UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET mr Ana S. Mitrovski Bogdanović MOLEKULARNA I MORFOLOŠKA KARAKTERIZACIJA VRSTA IZ KOMPLEKSA PRAON DORSALE-YOMENAE (HYMENOPTERA, BRACONIDAE) Doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY MSci Ana S. Mitrovski Bogdanović MOLECULAR AND MORPHOLOGICAL CHARACTERIZATION IN PRAON DORSALE-YOMENAE SPECIES COMPLEX (HYMENOPTERA, BRACONIDAE) Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. MENTORI: dr Ţeljko Tomanović, redovni profesor Univerzitet u Beogradu-Biološki Fakultet dr Milana Mitrović, nauĉni saradnik Institut za zaštitu bilja i ţivotnu sredinu, Zemun ČLANOVI KOMISIJE: dr Ana Ivanović, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu- Biološki fakultet dr Bela Blesić, docent Univerzitet u Kragujevcu- Prirodno-matematiĉki fakultet Dr Christoph Vorburger, SNF Förderungsprofessor ETH Zürich & EAWAG, Institute of Integrative Biology Datum odbrane doktorske disertacije: ZAHVALNICA Ţelela bih da se zahvalim svom mentoru prof. dr Ţeljku Tomanoviću na nesebiĉno pruţenom znanju o parazitoidima, na svim korisnim idejama i sugestijama, na neverovatnom razumevanju i još većem strpljenju s kojim je vodio ovu disertaciju. Veliku zahvalnost dugujem svojoj mentorki dr Milani Mitrović na nesebiĉnoj i ogromnoj pomoći prilikom uĉenja molekularnih metoda, na svim konstruktivnim predlozima i sugestijama, na prijateljskoj podršci i iskrenoj saradnji prilikom izrade disertacije. Veliko hvala i dr Ani Ivanović na neverovatnoj pomoći prilikom rešavanja problematike koju sa sobom nosi morfometrija, za svo znanje koje mi je pruţila prilikom statistiĉke obrade podataka, i hvala joj na svim korisnim predlozima i sugestijama prilikom pisanja disertacije. Iskrenu zahvalnost dugujem i dr Beli Blesiću i dr Christoph Vorburgeru kao ĉlanovima komisije koji su svojim korisnim sugestijama doprineli prilikom izrade disertacije. Veliku pomoć u izradi ilustracija pruţio mi je dragi kolega dr AnĊeljko Petrović, koji je uvek bio spreman da pomogne kad god je za to i bilo potrebe. Hvala mojoj dragoj koleginici dr Radmili Glišić na cimerskoj podršci i detektivskom instiktu u rešavanju mnogobrojnih problema tehniĉke prirode prilikom pisanja disertacije. Zahvaljujem se Vukašinu Ćiroviću na pomoći oko izrade grafikona, bez koga ne bih umela da otkrijem mnoge tajne Corel-a. Dragi moji roditelji, prijatelji i kolege hvala vam na dugogodišnjoj podršci. Ova doktorska disertacija je realizovana u okviru projekta br. 043001 koji je finansiran od strane Ministarstva prosvete i nauke. Zahvaljujem se i Švajcarskoj agenciji za nauku u okviru SCOPES programa koja je delimiĉno omogućila finansiranje disertacije. I najzad, najveću zahvalnost dugujem svom suprugu Vladanu i mojoj ćeri Teodori bez ĉije podrške, ljubavi, strpljenja i razumevanja ne bih mogla da istrajem do kraja. Molekularna i morfološka karakterizacija vrsta iz kompleksa Praon dorsale- yomenae (Hymenoptera, Braconidae) REZIME Molekularna i morfološka varijabilnost unutar kompleksa vrsta Praon dorsale- yomenae analizirana je primenom tri nezavisne metode: “tradicionalne” morfometrije, geometrijske morfometrije i analize citohrom oksidaza I sekvenci mitohondrijalne DNK i 28S D2 gena nuklearne DNK. Za morfometrijske analize korišćena je 421 jedinka (270 ţenki i 151 muţjak) sakupljena sa preko 30 razliĉitih afidnih domaćina širom Palearktika. Molekularne analize su obuhvatile 47 jedinki u asocijaciji sa razliĉitim domaćinima. Primenom diskriminantne kanonijske analize utvrĊeno je koji su karakteri dovoljno informativni za morfološku diferencijaciju analiziranih taksona. CVA analizom su prikazane razlike u obliku krila izmeĊu vrsta. Varijabilnost oblika krila meĊu biotipovima analizirana je primenom PCA. Pokazano je da postoji znaĉajan efekat domaćina na varijabilnost oblika krila meĊu biotipovima vrsta P. dorsale i P. longicorne, dok je meĊu biotipovima vrste P. yomenae utvrĊen znaĉajan efekat geografske distribucije. Analize oblika krila ukazale su na to da se vrste „dorsale- yomenae“ kompleksa mogu morfološki razlikovati na osnovu duţine radijalnog i povratnog nerva. Geometrijska morfometrija primenjena u cilju vizualizacije suptilnih razlika u obliku krila pokazala je veću osetljivost u razdvajanju analiziranih taksona „dorsale-yomenae“ grupe u odnosu na „tradicionalnu” morfometriju. Ispitali smo validnost prethodno korišćenih morfoloških karaktera u identifikaciji „dorsale- yomenae“ grupe. TakoĊe smo ukazali na nove karaktere koji se mogu koristiti u kljuĉevima za identifikaciju. UtvrĊeni su razliĉiti obrasci obojenosti krilne nervature unutar kompleksa vrsta „dorsale-yomenae“. Na osnovu rezultata molekularnih analiza potvrĊen je status vrsta P. longicorne, P. dorsale, P. yomenae i P. volucre. UtvrĊeni su novi domaćini/asocijacije za vrstu P. dorsale. Otkrivena je nova vrsta za nauku koja parazitira vaš Staticobium limonii na Limonium angustifolium. Vrsta P. megourae nije dobila molekularnu potvrdu pa su za rasvetljavanja statusa ovog taksona potrebna dodatna istraţivanja. Ključne reči: „dorsale-yomenae“ kompleks vrsta, geometrijska morfometrija, tradicionalna morfometrija, COI mtDNK, 28S D2 Naučna oblast: Biologija Uţa naučna oblast: Morfologija, sistematika i filogenija ţivotinja UDK broj: 595.79:[591.557.1:595.7 Molecular and morphological characterization in Praon dorsale-yomenae species complex (Hymenoptera, Braconidae) ABSTRACT Molecular and morphological variability of Praon dorsale-yomenae species complex was analyzed using the three independent methods: “traditional” morphometrics, geometric morphometrics and DNA sequence analysis of two gene regions (COI mtDNA and 28S D2). For morphometric analysis we used 421 specimens (270 females and 151 males) reared from about 30 different species of aphid hosts throughout Palaearctic. Molecular analysis included 47 specimens in association with different aphid hosts. Discriminant Canonical Analysis was performed in order to determine which characters were informative for morphological diferentiation of analyzed taxa. To explore differences in wing shape between species we performed Canonical Variate Analysis. Variation in wing shape among biotypes was investigated using Principal Component Analysis. We found that great variablity in wing shape of P. dorsale and P. longicorne biotypes was influenced by the host, while great effect of geographical distribution was noticed between P. yomenae biotypes. Analysis of wing shape demonstrated that „dorsale-yomenae“ species can be morphologically discriminated on the basis of length of forewing radial and recurrent vein. Geometric morphometrics applied to visualize subtle shape differences had more sensitivity than „traditional“ morphometrics in distiguishing taxa within „dorsale-yomenae“ group. We tested the validity of morphological characteristics previously used for identification in „dorsale-yomenae“ group, also indicating a new characters that could be used in identification keys. Different colour patterns of wing venation in „dorsale-yomenae“ species complex were found. On the basis of molecular results P. longicorne, P. dorsale, P. yomenae and P. volucre was confirmed as separate species. We presented a new tritrophic association for P. dorsale. A new parasitoid species from Staticobium limonii infesting Limonium angustifolium was described. P. megourae was not confirmed as separate species using molecular markers, thus the clarification of its status requires further research. Key words: „dorsale-yomenae“ species complex, geometric morphometry, traditional morphometry, COI mtDNA, 28S D2 Scientific field: Biology Narrow scientific field: Morphology, systematic and phylogeny of animals UDK number: 595.79:[591.557.1:595.7 SADRŢAJ 1. UVOD .......................................................................................................................... 1 1.1. FILOGENIJA I TAKSONOMIJA FAMILIJE BRACONIDAE ........................... 1 1.2. FILOGENIJA I TAKSONOMIJA PODFAMILIJE APHIDIINAE ...................... 2 1.3. BIOLOGIJA VRSTA IZ PODFAMILIJE APHIDIINAE ..................................... 3 1.4. FILOGENIJA I TAKSONOMIJA TRIBUSA PRAINI ........................................ 5 1.5. ROD PRAON ......................................................................................................... 7 1.5.1. Rod Praon Haliday, 1833 – biologija i sistematika ........................................ 7 1.5.2. Sinonimija i razmatrani taksoni Praon dorsale-yomenae kompleksa ............. 8 1.5.3. Dosadašnje taksonomske studije Praon dorsale-yomenae kompleksa ......... 12 1.6. MORFOMETRIJSKE I MOLEKULARNE METODE U ANALIZAMA PODFAMILIJE APHIDIINAE ............................................................................ 15 1.6.1. Primena geometrijske morfometrije .............................................................. 15 1.6.2. Dosadašnja molekularna istraţivanja i izbor markera................................... 16 1.7. INTERAKCIJSKI ODNOSI UNUTAR VAŠ-PARAZITOID ASOCIJACIJA .. 20 1.8. NIVOI SPECIJACIJE UNUTAR PODFAMILIJE APHIDIINAE ..................... 24 1.9. ULOGA I ZNAĈAJ PREDSTAVNIKA PODFAMILIJE APHIDIINAE .......... 26 2. CILJEVI ISTRAŢIVANJA ........................................................................................ 29 3. MATERIJAL I METODE RADA .............................................................................. 30 3.1. MORFOMETRIJSKE METODE ....................................................................... 30 3.1.1. „Tradicionalna“ morfometrija ....................................................................... 30 3.1.2. Geometrijska morfometrija ........................................................................... 33 3.2. MOLEKULARNE METODE ............................................................................. 35 3.2.1. Ekstrakcija DNK iz insekata ......................................................................... 35 3.2.2. Amplifikacija DNK, preĉišćavanje i sekvencioniranje ................................ 36 3.2.3. Obrada podataka i filogenetske analize ......................................................... 37 4. REZULTATI .............................................................................................................. 39 4.1. MORFOLOŠKE ANALIZE ................................................................................ 39 4.1.1.Varijabilnost morfoloških karaktera kod ţenki .............................................. 39 4.1.2.Varijabilnost morfoloških karaktera kod muţjaka ......................................... 44 4.2. ANALIZE VELIĈINE I OBLIKA KRILA PRIMENOM GEOMETRIJSKE MORFOMETRIJE ............................................................................................... 49 4.2.1. Analiza veliĉine i oblika krila ţenki .............................................................. 50 4.2.2. Analiza veliĉine i oblika krila muţjaka ......................................................... 61 4.2.3. Efekat geografske distribucije na veliĉinu i oblik krila jedinki vrste Praon yomenae ....................................................................................................... 70 4.2.3.1. Analiza veliĉine i oblika krila ţenki Praon yomenae razliĉite geografske distribucije ........................................................................................ 71 4.2.3.2. Analiza veliĉine i oblika krila muţjaka Praon yomenae razliĉite geografske distribucije ........................................................................................ 74 4.2.4. Polni dimorfizam u veliĉini i obliku krila ..................................................... 78 4.3. MOLEKULARNE ANALIZE ............................................................................. 81 4.3.1. Molekularne analize COI mtDNK vrsta iz roda Praon ................................. 81 4.3.2. Molekularne analize 28S rRNK vrsta iz roda Praon .................................... 88 5. DISKUSIJA ................................................................................................................ 93 5.1. Opis nove vrste .................................................................................................. 105 6. ZAKLJUĈCI ............................................................................................................ 107 7. LITERATURA ......................................................................................................... 110 8. PRILOZI ................................................................................................................... 144 9. BIOGRAFIJA ........................................................................................................... 160 IZJAVA O AUTORSTVU IZJAVA O ISTOVETNOSTI ŠTAMPANE I ELEKTRONSKE VERZIJE DOKTORSKOG RADA IZJAVA O KORIŠĆENJU 1 1. UVOD 1.1. FILOGENIJA I TAKSONOMIJA FAMILIJE BRACONIDAE Red Hymenoptera, sa preko 100.000 opisanih vrsta, predstavlja jedan od najvećih insekatskih redova. Istovremeno predstavlja i biološki raznovrsnu grupu (Gaston 1991), ukljuĉujući slobodno-ţiveće, socijalne i parazitske evolutivne linije. Postoje malobrojne informacije koje ukazuju na filogenetske odnose meĊu ĉlanovima ovog reda. Pokazano je da postoje brojne anatomske sinapomorfoze na nivou superfamilija (Whitfield 1998). Kod Hymenoptera koji su malih dimenzija tela, minijaturizacija i redukcija i gubljenje morfoloških celina ĉine da su filogenije bazirane na morfološkim podacima problematiĉne - taĉnije, teško je utvrditi da li je do redukcije pojedinih karakteristika došlo usled homologije ili je to posledica konvergentnih dogaĊaja (Gibson 1985; van Achterberg 1988). Kako bi se olakšalo rešavanje postojećih problema, u analizama evolucije socijalnih i parazitskih osa poĉinju da se ukljuĉuju i molekularne metode (Cameron 1993; Dowton and Austin 1994, 1997a, 2001; Gimeno et al. 1997). MeĊu opnokrilcima velika paţnja je posvećena taksonomskim i filogenetskim analizama predstavnika familije Braconidae, koja obuhvata preteţno parazitske ose (Quicke and van Achterberg 1990). Mnogobrojne studije razliĉitih morfoloških karakternih sistema (Quicke et al. 1992a; Quicke et al. 1992b; Quicke et al. 1992c; Basibuyuk and Quicke 1995, 1997), kao i paralelan rad na molekularnoj filogeniji postojećih parazitskih osa (Belshaw and Quicke 1997; Belshaw et al. 1998; Quicke et al. 1999) dale su novo obeleţje u filogenetkim istraţivanjima pomenute familije, što je od izuzetnog znaĉaja upravo zbog njene velike raznovrsnosti. Postoje mnogobrojne taksonomske studije familije Braconidae širom sveta (Watanabe 1963; van Achterberg 1990; Atanassova 1997; Ölmez and Ulusoy 2003; Aslan et al. 2004; van Achterberg 2006 ; Fallahzadeh and Saghaei 2010; Lozan et al. 2010). Do sada je prihvaćena podela famije Braconidae na dve odvojene klade (Wharton et al. 1992) koje se ĉesto oznaĉavaju kao ciklostomatna i neciklostomatna. Većina ĉlanova ove familije pokazuje jedan od dva parazitska naĉina ţivota: ektoparazitsku idiobiozu i endoparazitsku koinobiozu. Biološki sve neciklostomatne 2 vrste predstavljaju endoparazite, ali i oko polovina ciklostomatnih predstavnika vodi endoparazitski naĉin ţivota. Postoji pretpostavka da su se svi oblici endoparazitizma unutar ciklostomatne klade razvili od ektoparazitizma (Whitfield 1992; Quicke 1993), što bi znaĉilo da je endoparazitizam izvedeno stanje unutar ciklostomatne klade, sa ektoparazitizmom kao opšte prihvaćenim primitivnim stanjem. Wharton (2000) predlaţe postojanje dve ciklostomatne (Braconinae i Alysiinae) i dve neciklostomatne podfamilije (Agathidinae i Microgastrinae) unutar familije Braconidae. Taĉan poloţaj podfamilije Aphidiinae u okviru familije Braconidae nije još uvek razjašnjen. Zbog svega navedenog familija Braconidae predstavlja jako bitan sistemski model za praćenje evolucije parazitskih oblika ţivota (Gauld 1988; Whitfield 1992). 1.2. FILOGENIJA I TAKSONOMIJA PODFAMILIJE APHIDIINAE Sa oko 50 rodova i oko 400 opisanih vrsta, podfamilija Aphidiinae jedna je od najvećih unutar familije Braconidae (Mackauer and Starỳ 1967; Starỳ 1988; Dolphin and Quicke 2001). Predstavnici ove podfamilije predstavljaju solitarne endoparazitoide koji iskljuĉivo parazitiraju na biljnim vašima, i karakterišu se dominantnom distribucijom u severnoj hemisferi (Mackauer 1968). U poĉetku je ova podfamilija imala rang familije upravo zbog prisustva velike biološke i ekološke specijalizacije prema biljnim vašima kao domaćinima, kao i zbog prisustva nekih od morfološih karaktera, kao što je fleksibilna sutura izmeĊu prvog i drugog tergita na gasteru. Usled nedostatka ubedljivih dokaza o pripadnosti podfamilije Aphidiinae jednoj od dve utvrĊene klade unutar familije Braconidae, postojala je pretpostavka da je one sestrinska grupa familiji Braconidae (Tobias 1989). MeĊutim, na osnovu dosadašnjih filogenetskih studija podfamilija Aphidiinae se svrstava unutar familije Braconidae (Quicke and van Achterberg 1990; Wharton et al. 1992). Još uvek nije razjašnjeno da li se podfamilija Aphidiinae moţe svrstati unutar ciklostomatne ili neciklostomatne klade familije Braconidae (Ĉapek 1970; van Achterberg 1984; Quicke and van Achterberg 1990; Wahl and Sharkey 1993). Quicke i saradnici (1999) su, na bazi morfoloških, paleontoloških i molekularnih dokaza, ukazali na to da se pojedini predstavnici podfamilije Aphidiinae mogu svrstati unutar ciklostomatne klade, što se ne podudara sa drugim molekularnim 3 analizama (Belshaw and Quicke 1997; Belshaw et al. 1998) gde se daje dokaz o tome da je pomenuta podfamilija ipak bliţa neciklostomatnoj kladi. Podfamilija Aphidiinae predstavlja koherentnu grupu definisanu brojnim sinapomorfozama, meĊutim znaĉajne razlike u biologiji, morfologiji i ponašanju postoje izmeĊu i unutar tribusa. Zbog razliĉite interpretacije ovih razlika dolazi i do kontradiktornosti razliĉitih filogenija. Do sada su prikazane mnogobrojne filogenije i to bazirano na morfologiji adulta i larvi (Mackauer 1961b, 1968; Gärdenfors 1986; O‟Donnell 1989; Finlayson 1990), na embriologiji (Tremblay and Calvert 1971) i na DNK sekvencama (Belshaw and Quicke 1997). Najprihvatljiviju klasifikaciju podfamilije Aphidiinae dao je Mackauer (1961b), koji je podelio podfamiliju na ĉetiri tribusa: Aclitini, Aphidiini, Ephedrini i Praini. Aphidiini predstavlja najveći tribus i podeljen je na tri subtribusa Aphidiina, Monoctonina i Trioxina (Smith and Kambhampati 2000). Glavni problem u rekonstrukciji filogenije unutar podfamilije Aphidiinae predstavlja determinacija bazalne evolutivne linije i to zbog njenog jakog uticaja na evoluciju same podfamilije, kao i na evoluciju izvesnih morfoloških i ţivotnih odlika. U dosadašnjim analizama svaki od pomenuta ĉetiri tribusa je zauzimao bazalnu poziciju: Ephedrini na osnovu morfologije adulta (Mackauer 1961b; Gärdenfors 1986) i DNK sekvenci (Belshaw and Quicke 1997), Praini na osnovu tipa pupacije i nervature krila (Tobias 1967; Tobias and Kyriac 1971; Edson and Vinson 1979) i molekularnih podataka (Smith et al. 1999), Aclitini na osnovu morfologije i ponašanja (Cho 1984) i Trioxini na osnovu morfologije larve (Finlayson 1990). Postoji veliki broj meĊusobno neusaglašenih filogenetskih analiza podfamilije Aphidiinae koje su bazirane na ograniĉenom broju karaktera ili taksona. Zbog toga je neophodno planirati da se u narednim filogenetskim rekonstrukcijama mora ukljuĉiti znatno širi taksonomski uzorak, kao i morfološki i molekularni podaci. 1.3. BIOLOGIJA VRSTA IZ PODFAMILIJE APHIDIINAE Sve vrste podfamilije Aphidiinae predstavljaju solitarne koinobiontske parazitoide oviparnih i viviparnih biljnih vašiju iz familije Aphididae. Svi stadijumi domaćina osim jajeta su pogodni za parazitiranje, mada ţenke polaţu jaja najĉešće u II i III stupanj larve domaćina (Shaw and Huddleston 1991; Hagvar and Hofsvang 1991) 4 (Slika 1). MeĊutim, ĉesti su primeri da ţenke nekih vrsta afidiina polaţu jaja i u I i II larveni stupanj (Trioxys) ili u IV stupanj larve ili u adulta (Aphidius sonchi, Trioxys utilis, Praon palitans i dr.) (Liu and Hughes 1984). Vreme trajanja ovipozicije varira kod razliĉitih rodova u okviru familije. Tako npr. vrste roda Aphidius polaţu jaja u domaćina za 1-2 sekunde (Dransfield 1979; Mackauer 1983). Najduţe vreme ovipozicije imaju vrste roda Ephedrus, koje kod njih iznosi oko 10 sekundi (Hofsvang and Hagvar 1986). Slika 1. Ţivotni ciklus parazitskih osa iz podfamilije Aphidiinae (Hagvar and Hofsvang 1991) Larva parazitoida I stupnja poseduje mandibule tako da se hrani slobodnim teratocitama koje se nalaze u hemolimfi domaćina. Na ovom stupnju parazitoid omogućava domaćinu da se normalno hrani i normalno ţivi, osim što mu je onemogućena reprodukcija. II razvojni stupanj larve ne poseduje mandibule pa larva usisava teratocite svojim ezofagusom (Schlinger and Hall 1960). U III i kasnijim stupnjevima razvoja, larva opet dobija mandibule, ali ishrana teratocitama više ne zadovoljava potrebe parazitoida, pa on poĉinje direktno da se hrani tkivima domaćina prouzrokujući njegovo uginuće (Soldan and Starý 1981). Parazitska larva takoĊe izaziva promene u produkciji i sintezi hormona domaćina i prilagoĊava ih sopstvenom razviću (Lawrence 1986). Uskoro od parazitirane vaši ostaje samo kutikula („mumija“), koja 5 postaje tamnija i koju parazitska larva sekretom mandibularnih ţlezda fiksira za biljno tkivo. Potom dolazi do ulutkavanja IV stupnja parazitske larve. Prema mestu ulutkavanja Starý (1974) razlikuje dve grupe rodova i to: rodovi kod kojih se ulutkavanje odigrava unutar domaćina (Aphidius, Lysiphlebus, Trioxys, Monoctonus, Pauesia) i rodovi kod kojih larva ispreda kokon i ulutkava se ispod parazitirane vaši (Dyscritulus, Praon, Parapraon i Areopraon). Formiran adult mandibulama iseca kruţni izletni otvor na zadnjem kraju „mumije“. U zavisnosti od uslova sredine i same vrste, polna zrelost se dostiţe od jedan do nekoliko ĉasova po izleganju iz domaćina (Aphidius smithi, Diaeretiella rapae, Lysiphlebus fabarum, Praon exoletum) (Wiackowski 1962; Starý 1970). Obiĉno muţjaci sazrevaju ranije od ţenki. Parenje traje od nekoliko sekundi do nekoliko minuta (Mackauer 1983). MeĊutim kod manjeg broja vrsta (Praon aguti), primećeno je da parenje poĉinje nekoliko ĉasova po izleganju (Sekhar 1957). Jedan muţjak moţe da oplodi veći broj ţenki u toku nekoliko dana. Na primer muţjaci vrste Lysiphlebus testaceipes oplode do 19 ţenki u toku ţivota (Sekhar 1957). Nasuprot muţjacima, ţenke afidiina se pare samo jedanput (Starý 1970). Razviće predstavnika podfamilije Aphidiinae u velikoj meri zavisi od temperature, ali je u optimalnim uslovima za ceo razvojni ciklus potrebno dve do tri nedelje. Imaga se hrane nektarom, polenom i sekretima biljnih vašiju. Mnoge vrste su sposobne da u toku jedne sezone produkuju više generacija sa ţivotnim ciklusom od 2-3 nedelje, kada su uslovi pogodni. Pojavljivanje u sezoni zavisi i od biologije parazitoida, same biologije domaćina, kao i od spoljašnjih uslova. Predstavnici pomenute podfamilije koje ţive u umerenim regionima prezimljavaju kao prepupe ili kao zrele larve, zadrţavajući mekonijum u mumijama i kokonima ĉvršćim i tamnijim od letnjih (Liu and Carver 1985). 1.4. FILOGENIJA I TAKSONOMIJA TRIBUSA PRAINI Tribus Praini, zajedno sa tribusima Ephedrini, Aphidiini i Aclitini, pripada podfamiliji Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae). Postoje brojne filogenetske analize podfamilije Aphidiinae bazirane na morfologiji, embriologiji ili DNK sekvencama. Tako su npr. Smith i saradnici (1999) predloţili novo filogenetsko stablo gde klada Praini (Praon+Dyscritulus) ima bazalnu poziciju, što se kosi sa prethodno postavljenim 6 hipotezama gde je tribus Ephedrini zauzimao tu poziciju. Na osnovu dosadašnjih molekularnih i morfoloških podataka (Mackauer 1961b; Tobias and Kyriac 1971; Starý 1981a; Belshaw and Quicke 1997; Smith et al. 1999; Belshaw et al. 2000; Sanchis et al. 2000; Kambhampati et al. 2000), pokazano je da tribus Praini predstavlja jednu od najranije divergirajućih linija unutar podfamilije Aphidiinae. Iz tog razloga, razmatranje filogenetskih odnosa izmeĊu rodova unutar tribusa Praini je od velikog znaĉaja za tumaĉenje porekla same podfamilije, kao i veza sa predaĉkim grupama familije Braconidae. Na osnovu odreĊenih karakteristika, kao što su krilna nervatura, kratak petiolus i naĉin pupacije, tribusu Praini pripadaju rodovi Praon, Dyscritulus, Areopraon i Pseudopraon (Mackauer 1959, 1961b; Tobias and Kyriac 1971; Starý 1975a, 1981b, 1983). Mackauer (1959) i Starý (1976a) razdvajaju rodove Areopraon i Praon kao zasebne taksone, dok Tobias i Kyriac (1971) smatraju da su u pitanju sinonimi. Vrste Areopraon nisu prethodno ukljuĉivane u filogenetske analize podfamilije Aphidiinae, mada ih mnogi autori oznaĉavaju kao najraniju divergirajuću liniju unutar tribusa Praini i unutar afidiina (Mackauer 1961b; Tobias and Kyriac 1971; Starý 1975a, 1976c; Smith et al. 1999). Kod rodova Areopraon i Pseudopraon postoje istovremeno oba tipa pupacije: unutrašnja (unutar afidnog domaćina – „Aphidius“ tip pupacije) i spoljašnja (ispod afidnog domaćina – „Praon“ tip pupacije) (Tobias and Kyriac 1971; Starý 1976c). Iz tog razloga je filogenetska pozicija rodova Areopraon i Pseudopraon unutar tribusa Praini od kljuĉnog znaĉaja za tumaĉenje ponašanja u pogledu pupacije kod afidiina (Smith et al. 1999). Za razliku od njih, kod rodova Dyscritulus i Praon prisutan je samo spoljašnji tip pupacije. Rodovi Areopraon sa 5 vrsta, Dyscritulus sa poznate dve, kao i monotipski rod Pseudopraon su taksonomski i biološki slabo prouĉeni, a distribucija im je uglavnom ograniĉena na zapadni Palearktik (Tomanović et al. 2006; Tomanović et al. 2009). Svi ovi rodovi su u asocijacijama sa vašima domaćinima koje, filogenetski gledano, imaju više bazalnu poziciju. Za razliku od njih vrste roda Praon parazitiraju na širem krugu domaćina (Ortiz-Rivas et al. 2004) i uglavnom su kosmopoliti po pitanju distribucije (Starý 1981a). 7 1.5. ROD PRAON 1.5.1. Rod Praon Haliday, 1833 – biologija i sistematika Praon Haliday, 1833, Entomol. Mag. 1: 261, 483-484 Achoristus Ratzeburg, 1852, Die Ichneumonen der Forstinsecten 3: 31-32 Aphidaria Provancer, 1886, Add. et Correct. Faun. Hym. Québec: 151-152 Parapraon Starý, 1983, Acta Entomol. Bohemos. 80: 206-209 Rod Praon Haliday, 1833, sa oko 50 vrsta širom sveta i 28 opisanih vrsta u Evropi, predstavlja najveći rod unutar tribusa Praini i jedan je od najvećih rodova unutar podfamilije Aphidiinae (Braconidae: Hymenoptera) koji se odlikuje kosmopolitskom distribucijom (Mackauer and Starý 1967; Kavallieratos et al. 2005) i Palearktiĉkim rasprostranjenjem. Za razliku od ostalih tribusa podfamilije Aphidiinae, larvalna pupacija se, kod predstavnika pomenutog roda, dešava ispod parazitirane vaši domaćina (Mackauer 1959, 1961b; Starý 1970, 1975a, 1981a, 1983). Pretpostavlja se da je spoljašnji tip pupacije unutar tribusa Praini vid sekundarne adaptacije koji im sluţi kao zaštita od hiperparazitizma (Mackauer 1961b; Smith et al. 1999). Rod Praon je zadrţao dosta pleziomorfnih karakteristika, kao što su: razliĉit broj antenalnih segmenata kod muţjaka i ţenke, triangularna lacinija, sklerotizovan povratni nerv, dlakavost mezonotuma, kratak i širok petiolus. Vrste roda Praon imaju glavu subkvadratnog oblika, širine kao toraks ili nešto šire od toraksa u predelu tegula. Clypeus je gusto pokriven dugim setama (ĉekinjama). Maksilarni palpusi su izgraĊeni od 4 segmenata, a labijalni palpusi od 3 segmenata. Potiljak je jasno naglašen. Antene su filiformne sa razliĉitim brojem segmenata (13-23). Na torakalnom delu mezoskutum je jasno ispupĉen, nalazi se vertikalno u odnosu na protoraks, manje ili više pokriven setama (ĉekinjama). Na prednjim krilima uoĉava se triangularna pterostigma suţena u medijalnom delu, zaseban metakarpalni nerv (Mt), razvijen radijalni nerv (R) koji nikada ne doseţe do kraja krila, pa je pterostigmalna ćelija nekompletna, dok su radijalna ćelija 1 i medijalna ćelija 1 jasno odvojene medijalnom abscisom 1; interradijalni nervi su obezbojeni; intermedijalni nerv (Im) je manje ili više izdvojen. Propodeum je konveksan i gladak. Petiolus je kvadratnog oblika ili je malo širi u odnosu na duţinu. Abdomen je kod ţenki lancetastog, a kod muţjaka 8 valjkastog oblika. Ovoji legalice su pravi do malo povijeni na više, blago triangulani, a na vrhu sa oskudnim setama (Mescheloff and Rosen 1988). Mackauer (1959) je dao pregled Evropskih vrsta roda Praon. Postoji i veliki broj taksonomskih studija u Aziji (Watanabe and Takada 1964; Starý and Schlinger 1967; Takada 1968; Starý and Kaddou 1971; Paik 1975; Starý 1975b; Starý and Ghosh 1983; Mescheloff and Rosen 1988, 1990; Raychaudhuri 1990; Starý et al. 1998; Barahoei et al. 2010), u Severnoj Americi (Smith 1944; Mackauer 1963; Johnson 1987; Pike and Starý 1995; Pike et al. 2000), u Juţnoj Americi (Starý and Vogel 1985; Starý 1995), u Evropi (Starý 1961, 1962, 1966a, 1971, 1976a, 1981c,1983; Kierych 1975; Boness and Starý 1988). Posebno su obavljene i studije u oblasti Mediterana (Starý 1966b, 1976b; Starý et al. 1971; Starý et al. 1973; Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986; Mescheloff and Rosen 1988). 1.5.2. Sinonimija i razmatrani taksoni Praon dorsale-yomenae kompleksa Jedan od nerazrešenih problema unutar roda Praon je taksonomski status vrsta unutar kompleksa Praon dorsale-yomenae (Marshall 1891; Mackauer 1959; Mackauer 1961a; Starý 1971) koji su delimiĉno pokušali da razreše Tremblay i Pennacchio (1985) i Tremblay i saradnici (1986). Mackauer (1961a) je sinonimizirao vrstu Praon longicorne Marshall, 1891 sa vrstom Praon dorsale (Haliday, 1833). Tremblay i Pennacchio (1985) su na osnovu tipskih vrsta u Britanskom muzeju okarakterisali ove vrste kao posebne taksone i to na osnovu broja segmenata u antenama, krilne nervature i oblika prvog tergita abdomena. Taĉnije, P. dorsale u odnosu na P. longicorne pokazuje kraće antene (19-20 naspram 21-23), kraći radijalni nerv (R) koji ne dostiţe duţinu pterostigme i veći odnos duţine/širine tergita I. Problem je nastupio kada su ove dve vrste pokušali da uvrste u kljuĉ za identifikaciju vrsta roda Praon. P. dorsale Auct. nije odgovarao P. dorsale Hal., dok se P. grossum Starý 1971 podudarao sa P. longicorne. „Prava“ vrsta P. dorsale parazitira na Coryllobium avellanae (Schrank) i bila je okarakterisana kao retka vrsta (Marshall 1891; Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986). Ove poteškoće su ih navele da ispitaju jedinke vrste P. grossum i da naprave reviziju Praon vrsta koje parazitiraju na vašima roda Uroleucon i srodnih taksona. Rezultat njihovog rada je odvojen taksonomski status P. dorsale Haliday i P. 9 longicorne Marshall, što je potvrĊeno i novim analizama (Tremblay et al. 1986). P. dorsale Auct. sa vaši Uroleucon se podudarao sa vrstom P. yomenae iz Japana, dok je utvrĊeno da se P. grossum mora razmatrati kao junior sinonim vrste P. longicorne. Taksonomija Praon dorsale-yomenae kompleksa još uvek nije razrešena na šta nam ukazuje i postojanje velikog broja sinonima koji su nastali usled korišćenja neadekvatnih morfoloških karaktera u identifikaciji vrsta: SINONIMIJA (Mackauer 1959) Praon dorsale (Haliday 1833) Aphidius (Praon) dorsalis Haliday 1833 (Ent. Mag., London, 1, 484 ♀) Blacus discolor Nees ab Esenbeck 1834 (Mon. Ichn. aff., 1, 192, ♀) Praon dorsale Marshall 1891 ( Spéc. Hym. Eur. Alg., Gray, 5, 536♀) Praon discolor Marshall 1891 (Spéc. Hym. Eur. Alg., Gray, 5, 540, ♀) ? Aphidius dorsalis Thomson 1895 (Opusc. ent., Lund, 20, 2333, ♀) Praon dorsale Marshall 1899 (Trans. ent. Soc., London, 1899, p.17, ♀) Praon longicorne Marshall 1891 Praon longicorne Marshall 1891 ( Spéc. Hym. Eur. Alg., Gray, 5, 536, ♀♂) Praon longicorne Marshall 1899 (Trans. ent. Soc., London, 1899, p. 15, 17, ♀♂) Praon grossum Starý, 1971 n. syn. Praon yomenae Takada, 1968 Praon dorsale Auct. n. Syn Tremblay i Pennacchio (1985) daju u svom radu pregled najbitnijih komparativnih karaktera vrsta grupe „dorsale-yomenae“ (Slika 2): Praon dorsale (Haliday, 1833): Antene od 19-20 segmenata. Mezoskutum uniformno i gusto dlakav. Velika krila, radijalni nerv (R) kraći od duţine pterostigme, prva abscisa medijalnog nerva (M1) je nejasna u većem delu, intermedijalni (povratni) nerv (Im) je sklerotizovan. Propodeum je gladak, sa dugim i gustim dlakama. Petiolus duţi u odnosu na samu širinu u predelu spirakuluma; u središnjem delu ograniĉen, izdignut i izbrazdan sa lateralnim dlakama, apikalno sa jasnim nagibom prema tergitu II. Dorzalna linija treće valvule blago konkavna. Obojenost: Glava je braon boje, sa malim oblastima u predelu obraza crvenkasto-braon boje. Scapus, pedicelus i F1 su ţućkasti, vrh F2 je braonkast, ostatak antene je braon. Toraks je braon sa antero-lateralnim marginama protoraksa i antero- 10 inferiornim delovima mezopleure koji su ţućkaste boje. Tergit I je braon sa svetlijim apeksom, ostatak abdomena ţućkasto braon boje sa svetlijim oblastima na tergitima II i III i na vrhu. Domaćini: Ovo je retka vrsta u Evropi koj parazitira na vašima leske Corylobium avellanae (Schrank) (Tremblay et al. 1986). Pretpostavlja se da je krug domaćina nešto širi i da obuhvata verovatno i vrste rodova Acyrthosiphon i Macrosiphum. Praon longicorne Marshall, 1891: Antene od 21-23 segmenata. Lateralni lobusi mezonotuma gusto dlakavi. Velika krila, radijalni nerv (R) duţine pterostigme, prva abscisa medijalnog nerva (M1) je nejasna u većem delu, intermedijalni (povratni) nerv (Im) je sklerotizovan. Propodeum je gladak, sa dugim i gustim dlakama. Petiolus duţi u odnosu na širinu u predelu spirakuluma, izdignut i dlakav duţ strana. Dorzalna linija treće valvule blago konkavna. Obojenost: Glava je braon boje, lice svetlije do ţućkaste obojenosti. Scapus, pedicelus, F1 i ponekad 1/3 F2 su ţućkasti, ostatak antene je braon. Toraks je braon. Petiolus braon, svetliji na vrhu, ostatak abdomena ţućkasto braon boje. Domaćini: Vrste su sakupljene u Mediteranskim oblastima i to na rodovima sledećih vaši: Acyrthosiphon Mordvilko (Marshall 1891; Starý 1971), Amphorophora Buckton (Starý 1971), Macrosiphum Passerini (Starý 1971) i Aulacorthum Mordvilko (Starý et al. 1971; Starý et al. 1973). Praon yomenae Takada, 1968: Antene od 18-19 segmenata. Lateralni lobusi mezonotuma sa velikim regijama bez dlaka. Radijalni nerv (R) kraći od duţine pterostigme, prva abscisa medijalnog nerva (M1) i intermedijalni (povratni) nerv (Im) su obezbojeni. Propodeum je gladak, sa oskudnim dlakama. Petiolus duţi u odnosu na širinu u predelu spirakuluma, izdignut i dlakav duţ strana. Spoljna linija treće valvule izrazito konkavna. Obojenost: Glava je braon boje, lice i obrazi ţućkasti. Scapus, pedicelus i F1 su ţućkasti, ostatak antene je braon. Toraks je braon boje na dorzalnoj strani, dok je ostatak ţućkast. Petiolus braonkaste do ţućkastobraon boje, ostatak abdomena ţućkasto braon boje. 11 Domaćini: Ova vrsta je sakupljena u Japanu i to na: Macrosiphoniella yomenae (Shinji) (Takada 1968), Uroleucon formosanus (Takahashi) (Yamauchi and Takada 1978). U Mediteranskoj oblasti P. yomenae je tipiĉan parazit Uroleucon spp., ali ponekad moţe da parazitira i na Acyrthosiphon pisum (Harris) (Starý 1976b). Slika 2. Zadnja krila i genitalije kod vrsta P. dorsale (Hal.) (a,b), P. longicorne Marsh. (c,d) i P. yomenae Tak. (e,f) (Tremblay and Pennacchio 1985) 12 1.5.3. Dosadašnje taksonomske studije Praon dorsale-yomenae kompleksa Parazitske ose koje pripadaju rodu Praon (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) ukljuĉuju predstavnike sa veoma opseţnim krugom domaćina (Marshall 1891; Mackauer 1959; Starý 1971; Carver 1984; Mescheloff and Rosen 1988; Kavallieratos et al. 2001). Tokom poslednjih 15 godina opisano je nekoliko vrsta roda Praon kao i tritrofiĉkih asocijacija u jugoistoĉnoj Evropi (Tomanović et al. 1998a; Tomanović et al. 1998b; Tomanović et al. 1999; Kavallieratos and Lykouressis 1999; Kavallieratos and Lykouressis 2000; Kavallieratos et al. 2001; Kavallieratos et al. 2003; Kavallieratos et al. 2004a; Kavallieratos et al. 2004b; Tomanović and Kavallieratos 2002; Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b). MeĊutim, upravo zbog velike intraspecijske varijabilnosti postoje mnogobrojni taksonomski problemi unutar roda (Mackauer 1959; Starý 1966a, 1971; Tremblay and Pennacchio 1985; Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b). Tomanović i saradnici (2006) su analizirajući filogenetske odnose unutar tribusa Praini prepoznali postojanje tri glavne klade: Praon dorsale-yomenae+Parapraon (Praon exsoletum, P. gallicum, P. necans i P. retusae), Praon rosaecola, kao i grupu od rodova Areopraon, Pseudopraon i Dyscritulus koji formiraju monofiletiĉku kladu odvojenu od roda Praon, pri ĉemu je pokazano da je Dyscritulus sestrinska grupa rodovima Areopraon i Pseudopraon (Slika 3). Praon dorsale-yomenae zajedno sa „Parapraon“ grupom obrazuje zajedniĉku filetiĉku kladu (Kavallieratos et al. 2005; Tomanović et al. 2006). Tomanović i saradnici (2006) su ocenili Praon dorsale-yomenae grupu kao parafiletiĉku (Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986) iz razloga što vrsta P. longicorne Marshall „upada“ u kladu „rosaecola“. U ranijim studijama Johnson (1987) je rod Parapraon prepoznao kao junior sinonim roda Praon Haliday upravo usled nedostatka pouzdanih karaktera za njihovo razmatranje kao dva odvojena taksona. Tomanović i saradnici (2006) su ukazali na bazalnu poziciju vrste Pseudopraon mindariphagum unutar tribusa Praini, što je pokazano i studijom baziranoj na analizi DNK sekvenci (Kambhampati et al. 2000). 