UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Jelena R. Mitrović Gen za veliku subjedinicu šaperonina (groEL gen) kao dodatni molekularni marker za diferencijaciju fitoplazmi srodnih 'Candidatus Phytoplasma asteris' -doktorska disertacija- Beograd, 2013. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Jelena R. Mitrović Molecular chaperonin large subunit gene (groEL gene) as an additional marker for differentiation of 'Candidatus Phytoplasma asteris'- related strains -Doctoral Dissertation- Belgrade, 2013 Biološki fakultet – Univerzitet u Beogradu Mentori: Dr Svetlana Radović, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet Dr Bojan Duduk, viši naučni saradnik Institut za pesticide i zaštitu ţivotne sredine Član komisije: Dr Marina Stamenković-Radak, vanredni profesor Univerzitet u Beogradu Biološki fakultet Datum odbrane doktorske disertacije: _____________________________ Najlepše hvala Dr Bojanu Duduku na svemu što me je naučio, na pruženoj mogućnosti usavršavanja u prestižnim evropskim institutima i na izvanrednoj saradnji koju smo imali svih ovih godina a koja je rezultirala izradom ove doktorske teze. Profesorki Svetlani Radović na lepoj, visokoprofesionalnoj saradnji i svim konstruktivnim savetima tokom pisanja teze. Profesorki Marini Stamenković-Radak na svim korisnim savetima i stečenom znanju u okviru dugogodišnje saradnje tokom osnovnih i doktorskih studija. Svim kolegama sa posla koji su imali pregršt razumevanja tokom izrade i pisanja doktorata. Mojim prijateljima na svoj podršci, ljubavi i strpljenju. Mojoj porodici što je bila uz mene i verovala u mene u svakom momentu i na svakom koraku. Mom Milošu što je u mom životu i što je takav kakav jeste jer bez njega ovo sve ne bi imalo toliki sjaj kakav ima. Mitrović REZIME Gen za veliku subjedinicu šaperonina (groEL gen) kao dodatni molekularni marker za diferencijaciju fitoplazmi srodnih 'Candidatus Phytoplasma asteris' Jelena R. Mitrović REZIME Na teritoriji Republike Srbije su u periodu od 2009. do 2011. godine sakupljeni uzorci biljaka sa simptomima karakterističnim za prisustvo fitoplazmi. Upotrebom PCR metode pomoću univerzalnih prajmera P1/P7 i R16F2n/R16R2 u njima su detektovane fitoplazme. Upotrebom restrikcionih enzima Tru1I, HhaI, RsaI i Tsp509I na R16F2n/R16R2 amplikone, ove fitoplazme su na osnovu dobijenih restrikcionih profila identifikovane kao Aster yellows fitoplazme (ribozomalna grupa 16SrI), podgrupe 16SrI-B, I-C i I-P, odnosno kao Stolbur fitoplazme (ribozomalna grupa 16SrXII). Upotrebom iste PCR-RFLP metode kod 19 sojeva Aster yellows fitoplazmi iz kolekcije i tri soja poreklom iz šargarepe iz Srbije, potvrĎena je pripadnost podgrupama 16SrI-A, I-B, I-C i I-F preuzeta iz literature. TakoĎe je utvrĎena pripadnost odreĎenoj podgrupi kod četiri soja iz kolekcije, koji se prvi put koriste u analizi i o kojima nema literaturnih podataka. Upotrebom novodizajniranih prajmera AYgroesF/AYampR i AYgroelF/AYgroelR umnoţen je groEL gen kod sva 34 testirana soja Aster yellows fitoplazmi. Analizom restrikcionih profila dobijenih pomoću Tru1I i AluI restrikcionih enzima na AYgroelF/R amplikone, utvrĎeno je postojanje šest, odnosno osam različitih profila na osnovu kojih su svi testirani sojevi svrstani u devet groELI podgrupa (groELI-I do groELI-IX). Na osnovu groEL gena podgrupe 16SrI-A i I-C su dalje diferencirane u dve groELI podgrupe, 16SrI-B u tri, dok podgrupe 16SrI-M i I-L nisu pokazale nikakve meĎusobne razlike u odnosu na jedan deo podgrupe 16SrI-B. Podgrupe 16SrI-F i I-P se razlikuju od ostalih podgrupa i na nivou groEL gena kao i na nivou 16S rDNK. TakoĎe je utvrĎeno da sedam novodetektovanih sojeva Aster yellows fitoplazmi iz Srbije pripada podgrupama groELI-III, I-VII i I-IX. Analizom tuf gena, dela rp operona i secY gena kod 22 odabrana od 34 testirana soja soja Aster yellows fitoplazmi moguće je testirane sojeve klasifikovati u šest tufI i sedam rpI i secYI podgrupa na osnovu MboI, Tsp509I i Tru1I restrikcionih profila za tuf gen, HhaI, AluI i Tsp509I za rp gen i Tsp509I i Tru1I za secY gen. Podgrupa 16SrI-A je dalje diferencirana u dve tufI podgrupe, odnosno 16SrI-A i I-B u po dve rpI i secYI podgrupe, dok podgrupe 16SrI-B, I-M i I-L nisu pokazale nikakve meĎusobne razlike. Podgrupe 16SrI-C, I-F i I-P se razlikuju od ostalih podgrupa i na nivou sva tri testirana gena kao i na nivou 16S rDNK. Analizom tuf gena kod 116 detektovanih sojeva Stolbur fitoplazmi iz Srbije, pomoću HpaII restrikcionog enzima, utvrĎeno je da svi testirani sojevi pripadaju tuf type II podgrupi. Od ovih uzoraka je za dalju analizu groEL gena odabrano 39 sojeva, a radi kompletnije slike o varijabilnosti groEL gena kod Stolbur fitoplazmi, u analizu su uključena i dva soja Stolbur fitoplazmi iz Hrvatske, poreklom sa vinove loze, kao kontrolni sojevi Stolbur fitoplazmi tuf type I podgrupe. Kod sva 41 testirana uzorka Stolbur fitoplazmi uspešno je umnoţen groEL gen upotrebom novodizajniranih prajmera STOLgroesF/STOLstampR i Mitrović REZIME AYgroelF/STOLgroelR2. Analizom dobijenih fragmenata pomoću restrikcionog enzima Tru1I uočeno je postojanje dva tipa profila. Analizom dobijenih sekvenci osam odabranih sojeva, meĎu kojima su i sojevi tuf type I podgrupe, uočeno je postojanje tri varijabilna mesta na osnovu kojih se razlikuje ukupno pet genotipova. Prvo varijabilno mesto se nalazi u okviru groES gena i ono ne rezultuje u promeni predviĎene AK, dok se druga dva nalaze u okviru groEL gena i oni rezultuju u promeni predviĎene AK. TakoĎe se uočava da se na AK mestu 338 kod svih sojeva iz Srbije koji pripadaju tuf type II podgrupi tu nalazi alanin (A) dok se kod sojeva iz Hrvatske, koji predstavljaju tuf type I fitoplazme, nalazi treonin (T). Upotrebom AYgroelF, AYgroelR i STOLstampR prajmera u multipleks PCR reakciji moguće je detektovati Aster yellows i Stolbur fitoplazme u uzorcima u kojima se ove fitoplazme nalaze kako u pojedinačnim tako i u mešanim infekcijama. Analizom sekvenci groEL gena 27 testiranih sojeva Aster yellows fitoplazmi kod kojih je sekvenciran ovaj region, utvrĎeno je da duţina celog groEL gena kod AY fitoplazmi iznosi 1611 bp (protein je duţine 536 aminokiselina), da postoje ukupno 144 varijabilna mesta od kojih 55 rezultuje u promeni predviĎene AK a 89 je sinonimno, da meĎu proučavanim sojevima postoji ukupno 50 AK razlike u proteinskoj sekvenci, da je podgrupa 16SrI-A najvarijabilnija, da ekvatorijalni domen GroEL proteina čine AK 5- 132 i 406-521, apikalni 189-373, a intermedijarni 133-188 i 374-405. TakoĎe je utvrĎeno da kod GroEL proteina AY fitoplazmi postoje odreĎena odstupanja u mestima koja po literaturnim podacima imaju odreĎenu ulogu tokom procesa savijanja proteina. Uporednom analizom sekvenci 16S rRNK i groEL gena utvrĎeno je da srednja vrednost procenta meĎusobne identičnosti svih sojeva AY fitoplazmi iznosi 99.5% odnosno 98.1%, pri čemu je opseg za 16S rRNK od 98.7 do 100%, a za groEL gen od 93.7 do 100%. Srednja vrednost procenta identičnosti aminokiselinskih sekvenci GroEL proteina AY fitoplazmi iznosi 97.8%, a kreće se od 94.6 do 100%. Analizom sekvenci tuf, rp i secY gena kod sojeva kod kojih su sekvencirani ovi geni, utvrĎeno je da srednja vrednost procenta meĎusobne identičnosti sojeva AY fitoplazmi za tuf gen iznosi 97.2% (opseg je od 93 do 99.9%), za rp gen iznosi 97.4% (opseg je od 93.2 do 100%), a za secY gen iznosi 94.8% (opseg je od 84 do 100%). Najniţu vrednost procenta sličnosti sekvenci u odnosu na svih pet posmatranih gena ima soj PopD (16SrI-P) sa nekim od sojeva iz podgrupe 16SrI-A ili I-B. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu nukleotidnih sekvenci celog groEL gena ima u osnovi istu topologiju kao i stablo 16S rRNK s tim što je ovde došlo još i do izdvajanja novih klastera unutar podgrupa 16SrI-A, I-B i I-C. Soj AY-A koji je pripadnik podgrupe 16SrI-F, se nalazi kao zasebna grana, dok soj PopD (16SrI-P) čini potpuno odvojenu granu od svih ostalih sojeva. Devet zasebnih linija koje se izdvajaju na ovom filogenetskom stablu su u skladu sa podelom na groELI podgrupe napravljenu na osnovu RFLP analize. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu zdruţenih sekvenci tuf, rp i secY gena ima identičnu topologiju kao i stablo rekonstruisano na osnovu groEL gena. Na osnovu PCR-RFLP metode je pokazano da je groEL gen informativniji u odnosu na 16S rRNK, tuf, rp i secY gen, a filogenetskom analizom je potvrĎeno da groEL gen poseduje manju meĎugrupnu sličnost sekvenci nego 16S rDNK i stoga ima veću moć razdvajanja srodnih sojeva. Ovi rezultati pokazuju da je upotreba groEL gena i njegova analiza PCR-RFLP metodom pouzdana metoda kako za detekciju tako i za Mitrović REZIME identifikaciju sojeva AY fitoplazmi i to ne samo onih iz kolekcije, već i iz uzoraka uzetih iz prirode. Kljuĉne reĉi: varijabilnost gena, RFLP, groELI podgrupe, tufI podgrupe, rpI podgrupe, secYI podgrupe, Stolbur fitoplazme, filogenetska analiza Nauĉna oblast: Biologija Uţa nauĉna oblast: Genetika UDK broj: 575.22:579.887 (043.3) Mitrović ABSTRACT Molecular chaperonin large subunit gene (groEL gene) as an additional marker for differentiation of 'Candidatus Phytoplasma asteris'-related strains Jelena R. Mitrović ABSTRACT The plant samples with symptoms typical for phytoplasma infection were collected in Serbia from 2009 till 2011. In those samples phytoplasmas were detected by PCR technique with universal primers P1/P7 and R16F2n/R16R2 and identified according to their Tru1I, HhaI, RsaI and Tsp509I restriction profiles of digested R16F2n/R16R2 amplicons as Aster yellows phytoplasma (ribosomal group 16SrI), subgroups 16SrI-B, I-C and I-P or as Stolbur phytoplasma (ribosomal group 16SrXII). Applying the same PCR-RFLP method on 19 strains of Aster yellows phytoplasmas from collection and three strains from carrot from Serbia, it was confirmed that this strains belong to subgroups 16SrI-A, I-B, I-C and I-F as stated in literature. Also the subgroups were determined for four strains from collection that are used in analyses for the first time and that have no literature data. Using newly designed primers AYgroesF/AYampR and AYgroelF/AYgroelR, the groEL gene was successfully amplified in all 34 strains of Aster yellows phytoplasma tested. RFLP analyses of AYgroelF/AYgroelR amplicons with Tru1I i AluI restriction enzymes revealed existence of six and eight different restriction profiles, respectively, according to which all tested strains were classified in nine groELI subgroups (groELI-I till groELI-IX). On the basis of groEL gene, subgroups 16SrI-A and I-C were further differentiated into two groELI subgroups, 16SrI-B into three, while subgroups 16SrI-M and I-L showed no difference to some strains belonging to subgroup 16SrI-B. Subgroups 16SrI-F and I-P could be differentiated from other subgroups on the basis of groEL gene as on the basis of 16S rDNA. The seven newly detected Aster yellows strains from Serbia were affiliated to subgroups groELI-III, I-VII and I-IX. RFLP analyses with MboI, Tsp509I and Tru1I restriction enzymes of tuf gene, HhaI, AluI and Tsp509I of rp gene and Tsp509I and Tru1I of secY gene, classified 22 selected Aster yellows strains into six tufI subgroups and seven rpI and secYI subgroups. Subgroup 16SrI-A was further differentiated into two tufI subgroups and subgroups 16SrI-A and I-B were further differentiated into two rpI and secYI subgroups each. On the other hand subgroups 16SrI-B, I-M and I-L showed no mutual differences, while subgroups 16SrI-C, I-F and I-P could be differentiated from other subgroups on the basis of all three genes tested as on the basis of 16S rDNA. RFLP analysis of tuf gen with HpaII restriction enzyme showed that all 116 tested Stolbur phytoplasma strains from Serbia belong to tuf type II variant. For further analyses, 39 Stolbur strains were selected out of 116 detected and two strains from grapevine from Croatia were also included in analyses as tuf type I reference strains to gain a larger picture of variability of groEL gene in Stolbur phytoplasmas. In all 41 Stolbur tested strains, groEL gene was successfully amplified with newly designed primers STOLgroesF/STOLstampR and AYgroelF/STOLgroelR2. RFLP analysis of these amplicons with Tru1I restriction enzyme determined the presence of two different profiles. Analysis of groEL gene sequences of eight selected Mitrović ABSTRACT strains, including tuf type I strains, revealed the presence of three SNPs leading to determination of five genotypes in total. First SNP is inside groES gen and it is a synonymous one resulting in no predicted amino acid difference, while two others are inside the groEL gen and they lead to different predicted amino acid sequences. Also it can be noticed that in the predicted amino acid sequences at the position 338 all strains from Serbia, belonging to tuf type II variant, have alanine (A), while two strains from Croatia, tuf type I variants, have threonine (T). Applying AYgroelF, AYgroelR and STOLstampR primers together in multiplex PCR reaction, it was possible to detect only Aster yellows and Stolbur phytoplasma, or both together, in positive samples from collection as well as in field collected samples. Analyzing groEL gene sequences of 27 Aster yellows tested phytoplasma strains, it has been established that whole groEL gene was 1611 bp long (protein consisted of 536 amino acids), that there were 144 polymorphic positions in total, 55 of them resulted in different amino acid when translated while 89 was synonymous ones, that among the observed strains there was difference in 50 amino acids in protein sequences, that subgroup 16SrI-A is the most variable one, that equatorial domain of GroEL consisted of residues 5-132 and 406-521, apical domain of 189-373 and intermediate domain consisted of residues 133-188 and 374-405. Also, it has been determined that in GroEL protein of AY phytoplasmas there were some differences in amino acid composition in positions that are, from literature, important for its role in folding other proteins. Comparative sequence analyses of 16S rRNA and groEL gene revealed that the average nucleic acid similarity of examined AY strains was 99.5% and 98.1%, respectively, ranging from 98.7 till 100% for 16S rRNA and from 93.7 till 100% for groEL gen. Average amino acid similarity of GroEL protein of AY phytoplasmas tested was 97.8% ranging from 94.6 till 100%. Analysis of sequences of tuf, rp and secY genes determined that average nucleic acid similarity of examined AY strains for tuf gene was 97.2% (93-99.9%), for rp 97.4% (93.2-100%) and for secY gene it was 94.8% (84-100%). The lowest nucleic acid similarity regarding all five observed genes had strain PopD (ribosomal subgroup 16SrI-P) in respect to some of the strains from subgroups 16SrI-A or I-B. Phylogenetic tree reconstructed on the basis of nucleic acid sequences of whole groEL gene had basically the similar topology like the one made on the basis of 16S rDNA sequences, with the difference that new clusters inside subgroups 16SrI-A, I-B and I-C have emerged. Strain AY-A, which belongs to subgroup 16SrI-F, was situated as a separate lineage, while the strain PopD (16SrI-P) was separated forming the new lineage outside all the other strains which clustered together. Nine lineages delineated on this phylogenetic tree were in agreement with the affiliation to groELI subgroups, made on the basis of RFLP analyses. Phylogenetic tree reconstructed on the basis of tuf, rp and secY gene sequences put together had identical topology as the one made on the basis of groEL gene sequences. On the basis of PCR-RFLP method it has been shown that groEL gene is more informative in regard to 16S rRNA, tuf, rp and secY genes and by phylogenetic analyses it has been confirmed that groEL gene has lower intergroup sequence similarities than 16S rDNA and therefore has more resolution power in separating closely related strains. These results show that usage of groEL gene and its analyses with PCR-RFLP method Mitrović ABSTRACT is reliable tool for detection as well as for identification of Aster yellows phytoplasma strains from collection and from field collected samples. Keywords: gene variability, RFLP, groELI subgroups, tufI subgroups, rpI subgroups, secYI subgroups, Stolbur phytoplasma, phylogenetic analysis Scientific field: Biology Scientific discipline: Genetics UC number: 575.22:579.887 (043.3) Mitrović SADRŢAJ SADRŢAJ SKRAĆENICE 1. UVOD ............................................................................................................... 1 1.1. OPŠTE KARAKTERISTIKE FITOPLAZMI ................................................... 1 1.1.1. Vektori ......................................................................................... 4 1.1.2. Veliĉina i osobine genoma fitoplazmi ........................................ 