UNIVERZITET U BEOGRADU
BIOLOŠKI FAKULTET
Katarina Zeljić
POVEZANOST POLIMORFIZAMA VDR, CYP27B1 I
CYP24A1 GENA SA ETIOLOŠKIM FAKTORIMA I
ISHODOM BOLESTI KOD PACIJENATA SA
ORALNIM SKVAMOCELULARNIM KARCINOMOM
Doktorska disertacija
Beograd, 2012.
UNIVERSITY OF BELGRADE
FACULTY OF BIOLOGY
Katarina Zeljić
ASSOCIATION OF POLYMORPHISMS IN
VDR, CYP27B1 AND CYP24A1 GENES
WITH ETIOLOGICAL FACTORS AND DISEASE
OUTCOMES IN PATIENTS WITH ORAL
SQUAMOUS CELL CARCINOMA
Doctoral dissertation
Belgrade, 2012.
PODACI O MENTORIMA I ČLANOVIMA KOMISIJE
MENTORI
Dr Marina Stamenković-RadakVanredni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu
Dr sci. med. Zvonko MagićRedovni profesor Medicinskog fakulteta Vojnomedicinske akademije UniverzitetaOdbrane u Beogradu
ČLAN KOMISIJE
Dr Jelena MilašinRedovni profesor Stomatološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu
Datum odbrane: _______________2012. godine
Z A H V A L N I C A
Najsrdačnije se zahvaljujem svojim profesorima i mentorima prof. dr Marini
Stamenković-Radak i prof. dr sci. med. Zvonku Magiću na ukazanom poverenju i pruženojpomoći u toku studija i izrade doktorske disertacije.Iskrenu zahvalnost dugujem prof. dr Jeleni Milašin za predusretljivost i dobrusaradnju i dr biol. sci. Gordani Šupić za maksimalnu pomoć i podršku tokom realizacije ipisanja doktorske disertacije.Kolegama i članovima laboratorije dr biol. sci. Bojani Cikota-Aleksić, mr Nataši
Strelić, spec. biol. Vesni Ilić, mr Aleksandri Petković-Ćurčin i dipl. biohemičaru Stevi
Jovandiću na saradnji, korisnim savetima i lepom vremenu provedenom u laboratoriji.Kolegama sa Katedre za genetiku i evoluciju, a posebno Mariji Savić Veselinović,
Mariji Tanasković, Ljupki Filipović i Mihailu Jeliću, za kolegijalnost, profesionalnesugestije i dobro druženje.Mojim prvim učiteljima biologije Olgi Bogdanović i mr Slobodanki Bobi Milanović,jer su u značajnoj meri doprinele mom profesionalnom opredeljenju.Neizmerno hvala Mihajlu Farkiću na velikoj podršci i razumevanju, uvek i usvemu.Svim svojim prijateljima, jer me je druženje sa njima uveseljavalo i činilo dobroraspoloženom.Mojim Zeljićima i Kojićima na dobroj genetičkoj osnovi.Mojoj inspiraciji i snazi, vama koji ste me naučili pravim vrednostima u životu iomogućili mi da svoja maštanja danas živim. Mojim najdražima: Ivani, mami i tati.
Ovaj doktorat posvećujem vama i našoj Hani.
Srdačno,
Katarina Zeljić
„To što znamo je kapljica,
to što ne znamo je more“.
Isak Njutn
Povezanost polimorfizama VDR, CYP27B1 i CYP24A1 gena sa
etiološkim faktorima i ishodom bolesti kod pacijenata sa oralnim
skvamocelularnim karcinomom
Rezime
Uvod. Oralni skvamocelularni karcinomi (Oral Squamous Cell Carcinoma- OSCC) sekarakterišu visokom stopom mortaliteta, lošom prognozom i porastom incidencemeđu osobama mlađe populacije. I pored uloženih napora na polju prevencije,petogodišnje preživljavanje je ostalo nepromenjeno poslednjih nekoliko decenija,što nameće potrebu za nove, molekularne vidove karakterizacije oralnogkarcinoma. Poznati faktori rizika za nastanak oralnog karcinoma su: pušenje ižvakanje duvana, konzumiranja alkohola, loša oralna higijena i infekcijevisokorizičnim tipovima humanog papiloma virusa. Činjenica da samo izvesniprocenat osoba izloženih navedenim faktorima rizika zaista i razvije OSCC, ukazujena značaj genetičke osnove u procesu oralne kancerogeneze.Mnogobrojnim studijama je pokazano da vitamin D ima antikancerogeniefekat, koji se ogleda u zaustavljanju ćelijskog ciklusa, inicijaciji ćelijskediferencijacije, indukciji apoptoze, sprečavanju invazije malignih ćelija iantiangiogenetskom dejstvu. Vitamin D ispoljava svoju fiziološki aktivnu ulogunakon vezivanja za receptor za vitamin D (engl. Vitamin D Receptor- VDR) koji jekodiran VDR genom. U VDR genu je identifikovan veliki broj polimorfizamanukleotidne sekvence (engl. Single Nucleotide Polymorphisms- SNP), od kojihsamo mali broj ima funkcionalni efekat. U metabolizam vitamina D su uključeničlanovi velike familije proteina citohroma P450 i to: 1α-hidroksilaza uključena uproces anabolizma (kodirana CYP27B1 genom), odnosno 24-hidroksilaza koja imaulogu u katabolizmu (kodirana CYP24A1 genom). Obzirom na značaj proučavanjaSNP-ova u genetičkim studijama asocijacije, postavlja se pitanje da li postojanjeizvesnih genetičkih varijanti u genima uključenim u funkcionisanje i metabolizamvitamina D može biti asocirano sa rizikom nastanka oralnog karcinoma, kliničkopatološkim karakteristikama i preživljavanjem pacijenata.
Cilj. Cilj ove doktorske disertacije je bilo utvrđivanje postojanja asocijacije izmeđupolimorfizama EcoRV, FokI, TaqI, ApaI, BsmI i rs11574085 u VDR genu, rs4646536u CYP27B1 i rs2296241 polimorfizma u CYP24A1 genu sa rizikom za nastanakoralnog karcinoma, etiološkim faktorima i ukupnim preživljavanjem pacijenata.Pored navedenog, cilj je bilo i utvrđivanje postojanja haplotipskih blokova ustudijskoj grupi i asocijacije između registrovanih haplotipova sa rizikom zanastanak oralnog karcinoma i preživljavanjem.
Materijal i metode. Studijska grupa je obuhvatala 110 pacijenata sadijagnostikovanim oralnim skvamocelularnim karcinomom i 122 zdrave osobekontrolne grupe odgovarajuće polne i starosne distribucije. DNK je izolovana izuzoraka primarnih tumora u grupi pacijenata i periferne krvi kontrolne grupe.Genotipovi analiziranih polimorfizama su određivani PCR-RFLP metodom u slučajuVDR EcoRV, FokI, TaqI i ApaI polimorfizama, odnosno Real Time PCR metodom zars11574085 polimorfizam u VDR genu i polimorfizme u CYP27B1 i CYP24A1genima. Dobijeni rezultati su obrađeni statističkim programom SPSS. Vrednostineravnoteže vezanosti kao i učestalosti haplotipova su računate pomoću programa
Haploview, dok je programom Thesias analizirana povezanost izmeđuregistrovanih haplotipova i preživljavanja. Asocijacije su smatrane statističkiznačajnim ukoliko je p vrednost bila manja od 0.05.
Rezultati. Zabeležene su značajne razlike u distribuciji genotipova VDRpolimorfizama EcoRV (p=0.019, χ2 test), ApaI (p=0.013, χ2 test) i BsmI (p=0.025, χ2test), kao i CYP24A1 rs2296241 polimorfizma (p=0.025, Fisher test) između OSCC ikontrolne grupe. Statistički značajna razlika u distribuciji alela je zabeležena uslučaju EcoRV (p=0.019, χ2 test) i ApaI polimorfizma (p=0.019, χ2 test). Asocijacijasa polom je zabeležena za VDR TaqI (p=0.006, χ2 test), BsmI (p=0.002, χ2 test) iCYP27B1 rs4646536 (p=0.014, χ2 test), dok je značajna veza uočena između godinai ApaI SNP-a (p=0.049, χ2 test). Pušenje je bilo u asocijaciji sa TaqI polimorfizmom(p=0.039, χ2 test), dok je analizirani SNP u CYP27B1 genu bio asociran sakonzumacijom alkohola (p=0.012, χ2 test). Kada je reč o kliničko patološkim
odlikama bolesti, zabeleženo je postojanje statistički značajne veze između TaqIpolimorfizma i recidiva bolesti (p=0.008, χ2 test).Uočeno je statistički značajno smanjenje rizika za razvoj oralnog karcinomakod heterozigota AG analiziranog polimorfizma CYP24A1 gena, u odnosu na divljiAA genotip (OR=0.281, p=0.000).Pacijenti FokI ff genotipa su imali lošije preživljavanje (p=0.012, log-ranktest) u poređenju sa heterozigotnim i mutiranim genotipom zajedno. Stratifikovanaanaliza prema nodalnom statusu i stadijumu tumora je pokazala da je ff genotipasociran sa lošijim preživljavanjem u grupi sa negativnim i pozitivnim nodalnimstatusom (redom: p=0.025, p=0.040, log-rank test) i u III stadijumu tumora(p=0.026, log-rank test). Multivarijantna Cox-regresiona analiza je pokazala da seVDR FokI polimorfizam može koristiti kao nezavisni prognostički faktor.
Zaključak. Analiza polimorfizama gena uključenih u funkcionisanje i metabolizamvitamina D može dati važne informacije o razvoju i progresiji oralnog karcinoma.Polimorfizam u CYP24A1 genu je značajno asociran sa sniženim rizikom za razvojoralnog karcinoma, što je najverovatnije rezultat njegovog funkcionalnog efekta ilineravnoteže vezanosti sa drugim polimorfizmima unutar CYP24A1 gena ili čak sapolimorfizmima blisko lociranih susednih gena. Pored toga, ovakav nalaz bi mogaoukazati na potencijalno korišćenje datog polimorfizma CYP24A1 gena uprediktivne svrhe. VDR FokI polimorfizam može biti razmatran kao potencijalnimolekularni marker za preživljavanje, to jest može se koristiti kao nezavisniprognostički indikator. Ovakav nalaz je najverovatnije posledica postojanjafunkcionalnog efekta FokI polimorfizma.
Ključne reči. Oralni skvamocelularni karcinom, polimorfizmi nukleotidnesekvence, VDR gen, CYP27B1 gen, CYP24A1 gen.
Naučna oblast: Biologija
Uža naučna oblast: Genetika
UDK: 575.22: [575.113:577.161.2]]:616-006.6 (043.3)
Association of polymorphisms in VDR, CYP27B1 and CYP24A1
genes with etiological factors and disease outcomes in patients
with oral squamous cell carcinoma
Abstract
Introduction. Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is characterized with a highmortality, low survival rate and rising incidences among members of younger agegroups. Despite efforts in prevention, the survival rate remains unchanged for thelast few decades, which indicates the need for oral cancer molecularcharacterization. The well-known risk factors are tobacco smoking and chewing,alcohol consumption, poor oral hygiene and infection with high risk humanpapilloma virus types. The fact that only a small percentage of people exposed tothe risk factors really develops OSCC indicates the importance of geneticbackground in the process of oral cancerogenesis.Numerous studies have demonstrated the anticancerogen effects of vitaminD, which is reflected in cell cycle arrest, induction of cell differentiation, apoptosisinduction, inhibition of malignant cell invasion and antiangiogenic effect. Vitamin Dexerts it’s physiological function after binding to the Vitamin D Receptor (VDR),which is encoded by the VDR gene. A great number of Single NucleotidePolymorphisms (SNPs) have been identified in the VDR gene, among which a smallnumber have functional effects. Members of the huge protein cytochrome P450family are involved in vitamin D metabolism: 1α-hydroxylase is involved inanabolism (encoded by the CYP27B1 gene) and 24-hydroxylase is involved incatabolism (encoded by the CYP24A1 gene). Since SNPs investigation is of greatimportance in the genetic association studies, it is interesting to consider whethergenetic variants in genes, involved in vitamin D functioning and metabolism, couldbe associated with oral cancer risk, clinicopathological characteristics and patientsurvival.
Aim. The aim of the doctoral dissertation was to determine the associationbetween polymorphisms EcoRV, FokI, TaqI, ApaI, BsmI and rs11574085 in VDRgene, rs4646536 in CYP27B1 and rs2296241 polymorphisms in CYP24A1 genewith oral cancer risk, etiological factors and overall patients’ survival. Besides that,the aim was to determine the existence of haplotype blocks in the study group andto determine the association between detected haplotypes with risk of oral cancerdevelopment and survival.
Material and methods. The study group consisted of 110 patients with diagnosedoral squamous cell carcinoma and 122 healthy individuals in the control group,matched in gender and age. DNA was isolated from the tumour tissue samples inthe patients group and from peripheral blood samples, in the control group. VDRgene polymorphisms EcoRV, FokI, TaqI and ApaI were determined using the PCR-RFLP method and PCR Real Time method in the case of rs11574085 in VDR andpolymorphisms in CYP27B1 and CYP24A1 genes. Obtained results were analysedby the statistical program SPSS. Linkage disequilibrium values as well as haplotypefrequencies were calculated using the Haploview program, while associationbetween detected haplotypes and survival were performed by the program
Thesias. Associations were considered as significant when p values were less than0.05.
Results. The statistically significant differences in the frequencies of the VDRgenotypes were observed between the OSCC and control group for the EcoRV(p=0.019, χ2 test), ApaI (p=0.013, χ2 test) and BsmI (p=0.025, χ2 test)polymorphisms, as well for CYP24A1 rs2296241 polymorphism (p=0.025, Fishertest). The statistically significant differences in the allele distribution was noticedfor the EcoRV (p=0.019, χ2 test) and ApaI polymorphism (p=0.019, χ2 test). Theassociation with gender was observed for VDR TaqI (p=0.006, χ2 test), BsmI(p=0.002, χ2 test) and CYP27B1 rs4646536 (p=0.014, χ2 test), while significantassociation with age was observed for ApaI SNP (p=0.049, χ2 test). Smoking wasassociated with TaqI polymorphism (p=0.039, χ2 test), while analysed SNP inCYP27B1 gene was associated with alcohol consumption (p=0.012, χ2 test). In the
case of clinicopathological variables, statistically significant association wasdetected between TaqI polymorphism and recurrence (p=0.008, χ2 test).The statistically significant decrease of oral cancer risk was observed inheterozygote AG of analysed polymorphism in CYP24A1 gene, in comparison withwild type AA genotype (OR=0.281, p=0.000).Patients with FokI ff genotype had a lower survival rate (p=0.012, log-ranktest) compared with heterozygous and mutated genotype combined. A stratifiedanalysis by the lymph node involvement and tumours stage showed that ffgenotype is associated with poor survival in groups with and without lymph nodeinvolvement (p=0.025, p=0.040, respectively, log-rank test) and in stage IIItumours (p=0.026, log-rank test). Multivariate Cox-regression analysis revealedthat VDR FokI polymorphism could be considered as an independent prognosticfactor.
Conclusions. Analysis of gene polymorphisms involved in vitamin D functioningand metabolism could provide important information on oral cancer developmentand progression. Polymorphism in CYP24A1 gene was significantly associated withoral cancer development, which could be ca onsequence of its functional effect orlinkage disequilibrium with other polymorphisms in CYP24A1 gene or even withpolymorphisms in the nearby different genes. Besides, this finding indicates thatanalysed polymorphism in CYP24A1 gene could be used for predictive purposes.VDR FokI polymorphism could be considered as a potential molecular marker ofsurvival and could be used as an independent prognostic indicator. These findingsmost probably represent the functional effect of FokI polymorphism.
Keywords: oral squamocellular carcinoma, single nucleotide polymorphisms, VDRgene, CYP27B1 gene, CYP24A1 gene.
Scientific field: Biology
Narrower scientific field: Genetics
UDC: 575.22: [575.113:577.161.2]]:616-006.6 (043.3)
S A D R Ž A J
1. UVOD ...........................................................................................................................................11.1. Oralni skvamocelularni karcinom ..........................................................................................31.1.1. Genetička osnova oralne kancerogeneze.....................................................................91.2. Polimorfizmi nukleotidne sekvence ................................................................................... 131.3. Gametska neravnoteža vezanosti ........................................................................................ 151.4. Vitamin D....................................................................................................................................... 161.4.1. Sinteza i metabolizam vitamina D ............................................................................... 201.4.2. Transport vitamina D ....................................................................................................... 241.4.3. Intracelularni signalni putevi vitamina D................................................................. 251.4.4. Biološke funkcije vitamina D ......................................................................................... 261.4.4.1. Ćelijska proliferacija.................................................................................................. 271.4.4.2. Diferencijacija .............................................................................................................. 311.4.4.3. Apoptoza........................................................................................................................ 321.4.4.4. Invazija i metastaza malignih ćelija .................................................................... 341.4.4.5. Angiogeneza ................................................................................................................. 351.4.5. Povezanost geografske širine i vitamina D sa nastankom kancera ................ 361.5. Receptor za vitamin D .............................................................................................................. 371.5.1. Gen za receptor za vitamin D......................................................................................... 461.5.1.1. Polimorfizmi u VDR genu........................................................................................ 491.5.1.1.1. FokI (rs2228570)............................................................................................... 501.5.1.1.2. Poly A (rs2544038) ........................................................................................... 521.5.1.1.3. Cdx-2 (rs11568820).......................................................................................... 521.5.1.1.4. BsmI (rs1544410)-ApaI (rs7975232)-TaqI (rs731236) .................... 531.5.1.1.5. EcoRV (rs4516035)........................................................................................... 541.5.1.1.6. rs11574085 .......................................................................................................... 541.5.1.2. Učestalost SNP-ova i haplotipova VDR gena u različitim populacijama551.6. Enzim 1α-hidroksilaza i CYP27B1 gen .............................................................................. 571.6.1. Polimorfizmi u CYP27B1 genu ...................................................................................... 591.6.1.1. rs4646536..................................................................................................................... 59
1.7. Enzim 24-hidroksilaza i CYP24A1 gen .............................................................................. 601.7.1. Polimorfizmi u CYP24A1 genu...................................................................................... 631.7.1.1. rs2296241..................................................................................................................... 64
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA ....................................................................................................... 65
3. MATERIJAL I METODE ........................................................................................................ 683.1. Studijska grupa ........................................................................................................................... 693.2. Biološki uzorci i izolacija DNK .............................................................................................. 703.3. Provera kvaliteta i koncentracije izolovane DNK .......................................................... 713.4. Lančana reakcija polimerizacije ........................................................................................... 723.5. Analiza polimorfizma dužine restrikcionih fragmenata ............................................. 733.6. Real-Time PCR alelska diskriminacija................................................................................ 753.7. Analiza haplotipova................................................................................................................... 763.8. Statistička analiza....................................................................................................................... 77
4. REZULTATI ............................................................................................................................. 774.1. Analiza polimorfizama u VDR, CYP27B1 i CYP24A1 genima .................................... 784.2. Etiološke i kliničko patološke odlike ispitivane grupe pacijenata .......................... 854.3. Analiza haplotipova................................................................................................................... 924.4. Analiza ukupnog preživljavanja ........................................................................................... 964.5. Analiza promenljivih relevantnih za ukupno preživljavanje ..................................1024.6. Analiza asocijacije haplotipova i preživljavanja...........................................................104
5. DISKUSIJA .............................................................................................................................1055.1. EcoRV polimorfizam ...............................................................................................................1075.2. FokI polimorfizam ...................................................................................................................1095.3. TaqI polimorfizam ...................................................................................................................1135.4. ApaI polimorfizam ...................................................................................................................1155.5. BsmI polimorfizam ..................................................................................................................1175.6. Analiza haplotipova.................................................................................................................1195.7. VDR rs11574085 polimorfizam .........................................................................................1205.8. CYP27B1 polimorfizam..........................................................................................................1215.9. CYP24A1 polimorfizam..........................................................................................................123
6. ZAKLJUČCI.............................................................................................................................132
7. LITERATURA........................................................................................................................136
8. BIOGRAFIJA AUTORA........................................................................................................163
9. PRILOZI..................................................................................................................................165
11. UVOD
Uvod
2
Kancer predstavlja vodeći uzročnik smrtnosti svetske populacije nakonkardiovaskularnih bolesti (Global Cancer: Facts and Figures, 2011). Takvastatistička slika je odlika ne samo nerazvijenih i zemalja u razvoju, već i visokorazvijenih zemalja, kao što su Sjedinjene Američke Države i brojne Evropskedržave (Jemal i sar., 2011; Petersen, 2008).Prema definiciji, kancer predstavlja nekontrolisan rast grupe ćelija,uzrokovane multiplim promenama koje vode narušavanju balansa izmeđuproliferacije ćelija i ćelijske smrti (Ruddon, 2007; Schulz, 2007). Karakterišu senekontrolisanom ćelijskom deobom i rastom, gubitkom kontaktne inhibicije,manjom adhezivnošću i mogućnošću metastaziranja na udaljena mesta u telu(Macdonald i sar., 2004; Rudon, 2007). Prema ustaljenoj literaturnoj klasifikaciji,tumori ili neoplazije (od grčke reči neoplasia-novi rast) se mogu podeliti u dveglavne grupe: benigne i maligne promene. Benigne neoplazije se odlikuju rastomunutar jasno definisane fibrozne kapsule i dobrom diferencijacijom, dok, za razlikuod njih, maligne promene invadiraju okolna tkiva, nediferencirane su ili slabodiferencirane (Mcdonald, 2004; Schulz, 2007). U zavisnosti od porekla ćelija odkojih nastaju, maligne neoplazije mogu biti karcinomi (od epitelijalnih ćelija) ilisarkomi (od mezenhimalnih ćelija). Najveći procenat humanih maligniteta serazvija od epitelnog tkiva, pri čemu se karcinomi koji nastaju od pločastog epitelanazivaju skvamocelularni karcinomi, od bazalnog epitela- bazocelularni kacinomi,dok su nastali od žlezdanog epitela poznatiji kao adenokarcinomi (Ruddon, 2007;Schulz, 2007).Klasifikacija tumora se može vršiti na osnovu više različitih kriterijuma.Moguće je tzv. histološko rangiranje tumora prema stepenu histološkediferencijacije i procene rasta zasnovane na mitotičkom indeksu. Pored toga, jedanod načina klasifikacije se zasniva na proceni stepena atipičnosti ćelija i jedra uodnosu na normalno stanje (Schulz, 2007). Podela se može izvršiti na osnovuveličine tumora (T1-T4), proširenosti na regionalne limfne čvorove, veličine, brojai distribucije invadiranih limfnih čvorova (N0, N+) i prisustva udaljenih metastaza(M0, M+). Poslednji navedeni kriterijumi za određivanje stadijuma tumora sezasnivaju na primeni TNM (engl. Tumor-Node-Metastasis) klasifikacije, koja sedugi niz godina koristi u cilju odabira adekvatne terapije i prognoze (Lindenblatt i
Uvod
3
sar., 2012; Sobin i Wittekind, 2002). Međutim, ova klasifikacija pretpostavljalinearnu progresiju tumora, čime je relativno pojednostavljena i ne uzima u obzirmolekularne promene koje leže u osnovi neoplastične transformacije (Ruddon,2007; Schulz, 2007). Sa brzim razvojem i istraživanjima iz oblasti molekularnegenetike, moderna onkologija nastoji da poveže terapiju i prognozu ishoda bolestisa proučavanjem molekularne biologije tumorske ćelije te da pronađe validnemolekularne biomarkere, čime bi do sada korišćeni princip TNM klasifikacijepretrpeo izvesne promene i bio unapređen (Burke, 2004). Stoga su brojnaistraživanja usmerena na pokušaj integracije bioloških-molekularno genetičkihnalaza i kliničkog određivanja stadijuma bolesti, čime bi postojeće standardneklasifikacije tumora bile dopunjene ili izmenjene preciznijim određivanjemstadijuma bolesti.
1.1. Oralni skvamocelularni karcinom
Oralni skvamocelularni karcinom (engl. Oral Squamous Cell Carcinoma-OSCC) koji je, prema podacima Svetske Zdravstvene Organizacije jedanaestomaligno oboljenje u humanoj populaciji, predstavlja podgrupu karcinoma glave ivrata (engl. Head and Neck Squamous Cell Carcinoma-HNSCC). Više od 90%maligniteta gornjih disajnih puteva i maksilofacijalne regije su skvamocelularnikarcinomi (Johnson i sar., 2011; Lambert i sar., 2011; Warnakulasuriya 2009). Odsvih karcinoma glave i vrata, 44% čine karcinomi oralne duplje, u koje spadajukarcinomi jezika (prve 2/3 jezika), poda usne duplje, tvrdog nepca, usana i bukalnesluzokože (Pfister i sar., 2011) (Slika 1.).
Uvod
4
Slika 1. Tumori glave i vrata (preuzeto: Pfister i sar., 2011, modifikovano)
Oralni skvamocelularni karcinomi se karakterišu visokom stopommortaliteta, lošom prognozom i porastom incidence u razvijenim zemljama, kao imeđu mlađom populacijom i osobama srednjeg životnog doba (Hunter i sar.,2005). I pored napredaka na polju prevencije oralnih karcinoma, petogodišnjastopa preživljavanja je ostala gotovo nepromenjena poslednjih 20 godina (Mascoloi sar., 2012). Kod pacijenata se i dalje često javljaju regionalni recidivi i udaljenemetastaze (Rene-Lemans i sar., 2011). Loša prognoza je najverovatnije rezultatslabog odgovora na postojeću terapiju, uglavnom tumora dijagnostikovanih uuznapredovalom stadijumu (Mascolo i sar., 2012).Po pitanju učestalosti OSCC-a u svetu, zapažena je razlika u pogledugeografskih regiona (Slika 2.). Visoka incidenca je karakteristična za južnu ijugoistočnu Aziju (Šri Lanka, Indija, Pakistan, Tajvan), delove zapadne (Francuska)i istočne Evrope (Mađarska, Slovačka, Slovenija), delove Južne Amerike (Brazil,Urugvaj, Porto Riko) i Kariba i Melanezija (Papua Nova Gvineja) (Lambert i sar.,2011; Warnakulasuriya, 2009; Johnson i sar., 2011; Scully i Bagan, 2009). Što setiče Evrope, najviša incidenca je zabeležena u Francuskoj i Mađarskoj, a najmanja uGrčkoj i na Kipru (Warnakulasuriya, 2009). Generalno govoreći, zastupljenostOSCC-a je viša u zapadnoj u poređenju sa istočnom i južnom Evropom. Sa drugestrane, podaci GLOBOCAN za 2008 godinu pokazuju da je najviša incidenca
Uvod
5
karcinoma oralne duplje zabeležena u Melaneziji, centralnoj i južnoj Aziji,centralnoj i istočnoj Evropi, a najniža u Africi, centralnoj Americi i istočnoj Azijimeđu pripadnicima oba pola (Jemal i sar., 2011; Johnson i sar., 2011).
Slika 2. Zemlje sa visokom incidencom i mortalitetom od oralnog karcinoma(preuzeto: Warnakulasuriya, 2009, modifikovano)
Ovakva distribucija zastupljenosti OSCC-a u svetu ukazuje na značajnuulogu etioloških faktora u razvoju bolesti i to: konzumiranja alkohola, pušenja ižvakanja duvana. Korišćenje genotoksične biljke betel, u čije se listove umotavajumešavina areka oraha, praha kateha akacije i duvan, je tradicionalni običaj kojiupražnjava oko 20% svetske populacije pretežno u Indiji, Papua Novoj Gvineji iKini, gde je incidenca OSCC-a značajno viša u odnosu na ostatak sveta (Scully iBagan, 2009; Nair i sar., 2004). Najčešća mesta za razvoj lezija u oralnoj duplji suventralna strana jezika i pod usne duplje, verovatno zato što se upravo u tomregionu sakupljaju kancerogeni. Zabeleženo je da se incidenca javljanja kancerausana smanjuje već decenijama u Sjedinjenim Američkim Državama (Silverman,2001).
Uvod
6
Prema podacima Republičkog Zavoda za zdravlje Srbije, smrtnost odkarcinoma glave i vrata u Srbiji je porasla za 19.1% u periodu od 1977-2000godine (Broćić, 2008). Mortalitet od OSCC-a u periodu od 1995-2000 godine iznosi0.95% ukupnog mortaliteta uzrokovanog malignim oboljenjima, što je za 0.20%više u odnosu na period od 1990-1995. Na području grada Beograda, mortalitet odkarcinoma glave i vrata predstavlja 2% svih malignih tumora, pri čemu jezabeležena tendencija povećanja za 77% u poslednjih dvadeset godina (Broćić,2008). Brojnim studijama je pokazano da korišćenje duvana i alkohola povećavarizik za razvoj karcinoma glave i vrata na dozno-zavisan način i da su efekti dejstvaovih faktora sinergističke, a ne aditivne prirode (Ragin i sar., 2007). Rizik za razvojoralnog karcinoma kao rezultat sinergističkog dejstva duvana i alkohola seprocenjuje na preko 80%. Procenjuje se da alkoholičari i pušači imaju od 40 do 50puta veći rizik za razvoj OSCC-a od nepušača i nealkoholičara (Warnakulasuriya,2009; Petti i Scully, 2005). Biološko objašnjenje ovog fenomena leži u pretpostavcida etanol oštećuje oralnu mukozu čime bar delimično povećava permeabilnostmukoze za kancerogene prisutne u duvanu i one koji su proizvod metabolizmaetanola u oralnoj duplji kao npr. acetaldehid (Petti i Scully, 2005; Broćić i sar.,2011). Smatra se da konzumiranje marihuane takođe ima ulogu u razvojukarcinoma glave i vrata (Hunter i sar., 2005; Johnson i sar., 2011).Loša oralna higijena se smatra jednim od potencijalnih etioloških faktora itakođe može imati ulogu u nastanku OSCC-a (Scully i Bagan, 2009). Takođe,ispiranje usne duplje alkoholnim rastvorima je asocirano sa nastankom oralnogkarcinoma.Razlika u učestalosti javljanja oralnog skvamocelularnog karcinoma, kao istopi preživljavanja je zabeležena i među polovima (Warnakulasuriya, 2009;Silverman, 2001). Od dijagnostikovanih karcinoma 66-95% je zabeleženo međupripadnicima muškog pola (Silverman, 2001). U visoko rizičnim zemljama kao štosu Indija, Pakistan i Bangladeš, oralni karcinom je najčešći kod muškaraca i dostižedo 25% svih novo dijagnostikovanih slučajeva kancera (Warnakulasuriya, 2009).Prema nekim podacima, diskrepanca u oboljevanju od oralnog karcinoma izmeđupolova se polako smanjuje i odnos je blizu 1.8:1 u korist muškog pola, ali polako
Uvod
7
smanjenje razlike se objašnjava povećanom i prolongiranom upotrebom duvana ialkohola među pripadnicama ženskog pola (Silverman, 2001). Stopa petogodišnjegpreživljavanja od oralnog karcinoma širom sveta je manja od 50%, iako ženegeneralno imaju višu stopu relativnog preživljavanja u odnosu na muškarce (Ragini sar., 2007).Smatra se da su i godine značajan faktor rizika, na šta ukazuje podatak da jeoko 90% oralnih karcinoma detektovano kod osoba starijih od 45 godina, što semože objasniti prolongiranom izloženošću sredinskim kancerogenima,dugogodišnjim pušenjem, konzumiranjem alkohola, izloženošću virusima, lošomishranom (Silverman, 2001). Oko 6% oralnih karcinoma se registruje kod mlađihosoba ispod 45 godina starosti (Warnakulasuriya, 2009). Statistički podacipokazuju da je oko 25% mladih ispod 45 godina života izloženo nekom odpoznatih faktora rizika (Llewellyn i sar., 2004). Međutim, zabrinjavajući je podatakda je incidenca OSCC-a u porastu među osobama između 20 i 30 godina, koji nisuizloženi ni jednom od poznatih faktora rizika, čak i u razvijenim zemljama kao štosu Sjedinjene Američke Države, Velika Britanija i Norveška (Hunter i sar., 2005).„Rasa“ i etnička pripadnost mogu biti značajni za razvoj OSCC-a, što zboggenetičke predispozicije, ali verovatno i socioekonomskih faktora (dostupnostzdravstvenog sistema, loša prevencija i rana detekcija kancera). Najviša incidenca istopa smrtnosti od oralnog karcinoma je detektovana među crncima (Silverman,2001). Stopa petogodišnjeg preživljavanja Afro Amerikanaca iznosi 39.5% što jeznačajno manje u odnosu na stopu preživljavanja Kavkazijanca od 61.8%. Ovakavtrend petogodišnjeg preživljavanja među „rasama“ se nije promenio tokomposlednje tri decenije (Ragin i sar., 2007).Pored navedenih, značajan faktor rizika za razvoj OSCC-a je infekcijahumanim papiloma virusom (engl. Human Papilloma Virus- HPV), a posebnovisoko rizičnim tipovima HPV16 i HPV18. Oko 20-25% karcinoma glave i vratasadrži onkogene HPV tipove, ali pretežno HPV16 (Ragin i sar., 2007). HPV16 iHPV18 su detektovani u 30% OSCC-a, dok se ostali visokorizični tipovi javljaju uučestalosti manjoj od 1% kod ovih karcinoma (Ragin i sar., 2007). HPV proteiniodgovorni za poremećenu regulaciju tumor supresorskih funkcija, transformaciju istimulaciju rasta koja vodi kancerogenezi, su proteini E6 i E7, produkti virusnih
Uvod
8
onkogena E6 i E7. Naime, kod HPV pozitivnih karcinoma glave i vrata, oko 11-50%eksprimira E6 i E7 transkripte, što ukazuje da prisustvo HPV-a ne podrazumevauvek da je virus transkripciono aktivan. Činjenica da prisustvo virusnih onkogenaE6 i E7 nije detektovano u svim HPV pozitivnim karcinomima ukazuje da HPVinfekcija nije jedini i isključivi faktor rizika za razvoja OSCC-a, kako se ispočetkamislilo (Ragin i sar., 2007).Sa razvojem nutrigenomike, veliki značaj se pridaje ishrani, kao važnomfaktoru za prevenciju razvoja kancera (Ross, 2010; Milner, 2008), pa samim tim ioralnog karcinoma. Neka istraživanja procenjuju da je oko 30-40% svih kancerauzrokovano upravo neadekvatnom ishranom, ali ova procena zavisi i od hrane kojase koristi i tipa kancera (Davis i Milner, 2007). Ipak, balansirana ishrana ikorišćenje namirnica bogatih antikancerogenim i antioksidativnim jedinjenjima,pretežno voća i povrća, se smatra bitnim u cilju predupređivanja kancerogeneze(Lambert i sar., 2011). Procenjeno je da se korišćenjem voća i povrća svakog danaza 50% smanjuje rizik od razvoja oralnog karcinoma (Conway, 2007). Korišćenjevoća u ishrani, prevashodno citrusa ima veći protektivni značaj u odnosu naishranu bogatu povrćem (Johnson i sar., 2011). Mnogobrojne studije su pokazaleda korišćenje folata u značajnoj meri može smanjivati rizik od oboljevanja(Pelluchi i sar., 2003). Interesantan je podatak da interakcije između nutritivnihkomponenata mogu uticati na podložnost razvijanja kancera, modifikujući dozunutrijenta koji je potreban da bi se ostvario odgovarajući fiziološki efekat.Pokazano je da male doze retinoične kiseline i vitamina D, kada se daju odvojeno,nemaju efekat na prevenciju kancera dojke, dok pokazuju visok stepen efektivnostikada se daju zajedno (Davis i Milner, 2007). Smatra se da je kombinacija korišćenjaduvana i alkohola, zajedno sa lošom ishranom voćem i povrćem, povezana sapovećanom incidencom HNSCC-a kod mlađe populacije (Hunter i sar., 2005).Ipak, činjenica da samo određeni procenat osoba koji su pod uticajempoznatih faktora rizika zaista i razvije oralni karcinom, sugeriše na postojanjeznačajne genetičke osnove (Scully i Bagan, 2007). Interakcije između genetičkih,epigenetičkih i sredinskih faktora mogu imati bitnu ulogu u etiologiji oralnogkarcinoma. Sa razvojem personalizovane medicine, velika sredstva se ulažu umolekularno genetičke studije, koje nastoje da rasvetle uticaj genetičke osnove za
Uvod
9
razvoj različitih bolesti, a pre svega kancera, kao vodećeg uzročnika smrtnosti usvetu. Pored značajnih napora uloženih u karakterizaciju oralnog karcinoma ihirurških zahvata za njihovo uklanjanje, odsustvo rane senzitivnije dijagnostike ivisoka incidenca regionalnog i lokalnog recidiva nameće potrebu za detaljnijeispitivanje molekularnih osnova patogeneze oralnog skvamocelularnog karcinoma.Identifikacija i uvođenje novih molekularnih markera u dijagnostičke, terapeutskei prognostičke svrhe bi, potencijalno moglo značajno da utiče na smanjenjeincidence razvijanja bolesti, kao i na uspešnije medicinske tretmane.
1.1.1. Genetička osnova oralne kancerogeneze
Oralna kancerogeneza predstavlja heterogeni višestepeni proces koji seogleda u promeni histologije oralnog tkiva, od normalnog, neizmenjenog tkiva kahiperplaziji, displaziji, karcinoma in situ i invazivnog karcinoma (Slika 3.)(Forastiere i sar., 2001; Rene-Leemans i sar., 2011; Choi i Myers, 2008). Neoplazijese razvijaju klonalno iz transformisanih ćelija koje su pretrpele brojne genetičkepromene (Lingen i sar., 2011). Do akumulacije genetičkih promena dolazi usledpostojanja genetičke predispozicije (velikog broja genetičkih i epigenetičkihpromena koje mogu voditi genomskoj nestabilnosti, tumorskom razvoju iprogresiji (Mascolo i sar., 2012)), kao i uticaja faktora spoljašnje sredine, gde senajviši značaj pridaje korišćenju duvana, alkohola, hroničnim inflamacijama ivirusnim infekcijama (Perez-Sayans i sar., 2009; Mascolo i sar., 2012). Molekularnogenetičke promene najčešće pogađaju protoonkogene i tumor supresor gene, kojise mogu inaktivirati ili prekomerno eksprimirati usled mutacija, gubitkaheterozigotnosti (Loss of Heterozygosity-LOH), amplifikacija i/ili delecija iepigenetičkih modifikacija (Perez-Ordonez i sar., 2006; Lingen i sar., 2011). Poredprotoonkogena i tumor supresor gena, genetičke promene pogađaju i druge genekoji su uključeni u održavanje homeostaze, proliferacije i diferencijacije ćelija.Promene se mogu detektovati primenom molekularno genetičkih tehnika usvakom od stupnjeva bolesti ili kancerogeneze (Lingen i sar., 2011).
Uvod
10
Slika 3. Hipotetički model oralne kancerogeneze (preuzeto: Forastiere i sar., 2001,modifikovano)
Niz hromozomskih promena je brojniji sa svakim narednim histološkimstadijumom, počev od benigne hiperplazije, displazije, karcinoma in situ doinvazivnog karcinoma (Tabela 1.). Promene na hromozomima, tačnije LOH 3p, 9p i17p su najčešće na stadijumu displazije, te se stoga mogu smatrati ranimmarkerima oralne kancerogeneze, dok je LOH 8p i 13q češći u kasnijimstupnjevima kancerogeneze (Choi i Myers 2008) (Tabela 1.). Najčešća genetičkapromena koja se dešava u ranim fazama progresije je gubitak hromozomskogregiona 9p21, usled čega dolazi do inaktivacije p14 i p16 gena, inhibitora ciklin-zavisnih kinaza koje imaju ključnu ulogu u regulaciji ćelijskog ciklusa-ćelijskeproliferacije (Perez-Sayans i sar., 2009). LOH 9p21 regiona je detektovan u70-80% slučajeva karcinoma glave i vrata (Perez-Ordonez i sar., 2006). Generalnogovoreći, lokus 9p21 predstavlja najosetljiviji deo humanog genoma kada je reč ooralnom karcinomu i njegova delecija je povezana sa lošom prognozom (Scully isar., 2000).Za većinu oralnih karcinoma II i III tumorskog stadijuma, kao i IV stadijumakarcinoma glave i vrata, zabeležen je LOH 3p (Scully i sar., 2000), koji predstavljadrugu po redu najčešću genetičku promenu u oralnoj kancerogenezi, saučestalošću 60-70% (Perez-Ordonez i sar., 2006). Primenom komparativnegenomske hibridizacije je pokazano da se često dešava delecija na hromozomskojpoziciji 3p14, što predstavlja mesto tumor supresor gena kandidata (Hunter i sar.,2005). Pored ovog regiona, zabeležen je LOH sledećih regiona: 3p21, 3p22, 3p24 i3p26 (Perez-Ordonez i sar., 2006). Delecije 2q21-24, 2q33-35 i 2q37 takođe
Uvod
11
dovode do gubitka brojnih tumor supresor gena uključujući CASP8, CASP10,BARD1, ILKAP, ING5 i druge (Perez-Sayans i sar., 2009).
Tabela 1. Najčešće detektovane genetičke promene na različitim histološkimstadijumima oralne kancerogeneze
Stadijum Genetičke promene
Normalna mukoza-hiperplazija
LOH 9p21Inaktivacija p14/p16Trizomija 7EGFRAktivacija telomeraze
Hiperplazija-displazija
LOH 3pLOH 17p13 (p53 gen)Tetraploidija
Displazija-karcinom in situ
LOH 11q13LOH 13q21del 8pAneuploidijaAmplifikacija ciklina D1
Karcinom in situ-invazivni karcinom
del 18qLOH 10q23LOH 3p26PTEN inaktivacija
Gubitak heterozigotnosti na hromozomskoj poziciji 17p je zabeležen upremalignim oralnim lezijama i ranim stadijuma kancerogeneze (Perez-Sayans isar., 2009). Polovina od svih karcinoma glave i vrata sadrži mutaciju u p53 genukoji se nalazi na hromozomu 17p13 (Perez-Ordonez i sar., 2006). Gubitak funkcijep53 kao posledica mutacije u ovom genu, rezultira progresijom iz preinvazivnih uinvazivne lezije i značajnom povećanju verovatnoće za dalju progresiju bolesti ilošu prognozu (Forastiere i sar., 2001; Scully i sar., 2000).
