shiga i sar., 1983; Barshtein i sar., 2000). U normalnim fiziološkim uslovima, u zavisnosti od uslova protoka, eritrociti u krvnim sudovima kontinuirano agregiraju i razdvajaju se, a pokazuju i slabe interakcije sa drugim ćelijama krvnog sistema (Barshtein i sar., 2000). U patološkim stanjima, kao što su dijabetes, srpasta anemija, hroniĉna inflamacija ili kancer, ovi procesi se menjaju u zavisnosti od promene membrane eritrocita ili komponenata plazme, pa može doći do povećane agregabilnosti i adhezije za endotelne ćelije i komponente subendotelnog matriksa (Chien i Jan, 1973; Stoltz i Donner, 1987; Jones, 1990). Mucini u cirkulaciji, generalno, imaju prokoagulatornu ulogu i povećavaju agregabilnost i adhezivnost ćelija krvi (Wahrenbrock i sar., 2003). U ovom radu je naĊeno da pCA125 i pfCA125, umereno, povećavaju agregaciju eritrocita, i uspešno inhibiraju njihovu adheziju, a ovi efekti su bili ispoljeni pri znatno nižim koncentracijama pCA125 (do 3,6 puta) u odnosu na pfCA125. Za razliku od njih, clCA125 je pokazao neznatan uticaj na modulaciju ispitivanih osobina eritrocita. Uoĉeni efekti CA125 antigena na agregaciju i adheziju nisu bili povezani sa osmotskom osetljivošću eritrocita, što je potvrĊeno u testu hemolize. Na površini eritrocita su eksprimirani funkcionalno razliĉiti membranski proteini, ukljuĉujući i veliki broj adhezivnih molekula, koji imaju znaĉajnu ulogu u razvoju eritrocita i njihovom odgovoru na spoljašnje stimuluse (Steck, 1974; Telen, 2005). S druge strane, 110 poznato je da CA125 antigen sadrži SEA domene za koje se smatra da uĉestvuju u regulaciji i vezivanju ugljenohidratnih struktura, kao i ankirinske i leucinom-bogate ponovke, koji uĉestvuju u protein-protein interakcijama (Sedgwick i Smerdon, 1999; Bennett i Baines, 2001; Maeda i sar., 2004). Pored toga, od ranije je poznato da se CA125 antigeni kancerskog porekla (pfCA125 i clCA125), kao i CA125 antigen fetalnog porekla (pCA125), razlikuju po strukturi proteinskog i glikanskog dela molekula (Janković i Tapušković, 2005; Janković i Milutinović, 2008). Imajući sve ovo u vidu, dobijeni rezultati se mogu korelirati sa podacima o tome da mucinska supresija ćelijske agregacije ne mora biti samo posledica njihovog negativnog naelektrisanja i prisustva sijalinske kiseline, budući da tretman neuraminidazom ne dovodi do njene inhibicije (Ligtenberg i sar., 1992). Pretpostavlja se da ona može biti uzrokovana i njihovom rigidnom strukturom, koja maskira ćelijske površinske molekule i na taj naĉin razbija interakcije sa makromolekulima na susednim ćelijama. Sve ovo ostavlja otvoreno pitanje da li se uoĉeni efekti CA125 antigena, na eritrocite ĉoveka, javljaju usled interakcija protein-protein, protein-ugljeni hidrat, ili ukljuĉuju oba tipa. Kada je u pitanju cirkulacija, posebno u malim krvnim sudovima, agregacija i adhezivnost su kljuĉne osobine eritrocita, kako sa biološkog, tako i sa medicinskog aspekta (Chien i Jan, 1973). Ranije studije su pokazale da su tokom trudnoće, aglutinacija i agregacija eritrocita povećane, kako u normalnim, tako i u nekim patološkim stanjima, kao što su npr. hipertenzija i preeklampsija (El Bouhmadi i sar., 2000; Gamzu i sar., 2001). Pored toga, pretpostavlja se da su, tokom maligne transformacije, promene u strukturi i sintezi mucina povezane sa oštećenjima vaskularnog tkiva i poremećajima u cirkulaciji (Higes-Pascual i 111 sar., 2005; Borowski i sar., 2005). Što se tiĉe CA125 antigena, postoje podaci koji ukazuju na korelaciju visokog nivoa ovog tumorskog markera i rekurentnog ishemijskog moždanog udara kod pacijenata sa ovarijalnim malignitetima (Jovin i sar. 2005). Smeša abnormalnih kancerskih mucina i njihovih fragmenata može se otpustiti sa ćelije i naći u visokoj koncentraciji u serumu, a adhezivna i agregirajuća svojstva ovakvih mucina, u velikoj meri, mogu uticati na homotipske i heterotipske ćelijske interakcije, koje su znaĉajne za metaboliĉke, transportne i imunološke procese (Chan i sar., 1999; Kufe, 2009). Budući da kancerski mucini imaju vezujuća mesta za selektine, lektine eksprimirane na leukocitima, krvnim ploĉicama i vaskularnom endotelu, njihove interakcije mogu inicirati koagulopatije i formiranje mikrotrombova (Tedder i sar., 1995; Wahrenbrock i sar., 2003), a mucini, u tom sluĉaju, mogu delovati kao matrica na kojoj se agregiraju aktivirani trombociti (Wahrenbrock i sar., 2003). Zato je neophodno da se pored uticaja na eritrocite, ispita i moguća veza CA125 antigena sa drugim ćelijama krvnog sistema, posebno onim koje eksprimiraju specifiĉne lektinske receptore, ukljuĉene kako u adhezivne tako i u imunološke reakcije. Zbog ekstenzivne glikozilacije, kao i specifiĉnog ugljenohidratnog sastava, mucini u cirkulaciji mogu biti prepoznati od strane razliĉitih klasa leukocitnih receptora (Borsig i sar., 2001; Wahrenbrock i sar., 2003; Chen i sar., 2012). MeĊu potencijalnim mucinskim receptorima posebno mesto zauzimaju lektini, proteini koji vezuju ugljene hidrate, kao i brojni receptori lektinskog tipa. Sijalinska kiselina, važna strukturna determinanta mucina koja utiĉe na njihova fiziĉka i funkcionalna svojstva, može delovati kao ligand, ali i kao 112 sredstvo koje maskira razliĉite antigene determinante koje stupaju u interakcije sa ovim receptorima od kojih su od posebnog znaĉaja sigleci (Siglec), podgrupa lektina tipa I kao i selektini, podgrupa lektina tipa C (Tedder i sar., 1995; Varki i Angata, 2006; Varki i sar., 2009). Sigleci obuhvataju proteine koji nisu antitela i T-ćelijski receptori, a koji prepoznaju ugljene hidrate preko domena sliĉnog imunoglobulinu (Varki i Angata, 2006). Oni se dele u dve subgrupe, evolutivno konzervirani sigleci u koje spadaju siglek-1, siglek-2 i siglek-4 i subgrupa sigleka koji su sliĉni sigleku-3 tj. CD33, u koje spadaju siglek-3 i siglek-5 - siglek-13 (Varki i Angata, 2006). Smatra se da sigleci prepoznaju sijalinsku kiselinu u razliĉitim tipovima veze i pozicije u oligosaharidnom lancu. Dok evolutivno konzervirani sigleci pokazuju specifiĉnost prema taĉno definisanim ugljenohidratnim strukturama, sigleci sliĉni CD33, mogu prepoznati razliĉite strukturne varijante sijalinske kiseline (Brinkman-Van der Linden i Varki, 2000; Blixt i sar., 2003). U ovom radu, interakcija CA125 antigena razliĉitog porekla i sigleka, ispitivana je u testu na ĉvrstoj fazi korišćenjem rekombinantnih himernih lektina. Ovi lektini se sastoje od domena koji vezuje ugljene hidrate i Fc regiona humanog IgG, a zbog moguće polimerizacije, njihov afinitet za sijalinsku kiselinu se višestruko uvećava, u odnosu na nativne sigleke (Crocker i Kelm, 1996). Ovakav eksperimentalni sistem je izabran zbog ĉinjenice da su na površini ćelije, koja je prekrivena mnogobrojnim sijaloglikanima, sigleci “maskirani“ cis ligandima, i da je za njihovu interakciju sa drugim molekulima/ćelijama u trans položaju neophodno “demaskiranje“ tj. aktivacija, koja se dešava samo u odreĊenim fiziološkim stanjima (Razi i Varki, 1998; Varki i Angata, 2006). 113 Rezultati dobijeni u ovom radu su pokazali da postoje specifiĉni obrasci vezivanja sigleka za ispitivane CA125 antigene, kojima se ovi antigeni uspešnije razlikuju u odnosu na njihovo poreklo, nego što se to ĉini na osnovu obrazaca vezivanja biljnih lektina, takoĊe, specifiĉnih za sijalinsku kiselinu (Sia). Naime, od ranije je poznato da je kod CA125 antigena, naĊena Sia u oba tipa veze sa Gal/GalNAc, ali da su profili vezivanja biljnih lektina SNA (koji specifiĉno prepoznaje Sia2,6Gal/GalNAc) i MAA II (specifiĉno prepoznaje Sia2,3Galβ1,4GlcNAc/Glc) meĊusobno sliĉni (Janković i Milutinović., 2008). Pod datim eksperimentalnim uslovima, svi testirani sigleci su pokazali detektabilan nivo vezivanja za pCA125. Siglek-2, siglek-3 i siglek-7 su se nešto više vezali za pCA125 antigen u poreĊenju sa drugim ispitivanim siglecima. Za razliku od toga, pokazano je da su siglek-2 i siglek-3 visoko selektivni za pfCA125, sa većim ukupnim vezivanjem u odnosu na pCA125, dok su siglek-9 i siglek-10 visoko selektivni za clCA125. Sve ove interakcije su u manjoj ili većoj meri bile osetljive na blagi perjodatni tretman, koji dovodi do isecanja glicerolu-sliĉnog dela molekula sijalinske kiseline (Bock i Kelm, 2006). Literaturni podaci pokazuju da siglek-2 prepoznaje samo Sia2,6Gal, ĉime se njegova specifiĉnost dovodi u vezu sa lektinom SNA (Powell i Varki, 1994; Collins i sar., 1997; Varki i Angata, 2006). Uprkos tome što perjodatni tretman liganada inhibira vezivanje oba lektina, znaĉaj prezentacije Sia demonstriran je u ispitivanjima, u kojima je pokazano da oni na razliĉit naĉin aglutiniraju eritrocite ljudi sa razliĉitim krvnim grupama (Brinkman- Van der Linden i sar., 2002). NaĊeno je da SNA vezuje Sia nezavisno od prisustva 9-O- acetil grupa, za razliku od sigleka-2, ĉije je vezivanje blokirano njenom 9-O-acetilacijom (Sjoberg i sar., 1994; Brinkman-Van der Linden i sar., 2002). Vezivanje sigleka-2 za 114 pCA125 i pfCA125, moglo bi biti u korelaciji i sa podacima o postojanju placentnog IgG sa lektinskom aktivnošću, koji je identifikovan kao ligand za CA125, a koji sa siglekom-2 deli visoki afinitet za ugljenohidratne strukture glikoproteina fetuina (Bock i Kelm, 2006; Milutinović i sar., 2010). Siglek-2, najvećim afinitetom, vezuje Sia2,6Galβ1,4GlcNAc, dok siglek-7, za koji je, takoĊe, pokazano da prepoznaje pCA125, najvećim afinitetom vezuje Sia2,6Galβ1,4Glc (Angata i Varki, 2000). Siglek-3 ima veći afinitet za Sia2,6Gal nego za Sia2,3Gal, prepoznaje sijalil-Tn antigen, a u fiziološkim uslovima, njegovo vezivanje za ove epitope može donekle biti inhibirano 9-O-acetilacijom (Brinkman-Van der Linden i Varki, 2000; Blixt i sar., 2003). Siglek-6, koji je po strukturi sliĉan sigleku-3, takoĊe interaguje sa Sia2,6Gal i veoma selektivno vezuje sijalil-Tn antigen (Brinkman-Van der Linden i Varki, 2000). Za razliku od drugih sigleka, blagi tretman perjodatom ne utiĉe na aktivnost sigleka- 6, što je bilo u skladu sa rezultatima dobijenim za pfCA125 (Brinkman-Van der Linden i Varki, 2000; Brinkman-Van der Linden i sar., 2002). clCA125 antigen je, kao ligand, imao potpuno drugaĉije karakteristike u poreĊenju sa pCA125 i pfCA125, koji su pokazali sliĉnost u obrascu vezivanja sigleka. Siglek-9 i siglek- 10, ali ne i drugi sigleci, vezali su clCA125 antigen visokim afinitetom. Siglek-9 i siglek-10 prepoznaju i Sia2,3Galβ1,4GlcNAc i Sia2,6Galβ1,4GlcNAc, ali preferiraju Sia2,3Galβ1,4GlcNAc, koja je prisutna na N-glikanima (Blixt i sar., 2003). Dodatak fukoze i formiranje SLe x u potpunosti inhibira siglek-10, dok to nema efekta na aktivnost sigleka- 9. Vezivanje sigleka-9 i sigleka-10 je bilo osetljivo na perjodatni tretman, za razliku od 115 vezivanja MAA II, što je u skladu sa literaturnim podacima o specifiĉnostima ovih lektina (Brinkman-Van der Linden i sar., 2002). Za razliku od pCA125 i pfCA125, glikozilacija clCA125 je detaljno analizirana hemijskim metodama koje, u poreĊenju sa ovde korišćenim, dovode do degradacije molekula. Ranija ispitivanja su pokazala da je sijalinizacija N-glikana clCA125 niska, i da nijedan glikan ne nosi više od jedne Sia (Wong i sar., 2003). Ovo bi moglo biti u korelaciji sa dobijenim rezultatima, s obzirom da siglek-9 i siglek-10 preferiraju monosijalinizovane N-glikane (Blixt i sar., 2003). MeĊutim, iako je prisustvo Lex prethodno dokazano na clCA125, na osnovu dobijenih rezultata ne može se sa sigurnošću tvrditi da on sadrži sijalinizovanu formu Le x tj. SLe x (Wong i sar., 2003). Dobijeni rezultati se odnose na direktno vezivanje sigleka i CA125 antigena u in vitro uslovima, lišeno ćelijskog konteksta u kome se ovi molekuli nalaze, a koji ga može favorizovati ili ometati. Interakcija sigleka i CA125 antigena se može, s jedne strane, posmatrati sa aspekta detekcije njegovih specifiĉnih glikoformi. Dakle, bez obzira na to koji su njihovi prirodni ligandi, sigleci su pokazali potencijal za diskriminaciju CA125 antigena razliĉitog porekla, što bi bilo od posebnog biomedicinskog znaĉaja za formulaciju specifiĉnih testova za detekciju i praćenje ginekoloških maligniteta. S druge strane, jedan isti siglek može biti prisutan kod više tipova leukocita (Varki i Angata, 2006), ali distribucija može biti i specifiĉna za odreĊeni tip ćelija, pa bi se potencijal sigleka da interaguju sa CA125 antigenima razliĉitog porekla, mogao dovesti u vezu sa odreĊenim biološkim funkcijama. 