6 1.1.3. Klasifikacija ................................................................................. 8 1.1.4. 'Candidatus Phytoplasma' rod i podela na 16Sr grupe ........... 10 1.1.5. Detekcija fitoplazmi .................................................................... 14 1.2. OPŠTE OSOBINE I ZNAĈAJ groEL, tuf, rp I secY GENA ........................... 15 1.2.1. Molekularni šaperoni i gen za veliku subjedinicu šaperonina (groEL gen) .................................................................................. 15 1.2.1.1. Šaperonini .......................................................................... 18 1.2.1.2. Mehanizam delovanja GroEL-GroES kompleksa na savijanje proteina supstrata ............................................ 21 1.2.1.3. Prouĉavanje šaperonina kod molikuta i drugih bakterija ............................................................................ 25 1.2.2. Gen faktora elongacije kod fitoplazmi ...................................... 28 1.2.3. Geni ribozomalnih proteina kod fitoplazmi ............................. 29 1.2.4. Sec sistem ..................................................................................... 30 1.3. 'Candidatus Phytoplasma asteris' VRSTA ............................................. 31 1.4. STOLBUR FITOPLAZME ............................................................................ 32 2. CILJEVI RADA .............................................................................................. 35 3. MATERIJAL I METODE ............................................................................. 36 3.1. UZORKOVANJE I IZOLACIJA DNK .......................................................... 36 3.1.1. Uzorkovanje biljnog materijala ................................................. 36 3.1.2. Izolacija DNK iz biljnog materijala .......................................... 36 3.2. DIZAJNIRANJE PRAJMERA ZA UMNOŢAVANJE groEL GENA .................. 37 3.2.1. Aster yellows fitoplazme ............................................................. 37 3.2.2. Stolbur fitoplazme ...................................................................... 39 3.3. LANĈANA REAKCIJA POLIMERAZE (PCR) .............................................. 41 3.3.1. Multipleks PCR .......................................................................... 44 3.3.2. Vizuelizacija produkata PCR reakcije ..................................... 44 Mitrović SADRŢAJ 3.4. ANALIZA POLIMORFIZMA DUŢINE RESTRIKCIONIH FRAGMENATA (RFLP ANALIZA) .................................................................................... 45 3.5. SEKVENCIRANJE I FILOGENETSKA ANALIZA .......................................... 47 4. REZULTATI ................................................................................................... 50 4.1. ODREĐIVANJE PROTOKOLA ZA UMNOŢAVANJE groEL GENA KOD ASTER YELLOWS FITOPLAZMI ................................................................ 50 4.2. DETEKCIJA I IDENTIFIKACIJA ASTER YELLOWS FITOPLAZMI - REFERENTNIH SOJEVA I SOJEVA IZ SRBIJE ............................................. 55 4.2.1. Soj PopD ...................................................................................... 56 4.2.2. Sojevi Aster yellows fitoplazmi iz kolekcije i iz šargarepe ...... 58 4.2.3. Ostali sojevi Aster yellows fitoplazmi iz Srbije ........................ 62 4.3. ANALIZA groEL GENA KOD ASTER YELLOWS FITOPLAZMI .................. 64 4.3.1. Sojevi Aster yellows fitoplazmi iz kolekcije i iz šargarepe ...... 64 4.3.2. Ostali sojevi Aster yellows fitoplazmi poreklom iz Srbije ...... 72 4.4. ANALIZA OSTALIH GENA KOD ASTER YELLOWS FITOPLAZMI ............... 73 4.4.1. Analiza tuf gena kod Aster yellows fitoplazmi ......................... 73 4.4.2. Analiza rp gena kod Aster yellows fitoplazmi .......................... 77 4.4.3. Analiza secY gena kod Aster yellows fitoplazmi ...................... 81 4.5. STOLBUR FITOPLAZME ............................................................................ 85 4.5.1. Detekcija i identifikacija Stolbur fitoplazmi ............................ 85 4.5.2. Analiza tuf gena kod Stolbur fitoplazmi ................................... 88 4.5.3. Analiza groEL gena kod Stolbur fitoplazmi ............................. 88 4.6. MULTIPLEKS PCR .................................................................................. 94 4.7. ANALIZA SEKVENCI I FILOGENETSKA ANALIZA ..................................... 96 4.7.1. Analiza sekvenci groEL gena kod Aster yellows fitoplazmi .... 96 4.7.2. Analiza sekvenci groEL gena kod Stolbur fitoplazmi ............. 98 4.7.3. Analiza sekvenci 16S rRNK, tuf, rp i secY gena kod Aster yellows fitoplazmi ........................................................................ 100 4.7.4. Filogenetska analiza sekvenci 16S rDNK, groEL, tuf, rp i secY gena .............................................................................................. 104 5. DISKUSIJA ..................................................................................................... 114 6. ZAKLJUĈCI ................................................................................................... 123 7. LITERATURA ................................................................................................ 125 PRILOZI .............................................................................................................. 141 Mitrović SADRŢAJ PRILOG A .................................................................................................... 141 PRILOG B .................................................................................................... 144 Biografija ............................................................................................................. 145 Прилог 1 .............................................................................................................. 146 Прилог 2 .............................................................................................................. 147 Прилог 3 .............................................................................................................. 148 Mitrović SKRAĆENICE SKRAĆENICE ADP – adenozin di fosfat AK – aminokiselina APS – amonijumpersulfat ATP – adenozin tri fosfat AY – Aster yellows fitoplazme CTAB – cetiltrimetilamonijumbromid (C19H42N + Br - ) DNK – dezoksiribonukleinska kiselina EDTA – etilendiamintetraacetatna kiselina disodium so (C10H14O8N2Na2.2H2O) ORF – Open Reading Frame (otvoreni okvir čitanja) PCR – Polymeraze Chain Reaction (lančana reakcija polimeraze) rDNK – ribozomalna dezoksiribonukleinska kiselina RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism (analiza polimorfizma duţine restrikcionih fragmenata) rRNK – ribozomalna ribonukleinska (dezoksiribonukleinska) kiselina TEMED – N,N,N‟,N‟-tetrametiletilendiamin TRIS – hidroksimetil aminometan (C4H11NO3) Mitrović UVOD 1 1. UVOD 1.1. OPŠTE KARAKTERISTIKE FITOPLAZMI Fitoplazme je prvi put u literaturi opisao Kunkel 1926. godine, koji ih je okarakterisao kao viruse izazivače bolesti ţutila astera (Kunkel, 1926). Nekoliko decenija kasnije (1967. godine) Doi i saradnici su ih zvanično otkrili i opisali posmatrajući pod elektronskim mikroskopom tanke poprečne preseke mladih listova i izdanaka biljke duda koja je pokazivala izraţene simptome krţljavosti (dwarf disease) (Doi i sar., 1967). Dugo godina su, zbog svoje morfološke sličnosti sa mikoplazmama, nazivane „organizmi slični mikoplazmama“ (MLOs, mycoplasma-like organisms) da bi svoj definitivan naziv „fitoplazme“ stekle 1994. godine (Sears i Kirkpatrick, 1994). Fitoplazme su jednoćelijski prokariotski organizmi pleomorfnog oblika, veličine od 0.2 do 0.8 µm, bez ćelijskog zida umesto koga se nalazi dvoslojna membrana. One su obligatni patogeni biljaka, gde nastanjuju sitaste cevi floema, kao i insekata (vektora) koji se hrane floemskim sokom biljaka (Doi i sar., 1967). Slika 1. Poprečni presek sitastih ćelija floema vinke 84/11 uzorkovane na Tašmajdanu i zaraţene Aster yellows (AY) fitoplazmom posmatrane pod elektronskim mikroskopom pod uvećanjem 4400 (levo) i 19500 (desno). Fitoplazme su odgovorne za pojavu nekoliko stotina bolesti različitih biljnih vrsta širom sveta, meĎu kojima su i ekonomski značajne gajene biljke: kukuruz, vinova loza, duvan, peršun, šargarepa, breskva, jabuka i dr. (Khadhai i sar., 1998; Duduk i Bertaccini, 2006; Duduk i sar., 2008a, 2008b; Mitrović i Duduk, 2011). TakoĎe, u Mitrović UVOD 2 odreĎenim regionima u svetu povremeno dolazi i do pojave epidemija bolesti izazvanih fitoplazmama (Lee i sar., 1998a). Zaraţene biljke ispoljavaju širok opseg simptoma kao što su pojava veštičjih metli, proliferacija, promene na cvetu (virescencija, filodije), ţutilo i crvenilo listova, kao i postepeno odumiranje biljke (Christensen i sar., 2005). Do pojave ovakvih simptoma dolazi usled promena u metabolizu zaraţenih biljaka, koje se ogledaju u poremećaju balansa biljnih hormona i transporta aminokiselina (Lepka i sar., 1999; Maust i sar., 2003; Choi i sar., 2004; Favali i sar., 2004), kao i promeni sastava floemskog soka i poremećaju u funkcionisanju floema koji je histološki praćen taloţenjem kaloze u sitastim cevima, nekrozom i kolapsom sitastih cevi (Lee i sar., 2000). TakoĎe jedan od mehanizama nastanka simptoma moţe biti akumulacija ugljenih hidrata, koja dovodi do povratne inhibicije procesa fotosinteze i do pojave hloroze (Lepka i sar., 1999; Maust i sar., 2003). Vaţan parametar u epidemiologiji bolesti prouzrokovanih fitoplazmama je širok krug domaćina pojedinih fitoplazmi. Osetljivost biljke na odreĎenu fitoplazmu, kao i preferencija vektora u odnosu na tip ishrane, u velikoj meri odreĎuju krug domaćina odreĎene fitoplazme (Lee i sar., 1998a). Preklapanje biljnih domaćina i vektora različitih grupa fitoplazmi takoĎe daje velike mogućnosti fitoplazmama za interakciju i razmenu genetičkog materijala. U biljci domaćinu fitoplazme su detektovane u skoro svim organima gde okupiraju sitaste cevi floema. S obzirom na to da sitaste cevi nemaju nikakav direktan kontakt sa semenom, smatra se da prenošenje fitoplazmi semenom nije moguće iako dolazi do zaraţenosti cveta (Christensen i sar., 2005). MeĎutim, neki autori su ipak uspeli da dokaţu prisustvo fitoplazmi u semenu (Cordova i sar., 2003; Nipah i sar., 2007) tako da pitanje transmisije putem semena ostaje i dalje otvoreno. S obzirom na to da fitoplazme ne poseduju nijedan gen koji kodira citoskelet ili flagele, a pleomorfnog su oblika i dovoljno male veličine, smatra se da kod njih ne postoji mogućnost aktivnog kretanja, već da mogu slobodno da prolaze kroz pore sitastih cevi i da se na taj način nesmetano pasivno kreću kroz biljku zajedno sa tokom floemskog soka (Christensen i sar., 2005). Mitrović UVOD 3 Slika 2. Prolazak AY fitoplazmi kroz pore sitastih cevi u uzorku vinke 84/11 posmatrano pod mikroskopom pod uvećanjem 19500. Fitoplazme nemaju nekoliko osnovnih gena potrebnih za autonomni ćelijski metabolizam (npr. nedostaju im geni za de novo sintezu aminokiselina, masnih kiselina i nukleotida). Iz tog razloga fitoplazme moraju da se oslanjaju na unos nutritijenata iz šećerom bogatog floemskog soka biljaka domaćina. Pošto se ovaj unos obavlja putem membranskog transporta, kod njih je, u odnosu na druge gram-pozitivne bakterije sa kojima su evolutivno povezane, zadrţan veliki broj membranskih proteina transportera (Christensen i sar., 2005). Zbog gubitka gena za sintezu komponenata ćelijskog zida, aminokiselina i kofaktora, kao i zbog značajne redukcije gena odgovornih za metabolizam lipida i nukleotida, fitoplazme su primorane da osnovne nutritijente uzimaju od domaćina (Razin i sar., 1998). Pošto nije jednostavno postići ove uslove u hranljivoj podlozi, svi pokušaji kultivacije fitoplazmi u in vitro uslovima su do sada, u većoj ili manjoj meri, bili bezuspešni, što oteţava proces njihovog istraţivanja (Lee i Davis, 1992; Firrao i sar., 2007). Iz tog razloga jedini način njihovog očuvanja za sada je unutar biljke domaćina, pa je i proces mikropropagacije biljaka jedan od vaţnih načina odrţavanja nekih sojeva fitoplazmi (Bertaccini, 2010). Gajenje biljaka u in vitro uslovima je počelo ubrzano da se razvija i primenjuje od kada je 1933. godine francuski naučnik Rodţer Gotre uspešno odgajio: a) parenhimsko tkivo iz korena, b) krtole i c) kambijalno tkivo drvenastih biljaka na hranljivoj podlozi (http://paulownia.bg/en/tissue- culture.html). Mitrović UVOD 4 1.1.1. Vektori Fitoplazme se prenose na biljku domaćina perzistentnim načinom uz pomoć insekata iz familija Cicadellidae, Cixiidae, Psyllidae, Delphacidae, Derbidae (D'Arcy i Nault, 1982; Weintraub i Beanland, 2006) i Fulgoroidea (Lee i sar., 2000). Neke fitoplazme imaju nisku specifičnost za vektora i mogu se prenositi putem većeg broja insekata kao što je slučaj sa fitoplazmama ţutila astera (Aster yellows fitoplazme-AY) koje imaju najmanje 24 vrste vektora. Druge su opet visoko specifične i prenosi ih svega nekoliko vrsta insekata (Tsai, 1979; Seemuller i sar., 2002; Lee i sar., 2003). Da bi se vektor zarazio, on mora prvo da se hrani na zaraţenoj biljci i taj period se naziva period akvizicije (AAP – acquisition access period). Do prenosa fitoplazmi iz vektora u novu biljku domaćina moţe doći samo nakon završetka latentnog perioda tokom kog dolazi do umnoţavanja fitoplazmi u srednjem crevu i pljuvačnim ţlezdama vektora, a do kojih su došle putem hemolimfe (Tsai, 1979). U latentnom periodu se fitoplazme umnoţavaju do infektivne količine a duţina ovog perioda se razlikuje od vrste do vrste i u proseku iznosi tri nedelje (Webb i sar., 1999). Potom vektor prenosi patogena na zdravu biljku hraneći se na njoj i ovo predstavlja period inokulacije (IAP – inoculation access period). Kada insekt jednom postane infektivan, on ostaje infektivan do kraja ţivota (Carraro i sar., 2001; Palermo i sar., 2001). Uspešnost prenošenja fitoplazmi zavisi od mnogih faktora kao što su ţivotna faza, pol i prisustvo simbionata vektora, ponašanje vektora tokom leta, mere kontrole korova, temperatura, soj fitoplazme, vrsta biljke domaćina, kao i vrsta biljke koja je bila početni izvor zaraze (Swenson, 1971; Purcell i Suslow, 1987; Murral i sar., 1996; Bosco i sar., 1997; Beanland i sar., 1999; Palermo i sar., 2001; Tedeschi i sar., 2002; Lessio i Alma, 2004). Uticaj fitoplazmi na vektora moţe biti različit, pa su tako pronaĎeni vektori kojima je bio smanjen fitnes (Bressan i sar., 2005), ali takoĎe i oni kod kojih se povećala sposobnost preţivljavanja zimskog perioda kao i fertilnost i duţina ţivota (Beanland i sar., 2000; Ebbert i Nault, 2001). Rezultati dosadašnjih istraţivanja o prenošenju fitoplazmi, načinu ishrane vektora, kao i osetljivosti biljaka, pokazuju da mnogi vektori mogu prenositi više od jednog tipa fitoplazmi, kao i da mnoge biljke domaćini mogu biti zaraţene većim brojem filogenetski udaljenih fitoplazmi. U Mitrović UVOD 5 Severnoj Americi često se mogu naći biljke u kojima se u isto vreme u mešanoj infekciji nalaze Aster yellows (16SrI) i X-bolest (16SrIII) fitoplazme, a koje se u prirodi prenose istim vrstama vektora. U Evropi su takoĎe ustanovljene mešane infekcije Aster yellows, Stolbur (16SrXII) i elm yellows (16SrV) fitoplazmi kod kojih dolazi do preklapanja biljaka domaćina i vektora. Ovo preklapanje domaćina različitih grupa fitoplazmi im omogućava da interaguju meĎusobno i razmenjuju genetički materijal kako vertikalno tako i horizantlno. U Tabeli 1 dat je pregled jednog broja vektora koji prenose Aster yellows fitoplazme zajedno sa drugim grupama fitoplazmi (Lee i sar., 1998a). Tabela 1. Vrste insekata vektora fitoplazmi, njihov tip ishrane i geografska rasprostranjenost i grupe fitoplazmi koje prenose (Lee i sar., 1998a) Vektor Tip ishrane Geografska rasprostranjenost Grupe fitoplazmi koje prenosi u prirodi Macrosteles fascifrons Polifagna Severna Amerika, Evropa Aster yellows (16SrI-A, -B), clover phyllody (16SrI- C), clover proliferation (16SrVI-A) Macrosteles laevis Polifagna Juţna Evropa European aster yellows (16SrI-B), clover phyllody, clover dwarf (16Sr-B), Stolbur (16SrXII-A) Macrosteles striifrons Polifagna Japan Misuba W.B., garland chrysanthemum W.B., eggplant dwarf, tomato yellows, marguerite yellows (16SrI-B) Euscelis plebejus Polifagna Evropa, Severna Amerika Clover phyllody, strawberry green petal (16SrI-C), Stolbur, cabbage W.B. (16SrI-B), rape phyllody (16SrI-B) Euscelis lineolatus Polifagna Evropa, Severna Amerika Clover phyllody, chrysanthemum yellows (16SrI-B) Aphrodes bicinctus Polifagna Severna Amerika, Evropa Clover phyllody, strawberry green petal, Aster yellows (16SrI-A), European aster yellows, clover yellow edge (16SrIII-B) Orosius argentatus Polifagna Australija Tomato big bud (16SrII-D), tobacco virescence, lucerne W.B., legume