Uvod
12
U uznapredovalim tumorskim stadijumima i slabo diferenciranimkarcinomima se često mogu naći druge aberacije, kao što je gubitak alela napozicijama 5q21-22, 22q13, 4q, 11q, 18q i 21q (Perez-Sayans i sar., 2009).Analiza genske ekspresije, microarray metodom, je pokazala da postojistatistički značajna razlika u ekspresiji čak 426 gena, od kojih je 322 (75.58%)imalo povećanu, a 104 (24.42%) smanjenu ekspresiju u zdravom tkivu upoređenju sa tumorskim tkivom pacijenata sa dijagnostikovanim oralnimkarcinomom (Perez-Sayans i sar., 2009). Iako je drugim studijama pokazanaizmenjena ekspresija drugih gena, interesantno je da je biološka funkcijaanaliziranih gena u obe studije bila identična. U oralnim karcinomima jezabeležena povećana ekspresija CCND1 gena, koja može dovesti do povećaneekspresije proteina ciklina D1 koji je asociran sa povećanom stopom metastaza ulimfnim čvorovima i lošom prognozom u ranim stadijumima oralnog tumora(Perez-Sayans i sar., 2009). Amplifikacija 11q13 i povećana ekspresija ciklina D1 jeregistrovana u 30-60% slučajeva karcinoma glave i vrata (Perez-Ordonez i sar.,2006). Epigenetičke promene takođe imaju izuzetno važnu ulogu u multistepenomprocesu oralne kancerogeneze (Mascolo i sar., 2012; Šupic i Magić, 2009).Epigenetičke promene obuhvataju nasledne modifikacije u genskoj ekspresiji bezpromene primarne DNK sekvence i to: metilaciju DNK, histonsku modifikaciju iuticaj regulatornih nekodirajućih RNK na gensku ekspresiju (Herman i Baylin,2003; Šupic i Magić, 2009). Geni koji su hipermetilovani u oralnom karcinomu suuključeni u širok spektar ćelijskih procesa, kao što su regulacija ćelijskog ciklusa(p15, p16), apoptoza (p14, DAPK, p73, RASSF1A), Wnt signalni put (APC, WINF1,RUNX3), ćelijska adhezija (E-kadherin) i popravka DNK (MGMT i hMLH1) (Mascoloi sar., 2012; Perez-Sayans i sar., 2009). Za razliku od drugih genetičkih promena,epigenetičke promene su potencijalno reverzibilne.Što se tiče molekularno genetičkih promena koje se javljaju kod mlađihpacijenata u odnosu na starije, zabeležena je značajno viša učestalostmikrosatelitske nestabilnosti (kratkih varijabilnih ponovaka na DNK) kod mlađihosoba (88%) u poređenju sa starijom grupom pacijenata (36%) (Wang i sar.,2001). Međutim, mehanizam mikrosatelitske nestabilnosti u karcinomima glave i
Uvod
13
vrata i oralnog karcinoma nije do kraja rasvetljen, s obzirom da nisu detektovanemutacije i metilacija promotora gena uključenih u reparaciju DNK molekula(Perez-Ordonez i sar., 2006).Saznanja iz oblasti humane molekularne i populacione genetike imaju velikiuticaj na medicinske nauke i praksu. Razumevanje molekularnih puteva uključenihu nastanak bolesti, omogućava nalaženje novih ciljeva za lečenje. Istovremeno,mogućnost predikcije podložnosti bolesti, kao i klasifikacija bolesti u subtipove naosnovu genetičke informacije, će rezultovati poboljšanim medicinskim tretmanomi većom upotrebom farmakogenetike u individualnom lečenju. U tom smislu jevažno uzeti u obzir varijabilnost humanog genoma, a posebno najzastupljenijegtipa varijabilnosti: polimorfizme nukleotidne sekvence.Pored prethodno navedenih detektovanih genetičkih promena koje senalaze u osnovi oralne kancerogeneze, postavlja se pitanje da li postojanjegenetičkih varijacija određenih gena u humanom genomu može imati uticaj narazvoj oralnog karcinoma.
1.2. Polimorfizmi nukleotidne sekvence
Genetičke varijacije u humanom genomu se mogu podeliti na česte i retkevarijante, na osnovu razlike u učestalosti najređeg ili minor alela (engl. MinorAllele Frequency- MAF) u humanim populacijama. Česte genetičke varijante se jošnazivaju i polimorfizmi.Pod genetičkim polimorfizmom se podrazumevaju alelske varijante koje sejavljaju stabilno u populaciji u učestalosti koja je dovoljno velika da se ne smatrasamo proizvodom mutacionog procesa i generalno je veća od 1%, za razliku odretkih varijanti gde je učestalost najređeg alela manja od 1% (Frazer i sar., 2009).U humanom genomu su najzastupljeniji polimorfizmi nukleotidne sekvence (engl.Single Nucleotide Polymorphism- SNP) (Frazer i sar., 2009). SNP predstavljagenetičku promenu ili varijaciju u sekvenci DNK u jednom od četiri nukleotida ugenomu, koji se razlikuje između jedinki iste vrste ili parova hromozoma istejedinke. Rezultatima sekvenciranja je procenjeno da humani genom sadrži
Uvod
14
najmanje 11 miliona SNP-ova, pri čemu oko 7 miliona ima učestalost minor alelapreko 5%, a ostatak između 1-5% (Frazer i sar., 2009). Prema procenama, otprilikejedan na svakih 500-1 000 nukleotida u humanoj DNK može biti SNP. Ako se uzmeu obzir veličina humanog genoma od 3.2 milijarde baznih parova, procenjeno je daoko 1 milion razlika, koje postoje između dva genoma, predstavljaju rezultatpostojanja SNP-ova, što čini oko 85% genetičke varijabilnosti kod čoveka. Takođeje važno napomenuti da postoje varijacije između humanih populacija, tako da SNPaleli koji su česti u jednom geografskom regionu ili etničkoj grupi mogu biti mnogoređi u drugoj.SNP može postojati unutar promotorskog regiona, egzona (kodirajućegregiona gena), introna (nekodirajućeg regiona gena) ili intergenskih regiona.Interesovanje istraživača je posebno fokusirano na SNP-ove pronađene unutarkodirajuće sekvence, jer je verovatnije da oni menjaju biološku funkciju proteina.Međutim, SNP-ovi unutar kodirajućeg regiona gena ne menjaju neizbežno redosledamino kiselina kodiranog proteina, zbog izrođenosti genetičkog koda. SNP-oviidentifikovani unutar introna imaju verovatno manji biološki efekat. Polimorfizminukleotidne sekvence unutar promotorskog regiona su najučestaliji.Kada je reč o nomenklaturi SNP-ova, u najširoj upotrebi je označavanjepozicije nukleotida od startnog mesta transkripcije, pri čemu negativan predznakukazuje da se polimorfizam nalazi u promotorskom regionu, a pozitivan da je uintronu ili egzonu. U današnje vreme je daleko zastupljenije obeležavanjepolimorfizama na osnovu jedinstvenog registarskog broja, takozvani rs broj (engl.Reference SNP ID number), na osnovu koga se može pretraživati u dostupnoj SNPbazi podataka (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).Pored SNP-ova postoji jako veliki broj retkih ili de novo varijanti jednognukleotida. Na primer, bilo koji izmenjeni bazni par koji je kompatibilan sa životomse može pronaći u najmanje jednom od 6.7 milijardi ljudi na Zemlji (Frazer i sar.,2009). SNP-ovi blisko locirani na hromozomu se mogu nalaziti u vezanojneravnoteži (videti sledeće poglavlje).Na osnovu podataka dobijenih analizom SNP-ova, može se dosta saznati oevolucionoj prošlosti humanih populacija. Istovremeno, takvi podaci predstavljaju
Uvod
15
i bogat izvor za razvijanje posebne grane medicine tzv. genetičke medicine. Naime,postojanje različitih varijacija sekvence DNK kod ljudi može imati izvesneposledice po pitanju podložnosti bolestima, odgovoru na patogene, hemikalije,lekove, vakcine i druge agense. Poznavanje i proučavanje SNP-ova predstavljaznačajan izvor za razumevanje genetičke osnove velikog broja složenih bolesti.Genomskim studijama asocijacije (engl. Genome Wide Association Studies- GWAS)se ispituju povezanosti određenih alelskih varijanti sa rizikom tj. podložnošćurazvijanja bolesti. Stoga se smatra da su SNP-ovi ključ u omogućavanju realizacijekoncepta personalizovane medicine, te se u današnje vreme rapidno povećava brojbiomedicinskih istraživačkih radova koji imaju za cilj determinaciju polimorfizamakoji bi imali ulogu izvesnih molekularnih markera i važnih terapeutskih iprognostičkih faktora.
1.3. Gametska neravnoteža vezanosti
Pod konceptom gametske neravnoteže vezanosti (engl. LinkageDisequilibrium- LD) se podrazumeva neslučajna asocijacija alela/polimorfizama narazličitim lokusima i njihova vezana, zajednička segregacija u gamete (Collins,2008; Slatkin, 2008; Wall i Pritchard, 2003). Ovaj termin su prvi put upotrebilinaučnici Lewontin i Kojima još 1960. godine. Tokom osamdesetih godina XX veka,interesovanje za LD je naglo poraslo. Tako je jedan od zadataka prve fazeinternacionalnog HapMap projekta bilo raščlanjivanje genoma u grupe visokovezanih SNP-ova koji se nasleđuju zajedno (tzv. LD ili haplotipski blokovi)(www.hapmap.org). U drugoj fazi je predstavljeno da se velika većina SNP-ovamože svesti na oko 550 000 LD blokova kod individua Evropskog i Azijskogporekla i 1 100 000 LD blokova kod individua Afričkog porekla. Generalno gledano,koncept LD-a nam daje uvid u populacionu prošlost, mapiranje gena koji su uasocijaciji sa kvantitativnim osobinama i naslednim bolestima, kao i razumevanjeevolucije vezanih setova gena.Prema veličini haplotipski blokovi kod ljudi variraju od nekoliko kb do višeod 100 kb (u proseku oko 50 kb), pri čemu su kraći blokovi karakteristični za
Uvod
16
Afričke populacije i generalno za izolovane populacije (Collins, 2008; Slatkin,2008). Haplotipski blokovi su predstavljali iznenađujuće otkriće velikog praktičnogznačaja za mapiranje naslednih bolesti. Otkrićem haplotipskih blokova je pokazanoda LD blokovi zauzimaju mnogo veće hromozomske distance, tako da testiranjejednog SNP-a unutar jednog bloka na asocijacije sa bolestima može biti dovoljno daukaže na postojanje asocijacije sa svakim SNP-om u datom bloku (Collins, 2008).Očigledan je praktični značaj, s obzirom da se primenom navedene logike smanjujebroj SNP-ova koji bi trebalo da budu testirani u uzoračko-kontrolnim studijamaasocijacije sa bolestima.Najvažniji parametri za merenje jačine LD-a su r2 i D’. Obe mere mogu imativrednosti u rangu od 0 (odsustvo vezanosti-neravnoteže) do 1 (potpuna vezanost-neravnoteža) (Wall i Pritchard, 2003). Danas je dostupan veliki broj programa zamerenje jačine LD-a, haplotipske analize i procene haplotipskih učestalosti ugrupama nesrodnika uzoračko-kontrolnih studija (Barrett i sar., 2005; Fallin iSchork, 2000).
1.4. Vitamin D
Vitamin D je otkriven krajem XIX veka, zahvaljujući sprovođenju brojniheksperimenata koji su imali za cilj pronalaženje uzročnika bolesti rahitisa. Još odpočetka XIX veka je bilo poznato da se nastanak rahitisa može predupreditiizlaganjem Sunčevom zračenju. Nemački naučnici su 1919. godine pokazali da seza lečenje rahitisa može koristiti i veštačko ultravioletno zračenje. 1923. godine jenaučno potvrđeno da se vitamin D može stvarati izlaganjem 7-dehidroholesterolaSunčevom ili veštačkom ultravioletnom zračenju. Ova mogućnost produkcijevitamina D usled izlaganja Sunčevom zračenju i metabolizma do steroidnoghormona, ukazuje da nije reč samo o vitaminu, već i o hormonu (Dusso i sar.,2005). Struktura vitamina D je poznata od početka XX veka (Lin i White, 2003). Rečje o steroidnom molekulu, preciznije sekosteroidu, koji se u prirodi javlja u dveforme: vitamin D3 (holekalciferol) i vitamin D2 (ergokalciferol) (Bikle, 2009; Vuolo
Uvod
17
i sar., 2012). Holekalciferol je animalnog porekla i produkuje se u koži poddejstvom Sunčevog zračenja, dok se ergokalciferol produkuje kod biljaka i kvasacaod biljnog sterola ergosterola (Bikle, 2007).Vitamin D se može apsorbovati iz namirnica koje su bogate vitaminom D(masne ribe, kao što su : losos, tuna; riblje ulje, jetra, žumance jajeta, sir, sušenepečurke, itd) (Davis i Milner, 2011; Kemmis i sar., 2006). U mnogim zemljama,među kojima je i Srbija, brojne namirnice, kao što su mleko, mlečni proizvodi,margarini, cerealije su obogaćene vitaminom D, čime se može značajno povećatiunos ovog vitamina (Davis i Milner, 2011). Nakon II svetskog rata, obogaćivanjenamirnica vitaminom D nije bilo adekvatno praćeno i kontrolisano, što je vodilointoksikaciji vitaminom D i hiperkalcemiji, prvenstveno kod dece. Upravo zbogtoga, mnoge Evropske države su uvele zabranu obogaćivanja namirnica vitaminomD (Field i Newton-Bishop, 2011).Najpoznatija fiziološka uloga koju vitamin D ima je regulacija transportakalcijuma i fosfata kao i uloga u mineralizaciji kostiju. Značaj ove funkcije jepokazan eksperimentima na nokaut (engl. knockout) miševima deficijentnim zaneki od gena koji su ključni za metabolički put vitamina D. Gubitak tih gena kodmiševa je rezultirao abnormalnom morfologijom kostiju (Deeb i sar., 2007).Međutim, novije opservacije epidemioloških, biohemijskih i molekularnogenetičkih studija ukazuju da vitamin D zapravo ima plejotropnu ulogu u regulacijidiferencijacije i proliferacije ćelija, kao i programirane ćelijske smrti- apoptoze,modulaciji imunskog odgovora i kontrolisanju endokrinog sistema (Deeb i sar.,2007; Lin i White, 2003, Dusso i sar., 2005; Bikle, 2009). S obzirom da vitamin Dučestvuje u regulaciji proliferacije i diferencijacije brojnih ćelijskih tipova, sve seviše ispituju mogućnosti potencijalnog korišćenja vitamina D i/ili njegovihsintetičkih analoga u terapeutske svrhe, kao antikancerogenih agenasa imodulatora imunološke funkcije.Prema aktuelnim podacima, veliki procenat svetske populacije imadeficijenciju vitamina D, oko milijardu ljudi širom sveta (Ramagopalan i sar., 2010;Aung i sar., 2009; Dusso i sar., 2005) uključujući stanovništvo Severne Amerike iEvrope, što je posledica ishrane siromašne vitaminom D, ali i izbegavanje sunčanjai korišćenja zaštite od Sunca, koja u potpunosti može da blokira fotosintezu
Uvod
18
vitamina D (Dusso i sar., 2005; Garland i sar., 2004). Upravo ovakvi epidemiološkinalazi dovode u opravdanu sumnju vezu između vitamina D i podložnostirazvijanja različitih tipova karcinoma, kao što su kolorektalni karcinom, kancerdojke, prostate, oralni karcinomi (Deeb i sar., 2007,), ali i sa razvojemautoimunskih bolesti, respiratornih infekcija, hipertenzije, kardiovaskularnihbolesti i dijabetesa tip I i II (Dusso i sar., 2005; Vuolo i sar., 2012). Značaj vitaminaD u prevenciji kancera je pokazan mnogobrojnim epidemiološkim studijama ukojima je primećena asocijacija između incidence javljanja kancera i stepenaizlaganja Suncu (Aung i sar., 2009).Kao indikator statusa vitamina D se koristi nivo glavne cirkulišuće formevitamina D u plazmi, 25(OH)D3, poznatiji kao kalcidiol (Dusso i sar., 2005), čija jekoličina oko 1 000 puta viša u odnosu na aktivnu metaboličku formu kalcitriol (Loui sar., 2004). Uočeno je postojanje veze između niskog nivoa vitamina D u serumu ipovećanog rizika za razvoj različitih tipova kancera, a posebno kolorektalnogkarcinoma, kancera dojke i prostate (Deeb i sar., 2007). Takođe, poznato je da jepovećanje od 25 nmol/L 25(OH)D3 asocirano sa 17% smanjenjem morbiditeta i29% smanjenjem mortaliteta od malignih tumora uopšte, dok je u slučaju kanceradigestivnog sistema zabeležno čak 45% smanjenje smrtnosti (Giovannucci i sar.,2006). Osobe sa koncentracijom kalcidiola od 82 nmol/L su imale 50% manji rizikza razvoj kolorektalnog karcinoma u odnosu na osobe sa nižim nivoom kalcidiola(Deeb i sar., 2007; Gorham i sar., 2005). Pacijenti sa dijagnostikovanim ne-sitnoćelijskim karcinomom pluća, u ranom stadijumu, sa visokom koncentracijom25(OH)D3 i visokim unosom vitamina D u toku lečenja, su imali bolje ukupnopreživljavanje i duži period bez pojave recidiva (Zhou i sar, 2007). Kod žena jenizak nivo cirkulišuće forme vitamina D povezan sa povećanim rizikom zanastanak kancera dojke (Alimirah i sar., 2011). Takođe, kod žena u postmenopauzisa ranim kancerom dojke je registrovan nizak srednji nivo 25(OH)D3 i njegovihprekursora u serumu, dok je dalje smanjenje nivoa serumskog 25(OH)D3 ukorelaciji sa progresijom bolesti i pojavom metastaza. Pored toga, niži nivoserumskog 25(OH)D3 je naveden kao faktor rizika za razvoj kolorektalnogkarcinoma i kancera prostate (Osborne i Hutchinson, 2002). Svi ovi podaci jasnoukazuju da je nizak nivo vitamina D važan faktor rizika za razvoj maligniteta.
Uvod
19
Već neko vreme je poznato da postoje značajne rasne/etničke razlike univou vitamina D u serumu. Osobe Afričkog porekla imaju oko dva puta niži nivo25(OH)D3 u serumu u poređenju sa individuama Evropskog porekla (Roff i sar.,2008; Garland i sar., 2004). Afro Amerikanci imaju niži prosečni nivo 25(OH)D3 upoređenju sa Kavkazijancima iz Sjedinjenih Američkih Država, pri čemu seinsuficijencija vitamina D kreće u opsegu od 40-80% (Signorello i sar., 2011). Upoređenju sa belcima, kod Afro Amerikanaca je značajno viša učestalost karcinomakolona, prostate i dojke, što se dovodi u vezi u vezu sa nižim nivoom vitamina D ucirkulaciji, ali ukazuje i na izvesnu ulogu polimorfnih varijanti u genima uključenihu put metabolizma vitamina D, koji mogu imati uticaj na ispoljavanje ovih razlika(Roff i sar., 2008).Da bi bio fiziološki aktivan i obavljao sve prethodno navedene biološkefunkcije, vitamin D se prevodi u metabolički aktivnu formu, 1α25(OH)2D3,poznatiju kao kalcitriol, koji se sintetiše od nativne forme vitamina D koja jeprisutna u provitaminskoj formi u našem organizmu.
Uvod
20
1.4.1. Sinteza i metabolizam vitamina D
Vitamin D je prisutan u humanom organizmu u provitaminskoj formi,7-dehidroholesterol (7-dehidroholekalciferol), u ćelijama bazalnog sloja kože.Sinteza metabolički aktivne forme, kalcitriola, predstavlja višestepeni kompleksanfotohemijski proces (Slika 4.).
Slika 4. Fotohemijski proces sinteze aktivne forme vitamina D od7-dehidroholesterola
Kao što je rečeno u prethodnom poglavlju, vitamin D3 se može unositi uorganizam i ishranom namirnicama koje sadrže vitamin D (jaja, riba, namirniceobogaćene vitaminom D) (Slika 5.). Smanjeno Sunčevo zračenje predstavlja bitanograničavajući faktor za sintezu vitamina D. Pod dejstvom Sunčeve svetlosti, Bprsten 7-dehidroholesterola se otvara, te tako dobijen pre-vitamin D3 izomerizujedo vitamina D3 termo-senzitivnim procesom, ali ne katalitičkim procesom.
Uvod
21
Pokazano je da je formiranje pre-vitamina D3 relativno brzo i da dostižemaksimum tokom nekoliko sati (Bikle, 2009). Međutim, prilikom dužegvremenskog izlaganja Sunčevom zračenju pre-vitamin D3 se konvertuje do biološkineaktivne forme lumisterola (Bikle, 2009).Konformacione promene vitamina D3, dobijenog izomerizacijom pre-vitamina D3, omogućuju vezivanje za vitamin D vezujući protein i transportkrvotokom do jetre (Slika 5.). U mitohondrijama jetre se holekalciferol hidroksilujepomoću enzima 25-hidroksilaze (25(OH)-aza, kodiran genom CYP27A1), kojadodaje OH grupu na 25-i ugljenikov atom, čime nastaje 25-hidroksiholekalciferol(25(OH)D3), poznatiji kao kalcidiol. Regulacija 25-hidroksilacije vitamina D je slaboregulisana i nivo porasta 25(OH)D3 je u proporciji sa količinom uzimanja vitaminaD, zbog čega se upravo nivo 25(OH)D3 u plazmi koristi kao pokazatelj statusavitamina D. Tako nastali 25-hidroksiholekalciferol, koji je glavna cirkulišuća formavitamina D, se u mitohondrijama proksimalnih tubula bubrega dalje hidroksilujepomoću enzima 1α-hidroksilaze (1α(OH)-aza, kodiran genom CYP27B1),dodavanjem OH grupe na 1α ugljenikov atom, što rezultira konačniim stvaranjemaktivnog sekosteroida 1α25-dihidroksiholekalciferola, 1α25(OH)2D3, poznatijegkao kalcitriol, koji ima biološku aktivnost (Slika 5.). Proces 1α-hidroksilacije25(OH)D3 u bubregu je visoko regulisan i sinteza kalcitriola je stimulisanaparatireoidnim hormonom, dok je suprimirana visokim nivoom Ca2+, P i kalcitriola(Bikle, 2007). Iako su proksimalne tubule bubrega glavni izvor produkcije1α25(OH)2D3 u telu, enzim 1α-hidroksilaza je pronađen i u drugim ćelijama itkivima, kao što su: imunske ćelije, epitelna i mnoga druga tkiva (Bikle, 2007),kosti i paratireoidna žlezda (Bikle, 2009), prostata, kolon, dojka, pluća, β-ćelijepankreasa, monociti (Dusso i sar., 2005). Takvi nalazi su ukazivali na mnogobrojnepotencijalne uloge koje vitamin D može imati, pored uloge u regulaciji transportaP+ i Ca2+ i mineralizacije kostiju.
Uvod
22
Slika 5. Šematski prikaz metabolizma vitamina D
Ograničavajući korak u anabolizmu i biološkoj aktivnosti kalcitriolapredstavlja 24-hidroksilacija 25(OH)D3 i 1α25(OH)2D3 enzimom 24-hidroksilazom(24(OH)-aza, kodirana CYP24A1 genom) do metabolita 24,25(OH)2D3 i1α24,25(OH)3D3. 1α24,25(OH)3D3 je deset puta manje aktivan u poređenju sa1α25(OH)2D3, čija dalja oksidacija vodi progresivnom gubitku biološke aktivnosti iprodukcije hidrofilnih kalcitroičnih kiselina koje će biti ekskretovane (Lin i White,2003; Vuolo i sar.,2012). Miševi kojima nedostaje funkcionalan gen koji kodira24-hidroksilazu imaju visok nivo 1α25(OH)2D3 u serumu, s obzirom na smanjenumogućnost da ga degraduju (Dusso i sar., 2005). Aktivnost 24-hidroksilaze jeregulisana recipročno u odnosu na 1α-hidroksilazu, tako što se aktivnost iekspresija povećavaju fosfatom, a smanjuju paratireoidnim hormonom (PTH).Koncentracija kalcitriola je regulisana povratnom spregom, gde povećanje24,25(OH)2D3 indukuje sintezu kalcitriola 1α25(OH)2D3, dok Ca2+, P+ i samkalcitriol suprimiraju sintezu. Biološka aktivnost metabolički aktivne forme
Uvod
23
vitamina D i njegovih analoga je u korelaciji sa koncentracijom slobodnog vitamina(Maruyama i sar., 2006).S obzirom da se sinteza vitamina D u koži odvija pod uticajem Sunčevogzračenja, količina glavne cirkulišuće forme 25(OH)D3 u serumu pokazuje sezonskovariranje, pri čemu je najviša koncentracija tokom leta, a najniža tokom zime iranog proleća (Berry i Hypponen, 2011). Na koncentraciju 25(OH)D3 utiču igeografska širina, deo dana i klima. Takođe, efikasnija sinteza vitamina D jezapažena kod osoba svetlije puti, što se smatra adaptacijom i posledicom migracijetokom evolucije iz sunčanih južnih regiona u severne krajeve sa slabijim Sunčevimzračenjem (Berry i Hypponen, 2011). Pored toga, status vitamina D je u vezi saishranom, količinom masnog tkiva i fizičkom aktivnošću. Primećeno je da postojiveza između redovne fizičke aktivnosti i višeg nivoa cirkulišuće forme vitamina D.Gojaznost je asocirana sa smanjenom količinom 25(OH)D3 (Davis, 2009; Lagunovai sar., 2009). Naime, gojazne osobe imaju viši sadržaj masti koje predstavljajurezervoar liposolubilnog vitamina D. Oslobađanje vitamina D iz masti se odvijarelativno sporo, što zapravo predstavlja biološki mehanizam kojim se organizamštiti od toksičnih efekata aktivne forme vitamina D, zadržavajući optimalni nivo ukrvi (Lagunova i sar., 2009). Takođe je primećeno da je veza između statusavitamina D, gojaznosti i fizičke aktivnosti bila jača kod belaca u odnosu na AfroAmerikance (Davis, 2009). Faktori koji imaju veze sa sunčanjem (ultravioletnozračenje, sezona, vreme provedeno napolju, geografska širina), ishrana i drugekarakteristike (godine, gojaznost, rasa, pušački status, alkohol) doprinose oko 20-40% na variranje nivoa cirkulišuće forme 25(OH)D3 (Signorello i sar., 2011).Metabolizam vitamina D može biti modifikovan mnogim faktorima ishrane(kalcijum, soja, folati) (Davis, 2009). Na primer, postoje dokazi da genistein, važnabioaktivna komponenta soje inhibira aktivnost 24(OH)-aze, čime se povećavaprodukcija i poluživot kalcitriola u serumu. Korišćenje folata u ishrani takođe možedovesti do inhibiranja aktivnosti 24(OH)-aze, kao posledica povećane metilacijepromotorskog regiona i samim tim smanjene ekspresije CYP24A1 gena.
Uvod
24
1.4.2. Transport vitamina D
S obzirom da su metaboliti vitamina D lipofilni molekuli, slabo rastvorljivi uvodi, dalji transport cirkulacijom se odvija zahvaljujući vezivanju za proteineplazme. U tom smislu je najvažniji vitamin D vezujući protein (engl. Vitamin DBinding Protein- BDP) koji vezuje metabolite vitamina D sledećim afinitetom(Dusso i sar., 2005):
25(OH)D3= 24,25(OH)2D3> 1α25(OH)2D3> vitamin D
Nivo BDP-a u plazmi je dvadeset puta viši nego ukupna količina metabolitavitamina D, tako da se preko 99% metabolita vezuje upravo za ovaj protein itransportuje cirkulacijom (Dusso i sar., 2005; Kochupillai, 2008).Metaboliti vitamina D vezani za DBP imaju ograničeni pristup ciljnimćelijama i stoga su manje podložni hepatičnom metabolizmu i ekskreciji, što njihovcirkulišući poluživot čini dužim. DBP praktično ima ulogu i u zaštiti odintoksikacije vitaminom D. Nivo DBP-a nije regulisan vitaminom D, ali se smanjujeu slučaju bolesti jetre, nefrotičnih sindroma i pothranjenosti, dok se tokomtrudnoće povećava i usled korišćenja estrogenske terapije (Dusso i sar., 2005).Ipak, koncentracija 1α25(OH)2D3 ostaje konstantna i usled promenjene količineDBP-a. Raniji dokazi su sugerisali da samo mala frakcija nevezanih metabolitapasivno prolazi i ulazi u ciljne ćelije gde se dalje metabolišu ili ispoljavaju svojubiološku aktivnost. Danas je poznato da 25(OH)D3 ne ulazi prostom difuzijom ućelije proksimalnih tubula bubrega koje sadrže 1α-hidroksilazu, već je ulazakposredovan DBP receptorom. Megalin je deo kompleksa proteina koji ima ulogu uolakšanoj endocitozi (Slika 6.).
Uvod
25
Slika 6. Ulazak 25(OH)D3 u proksimalne tubule bubrega posredstvom receptoramegalina (preuzeto: Dusso i sar., 2005, modifikovano)
Po ulasku u ćeliju DBP se degraduje, oslobađajući 25(OH)D3 za daljumetaboličku obradu enzimom 1α-hidroksilazom ili 24-hidroksilazom.Translokacija 25(OH)D3 u mitohondrije predstavlja olakšan, pre nego pasivanmehanizam. COOH terminus megalina interaguje sa bar dva intracelularna vitaminD vezujuća proteina (engl. Intracellular Vitamin D Binding Proteins-IDBP) IDBP-1 iIDBP-3. Zapravo IDBP-3 interaguje direktno sa 1α-hidroksilazom. Prekomernaekspresija IDBP-3 u ćelijama koje eksprimiraju megalin povećava ulazak 25(OH)D3u mitohondrije, gde se vrši hidroksilacija.
1.4.3. Intracelularni signalni putevi vitamina D
Steroidni hormoni imaju ulogu hemijskih glasnika u velikom broju vrsta iciljnih tkiva za prenošenje signala koji rezultuju generisanjem brzih genomskihodgovora. Sposobnost steroidnih hormona, uključujući i vitamin D da generišebiološke odgovore je određena prisustvom njihovih receptora u određenim ciljnimorganima i tkivima (Norman, 2006). Kalcitriol je konformaciono fleksibilanmolekul koji učestvuje u stimulaciji brze intestinalne apsorpcije Ca2+, sekrecijeinsulina u β-ćelijama pankreasa, otvaranje jonsko zavisnih kanala za kalcijum u
Uvod
26
osteoblastima, brze migracije endoteliajalnih ćelija i mnoge druge (Norman, 2006).Klasični signalni put vitamina D se odvija, kao i za sve steroidne molekule, prekojedarnog receptora za vitamin D (engl. Vitamin D Receptor-VDR), koji je ujedno itranskripcioni faktor. Postoji takođe i veliki broj dokaza za učešće citoplazmatskihputeva u koje su uključeni citoplazmatski i membranski receptori koji su nezavisniod jedarnog VDR receptora. Stimulacija ovih puteva rezultira post-translacionimefektima, koji se brzo dešavaju, tokom nekoliko minuta, ali takođe mogu imati igenomske efekte, koji se ostvaruju nakon nekoliko sati ili dana (Osborne iHutchinson, 2002).
1.4.4. Biološke funkcije vitamina D
Biološke funkcije vitamina D se mogu podeliti u dve grupe: klasične ineklasične. Pored toga što je od davnina poznato da vitamin D ima ulogu uregulaciji metabolizma kalcijuma i fosfata, što bi predstavljalo klasičnu funkciju, jošod 1980. godine je poznato da metabolički aktivna forma vitamina D imapotencijalno antiproliferativno dejstvo i uticaj na diferencijaciju ćelija. Naime,1981. godine je pokazano da 1α25(OH)2D3 u nanomolarnoj koncentraciji inhibiraklonalnu proliferaciju humanih ćelijskih linija leukemije i podstiče diferencijacijunormalnih i mijeloidnih prekursora prema zrelijim, manje agresivnimfenotipovima (Thorne i Campbell, 2008). Ovim rezultatima je pokazano da1α25(OH)2D3 može biti potencijalno koristan za tretman leukemija i drugihmijeloproliferativnih bolesti. Antineoplastična aktivnost 1α25(OH)2D3 je pokazanai u in vitro i in vivo studijama na raznim malignim ćelijskim tipovima razvijenih odrazličitih tkiva, kao što su leukemije, kolon, prostata, dojka (Bouillon i sar., 2008).Mehanizmi koji leže u osnovi ovog procesa nisu u potpunosti rasvetljeni, ali jepokazano da se smanjenje ćelijskog rasta odvija preko brojnih ćelijskih puteva,uključujući zaustavljanje ćelijskog ciklusa, indukciju apoptoze i izmenjenuaktivaciju signalizacije fakora rasta (Deeb i sar., 2007; Cui i Rohan, 2006).Neklasične funkcije vitamina D su predstavljene na Slici 7. Efekat vitamina D naapoptozu, invaziju malignih ćelija, metastazu i angiogenezu se intenzivno proučava
Uvod
27
(Osborne i Hutchinson, 2002). Indukcija programirane ćelijske smrti doprinosiantineoplastičnoj aktivnosti kalcitriola, ali i inhibicija angiogeneze i invazivnostimogu doprineti antitumorskoj aktivnosti (Ali i Vaidya, 2008). Protektivna ulogavitamina D u nastanku kancera je potvrđena postojanjem asocijacija između pojavekancera prostate, dojke, kolorektalnog kancera i deficijencije vitamina D.
Slika 7. Neklasične funkcije metabolički aktivne forme vitamina D-kalcitriola
U predstojećem tekstu će biti prikazani samo neklasični vidovi aktivnostimetabolički aktivne forme vitamina D i to molekularni mehanizmi kojima vitaminD utiče na ćelijski rast, invaziju malignih ćelija, indukciju apoptoze i inhibicijuangiogeneze .
1.4.4.1. Ćelijska proliferacija
Kalcitriol, 1α25(OH)2D3, utiče na proliferaciju i diferencijaciju brojnihćelijskih tipova koji eksprimiraju receptor za vitamin D. Efekat 1α25(OH)2D3 naćelijski ciklus je pokazan na malignim ćelijama u kulturi in vitro i u in vivo modeluskvamocelularnih karcinoma (Nagpal i sar., 2005). Centralni efekat na proliferacijuvitamin D ostvaruje u G1/S kontrolnoj tački ćelijskog ciklusa (Slika 8.). Generalnoje prihvaćeno stanovište da velika većina kancera poseduje aberacije upravo u
Uvod
28
ovoj kontrolnoj tački. Kada se ćelija nalazi u G1 fazi, G1/S kontrolna tačka jeblokirana nefosforilisanom formom proteina retinoblastoma (Rb), koji vezuje iinaktivira transkripcione faktore, npr. E2F (Slika 9.). Transkripcioni faktor E2F jeesencijalan za sintezu DNK u S fazi i neophodan je za regulaciju proteina potrebnihza progresiju iz G1 u S fazu ćelijskog ciklusa. Fosforilacija Rb proteina ciklinzavisnom kinazom 4 (CDK4), CDK6 ili CDK2 uklanja inhibitorni efekat i oslobađatranskripcione faktore (Slika 8., Slika 9.). Ciklin zavisne kinaze se aktiviraju jednapo jedna ciklinima i to ciklinom D i E. CDK su inhibirane sa dve klase CDKinhibitora (p15, p16) koji odvajaju ciklin od ciklin-CDK kompleksa i cip-kipproteina (npr. p27, p21), koji zarobljavaju ćeliju u G1 fazi. Kombinovanimdelovanjem ovih „čuvara“ ćelijskog ciklusa, proliferacija ćelija kancera jeonemogućena. 1α25(OH)2D3 indukuje gensku transkripciju inhibitora ciklinzavisnih kinaza p21 (WAF1/CIP1), što se smatra dovoljnim za zaustavljanje rasta ipodsticanje diferencijacije (Slika 10.). Pretpostavlja se da vitamin D može direktnostimulisati transkripcionu aktivnost p21, s obzirom da su u genu koji kodira za p21CDK inhibitor identifikovani VDRE elementi (Liu i sar., 1996). Pored toga, kalcitriolindukuje sintezu i/ili stabilizaciju inhibitora ciklin zavisne kinaze p27 (KIP1)(Lamprecht i Lipkin, 2003; Ylikomi i sar., 2002; Jensen i sar., 2001; Hansen i sar.,2001). Povišen nivo p27 je zabeležen u slučaju ćelija karcinoma glave i vrata kojesu tretirane kalcitriolom (Lin i White, 2003). Od svih regulatora ćelijskog ciklusa,samo za p21 je pokazano da podleže efektu kalcitirola in vivo. Naime, nakondavanja kalcitriola tokom tri dana miševima sa skvamocelularnim karcinomom,uočena je značajna redukcija veličine tumora, što je bilo u vezi sa povećanjemnivoa p21 (Hershberger i sar., 2000).Takođe, pokazano je da kalcipotriol, analog kalcitriola povećava ekspresijup21 u normalnoj ljudskoj koži (Deeb i sar., 2007). S obzirom da je uticaj vitamina Dna ćelijski ciklus posredovan Rb proteinom, povišena ekspresija ilihiperfosforilacija Rb proteina može uticati na efekat vitamina D (Lou i sar., 2004;Ylikomi i sar., 2002). Pored toga, glavna cirkulišuća forma vitamina D, 25(OH)D3, ukoncentraciji koja je niska da aktivira receptor za vitamin D, može zaustaviti rastćelijama koje eksprimiraju 1α-hidroksilazu. Kalcitriol takođe vrši negativnu
Uvod
29
kontrolu ekspresije ciklina D, ključnog regulatora ćelijskog ciklusa, čija jeekspresija često značajno povišena u tumoru kolona (Lamprecht i Lipkin, 2003).
Slika 8. Faze i regulacija progresije ćelijskog ciklusa
Slika 9. Pojednostavljeni prikaz regulacije G1/S kontrolne tačke ćelijskog ciklusa
Uvod
30
Slika 10. Inhibitorni efekat vitamina D na ćelijski ciklus (slika rađena po uzoru naLamprecht i Lipkin, 2003).
Sumirano, vitamin D ima inhibitorni efekat na G1/S kontrolnu tačku i možepotpuno zaustaviti ćelijski ciklus u toj tački multiplim mehanizmima (Carlberg iSeuter, 2009; Stewart i Weigel, 2004). Glavni efekat 1α25(OH)2D3 je regulacijainhibitora CDK i regulacija aktivatora. Kada su različiti tipovi ćelija kancera izloženivitaminu D, dolazi do smanjenja broja ćelija koje se nalaze u S fazi, praćenoakumulacijom velikog broj ćelija u G0-G1 fazi. Količina ćelija koje se nalaze u G2fazi ili fazama mitoze se ne menja usled tretmana vitaminom D (Hansen i sar.,2001). Kalcitriol može imati indirektni efekat na regulaciju ćelijskog ciklusa. Takona primer 1α25(OH)2D3 dovodi do povećanja ekspresije IGFBP3 gena (engl.Insuline Like Growth Factor Binding Protein 3) i transformisanja TGFβ-SMAD3signalne kaskade, što dovodi do inhibicije proliferacije epitelijalnih ćelija (Deeb isar., 2007; Lamprecht i Lipkin, 2003). U LNCaP ćelijskim linijama kancera prostate,IGFBP3 je neophodna komponenta koja zajedno sa kalcitriolom indukujezaustavljanje ćelijskog ciklusa povećanjem ekspresije p21/WAF1 (Lou i sar., 2004).Iako je u prethodnom tekstu dat pregled načina na koji kalcitriol vršiinhibiciju proliferacije, smatra se da se precizni molekularni mehanizmiantiproliferativnog dejstva kalcitriola razlikuju od jednog do drugog tumorskogtipa.
Uvod
31
1.4.4.2. Diferencijacija
Da li je indukcija ćelijske diferencijacije vitaminom D posledica blokiranjaprogresije ćelijskog ciklusa ili je obrnuto, predmet je mnogobrojnih rasprava.Istovremeno se postavlja pitanje da li se ova dva procesa uopšte mogu razdvojiti ilisu čak potpuno nezavisni. Prema jednom stanovištu, diferencijacija je očiglednopovezana sa ćelijskim ciklusom i asocirana sa usporavanjem ćelijskog ciklusa, npr.povišenom ekspresijom p21, koji ima inhibitorni efekat na ćelijsku proliferaciju,što samim tim može podsticati diferencijaciju. Međutim, neki smatraju daantiproliferativni i prodiferencirajući efekti 1α25(OH)2D3 nisu povezani, te damanje koncentracije kalcitriola, koje su dovoljne da indukuju diferencijaciju ćelija,istovremeno mogu indukovati proliferaciju, pre nego da je inhibiraju (Osborne iHutchinson, 2002).Bez obzira na stavove, veliki je broj dokaza koji govore da je vitamin Dpovezan sa indukcijom procesa diferencijacije. U normalnim ćelijama,1α25(OH)2D3 podstiče diferencijaciju keratinocita od epidermalnih prekursora(Reichrath i sar., 1999), monocita-makrofaga od mijeloidnih progenitora iosteoklasta od mononukleusnih prekursora (Osborne i Hutchinson, 2002). Studijegenske ekspresije u ćelijama kancera, microarray metodom, su pokazale dakalcitriol deluje na maligne ćelije karcinoma glave i vrata, kolona i prostateinicirajući diferencijaciju (Lin i White, 2003; Deeb i sar., 2007). Ćelije karcinomaglave i vrata, tretirane analogom kalcitriola, EB1089, su pokazivale povišenuekspresiju nekoliko gena koji su uključeni u proces ćelijske diferencijacije (cistatinM, proteaza M, kolagen tip 13, dezmoglein 3) (Lin i White, 2003). U ćelijamakancera dojke, tretiranim vitaminom D u in vitro uslovima, uočeno je povećanjeapolipoproteina D, za koji se smatra da je povezan sa stepenom diferencijacije ikliničkim ishodom karcinoma dojke kod žena (Lopez-Boado i sar., 1997).Povećanje sekrecije markera diferencijacije, specifičnog antigena prostate, jeregistrovano nakon izlaganja ćelija kancera prostate kalcitriolu (Hansen i sar.,2001).