13 Slika 3. Filogenetsko stablo 25 taksona tribusa Praini (Tomanović et al. 2006) Grupa „dorsale-yomenae“ koja parazitira na Macrosiphini vašima obuhvata vrste P. dorsale i P. longicorne (Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986), P. yomenae (Takada 1968), kao i P. uroleucon, P. nonveilleri i P. unitum (Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b; Mescheloff and Rosen 1988). Tomanović i saradnici (2003b) su dali prikaz vrsta roda Praon koje parazitiraju na vašima iz roda Uroleucon u Zapadnom Palearktiku (Slika 4). 14 Slika 4. Filogenetsko stablo “dorsale-yomenae“ grupe (Tomanović et al. 2003b) Kao što se i vidi na filogenetskom stablu, u jednoj kladi su Praon vrste koje parazitiraju na vašima Uroleucon i Macrosiphoniella spp. (P. uroleucon, P. nonveilleri+P. unitum, P. yomenae, P. absinthii). Pomenutih 5 vrsta dele sledeće sinapomorfne karakteristike: bezbojan, delimiĉno sklerotizovan ili delimiĉno izgubjen intermedijalni nerv (Im), 2 koniĉna vršna apikalna spina na ovoju legalice, lateralne lobuse mezonotuma sa velikim regijama bez dlaka. P. uroleucon i P. nonveilleri grade odvojenu kladu jer obe parazitiraju na Uroleucon vašima u submediteranskim oblastima Srbije i Crne Gore. P. yomenae i P. unitum su najsliĉnije vrsti P. uroleucon, ali su im distribucije razliĉite, pri ĉemu su P. uroleucon i P. unitum ograniĉeni na Mediteran, a P. yomenae na Palearktik (Takada 1968; Völkl and Starý 1988). Sve tri vrste parazitiraju na Uroleucon vrstama, ali P. uroleucon je poznata sa Uroleucon koji parazitira na Carduus acanthoides, P. unitum napada vrstu Macrosiphoniella (Macrosiphoniella) sanborni (Gillette) (Hemiptera: Aphidoidea) sa Chrysanthemum sp. i Uroleucon (Uroleucon) sonchi (Linnaeus) (Hemiptera: Aphidoidea) sa Sonchus sp., dok vrsta P. 15 yomenae u Palearktiku parazitira na rodovima Uroleucon, Macrosiphoniella i ponekad Acyrthosiphon (Hemiptera: Aphidoidea) (Tremblay et al. 1986; Kavallieratos et al. 2001; Tomanović and Kavallieratos 2002). P. longicorne i P. dorsale imaju bazalnu poziciju unutar grupe „dorsale-yomenae“, zbog prisustva pleziomorfnih karakteristika kao što su: potpuno sklerotizovan i obojen intermedijalni nerv (Im), lateralni lobusi mezonotuma gusto dlakavi. P. athenaeum je sestrinska vrsta ostalim vrstama grupe „dorsale-yomenae“ i izdvaja se po svojim pleziomorfnim karakteristikama (prva medijalna abscisa-M1 delimiĉno sklerotizovana i obojena, ovoj legalice je dorzalno prav, tergit I subkvadratnog oblika) (Tomanović et al. 2003b). 1.6. MORFOMETRIJSKE I MOLEKULARNE METODE U ANALIZAMA PODFAMILIJE APHIDIINAE 1.6.1. Primena geometrijske morfometrije Geometrijska morfometrija predstavlja savremenu i sve raširenijum metodu u detekciji i vizualizaciji morfoloških varijacija u veliĉini i obliku razliĉitih delova tela, a samim tim omogućava i rešavanje taksonomskih problema unutar grupa blisko srodnih vrsta širokog spektra organizama (Baylac et al. 2003; Becerra and Valdecasas 2004; Ţikić et al. 2009). Geometrijska morfometrija omogućava izdvajanje promena oblika uslovljenih promenama u veliĉini (alometrija), kao i promena „ĉistog“ oblika, tj. promena koje nisu uslovljene promenama u veliĉini (Bookstein 1989). Geometrijska morfometrija ima veliku ”statistiĉku osetljivost“, tako da se njenom primenom mogu otkriti male promene u obliku morfoloških celina koje se ne mogu utvrditi tradicionalnim morfometrijskim metodama (Klingenberg 2002). Ove metode se uspešno koriste i u studijama obrazaca seksualnog dimorfizma insekata na osnovu veliĉine tela, kao i na osnovu veliĉine i oblika krila (Baylac and Penin 1998; Debat et al. 2003; Teder and Tammaru 2005; Huey et al. 2006; Bibly et al. 2008; Kelly et al. 2008; Serano-Meneses et. al. 2008; Mitrovski Bogdanović et al. 2009). Mitrovski Bogdanović i saradnici (2009) su nedavno, primenom geometrijske morfometrije u analizi veliĉine i oblika krila izmeĊu polova, ukazali na znaĉajan efekat domaćina na intraspecijsku varijabilnost u stepenu i obrascu polnog dimorfizma. 16 Ono što geometrijsku morfometriju razdvaja od „tradicionalne” morfometrije je pre svega definicija oblika. U geometrijskoj morfometriji oblik je definisan kao sva ona geometrijska informacija koja ostane kada se isfiltriraju svi efekti poloţaja, veliĉine i rotacije (Kendall 1977), tj. geometrijska informacija nekog objekta je nepromenljiva u odnosu na skaliranje, translaciju, rotaciju (Klingenberg and Monteiro 2005). Geometrijska morfometrija omogućava ne samo analizu geometrijskog oblika već i vizuelizaciju promena oblika. Krila insekata predstavljaju pogodne morfološke strukture u primeni metoda geometrijske morfometrije (Klingenberg and Zaklan 2000; Klingenberg et al. 2001; Baylac et al. 2003; Pretorius 2005; Ţikić et al. 2009), upravo zbog niza sloţenih karakteristika kao što su postojanje homologih taĉaka na krilnoj nervaturi, dvodimenzionalnost i transparentnost (Wooton 2002; Wooton et al. 2003; Combes and Daniel 2003; Aytekin et al. 2007; Shingleton et al. 2008). 1.6.2. Dosadašnja molekularna istraţivanja i izbor markera U entomologiji, tehnike bazirane na DNK analizama uspešno su primenjivane u mnogim oblastima istraţivanja, posebno u studijama taksonomije i filogenetskih odnosa (Caterino et al. 2000) i populacione genetike (Behura 2006). U populaciono-genetiĉkim studijama insekata, podjednako se koriste jedarni i mitohondrijalni genski markeri. Na mitohondrijalnoj DNK, najĉešće se analiziraju geni koji kodiraju citohrom b, citohrom oksidazu subjedinice I i II (COI, COII) i 16S rRNK. Usled postojanja velikog broja filogenija baziranih na ograniĉenom setu morfoloških podataka, kao i zbog niza karakteristika (veliki broj podataka – sekvenci, koji se mogu ukljuĉiti u analize, kao i zbog toga što su stope mutacija nezavisne od prirodne selekcije) molekularni podaci poslednjih decenija dominiraju u filogenetskim analizama uopšte, i sve ĉešće se ukljuĉuju i u praćenje filogenetskih odnosa socijalnih i parazitskih osa (Cameron 1993; Dowton and Austin 1994, 1997a, 1997b; Gimeno et al. 1997; Quicke et al. 2000; Chen et al. 2002). Castro i Dowton (2006) su ukazali na mogućnost primene mitohondrijskog genoma u cilju ispitivanja filogenetskih odnosa unutar reda Hymenoptera, kao i utvrĊivanju njihovog poloţaja meĊu holometabolnim insektima. Molekularne tehnike su takoĊe omogućile detekciju i identifikaciju 17 parazitoida, razumevanje njihove ekologije na molekularnom nivou, kao i njihovu primenu u programima biološke kontrole (Symondson 2002; Greenstone 2006). Pri tom je predstavljen i znaĉaj primene molekularnih podataka u prouĉavanju interakcija unutar ĉitave vaš-parazitoid zajednice (Traugott et al. 2008). Predstavnici familije Braconidae, upravo zbog prisustva razliĉitih oblika parazitizma, predstavljaju bitan model-sistem za praćenje evolucije parazitskih oblika ţivota (Gauld 1988; Whitfield 1992), te je iz tih razloga proizašao i veliki broj molekularnih analiza njenih razliĉitih podfamilija. Gimeno i saradnici (1997) su razmatrali filogenetske odnose subfamilija Alysiinae i Opiinae korišćenjem citohroma b, 16S i 28S D2 rRNK regiona. Filogenetski odnosi mikrogastroidnog kompleksa brakonida razmatrani su korišćenjem nekoliko marker gena, kao što su 16S, 28S rDNK geni i mitohondrijski COI gen (Dowton and Austin 1998; Mardulyn and Whitfield 1999; Whitfield et al. 2002; Shi and Chen 2005a). Molekularna filogenija subfamilije Rogadiinae bila je praćena sekvencioniranjem 28S rRNK D2 regiona (Chen et al. 2003). Belshaw i saradnici (1998) su prikazali rekonstrukciju superfamilije Ichneumonoidea upotrebom D2 varijabilnog regiona 28S rRNK, dok su Zaldívar- Riverón i saradnici (2006) za ispitivanje poloţaja brakonoidnih ciklostomatnih subfamilija koristili kombinaciju morfoloških podataka sa mitohondrijalnim COI i nuklearnim 28S rDNK genom. Molekularna sistematika podfamilije Aphidiinae je do danas bila predmet malobrojnih studija. Pungerl (1986) je, prateći morfološke i elektroforetske varijacije meĊu vrstama roda Aphidius, pristupila prvim takvim analizama. Kasnije su usledila i istraţivanja bazirana na enzimima, u kojima su se pratili genetiĉki odnosi predstavnika Aphidiinae ukljuĉujući njihovu reproduktivnu izolaciju uslovljenu visokim stepenom specifiĉnosti prema odreĊenom domaćinu (Unruh et al. 1989; Höller 1991; Atanassova et al. 1998). Filogenetska istraţivanja bazirana na DNK su znatno brojnija i pruţila su daleko više informacija o filogeniji podfamilije Aphidiinae. Belshaw i Quicke (1997) su prouĉavali filogenetske odnose unutar subfamilije Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae) koristeći sekvencione podatke sa tri gena: elongacioni faktor-1α, citohrom b i drugi ekspanzioni segment 28S ribozomske subjedinice. Glavni rezultat njihove filogenetske studije podfamilije Aphidiinae je postojanje ĉetiri tibusa (Ephedrini + 18 (Praini + (Aphidiini+Trioxini))), pri ĉemu je Praini sestrinski tribus kladi Aphidiini i Trioxini, a Ephedrini ima bazalnu poziciju. U njihovom radu je pokazano da ciklostomatne podfamilije familije Braconidae obrazuju odvojenu kladu od podfamilije Aphidiinae, ali nije najjasnije objašnjen njen poloţaj u odnosu na neciklostomatne podfamilije. Dobijena filogenija takoĊe potvrĊuje sekundarni gubitak unutrašnjeg tipa pupacije kod tribusa Praini, kao i polifiletiĉko poreklo endoparazitizma kod Braconidae. Sekvencioniranjem 16S rDNK gena (Dowton et al. 1998) došlo se do nešto drugaĉijih rezultata. Pokazano je da tribus Praini, sa svojim pleziomorfnim karakteristikama, ima bazalnu poziciju unutar afidiina. Smith i saradnici (1999) su, koristeći NADH1 gen u svom radu, za rezultat ukazali na mogućnost postojanja hipoteze (Praini+(Ephedrini+Aphidiini)), kao i na bazalni poloţaj tribusa Praini (Praon +Dyscritulus). MeĊutim ni jedna od pomenutih studija nije u analize ukljuĉila rod Aclitus koji poseduje brojne pleziomorfne karakteristike (Mackauer 1961b), kao ni rodove Adialytus i Lysaphidus sa dosta nerazjašnjenom taksonomskom pozicijom. Zato su Kambhampati i saradnici (2000) koristeći mitohondrijski 16S gen zakljuĉili da je podfamilija Aphidiinae monofiletska grupa ĉiju bazalnu evolutinu liniju ĉini upravo rod Aclitus. Ovim radom je pokazano da je tribus Praini imao više bazalnu poziciju u odnosu na Ephedrini. Sanchis i saradnici (2000) su pokazali da je 18S rRNK adekvatan marker u razotkrivanju filogenetskih odnosa unutar podfamilije Aphidiinae, i to ne samo na nivou tribusa, nego i na nivou subtribusa i roda. Rezultat njihovog rada je postojanje tri tribusa: Ephedrini (koji zauzima bazalnu poziciju), Praini i Aphidiini. Unutar tribusa Aphidiini se nalaze 2 grupe za koje se smatra da pripadaju tribusu Trioxini (Monoctonina i Trioxina) koje zauzimaju bazalni poloţaj. Pojavio se problem koji je otvorio novo pitanje, a to je poloţaj samog tribusa Trioxini, pa se stvorila nedoumica oko toga da li predloţiti novu filogeniju sa pet tribusa (Ephedrini, Praini, Monoctonini, Trioxini i Aphidiini). Belshaw i Quicke (1997) izdvajaju Trioxini kao zaseban tribus, ali da bi se prihvatilo njegovo postojanje kao zasebnog tribusa neophodno je uraditi nove molekularne i nemolekularne studije. Dowton i saradnici (2002) su, prilikom filogenetske rekonstrukcije familije Braconidae, upotrebom 16S i 28S rDNK gena, ukazali na sestrinsku vezu podfamilije 19 Aphidiinae i ciklostomatne grupe. MeĊutim, na osnovu drugih studija baziranih na korišćenju tri razliĉita gena (mitohondrijski 16S rDNK, nuklearni 28S rDNK D2 i 18S rDNK) dobijeni su sasvim suprotni rezultati koji ukazuju na pripadnost podfamilije Aphidiinae neciklostomatnoj kladi (Shi et al. 2005). Shi i Chen (2005b) su, koristeći tri molekularna markera (mitohondrijalnu Atp- azu 6, 18S rDNK i 16S rDNK gene), potvrdili postojanje hipoteze ((Ephedrini+Praini)+Aphidiini)) (Sanchis et al. 2000; Smith et al. 1999). Klada Praini je sestrinska Aphidiini, dok Ephedrini zauzima bazalnu poziciju, što se podudara sa rezultatima Belshaw i Quicke (1997) i Sanchis i saradnici (2000) na osnovu molekularnih analiza, kao i sa rezultatima koje su dobili Mackauer (1961b) i Gärdenfors (1986) na osnovu morfologije adulta, ali ne i sa onim što su predloţili Dowton i saradnici (1998), Smith i saradnici (1999) i Kambhampati i saradnici (2000). U cilju utvrĊivanja molekularne varijabilnosti Praon dorsale-yomenae grupe neophodno je koristiti barem dva regiona DNK koji imaju razliĉitu stopu mutacije tj. koji se karakterišu razliĉitom konzervativnošću. Gen koji kodira COI je mitohondrijalni gen i kao većina mitohondrijalnih gena je konzervativan. U dosadašnjim analizama COI gen se pokazao kao veoma informativan u filogenetskim analizama meĊu blisko srodnim vrstama parazitskih Hymenoptera (Dowton and Austin 1997b, 2001; Mardulyn and Whitfield 1999; Whitfield et al. 2002; Zaldívar-Riverón et al. 2006). Derocles i saradnici (2012a) su nedavno ukazali na kljuĉnu ulogu DNK barkodinga u molekularnoj karakterizaciji podfamilije Aphidiinae. DNK barkoding je molekularna metoda (Hebert 2003; Hebert and Gregory 2005) koja nam olakšava identifikaciju vrsta u mnogim filumima korišćenjem kratkih sekvenci gena koji kodira citohrom oksidazu subjedinica I mitohondrijalne DNK (COI mtDNK). Iako su kod srodnih vrsta insekata, DNK sekvence sliĉne, postoje jasne razlike koje definišu njihove barkodove i omogućavaju uspešnu determinaciju. DNK barkoding vrsta omogućio je uspešno rešavanje mnogobrojnih taksomskih problema, poput otkrivanja “skrivenih“ taksona unutar podfamilije Aphidiinae (Desneux et al. 2009; Darsouei et al. 2011; Kos et al. 2011) i familije Braconidae (Zaldívar-Riverón et al. 2010). Prednosti DNK barkodinga su uspešna identifikacija vrsta u svim razvojnim stadijumima, uniformnost podataka, minimalan rizik pogrešne determinacije i dr. Nedavno su Derocles i saradnici (2012b) 20 ukazali na mogućnost detekcije larvenih stadijuma parazitoida unutar vaši domaćina i njihove identifikacije do nivoa vrsta na osnovu sekvenci dobijenih korišćenjem specijalno dizajniranih prajmera za podfamiliju Aphidiinae. TakoĊe, DNK barkoding se moţe uspešno koristiti i na višim taksonomskim nivoima (superfamilija, familija) u proceni korektne klasifikacije (Quicke et al. 2012), što nam opet ukazuje na mogućnost uspešnog odreĊivanja taksonomske pripadnosti i kruga domaćina na osnovu larvenih stadijuma parazitoida. 28S gen je jedarni gen koji se do sada kod Hymenoptera pokazao kao informativan za filogenetske analize na višim taksonomskim nivoima (tribusi, familije i podfamilije) (Belshaw and Quicke 1997; Belshaw et al. 1998; Dowton and Austin 1998; Mardulyn and Whitfield 1999; Dowton and Austin 2001; Dowton et al. 2002; Whitfield et al. 2002; Chen et al. 2003; Shi et al. 2005; Zaldivar-Riverón et al. 2006). 1.7. INTERAKCIJSKI ODNOSI UNUTAR VAŠ-PARAZITOID ASOCIJACIJA Parazitoidni rodovi afidiina se mogu podeliti na pet grupa u zavisnosti od njihovog kruga domaćina i to na one koji parazitiraju: a) na jednoj vrsti domaćina, b) na dve ili više vrsta jednog roda, c) na vrstama dva ili više rodova jedne podfamilije, d) na dva ili više rodova ili dve ili više podfamilije jedne familije i e) na one koji parazitiraju na nekoliko rodova dve ili više familije (Starý 1981a). Vaš-parazitoid asocijacije predstavljaju odliĉan biološki model za ekološka i evoluciona istraţivanja (Le Ralec et al. 2010). Studije ĉiji je cilj prouĉavanje vaš- parazitoid interakcija su skoncentrisane na pitanje na osnovu ĉega neki insekti prihvataju ili odbijaju odreĊenu vaš za domaćina (Mackauer et al. 1996). Michaud i Mackauer (1994) smatraju da se odgovor na postavljeno pitanje krije upravo u ispunjavanju tri uslova: prepoznavanje vaši kao domaćina (zadovoljavanje profila koji traţi ţenka parazitoida), procena kvaliteta domaćina (posedovanje adekvatnih resursa u cilju zadovoljavanja minimalnih fizioloških potreba parazitoida) i procena vrednosti domaćina kako bi on bio prihvaćen ili odbijen za ovipoziciju. Insekti parazitoidi imaju razvijenu strukturnu, fiziološku, molekularnu i simbiotsku adaptaciju, kao i poseban oblik ponašanja u cilju uspešnog odabira i savlaĊivanja odbrambenog sistema domaćina (Vinson and Iwantsch 1980a, 1980b). 21 Obiĉno se odabir domaćina moţe podeliti na nekih pet koraka: lokacija staništa domaćina (lokacija biljke), lokacija domaćina, prihvatanje domaćina, pogodnost domaćina za razviće parazitoida i sposobnost parazitoida da reguliše fiziološke procese samog domaćina (Doutt 1959; Vinson 1975, 1976, 1981, 1984, 1990). Sposobnost parazitoida da pronaĊe domaćina, da odoleva njegovim odbrambenim mehanizmima i da reguliše njegov metabolizam utiĉe na njegov rang domaćina (Le Ralec et al. 2010). Rehman (1999) je ustanovio da postoje razliĉiti obrasci ponašanja prilikom selekcije vaši domaćina za ovipoziciju od strane parazitoida Praon volucre: nasumiĉno traţenje domaćina, detekcija i pribliţavanje domaćinu, ispitivanje domaćina antenama, pripremanje za ovipoziciju i savijanje abdomena, ovipozicija i ĉišćenje legalice i antena (Slika 5). Slika 5. Dijagramski prikaz obrasca ponašanja vrste Praon volucre prema vaši Sitobion avenae (Rehman 1999) Lokacija staništa domaćina je inicijalni korak u lokaciji hrane ili domaćina pogodnog za ovipoziciju (Hagvar and Hofsvang 1991). Ona podrazumeva lokaciju makrohabitata (šuma, livada) i mikrohabitata (potencionalni izvor hrane za domaćina, npr. odreĊena vrsta biljke) (Vinson 1984). Za sada nema dovoljno informacija o lokaciji makrohabitata od strane parazitoida, ali se pretpostavlja da presudnu ulogu u tome imaju sredinski faktori (temperatura, vlaţnost, vetar, intenzitet svetlosti) (van Alphen and Vet 1986). U lokaciji mikrohabitata domaćina bitnu ulogu imaju semiohemikalije 22 koje emituju domaćini, biljke ili organizmi koji su udruţeni sa njima (Vinson 1976 1984; Le Ralec et al. 2010). Parazitoidi mogu locirati vaši na osnovu njihovog emitovanja hemijskih supstanci kairomona i biljke putem sinomona (Rehman and Powel 2010). Domaćin sa svojim fiziĉkim i hemijskim atributima, kao i posebnim oblikom ponašanja predstavlja bitan resurs za parazitoida. Vizuelne karakteristike poput oblika, veliĉine i boje tela se mogu proceniti sa odreĊene distance i bez fiziĉkog kontakta, pa je ova informacija jako bitna u lokaciji biljke domaćina i lokaciji samog domaćina. Vrste koje razlikuju boje mogu da ignorišu boju koja ne odgovara njihovom traţenom profilu domaćina, iako je on upravo fiziološki i nutrititivno pogodan za raviće parazitoida (Michaud and Mackauer 1994). Michaud i Mackauer (1995) su istakli da vizuelne crte domaćina mogu da utiĉu na lokaciju parazitoida, ali i da nisu jedini signal neophodan za odabir domaćina. Boja vaši je bitna kako bi se razlikovali potencionalni domaćini od onih koji to nisu. Do sada se u prethodnim radovima nije previše paţnje posvećivalo uticaju oblika domaćina. Minimalna veliĉina domaćina ne mora biti ograniĉavajuća kada je u pitanju njegov odabir za ovipoziciju. Iako krupniji domaćini sadrţe više resursa i kao takvi su pogodniji za razviće parazitoida, vrste Aphidius smithi i Monoctonus paulensis jaja polaţu u manje, ali pri tom funkcionalne larvene stadijume vaši Acyrthosiphon pisum (Harris) iz razloga što ih je lakše savladati (Mackauer and Kambhampati 1988; Chau and Mackauer 2000). Ţenke parazitoida su generalno veće od muţjaka i to moţe biti razlog polno specifiĉne eksploatacije domaćina (Mackauer 1996). Lykouressis i saradnici (2009) su ukazali na to da je veliĉina tela ţenki parazitoida bitna u selekciji domaćina, taĉnije da krupnije ţenke ĉešće polaţu jaja u krupnije vaši domaćine, što se opet moţe iskoristiti kao potencijal parazitoida da eksploatišu populacije vaši koje se razlikuju u veliĉini. Postoje i podaci da majke obezbeĊuju ćerkama krupnije, a sinovima sitnije domaćine za njihovo razviće (Charnov et al. 1981; Godfray 1994). Pokret vaši se tumaĉi kao stimulans za napad i ovipoziciju kod nekih vrsta afidiina (Michaud and Mackauer 1994). Miris i hemijski sastav domaćina predstavljaju njegove hemijske atribute i parazitoidima pruţa informaciju o gustini populacije domaćina ili ĉak o vrsti domaćina (Hagvar and Hofsvang 1991). Miris koji potiĉe od biljke domaćina moţe imati bitnu ulogu u lokaciji domaćina (Powel and Wright 1991). Senzori na antenama mogu biti 23 jako korisni u percepciji mirisa i u proceni kontaktnih hemijskih materija u kutikuli (Muratori et al. 2006; Rehman and Powel 2010). Vizuelni i hemijski signali vaši domaćina utiĉu na ovipoziciju njihovih parazitoida (Battaglia et al. 2000). Prisistvom brojnih hemosenzila na legalici kod ţenki Aphidiinae omogućava se procena hemijskog kvaliteta domaćina tokom probne ovipozicije (Mackauer et al. 1996; Weinbrenner and Völkl 2002), a na osnovu dobijenih informacija domaćin se prihvata ili odbija za ovipoziciju. Kod pojedinih vrsta koje ne koriste vizuelne crte domaćina ova informacija sluţi i u identifikaciji domaćina (Michaud and Mackauer 1994) i u proceni kvaliteta (Chow and Mackauer 1986). Kvalitet domaćina se obiĉno definiše kao ukupna koliĉina postojećih i budućih resursa dostupnih larvama parazitoida, dok budući resursi uglavnom zavise od starosti domaćina i stadijuma parazitizma (Mackauer et al. 1996). Na razviće larve koinobionata utiĉe veliĉina domaćina na poĉetku parazitiranja i kapacitet rasta samog domaćina tokom parazitizma (Mackauer 1986). Hildebrands i saradnici (2000) su pokazali da je odabir domaćina i njihova pogodnost za razviće parazitoida povezana sa razlikama u fiziologiji ovih domaćina, a ne sa vizuelnim karakteristikama ili spoljašnjim hemijskim materijama. Regulacija domaćina podrazumeva sposobnost parazitoida da preţivi unutar domaćina tako što utiĉe na njegov rast, ishranu, razvoj, razmnoţavanje, morfologiju, ponašanje, respiraciju, biološke i hemijske procese unutar domaćina prilagodjavajući ga tako sopstvenim potrebama (Vinson and Iwantsch 1980b). Parazitoidi pokazuju neverovatnu fenotipsku plastiĉnost u pogledu asocijativnog uĉenja i interakcije izmeĊu uroĊenih i steĉenih karakteristika, kao i na osnovu prethodnog steĉenog iskustva (Poppy et al. 1997). Iskustvo ţenke parazitoida je jako bitno u inicijalnoj fazi selecije domaćina omogućavajući joj brţu detekciju vaš-biljka asocijacije (Vinson 1998). Prepoznavanje samog domaćina i ovipozicija su pod kontrolom genetiĉkih faktora (Rehman and Powell 2010). Upravo iz tih razloga, identifikacija gena koji determinišu prepoznavanje hemijskih atributa domaćina moţe unaprediti mogućnosti za buduću genetiĉku manipulaciju parazitoidima. Faktori koji utiĉu na izbor habitata mogu se podeliti na unutrašnje (starost parazitoida, steĉeno iskustvo, fiziološko stanje) i na spoljašnje (predatori, kompetitori, bolesti, sredinski faktori, hrana) (Vinson 1998). Völkl i Mackauer (2000) su predloţili da najveći uticaj na evoluciju odreĊenog tipa ovipozicije upravo imaju odbrambeni 24 sistem domaćina i izbegavanje napada trofobiotiĉkih mrava. Tokom evolucije razvile su se razliĉite adaptacije parazitoida za hvatanje vaši i ovipoziciju u cilju savlaĊivanja odbrambenih mehanizama domaćina (Klingauf 1966; Losey and Denno 1998). Kod vrste Monoctonus paludum uoĉeno je da jaja polaţu u ventralnu nervnu gangliju domaćina štiteći se na taj naĉin od hemocita koje prestavljaju deo imunog sistema domaćina (Griffiths 1961). Parazitoidi su tokom evolucije razvili razliĉite adaptacije u cilju odbrane od trofobiotiĉkih mrava (Völkl 1992,1994; Völkl and Novak 1997). Völkl i Mackauer (2000), na osnovu same duţine trajanja ovipozicije i pokretljivosti abdomena, izdvajaju šet tipova ovipozicije, pri ĉemu tribus Praini pripada grupi ĉije vrste prvo fiziĉki imobilišu domaćina prednjim nogama, a potom je i orijentišu za ovipoziciju. Rodríguez i Hawkins (2000) su, prouĉavajuĉi diverzitet, funkciju i stabilnost parazitoidne zajednice, utvrdili da ne postoji veza izmeĊu diverziteta parazitoida i njene sposobnosti da utiĉe na mortalitet domaćina, tj. diverzitet i funkcija su nezavisni. Nije pronaĊena ni veza izmeĊu raznovrsnosti parazitoidnih vrsta i stepena varijabilnosti zajednice, tj. njene stabilnosti. Ovipozicija ţenke parazitoida varira u zavisnosti od njene starosti, fiziološkog stanja i prethodno steĉenog iskustva, ali i od rizika od mortaliteta (Fletcher et al. 1994; Weisser et al. 1994). Ĉesti uzroci povećane smrtnosti mlaĊih stadijuma parazitoida mogu biti: ovipozicija u vaši koje nisu pogodne za njihovo razviće (Griffiths 1960), korišćenje hrane slabog kvaliteta (van Emden 1995; Stadler and Mackauer 1996), kompeticija larvi (McBrien and Mackauer 1991), hiperparazitizam (Höller et al. 1993) i predatorstvo (Völkl and Kraus 1996). Predatori mogu imati indirektan uticaj na vaš- parazitoid interakcije utiĉući na promenu samog ponašanja parazitoida (Taylor et al. 1998). Zapravo, parazitoidi su u mogućnosti da prepoznaju tragove koje predatori ostavljaju na vašima ili da registruju emitovanje alarmnih feromona vaši koje su napadnute od strane predatora. 1.8. NIVOI SPECIJACIJE UNUTAR PODFAMILIJE APHIDIINAE Afidni domaćini su od kljuĉnog znaĉaja za razumevanje evolucije njihovih parazitoida (Starý 1981a). Vaš-parazitoid interakcije objašnjavaju se kao kontinualne oscilacije, promenjive u skladu sa evolucijom, pri ĉemu je glavni trend parazitoida da 25 prate evoluciju mlaĊih, progresivnijih i brojnijih vaši domaćina. Mackauer (1965) smatra da postoji paralelna evolucija parazitoida i vaši. Odgovor parazitoida i njihovih domaćina na sredinske promene moţe i ne mora biti isti, te se smatra da je evoluciona progresija dovela do toga da rodovi i vrste parazitskih osa parazitiraju na vrstama koje nisu bili domaćini njihovim precima (Starý 1981a). Dokaz za to je i sama strategija ovipozicije (Starý 1970). Kao što je već i naglašeno u prethodnom poglavlju, postoje brojni faktori koji mogu uticati na razliĉite obrasce ponašanja parazitoida prilikom lokacije habitata, preko detekcije domaćina pa sve do selekcije odreĊene vaši domaćina za ovipoziciju što istovremeno utiĉe i na njihov rang domaćina (Godfray 1994, Antolin et al. 2006). Parazitoidi podfamilije Aphidiinae pokazuju razliĉit stepen specifiĉnosti prema domaćinima, od onih koji parazitiraju na samo jednom domaćinu do onih koji parazitiraju na više od stotinu vaši domaćina u razliĉitim tipovima habitata i razliĉitim geografskim oblastima (Starý 1981a). Populacije parazitoida koje pripadaju istoj vrsti mogu pokazivati odreĊene razlike u zavisnosti od uticaja klimatskih faktora i specifiĉnosti prema domaćinu. TakoĊe, populacije parazitoida koje parazitiraju istu vrstu domaćina zbog razliĉitih klimatskih uticaja mogu pokazati znaĉajne razlike u razvojnom ciklusu što se najviše odraţava u afinitetu prema odreĊenim razvojnim stadijumima domaćina (Starý 1988). Veliki genetiĉki diverzitet parazitoida iste vrste unutar jedne zoogeografske oblasti posledica je velikog diverziteta vaši domaćina (Godfray 1994). Gotovo svaki fitofagni insekt predstavlja domaćina najmanje jednoj vrsti parazitoida. Takav genetiĉki diverzitet omogućava pojavu parazitizma na domaćinima koji u normalnim uslovima nisu ciljna grupa parazitoida. Specijacija unutar razliĉitih kompleksa parazitoida prema odreĊenim domaćinima moţe biti i posledica visokog stepena specifiĉnosti njihovih fitofagnih domaćina prema odreĊenoj biljci domaćinu (Stireman et al. 2006). Specijacija usled specijalizacije prema odreĊenom domaćinu nastaje usled kompleksnog delovanja odreĊenih ekoloških i bioloških faktora prilikom odabira vaši domaćina (Porter and Hawkins 1998; Stadler 2002). Kod insekata parazitoida izdvojena su dva oblika specijacije: alopatrija i simpatrija (Quicke 1997). Pretpostavlja se da je simpatriĉka specijacija dominantnija kod parazitoida podfamilije Aphidiinae iz razloga što je evolutivni status pojedinih parazitoidnih filetiĉkih linija okarakterisan visokim 26 stepenom specifiĉnosti prema domaćinu (Tremblay and Pennacchio 1988), pri ĉemu se formiraju evolutivne jedinice koje ukljuĉuju grupe blisko srodnih vrsta. Adaptivna divergencija predstavlja dominantan model genetiĉke diferencijacije koja vodi ka specijaciji unutar grupe afidiina (Templeton 1981; Dress and Mallet 2002; Lajeunesse and Forbes 2002). Ona deluje tako što se populacija podeli na dve subpopulacije izmeĊu kojih je prekinut protok gena, pri ĉemu se raznim morfološkim i fiziološkim adaptacijama favorizuje reproduktivna izolacija na razliĉitim vašima domaćinima. Rezultat toga je nastanak kriptiĉkih vrsta koje je nemoguće razlikovati na osnovu morfoloških karakteristika. Pojam kriptiĉkih vrsta poznat je više stotina godina, ali tek u poslednje dve decenije, sa intenzivnim razvojem novih tehnologija, njihova detekcija dostiţe pravu ekspanziju (Blair et al. 2005). Ubrzan razvoj molekularnih metoda tokom „90-ih godina prošlog veka, omogućio je analizu razliĉitih genskih markera i karakterizaciju genetiĉkog polimorfizma, što je od izuzetnog znaĉaja za rekonstrukciju filogenetskih odnosa izmeĊu vrsta. Pored fundamentalnog znaĉaja kao što su karakterizacija specijacije, biodiverziteta i strukture zajednice, prouĉavanje kompleksa kriptiĉkih vrsta unutar podfamilije Aphidiinae je od presudnog znaĉaja za uspeh programa biološke kontrole gde potencijalni agent moţe predstavljati kompleks dve ili više kriptiĉkih vrsta (Desneux et al. 2009; Kos et al. 2011). 1.9. ULOGA I ZNAČAJ PREDSTAVNIKA PODFAMILIJE APHIDIINAE Vaši predstavljaju bitne insekatske štetoĉine u agroekosistemima (Minks and Harrewijn 1988). Štetan efekat moţe biti izazvan direktno njihovom ishranom usled ĉega dolazi do kovrdţanja listova ili indirektno, kao vektori virusa (Dawson et al. 1990). U proteklih nekoliko dekada velika je paţnja posvećena istraţivanju bioloških aspekata prirodnih neprijatelja vaši (predatora i parazita) u cilju njihovog korišćenja u programima biološke kontrole. Upravo zbog specifiĉnosti i efikasnosti posebno je interesovanje usmereno ka parazitoidima (Starý 1970, 1988; Hagvar and Hofsvang 1991; Tomanović i Brajković 2001; Kavallieratos et al. 2004a; Kos et al. 2008). U Panonskoj oblasti su se do sada prouĉavale neke ekonomski vaţne vrste vaši (Mitić- Muţina i Srdić 1977; Petrović 1992; Tomanović et al. 1996; Tomanović et al. 1998b), 27 ali više paţnje treba posvetiti i prouĉavanju sastava i diverziteta same faune parazitoida (Tomanović 1998; Tomanović i Brajković 2001). Mnoge vrste podfamilije Aphidiinae predstavljaju vaţne parazitoide vaši u razliĉitim agroekosistemima. Neke od njih su ĉak uveţene širom sveta radi borbe protiv štetnih vaši (Bosch et al. 1959; Carver 1984; Starý 1995; Dahlsten et al. 1999), komercijalno su uzgajane kao biološki kontrolni agensi (Hagvar and Hofsvang 1991; Heimpel and Lundgren 2000) i uspešno se koriste u programima biološke kontrole u svetu (Hughes 1989). MeĊutim, njihova efikasnost je uslovljena njihovim prisustvom na pravom mestu u pravo vreme i na pravom domaćinu. Poznata je ĉinjenica da su adulti parazitoidi osetljiviji na sintetiĉke insekticide više od njihovih domaćina (Hagvar and Hofsvang 1991; Hoffmann and Frodsham 1993), što moţe posluţiti kao korisna informacija prilikom odabira metoda za kontrolu brojnosti štetnih vaši. Upravo zbog rezistentnosti vaši na pesticide, sve više paţnje se posvećuje biološkoj kontroli i pronalasku najefikasnijeg prirodnog neprijatelja. Uspešnost suzbijanja biljnih vaši parazitskim osama zavisi pre svega od gustine populacije domaćina u kulturi, odnosa stepena parazitizma i hiperparazitizma (He et al. 2006). Fekunditet parazitoida mora da prati fekunditet domaćina. Taĉnije, ţenke parazitoida mogu menjati strategiju ovipozicije u zavisnosti od gustine populacije domaćina. Jako je bitno i parazitiranje domaćina u njegovom najranijem razvojnom stadijumu (I i II larveni stadijum, kada je najveća gustina populacije domaćina), tako da se parazitoid razvije pre nego što domaćin dostigne polnu zrelost i poĉne da produkujuje nove jedinke (Lykouressis et al. 2009). Taksonomske studije podfamilije Aphidiinae doprinose korektnoj identifikaciji vrsta koje predstavljaju prirodne kontrolne agense vašiju, što moţe biti od kljuĉnog znaĉaja za uspehe bioloških kontrolnih programa. Poznavanje tritrofiĉkih asocijacija (vaš-parazitoid-biljka) sa odreĊenih prostora, odnosno populacioni diverzitet parazitoida, moţe biti od kljuĉnog znaĉaja za biokontrolne strategije. Iz tih razloga prouĉavanje taksonomije, ekologije i ţivotnog ciklusa afidiina moţe doprineti sticanju znanja o parazitoidima primenljivih u programima biološke kontrole (Kavallieratos et al. 2001; Kavallieratos et al. 2004b). Parazitske ose koje parazitiraju na vašima vrsta Uroleucon u zapadnom Palearktiku bile su predmet mnogobrojnih taksonomskih studija (Mackauer and Starý 28 1967; Starý 1976b; Völkl and Starý 1988; Mescheloff and Rosen 1990; Barczak 1993; Tomanović et al. 1998a; Tomanović et al. 1998b; Kavallieratos et al. 2001). Iako se smatralo da vaši iz roda Uroleucon nemaju ekonomski znaĉaj, potvrĊeno je da one zajedno sa njihovim primarnim parazitoidima predstavljaju znaĉajne izvore hrane za predatore i hiperparazitoide u agroekosistemima (Völkl and Starý 1988). TakoĊe se smatra da prisustvo primarnih parazitoida Uroleucon vaši u agroekosistemima moţe smanjiti stopu hiperparazititma na primarne parazitoide ekonomski znaĉajnih afidnih vrsta (Horn 1984; Völkl and Starý 1988; Tomanović et al. 2003b; Takada and Nakamura 2010). 