little leaf, potato purple top Acinopterus angulatus Polifagna Severna Amerika Western X-disease (16SrIII-A), Aster yellows (16SrI-B) Colladonus montanus Polifagna Severna Amerika Western X-disease, Aster yellows Colladonus geminatus Polifagna Severna Amerika Western X-disease, Aster yellows Fieberiella florii Polifagna Severna Amerika Western and eastern X-disease (16SrIII-A), Aster yellows Paraphlepsius irroratus Polifagna Severna Amerika Eastern X-disease, clover phyllody Scaphytopius acutus delogi Polifagna Severna Amerika Western X-disease, Aster yellows Scaphytopius magdalensis Oligofagna Severna Amerika Blueberry stunt (16SrI-E) Mitrović UVOD 6 Tabela 1 (nastavak). Vrste insekata vektora fitoplazmi, njihov tip ishrane i geografska rasprostranjenost i grupe fitoplazmi koje prenose (Lee i sar., 1998a) Vektor Tip ishrane Geografska rasprostranjenost Grupe fitoplazmi koje prenosi u prirodi Dalbulus elimatus Oligofagna Amerika Maize bushy stunt (16SrI-B(rp-L)) Hishimonoides sellatiformis Oligofagna Japan Mulberry dwarf (16SrI-B) Scaphoideus luteolus Monofagna Severna Amerika American elm yellows (16SrV-A) Scaphoideus titanus Oligofagna Evropa Flavescence dorée (16SrV-C) Hyalestes obsoletus Oligofagna Evropa Stolbur, grapevine yellows (16SrXII-A) Hishimonus concavus Oligofagna Tajvan Loofah witches‟ broom (16SrVIII-A) Cacopsylla pyri, C. pyricola Monofagna Evropa Pear decline (16SrX-C) 1.1.2. Veliĉina i osobine genoma fitoplazmi Uz pomoć PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis-elektroforeza u pulsirajućem polju jednosmerne struje) metode odreĎena je veličina genoma kod oko 70 različitih fitoplazmi i odreĎene su fizičke mape hromozoma. Najmanji genom ima ‟Candidatus Phytoplasma cynodontis‟ i on iznosi 530 kb, dok najveći genom ima soj Stolbur fitoplazme sa paradajza i on iznosi 1350 kb, što ga čini otprilike 2.5 puta većim. Velike razlike u veličini genoma su uočene čak i kod evolutivno bliskih sojeva, pa tako Rape virescence fitoplazma i Hydrangea phylody fitoplazma (iz Belgije) koje pripadaju podgrupi 16SrI-B i malo se razlikuju u svojim biološkim karakteristikama, imaju genome veličina 1130 kb, odnosno 660 kb (Marcone i sar., 1999). Ova različita veličina genoma kod fitoplazmi se ne pripisuje različitom stepenu reduktivne evolucije već količini dupliranih gena i redundanciji (Firrao i sar., 2007). Podatak koji ovo potvrĎuje je da je procenjeno da 18% genoma Onion Yellows (OY) fitoplazme čine multipne kopije samo pet gena (Oshima i sar., 2004). Minimalna veličina genoma čini fitoplazme najjednostavnijom prirodnom do sada poznatom samo-replikujućom ţivotnom formom koja je na granici izmeĎu ţivog ćelijskog organizma i virusa, a to što imaju domaćine koji su iz dva carstva, nameće pitanje ograničenja brzine njihove evolucije (Christensen i sar., 2005). Mitrović UVOD 7 Do sada su u celosti sekvencirana četiri genoma fitoplazmi. Prva dva sekvencirana su članovi ‟Ca. P. asteris‟ taksona i to su soj OY-M koji spada u 16SrI-B podgrupu (Oshima i sar., 2004) i soj AYWB koji spada u 16SrI-A podgrupu (Bai i sar., 2006). Potom su 2008. godine objavljena i druga dva genoma, ‟Ca. P. australiense‟ (Tran-Nguyen i sar., 2008) i ‟Ca. P. mali‟ (Kube i sar., 2008). Uporednom analizom sva četiri genoma moguće je proceniti na koji način funkcioniše metabolizam fitoplazmi i u kom smeru su se fitoplazme kretale tokom njihove reduktivne evolucije (Kube i sar., 2012). Njima filogenetski najsrodnija je Acholeplasma laidlawii čiji je genom takoĎe sekvenciran u celosti (Lazarev i sar., 2011). Uporedni prikaz osnovnih podataka o graĎi genoma fitoplazmi i A. laidlawii dat je u Tabeli 2 (Kube i sar., 2012). Tabela 2. Opšti pregled četiri genoma fitoplazmi i Acholeplasma laidlawii sekvenciranih u celosti (Kube i sar., 2012) ’Ca. P. asteris’ soj OY-M ’Ca. P. asteris’ soj AYWB ’Ca. P. australiense’ soj Rp-A ’Ca. P. mali’ soj AT Acholeplasma laidlawii soj PG-8A Organizacija hromozoma Kruţni Kruţni Kruţni Linearni Kruţni Veliĉina hromozoma 853 092 706 569 879 959 601 943 1 496 992 G+C sadrţaj (%) 27.76 26.89 27.42 21.39 31.93 G+C % protein- kodirajućih gena 29.09 28.54 28.72 22.58 32.23 Broj protein- kodirajućih gena 1,2 752 776 684(155) 481(16) 1 380(11) Protein-kodirajući geni (%)1 73.1 73.7 64.1 76.3 90.7 Srednja veliĉina ORF-a 829 776 825 955 984 rRNK operoni 2 2 2 2 2 tRNK 32 31 35 32 34 Pristupni broj AP006628.2 CP000061.1 AM422018.1 CU469464.1 CP000896.1 Broj elemenata sliĉnih plazmidima 2 4 1 0 / 1 - bez pseudo gena; 2 - broj anotiranih pseudo gena je dat u zagradama Iz Tabele 2 se moţe videti da se fitoplazme razlikuju od A. laidlawii po manjoj veličini genoma, manjem broju gena koji kodiraju proteine i nešto niţem G+C procentu. Ipak, ne treba zaboraviti na činjenicu da su ovde poreĎene samo fitoplazme iz tri grupe fitoplazmi, tako da je veliki broj ostalih grupa fitoplazmi izostavljen iz ove analize. Mitrović UVOD 8 1.1.3. Klasifikacija Kao bakterije bez ćelijskog zida, fitoplazme se zajedno sa mikoplazmama, spiroplazmama i ostalim parazitima ţivotinja, svrstavaju u klasu Mollicutes. Jedinstvena klasifikacija klase Mollicutes na nivou razdela gde pripada, još uvek nije opšte prihvaćena na svetskom nivou. Na osnovu sekvenci 16S rRNK jasno je da postoji tesna veza izmeĎu molikuta i odreĎenih gram pozitivnih bakterija razdela Firmicutes, ali ipak na osnovu ostalih jedinstvenih karakteristika pripadnika klase Mollicutes, Murray je 1984. godine predloţio da se do tada podrazdeo Tenericutes, koji je bio u okviru razdela Firmicutes, podigne na nivo posebnog razdela. Ovaj predlog je prihvaćen 1988. godine od strane MeĎunarodnog komiteta za sistematiku bakterija-potkomitet za taksonomiju Mollicutes. MeĎutim, nisu svi prihvatili ovu odluku tako da u izdanjima knjige Prokarioti i izdanju TOBA (Taxonomic Outline of Bacteria and Archea) koji se zasniva samo na filogeniji gena za 16S rRNK, molikute se objašnjavaju kao Firmicutes sa niskim G+C sadrţajem i svrstavaju se u razdeo Firmicutes (Garrity i sar., 2007). Paradoks je da u najskorijem izdanju Ribosomal Database Project-a Tenericutes postoji kao poseban razdeo (Cole i sar., 2009). U Bergy-jevom priručniku klasa Mollicutes je odvojena u razdeo Tenericutes na osnovu njihovog nedostatka čvrstog ćelijskog zida i analize snaţno podrţanih alternativnih univerzalnih filogenetskih markera, kao što su subjedinica B RNK polimeraze, šaperon GroEL, nekoliko različitih amino-acil tRNK sintetaza kao i ATP- azna subjedinica F0F1 (Ludwig i Schleifer, 2005; Ludwig i sar., 2009; Brown, 2012). Kao dokaz da su fitoplazme deo klase Mollicutes, i da kao i ostali članovi ove klase imaju genom sa veoma niskim procentom G+C parova, pomoću metode centrifugiranja uzoraka sa cezijum hloridom (CsCl) izolovana je DNK fitoplazmi i procenjeno je da se procenat G+C parova genoma fitoplazmi kreće od 23% do 26.2% (Kirkpatrick i sar., 1987; Kollar i Seemüller, 1989). Dugo vremena se nije znalo tačno mesto fitoplazmi u okviru klase Mollicutes, pa su bile svrstavane kao poseban član ove klase bez odreĎenog taksonomskog nivoa. Tokom vremena je eksperimentima pokazano da je membrana fitoplazmi slična membrani aholeplazmi koje nemaju potrebu za sterolom, a ne onoj kod mikoplazmi kojima je sterol neophodan kao što se ranije mislilo (Lim i Sears, 1991, 1992; Lim i Mitrović UVOD 9 sar., 1992). TakoĎe je utvrĎeno da ove molikute koriste UGA kao STOP kodon, a ne kao kodon za ugradnju triptofana kao što je slučaj kod rodova Spiroplasma i Mycoplasma. Nakon intenzivnih istraţivanja došlo se do zaključka da su fitoplazme filogenetski najbliţe rodu Acholeplasma sa kojim i dele neke od karakteristika (UGA kao STOP kodon, nedostatak holesterola u membrani) i da su njihovi preci verovatno bili prokarioti slični aholeplazmama, koji su naseljavali insekte. Spekuliše se da su se fitoplazme od aholeplazmi odvojile u vreme pojave angiospermi – pre oko 140 do 210 miliona godina (Aoki i sar., 2004). Maniloff (2000) je čak, koristeći sekvencu 16S rDNK kao molekularni sat, procenio da tačno vreme odvajanja iznosi pre 180 miliona godina. Iako je, takoĎe, filogenetskom analizom sekvenci 16S rDNK proučavanih aholeplazmi pokazano da one formiraju dve grane, od kojih je jedna sestrinska linija fitoplazmi, fitoplazmama je zbog nemogućnosti gajenja na hranljivim podlogama dodeljena familija Incertae sedis (IRPCM, 2004). Zbog toga se red Acholeplasmatales sastoji od dve familije Acholeplasmataceae i Incertae sedis (Shema 1). Shema 1. Klasifikacija fitoplazmi (Brown i sar., 2012, dopunjeno) Mitrović UVOD 10 Sa evolucione tačke gledišta, preci klase Mollicutes su se rano podelili na dve grane nazvane AAA (Asteroleplasma, Acholeplasma i Anaeroplasma) i SEM (Spiroplasma, Entomoplasma i Mycoplasma) i obe su podlegle nezavisnoj redukciji veličine genoma. Fitoplazme su tokom evolucije od pretka iz grupe Bacillus/Clostridium u procesu redukcije izgubile tri četvrtine i više svog genoma. Pretpostavlja se da im se genom smanjio na veličinu 500-700 kb, a potom je u nekim sojevima došlo do duplikacija, pa se genom povećao na 1000-1400 kb. Tokom reduktivne evolucije fitoplazme su izgubile mnoge gene vaţne za funkcionisanje osnovnog (bazalnog) metabolizma, ali su zadrţale set gena neophodan za opstanak u floemu i kolonizaciju tela vektora (Firrao i sar., 2007). 1.1.4. 'Candidatus Phytoplasma' rod i podela na 16Sr grupe Pošto fitoplazme nije moguće gajiti in vitro na hranljivim podlogama, one su do skoro klasifikovane isključivo na osnovu simptoma koje izazivaju, biljaka domaćina koje parazitiraju, kao i vektora koji ih prenose (Freitag, 1964; Golino i sar., 1989; Errampalli i sar., 1991). MeĎutim, u novije vreme, sa razvojem molekularnih metoda, njihova klasifikacija se zasniva prvenstveno na RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - analiza polimorfizma duţine restrikcionih fragmenata) analizi PCR-om (Polymerase Chain Reaction - lančana reakcija polimeraze) umnoţenog gena za ribozomalnu ribonukleinsku kiselinu (16S rRNK). TakoĎe su izučavani i korišćeni drugi delovi genoma kao što su to secY gen, geni ribozomalnih proteina (rpl22, rpl15, rps3, rps19) i gen faktora elongacije (tuf gen) (Lee i sar., 1998b; Marcone i sar., 2000; Lee i sar., 2004a, 2004b, 2006). Naime, razvojem monoklonalnih i poliklonalnih antitela, kao i kloniranih DNK proba tokom 80-tih i 90-tih godina prošlog veka, fitoplazme su prvenstveno odvojene u nekoliko genetički različitih klastera (Kirkpatrick i sar., 1987; Chen i sar., 1994; Ko i Lin, 1994). Na osnovu filogenetske studije sekvenci 16S rRNK i ribozomalnog proteina Lim i Sears (1989, 1992) su po prvi put predstavili fitoplazmu ţutila astera kao novog člana klase Mollicutes. UtvrĎena filogenija je otvorila mogućnost identifikacije i klasifikacije ovih biljnih patogena na osnovu RFLP analize PCR-om umnoţenog gena za 16S rRNK uz pomoć većeg broja restrikcionih enzima (Lee i sar., 1993; Schneider i Mitrović UVOD 11 sar., 1993). Na osnovu opširne RFLP analize 16S rDNK i kombinacijama profila dobijenih sa 17 restrikcionih enzima, fitoplazme su odvojene prvenstveno u 10 grupa i 15 podgrupa (Lee i sar., 1993) da bi vremenom taj broj rastao (Lee i sar., 1998b, 2000). Razvojem servera iPhyClassifier koji na osnovu unete sekvence 16S rDNK pravi virtuelne RFLP profile, uporeĎuje ih sa svojom bazom podataka i dodeljuje odreĎenu grupu i podgrupu, fitoplazme su danas podeljene u 32 grupe i 114 podgrupa (Wei i sar., 2008; Zhao i sar., 2009). MeĎutim, ni ovaj broj nije konačan jer se još uvek objavljuju novi radovi u kojima su prikazane nove grupe ili podgrupe fitoplazmi. Nova podgrupa se dodeljuje nepoznatom soju fitoplazme ako on poseduje odreĎeni broj restrikcionih mesta različitih od svih do sada opisanih sojeva date grupe. Osnova ovog sistema leţi u visoko konzervativnoj prirodi 16S rDNK tako da su dizajnirani univerzalni prajmeri koji mogu umnoţiti ovaj region kod bilo koje fitoplazme iz bilo koje biljke ili vektora (Lee i sar., 2010). MeĎutim, za precizniju diferencijaciju srodnih ali različitih sojeva fitoplazmi, kao pripadnika različitih podgrupa unutar većih grupa, korišćeni su manje konzervativni geni, kao što je na primer gen za ribozomalni protein (Gundersen i sar., 1994a; Yoshikada i sar., 1994). Tabela 3. Pojedine 16Sr grupe i do sada opisane/potencijalne ‟Candidatus Phytoplasma‟ vrste (Zhao i sar., 2010, dopunjeno) Ime 16Sr grupe Trivijalni naziv grupe Takson Broj podgrupa 16SrI Aster yellows grupa 'Ca. Phytoplasma asteris' 'Ca. Phytoplasma lycopersici' 12 16SrII Peanut witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma aurantifolia' 'Ca. Phytoplasma australasiae' 12 16SrIII X-disease grupa 'Ca. Phytoplasma pruni' * 20 16SrIV Coconut lethal yellowing grupa 'Ca. Phytoplasma palmae' * 'Ca. Phytoplasma cocostanzaniae' * 7 16SrV Elm yellows grupa 'Ca. Phytoplasma ziziphi' 'Ca. Phytoplasma vitis' * 'Ca. Phytoplasma ulmi' 'Ca. Phytoplasma balanitae' „Ca. Phytoplasma rubi‟ 8 16SrVI Clover proliferation grupa 'Ca. Phytoplasma trifolii' 'Ca. Phytoplasma sudamericanum' 9 16SrVII Ash yellows grupa 'Ca. Phytoplasma fraxini' 3 16SrVIII Loofah witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma luffae' * 1 16SrIX Pigeon pea witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma phoenicium' 4 Mitrović UVOD 12 Tabela 3 (nastavak). Pojedine 16Sr grupe i do sada opisane/potencijalne ‟Candidatus Phytoplasma‟ vrste (Zhao i sar., 2010, dopunjeno) Ime 16Sr grupe Trivijalni naziv grupe Takson Broj podgrupa 16SrX Apple proliferation grupa 'Ca. Phytopalsma mali' 'Ca. Phytoplasma pyri' 'Ca. Phytoplasma prunorum' 'Ca. Phytoplasma spartii' 'Ca. Phytoplasma allocasuarinae' 6 16SrXI Rice yellow dwarf grupa 'Ca. Phytopalsma oryzae' 3 16SrXII Stolbur grupa 'Ca. Phytoplasma solani' * 'Ca. Phytoplasma australiense' 'Ca. Phytoplasma japonicum' 'Ca. Phytoplasma fragariae' 'Ca. Phytoplasma convolvuli' 8 16SrXIII Mexican periwinkle virescence grupa Nedefinisana 2 16SrXIV Bermudagrass white leaf grupa 'Ca. Phytoplasma cynodontis' 1 16SrXV Hibiscus witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma brasiliense' 1 16SrXVI Sugarcane yellow leaf syndrome grupa 'Ca. Phytoplasma graminis‟ 1 16SrXVII Papaya bunchy top grupa 'Ca. Phytoplasma caricae‟ 1 16SrXVIII American potato purple top wilt grupa 'Ca. Phytoplasma americanum‟ 1 16SrXIX Japanese chestnut witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma castaneae' 1 16SrXX Buckthorn witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma rhamnii' 1 16SrXXI Pine shoot proliferation grupa 'Ca. Phytoplasma pini' 1 16SrXXII Nigerian coconut lethal decline (LDN) grupa 'Ca. Phytoplasma cocosnigeriae' * 1 16SrXXIII Buckland Valley grapevine yellows grupa Nedefinisana 1 16SrXXIV Sorhum bunchy shoot grupa Nedefinisana 1 16SrXXV Weeping tea tree witches‟- broom grupa Nedefinisana 1 16SrXXVI Mauritius sugarcane yellows D3T1 grupa Nedefinisana 1 16SrXXVII Mauritius sugarcane yellows D3T2 grupa Nedefinisana 1 16SrXXVIII Havana derbid phytoplasma grupa Nedefinisana 1 16SrXXIX Cassia witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma omanense' 1 16SrXXX Salt cedar witches‟- broom grupa 'Ca. Phytoplasma tamaricis' 1 16SrXXXI Soybean stunt grupa „Ca. Phytoplasma costaricanum‟ 1 16SrXXXII Madagascar periwinkle virescence and phyllody grupa 'Ca. Phytoplasma malaysianum' 1 *- potencijalne ‟Candidatus Phytoplasma‟ vrste Mitrović UVOD 13 Pošto se u sistematici bakterija koriste geni za rRNK kao validni geni koji mogu predstaviti pravu genealogiju organizma (Woese, 2000), tako je i podela fitoplazmi na 16Sr grupe na osnovu RFLP profila u skladu sa filogenetskom analizom sekvenci 16S rDNK (Lee i sar., 1998b). Zbog toga su Gundersen i sar. (1994b) predloţili da svaka grupa treba da predstavlja najmanje jednu vrstu fitoplazmi. Fenotipske karakteristike bazirane na fiziološkim i biohemijskim osobinama, koje se koriste u klasifikaciji kultivisanih mikroorganizama, nisu uključene u klasifikaciju fitoplazmi zbog nemogućnosti njihovog gajenja na hranljivim podlogama. Da bi rešili ovu prepreku, „International Research Program for Comparative Mycoplasmology“ (IRPCM), Phytoplasma/Spiroplasma radni tim je u dogovoru sa „International Committee of Systematic Bacteriology Subcommittee for the Taxonomy of Mollicutes“ 2004. godine usvojio taksonomsko pravilo za nekultivisane mikroorganizme i predloţio novi rod 'Candidatus (Ca.) Phytoplasma' (IRPCM, 2004). Da bi izbegao nomenklaturnu konfuziju, ovaj radni tim je doneo odreĎena pravila po kojima opis nove 'Ca. Phytoplasma' vrste treba da se odnosi na jednu jedinstvenu sekvencu gena za 16S rRNK duţu od 1200 bp i da ima manje od 97.5% sličnosti sa bilo kojom prethodno opisanom 'Ca. Phytoplasma' vrstom, osim ako opisivana fitoplazma jasno ne predstavlja novu ekološki odvojenu populaciju (IRPCM, 2004; Firrao i sar., 2005). Nova vrsta bi trebalo takoĎe pored sekvence jedinstvene za fitoplazme (koja se nalazi na mestu jednog od univerzalnih prajmera) da poseduje još minimum jednu jedinstvenu sekvencu karakterističnu samo za tu vrstu, a naziv nove vrste moţe biti dat u odnosu na mesto ili domaćina u kom je prvi put detektovana. Soj čija sekvenca 16S rDNK je posluţila za opisivanje te vrste naziva se „referentni soj“ dok se svi ostali sojevi, koji se manje ili više razlikuju od referentnog, nazivaju „srodnim sojevima“. Do sada je zvanično opisano 34 'Ca. Phytoplasma' vrsta a postoji još 15 potencijalnih vrsta kod kojih se sekvenca 16S rDNK razlikuje više od 97.5% od svih prethodno opisanih ili poseduju jedinstvene biološke karakteristike, ali još uvek nisu zvanično opisane (IRPCM, 2004; Zhao i sar., 2010, dopunjeno). U Tabeli 3 je dat pregled postojećih 16Sr grupa i podgrupa kao i njihova povezanost i broj 'Ca. Phytoplasma' vrsta (Zhao i sar., 2010, dopunjeno). Ipak, dobro je poznata činjenica da je filogenija koja se zasniva na samo jednom visoko konzervativnom genu, kao što je 16S rDNK, veoma ograničena, pogotovo kada Mitrović UVOD 14 je u pitanju definisanje podgrupa i razlika u sojevima unutar podgrupa, tako da se novi pristup konstruisanja filogenetskih stabala kombinovanjem sekvenci različitih gena, koji se sada primenjuje za većinu drugih organizama, pokazao kao mnogo efikasniji i informativniji (Hodgetts i Dickinson, 2010). 