Uvod
32
1.4.4.3. Apoptoza
Pored antiproliferativnog efekta, sve je veći broj dokaza da kalcitriolispoljava antitumorske efekte regulacijom ključnih medijatora apoptoze i torepresijom ekspresije antiapoptotskih proteina ili indukujući ekspresijuproapoptotskih proteina. Indukcija apoptoze nakon tretmana vitaminom D jepokazana u slučaju kancera dojke, kolona, prostate, kao i melanoma, mijeloma iglioblastoma (Hansen i sar., 2001). Tačan proces kojim 1α25(OH)2D3 indukujeapoptozu je slabo okarakterisan, ali se pretpostavlja da je reč o višestrukommehanizmu. Efekat može biti klasifikovan kao indirektni, preko efekta na faktorerasta ili citokine i njihove receptore, ili direktan, gde se efekat ostvaruje namolekule koji su deo signalnog puta, što rezultira apoptozom. Konačni zajedničkisignalni put apoptoze je kaskada kaspaza. Kaspaze su familija evolucionokonzerviranih cistein proteinaza, vitalnih citoskeletnih i jedarnih proteina. Putaktiviranja kaspaza može biti podeljen u dve glavne grupe: spoljašnji, koji uključujereceptore smrti i unutrašnji put koji uključuje mitohondrije.Spoljašnji put pokretanja apoptoze aktivira receptore uništenja (ćelijskesmrti) koji se nalaze na površini ćelije i koji će pokrenuti aktivaciju kaspaza (Slika11.). Protein BID, član BCL-2 familije proteina, nakon isecanja od strane kaspaze 8,se translocira u spoljašnju membranu mitohondrija i indukuje otpuštanjeproapoptotskih faktora.Dobro poznat mitohondrijalni sistem uključuje BCL-2 familiju, čiji su članovii antiapoptotski (BCL-2 i BCL-X) i proapoptotski (BAX, BID, BAD) molekuli. Smatrase da se BAX i BAK proteini translociraju iz citoplazme u membranu mitohondrija,gde oligomerizuju. Efekti BAX i BAK proteina se ogledaju u otvaranjumitohondrijskih permeabilnih tranzicionih pora (PT), redukciji mitohondrijskogtransmembranskog potencijala, gubitaku kalcijuma i stvaranju reaktivnih vrstakiseonika. Posledično, dolazi do otpuštanja citohroma c u citosol, koji indukujeformiranje kompleksa APAF1 (engl. Apoptotic Protease Activating Factor 1) i pro-kaspaze 9 u molekularni kompleks apoptozom, što dovodi do stvaranja aktivnekaspaze 9. Kaspaza 9 aktivira kaspazu 3, što konačno vodi ćeliju u apoptozu.
Uvod
33
BCL-2 je inhibitor permeabilne PT pore u membrani mitohondrija. Postojinekoliko potvrda da se povećanje odnosa BAX/BCL-2 od strane 1α25(OH)2D3 ilinjegovih analoga, može odvijati preko snižene ekspresije BCL-2 ili prekotranslokacije proapoptotskog proteina BAX u mitohondriju. Poznato je dasfingomijelin-ceramid-gangliozid GD3 signalni put indukuje apoptozu. Agonistovog puta je 1α25(OH)2D3. Neki podaci ukazuju da vitamin D snižava ekspresijuproteina članova IAP familije, koja je uključena u inhibiciju apoptoze. Takođe serazmatra mogućnost direktnog delovanja vitamina D na mitohondrije.
Slika 11. Proapoptotski efekat vitamina D (preuzeto: Lamprecht i Lipkin, 2003,modifikovano)
U ćelijama kancera dojke 1α25(OH)2D3 indukuje apoptozu recipročnommodulacijom BCL-2 i BAX. Takođe povećava intracelularni kalcijum, koji aktivirakalcijum zavisne proapoptotske proteaze i kaspaze 12. Prema jednom odpredloženih mehanizama, kalcitriolom posredovana apoptoza u epitelijalnom
Uvod
34
kanceru ovarijuma je povezana sa destabilizacijom iRNK telomeraze reverznetranskriptaze, čime se apoptoza praktično pokreće kao posledica sniženeregulacije telomerazne aktivnosti (Jiang i sar., 2004; Deeb i sar., 2007). Sa drugestrane, 1α25(OH)2D3 štiti keratinocite od apoptoze indukovane UV zračenjem ilihemoterapijom. U normalnim tkivima proapoptotske osobine kalcitriola su ključneu kontroli hiperplastičnog rasta. Uzeto sve zajedno, ovi nalazi ukazuju da vitamin Dima proapoptotske i antiapoptotske efekte koji su važni u razvoju i funkcijinormalnog tkiva, kao i indukciji zaustavljanja rasta u kancer i nekancerskimhiperproliferativnim bolestima.
1.4.4.4. Invazija i metastaza malignih ćelija
Invazija i metastaza malignih ćelija predstavljaju veliki klinički problem iglavni uzrok smrti pacijenata obolelih od kancera. Reč je o kompleksnimmehanizmima koji uključuju vezivanje tumorskih ćelija za komponenteekstracelularnog matriksa, degradaciju ekstracelularnog matriksa, kretanjetumorskih ćelija kroz degradiran prostor, indukciju angiogeneze i proteolitičkihenzima i njihovih inhibitora. Sposobnost tumorskih ćelija da invadiraju imetastaziraju zavisi od stepena diferencijacije, s obzirom da su slabo diferenciranećelije invazivnije u poređenju sa ćelijama koje se nalaze na višem stupnjudiferencijacije.Bitna funkcija vitamina D je i sprečavanje invazije malignih ćelija. Pokazanoje da tretman fiziološkim koncentracijama 1α25(OH)2D3 inhibira invaziju brojnihmalignih ćelijskih tipova, kao što su karcinomi prostate, dojke i pluća (Osborne iHutchinson, 2002). 1α25(OH)2D3 u ćelijama kancera prostate inhibira migracijuendotelnih ćelija (Deeb i sar., 2007). In vivo studijama je pokazano da uvođenje1α25(OH)2D3 inhibira invaziju malignih ćelija kod eksperimentalno indukovanogkancera bešike kod pacova (Konety i sar., 2001). Što se tiče mehanizma, pokazanoje da 1α25(OH)2D3 inhibira serin proteinaze, npr. komponente plazminogenaktivator sistema i određene matriks metaloproteinaze i njihove inhibitore kojiimaju važnu ulogu u invaziji malignih ćelija. Smanjena ekspresija urokinaza PA itipova tkiva PA i povećanje ekspresije PA inhibitora u odgovoru na 1α25(OH)2D3 je
Uvod
35
pokazano u kancer ćelijama dojke, dok je registrovano smanjenje ekspresije MMP-2 u kancer ćelijama prostate i MMP-9 u karcinomima dojke i prostate (Osborne iHutchinson, 2002). Sprečavanje metastaze od strane 1α25(OH)2D3 se može jošobjasniti anti-angiogenetskim efektima vitamina D.Kao posledica tretmana analogom kalcitriola, EB1089, u ćelijama karcinomaglave i vrata je pokazana represija ekspresije nekoliko markera ćelijske progresije(N-kadherin, tumor antigen L6, tenascin-C) (Lin i White, 2003). Tenascin-C jeekstracelularni matriks protein sa invazivnim i angiogenetskim aktivnostima kojije aktiviran u mnogim ćelijskim tipovima tokom geneze tumora (Osborne iHutchinson, 2002). Pokazano je da je transkripcija tenascin-C inhibiranakalcitriolom u brojnim normalnim, kao i malignim epitelnim humanim i mišjimćelijskim linijama (Osborne i Hutchinson, 2002).
1.4.4.5. Angiogeneza
Jedna od osnovnih odlika tumorskog rasta je pojačano formiranje krvnihsudova, procesom koji se naziva angiogeneza. Kalcitriol takođe može inhibiratiangiogenezu, čime se efekti vitamina D kao antikancerogenog faktora moguzaokružiti u jednu celinu. In vitro studije su pokazale da 1α25(OH)2D3 inhibiraproliferaciju nekih tipova tumora poreklom od endotelnih ćelija i da istovremenoinhibira faktore rasta vaskularnog endotela čime se intenzitet angiogenezesmanjuje (Mantell i sar., 2000). In vivo studijama u imunosuprimiranim miševima,angiogeneza je indukovana intradermalnim injektiranjem humanih ćelijskih linijarazličitog porekla, a potom inhibirana kalcitriolom, koji je dostavljen sistematski iu životinje in vivo i u tumorske ćelije in vitro (Osborne i Hutchinson, 2002).Pokazano je da 1α25(OH)2D3 povećava nivo iRNK vaskularnog endotelnogfaktora rasta (engl. Vascular Endotelial Growth Factor-VEGF) u glatkimvaskularnim mišićnim ćelijama i reguliše nivo iRNK anti-angiogenetskog faktoratrombospondina 1 u SW480-ADH humanim tumorskim ćelijama kolona (Deeb isar., 2007). U ćelijama skvamocelularnih karcinoma, 1α25(OH)2D3 indukuje sintezuangiogenetskog faktora IL-8, dok u ćelijama kancera prostate 1α25(OH)2D3prekida signalni put IL-8, čime inhibira migraciju endotelnih ćelija (Vuolo i sar.,
Uvod
36
2012; Bao i sar., 2006). Značajna inhibicija metastaze je postignuta u modelimakancera prostate i pluća, tretiranih kalcitriolom i ovi efekti se mogu bar delimičnopripisati anti angiogenetskom efektu.
1.4.5. Povezanost geografske širine i vitamina D sa nastankom
kancera
Brojnim studijama je pokazano da je porast geografske širine, počev odekvatora i smanjenje pigmentacije kože u značajnoj vezi sa povećanjem inicidenceza pojavu različitih tipova kancera ili povećanjem agresivnosti kancera (Osborne iHutchinson, 2002; Deeb i sar., 2007; Bouillon i sar., 2006). Ovakva veza se možeobjasniti smanjenom sintezom vitamina D usled smanjene izloženosti efektivnomSunčevom zračenju, kao i korišćenju zaštite od Sunca. Incidenca kancera dojke jeveća u zemljama koje su locirane na većim geografskim širinama (Aung i sar.,2009; Osborne i Hutchinson, 2002) i povećana je stopa smrtnosti što se dodatnopovezuje i sa zagađenjem vazduha odnosno sa oštećenjem ozonskog omotača(Gorham i sar., 1989; Osborne i Hutchinson, 2002). Afro Amerikanke imaju lošijuprognozu karcinoma dojke u poređenju sa belkinjama Amerikankama, dokHispano Amerikanke imaju manje agresivnu formu bolesti u odnosu na Afrikanke,ali agresivniju u poređenju sa belkinjama (Elledge i sar., 1994). U navedenoj studijiveličina tumora i smanjena učestalost limfnih metastaza je bila asocirana sasmanjenom pigmentacijom kože.Pretraživanjem literature, može se naći veliki broj studija koje ukazuju napovezanost geografskih razlika koje koreliraju sa dostupnošću Sunčevog zračenja iincidence nastanka različitih tipova kancera. Na primer, u poređenju saAfrikancima iz Nigerije, Afro Amerikanci imaju šest puta povećan rizik za razvojkancera prostate (Osborne i Hutchinson, 2002). Latentne forme kancera prostatesu jednako zastupljene kod afrikanske i kavkazijanske rase. Kod Azijata, rizik zanastanak kancera prostate je povećan među migrantima, što se povezuje saishranom koja je manje bogata ribljim uljem (Osborne i Hutchinson, 2002).
Uvod
37
Rizik od nastanka kancera kolona i mortaliteta raste sa porastomgeografske širine i smanjenjem intenziteta Sunčevog zračenja i u urbanimregionima je dodatno asociran sa kiselom zagađenošću vazduha (Gorham i sar.,1989). Značajan izuzetak je Japan, koji ima relativno nisku incidencu kancerakolona (Osborne i Hutchinson, 2002).Veći indeks sunčanja i izloženost UV zračenju je imao protektivni efekat zarazvoj kancera prostate (John i sar., 2005). Najveći protektivni efekat je zabeleženu slučajevima regularnog sunčanja tokom detinjstva.Na osnovu epidemioloških podataka, uočeno je da je promena količinevitamina D asocirana sa pojavom karcinoma dojke, prostate i kolona (Deeb i sar.,2007). Nekoliko studija je sugerisalo postojanje recipročne veze između slabogunosa vitamina D i pojave kolorektalnog karcinoma, što drugim studijama nijepotvrđeno (Osborne i Hutchinson, 2002).
1.5. Receptor za vitamin D
Već tokom druge polovine XX veka, tačnije 1969. godine je potvrđenopostojanje receptora za vitamin D (engl. Vitamin D Receptor- VDR) u jedrima ćelijakoje su inkubirane sa radioaktivno obeleženim 1α25(OH)2D3 (Norman, 2006; Lin iWhite, 2003). Receptor je najpre identifikovan u jedrima ćelija intestinumakokoške, a kasnije i u drugim ćelijama i tkivima (Osborne i Hutchinson, 2002). VDRje prisutan u preko 30 tkiva kod čoveka (Norman, 2006). Dokaz o prisustvureceptora za vitamin D u tkivima koja nemaju ulogu u homeostazi mineralnih jonakalcijuma i fosfata je ključno i ukazivalo je na otkriće drugih funkcija koje vitaminD ima. Receptor za vitamin D pripada superfamiliji steroidnih hormonskihjedarnih receptora, konzervirane domenske strukture, koji predstavljaju ligande,aktivatore transkripcionih faktora. Da bi se izmenio nivo transkripcije ciljnih gena,VDR se vezuje za 1α25(OH)2D3, čime postaje aktivisani transkripcioni faktor kojidalje interaguje sa koregulatorima i transkripcionim preinicijacionim kompleksom(Dusso i sar., 2005). U tom smislu, bitno je poznavanje građe receptora zahvaljujući
Uvod
38
kojoj je moguće obavljanje uloge aktivacije transkripcionih faktora. Receptor jeizgrađen od 427 amino kiselina, težak 100 kDa i veličine 10 nm(www2.cnrs.fr/en/1961.htm). Kristalna struktura VDR-a je prikazana na Slici 12.
Slika 12. Kristalna struktura receptora za vitamin D(Preuzeto: www.drnickcampos.com/health-newsletter/VitD.html)
Humani VDR protein ima domensku strukturu, koja je, kao i kod drugihjedarnih receptora organizovana u pet regiona (A-E) (Slika 13.). Ligand vezujućidomen (engl. Ligand Binding Domain-LBD) se nalazi na COOH–terminusu VDRmolekula i odgovoran je za visoko afinitetno vezivanje kalcitriola, 1α25(OH)2D3.Druge metaboličke forme kalcitriola: 25(OH)D3 i 24,25(OH)2D3 se vezuju sa 100puta manjim aviditetom. Naime A prsten kalcitriola sadrži 1α hidroksilnu grupuzahvaljujući kojoj se vrši vezivanje za VDR. Afinitet za vezivanje liganda nijeapsolutni pokazatelj transkripcione aktivnosti VDR-a aktiviranog ligandom.Intracelularni vezujući proteini koji posreduju u isporučivanju liganda ka i od VDRreceptora mogu menjati stepen vezivanja odnosno asocijacije liganda i VDR-a. NaCOOH kraju ligand vezujućeg domena se nalazi ligand zavisni aktivator funkcije 2(AF2) (Slika 13.), koji ima glavnu ulogu u ostvarivanju konformacionih promenatrodimenzionalne strukture VDR-a i koji je esencijalan za aktivaciju transkripcije(Lin i White, 2003; Dusso i sar., 2005). Ovaj aktivacioni korak je neophodan za
Uvod
39
pokretanje motornih proteina koji su odgovorni za brzo translociranjecitoplazmatičnog VDR molekula do jedra pomoću mikrotubula (Dusso i sar., 2005).
Slika 13. Šematski prikaz građe VDR receptora
DNK vezujući domen (engl. DNA Binding Domain-DBD) je visokokonzerviran među steroidnim jedarnim receptorima i nalazi se u C regionu VDRproteina (Slika 13.). DBD je organizovan u dva „Zn-zinc“ modula. „Zinc finger“ jeDNK vezujući motiv koji je odgovoran za visoko afinitetnu interakciju saspecifičnim DNK sekvencama u promotorskom regionu ciljnih gena, nazvanihvitamin D elementi (engl. Vitamin D Response Elements- VDRE). Inače, mutacije u„zinc finger“ regionu humanog VDR-a rezultuju u defektnom vezivanju za DNK iposledično najtežim kliničkim fenotipovima rezistencije na vitamin D.Na N terminalnom kraju VDR proteina, u okviru A/B domena se nalaziligand zavisni transaktivacioni domen AF1 (Slika 13.), koji ima bitnu ulogu uostvarivanju tkivno specifične funkcije steroidnih receptora (Orlov i sar., 2012;Carlberg i Seuter, 2009). S obzirom da je A/B domen relativno kratak u VDRproteinu, funkcija AF1 može biti ograničena (Amano i sar., 2009).VDR protein se može naći i u citoplazmi i jedru, ali se akumulira u jedrunakon vezivanja kalcitriola (Hansen i sar., 2001). Slično drugim jedarnimreceptorima, VDR funkcioniše kao heterodimer sa članovima familije receptora:retinoid X receptorima (engl. Retinoid X Receptor-RXR) (Slika 14.). AsocijacijaVDR-a sa RXR-om podrazumeva dimerizaciju površine u tri različita domena VDRmolekula i indukuje VDR konformaciju koja je neophodna za transaktivirajućufunkciju VDR-a, kao i visokoafinitetno vezivanje za DNK (Dusso i sar., 2005; Lin iWhite, 2003). Vezivanje kompleksa kalcitriol-VDR-RXR za VDRE uzrokuje savijanje
Uvod
40
DNK za 55 stepeni iz horizontalnog položaja, ali veza između savijanja DNK u VDRposredovanoj transkripciji je još uvek nejasna. RXR se vezuje za 5' kraj, a VDR sa 3'kraj VDRE elemnata unutar promotora.VDRE elementi se sastoje od dva heksanukleotidna ponovka koja surazdvojena varijabilnim brojem nukleotida (npr. GGTCCA-N-GGTCCA, gde je N brojnukleotida) (Orlov i sar., 2012; Amano i sar., 2009). Najčešći VDRE tip, DR3, sadržidva ponovka konsenzus sekvence AGGTCA, međusobno odvojenu sa tri nukleotida(Slika 14.). Ova sekvenca usmerava VDR-RXR heterodimer do promotorskogregiona ciljnih gena kalcitriola.
Slika 14. Šematski prikaz vezivanja VDR-RXR heterodimera za DR3 VDRE elementpromotora ciljnog gena
VDR vezujući element DR3 je identifikovan u velikom broju regulatornihregiona mnogih gena, između ostalog u CYP24A1 genu. Drugi tip VDRE, IP9 sesastoji od dve invertovane palindromske sekvence odvojene sa devet nukleotida.Interesantno je da su VDRE elementi gena čija je aktivnost suprimirana VDR-usličnim DR3 sekvencama koje su detektovane u genima čija je transkripcijaindukovana vitaminom D. Stoga se dugo postavljalo pitanje koji mehanizamzapravo određuje da li će genska transkripcija biti suprimirana ili indukovanakalcitriolom. Otkriće interakcije VDR-a sa jedarnim koregulatornim molekulimadaje novi uvid u načine za pozitivnu i negativnu regulaciju transkripcije
Uvod
41
posredovane VDR-om. Dva domena VDR-a imaju ulogu adaptorne površine zajedarne proteine neophodne za interakciju VDR-a sa koregulatorima. Prvi je RXRheterodimerizujući domen, visoko konzerviran među jedarnim receptorima, kojiformira deo vezujuće površine sa transkripcionim koaktivatorima. Drugi domen jeprethodno opisani AF2, koji prolazi kroz veliku konformacionu promenu nakonvezivanja liganda, izlažući helix 12 (Slika 14.) što omogućava regrutovanje VDRinteragujućih proteina, tačnije otpuštanje korepresora i vezivanje koaktivatora(Orlov i sar., 2012).Koregulatori se mogu podeliti u tri funkcionalne grupe:
1) kompleks koregulatora koji reguliše transkripcionu aktivnost direktnominterakcijom sa transkripcionim faktorima i RNK polimerazom II2) kompleks koji učestvuje u modifikaciji histonskih repova acetilacijom ideacetilacijom3) kompleks uključen u ATP zavisno remodelovanje hromatina.
Čitav kompleksni put regulacije genske transkripcije posredovane VDR-ombi se mogao ukratko predstaviti na sledeći način (Slika 15.): 1α25(OH)2D3 disocirasa vitamin D vezujućeg proteina u cirkulaciji, ulazi u ćeliju i vezuje se za receptorza vitamin D, koji se nalazi u citosolu i/ili jedru (Osborne i Hutchinson, 2002). Ovoligandno vezivanje dovodi do konformacionih promena u samom receptoru,izlažući površinu za vezivanje koregulatornih faktora i dimerizaciju sa RXR-om,koji je podređen, ali obavezan član za potpunu transaktivaciju VDR-a.Heterodimerni kompleks kalcitriola i receptora za vitamin D, nakon vezivanja zaretinoid X receptor interaguje sa regionima DNK, VDRE elementima prekopromotora ciljnih gena, što za ishod ima aktivaciju ili represiju transkripcije.Kontrola transkripcije zahteva dodatno regrutovanje koregulatora (Bikle, 2009).
Uvod
42
Slika 15. Regulacija genske ekspresije posredovane VDR-om (Preuzeto: Deeb i sar.,2007, modifikovano)
Put transkripcione aktivacije uključuje vezivanje koaktivatora SRC1 (iliSRC2, SRC3), NcoA62-SKIP i histonskih acetiltransferaza: CBP-p300 i PBAF-SWI-SNF, koji vrši acetilaciju histona u nukleozomu i oslobađa DNK za transkripciju.Kada se hromatin dekondenzuje, VDR-interagujući proteini (DRIP) formirajukompleks koji se vezuje za AF2 domen VDR receptora. DRIP205 interagujedirektno sa VDR-om, tj. AF2 domenom. Ovaj DRIP kompleks, koji se sastoji od oko15 proteina predstavlja most između VDR-a i transkripcione mašinerije, s obziromda interaguje sa transkripcionim faktorima, uključujući transkripcioni faktor 2B(TF2B) i RNK polimerazu II, čime se inicira transkripcija (Slika 15.). Dakle, jedarnikoaktivatori sinergistički deluju sa VDR-om i značajno amplifikuju genskutranskripciju (Dusso i sar., 2005).
Uvod
43
U slučaju transkripcione represije posredovane VDR-om (Slika 15.),vezivanje VDR-RXR kompleksa za VDRE elemente regrutuje korepresor VDIR,disocijaciju histonskih acetiltransferaznih koaktivatora i regrutovanje korepresorahistonskih deacetilaza (HDAC, NcoR-SMRT), koji održavaju hromatin utranskripciono neaktivnom stanju. Ovi molekuli onemogućavaju oslobađanjehromatina i samim tim vezivanje proteina (TATA vezujućih proteina), koje jeobavezno za inicijaciju transkripcije ciljnih gena pomoću RNK polimeraze II.Williams sindrom transkripcioni faktor (WSTF) pojačava represiju tako štointeraguje sa multifunkcionalnim ATP-zavisnim hromatin remodelujućimkompleksom (WINAC). To vodi represiji gena, među kojima je i CYP27B1 gen.Jedan od komodulatora NcoA62/Skip ima bifunkcionalnu ulogu i može učestvovatiu transkripcionoj inicijaciji ili supresiji, zavisno od tipa ćelije i ekspresijekoregulatornih molekula.Iako je VDR jedarni receptor, zabeleženo je njegovo prisustvo i u citoplazmi,tako da je pored genomskih signalnih puteva vitamina D, poznat i negenomski putaktivacije. Naime, kalcitriol se može vezati za citosolni i membranski VDR (koji jenađen u kalveolama), koji će se potom translocirati u jedro, čime se generiše nizsignala koji vode transkripcionoj represiji ili aktivaciji. U kancer ćelijama kolona,citosolni pul VDR-a može brzo aktivirati intracelularne signalne kaskade (uodgovoru na tretman kalcitriolom), što na kraju pojačava transkripcionu regulacijujedarnog VDR-a (Srinivasan i sar., 2011).Sumirano, glavne faze VDR kontrole genske transkripcije podrazumevaju(Dusso i sar., 2005):
1. Vezivanje liganda 1α25(OH)2D32. Heterodimerizacija sa RXR3. Vezivanje heterodimera za VDRE elemente u promotoru gena koji reagujuna 1α25(OH)2D34. Regrutovanje koregulatora u transkripciono preinicijacioni kompleks kojipojačava ili suprimira nivo genske transkripcije
Uvod
44
Iz svega do sada navedenog je jasno da je dinamična i koordinisanainterakcija VDR-a i koregulatora (koaktivatora i korepresora) odgovorna zaefikasnu regulaciju transkripcije (Dusso i sar., 2005; Amano i sar., 2009).Početkom 2012 godine, tim stručnjaka sa Instituta za Genetiku, Univerzitetau Strazburu je predstavio po prvi put trodimenzionalnu strukturu ovog receptora uvisokoj rezoluciji (Orlov i sar., 2012) (Slika 16.). Pre ovog prikaza istraživači supretežno proučavali samo prethodno opisana dva dela receptora za vitamin D i toDNK interagujući region i vitamin D vezujući domen, čija je struktura proučavanaprimenom tehnika kristalografije. Ovi, prilično novi nalazi nam daju nove ipreciznije informacije o funkcionisanju receptora. Otkrivaju nam da VDR i njegov„partner“ RXR formiraju otvorenu strukturu sa vitamin D vezujućim domenomskoro perpendikularnim sa DNK vezujućim domenom. Ovakva struktura ukazujeda postoji kooperacija između dva domena koji zajedno mogu, sa visokim nivoompreciznosti vršiti regulaciju ekspresije ciljnih gena.
Slika 16. 3D struktura receptora za vitamin D i RXR receptora (preuzeto: Orlov isar., 2012, modifikovano)
Prema literaturnim podacima, transkripcija preko 200 gena je regulisanakompleksom VDR-RXR (Field i Newton-Bishop, 2011). Iako veliki broj gena možebiti regulisan vitaminom D, samo nekolicina njih sadrži VDRE elemente upromotorskom regionu i može biti pod direktnom transkripcionom kontrolomvitamina D (Lamprecht i Lipkin, 2003). Međutim, noviji podaci govore da je
Uvod
45
identifikovano čak 2 776 VDR vezujućih mesta u genomu nakon stimulacijekalcitriolom, primenom metode masivnog paralelnog sekvenciranja (Ramagopalani sar., 2010). Povećano VDR vezivanje je identifikovano u intronskim regionima(36%) i intergenskim regionima (28%). Pored toga je zabeleženo 229 gena saznačajnim promenama nivoa ekspresije u odgovoru na vitamin D (Ramagopalan isar., 2010). Identifikovana VDR vezujuća mesta su lokalizovana u blizini gena zakoje je pokazano da su asocirani sa nastankom kancera i autoimunskih bolesti(Ramagopalan i sar., 2010). Broj malignih ćelija koje eksprimiraju VDR je, prematrenutnim podacima, veliki (Carlberg i Seuter, 2009). Vitaminom D posredovanarepresija ili aktivacija specifičnih protoonkogena ili tumor supresornih gena, kojisu vezani za proliferaciju i diferencijaciju, je primećena u velikom broju zdravih itumorskih tkiva. Vezivanje kalcitriola za VDR će stimulisati ekspresiju inhibitoraćelijskog ciklusa p21 i p27 i ekspresiju molekula ćelijske adhezije, E-cadherina(Palmer i sar., 2001) i inhibirati transkripcionu aktivnost β-katenina (Bikle, 2009).U keratinocitima, koji eksprimiraju VDR (Reichrath i sar., 1999), kalcitriol imaulogu u reparaciji DNK oštećenja uzrokovanih UV zračenjem, redukuje apoptozu ipovećava ekspresiju p53 gena (Bikle, 2009). 1α25(OH)2D3 pospešujediferencijaciju keratinocita i inhibira njihovu proliferaciju, što ukazuje napotencijalni značaj kalcitriola u tretmanu skvamocelularnih karcinoma glave ivrata uopšte, pa samim tim i oralnog karcinoma (Nagpal i sar., 2005). U epidermisuse proliferacija dešava u bazalnom sloju i diferencijacija započinje po izlaskukeratinocita iz bazalnog sloja. Kalcitriol ograničava proliferaciju u bazalnom sloju iindukuje ekspresiju gena za produkciju permeabilnih barijera. Diferencijalnadistribucija koaktivatora (DRIP i SRC3) unutar epidermisa omogućuje kalcitrioluda vrši prethodno navedene funkcije (Bikle, 2009). Svakako niz različitih biološkihuloga koje kalcitriol ostvaruje je moguć zahvaljujući postojanju VDR receptora, kojiprenosi signale na prethodno opisan kompleksan način.
Uvod
46
1.5.1. Gen za receptor za vitamin D
Gen koji kodira receptor za vitamin D (VDR gen) je smešten na poziciji12q12-14 (Slika 17.) i sastoji se od preko 100 kb (Denzer i sar., 2011; Rukin iStrange, 2007). VDR gen se sastoji od šest promotorskih regiona, alternativnosplajsovanih netranslatiranih egzona 1a-1f i osam proteinkodirajućih egzona 2-9 (Slika 18.) (Rukin i Strange, 2007;Deeb i sar., 2007). Region koji se nalazi uzvodno odegzona 1a, sadrži GC bogata ostrvca i ne sadrži TATA blok.DNK-vezujući domen VDR receptora, odgovoran za visokoafinitetnu interakciju sa VDRE elementima promotorskogregiona u ciljnim genima, je kodiran egzonima 2-4. Ligandvezujući domen VDR proteina je kodiran egzonima 6-9 iodgovoran je za visoko afinitetno vezivanje kalcitriola(Slika 18.) (Rukin i Strange, 2007).
Slika 18. Šematski prikaz građe VDR gena sa LD blokovima i pozicijama najčešćeproučavanih SNP-ova
Do sada je, prema nekim podacima, otkriveno preko 470 polimorfizamanukleotidne sekvence u humanom VDR genu (Davis i Milner, 2011; Rukin i Strange,2007). Unutar različitih populacija postoje varijacije u učestalosti alela, ali većinaSNP-ova ima nisku učestalost što ih čini nepraktičnim za proučavanje.
Slika 17. Pozicija VDR gena(preuzeto:www.ghr.nlm.nih.gov/gene/VDR)
Uvod
47
Ispitivanje svih detektovanih SNP-ova bi zahtevalo dosta vremena, ali sastudijama neravnoteže vezanosti i identifikacijom LD blokova, proučavanje SNP-ova nekog gena se svodi na ispitivanje relativno malog broja polimorfizama odukupno detektovanih. Unutar VDR gena su identifikovana tri odvojena LD bloka iimenovana kao A, B i C blok (Slika 18.). Blok A se nalazi na 3’ kraju VDR genaegzona 9 i čini oko 10.5 kb. Blok B sadrži egzone 3-9 i čini ga 40.8 kb i sastoji se oddva odvojena bloka B1 i B2. Blok B i C su odvojeni sa 1.3 kb što uključuje egzon 2.Blok C obuhvata nekodirajuće egzone (1a-1f) i sadrži 92.9 kb. Blok C je takođepodeljen u tri manja C1, C2 i C3 podbloka. Prema nekim istraživanjima ljudi uSevernoj Africi i Gambiji imaju različitu distribuciju LD regiona, posebno C1, C2 iC3 podbloka u poređenju sa Evropskom populacijom (Nejentsev i sar., 2004).Varijacije u distribuciji LD blokova, koje mogu biti prisutne između rasa, mogupomoći u objašnjavanju različitih incidenci javljanja kancera među rasama, koji suu asocijaciji sa vitaminom D. Najviše proučavani SNP-ovi VDR gena se nalaze u BLD bloku (BsmI i ApaI). Dosta je proučavan FokI polimorfizam, detektovan uegzonu 2, između B i C LD bloka. Ovaj polimorfizam se ne nalazi u LD-u sa ostalimSNP-ovima u VDR genu.S obzirom na postojanje alternativnog splajsovanja i/ili alternativnogkorišćenja promotorskog regiona, nivo VDR transkripta je tkivno specifičan.Upravo se ovom pojavom može objasniti detekcija visokog nivoa ekspresije VDR-au metaboličkim tkivima, kao što su bubrezi, intestinum, koža i tireoidna žlezda iumereni nivo ekspresije u ostalim tkivima. Ekspresija VDR gena se može regulisativelikim brojem stimulusa, uključujući estrogen, citokine, faktore rasta (npr. Sp1,WT1), peptidne hormone i vitamin D (Maruyama i sar., 2006). Faza ćelijskogciklusa u kom se ćelija nalazi, kao i stadijum diferencijacije ćelije takođe utiču nanivo iRNK VDR gena (Osborne i Hutchinson, 2002). Rezultati jedne studije supokazali da protein p53 direktno povećava ekspresiju humanog VDR gena(Maruyama i sar., 2006). Naime, pokazano je da promotorski i intronski regioniVDR gena sadrže nekoliko vezujućih mesta za p53. Stoga se smatra da VDR gen imapotencijalnu tumor supresorsku aktivnost. Činjenica da je VDR zapravo target genp53, ukazuje da to može biti jedan od uzročnika disregulacije VDR-a u kanceru(Maruyama i sar., 2006). VDR putanje se mogu delimično preklapati sa p53
Uvod
48
putanjama, zato što je nekoliko nishodnih VDR gena istovremeno meta i p53 (Slika19.).
Slika 19. Dijagram zajedničkih ciljeva gena p53 i VDR gena (preuzeto: Maruyama isar., 2006, modifikovano)
U prisustvu genotoksičnih agenasa VDR indukuje ekspresiju ciljnih genaasociranih sa regulacijom ćelijskog ciklusa i apoptozom. Razlika u VDR ciljnimgenima pod normalnim i stresnim okolnostima može delimično biti objašnjena p53zavisnom regulacijom VDR proteinske ekspresije idukovane genotoksičnimstresom. VDR ciljni geni mogu biti indukovani stimulacijom vitaminom D uprisustvu inaktivnog mutiranog p53 ili u ćelijama deficijentnim za p53 protein(Maruyama i sar., 2006). Pod normalnim fiziološkim uslovima VDR preferencijalnoindukuje ciljne gene uključene u metabolizam kalcijuma i ćelijsku diferencijaciju(npr. CYP24A1). U prisustvu genotoksičnog stresa, VDR indukuje ciljne geneasocirane sa regulacijom ćelijskog ciklusa i apoptozom.Jednom studijom je pokazano da je ekspresija VDR gena bila umerenosmanjena u tumoru kolona, pluća i dojke, ali visoko povećana u tumoru ovarijuma(Maruyama i sar., 2006; Anderson i sar., 2006). Odsustvo ili nizak nivo VDR
Uvod
49
ekspresije je u vezi sa lošim preživljavanjem (Maruyama i sar., 2006). Poznato je daje tokom tumorske progresije ekspresija VDR gena snižena, iako regulatornimehanizmi VDR ekspresije nisu u potpunosti poznati (Maruyama i sar., 2006).Ekspresija VDR gena može biti snižena transkripcionim represorom SNAILgena (Maruyama i sar., 2006). Visok nivo SNAIL ekspresije je asociran sa ćelijskomdediferencijacijom i niskim nivoom VDR proteina. SNAIL protein interagujedirektno sa VDR promotorom, suprimirajući mu aktivnost, pri čemu jeonemogućena indukcija E-kadherina i drugih VDR target gena.
1.5.1.1. Polimorfizmi u VDR genu
Interesovanje za proučavanje polimorfizama u VDR genu se značajnopovećalo nakon što je istraživanjima pokazano postojanje asocijacije izmeđuodređenih VDR polimorfizama i mineralne gustine kostiju (Osborne i Hutchinson,2002). Većina studija ima za cilj pronalaženje asocijacije između pojedinačnihpolimorfizama ili grupe polimorfizama i fizioloških parametara od interesa, idaleko manji broj studija/analiza se bavi proučavanjem direktnog uticaja alelskevarijante na ekspresiju ili aktivnost VDR proteina. Do sada najviše proučavanipolimorfizmi se nalaze u intronu 8 između egzona 8 i 9, i nose naziv premarestrikcionim enzimima: BsmI, ApaI, kao i TaqI koji se nalazi u egzonu 9. Premadosadašnjim saznanjima polimorfizmi BsmI, ApaI i TaqI, pojedinačno proučavani,nemaju uticaja na nivo ekspresije niti aktivnost translatiranog VDR proteina.Upravo ovakvi rezultati ostavljaju mogućnost da su uočene asocijacije ovihSNP-ova sa bolestima rezultat vezanosti za susedno gensko mesto ili čak drugi gen.Iako je u VDR genu identifikovan veliki broj polimorfizama nukleotidne sekvence,samo mali broj njih ima funkcionalni efekat. S obzirom na kompleksnu organizacijuVDR gena, identifikacija funkcionalnih polimorfizama je poseban izazov.Funkcionalnost polimorfizama se može proučavati na više nivoa: iRNK,proteinskom, ćelijskom nivou...Poznavanje molekularnih i funkcionalnih posledicaVDR polimorfizama je krucijalno za potpuno razumevanje njihovog značaja, kao ipotencijalnih asocijacija sa bolestima. Sistematičnije proučavanje VDR SNP-ovaunutar populacija bi trebalo da posluži za traženje kliničke aplikacije u prevenciji
Uvod
50
ili tretmanu bolesti, kao i predikciji odgovora na terapiju vitaminom D ili njegovimsintetičkim analozima. Aplikativni značaj proučavanja VDR polimorfizama jepotvrđen i primerom da izvesni VDR polimorfizmi utiču na tumorsku progresiju itretman tamoksifenom u ranom stadijumu karcinoma dojke (Ylikomi i sar., 2002).Generalno govoreći, proučavanje funkcionalnih efekata polimorfizamamože biti problematično ekstrapolirati na in vivo sistem, s obzirom da se in vitrostudije sprovode u strogo kontrolisanim uslovima, što nije slučaj u in vivouslovima. Genetičke epidemiološke studije omogućavaju proučavanjefunkcionalnosti SNP-ova na populacionom nivou. Zapravo, genetičkeepidemiološke studije imaju za cilj proučavanje uloge VDR polimorfizama u relacijisa podložnošću različitim bolestima, što može značajno pomoći u otkrivanjufunkcionalnih efekata polimorfizama.U predstojećem tekstu je dat pregled najproučavanijih polimorfizama uVDR genu, od kojih su neki obuhvaćeni ovom doktorskom disertacijom.
1.5.1.1.1. FokI (rs2228570)
VDR FokI (rs2228570) polimorfizam predstavlja supstituciju timinacitozinom (T/C) u startnom kodonu egzona 2 na poziciji +27823, ili prema nekimpodacima +30875. Dobio je naziv po restrikcionoj endonukleazi FokI, koja se možekoristiti za genotipizaciju. FokI endonukleaza prepoznaje specifičnu sekvencunukleotida i vrši isecanje na mestu timina. Prisustvo FokI restrikcionog mesta (f)rezultira nastajanjem VDR proteina izgrađenog od 427 amino kiseline (divlji tip,engl. Wild Type (wt) ili M1 forma receptora), dok odsustvo restrikcionog mesta (F)rezultira sintezom kraćeg proteina koji se sastoji od 424 amino kiseline (M4 formareceptora) (Uitterlinden, 2004). Ove izoforme se ne razlikuju prema vezivanju zaDNK, afinitetu za ligand, kao ni heterodimerizaciji sa RXR-om. Međutim, utvrđenoje da se ove dve varijante međusobno razlikuju prema funkcionalnosti za 1.7 putau korist više aktivnosti FF varijante (Uitterlinden i sar., 2004; Denzer i sar., 2011).Naime, prisustvo mutiranog F alela ima umereno višu transkripcionu aktivnost,kao i veću interakciju sa in vitro transkripcionim faktorom 2B (TF2B) (Rukin iStrange, 2007) u poređenju sa divljim tipom, f alelom (Slika 20.)
Uvod
51
a) b)
Slika 20. Transkripciona aktivnost različitih alelskih varijanti FokI polimorfizmaVDR gena a) mutirani F alel b) divlji f alel
S obzirom da se nalazi u egzonu 2, između B i C LD bloka, FokI polimorfizamse može smatrati nezavisnim markerom VDR gena, s obzirom da nije u neravnoteživezanosti sa do sada poznatim i proučavanim polimorfizmima i da je LD oblast kojaokružuje ovaj polimorfizam relativno mala (Uitterlinden i sar., 2004).FokI polimorfizam, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim VDRpolimorfizmima je dosta proučavan u studijama rizika za nastanak različitih tipovakancera, a posebno kancera dojke. Prema nekim istraživanjima, FokI FF genotip je,zajedno sa ostalim VDR polimorfizmima povećavao rizik za kancer dojke uKavkazoidnoj populaciji u Velikoj Britaniji. Sa druge strane, dve druge studije supokazale da je kod žena sa ff genotipom postojala veća podložnost za kancer dojkeu poređenju sa FF genotipom. Kod Afro Amerikanki FF genotip je bio asociran sa50% smanjenim rizikom za kancer dojke (Osborne i Hutchinson, 2002) dok drugaistraživanja nisu pronašla asocijaciju između FokI polimorfizma i povećanog rizikaza kancer dojke među ženama u postmenopauzi. Ovakvi, međusobno konfliktnirezultati se mogu pripisati maloj veličini uzorka i odabira uzorka pacijenata izpopulacije za svaku studiju (Alimirah i sar., 2011).