29 2. CILJEVI ISTRAŢIVANJA Na osnovu svega navedenog uoĉava se da taksonomija Praon dorsale-yomenae kompleksa, usled velike varijabilnosti korišćenih dijagnostiĉkih karaktera, nije još uvek razrešena. Iz tih razloga, glavni cilj ovog istraţivanja bi se odnosio na utvrĊivanje taksonomskog statusa grupe vrsta „dorsale-yomenae“, kao i na pronalaţenje obrazaca specijalizacije prema odreĊenim vrstama domaćina. TakoĊe, ciljevi ovog istraţivanja bi bili sledeći: 1. UtvrĊivanje genetiĉke i morfološke varijabilnosti unutar Praon dorsale-yomenae kompleksa upotrebom molekularnih markera i metoda tradicionalne i geometrijske morfometrije 2. UtvrĊivanje postojanja „skrivenih“ taksona (sa specifiĉnim obrascima biogeografske distribucuje i visokim stepenom specifiĉnosti prema odreĊenim domaćinima), kao i taĉnog broja vrsta unutar Praon dorsale-yomenae kompleksa 3. UtvrĊivanje podudarnosti izmeĊu stepena genetiĉkih divergencija i morfoloških diferencijacija 4. Analiziranje faktora koji mogu uticati na varijabilnost, kao i mehanizama koji mogu dovesti do specijacije unutar „dorsale-yomenae“ grupe 5. UtvrĊivanje postojanja pouzdanih taksonomskih karaktera koji su dovoljno „dobri“ za razdvajanje taksona. 30 3. MATERIJAL I METODE RADA 3.1. MORFOMETRIJSKE METODE 3.1.1. „Tradicionalna“ morfometrija „Tradicionalna“ morfometrija se zasniva na jednostavom merenju distanci, uglova i površina delova nekog organizma. Ona predstavlja spoj kvantitativne morfologije, koja daje ulazne podatke, i multivarijantnih statistiĉkih metoda kojima se obraĊuju ti podaci. Morfološkim analizama obuhvaćeno je 270 ţenki i 151 muţjak koji pripadaju vrstama: Praon dorsale, P. longicorne, P. yomenae, P. volucre i P. megourae (Prilog 1). U analizama je korišćen i takson koji se po morfološkim karakterima nije mogao grupisati ni sa jednom od analiziranih vrsta, pa smo ga iz tih razloga oznaĉili kao Praon sp.. Materijal je sakupljan u periodu 2008-2011. godine na razliĉitim lokalitetima u Srbiji. Sa biljaka domaćina sakupljane su ţive i mumificirane biljne vaši. Ţive biljne vaši su stavljane u 90% alkohol i 75% mleĉnu kiselinu u odnosu 2:1 radi kasnije identifikacije (Eastop and van Emden 1972). Ostatak kolonije biljnih vašiju gajen je u laboratoriji oko tri nedelje, što je dovoljno da se izlegu parazitoidi. Kolonije biljnih vašiju su stavljane u male plastiĉne kutije pokrivene gazom, pri ĉemu su se adekvatnom ventilacijom unutar plastiĉnih kutija ostvarili sliĉni uslovi kao i u samoj laboratoriji (temperatura 22.5 oC, ralativna vlaţnost 65%) (Kavallieratos et al. 2001; Kavallieratos et al. 2002; Kavallieratos et al. 2003; Kavallieratos et al. 2005). Pored direktno sakupljenog materijala takoĊe je analiziran i materijal koji je sakupljan od 1959-2011. godine širom Palearktika, a koji su ustupili kolege: Petr Starý (Republika Ĉeška), Nickolas Kavallieratos (Grĉka), Christoph Vorburger (Švajcarska), Ehsan Rakhshani i Seyed Massoud Madjdzadeh (Iran), Hajimu Takada (Japan), Vladimir Ţikić i AnĊeljko Petrović (Srbija i Crna Gora). Zbog preciznog merenja odreĊenih morfoloških karakteristika jedinki pravljeni su trajni mikroskopski preparati. Disekcija insekata uraĊena je po standardnim metodama (Starý 1970). Jedinke su disekovane u 10% KOH, a delovi tela su sprovedeni kroz seriju alkohola rastuće koncentracije od 70% do apsolutnog. Prvo su odstranjivana 31 krila koja su direktno uvoĊena u 70% alkohol, dok su ostali delovi tela kuvani u 10% KOH u vodenom kupatilu na oko 90 o C u trajanju od 8 minuta za suvi materijal i 5 minuta za materijal deponovan u alkoholu. Delovi tela koji su korišćeni za taksonomsku analizu su uz pomoć igala i fine pincete razdvojeni pod binokularnom lupom i sprovedeni kroz serije alkohola rastuće koncentracije (70%, 85% i 100%) gde su drţani tri, pet, odnosno deset minuta radi dehidratacije. Dehidrirani delovi tela su na kraju montirani na predmetna stakla u kanada balzamu. Gotovi preparati su sušeni mesec dana u termostatu na 30 o C. Merenje delova tela izvršeno je pomoću okular mikrometra na ZEISS mikroskopu. Vrednost podeoka na skali mikrometra iznosila je 0,01mm. Analizirani delovi tela prikazani su na Slici 6. Morfološkim analizama obuhvaćene su dve vrste karaktera (Tabela 1): meristiĉki - karakteri koji opisuju odreĊeno svojstvo determinisano celobrojnom numeriĉkom vrednošću (karakteristike ĉija je promena stanja diskontinualna) i kontinuirani - karakteri koji mogu imati bilo koju vrednost unutar odreĊenog intervala (karakteristike koje kontinualno menjaju svoja stanja). Pošto veliĉina tela ovih parazitoida zavisi prvenstveno od veliĉine tela domaćina (Cohen et al. 2005), analizirane su relativne duţine tj. odnos duţina karaktera. U radu su korišćeni sledeći odnosi karaktera: F1l/F1w, F2l/F2w, F1l/F2l, F1w/F2w, Ptl/Ptw, Ptl/Mtl, Petl/Petw1, Petl/Petw2. Krilna nervatura je prikazana po nomenklaturi koju je dao Starý (1983). Tabela 1. Spisak karaktera koji su analizirani „tradicionalnom” morfometrijom; ţenke i muţjaci Oznaka karaktera Opis karaktera Tip karaktera LP Broj segmenata labijalnih palpusa Meristiĉki MP Broj segmenata maksilarnih palpusa Meristiĉki F Broj antenalnih segmenata Meristiĉki MBF1 Broj mirisnih brazdi na prvom antenalnom segmentu Meristiĉki MBF2 Broj mirisnih brazdi na drugom antenalnom segmentu Meristiĉki F1l Duţina prvog antenalnog segmenta Kontinuirani F1w Širina prvog antenalnog segmenta Kontinuirani F2l Duţina drugog antenalnog segmenta Kontinuirani F2w Širina drugog antenalnog segmenta Kontinuirani Ptl Duţina pterostigme Kontinuirani Ptw Širina pterostigme Kontinuirani Mtll Duţina Mt nerva Kontinuirani Petl Duţina petiolusa Kontinuirani Petw1 Širina petiolusa u nivou spirakuluma Kontinuirani Petw2 Širina petiolusa u osnovi Kontinuirani 32 Slika 6. Praon dorsale - delovi tela: a) glava (MP-broj segmenata maksilarnih palpusa, LP-broj segmenata labijalnih palusa); b) antena (F1l-duţina prvog flagelarnog segmenta, F1w-širina prvog flagelarnog segmenta, F2l-duţina drugog flagelarnog segmenta, F2w-širina drugog flagelarnog segmenta); c) prednje krilo (Ptl-duţina pterostigme, Ptw-širina pterostigme, Mtl-duţina Mt nerva); d) mezoskutum; e) petiolus (Petl-duţina petiolusa, Petw1-širina petiolusa u nivou spirakuluma, Petw2-širina petiolusa u osnovi); f) propodeum; g) legalica (autor ilustracija dr Anđeljko Petrović) 33 Statistiĉke analize obuhvatale su deskriptivnu statistiku kao i analizu varijabilnosti karaktera pomoću diskriminantne kanonijske analize. Primenom Analize varijanse i post-hoc Tukey‟s testa testirana je znaĉajnost razlika u varijabilnosti analiziranih karaktera. Analize su izvršene pomoću programskog paketa STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc. 2001). 3.1.2. Geometrijska morfometrija Primenom geometrijske morfometrije analizirana su desna krila jedinki unutar Praon dorsale-yomenae kompleksa vrsta, na kojima je odabrano 13 dvodimenzionalnih, jasno definisanih taĉaka (Slika 7). Krila su fotografisana digitalnim fotoaparatom Canon Power Shot S40, na fazno-kontrasnom mikroskopu LEICA DM LS u Institutu za zoologiju, Biološkog fakulteta u Beogradu. Prilikom analize krila redukovane nervature, kao kod roda Praon, neophodno je pored landmarks u analizu ukljuĉiti i semilandmarks. Semilandmarks su zapravo taĉke izvedene na osnovu dve ili više landmarks izabrane na analiziranom objektu. Za razliku od landmarks, to su a priori postavljene taĉke. Njihova funkcija je da olakšaju opisivanje neke morfološke celine (Perez et al. 2006), u našem sluĉaju oblik krila, kada je nemoguće postaviti prave taĉke. Korišćenjem softverskog paketa MakeFun6 (Sheets 2000), odabrali smo dva markera na osnovu kojih se odreĊuje centroid kroz koji se povlaĉe linije (u našem sluĉaju 20) koje seku krila na taĉno odreĊenim mestima. Taĉke su potom zabeleţene na svakom pojedinaĉnom krilu koristeći softverski paket tpsDig (Rohlf 2005), vodeći strogo raĉuna o tome da se prva i druga taĉka poklapaju sa redosledom odabira markera. Landmarks nose oznake 1-7, dok semilandmarks opisuju distalni deo krila (8-13) (Slika 7). Preciznost postavljanja taĉaka na krilnu ploĉu proverena je u tpsRelw programskom paketu (Rohlf 2005). Generalizovana Prokrustova Analiza (engl. General Procrustes Analysis – GPA) omogućava da se skaliranjem, translacijom i rotacijom konfiguracija specifiĉnih taĉaka eliminišu razlike uslovljene veliĉinom, poloţajem i orijentacijom, što se postiţe Prokrustovom superimpozicijom (Goodal 1991; Bookstein 1996; Dryden and Mardia 1998; Zelditch et al. 2004). Prokrustova superimpozicija uraĊena je uz pomoć softverskog paketa Semiland (Sheets 2000), pri ĉemu je poravnavanje, translacija i 34 rotacija uraĊena zasebno za specifiĉne taĉke koje imaju jasno definisan poloţaj, i za taĉke koje su rasporeĊene na pravilnim razmacima duţ oboda krila semilandmarks. Slika 7. Obeleţene specifiĉne taĉke (1-7) i polutaĉke (8-13) na krilu Praon yomenae Informacije o veliĉini krila date su preko veliĉine centroida (CS). Veliĉina centroida se za svako krilo izraĉunava kao kvadratni koren sume kvadratnih rastojanja svake taĉke od teţišta date konfiguracije (Dryden and Mardia 1998). Teţište konfiguracije je taĉka ĉije X i Y koordinate predstavljaju srednje vrednosti X i Y koordinata svih taĉaka (Klingenberg et al. 2001). Prokrustove koordinate specifiĉnih taĉaka, dobijene nakon Prokrustove superimpozicije, nose informaciju o obliku odreĊene konfiguracije, tako da razlike u Prokrustovim koordinatama predstavljaju razlike u obliku izmeĊu analiziranih konfiguracija. Prilikom analiza oblika krila izmeĊu uzoraka neophodno je utvrditi da li uopšte postoje statistiĉki znaĉajne razlike u varijabilnosti u veliĉini i obliku krila. Razlike u veliĉini krila izmeĊu grupa analizirane su primenom analize varijanse (ANOVA) za CS. Post-hoc Tukey‟ test korišćen je za prikaz statistiĉki znaĉajnih razlika u veliĉini krila meĊu analiziranim grupama. Varijabilnost u obliku krila, analizirana je multivarijantnom analizom varijanse (MANOVA), sa svim varijablama oblika kao zavisno promenjivim. Standardne metode multivarijantne statistike koje se primenjuju u morfometrijskim analizama inkorporirane su u softverski paket MorphoJ (Klingenberg 2011). Da bi se utvrdilo da li se jedinke koje potiĉu sa razliĉitih domaćina (razliĉite vrste afidnih domaćima) razlikuju u obliku krila, analiza glavnih komponenti (PCA - 35 Principal Component Analysis) uraĊena je za svaku vrstu parazitoida koja parazitira veci broj domaćina, odnosno biotipova. Deformacione krilne ploĉe, duţ I i II ose, prikazane su u cilju ilustracija promena u obliku krila. Da bismo utvrdili koje promene u obliku krila jedinki najviše doprinose diskriminaciji izmeĊu vrsta, izvršena je kanonijska varijantna analiza (Canonical Variate Analysis-CVA), koja za razliku od PCA analize favorizuje meĊugrupnu varijabilnost. Procenat pravilnog grupisanja jedinki u a priori definisane grupe utvrĊen je diskriminantnom analizom (Discriminant Function Analysis) preko distanci dobijenih na osnovu CVA. Za geometrijsku morfometriju koristi se serija TPS i IMP programa koji su dostupni na internet adresi: http://life.bio.sunysb.edu/morph, kao i softverski paket MorphoJ (Klingenberg 2011). Intraspecijska varijabilnost u stepenu i obrascu polnog dimorfizma u veliĉini i obliku krila testirana je izraĉunavanjem vrednosti standardnih indeksa. Indeks polnog dimorfizma u veliĉini krila-ISSD (Sexual Size Dimorphism) izraĉunava se preko veliĉine centroida: CS pola duţih krila/CS pola manjih krila. Indeks polnog dimorfizma u obliku krila-ISShD (Sexual Shape dimorphism) predstavljen je Prokrustovim distancama izmeĊu polova. 3.2. MOLEKULARNE METODE Za molekularne analize vrsta iz roda Praon i ocenu divergencije na inter- i intraspecijskom nivou korišćena su dva molekularna markera, gen koji kodira citohrom oksidazu subjedinica I mitohodrijalne DNK (COI mtDNK) i gen koji kodira 28S region jedarne DNK. 3.2.1. Ekstrakcija DNK iz insekata Svi primerci koji su sakupljeni za molekularne analize ĉuvani su u 96% etanolu, na temperaturi od -20 0 C do ekstrakcije DNK. Ukupna DNK svakog primerka ekstrahovana je pomoću TES metoda (Mahuku 2004) ili Dneasy®Blood and Tissue Kit-a (QIAGEN) prema uputstvu proizvoĊaĉa. TES ekstrakcija je bio metod izbora u analizama, dok se drugi metod koristio samo u sluĉaju kada je prinos DNK nakon ekstrakcije metodom izbora bio nizak. Kako bi se primerci saĉuvali, pod binokularom je 36 izvršeno punktiranje abdomena, a zatim su punktirani uzorci inkubirani na 40°C (TES esktrakcija) ili 56°C (Dneasy ® Blood and Tissue Kit) tokom noći, u rastvoru saĉinjenom od 400µl TES pufera za liziranje ćelija i 4µl proteinaze K (TES esktrakcija), odnosno 180 µl ATL pufera i 20 µl proteinaze K (Dneasy ® Blood and Tissue Kit). Sledećeg dana postupak ekstrakcije je nastavljen prateći protokol odabranog metoda ekstrakcije. Ekstrahovana DNK rastvorena je u 50 μl TE pufera (TES esktrakcija), odnosno 80 μl AE pufera (Dneasy ® Blood and Tissue Kit), a zatim ĉuvana na -20oC. Primerci iz kojih je izvršena ekstrakcija DNK su posle uzastopnih ispiranja vodom i 96% etanolom, preparovani, obeleţeni šifrom ekstrakcije i smešteni u entomološke kutije. 3.2.2. Amplifikacija DNK, prečišćavanje i sekvencioniranje Molekularne analize su obuhvatile vrste P. dorsale, P. yomenae, P. longicorne, P. volucre, P. megourae, i Praon sp. Citohrom oksidaza subjedinica I mitohondrijalne DNK umnoţena je sa setom prajmera LCO1490 (5‟-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG- 3‟) i HCO2198 (5‟-TAAACTTCAGGCTGACCAAAAAATCA-3‟) (Folmer et al. 1994). Ovi prajmeri kod parazitoida amplifikuju produkt veliĉine oko 658bp, koji obuhvata deo COI gena mtDNK (Slika 8). COI mtDNK NAD2 LCO1490→ produkt 658bp ←HCO2198 tRNA-Leu COII Slika 8. Deo gena COI mtDNK koji amlifikuju prajmeri LCO1490 i HCO2198 PCR amplifikacija je uraĊena u zapremini od 20μl koja sadrţi 1μl ekstrahovane DNK, 11.8μl H20, 2μl pufera A sa 1xMg (High Yield Reaction Buffer A, Kapabiosystems), 1.8μl MgCl2 (2.25mM), 1.2μl dNTP (0.6mM), 1μl LCO1490 (0.5μM), 1μl HCO2198 (0.5μM) i 0.2μl KAPATaq DNK polimeraze (0.1 U/μl) (Kapabiosystems). Amplifikacija je vršena u Eppendorf Mastercycler®ep po sledećem protokolu: inicijalna denaturacija 95°C/5 min; 35 ciklusa: 1) denaturacija 95°C/1min, 2) elongacija 54°C/1 min, 3) ekstenzija 72°C/2 min; finalna ekstenzija 72°C/10 min. Da bi se proverila uspešnost sinteze COI gena, 5μl PCR produkta svakog uzorka je pušteno na 1% agaroznom gelu obojenom etidijum bromidom i vizualiziranom pod UV transiluminatorom. 37 Za umnoţavanje gena koji kodira 28S region jedarne DNK, korišćen je set prajmera koji umnoţavaju drugi ekspanzioni segment 28S rRNA tj. 28S D2, a to su forward 28SD2f prajmer (5‟-AGAGAGAGTTCAAGAGTACGTG-3‟) (Belshaw and Quicke 1997) i reverse 28SD2r (5‟-TTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3‟) (Campbel et al. 1993). Umnoţavanje 28S D2 produkata PCR metodom uraĊena je u zapremini od 20μl koja sadrţi 1μl ekstrahovane DNK, 14.35μl H20, 2μl pufera A sa 1.5mM MgCl2 (Kapabiosystems), 0.5μl dNTP (0.25mM), 1μl 28SD2f (0.5μM), 1μl 28SD2r (0.5μM) i 0.15μl KAPATaq DNK polimeraze (0.0375 U/μl) (Kapabiosystems). Protokol za umnoţavanje 28S regiona jedarne DNK kod parazitoida se sastoji od: inicijalne denaturacije 95°C/3 min; 30 ciklusa: 1) denaturacija 95°C/30s, 2) elongacija 48°C/30s, 3) ekstenzija 72°C/60s i na kraju finalna ekstenzija 72°C/10 min. Da bi se proverila uspešnost sinteze COI gena, 5μl PCR produkta svakog uzorka je pušteno na 1% agaroznom gelu obojenom etidijum bromidom i vizualiziranom pod UV transiluminatorom. Nakon uspešne amplifikacije delova COI i 28S gena uzorci namenjeni za sekvenciranje su preĉišćeni pomoću QIAquick® PCR Purification Kit-a (QIAGEN) prateći upustvo proizvoĊaĉa. Provera ĉistoće preĉišćenih uzoraka izvršena je na 1% agaroznon gelu. Kvantifikacija, odnosno molekularna teţina i koliĉina DNK koja će se poslati na sekvenciranje, odreĊena je vizuelnim poreĊenjem produkata sa markerom DNA 100 Bp DNA Ladder (SERVA). Sekvenciranje je uraĊeno na automatskom kapilarnom sekvencionatoru ABI Prism 3700 (Applied Biosystems) u BMR Genomics (Padova, Italija). Produkt COI gena svakog uzorka je sekvencioniran u jednom smeru, upotrebom LCO1490 forward prajmera, a produkti 28S sa forward prajmerom 28SD2f. 3.2.3. Obrada podataka i filogenetske analize Za prevoĊenje sekvenci iz abi formata koji je proizveo sekvencionator i njihovo kompletiranje korišćen je program FinchTVTM (dostupan na http://www.geospiza.com). U cilju sagledavanja kvalitativne i kvantitativne razlike unutar COI mtDNK izmeĊu vrsta iz roda Praon, prvo je izvršeno poravnanje sekvenci u CLUSTAL W programu integrisanom u MEGA 4.0 softveru (Tamura et al. 2007). Sekvence su zatim 38 podvrgnute Best fit model testu prema Akaike Information kriterijumu koji je ocenio koji su modeli najbolji za poreĊenje nukleotidnih razlika. Za rekonstrukciju filogenetskih stabala korišćen je Neighbor-Joining metod (Saitou i Nei 1987) u modelu Tamura-Nei (Tamura i Nei 1993) i Metod maksimalne parsimonije (Nei i Kumar 2000) u MEGA4 programu. Za filogenetkse analize COI mtDNK kao outgroup su korišćene sekvence COI gena vrste Areopraon silvestre koja pripada istom tribusu Praini, ĉiji primerak je sakupljen sa Periphyllus sp. na Acer pseudoplatanii i Lysiphlebus fabarum iz iste podfamilije, sakupljen sa domaćina Aphis fabae poreklom sa Chenopodium album. Za filogenetske analize 28S D2 regiona jedarne DNK, kao outgroup je korišćena sekvenca Aphidius colemani iz iste podfamilije Aphidiinae, koja je preuzeta iz NCBI GenBank (National Center of Biotechnology Information, http://www.ncbi.nim.nih.gov) pod pristupnim brojem HQ599561. Za utvrĊivanje porekla genetiĉke struktuiranosti populacija, i ocene divergencije na inter- i intraspecijskom nivou uraĊena je Analiza molekularne varijanse (AMOVA) u programu ARLEQUIN 3.0 (Excoffier et al. 2005). 39 4. REZULTATI 4.1. MORFOLOŠKE ANALIZE Statistiĉke analize celokupnog ispitivanog uzorka uraĊene su odvojeno za muţjake i ţenke usled postojanja polnog dimorfizma u analiziranim morfološkim karakteristikama. 4.1.1.Varijabilnost morfoloških karaktera kod ţenki Deskriptivnom statistikom obuhvaćeno je 270 jedinki svrstanih unutar 6 vrsta (Praon yomenae, Praon sp., P. megourae, P. longicorne, P. volucre i P. dorsale). Da bismo utvrdili varijabilnost karaktera unutar grupa uraĊena je deskriptivna statistika za sve vrste odvojeno (Prilog 2). Izraĉunate su srednja vrednost, standardna devijacija, minimalne i maksimalne vrednosti analiziranih osobina. Analizirano je 6 meristiĉkih i 8 kontinuiranih karaktera. Meristiĉki karakeri i karakteri sa kontinuiranom varijabilnošću analizirani su zasebno. Da bi se eliminisao efekat veliĉine i omogućilo direktno poreĊenje dobijenih rezultata sa drugim studijama, kontinuirani karakteri analizirani su kao odnosi vrednosti dva karaktera. Karakter F (broj antenalnih segmenata) nije ušao u statistiĉke analize iz razloga što nije bilo moguće njegovo taĉno odreĊivanje u ĉitavom uzorku. Na osnovu dobijenih vrednosti moţe se prikazati variranje ovog karaktera po vrstama: P. yomenae (F=17-20), Praon sp. (F=16-17), P. megourae (F=19-21), P. longicorne (F=20-21), P. volucre (F=17-18) i P. dorsale (F=18-20). Naredni analizirani karakteri MP (broj segmenata maksilarnih palpusa) i LP (broj segmenata labijalnih palpusa) ukazuju na jasno izdvajanje vrste Praon sp. koja ima po 3 segmenta u maksilarnim i 2 segmenta u labijalnim palpusima. Sve ostale vrste imaju po 4 segmenta u maksilarnim i 3 segmenta u labijalnim palpusima. Broj mirisnih brazdi (rinarija) na prvom flagelarnom segmentu (MBF1) kod svih vrsta ima vrednost 0. Najveća varijabilnost u broju mirisnih brazdi na drugom flagelarnom segmentu (MBF2) uoĉava se unutar vrste P. yomenae (1-4), dok je najmanja varijabilnost ovog karaktera zabeleţena kod vrste P. megourae (1-2). Kod svih ostalih vrsta MBF2 ima vrednost 1-3 (Prilog 2). 40 Duţina tela (L) je jedan od karaktera koji najviše varira unutar vrsta. Najmanju srednju vrednost duţine tela ima vrsta Praon sp. (47.17) dok najveću ima vrsta P. longicorne (59.74). Najveće variranje ovog karaktera zabeleţeno je kod vrste P. yomenae (min=41, max=85), dok je najmanje variranje uoĉeno unutar vrste P. megourae i kreće se u opsegu od 50-64 (Prilog 2). Postojanje razlika u duţini tela ţenki izmeĊu 6 razliĉitih vrsta testirano je analizom varijanse i pokazane su statistiĉke znaĉajne razlike (ANOVA: F=14.35, df=5, P<0.000000). Rezultati post-hoc Tukey‟s testa za duţinu tela ukazuju na to da statistiĉki znaĉajna razlika u veliĉini tela postoji meĊu ţenkama sledećih vrsta: P. yomenae-Praon sp., P. yomenae-P. volucre, Praon sp.-P. megourae, Praon sp.-P. longicorne, Praon sp.-P. dorsale, P. megourae-P. volucre, P. longicorne-P. volucre i P. volucre-P. dorsale. Odnos duţine i širine prvog flagelarnog segmenta (F1l/F1w) pokazuje najveću srednju vrednost unutar vrste P. megourae (6.46), dok je najmanja vrednost zabeleţena kod vrste P. yomenae (5.36). Najveća varijabilnost ovog karaktera prisutna je upravo unutar pomenutih taksona. Sliĉne vrednosti dobijene su i prilikom analize karaktera F2l/F2w, F1l/F2l i F1w/F2w (Prilog 2). Oblik pterostigme je odreĊen odnosom njene duţine i širine – (Ptl/Ptw). Pored veoma ujednaĉenih srednjih vrednosti za većinu vrsta (3.9), uoĉava se da je najveća srednja vrednost ovog karaktera zabeleţena unutar vrste P. volucre (4.03), a najmanja za vrstu P. dorsale (3.82). Najveća varijabilnost prisutna je kod vrsta P. yomenae i P. volucre (Prilog 2). Najveće razlike srednjih vrednosti zabeleţene za karakter Ptl/Mtl (odnos duţine pterostigme i duţine metakarpalnog nerva) kreću se od 1.31 do 1.72 za vrstu P. megourae odnosno Praon sp., dok je najveća varijabilost zabeleţena unutar vrste P. yomenae (Prilog 2). Poslednji analizirani karakteri su Petl/Petw1 i Petl/Petw2 (odnosi duţine i širina petiolusa) i on pokazuje najveću varijabilnost za vrstu P. volucre, odnosno za vrstu P. yomenae. Najveće srednje vrednosti Petl/Petw1 i Petl/Petw2 zabeleţene su kod vrste P. dorsale (1.42 odnosno 1.61). Razlike jedino postoje kod najniţih srednjih vrednosti ovih karaktera (Petl/Petw1=1.28 za vrstu P. megourae i Petl/Petw2=1.38 za vrstu Praon sp.). Bivarijatnim i multivarijatnim analizama varijanse testirano je da li variranje pojedinih karaktera zavisi od vrste parazitoida. 41 Analiza varijanse (ANOVA) pokazuje statistiĉki znaĉajne razlike izmeĊu vrsta za sve karaktere osim za Ptl/Ptw (Tabela 2). Tabela 2. Analiza varijanse morfoloških karaktera ţenki svih vrsta. Statistiĉki znaĉajne razlike su boldirane (p<0,05). karakter df model F p F1l/F1w 5 21,56 0,000000 F2l/F2w 5 19,65 0,000000 F1l/F2l 5 14,85 0,000000 F1w/F2w 5 4,65 0,000437 Ptl/Ptw 5 0,55 0,738026 Ptl/Mtl 5 22,053 0,000000 Petl/Petw1 5 4,68 0,000414 Petl/Petw2 5 8,51 0,000000 Da bi se utvrdilo koji karakteri najviše utiĉu na diskriminaciju unapred definisanih taksona, primenjena je diskriminantna kanonijska analiza koja se bazira na utvrĊivanju osa po kojima se grupe najviše razdvajaju tj. maksimalizuje se meĊugrupno u odnosu na unutargrupno variranje karaktera. Ovom analizom obuhvaćene su iste jedinke svrstane u iste vrste kao i za deskriptivnu statistiku. Kao varijable za diskriminantu analizu ţenki korišćeno je 8 odnosa vrednosti kontinuiranih karaktera: F1l/F1w, F2l/F2w, F1l/F2l, F1w/F2w, Ptl/Ptw, Ptl/Mtl, Petl/Petw1 i Petl/Petw2, dok je faktor grupisanja kao i u ranijim analizama bila pripadnost vrsti parazitoida. Kanonijska diskriminantna analiza uraĊena je na osnovu svih analiziranih karaktera. Prva kanonijska osa (CV1) nosi oko 75 % svih razlika meĊu vrstama, a druga (CV2) 17% (Tabela 3). Ovi rezultati pokazuju da postoji razdvajanje analiziranih vrsta. Najveće opterećenje na prvoj kanonijskoj osi nose osobine: odnos duţine i širine prvog flagelarnog segmenta (F1l/F1w) i odnos širina prvog i drugog flagelarnog segmenta (F1w/F2w). Diskriminaciji po drugoj kanonijskoj osi doprinose 3 karaktera pri ĉemu najveće opterećenje po drugoj osi ima odnos duţine i širine petiolusa (Petl/Petw2), zatim odnos duţine i širine prvog flagelarnog segmenta (F1l/F1w), kao i odnos duţine i širine drugog flagelarnog segmenta (F2l/F2w) (Tabela 3). 42 Tabela 3. CVA analiza- standardizovani koeficijenti kanonijskih varijabli kod ţenki Karakter CV1 CV2 F1l/F1w 2,20497 -1,31605 F2l/F2w -1,23509 1,18954 F1l/F2l -0,74929 0,59369 F1w/F2w 1,69246 -0,99963 Ptl/Ptw 0,11606 -0,09451 Ptl/Mtl -0,50046 -0,74347 Petl/Petw1 0,28107 -0,81636 Petl/Petw2 -0,49803 1,06831 Eigenval 1,32569 0,32444 Cum.Prop 0,74589 0,92843 Razdvajanje vrsta po prvoj i drugoj kanonijskoj osi prokazano je na Slici 9 i Slici 10, pri ĉemu je na Slici 9 predstavljena projekcija svih jedinki u odnosu na prve dve ose pri ĉemu su elipsama obuhvaćene jedinke jedne vrste (95% jedinki), dok su na Slici 10 predstavljeni njihovi centroidi. Po prvoj kanonijskoj osi uoĉljivo je delimiĉno razdvajanje vrsta P. yomenae i P. megourae. Po drugoj kanonijskoj osi uoĉava se delimiĉno razdvajanje jedinki vrste Praon sp.. Razdvajanje je uoĉljivije ukoliko se posmatraju samo centroidi vrsta (Slika 10). Vrsta P. yomenae i P. volucre se grupišu u negativnom delu CV1 ose, a P. megourae u njenom pozitivnom delu. Centroidi vrsta P. dorsale i P. longicorne nalaze se veoma blizu jedan drugom ukazujući na njihovo meĊusobno preklapanje. Po CV2 osi uoĉljivo je jasno izdvajanje centroida vrste Praon sp. u negativnom delu ose za razliku od ostalih vrsta. 43 CV1 vs. CV2 CV1 C V 2 P. yomenae Praon sp. P. megourae P. longicorne P. volucre P. dorsale -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 Slika 9. Distribucija ţenki duţ prve (CV1) i druge (CV2) kanonijske ose. Elipse obuhvataju interval od 0.95. CV1 vs. Cv2 CV1 C V 2 P. yomenae Praon sp. P. megourae P. longicorne P. volucre P. dorsale -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 -2,0 -1,8 -1,6 -1,4 -1,2 -1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 Slika 10. Distribucija centroida duţ prve (CV1) i druge (CV2) kanonijske ose - ţenke 44 Diskriminantnom analizom utvrĊen je procenat ispravnosti grupisanja jedinki u unapred definisane vrste, izdvojene su 2 kanonijske ose, izraĉunate sopstvene vrednosti (engl. Eigen values) i procenat ukupne varijanse. Procenat pravilnog grupisanja jedinki dat je u Tabeli 4. Oko 70% svih jedinki je a priori pravilno grupisano, mada postoje jako velike razlike što se tiĉe procenta ispravnog grupisanja meĊu samim vrstama. Jedino su jedinke vrsta P. yomenae i P. megourae grupisane sa taĉnošću oko 92%. Jedinke ostalih vrsta su grupisane sa manjim procentom taĉnosti. Tabela 4. Matrica korektne klasifikacije ţenki u unapred definisane vrste gde redovi predstavljaju uoĉenu pripadnost, a kolone unapred predviĊenu pripadnost. Total predstavlja ukupan procenat korektne klasifikacije 4.1.2.Varijabilnost morfoloških karaktera kod muţjaka Kao i kod ţenki izraĉunate su srednja vrednost, standardna devijacija, minimalne i maksimalne vrednosti analiziranih osobina za svaku vrstu u cilju odreĊivanja unutargrupne varijabilnosti. Deskriptivnom statistikom je obuhvaćena 151 jedinka koje su svrstane unutar 6 vrsta (Praon yomenae, Praon sp., P. megourae, P. longicorne, P. volucre i P. dorsale). Analizirano je 6 meristiĉkih karaktera i 8 kontinuiranih karaktera. Broj antenalnih segmenata (F) takoĊe, kao i kod ţenki, nije ušao u statistiĉku analizu, ali se moţe uoĉiti njegovo variranje po vrstama: P. yomenae (F=19-22), Praon sp. (F=19-20), P. megourae (F=20-22), P. longicorne (F=20-23), P. volucre (F=19-20) i P. dorsale (F=18-22). Broj mirisnih brazdi (rinarija) na prvom i drugom flagelarnom segmentu (MBF1 i MBF2) kod svih vrsta se kreće u opsegu 3-9 odnosno 3-10. Najveća varijabilnost % tačnog grupisanja P. yomenae Praon sp. P. megourae P. longicorne P. volucre P. dorsale P. yomenae 92,85 130 0 4 4 2 0 Praon sp. 58,82 6 10 1 0 0 0 P. megourae 92,11 2 0 35 1 0 0 P. longicorne 33,33 12 0 6 10 1 1 P. volucre 18,75 22 1 0 2 6 1 P. dorsale 23,07 7 0 1 2 0 3 Total 70,00 179 11 47 19 9 5 45 MBF1 zabeleţena je unutar vrsta P. yomenae i P. longicorne (3-9), ali se pomenute vrste izdvajaju i po najvećoj varijabilnosti MBF2 (3-9 odnosno 3-10) (Prilog 3). Kao i kod ţenki, zapaţa se jasno izdvajanje jedinki vrste Praon sp. koje imaju po 3 segmenta u maksilarnim i 2 segmenta u labijalnim palpusima. Sve ostale vrste imaju po 4 segmenta u maksilarnim i 3 segmenta u labijalnim palpusima. Najmanju srednju vrednost duţine tela (L) ima vrsta P. volucre (42) dok najveću ima vrsta Praon sp. (49). Najveće variranje ovog karaktera zabeleţeno je kod vrste P. yomenae (min=32, max=61) (Prilog 3). Postojanje razlika u duţini tela muţjaka izmeĊu 6 razliĉitih vrsta testirano je analizom varijanse i pokazane su statistiĉke znaĉajne razlike (ANOVA: F=3.632, df=5, P=0.003993). Rezultati post-hoc Tukey‟s testa za duţinu tela ukazuju na to da je razlika u veliĉini tela statistiĉki znaĉajna jedino meĊu muţjacima vrsta P. yomenae - P. longicorne. Odnos duţine i širine prvog flagelarnog segmenta (F1l/F1w) pokazuje najveću srednju vrednost unutar vrste Praon sp. (3.0), dok je najmanja vrednost zabeleţena kod vrste P. longicorne (2.34). Analizom odnosa duţina odnosno širina prvog i drugog flagelarnog segmenta (F1l/F2l i F1w/F2w) zabeleţene su ujednaĉene srednje vrednosti za većinu vrsta, pri ĉemu je F1l/F2l imao najveću vrednost unutar vrste Praon sp. (1.27), dok je vrsta P. megourae pokazala najniţu srednju vrednost F1w/F2w (0.87). Najveća varijabilnost pomenutih analiziranih karaktera zabeleţena je unutar vrste P. yomenae (Prilog 3). Analizom oblika pterostigme, tj. odnosa njene duţine i širine – (Ptl/Ptw) izvajaju se vrste Praon sp. i P. dorsale sa najmanjom odnosno najvećom srednjom vrednošću analiziranog karaktera (3.38 i 3.98). Vrsta P. yomenae se izdvaja po najvećoj varijabilnosti ovog karaktera (Prilog 3). Najveće razlike srednjih vrednosti zabeleţene za karakter Ptl/Mtl (odnos duţine pterostigme i duţine metakarpalnog nerva) kreću se od 1.38 do 1.77 za vrstu P. megourae odnosno Praon sp., dok je najveća varijabilost zabeleţena unutar vrste P. yomenae (Prilog 3). Poslednji analizirani karakteri su Petl/Petw1 i Petl/Petw2 (odnosi duţine i širina petiolusa) i oni pokazuje najveću varijabilnost za vrstu P. yomenae. Najveće srednje vrednosti Petl/Petw1 i Petl/Petw2 zabeleţene su kod vrsta P. dorsale odnosno P. 46 longicorne (1.31 odnosno 1,63), dok su najniţe vrednosti ovih karaktera uoĉene kod vrsta P. megourae odnosno Praon sp. (1.11 odnosno 1.21). Da bi se utvrdilo da li postoje statistiĉki znaĉajne razlike za karaktere izmeĊu razliĉitih vrsta izvršena je analiza varijanse (ANOVA) (Tabela 5). Tabela 5. Analiza varijanse morfoloških karaktera muţjaka svih vrsta. Statistiĉki znaĉajne razlike su boldirane (p<0,05). karakter df model F p F1l/F1w 5 4,575 0,000664 F2l/F2w 5 2,87 0,016552 F1l/F2l 5 2,147 0,063137 F1w/F2w 5 1,239 0,29 Ptl/Ptw 5 0,949 0,451075 Ptl/Mtl 5 2,675 0,024102 Petl/Petw1 5 6,631 0,000014 Petl/Petw2 5 5,561 0,000102 Analiza varijanse je potvrdila odsustvo statistiĉki znaĉajnih razlika izmeĊu vrsta za sledeće karaktere: F1l/F2l, F1w/F2w i Ptl/Ptw. Diskriminantnom analizom muţjaka obuhvaćeno je 8 odnosa vrednosti kontinuiranih karaktera: F1l/F1w, F2l/F2w, F1l/F2l, F1w/F2w, Ptl/Ptw, Ptl/Mtl, Petl/Petw1 i Petl/Petw2. Kao faktor grupisanja i ovde je bila pripadnost vrsti. Kanonijska analiza je uraĊena na osnovu svih osam analiziranih indeksa. UtvrĊeno je da prve dve ose nose 81% razlika meĊu vrstama (63.18% i 18% redom) (Tabela 6). Odnos duţine i širine drugog flagelarnog segmenta (F2l/F2w) najviše doprinosi razdvajanju vrsta duţ prve ose, dok odnos duţine i širine petiolusa (Petl/Petw2) najviše doprinosi razdvajanju vrsta po drugoj osi (Tabela 6). Na Slikama 11 i 12 predstavljen je poloţaj jedinki u prostoru definisanom prvom i drugom CV osom. 47 Tabela 6. CVA analiza- standardizovani koeficijenti kanonijskih varijabli - muţjaci Karakter CV1 CV2 F1l/F1w 0.64569 -0.54189 F2l/F2w -1.29325 0.46172 F1l/F2l -0.72325 0.40075 F1w/F2w 0.73764 -0.27038 Ptl/Ptw 0.15566 -0.14278 Ptl/Mtl -0.44184 -0.10228 Petl/Petw1 0.66463 0.88059 Petl/Petw2 -0.03965 -1.14430 Eigenval 0.49021 0.13829 Cum.Prop 0.63188 0.81013 Elipsama su obuhvaćene jedinke koje pripadaju istoj vrsti (Slika 11), dok taĉke predstavljaju poloţaje pojedinaĉnih jedinki u prostoru definisanom sa prve dve kanonijske ose. Kao i u prethodnoj analizi i ovde je uoĉljivo izdvajanje vrste Praon sp. od klastera koga ĉine vrste P. yomenae i P. longicorne, mada je uzorak veoma mali. Kod svih ostalih vrsta uoĉljivo je velika varijabilnost kao i visok stepen preklapanja, što se moţe uoĉiti i posmatranjem samo njihovih centroida (Slika 12). CV1 vs. CV2 CV1 C V 2 P. yomenae Praon sp. P. megourae P. longicorne P. volucre P. dorsale -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 Slika 11. Distribucija muţjaka duţ prve (CV1) i druge (CV2) kanonijske ose. Elipse obuhvataju interval od 0.95. 48 CV1 vs. CV2 CV1 C V 2 P. yomenae Praon sp. P. megourae P. longicorne P. volucre P. dorsale -3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 Slika 12. Distribucija centroida duţ prve (CV1) i druge (CV2) kanonijske ose - muţjaci Procenat pravilnog grupisanja jedinki dat je u Tabeli 7. Tabela 7. Matrica korektne klasifikacije muţjaka u unapred definisane vrste gde redovi predstavljaju uoĉenu pripadnost, a kolone unapred predviĊenu pripadnost. Total predstavlja ukupan procenat korektne klasifikacije Oko 67% svih jedinki je a priori pravilno grupisano, mada postoje jako velike razlike što se tiĉe procenta ispravnog grupisanja meĊu samim vrstama. Tako su sve jedinke Praon sp. pravilno grupisane, dok je tek oko 33% jedinki Praon megourae, odnosno 11% jedinki Praon volucre ispravno grupisano. % tačnog grupisanja P. yomenae Praon sp. P. megourae P. longicorne P. volucre P. dorsale P. yomenae 87,65 71 0 1 8 0 1 Praon sp. 100,00 0 2 0 0 0 0 P. megourae 33,34 2 0 1 0 0 0 P. longicorne 56,25 19 0 1 27 1 0 P. volucre 11,11 8 0 0 0 1 0 P. dorsale 0,00 6 0 0 2 0 0 Total 67,55 106 2 3 37 2 1 49 4.2. ANALIZE VELIČINE I OBLIKA KRILA PRIMENOM GEOMETRIJSKE MORFOMETRIJE U ovu analizu varijabilnosti veliĉine i oblika krila ukljuĉeno je 482 jedinke kompleksa „dorsale-yomenae“ grupisanih unutar 6 razliĉitih vrsta. U tabelama 8 i 9 dat je pregled veliĉine krila ţenki i muţjaka prikazanih kao srednje vrednosti veliĉine centroida (CS), standardne devijacije, kao i minimumi i maksimumi. Tabela 8. Pregled veliĉine krila ţenki unutar 6 vrsta kompleksa „dorsale-yomenae“ Vrsta Br. ţenki Sr. vrednost Std. Dev. Minimum Maximum P. yomenae 161 1384.07 229.181566 697.574699 1851.20 Praon sp. 17 751.99206 42.976336 663.746360 811.661354 P. longicorne 33 1554.88 179.577835 828.923583 1821.06 P. dorsale 16 1244.90 328.172866 797.793592 1731.14 P. megourae 38 1569.49 106.554168 1403.09 1808.47 P. volucre 39 1365.91 306.366083 788.292312 1957.53 Tabela 9. Pregled veliĉine krila muţjaka unutar 6 vrsta kompleksa „dorsale-yomenae“ Vrsta Br. muţjaka Sr. vrednost Std. Dev. Minimum Maximum P. yomenae 99 1398.73 207.822496 731.160826 1708.78 Praon sp. 2 811.1450 112.915354 731.301789 890.988215 P. longicorne 50 1527.57 216.844561 1009.03 1911.07 P. dorsale 11 1115.55 397.714428 719.302439 1785.05 P. megourae 5 1270.00 451.504597 759.247502 1608.56 P. volucre 11 1605.37 173.893085 1389.29 1916.55 Da bi se utvrdilo da li uopšte postoje statistiĉki znaĉajne razlike u varijabilnosti u veliĉini i obliku krila, uraĊena je faktorska analiza varijanse (ANOVA), odnosno multivariatna analiza varijanse (MANOVA), sa faktorima vrsta, pol i interakcija vrsta × pol. Pregledom dobijenih rezultata uoĉeno je da postoji znaĉajna varijacija u veliĉini krila jedinki izmeĊu vrsta (ANOVA, faktor vrsta F=24.64, df=5, P<0.0001), dok izmeĊu polova razlike u veliĉini krila nemaju statistiĉku znaĉajnost (ANOVA, faktor pol: F=0.55, df=1, P=0.4575), ali je zato utvrĊeno da postoji znaĉajna interakcija vrsta × pol (ANOVA, interakcija vrsta × pol: F=4.26, df=5, P=0.0008). 