116 Smatra se da sigleci imaju ulogu u regulisanju ćelijske aktivacije u imunskom sistemu, u smislu da deluju kao inhibitorni tj. imunosupresivni receptori. Balansiranje izmeĊu pozitivne i negativne signalizacije, bazira se na glikanskoj kompoziciji liganada za sigleke. Smatra se da glikani normalnih epitelnih ćelija imaju supresivni efekat na održavanje homeostaze koja se narušava u toku karcinogeneze, kada se sintetišu glikani koji nemaju ligandni kapacitet za pojedine sigleke (Miyazaki i sar., 2012). Interakcija MUC16/CA125 i endogenih klasa humanih lektina nije detaljno analizirana, ni u in vitro ni u in vivo sistemima. Rezultati ovoga rada su jasno ukazali na razliku u ligandnom kapacitetu CA125 antigena kancerskog i fetalnog porekla, ali su oba antigena, u odnosu na ekspresiju reaktivnih sigleka (siglek-2, siglek-3, siglek-7, siglek-9 i siglek-10), mogla interagovati sa većim brojem istih tipova leukocita. Siglek-2/CD22 je selektivno eksprimiran na zrelim B-ćelijama, mada najnoviji podaci govore o njegovom prisustvu na bazofilima (Crocker i Varki, 2001; Varki i Angata, 2006). Nasuprot tome, siglek-3/CD33 je prisutan na monocitima/dendritskim ćelijama i makrofagama (Crocker i Varki, 2001; Varki i Angata, 2006). Siglek-9 i siglek-10, koji su pokazali interakciju sa clCA125, eksprimirani su na površini B ćelija, NK ćelija, monocita (Crocker i Varki, 2001; Varki i Angata, 2006). Na neutrofilima je prisutan samo siglek-9, a na bazofilima siglec-10. Siglek-7 koji je pokazao delimiĉnu selektivnost prema pCA125 eksprimiran je na CD8+ subsetu T ćelija, monocitima i dendritskim ćelijama. Nedavno je, siglek-9, identifikovan kao receptor za MUC16 na humanim NK ćelijama, B ćelijama i monocitima (Belisle i sar., 2010). Postoje podaci o tome da CA125 antigen može imati inhibitorni efekat na aktivnost komplementa i citotoksiĉnu funkciju NK (natural killer) ćelija, a pretpostavlja se da se ovi 117 efekti ostvaruju posredstvom bisektnih biantenarnih N-glikana CA125 antigena (el Ouagari i sar., 1995; Yoshimura i sar., 1996; McDonnel i sar., 2003; Patankar i sar., 2005). Na osnovu ovih podataka, izneta je pretpostavka o mogućoj dualnoj imunološkoj ulozi CA125 antigena u toku maligne transformacije (Patankar i sar., 2005), kao i o njegovoj ulozi u modulaciji imunskog odgovora u toku humane reprodukcije (Clark i sar., 1996a; 1996b; 1997). Pored sigleka, u cirkulatornom sistemu postoji još jedna specifiĉna grupa proteina koji vezuju Sia. To su selektini (CD62), kalcijum-zavisni lektini tipa C, koji obuhvataju L- selektin, E-selektin i P-selektin. L-selektin (CD62L, Leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 1 - LECAM-1) je transmembranski receptor leukocita, E-selektin (CD62E, endothelial-leukocyte adhesion molecule 1 - ELAM-1) je eksprimiran na endotelnim ćelijama, koje su aktivirane citokinima tokom inflamatornog procesa, a P-selektin (CD62P, Leukocyte-endothelial cell adhesion molecule 3 - LECAM-3) je naĊen u α-granulama krvnih ploĉica, kao i u Weibel-Palade-ovim telašcima endotelnih ćelija. U ovom radu, interakcija izmeĊu selektina i CA125 antigena razliĉitog porekla je ispitivana u testu na ĉvrstoj fazi, korišćenjem rekombinantnih himernih lektina, po istom modelu kao u i sluĉaju sigleka. Smatra se da dizajn eksperimentalnog sistema može, u većoj ili manjoj meri, odražavati realnu situaciju, u kojoj selektini, in vivo, vezuju svoje oligosaharidne ligande. Zbog toga, interakcije selektina i potencijalnih liganada, koje se detektuju u multivalentnim erejima, u kojima se signali veštaĉki, višestruko amplifikuju npr. imunokompleksima, ne moraju imati biološki znaĉaj (Varki, 1994). U tu svrhu, kao 118 prikladnije, trebalo bi koristiti interakcije detektovane metodama npr. imunoprecipitacije ili afinitetne hromatografije, koje se zasnivaju na korišćenju monomernih solubilnih selektina (Varki, 1994). Dobijeni rezultati su pokazali da sva tri ispitivana selektina vezuju, na dozno zavisan naĉin, pfCA125 i u manjoj meri pCA125, ali ne i clCA125. Pored toga, zapaženo je da je P- selektin reagovao na znatno nižim koncentracijama (16 puta manjim), nego L- i E-selektin. Poznato je da selektini dele zajedniĉku specifiĉnost prema SLex determinanti, NeuAcα2- 3Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc i da ona, i srodne determinante, u zavisnosti od tipa ćelija i tkiva, ispoljavaju znaĉajnu molekularnu heterogenost. Korišćenjem monoklonskog antitela, prisustvo SLe x antigena, je jasno potvrĊeno na pCA125, a nizak, ali detektabilan, nivo reakcije je uoĉen i sa pfCA125. Ovo je u skladu sa podacima koji govore da sama SLex determinanta ne predstavlja efikasan ligand za selektine, već su srodni sijalinizovani i fukozilovani laktozamini neophodne komponente da bi selektini prepoznali svoje ligande kod ljudi (Varki, 1994; Malý i sar., 1996). U poreĊenju sa drugim glikozilovanim ligandima, malo se zna o molekularnim mehanizmima koji su relevantni za vezivanje sijalinizovanih glikana (Kelm i sar., 1998). Svim proteinima koji vezuju sijalinsku kiselinu, za njeno prepoznavanje je neophodno prisustvo negativno naelektrisane karboksilne grupe, dok potreba za intaktnim, nemodifikovanim lancem glicerola van prstena (C-7 do C-9), varira u zavisnosti od lektina do lektina. On je, tako, bitan za interakcije sa siglecima, dok je neobavezan za interakcije sa selektinima. Šta više, selektini tolerišu zamenu sijalinske kiseline nekim drugim negativno naelektrisanim glikotopom, kao što su sulfo-strukture. 119 Pretpostavlja se da postoji više razliĉitih tipova mogućih visoko afinitetnih interakcija selektina sa ligandima (Varki, 1994). Moguća je multivalentna prezentacija liganada i selektina na intaktnim ćelijama, agregacija više selektina za ligand, postojanje većeg broja vezujućih mesta na selektinu, sinergizam peptidnog dela liganda i glikanskih epitopa, a najverovatnije se vezivanje liganada dešava preko grupisanih saharida - „clustered saccharide patch“ (Norgard i sar., 1993; Varki, 1994). Za razliku od sigleka koji nisu vezivali CA125 antigene tretirane perjodatom, što je govorilo u prilog interakcija baziranih na prepoznavanju ugljenih hidrata, interakcija selektina i CA125 antigena se nije mogla inhibirati helirajućim agensom EDTA, kao ni heparin sulfatom ili heparinom, što ostavlja otvoreno pitanje o njenoj prirodi. Ranijim istraživanjima je pokazano da EDTA, kao i heparin, ne moraju, nužno, da dovedu do inhibicije vezivanja selektina za njihove ligande (Varki, 1994; Koenig i sar., 1998). Dok L- selektin, npr. za vezivanje, zahteva mikromolarni nivo slobodnog Ca 2+, to nije sluĉaj sa P- selektinom. Pored toga, oba selektina mogu imati mesta za prepoznavanje sulfonovanih liganada, koja nisu striktno zavisna od Ca 2+ jona (Skinner i sar., 1991; Suzuki i sar., 1993; Varki, 1994; Koenig i sar., 1998). Jedno od objašnjenja za ovaj fenomen bi moglo biti ligand-zavisna aktivacija ili „indukovana prilagoĊenost“ („induced-fit“), gde je Ca2+ neophodan pri inicijalnom vezivanju, ali ne i pri kasnijem održavanju kompleksa (Varki, 1994). Alternativno, Ca 2+ može formirati vrlo jak (visoko afinitetan) kompleks sa ligandom posle inicijalnog vezivanja, koji se potom teško može ukloniti a da ne bude dugo vremena izložen helirajućem agensu. 120 Kao što je već istaknuto, selektini imaju složenu ugljenohidratnu specifiĉnost uslovljenu prirodom aktivnog mesta i mogućnošću njegovog konformacionog prilagoĊavanja razliĉitim ligandima. Stoga postoje znaĉajne razlike u inhibitornom potencijalu heparina i srodnih struktura, ĉiji ugljenohidratni sastav ne odgovara sastavu definisanih selektinskih liganada (Varki, 1994; Koenig i sar., 1998). Njihov inhibitorni potencijal, tako, varira u zavisnosti da li se vezivanje vrši za sulfo- ili sijalo-grupe. Selektini, koji su svrstani u familiju CAM proteina (cell adhesion molecules), svoju adhezionu sposobnost ispoljavaju u konstitutivnom navoĊenju limfocita, u inflamatornim procesima i metastazi (Cotran i sar., 1999; Ley, 2003). Malo se zna o ligandima za selektine, a do sada je identifikovano nekoliko molekula. Primarni ligand za P-selektin, koji specifiĉno prepoznaje O-vezane glikane jezgra tipa 2 koji nose SLex, je PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand-1) (Norgard i sar., 1993; Furie i Furie, 1995). Jedan od prvih pronaĊenih liganda za E-selektin, koji prepoznaje SLex, dvostruko fukozilovan SLex, SLea, 3’-sulfo Lex, 3’-sulfo Lea, GalNAc-Lex (fukozilovani lacdiNAc ili LDNF) i VIM-2 (laktozaminski lanac tipa II sa terminalnom Siaα2,3 i α1,3 vezanom fukozom na unutrašnjem GlcNAc), je glikoprotein ESL-1 (E-selectin-ligand-1) (Varki i sar., 2009). L- selektin vezuje GlyCAM-1 (glycosylation dependent cell adhesion molecule 1), CD34 (sialomucin), MAdCAM-1 (mucosal addressin cell adhesion molecule-1) i PCLP, transmembranski sijalomucin koji je sliĉan podokaliksinu (Imai i sar., 1991; Lasky i sar., 1992; Hemmerich i sar., 1994; Varki i sar., 2009). Dostupni literaturni podaci govore da, generalno, solubilni mucini ili mucini na površini tumorskih ćelija, mogu reagovati sa selektinima, i na taj naĉin uĉestvovati u koagulacionim 121 i/ili imunomodulatornim procesima (Borsig i sar., 2001, 