Uvod
52
1.5.1.1.2. Poly A (rs2544038)
Na 3’-netranslatirajućem regionu (UTR) VDR gena je identifikovanpolimorfizam dužine poliadenilatnog repa (poly A), koji se smatra važnim u post-transkripcionoj kontroli genske ekspresije (Holt i sar., 2010). Varijante polyA suklasifikovane prema broju A nukleotida. Ukoliko je broj A nukleotida ≥17, poly Avarijanta se obeležava kao L (engl. Long) alel, dok u slučaju broja A nukleotida ≤15kao S (engl. Short) alel. S obzirom da se nalazi na 3’-UTR regionu VDR gena, neutiče na strukturu VDR-a, iako je prema podacima nekih istraživačkih grupa L alelpovezan sa produkcijom iRNK koja je stabilnija i/ili je efikasnije translatirana uVDR protein nego u slučaju postojanja S alela (Whitfield i sar., 2001). Poly A rep senalazi u neravnoteži vezanosti sa BsmI-ApaI-TaqI blokom i smatra se da na tajnačin može uticati na stabilnost iRNK (Dusso i sar., 2005).Kada je reč o studijama asocijacije, Poly A polimorfizam je značajnoasociran sa izmenjenim rizikom za nastanak kancera dojke i prostate (Osborne iHutchinson, 2002). U slučaju kancera dojke, prisustvo L alela je bilo povezano sa50% smanjenim rizikom (Osborne i Hutchinson, 2002). Za razliku od kanceradojke, prisusto L alela je bilo asocirano sa 3-5 puta povećanim rizikom za nastanakkancera prostate (Ingles, 1997; Taylor i sar., 1996).
1.5.1.1.3. Cdx-2 (rs11568820)
Cdx2 polimorfizam je otkriven najpre u populaciji Japanaca (Uitterlinden isar., 2004) i predstavlja supstituciju adenina guaninom (A/G) u egzonu 1epromotorskog regiona na poziciji +1229. Pokazano je da polimorfizam Cdx2 imafunkcionalni efekat i izvesni uticaj na ekspresiju VDR gena. Naime, prisustvomutiranog alela rezultira nastankom VDR molekula sa defektnim vezujućimmestom za intestin specifični transkripcioni faktor Cdx2. Prisustvo A alela jepovezano sa većom aktivnošću u poređenju sa G alelom, u smislu jačeg vezivanjaCdx2 transkripcionog faktora i više transkripcione aktivnosti (Uitterlinden i sar.,2004). Smatra se da A alel rezultuje višom transkripcionom aktivnošću ipovećanjem ekspresije VDR-a, posebno u intestinumu, koji predstavlja glavno
Uvod
53
mesto resorpcije calcijuma (Heist i sar., 2008; Rukin i Strange, 2007). Takođe, Aalel je povezan sa povećanom transkripcionom aktivnošću VDR-a u Caco-2ćelijskim linijama kancera kolona (Rukin i Strange, 2007). Cdx-2 polimorfizam nijebio povezan sa preživljavanjem pacijenata sa ne-sitnoćelijskim karcinomom pluća(Heist i sar., 2008).
1.5.1.1.4. BsmI (rs1544410)-ApaI (rs7975232)-TaqI (rs731236)
S obzirom da je HapMap projektom utvrđeno da se navedena tripolimorfizma, locirana na 3’ kraju VDR gena nalaze u jakoj neravnoteži vezanostijedan sa drugim, najčešće su i proučavani zajedno. BsmI (rs1544410) predstavljazamenu guanina adeninom (G/A) na poziciji +60890 i nalazi se u intronu 8 izmeđuegzona 8 i 9, gde je smešten i polimorfizam ApaI (rs7975232), koji predstavljasupstituciju citozina adeninom (C/A) na poziciji +61888. U egzonu 9 je detektovanTaqI (rs731236), zamena timina citozinom (T/C) na poziciji +61938.Funkcionalnim studijama ovih polimorfizama se nastoji utvrđivanje njihovoguticaja na regulaciju transkripcije, translacije ili RNK procesovanja, ali nisudobijeni konzistentni rezultati između različitih studija (Barroso i sar., 2008).S obzirom da su BsmI-ApaI-TaqI u jakom LD-u, smatra se da ovajhaplotipski blok ima uticaja na stabilnost iRNK. Dok se BsmI nalazi u slabijojneravnoteži vezanosti sa preostala dva polimorfizma, ApaI i TaqI se međusobnonalaze u jakoj vezi. Još uvek je nerazjašnjeno kako BsmI i ApaI polimorfizam, kojise nalaze u nekodirajućem regionu VDR gena mogu uticati na funkcionalnost i bitiasocirani sa izvesnim bolestima, ali se pretpostavlja da su navedeni polimorfizmi uLD-u sa još uvek neidentifikovanim funkcionalno važnim alelskim mestima unutarVDR gena ili nekog od susednih gena na istom hromozomu, koji mogu imati uloguu ispoljavanju fenotipskih osobina ili bolesti i stoga se mogu koristiti kao markeri.Smatra se da je BAt haplotip povezan sa višim nivoom ekspresije iRNK negobaT haplotip, ali ovi rezultati nisu konzistentni među studijama (Uitterlinden i sar.,2004). BsmI ne menja strukturu i funkciju produkovnog VDR proteina te se možereći da nema funkcionalni efekat (Raimondi i sar., 2009). Međutim, ustanovljeno jeda je BsmI polimorfizam u neravnoteži vezanosti sa poly A mikrosatelitom, pa se
Uvod
54
smatra da može uticati na stabilnost VDR iRNK (Liu i sar., 2011; Raimondi i sar.,2009; Uitterlinden i sar., 2004). Analize pojedinačnih polimorfizama pokazuju da jeB alel BsmI polimorfizma asociran sa povišenom ekspresijom VDR gena ipovišenim nivoom kalcitriola u serumu (Heist i sar., 2008). Sa druge strane,pokazano je da je smanjenje nivoa ekspresije VDR gena u slučaju kolorektalnogkarcinoma nezavisno od genotipa BsmI polimorfizma (Parisi i sar., 2008).Skorašnja meta analiza je otkrila da je BsmI polimorfizam asociran sa rizikomrazvijanja kolorektalnog karcinoma (Bai i sar., 2012).Takođe, TaqI rezultuje supstitucijom amino kiseline izoleucina metioninom,za koju se smatra da dovodi do promene VDR funkcije, što bi moglo biti povezanosa razvojem i prognozom kancera (Liu i sar., 2011).
1.5.1.1.5. EcoRV (rs4516035)
Reč je o polimorfizmu koji je relativno retko proučavan u odnosu na ostalepolimorfizme VDR gena. Smešten u egzonu 1a promotorskog regiona, rezultujeizmenom citozina u timin (C/T) na poziciji -1012. Nije poznato da ima funkcionalniefekat. Studije asocijacije su uglavnom rađene u odnosu na karcinome kože i topretežno melanome. Jednom studijom je potvrđeno postojanje asocijacije izmeđumutirane varijante EcoRV polimorfizma i rizika od nastanka kutanog melanoma(Povey i sar., 2007).
1.5.1.1.6. rs11574085
Polimorfizam u VDR genu, koji, prema našim saznanjima, do sada nikadanije proučavan u asocijaciji sa karcinomima, pa samim tim ni sa oralnimkarcinomom. Nije poznato da ima funkcionalni efekat. U vezi sa ovimpolimorfizmom je dostupno veoma malo literaturnih podataka.
55
1.5.1.2. Učestalost SNP-ova i haplotipova VDR gena u različitim populacijama
Nekoliko velikih studija je utvrdilo postojanje etničke varijabilnosti popitanju zastupljenosti VDR polimorfizama. Na primer, divlji alel f FokI SNP-a sejavlja kod Afrikanaca u manjoj zastupljenosti u poređenju sa Kavkazijancima iAzijatima, dok je učestalost B alela BsmI SNP-a mnogo niža kod Azijata u poređenjusa drugim populacijama (Tabela 2.) (Kostner i sar., 2009). Bitno je naglasiti dapored ovih razlika u učestalosti SNP-ova, funkcionalni efekti polimorfizama se nerazlikuju između etničkih grupa, prvenstveno zato što je fiziološka uloga vitaminaD ista kod ljudi (Kostner i sar., 2009). Samo 7% Azijata ima SNP na BsmIrestrikcionom mestu, dok 74% Azijata ima polimorfizam unutar ApaI restrikcionogmesta. Generalno govoreći, polimorfizmi nastaju kao slučajne mutacije, čija seučestalost može povećavati unutar etničke grupe do te mere, da bi bila proglašenapolimorfizmom. Ovim evolucionim procesom se može objasniti postojanje razlikau učestalosti alela između različitih etničkih grupa (Uitterlinden i sar., 2004).
Tabela 2. Procentualne zastupljenosti minor alela VDR SNP-ova u različitimetničkim grupama
VDR SNP Minor alel
Etnička grupa (%)
Kavkazijanci Azijati Afrikanci
FokI f 34 51 24
BsmI B 42 7 36
ApaI A 44 74 31
TaqI T 43 8 31
Cdx2 A 19 43 74
Takođe, poznato je da postoje razlike u tipovima kao i učestalosti javljanjaVDR haplotipova između različitih etničkih grupa (Tabela 3.). Upravo se
Uvod
56
postojanjem ovih razlika mogu objasniti varijacije u podložnosti bolestima koje suprimećene među grupama. U tabeli 3. su prikazane učestalosti javljanja BsmI-ApaI-TaqI VDR haplotipova unutar različitih etničkih grupa.
Tabela 3. Zastupljenost haplotipova u različitim etničkim grupama
VDR Haplotip Haplotip
Etnička grupa (%)
Kavkazijanci Azijati Afrikanci
BsmI-ApaI-TaqI
baT 43 75 26
BAt 39 7 16
bAT 11 17 59
Najviša učestalost baT haplotipa je zabeležena kod Azijata (75%), za kojimaslede Kavkazijanci (43%) i Afrikanci (26%) (Tabela 3.). Najčešći haplotip međuAfrikancima, bAT, za učestalošću od 59% se relativno ređe sreće kod Azijata iKavkazijanaca. Jasno je da haplotipske učestalosti između etničkih grupa pokazujukompleksan obrazac koji se ne može izvesti na osnovu poznavanja učestalostipojedinačnih polimorfizama koji ulaze u sastav haplotipskog seta. Naime,haplotipski set odslikava teoriju “Out of Africa” kojim se opisuje poreklo humanihpopulacija širom sveta, koje je istovremeno rezultat i interakcije gena i spoljašnjesredine, u kojima neke određene varijante mogu imati prednost za preživljavanje ireprodukciju (Uitterlinden, 2004). Pored toga, pretpostavlja se da zastupljenostrelativno starih polimorfizama manje varira između različitih etničkih grupa, dokrelativno noviji polimorfizmi mogu pokazivati jako velike razlike (Uitterlinden isar., 2004). Na osnovu toga, na primer, Cdx-2 polimorfizam bi se smatrao relativnonovim, a FokI starim polimorfizmom (Uitterlinden i sar., 2004).U cilju interpretacije studija asocijacije, može se pretpostaviti daindividualni funkcionalni polimorfizmi mogu imati isti efekat u različitim etničkimgrupama, jer fiziološka uloga endokrinog sistema vitamina D nije promenjenaizmeđu različitih etničkih grupa. To takođe predstavlja osnovu za interpretaciju
Uvod
57
ekoloških studija, gde su alelske učestalosti između etničkih grupa u asocijaciji sarazličitom incidencom bolesti/fenotipova između tih grupa (Uitterlinden i sar.,2004). Za nefunkcionalne ili polimorfizme nepoznate funkcionalnosti, situacija jerazličita zato što se u tom slučaju možemo osloniti na LD u kojima se nalazeproučavani polimorfizmi da bismo objasnili asocijacije sa bolestima. Na primer,ako je haplotip 1 asociran sa nekom bolešću u populaciji Kavkazijanaca iAfrikanaca, to može biti rezultat vezanosti sa potpuno različitim funkcionalnimalelima. Sa druge strane, ako je asocijacija takvog marker-haplotipa primećena kodKavkazijanaca, a ne kod Azijata, može se pretpostaviti da je LD između markera ifunkcionalnog alela različit među različitim populacijama. Teško je razumetiposledice etničkih varijacija alela, posebno zbog postojanja različitih sredinskihfaktora između grupa, među kojima su ishrana, životne navike i drugo. Dodatno,postoje različite genetičke osnove između etničkih grupa u kojima VDRpolimorfizmi interaguju jedan sa drugim ili sa drugim genetičkim varijantamadrugih gena. U tom smislu je jasan izuzetan značaj i potreba definisanjahaplotipskih struktura VDR polimorfizama različitih etničkih grupa. Na taj način isa raspoloživim informacijama o sredinskim faktorima u različitim etničkimgrupama, možemo u potpunosti razumeti interakcije između gena i spoljašnjesredine (Uitterlinden i sar., 2004).
1.6. Enzim 1α-hidroksilaza i CYP27B1 gen
Identifikacijom hidroksilnih metabolita vitamina D, uključujući glavnucirkulišuću formu 25(OH)D3 i metabolički aktivnu formu 1α25(OH)2D3, započinjeistorija proučavanja enzima hidroksilaza vitamina D. Ulogu u anabolizmu odnosnokatabolizmu vitamina D imaju enzimi iz velike familije enzima citohroma P450.Anabolizam je katalizovan enzimom 1α hidroksilazom (1α(OH)-aza), koji se sastojiod 508 amino kiselina (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000776.1).1α hidroksilaza se nalazi na unutrašnjoj strani membrane mitohondrijaproksimalnih tubula bubrega, gde vrši hidroksilaciju kalcidiola 25(OH)D3 napoziciji 1α, čime nastaje biološki aktivna forma vitamina D, kalcitriol. Dakle, reč je
Uvod
58
o enzimu koji reguliše nivo biološki aktivne forme vitamina D. Na slici jepredstavljena kristalna struktura enzima CYP27B1 (Slika 21.).
1α hidroksilaza je kodirana CYP27B1 genom koji se nalazi na dugom krakuhromozoma 12 i poziciji 13.1-13.3 (12q13.1-13.3) prema Entrez Gene bazi (Slika21.), dok prema Ensembl bazi zauzima 14.1 poziciju dugog kraka hromozoma 12.CYP27B1 gen se pored renalnih eksprimira u različitim ekstrarenalnim tkivima utelu (Turunen i sar., 2007), uključujući keratinocite, pluća, kolon, makrofage(Prosser i Jones, 2004), prostatu (Holick i sar., 2007) i druga tkiva i organe.Ekspresija CYP27B1 gena je negativno regulisana kalcitriolom (Turunen isar., 2007).
Uočeno je da je u ćelijama kancera prostate aktivnost 1α-hidroksilazesnižena, što ukazuje na prisustvo nižih koncentracija kalcitriola u malignimćelijama (Whitlatch i sar., 2002). Interesantno je zapažanje da su za sniženuekspresiju CYP27B1 gena u ranim fazama neoplastične transformacije ćelija
Slika 22. Pozicija CYP27B1 gena na dugom krakuhromozoma 20(Preuzeto: www.ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP27B1)
Slika 21. Kristalna struktura enzima 1α-hidroksilaze(Preuzeto:www.bioscience.org/2005/v10/af/1514/fulltext.asp?bframe=figures.htm&doi=ye)
Uvod
59
kancera prostate odgovorni mehanizmi epigenetičke regulacije. Stoga se možepretpostaviti da genetičke varijacije koje imaju uticaja na gensku ekspresiju ilifuncionisanje proteina nemaju tako veliki efekat na maligne ćelije (Holt i sar.,2010; Hsu i sar., 2001).
1.6.1. Polimorfizmi u CYP27B1 genu
Postoji mali broj dokaza o identifikovanim funkcionalnim polimorfizmima uCYP27B1 genu (Holt i sar., 2010). Za razliku od polimorfizama u VDR genu koji sudosta proučavani, identifikovani SNP-ovi CYP27B1 gena su daleko manjezastupljeni u literaturi kada je reč o studijama asocijacije. Nedavno jeidentifikovano četiri nesinonimna SNP-a, ali su svi relativno retki (McCullough isar., 2009) i za sada ne postoje dokazi da SNP-ovi menjaju gensku funkciju ili rizikza razvoj bolesti (Davis i Milner, 2011).Relativno često proučavan polimorfizam, rs4646537, nije bio u vezi sarizikom za nastanak kancera prostate kod Afro Amerikanaca (Bonilla i sar., 2011).Sa druge strane, potvrđena je asocijacija između genotipova CYP27B1 gena i rizikaza nastanak kancera prostate, ali ne i sa agresivnošću bolesti (Holt i sar., 2010).U ovoj doktorskoj disertaciji je analiziran polimorfizam rs4646536.
1.6.1.1. rs4646536
Reč je o polimorfizmu identifikovanom u intronu CYP27B1 gena,smeštenom na poziciji +2838, koji predstavlja izmenu timina citozinom(+2838 T/C). Prethodne studije su pokazale da je navedeni polimorfizam asociransa nastankom dijabetesa tipa I (Bailey i sar., 2007). Naime, prisustvo divljeg tipa Talela je povezano sa smanjenim rizikom za razvoj dijabetesa tipa I u poređenju samutiranom formom. Pretpostavljeno je da SNP +2838 T/C u intronu snižava nivoaktivne 1α hidroksilaze i konverzije 25(OH)D3 do kalcitriola, što može voditinastanku različitih bolesti (Bailey i sar., 2007). Upravo je to bio osnov zauključivanje datog polimorfizma u analizu naše studije.
Uvod
60
1.7. Enzim 24-hidroksilaza i CYP24A1 gen
Ulogu u katabolizmu, odnosno degradaciji fiziološki aktivne forme vitaminaD hidroksilacijom bočnih lanaca, ima član familije enzima P450: 24-hidroksilaza(24(OH)-aza). Enzim je kodiran genom CYP24A1, koji se nalazi na dugom krakuhromozoma 20q13.2-13.3 (Slika 23.). Različite enzimske izoforme nastaju kaorezultat alternativnog splajsovanja transkripcionih varijanti.
Ovaj mitohondrijalni enzim je prvi put opisan početkom 1970. godine, kadase verovalo da uključen samo u renalnu 24-hidroksilaciju 25(OH)D3 (Jones i sar.,2011). Međutim, enzim ima sposobnost multiple hidroksilacije ugljenka C-23 iC-24 na bočnim lancima kalcidiola 25(OH)D3 i metabolički aktivne formekalcitriola. Poravnanjem dela aminokiselinske sekvence ovog enzima kod 57 vrsta,od košljoriba do čoveka, pokazan je visok stepen konzerviranosti rezidua, za velikideo proteina (Jones i sar., 2011). Tokom 2010. godine je rasvetljena kristalnastruktura proteina CYP24A1 kod pacova. CYP24A1 pacova je primarno24-hidroksilaza, za razliku od humanog enzima koji ima mogućnost hidroksilacije iC-23 i C-24 pozicija (Jones i sar., 2011). Gotovo u isto vreme kada je rasvetljenauloga u hidroksilaciji vitamina D, pokazano je da je i CYP24A1 gen eksprimiran umnogim, ako ne svim ciljnim ćelijama koje sadrže receptor za vitamin D,uključujući bubrege, kosti, intestinum itd. Ovakvi nalazi su vodili nekimpretpostavkama da je primarna uloga CYP24A1 da ograniči ili atenuira akcijukalcitriola na ciljne ćelije nakon inicijalne transkripcione aktivnosti u negativnoj
Slika 23. Pozicija CYP24A1 gena na dugom krakuhromozoma 20(Preuzeto: www.ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP24A1)
Uvod
61
povratnoj spregi (Jones i sar., 2011). Kloniranje CYP24A1 gena početkom 1990.godine je potvrdilo šablon ekspresije CYP24A1 u ciljnim ćelijama i inducibilnostsupstratom, kalcitriolom. Povećanje količine metabolički aktivne forme vitamina Du ciljnim ćelijama može pokrenuti CYP24A1 posredovani metabolizam koji štitićelije od aktivacije VDR puta (Jones i sar., 2011). U eksperimentima u kojima sukorišćeni CYP24A1 nokaut miševi, potvrđena je katabolička uloga enzima24(OH)-aze. Nivo razlaganja kalcitriola je bilo dramatično redukovano i poluživothormona u plazmi je bio povećan 10 puta (Jones i sar., 2011). Dakle postoji obiljedokaza da je reč o enzimu čija je normalna fiziološka uloga da kataboliše 25(OH)D3u cilju sprečavanja eventualne aktivacije kalcitriola i/ili da degraduje kalcitriolunutar ciljnih ćelija da bi prekinuo njegovu biološku aktivnost (Jones i sar., 2011).Kada je jasno ustanovljeno da je CYP24A1 ključni enzim za katabolizamvitamina D, postalo je očigledno da je reč o enzimu koji radi balansirano sacitohromom P450 familije, CYP27B1, koji ima ulogu u prevođenju 25(OH)D3 dokalcitriola u bubrezima, gde je njegova uloga prevashodno otkrivena, ali i u drugimekstrarenalnim tkivima.Činjenica da metabolički aktivna forma vitamina D ima antiproliferativno ipro-diferencirajuće dejstvo na nekoliko ćelijskih tipova in vivo i mnogim ćelijskimlinijama in vitro, kao i činjenica da je u ćelijskim linijama prostate, kolona i dojketokom tumorske progresije dokazano smanjenje CYP27B1 i povećanje CYP24A1ekspresije, navode na pretpostavku da zapravo progresija kancera podrazumevadisfunkcionalni metabolizam vitamina D.Postoji veliki broj tvrdnji da je CYP24A1 gen kandidat za potencijalnogonkogena (Jones i sar., 2011; Fischer i sar., 2009). Naime, povećana amplifikacijaCYP24A1 gena je detektovana u karcinomu dojke i ovarijuma (Fischer i sar., 2009).Inhibicija 24-hidroksilaze u ćelijskim linijama ovarijalnih kancera intenziviraćelijsku diferencijaciju i inhibiciju rasta posredovanu kalcitriolom, što je jedan oddokaza koji idu u prilog potencijalnoj onkogenoj funkciji CYP24A1 gena.Interesantno je da je bazalni nivo ekspresije CYP24A1 veoma nizak (Roff isar., 2008). Međutim, izvesne studije su pokazale da maligno tkivo ima značajnoviši nivo ekspresije iRNK 24(OH)-aze u poređenju sa benignim tkivom (Fischer isar., 2009; Jones i sar., 2011). Visok nivo iRNK CYP24A1 u malignom tkivu ukazuje
Uvod
62
na povećanu degradaciju i stoga smanjenu dostupnost kalcitriola što može voditimalignoj transformaciji.Dobro je poznat značaj CYP24A1 u tretmanu karcinoma. Analozi vitamina Dse koriste u hiperproliferativnim bolestima, kao što su psorijaza i kancer (Jones isar., 2011). Efektivnost analoga vitamina D je ograničena indukcijom CYP24A1 uciljnim ćelijama (npr. keratinocitima), uzrokujući rezistentnost na primenjeni lek(Jones i sar., 2011). Zabeleženo je da neke tumorske ćelije amplifikuju CYP24A1gen u cilju postizanja selekcione prednosti nad okružujućim normalnim ćelijama(Jones i sar., 2011).U humanim ćelijama prostate ekspresija CYP24A1 i CYP27B1 gena jeregulisana epigenetičkim mehanizmima (Cross i sar., 2009). Tokom maligneprogresije, promotor CYP27B1 je metilovan u epitelijalnim ćelijama, dok jepromotor CYP24A1 demetilovan, što dovodi do pojačane degradacije niskog nivoakalcitriola koji se još uvek produkuje. Takođe, sinteza kalcitriola od 25(OH)D3 sedešava u ovim ćelijama koje su tretirane inhibitorom metiltransferaze (Cross iKallay, 2009). Neke studije naglašavaju i značaj mikrosredine (tumorske vs.prirodne) u regulaciji ekspresije CYP24A1: promotor CYP24A1 gena je biohipermetilovan u endotelnim ćelijama nastalim od tumorskog tkiva, što nije bioslučaj kod endotelinih ćelija poreklom od normalnog tkiva (Cross i Kallay, 2009).Na prvi pogled, ovi rezultati deluju kontradiktorno u odnosu na fenomen zapažen uepitelijalnim ćelijama, što je dobar primer protektivne uloge sistema vitamina D(Cross i Kallay, 2009).Razlika u ekspresiji hidroksilaza vitamina D tokom tumorske progresije,primećena kod pacijenata sa dijagnostikovanim kancerom kolona, jenajverovatnije uzrokovana epigenetičkom regulacijom genske aktivnostimetilacijom/demetilacijom, kao i histonskom acetilacijom/deacetilacijom (Cross iKallay, 2009). U kancerogenim lezijama nižeg stadijuma, CYP27B1 ekspresija jevisoka u poređenju sa normalnom mukozom pacijenata bez kancera. Povećanasinteza i akumulacija kalcitriola u mukozi kolona bi bila odgovorna za povećanuekspresiju CYP24A1 transkripta, kao i parakrine/autokrine inhibicije rastatumorske ćelije. Pretpostavlja se da je tokom progresije kancera CYP27B1inaktiviran epigenetičkim mehanizmima, dok je CYP24A1 aktiviran. S obzirom na
Uvod
63
mogućnost da modifikuju epigenetičke mehanizme, uzimanje folata i fitoestrogenabi moglo povećati ekspresiju CYP27B1 i redukovati enormno povećanje ekspresijekataboličkog CYP24A1. Ako bi transkripciona represija ekspresije CYP24A1 moglabiti menjana metilacionim agensima, pacijenti sa dijagnostikovanimuznapredovalim stadijumom kolorektalnog karcinoma bi mogli imati veliku koristod tretmana vitaminom D ili njegovim analozima (Cross i Kallay, 2009).Činjenica da povećan nivo ekspresije CYP24A1 gena može biti glavniuzročnik deficijencije vitamina D i progresije bolesti, sugeriše da je reč o enzimu igenu koji predstavlja potencijalnu dobru metu za terapiju. Tokom prošle decenijeje identifikovan i/ili sintetisan značajan broj inhibitora u cilju tretmana bolestiasociranih sa povećanim katabolizmom vitamina D: npr. visoko specifični CYP24A1inhibitori, genistein i drugi (Jones i sar., 2011; Davis, 2009). Folati u ishrani takođemogu inhibirati aktivnost CYP24A1 povećanjem metilacionog statusapromotorskog regiona i time smanjenjem ekspresije ovog gena (Davis, 2009).Otkriće strukture enzima kod pacova će dati bolje uvide u višestrukufunkcionalnost enzima i poboljšati razvoj druge generacije inhibitora. Stoga sesadašnje vreme smatra jako pogodnim za istraživanje CYP24A1 gena i enzima.
1.7.1. Polimorfizmi u CYP24A1 genu
Na osnovu podataka dostupnih u genomskim bazama podataka,identifikovan je oko 50 polimorfizama u CYP24A1 gen i tokom nekoliko poslednjihgodina se ta lista značajno uvećava. Efekti ovih polimorfizama na enzimskuaktivnost su uglavnom slabo poznati ili potpuno nepoznati (Jones i sar., 2011).Proksimalni region promotora CYP24A1 je bogat GC parovima (oko 71%među prvih 550 nukleotida), te je pravi izazov sekvencirati ga i time objasnitinedostatak poznatih polimorfnih varijanti u ovom regionu (Roff i sar., 2008).Funkcionalni efekti identifikovanih polimorfizama u CYP24A1 genu suuglavnom nejasni/nepoznati. Međutim, nekoliko skorije identifikovanihpolimorfizama u CYP24A1 genu u promotorskom regionu egzona 1 imajufunkcionalni efekat na vezivanje za VDRE, in vitro transaktivaciju i izmenjenu
Uvod
64
ekspresiju gena in vivo (Holt i sar., 2010). SNP-ovi koji se nalaze u blizini ovogregiona (npr. rs4809960, rs2296241, rs2585428, rs6022999) se možda nalaze uneravnoteži vezanosti sa funkcionalnim polimorfizmima.Jednom studijom je identifikovano 6 polimorfizama u promotoru CYP24A1gena, koji utiču na vezivanje proteinskog receptora, sniženu transaktivaciju isniženu ekspresiju CYP24A1 gena u in vivo uslovima (Roff i sar., 2008).
1.7.1.1. rs2296241
Polimorfizam rs2296241 predstavlja izmenu adenina guaninom u egzonu 4CYP24A1 gena i reč je o sinonimnom polimorfizmu. Spada u evolucionokonzervirane polimorfizme (skor 0.99) (Holt i sar., 2010). Neke od prethodnihsudija pokazuju da je navedeni polimorfizam asociran sa smanjenim mortalitetomuzrokovanim kancerom prostate, ali ne i rizikom za nastanak karcinoma prostate(Holt i sar., 2010). Jedno od nedavno sprovedenih istraživanja nije ustanovilopostojanje asocijacije sa rizikom za nastanak kancera dojke (Dorjgochoo i sar.,2011). Kontradiktorni rezultati prisutni u literaturi su predstavljali glavni povod zaizbor datog polimorfizma u CYP24A1 genu za našu studiju asocijacije sa oralnimkarcinomom.
65
2. CILJEVI ISTRAŽIVANJA
Ciljevi istraživanja
66
Mnogobrojni podaci ukazuju da i pored izloženosti značajnim faktorimarizika za nastanak oralnog skvamocelularnog karcinoma (npr. pušenje, alkohol,HPV infekcija) samo izvesni procenat osoba oboli od oralnog karcinoma, štoukazuje na značaj genetičke osnove u procesu oralne kancerogeneze. Na osnovučinjenica iznetih u uvodnom delu ove doktorske disertacije, može se zaključiti davitamin D ima značajnu ulogu kao antikancerogeni agens, koji inhibitorno deluje namnogobrojne molekule i signalne puteve koji su uključeni u progresijukancerogeneze. Vitamin D ispoljava svoj biološki efekat nakon vezivanja zareceptor za vitamin D, čije se sposobnosti ligandnog vezivanja ne razlikuju izmeđunormalnih i malignih ćelija u kojima je receptor eksprimiran. Receptor za vitaminD je kodiran VDR genom, u kom je identifikovan veliki broj polimorfizamanukleotidne sekvence, od kojih samo mali broj ima funkcionalni efekat. S obziromna značaj koji SNP-ovi imaju u studijama asocijacije, postavlja se pitanje da lipostojanje određenih genotipskih varijanti u VDR genu može biti u vezi sapodložnošću nastanka oralnog karcinoma ili asocirano sa kliničko patološkimodlikama bolesti i ukupnim preživljavanjem pacijenata. Kako su u metabolizamvitamina D uključeni enzimi kodirani CYP27B1 i CYP241A1 genima, od interesa jerazmotriti potencijalnu vezu polimorfizama identifikovanih u ovim genima sanastankom oralnog karcinoma. Na osnovu toga, postavljena je radna hipoteza,koja glasi: mutirane varijante analiziranih polimorfizama u VDR, CYP27B1 iCYP24A1 genima su asocirane sa etiološkim faktorima, kliničko patološkimkarakteristikama i rizikom oboljevanja od oralnog skvamocelularnog karcinoma.Analizirani polimorfizmi i/ili haplotipovi su asocirani sa ishodom bolesti iukupnim preživljavanjem pacijenata.
U cilju provere radne hipoteze, postavljeni su sledeći ciljevi istraživanja:
 Utvrditi učestalosti genotipova i alela polimorfizama EcoRV, FokI, TaqI, ApaI,BsmI i rs11574085 u VDR genu, CYP27B1 (rs4646536) i CYP24A1 (rs2296241)genima u grupi pacijenata sa oralnim skvamocelularnim karcinomom i ukontrolnoj grupi;
Ciljevi istraživanja
67
 Utvrditi eventualno postojanje razlike u distribuciji genotipova i alelaanaliziranih polimorfizama između grupe pacijenata i kontrolne grupe zdravihosoba naše populacije odgovarajuće polne i starosne distribucije;
 Ustanoviti da li postoji  veza između genotipova proučavanih polimorfizama uVDR, CYP27B1 i CYP24A1 genima sa etiološkim faktorima, kao što su: pušenje,konzumiranje alkohola i oralna higijena i kliničko patološkim karakteristikama:veličinom tumora, stadijumom bolesti, nodalnim statusom, nukleusnim ihistološkim gradusom;
 Identifikacija LD blokova. Odrediti učestalosti haplotipova u grupi pacijenata ikontrolnoj grupi i utvrditi eventualno postojanje razlike u distribucijihaplotipova između analiziranih grupa;
 Utvrditi postojanje asocijacije između identifikovanih haplotipova i rizika zarazvoj oralnog skvamocelularnog karcinoma;
 Ispitati povezanost polimorfizama u analiziranim genima i/ili haplotipova saishodom bolesti, odnosno sa ukupnim preživljavanjem pacijenata.
68
3. MATERIJAL I METODE
Materijal i metode
69
Eksperimentalni deo doktorske disertacije je realizovan u Laboratoriji zamolekularnu genetiku Instituta za medicinska istraživanja Vojnomedicinskeakademije u Beogradu.
Etički aspekti. Osobe čiji je biološki materijal korišćen u istraživačke svrhe su daleinformisani pristanak za učešće u studiji. Etički komitet Vojnomedicinskeakademije u Beogradu je odobrio izođenje ove studije u skladu sa Helsinškomdeklaracijom (2008).
3.1. Studijska grupa
U studiju je uključeno 110 pacijenata sa dijagnostikovanim oralnimskvamocelularnim karcinomom jezika i poda usne duplje, operisanih na Klinici zamaksilofacijalnu hirurgiju, Vojnomedicinske akademije u Beogradu. Grupapacijenata je obuhvatala 81 (73.6%) muškaraca i 29 (26.4%) žena, starosti od39-80 godina (medijana 58 godina). Pacijenti nisu primali hemioterapiju, a svi subili podvrgnuti radioterapiji nakon operacije. Kod 83 (75.5%) pacijenata jedijagnostikovan tumor u uznapredovalom III stadijumu, dok je 27 (24.5%)pacijenata imalo tumor u II stadijumu bolesti. Metastaze limfnih čvorova su bileprisutne kod 87 (79.1%) pacijenta, tj. bili su pozitivnog nodalnog statusa (N+), a23 (20.9%) pacijenta je bilo negativnog nodalnog statusa. Udaljene metastaze nisudetektovane. Minimalno vreme praćenje pacijenta nakon operacije je bilo 28, amaksimalno 100 meseci.Kontrolnu grupu je činilo 122 osobe, dobrovoljnih davaoca krvi, koji su sejavili Institutu za transfuziologiju Vojnomedicinske akademije u Beogradu. Osobekoje su činile kontrolnu grupu su iste populacije sa teritorije Srbije, odgovarajućestarosne i polne distribucije, bez prethodno dijagnostikovanih kancera u istorijibolesti.Učesnici studijske grupe su intervjuisani usmenim putem, čime su dobijeneinformacije o njihovom pušačkom statusu odnosno korišćenju alkohola. Kao bivšipušači su definisane osobe koje su prestale sa pušenjem najmanje godinu dana prepostavljanja dijagnoze. Osobe koje su svakodnevno pušile, godinu dana ili duže pre
Materijal i metode
70
postavljanja dijagnoze su klasifikovane kao pušači. Ukoliko je osoba unosila više od20 alkoholnih jedinica sedmično (1 jedinica=22g etanola), klasifikovana je kaoalkoholičar, a kao bivši alkoholičar ukoliko je prestala sa konzumiranjem alkoholaminimum godinu dana pre postavljanja dijagnoze. Zbog ograničenog brojanepušača, odnosno nealkoholičara, bivši pušači i nepušači, odnosno bivšialkoholičari i nealkoholičari su spojeni u jednu grupu u daljoj analizi.Oralna higijena u grupi pacijenata je procenjivana kao loša ili dobra naosnovu odgovarajućih standardnih kriterijuma od strane iskusnih stomatologa.
3.2. Biološki uzorci i izolacija DNK
Uzorci tumorskog tkiva su dobijeni neposredno po izvršenoj operaciji,nakon čega su smrznuti na -200C u tečnom azotu i čuvani do početka izolacije DNK.Patološkom analizom je izvršena TNM klasifikacija tumorskog tkiva (UICC TNMklasifikacija, VI izdanje) nakon urađene disekcije tumorskog od nekrotičnog inormalnog tkiva. Od učesnika kontrolne grupe je korišćena periferna krv, koja jenakon uzimanja čuvana na temperaturi od -200C, uz prisustvo antikoagulansaheparina, do početka izolacije DNK.Iz uzoraka tumorskog tkiva, DNK je izolovana korišćenjem TRIzol reagensa(Invitrogen, Nemačka) prema uputstvu proizvođača. Ukratko, na prethodno dobrohomogenizovan deo tumorskog tkiva se dodaje 1ml TRIzol reagensa i inkubira nasobnoj temperaturi u trajanju od 5 min da bi se obezbedila potpuna disocijacijanukleoproteinskog kompleksa. Uzorci se potom centrifugiraju na 12 000g/15 minna temperaturi od +40C. Nakon centrifugiranja se uočavaju tri faze: prva bezbojnavodena faza koja sadrži RNK, interfaza i donja crvena organska fenol-hloroformskafaza. DNK se precipitira iz interfaze i organske faze dodavanjem etanola,inkubiranjem u trajanju od 2-3 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega se vršicentrifugiranje. Nakon odlivanja fenol-etanolskog supernatanta, DNK se „pere“ u0.1M Na-citratu rastvorenim u 10% etanolu. Sledi inkubacija 30 minuta na sobnojtemperaturi, centrifugiranje i odbacivanje supernatanta. DNK pelet se
71
resuspenduje u 75% etanolu i potom centrifugira na 2 000g/5 min. Nakonodbacivanja supernatanta, izolovana DNK se suši na sobnoj temperaturi i konačnorastvara u 8mM NaOH.Iz uzoraka periferne krvi kontrolne grupe, DNK je izolovana na aparatuAbiPrism 6 100 Nucleic Acid PrepStation (Applied Biosystems, SAD) uz korišćenjeBloodPrep kita (Applied Biosystems, SAD), prema pratećem protokolu. Nakonpripreme uzoraka i inkubacije sa digestionim puferom i proteinazom K na 650C utrajanju od 10 min, uzorci se nanose na odgovarajuću ploču za izolaciju. Aparat zaizolaciju DNK radi po principu vakuma koji povlači sadržaj bunarića na ploči iodbacuje ga, pri čemu DNK zaostaje i vezuje se za specijalno dizajniranumembranu od staklenih vlakana, koja se nalazi u osnovi bunarića. Nakondodavanja rastvora koji sadrži etanol i precipitiranja izolovane DNK na membrani,vrši se eluiranje odgovarajućim puferima, nakon čega se konačno dobija izolovanaDNK u visokom prinosu.Izolovana DNK je nakon provere kvaliteta i čistoće i određivanjakoncentracije čuvana na temperaturi od -200C, do početka daljeg rada.
3.3. Provera kvaliteta i koncentracije izolovane DNK
Kvalitet izolovane genomske DNK je proveravan na 1% agarozi bojenojetidijum-bromidom čija je finalna koncentracija u rastvoru bila 5µg/ml.Elektroforeza se odvijala u 0.5 TBE puferu pri struji od 40 mA i naponu od 80 V utrajanju od 20 min. Intaktnost i kvalitet genomske DNK je analizirana pod UVsvetlošću transiluminatora (Pharmacia LKB, Švedska).Koncentracija DNK u uzorku, kao i čistoća izolata je određena korišćenjemGene Quant spektrofotometra (Pharmacia LKB, Švedska) merenjem apsorbance natalasnoj dužini od 260 nm. Koncentracija DNK je računata primenom formule:
  1000
260/ OPFRAlgc gde je:A260 - apsorbanca uzorka na 260 nm
Materijal i metode
72
R-razblaženje (100 puta)F- faktor konverzije za dvolančanu DNK (F=50)OP- optički put svetlosti (debljina zid kivete, u našem slučaju 1 cm)
Čistoća izolovane DNK je procenjena odnosom apsorbanci (R) merenih na260 nm i 280 nm. U svim uzorcima, odnos apsorbanci je bio R≥ 1.6, što ukazuje narelativno visok stepen čistoće izolovane DNK koja nije kontaminirana proteinima.
3.4. Lančana reakcija polimerizacije
Lančanom reakcijom polimerizacije (engl. Polymerase Chain Reaction- PCR)su amplifikovani ciljni regioni VDR gena, koji sadrže polimorfizam nukleotidnesekvence od interesa. Sekvence prajmera su bile poznate od ranije (Tabela 4.)(Povey i sar., 2007; Vupputuri i sar., 2006; Haghpanah i sar., 2007).