50 Znaĉajne varijabilnosti u obliku krila pronaĊene su primenom multivarijantne analize varijanse MANOVA sa faktorima vrsta, pol, i interakcija vrsta × pol, i to izmeĊu vrsta (Wilk‟s Lambda=0.13845216, F=9.96, df1=110, df2=2204.4, P<0.0001), izmeĊu polova (Wilk‟s Lambda=0.81998317, F=4.48, df1=22, df2=449, P<0.0001), i pokazano je da postoji interakcija vrsta × pol (Wilk‟s Lambda=0.64154116, F=1.90, df1=110, df2=2204.4, P<0.0001). Statistiĉki znaĉajna varijabilnost u obliku krila izmeĊu polova ukazuje na statistiĉki znaĉajan polni dimorfizam, dok statistiĉki znaĉajna interakcija vrsta × pol ukazuje na postojanje razlika izmeĊu vrsta u polnom dimorfizmu u obliku krila. 4.2.1. Analiza veličine i oblika krila ţenki Analiza oblika krila ţenki izvršena je na 304 jedinki kompleksa „dorsale- yomenae“ koje su grupisane unutar 6 razliĉitih vrsta. Analizirana su samo desna krila ţenki parazitoida na kojima je pozicionirano 13 taĉaka (7 specifiĉnih taĉaka landmarks i šest poluspecifiĉnih taĉaka semilandmarks). Na Slici 13 prikazan je poloţaj koordinata odabranih taĉaka nakon Prokrustove superimpozicije. Slika 13. Konsenzus konstelacija svih taĉaka na svim krilima ţenki nakon Prokrustove superimpozicije (iz MorphoJ) 51 Postojanje razlika u veliĉini krila ţenki izmeĊu 6 razliĉitih vrsta kompleksa „dorsale-yomenae“ testirano je analizom varijanse za CS i pokazane su statistiĉki znaĉajne razlike (ANOVA: F=42.74, df=5, P<0.0001). Rezultati post-hoc Tukey‟s testa za razlike izmeĊu vrsta u veliĉini krila (logaritmovana vrednost veliĉine centroida) ukazuju na to da ne postoji statistiĉka znaĉajnost u razlikama veliĉine krila meĊu ţenkama sledećih vrsta: P. megourae-P. longicorne, P. yomenae-P. volucre, P. yomenae-P. dorsale, kao i P. dorsale-P. volucre. Na Slici 14 se jasno uoĉava da se ţenke vrste Praon sp. jasno izdvajaju od ostalih vrsta po najmanjoj veliĉini krila, dok su najveća krila prisutna kod ţenki vrste P. longicorne. Najveću varijabilnost u veliĉini krila uoĉena je kod ţenki vrsta P. volucre i P. dorsale. Slika 14. Prikaz srednjih vrednosti i standardnih devijacija za veliĉinu krila kod ţenki Multivarijantnom analizom varijanse utvrĊeno je i postojanje statistiĉki znaĉajnih razlika u obliku krila meĊu razliĉitim vrstama ţenki (MANOVA: Wilks‟ Lambda= 0.07332163, F= 8.72, df1=110, df2=1361.8, P<0.0001). Da bismo utvrdili koje promene u obliku krila ţenki najviše doprinose diskriminaciji izmeĊu vrsta, izvršena je diskriminantna kanonijska analiza (CVA) (Slika 15). Ilustracija promena oblika duţ CVA osa dobijena je regresijom svih varijabli oblika 52 na izdvojene ose. CVA ose opisuju promene oblika koje u najvećoj meri doprinose razlikovanju grupa. Preko 83% od ukupnih razlika u obliku opisano je sa prve dve CVA ose. Duţ prve kanonijske ose, koja opisuje 50.46% razlika u obliku dolazi do jasnog razdvajanja ţenki vrsta P. yomenae, P. megourae i Praon sp. od ţenki vrste P. longicorne koja se jasno izdvaja u zaseban klaster u pozitivnom delu ove ose. Posmatranjem deformacionih mreţa (Slika 15) uoĉava se da su najveće promene oblika opisanih prvom osom uslovljene izduţivanjem radijalnog nerva-R (opisanog taĉkama 2 i 7). TakoĊe se uoĉavaju i promene u veliĉini intermedijalnog (povratnog) nerva-Im (opisanog taĉkama 3 i 4). Dolazi i do promene u odnosima površina krila iznad i ispod radijalnog nerva (distalni deo krila iznad radijalnog nerva ograniĉen je taĉkama 2, 6, 7, i 8, dok je deo krila ispod radijalnog nerva opisan taĉkama 7, 9 i 10). Ove promene oznaĉavaju da poĉevši od vrsta P. yomenae, P. megourae i Praon sp. pa do vrste P. longicorne radijalni nerv ima tendenciju izduţivanja, povratni nerv se skraćuje, blago se povećava površina distalnog dela krila iznad radijalnog nerva, dok se smanjuje njegova površina ispod radijalnog nerva. U odnosu na ove jako izraţene promene sve ostale su zanemarljive. Jedinke vrste P. dorsale pokazuju veliku unutarspecijsku varijabilnost, kao i visok stepen preklapanja sa ostalim vrstama. Oblik krila kod jedinki vrste P. volucre poklapa se sa srednjom vrednošću oblika krila ĉitavog uzorka. Druga kanonijska osa opisuje 33.18% razlika u obliku krila unutar analiziranog uzorka. Na deformacionim mreţama prikazane su promene oblika krila od ţenki vrste Praon sp. preko P. yomenae pa sve do P. megourae (Slika 15). Razdvajanje ţenki pomenutih vrsta je uzrokovano izduţivanjem radijalnog nerva i smanjenjem površine distalnog dela krila iznad i ispod radijalnog nerva. TakoĊe se uoĉava i neznatno proširenje pterostigme opisane taĉkama 2, 5 i 6. Po CV2 osi uoĉava se velika unutarspecijska varijabilnost kod vrsta P. dorsale i P. longicorne, kao i njihovo preklapanje sa ostalim vrstama. Statistiĉki znaĉajne Prokrustove distance izmeĊu oblika krila ţenki razliĉitih vrsta, nakon Bonferroni korekcije prikazane su u Tabeli 10. Uoĉeno je da razlike u obliku krila nisu statististiĉki znaĉajne jedino izmeĊu vrsta P. volucre i P. dorsale (Tabela 10). 53 Tabela 10. Prokrustove distance izmeĊu vrsta (iz CVA, MorphoJ). Statistiĉki znaĉajne razlike nakon Bonferroni korekcije su boldirane P. dorsale P. longicorne P. megourae Praon sp. P. volucre P. yomenae P. dorsale P. longicorne 0.0306 P. megourae 0.0351 0.0377 Praon sp. 0.0575 0.0657 0.0465 P. volucre 0.023 0.0352 0.0299 0.0377 P. yomenae 0.0402 0.0461 0.0225 0.0254 0.024 54 Slika 15. CVA ţenke. Distribucija ţenki duţ prve dve kanonijske ose. Deformacione mreţe ilustruju promene oblika krila korelisanih sa prvom i drugom kanonijskom osom 55 Procenat pravlinog grupisanja jedinki u a priori definisane grupe utvrĊen diskriminantnom analizom preko CVA distanci (programski paket MorphoJ) (Tabela 11). Tabela 11. Matrica korektne klasifikacije ţenki u a priori definisane vrste nakon diskriminacione analize gde redovi predstavljaju unapred predviĊenu pripadnost, a kolone uoĉenu pripadnost. Total predstavlja ukupan procenat korektne klasifikacije. a priori % tačnog grupisanja postpriori P . d o rs a le P . lo n g ic o rn e P . m eg o u ra e P ra o n s p . P . vo lu cr e P . yo m en a e T o ta l P. dorsale 81.25 13 0 0 0 0 3 16 P. longicorne 81.82 1 27 0 0 5 0 33 P. megourae 92.10 0 1 35 0 1 1 38 Praon sp. 94.12 0 0 0 16 0 1 17 P. volucre 76.92 2 4 0 0 30 3 39 P. yomenae 72.67 6 9 10 4 15 117 161 Ukoliko pogledamo ceo analizirani uzorak jedinke su sa 72.73% taĉnosti grupisane unutar odgovarajuće vrste tj. od 304 jedinki, 238 je grupisano u a priori definisane grupe. MeĊu vrstama postoji razlika u procentu taĉnosti poĉev od 72.67% kod P. yomenae, pa do 94.12% kod P. megourae. Unutar vrste P. yomenae se nalaze jedinke koje su naknadno svrstane unutar preostalih pet vrsta (27.33% je pogrešno klasifikovano). Najbolje definisane vrste su Praon sp. kod koje je na osnovu oblika krila samo jedna jedinka pogrešno klasifikovana i P. megourae kod koje su tri jedinke pogrešno klasifikovane. Da bi se utvrdilo da li se jedinke koje potiĉu iz razliĉitih domaćina (razliĉite vrste afidnih domaćima) razlikuju u obliku krila, analiza glavnih komponenti uraĊena je za svaku vrstu parazitoida koja parazitira veći broj domaćina, odnosno biotipova. Analizom glavnih komponenti (PCA) unutar vrste P. dorsale utvrĊeno je jasno razdvajanje ţenki u obliku krila izmeĊu dva biotipa Mulgedium alpinum i Coryllobium avellanae po prvoj PC osi koja nosi najveći procenat varijabilnosti ţenki u okviru ove vrste (52.27%) (Slika 16). Biotip Coryllobium avellanae se izdvaja, u odnosu na biotip Mulgedium alpinum, posedovanjem duţeg radijalnog nerva (opisan taĉkama 2 i 7), 56 kraćim povratnim nervom (ograniĉen taĉkama 3 i 4), neznatno širom i duţom pterostigmom opisane taĉkama 2, 5 i 6, kao i manjom površinom distalnog dela krila ispod radijalnog nerva ograniĉenog taĉkama 7, 9 i 10. Za razliku od PC1 ose koja opisuje varijabilnost izmeĊu pomenuta dva biotipa, PC2 osa ukazuje na unutargrupnu varijabilnost. Posmatranjem deformacionih mreţa (Slika 16) uoĉava se da se najveće promene oblika od negativnog ka pozitivnom delu PC2 ose ogledaju u smanjenju površine distalnog dela krila iznad radijalnog nerva (opisanog taĉkama 7, 9 i 10). TakoĊe se uoĉava i izduţivanje i proširivanje pterostigme, kao izduţivanje drugog sektora kubitalnog nerva (opisanog taĉkama 1 i 3). U prostoru opisanom sa prve dve glavne komponente izdvojene PCA analizom unutar vrste P. longicorne, jasno se izdvajaju dva klastera: 1. Aulacorthum rufum i Impantientinum balsamines i 2. Microlophium carnosum i Microlophium evansi (Slika 17). Najveće promene u obliku krila uslovljene su menjanjem duţine radijalnog nerva, kao i promenom duţine i širine pterostigme. Klaster koga ĉine biotipovi Microlophium carnosum i Microlophium evansi se izdvaja posedovanjem duţe i šire stigme, kao i kraćim radijalnim nervom. TakoĊe se kod njih zapaţa neznatno povećanje površine distalnog dela krila iznad radijalnog nerva. PC2 osa pokazuje veliku unutargrupnu varijabilnost kod svih biotipova. Promene oblika krila uslovljene su, u pozitivnom delu ove ose, izduţivanjem radijalnog nerva, smanjenjem površine donjeg dela krila opisanog taĉkama 7, 10, 11 i 12, neznatnim skraćivanjem i proširivanjem pterostigme, izduţivanjem drugog sektora kubitalnog nerva opisanog taĉkama 1 i 3, kao smanjenjem duţine povratnog nerva opisanog taĉkama 3 i 4. U okviru vrste P. yomenae postoji visok stepen preklapanja i velika varijabilnost u okviru biotipova Uroleucon sp. i Uroleucon sonchi. PCA analiza ukazuje na razdvajanje biotipa Macrosiphoniella sanborni od biotipa Uroleucon jaceae. Razlozi ovakvog razdvajanje ova dva biotipa predstavljeni su deformacionim mreţama (Slika 18). Promene oblika krila, poĉevši od biotipa Uroleucon jaceae pa do biotipa Macrosiphoniella sanborni, podrazumevaju smanjenje širine središnjeg dela krila opisanog taĉkama 2, 5, 6, 7, 12 i 13, kao i povećanjem površine distalnog dela krila iznad radijalnog nerva ograniĉene taĉkama 7, 8 i 9, a smanjenjem površine distalnog dela krila ispod radijalnog nerva opisane taĉkama 7, 10 i 11. Najveće promene u obliku krila po PC2 osi, koja opisuje unutargrupnu varijabilnost svih biotipova, uslovljene su 57 izduţivanjem radijalnog nerva, povećanjem površine distalnog dela krila iznad, a smanjenjem površine ispod radijalnog nerva, kao i smanjenjem duţine povratnog nerva. TakoĊe se uoĉava i širenje središnjeg dela krila ograniĉenog takama 6, 11, 12 i 13. 58 Slika 16. PCA analiza meĊu biotipovima ţenki vrste Praon dorsale 59 Slika 17. PCA analiza razliĉitih biotipova ţenki vrste Praon longicorne 60 Slika 18. PCA analiza razliĉitih biotipova ţenki vrste Praon yomenae 61 4.2.2. Analiza veličine i oblika krila muţjaka Muţjaci, ĉija su krila analizirana, su kao i ţenke grupisani unutar 6 razliĉitih vrsta, pri ĉemu je ukupan broj jedinki 178. Poloţaj specifiĉnih taĉaka nakon Prokrustove superimpozicije, kao i srednja vrednost konstelacije specifiĉnih taĉaka u analiziranom uzorku muţjaka dat je na Slici 19. Slika 19. Konsenzus konstelacija svih taĉaka na svim krilima muţjaka nakon Prokrustove superimpozicije (iz MorphoJ) Postojanje razlika u veliĉini krila muţjaka izmeĊu 6 razliĉitih vrsta kompleksa „dorsale-yomenae“ testirano je, kao i kod ţenki, analizom varijanse za CS i pokazane su statistiĉke znaĉajne razlike (ANOVA: F=11.85, df=5, P<0.0001). Rezultati post-hoc Tukey‟s testa za veliĉinu krila (logCS) ukazuju na statistiĉki znaĉajne razlike u veliĉini krila muţjaka sledećih vrsta: P. dorsale-P. volucre, P. volucre-Praon sp., P. longicorne-P. dorsale, P. longicorne-Praon sp., P. yomenae-P. dorsale, P. yomenae-Praon sp.. Na Slici 20 se jasno uoĉava da se, kao i kod ţenki, muţjaci vrste Praon sp. jasno izdvajaju od ostalih vrsta po najmanjoj veliĉini krila, dok su najveća krila prisutna kod muţjaka vrste P. volucre. Najveća varijabilnost u veliĉini krila muţjaka uoĉava se kod vrsta P. dorsale i P. megourae. 62 Slika 20. Prikaz srednjih vrednosti i standardnih devijacija za veliĉinu krila kod muţjaka Multivarijantnom analizom varijanse utvrĊeno je i postojanje statistiĉki znaĉajnih razlika u obliku krila muţjaka (MANOVA: Wilks‟ Lambda= 0.06680332, F=4.49, df1=110, df2=744.53, P<0.0001). Kao i kod ţenki primenili smo diskriminantnu kanonijsku analizu (CVA) kako bi utvrdili kvantitet i kvalitet promena u obliku krila muţjaka izmeĊu razliĉitih vrsta. Duţ prve kanonijske ose koja nosi 70.57% varijabilnosti dolazi do razdvajanja muţjaka vrsta P. yomenae i P. longicorne, što se podudara sa rezultatima dobijenim kod ţenki. Razlozi ovakvog razdajanja predstavljeni su deformacionim mreţama (Slika 21). Poĉevši od vrste P. longicorne ka vrsti P. yomenae radijalni nerv ima tendenciju skraćivanja, dok povratni nerv postaje duţi. Ovakve promene oblika krila uoĉene su i kod ţenki istih vrsta. Druga kanonijska osa nosi 14.47% varijabilnosti i po njoj se muţjaci vrsta P. volucre, P. longicorne i P. yomenae razdvajaju od vrste P. megourae. Posmatranjem mreţa deformacije (Slika 21) uoĉava se da je njeno izdvajanje u zaseban klaster uzrokovano izduţivanjem radijalnog nerva, kao i izduţivanjem drugog sektora 63 kubitalnog nerva opisanog taĉkama 1 i 3. TakoĊe se uoĉava i povećanje duţine i širine pterostigme opisane taĉkama 2, 5 i 6. Ova vrsta se odlikuje manjom površinom donjeg dela krila ograniĉenog taĉkama 7, 10, 11 i 12. Po CV2 osi uoĉavamo i veliku unutarspecijsku varijabilnost unutar vrste P. megourae. Muţjaci vrste P. dorsale, kao i ţenke, pokazuju veliku unutarspecijsku varijabilnost kao i preklapanje sa ostalim vrstama kompleksa dorsale-yomenae. Za razliku od ţenki, gde je nakon analize Prokrustovih distanci meĊu gotovo svim vrstama postojala statistiĉki znaĉajna razlika u obliku krila, kod muţjaka te razlike ostaju statistiĉki znaĉajne samo izmeĊu sledećih vrsta: P. yomenae i P. dorsale, P. yomenae i P. longicorne, P. yomenae i P. megourae, P. volucre i P. longicorne, P. volucre i P. megourae (Tabela 12 ). Tabela 12. Prokrustove distance izmeĊu vrsta (iz CVA, MorphoJ). Statistiĉki znaĉajne razlike nakon Bonferroni korekcije su boldirane P. dorsale P. longicorne P. megourae Praon sp. P. volucre P. yomenae P. dorsale P. longicorne 0.0333 P. megourae 0.032 0.047 Praon sp. 0.0493 0.0567 0.0448 P. volucre 0.0466 0.0347 0.0502 0.0343 P. yomenae 0.0483 0.0411 0.0459 0.0273 0.0217 64 Slika 21. CVA muţjaci. Distribucija muţjaka duţ prve dve kanonijske ose. Deformacione mreţe ilustruju promene oblika krila korelisanih sa prvom i drugom kanonijskom osom 65 Procenat pravilnog grupisanja jedinki u a priori definisane grupe utvrĊen je preko CVA distanci (programski paket MorphoJ) (Tabela 13). Tabela 13. Matrica korektne klasifikacije muţjaka u a priori definisane vrste gde redovi predstavljaju predviĊenu pripadnost, a kolone uoĉenu pripadnost. Total predstavlja ukupan procenat ispravne klasifikacije. a priori % tačnog grupisanja postpriori P . d o rs a le P . lo n g ic o rn e P . m eg o u ra e P ra o n s p . P . vo lu cr e P . yo m en a e T o ta l P . dorsale 72.72 8 1 0 0 0 2 11 P. longicorne 100 0 50 0 0 0 0 50 P. megourae 80 0 0 4 0 0 1 5 Praon sp. 100 0 0 0 2 0 0 2 P. volucre 100 0 0 0 0 11 0 11 P. yomenae 79.79 5 3 2 6 4 79 99 Muţjaci su sa malo većom taĉnošću (86.51%) grupisani unutar a priori definisanih vrsta. MeĊu vrstama postoji znaĉajna razlika u procentu taĉnosti poĉev od 72.72% kod P. dorsale pa do 100% kod P. longicorne, P. volucre i Praon sp.. Kao i kod ţenki, unutar vrste P. yomenae nalaze se jedinke koje su naknadno svrstane unutar preostale ĉetiri vrste (20.21% je pogrešno klasifikovano). Najbolje definisane vrste su P. longicorne, P. volucre i Praon sp. kod kojih su sve jedinke ispravno klasifikovane. Varijabilnost unutar vrsta, izmeĊu razliĉitih biotipova analizirana je analizom glavnih komponenti (PCA). PCA analizom unutar vrste P. dorsale utvrĊeno je jasno razdvajanje dva biotipa Mulgedium alpinum i Coryllobium avellanae po prvoj PC osi koja opisuje najveći procenat varijabilnosti u okviru ove vrste (64.32%). Deformacionim mreţama ilustrovane su promene oblika krila (Slika 22). Kao i kod ţenki tako i kod muţjaka unutar biotipa Coryllobium avellanae najveće promene oblika krila uslovljene su izduţivanjem radijalnog, a skraćivanjem povratnog nerva. Za razliku od ţenki istog biotipa uoĉava se i smanjenje površine donjeg dela krila opisanog taĉkama 7, 9, 10, 11 i 12. PC2 osa ukazuje na veliku unutargrupnu varijabilnost biotipova. Promene oblika krila uslovljene su, u najvećoj meri, izduţivanjem radijalnog 66 nerva, smanjenjem površine distalnog dela krila iznad radijalnog nerva, kao i povećanjem širine središnjeg dela krila opisanog taĉkama 2, 6, 11 i 12. TakoĊe drugi sektor kubitalnog nerva ima tendenciju skraćivanja. U okviru vrste P. longicorne uoĉen je visok stepen preklapanja i velika varijabilnost u okviru biotipova Acyrthosiphon pisum, Macrosiphum funestum, Microlophium carnosum i Microlophium evansi. PCA analiza ukazuje na razdvajanje biotipova Macrosiphum funestum i Microlophium evansi od biotipa Impatientinum balsamines po PC2 osi koja nosi svega 19.50% ukupne varijabilnosti (Slika 23). Njegovo izdvajanje u zaseban klaster uzrokovano je posedovanjem duţeg radijalnog i kraćeg povratnog nerva. TakoĊe se uoĉava neznatno smanjenje širine i duţine pterostigme, kao i smanjenjem površine distalnog dela krila iznad radijalnog nerva. Sliĉne promene oblika krila uoĉene su i kod ţenki istog biotipa. U okviru vrste P. yomenae postoji visok stepen preklapanja i velika varijabilnost u oviru svih analiziranih biotipova. Nije uoĉeno razdvajanje biotipova duţ PC1 i PC2 ose (Slika 24). Posmatranjem deformacionih mreţa uoĉavaju se iste promene oblika krila u PC1 plus orjentaciji kao i kod ţenki: smanjuje se širina središnjeg dela krila ograniĉenog taĉkama 5, 6, 11, 12 i 13, a povećava se površina distalnog dela krila iznad radijalnog nerva. Najveće promene duţ PC2 ose uslovljene su smanjenjem duţine radijalnog nerva, smanjenjem širine središnjeg dela krila ograniĉenog taĉkama 6, 12 i 13, kao i povećanjem površine distalnog dela krila ispod radijalnog nerva. 67 Slika 22. PCA analiza meĊu biotipovima muţjaka vrste Praon dorsale 68 Slika 23. PCA analiza razliĉitih biotipova muţjaka vrste Praon longicorne 69 Slika 24. PCA analiza razliĉitih biotipova muţjaka vrste Praon yomenae 70 4.2.3. Efekat geografske distribucije na veličinu i oblik krila jedinki vrste Praon yomenae U okviru vrste P. yomenae uoĉena je najveća varijabilnost u veliĉini i obliku krila, kao i veliki stepen preklapanja meĊu razliĉitim biotipovima (domaćinima) tako da efekat domaćina nema statistiĉku znaĉajnost. Iz tog razloga smo se opredelili za analizu efekta geografske distribucije na veliĉinu i oblik krila pomenute vrste. U ovu analizu varijabilnosti veliĉine i oblika krila ukljuĉeno je 236 jedinki vrste P. yomenae razliĉitih geografskih distribucija kojima su dodeljeni kodovi: 1-Zapadna Evropa (Francuska, Švajcarska), 2-Istoĉna Evropa (Republika Ĉeška, Slovaĉka), 3- Centralna Evropa (Italija, Slovenija, Crna Gora, Srbija, Grĉka, Bugarska), 4-Bliski istok (Iran), 5- Daleki istok (Japan). U tabelama 14 i 15 dat je pregled veliĉine krila ţenki i muţjaka prikazanih kao geometrijska mera (veliĉina centroida CS), taĉnije njihove srednje vrednosti, standardne devijacije, kao i minimumi i maksimumi. Tabela 14. Pregled veliĉine krila ţenki P. yomenae u zavisnosti od geografske distribucije Kod Br. ţenki Sr. vrednost Std. Dev. Minimum Maximum 1 22 1440.24 179.156339 1023.04 1851.20 2 37 1495.66 138.067628 1256.60 1815.59 3 67 1408.14 153.320840 795.9351539 1789.52 4 12 1252.57 245.444137 791.5595123 1670.00 5 11 806.2752050 75.761367 697.5746996 924.2011935 Tabela 15. Pregled veliĉine krila muţjaka P. yomenae u zavisnosti od geografske distribucije Kod Br. muţjaka Sr. vrednost Std. Dev. Minimum Maximum 1 1 1405.57 - 1405.57 1405.57 2 28 1443.65 127.504580 1201.95 1684.80 3 47 1448.95 154.166555 731.1608263 1708.78 4 5 1405.28 216.125260 1155.31 1658.53 5 6 803.69 50.766320 755.3525921 883.6794581 71 4.2.3.1. Analiza veličine i oblika krila ţenki Praon yomenae različite geografske distribucije Postojanje eventualnih razlika izmeĊu geografskih oblasti u veliĉini krila ţenki P. yomenae testirano je analizom varijanse za CS i pokazane su statistiĉke znaĉajne razlike (ANOVA: F=58.49, df=4, P<0.0001). Rezultati post-hoc Tukey‟s testa za log_centroid_size ukazuju na to da ne postoji statistiĉka znaĉajnost u razlikama veliĉine krila meĊu ţenkama zapadne, centralne i istoĉne Evrope pri ĉemu one formiraju zajedniĉki klaster koji ih jasno izdvaja u odnosu na ţenke Bliskog i Dalekog istoka. Na Slici 25 se jasno uoĉava da se ţenke Dalekog istoka izdvajaju u zaseban klaster po najmanjoj veliĉini krila. Najveća krila imaju ţenke centralne Evrope što se moţe objasniti i time da je najveći uzorak poreklom iz pomenute geografske oblasti. Multivarijantnom analizom varijanse utvrĊeno je i postojanje statistiĉki znaĉajnih razlika u obliku krila meĊu ţenkama P. yomenae grupisanih po geografskim oblastima (MANOVA: Wilks‟ Lambda= 0.20047000, F= 2.79, df1=88, df2=488.85, P<0.0001). Slika 25. Prikaz srednjih vrednosti i standardnih devijacija u veliĉini krila ţenki P. yomenae 72 Da bismo utvrdili kvantitet i kvalitet promena u obliku krila ţenki P. yomenae razliĉite geografske distribucije izvršena je kanonijska varijatna analiza (CVA) (Slika 26). Preko 75% razlika u obliku izmeĊu geografskih oblasti opisano je duţ prve dve CVA ose. Duţ prve kanonijske ose, koja nosi 56.39% varijabilnosti dolazi do jasnog razdvajanja ţenki sa Bliskog istoka od ţenki sa Dalekog istoka, dok su ţenke zapadne, centralne i istoĉne Evrope formirale zajedniĉki klaster. Posmatranjem deformacionih mreţa (Slika 26) uoĉava se da su najveće promene oblika opisanih prvom osom uslovljene izduţivanjm radijalnog nerva (opisanog taĉkama 2 i 7). TakoĊe se uoĉavaju i promene u površini distalnog dela krila iznad radijalnog nerva opisane taĉkama 7, 8 i 9, kao i promene u duţini pterostigme ograniĉene taĉkama 2, 5 i 6. Ove promene oznaĉavaju da poĉevši od ţenki Bliskog istoka, preko ţenki Evrope, pa sve do ţenki Dalekog istoka radijalni nerv ima tendenciju izduţivanja, smanjuje se površina distalnog dela krila iznad radijalnog nerva, dok se pterostigma izduţuje. Po CV2 osi, koja nosi 19.45% varijabilnosti i više ukazuje na unutargrupnu varijabilnost, nema jasnog razdvajanja u obliku krila po geografskoj distribuciji. Najveće promene oblika krila, u pozitivnom delu ose, ogledaju se u smanjenju širine središnjeg dela krila (opisanog taĉkama 2, 5, 6, 11, 12 i 13) i povećanju površine distalnog dela krila iznad radijalnog nerva. TakoĊe se uoĉava i neznatno izduţivanje radijalnog nerva. 73 Slika 26. CVA ţenke Praon yomenae. Distribucija ţenki duţ prve dve kanonijske ose. Deformacione mreţe ilustruju promene oblika krila korelisanih sa prvom i drugom kanonijskom osom 74 Prokrustove distance izmeĊu ţenki P. yomenae razliĉitih geografskih distribucija, pokazuju postojanje znaĉajnih razlika u obliku krila. Nakon Bonferroni korekcije, uoĉeno je da razlike u obliku krila nemaju statistiĉku znaĉajnost jedino izmeĊu ţenki grupisanih po sledećim geografskim oblastima: zapadna i istoĉna Evropa, zapadna Evropa i Daleki istok, centralna Evropa i Bliski istok (Tabela 16). Tabela 16. Prokrustove distance izmeĊu ţenki P. yomenae grupisanih po kodovima (iz CVA, MorphoJ). Statistiĉki znaĉajne razlike nakon Bonferroni korekcije su boldirane kod 1 2 3 4 5 1 2 0,0093 3 0,0227 0,0181 4 0,0388 0,034 0,0228 5 0,0251 0,0278 0,0267 0,0427 4.2.3.2. Analiza veličine i oblika krila muţjaka Praon yomenae različite geografske distribucije Postojanje razlika u veliĉini krila muţjaka P. yomenae grupisanih po geografskim oblastima testirano je, kao i kod ţenki, analizom varijanse za CS i pokazane su statistiĉke znaĉajne razlike (ANOVA: F=36.40, df=4, P<0.0001). Rezultati post-hoc Tukey‟s testa za log_centroid_size ukazuju na to da postoji statistiĉka znaĉajnost u razlikama veliĉine krila meĊu muţjacima zapadne, centralne i istoĉne Evrope, koji formiraju jedan klaster, od muţjaka Dalekog istoka. TakoĊe se uoĉava i znaĉajna razlika u veliĉini krila izmeĊu muţjaka Bliskog i Dalekog istoka. Na Slici 27 se jasno uoĉava da se muţjaci Dalekog istoka, kao i ţenke, izdvajaju u zaseban klaster po najmanjoj veliĉini krila. Najveća krila imaju muţjaci Bliskog istoka, pri ĉemu se u tom uzorku zapaţa i najveći procenat varijabilnosti. 75 Slika 27. Prikaz srednjih vrednosti i standardnih devijacija u veliĉini krila muţjaka P. yomenae . Multivarijantnom analizom varijanse utvrĊeno je i postojanje statistiĉki znaĉajnih razlika u obliku krila meĊu muţjacima P. yomenae grupisanih po geografskim oblastima (MANOVA: Wilks‟ Lambda= 0.10794241, F= 2.09, df1=88, df2=243.69, P<0.0001). Kao i kod ţenki primenili smo diskriminantnu kanonijsku analizu (CVA) kako bi utvrdili kvantitet i kvalitet promena u obliku krila muţjaka grupisanih po kodovima. Duţ prve kanonijske ose, koja nosi 46.41% varijabilnosti dolazi do jasnog izdvajanja muţjaka sa Dalekog istoka u zaseban klaster (Slika 28). Promene oblika krila koje dovode do ovakvog izdvajanja uslovljene su, u najvećoj meri, izduţivanjem radijalnog nerva. TakoĊe se zapaţa skraćenje povratnog nerva opisanog taĉkama 3 i 4, smanjenje površine dela krila ispod radijalnog nerva opisanog taĉkama 7, 11, 12 i 13, kao i neznatno smanjenje duţine a povećanje širine pterostigme (ograniĉene taĉkama 2, 5 i 6). Na Slici 28 uoĉava se izdvajanje muţjaka zapadne, centralne i istoĉne Evrope u zaseban klaster, pri ĉemu se njihov oblik krila poklapa sa srednjom vrednošću oblika krila ĉitavog uzorka. 76 Po CV2 osi, koja nosi 27.20% varijabilnosti uoĉava se jasno razdvajanje muţjaka sa Bliskog istoka od muţjaka ostalih analiziranih geografskih oblasti. Posmatranjem deformacionih mreţa (Slika 28) zapaţa se da su najveće promene oblika krila, koje su dovele do njihovog izdvajanja u zaseban klaster, uslovljene skraćenjem radijalnog nerva, suţavanjem središnjeg dela krila opisanog taĉkama 6, 11, 12 i 13, kao i povećanjem površine distalnog dela krila ispod radijalnog nerva (ograniĉenog taĉkama 7, 9 i 10). Analizom Prokrustove distance izmeĊu muţjaka P. yomenae razliĉitih geografskih distribucija, nakon Bonferroni korekcije, uoĉeno je da razlike u obliku krila imaju statistiĉku znaĉajnost jedino izmeĊu muţjaka istoĉne Evrope i muţjaka Bliskog i Dalekog istoka, kao i izmeĊu muţjaka Bliskog i Dalekog istoka (Tabela 17). Tabela 17. Prokrustove distance izmeĊu muţjaka P. yomenae grupisanih po kodovima (iz CVA, MorphoJ). Statistiĉki znaĉajne razlike nakon Bonferroni korekcije su boldirane kod 1 2 3 4 5 1 2 0,0281 3 0,0268 0,0141 4 0,0276 0,0405 0,0337 5 0,0477 0,0385 0,0316 0,0517 77 Slika 28. CVA muţjaci Praon yomenae. Distribucija muţjaka duţ prve dve kanonijske ose. Deformacione mreţe ilustruju promene oblika krila korelisanih sa prvom i drugom kanonijskom osom 78 4.2.4. Polni dimorfizam u veličini i obliku krila Polni dimorfizam u veliĉini krila izmeĊu muţjaka i ţenki unutar 6 razliĉitih vrsta testiran je analizom varijanse na CS i pokazano je da razlike u veliĉini krila izmeĊu polova nemaju veću statistiĉku znaĉajnost (ANOVA: F=5.52, df=1, P=0.0230). Izraĉunavanjem indeksa polnog dimorfizma u veliĉini krila-ISSD (Tabela 18) pokazano je da ţenke vrsta P. longicorne, P. dorsale i P. megourae imaju nešto duţa krila u odnosu na muţjake. Kod vrsta P. yomenae, Praon sp. i P. volucre muţjaci su ti koji imaju duţa krila. Najveća vrednost ISSD je pokazana unutar vrste P. megourae (1.23), dok je najmanji ISSD zabeleţen izmeĊu ţenki i muţjaka vrste P. volucre. Same vrednosti ISSD pokazuju da nivo polnog dimorfizma ne varira znaĉajno meĊu vrstama. Tabela 18. Prikaz indeksa seksualnog dimorfizma u veliĉini i obliku krila meĊu razliĉitim vrstama. Statistiĉki znaĉajne razlike u Prokrustovim distancama su boldirane nakon Bonferroni korekcije Vrste No ♀ No♂ ISSD (indeks polnog dimorfizma u veličini krila) ISShD (indeks polnog dimorfizma u obliku krila) P. yomenae 161 99 0.989519 0.0263 Praon sp. 17 2 0.927075 0.0175 P. longicorne 33 50 1.017878 0.0183 P. dorsale 16 11 1.115952 0.0124 P. megourae 38 5 1.235819 0.0288 P. volucre 39 11 0.850838 0.036 Indeks polnog dimorfizma u obliku krila-ISShD izmeĊu polova predstavljen je Prokrustovim distancama izmeĊu srednjih oblika muţjaka i ţenki unutar svake vrste posebno (Tabela 18). Izraĉunavanjem ISShD uoĉava se statistiĉki znaĉajna razlika u obliku krila izmeĊu polova unutar vrsta P. yomenae, P. longicorne, P. megourae i P. volucre. Kako bi ilustrovali promene u obliku krila izmeĊu muţjaka i ţenki, uradjena je PCA na srednjim vrednostima oblika krila muţjaka i ţenki analiziranih vrsta (Slika 29). Na osnovu poloţaja muţjaka i ţenki u morfološkom prostoru definisanom sa prve dve komponente koje opisuju više od 72% ukupne varijabilnosti u obliku krila jasno se uoĉava da je pravac promena oblika krila izmeĊu ţenki i muţjaka isti kod vrsta P. yomenae, P. volucre, P. longicorne. Te promene su u najvećoj meri uslovljene smanjenjem duţine radijalnog nerva opisanog taĉkama 2 i 7, povećanjem duţine povratnog nerva opisanog taĉkama 1 i 3, kao i povećanjem površine donjeg dela krila 79 ispod radijalnog nerva (ograniĉene taĉkama 7, 10, 11 i 12). TakoĊe, ţenke ovih vrsta imaju kraća i šira krila u poreĊenju sa muţjacima (promene oblika opisane drugom osom). Kod vrste P. megourae, za koju je utvrĊeno postojanje statistiĉki znaĉajnog polnog dimorfizma u obliku krila pravac promena oblika krila izmeĊu ţenki i muţjaka je suprotan. Za P. dorsale i Praon sp. nije utvrĊen statistiĉki znaĉajan dimorfizam u obliku krila. 80 Slika 29. PCA analiza muţjaka i ţenki. Strelice pokazuju pravac promena oblika krila izmeĊu ţenki i muţjaka 81 4.3. MOLEKULARNE ANALIZE 4.3.1. Molekularne analize COI mtDNK vrsta iz roda Praon Za filogenetsku analizu vrsta iz roda Praon zasnovanu na COI genu mitohondrijalne DNK, uspešno je PCR metodom amplifikovano i sekvencirano 47 primeraka (Tabela 19), ĉime su bile obuhvaćene vrste Praon dorsale, P. megourae, P. volucre, P. longicorne, Praon sp. i P. yomenae (Slika 30) . Slika 30. Agarozni gel sa PCR produktima COI mtDNK vrsta iz roda Praon (prajmeri LCO1490 i HCO2198); Pd - Praon dorsale; Pm - Praon megourae; Pl - Praon longicorne; Pv - Praon volucre; Psp – Praon sp.; Py – Praon yomenae; B - negativna kontrola, 487 - pozitivna kontrola Mecinus janthinus (Curculionidae, Coleoptera), M – marker. Filogenetska analiza izvedena je primenom Neighbor-Joining metoda (NJ) i metoda Maksimalne Parsimonije (MP). Kao spoljna grupa (outgroup) za formiranje stabala upotrebljene su sekvence COI mtDNK vrsta Areopraon silvestre koji pripada istom tribusu Praini i Lysiphlebus fabarum iz iste podfamilije Aphidiinae. Best fit model test prema Akaike Information kriterijumu je ocenio da je Tamura – Nei model najbolji za poreĊenje razlika izmeĊu sekvenci COI mtDNK vrsta iz roda Praon. Na filogenetskom stablu rekonstruisanom NJ metodom u Tamura-Nei modelu, P. volucre, P. longicorne, Praon sp. i P. yomenae su se jasno izdvojile kao zasebne vrste sa 100% bootstrap podrške, dok su se primerci P. dorsale i P. megourae grupisali u okviru jednog taksona (Slika 31). 82 Tabela 19. Pregled jedinki korišćenih u molekularnim analizama Parazitoid Vaš domaćin Biljka domaćin Lokalitet Šifra umnoţen gen COI 28S P. volucre Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija P2 + + P. volucre Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija P5 + - P. longicorne Aulacorthum solani Geum rivale Crna Gora P6 + + P. dorsale Macrosiphum cholodkovskyi Filipendula ulmaria Crna Gora P10/1 + + P10/2 + - P. volucre Acyrthosiphon malvae Geranium robertianum Crna Gora P11 + + P. megourae Megourae viciae Lathyrus pratensis Crna Gora P14 + + P. yomenae Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška P15 + - P. yomenae Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran P17 + + P. yomenae Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran P19 + + P. volucre Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran P20 + + P. yomenae Uroleucon acroptilidis Acroptilon repens Iran P21 + + P. yomenae Uroleucon sp. Acroptilon repens Iran P25 + + P. yomenae Uroleucon sp. Crepis sp. Grĉka P26 + + P. yomenae Aphis nerii Nerium oleander Grĉka P28 + - P. yomenae Macrosiphoniella sanbornii Chrysanthemum sp. Srbija P31 + - P. longicorne Macrosiphum prenanthidis Lonicera nigra Srbija P32/1 + + P32/2 + - P. volucre Nasonovia sp. Hieracium gronovii Francuska P33 + + P33/1 + - P33/2 + - P. volucre Uroleucon sp. Sonchus arvensis Srbija P35 + + P. yomenae Uroleucon sp. Sonchus asper Švajcarska P37 + + P. volucre Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Švajcarska P38 + + P. yomenae Uroleucon sp. Crepis biennis Švajcarska P40 + + P. yomenae Uroleucon sp. Crepis biennis Švajcarska P41 + + P. dorsale Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija P49 + + P. dorsale Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska P62/1 + + P62/2 + + P. volucre Hyperomyzus sp. Lactuca serriola Švajcarska P63/1 - + P63/2 + + P. megourae Megoura viciae Lathyrus sp. Crna Gora P67/1 + - P67/2 + + P. dorsale Corylobium avellanae Corylus avellana Srbija P69/1 + + P69/2 + + 83 Tabela 19 . Pregled jedinki korišĉenih u molekularnim analizama- nastavak *Outgroups korišćene u analizi COI gena # Outgroup korišćena u analizi 28SD2 gena pod prisutpnim šifrom HQ599561 Vrste Praon sp. i P. yomenae izdvojile su se jasno kao jedna filetiĉka grupa, sa 100% bootstrap podrške, dok su P. dorsale+megourae, P. volucre i P. longicorne formirale drugu filetiĉku grupu sa podrškom od 91% (Slika 31). U cilju ocene proseĉne evolutivne divergencije, sekvence COI mtDNK analizirane su unutar i izmeĊu taksona u Tamura–Nei modelu. Broj supstitucija po nukleotidnom mestu unutar taksona u odnosu na proseĉnu divergenciju na nivou svih sekvenci je prikazan u Tabeli 20. Nukleotidne razlike unutar taksona su bile vrlo male, gde je najmanja proseĉna distanca od 0.00 zabeleţena meĊu sekvencama iz P. longicorne grupe, a najveća od 0.004 unutar P. yomenae grupe (Tabela 20). Parazitoid Vaš domaćin Biljka domaćin Lokalitet Šifra umnoţen gen COI 28S Praon sp. Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija P76/1 + - P76/2 + - P. dorsale Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska P78/1 + + P78/2 + + Praon sp. Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija P91/1 + + P91/2 + - P91/3 + + P. dorsale Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska P93/1 + + P93/2 + + P. yomenae Uroleucon jaceae Sonchus oleraceus Iran IR9-1-1 - + IR9-1-2 + + P. yomenae Macrosiphoniella sp. Artemisia sp. Srbija S11-9-1-1 + + S11-9-1-2 + - P. yomenae Uroleucon sp. Centaurea scabiosa Srbija S11-18 + + Areopraon silvestre Periphyllus sp. Acer pseudoplatani Srbija * + - Lysiphlebus fabarum Aphis fabae Chenopodium album Srbija * + - Aphidius colemani HQ599561 HQ599561 / # - + 84 Tabela 20. Ocena evolutivne divergencije sekvenci COI mtDNK unutar taksona iz roda Praon Vrsta stopa nukleotidnih razlika (Tamura-Nei model) P. volucre 0.002 P. longicorne 0.000 P. dorsale+megourae 0.001 P. yomenae 0.004 Praon sp. 0.001 Broj supstitucija po nukleotidnom mestu izmeĊu taksona u odnosu na proseĉnu divergenciju na nivou svih sekvenci se kretao u intervalu od 0.034 do 0.089 (Tabela 21). Primetno je da se genetiĉke distance razlikuju izmeĊu taksona koji na filogenetskim stablima formiraju razliĉite filetiĉke grupe. U okviru filetiĉke grupe koju ĉine P. dorsale+megourae, P. volucre i P. longicorne, nukleotidne razlike se kreću od 0.034 do 0.048, a u filetiĉkoj grupi koju ĉine Praon sp. i P. yomenae 0.047. MeĊutim, razlike su skoro dvostruko veće izmeĊu taksona koji pripadaju razliĉitim filetiĉkim grupama i kreću se od 0.069 izmeĊu Praon sp. i P. volucre, do 0.089 izmeĊu P. yomenae i P. longicorne. Tabela 21. Ocena evolutivne divergencije sekvenci COI mtDNK izmeĊu taksona iz roda Praon Vrsta [1] [2] [3] [4] [5] 1. P. dorsale+megourae - 2. P. volucre 0.034 - 3. P. longicorne 0.048 0.046 - 4. Praon sp. 0.078 0.069 0.076 - 5. P. yomenae 0.083 0.081 0.089 0.047 - Rekonstrukcija filogenetskog stabla primenom metoda maksimalne parsimonije pokazala je iste filogenetske odnose izmedju sekvencioniranih jedinki kao kod Neighbor-Joining metoda, odnosno izdvojilo se 5 istih vrsta sa 99% bootstrap podrške za svaku grupu (Slika 32). Analizom molekularne varijanse (AMOVA) u Arlequin programu, obradjene su sekvence COI mtDNK svih primeraka parazitoida. Sekvence su organizovane u taksone, kako bi AMOVA ocenila inter- i intraspecijsku divergenciju i struktuiranost 85 genetiĉke varijabilnosti. Analizom sekvenci je utvrĊena vrednost Indeksa fiksacije Fst=0.98 za interval pouzdanosti od p=0.0001 (Tabela 22). Vrednost statistike Fst je skoro maksimalna odnosno 1, što ukazuje da su taksoni koji se porede genetski vrlo udaljeni i predstavljaju zasebne vrste. Procenat varijabilnosti u tabeli prikazuje hijerarhiju genetiĉke divergencije kod poreĊenih taksona, odnosno da je varijabilnost izmeĊu taksona P. dorsale, P. megourae, P. volucre, P. longicorne, Praon sp. i P. yomenae statistiĉki znaĉajna i iznosila je 96.5%, dok je varijacija unutar samih taksona iznosila samo 3.5% (Tabela 22). Tabela 22. Genetiĉka struktuiranost populacija taksona iz roda Praon utvrĊena analizom molekularne varijanse sekvenci COI mtDNK (AMOVA) ---------------------------------------------------------------------------------------------- Izvor Suma Kovarijanse Procenat varijabilnosti s.s.* kvadrata varijabilnosti ---------------------------------------------------------------------------------------------- IzmeĊu taksona 4 612.385 17.32999 Va 96.50 Unutar taksona 42 26.424 0.62914 Vb 3.50 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Ukupno 46 638.809 17.95913 100.00 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Indeks fiksacije FST= 0.96497 ---------------------------------------------------------------------------------------------- *stepeni slobode; p≤0.0001 86 P10 2-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P93 1-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P62 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P62 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P10 1-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P49-P. dorsale-M. funestum-Rubus sp. P78 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P14-P. megourae-M. viciae-L. pratensis P78 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P93 2-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P67 2-P. megourae-M. viciae-Lathyrus sp. P69 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P67 1-P. megourae-M. viciae-Lathyrus sp. P69 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P2-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P20-P. volucre-U. sonchi-S. oleraceus P5-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P11-P. volucre-A. malvae-G. robertianum P33 2-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P38-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P63 2-P. volucre-Hyperomyzus sp.-L. serriola P33 1-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P33-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P35-P.volucre-Uroleucon sp.-S. arvensis P32 2-P. longicorne-M. prenanthidis-L. nigra P6-P. longicorne-A. solani-G. rivale P32 1-P. longicorne-M. prenanthidis-L. nigra P91 1-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P91 3-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P91 2-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P76 1-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P76 2-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P15-P.yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis P28-P. yomenae-A. nerii-N. oleander P37-P. yomenae-Uroleucon sp.-S. asper P26-P. yomenae-Uroleucon sp.-Crepis sp. P40-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis P17-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus IR9-1-2-P. yomenae-U. jaceae-S. oleraceus P21-P. yomenae-U. acroptilidis-A. repens P19-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus P25-P. yomenae-Uroleucon sp.-A. repens P31-P. yomenae-M. sanbornii-Chrysanthemum sp. P41-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis S11-9-1-1-P. yomenae-Macrosiphoniella sp.-Artemisia sp. S11-9-1-2-P. yomenae-Macrosiphoniella sp.-Artemisia sp. S11-18-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. scabiosa Areopraon silvestre_Periphyllus sp_Acer pseudoplatanii Lysiphlebus fabarum_Aphis fabae_Chenopodium album Slika 31. Optimalno stablo po Neighbor-Joining metodu sa sumom duţine grana od 0.36. Procenat zajedniĉkog grupisanja sekvenci izveden je pomoću bootstrap testa u 500 replikacija i prikazan je na nivou grananja za vrednosti ≥90%. Na granama su prikazani procenti koji predstavljaju broj stabala u kojima su se ovi taksoni grupisali zajedno. Duţina grane u stablu odgovara evolutivnoj distanci izmedju analiziranih sekvenci, koja je izraţena u odnosu na broj supstitucija. Evolutivne distance su izraĉunate po Tamura-Nei metodu i izraţene u broju supstitucija po nukleotidnom mestu. 87 P10 2-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P49-P. dorsale-M. funestum-Rubus sp. P62 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P93 2-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P78 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P14-P. megourae-M. viciae-L. pratensis P93 1-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P78 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P10 1-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P62 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P69 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P67 1-P. megourae-M. viciae-Lathyrus sp. P67 2-P. megourae-M. viciae-Lathyrus sp. P69 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P11-P. volucre-A. malvae-G. robertianum P20-P. volucre-U. sonchi-S. oleraceus P2-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P5-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P33 1-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P33 2-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P63 2-P. volucre-Hyperomyzus sp.-L. serriola P33-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P35-P.volucre-Uroleucon sp.-S. arvensis P38-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P32 2-P. longicorne-M. prenanthidis-L. nigra P6-P. longicorne-A. solani-G. rivale P32 1-P. longicorne-M. prenanthidis-L. nigra P91 1-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P91 3-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P91 2-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P76 1-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P76 2-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P40-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis P17-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus IR9-1-2-P. yomenae-U. jaceae-S. oleraceus P21-P. yomenae-U. acroptilidis-A. repens P19-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus P25-P. yomenae-Uroleucon sp.-A. repens P26-P. yomenae-Uroleucon sp.-Crepis sp. P15-P.yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis P28-P. yomenae-A. nerii-N. oleander P37-P. yomenae-Uroleucon sp.-S. asper S11-9-1-2-P. yomenae-Macrosiphoniella sp.-Artemisia sp. P31-P. yomenae-M. sanbornii-Chrysanthemum sp. P41-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis S11-9-1-1-P. yomenae-Macrosiphoniella sp.-Artemisia sp. S11-18-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. scabiosa Areopraon silvestre_Periphyllus sp_Acer pseudoplatanii Lysiphlebus fabarum_Aphis fabae_Chenopodium album Slika 32. Optimalno stablo po metodu maksimalne parsimonije je rekonstruisano pomoću bootstrap testa u 500 replikacija i prikazano na nivou grananja za vrednosti ≥90%. Na slici je prikazano prvo od mogućih 199 stabala (duţina=201) rekonstruisanih metodom maksimalne parsimonije. Za sva varijabilna mesta, ukljuĉujući ona informativna za parsimoniju, indeks konzistencije je bio 0.68, indeks retencije 0.95, a kompozitni indeks 0.74. Na granama su prikazani procenti stabala na kojima se odreĊeni taksoni grupišu zajedno. Evolutivne distance su izraĉunate po Close-Neighbor- Interchange algorithmu na nivou 2 i izraţene u broju nukleotidnih supstitucija u odnosu na celu sekvencu. 88 4.3.2. Molekularne analize 28S rRNK vrsta iz roda Praon PCR reakcijom je uspešno umnoţeno 36 sekvenci 28SD2 koje ukljuĉuju vrste Praon dorsale, P. megourae, P. volucre, P. longicorne, Praon sp. i P. yomenae (Slika 33) . Analizom nukleotidnog sastava svih produkata 28SD2 duţine oko 685bp, utvrĊeno je 10 varijabilnih mesta i sva su informativna za parsimoniju. Slika 33. Agarozni gel sa PCR produktima 28SD2 rRNA vrsta iz roda Praon (prajmeri 28SD2f/r); Pd - Praon dorsale; Pv - Praon volucre; Pl - Praon longicorne; Psp – Praon sp.; Py – Praon yomenae; B - negativna kontrola, Pv + - pozitivna kontrola Praon volucre, M – marker. PoreĊenjem nukleotidnih razlika izmeĊu sekvenci unutar vrsta iz roda Praon u Tamura-Nei modelu, utvrĊeno je da se proseĉan broj supstitucija po nukleotidnom mestu u odnosu na celu sekvencu bio izrazito mali, odnosno da se kretao od 0 (kod P. volucre, Praon sp.) do 0.0016 (P. longicorne) (Tabela 23). Drugi ekspanzioni segment 28S rRNA tj. 28SD2 je mnogo konzervativniji u poreĊenju sa COI mtDNK, što se moţe videti u Tabeli 24 sa ocenama evolutivne divergencije izmeĊu vrsta iz roda Praon. Dok su nukleotidne razlike izmeĊu vrsta izraĉunate u Tamura-Nei modelu kod COI u intervalu od 0.034 do 0.089, za 28SD2 sekvence utvrĊen je interval vrednosti od 0.002 do 0.014. 89 Tabela 23. Ocena evolutivne divergencije sekvenci 28SD2 unutar vrsta iz roda Praon Vrsta stopa nukleotidnih razlika (Tamura-Nei model) P. yomenae 0.0006 P. dorsale+megourae 0.0011 P. longicorne 0.0016 P. volucre 0 Praon sp. 0 Filogenetska analiza izvedena je primenom Neighbor-Joining metoda i metoda Maksimalne Parsimonije. Kao spoljna grupa (outgroup) za formiranje stabala korišćena je sekvenca 28SD2 parazitoida Aphidius colemani (Aphidiinae) preuzeta iz banke gena. Tabela 24. Ocena evolutivne divergencije sekvenci 28SD2 izmeĊu vrsta iz roda Praon Vrsta [1] [2] [3] [4] [5] 1. P. yomenae - 2. P. dorsale+megourae 0.014 - 3. P. longicorne 0.010 0.004 - 4. P. volucre 0.012 0.003 0.002 - 5. Praon sp. 0.004 0.010 0.006 0.008 - Na filogenetskom stablu rekonstruisanom NJ metodom u Tamura-Nei modelu, vrste se nisu zasebno izdvojile, već su formirale dve filetiĉke grupe. U prvu filetiĉku grupu su se izdvojile sekvence vrsta P. dorsale, P. megourae P. volucre i P. longicorne, sa 90% bootstrap podrške, a u drugu Praon sp. i P. yomenae sa 92% podrške (Slika 35). Rekonstrukcija filogenetskog stabla primenom metoda maksimalne parsimonije pokazala je izdvajanje iste dve filetiĉke grupe sa 89% bootstrap podrške (Slika 34). Evidentna je komplementarnost grupisanja sekvenci 28SD2 i COI regiona na NJ i MP filogenetskom stablu, odnosno iste vrste iz roda Praon su se grupisale u zasebne filetiĉke grupe, što samo potvrĊuje njihovo zajedniĉko poreklo. 90 P67 2-P. megourae-M. viciae-Lathyrus sp. P93 1-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P62 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P78 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P49-P. dorsale-M. funestum-Rubus sp. P69 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P14-P. megourae-M. viciae-L. pratensis P93 2-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P62 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P78 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P69 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P11-P. volucre-A. malvae-G. robertianum P35-P.volucre-Uroleucon sp.-S. arvensis P63 1-P. volucre-Hyperomyzus sp.-L. serriola P63 2-P. volucre-Hyperomyzus sp.-L. serriola P2-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P33-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P38-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P20-P. volucre-U. sonchi-S. oleraceus P6-P. longicorne-A. solani-G. rivale P10 1-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P10 2-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P32-P. longicorne-M. prenanthidis-L. nigra P91 1-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium P91 3-Praon sp.-S. limonii-L. angustifolium S11-9-1-1-P. yomenae-Macrosiphoniella sp.-Artemisia sp. P26-P. yomenae-Uroleucon sp.-Crepis sp. P17-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus P25-P. yomenae-Uroleucon sp.-A. repens P21-P. yomenae-U. acroptilidis-A. repens P19-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus P41-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis IR9-1-2-P. yomenae-U. jaceae-S. oleraceus S11-18-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. scabiosa P31-P. yomenae-M. sanbornii-Chrysanthemum sp. P37-P. yomenae-Uroleucon sp.-S. asper P40-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis IR9-1-1-P. yomenae-U. jaceae-S. oleraceus HQ599561 Aphidius colemani Slika 34. Optimalno stablo rekonstruisano metodom maksimalne parsimonije. Prikazano je jedno od 570 mogućih stabala (duţina=102). Indeks konzistencije, indeks retencije i indeks kompozicije imaju vrednost 1 za sva nukleotidna mesta pa i ona informativna za parsimoniju. Na granama su prikazani procenti stabala na kojima se odreĊeni taksoni grupišu zajedno u bootstrapp testu (500 replikacija) i prikazan je na nivou grananja za vrednosti ≥90%. Evolutivne distance su izraĉunate po Close- Neighbor-Interchange algorithmu na nivou 2 i izraţene u broju nukleotidnih supstitucija u odnosu na celu sekvencu. 91 P78 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P93 2-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P69 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P93 1-P. dorsale-C.avellanae-C. avellana P78 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P67 2-P. megourae-M. viciae-Lathyrus sp. P62 1-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P49-P. dorsale-M. funestum-Rubus sp. P69 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P14-P. megourae-M. viciae-L. pratensis P62 2-P. dorsale-C. avellanae-C. avellana P35-P.volucre-Uroleucon sp.-S. arvensis P20-P. volucre-U. sonchi-S. oleraceus P63 2-P. volucre-Hyperomyzus sp.-L. serriola P2-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P63 1-P. volucre-Hyperomyzus sp.-L. serriola P33-P. volucre-Nasonovia sp.-H. gronovii P11-P. volucre-A. malvae-G. robertianum P38-P. volucre-Uroleucon sp.-S. oleraceus P6-P. longicorne-A. solani-G. rivale P32-P. longicorne-M. prenanthidis-L. nigra P10 2-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P10 1-P. dorsale-M. cholodkovskyi-F. ulmaria P17-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus P21-P. yomenae-U. acroptilidis-A. repens P25-P. yomenae-Uroleucon sp.-A. repens P41-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis P37-P. yomenae-Uroleucon sp.-S. asper S11-9-1-1-P. yomenae-Macrosiphoniella sp.-Artemisia sp. IR9-1-1-P. yomenae-U. jaceae-S. oleraceus IR9-1-2-P. yomenae-U. jaceae-S. oleraceus P26-P. yomenae-Uroleucon sp.-Crepis sp. P31-P. yomenae-M. sanbornii-Chrysanthemum sp. S11-18-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. scabiosa P19-P. yomenae-U. sonchi-S. oleraceus P40-P. yomenae-Uroleucon sp.-C. biennis HQ599561 Aphidius colemani Slika 35. Optimalno stablo po Neighbor-Joining metodu sa sumom duţine grana od 0.31. Procenat zajedniĉkog grupisanja sekvenci izveden je pomoću bootstrap testa u 500 replikacija i prikazan je na nivou grananja za vrednosti ≥90%. Na granama su prikazani procenti koji predstavljaju broj stabala od ukupno 500 replikacija u kojima su se ovi taksoni grupisali zajedno. Duţina grane u stablu odgovara evolutivnoj distanci izmedju analiziranih sekvenci, koja je izraţena u odnosu na broj supstitucija. Evolutivne distance su izraĉunate po Tamura-Nei metodu i izraţene u broju supstitucija po nukleotidnom mestu. 92 Kako bismo ocenili genetiĉku varijabilnost unutar i izmeĊu filetiĉkih grupa, sekvence 28SD2 su analizirane u Tamura-Nei modelu. Proseĉna evolutivna divergencija sekvenci unutar filetiĉkih grupa iznosila je 0.001 za grupu koju ĉini P. dorsale, P. megourae, P. volucre i P. longicorne, odnosno 0.002 unutar druge grupe koju ĉine Praon sp. i P. yomenae. Divergencija izmeĊu filetiĉkih grupa izraţena u broju supstitucija po nukleotidnom mestu u odnosu na sve sekvence u grupama, iznosila je 0.012. Analiza molekularne varijanse sekvenci 28SD2 utvrdila je vrednost indeksa fiksacije Fst=0.85 za interval pouzdanosti od p=0.05 (Tabela 25). AMOVA je dala istu sliku kao i nukleotidne razlike u Tamura-Nei modelu, jer je utvrĊena genetiĉka varijabilnost izmeĊu filetiĉkih grupa statistiĉki znaĉajna (85.54%), dok je varijacija unutar samih grupa iznosila 14.46% (Tabela 25). Tabela 25. Genetiĉka struktuiranost populacija vrsta iz roda Praon utvrĊena analizom molekularne varijanse sekvenci 28SD2 dve filetiĉke grupe ---------------------------------------------------------------------------------------------- Izvor Suma Kovarijanse Procenat varijabilnosti s.s.* kvadrata varijabilnosti ---------------------------------------------------------------------------------------------- IzmeĊu grupa 1 58.41 3.380 Va 85.54 Unutar grupa 34 19.43 0.571 Vb 14.46 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Ukupno 35 77.84 3.951 100.00 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Indeks fiksacije FST= 0.85538 ---------------------------------------------------------------------------------------------- *stepeni slobode; p≤0.05 93 5. DISKUSIJA U dosadašnjim istraţivanjima utvrĊeno je da postoje mnogobrojni taksonomski problemi unutar roda Praon upravo zbog njegove velike intraspecijske varijabilnosti (Mackauer 1959; Starý 1966a, 1971; Tomanović et al. 2003a, Tomanović et al. 2003b). Jedan od njih je i nerazrešen taksonomski status vrsta kompleksa „dorsale-yomenae“ (Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986; Tomanović et al. 2006), koji je u dosadašnjim studijama okarakterisan kao parafiletiĉka grupa (Tomanović et al. 2006). U ovom radu analizirani su karakteri koji su i do sada korišćeni u kljuĉevima za identifikaciju vrsta ovog roda. Sve analize su uraĊene odvojeno, po polovima, usled postojanja polnog dimorfizma (Mackauer 1996; Teder and Tammaru 2005; Mitrovski Bogdanović et al. 2009) i razliĉitih selekcionih pritisaka na ţenke i muţjake (Mackauer 1996). U ovoj studiji smo, usled biološke kompleksnosti „dorsale-yomenae“ grupe, koristili tri razliĉite metode u cilju utvrĊivanja genetiĉke i morfološke varijabilnosti samog kompleksa vrsta. Upotrebom molekularnih markera i metoda tradicionalne i geometrijske morfometrije analizirali smo mogućnost postojanja „skrivenih“ taksona (sa specifiĉnim obrascima biogeografske distribucije i visokim stepenom specifiĉnosti prema odreĊenim domaćinima), kao i postojanje pouzdanih taksonomskih karaktera koji su dovoljno „dobri“ za njihovu identifikaciju. Rezultati „tradicionalne“ morfometrije ukazuju na postojanje razlika kako meĊu ţenkama, tako i meĊu muţjacima unutar „dorsale-yomenae“ grupe. Analiza varijanse pokazuje statistiĉki znaĉajne razlike meĊu ţenkama svih vrsta za sve karaktere osim za Ptl/Ptw, dok se kod muţjaka pored pomenutog karaktera izdvajaju i F1l/F2l i F1w/F2w kao karakteri koji nemaju statistiĉku znaĉajnost u razdvajanju vrsta. Nivo razlika varira meĊu razliĉitim morfološkim karakterima. Najmanja srednja vrednost duţine tela zabeleţena je kod ţenki vrste Praon sp., a najveća meĊu ţenkama vrste P. longicorne. S obzirom da su vaši iz roda Staticobium na kojima parazitiraju jedinke vrste Praon sp. sitnije od vaši iz roda Macrosiphum, koji su parazitirani vrstom P. longicorne, potvrĊuje se komplementarnost rezultata ove studije sa rezultatima dobijenim u studiji Cloutier i saradnici (2000) da veliĉina tela parazitoida unutar podfamilije Aphidiinae zavisi od veliĉine tela domaćina. Nešto drugaĉiji rezultati dobijeni su kod muţjaka, gde se vrsta Praon sp. izdvaja po najvećoj srednjoj vrednosti duţine tela, a P. volucre po najmanjoj. 94 Broj ĉlanaka maksilarnih (MP) i labijalnih (LP) palpusa predstavljaju najstabilnije karaktere u celom uzorku (MP=4, LP=3) osim kod jedinki vrste Praon sp. koja se na osnovu analiziranih karaktera jasno izdvaja od ostalih (MP=3, LP=2). Na osnovu naših rezultata zakljuĉujemo da pomenute karaktere i dalje treba koristiti u sliĉnim studijama, a u prilog tome ide i ĉinjenica da broj ĉlanaka maksilarnih i labijalnih palpusa moţe biti jedan od pouzdanih karaktera za morfološku diferencijaciju unutar vrsta roda Aphidius (Petrović et al. 2009). Vrsta Praon sp. se pokazala kao najkonzervativnija za veći broj karaktera, dok je najvarijabilnija vrsta bila P. yomenae. Diskriminantnom kanonijskom analizom, kojom se maksimalizuje meĊugrupno u odnosu na unutargrupno variranje karaktera, utvrĊeno je koji karakteri doprinose diskriminaciji vrsta. Na osnovu diskriminantne analize utvrĊeno je da razdvajanju ţenki vrste P. megourae od ţenki vrsta P. yomenae i P. volucre najviše doprinose karakteri F1l/F1w i F1w/F2w, dok se ţenke vrste Praon sp. od ostalih analiziranih vrsta diskriminišu po osobinama Petl/Petw2, F1l/F1w i F2l/F2w. Kod muţjaka je, na osnovu srednjih vrednosti osobina u prostoru definisanom CV osama, uoĉeno razdvajanje jedinki vrste Praon sp. i to po karakterima F2l/F2w i Petl/Petw2. Kod svih ostalih vrsta uoĉena je velika varijabilnost i visok stepen preklapanja na osnovu analiziranih morfoloških karaktera. Karakteri kao što su broj antenalnih segmenata, F1l/F1w, F1l/F2l, Ptl/Ptw, Ptl/Mtl, duţina radijalnog nerva, kao i Petl/Petw1 su se u dosadašnjim morfometrijskim analizama roda Praon izdvojili kao najvalidniji karakteri za rešavanje taksonomskih problema unutar „dorsale-yomenae“ kompleksa (Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986; Kavallieratos et al. 2003; Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b; Kavallieratos et al. 2005; Tomanović et al. 2006). Na osnovu naših rezulatata zapaţa se da veliki procenat ukupnih razlika meĊu analiziranim taksonima nose sledeći karakteri: F1l/F1w, F1w/F2w, F2l/F2w, Petl/Petw1, Petl/Petw2 od kojih karakteri F1w/F2w, F2l/F2w, Petl/Petw2 nisu do sada korišćeni u sliĉnim studijama. Ostali karakteri usled velike varijabilnosti nisu bili dovoljno informativni za morfološku karakterizaciju „dorsale-yomenae“ grupe. Na osnovu dobijenih rezultata za ţenke napravljeno je poreĊenje sa poslednjom revizijom „dorsale-yomenae“ kompleksa (Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986): 95 P. dorsale: F=18-20 (19-20), F1l/F1w=5.95±0.47 (6), F1l/F2l=1.47±0.08 (1/3), Ptl/Ptw=3.74±0.30 (3), Ptl/Mtl=1.43±0.17 (MtlPetw1), mezoskutum uniformno dlakav, M1 obezbojen, Im obojen; P. longicorne: F=20-21 (21-23), F1l/F1w=5.90±0.42 (5), F1l/F2l=1.41±0.11 (2/3), Ptl/Ptw=3.89±0.36 (3), Ptl/Mtl=1.34±0.21 (Mtl=Ptl) (R=Ptl), Petl/Petw1=1.37±0.10 (Petl≥Petw1), mezoskutum uniformno dlakav, M1 obezbojen, Im obojen; P. yomenae: F=17-20 (18-19), F1l/F1w=5.44±0.49, F1l/F2l=1.35±0.09, Ptl/Ptw=3.94±0.40, Ptl/Mtl=1.59±0.21 (RPetw1), mezoskutum sa lateralnim regijama bez dlaka, M1 i Im pokazuju razliĉite obrasce obojenosti (M1 i Im su obezbojeni). Geometrijskom morfometrijom je pokazano da su razlike u veliĉini i obliku krila kod analiziranih vrsta znaĉajne kod oba pola, pri ĉemu su utvrĊeni razliĉiti meĊusobni odnosi kao i razliĉiti obrasci promena oblika krila ţenki i muţjaka. Pregledom dobijenih rezultata uoĉeno je da postoji znaĉajna varijacija u obliku krila jedinki izmeĊu vrsta, polova i da postoji znaĉajna interakcija vrsta × pol. Varijabilnost u obliku krila izmeĊu polova ukazuje na statistiĉki znaĉajan polni dimorfizam, dok statistiĉki znaĉajna interakcija vrsta × pol ukazuje na postojanje razlika izmeĊu vrsta u polnom dimorfizmu u obliku krila. Izraĉunavanjem indeksa polnog dimorfizma u veliĉini (ISSD) i u obliku krila (ISShD) uoĉava se statistiĉki znaĉajna razlika u obliku krila izmeĊu polova unutar vrsta P. yomenae, P. longicorne, P. megourae i P. volucre, pri ĉemu je pravac promena oblika krila izmeĊu ţenki i muţjaka u najvećoj meri uslovljen promenom duţine radijalnog nerva, kao i promenom duţine i širine krila. Za vrste P.dorsale i Praon sp. nije utvrĊen statistiĉki znaĉajan dimorfizam u obliku krila. Analiza varijanse ne ukazuje na statistiĉki znaĉajne razlike u veliĉini krila izmeĊu polova. Same vrednosti ISSD pokazuju da nivo SSD-a ne varira znaĉajno meĊu vrstama, ali se moţe zapaziti da najmanju vrednost ISSD ima polifagna vrsta P. volucre, dok je najveći ISSD dobijen kod monofagne vrste P. megourae. Mitrovski Bogdanović i saradnici (2009) su ukazali na to da su ţenke roda Ephedrus krupnije u odnosu na muţjake, ali da imaju manja krila, pri ĉemu ISSD znaĉajno varira meĊu razliĉitim 96 domaćinima. Iako je pokazano da su ţenke generalno krupnije od muţjaka (Hurlbutt 1987), postoje izuzeci gde su muţjaci upravo krupniji pol (Godfray 1994). Studije koje se odnose na problematiku polnog dimorfizma ukazuju na to da stepen SSD-a moţe zavisiti od veliĉine domaćina (Mackauer 1996), ali i da su ţenke i muţjaci pod razliĉitim selekcionim pritiscima (Mackauer 1996; Mackauer and Völkl 2002). TakoĊe, ovaj problem postaje još kompleksniji unutar podfamilije Aphidiinae upravo zbog postojanja kompleksnog ţivotnog ciklusa, efekta domaćina, kao i zbog toga što meĊu parazitoidima postoji tendencija da su ţenke krupnije (Charnov 1982; Jarošik et al. 2003). Ţenke i muţjaci vrste Praon sp. se jasno razlikuju od ostalih analiziranih vrsta po najmanjoj veliĉini krila, što se podudara sa rezultatima tradicionalne morfometrije u pogledu duţine tela. Najveća varijabilnost u veliĉini krila uoĉena je kod ţenki vrsta P. volucre i P. dorsale. Multivarijantnom analizom varijanse utvrĊeno je i postojanje statistiĉki znaĉajnih razlika u obliku krila meĊu razliĉitim vrstama ţenki i muţjaka. Obrasci promena oblika krila se razlikuju kod muţjaka i ţenki što potvrĊuje postojanje razliĉitih selekcionih pritisaka na polove (Mackauer 1996). Da bismo utvrdili koje promene u obliku krila najviše doprinose razdvajanju analiziranih vrsta izvršena je diskriminantna kanonijska analiza za ţenke i muţjake (CVA). Duţ prve kanonijske ose dolazi do jasnog razdvajanja ţenki vrsta P. yomenae, P. megourae i Praon sp. od ţenki vrste P. longicorne koja se jasno izdvaja u zasebnu grupu. Ovakve promene oblika krila, koje su uoĉene i kod muţjaka istih vrsta, u najvećoj meri su posledica promena duţina radijalnog i povratnog nerva. Razdvajanje ţenki Praon sp. preko P. yomenae pa sve do P. megourae po CV2 osi je pored promene duţine radijalnog nerva uslovljeno i neznatnom promenom duţine pterostigme. U razdvajanju muţjaka vrsta P. volucre, P. longicorne i P. yomenae od vrste P. megourae po CV2 najviše udela pored promena duţine radijalnog nerva, imaju i promena duţine drugog sektora kubitalnog nerva, kao i promena duţine i širine pterostigme. Po CV2 osi uoĉavamo i veliku unutarspecijsku varijabilnost muţjaka unutar vrste P. megourae. Na osnovu analiza oblika krila uoĉavamo jasno razdvajanje vrsta P. yomenae, P. longicorne, P. megourae i Praon sp. Analize oblika krila ne prepoznaju vrste P. dorsale i P. volucre kao validne taksone usled postojanja velike unutarspecijske varijabilnosti i 97 njihovog meĊusobnog preklapanja. Iako su dosadašnje studije (Mackauer 1959; Watanabe and Takada 1964; Tomanović et al. 2003b; Kavallieratos et al. 2004b; Kavallieratos et al. 2005; Tomanović et al. 2006), kao i rezultati tradicionalne morfometrije i molekularnih analiza prikazane u okviru ove studije pokazale da je reĉ o jasno definisanim taksonima, ovakvi rezultati se mogu objasniti delovanjem razliĉitih selekcionih pritisaka i zajedniĉkom ekološkom nišom koju oni zazuzimaju (Tremblay and Pennacchio 1988). Eksplorativne analize varijabilnosti (PCA) unutar vrsta koje parazitiraju dva ili većem broj domaćina ukazuju na to da domaćin utiĉe na unutargrupnu varijabilnost vrsta P. dorsale i P. longicorne pri ĉemu se jasno uoĉava da promena duţine radijalnog i povratnog nerva, kao i duţine i širine pterostigme doprinose varijabilnosti u obliku krila. Ţikić i saradnici (2009) su potvrdili da je morfološka varijabilnost unutar podfamilije Aphidiinae posledica znaĉajnog efekta domaćina. U okviru vrste P. yomenae uoĉena je najveća varijabilnost u veliĉini i obliku krila, kao i veliki stepen preklapanja meĊu razliĉitim biotipovima tako da efekat domaćina nema statistiĉku znaĉajnost, ali su zato pokazane statistiĉki znaĉajne razlike u veliĉini i obliku krila u zavisnosti od efekta geografske distribucije. Evropske populacije muţjaka i ţenki se jasno razlikuju po veliĉini i obliku krila od populacija Bliskog i Dalekog istoka, pri ĉemu se populacije Dalekog istoka izdvajaju u zasebnu grupu po najmanjoj veliĉini krila. Najinformativniji karakteri u njihovom razdvajanju bili su duţina radijalnog i povratnog nerva, kao i duţina pterostigme. Najuoĉljivija promena u obliku krila i muţjaka i ţenki je promena u duţini radijalnog nerva-R (Slika 36, 37 i 38) koji se i u dosadašnjim studijama pokazao kao validan karakter u razdvajanju taksona (Tremblay and Pennachio 1985; Tremblay et al. 1986), te ga iz tih razloga moţemo smatrati pouzdanim karakterom u taksonomskim studijama roda Praon. TakoĊe, duţina povratnog (intermedijalnog) nerva-Im se pokazao kao dovoljno informativan karakter za razdvajanje vrsta „dorsale-yomenae“ grupe na osnovu promena u obliku krila (Slika 36, 37 i 38). Ovaj karakter se do sada nije ukljuĉivao u morfometrijske analize roda Praon, te se iz tih razloga moţe razmatrati kao mogući novi karakter u kljuĉevima za identifikaciju. Varijabilnosti oblika krila kod muţjaka doprinosi u izvesnoj meri i promena duţine drugog sektora kubitalnog nerva. Pomenuti karakteri (radijalni, povratni nerv i drugi sektor kubitalnog 98 nerva) nisu analizirani tradicionalnom morfometrijom. Odnos duţina pterostigme i metakarpalnog nerva, kao i odnos duţine i širine pterostigme koji su u dosadašnjim studijama predstavljali dobre karaktere za razdvajanje vrsta unutar roda Praon (Tremblay and Pennachio 1985; Mescheloff and Rosen 1988; Kavallieratos et al. 2003; Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b; Kavallieratos et al. 2005; Tomanović et al. 2006) ovde se nisu pokazali informativnim na osnovu rezultata tradicionalne morfometrije. Ostale brojne i znaĉajne promene u obliku krila (promene odnosa površina iznad i ispod radijalnog nerva, promene površina donjeg dela krila itd.) nije bilo moguće utvrditi tradicionalnom morfometrijom. Ovo potvrĊuje znatno veću osetljivost geometrijske morfometrije i njen veći potencijal u detekovanju promena u odnosu na tradicionalnu morfometriju, kao što su istakli i Ţikić i saradnici (2009). Barkoding region odnosno sekvence COI gena mitohondrijalne DNK su pogodan marker za uspešnu identifikaciju taksona iz roda Praon do nivoa vrsta. Na filogenetskim stablima rekonstruisanim na osnovu ovog gena uoĉava se jasno izdvajanje P. volucre, P. longicorne, P. yomenae i Praon sp. kao zasebnih vrsta. Iako su sekvencirani primerci vodili poreklo sa razliĉitih domaćina i geografski razliĉitih regiona, intraspecijska genetiĉka varijabilnost je bila vrlo mala, od 0 kod P. longicorne do 0.4% kod P. yomenae. Praon megourae se nije izdvojila kao zasebna vrsta, već se sa P. dorsale grupisala u okviru istog taksona, sa varijabilnošću sekvenci od svega 0.1% na nivou cele grupe. Visoka divergencija na mitohondrijalnoj DNK izmeĊu taksona u rasponu od 3.4% izmeĊu P. dorsale+megourae i P. volucre do 8.9% izmeĊu P. yomenae i P. longicorne, znaĉajan je dokaz da su u pitanju dobre vrste. Uzimajući u obzir da je standardna stopa mutacija kod artropoda na mitohondrijalnoj DNK od 2.15% (DeSalle et al. 1987; Brower 1994) ekvivalentno periodu razdvajanja od milion godina, moţemo zakljuĉiti da su se vrste iz roda Praon razdvojile pre nekoliko miliona godina. Svi taksoni su se grupisali u okviru istog roda, s tim da su se vrste Praon sp. i P. yomenae izdvojile kao jedna, a P. dorsale+megourae, P. volucre i P. longicorne kao druga filetiĉka grupa. U poreĊenju sa genetskom varijabilnošću unutar grupa, evolutivne distance su skoro dvostruko veće izmeĊu vrsta koji pripadaju razliĉitim filetiĉkim grupama i kreću se od 6.9% izmeĊu Praon sp. i P. longicorne, do 8.9% izmeĊu P. yomenae i P. longicorne. To jasno ukazuje da su vrste u okviru filetiĉkih grupa srodnije i da dele zajedniĉkog pretka. 