2002; Wahrenbrock i sar., 2003). Što se tiĉe MUC16, najnovija istraživanja su pokazala da ovaj molekul, eksprimiran na ćelijama kancera pankreasa, predstavlja funkcionalni ligand za L-selektin i E-selektin, ali ne i za P-selektin (Chen i sar., 2012). Ovo je, delimiĉno, u saglasnosti sa rezultatima dobijenim u ovom radu, a neslaganja mogu poticati od razlika u poreklu/glikozilaciji ispitivanih antigena, kao i primenjenim eksperimentalnim sistemima. Za razliku od sigleka, od kojih se neki tipovi vezuju za antigen fetalnog porekla, a sasvim drugi za antigen kancerskog porekla, selektini su vezali oba tipa antigena, ali kancerski u većoj meri nego fetalni antigen. Na osnovu uoĉenog visokog afiniteta P-selektina, CA125 antigen kancerskog porekla bi pre stupio u interakcije sa aktiviranim endotelnim ćelijama ili krvnim ploĉicama, na kojima je ovaj selektin prisutan, nego sa ćelijama na kojima su prisutni drugi tipovi selektina. Interakcija CA125 antigena i P-selektina bi, na taj naĉin, mogla biti znaĉajan element u regrutovanju tumorskih ćelija u ciljne organe. Vezivanje krvnih ploĉica za tumorske ćelije koje metastaziraju, odvija se na mestu gde primarni tumor vrši invaziju vaskularnog sistema (Aigner i sar., 1998). Tumorske ćelije u tranzitu kroz cirkulaciju, stižu u ciljni organ, gde se mogu kotrljati na aktiviranom endotelu pre no što bivaju uhvaćene i poĉnu da proliferišu. CA125 antigen bi mogao, analogo, drugim ligandima za P-selektin da potpomogne kotrljanje tumorske ćelije po endotelu (Aigner i sar., 1998). Pored sijalinske kiseline, za glikoligandni kapacitet CA125 antigena, važne su i druge strukture, koje bi, u cirkulaciji, mogle stupati u interakcije sa receptorima lektinskog tipa. Za ovo ispitivanje su, kao potencijalno znaĉajni, izabrani: DC-SIGN (CD209, Dendritic 122 cell-specific ICAM-3-grabbing non-integrin 1) i MMR (CD206), manozni receptor makrofaga. DC-SIGN je kalcijum-zavisni lektin tipa C, na površini dendritskih ćelija (DC), koji vezuje manan i visoko-manozne glikane, kao i glikane sa terminalnim Le x /Le y /Le a /Le b antigenima, dok se ne vezuje za sulfo/SLe x (Geijtenbeek i sar., 2000a; Mitchell i sar., 2001; van Die i sar., 2002; Appelmelk i sar., 2003). MMR je, takoĊe, lektin tipa C, koji je prisutan na makrofagama i DC. Osim terminalne manoze, MMR vezuje i fukozu i SLe x (Marttila-Ichihara i sar., 2008; García-Vallejo i van Kooyk, 2009). Rezultati detekcije ugljenohidratnih struktura, koje bi mogle biti odgovorne za lektinski tip receptorskog prepoznavanja CA125 antigena, pokazali su da su one prisutne kod svih ispitivanih antigena. Nivo reaktivnosti antitela na Lewis glikotope/LTL je zavisio, meĊutim, od primenjenog eksperimentalnog sistema, što se može dovesti u vezu sa podacima o uticaju orijentacije i dostupnosti reaktanata na afinitetne interakcije (Tang i sar., 1998). Ovakva zavisnost se mogla odraziti i na test vezivanja DC-SIGN, kojim je pokazana dozno-zavisna reakcija sa pCA125 i pfCA125, ali ne i sa clCA125. Njena inhibicija mananom, meĊutim, postignuta je samo u sluĉaju pCA125. Ovo je u skladu sa saopštenim rezultatima inhibicije interakcije DC-SIGN sa razliĉitim glikoproteinskim ligandima. Pokazano je da je vezivanje DC-SIGN za ICAM-2 i ICAM-3, zavisno od prisustva glikana bogatih manozom, tj. da se može inhibirati mananom, za razliku od vezivanja gp120 glikoproteina omotaĉa HIV-1, koje je nezavisno od njegovih N- ili O- glikana (Curtis i sar., 1992; Geijtenbeek i sar., 2000a; b; c; Geijtenbeek i sar., 2002). Dok je DC-SIGN, koji specifiĉno vezuje visoko-manozne glikane, pod datim eksperimentalnim uslovima reagovao sa CA125 antigenom, MMR, koji preferira manozu u 123 terminalnom položaju, nije vezao ni jedan od ispitivanih antigena. Poznato je da glikanska kompozicija CA125 antigena varira u zavisnosti od porekla tj. izvora. CA125 antigen izolovan iz ćelijske linije OVCA433, tako, ima daleko viši sadržaj manoze od CA125 antigena iz ćelijske linije OVCAR-3 (Davis i sar., 1986), koji nosi O-vezane glikane koji su bogati Le x i Le y antigenima, kao i visoko-manozne N-glikane, koji su sliĉni onim na gp120 glikoproteinu kapsida virusa HIV-a (Mizuochi i sar., 1990; Lloyd i sar., 1997; Kui Wong i sar., 2003). Pored ovoga, pokazano je da CA125 antigen iz amnionske teĉnosti ima znatno nižu zastupljenost manoze u odnosu na CA125 antigen iz ćelijske linije OVCAR-3 (Janković i Milutinović, 2008). Lektini tipa C, generalno, poseduju veći broj vezujućih mesta, ĉiji afinitet zavisi od malih, finih razlika u sastavu i razgranatosti glikana njihovih liganada. Primarno vezujuće mesto za manozu, kod DC-SIGN, homologo je primarnim vezujućim mestima drugih lektina, koji, takoĊe, specifiĉno prepoznaju ovaj saharid (Geijtenbeek i sar., 2002). Visoka selektivnost DC-SIGN ili drugih lektina tipa C za pojedine ligande, kao i mehanizam vezivanja, omogućen je i postojanjem sekundarnih vezujućih mesta (Geijtenbeek i sar., 2002). Nedavno je pokazano da se DC-SIGN razlikuje od drugih C-tip lektina po izrazitom grupisanju njegovih monomernih formi, ĉime se formira tetramerni motiv u obliku kalema (coiled-coil motif), koji povećava selektivnost vezivanja ovog lektina za ligande (Mitchell i sar., 2001). Poznato je da DC-SIGN i MMR, mogu interagovati sa nekim epitelnim mucinima i ćelijama tumorskog porekla (Chieppa i sar., 2003; Monti i sar., 2004; Rughetti i sar., 2005; García-Vallejo i van Kooyk, 2009; Allavena i sar., 2010). NaĊeno je da DC-SIGN deluje 124 kao receptor za transmisiju mukoznih patogena ukljuĉujući i HIV virus. Mucin 6 iz semene plazme, kao i MUC1 iz majĉinog mleka, identifikovani su kao molekuli koji se vezuju za DC-SIGN, i na taj naĉin dovode do inhibicije transfera virusa iz dendritskih ćelija u T ćelije (Saeland i sar., 2009; Stax i sar., 2009). Što se tiĉe manoznog receptora, utvrĊeno je da on vezuje MUC1 i tumorski mucin TAG-72 (tumor-associated glycoprotein-72). Pored toga, tumorski mucini ukljuĉujući i CA125, kod ljudi, mogu indukovati njegovu internalizaciju, i aktivirati imunosupresivni fenotip u tumorskim makrofagama (Allavena i sar., 2010). Poznato je da ekspresija DC-SIGN predstavlja rani odgovor imunog sistema majke na implantaciju embriona, i da su pojedini podtipovi DC, koji se javljaju samo u toku trudnoće, ukljuĉeni u perifernu toleranciju, imaju visok nivo proliferacije i nalaze se u upadljivom kontaktu sa podtipovima NK ćelija (Kämmerer i sar., 2003; Breburda i sar., 2006). Uoĉeno vezivanje pCA125 antigena za DC-SIGN bi, na osnovu ovoga, moglo imati veze sa pretpostavkom da CA125 antigen štiti embrion od napada imunskog sistema majke (Clark i sar., 1996a; 1996b; 1997). Receptori sliĉni lektinima tipa C imaju važnu ulogu u imunskom sistemu, u smislu posredovanja u interakcijama tipa ćelija-ćelija, tj. u meĊusobnom kontaktu leukocita ili u njihovom kontaktu sa endotelom, i u vezivanju patogena. Selektini, tako, uĉestvuju u ćelijskoj adheziji i migraciji, i iniciranju mnogih kritiĉnih interakcija meĊu ćelijama krvnog sistema. Visok nivo SLe x na neutrofilima može biti odgovoran za inicijalno vezivanje za E- i P-selektine na endotelnim ćelijama, i iniciranje procesa kotrljanja (rolling). Pokazano je da svaki organ poseduje sopstveni obrazac glikana bogatih SLe x ili sulfo-SLe x , što sugeriše 125 da svaki organ ima svoj jedinstveni glikanski kod koji je odgovoran za selektivni promet leukocita (Renkonen i sar., 2002). Nasuprot selektinima, MMR i srodni receptori su specijalizovani za vezivanje i uklanjanje patogena. IzmeĊu selektina i MMR, nalazi se DC-SIGN koji, meĊutim, ima dualnu funkciju, i u adheziji i u prepoznavanju patogena i aktivaciji njihove fagocitoze (Cambi i Figdor, 2003). Pored ovoga, interakcija DC-SIGN sa ICAM-2 reguliše kotrljanje DC preko mirujućeg i aktiviranog endotela in vitro, kao i transmigraciju DC u periferna tkiva, što ukazuje da DC-SIGN ima kljuĉnu ulogu u procesu specifiĉne migracije DC (Geijtenbeek i sar., 2000; van Kooyk i Geijtenbeek, 2002). Promene u glikozilaciji liganada za receptore sliĉne lektinima tipa C, direktno utiĉu na njihovu aktivnost i specifiĉnost i imaju važne posledice na razvoj, preživljavanje i reaktivnost ćelija krvnog i imunskog sistema. Fiziološki i patološki uslovi koji utiĉu na izmenu glikozilacije, tako, indirektno utiĉu i na adhezivna i homing svojstva leukocita, i njihovu sposobnost da vezuju patogene. U normalnim fiziološkim uslovima, receptori sliĉni lektinima tipa C deluju u smislu kontrole uroĊene imunosti i oĉuvanja homeostaze. U patološkim uslovima, posebno u tumorskoj mikrosredini, u kojoj su prisutni strukturno izmenjeni molekuli, oni dolaze u kontakt sa razliĉitim potencijalnim ligandima, koji mogu ometati aktivaciju protektivnog imunskog odgovora i favorizovati širenje tumora. Rezultati ovoga rada ukazuju da bi razlike u strukturi/glikozilaciji CA125 antigena, koje se vezuju za posebna fiziološka i patološka stanja, mogle menjati njegov uticaj na ćelije krvnog sistema ĉoveka i imati znaĉajne biomedicinske posledice u razliĉitim mikrosredinama. Dalji uvid u prirodu i mehanizme multifunkcionalnosti CA125 antigena 126 zahteva interdisciplinarni pristup baziran na kompleksnim interakcijama koje su posredovane razliĉitim strukturnim domenima. 6. ZAKLJUČCI 127 Bioinformatiĉka analiza Rezultati in silico analize proteinske sekvence MUC16/CA125, stavili su ovaj molekul u kontekst modularnih proteina sa anotiranom ulogom u adheziji i srodnim procesima. Pokazana je homologija u sekvenci domena bogatih serinom/treoninom kod MUC16/CA125 i proteina iz evolutivno udaljenih taksona, kao i prisustvo sekvence sliĉne konzerviranom multidomenu glikoproteina omotaĉa virusa iz familije Herpesviridae. Na osnovu korelacije sa vezujućim svojstvima homologih sekvenci, CA125 antigen bi mogao biti ukljuĉen u vezivanje/transport jona i proteina, kao i u interakcije sa ugljenohidratnim komponentama. Glikobiohemijska analiza CA125 antigen ispoljava efekte na eritrocite ĉoveka, u smislu umerenog povećanja agregabilnosti i efikasnog smanjenja adhezivnosti na arteficijelne podloge. CA125 antigen fetalnog porekla je, u tom smislu, potentniji od CA125 antigena kancerskog porekla. Modulacija ispitivanih svojstava eritrocita nije bila povezana sa osmotskom osetljivošću, a sudeći na osnovu strukturnih domena CA125 antigena kao i receptorskog sastava membrane eritrocita, mogla bi se bazirati na interakcijama protein-protein i protein-ugljeni hidrat. 