Tabela 4. Sekvence korišćenih prajmera za amplifikaciju ciljnih regiona VDRgena koji sadrže SNP od interesa
Gen Polimorfizam(Ref SNP) Sekvence forward i reverse prajmera
V
D
R
EcoRV F: 5'-CCT CCT CTG TAA GAG GCG AAT AGC GAT-3'(rs4516035) R: 5'-GGA CAG GTG AAA AAG ATG GGG TTC-3'
FokI F: 5'-AGC TGG CCC TGG CAC TGA CTC TGC TCT-3'(rs2228570) R: 5'-ATG GAA ACA CCT TGC TTC TTC TCC CTC-3'
TaqI F: 5'-CAG AGC ATG GAC AGG GAG C -3'(rs731236) R: 5'-AGG AGA GGC AGC GGT ACT G-3'
ApaI F: 5'-AGC AGA GCA GAG TTC CAA GC-3'(rs7975232) R: 5'-GTG AGG AGG GCT GCT GAG TA-3'
Materijal i metode
73
U PCR reakciju je dodavano 200ng izolovane genomske DNK. Korišćen je2x AmpliTaqGold Master Mix (Applied Biosystems, SAD). Temperaturehibridizacije prajmera su se razlikovale u zavisnosti od analiziranih polimorfizama.Uspešnost amplifikacije ciljnog regiona je proveravana na 2% agarozivisoke rezolucije (Serva, Nemačka), bojenoj etidijum-bromidom. Elektroforeza seodvijala u 0.5 TBE puferu, pri struji od 40 mA i naponu od 80 V u trajanju od 15minuta. Gel je analiziran pod UV svetlošću transiluminatora (Pharmacia LKB,Švedska).
3.5. Analiza polimorfizma dužine restrikcionih fragmenata
Konvencionalna PCR reakcija je praćena analizom polimorfizama dužinerestrikcionih fragmenata (engl. Restriction Fragment Length Polymorphism-RFLP). Nakon amplifikacije gena, u cilju utvrđivanja genotipa analiziranihpolimorfizama nukleotidne sekvence, dobijeni amplifikati su tretiraniodgovarajućim restrikcionim enzimima, Fast digest (Fermentas, Nemačka) premapriloženom uputstvu proizvođača. Polimorfizmi u VDR genu: EcoRV (rs4516035),FokI (rs2228570), TaqI (rs731236) i ApaI (rs7975232) su genotipizirani RFLPmetodom i imenovani su prema restrikcionim enzimima koji se koriste u njihovojidentifikaciji. Nakon inkubacije na optimalnoj temperaturi, specifičnoj za svaki odprimenjenih enzima, restrikcioni fragmenti su analizirani na 10%poliakrilamidnom gelu. Elektoroforeza se odvijala u 0.5 TBE puferu pri struji od10-20 mA i naponu od 150-200 V u trajanju od 90 min. Po isteku elektroforeze,poliakrilamidni gel je bojen srebro nitratom. Ukratko: nakon završeneelektroforeze gel se najpre fiksira 10% etanolom nakon čega se vrši obezbojavanje1% azotnom kiselinom. Nakon ispiranja u destilovanoj vodi, za bojenje gela sekoristi 0.2% rastor srebro nitrata, a kao razvijač boje 0.1M Na2CO3 sa 0.02%formaldehidom. Nakon bojenja u trajanju od 20 min na tamnom, vrši se ispiranjedestilovanom vodom. Konačno, gel se fiksira 10% sirćetnom kiselinom.Na osnovu dužine restrikcionih fragmenata je određivan genotipanaliziranog polimorfizma. Za određivanje veličine restrikovanih fragmenata su
Materijal i metode
74
korišćeni molekulski markeri (BioRAD, SAD). Genotipovi su obeležavanistandardnom nomenklaturom prema kojoj se velikim slovom označava odsustvo, amalim slovom prisustvo restrikcionog mesta. Detalji o analiziranimpolimorfizmima u VDR genu, kao i veličine restrikcionih fragmenata supredstavljeni tabelom 5.
Tabela 5. Detalji o polimorfizmima u VDR genu genotipiziranih RFLP metodom
Gen Lokacija Polimorfizam Enzim Alel/veličina(Ref SNP)
VDR EcoRV Promotor-1012 T/C ili e/E(rs4516035) wt: 152 bp + 27 bpmut: 179 bpEcoRV
VDR FokI Egzon 2+27823 T/C ili f/F(rs2228570) wt: 265 bpmut: 196 bp + 69 bpFokI
VDR TaqI Egzon 9+61938 T/C ili T/t(rs731236) wt: 454 bpmut: 293 bp + 161 bpTaqI
VDR ApaI Intron 8+61888 C/A ili a/A(rs7975232) wt: 403 bp+ 298 bpmut: 701 bpApaIwt: divlji homozigot;mut: mutirani homozigot
Materijal i metode
75
3.6. Real-Time PCR alelska diskriminacija
Polimorfizmi u VDR genu: BsmI (rs1544410) i rs11574085 kao ipolimorfizmi CYP27B1 gena (rs464653) i CYP24A1 gena (rs2296241) sugenotipizirani alelskom diskriminacijom na Real-Time PCR 7 300 (AppliedBiosystems, SAD). Korišćeni su komercijalno dostupni eseji: TaqMan SNPsGenotyping Assay (Applied Biosystems, SAD) u koncentraciji 40x i 2x UniversalTaqMan MasterMix (Applied Biosystems, SAD).Svaki TaqMan esej pored odgovarajućih prajmera sadrži i dve probe,komplementarne sa ciljnom sekvencom genomske DNK koja sadrži SNP odinteresa, pri čemu se dve probe međusobno razlikuju za samo jedan nukleotid kojije komplementaran divljem, odnosno mutiranom alelu. TaqMan probe su na 5'kraju obeležene fluorescentnim bojama VIC i FAM, koje ne fluoresciraju uintaktnom stanju zahvaljujući energetskom prihvatanju fluorescence od strane„prigušivača“ (engl. quencher) koji se nalazi na 3' kraju probe. Nakon hibridizacijeprajmera i komplementarnog sparivanja probe sa ciljnom sekvencom, Taqpolimeraza vrši ekstenziju i istovremeno iseca komplementrno sparenu TaqManprobu, čime se fluorescentna boja kojom je proba bila obeležena oslobađa urastvor. S obzirom da se nakon isecanja proba više ne nalazi u intaktnom stanju ipod uticajem prigušivača na 3' kraju, počinje da fluorescira u rastvoru. Intenzitetfluoresciranja odgovara količini amplifikata u reakciji. Dakle, tokom odvijanjaPCR-a u realnom vremenu meri se promena intenziteta fluorescence boja kojimasu probe obeležene. Prisustvo divljeg ili mutiranog homozigota rezultiradetektovanjem samo jedne fluorescentne boje u uzorku, dok se u slučajuheterozigota registruju obe fluorescentne boje. Alel specifične fluorescentne krivesu detektovane i analizirane korišćenjem 7 500 System SDS softvera (AppliedBiosystems, SAD).Detalji o polimorfizmima analiziranim Real-Time PCR alelskomdiskriminacijom su predstavljeni u Tabeli 6.
Materijal i metode
76
Tabela 6. Detalji o polimorfizmima u VDR, CYP27B1 i CYP24A1 genimagenotipiziranih Real Time PCR metodom
Gen Lokacija Polimorfizam ID TaqMan Assay(Ref SNP)
VDR BsmI Intron 8+60890 G/A ili b/B(rs1544410) C__8716062__10
VDR Intron 8 A/T(rs11574085) C__30742487__10
CYP27B1
Intron 6+2838 C/T(rs4646536) C__25623453__10
CYP24A1 Egzon 4 A/G(rs2296241) C__1915656__30ID TaqMan Assay-identifikacioni broj eseja
3.7. Analiza haplotipova
Vrednosti neravnoteže vezanosti (LD) su računate i grafički predstavljeneza sve analizirane parove polimorfizama u VDR genu pomoću programa Haploview
4.2. (Barret i sar., 2005). Za identifikaciju haplotipskog bloka je korišćena opcija
solid spine block definition, prema kojoj se krajnji članovi haplotipskog bloka nalazeu jakom LD-u, dok se između njih nalaze članovi koji međusobno mogu biti uslabijem LD-u. Haploview program pruža i mogućnost računanja učestalostihaplotipova u analiziranoj grupi-populaciji nesrodnika, primenom matematičkog
Expectation Maximisation (EM) algoritma (Fallin i Schork, 2000).Asocijacija haplotipova sa ukupnim preživljavanjem je urađena pomoćuprograma Thesias 3.1. (Tregouet i sar., 2007). Naime, primenom Cox-regression
hazard risk modela se procenjuje Hazard Ratio (HR) sa nivoom poverenja (engl.Confidence Interval-CI) od 95%. U osnovi se koristi matematički Stohastic
Expectation Maximisation (SEM) algoritam (Tregouet i sar., 2004; Zaykin i sar.,2002).
77
3.8. Statistička analiza
Dobijeni rezultati su obrađeni statističkim programom SPSS (verzija 17.00,IBM SPSS Inc., SAD). Tablice kontingencije su analizirane primenom hi-kvadrat (χ2)ili Fisher testa u slučaju kada je očekivana učestalost bila manja od 5%. Primenomlogističke regresije je računat Odds Ratio (OR) sa intervalom poverenja (engl.Confidence Interval- CI) od 95%.Ukupno preživaljvanje je procenjivano Kaplan-Meier Survival metodom.Kaplan-Meier krive preživljavanja su međusobno poređene log-rank testom.
Hazard Ratio (HR) je računat Cox-proporcionalnom hazard regresionom analizomsa 95% nivoom poverenja. Sve varijable koje su u univarijantnoj analizi bilestatistički značajne su analizirane udruženo u multivarijantnoj Cox-regresionojanalizi. U Cox-ovom modelu je korišćen forward stepwise method, kojim su seuklanjale promenljive sa verovatnoćom p<0.1.Sve prikazane p vrednosti su bile two-sided i asocijacije su smatranestatistički značajnim ukoliko je p vrednost bila manja od 0.05.
78
4. REZULTATI
Rezultati
79
Poglavlje rezultati je podeljeno u šest delova, pri čemu je u prvom delupredstavljena analiza proučavanih polimorfizama u grupi pacijenata sa oralnimkarcinomom i u kontrolnoj grupi. U drugom delu su predstavljeni rezultatipovezanosti polimorfizama sa etiološkim i kliničko patološkim odlikama grupepacijenata. Rezultati analize haplotipova su predstavljeni u trećem delu, dok serezultati analize ukupnog preživljavanja nalaze u četvrtom delu. U petom delu jepredstavljena analiza promenljivih relevantnih za ukupno preživljavnje i u šestomdelu analiza asocijacije haplotipova i preživljavanja pacijenata.
4.1. Analiza polimorfizama u VDR, CYP27B1 i CYP24A1 genima
Analiza zastupljenosti genotipova proučavanih polimorfizama u VDR genuizmeđu OSCC pacijenata i kontrolne grupe je pokazala da postoji statističkiznačajna razlika u učestalosti VDR genotipova za ApaI (p=0.013, χ2 test), EcoRV(p=0.002, χ2 test) i BsmI polimorfizam (p=0.025, χ2 test) (Tabela 7., Slika 24.). Štose tiče preostalih analiziranih polimorfizama VDR gena u studiji, razlike uučestalosti između OSCC i kontrolne grupe nisu pronađene (Tabela 7., Slika 24.) ip vrednosti za preostale polimorfizme su iznosile: FokI (p=0.293, χ2 test), TaqI(p=0.123, χ2 test) i rs11574085 (p=0.641, Fisher test).
Interesantno je napomenuti da u slučaju BsmI polimorfizma nijeregistrovano prisustvo mutiranog BB genotipa u grupi pacijenata sa oralnimkarcinomom, dok je zastupljenost BB genotipa u kontrolnoj grupi iznosila 2.4%.Takođe je zabeleženo odsustvo mutirane TT homozigotne varijante u slučajurs11574085 polimorfizma u grupi pacijenata, kao i u kontrolnoj grupi.
Rezultati
80
Tabela 7. Distribucija genotipova analiziranih polimorfizama u VDR genu u OSCC ikontrolnoj grupi
Gen/SNP Genotip OSCC Kontrole p*N N
VDR ee 35 34
0.002EcoRV Ee 62 51EE 13 37
VDR ff 32 46 0.293FokI Ff 67 62FF 11 14
VDR TT 41 59 0.123TaqI Tt 58 48tt 11 15
VDR aa 31 29
0.013ApaI Aa 52 41AA 27 52
VDR bb 39 59
0.025BsmI Bb 71 60BB 0 3
VDR AA 102 110 0.641rs11574085 AT 8 12TT / /*Vrednosti p<0.05 su podebljane
Rezultati
81
a) b)
c) d)
e) f)
Slika 24. Procentualna zastupljenost genotipova proučavanih polimorfizama uVDR genu u OSCC i kontrolnoj grupi za polimorfizme: a) EcoRV b) FokIc) TaqI d) ApaI e) BsmI f) rs11574085
Rezultati
82
Učestalosti alela proučavanih polimorfizama VDR gena su predstavljene uTabeli 8. Zapaženo je postojanje značajne razlike u distribuciji alela EcoRVpolimorfizma (p=0.019, χ2 test) (Tabela 8., Slika 25.) i alela ApaI polimorfizma(p=0.019, χ2 test) (Tabela 8., Slika 26.) između grupe pacijenata sadijagnostikovanim oralnim karcinomom i kontrolne grupe. Za preostaleanalizirane polimorfizme, nije zabeleženo postojanje razlike u zastupljenosti alela(Tabela 8.).
Tabela 8. Učestalost alela proučavanih polimorfizama VDR gena u OSCC ikontrolnoj grupi
Gen/SNP Alel OSCC Kontrole p*
N N
VDR e 132 120 0.019EcoRV E 88 124
VDR f 132 154 0.490FokI F 88 90
VDR T 141 166 0.370TaqI t 79 78
VDR a 114 100 0.019ApaI A 106 144
VDR b 150 178 0.260BsmI B 70 66
VDR A 211 232 0.669
rs11574085 T 9 12*Vrednosti p <0.05 su podebljane
Rezultati
83
a) b)
Slika 25. Procentualna zastupljenost alela EcoRV polimorfizma VDR gena u OSCC ikontrolnoj grupi a) OSCC b) kontrole
a) b)
Slika 26. Procentualna zastupljenost alela ApaI polimorfizma VDR gena u OSCC ikontrolnoj grupi a) OSCC b) kontrole
Stratifikovana analiza u odnosu na pol je pokazala postojanje značajnerazlike u distribuciji genotipova EcoRV polimorfizma pacijenata muškog pola ikontrolne grupe istog pola (p=0.003, χ2 test), dok za isti polimorfizam nijeregistrovana razlika između pacijenata ženskog pola i kontrolne grupe istog pola(p=0.972, χ2 test). Stratifikacija prema polu za BsmI polimorfizam je pokazalapostojanje značajne razlike između pacijenata muškog pola i kontrolne grupe istogpola (p=0.003, χ2 test), dok značajnost nije nađena kod pripadnika ženskog polaizmeđu analiziranih grupa. Za preostale polimorfizme u VDR genu, stratifikovanaanaliza prema polu nije dala rezultate sa nivoom statističke značajnosti.
Rezultati
84
Kada je reč o analiziranim polimorfizmima u genima uključenim umetabolizam vitamina D, uočeno je postojanje statističke razlike u distribucijigenotipova za CYP24A1 (rs2296241) polimorfizam između grupe pacijenata saoralnim karcinomom i kontrolne grupe (p=0.025, Fisher test) (Tabela 9., Slika 27.).Za rs4646536 polimorfizam u CYP27B1 genu nije registrovana značajnost udistribuciji genotipova između OSCC i kontrolne grupe (Tabela 9., Slika 27.).
Tabela 9. Distribucija proučavanih polimorfizama u CYP27B1 i CYP24A1 genima uOSCC i kontrolnoj grupi
Gen/SNP Genotip OSCC Kontrole p*
N N
CYP27B1 CC 15 19 0.859rs4646536 CT 40 46TT 55 57
CYP24A1 AA 45 32
0.025rs2296241 AG 65 90GG / /*Vrednosti p <0.05 su podebljane
a) b)
Slika 27. Procentualne zastupljenosti genotipova analiziranih polimorfizama uCYP27B1 i CYP24A1 genu u OSCC i kontrolnoj grupi a) rs4646536b) rs2296241
Rezultati
85
Tabelom 10. su predstavljene učestalosti alela proučavanih polimorfizama uCYP27B1 i CYP24A1 genima. Naši rezultati pokazuju da za analiziranepolimorfizme u CYP27B1 i CYP24A1 genu ne postoji razlika u zastupljenosti alela(Tabela 10.) u oba slučaja.
Tabela 10. Učestalost alela proučavanih polimorfizama CYP27B1 i CYP24A1 genau OSCC i kontrolnoj grupi
Gen/SNP Alel
OSCC Kontrole
p
N N
CYP27B1
rs4646536
C 70 83
0.615
T 150 161
CYP24A1
rs2296241
A 154 154
0.117
G 66 90
U slučaju polimorfizma u CYP24A1 genu, uočeno je postojanje statističkiznačajne razlike između pripadnika muškog pola OSCC i kontrolne grupe (p=0.019,Fisher test) što nije detektovano između pripadnica ženskog pola iz grupepacijenata i kontrolne grupe. Za preostale proučavane polimorfizme u studiji,stratifikacija prema polu nije pokazala postojanje statistički značajne razlike.
Rezultati
86
4.2. Etiološke i kliničko patološke odlike ispitivane grupe
pacijenata
Asocijacija između analiziranih polimorfizama u VDR, CYP27B1 i CYP24A1genima i etiološkim faktorima su predstavljeni Tabelom 11. Asocijacija sa polom jeprimećena za VDR TaqI (p=0.006, χ2 test), BsmI (p=0.002, χ2 test) i CYP27B1rs4646536 (p=0.014, χ2 test) polimorfizme za mutirane homozigote iheterozigotne genotipove zbirno, u poređenju sa divljim homozigotom u sva trislučaja (Tabela 11.). Statistička značajna veza između godina i analiziranihSNP-ova je zabeležena za ApaI polimorfizam (p=0.049, χ2 test) kod mutiranih iheterozigotnih genotipova združeno nasuprot divljem genotipu (Tabela 11.).Pušenje je u asocijaciji sa mutiranom i heterozigotnom formom TaqI polimorfizmau odnosu na divlju formu (p=0.039, χ2 test). Takođe je uočena povezanost izmeđuCYP27B1 rs4646536 i konzumacije alkohola (p=0.012, χ2 test) (Tabela 11.).
Povezanost polimorfizama u VDR, CYP27B1 i CYP24A1 genima sa kliničkopatološkim varijablama u proučavanoj OSCC grupi su predstavljeni Tabelom 12. ZaTaqI polimorfizam je zabeležena značajna veza sa pojavom recidiva bolesti(p=0.008, χ2 test). Preostale kliničko patološke varijable: OSCC stadijum, veličinatumora, nodalni status kao i histološki i nukleusni gradus nisu bili asocirni saanaliziranim polimorfizmima u ovoj studiji (Tabela 12.).
Rezultati
87
Tabela 11. Povezanost polimorfizama u VDR, CYP27B1 i CYP24A1 genima saetiološkim faktorima
Varijable N
VDR
EcoRV
VDR
FokI
VDR
TaqI
VDR
ApaI
VDR
BsmI
VDR
rs11574085
CYP27B1
rs4646536
CYP24A1
rs2296241
wt/heterozigot/mutirani homozigot
Pol Muški 81 26/45/10 24/50/7 24/49/8 22/36/23 22/59/0 75/6/0 15/28/38 36/45/0Ženski 29 9/17/3 8/17/4 17/9/3 38246 17/12/0 27/2/0 12/17/0 9/20/0p* NSZ NSZ 0.006 NSZ 0.002 NSZ 0.014 NSZ
Godine#<58 51 13/29/9 16/31/4 20/27/4 19/20/12 19/32/0 46/5/0 10/18/23 18/33/0≥58 59 22/33/4 16/36/7 21/31/7 12/32/15 20/39/0 56/3/0 5/22/32 27/32/0p* NSZ NSZ NSZ 0.049 NSZ NSZ NSZ NSZ
PušenjeNe/bivši 28 7/16/5 7/19/2 15/11/2 7/14/7 13/15/0 24/4/0 3/12/13 10/18/0Da 82 28/46/8 25/48/9 26/47/9 24/38/20 26/56/0 78/4/0 12/28/42 35/47/0p* NSZ NSZ 0.039 NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ
AlkoholNe/bivši 75 25/41/9 20/47/8 32/33/10 21/36/18 31/44/0 68/7/0 6/31/38 35/40/0Da 35 10/21/4 12/20/3 9/25/1 10/16/9 8/27/0 34/1/0 9/9/17 10/25/0p* NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ 0.012 NSZ
Oralna
higijenaDobra 54 13/31/10 14/35/5 24/24/6 18/25/11 23/31/0 50/4/0 7/22/25 23/31/0Loša 56 22/31/3 18/32/6 17/34/5 13/27/16 16/40/0 52/4/0 8/18/30 22/34/0p* NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ*Vrednosti p<0.05 su podebljaneN- ukupan broj pacijenata u datoj kategorijiNSZ- Nije statistički značajno
Rezultati
88
Tabela 12. Povezanost polimorfizama u VDR, CYP27B1 i CYP24A1 genima sa kliničkopatološkim karakteristikama OSCC grupe
Varijable N
VDR
EcoRV
VDR
FokI
VDR
TaqI
VDR
ApaI
VDR
BsmI
VDR
rs11574085
CYP27B1
rs4646536
CYP24A1
rs2296241
wt/heterozigot/mutirani homozigot
Stadijum II 27 7/17/3 8/16/3 9/15/3 9/14/4 10/17/0 27/0/0 4/10/13 8/19/0III 83 28/45/10 24/51/8 32/43/8 22/38/23 29/54/0 75/8/0 11/30/42 37/46/0p* NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ
Velič. tum.T1/2 82 28/43/11 22/49/11 29/45/8 25/40/17 28/54/0 77/5/0 11/29/42 37/45/0T3/4 28 7/19/2 10/18/0 12/13/3 6/12/10 11/17/0 25/3/0 4/11/13 8/20/0p* NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ
Nod. statusN0 23 7/14/2 6/14/3 9/12/2 8/13/2 10/13/0 23/0/0 5/7/11 7/16/0N+ 87 28/48/11 26/53/8 32/46/9 23/39/25 29/58/0 79/8/0 10/33/44 38/49/0p* NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ
Recidiv R0 49 17/26/6 13/27/9 25/19/5 17/23/9 22/27/0 44/5/0 4/24/21 24/25/0R+ 61 18/36/7 19/40/2 16/39/6 14/29/18 17/44/0 58/3/0 11/16/34 21/40/0p* NSZ NSZ 0.008 NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ
Hist.grad.H1 30 11/15/4 7/19/4 11/14/5 7/17/6 10/20/0 29/1/0 4/12/14 17/13/0H2 60 21/32/7 16/37/7 25/31/4 20/25/15 23/37/0 54/6/0 6/23/31 20/40/0H3 20 3/15/2 9/11/0 5/13/2 4/10/6 6/14/0 19/1/0 5/5/10 8/12/0p* NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ
Nukl. grad. 1 19 8/7/4 2/15/2 9/8/2 5/9/5 7/12/0 17/2/0 2/8/9 11/8/02 56 18/33/5 18/30/8 21/30/5 17/27/12 30/36/0 51/5/0 8/21/27 22/34/03 35 9/22/4 12/22/1 11/20/4 9/16/10 12/23/0 34/1/0 5/11/19 12/23/0p* NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ NSZ*Vrednosti p <0.05 su podebljaneN-ukupan broj pacijenata u datoj kategorijiNSZ- Nije statistički značajnoVelič. tum.- Veličina tumora; Nod. status- Nodalni status; Hist. grad.- Histološki gradus; Nukl.grad.- Nukleusni gradus
Rezultati
89
U cilju ispitivanja postojanja asocijacije između određenog genotipa i rizikaza razvoj OSCC-a, računat je crude Odds Ratio logističkom regresionom analizom(Tabela 13.). Statistički značajno smanjenje rizika za razvoj OSCC je uočeno uslučaju mutiranog EE genotipa EcoRV (OR=0.341, p=0.008), mutiranog genotipaAA ApaI (OR=0.486, p=0.040) polimorfizama VDR gena i heterozigotnog genotipaCYP24A1 gena (OR=0.514, p=0.018) u poređenju sa wt formom u sva tri slučaja(Tabela 13.). Heterozigotni genotip VDR BsmI polimorfizma je značajno asociran sapovišenim rizikom za razvoj oralnog karcinoma (OR=1.790, p=0.032), ali iheterozigotni i mutirani genotip zajedno u odnosu na wt genotip (OR=1.705,p=0.048) (Tabela 13.).
U tabeli 14. je prikazan crude Odds Ratio za ispitivane alele analiziranihpolimorfizama i rizika za razvoj OSCC. Mutirani alel E EcoRV polimorfizma jeznačajno asociran sa smanjenim rizikom za razvoj OSCC-a u poređenju sa wt ealelom (OR=0.645, p=0.019). U slučaju polimorfizma ApaI, mutirani alel A jestatistički značajno povezan sa smanjenjem rizika za razvoj oralnog karcinoma upoređenju sa wt alelom a (OR=0.645, p=0.019). Aleli drugih ispitivanihpolimorfizama nisu bili u vezi sa povećanim niti smanjenim rizikom za razvojOSCC.
Adjusted Odds Ratio, kombinovan sa podacima o konzumiranju alkohola,pušenju, godinama i polu je pokazao statistički značajno smanjenje rizika za razvojoralnog karcinoma kod heterozigota AG polimorfizma rs2296241 CYP24A1 gena, uodnosu na wt AA genotip (OR=0.281, p=0.000) (Tabela 15.). U slučaju EEmutiranog genotipa EcoRV polimorfizma u poređenju sa wt ee genotipom nijedostignuta statistička značajnost, ali se zapaža trend smanjivanja rizika za razvojoralnog karcinoma (OR=0.388, p=0.063) (Tabela 15.). Ni jedan od preostalihgenotipova proučavanih polimorfizama u VDR i CYP27B1 genu nije bio značajnopovezan sa rizikom za nastanak OSCC-a (Tabela 15.).
Rezultati
90
Tabela 13. VDR, CYP27B1 i CYP24A1 polimorfizmi i rizik za nastanak oralnogkarcinoma-crude Odds Ratio
Gen/SNP Genotip OSCC Kontrole Crude OR (95% CI) p*
N % N %
VDR
EcoRV
ee 35 31.8 34 27.9 1 Ref.Ee 62 56.4 51 41.8 1.181 (0.648-2.152) 0.587EE 13 11.8 37 30.3 0.341 (0.155-0.751) 0.008Ee+EE# 75 68.2 88 72.1 0.828 (0.471-1.455) 0.511
VDR
FokI
ff 32 29.1 46 37.7 1 Ref.Ff 67 60.9 62 50.8 1.553 (0.880-2.742) 0.129FF 11 10 14 11.5 1.129 (0.455-2.805) 0.793Ff+FF# 78 70.9 76 62.3 1.475 (0.851-2.559) 0.166
VDR
TaqI
TT 41 37.3 59 48.4 1 Ref.Tt 58 52.7 48 39.3 1.739 (1.001-3.021) 0.050tt 11 10 15 12.3 1.055 (0.440-2.529) 0.904Tt+tt# 69 62.7 63 51.6 1.576 (0.932-2.664) 0.089
VDR
ApaI
aa 31 28.2 29 23.8 1 Ref.Aa 52 47.3 41 33.6 1.186 (0.619-2.275) 0.607AA 27 24.5 52 42.6 0.486 (0.244-0.966) 0.040Aa+AA# 79 71.8 93 76.2 0.795 (0.441-1.431) 0.444
VDR
BsmI
bb 39 35.5 59 48.4 1 Ref.Bb 71 64.5 60 49.2 1.790 (1.053-3.044) 0.032BB 0 0 3 2.4 NR NRBb+BB# 71 64.5 63 51.6 1.705 (1.006-2.891) 0.048
VDR
rs11574085
AA 102 92.7 110 90.2 1 Ref.AT 8 7.3 12 9.8 0.719 (0.282-1.830) 0.489TT / / / / NR NRAT+TT# / / / / NR NR
CYP27B1
rs4646536
CC 15 13.6 19 15.6 1 Ref.CT 40 36.4 46 37.7 1.101 (0.496-2.448) 0.813TT 55 50 57 46.7 1.222 (0.565-2.644) 0.61CT+TT# 95 86.4 103 84.4 1.168 (0.562-2.429) 0.677
CYP24A1
rs2296241
AA 45 40.9 32 26.2 1 Ref.AG 65 59.1 90 73.8 0.514 (0.295-0.894) 0.018GG / / / / NR NRAG+GG# / / / / NR NR*Vrednosti p<0.05 su podebljane#Heterozigot i mutirani homozigot združeni vs.wt genotipRef.- Referentna vrednost; NR- Nije računato
Rezultati
91
Tabela 14. Aleli analiziranih polimorfizama u VDR, CYP27B1 i CYP24A1 genima irizik za nastanak oralnog karcinoma- crude Odds Ratio
Gen/SNP Alel OSCC Kontrole Crude OR(95% CI) p*
N % N %
VDR e 132 60 120 49 1 Ref.
EcoRV E 88 40 124 51 0.645 (0.446-0.932) 0.019
VDR f 132 60 154 63 1 Ref.
FokI F 88 40 90 37 1.141 (0.784-1.659) 0.493
VDR T 141 64 166 68 1 Ref.
TaqI t 79 36 78 32 1.192 (0.811-1.752) 0.371
VDR a 114 52 100 41 1 Ref.
ApaI A 106 48 144 59 0.645 (0.447-0.932) 0.019
VDR b 150 68 178 73 1 Ref.
BsmI B 70 32 66 27 1.258 (0.843-1.878) 0.259
VDR A 211 96 232 95 1 Ref.
rs11574085 T 9 4 12 5 0.825 (0.341-1.996) 0.671
CYP27B1 C 70 32 83 34 1 Ref.
rs4646536 T 150 68 161 66 1.104 (0.749-1.628) 0.617
CYP24A1 A 154 70 154 63 1 Ref.
rs2296241 G 66 30 90 37 0.733 (0.497-1.081) 0.116*Vrednosti p<0.05 su podebljaneRef.- Referentna vrednost
Rezultati
92
Tabela 15. VDR, CYP27B1 i CYP24A1 polimorfizmi i rizik za nastanak oralnogkarcinoma-adjusted Odds Ratio
Gen/SNP Genotip OSCC Kontrole Adjusted ORa(95% CI) p*
N % N %
VDR
EcoRV
ee 35 31.8 34 27.9 1 Ref.Ee 62 56.4 51 41.8 1.083 (0.517-2.270) 0.832EE 13 11.8 37 30.3 0.388 (0.143-1.054) 0.063Ee+EE# 75 68.2 88 72.1 0.789 (0.391-1.592) 0.508
VDR
FokI
Ff 32 29.1 46 37.7 1 Ref.Ff 67 60.9 62 50.8 1.841 (0.906-3.739) 0.091FF 11 10 14 11.5 1.571 (0.495-4.982) 0.443Ff+FF# 78 70.9 76 62.3 1.832 (0.912-3.679) 0.089
VDR
TaqI
TT 41 37.3 59 48.4 1 Ref.Tt 58 52.7 48 39.3 1.749 (0.868-3.524) 0.118tt 11 10 15 12.3 1.689 (0.616-4.633) 0.309Tt+tt# 69 62.7 63 51.6 1.720 (0.891-3.322) 0.106
VDR
ApaI
aa 31 28.2 29 23.8 1 Ref.Aa 52 47.3 41 33.6 1.368 (0.621-3.014) 0.437AA 27 24.5 52 42.6 0.643 (0.278-1.486) 0.302Aa+AA# 79 71.8 93 76.2 1.041 (0.502-2.158) 0.914
VDR
BsmI
bb 39 35.5 59 48.4 1 Ref.Bb 71 64.5 60 49.2 1.725 (0.895-3.323) 0.103BB 0 0 3 2.4 NR NRBb+BB# 71 64.5 63 51.6 1.663 (0.864-3.202) 0.128
VDR
rs11574085
AA 102 92.7 110 90.2 1 Ref.AT 8 7.3 12 9.8 0.697 (0.237-2.054) 0.513TT / / / / NR NRAT+TT# / / / / NR NR
CYP27B1
rs4646536
CC 15 13.6 19 15.6 1 Ref.CT 40 36.4 46 37.7 1.612 (0.535-4.857) 0.396TT 55 50 57 46.7 1.317 (0.430-4.037) 0.630CT+TT# 95 86.4 103 84.4 1.426 (0.499-4.074) 0.507
CYP24A1
rs2296241
AA 45 40.9 32 26.2 1 Ref.AG 65 59.1 90 73.8 0.281 (0.139-0.568) 0.000GG / / / / NR NRAG+GG# / / / / NR NR*Vrednosti p <0.05 su podebljane; aadjusted Odds Ratio za godine, pol, alkohol i pušenje
#Heterozigot i mutirani homozigot združeno vs. wt genotipNR- Nije računato; Ref-Referentna vrednost
Rezultati
93
4.3. Analiza haplotipova
Koeficijent neravnoteže vezanosti je računat za sve VDR proučavaneSNP-ove međusobno pomoću programa Haploview 4.2. Nivo LD-a između svihparova analiziranih polimorfizama su izražene preko parametra D' ipredstavljene procentualno (prikazane u kvadratićima), za celokupnu studijskugrupu, kao i kontrolnu i OSCC grupu (Slike 28., 29., 30., redom). Primenommatematičkih algoritama i EM modela, na kojima se zasniva program Haploview,za datu analiziranu grupu se procenjuje postojanje potencijalnih haplotipova injihova učestalost.
Slika 28. Neravnoteža vezanosti i haplotipski blok u celokupnoj studijskoj grupi
Za definiciju haplotipskog bloka je korišćena opcija solid spine block
definition. Identifikovan je jedan haplotipski blok u celokupnoj studijskoj grupi,OSCC i kontrolnoj grupi i BsmI (rs1544410), ApaI (rs7975232) i TaqI (rs731236)polimorfizmi VDR gena su se nalazili u neravnoteži vezanosti (Slike 28., 29., 30.).Može se zapaziti da su TaqI i BsmI polimorfizmi međusobno jače vezani (D'=0.87)nego TaqI i ApaI (D'=0.65) odnosno BsmI i ApaI (D'=0.74) (Slika 28.).
Rezultati
94
Slika 29. Neravnoteža vezanosti Slika 30. Neravnoteža vezanosti ii haplotipski blok u kontrolnoj grupi haplotipski blok u OSCC grupi
Izuzetno visok nivo vezanosti između tri polimorfizma u haplotipskombloku je zabeležen u kontrolnoj grupi (D'>0.90) (Slika 29.). Haplotipski blok unutarOSCC grupe pokazuje isti obrazac vezanosti kao i u celokupnoj studijskoj grupi, gdesu TaqI i BsmI bili u jačem LD-u (D'=0.80) u odnosu na svaki od ova dvapolimorfizma pojedinačno sa ApaI polimorfizmom (D'=0.38, D'=0.62, redom) (Slika30.). Distribucija analiziranih VDR haplotipova unutar OSCC i kontrolne grupe jeprikazana Slikom 31. Kao što se može uočiti, najčešći haplotip u grupi pacijenata ikontrolnoj grupi je bio baT (40%) (Slika 31.,a). Haplotip BaT je bio najmanjezastupljen u grupi pacijenata (1.4%), pri čemu nije detektovan u kontrolnoj grupi.Pored ovog, u kontrolnoj grupi nisu uočeni haplotipovi bat, Bat i BAT koji sudetektovani u grupi pacijenata sa oralnim karcinomom (Slika 31.,b).
Rezultati
95
Slika 31. Procentualne zastupljenosti identifikovanih haplotipova u OSCC ikontrolnoj grupi a) OSCC b) kontrole
Analizirano je postojanje veze identifikovanih haplotipova sa rizikom zanastanak oralnog karcinoma (Tabela 16.). Za referentnu vrednost je uzet baThaplotip koji je bio najučestaliji u obe grupe. Logistička regresiona analiza jepokazala da BsmI-ApaI-TaqI tri-lokusni haplotip nije bio u statistički značajnojasocijaciji sa rizikom za razvoj oralnog karcinoma (Tabela 16.).
Tabela 16. Asocijacija haplotipova i rizika za nastanak oralnog karcinoma
Haplotip
OSCC Kontrole
Odds Ratio (95% CI) p
2N =220 % 2N=244 %
baT 88 40.2 98 40.1 1.000 Ref.
BAt 51 23.2 66 27 0.861 (0.540-1.370) 0.527
bAT 43 19.4 64 26.2 0.748 (0.462-1.211) 0.238
bat 12 5.3 / / NR NR
Bat 11 5 / / NR NR
bAt 6 2.9 14 5.8 0.477 (0.176-1.296) 0.140
BAT 6 2.7 / / NR NR
BaT 3 1.4 / / NR NRRef.- Referentna vrednostNR- Nije računato
a) b)
Rezultati
96
4.4. Analiza ukupnog preživljavanja
Period praćenja pacijenata je bio od 28-100 meseci, sa medijanompreživaljavanja od 35 meseci.Analizom Kaplan-Meier kriva preživljavanja, uočava se značajno smanjenjeukupnog preživaljavanja kod pacijenata u uznapredovalom stadijumu bolesti uodnosu na raniji stadijum (III vs. II, p=0.007, log-rank test) (Slika 32., a). Značajnosmanjenje ukupnog preživljavanja je zabeleženo i kod pacijenata sa limfnimmetastazama (N+ vs. N0, p=0.007, log-rank test) (Slika 32., b), većim tumorima(T3/4 vs. T1/2, p=0.001, log-rank test) (Slika 32., c) kao i pojavom recidiva bolesti(R+ vs. R0, p=0.000, log-rank test) (Slika 32., d)
a) b)
Slika 32. Kaplan-Meier krive preživljavanja a) stadijum bolesti b) nodalni statusc) veličina tumora d) recidiv
c) d)
Rezultati
97
VDR FokI polimorfizam je bio u asocijaciji sa smanjenim ukupnimpreživljavanjem (p=0.042, log-rank test) (Grafik 33., a). Divlji ff genotip je asociransa lošijim preživljavanjem (p=0.012, log-rank test) u poređenju sa heterozigotimaFf i mutiranim FF genotipovima zajedno (Grafik 33., b). Stratifikovana analizaprema postojanju limfnih metastaza je pokazala da je wt ff genotip asociran salošijim preživljavanjem u obe grupe sa i bez limfnih metastaza (p=0,025, p=0.040,redom, log-rank test) (Slika 33., c, d). Pored toga, wt ff genotip je imao lošijuprognozu preživljavanja u grupi pacijenata sa III stadijumom bolesti (p=0.026), zarazliku od II stadijuma (p=0.079) gde nije postignuta statistička značajnost, alipostoji izvesna tendencija (Slika 33., e, f). Stratifikacionom analizom premarecidivu, uočeno je lošije preživaljavanje wt FokI genotipa u odnosu naheterozigotne i mutirane forme zajedno u podgrupi sa recidivom bolesti (R+ vs. R0,p=0.036, log-rank test) (krive nisu prikazane).
a) b)
c)                                                               d)
98
e) f)
Slika 33. Kaplan-Meier krive preživljavanja: a) FokI polimorfizam b) Ff +FF vs. wtff c) FokI kod pacijenata sa II stadijumom bolesti d) FokI kod pacijenata saIII stadijumom bolesti e) FokI kod pacijenata sa negativnim nodalnimstatusom (N0) f) FokI kod pacijenata sa pozitivnim nodalnim statusom(N+)
U slučaju polimorfizma rs2296241 u CYP24A1 genu, nije uočena veza saukupnim preživljavanjem (p=0.108, log-rank test) (Slika 34., a). Međutim,stratifikacija prema stadijumu bolesti je pokazala da heterozigotni genotip AG imastatistički lošije preživljavanje u odnosu na wt u uznapredovalom, III stadijumubolesti (p=0.021, log-rank test), dok takva veza nije uočena u slučaju II stadijuma(p=0.989, log-rank test) (Slika 33., b, c). Pored toga, heterozigoti su imali lošijepreživljavanje u grupi pacijenata sa limfnim metastazama (p=0.016, log-rank test),što nije bio slučaj u grupi pacijenata bez limfnih metastaza (p=0.553, log-rank test)(Slika 33., d, e). Stratifikaciona analiza prema veličini tumora i pojavom recidivanije otkrila postojanje statistički značajnih razlika u preživljavanju između nosiocarazličitih genotipova (krive preživljavanja nisu predstavljene).
Rezultati
99
a)
b) c)
d)                                                                                     e)
Slika 34. Kaplan-Meier krive preživljavanja a) CYP24A1 (rs2296241) b) CYP24A1kod pacijenata sa II stadijumom bolesti c) CYP24A1 kod pacijenata sa IIIstadijumom bolesti d) CYP24A1 kod pacijenata sa negativnim nodalnimstatusom e) CYP24A1 kod pacijenata sa pozitivnim nodalnim statusom
Rezultati
100
Preostali proučavani polimorfizmi u VDR genu kao i CYP27B1 genu nisu bilipovezani sa ukupnim preživljavanjem (Slika 35.).
a) b)
c) d)
e) f)
Slika 35. Kaplan-Meier krive preživljavanja analiziranih polimorfizama: a) EcoRVb) BsmI c) TaqI d) ApaI e) VDR rs11574085 f) CYP27B1 rs4646536
Rezultati
101
Grupisanje heterozigotnog i mutiranog genotipa za analiziranepolimorfizme naspram divljih genotipova takođe nije bilo asocirano sapreživljavanjem. Isto je pokazano i stratifikovanom analizom prema stadijumubolesti, veličini tumora, nodalnom statusu i recidivu bolesti (rezultati nisuprikazani).
Rezultati
102
4.5. Analiza promenljivih relevantnih za ukupno preživljavanje
Univarijantna Cox regresiona analiza pojedinačnih promenljivih koje utičuna ukupno preživljavanje je pokazala da su VDR FokI polimorfizam, veličinatumora, stadijum bolesti, nodalni status, recidiv i nukleusni gradus, kao i oralnahigijena i konzumiranje alkohola značajni prognostički indikatori za ukupnopreživljavanje (Tabela 17).