99 Zbog svoje konzervativnosti, nuklearni gen 28S rDNK se koristi za filogeniju viših taksona. PoreĊenjem sekvenci 28SD2 regiona vrsta iz roda Praon, potvrĊeno je da svi taksoni pripadaju istom rodu. Samo 10 nukleotidnih promena u sekvencama je zabeleţeno, a evolutivne distance su iznosile od 0.2% do 1.4%. Na filogenetskim stablima nije došlo do izdvajanja taksona u zasebne vrste, već su se sekvence 28SD2 izdvojile u dve filetiĉke grupe, jednu koju ĉine P. dorsale+P. megourae, P. volucre i P. longicorne, a drugu Praon sp. i P. yomenae. Evidentna je komplementarnost grupisanja sekvenci 28SD2 i COI regiona na filogenetskim stablima, odnosno iste vrste iz roda Praon su se grupisale u zasebne filetiĉke grupe, što samo potvrĊuje njihovo zajedniĉko poreklo. Mala varijabilnost sekvenci 28S rDNK unutar roda Praon, u evolutivnom smislu pokazuje da su to relativno mlade vrste, što je u saglasnosti sa divergencijom na mitohondrijalnom genu i procenom da su se vrste razdvojile pre nekoliko miliona godina. S druge strane, iako je nuklearni gen konzervativniji u poreĊenju sa mitohondrijalnom DNK, dve filetiĉke grupe su se jasno izdvojile sa velikom podrškom. To ukazuje da je u odreĊenom trenutku došlo do razdvajanja dve evolutivne linije u okviru roda Praon, koje su nastavile paralelnu genetiĉku diversifikaciju u pravcu formiranja zasebnih filetiĉkih grupa i specijacije. Na osnovu rezultata tradicionalne morfometrije postavlja se pitanje validnosti do sada korišćenih morfoloških karaktera za diferencijaciju vrsta „dorsale-yomenae“ kompleksa, a posebno karaktera krilne nervature, koji su najdostupniji i najviše zastupljeni u kljuĉevima za identifikaciju (Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986; Kavallieratos et al. 2003; Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b; Kavallieratos et al. 2005; Tomanović et al. 2006). PoreĊenjem krilne nervature sekvenciranih primeraka P. yomenae, utvrĊeno je znaĉajno variranje u obojenosti prve abscise medijalnog nerva (M1) i intermedijalnog (povratnog) nerva (Im). Kao jedan od najpouzdanijih karaktera za identifikaciju vrste P. yomenae korišćena je obezbojenost dva prethodna nerva (Tremblay and Pennacchio 1985; Tremblay et al. 1986; Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b). U originalnom opisu taksona (Takada 1968) navodi se kao jedan od dijagnostiĉkih karaktera potpuna obezbojenost povratnog nerva. MeĊutim, poreĊenjem krilne nervature sekvenciranih primeraka P. yomenae, grupisanih u jednu filetiĉku liniju sa podrškom od 100% na osnovu COI mitohondrijalnog gena i 100 92% na osnovu 28S D2 gena, uoĉavamo primerke sa obezbojena oba nerva, sa jasno obojenim povratnim nervom ili delimiĉno obojenom prvom abscisom medijalnog nerva i delimiĉno obojenim povratnim nervom (Slika 36). Iz navedenog je jasno da se ovaj karakter ne moţe pouzdano koristiti u kljuĉevima za identifikaciju vrsta P. yomenae. Primerci sa obojenim povratnim nervom i delimiĉno obojenom prvom abscisom medijalnog nerva imaju veoma sliĉan obrazac nervature kod polifagne vrste P. volucre (Slika 37). Obrazac krilne nervature vrsta P. dorsale i P. longicorne je stabilan (obezbojena prva abscisa medijalnog nerva i obojen povratni nerv) (Slika 37 i 38) i u skladu sa poslednjom revizijom (Tremblay and Pennacchio 1985). Na osnovu rezultata molekularne analize potvrĊen je status P. longicorne, P. yomenae i P. volucre kao dobrih vrsta (Tremblay and Pennacchio 1985; Tomanović et al. 2003a; Tomanović et al. 2003b; Kavalieratos et al. 2004b; Kavalieratos et al. 2005; Tomanović et al. 2006). Molekularnim analizama potvrĊen je status vrste P. dorsale koja nije toliko retka vrsta u evropskim okvirima, kao što se pretpostavljalo (Tremblay and Pennacchio 1985), i koja je više puta sinonimizirana sa vrstom P. longicorne. Pored već utvrĊene asocijacije Corylobium avellanae/Corylus avellana (Tremblay and Pennacchio 1985) utvrĊeni su novi domaćini/asocijacije za vrstu P. dorsale: Macrosiphum funestum/Rubus spp. i Macrosiphum cholodkovskyi/Filipendula ulmaria. Prvi opis vrste P. megourae dao je Starý (1971) naglasivši da je reĉ o taksonu sliĉnom vrsti P. dorsale, ali da se ipak razlikuju po broju antenalnih segmenata, duţini metakarpalnog nerva, dlakavosti propodeuma i krugu domaćina. U poreĊenju sa originalnim opisom vrste P. megourae (Starý 1971) prikazani su rezultati na osnovu morfometrijskiih analiza: antene filiformne, F1 ţute boje, F=19-21 (F=19-20), F1l/F1w=6.46±0.72 (F1l/F1w=5), F1l/F2l=1.50±0.06 (F1l/F2l=1/5), Ptl/Ptw=4.00±0.30 (Ptl/Ptw=3.5-4), Ptl/Mtl=1.32±0.14 (Ptl/Mtl=1/3), Petl/Petw1=1.27±0.09 (Petl/Petw1=1/6), mezoskutum sa lateralnim regijama bez dlaka, Im obezbojen, duţina tela 2.05-3.2mm (2.2-2.6mm). Na osnovu dobijenih rezultata moţemo zakljuĉiti da se vrsta P. megourae razlikuje u odnosu na vrstu P. dorsale na osnovu broja antenalnih segmenata (19-21 naspram 18-20), odnosa duţine i širine prvog flagelarnog segmenta-F1l/F1w (6.46 naspram 5.95), na osnovu duţine metakarpalnog nerva-Ptl/Mtl (1.32 naspram 1.43), kao 101 i na osnovu dlakavosti mezoskutuma (lateralne regije bez dlaka naspram uniformne dlakavosti vrste P. dorsale). (Prilog 2). Obrazac obojenosti M1 i Im nerva je veoma sliĉan izmeĊu vrsta P. dorsale i P. megourae (Slika 37 i 38). PotvrĊeno je da je vrsta P. megourae monofagna vrsta koja parazitira na vaši Megourae viciae sa Lathyrus spp. Iako vrsta P. megourae pokazuje morfološku diferencijaciju u odnosu na druge vrste, molekularni markeri je ne prepoznaju kao validan takson, već ga grupišu zajedno sa vrstom P. dorsale. Morfometrijske i genetiĉke analize Aphidius rhopalosiphi- uzbekistanicus kompleksa vrsta (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) ukazale su na sliĉan problem (Kos et al. 2011; Tomanović et al. 2012). Taĉnije, geometrijska morfometrija na osnovu oblika pterostigme ukazuje na morfološku diferencijaciju vrsta Aphidius avenaphis i Aphidius uzbekistanikus, ali se na osnovu analize COI gena one grupišu zajedno i pretpostavlja se da su u pitanju konspecifiĉne vrste. Ovakvi rezultati se mogu objasniti time da obrazac genetiĉke i fenotipske evolucije unutar podfamilije Aphidiinae moţe biti razliĉit izmeĊu srodnih vrsta koje dele iste ili sliĉne ekološke niše (Tremblay and Pennacchio 1988), imaju sliĉne biološke i ekološke odlike (Nemec and Starý 1983, 1984) i sliĉnu morfologiju (Pennacchio and Tremblay 1987). 102 Slika 36. Varijabilnost krilne nervature jedinki vrste P. yomenae korišćenih u molekularnim analizama. Strelice ukazuju na obrasce obojenosti M1 i Im nerva 103 Slika 37. Varijabilnost krilne nervature jedinki vrsta P. dorsale i P.volucre korišćenih u molekularnim analizama. Strelice ukazuju na obrasce obojenosti M1 i Im nerva 104 Slika 38. Varijabilnost krilne nervature jedinki vrsta P. longicorne, P.megourae i Praon sp. korišćenih u molekularnim analizama. Strelice ukazuju na obrasce obojenosti M1 i Im nerva 105 5.1. Opis nove vrste U analizama je korišćen i takson u asocijaciji sa srodnom grupom domaćina kao i P. yomenae, ali se po morfološkim karakterima nije mogao grupisati ni sa jednom od analiziranih vrsta. Rezultati morfometrijskih i molekularnih analiza jasno su ukazali da se radi o novoj vrsti za nauku. Praon sp. n. – kratak opis vrste (Slika 39): Slika 39. Delovi tela vrste Praon sp.: a-glava, b-krilo, c-antena, d-mezoscutum, e- propodeum, f-petiolus, g-legalica, h-genitalije muţjaka 106 Antene filiformne, ½ F1 ţute boje, F=16-17 (F=19-20), F1l/F1w=5-6.71, F2l/F2w=2.7-3.88, F1l/F2l=1.32-1.56, F1w/F2w=0.7-0.89, nema mirisnih brazdi na F1, F2 ima 1-3 mirisne brazde, maksilarnih palpusi 3-segmentisani, labijalni palpusi 2- segmentisani, Ptl/Ptw=3.13-5, Ptl/Mtl=1.53-2.08, Petl/Petw1=1.11-1.63, mezoskutum sa lateralnim regijama bez dlaka, M1 i Im nervi su obezbojeni, broj spinova na ovoju legalice 2, duţina tela 1.75-2.75mm. Nova vrsta je dobijena iz veoma specifiĉne asocijacije afidnog domaćina, Staticobium limonii i halofitne biljke Limonium angustifolium, sa podruĉja slovenaĉkog primorja. Pretpostavljamo da je usled specifiĉnih ekoloških zahteva navedene asocijacije došlo do reproduktivne izolacije i specijacije unutar „dorsale-yomenae“ kompleksa. 107 6. ZAKLJUČCI 1. Diskriminantnom kanonijskom analizom utvrĊeno je da veliki procenat ukupnih razlika meĊu ţenkama i muţjacima nose sledeći karakteri: odnos duţine i širine prvog antenalnog segmenta, odnos širina prvog i drugog antenalnog segmenta, odnos duţine i širine drugog flagelarnog segmenta, odnos duţine i širina petiolusa u nivou spirakuluma i u osnovi. Njihovom primenom moguće je razlikovati ţenke vrsta P. megourae, P. volucre, P. yomenae i Praon sp., kao i muţjake Praon sp. 2. Broj ĉlanaka maksilarnih i labijalnih palpusa predstavljaju najstabilnije karaktere u celom uzorku. Njihov broj je konstantan u okviru ove grupe (kod svih analiziranih jedinki 4 i 3, kod Praon sp. 3 i 2). 3. Geometrijskom morfometrijom je pokazano da za razliku od polnog dimorfizma u obliku krila, ne postoji statistiĉki znaĉajan dimorfizam u veliĉini krila. 4. PCA analize ukazuju na znaĉajan efekat domaćina na unutargrupnu varijabilnost vrsta P. dorsale i P. longicorne. 5. Unutar vrste P. yomenae postoji statistiĉki znaĉajan efekat geografske distribucije na varijabilnost u obliku krila, na osnovu koga se evropske populacije jasno razdvajaju od populacija Bliskog i Dalekog istoka. Jedinke sa Bliskog istoka nisu pokazale znaĉajne evolutivne distance u sekvencama COI i 28S u odnosu na evropske populacije, već su se grupisale zajedno u okviru istog taksona. 6. Analizom oblika krila pokazano je da je najvarijabilniji deo krila „dorsale-yomenae“ grupe duţina radijalnog nerva te ga iz tih razloga moţemo smatrati pouzdanim karakterom u taksonomskim studijama pomenute grupe. TakoĊe, kao dovoljno informativni karakter za razdvajanje vrsta „dorsale-yomenae“ grupe izdvaja se i duţina povratnog nerva (Im) koji moţe predstavljati novi karakter u kljuĉevima za identifikaciju. 108 7. Usled velikog variranja u obojenosti prve abscise medijalnog nerva (M1) i povratnog (Im) nerva ovi karakteri se ne mogu pouzdano koristiti u kljuĉevima za identifikaciju vrsta P. yomenae. Unutar vrsta P. volucre, P. dorsale, P. longicorne i P. megourae pomenuti karakteri su pokazali veću stabilnost. Na osnovu vrednosti odnosa duţine pterostigme i metakarpalnog nerva izdvajaju se vrste P. yomenae i Praon sp. sa najkraćim, odnosno vrste P. longicorne i P. megourae sa najduţim metakarpalnim nervom. 8. Obrazac obojenosti prvog antenalnog ĉlanka unutar svih analiziranih taksona se, usled njegove stabilnosti, i dalje moţe koristiti u kljuĉevima za identifikaciju. TakoĊe, odnos duţine i širine prvog antenalnog ĉlanka moţe biti pouzdan karakter u identifikaciji svih analiziranih taksona. 9. Uoĉeni su razliĉiti obrasci dlakavosti mezoskutuma unutar vrsta P. dorsale i P. volucre zbog ĉega se ovaj karakter ne moţe smatrati pouzdanim u morfološkoj diferencijaciji pomenutih vrsta. Ovaj karakter se i dalje moţe koristiti u kljuĉevima za identifikaciju kod vrsta P. yomenae, P. megourae i P. longicorne. 10. Vrste P. dorsale i P. longicorne se mogu meĊusobno razlikovati na osnovu broja antenalnih segmenata, kao i na osnovu duţine metakarpalnog nerva. 11. Vrsta P. yomenae se u odnosu na ostale analizirane taksone izdvaja po broju antenalnih segmenata, obrascu dlakavosti mezoskutuma, duţini metakarpalnog nerva, kao i po duţinama radijalnog i povratnog nerva. 12. Na osnovu rezultata molekularne analize potvrĊen je status vrsta P. longicorne, P. yomenae, P. volucre i P. dorsale. 13. Analize filogenetskih odnosa unutar „dorsale-yomenae“ grupe na osnovu COI i 28S gena ukazuju na izdvajanje dve filetiĉke linije: jednu ĉine jedinke P. dorsale+megourae, P. volucre i P. longicorne, a drugu Praon sp. i P. yomenae. 109 14. UtvrĊeni su novi domaćini/asocijacije za vrstu P. dorsale: Macrosiphum funestum/Rubus spp. i Macrosiphum cholodkovskyi/Filipendula ulmaria. 15. Vrsta P. megourae i pored morfološke diferencijacije u odnosu na druge vrste se po rezultatima molekularnih analiza grupiše zajedno sa vrstom P. dorsale. Na osnovu dobijenih rezultata tradicionalne morfometrije moţemo zakljuĉiti da se vrsta P. megourae razlikuje u odnosu na vrstu P. dorsale na osnovu broja antenalnih segmenata, odnosa duţine i širine prvog flagelarnog segmenta, na osnovu duţine metakarpalnog nerva, kao i na osnovu dlakavosti mezoskutuma. Obrazac obojenosti prve abscise medijalnog nerva (M1) i povratnog nerva (Im) je veoma sliĉan izmeĊu vrsta P. dorsale i P. megourae, ali se zato moţe zapaziti da vrsta P. megourae ima duţi povratni i metakarpalni nerv. 16. UporeĊivanjem rezultata „tradicionalne“ i geometrijske morfometrije sa rezultatima analize dva genska regiona (COI mtDNK i 28S D2) utvĊeno je da je Praon sp. nova vrsta za nauku koja se i morfološki i genetiĉki razlikuje od ostalih taksona „dorsale- yomenae“ grupe. Nova vrsta je dobijena iz veoma specifiĉne asocijacije afidnog domaćina, Staticobium limonii i halofitne biljke Limonium angustifolium, sa podruĉja slovenaĉkog primorja. 17. Dobijeni rezultati varijabilnosti oblika krila ukazuju na veliki znaĉaj geometrijske morfometrije i njen potencijal u detekovanju morfološke varijabilnosti, odnosno kriptiĉke specijacije kod insekata parazitoida. 18. Kombinacijom „tradicionalne“ morfometrije, geometrijske morfometrije i molekularnih metoda pokazano je da je moguće istraţiti morfološku i molekularnu varijabilnost unutar „dorsale-yomenae“ grupe. 110 7. LITERATURA Antolin M. F., Bjorksten T. A. and Vaughn T. T. (2006): Host-related fitness trade-offs in a presumed generalist parasitoid, Diaeretiella rapae (Hymenoptera: Aphidiidae). Ecological Entomology, 31: 242-254 Aslan M. M., Uygun N. and Starý P. (2004): A Survey of Aphid Parasitoids in Kahramanmaras, Turkey (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae; and Hymenoptera: Aphelinidae). Phytoparasitica, 32 (3): 255-263 Atanassova P. V. (1997): Checklist of the subfamily Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae) from Bulgaria. Zoologische Mededlingen, 71 (24): 287-290 Atanassova P., Brookes C. P., Loxdale H. D. and Powell W. (1998): Electrophoretic study of five aphid parasitoid species of the genus Aphidius (Hymenoptera, Braconidae), including evidence for reproductively isolated sympatric populations and a cryptic species. Bulletin of Entomological Research, 88: 3-13 Aytekin A. M., Terzo M., Rasmont P. and Çaġatay N. (2007): Landmark based geometric morphometric analysis of wing shape in Sibiricobombus Vogt (Hymenoptera: Apidae: Bombus latreille). Annales de la Société Entomologique de France, 43: 95-102 Barahoei H., Madjdzadeh S. M., Mehrparvar M. and Starý P. (2010) : A study of Praon Haliday (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) in South-East Iran with two new records. Acta entomologica serbica, 15 (1): 107-120 Barcazk T. (1993): The parasitoid guilds of aphids from the Uroleucon genus (Hymenoptera: Parasitica; Homoptera: Aphididae). Polskie Pismo Entomologiczne, 30: 3-8 Basibuyuk H. H. and Quicke D. L. J. (1995): Morphology of antenna cleaner in the Hymenoptera with particular reference to non-aculeate families (Insecta). Zoologica Scripta, 24: 157-177 111 Basibuyuk H. H. and Quicke D. L. J. (1997): Hamuli in the Hymenoptera (Insecta) and their phylogenetic implications. Journal of Natural History, 31: 1563-1585 Battaglia D., Poppy G. M., Powell W., Romano A., Tranfaglia A. and Pennachio F. (2000): Physical and chemical cues influencing the ovoposition behaviour of Aphidius ervi. Entomologia experimentalis et Applicata, 94: 219-227 Baylac M., Villemant C. and Simbolotti G. (2003): Combining geometric morphometrics with pattern recognition for the investigation of species complexes. Biological Journal of the Linnean Society, 80: 89-98 Becerra J. M. and Valdecasas A. G. (2004): Landmark superimposition for taxonomic identification. Biological Journal of the Linnean Society, 81: 267-274 Behura S. K: (2006): Molecular marker systems in insects: current trends and future avenues. Molecular Ecology, 15: 3087-3113 Belshaw R. and Quicke D. L. J. (1997): A Molecular Phylogeny of the Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 7:281-293 Belshaw R., Fitton M., Herniou E., Gimeno C. and Quicke D. L. J. (1998): A phylogenetic reconstruction of the Ichneumonoidea (Hymenoptera) based on the D2 variable region of 28S ribosomal RNA. Systematic Entomology, 23: 109-123 Belshaw R., Dowton M., Quicke D. L. J. and Austin A. D. (2000): Estimating ancestral geographical distributions: a Gondwanan origin for aphid parasitoids? Proceedings of the Royal Society B, 267: 491-496 Blair C. P., Abrahamson W. G., Jackman J. A. and Tyrrell L. (2005): Cryptic speciation and host-race formation in a purportedly generalist tumbling flower beetle. Evolution, 59(2): 304–316 112 Boness M. and Starý P. (1988): Aphid parasitoid in river flood debris (Hymenoptera: Aphidiidae). Entomologia Generalis, 13: 251-254 Bookstein F. L. (1989): Principal warps: thin-plate splines and the decomposition of deformations. IEEE Transactions on Patterns Analysis and Machine Intelligence, 11: 567-585 Bookstein F. L. (1996): Combining the tools of geometric morphometrics. In: Marcus L. F., Corti M., Loy A., Nayulor G.J.P. and Slice D. E. (eds.). Advances in morphometrics. Plenum Press, New York, pp. 131-151 Bosch R. V. D., Schlinger E. I., Dietrick E. J. Hagen K. S. and Holloway J. K. (1959): The colonization and establishment of imported parasites of the spotted alfaalfa aphid in California. Journal of Economic Entomology, 52: 136-141 Brower A. V. Z. (1994): Rapid morphological radiation and convergence among races of the butterfly Heliconius erato inferred from patterns of mitochondrial DNA evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA,91: 6491-6495 Cameron S. A. (1993): Multiple origins of advanced eusociality in bees inferred from mitochondial DNA sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences USA (PNAS), 90: 8687-8691 Campbell B. C., Steffen-Campbell J. D. and Werren J. H. (1993): Phylogeny of the Nasonia species complex (Hymenoptera: Pteromalidae) inferred from an internal transcribed spacer (ITS2) and 28SrDNA sequences. Insect Molecular Biology, 2: 225–237 Carver M. (1984): The potential hosta ranges in Australia of some imported aphid parasites (Hymenoptera: Ichneumonoidea: Aphidiinae). Entomophaga, 29: 351-359 Castro L. R. and Dowton M. (2006): Mitochondrial genomes in the Hymenoptera and their utility as phylogenetic markers. Systematic Entomology, 1-10 113 Caterino M. S., Cho S. and Sperling F. A. H. (2000): The Current State Of Insect Molecular Systematics: A Thriving Tower of Babel. Annual Review of Entomology, 45: 1–54 Charnov E. L. (1982): The theory of sex allocation. Princeton University Press, Princeton, New Jersey Charnov E. L., Los-den-Hartogh R. L., Jones W. T. and van dem Assem J. (1981): Sex ratio evolution in a variable environment. Nature (London), 289: 27-33 Chau A. and Mackauer M. (2000): Host-instar selection in the aphid parasitoid Monoctonus paulensis (Hymenoptera: Braconidae,Aphidiinae): a preference for small pea aphids. European Journal of Entomology, 97: 347-53 Chen Y., Giles K. L. and Greenstone M. H. (2002): Molecular Evidence for a Species Complex in the Genus Aphelinus (Hymenoptera: Aphelinidae) with Additional Data on Aphidiine Phylogeny (Hymenoptera: Braconidae). Annals of the Entomological Society of America, 95 (1): 29-34 Chen X. X., Piao M. H., Whitfield J. B. and He J. H. (2003): A molecular phylogeny of the subfamily Rogadinae (Hymenoptera: Braconidae) based on D2 variable region of 28S ribosomal RNA. Acta Entomologica Sinica, 46 (2): 209-217 Cho L. (1984): The phylogeny of Aphidiidae (Hymenoptera) of Taiwan. Journal of Agricultural Research of China, 33: 437-446 [in Chineese] Chow F. J. and Mackauer M. (1986): Host discrimination and larval competitions in the aphid parasite Ephedrus californicus baker. Entomologia experimentalis et Applicata, 41: 243-254 Cloutier C., Dupperon J., Tertuliano M. and McNeil J. N. (2000): Host instar, body size and fitness in the koinobiotic parasitoid Aphidius nigripes. Entomologia Experimentalis et Applicata, 97 (1): 29-40 114 Cohen J. E., Jonsson T., Müller C. B., Godfray H. C. J. and Savage van M. (2005): Body sizes of hosts and parasitoids in individual feeding relationships. PNAS, 102: 684-689 Combes S. A. and Daniel T. L. (2003): Flexural stiffness in insect wings I. scaling and the influence of wing venation. The Journal of Experimental Biology, 206: 2979-2987 Ĉapek M. (1970): A new classification of the Braconidae (Hymenoptera) based on cephalic structures of the final instar larva and biological evidence. The Canadian Entomologist, 102: 846-875 Dahlsten D. L., Zuparko R. L., Hajek A. E., Rowney D. L. and Dreistadt S. H. (1999): Long-term sampling of Eucallipterus tiliae (Homoptera: Drepnosiphidae) and associated natural enemies in a northern California site. Environmental Entomology, 28: 845-850 Darsouei R., Karimi J. and Modarres-Awal M. (2011): Parasitic wasps as natural enemies of aphid populations in the Mashhad region of Iran: New data from DNA barcodes and SEM. Archives of Biological Science, 63 (4): 1225-1234 Dawson G. W., Griffits D. C., Merritt L. A., Mudd A., Picket J. A., Wadhams L. J. and Woodcock C. M. (1990): Aphid semiochemicals review, and recent advances on the sex feromone. Journal of Chemical Ecology, 16: 3019-3030 Derocles S. A. P., Le Ralec A., Plantegenest M., Chaubet B., Cruaud C., Cruaud A. and Rasplus J. Y. (2012a) : Identification of molecular markers for DNA barcoding in the Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae). Molecular Ecology Resources, 12 (2): 197-208 Derocles S. A. P., Plantegenest M., Simon JC., Taberlet P. and Le Ralec A. (2012b): A universal method for the detection and identification of Aphidiinae parasotoids within their aphid hosts. Molecular Ecology Resources, in press 115 DeSalle R., Freedman T., Prager E. M. and Wilson A. C. (1987): Tempo and model of sequence evolution in mitochondrial DNA of Hawaiian Drosophila. Journal of Molecular Evolution, 26: 157-164 Desneux N., Starý P., Delebecque C. J., Gariepy T. D., Barta R. J., Hoelmer K. A. and Heimpel G. E. (2009): Cryptic Species of Parasitoids Attacking the Soybean Aphid (Hemiptera: Aphididae) in Asia: Binodoxys communis and Binodoxys koreanus (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Annals of the Entomological Society of America, 102 (6): 925-936 Dolphin K. and Quicke D. L. J. (2001): Estimating the global species richness of an incompletely described taxon: an example using parasitoid wasp (Hymenoptera: Braconidae). Biological Journal of the Linnean Society, 73: 279-286 Doutt R. L. (1959): The biology of parasitic Hymenoptera. Annual Review of Entomology, 4: 161-182 Dowton M. and Austin A. D. (1994): Molecular phylogeny of the insect order Hymenoptera: Apocritan relationhips. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 91: 9911-9915 Dowton M. and Austin A. D. (1997a): The Evolution of Strand-Specific Compositional Bias. A Case Study in the Hymenopteran Mitochondrial 16S rRNA Gene. Molecular Biology and Evolution,14 (1): 109-112 Dowton M. and Austin A. D. (1997b): Evidence for AT-Transversion Bias in Wasp (Hymenoptera: Symphyta) Mitochondrial Genes and Its Implications for the Origin of Parasitism. Journal of Molecular Evolution, 44: 398-405 Dowton M. and Austin A. D. (1998): Phylogenetic Relationship among the Microgastroid Wasps (Hymenoptera: Braconidae): Combined Analysis of 16S and 28S 116 rDNA Genes and Morphological Data. Molecular Phylogenetics and Evolution, 10 (3): 354-366 Dowton M., Austin A.D. and Antolin M. F. (1998): Evolutionary relationships among the Braconidae (Hymenoptera:Ichneumonoidea) inferred from partial 16S rDNA gene sequences. Insect Molecular Biology, 7(2):129-150 Dowton M. and Austin A. D. (2001): Simultaneous analysis of 16S, 28S, COI and morphology in the Hymenoptera: Apocrita - evolutionary transitions among parasitic wasps. Biological Journal of the Linnean Society, 74:87-111 Dowton M., Belshaw R., Austin A. D. and Quicke D. L. J. (2002): Simultaneous Molecular and Morphological Analysis of Braconid Reationships (Insecta: Hymenoptera: Braconidae) Indicates Independent mt-tRNA Gene Inversions Within a Single Wasp Family. Journal of Molecular Evolution, 54: 210-226 Dransfield R. D. (1979): Aspects of host-parasitoid interactions of two aphid parasitoids, Aphidius urticae (Hal.) and Aphidius uzbekistanicus Luz. (Hymenoptera, Aphidiidae). Ecological Entomology, 4:307-316 Dres M. and Mallet J. (2002): Host races in plant-feeding insects and their importance in sympatric speciation. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B, 357: 471-492 Dryden I. L. and Mardia K. V. (1998): Statistical Shape Analysis. John Wiley and Sons, New York Eastop V. F. and Emden H. F. (1972): The insect material. In: van Emden H. F. (ed.), Aphid Technology. Academic Press, London, pp. 1-45 117 Edson K. M. and Vinson S. B. (1979): A comparative morphology of the venom apparatus of female braconids (Hymenoptera: Braconidae). The Canadian Entomologist, 111: 1013-1024 Excoffier L., Laval G. and Schneider S. (2005): Arlequin ver. 3.0: An integrated software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online, 1:47-50 Fallahzadeh M. and Saghaei N. (2010): Checklist of Braconidae (Insecta: Hymenoptera) from Iran. Munis Entomology and Zoology, 5 (1): 170-186 Finlayson T. (1990): The systematics and taxonomy of final instar larvae of the family Aphidiidae (Hymenoptera). Memoirs of the Entomological Society of Canada, 152: 3-74 Fletcher J. P., Hughes J. P. and Harvey I. F. (1994): Life expectancy and egg load affect ovoposition decisions of a solitary parasitoid. Proceedings of the Royal Society (London), B 258: 163-167 Folmer O., Black M., Hoeh W., Lutz R. and Vrijenhoek R. (1994): DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(5): 294-299 Gärdenfors U. (1986): Taxonomic and biological revision of Palearctic Ephedrus (Haliday) (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Entomologica Scandinavica Supplement, 27: 1-95 Gaston K. J. (1991): The Magnitude of Global Insect Species Richness. Conservation Biology, 5: 283–296 Gauld I. D. (1988): Evolutionary patterns of host utilization by ichneumonoid parasitoids (Hymenoptera: Ichneumonidae and Braconidae). Biological Journal of the Linnean Society, 35: 351–377 118 Gibson G. A. P. (1985): Some pro- and mesothoracic structures important for phylogenetic analysis of Hymenoptera, with review of terms used for structures. The Canadian Entomologist, 117: 1395-1443 Gimeno C., Belshaw R. and Quicke D. L. J. (1997): Phylogenetic relationships of the Alysiinae/Opiinae (Hymenoptera: Braconidae) and the utility of cytohrome b, 16S and 28S D2 rRNA. Insect Molecular Biology, 6 (3): 273-284 Godfray H. C. J. (1994): Parasitoids. Behavioral and Evolutinary Ecology. Princeton University Press, Princeton, NJ, 473 pp Goodall C. R. (1991): Procrusets methods in the statistical analysis of shape. Journal of Royal Statistical Society B, 53: 285-339 Greenstone M. H. (2006): Molecular methods for assessing insect parasitism. Bulletin of Entomological Research, 96: 1-13 Griffiths D. C. (1960): The behaviour and specifity of Monoctonus paludum Marshall (Hymenoptera, Braconidae), a parasite of Nosonovia ribis-nigri (Mosley) on lettuce. Bulletin of Entomological Research, 51: 303-319 Griffiths D. C. (1961): The development of Monoctonus paludum Marshall (Hymenoptera, Braconidae) in Nosonovia ribis-nigri on lettuce, and immunity reactions in other lettuce aphids. Bulletin of Entomological Research, 52: 147-163 Hagvar E. B. and Hofsvang T. (1991): Aphid parasitoids (Hymenoptera: Aphidiidae) biology, host selection, and use in biological control. Biocontrol News and Information, 12: 13-41 He X. Z., Teulon D. A. J. and Wang Q. (2006): Ovoposition strategy of Aphidius ervi (Hymenoptera: Aphidiidae) in response to host density. New Zeland Plant Protection, 59: 190-194 119 Hebert P. D. N. and Gregory T. R. (2005): The promise of DNA barcoding for taxonomy. Systematic Biology, 54: 852-859 Hebert P. D. N., Cywinska A., Ball S. L. and de Waard J.R. (2003): Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B, 270: 313-321. Heimpel G. E. and Lundgren J. G. (2000): Sex ratios of commercially reared biological control agents. Biological Control, 19: 77-93 Hildebrands A., Thieme T. and Vidal S. (2000): Which factors govern the host preference of aphid parasitoids when offered host races of an aphid species? In: Austin A. D. and Dowton M. (eds.). Hymenoptera: evolution, biodiversity and biological control. Csiro Publishing, Science, pp. 359-370 Hoffmann M. P. and Frodsham A. C. (1993): Natural enemies of vegetable insect pests. Ithaca, NY, Cooperative Extension, Cornell University, 63 p. Hofsvang T. and Hagvar B. E. (1986): Ovoposition behaviour of Ephedrus cerasicola (Hymenoptera, Aphidiidae) parasitizing different instars of its aphid hosts. Entomophaga, 31: 261-267 Horn D. J. (1984): Vegetational complexity and parasitation of green peach aphids [Myzus persicae (Silzer) (Homoptera:Aphididae)] on collards. Journal of the New York Entomological Society, 92: 19-26 Höller C. A. (1991): Evidence for the existence of a species closely related to the cereal aphid parasitoid Aphidius rhopalosiphi De Stefani-Perez based on host ranges, morphological characters, isoelectric focusing banding patterns, cross-breeding experiments and sex pheromone specificities (Hymenoptera, Braconidae, Aphidiinae). Systematic Entomology, 16: 15-28 120 Höller C., Borgemeister C., Haardt H. and Powell W. (1993): The relationship between primary parasitoids and hyperparasitoids of cereal aphids: An analysis of field data. Journal of Animal Ecology, 62: 12-21 Hughes R. D. (1989): Biological control in the open field. In: Minks A. K. and Harrewijn P. (eds.). World Crop Pest. Aphids. Their Biology, Natural Enemies and Control, Vol. C. Amsterdam, Elsevier, pp. 167-198 Hurlbutt B. (1987): Sexual size dimorphism in parasitoid wasps. Biological Journal of the Linnean Society, 30: 63-89 Jarošik V. V., Holý I., Lapchin L. and Havelka J. (2003): Sex ratio in the aphid parasitoid Aphidius colemani (Hymenoptera: Braconidae) in relation to host size. Bulletin of Entomological Research, 93 (3): 255-258 Johnson J. W. (1987): Revision of the species of Praon Haliday in North America North of Mexico (Hymenoptera: Aphidiidae). The Canadian Entomologist, 119: 999-1025 Kambhampati S., Völkl W. and Mackauer M. (2000): Phylogenetic relationship among genera of Aphidiinae (Hymenoptera:Braconidae) based on DNA sequence of the mitochondrial 16S rRNA gene. Systematic Entomology, 25:437-445 Kavallieratos N. G. and Lykouressis D. P. (1999): Parasitoids (Hymenoptera: Braconidae) emerged from aphids (Homoptera: Aphidoidea) on citrus and their frequency in Greece. Bollettino del Laboratorio di Entomologia Agraria „Filippo Silvestri“, 55: 93-104. Kavallieratos N. G. and Lykouressis D. P. (2000): Two new species of Praon Haliday (Hymenoptera: Aphidiidae) from Greece. Entomologia Hellenica, 13: 5-12 121 Kavallieratos N. G., Lykouressis D. P., Sarlis G. P., Stathas G. J., Sanchis Segovia A. and Athanassiou C. G. (2001): The Aphidiinae (Hymenoptera: Ichneumonoidea: Braconidae) of Greece. Phytoparasitica, 29: 306-340 Kavallieratos N. G., Athanassiou C. G., Stathas G. J. and Tomanović Ţ. (2002): Aphid parasitoids (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) on citrus: seasonal abundance, association with the species of host plant and sampling indices. Phytoparasitica, 30: 365-377 Kavallieratos N. G., Athanassiou C. G. and Tomanović Ţ. (2003): A new species and key to Greek Praon Haliday (Hymenoptera, Braconidae, Aphidiinae). Mitteilungen aus dem Museum für Naturkunde in Berlin-Deutsche Entomologische Zeitschrift,50 (1): 13-22 Kavallieratos N. G., Stathas G. J. and Tomanović Ţ. (2004a): Seasonal abundance of parasitoids (Hymenoptera: Braconidae, Aphidiinae) and predators (Coleoptera: Coccinelidae) of aphids infesting citrus in Greece. Biologia, Bratislava, 59/2: 191-196 Kavallieratos N. G., Tomanović Ţ., Starý P., Athanassiou C. G., Sarlis G. P., Petrović O., Niketić M. and Veroniki M. A. (2004b): A survey of aphid parasitoid (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) of Southeastern Europe and their aphid-plant associations. Applied Entomology and Zoology, 39 (3): 527-563 Kavallieratos N. G., Tomanović Ţ., Starý P., Athanassiou C. G., Fasseas C., Petrović O. and Stanisavljević Lj. (2005): Praon Haliday (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) of Southeastern Europe: key, host range and phylogenetic relationship. Zoologischer Anzeiger, 243: 181-209 Kendall D. G. (1977): The Diffusion of Shape. Applied Probability, 9: 428-430 Kierych E. (1975): Contribution to the knowledge of Polish Aphidiidae (Hymenoptera). Fragmenta Faunistica, 20: 233-246 (In Polish) 122 Klingauf F. (1966): Abwehr- und Meidereaktionen von Blattläusen (Aphididae) bei Bedrohung durch Räuber und Parasiten. Zeitschrift für Angewandte Entomologie, 60: 269-317 Klingenberg C. P. (2002): Morphometrics and the role of phenotype in studies of the evolution of developmental mechanisms. Gene, 287: 3-10 Klingenberg C. P. (2011): MorphoJ: an integrated software package for geometric morphometrics. Molecular Ecology Resources, 11: 353-357 Klingenberg C. P. and Zaklan S. D. (2000): Morphological Integration between Developmental Compartments in the Drosophila Wing. Evolution, 54(4): 1273-1285 Klingenberg C. P. and Monteiro L. R. (2005): Distances and directions in multidimensional shape spaces: implications for morphometric applications. Systematic Biology, 54: 678-688 Klingenberg C. P., Leamy L. J., Routman E. J. and Cheverud J.. M. (2001): Genetic architecture of mandible shape in mice: Effects of quantitive trait loci analyzed by geometric morphometrics. Genetics, 157: 785–802 Kos K., Tomanović Ţ., Petrović-Obradović O., Laznik Ţ., Vidrih M. and Trdan S. (2008): Aphids (Aphidiidae) and their parasitoids in selected vegetable ecosystems in Slovenia. Acta agriculturae Slovenica, 91 (1): 15-22 Kos K., Petrović A., Starý P., Kavallieratos N. G., Ivanović A., Toševski I., Jakše J., Trdan S. and Tomanović Ţ. (2011): On the Identity of Cereal Aphid Parasitoid Wasps Aphidius uzbekistanicus, Aphidius rhopalosiphi, and Aphidius avenaphis (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) by Examination of COI Mitochondrial Gene, Geometric Morphometrics, and Morphology. Annals of the Entomological Society of America, 104(6): 1221-1232 123 Lajeunesse M. J. and Forbes M. R. (2002): Host range and local parasite adaptation. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Biological Sciences, 269: 703- 710 Lawrence P. O. (1986): Host-parasite hormonal interactions: an overview. Journal of Insect Physiology 32,4: 295-298 Le Ralec A., Anselme C., Outreman Y., Poirié M., van Baaren J., Le Lann C. and van Alphen J. J. M. (2010): Evolutionary ecology of the interactions between aphids and their parasitoids. Comptes Rendus Biologies, 333: 554-565 Liu S. S. and Hughes R. D. (1984): Effects of host age at parasitization by Aphidius sonchi on the development, survival and reproduction of the sowthistle aphid, Hyperomyzus lactucae. Entomologica Experimentalis et Applicata, 36:231-238 Liu S. S. and Carver M. (1985): Studies of the biology of Aphidius sonchi Marshall (Hymenoptera, Aphdiidae), a parasite of the sowthistle aphid, Hyperomyzus lactucae (L. ) (Homoprtera, Aphididae). Bulletin of Entomological Research, 75: 199-208 Losey J. E. and Denno R. F. (1998): The escape response of pea aphids to foliar- foraging predators: factors affecting dropping behaviour. Ecological Entomology, 23: 53-61 Lozan A., Belokobylskij S., van Achterberg C. and Monaghan M. T. (2010): Diversity and distribution of Braconidae, a family of parasitoid wasps in the Central European peatbogs of South Bohemia, Czech Republic. Journal of Insect Science, 10, article 16 available online: insectscience.org/10.16 Lykouressis D., Garantonakis N., Perdikis D., Fantinou A. and Mauromoustakos A. (2009): Effect of female size on host selection by koinobiont insect parasitoid (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). European Journal of Entomology, 106: 363-367 124 Mackauer M. (1959): Die europäischen Arten der Gattungen Praon and Areopraon (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Beiträege zur Entomologie, 9: 819-865 Mackauer M. (1961a): Die Type der Unterfamilie Aphidiinae des Britischen Museums London. Beiträge zur Entomologie, 11: 96-154 Mackauer M. (1961b): Die Gattungen der Familie Aphidiidae und ihre verwandtschaftliche Zuordnung (Hymenoptera: Ichneumonoidea). Beiträege zur Entomologie, 11: 792-803 Mackauer M. (1963): A re-examination of C. F. Baker‟s collection of aphid parasites (Hymenoptera: Aphidiidae). The Canadian Entomologist, 95: 921-935 Mackauer M. (1965): Parasitological data as an aid in aphid classification. The Canadian Entomologist, 97: 1016-1024 Mackauer M. (1968): Hymenopterorum Catalogous. Pars 3, Aphidiidae. Dr W. Junk, Gravenhage, pp. 1-103 Mackauer M. (1983): Determination of parasite preference by choice tests: the Aphidius smithi (Hymenoptera, Aphidiidae)-pea aphid (Homoptera, Aphididae) model. Annals of the Entomological Society of America, 76: 256-261 Mackauer M. (1986): Growth and developmental interactions in some aphids and their hymenopterous parasiets. Journal of Insect Physiology, 32 (4):275-280 Mackauer M. (1996): Sexual size dimorphism in solitary parasitoid wasps: Influence of host quality. Oikos, 76: 265-272 Mackauer M. and Kambhampati S. (1988): Parasitism of aphid embryos by Aphidius smithi: Some effects of extremely small host size. Entomologia Experimentalis et Applicata, 49:167-173 125 Mackauer M. and Starý P.(1967): Index of entomophagous insects. In: Delucchi V. and Remaudière G. (eds.). Hymenoptera: Ichneumonoidea, World Aphidiidae. Le Francois, Paris, pp. 1-167 Mackauer M. and Völkl W. (2002): Brood-size and sex-ratio variation in field populations of three species of solitary aphid parasitoids (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Oecologia, 131: 296-305 Mackauer M., Michaud J. P. and Völkl W. (1996): Host choise by aphidiid parasitoids (Hymenoptera: Aphidiidae): host recognition, host quality and host value. The Canadian Entomologist, 128 (6): 959-980 Mahuku G. S. (2004): A Simple Extraction Method Suitable for PCR Based Analysis of Plant, Fungal, and Bacterial DNA. Plant Molecular Biology Reporter, 22: 71–81 Mardulyn P. and Whitfield J. B. (1999): Phylogenetic Signal in the COI, 16S and 28S Genes for Inferring Relationship among Genera of Microgastrinae (Hymenoptera: Braconidae): Evidence of a High Diversification Rate in This Group of Parasitoids. Molecular Phylogenetics and Evolution, 12 (3): 282-294 Marshall T. A. (1891): Braconides. In: André E. (ed.). Species des Hyménoptéres d‟ Europe et d‟ Algérie (5). Gray: Bouffaut Frères, pp. 1-635 McBrien H. and Mackauer M. (1991): Decision to superparasitize based on larval survival: competition between aphid parasitoids Aphidius ervi and Aphidius smithi. Entomologia Experimentalis et Applicata, 59: 145-150 Michaud J. P. and Mackauer M. (1994): The use of visual cues in host evaluation by aphidiid wasps. I. Comparison between three Aphidius parasitoids of the pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata, 70: 273-283 126 Michaud J. P. and Mackauer M. (1995): The use of visual cues in host evaluation by aphidiid wasps. II. Comparison between Ephedrus californicus, Monoctonus paulensis and Praon pequodorum. Entomologia Experimentalis et Applicata, 74: 267-275 Minks A. K. and Harrewijn P. (1988): Aphids, their biology, natural enemies and control. World Crop Pest 2B. Amsterdam, Elsevier: 364 p. Mitić-Muţina N. i Srdić, Ţ (1977): Rasprostranjenost i prirodni neprijatelji Macrosiphum (Sitobion) avenae Fabr. (Homoptera: Aphidoidea) u Jugoslaviji. Zaštita bilja 28, 141: 255-267 (in Serbian) Mitrovski-Bogdanović A., Ivanović A., Tomanović Ţ., Ţikić V., Starý P. and Kavallieratos N. G. (2009): Sexual dimorphism in Ephedrus persicae (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae): intraspecific variation in size and shape. The Canadian Entomologist, 141: 550-560 Mescheloff E. and Rosen D. (1988): Biosystematic studies on the Aphidiidae of Israel (Hymenoptera: Ichneumonoidea).2. The genera Ephedrus and Praon. Israel Journal of Entomology, 22: 61-73 Mescheloff E. and Rosen D. (1990): Biosystematic studies on the Aphidiidae of Israel (Hymenoptera: Ichneumonoidea).4. The genera Pauesia, Diaeretus, Aphidius and Diaeretiella. Israel Journal of Entomology, 24: 51-91 Muratori F., Le Ralec A., Lognay G. and Hance T. (2006): Epicuticular factors involved in host recognition for the aphid parasitoid Aphidius rhopalosiphi. Journal of Chemical Ecology, 32: 579-593 Nei M. and Kumar S. (2000): Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, New York. 127 Nemec V. and Starý P. (1983): Genetic polymorphism in Aphidius ervi Hal. (Hymenoptera: Aphidiidae), an aphid parasitoid on Microlophium carnosum (Bckt.) Zeitschrift für Angewandte Entomologie, 95: 345-350 Nemec V. and Starý P. (1984): Utilization of isozyme analysis in the research on population diversity of aphid parasitoids (Hymenoptera: Aphidiidae). Zeitschrift für Angewandte Entomologie, 98: 150-159 O‟ Donnell D. J. (1989): A morphological and taxonomic study of first instar larvae of Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae). Systematic Entomology, 14: 197-219 Ortiz-Rivas B., Moya B. and Martinez-Torres D. (2004): Molecular systematics of aphids (Homoptera: Aphidiidae): new insights from the long-wavelenght opsin gene. Molecular Phylogenetics and Evolution, 30: 24-37 Ölmez S. and Ulusoy M. R. (2003): A Survey of Aphid Parasitoids (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) in Diyarbakır, Turkey. Phytoparasitica, 31 (5): 524-528 Paik Jong-Cheol (1975): Key to genera and species of Aphidiidae (Hymenoptera) in Korea. The Korean Journal of Entomology, 5:27-37 Pennacchio F. and Tremblay E. (1987): Byosistematic and morphological study of two Aphidius ervi Haliday “biotypes” with the description of a new species. Bollettino del Laboratorio di Entomologia Agraria “Filippo Silvestri”di Portici, 43: 105-117 Perez S. I., Bernal V. and Gonzalez P. N. (2006): Differences between sliding semi- landmark methods in geometric morphometrics, with an application to human craniofacial and dental variation. Journal of Anatomy, 208: 769-784 Petrović O. (1992): Vaši strnih ţita Srbije. Magistarska teza, Poljoprivredni fakultet, Beograd (in Serbian) 128 Petrović A., Tomanović Ţ., Kavallieratos N. G., Starý P. and Ţikić V. (2009): Aphidius geranii sp.n. (Hymenoptera: Braconidae) from Southeast Europe – a new member of the Aphidius urticae s.str. group. Entomologica fennica, 20:233–238 Pike K. S. and Starý P. (1995): New species of parasitic wasps attacking cereal aphids in the Pacific Northwest (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Journal of Kansas Entomological Society, 68: 408-414 Pike K. S., Starý P., Miller T., Graff G., Allison D., Boydston L. and Miller R. (2000): Aphid parasitoids (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) of Northwest USA. Proceedings of the Entomological Society of Washington, 102: 688-740 Poppy G. M., Powell W. and Pennacchio F. (1997): Aphid parasitoid responses to semiochemicals- genetic, conditioned or learnt? Entomophaga, 42 (1/2): 193-197 Porter E. E. and Hawkins B. A. (1998): Patterns of diversity for aphidiine (Hymenoptera:Braconidae) parasitoid assemblages on aphids (Homoptera). Oecologia, 116: 234-242 Powel W. and Wright A. F. (1991): The influence of host food plants on host recognition by four aphidiine parasitoids (Hymenoptera: Braconidae). Bulletin of Entomological Research, 81 (4):449-453 Pretorius E. (2005): Using geometric morphometrics to investigate wing dimorphism in male and females of Hymenoptera – a case study based on the genus Tachysphex Kohl (Hymenoptera: Sphecidae: Larrinae). Australian Journal of Entomology, 44: 113-121 Pungerl N. B. (1986): Morphometric and electrophoretic study of Aphidius species (Hymenoptera: Aphidiidae) reared from a variety of aphid hosts. Systematic Entomology, 11 (3): 327–354 129 Quicke D. L. J. (1993): The polyphyletic origin of endoparasitism in the cyclostome lineages of Braconidae (Hymenoptera): a reassessment. Zoologische Mededlingen, 67 (10): 159-177 Quicke D. L. J. (1997): Parasitic Wasps. Chapman and Hall, London, 470 pp Quicke D. L. J. and Achterberg van C. (1990): Phylogeny of the subfamilies of the family Braconidae (Hymenoptera: Ichneumonoidea). Zoologische Verhandelingen, 258 (1): 1-95 Quicke D. L. J. , Fitton M. G and Ingram S. (1992a): Phylogenetic implications of the structure and distribution of ovipositor valvilli in the Hymenoptera (Insecta). Journal of Natural History, 26: 587-608 Quicke D. L. J. , Ingram S. N., Baillie H. S. and Gaitens P. V. (1992b): Sperm structure and ultrastructure in the Hymenoptera (Insecta). Zoologica Scripta, 21: 381–402 Quicke D. L. J., Tunstead J., Falco J. V. and Marsh P. M. (1992c): Venom gland and reservoir morphology in the Doryctinae and related braconid wasps (Insecta, Hymenoptera, Braconidae). Zoologica Scripta, 21: 403–416 Quicke D. L. J., Basibuyuk H. H., Fitton M. G. and Rasnitsyn A. P. (1999): Morphological, palaentological and molecular aspects of ichneumonoid phylogeny (Hymenoptera, Insecta). Zoologica Scripta, 28 (1-2): 175-202 Quicke D. L. J., Fitton M. G., Notton D. G., Broad G. R. and Dolphin K. (2000): Phylogeny of the subfamilies of Ichneumonidae (Hymenoptera): a simultaneous molecular and morphological analysis. In: Austin A. D. and Dowton M. (eds.). Hymenoptera: evolution, biodiversity and biological control. Csiro Publishing, Science, pp. 74-83 130 Quicke D. L. J., Smith M. A., Janzen D., Hallwachs W., Fernandez-Triana J., Laurenne N. M., Zaldívar-Riverón A., Shaw M., Broad G. R., Klopfstein S., Shaw S. R., Hrcek J., Hebert P. D. N., Miller S. E., Rodriguez J. J., Whitfield J. B., Sharkey M. J., Sharanowski B. J., Jussila R., Gauld I. D., Chesters D. and Vogler A. (2012): Utility of the DNA barcoding gene fragment for parasitic wasp phylogeny (Hymenoptera: Ichneumonoidea): data release and new easure of taxonomic congruence. Molecular Ecology Resources (in press) Raychaudhuri D. (1990): Aphidiids (Hymenoptera) of Northeast India.155 pp. U.S.A. Rehman A. (1999): The host relationship of aphid parasitoids of the genus Praon (Hymenoptera: Aphidiidae) in agro-ecosystems. PhD Thesis, University of Reading, Reading UK, p. 291 Rehman A. and Powell W. (2010): Host selection behaviour of aphid parasitoids (Aphidiidae: Hymenoptera). Journal of Plant Breeding and Crop Science, 2 (10): 299- 311 Rodríguez M. Á. and Hawkins B. A. (2000): Diversity, function and stability in parasitoid communities. Ecology Letters, 3: 35-40 Rohlf F. J. (2005): TpsDig program, version 2.04, Ecology and Evolution, SUNY at Stony Brook. (http://life.bio.sunysb.edu/morph/) Saitou N. and Nei M. (1987): The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution, 4: 406-425 Sanchis A., Latorre A., Gonzáles-Candelas F. and Michelena J.M. (2000): An 18S rDNA-Based Molecular Phylogeny of Aphidiinae (Hymenoptera:Braconidae). Molecular Phylogenetics and Evolution, 14 (2):180-194 Schlinger E. I. and Hall J. C. (1960): The biology, behaviour and morphology of Praon palitans Muesebeck, an internal parasite of the spotted alphalpha aphid, Therioaphis 131 maculate (Buckton) (Hymenoptera, Braconidae, Aphidiinae). Annals of the Entomological Society of America, 53:144-160 Sekhar P. S. (1957): Mating, ovoposition and discrimination of hosts by Aphidius testaceipes (Cresson) and Praon aguti Smith, primary parasites of aphids. Annales Entomological Society of America, 50: 370-375 Shaw M. R. and Huddleston T. (1991): Classification and biology of braconid wasps (Hymenoptera, Braconidae). Royal Entomological Society of London 7, 11: 1-126 Sheets H. D. (2000): Integrated Morphometrics Package (IMP). http://www2.canisius.edu/~sheets/ Shi M. and Chen, X. X. (2005a): Molecular differentiation of the microgastrine species commonly found in paddy fields from Southeast Asia, with additional data on their phylogeny (Hymenoptera: Braconidae). Insect Science, 12: 155-162 Shi M. and Chen X. X. (2005b): Molecular phylogeny of the Aphidiinae (Hymenoptera:Braconidae) based on DNA sequences of 16S rRNA, 18S rDNA i ATPaese 6 genes. European Journal of Entomology, 102:133-138 Shi M., Chen X. X. and van Achterberg C. (2005): Phylogenetic relationship among the Braconidae (Hymenoptera:Ichneumonidea) inferred from partial 16S rDNA, 28S rDNA D2 i 18S rDNA gene sequences and morphological characters. Molecular Phylogenetics and Evolution, 37:104-116 Shingleton A. W., Mirth C. K. and Bates P. W. (2008): Developmental model of static allometry in holometabolous insect. Proceedings of the Royal Society B, 275: 1875- 1885 Smith P. T. (1944): The Aphidiinae of North America (Braconidae: Hymenoptera). Ohio State Univ. Contr. Zool. Entomol., 6: 1-154 132 Smith P. T., Kambhampati S., Völkl W. and Mackauer M. (1999): A phylogeny of Aphid Parasitoids (Hymenoptera:Braconidae:Aphidinae) inferred from Mitochondrial NADH 1 Dehydrogenase Gene Sequence. Molecular Phylogenetics and Evolution, 11(2): 236-245 Smith P. T. and Kambhampati S. (2000): Evolutionary transitions in Aphidiinae (Hymenoptera: Braconidae). In: Austin A. D. and Dowton M. (eds.). Hymenoptera: evolution, biodiversity and biological control. Csiro Publishing, Science, pp. 106-113 Soldan T. and Starý P. (1981): Parasitogenic effects of Aphidius smithi (Hymenoptera, Aphidiidae) on the reproductive organs of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum (Homoptera, Aphididae). Acta Entomologica Bohemoslovaca, 78: 243-253 Stadler B. (2002): Determinants of the size of aphid-parasitoid assemblages. Journal of Applied Entomology, 126: 258-264 Stadler B. and Mackauer M. (1996): Influence of plant quality on interactions between the aphid parasitoids Ephedrus californicus (Hymenoptera: Aphidiidae) and its host, Acyrthosiphon pisum (Homoptera: Aphididae). The Canadian Entomologist, 128: 27-39 Starý P. (1961): Two new species of Praon Haliday from Czechoslovakia (Hymenoptera: Aphidiidae), Acta Soc. Entomol. Cechoslov., 58: 340-343 Starý P. (1962): Faunistic notes on the Aphidiidae of Bulgaria. Acta Faunistica Entomologica Musei Nationalis Pragae, 71: 83-86 Starý P. (1966a): Aphid parasites of Czechoslovakia. A review of the Czechoslovak Aphidiidae (Hymenoptera), Prague Starý P. (1966b): The Aphidiidae of Italy (Hymenoptera: Ichneumonoidea). Bollettino dell’ Istituto di Entomologia della Università degli Studi di Bologna, 28: 65-139 133 Starý P. (1970): Biology of aphid parasites (Hymenoptera: Aphidiidae) with respect to integrated control. Series entomologica, 6. Dr W. Junk, The Hague. 643 pp Starý P. (1971): New aphid parasites from central Europe (Hymenoptera: Aphidiidae). Acta Entomologica Bohemoslovaca, 68: 310-318 Starý P. (1974): The emergence hole of aphid parasites (Hymenoptera, Aphidiidae): its significance in a natural system. Acta Entomologica Bohemoslovaca, 71: 209-216 Starý P. (1975a): Pseudopraon mindariphagum gen. n., sp. n. (Hymenoptera: Aphidiidae)- description and life history of a parasite of Mindarus abietinus (Homoptera: Mindaridae) in Central Europe. Acta Entomologica Bohemoslovaca, 72: 249-258 Starý P. (1975b): A checklist of the Far East Asian Aphidiidae (Hymenoptera). Beiträge Zur Entomologie, 25: 53-76 Starý P. (1976a): External female genitalia of the Aphidiidae (Hymenoptera). Acta Entomologica Bohemoslovaca, 73: 102-112 Starý P. (1976b): Aphid parasites (Hymenoptera: Aphidiidae) of the Mediterramnean area. Dr W. Junk, The Hague. Starý P. (1976c): Biology of Areopraon lepelleyi Waterston, a parasite of some Eriosomatid aphids (Hymenoptera: Aphidiidae). Acta Entomologica Bohemoslovaca, 73: 312-317 Starý P. (1981a): On the strategy, tactics and trends of host specifity evolution in aphid parasitoids (Hymenoptera: Aphidiidae). Acta Entomologica Bohemoslovaca, 78: 65-75 Starý P. (1981b): Mesopraon helleni gen. n., sp. n. (Hymenoptera, Aphidiinae) from Finland. Notulae Entomologicae, 61: 175-176 134 Starý P. (1981c): Biosystematic synopsis of parasitoids on cereal aphids in the western Palearctic (Hymenoptera: Aphidiidae, Homoptera: Aphidoidea). Acta Entomologica Bohemoslovaca, 78: 382-396 Starý P. (1983): Parapraon, a new genus of the Aphidiidae (Hymenoptera). Acta Entomologica Bohemoslovaca, 80: 206-209 Starý P. (1988): Aphidiidae. In: Minks A. K. and Harrewijn P. (eds.). Aphids, Their Biology, Natural Enemies and Control. Vol 2B, Elsevier, Amsterdam, pp 171-184 Starý P. (1995): The Aphidiidae of Chile. Deutsche Entomologische Zeitschrift, 42:113-138 Starý P. and Schlinger E. I. (1967): A revision of the Far East Asian Aphidiidae (Hymenoptera). The Hague, Dr W. Junk Starý P. and Kaddou I. K. (1971): Fauna and distribution of aphid parasites (Hymenoptera: Aphidiidae) in Iraq. Acta Faunistica Entomologica Musei Nationalis Pragae, 14: 179-197 Starý P. and Ghosh A. K. (1983): Aphid parasitoids of India and adjacent countries, India Starý P. and Vogel M. (1985): Aphid parasitoids in the Sub-Antarctic (Hymenoptera: Aphidiidae). Spixiana, 8: 25-31 Starý P., Remaudière G. and Leclant F. (1971): Les Aphidiidae (Hymenoptera). Entomophaga Mémoire Hors Série, 5: 1-72 Starý P., Remaudière G. and Leclant F. (1973): Nouvelles sur les Aphidiidae de France (Hym.). Annales de la Société Entomologique de France (N. S.), 9 (2): 309-329 135 Starý P., Naumann-Etienne K. and Remaudière G. (1998): A review and tritrophic associations of aphid parasitoids (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) of Pakistan. Parasitica, 54: 3-21 StatSoft Inc. (2001): STATISTICA (data analysis software system), versiom 6. www. statsoft.com Stireman III J. O., Nason J. D., Heard S. B. and Seehawer J. M. (2006): Cascading host- associated genetic differentiation in parasitoids of phytophagous insects. Proceedings of the Royal Society B, 273: 523-530 Symondson W. O. C. (2002): Molecular identification of prey in predator diets. Molecular Ecology, 11: 627-641 Takada H. (1968): Aphidiidae of Japan (Hymenoptera). Insecta Matsumurana, 30: 67-124 Takada H. and Nakamura T. (2010): Native primary parasitoids and hyperparasitoids attacking an invasive aphid Uroleucon nigrotuberculatum in Japan. Entomological Science, 13: 269-272 Tamura K., and Nei M. (1993): Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution, 10:512-526 Tamura K., Dudley J., Nei M. and Kumar S. (2007): MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24:1596-1599 Taylor A. J., Müller C. B. and Godfray H. C. J. (1998): Effect of aphid predators on ovoposition behaviour of aphid parasitoids. Journal of Insect Behaviour, 11 (2): 297- 302 136 Teder T. and Tammaru T. (2005): Sexual size dimorphism within species increases with body size in insects. Oikos, 108:321-334 Templeton A. R. (1981): Mechanisms of speciation. A population genetic approach. Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics, 12: 23-48 Tobias V. I. (1967): A review of the classification, phylogeny and evolution of the family Braconidae (Hymenoptera). Entomological Review, 46: 387-399 Tobias V. I. (1989): Application of W. Hennig‟s method of phylogenetic analysis for the construction of the phylogenetic tree of the family Braconidae (Hymenoptera). Procceedings of the Zoological Institute of the USSR Academy of Sciences, Leningrad 202: 67-83 [in Russian] Tobias V. I. and Kyriac I. G. (1971): Najezdnik Areopraon pilosum Mackauer, 1959 i voprosy filogenii i evoljucii sem. Aphidiidae (Hymenoptera). Entomologicesko Obozrenie, 50: 11-16 Tomanović Ţ. (1998): Faunistiĉko-ekološka i taksonomska studija parazitskih osa (Aphidiidae, Hymenoptera) agroekosistema jugoistoĉnog dela Panonske nizije. Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.Doktorska disertacija Tomanović Ţ. and Brajković M. (2001): Aphid parasitoids (Hymenoptera, Aphidiidae) of agroecosystems of the south part of the Pannonian area. Archives of Biological Science, 53 (1-2): 57-64 Tomanović Ţ. and Kavallieratos N. G. (2002): Two new aphidiinae wasps (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) from the southeastern Europe. Reichenbachia, 34: 341-345 Tomanović Ţ., Brajković M., Krunić M. and Stanisavljević Lj. (1996): Seasonal dynamics, parasitization and color polymorphism of the pea aphid, Acyrthosiphon 137 pisum (Harris) (Aphididae, Homoptera) on alfalfa in south part of the Pannonian area. Tiscia, 30: 45-48 Tomanović Ţ., Brajković M. and Krunić M. (1998a): A checklist of aphid parasitoids (Hymenoptera: Aphididae) in Yugoslavia. Acta Entomologica Serbica, 3: 95-106 Tomanović Ţ., Brajković M., Petrović O. and Leclant F. (1998b): Species composition of aphids (Aphididae, Homoptera) and their primary parasitoids (Aphidiidae, Hymenoptera) on the Prunus spp. in Yugoslavia. Archives of Biological Sciences Belgrade, 50 (2-3): 17P-18P Tomanović Ţ., Brajković M. and Krunić M. (1999): Numerical discrimination of some Aphidius species (Aphidiidae, Hymenoptera) from Yugoslavia. Archives of Biological Sciences, 51 (4): 209-218 Tomanović Ţ., Kavallieratos N. G., Athanassiou C. G. and Petrović O. (2003a): A New Praon species (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) of the Uroleucon Parasitoid Complex from the Mediterranean Area. Phytoparasitica, 31 (1): 19-26 Tomanović Ţ., Kavallieratos N. G., Athanassiou C. G. and Stanisavljević Lj. (2003b): A review of the West Palaearctic aphidiines (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) parasitic on Uroleucon spp., with the description of a new species. Annales de la Société Entomologique de France (n.s.), 39 (4): 343-353 Tomanović Ţ., Kavallieratos N. G., Starý P., Stanisavljević Lj., Petrović-Obradović O., Tomanović S. and Milutinović M. (2006): Phylogenetic relationships among Praini (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) aphid parasitoids, with redescription of two species. Insect Systematics and Evolution, 37 (2): 213-226 Tomanović Ţ., Petrović A., Kavallieratos N. G ., Starý P., Toševski I. and Mitrovski- Bogdanović A. (2009): Areopraon chaitophori n. sp (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae) associated with Chaitophorus leucomelas Koch on poplars, with a key for 138 European Areopraon Mackauer species. Annales de La Societe Entomologique de France, 45 (2): 187-192 Tomanović Ţ., Kos K., Petrović A., Starý P., Kavallieratos N. G., Ţikić V., Jakše J., Trdan S. and Ivanović A. (2012): The relationship between molecular variation and variation in the wing shape of three aphid parasitoid species: Aphidius uzbekistanicus Luzhetzki, Aphidius rhopalosiphi De Stefani Perez and Aphidius avenaphis (Fitz) (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Zoologischer Anzeiger, in press Traugott M., Bell J. R., Broad G. R., Powel W., Van Veen F. J. F., Vollhardt I. M. G. and Symondson W. O. C. (2008): Endoparasitism in cereal aphids: molecular analysis of a whole parasitoid community. Molecular Ecology, 17: 3928-3938 Tremblay E. and Calvert D. (1971): Embryosystematics in the aphidiines (Hymenoptera: Braconidae). Bollettino del Laboratorio di Entomologia Agraria “Filippo Silvestri”di Portici, 29: 223-249 Tremblay E. and Pennacchio F. (1985): Taxonomic status of some species of the genus Praon Haliday (Hymenoptera, Braconidae, Aphidiinae). Bollettino del Laboratorio di Entomologia Agraria “Filippo Silvestri”di Portici, 42: 143-147 Tremblay E. and Pennacchio F. (1988): Speciation in aphidiine Hymenoptera. In: Gupta V. K. (ed.). Advances in Parasitic Hymenoptera Research, New York: E. J. Brill, pp. 139-146 Tremblay E., Pennacchio F., Matrone L. and Piccolo D. (1986): Redescription of Praon dorsale (Haliday 1833) and resurrection of Praon longicorne Marshall, 1891: a statistical analysis of morphological data (Hymenoptera: Braconidae). Entomotaxonomia, 8: 31-42 139 Unruh T. R., White W., Gonzales D. and Woolley J. B. (1989): Genetic Relationships Among Seventeen Aphidius (Hymenoptera: Aphidiidae) Populations, Including Six Species. Annals of the Entomological Society of America, 82 (6): 754-768 Van Achterberg C. (1984): Essay on the phylogeny of Braconidae (Hymenoptera: Ichneumonoidea). Entomologisk Tidskrift, 105: 41-58 Van Achterberg C. (1988): Revision of the subfamily Blacinae Foerster (Hymenoptera, Braconidae). Zoologische Verhandelingen, 249: 1-324, figs 1-1250 Van Achterberg C. (1990): Illustrated key to the subfamilies of the Holarctic Braconidae (Hymenoptera: Ichneumonoidea). Zoologische Mededlingen, 64(1): 1-20 Van Achterberg C. (2006): The Braconidae (Hymenoptera) of Greenland. Zoologische Mededlingen, 80-1(2): 13-62 Van Alphen J. J. M. and Vet L. E. M. (1986): An evolutionary approach to host finding and selection. In: Waage J. and Greathead D. (eds.). Insect parasitoids. London, Aacademic press, pp. 23-61 Van Emden H. F. (1995): Host plant-Aphidophaga interactions. Agriculture, Ecosystems and Environment, 52: 3-11 Vinson S. B. (1975): Biochemical coevolution between parasitoids and their hosts. In: Price P. W (ed.). Evolutionary strategies of parasitic insects and mites. New York, Plenum Press, pp. 14-48 Vinson S. B. (1976): Host selection by insect parasitoids. Annual Review of Entomology, 21: 109-133 140 Vinson S. B. (1981): Habitat location. In: Nordlund D. A., Jones R. L. and Lewis W. J. (eds.). Semiochemicals:their role in pest control. New York, John Wiley and Sons, pp. 51-77 Vinson S. B. (1984): Parasitoid-host relationship. In: Bell W. J. and Cardé R. T.(eds). Chemical Ecology of Insects. Chapman and Hall, London, pp. 205-233 Vinson S. B. (1990): How parasitoids deal with the immune system of their host: An overview. Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 13: 3-27 Vinson S. B. (1998): The General Host Selection Behaviour of Parasitoid Hymenoptera and a Comparison of Initial Stretegies Utilized by Larvaphagous and Oophagous Species. Biological Control, 11: 79-96 Vinson S. B. and Iwantsch G. F. (1980a): Host suitability for insect parasitoids. Annual Review of Entomology, 25: 397-419 Vinson S. B. and Iwantsch G. F. (1980b): Host regulation by insect parasitoids. Quarterly Review of Biology, 55: 143-165 Völkl W. (1992): Aphids or their parasitoids: who actually benefits from ant- attendance? Journal of Animal Ecology, 61: 273-281 Völkl W. (1994): The effects of ant-attendance on the foraging behaviour of the aphid parasitoid Lysiphlebus cyrdui. Oikos, 70: 149-155 Völkl W. and Starý P. (1988): Parasitation of Uroleucon species (Homoptera: Aphididae) on thistles (Compositae: Cardueae). Journal of Applied Entomology, 106: 500-506 141 Völkl W. and Kraus W. (1996): Foraging behaviour and resource utilization of the aphid parasitoid Pauesia unilachni: Adaptation to host distribution and mortality risk. Entomologia Experimentalis et Applicata, 79: 101-109 Völkl W. and Novak H. (1997): Foraging behaviour and resource utilization of the aphid parasitoid, Pauesia pini (Hymenoptera: Aphidiidae) on spruce: influence of host species and ant attendance. European Journal of Entomology, 94: 211-220 Völkl W. and Mackauer M. (2000): Ovoposition behaviour of aphidiine wasps (Hymenoptera: Braconidae, Aphidiinae), morphological adaptations end evolutionary trends. The Canadian Entomologist, 132: 197-212 Wahl D. B. and Sharkey M. J. (1993): Superfamily Ichneumonoidea. In: Goulet H. and Huber J. T. (eds). Hymenoptera of the World: An identification Guide to Families. Agriculture Canada, Ottawa, pp. 358-509 Watanabe C. (1963): Notes on some species of Braconidae of Japan (Hymenoptera: Braconidae). Insecta Matsumurana, 25 (2): 96-97 Watanabe C. and Takada H. (1964): Occurence of two species of the genus Praon Haliday in Japan. Insecta Matsumurana, 27 (1): 8-11 Weinbrenner W. and Völkl W. (2002): Ovoposition behaviour of the aphid parasitoid, Aphidius ervi. Entomologia experimentalis et Applicata, 103: 51-59 Weisser W. W., Houston A. I. and Völkl W. (1994): Foraging strategies in solitary parasitoids: The trade off between female and offspring mortality risks. Evolutionary Ecology, 8: 587-597 Wharton R. A. (2000): Can Braconid classification be reconstructed to facilitate portrayal of relationships? In: Austin A. D. and Dowton M. (eds.). Hymenoptera: evolution, biodiversity and biological control. Csiro Publishing, Science, pp. 143-153 142 Wharton R., Shaw S., Sharkey M., Wahl D., Woolley J., Whitfield J., Marsh P. and Johnson W. (1992): Phylogeny of the subfamilies of the family Braconidae (Hymenoptera: Ichneumonoidea): a reassessment. Cladistics, 8: 199-235 Whitfield J. B. (1992): The polyphyletic origin of endoparasitism in the cyclostome lineages of Braconidae (Hymenoptera). Systematic Entomology, 17: 273-286 Whitfield J. B. (1998): Phylogeny and evolution of host-parasitoid interactions in Hymenoptera. Annual Review of Entomology, 43: 129-151 Whitfield J. B., Mardulyn P., Austin A.D. and Dowton M. (2002): Phylogenetic relationships among microgastrine braconid wasp genera based on data from the 16S, COI and 28S genes and morphology. Systematic Entomology, 27: 337-359 Wiackowski S. K. (1962): Studies on the biology and ecology of Aphidius smithi Sharma and Subba Rao (Hymenoptera, Braconidae), a parasite of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum (Harris). Bulletin of Entomology Pologne, 32: 253-310 Wootton R. J. (2002): Design, function and evolution in the wings of holometabolous insects. Zoologica Scripta, 31: 31-40 Wootton R. J., Herbert R. C., Young P. G. and Evans K. E. (2003): Approaches to the structural modeling of insect wings. Philosophical Transactions of the Royal Society B, 358:1577-1587 Yamauchi S. and Takada H. (1978): Aphid parasites from Okinawa island, the Ryûkyûs (Hymenoptera: Aphidiidae). Akitu (N. S.), 20: 1-2 Zaldivar-Riverón A., Mori M. and Quicke D. L. J. (2006): Systematics of cyclostome subfamilies of braconid parasitic wasps (Hymenoptera:Ichneumonoidea): A simultaneous molecular and morphological Bayesian approach. Molecular Phylogenetics and Evolution, 38:130-145 143 Zaldívar-Riverón A., Martínez J. J., Ceccarelli F. S., de Jesús-Bonilla V. S., Rodríguez- Pérez A. C., Reséndiz-Flores and Smith M. A. (2010): DNA barcoding a highly diverse group of parasitoid wasps (Braconidae: Doryctinae) from Mexican nature reserve. Mitochondrial DNA, 21 (S1): 18-23 Zelditch M. L., Swiderski D. L., Sheets H. D. and Fink W. L. (2004): Geometric morphometrics for biologists: A primer. Elsevier Academic Press. 