128 CA125 antigen poseduje ligandni kapacitet za interakcije sa siglecima, lektinima tipa I koji vezuju sijalinsku kiselinu u razliĉitim tipovima veze i pozicije u oligosaharidnom lancu. Siglek-2, iz podgrupe evolutivno konzerviranih sigleka, i siglek-3, siglek-7, siglek-9 i siglek-10, iz podgrupe sigleka koji su sliĉni CD33, su selektivno (u većoj ili manjoj meri ili ekskluzivno), interagovali sa fetalnim i kancerskim CA125 antigenima. Uoĉeni obrasci vezivanja sigleka omogućavaju jasnu diferencijaciju porekla CA125 antigena, za razliku od obrazaca vezivanja biljnih lektina, takoĊe, specifiĉnih za sijalinsku kiselinu. Sa aspekta detekcije specifiĉnih glikoformi CA125 antigena, njegova interakcija sa siglecima, može biti od posebnog biomedicinskog znaĉaja, kako za formulaciju specifiĉnih testova za detekciju, tako i za praćenje ginekoloških maligniteta. Specifiĉna distribucija sigleka na površini razliĉitih tipova leukocita i njihov selektivni potencijal za interakciju sa CA125 antigenima razliĉitog porekla, mogao bi se dovesti u vezu sa modulacijom njihove funkcije koja, izmeĊu ostalog, ukljuĉuje i regulisanje ćelijske aktivacije u imunskom sistemu. Glikanska kompozicija CA125 antigena koja se menja u razliĉitim fiziološkim stanjima bi, u tom smislu, mogla uticati na imunosupresivna svojstva sigleka ometanjem aktivacije protektivnog imunskog odgovora i favorizovanjem širenja tumora. 129 Diverzitet sijalinske kiseline, važne strukturne determinante CA125 antigena, odgovoran je i za njegov ligandni potencijal za vezivanje selektina (CD62), receptora sliĉnih lektinima tipa C. Analiza distribucije specifiĉnih glikotopa koji bi mogli uticati na aktivnost selektina, kao i ispitivanje prirode interakcije u testovima inhibicije, pokazali su da se ona bitno razlikuje od interakcije sa siglecima. Selektin-L, selektin-E i selektin-P su vezivali CA125 antigen kancerskog porekla u većoj meri nego CA125 antigen fetalnog porekla. Sva tri selektina su reagovala na isti naĉin, ali je afinitet P-selektina bio izrazito veći. CA125 antigen kancerskog porekla bi, na osnovu razlika u afinitetu selektina, pre stupio u interakcije sa aktiviranim endotelnim ćelijama ili krvnim ploĉicama, na kojima je prisutan P-selektin, što bi mogao biti znaĉajan element u regrutovanju tumorskih ćelija u ciljne organe. Uoĉena je razlika u molekularnoj osnovi interakcije DC-SIGN (CD209, Dendritic cell- specific ICAM-3-grabbing non-integrin 1), kalcijum-zavisnog lektina tipa C, na površini dendritskih ćelija, i CA125 antigena fetalnog i kancerskog porekla, koja se najverovatnije zasniva na korišćenju razliĉitih vezujućih mesta. Interakcija sa CA125 antigenom fetalnog porekla je zavisna od prisustva glikana bogatih manozom, tj. može se inhibirati mananom, dok je reakcija sa antigenom kancerskog porekla nezavisna od njegovih N- ili O-glikana. 130 Dualna funkcija DC-SIGN, u procesu specifiĉne migracije DC, koja je zavisna od ugljenohidratne kompozicije odgovarajućih liganada, ili u procesu prepoznavanja patogena, koja ne zavisi od glikanskog sastava, mogla bi se, na osnovu karakteristika interakcije sa CA125 antigenom, specifiĉno menjati u zavisnosti od promene njegove strukture. Bez obzira na sliĉnosti sa DC-SIGN, u afinitetu prema visoko manoznim glikanskim strukturama, MMR (CD206), manozni receptor makrofaga, kalcijum-zavisni lektin tipa C, koji je prisutan na makrofagama i DC, nije vezao ni jedan od ispitivanih CA125 antigena. Promene u glikozilaciji liganada za receptore lektinskog tipa C, direktno utiĉu na njihovu aktivnost i specifiĉnost i imaju važne posledice na razvoj, preživljavanje i reaktivnost ćelija krvnog i imunskog sistema. Rezultati ovoga rada ukazuju da bi razlike u strukturi/glikozilaciji CA125 antigena, koje se vezuju za posebna fiziološka i patološka stanja, mogle menjati njegov uticaj na ćelije krvnog sistema ĉoveka i imati znaĉajne biomedicinske posledice u razliĉitim mikrosredinama. 7. LITERATURA 131 Aebischer T, Harbecke D, Ilg T. Proteophosphoglycan, a major secreted product of intracellular Leishmania mexicana amastigotes, is a poor B-cell antigen and does not elicit a specific conventional CD4+ T-cell response. Infect Immun, 1999; 67(10):5379-5385. Agrawal B, Gendler SJ, Longenecker BM. The biological role of mucins in cellular interactions and immune regulation: prospects for cancer immunotherapy. Mol Med Today, 1998; 4:397–403. Agrawal B, Krantz MJ, Reddish MA, Longenecker BM. Cancer-associated MUC1 mucin inhibits human T-cell proliferation, which is reversible by IL-2. Nature Med, 1998; 4:43–49. Aigner S, Ramos CL, Hafezi-Moghadam A, Lawrence MB, Friederichs J, Altevogt P, Ley K. CD24 mediates rolling of breast carcinoma cells on P-selectin. FASEB J, 1998; 12(12):1241-1251. Albert LJ, Inman RD. Molecular mimicry and autoimmunity. N Engl J Med, 1999; 341(27):2068-2074. Alberts B. Leukocyte functions and percentage breakdown. In: Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland Science; 2002. Allavena P, Chieppa M, Bianchi G, Solinas G, Fabbri M, Laskarin G, Mantovani A. Engagement of the mannose receptor by tumoral mucins activates an immune suppressive phenotype in human tumor-associated macrophages. Clin Dev Immunol, 2010; 2010:547179. Altman RB. Building successful biological databases. Brief Bioinfor, 2004; 5 (1):4–5. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 1990; 215(3):403-410. Angata Tand Varki A. Siglec-7: a sialic acid-binding lectin of the immunoglobulin superf amily. Glycobiol, 2000; 10:431-438. Appelmelk BJ, van Die I, van Vliet SJ, Vandenbroucke-Grauls CM, Geijtenbeek TB, van Kooyk Y. Cutting edge: carbohydrate profiling identifies new pathogens that interact with dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing nonintegrin on dendritic cells.; J Immunol, 2003; 170(4):1635-1639. 132 Apweiler R, Attwood TK, Bairoch A, Bateman A, Birney E, Biswas M, Bucher P, Cerutti L, Corpet F, Croning MD, Durbin R, Falquet L, Fleischmann W, Gouzy J, Hermjakob H, Hulo N, Jonassen I, Kahn D, Kanapin A, Karavidopoulou Y, Lopez R, Marx B, Mulder NJ, Oinn TM, Pagni M, Servant F, Sigrist CJ, Zdobnov EM. The InterPro database, an integrated documentation resource for protein families, domains and functional sites. Nucleic Acids Res, 2001; 29(1): 37-40. Ashburner M, Ball CA, Blake JA, Botstein D, Butler H, Cherry JM, Davis AP, Dolinski K, Dwight SS, Eppig JT, Harris MA, Hill DP, Issel-Tarver L, Kasarskis A, Lewis S, Matese JC, Richardson JE, Ringwald M, Rubin GM, Sherlock G. Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat Genet, 2000; 25(1):25-29. Asker N, Axelsson MA, Olofsson S O, Hansson GC. Dimerization of the human MUC2 mucin in the endoplasmic reticulum is followed by a N-glycosylation-dependent transfer of the mono- and dimers to the Golgi apparatus. J Biol Chem, 1998; 273:18857–18863. Attwood TK, Beck ME, Bleasby AJ, Parry-Smith DJ. PRINTS - A database of protein motif fingerprints. Nucl Acids Res, 1994; 22 (17):3590-3596. Bairey O, Blickstein D, Stark P, Prokocimer M, Nativ HM, Kirgner I, Shaklai M. Serum CA 125 as a prognostic factor in non-Hodgkin's lymphoma. Leuk Lymphoma, 2003; 44(10):1733-1738. Barshtein G, Wajnblum D, Yedgar S. Kinetics of linear rouleaux formation studied by visual monitoring of red cell dynamic organization. Biophys J, 2000; 78(5):2470-2474. Bast RC, Feeney M, Lazarus H, Nadler LM, Colvin RB, Knapp RC. Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian carcinoma. J Clin Invest, 1981; 68(5):1331– 1337. Bastian F, Parmentier G, Roux J, Moretti S, Laudet V, Robinson-Rechavi M. Bgee: Integrating and Comparing Heterogeneous Transcriptome Data Among Species. in DILS: Data Integration in Life Sciences. Lecture Notes in Computer Science 2008; 5109: 124-131. Belisle JA, Horibata S, Jennifer GA, Petrie S, Kapur A, André S, Gabius HJ, Rancourt C, Connor J, Paulson JC, Patankar MS. Identification of Siglec-9 as the 133 receptor for MUC16 on human NK cells, B cells, and monocytes. Mol Cancer,. 2010; 9:118. Bennett V, and Baines AJ. Spectrin- and ankyrin-based pathways: metazoan inventions for integrating cells into tissues. Physiol Rev, 2001; 81:1353-1392. Berman HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat TN, Weissig H, Shindyalov IN, Bourne PE. The Protein Data Bank. Nucl Acids Res, 2000; 28:235-242. Bhaskar KR, Garik P, Turner BS, Bradley JD, Bansil R, Stanley HE, LaMont JT. Viscous fingering of HCl through gastric mucin. Nature, 1992; 360:458–461. Blixt O, Collins BE, van den Nieuwenhof IM, Crocker PR, Paulson JC. Sialoside specificity of the siglec family assessed using novel multivalent probes: identification of potent inhibitors of myelin-associated glycoprotein. J Biol Chem, 2003; 278:31007-31019. Bobek LA, Situ H. MUC7 20-Mer: investigation of antimicrobial activity, secondary structure, and possible mechanism of antifungal action. Antimicrob Agents Chemother, 2003; 47:643–652. Bock N, and Kelm S. Binding and inhibition assays for Siglecs, in: Glycobiology protocols, Brockhausen I. Ed., Humana Press, Totowa, 2006, pp.359-375. Bork P, Patthy L. The SEA module: a new extracellular domain associated with O- glycosylation. Protein Sci, 1995; 4:1421–1425. Borowski A, Ghodsizad A. Gams E. Stroke as a first manifestation of ovarian cancer. J Neurooncol, 2005; 71(3):267-269. Borsig L, Wong R, Feramisco J, Nadeau DR, Varki NM, Varki A. Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis. Proc Natl Acad Sci USA, 2001; 98(6):3352-3357. Borsig L, Wong R, Hynes RO, Varki NM, Varki A. Synergistic effects of L- and P- selectin in facilitating tumor metastasis can involve non-mucin ligands and implicate leukocytes as enhancers of metastasis. Proc Natl Acad Sci USA, 2002; 99(4):2193-2198. Bourne P. Will a biological database be different from a biological journal?. PLoS Comput Biol, 2005; 1(3):179–181. Bozzuto G, Ruggieri P, Molinari A. Molecular aspects of tumor cell migration and invasion. Ann Ist Super Sanita, 2010; 46(1):66-80. 134 Breburda EE, Dambaeva SV, Slukvin II, Golos TG. Selective distribution and pregnancy-specific expression of DC-SIGN at the maternal-fetal interface in the rhesus macaque: DC-SIGN is a putative marker of the recognition of pregnancy. Placenta, 2006; 27(1):11-21. Brinkman-Van der Linden ECM, and Varki A. New aspects of siglec binding specificities, including the significance of fucosylation and of the sialyl-Tn epitope. Sialic acid-binding immunoglobulin superfamily lectins. J Biol Chem, 2000; 275:8625–8632. Brinkman-Van der Linden ECM, Sonnenburg JL, Varki A. Effects of sialic acid substitutions on recognition by Sambucus nigra agglutinin and Maackia amurensis hemagglutinin. Anal Biochem, 2002; 303:98-104. Buanne P, Incerti B, Guardavaccaro D, Avvantaggiato V, Simeone A, Tirone F. Cloning of the human interferon-related developmental regulator (IFRD1) gene coding for the PC4 protein, a member of a novel family of developmentally regulated genes. Genomics, 1998; 51(2):233-242. Cambi A, and Figdor CG. Dual function of C-type lectin-like receptors in the immune system. Curr Opin Cell Biol, 2003; 15(5):539-546. Cebo C, Dambrouck T, Maes E, Laden C, Strecker G, Michalski J-C, Zanetta J-C. Recombinant human interleukins IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-6, and IL-7 show different and specific calcium-independent carbohydrate-binding properties. J Biol Chem, 2001; 276:5685–5691. Chan AK, Lockhart DC, von Bernstorff W, Spanjaard RA, Joo HG, Eberlein TJ, Goedegebuure PS. Soluble MUC1 secreted by human epithelial cancer cells mediates immune suppression by blocking T-cell activation. Int J Cancer, 1999; 82:721–726. Chen SH, Dallas MR, Balzer EM, Konstantopoulos K. Mucin 16 is a functional selectin ligand on pancreatic cancer cells. FASEB J, 2012; 26(3):1349-1359. Chenna R, Sugawara H, Koike T, Lopez R, Gibson TJ, Higgins DG, Thompson JD. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acids Res, 2003; 31(13):3497-3500. Chien S, and Jan KJ. Ultrastructural basis of rouleaux formation. Microvasc Res, 1973; 5:155-166. 135 Chieppa M, Bianchi G, Doni A, Del Prete A, Sironi M, Laskarin G, Monti P, Piemonti L, Biondi A, Mantovani A, Introna M, Allavena P. Cross-linking of the mannose receptor on monocyte-derived dendritic cells activates an anti-inflammatory immunosuppressive program. J Immunol, 2003; 171(9):4552-4560. Clark GF, Oehninger S, Patankar MS, Koistinen R, Dell A, Morris HR, Koistinen H, Seppälä M. A role for glycoconjugates in human development: the human feto-embryonic defence system hypothesis. Hum Reprod, 1996a; 11(3):467-473. Clark GF, Oehninger S, Seppälä M. Role for glycoconjugates in cellular communication in the human reproductive system. Mol Hum Reprod, 1996b; 2(7):513-517. Clark GF, Patankar MS. Opinion: Hu-FEDS: in search of 'universal self'. Mol Hum Reprod, 1997; 3(11):985-987. Cohen PA, Peng L, Kjaergaard J, Plautz GE, Finke JH, Koski GK, Czerniecki BJ, Shu S. T-cell adoptive therapy of tumors: mechanisms of improved therapeutic performance. Crit Rev Immunol, 2001; 21:215–248. Cole JR, Wang Q, Cardenas E, Fish J, Chai B, Farris RJ, Kulam-Syed-Mohideen AS, McGarrell DM, Marsh T, Garrity GM, Tiedje JM. The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucl Acids Res, 2009; 37: 141-145. Collins BE, Kiso M, Hasegawa A, Tropak MB, Roder JC, Crocker PR, Schnaar RL. Binding specificities of the sialoadhesin family of I-type lectins – sialic acid linkage and substructure requirements for binding of myelin-associated glycoprotein, Schwann cell myelin protein and sialoadhesin. J Biol Chem, 1997; 272:16889–16895. Cotran RS, Kumar V, Collins T. In: Robbins Pathologic Basis of Disease. 6th edition. Philadelphia, Pa, WB Saunders Co, 1999. Page 1425. Crocker PR, and Kelm S. In Weir’s Handbook of Experimental Immunology (Herzenberg, L. A., Weir, D. M., and Blackwell, C., eds.) Blackwell Sciences, Cambridge; 1996. pp. 166.1-166.11. Crocker PR, and Varki A. Siglecs, sialic acids and innate immunity. Trends Immunol, 2001; 22(6):337-342. Cullen PJ, Sprague GF Jr. The roles of bud-site-selection proteins during haploid invasive growth in yeast. Mol Biol Cell, 2002; 13(9):2990-3004. 136 Davis HM, Zurawski VR Jr, Bast RC Jr, Klug TL. Characterization of the CA125 antigen associated with human epithelial ovarian carcinomas. Cancer Res, 1986; 46(12):6143-6148. Desseyn JL, Aubert JP, Porchet N, Laine A. Evolution of the large secreted gel-forming mucins. Mol Biol Evol, 2000; 17:1175–1184. Desseyn JL, Buisine MP, Porchet N, Aubert JP, Degand P, Laine A. Evolutionary history of the 11p15 human mucin gene family. J Mol Evol, 1998; 46:102–106. Ding F, Tang P, Hsu MH, Cui P, Hu S, Yu J, Chiu CH. Genome evolution driven by host adaptations results in a more virulent and antimicrobial-resistant Streptococcus pneumoniae serotype 14. BMC Genomics, 2009; 10:158. Duraisamy S, Kufe T, Ramasamy S, Kufe D. Evolution of the human MUC1 oncoprotein. Int. J. Oncology, 2007; 31:671–677. Duraisamy S, Ramasamy S, Kharbanda S, Kufe D. Distinct evolution of the human carcinoma associated transmembrane mucins, MUC1, MUC4 and MUC16. Gene, 2006; 373:28–34. El Bouhmadi A, Laffargue F, Brun JF. Aggregability and disaggregability of erythrocytes in women suffering from ovarian cancer: evidence for an increased disaggregation threshold. Clin Hemorheol Microcirc, 2000; 22:91-97. el Ouagari K, Teissié J, Benoist H. Glycophorin A protects K562 cells from natural killer cell attack. Role of oligosaccharides. J Biol Chem, 1995; 270(45):26970-26975. Enkhbayar P, Kamiya M, Osaki M, Matsumoto T, Matsushima N. Structural principles of leucine-rich repeat (LRR) proteins. Proteins, 2004; 54(3):394–403. Finn OJ. Immunological weapons acquired early in life win battles with cancer late in life. J Immunol, 2008; 181:1589–1592. Finn RD, Mistry J, Tate J, Coggill P, Heger A, Pollington JE, Gavin OL, Gunesekaran P, Ceric G, Forslund K, Holm L, Sonnhammer EL, Eddy SR, Bateman A. The Pfam protein families database. Nucl Acids Res Datab, 2010; 38:211-222. Fleischmann RD, Adams MD, White O, Clayton RA, Kirkness EF, Kerlavage AR, Bult CJ, Tomb JF, Dougherty BA, Merrick JM. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science, 1995; 269(5223):496–512. 137 Friedl P, Weigelin B. Interstitial leukocyte migration and immune function. Nat Immunol. 2008; 9(9):960-969. Fujita T, Ohara S, Sugaya T, Saigenji K, Hotta K. Effects of rabbit gastrointestinal mucins and dextran on hydrochloride diffusion in vitro. Comp Biochem Physiol B, 2000; 126:353–359. Furie B and BC Furie. The molecular basis of platelet and endothelial cell interaction with neutrophils and monocytes: role of P-selectin and the P-selectin ligand, PSGL-1. Thromb Haemost, 1995; 74(1):224-227. Gahmberg CG, Valmu L, Tian L, Kotovuori P, Fagerholm S, Kotovuori A, Kantor C, Hilden T. Leukocyte adhesion--a fundamental process in leukocyte physiology. Braz J Med Biol Res. 1999; 32(5):511-517. Gamzu R, Rotstein R, Fusman R, Zeltser D, Berliner AS Kupferminc MJ. Increased erythrocyte adhesiveness and aggregation in peripheral venous blood of women with pregnancy-induced hypertension. Obstet & Gynecol, 2001; 98:307-312. García-Vallejo JJ, and van Kooyk Y. Endogenous ligands for C-type lectin receptors: the true regulators of immune homeostasis. Immunol Rev. 2009; 230(1):22-37. Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Duvaud S, Wilkins, MR, Appel RD, Bairoch A. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. In: John M. Walker. Ed: The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press. 2005. pp. 571-607. Gay NJ, Packman LC, Weldon MA, Barna JC. A leucine-rich repeat peptide derived from the Drosophila Toll receptor forms extended filaments with a beta-sheet structure. FEBS Lett, 1991; 291(1):87–91. Geijtenbeek TB, Krooshoop DJ, Bleijs DA, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Grabovsky V, Alon R, Figdor CG, van Kooyk Y. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol. 2000b; 1(4):353-357. Geijtenbeek TB, Kwon DS, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Middel J, Cornelissen IL, Nottet HS, KewalRamani VN, Littman DR, Figdor CG, van Kooyk Y. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 2000c; 100(5):587-597. 138 Geijtenbeek TB, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Adema GJ, van Kooyk Y, Figdor CG. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell. 2000a; 100(5):575-585. Geijtenbeek TB, van Duijnhoven GC, van Vliet SJ, Krieger E, Vriend G, Figdor CG, van Kooyk Y. Identification of different binding sites in the dendritic cell-specific receptor DC-SIGN for intercellular adhesion molecule 3 and HIV-1. J Biol Chem. 2002; 277(13):11314-11320. Gimmi CD, Morrison BW, Mainprice BA, Gribben JG, Boussiotis VA, Freeman GJ, Park SY, Watanabe M, Gong J, Hayes DF, Kufe DW, Nadler LM. Breast cancer- associated antigen, DF3/MUC1, induces apoptosis of activated human T cells. Nature Med, 1996; 2: 1367–1370. Gipson IK, Blalock T, Tisdale A, Spurr-Michaud S, Allcorn S, Stavreus-Evers A, Gemzell K. MUC16 is lost from the uterodome (pinopode) surface of the receptive human endometrium: in vitro evidence that MUC16 is a barrier to trophoblast adherence. Biol Reprod, 2008; 78(1):134-142. Gloor S, Antonicek H, Sweadner KJ, Pagliusi S, Frank R, Moos M, Schachner M. The adhesion molecule on glia (AMOG) is a homologue of the beta subunit of the Na,K- ATPase. J Cell Biol, 1990; 110(1):165-174. Godl K, Johansson ME, Lidell ME, Mörgelin M, Karlsson H, Olson FJ, Gum JR Jr, Kim YS, Hansson GC. The N terminus of the MUC2 mucin forms trimers that are held together within a trypsinresistant core fragment. J Biol Chem, 2002; 277:47248–47256. Gorina S, Pavletich NP. Structure of the p53 Tumor Suppressor Bound to the Ankyrin and SH3 Domains of 53BP2. Science, 1996; 274:1001-1005. Greenwood PC, Hunter MW and Glover S. The preparation of 131 I labelled growth hormone of high specific radioactivity. Biochem 1963; 89:114–120. Hanish F-G, Uhlenbruck G, Dienst C, Stottrop M, Hippauf E. CA125 and CA19-9: two cancer-associated sialylsaccharide antigens on a mucus glycoprotein from human milk. Eur J Biochem, 1985; 149:323-330. 139 Hansen JE, Lund O, Engelbrecht J, Bohr H, Nielsen JO, Hansen JE. Prediction of O- glycosylation of mammalian proteins: specificity patterns of UDP-GalNAc:polypeptide N- acetylgalactosaminyltransferase. Biochem J, 1995; 308(3):801-813. Harada N, Iijima S,Kobayashi K,Yoshida T, Brown WR, Hibi T, Oshima A, Morikawa M. Human IgGFc binding protein (FcγBP) in colonic epithelial cells exhibits mucin-like structure. J Biol Chem, 1997; 272:15232–15241. Hawkins T, Luban S, Kihara D. Enhanced automated function prediction using distantly related sequences and contextual association by PFP. Protein Sci, 2006; 15(6):1550-1556. Hayashi T, Takahashi T, Motoya S, Ishida T, Itoh F, Adachi M, Hinoda Y, Imai K. MUC1 mucin core protein binds to the domain 1 of ICAM-1. Digestion, 2001; 63:87–92. Hemmerich S, Rosen SD. 6'-sulfated sialyl Lewis x is a major capping group of GlyCAM- 1. Biochemistry, 1994; 33(16):4830-4835. Henikoff S, Henikoff JG. Protein family classification based on searching a database of blocks". Genomics, 1994; 19:97-107. Herrmann A, Davies JR, Lindell G, Mårtensson S, Packer NH, Swallow DM, Carlstedt I. Studies on the “insoluble” glycoprotein complex from human colon. Identification of reduction-insensitive MUC2 oligomers and C-terminal cleavage. J Biol Chem, 1999; 274, 15828–15836. Higes-Pascual F, Tello-Blasco S, Fernández-Santos A, Hernández-García M. Cerebral ischaemia secondary to non-bacterial thrombotic endocarditis as the presenting symptom of an ovarian tumour. Rev Neurol, 2005; 41(7):404-408. Hoffmann W, Jagla W, Wiede A. Molecular medicine of TFF-peptides: from gut to brain. Histol Histopathol, 2001; 16:319–334. Hoffmann W, Jagla W. Cell type specific expression of secretory TFF peptides: colocalization with mucins and synthesis in the brain. Int Rev Cytol, 2002; 213:147–181. Hogeweg P, Hesper B. Interactive instruction on population interactions. Comput Biol Med, 1978; 8:319-327. Hogeweg P. Simulating the growth of cellular forms. Simulation, 1978; 31:90-96. Hollingsworth MA, Swanson BJ. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat Rev Cancer, 2004; 4(1):45-60. 140 Holm L, Rosenström P. Dali server: conservation mapping in 3D. Nucl Acids Res, 2010; 38: 545-549. Hsieh WC, Chang Y, Hsu MC, Lan BS, Hsiao GC, Chuang HC, Su IJ. Emergence of anti-red blood cell antibodies triggers red cell phagocytosis by activated macrophages in a rabbit model of Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic syndrome. Am J Pathol, 2007; 170(5):1629-1639. http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term-details.cgi?term=GO:0004339 http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GTerm?id=GO:0008061 http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term-details.cgi?term=GO:0006812 http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/term-details.cgi?term=GO:0015986 http://bgee.unil.ch/bgee/bgee http://blast.genome.jp/ http://blocks.fhcrc.org/blocks/blocks_search.html http://dragon.bio.purdue.edu/pfp http://elm.eu.org/ http://expasy.org/ http://expasy.org/tools/protparam.html http://expasy.org/tools/protscale.html http://expasy.org/tools/scanprosite/ http://globplot.embl.de/ http://jafa.burnham.org/ http://motif.genome.jp/ http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/index http://pir.georgetown.edu/iproclass/ http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/ http://www.ebi.ac.uk/interpro/IEntry?ac=IPR002653 http://www.ebi.ac.uk/Tools/ http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/ http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/ http://www.expasy.org/ 141 http://www.geneontology.org/ http://www.hiv.lanl.gov/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/tools/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi http://www.roseindia.net/bioinformatics/bioinformatics_tools.shtml http://www.uniprot.org http://www.uniprot.org/uniprot/B2ISC7 http://www.uniprot.org/uniprot/C8ZAR8 http://www.uniprot.org/uniprot/E9P8M0 http://www.uniprot.org/uniprot/Q4L9P0 Imai Y, Singer MS, Fennie C, Lasky LA, Rosen SD. Identification of a carbohydrate- based endothelial ligand for a lymphocyte homing receptor. J Cell Biol, 1991; 113(5):1213- 1221. Jankovic MM, and Milutinovic BS. Glycoforms of CA125 antigen as a possible cancer marker. Cancer Biomark, 2008; 4(1):35-42. Janković MM, and Tapusković BS. Molecular forms and microheterogenity of the oligosaccharide chains of pregnancy-associated CA125. Hum Reprod, 2005; 20(9):2632- 2638. Janz A, Oezel M, Kurzeder C, Mautner J, Pich D, Kost M, Hammerschmidt W, Delecluse HJ. Infectious Epstein-Barr virus lacking major glycoprotein BLLF1 (gp350/220) demonstrates the existence of additional viral ligands. J Virol, 2000; 74(21):10142-10152. Jensen LJ, Gupta R, Blom N, Devos D, Tamames J, Kesmir C, Nielsen H, Staerfeldt HH, Rapacki K, Workman C, Andersen CA, Knudsen S, Krogh A, Valencia A, Brunak S. Ab initio prediction of human orphan protein function from post-translational modifications and localization features. J Mol Biol, 2002; 319:1257-1265. Jensen LJ, Stærfeldt HH, Brunak S. Prediction of human protein function according to Gene Ontology categories. Bioinfor, 2003; 19:635-642. Jepson S, Komatsu M, Haq B, Arango ME, Huang D, Carraway CA, Carraway KL. Muc4/sialomucin complex, the intramembrane ErbB2 ligand, induces specific 142 phosphorylation of ErbB2 and enhances expression of p27(kip), but does not activate mitogen-activated kinase or protein kinaseB/Akt pathways. Oncogene, 2002; 21:7524– 7532. Jones JG. New aspects of red cell aggregation. J R Soc Med, 1990; 83(10):663–664. Jovin TG, Boosupalli V, Zivković SA, Wechsler LR Gebel JM. High titers of a CA-125 may be associated with recurrent ischemic strokes in patients with cancer. Neurol, 2005; 64(11):1944-1945. Kam JL, Regimbald LH, Hilgers JH, Hoffman P, Krantz MJ, Longenecker BM, Hugh JC. MUC1 synthetic peptide inhibition of intercellular adhesion molecule-1 and MUC1 binding requires six tandem repeats. Cancer Res, 1998; 58:5577–5581. Kämmerer U, Eggert AO, Kapp M, McLellan AD, Geijtenbeek TB, Dietl J, van Kooyk Y, Kämpgen E. Unique appearance of proliferating antigen-presenting cells expressing DC-SIGN (CD209) in the decidua of early human pregnancy. Am J Pathol, 2003; 162(3):887-896. Kannagi R. Regulatory roles of carbohydrate ligands for selectins in the homing of lymphocytes. Curr Opin Struct Biol, 2002; 12:599–608. Karunanithi S, Vadaie N, Chavel CA, Birkaya B, Joshi J, Grell L, Cullen PJ. Shedding of the mucin-like flocculin Flo11p reveals a new aspect of fungal adhesion regulation. Curr Biol, 2010; 20(15):1389-1395. Kelm S, Brossmer R, Isecke R, Gross HJ, Strenge K, Schauer R. Functional groups of sialic acids involved in binding to siglecs (sialoadhesins) deduced from interactions with synthetic analogues. Eur J Biochem, 1998; 255(3):663-672. Kim YJ, Borsig L, Han HL, Varki NM, Varki A. Distinct selectin ligands on colon carcinoma mucins can mediate pathological interactions among platelets, leukocytes, and endothelium. Am J Pathol, 1999; 155:461–472. Kobayashi K, Ogata H, Morikawa M, Iijima S, Harada N, Yoshida T, Brown WR, Inoue N, Hamada Y, Ishii H, Watanabe M, Hibi T. Distribution and partial characterisation of IgG Fc binding protein in various mucin producing cells and body fluids. Gut, 2002; 51:169–176. 143 Kobe B, Deisenhofer J. The leucine-rich repeat: a versatile binding motif. Trends Biochem Sci, 1994; 19(10): 415–421. Kobe B, Kajava AV. The leucine-rich repeat as a protein recognition motif. Curr Opin Struct Biol, 2001; 11(6):725–732. Koenig A, Norgard-Sumnicht K, Linhardt R, Varki A. Differential interactions of heparin and heparan sulfate glycosaminoglycans with the selectins. Implications for the use of unfractionated and low molecular weight heparins as therapeutic agents. J Clin Invest, 1998; 101(4):877-889. Kondo K, Kohno N, Yokoyama A, Hiwada K. Decreased MUC1 expression induces E- cadherin-mediated cell adhesion of breast cancer cell lines. Cancer Res, 1998; 58:2014– 2019. Kufe D, Inghirami G, Abe M, Hayes D, Justi-Wheeler H, Schlom J. Differential reactivity of a novel monoclonal antibody (DF3) with human malignant versus benign breast tumors. Hybridoma, 1984; 3:223–232. Kufe DW. Mucins in cancer: function, prognosis and therapy. Nat Rev Cancer, 2009; 9(12):874-885. Kui Wong N, Easton RL, Panico M, Sutton-Smith M, Morrison JC, Lattanzio FA, Morris HR, Clark GF, Dell A, Patankar MS. Characterization of the oligosaccharides associated with the human ovarian tumor marker CA125. J Biol Chem. 2003; 278(31):28619-28634. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680–685. Laity JH, Lee BM, Wright PE. Zinc finger proteins: new insights into structural and functional diversity. Curr Opin Struct Biol. 2001; 11(1):39-46. Lalani EN, Williams R, Jayaram Y, Gilbert C, Chaudhary KS, Siu LS, Koumarianou A, Playford R, Stamp GW. Trefoil factor-2, human spasmolytic polypeptide, promotes branching morphogenesis in MCF-7 cells. Lab Invest, 1999; 79:537–546. Lambrechts MG, Bauer FF, Marmur J, Pretorius IS. Muc1, a mucin-like protein that is regulated by Mss10, is critical for pseudohyphal differentiation in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996; 93(16):8419-8424. 144 Lang T, Hansson GC, Samuelsson T. Gel-forming mucins appeared early in metazoan evolution. Proc. Nat Acad Sci, 2007; 104, 16209–16214. Lasky LA, Singer MS, Dowbenko D, Imai Y, Henzel WJ, Grimley C, Fennie C, Gillett N, Watson SR, Rosen SD. An endothelial ligand for L-selectin is a novel mucin-like molecule. Cell, 1992; 69(6):927-938. Latif F, Duh FM, Bader S, Sekido Y, Li H, Geil L, Zbar B, Minna JD, Lerman MI. The human homolog of the rodent immediate early response genes, PC4 and TIS7, resides in the lung cancer tumor suppressor gene region on chromosome 3p21. Hum Genet, 1997; 99(3):334-341. Learmonth GS, Love DN, Wellington JE, Gilkerson JR, Whalley JM. The C-terminal regions of the envelope glycoprotein gp2 of equine herpesviruses 1 and 4 are antigenically distinct. Arch Virol, 2002; 147(3):607-615. Ley K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol Med, 2003; 9(6):263- 268. Lidell, ME, Johansson MEV, Orgelin MM, Asker N, Gum JR, Kim YS, Hansson GC. The recombinant C-terminus of the human MUC2 mucin forms dimers in Chinese-hamster ovary cells and heterodimers with full-length MUC2 in LS 174T cells. Biochem J, 2003; 372:335–345. Ligtenberg MJ, Buijs F, Vos HL, Hilkens J. Suppression of cellular aggregation by high levels of episialin. Cancer Res, 1992; 52(8):2318-2324. Linding R, Russell RB, Neduva V, Gibson TJ. GlobPlot: Exploring protein sequences for globularity and disorder. Nucleic Acids Res, 2003; 31(13):3701-3708. Lloyd KO, Yin BW, Kudryashov V. Isolation and characterization of ovarian cancer antigen CA 125 using a new monoclonal antibody (VK-8): identification as a mucin-type molecule. Int J Cancer. 1997; 71(5):842-850. Lo WS, and Dranginis AM. The cell surface flocculin Flo11 is required for pseudohyphae formation and invasion by Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell, 1998; 9(1):161-171. Luo B, Liu M, Chao Y, Wang Y, Jing Y, Sun Z. Characterization of Epstein-Barr virus gp350/220 gene variants in virus isolates from gastric carcinoma and nasopharyngeal carcinoma. Arch Virol, 2012; 157(2):207-216. 145 Maeda T, Inoue M, Koshiba S, Yabuki T, Aoki M, Nunokawa E, Seki E, Matsuda T, Motoda Y, Kobayashi A, Hiroyasu F, Shirouzu M, Terada T, Hayami N, Ishizuka Y, Shinya N, Tatsuguchi A, Yoshida M, Hirota H, Matsuo Y, Tani K, Arakawa T, Carninci P, Kawai J, Hayashizaki Y, Kigawa T, Yokoyama S. Solution structure of the SEA domain from the murine homologue of ovarian cancer antigen CA125 (MUC16). J Biol Chem, 2004; 279(13):13174-13182. Malý P, Thall A, Petryniak B, Rogers CE, Smith PL, Marks RM, Kelly RJ, Gersten KM, Cheng G, Saunders TL, Camper SA, Camphausen RT, Sullivan FX, Isogai Y, Hindsgaul O, von Andrian UH, Lowe JB. The alpha(1,3)fucosyltransferase Fuc-TVII controls leukocyte trafficking through an essential role in L-, E-, and P-selectin ligand biosynthesis. Cell, 1996; 86(4):643-653. Marchler-Bauer A, Anderson JB, Chitsaz F, Derbyshire MK, DeWeese-Scott C, Fong JH, Geer LY, Geer RC, Gonzales NR, Gwadz M, He S, Hurwitz DI, Jackson JD, Ke Z, Lanczycki CJ, Liebert CA, Liu C, Lu F, Lu S, Marchler GH, Mullokandov M, Song JS, Tasneem A, Thanki N, Yamashita RA, Zhang D, Zhang N, Bryant SH. CDD: specific functional annotation with the Conserved Domain Database. Nucleic Acids Res, 2009; 37: 205-210. Marchler-Bauer A, Bryant SH. D-Search: protein domain annotations on the fly. Nucleic Acids Res, 2004; 32: 327-331. Marchler-Bauer A, Lu S, Anderson JB, Chitsaz F, Derbyshire MK, DeWeese-Scott C, Fong JH, Geer LY, Geer RC, Gonzales NR, Gwadz M, Hurwitz DI, Jackson JD, Ke Z, Lanczycki CJ, Lu F, Marchler GH, Mullokandov M, Omelchenko MV, Robertson CL, Song JS, Thanki N, Yamashita RA, Zhang D, Zhang N, Zheng C, Bryant SH. CDD: a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins. Nucleic Acids Res, 2011; 39(Database issue):D225-229. Marttila-Ichihara F, Turja R, Miiluniemi M, Karikoski M, Maksimow M, Niemelä J, Martinez-Pomares L, Salmi M, Jalkanen S. Macrophage mannose receptor on lymphatics controls cell trafficking. Blood. 