Tabela 17. Univarijantna regresiona analiza pojedinačnih promenljivih koje utičuna ukupno preživljavanje
Varijable HR 95 % CI p*
VDR EcoRV 0.754 (0.499-1.400) 0.181
VDR FokI 0.615 (0.391-0.968) 0.035
VDR TaqI 1.376 (0.909-2.085) 0.132
VDR ApaI 0.975 (0.679-1.401) 0.892
VDR BsmI 1.331 (0.771-2.299) 0.304
VDR rs11574085 1.068 (0.330-3.458) 0.912
CYP27B1 rs4646536 1.052 (0.723-1.530) 0.792
CYP24A1 rs2296241 1.538 (0.897-2.637) 0.118
Pol 0.652 (0.350-1.215) 0.178
Godine 1.307 (0.779-2.193) 0.311
Pušenje 1.802 (0.912-3.563) 0.090
Alkohol 1.544 (1.129-2.112) 0.007
Stadijum 2.774 (1.257-6.122) 0.012
Nodalni status 2.977 (1.277-6.939) 0.012
Veličina tumora 2.636 (1.475-4.711) 0.001*Vrednosti p<0.05 su podebljane
Rezultati
103
Statistički značajne varijable u univarijantnoj analizi, uključujući varijablesa nivoom značajnosti ispod 20% (0.2) su ponovo analizirane zajedno umultivarijantnoj analizi. S obzirom da su nodalni status i veličina tumora uključeniu određivanje stadijuma bolesti, ove dve varijable su isključene iz multivarijantneanalize u cilju dobijanja što preciznijih rezultata (Tabela 18.).
Tabela 18. Multivarijantna regresiona analiza više promenljivih koje utiču naukupno preživljavanje
Varijable HR 95% CI p*
VDR FokI 0.580 (0.365-0.923) 0.021
Alkohol 1.477 (1.080-2.020) 0.211
Stadijum 2.656 (1.197-5.894) 0.016*Vrednost p<0.05 su podebljane
Multivarijantnom Cox regresionom analizom je pokazano da su VDR FokIpolimorfizam i stadijum bolesti zadržali statistički značajan uticaj kao nezavisniprognostički faktori za ukupno preživljavanje, dok je doprinos unosa alkohola kaoprognostičkog faktora izgubljen (Tabela 18.).
Rezultati
104
4.6. Analiza asocijacije haplotipova i preživljavanja
Korišćenjem programa Thesias 3.1. je analizirano postojanje veze izmeđuprocenjenih VDR haplotipova i ukupnog preživljavanja, Cox proporcionalnimmodelom izraženim preko Hazard Ratio (HR). Kao referentna vrednost je korišćenbaT haplotip koji se javlja sa najvišom učestalošću u grupi pacijenata. U poređenjusa referentnom vrednošću, nije uočeno postojanje značajne veze između preostalihdetektovanih haplotipova unutar grupe pacijenata sa dijagnostikovanim OSCC-om ipreživljavanja (Tabela 19.). U slučaju asocijacije bat haplotipa i preživljavanja,uočava se trend (p=0.075), ali ta vrednost nije dostigla nivo statističke značajnosti(Tabela 19.).
Tabela 19. Asocijacija haplotipova sa preživljavanjem
Haplotip HR 95 % CI p
baT Ref.
BAt 1.211 (0.653-2.244) 0.543
bAT 1.078 (0.637-1.823) 0.778
bat 2.095 (0.929-4.726) 0.075
Bat 2.173 (0.850-5.553) 0.105
bAt 1.366 (0.454-4.109) 0.578
BAT 2.291 (0.509-10.315) 0.280
BaT 1.961 (0.339-11.392) 0.451Ref.- Referentna vrednost
105
5. DISKUSIJA
Diskusija
106
Oralna kancerogeneza predstavlja višestepeni proces koji uključuje složenomultifaktorsko preplitanje kako genetičkih tako i sredinskih faktora. Oralniskvamocelularni karcinomi se odlikuju lošom prognozom i visokim mortalitetom,kao i rastućom incidencom među osobama mlađim od 40 godina. Uprkos uloženimnaporima za unapređenje dijagnostike i terapije, petogodišnje preživljavanjepacijenata sa dijagnostikovanim oralnim karcinomom je ostalo nepromenjenoposlednjih nekoliko decenija (Mascolo i sar., 2012), što ukazuje na potrebu zaulaganje u nove kriterijume klasifikacije ovog karcinoma. Poseban značaj sepridaje opisivanju molekularno genetičkih aspekta oralne kancerogeneze koji biposlužili za pronalaženje dobrih prediktivnih i prognostičkih molekularnihmarkera. Polimorfizmi nukleotidne sekvence predstavljaju prirodne varijacije kojese smatraju odgovornim za razlike koje postoje među individuama po pitanjupodložnosti bolestima, pa samim tim i karcinomima. U današnje vreme je sve većibroj studija koje imaju za cilj otkrivanje različitih polimorfizama u kandidatgenima, koji bi mogli imati bitnu ulogu terapeutskih, prediktivnih ili prognostičkihfaktora. Studije asocijacija identifikovanih polimorfizama kandidat gena ikarcinoma, uključujući i GWAS projekat, ukazuju na značaj ovih genetičkihvarijanti u humanom genomu i njihovu vezu sa podložnošću kompleksnimbolestima. Istovremeno se velike nade ulažu u identifikaciju prirodnih supstancikoje imaju antikancerogeno dejstvo, čija bi primena pokazala dobre rezultate,posebno kod onih osoba koje imaju povišen rizik za oboljevanje od različitih tipovakarcinoma. Mnogobrojne in vitro i in vivo studije su pokazale da vitamin D imaantikancerogeni potencijal koji ostvaruje nakon vezivanja za svoj receptor (Deeb isar., 2007; Stewart i Weigel, 2004; Kornfehl i sar., 1996). Aktivnost vitamina D jemodulisana enzimima familije citohroma P450 koji su uključeni u njegovmetabolizam. Prethodnim studijama je pokazano da su polimorfizmi u VDR genu,koji kodira za receptor za vitamin D, asocirani sa nekoliko tipova kancera,uključujući karcinome glave i vrata (Liu i sar., 2005), kao i oralni karcinom (Abo-Hanger i sar., 2008; Bektas-Kayhan i sar., 2010). Uvidom u literaturu nalazimo dastudije asocijacije gena koji imaju ulogu u anabolizmu i katabolizmu vitamina D saoralnim karcinomima nisu do sada rađene.
Diskusija
107
U ovoj doktorskoj disertaciji je proučavana asocijacija nekoliko najčešćeanaliziranih polimorfizama VDR gena, kao i CYP27B1 i CYP24A1 gena, uključenih umetabolizam vitamina D, sa rizikom za razvoj oralnog karcinoma, kliničkopatološkim karakteristikama i preživljavanjem pacijenata. Po našem saznanju,analiza polimorfizama gena bitnih za metabolizam i funkcionisanje vitamina D kodpacijenata sa oralnim karcinomom nije do sada rađena u našoj populaciji. Brojnestudije su ispitivale postojanje asocijacija između VDR polimorfizama i rizika zarazvoj kancera, pretežno kancera dojke, prostate i kolona, ali dobijeni rezultati nisukonzistentni i niskog su stepena reproducubilnosti između studija. Relativno malibroj studija je ispitivao potencijalni prognostički značaj VDR polimorfizama kodpacijenata obolelih od karcinoma. Samo nekoliko studija je proučavalo asocijacijuizvesnih SNP-ova u VDR genu sa rizikom za nastanak karcinoma glave i vrata ioralnog karcinoma, dok, prema našem saznanju, ovo predstavlja prvu studiju kojase posebno bavila i utvrdila postojanje asocijacije VDR polimorfizama i OSCCpreživljavanja, što će biti diskutovano u predstojećem tekstu.U ovoj studiji su primećene značajne razlike u distribuciji genotipova VDRpolimorfizama EcoRV (p=0.019), ApaI (p=0.013) i BsmI (p=0.025), kao i CYP24A1rs2296241 (p=0.025) između grupe pacijenata sa oralnim karcinomom i kontrolnegrupe osoba naše populacije bez dijagnostikovanog karcinoma. Uočena razlika udistribuciji polimorfizama između OSCC i kontrolne grupe ukazuje na mogućuasocijaciju i važnu ulogu VDR i CYP24A1 gena u procesu oralne kancerogeneze.
5.1. EcoRV polimorfizam
Polimorfizam u VDR genu smešten na poziciji -1012 u 1a promotorskomregionu, EcoRV (rs4516035), predstavlja supstituciju timina citozinom. Premanašem saznanju, EcoRV polimorfizam je relativno slabo ispitivan u genetičkimstudijama asocijacije sa složenim bolestima, pa samim tim i karcinomima. Sobzirom da je reč o polimorfizmu koji se nalazi u promotorskom regionu VDR genaza koji se smatra da nema funkcionalni efekat, čini ovaj polimorfizam relativnoneprivlačnim za ispitivanja ovog tipa. U našem istraživanju je zapaženo da postoji
Diskusija
108
statistički značajna razlika u distribuciji genotipova (p=0.002) i alela (p=0.019)EcoRV polimorfizma između grupe pacijenata sa dijagnostikovanim OSCC-om ipripadnika kontrolne grupe. Mutirani alel E je bio nešto više zastupljen međukontrolama (51%) u odnosu na uzorke (40%), dok je divlji tip alela e bio češći uuzoračkoj grupi (60%) u odnosu na kontrolnu grupu (40%). Prethodna ispitivanjasu pokazala da je VDR EcoRV EE mutirani genotip asociran sa smanjenim rizikomod kutanog melanoma u odnosu na ee wt genotip (Povey i sar., 2007), dok rezultatidruge studije pokazuju da je mutirani genotip povezan sa povišenim rizikom zarazvoj malignog melanoma (Barroso i sar., 2008) i da je divlji e alel povezan sapovećanom podložnošću i lošijim ishodom malignog melanoma (Halsall i sar.,2009). Kada je reč o našem istraživanju, rezultati crude Odds Ratio, pokazuju da jemutirani E alel, kao i EE varijanta EcoRV polimorfizma bila povezana sa 0.341 putasniženim rizikom za razvoj oralnog karcinoma u poređenju sa wild type eevarijantom, ali je ova značajnost izgubljena nakon analize modifikovane premapolu, godinama, pušenju i unosu alkohola. Kako se rezultati adjusted Odds Ratiologističke regresione analize smatraju preciznijom merom za procenu rizika, možese reći da naši rezultati negiraju postojanje asocijacije između EcoRV polimorfizmai rizika za nastanak oralnog karcinoma, što je u skladu sa nalazima za kancer dojke(Barroso i sar., 2008) i za kancer dojke u populaciji Poljaka (Gapska i sar., 2009).EcoRV polimorfizam je bio asociran sa povećanim rizikom za pojavu melanomalociranim na glavi, vratu i trupu (Barroso i sar., 2008). Pored toga, u kanceru dojkeje EcoRV polimorfizam povezan sa smanjenim rizikom za metastaziranje (Barroso isar., 2008), dok je u slučaju malignog melanoma wt alel e bio asociran sa rizikom zametastaziranje (Halsall i sar., 2009). Stiče se utisak da su rezultati ovihmalobrojnih istraživanja, koja su se bavila EcoRV polimorfizmom, potpunooprečna, što se može dovesti u vezu sa tumorskom specifičnošću. EcoRVpolimorfizam nije bio u vezi sa ispitivanim kliničko patološkim odlikama oralnogkarcinoma u našem istraživanju.Prema našem saznanju, ni jedna studija se do sada nije bavila proučavanjemveze između EcoRV polimorfizma i preživljavanja pacijenata sa oralnimkarcinomom i karcinomom uopšte. EcoRV polimorfizam nije bio statističkipovezan sa preživljavanjem u našoj studiji (p=0.357) i isto je pokazano i
Diskusija
109
stratifikacionom analizom prema stadijumu bolesti, nodalnom statusu, veličinitumora i recidivu. Pored toga, univarijantna Cox-regresiona analiza je pokazala dase ovaj polimorfizam ne može koristiti kao nezavisni prognostički faktor.
5.2. FokI polimorfizam
Najčešće proučavani polimorfizam u VDR genu, FokI (rs2228570) se nalaziu egzonu 2 i predstavlja izmenu timina citozinom na poziciji +27823 (ili +30875).Reč je o jednom od retkih polimorfizama u VDR genu za koji je potvrđeno da imafunkcionalni efekat. Divlja ff forma rezultuje sintezom proteina koji se sastoji od427 amino kiselina (M1 forma) za koju je pokazano da ima manji transaktivacijskikapacitet u odnosu na mutiranu varijantu FF, koja dovodi do sinteze proteinakraćeg za 3 amino kiseline (M4 forma) (Whitfield i sar., 2001). Ovom doktorskomdisertacijom nije utvrđeno postojanje razlike u distribuciji genotipova i alelaizmeđu uzoračke i kontrolne grupe. Pored toga nije pokazano postojanje statističkeveze između FokI polimorfizma i kliničko patoloških karakteristika, kao i rizika zarazvijanje oralnog karcinoma. Istraživanjima koja su nedavno sprovedena nijeutvrđeno postojanje asocijacije između VDR FokI polimorfizma i rizika za pojavukrupnoćelijskog karcinoma pluća (Turna i sar., 2012), prostate (Ahn i sar., 2009, Lii sar., 2007; Mikhak i sar., 2007), nazofaringealnog karcinoma u populaciji HanKineza (Huang i sar., 2011) i kolorektalnog karcinoma u Iranskoj populaciji(Mahmoudi i sar., 2011), što je u konzistenciji sa našim rezultatima. Međutim,rezultati jedne istraživačke grupe su pokazali da je mutirana homozigotna FFvarijanta povezana sa sniženim rizikom za razvoj karcinoma glave i vrata kod ne-hispanskih belaca (Liu i sar., 2005). U populaciji Poljaka, osobe divljeg ff genotipasu bile pod značajno povećanim rizikom za nastanak karcinoma dojke (Gapska isar, 2009). Studija koja je obuhvatala pacijente sa dijagnostikovanim kanceromprostate, Kavkazoidne populacije, pokazuje da je prisustvo divljeg f alela biloasocirano sa povećanim rizikom od nastanka agresivnog kancera prostate i stogapovezivano i sa lošijom prognozom (Xu i sar., 2003; Zhou i sar., 2006). Takođe,sprovedena meta analiza pokazuje da je divlji ff genotip asociran sa povećanjem
Diskusija
110
rizika za razvoj kancera kože i dojke u poređenju sa FF mutiranim genotipom(Raimondi i sar., 2009). Različita zapažanja među studijama, po pitanju postojanjaasocijacije FokI polimorfizma i rizika za razvoj karcinoma se mogu pripisatispecifičnostima različitih tipova karcinoma, ali i veličini studijske grupe.Istraživanje koje se bavilo ispitivanjem povezanosti polimorfizama VDR gena ipreživljavanja u slučaju krupnoćelijskog karcinoma pluća je utvrdilo dapojedinačni polimorfizmi nisu povezani sa preživljavanjem, ali je boljepreživljavanje uočeno u slučaju združenog efekta protektivnih alela tripolimorfizma VDR gena: FokI, BsmI i Cdx-2 (Zhou i sar., 2006).Naši rezultati pokazuju da OSCC pacijenti sa divljom ff formom VDR FokIpolimorfizma imaju značajno lošiju stopu preživljavanja u poređenju saheterozigotnim i mutiranim genotipom zajedno (p= 0.012). Ovo zapažanje je uskladu sa rezultatima prethodnih studija prema kojima je ff genotip asociran salošim preživljavanjem u slučaju karcinoma glave i vrata (Hama i sar., 2011),uznapredovalog krupnoćelijskog karcinoma pluća (Heist i sar., 2008) i epitelijalnogkancera ovarijuma (Tamez i sar., 2009). Ovakvi rezultati podržavaju podatke kojigovore o funkcionalnosti FokI polimorfizma. Poznato je da je prisustvo divljeg falela asocirano sa smanjenom VDR ekspresijom i VDR funkcionalnom aktivacijomnakon izlaganja kalcitriolu (Colin i sar., 2000). M1 forma receptora za vitamin D,koji nastaje kao rezultat postojanja FokI divljeg genotipa, ima manji kapacitettransaktivacije, što može rezultovati progresijom bolesti i posledično lošimishodom (Zeljic i sar., 2012). Nedavno publikovano istraživanje ukazuje da je rastćelijske linije kancera dojke MCF-7 VDR FF genotipa bio 60% inhibiran kaoposledica tretmana kalcitriolom, u poređenju sa ćelijskim linijama ff genotipa, čijije rast bio inhibiran za samo 28% (Alimirah i sar., 2011). Pretpostavlja se da VDRM4 proteinska forma ima veći kapacitet da indukuje ekspresiju CYP24A1 gena upoređenju sa M1 formom (Roff i sar., 2008). U skladu sa ovom pretpostavkom, ućelijama FF genotipa je nivo iRNK CYP24A1 gena bio 1.8 puta viši (Alimirah i sar.,2011). Istovremeno, zabeleženo je da je nivo iRNK CYP24A1 gena i proteina bioznačajno povišen u odgovoru na kalcitriol u slučaju ćelija FF genotipa u poređenjusa ćelijama ff genotipa, što dodatno potvrđuje zaključak o intenzivnijem odgovoruna vitamin D u slučaju FF genetičke varijante (Alimirah i sar., 2011). Jedan od
Diskusija
111
mogućih predloženih mehanizama kojima FF varijanta pojačava efikasnostvitamina D je povećanje stabilnosti proteinskog receptora. Naime, ćelije FFgenotipa su bile rezistentne na efekte inhibitora proteinske sinteze,cikloheksamida, iako nisu bile izložene tretmanu kalcitriolom. Poznato je da jeN-terminalna sekvenca proteina često determinanta njegove stabilnosti, te jemoguće da različita proteinska stabilnost M1 odnosno M4 VDR forme može bitirezultat njihove razlike u N-terminalnoj sekvenci (Jurutka i sar., 2000; Alimirah isar., 2011). Proteinska stabilnost receptora i viša aktivnost FF genetičke varijantedoprinosi da ova varijanta pojačava odgovor na vitamin D u ćelijama kancera dojke(Alimirah i sar., 2011). Nasuprot ovome, ćelijske linije kancera tireoidee ff genotipasu pokazale senzitivnost pri izlaganju kalcitriolu u poređenju sa rezistentnimćelijama, koje su bile FF genotipa (Sharma i sar., 2010). Primećene diskrepance uslučaju kancera tireoidee i oralnog karcinoma se mogu pripisati tkivnojspecifičnosti i drugačijoj patogenezi, iako se oba navedena karcinoma razvijaju odskvamocelularnog epitela. Kao mogući zaključak se nameće da divlji ff genotipmože imati značajnu ulogu u pojačanju agresivnosti kancera i samim tim bitipovezan sa lošijom prognozom i ukupnim preživljavanjem. Istovremeno, time bi semoglo objasniti zašto neke ćelije kancera nedovoljno reaguju na tretmanvitaminom D (Alimirah i sar., 2011). Ipak, bitno je naglasiti da se pretpostavlja dasnižena transaktivacijska sposobnost M1 forme nije sama po sebi dovoljna dainicira nastajanje bolesti, ali ima mogućnost da unapredi razvoj bolesti (Gapska isar., 2009). U prilog tome govore i rezultati istraživanja koja potvrđuju da je samou slučaju niske koncentracije 25(OH)D3 u serumu, divlji ff genotip bio povezan sa2.53 puta povećanim rizikom za nastanak agresivne forme kancera prostate (Li isar., 2007), što ukazuje na postojanje interakcije između genotipa i sredinskihfaktora. Obrnuto, u slučaju visokog nivoa kalcidiola i FokI ff genotipa rizik odnastanka agresivne forme kancera prostate je bio snižen za 60-70% (Li i sar.,2007). Budući da nemamo podatke o nivou glavne cirkulišuće forme vitamina D userumu naših pacijenata u studiji, postoji mogućnost da su upravo osobe ffgenotipa imale nizak nivo kalcidiola, prema literaturnim podacima niži od25 ng/ml, što je rezultovalo značajno lošijim preživljavanjem uočenim u ovomistraživanju. Pored toga, mutirana FF varijanta je asocirana sa sniženim rizikom za
Diskusija
112
razvoj karcinoma prostate u slučaju visokog stepena izloženosti Sunčevomzračenju i svetlije pigmentacije kože (John i sar., 2005; Ingles, 2007). Muškarci ffgenotipa Britanske populacije su bili pod čak 3 puta višim rizikom za razvojkancera prostate samo ukoliko su bili izloženi Sunčevom zračenju manje odprosečnog vremena od 1 100 sati godišnje (Bodiwala i sar., 2004). Ovakvi podacinam nedvosmisleno pokazuju koliko je veliki značaj sredinskih faktora, poredgenetičke osnove, u determinaciji složenih fenotipskih osobina i time kompleksnihbolesti uključujući i kancer, koje bi trebalo uzeti u razmatranje u budućimproširivanjima ove studije.Multivarijantna analiza Cox regresionim modelom je pokazala da FokIpolimorfizam VDR gena može biti razmatran kao nezavisan prognostički faktor(HR=0.580, p=0.021). Dodatno, mi smo pokazali da je FokI ff genotip značajnoasociran sa lošom prognozom u slučaju OSCC pacijenata sa i bez metastaza limfnihčvorova (p=0.040, p=0.025, redom), kao i podgrupe pacijenata u III stadijumubolesti (p=0.026), dok u stadijumu II, FokI nije imao prognostički značaj (p=0.079).Prema literaturnim podacima, smatra se da maligne ćelije mogu razviti izvesnimehanizam za izbegavanje antiproliferativnih dejstava vitamina D, uključujućismanjenje VDR ekspresije, smanjenje konverzije 25(OH)D3 u 1α25(OH)2D3 ilipovećanje ekspresije CYP24A1 gena. Pretpostavlja se da taj kapacitet zaizbegavanje antiproliferativnih dejstava vitamina D može biti više zastupljen međućelijama u uznapredovalom tumorskom stadijumu (Heist i sar., 2008; Bouillon isar., 2006), čime bi se mogla objasniti uočena veza sa lošijim preživljavanjem u IIIstadijumu bolesti u slučaju wt ff genotipa u našem istraživanju. Dodatno, pokazanoje da su osobe ff genotipa pod većim rizikom od nastajanja metastaza u slučajukancera dojke u populaciji Britanaca (Osborne i Hutchinson, 2002). Ovaj nalaz bi semogao povezati sa našim zapaženjem statistički značajno lošijeg preživljavanjapacijenata ff genotipa u odnosu na nodalni status.Značajno je pomenuti i zapažanje da je kod ćelija ff genotipa zabeleženapovišena ekspresije proinflamatornih gena COX-2, IL-8, CCL-2 i BIRC-3(Alimirah i sar., 2011). Prema skorašnjim podacima smatra se da COX-2 gen imabitnu ulogu u metastazi ćelija kancera. Utvrđeno je da je upravo COX-2 jedan odgena odgovornih za pokretanje metastaze ćelija kancera dojke u mozak, pluća (Bos
Diskusija
113
i sar., 2009; Minn i sar., 2005; Alimirah i sar., 2011) i kosti (Singh i sar., 2006).Povišen nivo expresije COX-2 i IL-8, detektovan kod pacijenata sa kancerom dojke(Singh i sar., 2006) bio je pozitivno povezan sa nepovoljnom prognozom iubrzanom progresijom bolesti koja na kraju rezultira metastazom (Alimirah i sar.,2011). Time bi se mogla objasniti i naša zapažanja o lošijem preživljvanjupacijenata ff genotipa u odnosu na pozitivni nodalni status. Iz prethodno iznetihpodataka bi se moglo zaključiti da COX-2 i IL-8 geni na izvestan način potpomažuinvaziju ćelija kancera ff genotipa u druge organe (Alimirah i sar., 2011). Dakle,povišena ekspresija proinflamatornih gena, zajedno sa ff genotipom bi moglapotencijalno poslužiti kao klinički marker za agresivnost tumora i prognozu.Prema sugestijama datim u istoimenom istraživanju, bitno je napomenuti da VDR ffgenetička varijanta sama po sebi ne uzrokuje agresivni fenotip, ali usled povećanjatranskripcione aktivnosti gena koji su u vezi sa agresivnim fenotipom, normalnećelije će podleći procesu kancerogeneze tokom vremena (Alimirah i sar., 2011).Povišen nivo expresije BIRC-3 gena u slučaju ćelija ff genotipa ukazuje da ćelijekancera sa ovim genotipom mogu izbeći apoptozu, doprinoseći posledičnonepovoljnoj prognozi (Alimirah i sar., 2011). Buduća istraživanja u našoj studijskojgrupi bi mogla da obuhvate i analizu ekspresije prethodno navedenihproinflamatornih gena, što bi se moglo dovesti u vezu sa rezultatima dobijenim zaFokI polimorfizam i oralni karcinom.
5.3. TaqI polimorfizam
Na 3' kraju VDR gena, u egzonu 9 je identifikovan polimorfizam TaqI(rs731236) koji predstavlja supstituciju timina citozinom na poziciji +61938. Rečje o tihoj (engl. silent) izmeni kodona ATT u ATC, gde oba kodona kodiraju zaugradnju izoleucina na pozicijji 352 u polipeptidnom lancu (Thorne i Campbell,2008). TaqI polimorfizam se najčešće proučava u sklopu haplotipskog bloka, sobzirom da se nalazi u jakoj neravnoteži vezanosti sa ApaI i BsmI polimorfizmom,ali je i individualni efekat TaqI polimorfizma ispitivan u različitim karcinomima. Uovom istraživanju nije detektovano postojanje razlike u distribuciji genotipova i
Diskusija
114
alela TaqI polimorfizma između grupe OSCC pacijenata i kontrola. Što se tiče vezesa kliničko patološkim odlikama, naši rezultati ukazuju da je TaqI polimorfizamznačajno povezan sa polom (p=0.006), pušačkim statusom (p=0.039) i pojavomrecidiva (p=0.008). Mutirani i heterozigotni genotip su bili zastupljeniji međupripadnicima muškog (70%) u odnosu na ženski pol (50%). Literaturni podaciukazuju da je oralni karcinom češći među pripadnicima muškog u odnosu naženski pol (Jemal i sar., 2011). Tradicionalno se ovakva polna distribucija ujavljanju oralnog karcinoma povezivala sa višom zastupljenošću pušenja ikonzumacije alkohola među pripadnicima muškog pola (Silverman, 2001). Udanašnje vreme se razlika u učestalosti OSCC-a između polova snižava, što senajčešće objašnjava sve zastupljenijom upotrebom cigareta i/ili alkohola međuženama. Međutim, moguće je da pored ovih dobro poznatih faktora rizika, genotipTaqI polimorfizma igra izvesnu indirektnu ulogu u razvijanju oralnog karcinoma,čime bi se mogao objasniti rastući broj dijagnostikovanih oralnih karcinoma međupripadnicama ženskog pola. Takođe, pušenje je bilo značajno povezano sa TaqIpolimorfizmom i to heterozigotnom i mutiranom varijantom zajedno, koje su biledaleko zastupljenije u grupi nepušača i bivših pušača, u poređenju sa divljomformom.Mi nismo registrovali postojanje veze između TaqI VDR SNP-a i rizika zarazvoj oralnog karcinoma što je u skladu sa rezultatima dobijenim za kancerprostate u populaciji nehispanskih belaca (Ahn i sar., 2009; Tayeb i sar., 2003),kancer prostate u populaciji Afro Amerikanaca (Bonilla i sar., 2011) i kolorektalnikarcinom u populaciji Čeha (Hughes i sar., 2011). Međutim, druge studije pokazujudrugačije nalaze. Mutirani homozigot VDR TaqI polimorfizma je bio asociran sasmanjenim rizikom za razvoj karcinoma glave i vrata kod ne-hispanskih belaca(Liu i sar., 2005). Isti rezultati za TaqI polimorfizam su dobijeni za populacijuEgipćana, OSCC pacijenata (Abo-Hanger i sar., 2008). U studiji sprovedenoj naTurskoj populaciji, heterozigotne varijante TaqI polimorfizma su asocirane sasmanjenim rizikom za nastanak oralnog skvamocelularnog karcinoma (Bektas-Kayhan i sar., 2010). Kada je reč o drugim kancerima, divlji TT genotip TaqIpolimorfizma je bio asociran sa povećanim rizikom za razvoj krupnoćelijskogkarcinoma pluća (Turna i sar., 2012) i pet puta višim rizikom za nastanak
Diskusija
115
metastaza u slučaju karcinoma prostate i dojke (Garland i sar., 2004). Sa drugestrane, TaqI nije pokazao značajnu asocijaciju sa kancerom prostate ili benignimhiperplazijama u populaciji Japanaca (Habuchi, i sar. 2000), što odgovarazapažanjima za kancer prostate u populaciji Kavkazijanaca (Holick i sar., 2007).Može se pretpostaviti da ovakvi nekonzistentni rezultati između studijaodslikavaju razlike u učestalosti alela između različitih populacija. Inače, minor alelTaqI polimorfizma je daleko zastupljeniji među Kavkazijancima u poređenju saAzijatima i Afrikancima. Smatra se da relativno novi polimorfizmi mogu pokazivativisok stepen varijacije među etničkim grupama (Uitterlinden i sar., 2004). Poredtoga, faktore spoljašnje sredine, kao što je UV zračenje, bi trebalo uzeti urazmatranje kao potencijalni uzrok nekonzistentnih rezultata među studijama.Pokazano je da je značajno sniženje rizika za razvoj karcinoma prostate u vezi sa ttgenotipom TaqI polimorfizma u slučaju većeg izlaganja Suncu i provođenjavremena napolju (John i sar., 2005). Takođe, ne treba zanemariti efekat veličineuzorka i odabira pacijenata za studiju, što takođe može uticati na uočene razlikeizmeđu istraživanja.Što se tiče preživljavanja, u našem istraživanju nije pronađena veza sa TaqIpolimorfizmom, ni nakon stratifikovane analize prema nodalnom statusu,stadijumu bolesti i postojanju recidiva.
5.4. ApaI polimorfizam
Nedaleko od TaqI polimorfizma, u intronu 8 na poziciji +61888 jeidentifikovana izmena citozina adeninom, poznatija kao ApaI polimorfizam. Ovimistraživanjem je pokazano da je mutirani alel A značajno povezan sa 0.645 putasmanjenim rizikom za razvoj oralnog karcinoma u poređenju sa divljim a alelom(p=0.019). Nasuprot našim nalazima, nosioci mutiranog alela A ApaI polimorfizmasu imali povećani rizik za razvoj kancera ovarijuma u Kavkazoidnoj populaciji, štonije bio slučaj u populaciji žena iz Japana (Lurie i sar., 2007). Takođe, mi smozabeležili značajno smanjenje rizika od 0.486 puta kod mutiranog genotipa AAgrubom logističkom regresionom analizom. Međutim, modifikovanom logističkom
Diskusija
116
regresijom je ova značajnost izgubljena, što ukazuje na značaj kofaktora: godina,pola, pušenja i unosa alkohola. Takvo zapažanje je u konzistenciji sa nalazima zamelanom (Schafer i sar., 2012). U slučaju kolorektalnog karcinoma, odsustvoasocijacije je zabeleženo za pripadnike Češke populacije (Hughes i sar., 2011) iKavkazijanaca uopšte (Kupfer i sar., 2011), dok je ApaI je bio značajno povezan upopulaciji Afro Amerikanaca. Takođe su primećene razlike u asocijaciji populacijaAfro Amerikanaca iz različitih geografskih regiona, te se postojanje takvih razlikamože objasniti razlikama u izloženosti sredinskim faktorima između ovih grupa(Kupfer i sar., 2011). U populaciji Japanaca (Habuchi i sar., 2000) ApaI SNP nijepokazao značajnu asocijaciju sa kancerom prostate niti benignim hiperplazijama,što je potvrđeno i drugim istraživanjima čiju su studijsku grupu činili Kavkazijanci(Ahn i sar., 2009). Sa druge strane u Turskoj populaciji (Hacer Onen i sar., 2008)ApaI heterozigoti Aa i mutirani AA genotipovi su asocirani sa povećanim rizikomza nastanak sporadičnog kancera prostate. Pored VDR polimorfizama, pokazano jeda u etiologiji kancera prostate, važnu ulogu imaju i sredinski faktori, kao što jeizlaganje Suncu (John i sar., 2005), čime se mogu pojasniti uočene razlike.Starosna dob se navodi kao bitan faktor u oralnoj kancerogenezi, s obziromda je incidenca oralnog karcinoma viša u kasnijem životnom dobu. Međutim, novijipodaci pokazuju da je veliki broj pacijenata identifikovan u grupi ispod 40 godinastarosti, koji čak nisu izloženi nekim od poznatih faktora rizika, što ostavlja prostorza razmatranje genetičke osnove koja bi u takvim situacijama predstavljala okidačza nastanak oralnog karcinoma. Naime, u našoj grupi OSCC pacijenata, zapažena jeveza između VDR ApaI polimorfizma i godina, prema medijani starosti od 58godina (p=0.049). Značajno viša zastupljenost heterozigota i mutiranog genotipazajedno u odnosu na divlju formu je detektovana među pacijentima starijim od 58godina, kao i u odnosu na mlađe od 58 godina svih genotipskih varijanti. Time jemoguće dovesti u vezu Aa i AA genotip sa godinama kod oralnog karcinoma.Ovakav nalaz se možda ne odnosi direktno na proces starenja već može biti irezultat dužeg perioda konzumacije alkohola i pušenja, koji je evidentiran u grupipacijenata sa OSCC karcinomom.
Diskusija
117
5.5. BsmI polimorfizam
BsmI polimorfizam, smešten u intronu 8, između egzona 8 i 9, predstavljaizmenu timina citozinom na mestu +60890. S obzirom da je reč o izmeni koja nedovodi do promene amino kiselinske sekvence, pretpostavlja se da nemafunkcionalni efekat. Međutim, utvrđeno je da se BsmI nalazi u jakom LD-u sa poly Arepom i da može uticati na nivo ekspresije menjanjem stabilnosti iRNK (Denzer isar., 2011; Parisi i sar., 2008).Uočili smo da između grupe pacijenata sa dijagnostikovanim oralnimkarcinomom i kontrolne grupe postoji značajna razlika u distribuciji genotipova(p=0.025) ali ne i alela (p=0.260). Interesantno je zapažanje da unutar OSCC grupenisu zabeleženi nosioci mutiranog BB genotipa, dok su u kontrolnoj grupidetektovani u malom procentu (2.4%). Heterozigotna forma Bb je bila zastupljenijameđu obolelima (64.5%) u odnosu na kontrole (49.2%).Pored toga, naši rezultati ukazuju da je BsmI značajno povezan sa polom(p=0.002). Crude Odds Ratio je pokazao da je heterozigotna varijanta, kao izdruženi heterozigot i mutirani genotip statistički značajno povezani sa 1.790 putapovećanim rizikom za nastanak oralnog karcinoma. Nakon adjusted Odds Ratioanalize, ova statistička značajnost je izgubljena. To je u skladu sa nedavnimzapažanjem nepostojanja asocijacije između BsmI polimorfizma i rizika od pojavekarcinoma prostate (Ahn i sar., 2009; Mikhak i sar., 2007), nazofaringealnogkarcinoma u populaciji Han Kineza (Huang i sar., 2011), kolorektalnog karcinoma upopulaciji Čeha (Hughes i sar., 2011) i Iranskoj populaciji (Mahmoudi i sar., 2011).Jednom studijom je pokazano da je mutirani BB genotip značajno povezan sapovećanim rizikom za nastanak skvamocelularnih karcinoma (Han i sar., 2007).Međutim, u populaciji Japanaca BsmI polimorfizam je imao značajnu protektivnuulogu u nastanku benignog kancera prostate (Habuchi i sar., 2000). Opsežna metaanaliza je ukazala da Bb heterozigoti imaju značajno smanjeni rizik za nastanakkancera prostate u odnosu na divlji genotip. Prema istoimenoj meta-analizi,naglašeno je da je BsmI heterozigotni genotip kod Kavkazijanaca asociran saznačajnim smanjenjem rizika za razvoj kancera na bilo kom mestu (Raimondi i sar.,2009). Sa druge strane, ustanovljeno je postojanje veze između povećanog rizika za
Diskusija
118
razvoj karcinoma prostate i bb genotipa BsmI polimorfizma samo u slučaju niskekoncentracije kalcidiola u serumu (Ahn i sar., 2009; John i sar., 2005), što jepotvrđeno i za karcinom dojke (Colston i sar., 2006). U Američkoj populaciji, bbgenotip je povezan sa niskom koncentracijom kalcitriola u cirkulaciji i dva putavećim rizikom za nastanak karcinoma kolona kod muškaraca (Garland i sar., 2004).Ovakvi nalazi stavljaju akcenat na obavezno razmatranje sredinskih faktora ustudijama asocijacije polimorfizama i rizika od kancerogeneze. Statistički značajnopovećanje rizika za kancer dojke je primećeno kod žena sa wt bb genotipom i polyA LL genotipom (Guyi sar., 2004). U studiji sprovedenoj na velikom uzorku žena upostmenopauzi, wt bb genotip je bio asociran sa povećanim rizikom za kancerdojke kod Kavkazijanaca, ali ne i Afro-Amerikanki (Trabert i sar., 2007). Obe rasnegrupe nisu pokazivale značajnu asocijaciju između poly A polimorfizma i rizika zakancer dojke, iako se poly A i BsmI polimorfizam nalaze u jakoj neravnoteživezanosti (Uitterlinden i sar., 2004). Iz prethodno navedenog je jasno da surezultati vrlo nekonzistentni među studijama, što se može pripisati etničkimrazličitostima kao i izloženostima faktorima spoljašnje sredine, koje bi trebalouzeti u razmatranje prilikom izvođenja studija asocijacije. Takođe, u predstojećimispitivanjima bi bilo poželjno uključiti i polimorfizam dužine poly A repa, koji bi ukombinaciji sa genotipovima BsmI polimorfizma mogao dati dodatne informacijeza dobijene rezultate.Kada je reč o proučavanju povezanosti polimorfizama VDR gena i prognoze,najproučavaniji je BsmI polimorfizam. U našoj studijskoj grupi BsmI polimorfizamnije bio u vezi sa preživljavanjem pacijenata. Prema rezultatima izvesnihistraživanja, mutirani BB genotip BsmI polimorfizma se povezivao sa zaštitom odrazvoja metastaza kod pacijenata sa karcinomom dojke i bio povezivan saprognozom kancera rektuma utičući na ekspresiju erbB-2 onkogena, koji nijesamostalno imao uticaja na preživljavanje (Zhou i sar., 2006). Kod žena BBgenotipa rizik od metastaziranja karcinoma dojke je bio četiri puta viši u odnosu nanosioce wt genotipa (Garland i sar., 2004).Drugim studijama nije utvrđeno postojanje asocijacije između genotipovaanaliziranih polimorfizama BsmI, ApaI, TaqI FokI i poly A sa karcinomom dojke, alistratifikovana analiza prema ishrani je pokazala da osobe sa većim unosom
Diskusija
119
kalcijuma imaju manji rizik ukoliko su BsmI bb, TaqI TT i poly A LL genotipa(McCullough i sar., 2007). Ovakva zapažanja predstavljaju dokaz više koji ukazujena značaj faktora spoljašnje sredine, u ovom slučaju ishrane, u studijamaasocijacije. S obzirom da se ishrana smatra vrlo značajnim faktorom koji možemodifikovati podložnost karcinomima uopšte, pa samim tim i oralnom karcinomu,postojanje podataka o ishrani, a posebno unosu vitamina D i kalcijuma, bi bilo odizuzetnog značaja za analizu naših dobijenih rezultata.
5.6. Analiza haplotipova
Značaj pojedinačnih SNP-ova koji nisu pokazali postojanje veze naindividualnom nivou sa rizikom za razvijanje kancera bi trebalo razmatrati i uanalizama interakcije između SNP-ova. Istovremeno, treba imati na umu da seSNP-ovi mogu nalaziti u neravnoteži vezanosti i da je vrlo često uočena vezapojedinačnog polimorfizma sa bolešću zapravo rezultat postojanja haplotipskogbloka u kom se analizirani polimorfizam nalazi. Studije asocijacije su pokazale daproučavanje haplotipova ima veću statističku snagu u odnosu na proučavanjepojedinačnih SNP-ova (Bader, 2001). Stoga bi analiza haplotipova mogla da pokažekako polimorfizmi u nekom genu mogu doprineti riziku za nastanak određenihkancera. Iz literature je poznato da se BsmI, ApaI i TaqI SNP-ovi VDR gena nalaze ujakom LD-u i čine B LD blok VDR gena (Uitterlinden i sar., 2004; Whitfield i sar.,2001). Haplotipskom analizom pomoću programa Haploview, je pokazano da suupravo ova tri polimorfizma u jakom LD-u u našoj celokupnoj studijskoj grupi, kaoi u OSCC i kontrolnoj grupi. Najzastupljeniji haplotip u grupi pacijenata i osoba kojesu činile kontrolnu grupu je bio baT, sa učestlošću oko 40%, za kojim slede Bat ibAT, što odgovara prethodno zabeleženim učestalostima u drugim studijama(Denzer i sar., 2011). U studijskoj grupi koju su činili pripadnici Turske populacijehaplotip baT je bio najviše zastupljen sa relativno sličnom učestalošću kojaodgovara našim nalazima (Hacer Onen i sar., 2008). S obzirom da je poznato dahaplotipski blokovi odslikavaju evolucionu istoriju humanih populacija, na osnovutri navedena polimorfizma koji pripadaju B haplotipskom bloku VDR gena i koji se
Diskusija
120
nalaze u jakom LD-u, moglo bi se reći da nije bilo dovoljno vremena za razdvajanjeovog bloka rekombinacijama, bar kada je reč o Evropskim populacijama.Identifikovani haplotipovi u našoj grupi nisu bili u asocijaciji sa rizikom nastankaoralnog karcinoma. Nepostojanje asocijacije ovog tri-lokusnog haplotipa sakancerom prostate je zabeleženo za većinu Kavkazoidne populacije (Cicek i sar.,2006), ali je uvođenjem FokI polimorfizma u haplotipsku analizu pokazanosmanjenje rizika. Prethodno istraživanje sprovendeno na Turskoj populacijipacijenata sa sporadičnim kancerom prostate (Hacer Onen i sar., 2008) je pokazalada je Bat haplotip povezan sa smanjenjem rizika za nastanak kancera prostate.Inače, in vitro funkcionalne studije su pokazale da je baT haplotip povezan sasniženom genskom aktivnošću i nižim nivoom VDR iRNK (Denzer i sar., 2011).Smatra se da Bat haplotip ima 140% veću receptorsku aktivnost u poređenju sabaT haplotipom (Obara i sar., 2007). U populaciji Poljaka, BsmI i TaqI haplotipskaforma BT je asocirana sa smanjenim rizikom za kancer dojke (Gapska i sar., 2009).Takođe je pronađeno da bL haplotip ima protektivnu ulogu u nastankuuznapredovalih kancera prostate kod Afro Amerikanaca (Osborne i Hutchinson,2002). Naši rezultati su pokazali da identifikovani haplotipovi u uzoračkoj grupinisu u vezi sa ukupnim preživljavanjem. Izvesni trend postoji u slučaju bathaplotipa, ali vrednost nije dostigla statističku značajnost (p=0.075). Ovo je prvinalaz koji se bavio asocijacijom haplotipova u VDR genu i preživljavanja, s obziromda do sada nije zabeleženo istraživanje tog tipa.