1.1.5. Detekcija fitoplazmi Od otkrića fitoplazmi pa do danas, naučnici su koristili različite tehnike u njihovoj detekciji. Posmatranje tanjih ili debljih preseka biljnih delova obolelih biljaka pod elektronskim mikroskopom, bojenje posebnim DNK-specifičnim bojama, serološke probe sa antigenima specifičnim za fitoplazme su neke od prvih tehnika koje su bile razvijene za detekciju fitoplazmi (Schneider, 1977; Braun i Sinclair, 1979; Hiruki i Rocha, 1986; D'Agostino, 1991; Milne i sar., 1995; Musetti i sar., 2002). Nakon uspešnog kloniranja molekula DNK 80-tih godina prošlog veka (Kirkpatrick i sar., 1987) tehnike koje su se zasnivale na DNK probama, kao što su nasumično kloniranje DNK ili komplementarne RNK, su široko razvijane i korišćene (Davis i sar., 1988; Bertaccini i sar., 1990, 1993; Kuan i Su, 1998). Sa razvojem molekularnih metoda i sakupljanjem novih znanja o fitoplazmama, ustanovljeni su protokoli za detekciju fitoplazmi korišćenjem PCR metode koja se pokazala kao najuspešnija i koja se i danas koristi (Chen i sar., 1993; Bertin i sar., 2004). U cilju definisanja evolutivnih odnosa meĎu različitim sojevima fitoplazmi sekvenciran je ribozomalni operon (Lim i Sears, 1989). Potom su identifikovani prajmeri na različitim pozicijama ovog operona sa ciljem umnoţavanja fragmenata specifičnih za fitoplazme kod zaraţenih biljaka i vektora (Lee i sar., 1993; Gundersen i sar., 1994b; Gundersen i Lee, 1996). PoreĎenjem sekvenci 16S rRNK gena kao i 16S-23S rDNK intergenskog regiona dizajnirani su prajmeri specifični za odreĎene grupe fitoplazmi da bi se omogućila brţa karakterizacija patogena (Rhode i sar., 1993; Firrao i sar., 1994; Lee i sar., 1994; Smart i sar., 1996). Geni ribozomalnih proteina su takoĎe bili meĎu prvima na osnovu kojih su dizajnirani univerzalni i za grupu specifični prajmeri (Lim i Sears, 1991; Jomantiene i sar., 1998; Lee i sar., 1998b; Bertaccini i Martini, 1999). Osim ribozomalnog operona i gena za ribozomalne proteine, naučnici su sekvencionirali i druge gene kao što su tuf gen, gen koji kodira Mitrović UVOD 15 enzim nitroreduktazu, gen za girazu i dizajnirali su prajmere za njihovo umnoţavanje (Schneider i sar., 1997; Jarausch i sar., 1998; Chuang i Lin, 2000). Najveće ograničenje još brţeg razvoja savremenih molekularnih metoda je izolacija adekvatne količine DNK fitoplazmi iz biljnog materijala zbog njihove neravnomerne distribucije u biljci, kao i njihove ukupne količine. Zbog toga se prilikom ekstrakcije pristupa metodama obogaćivanja DNK (jedna od njih je samo ekstrakcija DNK iz nerava zeljastih delova ili floema odrvenelih delova) (Firrao i sar., 2007). Poslednjih godina najčešće korišćena metoda za detekciju fitoplazmi je PCR/nested-PCR/RFLP metoda konzervativnog gena za 16S rRNK, koja se pokazala kao veoma brza i pouzdana metoda primenjiva na velikom broju uzoraka (Lee i sar., 1998b; Bertaccini, 2007). Zbog razlika u osetljivosti biljaka domaćina i vektora na različite fitoplazme, selekcioni pritisak nametnut od strane insekta i/ili biljke domaćina je tokom vremena olakšao evoluciju i/ili izolaciju specifičnih populaciija fitoplazmi. Nedostatak detekcije i karakterizacije fitoplazmi zasnovan na 16S rDNK je što on nije u mogućnosti da razlikuje srodne ali ekološki različite sojeve, tako da je neophodna upotreba dodatnih molekularnih markera u rutinskoj klasifikaciji fitoplazmi. Višegenski sistem klasifikacije i identifikacije fitoplazmi, koji ulazi u upotrebu poslednjih godina, trebalo bi da obezbedi nove molekularne kriterijume za bolje razdvajanje vrsta i sojeva fitoplazmi (Lee i sar., 2010). Precizna identifikacija i karakterizacija fitoplazmi povezanih sa biljkom domaćinom i vektorom je vaţna zbog daljeg izučavanja epidemiologije bolesti izazvanih fitoplazmama kao i ekologije fitoplazmi. Znanje o ekologiji i epidemiologiji fitoplazmi ima vaţnu ulogu u daljem izučavanju mogućih mera zaštite i sprečavanju novih epidemija bolesti koje one prouzrokuju (Lee i sar., 1998a). 1.2. OPŠTE OSOBINE I ZNAĈAJ groEL, tuf, rp I secY GENA 1.2.1. Molekularni šaperoni i gen za veliku subjedinicu šaperonina (groEL gen) Savijanje proteina u smislu zauzimanja krajnje trodimenzionalne (3D) konformacije u in vitro uslovima je proces koji se obavlja sam po sebi jer je informacija o 3D strukturi proteina sadrţana u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci. Sa druge Mitrović UVOD 16 strane, savijanje proteina u in vivo uslovima predstavlja biološki problem iz više razloga. Naime, zbog prirode samog procesa translacije svi bočni ostaci koji treba da interaguju da bi došlo do uspostavljanja krajnje 3D strukture proteina, nisu prisutni sve dok ne doĎe do terminacije procesa translacije, pa samim tim i savijanje proteina nije moguće sve do terminacije translacije. TakoĎe, hidrofobni regioni, koji se inače u 3D strukturi nalaze sakriveni u unutrašnjosti proteina, tokom translacije nisu zaštićeni od uticaja faktora spoljašnje sredine, što povećava tendenciju stvaranja nepoţeljnih veza. Još jednu prepreku pravilnom savijanju predstavlja priroda citoplazme koja je bogata raznim jedinjenjima uključujući i proteine, a opšte je poznato da visoka koncentracija proteina značajno povećava stvaranje meĎumolekularnih veza izmeĎu nesavijenih proteina i ostalih prisutnih u njihovoj okolini. Zbog svega ovoga proces savijanja proteina je u ćeliji potpomognut proteinima koji se nazivaju molekularni pratioci (šaperoni) (Anfinsen, 1973; Ellis, 1990). Molekularni šaperoni su grupa strukturno različitih proteina koji imaju zajedničku sposobnost interagovanja sa drugim proteinima koji se nalaze u nenativnom obliku (koji još nisu zauzeli 3D konformaciju). Oni imaju esencijalnu ulogu u pravilnom savijanju proteina jer prepoznaju nenativne proteine sa kojima se selektivno i nekovalentno vezuju stvarajući stabilne komplekse i samim tim sprečavajući njihovo pogrešno savijanje kao i agregaciju tokom savijanja. Vaţno je istaći da molekularni šaperoni samo prolazno interaguju sa svojim supstratima i da nisu prisutni u njihovoj krajnjoj 3D konformaciji (Ellis, 1990). Pomaganje pravilnog savijanja drugih proteina moţe biti postignuto ili putem aktivnog ATP zavisnog mehanizma ili putem pasivnog ATP nezavisnog mehanizma. Pored ove osnovne uloge, molekularni šaperoni su uključeni u mnoge procese u ćeliji kao što su metabolizam, rast, diferencijacija i programirana ćelijska smrt putem savijanja proteina odgovornih za ove procese, a potpomaţu i procese transporta i degradacije drugih proteina unutar ćelije. Oni takoĎe utiču i na aktivaciju enzima i receptora. Zbog svega ovoga molekularni šaperoni su sveprisutni proteini i u ćeliji ih ima u izobilju (Ranson i sar., 1998; Ranford i sar., 2000). Mnogi od molekularnih šaperona su prvenstveno bili identifikovani kao proteini toplotnog šoka pošto se njihova koncentracija značajno povećava u ćeliji nakon stresa izazvanog povišenom temperaturom. Pošto su proteini toplotnog šoka kategorisani Mitrović UVOD 17 prema njihovoj molekulskoj masi izraţenoj u kDa (npr. Hsp100, Hsp90, Hsp60, Hsp10), stoga su mnogi molekularni šaperoni poznatiji po ovoj nomenklaturi (Lee i Tssai, 2005). Proteini toplotnog stresa (Hsps, heat-shock proteins) spadaju u grupu visoko konzervativnih proteina, a glavna fiziološka uloga im je odrţavanje homeostaze proteina. U većini ćelija ovi proteini čine 1-2% ukupnih proteina čak i pre izloţenosti ćelije nekom tipu stresa, što govori o vaţnoj ulozi ovih proteina u biologiji i fiziologiji ćelija. Njihova uloga se prvenstveno odnosi na regulisanje savijanja i odvijanja drugih proteina. Pošto su ovi proteini prvi put identifikovani na osnovu njihove povišene sinteze nakon izloţenosti ćelije visokim temperaturama, tako su i dobili ime - proteini toplotnog stresa. Kasnije je nedvosmisleno utvrĎeno da njihova sinteza moţe biti indukovana i u uslovima različitih vrsta stresa, a neki od ovih proteina se mogu detektovati u visokoj koncentraciji i u situacijama koje nisu stresne (Stephanou i Latchman, 2011). Odgovor ćelije na stres je evolutivno stari, sveprisutni i ključni mehanizam neophodan za preţivljavanje ćelije. Ova činjenica je sadrţana u konzervativnosti peptidne sekvence molekularnih šaperona kroz sve ţive organizme (Ranford i sar., 2000). Ova dvostruka uloga Hsp proteina, u normalnim ćelijama i ćelijama pod stresom, zahteva postojanje kompleksnih regulatornih procesa koji omogućavaju da doĎe do tačne ekspresije gena (Stephanou i Latchman, 2011). Do danas je 15 različitih grupa proteina klasifikovano kao molekularni šaperoni (Tabela 4). Mnogi istraţivači širom sveta su se bavili, i danas se bave, proučavanjem mehanizama delovanja ovih proteina, ali je jedna podgrupa dobila najveću paţnju a to su šaperonini. Šaperonini su podeljeni u dve familije proteina - familije šaperonina 10 i 60 i jedan od prvih identifikovanih molekularnih šaperona je protein mase 60 kDa koji je nazvan šaperonin 60 (Cpn60). Ova podgrupa je posebno privukla paţnju na sebe zbog otkrića da imaju dodatno svojstvo a to je da deluju i kao signalni molekuli izmeĎu susednih ćelija (Ranford i sar., 2000). Mitrović UVOD 18 Tabela 4. Do sada otkrivene familije šaperona i njihova uloga (Ranford i sar., 2000) Familija Naziv Uloga šaperona Šaperonin 10 Cpn10, Hsp10, ko-šaperonin, faktor rane trudnoće, GroES Ko-šaperonin šaperonina 60, učestvuje u sklapanju proteina vezanih za šaperonin 60 Mali proteini toplotnog šoka Hsps Raznovrsna klasa proteina; funkcija šaperona je nezavisna od ATP-a; vezuju nezavršene proteine Hsp40 DnaJ srodni proteini Ko-šaperoni koji regulišu aktivnost proteina Hsp70; neki mogu samostalno vezivati za sebe nezavršene proteine Šaperonin 60 Cpn60, Hsp60, Hsp65, GroEL ATP-zavisno sklapanje ili ponovo sklapanje pribliţno 15-30% ukupnih proteina ćelije Hsp70 Hsp70 Sprečava agregaciju rasklopljenih proteina; rastavlja multimerne proteinske komplekse; učestvuje u prenosu proteina; reguliše odgovor ćelije na toplotni šok Hsp90 Hsp90 Posebna uloga u regulisanju signalnog transdukcionog puta, preko delovanja na pojedine kinaze i steroidne receptore; mogućnost uobičajene aktivnosti šaperona Hsp100 Clp Rastavlja proteinske oligomere i agregate Hsp110 Hsp110 U visokom stepenu je homologan sa familijom Hsp70; malo se zna o njegovoj ulozi 1.2.1.1. Šaperonini Šaperonini su najbolje okarakterisana i izučena grupa molekularnih šaperona a uključuju potklase GroE i TCP-1 (T-kompleks polipeptid 1) za koje je karakteristično da su to kompleksi sastavljeni iz dva prstena koji vezuju odvijene proteine u svojoj centralnoj šupljini i posreduju u njihovom pravilnom savijanju putem višestrukih procesa ATP-zavisnog otpuštanja i ponovnog vezivanja (Hartl i Martin, 1995). Potklasu GroE (šaperonini Grupe I) čine šaperonin 60 (Cpn60, Hsp60, GroEL) i njegov kofaktor šaperonin 10 (Cpn10, Hsp10, GroES). Šaperonini ove potklase se mogu naći kod eubakterija, u mitohondrijama i hloroplastima, za razliku od TCP-1 šaperonina (šaperonini Grupe II) koji su prisutni kod arhebakterija i u citosolu eukariota. Razlike u strukturi proteina izmeĎu ove dve potklase su u regionu vezivanja proteina supstrata (Ranson i sar., 1998). Do danas najintenzivnije proučavan molekularni šaperon je GroEL koji je zajedno sa GroES proteinom, neophodan za pravilno savijanje mnogih proteina u ćeliji, bilo pod normalnim ili stresnim uslovima. Delecija groE operona kod Escherichia coli je letalna za bakteriju, a postojanje oba proteina, i GroEL i GroES, je esencijalno za preţivljavanje ćelije u bilo kojim uslovima spoljašnje sredine. Istraţivanjima je utvrĎeno da pod normalnim uslovima za rast ćelije, GroEL pomaţe savijanje 10-15% proteina pri čemu se ovaj procenat povećava i do 30% u uslovima toplotnog stresa (Horwich i sar., 1993; Ranford i sar., 2000). Mitrović UVOD 19 Šaperonin 60 je GroEL oligomer i ima oblik šupljeg cilindra (bureta, kaveza) koji je sastavljen od dva heptamerna prstena meĎusobno okrenuta „leĎima“, odnosno donji prsten je okrenut kao u ogledalu u odnosu na gornji, pri čemu su prstenovi meĎusobno povezani preko dva kontaktna mesta iz oba prstena. Ovakvom strukturom se stvara velika centralna šupljina u koju ulazi supstrat i sa kojom uspostavlja kontakt putem hidrofobnih veza (Slika 3). Da bi mogao da vrši svoju funkciju, GroEL oligomer se povezuje sa GroES oligomerom, jednostrukim heptamernim prstenom oblika kupole (Xu i sar., 1997). Slika 3. Izgled GroEL oligomera posmatran pod elektronskim mikroskopom. Bar je duţine 50 Å (Katayama i sar., 2008) Istraţivanje kristalne strukture GroEL subjedinica je pokazalo da je svaka subjedinica podeljena u tri jasno odvojena domena (Shema 2): 1) ekvatorijalni domen - sastavljen od ostataka aminokiselina 6-133 i 409-523; sadrţi mesto za vezivanje ATP-a kao i kontaktna mesta za meĎusobno vezivanje prstenova; 2) apikalni domen - sastavljen od ostataka aminokiselina 191-376; u njemu se nalaze mesta vezivanja supstrata i vezivanja GroES subjedinice; 3) intermedijerni domen - sastavljen od ostataka aminokiselina 134-190 i 377-408; povezuje prethodna dva domena. Intermedijarni domen deluje kao zglob jer u njemu dolazi do konformacionih promena kada se ATP veţe za ekvatorijalni domen, dozvoljavajući tako alosteričke pokrete apikalnog domena (Hartl i Martin, 1995; Ranford i sar., 2000). Mitrović UVOD 20 Shema 2. Prikaz domena, mesta vezivanja supstrata, kontaktnih mesta i mesta vezivanja ATP-a jedne subjedinice GroEL proteina (Ranson i sar., 1998) Kombinacijom kinetičkih i kristalografskih studija, kao i uz pomoć elektro krio mikroskopskih snimaka različitih stanja intermedijernog domena, otkriven je niz rotacija zgloba koje reorijentišu mesta vezivanja polipeptida i dovode do velikih konformacionih promena u šaperoninskom kompleksu (Ranson i sar., 1998). Naime, novonastala promena zgloba dovodi do promene stanja površine supstrata, kojom se on vezuje za GroEL, a te promene podrazumevaju promenu stanja iz hidrofobnog u hidrofilno stanje i obrnuto (Ranford i sar., 2000). Oligomer GroEL se moţe naći u dva stanja – T stanje u kom ima visok afinitet za vezivanje proteina supstrata i nizak afinitet za vezivanje molekula ATP-a i R stanje u kome je situacija obrnuta. U srţi mehanizma savijanja proteina leţi jednostavna promena stanja vezivanja supstrata za GroEL iz snaţno vezanog u stanje oslobaĎanja pri čemu vezivanje ATP-a za GroEL dovodi do oslobaĎanja supstrata. Nakon njegovog oslobaĎanja, intermolekularne interakcije izmeĎu izloţenih hidrofobnih mesta supstrata i mesta vezivanja supstrata na GroEL proteinu, mogu biti zamenjene intramolekularnim interakcijama, tj. moţe doći do ukopavanja hidrofobnih mesta unutar supstrata i pravilnog savijanja proteina ili daljeg pogrešnog savijanja. Ako se supstrat savije pravilno, on se neće ponovo vezati za šaperonin i uslediće hidroliza ATP-a koja će Mitrović UVOD 21 vratiti ceo sistem u stanje T spremno za vezivanje novog supstrata. Ako doĎe do pogrešnog savijanja supstrata, ciklus se ponavlja sve dok se protein ne savije pravilno i ne oslobodi od GroEL oligomera (Ranson i sar., 1998). 