2008; 112(1):64-72. 146 McDermott KM, Crocker PR, Harris A, Burdick MD, Hinoda Y, Hayashi T, Imai K, Hollingsworth MA. Overexpression of MUC1 reconfigures the binding properties of tumor cells. Int J Cancer, 2001; 94:783–791. McDonnel AC, Van Kirk EA, Austin KJ, Hansen TR, Belden EL, Murdoch WJ. Expression of CA-125 by progestational bovine endometrium: prospective regulation and function. Reprod, 2003; 126(5):615-620. Milutinovic BS, Mitic NM, Jankovic MM. Identification of pregnancy-associated CA125-reactive protein as carbohydrate-binding IgG. Arch Biochem Biophys, 2010; 499:69-76. Mitchell DA, Fadden AJ, Drickamer K. A novel mechanism of carbohydrate recognition by the C-type lectins DC-SIGN and DC-SIGNR. Subunit organization and binding to multivalent ligands. J Biol Chem. 2001; 276(31):28939-28945. Miyazaki K, Sakuma K, Kawamura YI, Izawa M, Ohmori K, Mitsuki M, Yamaji T, Hashimoto Y, Suzuki A, Saito Y, Dohi T, Kannagi R. Colonic epithelial cells express specific ligands for mucosal macrophage immunosuppressive receptors siglec-7 and -9. J Immunol, 2012; 188(9):4690-4700. Mizuochi T, Matthews TJ, Kato M, Hamako J, Titani K, Solomon J, Feizi T. Diversity of oligosaccharide structures on the envelope glycoprotein gp 120 of human immunodeficiency virus 1 from the lymphoblastoid cell line H9. Presence of complex-type oligosaccharides with bisecting N-acetylglucosamine residues. J Biol Chem. 1990; 265(15):8519-8524. Moniaux N, Andrianifahanana M, Brand RE, Batra SK. Multiple roles of mucins in pancreatic cancer, a lethal and challenging malignancy. B J Canc, 2004; 91:1633-1638. Moniaux N, Nollet S, Porchet N, Degand P, Laine A and Aubert J-P. Structural organization and clasification of the human genes. Front Biosci, 2001; 6:1192-1206. Monti P, Leone BE, Zerbi A, Balzano G, Cainarca S, Sordi V, Pontillo M, Mercalli A, Di Carlo V, Allavena P, Piemonti L. Tumor-derived MUC1 mucins interact with differentiating monocytes and induce IL-10highIL-12low regulatory dendritic cell. J Immunol, 2004; 172(12):7341-7349. 147 Murzin AG, Brenner SE, Hubbard T, Chothia C. SCOP: a structural classification of proteins database for the investigation of sequences and structures. J Mol Biol, 1995; 247:536-540. N. Bock and S. Kelm, Binding and inhibition assays for Siglecs, in: Glycobiology protocols, I. Brockhausen, Ed., Humana Press, Totowa, 2006. pp.359-375. Nath D, Hartnell A, Happerfield L, Miles DW, Burchell J, Taylor-Papadimitriou J, Crocker PR. Macrophage-tumour cell interactions: identification of MUC1 on breast cancer cells as a potential counter-receptor for the macrophage-restricted receptor, sialoadhesin. Immunology, 1999; 98:213–219. Norgard KE, Moore KL, Diaz S, Stults NL, Ushiyama S, McEver RP, Cummings RD, Varki A. Characterization of a specific ligand for P-selectin on myeloid cells. A minor glycoprotein with sialylated O-linked oligosaccharides. J Biol Chem, 1993; 268(17):12764- 12774. Nustad K, Onsurd M, Jansson B, Warren D. CA125- epitopes and molecular size. Int J Biol Mark, 1998; 13:196–199. O’Brien TJ, Beard JB, Underwood LJ, Shigemasa K. The CA 125 gene: a newly discovered extension of the glycosylated N-terminal domain doubles the size of this extracellular superstructure. Tumour Biol, 2002; 23(3):154-169. O'Brien TJ, Beard JB, Underwood LJ, Dennis RA, Santin AD, York L. The CA 125 gene: an extracellular superstructure dominated by repeat sequences. Tumour Biol, 2001; 22(6):348-366. Orengo CA, Bray JE, Buchan DW, Harrison A, Lee D, Pearl FM, Sillitoe I, Todd AE, Thornto JM. The CATH protein family database: a resource for structural and functional annotation of genomes. Proteomics, 2002; 2:11-21. Ozkucur N, Perike S, Sharma P, Funk RH. Persistent directional cell migration requires ion transport proteins as direction sensors and membrane potential differences in order to maintain directedness. BMC Cell Biol, 2011; 12:4. Pagni M, Ioannidis V, Cerutti L, Zahn-Zabal M, Jongeneel CV, Hau J, Martin O, Kuznetsov D, Falquet L. MyHits: improvements to an interactive resource for analyzing protein sequences. Nucleic Acids Res, 2007; 35 (Web Server issue):433-437. 148 Patankar MS, Jing Y, Morrison JC, Belisle JA, Lattanzio FA, Deng Y, Wong NK, Morris HR, Dell A, Clark GF. Potent suppression of natural killer cell response mediated by the ovarian tumor marker CA125. Gynecol Oncol, 2005; 99(3):704-713. Pelaseyed T, Hansson GC. CFTR anion channel modulates expression of human transmembrane mucin MUC3 through the PDZ protein GOPC. J Cell Sci, 2011; 124(18):3074-3083. Perez BH, Gipson IK. Focus on Molecules: human mucin MUC16. Exp Eye Res, 2008; 87(5):400-401. Phalipon A, Cardona A, Kraehenbuhl JP, Edelman L, Sansonetti PJ, Corthésy B. Secretory component: a new role in secretory IgA-mediated immune exclusion in vivo. Immunity, 2002; 17:107–115. Pineo GF, Brain MC, Gallus AS, Hirsh J, Hatton MW, Regoeczi E. Tumors, mucus production, and hypercoagulability. Ann N Y Acad Sci, 1974; 230:262–270. Pineo GF, Regoeczi E, Hatton MW, Brain MC. The activation of coagulation by extracts of mucus: a possible pathway of intravascular coagulation accompanying adenocarcinomas. J Lab Clin Med, 1973; 82:255–266. Powell LD and Varki A. The oligosaccharide binding specificities of CD22β, a sialic acid- specific lectin of B cells. J Biol Chem, 1994; 269:10628-10636. Prasad AS. Zinc: mechanisms of host defense. J Nutr. 2007; 137(5):1345-1349. Punta M, Ofran Y. The rough guide to in silico function prediction, or how to use sequence and structure information to predict protein function. PLoS Comput Biol, 2008; 4(10):e1000160. Puntervoll P, Linding R, Gemünd C, Chabanis-Davidson S, Mattingsdal M, Cameron S, Martin DM, Ausiello G, Brannetti B, Costantini A, Ferrè F, Maselli V, Via A, Cesareni G, Diella F, Superti-Furga G, Wyrwicz L, Ramu C, McGuigan C, Gudavalli R, Letunic I, Bork P, Rychlewski L, Küster B, Helmer-Citterich M, Hunter WN, Aasland R, Gibson TJ. ELM server: A new resource for investigating short functional sites in modular eukaryotic proteins. Nucleic Acids Res, 2003; 31:3625-3630. Razi N, and Varki A. Masking and unmasking of the sialic acid-binding lectin activity of CD22 (Siglec-2) on B lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95(13):7469-7474. 149 Renkonen J, Tynninen O, Häyry P, Paavonen T, Renkonen R. Glycosylation might provide endothelial zip codes for organ-specific leukocyte traffic into inflammatory sites. Am J Pathol, 2002; 161(2):543-550. Rose NR, Mackay IR. Molecular mimicry: a critical look at exemplary instances in human diseases. Cell Mol Life Sci, 2000; 57(4):542-551. Rughetti A, Pellicciotta I, Biffoni M, Bäckström M, Link T, Bennet EP, Clausen H, Noll T, Hansson GC, Burchell JM, Frati L, Taylor-Papadimitriou J, Nuti M. Recombinant tumor-associated MUC1 glycoprotein impairs the differentiation and function of dendritic cells. J Immunol, 2005; 174(12):7764-7772. Rump A, Morikawa Y, Tanaka M, Minami S, Umesaki N, Takeuchi M, Miyajima A. Binding of ovarian cancer antigen CA125/MUC16 to mesothelin mediates cell adhesion. J Biol Chem, 2004; 279(10):9190-9198. Sack GH Jr, Levin J, Bell WR. Trousseau's syndrome and other manifestations of chronic disseminated coagulopathy in patients with neoplasms: clinical, pathophysiologic, and therapeutic features. Medicine (Baltimore), 1977; 56(1):1-37. Saeland E, de Jong MA, Nabatov AA, Kalay H, Geijtenbeek TB, van Kooyk Y. MUC1 in human milk blocks transmission of human immunodeficiency virus from dendritic cells to T cells. Mol Immunol, 2009; 46(11-12):2309-2316. Sands BE, Podolsky DK. The trefoil peptide family. Annu Rev Physiol, 1996; 58:253–273. Sanger F, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Coulson AR, Fiddes CA, Hutchison CA, Slocombe PM, Smith M. Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA. Nature, 1977; 265 (5596): 687–695. Schneider J, Moragues D, Martínez N, Romero H, Jimenez E, Pontón J. Cross- reactivity between Candida albicans and human ovarian carcinoma as revealed by monoclonal antibodies PA10F and C6. Br J Cancer, 1998; 77(6):1015-1020. Secundino N, Kimblin N, Peters NC, Lawyer P, Capul AA, Beverley SM, Turco SJ, Sacks D. Proteophosphoglycan confers resistance of Leishmania major to midgut digestive enzymes induced by blood feeding in vector sand flies. Cell Microbiol, 2010; 12(7):906- 918. 150 Sedgwick SG, and Smerdon SJ. The ankyrin repeat: a diversity of interactions on a common structural framework. Trends Biochem Sci, 1999; 24(8):311-316. Seelenmeyer C, Wegehingel S, Lechner J, Nickel W. The cancer antigen CA125 represents a novel counter receptor for galectin-1. J Cell Sci, 2003; 116(7):1305-1318. Shiga T, Imaizumi K, Harada N, Sekiya M. Kinetics of rouleaux formation using TV image analyzer. I. Human erythrocytes. Am J Physiol, 1983; 245(2):H252-H258. Singh AP, Moniaux N, Chauhan SC, Meza JL, Batra SK. Inhibition of MUC4 expression suppresses pancreatic tumor cell growth and metastasis. Cancer Res, 2004; 64(2):622-630. Situ H, Wei G, Smith CJ, Mashhoon S, Bobek LA. Human salivary MUC7 mucin peptides: effect of size, charge and cysteine residues on antifungal activity. Biochem J, 2003; 375:175–182. Sjoberg ER, Powell LD, Klein A, Varki A. Natural ligands of the B cell adhesion molecule CD22β can be masked by 9-O-acetylation of sialic acids. J Cell Biol, 1994; 126:549-562. Skinner MP, Lucas CM, Burns GF, Chesterman CN, Berndt MC. GMP-140 binding to neutrophils is inhibited by sulfated glycans. J Biol Chem, 1991; 266(9):5371-5374. Sleator RD, Walsh P. An overview of in silico protein function prediction. Arch Microbiol, 2010; 192(3):151-155. Sommer P, Blin N, Gott P. Tracing the evolutionary origin of the TFF-domain, an ancient motif at mucus surfaces. Gene, 1999; 236:133–136. Srinivasappa J, Saegusa J, Prabhakar BS, Gentry MK, Buchmeier MJ, Wiktor TJ, Koprowski H, Oldstone MB, Notkins AL. Molecular mimicry: frequency of reactivity of monoclonal antiviral antibodies with normal tissues. J Virol, 1986; 57(1):397-401. Stax MJ, van Montfort T, Sprenger RR, Melchers M, Sanders RW, van Leeuwen E, Repping S, Pollakis G, Speijer D, Paxton WA. Mucin 6 in seminal plasma binds DC- SIGN and potently blocks dendritic cell mediated transfer of HIV-1 to CD4(+) T- lymphocytes. Virology, 2009; 391(2):203-211. Steck TL. The organization of proteins in the human red blood cell membrane. A review. J Cell Biol, 1974; 62(1):1-19. 