5.7. VDR rs11574085 polimorfizam
VDR rs11574085 polimorfizam, prema pretraživanju PubMed baze, do sadanije ispitivan u studijama asocijacije sa oralnim karcinomom i karcinomima uopšte.Nismo zabeležili postojanje razlike u učestalosti genotipova i alela između grupepacijenata i kontrola. Rezultati su pokazali da ovaj SNP nije povezan sa kliničkopatološkim karakteristikama, rizikom za nastanak oralnog karcinoma ipreživljavanjem. Dobijeni negativni rezultati asocijacije rs11574085 polimorfizma
Diskusija
121
u VDR genu i podložnosti oralnom karcinomu se mogu objasniti najverovatnijenefunkcionalnošću proučavanog polimorfizma i odsustva vezanosti sa drugimblisko lociranim polimorfizmima VDR gena.
5.8. CYP27B1 polimorfizam
S obzirom da je metabolizam vitamina D regulisan enzimima familije P450,za studiju su izabrani ključni geni koji kodiraju enzime uključene u anabolizamodnosno katabolizam vitamina D. CYP27B1 kodira 1α-hidroksilazu, enzim koji imaulogu u prevođenju glavne cirkulišuće forme vitamina D, 25(OH)D3, do metaboličkiaktivne forme vitamina D, kalcitriola. Proučavanje polimorfizma rs4646536 uCYP27B1 genu je potpuno relevantno za kancerogenezu, s obzirom na rezultateprethodnih studija prema kojima su neki drugi SNP-ovi u ovom genu asocirani sanastankom kancera prostate (Holt i sar., 2010) i kolona (Dong i sar., 2009).Međutim, neke istraživačke grupe za rs4646536 polimorfizam nisu uočilepostojanje asocijacije u slučaju kancera kolona (Dong i sar., 2009), prostate(Beuten i sar., 2009) i melanoma (Schafer i sar., 2012), što je u skladu sarezultatima ove doktorske disertacije. S obzirom da je funkcionalni efekatproučavanog polimorfizma nepoznat, od izuzetnog značaja bi bilo određivanjeekspresije CYP27B1 gena u našoj grupi. Interesantan je podatak da nivo iRNKCYP27B1 gena nija bio promenjen u slučaju MCF-7 ćelijskih linija dojke nakonizlaganja kalcitriolu (Alimirah i sar., 2011). U našem istraživanju nije uočenaznačajna razlika u distribuciji alela i genotipova rs4646536 polimorfizma izmeđuOSCC i kontrolne grupe. Isto zapažanje je dato u slučaju daleko veće studijskegrupe, koja je uključivala pacijente sa kancerom prostate (Hawkins i sar., 2002).Pokazali smo da je CYP27B1 rs4646536 polimorfizam značajno povezan saunosom alkohola (p=0.012). Od ranije je poznato da alkohol i pušenje predstavljajuznačajne faktore rizika za nastanak oralnog karcinoma. Osobe koje puše više od 20cigareta dnevno i konzumiraju preko 100 g alkohola na dan, imaju povišen rizik odoralnih epitelijalnih displazija, ali i bivši pušači i alkoholičari (Kruse i sar., 2010).Pored toga, poznato je da alkohol predstavlja nezavisni faktor rizika među
Diskusija
122
nepušačima, a duvanski dim među nealkoholičarima. Kombinacija oba faktora,pojačava kancerogeni efekat. Efekti alkohola mogu biti modulisani usled postojanjapolimorfizama u genima koji kodiraju enzime uključene u metabolizam etanola.Naime, prethodni rezultati naše istraživačke grupe su pokazali da je izvesnipolimorfizam u genu za alkoholnu dehidrogenazu (ADHC1 gen), uključenom ukonverziju alkohola do acetaldehida, povezan sa povećanim rizikom za razvojoralnog karcinoma, nezavisno od unosa alkohola (Brocic i sar., 2011). Ovomstudijom smo pokazali postojanje veze između unosa alkohola i CYP27B1rs4646536 polimorfizma. Mutirana i heterozigotna forma CYP27B1 je bilazastupljenija među pacijentima koji nisu ili su umereno unosili alkohol u odnosu napacijente koji su unosili velike količine alkohola. Studija koja je uključila preko6 000 učesnika, pokazala je da su genetičke varijante u CYP27B1 genu asocirane sakoličinom glavne cirkulišuće forme vitamina D, 25(OH)D3 (Berry i Hypponen,2011). Genetički uticaj na status vitamina D je kompleksan. Možemo pretpostavitida nealkoholičari i/ili bivši alkoholičari, nosioci određenih genotipskih varijantiCYP27B1 gena, u slučaju proučavanog polimorfizma mutiranog i/ili heterozigotnoggenotipa, razvijaju OSCC usled snižene mogućnosti za konverziju 25(OH)D3 umetabolički aktivnu formu, kalcitriol. Snižena enzimska aktivnost 1α-hidroksilaze,kao posledica starenja ili nekih drugih faktora kao što je nedostatak vitamina D uishrani (Riggs, 2002), a posebno niskog nivoa 25(OH)D3, može predstavljati faktorrizika za razvoj različitih kancera (Li i sar., 2007). Ustanovljena snižena aktivnost1α-hidroksilaze i snižena ekspresija CYP27B1 u ćelijskim linijama kancera prostatei dojke (Colston i sar., 2006) u poređenju sa ćelijama normalnog tkiva (Hsu i sar.,2001; Lou i sar., 2004) sugeriše da ove ćelije praktično mogu snižavati ili čakizgubiti mogućnost konverzije kalcidiola do kalcitriola na lokalnom nivou i postatinesenzitivne na kalcitriol, što dovodi do neoplastične transformacije ćelije. Postojimogućnost da polimorfizam rs4646536 u CYP27B1 genu ima funkcionalni efekatili da je u vezanoj neravnoteži sa drugim polimorfizmima, što rezultuje smanjenomaktivnošću 1α-hidroksilaze, što ostaje da se ispita narednim istraživanjima u našojstudijskoj grupi.Sa starenjem, aktivnost 1α-hidroksilaze se smanjuje, dok se aktivnost24-hidroksilaze povećava (Lou i sar., 2004). Takođe, uočena hipermetilacija
Diskusija
123
promotora CYP27B1 gena u MDA-MB-231 ćelijskim linijama kancera dojke i utumorskom tkivu dojke, rezultuje transkripcionom inaktivacijom CYP27B1 gena in
vivo (Shi i sar., 2002). Fiziološke koncentracije 25(OH)D3 (100 nM) stimulišuekspresiju 1α-hidroksilaze, dok 1,25α(OH)2D3 ne utiče na ekspresiju CYP27B1(Lou i sar., 2004).
5.9. CYP24A1 polimorfizam
CYP24A1 gen kodora za enzim 24-hidroksilazu koji ima ulogu u degradacijikalcitriola. Pretpostavlja se da izvesni polimorfizmi u ovom genu mogu damodifikuju aktivnost enzima. Međutim, epidemiološka istraživanja polimorfnihvarijanti u CYP24A1 genu su malobrojna i ograničena. Za mali broj do sadaproučavanih SNP-ova nije uvrđeno postojanje asocijacije sa kancerom prostate ipostmenopauzalnim kancerom dojke kod Kavkazijanaca (Roff i Taylor Wilson,2008). Kada je reč o rs2296241 polimorfizmu u CYP24A1 genu, ne postoje podaciniti ispitivanja o funkcionalnosti ovog SNP-a. U slučaju naše studijske grupe,zabeleženo je postojanje razlike u frekvenci genotipova rs2296241 polimorfizmaCYP24A1 gena između uzoraka i kontrola (p=0.025). Ovakvo zapažanje dovodi uopravdanu sumnju potencijalno postojanje veze analiziranog polimorfizma inastanka oralnog karcinoma. Proučavani polimorfizam nije bio u vezi sa kliničkopatološkim odlikama oralnog karcinoma. Rezultati ove studije pokazuju da jeheterozigotna genetička varijanta rs2296241 polimorfizma u CYP24A1 genuznačajno asocirana sa smanjenim rizikom za razvoj oralnog karcinoma u našojproučavanoj populaciji. Nakon kombinovane analize sa potencijalnim kofaktorima,uočeno je da heterozigotni genotip, u poređenju sa divljom formom, ima 0.281puta smanjen rizik za razvoj oralnog karcinoma. Prethodnim studijama jezabeleženo odsustvo asocijacije između CYP24A1 rs2296241 polimorfizma i rizikaza nastanak karcinoma dojke (Dorjgochoo i sar., 2011; McCullough i sar., 2007) ikarcinoma prostate (Holick i sar., 2007), ali je uočena veza ovog polimorfizma sasmanjenim rizikom smrtnosti u slučaju karcinoma prostate (Holt i sar., 2010).Tačan mehanizam kojim ova genetička varijanta utiče na smanjenje rizika za razvoj
Diskusija
124
OSCC-a je nepoznata. Stoga bi se moglo pretpostaviti da analizirani polimorfizamima funkcionalni efekat ili da može uticati na nivo ekspresije CYP24A1 gena.Ranijim istraživanjima je zabeležena viša ekspresija CYP24A1 gena u slučajutumorskog tkiva ezofagusa u poređenju sa normalnim tkivom (Mimori i sar., 2004),kao i ćelijskim linijama kancera tireoidee koje su bile rezistentne na tretmankalcitriolom (Sharma i sar., 2010). Povišena ekspresija CYP24A1 gena je bilazabeležena tokom tumorske progresije u slučaju kancera pluća, kolona i jajnika(Anderson i sar., 2006), prostate i dojke (Chung i sar., 2007), što ukazuje namoguću rezistenciju ovih tumorskih tipova na tretman kalcitriolom. Nivoekspresije CYP24A1 gena je bio povećan čak 7 000 puta u prisustvu metaboličkiaktivne forme vitamina D u nekoliko ćelijskih linija melanoma, praćenomznačajnom inhibicijom rasta (Alimirah i sar., 2011). Nasuprot tome, nivo iRNKCYP24A1 je bio 100 puta manji u drugim ćelijama melanoma koje nisu bile izloženeantikancerogenom efektu kalcitriola (Alimirah i sar., 2011). Pored toga, dubljainvazija tumora, povećana incidenca metastaziranja kao i stopa ukupnogpreživljavanja je bila značajno viša u slučaju niže ekspresije CYP24A1 i višeekspresije VDR gena (Mimori i sar., 2004). Međutim, prethodno navedene studijenisu razmatrale povezanost nivoa ekspresije CYP24A1 gena sa polimorfizmomrs2296241, te se ostavlja pitanje da li se uočene promene u nivou ekspresije mogudovesti u vezu sa ovim polimorfizmom i na koji način. Pokazano je da nekolikonovoidentifikovanih SNP-ova u promotorskom regionu egzona 1 CYP24A1 genaima funkcionalni efekat na vezivanje VDRE i transaktivaciju in vitro kao iizmenjenu ekspresiju CYP24A1 gena in vivo (Holt i sar., 2010; Roff i Taylor Wilson,2008). Uzimajući ovaj podatak u obzir, primećena asocijacija u našoj studiji možebiti rezultat vezanosti polimorfizma rs2296241 za susedni promotorski region gdesu identifikovani funkcionalni SNP-ovi.S obzirom na značajnu ulogu epigenetičkih mehanizama u procesukancerogeneze, bitno je spomenuti da bi se i epigenetičke modifikacije trebaleuzeti u razmatranje prilikom tumačenja dobijenih rezultata. Naime, nedavnimistraživanjima je pokazano da hipermetilacija i histonska modifikacija promotoraCYP24A1 utišava ekspresiju CYP24A1 gena (Luo i sar., 2010). Metilacioni statuspromotora CYP24A1 gena se razlikuje u endotelnim ćelijama izolovanim iz tumora
Diskusija
125
i netumorskog tkiva kod miša (Deeb i sar., 2011). Uočeno je da kalcitriol imaznačajan antiproliferacioni efekat na endotelne ćelije izolovane iz tumorskog tkivau poređenju sa endotelnim ćelijama izolovanim iz normalnog zdravog tkiva.Mehanizam koji je odgovoran za različitu senzitivnost na tretman kalcitriolom jeupravo epigenetičko utišavanje CYP24A1 gena u tumorskim endotelijalnimćelijama (Chung i sar., 2007). U prilog tome govore podaci da je nivo metilovanostipromotora bio 2-17 puta povećan u endotelu tumora prostate u poređenju sabenignim endotelom (Deeb i sar., 2011). Bilo bi značajno proveriti nivometilovanosti promotora CYP24A1 gena i postojanje veze sa proučavanimpolimorfizmom rs2296241 u našoj studijskoj grupi u predstojećem periodu.Skorašnji rezultati ukazuju da je mikro RNK: miR-125b uključena u regulacijugenske ekspresije tako što snižava ekspresiju VDR (Mohri i sar., 2009), a povećavaekspresiju CYP24A1 gena u tumorskim ćelijama (Komagata i sar., 2009). Dakle,povišena ekspresija miR-125b u ćelijama kancera će inhibirati efekat kalcitriolasnižavanjem VDR i povećanjem CYP24A1 ekspresije. Iz prethodno navedenog,jasno je da regulaciju genske ekspresije CYP24A1 gena treba sagledati iz višeaspekata, razmatrajući metilacioni status promotora kao negativni oblik regulacije,ali i nivo ekspresije miR-125b, koja predstavlja pozitivni vid regulacije.Istovremeno uključivanje polimorfnih varijanti CYP24A1 gena u razmatranje, aposebno rs2296241 proučavane ovom doktorskom disertacijom, u vezi saepigenetičkim mehanizmima regulacije ekspresije CYP24A1 gena bi dalo dubljiuvid za tumačenje dobijenih rezultata.Rezultati naše studije ukazuju da analizirani polimorfizam u CYP24A1 genunije asociran sa ukupnim preživljavanjem (p=0.108). Ipak, stratifikaciona analizaprema stadijumu bolesti i nodalnom statusu je pokazala da heterozigoti imajuznačajno lošije preživljavanje u odnosu na wt genotip u uznapredovalom stadijumubolesti (p=0.021) i podgrupi sa pozitivnim nodalnim statusom (p=0.016). Moglo bise pretpostaviti da heterozigotna forma proučavanog polimorfizma ima uticaj napovećanje ekspresije CYP24A1 gena, što bi posledično rezultovalo lošijimpreživljavanjem. Utvrđeno je da je nivo ekspresije CYP24A1 značajno viši utumorskim ćelijama pluća u odnosu na normalne ćelije, što je bilo u vezi sa lošijimpreživljavanjem pacijenata od adenokarcinoma pluća, ali nezavisno od tumorskog
Diskusija
126
stadijuma (Chen i sar., 2011). Dodatno, primećena je značajna korelacija izmeđuvisokog nivoa ekspresije CYP24A1 i loše diferenciranosti tumora (Chen i sar.,2011), kao i lošijeg preživljavanja u slučaju karcinoma ezofagusa (Mimori i sar.,2004). Jasna je pretpostavka da je CYP24A1 uključen u proces kancerogeneze,verovatno inhibiranjem antikancerogenog dejstva vitamina D. Prema nekimpretpostavkama, povišena ekspresija gena može biti u vezi sa genskomamplifikacijom, koja je potvrđena u slučaju karcinoma glave i vrata (Lin i sar.,2006), ali se smatra da to nije jedini odgovorni mehanizam za povećanu ekspresijuCYP24A1 gena (Chen i sar., 2011). Takođe, moguće je da je uočeno lošijepreživljavanje heterozigota u uznaredovalom stadijumu tumora i prisustvu limfnihmetastaza u vezi sa globalnom hipometilacijom koja je odlika procesakancerogeneze i koja može dovesti do aktivacije onkogena (Šupić i Magić, 2009). Sobzirom da se CYP24A1 smatra ozbiljnim kandidatom za onkogena (Chung i sar.,2007; Mimori i sar., 2004; Albertson i sar., 2000), postoji verovatnoća da satumorskom progresijom i globalnom hipometilacijom dolazi do aktivacijeCYP24A1 gena, povišenja ekspresije i posledično izbegavanja antikancerogenogdejstva kalcitriola, što na kraju rezultuje lošijim preživljavanjem.
Poznavanje molekularnih i funkcionalnih posledica postojanja VDR,CYP27B1 i CYP24A1 polimorfizama je krucijalno za potpuno razumevanje njihovogznačaja i potencijalne kliničke primene (Uitterlinden i sar., 2004). Našemistraživanju nedostaju podaci o ekspresiji ova tri gena, što bi bilo od posebnogznačaja za utvrđivanje postojanja potencijalne veze između analiziranihpolimorfizama, a posebno FokI polimorfizma i nivoa ekspresije VDR gena, odnosnors2296241 polimorfizma i CYP24A1 gena, kao i za utvrđivanje postojanjaasocijacije između ekspresije i preživljavanja pacijenata. Skorašnje istraživanjeukazuje da je visoka ekspresija VDR-a povezana sa manje uznapredovalimstadijumom tumora i smanjenim rizikom letalnosti od kancera prostate(Hendrickson i sar., 2011). Interesantno je da je u istoj studiji pokazano da nivoVDR ekspresije nije bio u vezi ni sa nivoom vitamina D u serumu, niti saproučavanim FokI i BsmI VDR polimorfizmima (Hendrickson i sar., 2011).
Diskusija
127
Povišena ekspresija VDR gena je zabeležena u tumoru pluća u odnosu na normalnotkivo (Zhou i sar., 2006). VDR aktivnost može biti pojačana β-kateninom, koji činićelije tumorske mase više adherentnim jednu za drugu i smanjuje verovatnoćumetastaziranja velikog broja malignih ćelija u limfotok ili krvotok (Palmer i sar.,2001; Zhou i sar., 2006). Analiza ekspresije VDR gena imunohistohemijskimmetodama kod pacijenata sa dijagnostikovanim krupnoćelijskim karcinomompluća je pokazala da je viši nivo ekspresije jedarnog VDR-a nezavisno asociran saboljim preživljavanjem pacijenata. Veza između ekspresije citoplazmatskog VDR-ai preživljavanja kod pacijenata u istoj studiji nije pronađena. Ovim istraživanjem jetakođe pokazano da se nivo VDR-a može koristiti kao prognostički marker uslučaju krupnoćelijskog karcinoma pluća (Srinivasan i sar., 2011). Međutim ovomstudijom nije ispitivano postojanje veze polimorfizama u VDR genu i preživljavanjapacijenata.Studije humanih karcinoma u kojima je merena VDR koncentracijaimunoradiometrijskim esejima su pokazali da dolazi do promene broja VDR-a kadaćelija podleže malignoj transformaciji, što sugeriše na korišćenje merenja količineVDR-a kao prognostičkog markera (Srinivasan i sar., 2011). Prema rezultatimadobijenih jednim istraživanjem, uočeno je da preživljavanje pacijenata, obolelih odkrupnoćelijskog karcinoma pluća, zavisi i od sezone u kom je vršen hirurški zahvati visokog unosa vitamina D (Turna i sar., 2012). Stoga sezona kada je izvršenaoperacija, kao i kombinovani genotip može služiti kao nezavisni prognostičkifaktor u slučaju krupnoćelijskog karcinoma pluća (Turna i sar., 2012).Što se tiče analize promenljivih relevantinih za ukupno preživljavanjepacijenata, univarijantnom Cox regresionom analizom smo pokazali da pored FokIpolimorfizma, alkohol, stadijum bolesti, nodalni status i veličina tumora mogu dase koriste kao prognostički faktori. Ove varijable su testirane zajednomultivarijantnom regresionom analizom, pri čemu su iz analize isključeni nodalnistatus i veličina tumora, koji svakako predstavljaju elemente koji određujustadijum bolesti i kao takvi bi mogli da zamaskiraju efekat stadijuma. Pokazali smoda se stadijum bolesti kao i FokI polimorfizam mogu koristiti kao nezavisniprognostički faktori za oralni karcinom. Statistička značajnost za alkohol jeizgubljena, što govori da, iako značajan faktor rizika za razvoj oralnog karcinoma,
Diskusija
128
unos alkohola nije dovoljan pokazatelj na osnovu kog se može predvideti prognozasamog toka bolesti. Kao što je bilo očekivano, potvrdili smo da se stadijum bolestimože koristiti kao nezavisni prognostički faktor.Poređenje naših rezultata za analizirane polimorfizme u VDR, CYP27B1 iCYP24A1 genima i drugih istraživanja, ukazuje na visok stepen nekonzistentnostimeđu studijama. Tako dobijeni različiti rezultati bi se mogli objasniti razlikama uučestalosti alela odnosno genotipova između različitih etničkih grupa (Lurie i sar.,2007, Bid i sar., 2005), tkivnoj specifičnosti, veličini uzorka i odabira pacijenata zastudiju, ali i izloženosti faktorima spoljne sredine i ishrane. Analiziranjempodataka dostupnih u SNP bazi (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) očigledno jepostojanje razlike u učestalostima alela proučavanih polimorfizama VDR genaizmeđu Kavkazoidne, Azijske i Afričke grupe. Pretpostavlja se da relativno staripolimorfizmi imaju malu varijaciju između različitih etničkih grupa, dok većerazlike mogu postojati u slučaju relativno novih polimorfizama (Uitterlinden i sar.,2004). Pojedinačni funkcionalni polimorfizmi mogu imati iste funkcionalne efekteu različitim etničkim grupama zato što je fiziološka uloga vitamima D ista u slučajusvih etničkih grupa. Ovo predstavlja osnovu i za interpretaciju epidemiološkihstudija gde je učestalost alela između etničkih grupa u asocijaciji sa različitimincidencama bolesti/fenotipova u datim proučavanim grupama.Svakako, uključivanje podataka o faktorima spoljašnje sredine, nivoacirkulišuće forme vitamina D u serumu i ishrane bi mogao dati kompletniji uvid zauočene razlike dobijene različitim istraživanjima, uključujući i naše istraživanje.Visok stepen insuficijencije vitamina D je zabeležen kod pacijenata sa karcinomomglave i vrata na području Finske (Orell-Kotikangas i sar., 2012). Period bez pojavebolesti, kao i ukupno vreme preživljavanja su bili značajno asocirani sa nivoom25(OH)D3, gde je viši nivo cirkulišuće forme bio povezan sa boljim preživljavanjem(Srinivasan i sar., 2011). Prema rezultatima jedne istraživačke grupe, nivovitamina D je bio povezan sa boljim preživljavanjem pacijenata sa ranimstadijomom krupnoćelijskog karcinoma pluća (Zhou i sar., 2006), dok u slučajuuznapredovalog stadijuma nije zabeleženo postojanje veze između preživljavanja inivoa vitamina D (Heist i sar., 2008). Iz navedenih podataka se može zaključiti da
Diskusija
129
nivo vitamina D ima izvesni uticaj na incidencu i smrtnost, ne samo karcinomaglave i vrata (Gugatschka i sar., 2011), već i drugih karcinoma.Nivo vitamina D je takođe genetički determinisan u prilog čemu govorepodaci o postojanju asocijacije između Afričkog porekla i nižeg nivoa vitamina D(Field i Newton-Bishop, 2011). GWAS projektom su identifikovani SNP-ovi u blizinigena koji kodiraju za jedinjenja uključena u sintezu holesterola, hidroksilaciju itransport vitamina D, koje takođe predstavljaju determinante nivoa vitamina D(Field i Newton-Bishop, 2011). Takođe, poznato je da je nivo vitamina D povezan isa tipom kože, indeksom gojaznosti, ishranom, izlaganjem Suncu i konačnogenetičkim varijantama (Field i Newton-Bishop, 2011). Poslednjih nekoliko godinaje sve veći broj dokaza koji ukazuju da su varijacije u nivou vitamina D ipolimorfizmi u genu za receptor za vitamin D asocirani sa izmenjenim rizikomnastanka različitih maligniteta. U nedavnom istraživanju sprovedenom u populacijiKineza, uočeno je da je visok nivo 25(OH)D3 u plazmi povezan sa lošijimpreživljavanjem pacijenata od krupnoćelijskog karcinoma pluća i rizik od smrti jebio značajno povećan u odnosu na pacijente sa nižim nivoom 25(OH)D3 u plazmi(Liu i sar., 2011). U istoj studiji, TaqI i BsmI su bili asocirani sa preživljavanjem, pričemu je BsmI identifikovan kao nezavisan prognostički faktor za preživljavanje uslučaju krupnoćelijskog karcinoma pluća (Liu i sar., 2011). Za razliku od drugihpopulacija, nivo vitamina D u plazmi i navedeni VDR SNP-ovi se mogu koristiti kaoprognostički biomarkeri za krupnoćelijski karcinom u Kineskoj populaciji. Uočeneetničke razlike u učestalosti alela i genotipova mogu biti delimično odgovorne zarazličite rezultate među studijama. Rezultati su vrlo kontroverzni ne samo popitanju nivoa vitamina D, nego i uloge VDR polimorfizama. VDR gen je visokopolimorfan i trenutno se ne zna tačno koliko polimorfizama je vezano za bolestiniti koliki je nivo doprinosa svakog od njih. U našoj ispitivanoj studijskoj grupi,podaci o ishrani i relativnom unosu vitamina D, kao i nivou vitmina D u serumunedostaju, a što bi možda moglo da da kompletniji uvid u moguće postojanje vezeizmeđu unosa vitamina D ishranom, nivoa 25(OH)D3 u serumu, polimorfizama VDRgena i rizika za razvoj oralnog karcinoma i preživljavanja. Uzimajući ove podatke uobzir, može se reći da vitamin D ima očigledno značajnu protektivnu ulogu u
Diskusija
130
kancerogenezi. Sa tim u vezi i analozi vitamina D bi mogli poslužiti kaoantikancerogeni agensi.Incidence različitih tipova karcinoma se razlikuju između rasa/etničkihgrupa i dublje razumevanje genetičkih i sredinskih uzroka ovih razlika predstvaljaistovremeno i naučnu i medicinsku potrebu. Genetičke studije asocijacije dajuznačajne informacije o etiologiji različitih karcinoma. Etiologija humanihkarcinoma je izuzetno kompleksna tematika. Samo za mali broj karcinoma, kao štoje karcinom pluća ili cerviksa je poznat faktor rizika koji je najodgovorniji zaincidencu konkretnog karcinoma u populaciji (Haiman i Stram, 2010). Za većinudrugih karcinoma, naše poznavanje sredinskih faktora, genetičke predispozicijekao i međusobni odnos između ova dva etiološka faktora je daleko od potpunogpoznavanja i razumevanja. Uočena variranja u incidenci i mortalitetu karcinomaunutar i između populacija se smatraju posledicom različite zastupljenostigenetičkih i sredinskih faktora rizika (Haiman i Stram, 2010).Smatra se da genetičke varijante mogu imati različite efekte u različitimpopulacijama zbog nepoznatih ili neizmerenih sredinskih faktora rizika, koji mogumodifikovati penetrantnost određene genetičke varijante (Uitterlinden i sar.,2004). Studije koje imaju za cilj otkrivanje faktora rizika za nastanak različitihtipova karcinoma se oslanjaju na samoizjašnjavanje po pitanju rasne i etničkepripadnosti, što relativizuje tumačenje rezultata. Očekuje se da će u bliskojbudućnosti smanjenje zdravstvenih razlika zahtevati detaljnu procenu bioloških inebioloških komponenata rase/etniciteta koji se značajno prepliću (Uitterlinden isar., 2004).Kao što se može zapaziti iz prethodno iznetih rezultata dobijenih našomstudijom i poređenjem sa rezultatima dobijenih drugim istraživanjima, rezultatiizmeđu različitih studija su nekonzistentni po pitanju povezanosti polimorfizamaVDR gena i gena uključenih u metabolizam vitamina D sa rizikom za razvojkarcinoma glave i vrata, uključujući i oralni karcinom. Uočene razlike verovatnoodražavaju heterogenost karcinoma glave i vrata kao i oralnih karcinoma upogledu histologije i kliničkih karakteristika, sa različitim etiologijama i faktorimarizika (Forastiere i sar., 2001). Pored toga, različiti rezultati u poređenju sa našimnalazima za proučavane polimorfizme se mogu dovesti u vezu sa etničkom i
Diskusija
131
rasnom varijabilnošću između populacija ili čak i regionalnih razlika u količinivitamina D koji se unosi ishranom, što može biti važan faktor za razvoj oralnogkarcinoma. Pored toga različiti stepen izloženosti faktorima spoljašnje sredine,npr. Sunčevom zračenju, predstavljaju bitne faktore koji mogu usloviti dobijanjeoprečnih rezultata između studija. Iz svega navedenog u diskusiji, jasno je da zadobijanje potpune i kompletne slike uloge i značaja polimorfizama nukleotidnesekvence u genima bitnim za funkcionisanje i metabolizam vitamina D u vezi saoralnim karcinomom, pored genotipova proučavanih polimorfizama neophodno jeu razmatranje uzeti i analize ekspresije proučavanih gena, epigenetičkemehanizme, povezanosti polimorfizama sa nivoom cirkulišuće forme vitamina D userumu, faktorima ishrane i izloženošću faktorima spoljašnje sredine (npr.izloženost Sunčevom zračenju). Dalje proširivanje ove studije bi trebalo da uključinavedene faktore koji bi dodatno mogli da potvrde i razjasne do sada dobijenerezultate u ovoj studiji.
132
6. ZAKLJUČCI
Zaključci
133
Na osnovu dobijenih rezultata ove doktorske disertacije, izvedeni su sledećizaključci:
 Između grupe pacijenata sa dijagnostikovanim oralnim karcinomom ikontrolne grupe odgovarajuće polne i starosne distribucije je uočena razlika udistribuciji genotipova EcoRV, ApaI i TaqI polimorfizama VDR gena, kao ipolimorfizma u CYP24A1 genu. Ovakav nalaz bi mogao da ukazuje na potencijalnuulogu navedenih polimorfizama u podložnosti razvijanja oralnog karcinoma.
 Uočena je statistički značajna razlika u distribuciji alela u slučaju VDREcoRV i ApaI polimorfizama, kao i polimorfizma CYP24A1 gena.
 Stratifikovana analiza u odnosu na pol je pokazala postojanje značajnerazlike u distribuciji VDR EcoRV i BsmI polimorfizma među pripadnicima muškogpola grupe obolelih u odnosu na pripadnike istog pola kontrolne grupe, kao i uslučaju proučavanog polimorfizma CYP24A1 gena. Razlika u distribuciji datihpolimorfizama nije detektovana među pripadnicama ženskog pola između grupeobolelih i kontrolne grupe.
 Statistička analiza polimorfizama i etioloških faktora je ukazala napostojanje asocijacije između VDR TaqI i BsmI polimorfizama i CYP27B1polimorfizma i pola pacijenata sa dijagnostikovanim oralnim karcinomom. Uočenaje veza između TaqI polimorfizma i pušenja i CYP27B1 analiziranog polimorfizma ikonzumacije alkohola.
 Zapažena asocijacija ApaI polimorfizma u VDR genu i godina pacijenataverovatno ne predstavlja samo rezultat procesa starenja, već dužeg periodaizloženosti kancerogenim jedinjenjima prisutnim u duvanu, alkoholu i generalno uspoljašnjoj sredini.
Zaključci
134
 Našom studijom nije utvrđeno postojanje asocijacije analiziranihpolimorfizama i kliničko patoloških odlika oralnog karcinoma, osim u slučajuidentifikovane značajne veze između TaqI polimorfizma VDR gena i pojave recidivabolesti.
 Pokazano je da su mutirane varijante VDR polimorfizama EcoRV i ApaIznačajno asocirani sa sniženim rizikom za razvoj oralnog karcinoma, dok suhomozigotna mutirana i heterozigotna varijanta BsmI polimorfizma povezane sapovišenim rizikom sa nastanak oralnog karcinoma. Nakon udružene analize sagodinama, polom, pušenjem i konzumacijom alkohola, ove statističke značajnostisu izgubljene.
 Polimorfizam u CYP24A1 genu je značajno asociran sa sniženim rizikom zarazvoj oralnog karcinoma, što je najverovatnije rezultat njegovog funkcionalnogefekta ili neravnoteže vezanosti sa drugim polimorfizmima unutar CYP24A1 genaili čak sa polimorfizmima blisko lociranih susednih gena.
 Divlja (wt) homozigotna forma proučavanog polimorfizma FokI VDR gena jepovezana sa lošijim preživljavanjem pacijenata sa oralnim karcinomom u odnosuna heterozigotnu i homozigotnu mutiranu varijantu zajedno. Isti trendpreživljavanja je zapažen i u slučaju stratifikacije prema nodalnom statusu iuznapredovalom stadijumu bolesti. Zapažena veza je najverovatnije posledicapostojanja funkcionalnog efekta FokI polimorfizma, s obzirom da je poznato damutirana varijanta FokI polimorfizma rezultuje nastajanjem VDR receptora kraćegza tri amino kiseline u odnosu na wt formu, ali većeg transaktivacijskog kapaciteta.
 Polimorfizam FokI VDR gena se može koristiti kao samostalni prognostičkiindikator u slučaju oralnog karcinoma, što je potvrđeno i za stadijum bolesti, ali nei za konzumiranje alkohola.
Zaključci
135
 Identifikovani haplotipovi BsmI-ApaI-TaqI tri lokusnog sistema nisu uasocijaciji sa rizikom za nastanak oralnog karcinoma, niti preživljavanjempacijenata.
Sumirano, analiza polimorfizama gena uključenih u funkcionisanje imetabolizam vitamina D može dati važne informacije o razvoju i progresiji oralnogkarcinoma. VDR FokI polimorfizam može biti razmatran kao potencijalnimolekularni marker za preživljavanje pacijenata sa oralnim karcinomom, to jestima ulogu nezavisnog prognostičkog indikatora. Pored toga polimorfizamrs2296241 CYP24A1 gena je asociran sa sniženim rizikom za razvoj oralnogkarcinoma, što bi moglo ukazati na potencijalno korišćenje datog polimorfizma uprediktivne svrhe.Etiologija oralnog karcinoma je vrlo kompleksna i pored poznatih faktorarizika uključuje interakciju genotipa i faktora spoljašnje sredine. Poznavanjegenetičke varijante gena koji su asocirani sa rizikom nastanka oralnog karcinomabi u budućnosti moglo da omogući uvođenje koncepta personalizovane medicine, usmislu davanja individualnih saveta i/ili terapije.Dalje studije koje će biti usmerene na dodatna ispitivanja, obuhvatiće analizuvećeg broja polimorfizama i haplotipskih blokova, unos vitamina D ishranom, nivovitamina D u serumu, kao i nivoa ekspresije ključnih gena, dodatno će doprinetirasvetljavanju postojećih rezultata i zaključaka prezentovanih u ovoj doktorskojdisertaciji.
136
7. LITERATURA
Literatura
137
A
Abo-Hanger E, Gawish A, El-Guinday N, Azzam O. Vitamin D receptor genepolymorphism and risk of oral squamous cell carcinoma. J Appl Sci Res 2008;4: 929-938.
Ahn J, Albanes D, Berndt S, Peters U, Chatterjee N, Freedman N, Abnet C, Huang W,Kibel A, Crawford D, Weinstein S, Chanock S, Schatzkin A, Hayes R. Vitamin D-related genes, serum vitamin D concentrations and prostate cancer risk.
Carcinogen 2009; 30: 769-776.
Albertson G, Ylstra B, Segraves R, Collins C, Dairkee H, Kowbel D, Kuo L, Gray W,Pinkel D. Quantitative mapping of amplicon structure by array CGH identifiesCYP24 as a candidate oncogene. Nat Rev 2000; 25: 144-146.
Ali V, Vaidya V. Vitamin D and cancer. J Cancer Res Ther 2008; 3: 225-230.
Alimirah F, Peng X, Murillo G, Mehta R. Functional significance of vitamin Dreceptor FokI polymorphism in human breast cancer cells. Plos One 2011;6: e16024.
Amano Y, Komiyama K, Makishima M. Vitamin D and periodontal disease. J Oral Sci2009; 51: 11-20.
Anderson M, Nakane M, Ruan X, Kroeger P, Wu-Wong R. Expression of VDR andCYP24A1 mRNA in human tumors. Cancer Chemother Pharmacol 2006; 57: 234–240.
Aung T, Chandina S, D'Silva K, Dimitrov N. The role of vitamin D in breast cancer.
Oncol Rev 2009; 3: 19-25.
Literatura
138
B
Bader J. The relative power of SNPs and haplotype as genetic markers forassociation tests. Pharmacogenomics 2001; 2: 11-24.Bai Y, Lu H, Hong D, Lin C, Yu Z, Chen B. Vitamin D receptor gene polymorphismsand colorectal cancer risk: A systematic meta-analysis. World J Gastroenterol2012; 18: 1672-1679.
Bailey R, Cooper J, Zeitels L, Smyth D, Yang J, Walker N, Hypponen E, Dunger D,Ramos-Lopez E, Badenhoop K, Nejentsev S, Todd J. Association of the vitamin Dmetabolism gene CYP27B1with type 1 diabetes. Diabetes 2007; 56: 2616-2621.
Bao B, Yao J, Lee Y. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3 supress interleukin-8-mediatedprostate cancer cell angiogenesis. Carcinogen 2006; 27: 1883-1893.
Barrett J, Fry B, Maller J, Daly M. Haploview: analysis and visualization of LD andhaplotype maps. Bioinformatics 2005; 21: 263-265.
Barroso E, Fernandez L, Milne R, Pita G, Sendagorta E, Floristan U, Feito M, Aviles J,Martin-Gonzales M, Arias J, Zamora P, Blanco M, Lazaro P, Benitez J, Ribas G.Genetic analysis of the vitamin D receptor gene in two epithelial cancers:melanoma and breast cancer case-control studies. BMC Cancer 2008; 8: 385-393.
Bektas-Kayhan K, Unur M, Yaylim-Eraltan I, Ergen HA, Toptas B, Hafiz G, Isbir T.Association of vitamin D receptor TaqI polymorphism and susceptibility to oralsquamous cell carcinoma. In Vivo 2010; 24: 755-759.
Berry D, Hypponen E. Determinants of vitamin D status: focus on geneticvariations. Curr Opin Nephrol Hypertens 2011; 20:331-336.
Literatura
139
Beuten J, Gelfond J, Franke J, Weldon K, Crandall A, Johnson-Pais T, Thompson I,Leach R. Single and multigenic analysis of the association between variants in12 steroid hormone metabolism genes and risk of prostate cancer. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2009; 18: 1869-1880.
Bid H, Mishara D, Mittal R. Vitamin D receptor (VDR) gene (FokI, TaqI & ApaI)polymorphisms in healthy individuals from North Indian population. Asian
Pacific J Cancer Prev 2005; 6:147-152.
Bikle D. Nonclassic actions of vitamin D. J Clin Endocrinol Metab 2009; 94: 26-34.
Bikle D. What is new in vitamin D: 2006-2007. Curr Opin Rheumatol 2007, 19: 383–388.
Bodiwala D, Luscombe C, French M, Liu S, Saxby M, Jones P, Fryer A, Strange R.Polymorphisms in the vitamin D receptor gene, ultraviolet radiation andsusceptibility to prostate cancer. Environ Mol Mutagen 2004; 43:121–127.
Bonilla C, Hooker S, Mason T, Bock C, Kittles R. Prostare cancer susceptibility lociidentified on chromosome 12 in African Americans. PLoS One 2011; 6: e16044.Bos P, Zhang X, Nadal C, Shu W, Gomis R, Nguyen D, Minn A, van de Vijver M, GeraldWL Foekens J, Massagué J. Genes that mediate breast cancer metastasis to thebrain. Nature 2009; 459: 1005-1009.Bouillon R, Carmeliet G, Verlinden L, van Etten E, Verstuyf A, Luderer H, Lieben L,Mathieu C, Demay M. Vitamin D and human health: lessons from vitamin Dreceptor null mice. Endocrine Rev 2008; 6: 726-776.
Bouillon R, Eelen G, Verlinden L, Mathieu C, Carmeliet G, Verstuyf A. Vitamin D andcancer. J Steroid Biochem Mol Biol 2006; 102: 156–162.
Literatura
140
Broćić M, Šupić G, Zeljić K, Jović N, Kozomara R, Zagorac S, Zlatković M, Magić Z.Genetic polymorphisms of ADHIC and CYP2EI and risk of oral squamous cellcarcinoma. Otolaryngo Head Neck Surg 2011; 145: 586-593.
Broćić M. Klinički značaj nivoa ekspresije vaskularnog endotelijalnog faktora rastakod bolesnika sa planocelularnim karcinomom jezika i poda usta-magistarskirad. 2008.
Burke H. Outcome prediction and the future of the TNM staging system. J Natl
Cancer Inst 2004; 96: 1408-1409.