1.2.1.2. Mehanizam delovanja GroEL-GroES kompleksa na savijanje proteina supstrata U pogledu konformacionih promena zgloba utvrĎeno je da kada je površina supstrata u hidrofobnom stanju, on moţe da se veţe za GroEL i tako dolazi do sprečavanja stvaranja pogrešnih veza sa ostalim proteinima pri čemu ove veze na kraju mogu dovesti do pogrešnog savijanja supstrata. Kada se ATP veţe za GroEL, zglob se otvori, dolazi do promene površine supstrata i ona postaje hidrofilna, a protein se otpušta. TakoĎe kada je ATP vezan za GroEL, GroES se vezuje za njega formirajući poklopac na vrhu jedne strane GroEL oligomera prouzrokujući tako povećavanje centralne šupljine čime se potpomaţe proces savijanja proteina supstrata (Ranford i sar., 2000). Kofaktor GroES je takoĎe u obliku heptamernog prstena koji se vezuje za jedan kraj GroEL oligomera u prisustvu adenin nukleotida. Poseduje strukturu β cilindra i formira poklopac koji zatvara otvoren apikalni domen GroEL oligomera (Shema 3). Vezivanje GroES prstena je brzo u prisustvu ATP-a, a sporo u prisustvu ADP-a. Deo GroES nazvan pokretna petlja, koju čine aminokiseline 17-32, izduţuje se naniţe i spolja formirajući kontakt sa nekoliko hidrofobnih ostataka na GroEL-u na bivšim mestima vezivanja supstrata, koja su okrenuta ka vrhu apikalnog domena. U najvećem broju slučajeva jedan GroES prsten se vezuje za jedan kraj GroEL oligomera stvarajući tako negativan efekat na suprotni GroEL prsten smanjujući njegov afinitet za vezivanje drugog GroES prstena. Formiranje GroEL-GroES kompleksa dovodi do pomeranja na spolja apikalnog domena GroEL subjedinica prstena za koji je vezan GroES. Zbog ovog pomeranja dolazi do uvećavanja centralne šupljine ovog prstena, koja dostiţe visinu i širinu od 70 Å. Otvor suprotnog prstena se u isto vreme proširuje, ali u mnogo manjem stepenu. Na ovaj način vezivanjem GroES kape supstrat se oslobaĎa u unutrašnjost uvećane i zatvorene cis šupljine maksimalne veličine oko 8 nm. Najveći poznati protein supstrat koji koristi ovaj sistem je velika subjedinica bakterijskog Rubisco proteina Mitrović UVOD 22 veličine 52 kDa, pa je verovatno da je ovo gornja granica veličine supstrata odreĎena veličinom cis centralne šupljine GroEL oligomera. Izuzetak od ove gornje granice je GroES homolog bakteriofaga T4, Gp31, koji je neophodan za sklapanje proteina Gp23 veličine 56 kDa, a to je moguće zato što Gp31 ima duţu pokretnu petlju i širi unutrašnji prostor što dovodi do uvećavanja cis šupljine (Hartl i Martin, 1995; Ranson i sar., 1998). Vezivanjem GroES subjedinice suprotan trans prsten postaje bliţi. Hidroliza ATP-a i formiranje ADP/GroES vezanog stanja dovodi do rotacije trans ekvatorijalnog domena čime se „priteţe“ kontakt izmeĎu prstenova na mestu Ala-109. Posledica ovog pomeranja je prekidanje kontakata izmeĎu susednih trans ekvatorijalnih domena, što dovodi do proširenja celog trans prstena. Prošireni i nešto manje uvrnuti apikalni domeni trans prstena sada pruţaju novo akceptorsko stanje za supstrat (Ranson i sar., 2006). Akceptorsko stanje je otvorena trans šupljina GroEL-GroES-ADP kompleksa. Nakon jednog kruga vezivanja i hidrolize ATP-a oko polovina supstrata će završiti u cis šupljini gde je zaštićena od proteolize i agregacije (Ranson i sar., 1998). Odvijeni protein se vezuje za centralnu šupljinu GroEL prstena za koji nije vezan GroES poklopac. Ovo vezivanje supstrata pospešuje disocijaciju GroES poklopca vezanog za suprotan prsten tako što stimuliše hidrolizu ATP-a suprotnog prstena i uzrokujući preureĎivanje u GroEL-GroES kompleksu, koji olakšavaju disocijaciju snaţno vezanog ADP-a i GroES poklopca. Nakon vezivanja ATP-a, GroES se ponovo vezuje za onaj prsten GroEL oligomera za koji je vezan supstrat (Hartl i Martin, 1995; Ranson i sar, 2001). Predloţena su dva modela delovanja GroEL oligomera na savijanje proteina a takoĎe je i utvrĎeno da se u zavisnosti od supstrata oba modela dešavaju u realnosti. Prvi model pretpostavlja da supstrat interaguje sa GroEL hidrofobnim ostacima kroz mnogobrojne cikluse hidrolize ATP-a pri čemu dolazi do vezivanja i otpuštanja GroES poklopca. UtvrĎeno je da se dešava oko 2-5 ciklusa vezivanja i otpuštanja GroES subjedinice u minuti na temperaturi od 25°C. Ovim modelom se sugeriše da se nativno stanje proteina postiţe u ponovljenim procesima savijanja i strukturnih promena supstrata. U ovom modelu do savijanja proteina dolazi unutar šupljine GroEL oligomera. Suprotno ovom modelu, drugi model pretpostavlja da je osnovna funkcija Mitrović UVOD 23 GroEL oligomera da odvije nepravilno savijen intermedijerni stupanj supstrata i da ga potom izbaci u citoplazmu sa svakim krugom hidrolize ATP-a ostavljajući tako da se supstrat spontano sam od sebe savije. Ovim modelom do savijanja proteina dolazi preko niza skokova supstrata izmeĎu različitih GroEL molekula sve dok se ne postigne pravilno savijanje (Hartl i Martin, 1995; Mayhew i sar., 1996). Ceo proces savijanja proteina uz pomoć GroEL-GroES kompleksa se moţe prikazati u nekoliko koraka (Mayhew i sar., 1996): 1. Odvijeni polipeptid se unutar GroEL prstena koji je u trans konformacionom obliku inicijalno vezuje za GroEL. 2. Ovim se olakšava disocijacija GroES prstena vezanog za suprotni cis prsten. 3. GroES se ponovo vezuje zajedno sa ATP-om za bilo koji GroEL prsten. Zbog toga supstrat koji je vezan za cis prsten GroEL oligomera se premešta unutar GroEL šupljine i jedan njegov deo se savija u nativni oblik ili u stanje iz kog sledi pravilno savijanje. 4. Kooperativnom hidrolizom sedam ATP molekula iz cis prstena GroEL oligomera stabilizuje se vezivanje GroES poklopca. 5. Podstaknut hidrolizom ATP-a iz drugog prstena GroEL oligomera, GroES se potom disocira a savijen protein (ili protein u intermedijernom stanju iz kog sledi pravilno savijanje) izlazi iz GroEL kaveza. 6. Nekompletno ili pogrešno savijeni protein se ponovo snaţno vezuje što dovodi do njegovog odvijanja i strukturnog preureĎivanja. Ponovo vezivanje GroES poklopca pokreće još jedan krug procesa savijanja. Ovi ciklusi se nastavljaju kontinuirano sve dok se protein ne savije pravilno. Mitrović UVOD 24 Shema 3. Prikaz GroE kompleksa (Ranford i sar., 2000) Proučavanjem kristalne strukture oligomera, kao i uticaja različitih mutacija na mehanizam delovanja GroEL-GroES kompleksa, utvrĎeno je postojanje nekoliko aminokiselina (AK) na odreĎenim mestima u proteinu, neophodnih za pravilno funkcionisanje ovog kompleksa. Kristalna struktura GroEL oligomera je otkrila par sonih mostova koji povezuju subjedinice jednog prstena sa subjedinicama susednog suprotno orijentisanog prstena. Mutacije na ovim kontaktnim mestima (Arg-452 u Glu, Glu-461 u Ala, Ser-463 u Ala i Val-464 u Ala) sprečavaju asocijaciju prstenova i dovode do nastajanja SR (single ring) mutanata čiji se GroEL oligomer sastoji od samo jednog prstena. Ovi mutanti i dalje mogu da vezuju i da hidrolizuju ATP kao i da vezuju supstrat i GroES, ali ne mogu da otpuštaju GroES. U nedostatku alosteričkog signala vezivanjem ATP-a za drugi GroEL prsten, GroES ostaje snaţno vezan za GroEL. Ovim Mitrović UVOD 25 se objašnjava zašto GroEL ima dva prstena – oslobaĎanje GroES poklopca uz pomoć cis prstena je omogućeno nekim promenama u trans prstenu (Ranson i sar., 1998). Kristalna struktura GroEL-GroES-ADP kompleksa je otkrila neočekivanu inserciju Asp-398 u mesto vezivanja nukleotida putem rotacije intermedijarnog domena nadole. Mutant kod koga je Asp-398 zamenjen sa Ala moţe da vezuje ATP, ali ga hidrolizuje izuzetno sporo (poluvreme iznosi 20 minuta umesto 20 sekundi) (Ranson i sar., 1998). Kinetičke i stukturne studije GroEL mutanta Arg-197 u Ala su pomogle razjašnjavanju mehanizma oslobaĎanja supstrata i delovanje ATP-a. Ostaci aminokiseline Arg-197 se nalaze u apikalnom domenu i ona stvara soni most sa Glu- 386 koji se nalazi u intermedijernom domenu susedne subjedinice. Raskidanjem ovih sonih veza mutacijama, odnosno promenom AK na mestu 197, nastaje funkcionalni GroEL oligomer, ali sa nešto izmenjenim kinetičkim svojstvima. Ova promena kinetičkih osobina je odgovorna za vezivanje ATP-a za jedan, a potom i drugi prsten u odreĎenoj koncentraciji ATP-a (Ranson i sar., 1998). 1.2.1.3. Prouĉavanje šaperonina kod molikuta i drugih bakterija Mnogi autori su koristili groEL gen kao molekularni marker za bolju tipizaciju i identifikaciju vrsta (Salmonella, Campylobacter jejuni, Staphylococcus) (Goh i sar., 1996; Satheesh, 2002; Karenlampi, 2004) kao i diferencijaciju srodnih vrsta ili karakterizaciju različitih serotipova (kod Streptococcus suis) (Brousseau i sar., 2001). TakoĎe je korišćen za detekciju patogena kod pacijenata (Bartonella spp.) (Diederen i sar., 2007) ili tačnu identifikaciju vrste izazivača odreĎenog oboljenja (identifikacija Burkholderia pseudomallei i B. thailandensis) (Woo i sar., 2002). Posmatrajući problem tačne identifikacije patogena, Yushan i sar. (2010) su dizajnirali par univerzalnih prajmera koji mogu da umnoţe 600 bp groEL gena kod patogenih bakterija. Protein toplotnog stresa i šaperon GroEL su prisutni kod skoro svih bakterija, dok su GroEL homolozi prisutni u ţivim organizmima u plastidima, hloroplastima i mitohondrijama. Smatra se da je GroEL jedini šaperon koji je esencijalan za rast bakterije E. coli (Fayet i sar., 1989). TakoĎe je pokazano da su GroEL homolozi Mitrović UVOD 26 neophodni za rast drugih bakterija kao što su Bacillus subtilis (Li i Wong, 1992; Kobayashi i sar., 2003), Rhodobacter sphaeroides (Lee i sar., 1997), Streptomyces albus G (Servant i sar., 1993), Rhizobium leguminosarum (Rodríguez-Quiñones i sar., 2005) i Mycobacterium tuberculosis (Hu i sar., 2008). Iako se smatra da bi esencijalni geni, kao što je groEL, trebalo da budu odrţani u genomu, utvrĎeno je da je GroEL izgubljen kod mnogih vrsta molikuta tokom njihove reduktivne evolucije od gram-pozitivnih predaka (Slika 4) (Wong i Houry, 2004). MeĎutim, u svim drugim bakterijskim genomima do sada sekvenciranim u celosti, groEL gen je prisutan (Clark i Tillier, 2010). Pretpostavlja se da razlog ovog gubitka kod nekih vrsta mikoplazmi leţi u činjenici da GroEL izaziva snaţan imunski odgovor kod domaćina, a Mycoplasma vrste koriste mnoge načine da ga smanje. TakoĎe, ove vrste imaju spor rast koji utiče na fluks proteina dok prolaze kroz GroEL sistem. Moţda najvaţnija činjenica jeste da su mikoplazme izgubile mnoge proteine kojima je neophodan GroEL oligomer za pravilno funkcionisanje. Mikoplazme se od ostalih bakterija razlikuju i po tome što je mutagenezom transpozonima pokazano da GroEL nije esencijalan za vrste M. genitalium i M. pneumoniae i da ne dolazi do njegove povećane sinteze nakon toplotnog stresa. Ovaj nedostatak odgovora GroEL proteina na toplotni stres moţe nastati usled prisustva drugog regulatornog sistema za toplotni šok koji je pronaĎen kod Mycoplasma vrsta a to je HrcA-CIRCE sistem. Mitrović UVOD 27 Mollicutes Proteo bacteria Slika 4. Prikaz prisutnosti/odsutnosti groEL gena kod molikuta i proteobakterija pomoću filogenetskog stabla konstruisanog na osnovu sekvenci 16S rRNK. Plava boja označava potvrĎeno prisustvo, ljubičasta označava da postoje dokazi o prisustvu, ali nije još dokazano, crvena označava odsustvo gena, a crna boja označava da još uvek ne postoje podaci o ovom genu (Clark i Tillier, 2010) Kod šest vrsta mikoplazmi (M. agalactiae, M. arthritidis, M. bovis, M. hyopneumoniae, M. pneumoniae i M. genitalium) koje su izazivači različitih oboljena stoke, laboratorijskih ţivotinja i ljudi i kod kojih je groEL gen prisutan, on je intenzivnije proučavan. PoreĎenjem njegovih sekvenci svih šest vrsta mikoplazmi utvrĎeno je da sve osim M. genitalium imaju homologiju sekvenci izmeĎu 98 i 99.9%, a Mitrović UVOD 28 u poreĎenju sa M. genitalium, koja ima jako mali genom od 570 kb i kod koje nedostaje reparacioni DNK sistem tako da podleţe intenzivnom mutacionom pritisku na trećoj poziciji svakog kodona, sličnost je iznosila izmeĎu 76.5 i 77.7%. U odnosu na B. subtilis, Clostridium perfringens i E. coli sličnost je iznosila izmeĎu 49.2 i 59.7% što govori o visokoj konzervativnosti ovog gena tokom evolucije. Zanimljivo je da je sličnost na nivou predviĎene AK sekvence iznosila izmeĎu 90.4 i 99.9% izmeĎu svih poreĎenih mikoplazmi, uključujući i M. genitalium, dok je sa drugim gore pomenutim bakterijama iznosila izmeĎu 53.2 i 60.8%. Još interesantniji je podatak da je u poreĎenju sa AK sekvencom hsp60 kod eukariotskih organizama sličnost iznosila izmeĎu 50 i 65% (Scherm i sar., 2002). PoreĎenjem genoma četiri fitoplazme sekvencirane u celosti uočeno je da sve četiri poseduju osnovni set gena toplotnog šoka i šaperona koji se sastoji od Hsp70 familije (dnaK, grpE), GroE familije (groEL, groES), šaperon dnaJ i faktor aktivacije (ST17) koji se vezuje za agregirane proteine. Faktor aktivacije jedino nije identifikovan kod 'Ca. P. mali' dok ga poseduju ostale tri fitoplazme (Kube i sar., 2012). 1.2.2. Gen faktora elongacije kod fitoplazmi Gen koji kodira Tu faktor elongacije (EF-Tu), tuf gen, takoĎe je visoko konzervativan gen koji ima centralnu ulogu u procesu translacije i koji je često korišćen u filogenetskoj analizi drugih bakterija. On se u genomu fitoplazmi nalazi u jednoj kopiji i često se koristi u njihovoj diferencijaciji i klasifikaciji. Schneider i sar. (1997) su dizajnirali prajmere koji mogu da umnoţe ovaj gen kod većine grupa fitoplazmi čime je pokazano da ovaj gen predstavlja potencijalni marker za klasifikaciju fitoplazmi. Naime uz pomoć par restrikcionih enzima moguće je identifikovati različite grupe i podgrupe fitoplazmi (Lee i sar., 2010). Iako se pokazalo da je njegova sposobnost razlikovanja evolutivno udaljenih linija fitoplazmi nešto manja nego kod 16S rDNK (Schneider i sar., 1997; Marcone i sar., 2000), u nekim slučajevima se pokazalo da je ovaj gen veoma koristan u diferencijaciji bliskih sojeva različitih ekoloških karakteristika (Langer i Maixner, 2004). Zbog nemogućnosti dizajniranja univerzalnih prajmera koji bi umnoţavali tuf gen kod svih grupa fitoplazmi, ovaj gen se za sada koristi pri diferencijaciji podgrupa Mitrović UVOD 29 unutar 16Sr grupa, naročito grupa 16SrI i 16SrXII (Marcone i sar., 2000; Streten i Gibb, 2005). 1.2.3. Geni ribozomalnih proteina kod fitoplazmi Geni ribozomalnih proteina se nalaze u okviru većeg rp operona koji se sastoji od najmanje 21 gena u svim do sada u potpunosti sekvenciranim fitoplazmama. Literaturni podaci pokazuju da je redosled ovih gena u principu isti a on izgleda ovako: rpsJ (koji kodira ribozomalni protein S10), rplC (L3), rplD (L4), rplW (L23), rplB (L2), rpsS (S19), rplV (L22), rpsC (S3), rplP (L16), rpmC (L29), rpsQ (S17), rplN (L14), rplX (L24), rplE (L5), rpsN (S14), rpsH (S8), rplF (L6), rplR (L18), rpsE (S5), rpmD (L30) i rplO (L15). Na osnovu sekvenci dela rp operona fitoplazme iz Oenothera biljke, dobijene pomoću proba napravljenih na osnovu rp operona vrste Mycoplasma capricolum, dizajnirani su prvi prajmeri rpF1 i rpR1 za koje se pokazalo da u osnovi mogu da umnoţe gene rplV, rpsC i deo rplP kod Acholeplasma laidlawii. Potom su usledile dalje studije i dizajnirano je više pari prajmera, kako polu-univerzalnih tako i specifičnih, koji mogu umnoţiti ovaj i druge delove rp operona kod većeg broja grupa fitoplazmi (Hodgetts i Dickinson, 2010). Analizom RFLP profila PCR-om umnoţenih delova rp operona pomoću dizajniranih prajmera, a u kombinaciji sa već postojećom 16S rDNK klasifikacijom, fitoplazmama su dodeljene nove 16Sr-rp podgrupe (Lee i sar., 1998b). Naime, geni koji kodiraju ribozomalne proteine su pokazali veću varijabilnost od 16S rDNK i veću informativnost u smislu filogenije, tako da povećavaju rezolucionu moć pri razdvajanju filogenetski srodnih sojeva (Lee i sar., 2010). Prvenstveno su studije u okviru grupa 16SrI i 16SrV pokazale da je analizom rp sekvenci moguće identifikovati ne samo grupe i podgrupe kao i na nivou 16S rDNK, već je moguće identifikovati i nove linije/podgrupe što nije bilo moguće uz pomoć samog 16S rDNK (Lee i sar., 2004a; Martini i sar., 2007). Ovi podaci su potvrĎeni i činjenicom da je većina novih linija imala biološki različite osobine od ostalih pripadnika te (pod)grupe. Srednja vrednost varijabilnosti sekvenci izmeĎu ove dve grupe na nivou rp gena se kretala izmeĎu 50.4% i 83.5% za razliku od 16S rDNK gde je ona iznosila izmeĎu 85% i 96.9%, čime je Mitrović UVOD 30 pokazano da su rp geni bolji molekularni markeri za diferencijaciju srodnih sojeva fitoplazmi (Lee i sar., 2010). 