151 Stoltz JF, and Donner M. Hemorheology: importance of erythrocyte aggregation. Clin Hemorheol, 1987; 7:3–14. Suzuki Y, Toda Y, Tamatani T, Watanabe T, Suzuki T, Nakao T, Murase K, Kiso M, Hasegawa A, Tadano-Aritomi K, Ishizuka I, Miyasaka M. Sulfated glycolipids are ligands for a lymphocyte homing receptor, L-selectin (LECAM-1), Binding epitope in sulfated sugar chain. Biochem Biophys Res Commun, 1993; 190(2):426-434. Takeuchi F, Watanabe S, Baba T, Yuzawa H, Ito T, Morimoto Y, Kuroda M, Cui L, Takahashi M, Ankai A, Baba S, Fukui S, Lee JC, Hiramatsu K. Whole-genome sequencing of staphylococcus haemolyticus uncovers the extreme plasticity of its genome and the evolution of human-colonizing staphylococcal species. J Bacteriol, 2005; 187(21):7292-7308. Tanaka S, Podolsky DK, Engel E, Guth PH, Kaunitz JD. Human spasmolytic polypeptide decreases proton permeation through gastric mucus in vivo and in vitro. Am J Physiol, 1997; 272:G1473–G1480. Tang W, Miura T, Nakata M, Kojima N, Mizuochi T. Binding specificities of lectins to immobilized glycoproteins and oligosaccharides differ from those of immobilized lectins to oligosaccharides. Acta Med Okayama, 1998; 52(6):311-318. Tanner J, Weis J, Fearon D, Whang Y, Kieff E. Epstein-Barr virus gp350/220 binding to the B lymphocyte C3d receptor mediates adsorption, capping, and endocytosis. Cell, 1987; 50(2):203-213. Tas SW, Klickstein LB, Barbashov SF, Nicholson-Weller A. C1q and C4b bind simultaneously to CR1 and additively support erythrocyte adhesion. J Immunol, 1999; 163(9):5056-5063. Tatebayashi K, Tanaka K, Yang HY, Yamamoto K, Matsushita Y, Tomida T, Imai M, Saito H. Transmembrane mucins Hkr1 and Msb2 are putative osmosensors in the SHO1 branch of yeast HOG pathway. EMBO J, 2007; 26(15):3521-3533. Taupin D, Wu DC, Jeon WK, Devaney K, Wang TC, Podolsky DK. The trefoil gene family are coordinately expressed immediate-early genes: EGF receptor- and MAP kinase- dependent interregulation. J Clin Invest, 1999; 103:R31–R38. 152 Tedder TF, Steeber DA, Chen A, Engel P. The selectins: vascular adhesion molecules. FASEB J, 1995; 9(10):866-873. Telen MJ. Erythrocyte adhesion receptors: blood group antigens and related molecules. Transfus Med Rev, 2005; 19(1):32-44. Thim L, Madsen F, Poulsen SS. Effect of trefoil factors on the viscoelastic properties of mucus gels. Eur J Clin Invest, 2002; 32:519–527. Timoshenko AV, Gorudko IV, Maslakova OV, André S, Kuwabara I, Liu FT, Kaltner H, Gabius HJ. Analysis of selected blood and immune cell responses to carbohydrate- dependent surface binding of proto- and chimera-type galectins. Mol Cell Biochem, 2003; 250(1-2):139-149. Tran CP, Cook GA, Yeomans ND, Thim L, Giraud AS. Trefoil peptide TFF2 (spasmolytic polypeptide) potently accelerates healing and reduces inflammation in a rat model of colitis. Gut, 1999; 44:636–642. Tweedie S, Ashburner M, Falls K, Leyland P, McQuilton P, Marygold S, Millburn G, Osumi-Sutherland D, Schroeder A, Seal R, Zhang H. The FlyBase Consortium. FlyBase: enhancing Drosophila Gene Ontology annotations. Nucl Acids Res, 2009; 37: 555- 559. Ueda MJ, and Takeichi M. Two mechanisms in cell adhesion revealed by effects of divalent cations. Cell Struct Funct, 1976; 1:377–388. van de Wiel-van Kemenade E, Ligtenberg MJ, de Boer AJ, Buijs F, Vos HL, Melief CJ, Hilkens J, Figdor CG. Episialin (MUC1) inhibits cytotoxic lymphocyte-target cell interaction. J Immunol, 1993; 151:767–776. Van der Sluis M, De Koning BA, De Bruijn AC, Velcich A, Meijerink JP, Van Goudoever JB, Büller HA, Dekker J, Van Seuningen I, Renes IB, Einerhand AW. MUC2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that MUC2 is critical for colonic protection. Gastroenterology, 2006; 1:117–129. van Die I, van Vliet SJ, Schiphorst WECM, Bank CMC, Appelmelk B, Nyame AK, Cummings RD, Geijtenbeek TBH, van Kooyk Y. The dendritic cell specific C-type lectin DC-SIGN recognizes Lewis x, a major glycan epitope of Schistosoma mansoni egg antigen. Glycobiol. 2002, 12:641-642. 153 van Kooyk Y, and Geijtenbeek TB. A novel adhesion pathway that regulates dendritic cell trafficking and T cell interactions. Immunol Rev, 2002; 186:47-56. Van Seunigen I. The epithelial mucins: structure-function. Roles in cancer and inflammatory disease. Research Signpost, Kerala, India, 2008. Varki A, and Angata T. Siglecs - the major subfamily of I-type lectins. Glycobiol, 2006; 16(1):1-27. Varki A. Selectin ligands. Proc Natl Acad Sci USA, 1994; 91(16):7390-7397. Varki A. Selectins. In: Cummings RD, Lowe JB, Ed. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009. Chapter 26. Varki A. Sialic acids. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, Hart GW, Etzler ME, editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009. Chapter 15. Varki A. Trousseau's Syndrome: Multiple Definitions and Multiple Mechanisms (Invited Review). Blood, 2007; 110:1723-1729. Veelders M, Brückner S, Ott D, Unverzagt C, Mösch HU, Essen LO. Structural basis of flocculin-mediated social behavior in yeast. Proc Natl Acad Sci USA, 2010; 107(52):22511- 22516. Velcich A, Yang W, Heyer J, Fragale A, Nicholas C, Viani S, Kucherlapati R, Lipkin M, Yang K, Augenlicht L. Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin Muc2. Science, 2002; 295:1726–1729. von der Lieth C-W, Lütteke T, Martun F. Bioinformatics for glycobiology and glycomics: an introduction. Wiley-Blackwell, 2009. Wahrenbrock M, Borsig L, Le D, Varki N, Varki A. Selectin-mucin interactions as a probable molecular explanation for the association of Trousseau syndrome with mucinous adenocarcinomas. J Clin Invest, 2003; 112(6):853-862. Wellington JE, Allen GP, Gooley AA, Love DN, Packer NH, Yan JX, Whalley JM. The highly O-glycosylated glycoprotein gp2 of equine herpesvirus 1 is encoded by gene 71. J Virol, 1996; 70(11):8195-8198. Welsh RM, Fujinami RS. Pathogenic epitopes, heterologous immunity and vaccine design. Nat Rev Microbiol, 2007; 5(7):555-563. 154 Wesseling J, van der Valk SW, Hilkens J. A mechanism for inhibition of E-cadherin- mediated cell–cell adhesion by the membrane-associated mucin episialin/MUC1. Mol Biol Cell, 1996; 7:565–577. Wesseling J, van der Valk SW, Vos HL, Sonnenberg A, Hilkens J. Episialin (MUC1) overexpression inhibits integrin-mediated cell adhesion to extracellular matrix components. J Cell Biol, 1995; 129:255–265. Whittaker GR, Wheldon LA, Giles LE, Stocks JM, Halliburton IW, Killington RA, Meredith DM. Characterization of the high Mr glycoprotein (gP300) of equine herpesvirus type 1 as a novel glycoprotein with extensive O-linked carbohydrate. J Gen Virol, 1990; 71(10):2407-2416. Wright NA, Hoffmann W, Otto WR, Rio MC, Thim L. Rolling in the clover: trefoil factor family (TFF)-domain peptides, cell migration and cancer. FEBS Lett, 1997; 408:121– 123. Wu CH, Huang H, Nikolskaya A, Hu Z, Barker WC. The iProClass integrated database for protein functional analysis. Comput Biol Chem. 2004; 28(1):87-96. Wu CH, Xiao C, Hou Z, Huang H, Barker WC. iProClass: an integrated, comprehensive and annotated protein classification database. Nucleic Acids Res, 2001; 29(1):52-54. Wykes M, MacDonald KP, Tran M, Quin RJ, Xing PX, Gendler SJ, Hart DN, McGuckin MA. MUC1 epithelial mucin (CD227) is expressed by activated dendritic cells. J Leukoc Biol, 2002; 72:692–701. Yin BW, Dnistrian A, Lloyd KO. Ovarian cancer antigen CA125 is encoded by the MUC16 mucin gene. Int J Cancer, 2002; 98(5):737-740. Yin BW, Lloyd KO. Molecular cloning of the CA125 ovarian cancer antigen: identification as a new mucin, MUC16. J Biol Chem, 2001; 276(29):27371-27375. Yoshimura M, Ihara Y, Ohnishi A, Ijuhin N, Nishiura T, Kanakura Y, Matsuzawa Y, Taniguchi N. Bisecting N-acetylglucosamine on K562 cells suppresses natural killer cytotoxicity and promotes spleen colonization. Cancer Res, 1996; 56(2):412-418. Zacharius RM, Zell TE, Morrison JH, Woodlock JJ. Glycoprotein staining following electrophoresis on acrylamide gels. Anal Biochem 1969;30:148-152. 155 Zhang K, Baeckstrom D, Brevinge H, Hansson GC. Secreted MUC1 mucins lacking their cytoplasmic part and carrying sialyl-Lewis a and x epitopes from a tumor cell line and sera of colon carcinoma patients can inhibit HL-60 leukocyte adhesion to E-selectin- expressing endothelial cells. J Cell Biochem, 1996; 60:538–549. Zhu X, Price-Schiavi SA, Carraway KL. Extracellular regulated kinase (ERK)-dependent regulation of sialomucin complex/rat Muc4 in mammary epithelial cells. Oncogene, 2000; 19:4354–4361. Zrihan-Licht S, Baruch A, Elroy-Stein O, Keydar I, Wreschner DH. Tyrosine phosphorylation of the MUC1 breast cancer membrane proteins. Cytokine receptor-like molecules. FEBS Lett, 1994; 356:130–136. Ninoslav M. Mitić, roĊen je 06.04.1982. godine u Beogradu (Srbija). Osnovnu školu i gimnaziju završio je u Beogradu. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu (studijska grupa Biologija), upisao je školske 2001/2002 godine. Diplomirao je 2007. godine sa proseĉnom ocenom 9.31, a diplomski rad pod nazivom „Antibakterijsko dejstvo 2-alkiliden-4-oksotiazolidina i ekstrakta ljuspica semena heljde (Fagopyrum esculentum Moench.)“ uradio je u Odeljenju za mikrobiologiju Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Školske 2007/2008 godine upisao je doktorske studije na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, modul Biologija ćelija i tkiva. Od 2007. godine je zaposlen u Institutu za primenu nuklearne energije – INEP, na Odeljenju za imunohemiju i glikobiologiju, a u zvanje istraživaĉ saradnik izabran je 2010. godine. Od 2007. do 2010. godine uĉestvovao je na projektu B 143048 „Glikani kao molekularni markeri ćelijske funkcije: ekspresija, mikroheterogenost i biosignalna svojstva“ koji je finansiran od strane Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije. Od 2011. godine angažovan je na projektu 173010 „Strukturna heterogenost i efekti kompleksnih ugljenih hidrata (glikani) kao kljuĉnih komponenti molekulskog raspoznavanja u biološkim sistemima“ koji je finansiran od strane Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije. Eksperimentalni deo doktorske disertacije uradio je u Institutu za primenu nuklearne energije – INEP, na Odeljenju za imunohemiju i glikobiologiju, pod rukovodstvom dr Miroslave Janković, nauĉnog savetnika. Do sada je objavio 4 nauĉna rada u ĉasopisima meĊunarodnog znaĉaja. 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.