C
Carlberg C, Seuter S. A genomic perspective on vitamin D signaling. Anticancer Res2009; 29: 3485-3494.
Chen G, Kim S, King A, Zhao L, Simpson R, Christensen P, Wang Z, Thomas D,Giordano T, Lin L, Brenner D, Beer D, Ramnath N. CYP24A1 is an independentprognostic marker of survival in patients with lung adenocarcinoma. Clin Cancer
Res 2011; 17: 817-826.
Choi S, Myers J. Molecular pathogenesis of oral squamous cell carcinoma:implications for therapy. J Dent Res 2008; 87: 14-32.
Chung I, Karpf A, Muindi J, Conroy J, Nowak N, Johnson C, Trump D. Epigeneticsilencing of CYP24 in tumor-derived endothelial cells contributes to selectivegrowth inhibition by calcitriol. J Biol Chem 2007; 282: 8704-8714.
Cicek M, Liu X, Schumacher F, Casey G, Witte J. Vitamin D receptorgenotypes/haplotypes and prostate cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev 2006; 15: 2549-2552.
Literatura
141
Colin E, Weel A, Uitterlinden A, Buurman C, Birkenhager J, Pols H, van Leeuwen J.Consequences of vitamin D receptor gene polymorphisms for growth inhibitionof cultured human peripheral blood mononuclear cells by 1,25-dihydroxyvitamin D3. Clin Endocrinol 2000; 52: 211-216.
Collins A. Allelic association: Linkage Disequilibrium structure and gene mapping.
Mol Biotechnol 2008; 41: 83-89.
Colston K, Lowe L, Mansi J, Campbell M. Vitamin D status and breast cancer risk.
Anticancer Res 2006; 26: 2573-2580.
Conway D. Each portion of fruit or vegetable consumed halves the risk of oralcancer. Evid Based Dent 2007; 8: 19–20.Cross H, Kallay E, Lechner D, Gerdenitsch W, Adlercreutz H, Armbrecht J.Phytoestrogens and vitamin D metabolism: a new concept for the preventionand therapy of colorectal, prostate and mammary carcinomas. J Nutr 2004;1207S-1212S.
Cross H, Kallay E. Regulation of the colonic vitamin D system for prevention ottumor progression: an update. Future Oncol 2009; 5: 493-507.
Cui Y, Rohan T. Vitamin D, calcium and breast cancer risk: a review. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15: 1427-1437.
D
Davis C, Milner J. Nutrigenomics, vitamin D and cancer prevention. J Nutrigenet
Nutrigenomics 2011; 4: 1–11.
Davis C, Milner J. Biomarkers for diet and cancer prevention research: potentialsand challenges. Acta Pharmacol Sin 2007; 28: 1262–1273.
Literatura
142
Davis C. Vitamin D and cancer: current dilemmas and future research needs. Am J
Clin Nutr 2009; 88: 565S-569S.Deeb K, Luo W, Karpf A, Omilian A, Bshara W, Tian L, Tangrea M, Morrison C,Johnson C, Trump D. Differential vitamin D 24-hydroxylase/CYP24A1 genepromoter methylation in endothelium from benign and malignant humanprostate. Epigenetics 2011; 6: 994-1000.Deeb K, Trump D, Johnson C. Vitamin D signalling pathways in cancer: potential foranticancer therapeutics. Nat Rev 2007; 7: 684-700.Denzer N, Vogt T, Reichrath J. Vitamin D receptor (VDR) polymorphisms and skincancer. Dermato-Endocrinology 2011; 3: 205-210.Dong L, Ulrich C, Hsu L, Duggan D, Benitez D, White E et al. Vitamin D related genes,CYP24A1 and CYP27B1 and colon cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev2009; 18: 2540-2548.Dorjgochoo T, Delahanty R, Lu W, Long J, Cai Q, Zheng Y, Gu K, Gao YT, Zheng W.Common genetic variants in the vitamin D pathway including genome-wideassociated variants are not associated with breast cancer risk among Chinesewomen. Cancer Epidemiol Biomarker Prev 2011; 20: 2313-2316.Dusso A, Brown A, Slatopolsky E. Vitamin D. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 289:F8-F28.
E
Elledge R, Clark G, Chamness G, Osborne C. Tumor biologic factors and breastcancer prognosis among white, Hispanic and black women in the United States. J
Natl Cancer Inst 1994; 86: 705-712.
Literatura
143
F
Fallin D, Schork N. Accuracy of haplotype frequency estimation for biallelic loci, viathe expectation-maximization algorithm for unphased diploid genotype data.
Am J Hum Genet 2000; 67: 947-959.
Field S, Newton-Bishop J. Melanoma and vitamin D. Mol Oncol 2011; 5: 197-214.
Fischer D, Thome M, Becker S, Cordes T, Diedrich K, Friedrich M, Thill M.Expression of 25-hydroxyvitamin D3-24-hydroxylase in benign and malignantovarian cell lines and tissue. Anticancer Res 2009; 29: 3635-3640.
Forastiere A, Koch W, Trotti A, Sidransky D. Head and neck cancer. N Engl J Med2001; 345: 1890-1900.
Frazer K, Murray S, Schor N, Topol E. Human genetic variation and its contributionto complex traits. Nat Rev Genet 2009; 10: 241-251.
G
Gapska P, Scott R, Serrano-Fernandez P, Huzarski T, Byrski T, et al. Vitamin Dreceptor variants and breast cancer risk in the Polish population. Breast Cancer
Res Treat 2009; 115: 629-633.
Garland C, Garland F, Gorham E, Lipkin M, Newmark H, Mohr S, Holick M. The roleof vitamin D in cancer prevention. Am J Publish Health 2004; 96: 252-261.
Giovannucci E,  Liu Y, RimmE, Hollis B, Fuchs C, Stampfer M, Willett W. Prospectivestudy of predictors of vitamin D status and cancer incidence and mortality inmen. J Natl Cancer Inst 2006; 98: 451-459.
Global Cancer: Facts and figures, 2nd Edition. American Cancer Society 2011.
Literatura
144
Gorham E, Garland C, Garland F, Grant W, Mohr S, Lipkin M, Newmark H,Giovnnucci E, Wei M, Holick M. Vitamin D and prevention of colorectal cancer. J
Steroid Biochem Mol Biol 2005; 97: 179-194.
Gorham E, Garland C, Garland F. Acid haze air pollution and breast and coloncancer mortality in 20 Canadian cities. Can J Public Health 1989; 80: 96-100.Gugatschka M, Kiesler K, Obermayer-Pietsch B, Groselj-Strele A, Griesbacher A,Friedrich G. Vitamin D status is associated with disease-free survival and overallsurvival time in patients with squamous cell carcinoma of the upperaerodigestive tract. Eur Arch Otorhinolaryngol 2011; 268: 1201-1204.Gunes S, Yucel Bilen C, Kara N, Asci R, Bagci H, Yilmaz AF. Vitamin D receptor genepolymorphisms in patients with urolithiasis. Urol Res 2006; 34: 47-52.
Guy M, Lowe L, Wat-Bretherton D, Mansi J, Peckitt C, Bliss J et al. Vitamin Dreceptor gene polymorphisms and breast cancer risk. Clin Cancer Res 2004; 10:5472-5481.
H
Habuchi T, Suzuki T, Sasaki R, Wang L, Sato K, Satoh S et al. Association of vitaminD receptor with prostate cancer and benign prostatic hyperplasia in a Japanesepopulation. Cancer Res 2000; 60: 305-308.
Hacer Onen I, Ekmekci A, Eroglu M, Konac E, Yesil S, Biri H. Association of geneticpolymorphisms in vitamin D receptor gene and susceptibility to sporadicprostate cancer. Exp Biol Med 2008; 233: 1608-1614.
Haghpanah V, Ghaffari SH, Rahimpour P et al. Vitamin D receptor genepolymorphisms in patients with thyroid cancer. Gene Ther Mol Biol 2007; 11:299-304.
Literatura
145
Haiman C, Stram D. Exploring genetic susceptibility to cancer in diversepopulations. Curr Opin Genetics Dev 2010; 20: 1-6.
Halsall J, Osborne J, Epstein M, Pringle J, Hutchinson P. The unfavorable effect ofthe A allele of the vitamin D receptor promoter polymorphism A-1012G hasdifferent mechanisms related to susceptibility and outcome of malignantmelanoma. Dermato-Endocrinology 2009; 1: 54-57.
Hama T, Norizoe C, Suga H, Mimura T, Kato T, Moriyama H, Urashima M. Prognosticsignificance of vitamin D receptor polymorphisms in head and neck squamouscell carcinoma. PlosONE 2011; 6: e29634.
Han J, Colditz G, Hunter D. Polymorphisms in the MTHFR and VDR genes and skincancer risk. Carcinogenesis 2007; 28: 390-397.Hansen C, Binderup L, Hamberg K, Carlberg C. Vitamin D and cancer: effects of1,25(OH)2D3 and its analogs on growth control and tumorigenesis. Front Biosci2001; 6: 820-848.
Hawkins G, Cramer S, Zheng S, Isaacs S, Wiley K, Chang B, Bleecker E, Walsh P,Meyers D, Isaacs W, Xu J. Sequence variants in the human 25-hydroxyvitamin D31-a hydroxylase (CYP27B1) gene are not associated with prostate cancer risk.
Prostate 2002; 53: 175-178.
Heist RS, Zhou W, Wang Z, Liu G, Neuberg D, Su L et al. Circulating 25-Hydroxyvitamin D, VDR polymorphisms and survival in advanced non-small celllung cancer. J Clin Oncol 2008; 26: 5596-5602.
Hendrickson K, Flavin R, Kasperzyk L, Fiorentino M, Fang F, Lis R, Fiore C, PenneyL, Ma J, Kantoff W, Stampfer J, Loda M, Mucci A, Giovannucci E. Vitamin Dreceptor protein expression in tumor tissue and prostate cancer progression. J
Clin Oncol 2011; 29: 2378-2385.
Literatura
146
Herman J, Baylin S. Gene Silencing in Cancer in Association with PromoterHypermethylation. N Engl J Med 2003; 349: 2042-2054.
Hershberger P, Modzelewski R, Shurin Z, Rueger R, Trump D, Johnson C. 1,25-dihydroxycholecalciferol (1,25-D3) inhibits the growth of squamous cellcarcinoma and down-modulates p21Waf1/Cip1 in vitro and in vivo. Cancer Res2000; 59: 2644-2649.
Holick C, Stanford J, Kwon E, Ostrander E, Nejentsev S, Peters U. Comprehensiveassociation analysis of the vitamin D pathway genes, VDR, CYP27B1 andCYP24A1 in prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007; 16: 1990-1999.
Holt S, Kwon E, Koopmeiners J, Lin D, Feng Z, Ostrander E, Peters U, Stanford J.Vitamin D pathway gene variants and prostate cancer prognosis. Prostate 2010:70: 1448 -1460.
Holt S, Kwon E, Peters U, Ostrander E, Stanford J. Vitamin D Pathway Gene Variantsand Prostate Cancer Risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009; 18: 1929-1933.
Hsu J, Feldman D, McNeal J, Peehl D. Reduced 1a-hydroxylase Activity in HumanProstate Cancer Cells Correlates with Decreased Susceptibility to 25-Hydroxyvitamin D3-induced Growth Inhibition. Cancer Res 2001; 6: 2852-2856.
Huang X, Cao Z, Zhang Z, Yang Y, Wang J, Fang D. No association between VitaminD receptor gene polymorphisms and nasopharyngeal carcinoma in a ChineseHan population. BioSci Trends 2011; 5: 99-103.
Literatura
147
Hughes D, Hlavata I, Soucek P, Pardini B, Naccarati A, Vodickova L, Jenab M,Vodicka P. Variation in the vitamin D receptor gene is not associated with risk ofcolorectal cancer in the Czech republic. J Gastrointest Canc 2011; 42: 149-154.
Hunter K, Parkinson E, Harrison P. Profiling early head and neck cancer. Nature
Rev 2005; 5: 127-135.
I
Ingles S, Ross R, Yu M, Irvine R, La Pera G, Haile R, Coetzee G. Association ofprostate cancer risk with genetic polymorphisms in vitamin D receptor. J Natl
Cancer Inst 1997; 89: 166-170.
Ingles S. Can diet and/or sunlight modify the relationship between vitamin Dreceptor polymorphisms and prostate cancer risk? Nutr Rev 2007; 2: S105-S107.
J
Jemal A, Bray F, Center M, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global Cancer Statistics.
Cancer J Clin 2011; 61: 69-90.
Jensen S, Madsen M, Lukas J, Binderup L, Bartek J. Inhibitory effects of 1alpha,25-dihydroxyvitamin D(3) on the G(1)-S phase-controlling machinery. Mol
Endocrinol 2001; 15: 1370-1380.
Jiang F, Bao J, Li P, Nicosia S, Bai W. Induction of ovarian cancer cell apoptosis by1α, 25-dihydroxyvitamin D3 through the down-regulation of telomerase. J Biol
Chem 2004; 279: 53213-53221.
Literatura
148
John E, Schwartz G, Koo J, Van Den Berg D, Ingles S. Sun exposure, vitamin Dreceptor gene polymorphisms and risk of advanced prostate cancer. Cancer Res2005; 65: 5470-5479.
Johnson N, Warnakulasuriya S, Gupta P, Dimba E, Chindia M, Otoh E,Sankaranarayanan R, Califano J, Kowalski L. Global oral health inequalities inincidence and outcomes for oral cancer: causes and solutions. Adv Dent Res2011; 23: 237-246.
Jones G, Prosser D, Kaufmann M. 25-Hydroxivitamin  D-24-hydroxilase (CYP24A1):Its important role in the degradation of vitamin D. Arch biochem biophys 2012;523: 9-18.
K
Kemmis C, Salvador S, Smith K, Welsh J. Human mammary epithelial cells expressCYP27B1 and are growth inhibited by 25-hydroxyvitamin D-3, the majorcirculating form of vitamin D-3. J Nutr 2006; 136: 887-892.
Kochupillai N. The physiology of vitamin D: current concepts. Indian J Med Res2008; 127: 256-262.
Komagata S, Nakayima M, Takagi S, Mohri T, Tniya T, Yokoi T. Human CYP24catalyzing the inactivation of calcitriol is post-transcriptionally regulated bymiR-125b.Mol Pharmacol 2009; 76: 702-709.
Konety B, Lavelle J, Pirtskalaishvili G, Dhir R, Meyers SA, Nguyen T, Hershberger P,Shurin M, Johnson CS, Trump D, Zeidel M, Getzenberg R. Effects of vitamin D(calcitriol) on transitional cell carcinoma of the bladder in vitro and in vivo. J
Urol 2001; 165: 253-258.
Literatura
149
Kornfehl J, Formanek M, Temmel A, Knerer B, Willheim M. Antiproliferative effectsof the biologically active metabolite of vitamin D3 (1,25[OH]2D3) on head andneck squamous cell carcinoma cell lines. Eur Arch Otorhinolaryngol 1996; 253:341-344.
Kostner K, Denzer N, Muller C, Klein R, Tilgen W, Reichrath J. The relevance ofvitamin D receptor (VDR) gene polymorphisms for cancer: a review of theliterature. Anticancer Res 2009; 29: 3511-3536.
Kruse A, Bredell M, Gratz K. Oral squamous cell carcinoma in non-smoking andnon-drinking patients. Head Neck Oncol 2010; 2: 24.
Kupfer S, Anderson J, Ludvik A, Hooker S, Skol A, Kittles R, Keku T, Sandler R, Ruiz-Ponte C, Castellvi-Bel S, Casttels A, Carracedo A, Ellis N. Genetic associations inthe vitamin D receptor and colorectal cancer in Afrikan Amerikans andCaucasians. PLoS One 2011; 6: e26123.
L
Lagunova Z, Porojnicu A, Lindberg F, Hexeberg S, Moan J. The dependency ofvitamin D status on body mass index, gender, age and season. Anticancer Res2009; 29: 3713-3720.
Lambert R, Sauvaget C, de Camargo Cancela M, Sankaranarayanan R. Epidemiologyof cancer from the oral cavity and oropharynx. Eur J Gastroenter Hepat 2011; 23:633–641.
Lamprecht S, Lipkin M. Chemoprevention of colon cancer by calcium, vitamin Dand folate: molecular mechanisms. Nature Rev 2003; 3: 601-614.
Literatura
150
Li H, Stampfer M, Hollis B, Mucci L, Gaziano M, Hunter D, Giovannucci E, Ma J. Aprospective study of plasma vitamin D metabolites, vitamin D receptorpolymorphisms and prostate cancer. PLoS Med 2007; 4: e103.
Lin M, Smith L, Smiraglia D, Kazhiyur-Mannar R, Lang J, Schuller D, Kornacker K,Wenger R, Plass C. DNA copy number gains in head and neck squamous cellcarcinoma. Oncogene 2006; 24: 1424-1433.
Lin R, White J. The pleiotropic actions of vitamin D. BioEssays 2003; 26: 21-28.
Lindenblatt R, Martinez G, Silva L, Faria P, Camisasca D, Lourenco S. Oral squamouscell carcinoma grading systems-analysis of the best survival predictor. J Oral
Pathol Med 2012; 41: 34-39.
Lingen M, Pinto A, Mendes R, Franchini R, Czerninski R, Tilakaratne W, PartridgeM, Peterson D, Woo S. Genetics⁄epigenetics of oral premalignancy: currentstatus and future research. Oral Dis 2011; 17(Suppl. I): 7-22.
Liu Y, Chen W, Hu Z, Xu L, Shu Y, Pan S, Dai J, Jin G, Ma H, Shen H. Plasma vitamin Dlevels and vitamin D receptor polymorphisms are associated with survival ofnon-small cell lung cancer. Chin J Cancer Res 2011; 23: 33-37.
Liu Z, Calderon J, Zhang Z, Sturgis E, Spitz M, Wei Q. Polymorphisms of vitamin Dreceptor gene protect against the risk of head and neck cancer. Pharmacogenet
Genomics 2005; 15: 159-165.
Liu, M. Lee, M.-H. Cohen, M. Bommakanti, M. & L. P. Freedman: Transcriptionalactivation of the cdk inhibitor p21 by vitamin D3 leads to the induceddifferentiation of the myelomonocytic cell line U937. Gene Dev 1996; 10: 142-153.
Literatura
151
Llewellyn C, Linklater K, Bell J, Johnson N, Warnakulasuriya S. An analysis of riskfactors for oral cancer in young people: a case-control study. Oral Oncol 2004;40: 304-313.
Lopez-Boado Y, Puente X, Alvarez S, Tolivia J, Binderup L, Lopez-Otin C. Growthinhibition of human breast cancer cells by 1,25-Dihydroxyvitamin D3 isaccompanied by induction of apolipoprotein D expression. Cancer Res 1997; 57:4091-4097.
Lou Y, Qiao S, Talonpoika R, Syvala H, Tuohimaa P. The role of vitamin D3metabolism in prostate cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 2004; 92: 317-325.
Luo W, Karpf A, Deeb K, Muindi J, Morrison C, Johnson C, Trump D. Epigeneticregulation of vitamin D 24-hydroxylase/CYP24A1 in human prostate cancer.
Cancer Res 2010; 70: 5953-5962.
Lurie G, Wilkens L, Thompson P, McDuffie K, Carney M, Terada K et al. Vitamin Dreceptor gene polymorphisms and epithelial ovarian cancer risk. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2007; 16: 2566-2571.
MMacdonald F, Ford C, Casson A. Molecular biology of cancer. Second edition,
Garland Science/BIOS Scientific Publishers, 2004: 1-10.
Mahmoudi T, Karimi K, Mohebbi S, Fatemi S, Zali M. Start codon FokI and intron 8BsmI variants in the vitamin D receptor gene and susceptibility to colorectalcancer.Mol Biol Rep 2011; 38: 4765-4770.
Mantell D, Owens P, Bundred N, Mawer B, Canfield A.  1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 inhibits angiogenesis in vitro and in vivo. Circ Res 2000; 87:214-220.
Literatura
152
Maruyama R, Aoki F, Toyota M, Sasaki Y, Akashi H, Mita H, Suzuki H, Akino K, Ohe-Toyota M, Maruyama Y, Tatsumi H, Imai K, Shinomura Y, Tokino T. ComparativeGenome analysis identifies vitamin D receptor gene as a direct target of p53-mediated transcriptional activation. Cancer Res 2006; 66: 4574-83.
Mascolo M, Siano M, Ilardi G, Russo D, Merolla F, De Rosa G, Staibano S. Epigeneticdisregulation in oral cancer. Int J Mol Sci 2012; 13: 2331-2353.
McCullough M, Bostck R, Mayo T. Vitamin D gene pathway polymorphism and riskof colorectal, breast and prostate cancer. Ann Rev Cancer 2009; 29: 111-132.
McCullough M, Stevens V, Diver W, et al. Vitamin D pathway gene polymorphisms,diet, and risk of postmenopausal breast cancer: a nested case-control study.
Breast Cancer Res 2007; 9: R9.
Mikhak B, Hunter D, Spiegelman D, Platz E, Hollis B, Giovannucci E. Vitamin Dreceptor (VDR) gene polymorphisms and haplotypes, interactions with plasma25-hydroxyvitamin D and 1,25-dihydroxyvitamin D and prostate cancer risk.
Prostate 2007; 67: 911-923.
Milner J. Nutrition and cancer: essential elements for a roadmap. Cancer Letters2008; 269: 189-198.
Mimori K, Tanaka Y, Yoshinaga K, Masuda T, Yamashita K, Okamoto M. Clinicalsignificance of the overexpression of the candidate oncogene CYP24A1 inesophageal cancer. Ann Oncol 2004; 15: 236-241.Minn A, Gupta G, Siegel P, Bos P, Shu W, Giri D, Viale A, Olshen A, Gerald W,Massagué J. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature 2005;436: 518-524.
Literatura
153
Mohri T, Nakajima M, Takagi S, Komagata S, Yokoi T. MicroRNA regulates humanvitamin D receptor. Int J Cancer 2009; 125: 1328-1333.
N
Nagpal S, Na S, Rathnachalam R. Noncalcemic actions of vitamin D receptor ligands.
Endocrine Rev 2005; 26: 662-687.
Nair U, Bartsch H and Nair J Alert for an epidemic of oral cancer due to use of thebetel quid substitutes gutkha and pan masala: a review of agents and causativemechanismsMutagenesis 2004; 19: 251-262.
Nejentsev S, Godfrey L, Snook H, Rance H, Nutland S, Walker N, Lam A, Guja C,Ionescu-Tirgoviste C, Undlien D, Rønningen K, Tuomilehto-Wolf E, Tuomilehto J,Newport M, Clayton D, Todd J. Comparative high-resolution analysis of linkagedisequilibrium and tag single nucleotide polymorphisms between populationsin the vitamin D receptor gene. Hum Mol Gen 2004; 13: 1633-1639.
Norman A. Minireview: vitamin D receptor: new assigments for an already busyreceptor. Endocriniology 2006; 147: 5542-5548.
O
Obara W, Suzuki Y, Kato K, Tanji S, Konda R, Fujioka T. Vitamin D receptor genepolymorphisms are associated with increased risk and progression of renal cellcarcinoma in a Japanese population. Int J Urol 2007; 14: 483-487.
Orell-Kotikangas H, Schwab U, Osterlund P, Saarilahti K, Makitie O, Makitie A. Highprevalence of vitamin D insufficiency in patients with head and neck cancer atdiagnosis. Head Neck 2012; doi: 10.1002/hed.21954.
Literatura
154
Orlov I, Rochel N, Moras D, Klaholz B. Structure of the full human RXR/VDR nuclearreceptor heterodimer complex with its DR3 target DNA. EMBO J 2012; 31: 291-300.
Osborne J, Hutchinson P. Vitamin D and systemic cancer: is this relevant tomalignant melanoma? Br J Dermatol 2002; 147: 197-213.
P
Palmer H, Gonzalez-Sancho JM, Espada J, Berciano M, Puig I, Baulida J, QuintanillaM, Cano A, García de Herreros A, Lafarga M, Muñoz A. Vitamin D3 promotes thedifferentiation of colon carcinoma cells by the induction of E-cadherin and theinhibition of catenin signaling. J Cell Biol 2001; 154: 369-387.
Parisi E, Rene J, Cardus A, Valcheva P, Pinol-Felis C, Valdivielso J, Fernandez E.Vitamin D receptor levels in colorectal cancer- possible role of BsmIpolymorphism. J Steroid Biochem Mol Biol 2008; 11: 87-90.
Pelluchi C, Talamini R, Negri E, Levi F, Conti E, Franceschi S, La Vecchia C. Folateintake and risk of oral and pharyngeal cancer. Ann Oncol 2003; 14: 1677-1681.
Perez-Ordonez B, Beauchemin M, Jordan R. Molecular biology of squamous cellcarcinoma of the head and neck. J Clin Pathol 2006; 59: 445-453.
Perez-Sayans M, Somosa-Martin JM, Barros-Angueira F, Reboiras-Lopes MD,Gandara Rey JM, Garcia-Garcia A. Genetic and molecular alterations associatedwith oral squamous cell carcinoma. Oncol Rep 2009; 22: 1277-1282.
Petersen P. Oral cancer prevention and control- the approach of the World HealthOrganization. Oral Oncol 2008; 45: 454-460.
Literatura
155
Petti S, Scully C. Oral cancer: The association between nation-based alcohol-drinking profiles and oral cancer mortality. Oral Oncol 2005; 41: 828–834.
Pfister D, Ang K, Brizel D, Burtness B, Cmelak A, Colevas D, Dunphy F, Eisele D,Gilbert J, Gillidon M, Haddad R, Haughey B, Hicks W, Hitchcock Y, Kies M, LydiattW, Maghami E, Martins R, McCaffrey T, Mittal B, Pinto H, Ridge J, Samant S,Sanguineti G, Schuller D, Shah J, Spencer S, Trotti A, Weber R, Wolf G, Worden F.Head and neck cancers. J Natl Compr Canc Netw 2011; 9: 596-650.
Povey J, Darakhshan F, Robertson K, Bisset Y, Mekky M, Rees J et al. DNA repairgene polymorphisms and genetic predisposition to cutaneous melanoma.
Carcinog 2007; 28: 1087-1093.
Prosser D, Jones G. Enzymes involved in the activation and inactivation of vitaminD. Trends Biochem Sci 2004; 29: 664-673.
R
Ragin CCR, Modugno F, Gollin SM. The epidemiology and risk factors of head andneck cancer: a focus on human papilloma virus. J Dent Res 2007; 86: 104-114.
Raimondi S, Johansson H, Maisonneuve P, Gandini S. Review and meta-analysis onvitamin D receptor polymorphisms and cancer risk. Carcinog 2009; 30: 1170-1180.
Ramagopalan S, Heger A, Berlanga A, Maugeri N, Lincoln M, Burrell A,Handunnetthi L, Handel A, Disanto G, Orton SM, Watson C, Morahan J,Giovannoni G, Ponting C, Ebers G, Knight J. A ChiP-seq defined genome-widemap of vitamin D receptor binding: associations with disease and evolution.
Genome Res 2010; doi:10.1101/gr.107920.110.
Literatura
156
Reichrath J, Kamradt J, Zhu X, Kong X, Tilgen W, Holick M. Analysis of 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptors (VDR) in basal cell carcinomas. Am J Pathol1999; 155: 583-589.
Rene Leemans C, Braakhuis B, Brakenhoff R. The molecular biology of head andneck cancer. Nature Cancer Rev 2011; 11: 9-22.
Riggs L. Role of the vitamin D endocrine system in the pathophysiology ofpostmenopausal osteoporosis. J Cell Biochem 2002; 88: 209-215.
Roff A, Taylor Wilson R. A novel SNP in a vitamin D response element of theCYP24A1 promoter reduces protein binding, transactivation and geneexpression. J Steroid Biochem Mol Biol 2008; 112: 47-54.
Ross S. Evidence for the relationship between diet and cancer. Exp Oncol 2010; 32:137-142.
Ruddon R. Cancer biology. Fourth edition, Oxford University Press 2007.
Rukin N, Strange R. What are the frequency, distribution and functional effects ofvitamin D receptor polymorphisms as related to cancer risk? Nutr rev 2007;65: S96-S101.
S
Schafer A, Emmert S, Kruppa J, Schubert S, Tzvetkov M, Mossner R, Reich K,Berking C, Volkenandt M, Pfohler C, Schon M, Vogt T, Konig I, Reichrath J. Noassociation of vitamin D metabolism-related polymorphisms and melanoma riskas well as melanoma prognosis: a case-control studies. Arch Dermatol Res 2012;304: 353-361.
Literatura
157
Schulz W. Molecular biology of human cancers: an advanced student’s textbook.
Springer 2007.
Scully C, Bagan J. Oral squamous cell carcinoma: overview ofcurrentunderstanding of aetiopathogenesis and clinical implications. Oral Dis2009; 15: 388-399.
Scully C, Bagan J. Recent advances in oral oncology. Oral oncol 2007; 43: 107-115.
Scully C, Field J, Tanzawa H. Genetic aberrations in oral or head and necksquamous cell carcinoma 3: clinico-pathological applications. Oral Oncol 2000;36: 404-413.
Sharma V, Fretwell D, Crees Z, Kerege A, Klopper J. Thyroid Cancer Resistance toVitamin D Receptor Activation Is Associated with 24-Hydroxylase Levels ButNot the ff FokI Polymorphism. Thyroid 2010; 20: 1103-1111.
Shi H, Yan P, Chen C, Rahmatpanah F, Lofton-Day C, Caldwell C, Huang T. ExpressedCpG island sequence tag microarray for dual screening of DNAhypermethylation and gene silencing in cancer cells. Cancer Res 2002; 62: 3214-3220.
Signorello L, Shi J, Cai Q, Zheng W, Williams S, Long J, Cohen S, Li G, Hollis B, SmithJ, Blot W. Common variation in vitamin D pathway genes predicts circulating 25-hydroxivitamin D levels among African Americans. PloS One 2011; 6: e28623.
Silverman S. Demographics and occurrence of oral and pharyngeal cancers: theoutcomes, the trends, the challenge. J Am Dent Assoc 2001; 132: 7S-11S.
Singh B, Berry J, Vincent L, Lucci A. Involvement of IL-8 and COX-2 mediated bonemetastases from breast cancer. J Surg Res 2006; 134: 44-51.
Literatura
158
Slatkin M. Linkage disequilibrium-undrestanding the evolutionary past andmapping the medical future. Nat Rev Genet 2008; 9: 477-485.
Sobin L, Wittekind C. TNM classification of malignant tumours. New York: JohnWiley & Sons, Inc, 2002.
Srinivasan M, Parwani A, Hershberger P, Lenzner D, Weissfeld J. Nuclear vitamin Dreceptor expression is associated with improved survival in non-small cell lungcancer. J Steroid Biochem Mol Biol 2011; 123: 30-36.
Stewart L, Weigel N. Vitamin D and prostate cancer. Exp Biol Med 2004; 229:277-284.
Sweeney C, Curtin K, Murtaugh M, Caan B, Potter J, Slattery M. Haplotype analysisof common vitamin D receptor variants and colon and rectal cancers. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev 2006; 15: 744-749.
Š
Šupić G, Magić Z. Osnovni epigenetski mehanizmi kancera. Med Data Rev 2009;4: 31-36.
T
Tamez S, Norizoe1 C, Ochial K, Takahashi D, Shimojima A, Tsutsumi Y et al. VitaminD receptor polymorphisms and prognosis of patients with epithelial ovariancancer. Br J Cancer 2009; 101: 1957-1960.
Tayeb M, Clark C, Haites N, Sharp L, Murray G, McLeod H. CYP3A4 and VDR genepolymorphisms and the risk of prostate cancer in men with benign prostatehyperplasia. Br J Cancer 2003; 88: 928-932.
Literatura
159
Taylor A, Hirvonen A, Watson M, Pittman G, Mohler L, Bell A. Association ofprostate cancer with vitamin D receptor gene polymorphism. Cancer Res 1996;56: 4108-4110.
Taylor J, Hirvonen A, Watson M, Pittman G, Mohler J, Bell D. Association of prostatecancer with vitamin D receptor gene polymorhism. Cancer Res 1996; 56: 4108-4110.
Thorne J, Campbell M. The vitamin D receptor and cancer. Proc Nutr Soc 2008;  67:115-127.
Trabert B, Malone K, Daling J, Doody D, Bernstein L, Ursin G et al. Vitamin Dreceptor polymorphisms and breast cancer risk in a large population-basedcase-control study of Caucasian and African-American women. Breast Cancer
Res 2007; 9: R84.
Tregouet D, Garelle V. A new JAVA interface implementation of THESIAS: testinghaplotype effects in association studies. Bioinformatics Application Notes 2007;23: 1038-1039.
Tregouet D, Tiret L. Cox proportional hazards survival regression in haplotype-based association analysis using the stochastic-EM algorithm. Euro J Hum Genet2004; 12: 971- 974.
Turna A, Pekcolaklar A, Metin M, Yaylim I, Gurses A. The effect of season ofoperation on the survival of patients with resected non-small cell lung cancer.
Interact CardioVasc Thorac Surg 2012; 14: 151-155.
Turunen M, Dunlop T, Carlberg C, Vaisanen S. Selective use of multiple vitamin Dresponse elements underlies the 1α25-dihydroxyvitamin D3 –mediated negativeregulation of the human CYP27B1 gene. Nucleic Acids Res 2007; 35: 2734-2747.
Literatura
160
U
Uitterlinden A, Fang Y, van Meurs J, Pols H, van Leeuwen J. Genetics and biology ofvitamin D receptor polymorphisms. Gene 2004; 338: 143-156.
V
Vuolo L, Somma C, Faggiano A, Colao A. Vitamin D and cancer. Front endocrin2012; 3: doi: 10.3389/fendo.2012.00058.
Vupputuri M, Goswami R, Gupta N et al. Prevalence and functional significance of25-hydroxyvitamin D deficiency and vitamin D receptor gene polymorphisms inAsian Indians. Am J Clin Nutr 2006; 83: 1411-1419.
W
Wall J, Pritchard J. Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the humangenome. Nat Rev Genet 2003; 4: 587-597.
Wang Y, Irish J, MacMillan C, Brown D, Xuan Y, Boyington C, Gullane P, Kamel-ReidS. High frequency of microsatellite instability in young patients with head andneck squamous cell carcinoma: lack of involvement of the mismatch repairgenes hMLH1 and hMSH2. Int J Cancer 2001; 93: 353-360.
Warnakulasuriya S. Global epidemiology of oral and oropharyngeal cancer. Oral
Oncol 2009; 45: 309–316.
Welsh J. Cellular and molecular effects of vitamin D on carncerogenesis. Arch
Biochem Biophys 2012; 523: 107-114.
Literatura
161
Whitfield K, Remus L, Jurutka P, Zitzer H, Oza A, Dang H et al. Functionally relevantpolymorphisms in the human nuclear vitamin D receptor gene. Mol Cell
Endocrinol 2001; 177: 145-159.
Whitlatch L, Young M, Schwartz G, Flanagan J, Burnstein K, Lokeshwar B, Rich E,Holick M, Chen T. 25-Hydroxyvitamin D-1-hydroxylase activity is diminished inhuman prostate cancer cells and is enhanced by gene transfer. J Steroid Biochem
Mol Biol 2002; 81: 135-140.
X
Xu Y, Shibata A, McNeal J, Stamey T, Feldman D, Peehl D. Vitamin D receptor startcodon polymorphism (FokI) and prostate cancer progression. Cancer Epidem
Biomarkers Prev 2003; 12: 23-27.
Y
Ylikomi T, Laaksi I, Lou Y, Martikainen P, Miettinen S, Pennanen P, Purmonen S,Syvala H, Vienonen A, Tuohimaa P. Antiproliferative action of vitamin D.
Vitamins and Hormons 2002; 64: 357-406.
Z
Zaykin D, Westfall P, Young S, Karnoub M, Wagner M, Ehm M. Testing association ofstatistically inferred haplotypes with discrete and continuous traits in samplesof unrelated individuals. Hum Hered 2002; 53: 79-91.
Zeljic K, Supic G, Stamenkovic Radak M, Jovic N, Kozomara R, Magic Z. VDR,CYP27B1 and CYP24A1 genes polymorphisms association with oral cancer riskand survival. J Oral Pathol Med 2012; doi: 10.1111/j.1600-0714.2012.01164.x
Literatura
162
Zhou W, Heist R, Liu G, Asomaning K, Neuberg D, Hollis B, Wain J, Lynch T,Giovannucci E, Su L, Christiani D. Circulating 25-Hydroxyvitamin D LevelsPredict Survival in Early-Stage Non–Small-Cell Lung Cancer Patients. J Clin Oncol2007; 25: 479-485.
Zhou W, Heist R, Liu G, Neuberg D, Asomaning K, Su L, Wain J, Lynch T, GiovannucciE, Christiani D. Polymorphisms of vitamin D receptor and survival in early-stagenon-small  cell lung cancer patients. Cancer Epidem Biomarkers Prev 2006; 15:2239-2245.
Web stranice
www.ncbi.nlm.nih.gov/SNPwww.hapmap.orgwww2.cnrs.fr/en/1961.htmwww.drnickcampos.com/health-newsletter/VitD.htmlwww.ghr.nlm.nih.gov/gene/VDRwww.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000776.1www.bioscience.org/2005/v10/af/1514/ fulltext.asp?bframe=figures.htm&doi=yewww.ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP27B1www.ghr.nlm.nih.gov/gene/CYP24A1
163
8. BIOGRAFIJA AUTORA
Biografija autora
164
Diplomirani biolog Katarina Zeljić je rođena 04.07.1984. godine u Loznici.Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu, studijska grupa Biologija upisala ješkolske 2003/2004. godine. Diplomirala je 2008. godine na usmerenju Primenjenagenetika, sa prosečnom ocenom 9.82. Školske 2008/2009. godine je upisaladoktorske studije na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, modul:Genetika. U periodu od 2009-2011. godine je bila stipendista Ministarstva nauke itehnološkog razvoja Republike Srbije u okviru projekta „Adaptivni značaj
genetičkog polimorfizma populacija Drosophila“ (evidencioni broj 143014). Poredpomenutog, Katarina Zeljić je bila nosilac stipendije opštine Loznica (2001-2002.),kao i stipendije Ministarstva nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije zastudiranje (2002–2008.). Saradnik je na projektu „Prognostički i prediktivni značaj
genetskih i epigenetskih promena u solidnim tumorima“ (evidencioni broj VMA/06-10/A1).Katarina Zeljić je do sada bila autor i koautor 6 naučnih publikacija uvrhunskim časopisima međunarodnog značaja i 10 saopštenja na skupovimameđunarodnog značaja iz uže naučne oblasti.Katarina Zeljić je 2002. godine osvojila prvo mesto na međunarodnoj BIOSolimpijadi (Sankt Petersburg, Rusija), 2007. godine dobila nagradu EFG banke zanajbolje studente Srbije u okviru projekta „Investiramo u Evropske vrednosti“, a2011. godine je dobila stipendiju Union Graduate College-Mount Sinai School ofMedicine, za program edukacije Bioetike.Tokom školske 2009/2010. godine je kao student doktorskih studijaučestvovala u izvođenju praktične nastave na Katedri za genetiku i evoluciju. Odfebruara 2011. godine je zaposlena na Biološkom fakultetu Univerziteta uBeogradu, najpre kao saradnik u nastavi, a potom i kao asistent na Katedri zagenetiku i evoluciju. Školske 2011/2012. je bila angažovana kao asistent po pozivuna Medicinskom fakultetu Vojnomedicinske akademije Univerziteta odbrane uBeogradu.Uža naučna oblast interesovanja su: molekularna genetika i epigenetikakancera, humana populaciona genetika i etika naučno-istraživačkog rada.
165
9. PRILOZI
166
Прилог 1.
Изјава о ауторству
Потписани-a Kaтарина Зељић ________
број уписа Б504/2008 _______________________________
Изјављујем
да је докторска дисертација под насловом
Повезаност полиморфизама VDR, CYP27B1 и CYP24A1 гена са етиолошким факторима и
исходом болести код пацијената са оралним сквамоцелуларним карциномом
 резултат сопственог истраживачког рада,
 да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за
добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских
установа,
 да су резултати коректно наведени и
 да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица.
Потпис докторанда
У Београду, _03.10.2012._______
167
Прилог 2.
Изјава o истоветности штампане и електронске верзије
докторског рада
Име и презиме аутора __Катарина Зељић___________________________________
Број уписа Б504/2008__________________________________________________
Студијски програм Биологија, модул Генетика______________________________
Наслов рада Повезаност полиморфизама VDR, CYP27B1 и CYP24A1 гена са етиолошким
факторима и исходом болести код пацијената са оралним сквамоцелуларним карциномом
Ментор _проф. др Марина Стаменковић- Радак, проф. др сци. мед. Звонко Магић__
Потписани  _Катарина Зељић_______________________________________
изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју
сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у
Београду.
Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора
наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада.
Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у
електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду.
Потпис докторанда
У Београду, _03.10.2012.___________
168
Прилог 3.
Изјава о коришћењу
Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални
репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом:
Повезаност полиморфизама VDR, CYP27B1 и CYP24A1 гена са етиолошким факторима и
исходом болести код пацијената са оралним сквамоцелуларним карциномом
која је моје ауторско дело.
Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно
архивирање.
Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду
могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне
заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла.
1. Ауторство
2. Ауторство - некомерцијално
3. Ауторство – некомерцијално – без прераде
4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима
5. Ауторство – без прераде
6. Ауторство – делити под истим условима
(Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је
на полеђини листа).
Потпис докторанда
У Београду, __03.10.2012.______________
169
1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела,
и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или
даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих
лиценци.
2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно
саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од
стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну
употребу дела.
3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање,
дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе
дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или
даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У
односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права
коришћења дела.
4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате
умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име
аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада
дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава
комерцијалну употребу дела и прерада.
5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно
саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу,
ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце.
Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела.
6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију
и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен
од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или
сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и
прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.