1.2.4. Sec sistem Sec sistem je opšti sistem za izlučivanje proteina iz ćelije i univerzalan je za Eubacteria, Archaea i eukariote, a odgovoran je za transport tek sintetisanih proteina pre nego što zauzmu krajnju konformaciju. Sec sistem čine subjedinice SecY/SecE/SecG koje formiraju poru u ćelijskoj membrani, SecA subjedinica koja se nalazi u citoplazmi i ima ulogu u hidrolizi ATP-a i SecB šaperon koji se vezuje za SecA i tako upućuje sekretujući protein na poru. Sec sistem takoĎe moţe da ima i subjedinice SecD, SecF, YajC i YidC koje olakšavaju proces izlučivanja (Mori i Ito, 2001; Tseng i sar., 2009). Proučavanjem četiri za sada jedina genoma fitoplazmi sekvencirana u potpunosti (‟Ca. Phytoplasma asteris‟ sojevi AYWB i OY-M, ‟Ca. Phytoplasma australiense‟ i ‟Ca. Phytoplasma mali‟) utvrĎeno je da se Sec sistem fitoplazmi sastoji od gena secA, secY, secE i yidC koji kodiraju istoimene proteine (Oshima i sar., 2004; Bai i sar., 2006; Kube i sar., 2008; Tran-Nguyen i sar., 2008). Od prisutnih gena sec sistema, geni secY i secA se široko koriste kao molekularni markeri korisni za finiju diferencijaciju sojeva fitoplazmi. Na osnovu tehnike kretanja po genomu (genome walking) identifikovani su klonovi fitoplazmi koji su obuhvatali 3‟ kraj rplO gena, ceo secY gen zajedno sa susednim map (methionine aminopeptidase) genom i 5‟ kraj infA gena koji kodira inicijacioni faktor If-1 (Arnaud i sar., 2007). Na osnovu ovih sekvenci dizajnirani su prajmeri za umnoţavanje secY gena prvenstveno kod grupa 16SrI i 16SrV. Pokazalo se da je kod ove dve grupe fitoplazmi varijabilnost sekvenci secY gena slična varijabilnosti gena ribozomalnih proteina i da je srednja vrednost iznosila od 57.4% do 76%. TakoĎe je utvrĎeno da su podgrupe izdvojene na osnovu RFLP profila ovog gena u skladu sa podgrupama odvojenim na osnovu RFLP profila rp gena (Lee i sar., 2004a, 2004b, 2006; Martini i sar., 2007). Bez obzira na sličnost secY i rp gena, secY gen se ipak pokazao informativnijim jer je izraţenija njegova sposobnost razdvajanja srodnih sojeva. Mitrović UVOD 31 1.3. 'Candidatus Phytoplasma asteris' VRSTA Ova visoko heterogena i široko rasprostranjena grupa fitoplazmi se povezuje sa bolestima koje izaziva kod preko 80 biljnih vrsta, a eksperimentalno je dokazano da je moţe preneti preko 30 vrsta vektora na više od 200 biljaka (Kunkel, 1926; Brcák, 1979; Tsai, 1979; McCoy i sar., 1989). Aster yellows (AY) fitoplazma koja napada Callistephus chinensis je bila rasprostranjena u istočnom delu SAD-a na početku XX veka i prvenstveno se prenosila pomoću cikade Macrosteles quadrilineatus. Ova fitoplazma je kasnije nazvana Eastern aster yellows da bi se razlikovala od druge AY fitoplazme koja izaziva bolest na celeru u Kaliforniji i koja je kasnije nazvana Western aster yellows. Western aster yellows se prenosi pomoću većeg broja vektora i izaziva drugačije simptome na obolelim biljkama od Eastern aster yellows fitoplazme. Danas se zna da su ove dve fitoplazme povezane sa fitoplazmama koje pripadaju grupi 16SrI a podgrupama A (Eastern) i B (Western). Sojevi unutar AY grupe imaju više od 97% sličnosti njihovih 16S rRNK sekvenci, meĎutim uočljive su značajne genetičke varijacije kao i činjenica da članovi ove grupe zauzimaju različite ekološke niše. Zbog toga se pretpostavlja da se ova heterogena grupa fitoplazmi sastoji od više od jedne vrste koja je za nju za sada definisana a to je ‟Candidatus Phytoplasma asteris‟ vrsta. Danas se ova grupa sastoji od 15 podgrupa a one su 16SrI-A, B, C, D, E, F, H, K, L, M, N, O, P, Q i R (Lee i sar., 2004b). Članovi podgrupe 16SrI-G su reklasifikovani u odvojenu grupu 16SrXII, podgrupu 16SrXII-A, nazvanu Stolbur grupa i kojoj odgovara još uvek zvanično neopisana ‟Candidatus Phytoplasma solani' vrsta. Članovi podgrupe 16SrI-J su takoĎe reklasifikovani u novu grupu 16SrXIV, podgrupu 16SrXIV-B (Lee i sar., 1998b). Podgrupa 16SrI-B predstavlja najveću i najrasprostranjeniju podgrupu dok su prema dosadašnjim podacima podgrupe 16SrI-L i I-M ograničene samo na Evropski kontinent. Eksperimentalno je potvrĎeno da se fitoplazme iz podgrupa I-A i I-B mogu preneti vektorima na 191 biljnu vrstu koje spadaju u 42 familije. Neki vektori mogu prenositi fitoplazme iz podgrupa I-A, I-B i I-C, a glavni vektori AY fitoplazmi su cikade Macrosteles spp., Euscelis spp., Scaphytopius spp. i Aphrodes spp. (Lee i sar., 2004b). Iz literature je poznato da je u nekoliko vrsta iz roda Populus, uključujući i vrstu Populus nigra L. 'Italica', u Bugarskoj, Holandiji, Francuskoj, Nemačkoj i u skorije Mitrović UVOD 32 vreme i u Hrvatskoj detektovano prisustvo fitoplazmi (Atanasoff, 1973; Van der Meer, 1980, 1981; Sharma i Cousin, 1986; Seemüller i Lederer, 1988; Šeruga i sar., 2003). Tada je dokazano PCR-RFLP metodom da detektovana fitoplazma u topoli u Francuskoj i Nemačkoj pripada vrsti 'Ca. P. asteris' (Maurer i sar., 1994; Cousin, 1998). Prema literaturi prisustvo fitoplazmi u topoli je prvenstveno povezano sa pojavom veštičjih metli, ali dolazi i do pojave manje karakterističnih simptoma kao što je smanjenje veličine listova, ţutilo i manji broj listova, krţlljavost i odumiranje cele biljke (Sharma i Cousin, 1986; Cousin, 1996; Berges i sar., 1997). Šeruga i sar. (2003) su u Hrvatskoj u biljkama topole detektovali fitoplazme kojima su na osnovu PCR-RFLP metode 16S rRNK gena dodelili novu podgrupu 16SrI-P, a na osnovu rp gena dodelili su im novu rpI-O podgrupu. Tipični simptomi koje prouzrokuju AY fitoplazme su pojava virescencije i filodija, promene na cvetovima, ţutilo i uspravan rast listova, izduţivanje i etiolacija internodija, intenzivno grananje vršnih izdanaka, pojava veštičjih metli i zakrţljali rast biljke. Još neki od simptoma koje mogu izazvati su kovrdţanje, uvijanje i smanjenje veličine listova, kao i slaba obojenost cvetova (Lee i sar., 2004b). Za referentni soj vrste ‟Ca. Phytoplasma asteris‟ uzet je soj OAY (=MIAY) izolovan iz floema biljke Oenothera hookeri (Lee i sar., 2004b). 1.4. STOLBUR FITOPLAZME Stolbur fitoplazme pripadaju Stolbur grupi (16SrXII) koja se sastoji od dve podgrupe: vrsta 'Ca. P. australiense' (podgrupa 16SrXII-B) opisana je od strane Davis i sar. (1997) i njen tipičan pripadnik je Australian grapevine yellows fitoplazma, a druga je još uvek neopisana vrsta 'Ca. P. solani' (podgrupa 16SrXII-A) kojoj i pripadaju Stolbur fitoplazme. Referentni soj Stolbur fitoplazmi je soj STOL koji je poreklom sa ljute papričice iz Srbije i čija se sekvenca 16S rDNK nalazi u NCBI Banci gena pod pristupnim brojem AF248959 (IRPCM, 2004). Stolbur fitoplazme su detektovane u mnogim biljnim vrstama od kojih su neke ekonomski značajne kao što su celer, paradajz, paprika, kukuruz, krompir, duvan, šargarepa, peršun, šećerna repa, grašak, breskva i mnoge druge (Martinović i Bjegović, 1950; Richard-Molard i sar., 1995; Viczián i sar., 1998; Del Serrone i sar., 2001; Paltrinieri i sar., 2006; Duduk i Mitrović UVOD 33 Bertaccini, 2006; Carraro i sar., 2008; Jović i sar., 2011; Zwolínska i sar., 2012). Ova grupa fitoplazmi je najčešće proučavana na vinovoj lozi na kojoj se moţe naći i druga fitoplazma iz grupe 16SrV koja je u našoj zemlji još uvek na listi karantinskih patogena (Daire i sar., 1997; Clair i sar., 2003; Langer i Maixner, 2004). Smatraju se uglavnom biljnim patogenima Evropskih i Mediteranskih predela mada su pronaĎene i u drugim delovima sveta (Garnier, 2000). Simptomi koje Stolbur fitoplazme izazivaju najčešće su proliferacija izdanaka, hloroza, crvenilo i ţutilo listova, kao i promene na cvetu (Fialová i sar., 2009; Jović i sar., 2011; Zwolínska i sar., 2012). Nekoliko vrsta insekata iz familija Cixiidae, Delphacidae i Derbidae, kao i vrsta psilida Bactericera trigonica su dokazani vektori Stolbur fitoplazmi. Poznato je takoĎe da vektor Hyalesthes obsoletus, koji je utvrĎeni vektor Stolbur fitoplazmi i u Srbiji (Aleksić i sar., 1967), prenosi Stolbur fitoplazme na vinovu lozu koja je njihov krajnji domaćin, što znači da se sa nje one ne mogu dalje preneti na druge biljke jer iz nje vektori ne mogu da usvoje fitoplazme (Weintraub i Beanland, 2006). Genetička varijabilnost zasnovana na RFLP analizi 16S rDNK je niska unutar Stolbur podgrupe u poreĎenju sa drugim grupama, kao na primer sa AY grupom, što pokazuje da je Stolbur grupa veoma homogena. Sama RFLP analiza 16S rDNK nije pokazala nikakve razlike meĎu sojevima poreklom sa različitih domaćina (Marcone i sar., 1996, 2000). Pored 16S rDNK koji se koristi u klasifikaciji svih fitoplazmi, kod Stolbur fitoplazmi su proučavani i drugi geni kao što su geni ribozomalnih proteina, secY gen i gen faktora elongacije (tuf gen) (Schneider i sar., 1997; Langer i Maixner, 2004; Martini i sar., 2007). Zbog svoje veće varijabilnosti u odnosu na 16S rDNK, ovi geni su pogodniji za diferencijaciju i klasifikaciju srodnih fitoplazmi. U odnosu na tuf gen pronaĎena je i korelacija izmeĎu pripadnika odreĎene tuf podgrupe, kojih ima ukupno tri, i različitih biljaka domaćina. Tako je podgrupa (tip) tuf type I pronaĎena samo kod sojeva poreklom sa koprive (Urtica dioica), tuf type II povezan samo sa sojevima poreklom sa poponca (Convolvulus arvensis) i divljeg ladoleţa (Calystegia sepium), a tuf type III samo sa divljeg ladoleţa i on je najreĎi. Sva tri tipa su detektovana kako u vinovoj lozi (Vitis vinifera) tako i u vektoru H. obsoletus. S obzirom na to da populacija vektora sa koprive i poponca pokazuje razlike u pogledu načina ishrane i vremena neophodnog za završavanje ţivotnog ciklusa i ostavljanje potomstva, moţe se postaviti hipoteza da u polju postoje različiti prirodni ciklusi zaraţavanja Mitrović UVOD 34 vinove loze. U Nemačkoj i verovatno Francuskoj predominantan ciklus bolesti je sistem C. arvensis-H. obsoletus-V. vinifera dok je u Italiji vaţniji drugi sistem U. dioica-H. obsoletus-V. vinifera (Langer i Maixner, 2004). Mitrović CILJEVI RADA 35 2. CILJEVI RADA Osnovni cilj planiranih istraţivanja jeste utvrĎivanje pogodnosti groEL gena da detektuje varijabilnost srodnih fitoplazmi u okviru brojne i heterogene 16SrI ribozomalne grupe fitoplazmi (‟Ca. Phytoplasma asteris‟) i Stolbur fitoplazmi i mogućnost njegovog korišćenja kao dodatnog molekularnog markera za diferencijaciju ovih fitoplazmi. Ovi rezultati će doprineti boljem razumevanju fitoplazmi i stvoriti novu mogućnost za njihovu jasnu i jednostavnu diferencijaciju. To će, s obzirom na njihov širok krug domaćina i veliki broj vektora, doprineti rasvetljavanju njihove epidemiologije što je prvi korak u merama kontrole bolesti koje one prouzrokuju. Realizacija ovih ciljeva izvršena je kroz nekoliko zadataka: 1. Uzorkovanje biljnog materijala poreklom iz Srbije, izolacija DNK, detekcija i identifikacija AY i Stolbur fitoplazmi iz sakupljenih uzoraka. 2. Dizajniranje specifičnih prajmera za umnoţavanje groEL gena kod fitoplazmi srodnih ‟Ca. Phytoplasma asteris‟ (Aster yellows fitoplazmi-AY) i Stolbur fitoplazmi kao i utvrĎivanje protokola za njihovo korišćenje. 3. Primena prethodno utvrĎenog protokola za umnoţavanje groEL gena kod sakupljenih uzoraka i kod uzoraka AY fitoplazmi iz kolekcije. 4. Umnoţavanje tuf, rp i secY gena kod AY fitoplazmi, odnosno tuf gena kod Stolbur fitoplazmi prema protokolima iz literature. 5. Analiza dobijenih amplikona 16S rDNK, groEL, tuf, rp i secY gena putem RFLP metode uz upotrebu različitih restrikcionih enzima, kao i analiza sekvenci ovih amplikona odabranih reprezentativnih sojeva. 6. Analiza filogenetskih stabala konstruisanih na osnovu sekvenci 16S rDNK, groEL gena i zdruţenih sekvenci tuf, rp i secY gena. Mitrović MATERIJAL I METODE 36 3. MATERIJAL I METODE 3.1. UZORKOVANJE I IZOLACIJA DNK 3.1.1. Uzorkovanje biljnog materijala U periodu od 2009. do 2011. godine sa teritorije Beograda i okoline sakupljeni su uzorci biljaka sa simptomima karakterističnim za prisustvo fitoplazmi kao što su ţutilo, virescencija, pojava filodija i veštičjih metli, smanjenje veličine listova i odumiranje biljke. TakoĎe je u Beogradu u ulici Gospodara Vučića uočena biljka crne topole (Populus nigra L. 'Italica') sa simptomima ţutila i smanjenom veličinom listova, kao i prisustvom veštičjih metli (Slika 12 sa strane 56). S obzirom na to da su uočeni simptomi u skladu sa literaturnim podacima o simptomima na biljkama topole u kojima su detektovane AY fitoplazme, grane i listovi ove biljke topole su uzorkovani. Kao što se moţe primetiti sa Slike 12, cela biljka sa simptomima karakterističnim za prisustvo fitoplazmi se osušila nakon samo 15 dana od uzorkovanja. Iz centralnih lisnih nerava i lisnih peteljki sakupljenih uzoraka listova i grana uraĎena je izolacija DNK po nešto izmenjenoj metodi Doyle i Doyle (1990). Pored sakupljenih uzoraka u analizu su uključeni sojevi fitoplazmi različitih podgrupa u okviru grupe 16SrI koji su odrţavani u biljci Vinca major ili koji su bili dostupni u obliku već ekstrahovane DNK, a deo su kolekcije fitoplazmi odrţavanih u mikropropagaciji u Italiji - Phytoplasmology Laboratory, Plant Pathology, DiSTA - Alma Mater Studiorum - University of Bologna (Bertaccini, 2010). Pored tek uzorkovanih i uzoraka iz kolekcije, korišćeni su i sojevi MBSColombia, ca2006/1, ca2006/5 i ca2006/9 koji su bili dostupni kao već ekstrahovana DNK iz prirodno zaraţenih biljaka (Duduk i sar., 2008a, 2008c). 3.1.2. Izolacija DNK iz biljnog materijala U avanu je, uz dodatak tečnog azota, homogenizovano do finog praha 0.5 g centralnih lisnih nerava i lisnih peteljki po svakom uzorku. U dobijeni homogenizat je zatim dodato 3.5 ml 3% CTAB ekstrakcionog pufera (Prilog A). Iz avana je potom u mikrotube zapremine 1.5 ml preneseno po 750 µl dobijene suspenzije i inkubirano u Mitrović MATERIJAL I METODE 37 vodenom kupatilu na 65ºC u trajanju od 20 minuta, pri čemu su mikrotube invertovane na svakih 5 minuta. Nakon inkubacije, u mikrotube je dodato po 750 µl hloroforma (trihlormetan, CHCl3), mikrotube su vorteksovane a potom centrifugirane 15 minuta pri brzini od 13000 rpm i na temperaturi od 4ºC. Centrifugiranjem je sadrţaj mikrotuba odvojen na dve faze – gornju vodenu fazu u kojoj se nalaze nukleinske kiseline i donju u kojoj se nalazi hloroform sa rastvorenim proteinima i ostatak biljnog materijala. U narednom koraku je gornja vodena faza (supernatant) paţljivo prebačena u novu mikrotubu i u nju je dodato po 750 µl ohlaĎenog izopropanola (IPA, (CH3)2CHOH) nakon čega su mikrotube inkubirane na -20 ºC u trajanju od 10 minuta, a potom centrifugirane kao u prethodnom koraku. Nakon centrifugiranja tečna faza je paţljivo odbačena, a u talog je dodato 200 µl ohlaĎenog 70% etanola (EtOH, CH3CH2OH). Mikrotube su potom centrifugirane 10 minuta pri brzini od 13000 rpm i na temperaturi od 4ºC nakon čega je etanol paţljivo odliven, a mikrotube sa istaloţenom DNK ostavljene otvorene na sobnoj temperaturi dok nije ispario ostatak etanola. Na kraju je dobijena DNK resuspendovana sa 75 µl TE pufera (Prilog A) i čuvana u friţideru na 4ºC. 3.2. DIZAJNIRANJE PRAJMERA ZA UMNOŢAVANJE groEL GENA 3.2.1. Aster yellows fitoplazme Za umnoţavanje groEL gena dizajnirani su prajmeri pomoću programa Primer Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/), a korišćenjem sekvence Marguerite yellows fitoplazme (AB242235) i poreĎenjem sa nekoliko javno dostupnih sekvenci iz NCBI (National Center of Biotechnology Information) Banke gena (Tabela 5) kao i sekvenci četiri genoma sekvencirana u potpunosti. Pomenute sekvence su sadrţale groES (gen za malu subjedinicu molekularnog šaperona), groEL (gen za veliku subjedinicu molekularnog šaperona), amp/imp (gen za antigenski/imunodominantni membranski protein) i nadE (gen za glutamin zavisnu NAD(+) sintetazu) gene osim kod 'Ca. P. mali' soj AT i 'Ca. P. australiense' koji su sadrţali samo groES i groEL gene jer ove fitoplazme imaju drugačiji raspored gena od fitoplazmi srodnih 'Ca. P. asteris'. Njihovim poravnanjem pomoću programa MEGA5 (Tamura i sar., 2011) bilo je Mitrović MATERIJAL I METODE 38 moguće odrediti regione koji omogućavaju dizajniranje prajmera specifičnih za umnoţavanje groEL gena kod AY fitoplazmi. Tabela 5. Sekvence javno dostupne u NCBI Banci gena korišćene pri dizajniranju prajmera za umnoţavanje groEL gena kod fitoplazmi srodnih 'Ca. P. asteris' Naziv fitoplazme Dostupni geni (duţina fragmenta u bp) Pristupni broj Potato purple top groES, groEL, amp i nadE (3 374) AB167357 Onion yellows groES, groEL, amp i nadE (3 722) AB124806 Onion yellows groES, groEL, amp i nadE (3 630) AB124807 Onion yellows groES, groEL, amp i nadE (3 622) AB124808 Mulberry dwarf groES, groEL, amp i nadE (3 616) AB124809 Paulownia witches'-broom groES, groEL, amp i nadE (3 675) AB124810 Phytoplasma sp. AYBG groES, groEL, amp i nadE (3 634) AB124811 Eggplant dwarf groES, groEL, amp i nadE (3 671) AB242231 Tomato yellows groES, groEL, amp i nadE (3 722) AB242232 Lettuce yellows groES, groEL, amp i nadE (3 712) AB242233 Iceland poppy yellows groES, groEL, amp i nadE (3 722) AB242234 Marguerite yellows groES, groEL, amp i nadE (3 722) AB242235 Sumac witches'-broom groES, groEL, amp i nadE (3 720) AB242236 Porcelain vine witches'-broom groES, groEL, amp i nadE (3 720) AB242237 Aster yellows witches'-broom AYWB groES, groEL, imp i nadE (4 974) CP000061 *c(621635.. 626608) Onion yellows OY-M groES, groEL, amp i hypop (4 104) AP006628 *(142019.. 146122) 'Ca. P. mali' AT groES i groEL (2 052) CU469464 *(236678.. 238729) 'Ca. P. australiense' groES i groEL (1 963) AM422018 *(774690.. 