1 – 443. Ţikić V., Tomanović Ţ., Ivanović A., Kavallieratos N. G., Starý P., Stanisavljević Lj. and Rakhshani E. (2009): Morphological characterization of Ephedrus persicae Froggatt biotypes (Hymenoptera, Braconidae, Aphidiinae) in the Palaearctic. Annals of the Entomological Society of America, 102: 1-11 144 8. PRILOZI PRILOG 1 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 1 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Crepis setosa Bugarska 2 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Crepis setosa Bugarska 143 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Crepis biennis Srbija 11 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 13 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 16 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 18 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 116 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Srbija 175 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 176 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 181 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 197 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 446 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus R. Ĉeška 447 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus R. Ĉeška 449 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium intybus R. Ĉeška 443 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Cichorium sp. R. Ĉeška 137 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Lactuca sp. Srbija 139 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Lactuca sp. Srbija 140 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Lactuca sp. Srbija 141 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Lactuca sp. Srbija 142 P. yomenae ♀ Uroleucon cichorii Lactuca sp. Srbija 19 P. yomenae ♀ Uroleucon jaceae Centaurea sp. Francuska 20 P. yomenae ♀ Uroleucon jaceae Centaurea sp. Francuska 21 P. yomenae ♀ Uroleucon jaceae Centaurea sp. Francuska 22 P. yomenae ♀ Uroleucon jaceae Centaurea sp. Francuska 436 P. yomenae ♀ Uroleucon jaceae Centaurea stoebe R. Ĉeška 434 P. yomenae ♀ Uroleucon jaceae Centaurea stoebe Slovaĉka 435 P. yomenae ♀ Uroleucon jaceae Centaurea stoebe Slovaĉka 33 P. yomenae ♀ Uroleucon campestre Campanula rotundifolia R. Ĉeška 39 P. yomenae ♀ Uroleucon campestre Campanula rotundifolia R. Ĉeška 41 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus sp. Francuska 42 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus sp. Francuska 408 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus sp. Bugarska 240 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 241 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 243 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 244 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 245 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 492 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 406 P. yomenae ♀ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Bugarska 312 P. yomenae ♀ Uroleucon composita Carthamum tinctorium Iran 313 P. yomenae ♀ Uroleucon composita Carthamum tinctorium Iran 497 P. yomenae ♀ Uroleucon chondrillae Chondrilla junceae Crna Gora 499 P. yomenae ♀ Uroleucon chondrillae Chondrilla junceae Crna Gora 145 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 400 P. yomenae ♀ Uroleucon chondrillae Chondrilla sp. Italija 401 P. yomenae ♀ Uroleucon chondrillae Chondrilla sp. Italija 424 P. yomenae ♀ Uroleucon tanaceti Tanacetum vulgare Francuska 439 P. yomenae ♀ Uroleucon solidaginis Solidago virgaurea Francuska 440 P. yomenae ♀ Uroleucon solidaginis Solidago virgaurea Francuska 441 P. yomenae ♀ Uroleucon bosalis Tussilago sp. Francuska 442 P. yomenae ♀ Uroleucon aeneus Cirsium sp. Francuska 500 P. yomenae ♀ Uroleucon hypochoeridis Leontodon hispidus Slovenija 501 P. yomenae ♀ Uroleucon hypochoeridis Leontodon hispidus Slovenija 591 P. yomenae ♀ Uroleucon inoculata Inula salicina Srbija 642 P. yomenae ♀ Uroleucon inoculata Inula salicina Srbija 496 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Taraxacum sp. Francuska 47 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška 48 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška 394 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška 490 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška 491 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška 167 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis Srbija 474 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis Švajcarska 488 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis biennis Švajcarska 398 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Crepis sp. Francuska 8 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Hieracium sp. Francuska 9 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Hieracium sp. Francuska 10 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Hieracium sp. Francuska 412 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Hieracium silvaticum R. Ĉeška 413 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Hieracium silvaticum R. Ĉeška 414 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Hieracium silvaticum R. Ĉeška 425 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Hieracium sp. Slovaĉka 135 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Cichorium intybus Srbija 404 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Cichorium intybus SSSR 431 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Cichorium intybus R. Ĉeška 119 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Cichorium intybus Srbija 120 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Cichorium intybus Srbija 403 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Cichorium sp. R. Ĉeška 427 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Cichorium endivia R. Ĉeška 49 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Centaurea sp. R. Ĉeška 53 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Centaurea sp. R. Ĉeška 55 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Centaurea sp. R. Ĉeška 56 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Centaurea sp. R. Ĉeška 399 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Sonchus sp. Francuska 479 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Sonchus asper Švajcarska 57 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus SSSR 58 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus SSSR 59 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus SSSR 60 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus SSSR 61 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus SSSR 146 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 62 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus SSSR 419 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus Italija 421 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus Italija 430 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Carthamus lanatus Italija 126 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Rhagadiolus stellatus Crna Gora 128 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Rhagadiolus stellatus Crna Gora 129 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Rhagadiolus stellatus Crna Gora 130 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Rhagadiolus stellatus Crna Gora 148 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 149 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 150 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 156 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 159 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 203 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 204 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 206 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 207 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 214 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 464 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Acroptilon repens Iran 397 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Acroptilon repens SSSR 416 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Seriola actuensis 63 P. yomenae ♀ Macrosiphoniella staegeri Centaurea stoebe R. Ĉeška 66 P. yomenae ♀ Macrosiphoniella staegeri Centaurea stoebe R. Ĉeška 68 P. yomenae ♀ Macrosiphoniella staegeri Centaurea stoebe R. Ĉeška 69 P. yomenae ♀ Macrosiphoniella staegeri Centaurea stoebe R. Ĉeška 280 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 281 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 282 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 285 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 286 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 291 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 292 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 294 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 296 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 297 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 298 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 299 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 301 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 470 P. yomenae ♀ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 486 P. yomenae ♀ Aphis nerii Nerium oleander Grĉka 568 P. yomenae ♀ Indomegoura indica Hemerocallis fulva Japan 570 P. yomenae ♀ Indomegoura indica Staphyllae bumalda Japan 572 P. yomenae ♀ Acyrthosiphon sp. Kondoi on alfaalfa Japan 573 P. yomenae ♀ Acyrthosiphon sp. Kondoi on alfaalfa Japan 574 P. yomenae ♀ Acyrthosiphon sp. Kondoi on alfaalfa Japan 575 P. yomenae ♀ Acyrthosiphon sp. Kondoi on alfaalfa Japan 147 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 576 P. yomenae ♀ Acyrthosiphon pisum Asteraceae Japan 578 P. yomenae ♀ Uroleucon formosanum Asteraceae Japan 579 P. yomenae ♀ Uroleucon formosanum Asteraceae Japan 583 P. yomenae ♀ Uroleucon sp. Asteraceae Japan 601 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 656 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 657 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 662 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 663 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 664 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 665 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 666 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 667 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 668 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 670 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 671 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 672 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 673 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 674 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 675 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 676 Praon sp. ♀ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 354 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 355 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 356 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 357 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 358 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 359 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 360 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 361 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 362 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 363 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 364 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 365 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 366 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 367 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 368 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 369 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 370 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 371 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 372 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 373 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 376 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 377 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 378 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 379 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 380 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 148 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 381 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 382 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 383 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 384 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 385 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 386 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 387 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 388 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 389 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 390 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 391 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 392 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 469 P. megourae ♀ Megoura viciae Lathyrus pratensis Crna Gora 80 P. longicorne ♀ Acyrthosiphon malvae Geranium sp. Francuska 81 P. longicorne ♀ Acyrthosiphon pisum Vicia sp. R. Ĉeška 82 P. longicorne ♀ Acyrthosiphon pisum Vicia sp. R. Ĉeška 85 P. longicorne ♀ Amphorophora rubi Rubus sp. R. Ĉeška 93 P. longicorne ♀ Aulacorthum rufum Vaccinium myrtilus Francuska 94 P. longicorne ♀ Aulacorthum rufum Vaccinium myrtilus Francuska 95 P. longicorne ♀ Aulacorthum rufum Vaccinium myrtilus Francuska 96 P. longicorne ♀ Aulacorthum rufum Vaccinium myrtilus Francuska 97 P. longicorne ♀ Aulacorthum rufum Vaccinium myrtilus Francuska 458 P. longicorne ♀ Aulacorthum solani Geum rivale Crna Gora 593 P. longicorne ♀ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 122 P. longicorne ♀ Macrosiphum oredonense Lonicera xylosteum Crna Gora 124 P. longicorne ♀ Macrosiphum oredonense Lonicera nigra Crna Gora 460 P. longicorne ♀ Macrosiphum oredonense Lonicera nigra Srbija 232 P. longicorne ♀ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 233 P. longicorne ♀ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 338 P. longicorne ♀ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 352 P. longicorne ♀ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 353 P. longicorne ♀ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 332 P. longicorne ♀ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 333 P. longicorne ♀ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 336 P. longicorne ♀ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 345 P. longicorne ♀ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 99 P. longicorne ♀ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 101 P. longicorne ♀ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 223 P. longicorne ♀ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 112 P. longicorne ♀ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 230 P. longicorne ♀ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 225 P. longicorne ♀ Impatientinum asiaticum Impatiens parviflora R. Ĉeška 226 P. longicorne ♀ Impatientinum asiaticum Impatiens parviflora R. Ĉeška 246 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 247 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 248 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 149 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 249 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 250 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 251 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 252 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 253 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 254 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 255 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 256 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 257 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 258 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 259 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 261 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 262 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 263 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 264 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 265 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 266 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 268 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 462 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 467 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 480 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Švajcarska 472 P. volucre ♀ Uroleucon sp. Sonchus arvensis Srbija 236 P. volucre ♀ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 339 P. volucre ♀ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 331 P. volucre ♀ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 337 P. volucre ♀ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 103 P. volucre ♀ Cryptomyzus sp. Ribes grosularia R. Ĉeška 104 P. volucre ♀ Cryptomyzus sp. Ribes grosularia R. Ĉeška 105 P. volucre ♀ Cryptomyzus sp. Ribes grosularia R. Ĉeška 597 P. dorsale ♀ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 608 P. dorsale ♀ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 609 P. dorsale ♀ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 610 P. dorsale ♀ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 611 P. dorsale ♀ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 455 P. dorsale ♀ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 457 P. dorsale ♀ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 461 P. dorsale ♀ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 73 P. dorsale ♀ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 459 P. dorsale ♀ Macrosiphum cholodkovskyi Filipendula ulmaria Crna Gora 70 P. dorsale ♀ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 71 P. dorsale ♀ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 72 P. dorsale ♀ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 3 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Crepis setosa Bugarska 4 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Crepis setosa Bugarska 7 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Crepis setosa Bugarska 131 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Crepis biennis Srbija 150 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 12 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 14 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 15 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 17 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovaĉka 117 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Srbija 118 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Srbija 195 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 305 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 306 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 307 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus Slovenija 445 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus R. Ĉeška 448 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus R. Ĉeška 450 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium intybus R. Ĉeška 444 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Cichorium sp. R. Ĉeška 138 P. yomenae ♂ Uroleucon cichorii Lactuca sp. Srbija 433 P. yomenae ♂ Uroleucon jaceae Centaurea stoebe R. Ĉeška 437 P. yomenae ♂ Uroleucon jaceae Centaurea stoebe R. Ĉeška 438 P. yomenae ♂ Uroleucon jaceae Centaurea stoebe R. Ĉeška 35 P. yomenae ♂ Uroleucon campestre Campanula rotundifolia R. Ĉeška 37 P. yomenae ♂ Uroleucon campestre Campanula rotundifolia R. Ĉeška 38 P. yomenae ♂ Uroleucon campestre Campanula rotundifolia R. Ĉeška 40 P. yomenae ♂ Uroleucon campestre Campanula rotundifolia R. Ĉeška 43 P. yomenae ♂ Uroleucon sonchi Sonchus sp. Francuska 407 P. yomenae ♂ Uroleucon sonchi Sonchus sp. Bugarska 409 P. yomenae ♂ Uroleucon sonchi Sonchus sp. Bugarska 242 P. yomenae ♂ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 282 P. yomenae ♂ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Iran 405 P. yomenae ♂ Uroleucon sonchi Sonchus oleraceus Bugarska 498 P. yomenae ♂ Uroleucon chondrillae Chondrilla junceae Crna Gora 495 P. yomenae ♂ Uroleucon chondrillae Chondrilla junceae Iran 46 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška 475 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Crepis biennis R. Ĉeška 169 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Crepis biennis Srbija 173 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Crepis biennis Srbija 422 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Crepis biennis YU Bled 465 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Crepis sp. Grĉka 411 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Hieracium silvaticum R. Ĉeška 426 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Hieracium sp. Slovaĉka 432 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Cichorium intybus R. Ĉeška 402 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Cichorium sp. R. Ĉeška 50 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Centaurea sp. R. Ĉeška 51 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Centaurea sp. R. Ĉeška 54 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Centaurea sp. R. Ĉeška 420 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Carthamus lanatus Italija 429 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Carthamus lanatus Italija 127 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Rhagadiolus stellatus Crna Gora 151 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 147 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 152 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 153 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 154 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 155 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 157 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 158 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 201 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 208 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 209 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 215 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Chondrilla junceae Crna Gora 303 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Acroptilon repens Iran 395 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Acroptilon repens SSSR 417 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Seriola actuensis 219 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Innula ensifolia Crna Gora 220 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Innula ensifolia Crna Gora 221 P. yomenae ♂ Uroleucon sp. Innula ensifolia Crna Gora 64 P. yomenae ♂ Macrosiphoniella staegeri Centaurea stoebe R. Ĉeška 65 P. yomenae ♂ Macrosiphoniella staegeri Centaurea stoebe R. Ĉeška 67 P. yomenae ♂ Macrosiphoniella staegeri Centaurea stoebe R. Ĉeška 283 P. yomenae ♂ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 284 P. yomenae ♂ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 287 P. yomenae ♂ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 288 P. yomenae ♂ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 290 P. yomenae ♂ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 293 P. yomenae ♂ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 295 P. yomenae ♂ Macrosphoniella sanborni Chrysanthemum sp. Srbija 567 P. yomenae ♂ Indomegoura indica Hemerocallis fulva Japan 571 P. yomenae ♂ Indomegoura indica Staphyllae bumalda Japan 580 P. yomenae ♂ Uroleucon formosanum Asteraceae Japan 581 P. yomenae ♂ Uroleucon formosanum Asteraceae Japan 659 Praon sp. ♂ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 661 Praon sp. ♂ Staticobium limonii Limonium angustifolium Slovenija 374 P. megourae ♂ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 375 P. megourae ♂ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 393 P. megourae ♂ Megoura viciae Lathyrus sp. R. Ĉeška 308 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon malvae Geranium robertianum Crna Gora 309 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon malvae Geranium robertianum Crna Gora 310 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon malvae Geranium robertianum Crna Gora 311 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon malvae Geranium robertianum Crna Gora 83 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon pisum Vicia sp. R. Ĉeška 108 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon pisum Vicia sp. R. Ĉeška 109 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon pisum Vicia sp. R. Ĉeška 110 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon pisum Vicia sp. R. Ĉeška 86 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon pisum Vicia fesa R. Ĉeška 87 P. longicorne ♂ Acyrthosiphon pisum Vicia fesa R. Ĉeška 152 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 88 P. longicorne ♂ Amphorophora rubi Rubus idaeus Finska 84 P. longicorne ♂ Amphorophora ampullata Dryopteris sp. R. Ĉeška 91 P. longicorne ♂ Hyperomyzus sp. Lactuca sp. Avganistan 92 P. longicorne ♂ Aulacorthum rufum Vaccinium myrtilus Francuska 302 P. longicorne ♂ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 451 P. longicorne ♂ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 452 P. longicorne ♂ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 453 P. longicorne ♂ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 454 P. longicorne ♂ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 456 P. longicorne ♂ Macrosiphum funestum Rubus sp. Srbija 121 P. longicorne ♂ Macrosiphum oredonense Lonicera xylosteum Crna Gora 123 P. longicorne ♂ Macrosiphum oredonense Lonicera nigra Crna Gora 125 P. longicorne ♂ Macrosiphum oredonense Lonicera nigra Crna Gora 234 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 235 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 237 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 340 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 341 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 343 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 350 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 351 P. longicorne ♂ Microlophium carnosum Urtica dioica R. Ĉeška 327 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 328 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 329 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 330 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 334 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 335 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 344 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 346 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 347 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 349 P. longicorne ♂ Microlophium evansi Urtica dioica R. Ĉeška 98 P. longicorne ♂ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 100 P. longicorne ♂ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 224 P. longicorne ♂ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 228 P. longicorne ♂ Impatientinum balsamines Impatiens noli-tangere R. Ĉeška 102 P. longicorne ♂ Cryptomyzus sp. Ribes grosularia R. Ĉeška 106 P. longicorne ♂ Cryptomyzus sp. Ribes grosularia R. Ĉeška 107 P. longicorne ♂ Cryptomyzus sp. Ribes grosularia R. Ĉeška 270 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 271 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 272 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 273 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 274 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 276 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 277 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 278 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 153 Tabela P1. Spisak jedinki korišćenih u morfometrijskim analizama - nastavak Šifra Vrsta Pol Vaš domaćin Biljka domaćin Drţava 279 P. volucre ♂ Uroleucon sp. Sonchus oleraceus Srbija 599 P. dorsale ♂ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 604 P. dorsale ♂ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 605 P. dorsale ♂ Corylobium avellanae Corylus avellana Švajcarska 74 P. dorsale ♂ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 75 P. dorsale ♂ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 76 P. dorsale ♂ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 77 P. dorsale ♂ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 79 P. dorsale ♂ Mulgedium alpinum R. Ĉeška 154 PRILOG 2 Tabela P2. Deskriptivna statistika svih karaktera po vrstama – ţenke dt Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 57,85714 9,375133 41,00000 85,00000 Praon sp. 17 47,17647 4,517124 38,00000 55,00000 Praon megourae 38 56,47368 3,334803 50,00000 64,00000 Praon longicorne 30 59,73333 6,405457 48,00000 71,00000 Praon volucre 32 48,31250 4,802133 42,00000 58,00000 Praon dorsale 13 58,07692 6,550592 45,00000 66,00000 Sve grupe 270 56,07778 8,525790 38,00000 85,00000 MBF2 Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 2.450000 0.931657 1.000000 4.000000 Praon sp. 17 2.117647 0.485071 1.000000 3.000000 Praon megourae 38 1.184211 0.982420 1.000000 2.000000 Praon longicorne 30 1.533333 0.571346 1.000000 3.000000 Praon volucre 32 1.343750 0.545325 1.000000 3.000000 Praon dorsale 13 1.538462 0.660225 1.000000 3.000000 Sve grupe 270 1.974074 0.984675 1.000000 4.000000 F1l/F1w Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 5,366786 0,671057 2,500000 6,880000 Praon sp. 17 6,098824 0,512200 5,000000 6,710000 Praon megourae 38 6,462895 0,724020 3,230000 7,630000 Praon longicorne 30 5,900333 0,424617 5,000000 6,670000 Praon volucre 32 5,525895 0,534705 4,470000 7,125000 Praon dorsale 13 5,956838 0,678969 4,666667 7,222222 Sve grupe 270 5,673695 0,744298 2,500000 7,630000 F2l/F2w Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 3,171857 0,365941 2,270000 4,000000 Praon sp. 17 3,450000 0,300208 2,700000 3,880000 Praon megourae 38 3,757895 0,307959 2,570000 4,440000 Praon longicorne 30 3,528333 0,364077 3,000000 4,560000 Praon volucre 32 3,225306 0,347366 2,800000 4,130000 Praon dorsale 13 3,417272 0,407495 2,923077 4,500000 Sve grupe 270 3,329609 0,411162 2,270000 4,560000 155 Tabela P2. Deskriptivna statistika svih karaktera po vrstama – ţenke F1l/F2l Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 1,357429 0,099005 1,120000 1,770000 Praon sp. 17 1,462941 0,074058 1,320000 1,560000 Praon megourae 38 1,496316 0,086099 1,170000 1,660000 Praon longicorne 30 1,418333 0,109169 1,060000 1,570000 Praon volucre 32 1,397371 0,096241 1,228571 1,640000 Praon dorsale 13 1,438659 0,109308 1,235294 1,571429 Sve grupe 270 1,399031 0,109132 1,060000 1,770000 F1w/F2w Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 0,806643 0,086070 0,640000 1,070000 Praon sp. 17 0,830000 0,055340 0,700000 0,890000 Praon megourae 38 0,873947 0,054353 0,730000 1,000000 Praon longicorne 30 0,846667 0,096859 0,730000 1,170000 Praon volucre 32 0,817705 0,081526 0,666667 0,940000 Praon dorsale 13 0,827223 0,084806 0,666667 1,000000 Sve grupe 270 0,824335 0,084194 0,640000 1,170000 Ptl/Ptw Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 3,946429 0,432783 2,850000 5,070000 Praon sp. 17 3,959412 0,469620 3,130000 5,000000 Praon megourae 38 3,991579 0,316983 3,330000 4,560000 Praon longicorne 30 3,912000 0,420758 3,330000 5,000000 Praon volucre 32 4,030335 0,514467 2,916667 5,080000 Praon dorsale 13 3,827805 0,425961 3,272727 4,857143 Sve grupe 270 3,954008 0,428129 2,850000 5,080000 Ptl/Mtl Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 1,595500 0,207039 1,110000 2,100000 Praon sp. 17 1,721765 0,164135 1,530000 2,080000 Praon megourae 38 1,315000 0,142653 1,100000 1,610000 Praon longicorne 30 1,371667 0,252055 0,980000 1,920000 Praon volucre 32 1,652811 0,186405 1,395833 2,000000 Praon dorsale 13 1,420543 0,175965 1,138889 1,750000 Sve grupe 270 1,537470 0,234490 0,980000 2,100000 156 Tabela P2. Deskriptivna statistika svih karaktera po vrstama – ţenke Petl/Petw1 Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 1,302643 0,133635 1,060000 1,690000 Praon sp. 17 1,318235 0,129143 1,110000 1,630000 Praon megourae 38 1,281579 0,116306 1,080000 1,670000 Praon longicorne 30 1,379333 0,124760 1,110000 1,700000 Praon volucre 32 1,374135 0,168133 1,076923 1,810000 Praon dorsale 13 1,422672 0,156460 1,200000 1,680000 Sve grupe 270 1,323434 0,140402 1,060000 1,810000 Petl/Petw2 Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 140 1,564214 0,188611 1,210000 2,200000 Praon sp. 17 1,382353 0,123315 1,180000 1,600000 Praon megourae 38 1,421316 0,134851 1,190000 1,790000 Praon longicorne 30 1,593333 0,137297 1,310000 1,820000 Praon volucre 32 1,557325 0,169569 1,120000 1,900000 Praon dorsale 13 1,612571 0,112662 1,400000 1,769231 Sve grupe 270 1,537399 0,179350 1,120000 2,200000 157 PRILOG 3 Tabela P3. Deskriptivna statistika svih karaktera po vrstama – muţjaci dt Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 44,76543 6,538868 32,00000 61,00000 Praon sp. 2 49,00000 0,000000 49,00000 49,00000 Praon megourae 3 48,33333 6,350853 41,00000 52,00000 Praon longicorne 48 49,18750 6,238713 39,00000 63,00000 Praon volucre 9 42,77778 4,841946 34,00000 50,00000 Praon dorsale 8 46,00000 6,654751 36,00000 55,00000 Sve grupe 151 46,24503 6,612077 32,00000 63,00000 MBF1 Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 6.641975 1.510866 3.000000 9.00000 Praon sp. 2 5.000000 0.000000 5.000000 5.00000 Praon megourae 3 6.000000 1.000000 5.000000 7.00000 Praon longicorne 48 7.812500 1.496894 3.000000 9.00000 Praon volucre 9 5.777778 1.394433 4.000000 8.00000 Praon dorsale 8 6.750000 2.052873 4.000000 9.00000 Sve grupe 151 6.933775 1.635722 3.000000 9.00000 MBF2 Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 6.358025 1.408090 3.000000 9.00000 Praon sp. 2 6.000000 0.000000 6.000000 6.00000 Praon megourae 3 7.333333 1.527525 6.000000 9.00000 Praon longicorne 48 7.604167 1.633943 3.000000 10.00000 Praon volucre 9 5.444444 1.333333 3.000000 7.00000 Praon dorsale 8 6.750000 1.488048 5.000000 8.00000 Sve grupe 151 6.735099 1.598758 3.000000 10.00000 F1l/F1w Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 2,526914 0,399814 2,000000 5,000000 Praon sp. 2 3,000000 0,113137 2,920000 3,080000 Praon megourae 3 2,926667 0,359490 2,640000 3,330000 Praon longicorne 48 2,342292 0,307642 1,820000 3,200000 Praon volucre 9 2,766296 0,365363 2,266667 3,270000 Praon dorsale 8 2,437920 0,158173 2,222222 2,769231 Sve grupe 151 2,491987 0,380427 1,820000 5,000000 158 Tabela P3. Deskriptivna statistika svih karaktera po vrstama – muţjaci F2l/F2w Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 2,174198 0,273317 1,690000 3,400000 Praon sp. 2 2,230000 0,113137 2,150000 2,310000 Praon megourae 3 2,183333 0,127017 2,110000 2,330000 Praon longicorne 48 2,038958 0,275034 1,670000 3,380000 Praon volucre 9 2,389312 0,513077 1,880000 3,670000 Praon dorsale 8 2,127646 0,102595 2,000000 2,294118 Sve grupe 151 2,142483 0,293513 1,670000 3,670000 F1l/F2l Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 1,128642 0,066984 0,970000 1,370000 Praon sp. 2 1,270000 0,056569 1,230000 1,310000 Praon megourae 3 1,176667 0,102144 1,060000 1,250000 Praon longicorne 48 1,125208 0,078686 0,980000 1,340000 Praon volucre 9 1,157603 0,072915 1,062500 1,300000 Praon dorsale 8 1,150919 0,071692 1,055556 1,285714 Sve grupe 151 1,133283 0,073405 0,970000 1,370000 F1w/F2w Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 0,975556 0,083516 0,790000 1,250000 Praon sp. 2 0,940000 0,028284 0,920000 0,960000 Praon megourae 3 0,876667 0,075719 0,790000 0,930000 Praon longicorne 48 0,980417 0,080872 0,840000 1,150000 Praon volucre 9 0,993333 0,104764 0,860000 1,220000 Praon dorsale 8 1,005536 0,066634 0,888889 1,076923 Sve grupe 151 0,977313 0,083231 0,790000 1,250000 Ptl/Ptw Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 3,800617 0,439762 2,820000 5,080000 Praon sp. 2 3,385000 0,077782 3,330000 3,440000 Praon megourae 3 3,743333 0,336204 3,520000 4,130000 Praon longicorne 48 3,742292 0,425312 3,200000 5,130000 Praon volucre 9 3,647156 0,304541 3,210526 4,285714 Praon dorsale 8 3,982166 0,609830 3,333333 5,142857 Sve grupe 151 3,775906 0,435526 2,820000 5,142857 159 Tabela P3. Deskriptivna statistika svih karaktera po vrstama – muţjaci Ptl/Mtl Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 1,610864 0,236248 1,080000 2,130000 Praon sp. 2 1,775000 0,318198 1,550000 2,000000 Praon megourae 3 1,380000 0,036056 1,350000 1,420000 Praon longicorne 48 1,491458 0,250574 1,030000 2,120000 Praon volucre 9 1,682646 0,201593 1,418605 1,914286 Praon dorsale 8 1,528058 0,209588 1,193548 1,750000 Sve grupe 151 1,570386 0,243645 1,030000 2,130000 Petl/Petw1 Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 1,305802 0,134396 1,000000 1,800000 Praon sp. 2 1,150000 0,000000 1,150000 1,150000 Praon megourae 3 1,113333 0,046188 1,060000 1,140000 Praon longicorne 48 1,415417 0,150855 0,910000 1,680000 Praon volucre 9 1,263638 0,083044 1,130000 1,423077 Praon dorsale 8 1,316382 0,184770 1,066667 1,700000 Sve grupe 151 1,332807 0,151793 0,910000 1,800000 Petl/Petw2 Vrsta N Sr. Vrednost Std. Dev. Min Max Praon yomenae 81 1,604321 0,167898 1,210000 2,000000 Praon sp. 2 1,215000 0,205061 1,070000 1,360000 Praon megourae 3 1,313333 0,140119 1,170000 1,450000 Praon longicorne 48 1,636875 0,163501 1,110000 1,920000 Praon volucre 9 1,462918 0,152467 1,130000 1,681818 Praon dorsale 8 1,556088 0,214356 1,142857 1,750000 Sve grupe 151 1,592748 0,180498 1,070000 2,000000 160 9. BIOGRAFIJA Mr Ana S. Mitrovski Bogdanović roĊena je 1979. godine u Kraljevu. Osnovnu školu i Gimnaziju završila je u Kragujevcu sa odliĉnim uspehom. Prirodno-matematiĉki fakultet u Kragujevcu, studijska grupa Biologija, završila je 2003. godine sa proseĉnom ocenom 9.93. Proglašena je za najboljeg studenta Univerziteta u Kragujevcu 2003. godine, od strane Ministarstva prosvete i sporta, a od strane Univerziteta u Kragujevcu za najboljeg diplomiranog studenta Prirodno-matematiĉkog fakulteta. Magistrirala je 2007. godine na Prirodno-matematiĉkom fakultetu u Kragujevcu, smer Entomologija. Magistarski rad, posvećen istraţivanju zemljišnih insekata, nagraĊen je drugom nagradom Srpskog biološkog društva u Beogradu, kao jedan od tri najbolje ocenjena magistarska rada u toku 2006/2007. godine. Doktorske studije na Biološkom fakultetu u Beogradu, oblast Morfologija, sistematika i filogenija ţivotinja, upisala je 2007. godine. Radni odnos zasnovala je na Prirodno-matematiĉkom fakultetu u Kragujevcu 2003. godine u zvanju asistenta pripravnika za uţu nauĉnu oblast Zoologija invertebrata. U zvanje asistenta za uţu nauĉnu oblast Zoologija izabrana je 2008. godine. Oblast nauĉno-istraţivaĉkog rada Ane Mitrovski Bogdanović je taksonomska i filogenetska analiza parazitoida biljnih vašiju, taĉnije kompleksa vrsta Praon dorsale- yomenae (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Rezultate svog nauĉnog rada objavila je u ĉetiri rada u meĊunarodnim ĉasopisima sa ISI liste, ĉetiri rada u nacionalnim ĉasopisima, tri saopštenja na meĊunarodnim kongresima i skupovima i 8 saopštenja na nacionalnim skupovima. Od 2005. godine neprekidno je angaţovana u realizaciji nacionalnih nauĉnih projekata (tri), a u periodu 2010-2012. godine i u realizaciji jednog projekta iz SCOPES programa.