776652) hypop- hypothetical protein; *- u zagradi su date pozicije ovog regiona u genomu; c- complement, pozicija na komplementarnom lancu Od ponuĎenih prajmera koje je program dao, odabrana su dva uzvodna i dva nizvodna prajmera koja su odgovarala našim kriterijumima i dati su im nazivi u zavisnosti od gena u kome su se nalazili. Prvi uzvodni prajmer duţine 20 bp je nazvan AYgroesF jer se nalazi u groES genu od 96 bp do 115 bp od početka sekvence ovog gena kod Marguerite yellows fitoplazme (AB242235) koja je i korišćena kao matrica za dizajniranje prajmera. Drugi uzvodni prajmer, AYgroelF, se nalazi u groEL genu, kao što mu i sam naziv naglašava, Mitrović MATERIJAL I METODE 39 Marguerite yellows fitoplazma (AB242235) 1-270 groES (270 bp) 452-2062 groEL (1611 bp) 2222-2923 amp (702 bp) 3329-3721 nadE (393 bp) AYgroesF (96-115 bp) AYgroelF (22-40 bp) AYgroelR (1399-1418 bp) AYampR (46-65 bp) 1397 bp 2191 bp od 22 bp do 40 bp od početka groEL gena i duţine je 19 bp. Jedan od nizvodnih prajmera se nalazi takoĎe u groEL genu i nazvan je AYgroelR a pozicioniran je pred kraj ovog gena, tačnije od 1399 bp do 1418 bp (sam gen je duţine 1611 bp) i dugačak je 20 bp. Da bi bio obuhvaćen ceo groEL gen, poslednji odabrani nizvodni prajmer se nalazi u amp genu, nazvan je AYampR i obuhvata sekvencu od 46 bp do 65 bp od početka ovog gena kod Marguerite yellows fitoplazme a duţine je takoĎe 20 bp kao i prethodni nizvodni prajmer (Shema 4). Sva četiri odabrana prajmera imaju temperaturu topljenja izmeĎu 50ºC i 55ºC. Sekvence dizajniranih prajmera su date u Tabeli 6. Shema 4. Prikaz pozicija i duţine dizajniranih prajmera, duţine očekivanih PCR produkata kao i raspored i duţina groES, groEL, amp i nadE gena kod AY fitoplazmi 3.2.2. Stolbur fitoplazme MeĎu dostupnim draft sekvencama genoma dva soja Stolbur fitoplazmi poreklom iz Srbije (saradnja sa dr Michael Kube-om iz Berlina, Nemačka; Siewert i sar., 2012), soja 284/09 iz duvana i soja 231/09 iz peršuna, nalazile su se i sekvence gena groES, groEL i stamp (analog amp gena kod AY fitoplazmi). Na osnovu poravnatih ovih sekvenci kao i sekvenci ovog regiona kod četiri fitoplazme sekvencirane u celosti, pronaĎeni su regioni specifični za Stolbur fitoplazme i u tim regionima su za njih ručno dizajnirani prajmeri. Uz pomoć softvera Oligo Calc dostupnog na internetu (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) Mitrović MATERIJAL I METODE 40 odreĎene su duţina i sekvenca prajmera kod kojih temperatura hibridizacije iznosi 55ºC zbog mogućnosti korišćenja istog ciklusa kao i za umnoţavanje groEL gena kod AY fitoplazmi. Na ovaj način je dizajniran jedan uzvodni i tri nizvodna prajmera. Prajmeri su nazvani kao i kod AY fitoplazmi u odnosu na gen u kome se nalaze, pa je tako uzvodni prajmer duţine 20 bp koji se nalazi u groES genu (od 93 do 112 bp od početka ovog gena) nazvan STOLgroesF, dva nizvodna prajmera koja se nalaze u groEL genu su nazvana STOLgroelR i STOLgroelR2 (od 1396 do 1418 bp, odnosno od 1539 do 1558 bp od početka groEL gena), a duţine su 23 bp odnosno 20 bp i treći nizvodni prajmer koji se nalazi u stamp genu nazvan je STOLstampR (od 55 do 75 bp od početka stamp gena) i duţine je 21 bp (Shema 5). Uzvodni prajmer dizajniran za AY fitoplazme, AYgroelF, ima sekvencu koja se razlikuje u samo dva nukleotida od istog regiona kod Stolbur fitoplazmi, pa je i ovaj prajmer korišćen za umnoţavanje groEL gena kod Stolbur fitoplazmi. Sva četiri dizajnirana prajmera imaju temperaturu topljenja oko 55ºC. Sekvence dizajniranih prajmera su date u Tabeli 6. Shema 5. Prikaz pozicija i duţine dizajniranih prajmera, duţine očekivanih PCR produkata kao i raspored i duţina groES, groEL i stamp gena kod Stolbur fitoplazmi Soj 284/09 1-267 groES (267 bp) 296-1900 groEL (1605 bp) 2042-2515 stamp (474 bp) STOLgroesF (93-112 bp) AYgroelF (22-40 bp) STOLgroelR (1396-1418 bp) STOLstampR (55-75 bp) 1397/1537 bp 2024 bp STOLgroelR2 (1539-1558 bp) 1708 bp Mitrović MATERIJAL I METODE 41 3.3. LANĈANA REAKCIJA POLIMERAZE (PCR) Za detekciju i identifikaciju fitoplazmi korišćen je par univerzalnih prajmera P1/P7 (Tabela 6) u direktnoj PCR reakciji koji umnoţava fragment veličine oko 1800 bp a obuhvata skoro celu 16S rDNK, intergenski region 16S-23S rDNK u kome se nalazi i gen za tRNK za ugradnju izoleucina (tRNK Ile ) i 5' početak 23S rDNK (Deng i Hiruki, 1991; Schneider i sar., 1995). U sledećoj (nested) reakciji, dobijeni P1/P7 produkti su razblaţeni vodom u odnosu 1:30 i kao takvi su u količini od 1 µl korišćeni kao osnova za umnoţavanje fragmenta veličine oko 1245 bp koji obuhvata samo 16S rDNK. U nested reakciji je korišćen drugi par takoĎe univerzalnih prajmera R16F2n/R16R2 (Tabela 6) (Lee i sar., 1993; Gundersen i Lee, 1996). Uslovi u kojima su se odvijale obe PCR reakcije su predstavljeni na Shemi 6 kao ciklus 1. Za uspešno umnoţavanje groEL gena kod svih sojeva AY fitoplazmi pomoću dizajniranih prajmera je standardizovan PCR protokol. Nekolicina sojeva je prvenstveno korišćena kao kontrola pri odreĎivanju protokola. Različitim kombinacijama sva četiri dizajnirana prajmera na različitim temperaturama hibridizacije koja se kretala od 50 do 57ºC i sa različitom količinom MgCl2 (dodavanjem 0.5 ili 0.75 µl 25 mM MgCl2 po uzorku čime je dobijena krajnja količina MgCl2 u PCR reakcionoj smeši od 2.5 odnosno 2.75 mM) u reakcionoj smeši, dobijani su rezultati koji su omogućili odreĎivanje konačnog optimalnog protokola. Ustanovljeno je da se za umnoţavanje groEL gena kod AY fitoplazmi koristi par prajmera AYgroelF/R u direktnoj PCR reakciji ili u drugoj (nested) PCR reakciji nakon AYgroesF/AYampR para prajmera u uslovima predstavljenim na Shemi 6 kao ciklus 2 i to sa koncentracijom MgCl2 od 2 mM. Očekivana veličina AYgroelF/R amplikona je oko 1400 bp. Prajmeri za umnoţavanje groEL gena kod Stolbur fitoplazmi su dizajnirani tako da se mogu koristiti pri istim uslovima ciklusa kao i prajmeri za umnoţavanje ovog gena kod AY fitoplazmi (Shema 6, ciklus 2). Par prajmera koji se koristi u direktnoj PCR reakciji je STOLgroesF/STOLstampR pri čemu je očekivana veličina fragmenta oko 2000 bp, nakon čega se moţe primeniti par prajmera AYgroelF/STOLgroelR2 u drugoj PCR reakciji (veličina fragmenta je oko 1500 bp). Za umnoţavanje elongacionog faktora Tu, tuf gena kod AY fitoplazmi, korišćen je par prajmera fTufAy/rTufAy (Tabela 6) koji je specifičan za AY i Stolbur grupu Mitrović MATERIJAL I METODE 42 fitoplazmi i koji umnoţava fragment ovog gena veličine 940 bp (Schneider i sar., 1997). Kod Stolbur fitoplazmi ovaj gen je umnoţavan sa istim parom prajmera u direktnoj PCR reakciji ili u nested nakon primene Tuf1f/Tuf1r para prajmera. Uslovi u kojima su se odvijale PCR reakcije su predstavljeni na Shemi 6 kao ciklus 3. Za umnoţavanje ribozomalnog operona kod AY fitoplazmi korišćen je rpL2F3 uzvodni prajmer (Tabela 6) koji se nalazi u genu rplB (rpl2) i koji je dizajniran na osnovu sekvenci AY fitoplazmi, a kao nizvodni prajmer je korišćen rp(I)R1A prajmer (Tabela 6) koji se nalazi na samom kraju rpsC (rps3) gena. Produkt umnoţavanja uz pomoć ovog para prajmera je fragment veličine oko 1600 bp koji obuhvata rplB (rpl2), rpsS (rps19), rplV (rpl22) i rpsC (rps3) gene. Uslovi u kojima se odvijala PCR reakcija su predstavljeni na Shemi 6 kao ciklus 2. Za umnoţavanje secY gena kod AY fitoplazmi korišćeni su prajmeri AYsecYF1/AYsecYR1 (Tabela 6) koji daju produkt veličine oko 1400 bp a obuhvataju ceo secY gen. Uslovi u kojima se odvijala PCR reakcija su predstavljeni na Shemi 6 kao ciklus 2. Sve PCR reakcije su obavljane u reakcionoj smeši zapremine 25 µl koja se sastojala od 12.5 µl 2xPCR Master mix-a (koji sadrţi PCR reakcioni pufer sa 4 mM MgCl2, 0.05 U/μl Taq DNA polimeraze i po 0.4 mM svakog nukleotida) (MBI Fermentas, Litvanija), 10.5 µl bidestilovane i sterilisane vode, 0.5 µl svakog prajmera koncentracije 20 pmol/µl (finalne koncentracije 0.4 µM) i 1 µl izolovane ukupne DNK razblaţene u odnosu 1:100 (otprilike 20 ng). Kao negativna kontrola korišćena je reakciona smeša sastavljena od svih reagenasa potrebnih za umnoţavanje DNK, ali bez dodate DNK. Reakcije su izvedene u Thermocycler-u (Eppendorf Mastercycler) upotrebom odgovarajućeg ciklusa. Mitrović MATERIJAL I METODE 43 Tabela 6. Sekvence svih korišćenih prajmera Prajmer Sekvenca prajmera u 5'-3' smeru Literatura P1 AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T Deng i Hiruki, 1991 P7 CGT CCT TCA TCG GCT CTT Schneider i sar., 1995 R16F2n GAA ACG ACT GCT AAG ACT GG Gundersen i Lee, 1996 R16R2 TGA CGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G Lee i sar., 1993 Tuf1f CAA GTT GGT GTT CCA AA Schneider i sar., 1997 Tuf1r GTT GTC ACC TGC TTG AGC Schneider i sar., 1997 fTufAy GCT AAA AGT AGA GCT TAT GA Schneider i sar., 1997 rTufAy CGT TGT CAC CTG GCA TTA CC Schneider i sar., 1997 AYsecYF1 CAG CCA TTT TAG CAG TTG GTG G Lee i sar., 2006 AYsecYR1 CAG AAG CTT GAG TGC CTT TAC C Lee i sar., 2006 rpL2F3 WCC TTG GGG YAA AAA AGC TC Martini i sar., 2007 rp(I)R1A GTT CTT TTT GGC ATT AAC AT Lee i sar., 2003 AYgroesF ATC AGA AAA AGA AAA ATC CT Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi AYgroelF GGC AAA GAA GCA AGA AAA G Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi AYgroelR TTT AAG GGT TGT AAA AGT TG Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi AYampR GCA ACA GCA GCA AAT AAA AC Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi STOLgroesF AGC TGA AAA AGA AAA ATC TT Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi STOLgroelR TTC AAT TTT TGG TTT AAT TGT TG Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi STOLgroelR2 CAA CAG CAG CTT CGG TCG TA Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi STOLstampR AGC AAA CAA ACT AAC AAA AGC Dizajnirani u ovoj doktorskoj tezi Shema 6. Prikaz različitih PCR ciklusa korišćenih za umnoţavanje 16S rRNK, groEL, tuf, rp i secY gena 94ºC 1min 94ºC 1min 50ºC 2min 72ºC 3min 72ºC 7min x35 94ºC 1min 94ºC 1min 55ºC 2min 72ºC 3min 72ºC 7min x35 95ºC 30sec 45ºC 30sec 72ºC 1min x35 Ciklus 1 Ciklus 2 Ciklus 3 Inicijalna denaturacija Denaturacija DNK Aniling prajmera Elongacija Finalna elongacija Mitrović MATERIJAL I METODE 44 3.3.1. Multipleks PCR Za istovremenu detekciju i identifikaciju AY i Stolbur fitoplazmi u jednoj reakciji uveden je multipleks PCR za umnoţavanje groEL gena kod ove dve grupe fitoplazmi. Od ukupno osam dizajniranih prajmera za umnoţavanje groEL gena kod AY i Stolbur fitoplazmi, odabrana su tri prajmera za multipleks PCR reakciju i to su AYgroelF, AYgroelR i STOLstampR. PCR reakcija je takoĎe obavljana u reakcionoj smeši zapremine 25 µl koja se sastojala od 12.5 µl 2xPCR Master mix-a, 10.5 µl bidestilovane i sterilisane vode, 0.5 µl AYgroelF prajmera i po 0.25 µl prajmera AYgroelR i STOLstampR (svi prajmeri su koncentracije 20 pmol/µl) i 1 µl izolovane ukupne DNK razblaţene u odnosu 1:100. Kao negativna kontrola korišćena je reakciona smeša sastavljena od svih reagenasa potrebnih za umnoţavanje DNK ali bez dodate DNK. Ciklus u kome se odvijala PCR reakcija se sastoji od inicijalne denaturacije na 94°C u trajanju od 1 minuta, 35 ciklusa u kojima je denaturacija na 94°C u trajanju od 30 sekundi, hibridizacija prajmera na 52°C u trajanju od 15 sekundi i elongacija na 72°C u trajanju od 2 minuta i 30 sekundi, nakon svih 35 ciklusa finalna elongacija je na 72°C u trajanju od 5 minuta. 3.3.2. Vizuelizacija produkata PCR reakcije Vizuelizacija fragmenata dobijenih PCR reakcijom uraĎena je u 1% agaroznom gelu uronjenom u 1xTBE pufer (Prilog A) pri naponu od 100 V. Gel zapremine 25 ml je pripreman tako što je u 0.25 g agaroze dodato 25 ml 1xTBE pufera a potom je smeša zagrejana do ključanja u mikrotalasnoj pećnici. Gel je potom razlivan u kalup u koji je postavljen češalj i ostavljen na sobnoj temperaturi da se ohladi i stegne. Nakon toga je izvaĎen češalj a kalup sa gelom postavljen u kadicu za horizontalnu elektroforezu (BlueMarine 100, Serva) i naliven 1xTBE pufer do količine dovoljne da gel bude u potpunosti uronjen u pufer. U bunarčiće gela su nalivani uzorci (4 µl) prethodno pomešani sa bojom (1 µl 6x Loading Dye, MBI Fermentas, Litvanija). Kao marker u gelovima je korišćen 1kb marker (MBI Fermentas, Litvanija) čiji su fragmenti veličina (od vrha) 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 Mitrović MATERIJAL I METODE 45 i 250 bp. Produkti iz gela su potom obojeni u 0.1% rastvoru etidijum bromida u trajanju od 10 minuta, a vizuelizacija je obavljena posmatranjem na UV transiluminatoru. Pozitivnom reakcijom smatrana je pojava fragmenata očekivane veličine, odreĎene poreĎenjem sa markerom. 3.4. ANALIZA POLIMORFIZMA DUŢINE RESTRIKCIONIH FRAGMENATA (RFLP ANALIZA) Za identifikaciju AY fitoplazmi na osnovu 16S rDNK, produkti PCR reakcije umnoţeni pomoću R16F2n/R16R2 para prajmera su digerirani restrikcionim enzimima Tru1I (MseI), HhaI, RsaI i Tsp509I (TasI). Restrikcioni enzim Tru1I daje ukupno dva profila i koristi se za razlikovanje podgrupe 16SrI-C od svih ostalih podgrupa, enzim HhaI takoĎe daje dva profila gde podgrupe 16SrI-B, I-M i I-L imaju isti profil a sve ostale podgrupe drugi. Kombinacijom ova dva enzima moguće je razlikovati podgrupe 16SrI-A, I-B i I-C (Lee i sar., 1998b). Enzim RsaI se koristi za razlikovanje podgrupe 16SrI-F od svih ostalih (Marcone i sar., 2000), a Tsp509I za razlikovanje podgrupe 16SrI-P od svih ostalih (pronaĎen na osnovu virtuelnog RFLP profila). Za identifikaciju Stolbur fitoplazmi korišćen je Tru1I restrikcioni enzim na R16F2n/R16R2 amplikone. Na ovaj način se dobija specifičan RFLP profil koji ove fitoplazme jasno odvaja od ostalih grupa fitoplazmi. TakoĎe je korišćen MboII enzim za dokazivanje postojanja razlika izmeĎu dva 16S rRNK operona kod soja 99/10. Analiza AYgroelF/AYgroelR amplikona je uraĎena pomoću Tru1I, AluI i TaqI restrikcionih enzima, a analiza STOLgroesF/STOLstampR amplikona je uraĎena pomoću AluI i Tru1I restrikcionih enzima. Analiza f/rTufAy amplikona kod AY fitoplazmi je uraĎena pomoću MboI (Sau3AI) (Marcone i sar., 2000), Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima, dok je kod Stolbur fitoplazmi ovaj amplikon analiziran pomoću enzima HpaII. Analiza rpL2F3/rp(I)R1A amplikona kod AY fitoplazmi je uraĎena pomoću restrikcionih enzima HhaI, AluI i Tsp509I, dok je analiza amplikona dobijenih AYsecYF1/AYsecYR1 parom prajmera uraĎena korišćenjem Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima. Mitrović MATERIJAL I METODE 46 Sve reakcije RFLP analize su se odvijale u reakcionoj smeši koja se po uzorku sastojala od 9.75 µl destilovane vode, 2.5 jedinice (U) odreĎenog restrikcionog enzima, 2 µl odgovarajućeg pufera koji je dobijen uz svaki restrikcioni enzim i, u zavisnosti od količine umnoţenog amplikona, od 3 do 7 µl PCR produkta (što je oko 100-200 ng). Reakcione smeše su inkubirane tokom noći na temperaturi od 65ºC za restrikcione enzime TaqI, Tru1I i Tsp509I, odnodno na 37ºC za AluI, HhaI, MboI, MboII, HpaII i RsaI (Tabela 7). Razdvajanje i vizuelizacija produkata digestije uraĎena je elektroforetskim razdvajanjem u 1% ili 2% agaroznom gelu za restrikcione enzime HpaII, HhaI, RsaI i MboI, odnosno u 6% ili 8% poliakrilamidnom gelu za restrikcione enzime TaqI, AluI, MboII, Tsp509I i Tru1I. Gelovi uronjeni u 1xTBE pufer su podvrgnuti elektroforetskom razdvajanju pri naponu od 100V za agarozni gel, 120V za poliakrilamidni gel sa 10 bunarčića zapremine 5 ml, odnosno 130 V za poliakrilamidni gel sa 14 bunarčića zapremine 25 ml. Agarozni gel je pripreman kao i za vizuelizaciju PCR produkata, pri čemu je pravljeno 35 ml gela. Za 2% agarozni gel je sipano 0.7 g agaroze u 35 ml 1xTBE pufera, umesto 0.35 g koliko je sipano za 1% gel. Poliakrilamidni gel je pripreman tako što je u bidestilovanu vodu dodat 10xTBE pufer, akrilamid/bisakrilamid (Sigma-Aldrich, Nemačka), APS i TEMED (Acros Organics, SAD). Količine hemikalija neophodnih za pravljenje ovog gela date su u Prilogu B. Gel je naliven izmeĎu dva stakla, a zatim je uronjen češalj i gel ostavljen 30 minuta da polimerizuje na sobnoj temperaturi i zaštićen od direktne sunčeve svetlosti. Nakon polimerizacije gel je pričvršćen za aparat za vertikalnu elektroforezu (Mini PROTEAN® Tetra Cell, BioRad ili Cole-Parmer 28570-05), komora gela je nalivena sa 1xTBE puferom i bunarčići su očišćeni. Pre nanošenja uzoraka u bunarčiće, kompletan digerirani produkt svakog uzorka pomešan je sa bojom za nalivanje (6x Loading Dye, MBI Fermentas, Litvanija). Kao marker je korišćen 100 bp marker (MBI Fermentas, Litvanija) čiji su fragmenti veličina od vrha 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 i 100 bp, kao i marker PhiX174 HaeIII digeriran (MBI Fermentas, Litvanija) čiji su fragmenti veličina od vrha 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 i 72 bp. Gel je obojen potapanjem u 0.05% rastvor etidijum bromida u trajanju od 30 minuta, a vizuelizacija produkata obavljena je posmatranjem na UV transiluminatoru. Mitrović MATERIJAL I METODE 47 Tabela 7. Pregled korišćenih restrikcionih enzima, njihove osnovne osobine, restrikciona mesta i analizirani amplikoni 3.5. SEKVENCIRANJE I FILOGENETSKA ANALIZA Pre sekvenciranja odabrani PCR produkti su prečišćeni pomoću mi-PCR Purification Kit-a (Metabion International, Nemačka), a prečišćavanje je uraĎeno po uputstvu proizvoĎača. Nakon prečišćavanja amplikoni su direktno poslati na usluţno sekvenciranje u Macrogen Inc. (Koreja). Amplikoni dobijeni P1/P7 parom prajmera su sekvencirani u oba smera pomoću dva uzvodna prajmera, P1 i R16F2n, i jednog reverznog prajmera P7 na automatskom kapilarnom sekvenatoru. Radi tačnije filogenetske analize sekvenciran je ceo groEL gen koji se nalazi u okviru duţeg amplikona dobijenog umnoţavanjem LA-PCR-om (long and accurate) koristeći LA Taq DNK polimerazu (TaKaRa Bio, Shiga, Japan) a pomoću prajmera ES- 1/Nad-2. Ovi amplikoni su sekvencirani direktno sa 11 prajmera: ES-1, ES-2, EL-1, EL- 3, EL-F1w, Amp.N1, Amp-3, Amp-C1, Nad-1, Nad-2 i Nad-3 (Kakizawa i sar., 2006). 5‟......^AATT......3‟ 3‟........TTAA^....5‟ 5‟......^GATC......3‟ 3‟........CTAG^....5‟ 5‟...GAAGA(N) 8 ^...3‟ 3‟...CTTCT(N) 7 ^....5‟ 5‟......GCG^C......3‟ 3‟......C^GCG......5‟ 5‟......GT^AC......3‟ 3‟......CA^TG......5‟ 5‟......T^TAA......3‟ 3‟......AAT^T......5‟ 5‟......AG^CT......3‟ 3‟......TC^GA......5‟ 5‟......T^CGA......3‟ 3‟......AGC^T......5‟ 5‟......C^CGG......3‟ 3‟......GGC^C......5‟ Mitrović MATERIJAL I METODE 48 Nukleotidne sekvence su odreĎene korišćenjem metode terminacije didezoksinukleotid lanca pomoću automatskog DNK sekvenatora (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems Japan, Tokio, Japan). Pored P1/P7 amplikona i celog groEL gena, takoĎe su sekvencirani f/rTufAy, rpL2F3/rp(I)R1A i AYsecYF1/AYsecYR1 amplikoni odabranih sojeva a čije sekvence nisu već prethodno bile javno dostupne. Sva tri navedena amplikona su sekvencirana u oba smera sa po jednim uzvodnim i jednim nizvodnim prajmerom koji su i korišćeni za njihovo umnoţavanje. Dobijene sekvence su analizirane i obraĎene pomoću programa Pregap4 verzija 1.5 koji se nalazi u okviru Staden paketa, a zatim je u okviru Gap4 programa iz istog paketa odreĎena konsenzus sekvenca. Sve dobijene konsenzus sekvence su deponovane u NCBI Banku gena, gde im je i dodeljen pristupni broj (GenBank Accession number). Pristupni brojevi svih korišćenih sekvenci 16S rRNK, groEL, tuf, rp i secY gena, kako novodobijenih tako i onih prethodno deponovanih u Banci gena, su navedeni u delu 'Rezultati' u Tabelama 8, 9, 12, 14, 16 i 18. Za proračun nukleotidne i aminokiselinske sličnosti na osnovu analiziranih sekvenci kao i za filogenetske analize upotrebljen je softverski paket MEGA5 (Tamura i sar., 2011). Filogenetska analiza je uraĎena na osnovu sekvenci AY fitoplazmi 16S rRNK gena sa jedne i groEL gena sa druge strane. Ovi rezultati su poreĎeni sa filogenetskom analizom zdruţenih sekvenci tuf, rp i secY gena kod AY fitoplazmi. Filogenetska stabla 16S rDNK i groEL sekvenci su rekonstruisana na osnovu 31 soja fitoplazmi (29 sojeva AY fitoplazmi meĎu kojima su i sojevi AYWB i OY-M, a uključene su i sekvence druge dve fitoplazme sekvencirane u celosti - 'Ca. P. australiense' i 'Ca. P. mali'), dok je u analizi kao spoljna grupa korišćena sekvenca ovih gena kod Acholeplasma laidlawii soj PG-8A. Filogenetsko stablo ostala tri analizirana gena je rekonstruisano na osnovu sekvenci 11 odabranih sojeva AY fitoplazmi, pored kojih su takoĎe u analizu uključene sekvence sve četiri fitoplazme sekvencirane u celosti. Kao spoljna grupa je i ovaj put korišćena sekvenca ovih gena kod A. laidlawii. Mitrović MATERIJAL I METODE 49 Sva tri filogenetska stabla su rekonstruisana korišćenjem Maximum Parsimony metode i analize stabilnosti (bootstrap analize) sa 1000 ponavljanja pri čemu su sva prazna mesta (gapovi) uzimana u obzir pri rekonstrukciji (opcija 'use all sites'). Mitrović REZULTATI 50 4. REZULTATI 4.1. ODREĐIVANJE PROTOKOLA ZA UMNOŢAVANJE groEL GENA KOD ASTER YELLOWS FITOPLAZMI Radi provere dizajniranih prajmera, odreĎivanja tačnog protokola za njihovo korišćenje, kao i uspešnog umnoţavanja groEL gena, odabrano je osam sojeva prethodno identifikovanih fitoplazmi a izolovanih iz šargarepe poreklom iz Srbije (Duduk i sar., 2008a) i soj PopD poreklom sa topole (videti odeljak 3.2.1.). Primenjene su različite kombinacije dva uzvodna i dva nizvodna prajmera, PCR reakcione smeše su sadrţale 2, 2.5 ili 2.75 mM MgCl2, a takoĎe su primenjivane i različite temperature hibridizacije koje su se kretale izmeĎu 50 i 57ºC. Kao osnovni protokol u kome su menjane temperature hibridizacije, korišćen je ciklus za umnoţavanje 16S rDNK. Primenom para prajmera AYgroesF i AYampR na temperaturi hibridizacije od 50ºC i koncentracijom MgCl2 od 2 i 2.5 mM, umnoţeni su fragmenti veličine oko 2000 bp što i odgovara predviĎenoj veličini ovog fragmenta u odnosu na sekvencu Marguerite yellows fitoplazme na osnovu koje su i dizajnirani prajmeri (Slika 5). MeĎutim, pored ovog fragmenta umnoţen je i fragment duţine oko 600 bp kao i drugi nespecifični fragmenti koji mogu biti poreklom od simbiontskih bakterija iz izolovanog materijala, od hloroplasta ili same biljke. U reakcijama gde je koncentracija MgCl2 iznosila 2.5 mM uspešno je umnoţen groEL gen kod svih 10 ispitivanih uzoraka, za razliku od reakcija sa 2 mM MgCl2 gde se umnoţilo šest od 10 ispitivanih uzoraka (Slika 5). Da bi se proverila mogućnost umnoţavanja ovog fragmenta kod svih ispitivanih sojeva samo sa koncentracijom MgCl2 koja se nalazila u PCR Master Mix-u (odnosno u koncentraciji od 2 mM), kao i mogućnost da ne doĎe do umnoţavanja nespecifičnih fragmenata, u sledećoj PCR reakciji temperatura hibridizacije je podignuta za jedan stepen i iznosila je 51ºC a MgCl2 nije dodat (Slika 6). Mitrović REZULTATI 51 Slika 5. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroesF/AYampR sa koncentracijom MgCl2 od 2 mM (levo) i 2.5 mM (desno) na temperaturi hibridizacije od 50ºC. Svi sojevi su iz šargarepe (Duduk i sar., 2008a) osim soja PopD koji je iz topole. Brojevi (1) i (2) kod soja PopD označavaju broj ekstrakcije. M, molekularni marker 1kb, veličine fragmenata u bp od vrha su: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 i 250. Slika 6. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroesF/AYampR sa koncentracijom MgCl2 od 2 mM na temperaturi hibridizacije od 51ºC. Oznake uzoraka i marker su kao na Slici 5. Iz Slike 6 se uočava da povećanjem temperature hibridizacije za jedan stepen ne dolazi do umnoţavanja nespecifičnih fragmenata osim onog veličine oko 600 bp, što govori da se povećanjem temperature povećava specifičnost prajmera. MeĎutim, od 10 testiranih uzoraka, kod samo tri su se pojavili ţeljeni amplikoni za razliku od prethodne reakcije u kojoj je koncentracija MgCl2 iznosila 2.5 mM i gde su se svi umnoţili. Iz tog razloga je u sledećim PCR reakcijama koncentracija MgCl2 iznosila 2.5 mM, a temperatura hibridizacije je povećavana do 55ºC za po jedan stepen (Slika 7). D Mitrović REZULTATI 52 Slika 7. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroesF/AYampR sa koncentracijom MgCl2 od 2.5 mM na temperaturi hibridizacije od A - 52ºC, B - 53ºC, C - 54ºC i D - 55ºC. Oznake uzoraka i marker su kao na Slici 5. PoreĎenjem dobijenih gelova uočen je postepen gubitak svih nespecifičnih fragmenata sa porastom temperature hibridizacije, tako da se temperatura od 55ºC pokazala kao najbolja za rad sa ovim parom prajmera. Pošto se upotrebom para prajmera AYgroesF/AYampR na temperaturi hibridizacije od 55ºC dobija najčistije umnoţavanje ovog amplikona sa jedne strane, ali se od 10 testiranih uzoraka na ovaj način umnoţilo svega sedam, ispitivana je mogućnost upotrebe ostalih dizajniranih prajmera u različitim kombinacijama. Uspešne kombinacije ostalih prajmera bi se kasnije mogle primeniti u semi-nested ili nested reakcijama, a sa ciljem umnoţavanja svih testiranih uzoraka. Tako su PCR reakcije sa parom prajmera AYgroelF/AYampR i AYgroesF/AYgroelR izvedene na dve krajnje temperature anillinga (50 i 55ºC) i sa koncentracijom MgCl2 od 2 i 2.5 mM (Slike 8 i 9). TakoĎe je izvedena i A B C D Mitrović REZULTATI 53 AYgroesF/AYgroelR PCR reakcija sa još većom količinom MgCl2 koja je iznosila 2.75 mM (Slika 9, C). Slika 8. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroelF/AYampR na temperaturi hibridizacije od 50ºC (levo) i 55ºC (desno). U oba gela PCR reakcije prikazane u linijama 2-6 su izvedene u koncentraciji MgCl2 od 2 mM dok su linije od 7-12 izvedene u koncentraciji od 2.5 mM MgCl2. Oznake uzoraka i marker su kao na Slici 5. Slika 9. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroesF/AYgroelR na temperaturi hibridizacije od 50ºC sa 2 mM MgCl2 (A), sa 2.5 mM MgCl2 (B) i sa 2.75 mM MgCl2 (C), kao i na temperaturi hibridizacije od 55ºC sa 2.5 mM MgCl2 (D). Oznake uzoraka i marker su kao na Slici 5. A D C B Mitrović REZULTATI 54 Pošto je u svim PCR reakcijama izvedenim sa parom prajmera AYgroelF/AYampR, nezavisno od temperature hibridizacije i prisutne količine MgCl2, došlo do umnoţavanja dodatnih nespecifičnih fragmenata, za razliku od para prajmera AYgroesF/AYgroelR koji je imao mali broj slabo umnoţenih dodatnih fragmenata i to samo na temperaturi hibridizacije od 50ºC u reakcijama sa 2 mM MgCl2, izvedene su dve semi-nested reakcije sa parom prajmera AYgroesF/AYgroelR. Prva je bila na temperaturi hibridizacije od 50ºC sa 2.5 mM MgCl2, a druga je bila na temperaturi hibridizacije od 57ºC sa 2 i 2.5 mM MgCl2. Kao uzorak za obe semi-nested reakcije uzeti su amplikoni AYgroesF/AYampR dobijeni iz PCR reakcije izvedene na temperaturi hibridizacije od 54ºC sa 2.5 mM MgCl2 (Slika 10). Slika 10. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroesF/AYgroelR u semi-nested reakciji nakon PCR reakcije sa AYgroesF/AYampR koja je u direktnom PCR-u izvedena na temperaturi hibridizacije od 54 ºC i sa 2.5 mM MgCl2. Temperature hibridizacije semi-nested reakcija su iznosile A - 50ºC sa 2.5 mM MgCl2 i B - 57ºC gde su PCR reakcije prikazane u linijama 2-6 izvedene sa 2 mM MgCl2 dok su linije od 7-12 izvedene sa 2.5 mM MgCl2. Oznake uzoraka i marker su kao na Slici 5. Poslednja kombinacija prajmera AYgroelF/AYgroelR je izvedena na temperaturi hibridizacije od 55ºC, jer su sve prethodne reakcije sa drugim kombinacijama prajmera davale najbolje rezultate na ovoj temperaturi. PCR reakciona smeša je bila sa 2 mM MgCl2 da bi se video osnovni kapacitet i mogućnost ovih prajmera (Slika 11, A). Pošto je umnoţavanje bilo veoma uspešno (bez umnoţavanja dodatnih nespecifičnih fragmenata kao i jakim amplikonima ţeljene veličine od oko 1400 bp), uraĎen je nested PCR na temperaturi hibridizacije od 55ºC sa 2 mM MgCl2 na A B Mitrović REZULTATI 55 C B A amplikone AYgroesF/AYampR koji su dobijeni u direktnoj PCR reakciji na temperaturama hibridizacije od 50 i 55ºC takoĎe sa 2 mM MgCl2 (Slika 11, B i C). Slika 11. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima A - AYgroelF/AYgroelR na temperaturi hibridizacije od 55ºC sa 2 mM MgCl2, B - AYgroesF/AYampR sa 2 mM MgCl2 na temperaturi hibridizacije od 55ºC u linijama 1-4 i 50ºC u linijama 6-9 i C - AYgroelF/AYgroelR na temperaturi hibridizacije od 55ºC sa 2 mM MgCl2 dobijene u nested reakciji na amplikone iz reakcije prikazane na gelu B. Oznake uzoraka i marker su kao na Slici 5. PoreĎenjem svih dobijenih rezultata četiri tipa amplikona, AYgroesF/AYampR, AYgroesF/AYgroelR, AYgroelF/AYampR i AYgroelF/AYgroelR, na različitim temperaturama hibridizacije i sa različitom koncentracijom MgCl2 u PCR reakcionim smešama, uočeno je da su sva četiri dizajnirana prajmera rezultirala umnoţavanjem ţeljenog regiona, ali je najbolje rezultate dala kombinacija prajmera AYgroelF/AYgroelR na temperaturi hibridizacije od 55ºC sa 2 mM MgCl2, koja se po potrebi moţe koristiti i kao nested PCR reakcija nakon direktne AYgroesF/AYampR PCR reakcije izvedene u identičnim uslovima. Stoga su za dalje istraţivanje varijabilnosti groEL gena RFLP metodom korišćeni AYgroelF/AYgroelR amplikoni dobijeni pod navedenim uslovima. 4.2. DETEKCIJA I IDENTIFIKACIJA ASTER YELLOWS FITOPLAZMI - REFERENTNIH SOJEVA I SOJEVA IZ SRBIJE U istraţivanje su uključena ukupno 34 soja Aster yellows fitoplazmi iz kolekcije i iz Srbije. Sojevi iz kolekcije, kojih ima ukupno 23, prethodno su preneti na test biljku Mitrović REZULTATI 56 Catharanthus roseus iz različitih domaćina poreklom iz 10 zemalja širom sveta (Tabela 8). Od sojeva poreklom iz Srbije u analizu su uključena tri prethodno opisana soja iz šargarepe (Duduk i sar., 2009), kao i osam sojeva čija je DNK izolovana tokom ove doktorske teze, a poreklom su sa topole i vinke. 4.2.1. Soj PopD Iz uzorkovanog biljnog materijala biljke topole iz Beograda sa simptomima karakterističnim za prisustvo fitoplazmi (Slika 12) je uraĎena izolacija DNK a potom i detekcija fitoplazmi. Nakon vizuelizacije produkata direktne PCR reakcije upotrebom P1/P7 univerzalnih prajmera uočen je fragment veličine oko 1800 bp, a nakon nested upotrebom R16F2n/R16R2 univerzalnih prajmera fragment veličine oko 1200 bp, što odgovara očekivanim veličinima ovih amplikona (Slika 13, A i B). Zbog simptoma odumiranja cele biljke ovaj soj je nazvan PopD (populus decline). Slika 12. A i B - Fotografije zdrave biljke topole (desno) i sa simptomima karakterističnim za prisustvo fitoplazmi (levo); A - 06.06.2009. godine i B - 22.06.2009. godine; C - Izgled grane sa listovima zdrave topole (desno) i sa simptomima karakterističnim za prisustvo fitoplazmi (levo) Nakon detekcije fitoplazmi uraĎena je identifikacija RFLP metodom pomoću enzima Tru1I i HhaI primenjenih na amplikon R16F2n/R16R2 (Slika 13, C). Na osnovu poreĎenja dobijenih profila sa podacima iz literature, detektovana fitoplazma je klasifikovana kao pripadnik AY grupe (16SrI). A B C Mitrović REZULTATI 57 1500 bp 2000 bp 1000 bp 1500 bp A B C Slika 13. A i B - Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima P1/P7 (A) i R16F2n/R16R2 (B) uzorka topole. Brojevi (1) i (2) označavaju broj ekstrakcije. M (A), molekularni marker 1kb, veličine fragmenata u bp od vrha su: 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500 i 250; M (B), molekularni marker Express DNA Ladder, veličine fragmenata u bp od vrha su: 5000, 3000, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 300 i 100; C - Prikaz digeriranih amplikona R16F2n/R16R2 topole pomoću restrikcionih enzima Tru1I (linija 1) i HhaI (linija 2) razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu. M, marker PhiX174 (HaeIII digeriran), veličine fragmenata u bp od vrha su: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 i 72. Podgrupa 16SrI-P prvi put je opisana 2003. godine (Šeruga i sar., 2003) kada je i data sekvenca P1/P7 regiona ove fitoplazme (pristupni broj AF503568). Pošto su svi do sada detektovani pripadnici podgrupe I-P poreklom sa topole, tako je radi preciznog odreĎivanja podgrupe soja PopD dobijeni P1/P7 amplikon prečišćen i sekvenciran sa dva uzvodna prajmera, P1 i R16F2n, i jednim nizvodnim prajmerom, P7. Nakon obrade sekvenci dobijena je konsenzus sekvenca soja PopD duţine 1494 bp koja je poreĎena sa svim 16S rDNK sekvencama dostupnim u NCBI Banci gena korišćenjem programa Blast (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Sekvenca PopD soja je pokazala 100% homologije sa gore pomenutim sojem Aster yellows fitoplazme iz Hrvatske (AF503568), podgrupa I-P. Rezultat je potvrĎen i korišćenjem online aplikacije iPhyClassifier (http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/ iphyclassifier.cgi) koja generiše in silico gelove i koja je kao rezultat dala da soj PopD ima 99.1% sličnosti sa referentnim sojem AY fitoplazmi M30790, kao i da je odreĎenje PopD soja da je pripadnik podgrupe 16SrI-P jer je pokazao koeficijent sličnosti virtuelnih RFLP profila 1.00 sa referentnim sojem ove podgrupe, a to je gore već pomenuti soj iz Hrvatske. Sekvenca 16S rDNK soja PopD je deponovana u NCBI Banci Mitrović REZULTATI 58 gena pod pristupnim brojem prikazanim u Tabeli 8. Zbog svega navedenog, soj PopD je uključen u dalja ispitivanja zajedno sa ostalim referentnim sojevima AY fitoplazmi kao predstavnik ribozomalne podgrupe 16SrI-P. 4.2.2. Sojevi Aster yellows fitoplazmi iz kolekcije i iz šargarepe Da bi se potvrdili podaci preuzeti iz literature o pripadnosti odreĎenoj podgrupi unutar grupe 16SrI sojeva iz kolekcije i tri soja izolovana iz šargarepe, a i odredila podgrupa kod četiri soja takoĎe iz kolekcije koji se prvi put koriste u analizi (o kojima nema literaturnih podataka), umnoţena je 16S rDNK u direktnoj PCR reakciji prajmerima P1/P7, a potom je ova reakcija praćena nested PCR reakcijom sa prajmerima R16F2n/R16R2. Pored sojeva koji pripadaju AY grupi, u analizu su uključena i dva soja, STOL i ‟Ca. P. japonicum‟, koji pripadaju grupi 16SrXII evolutivno srodnoj sa AY fitoplazmama. Ova dva soja su uključena u analizu radi kasnije potvrde specifičnosti dizajniranih prajmera za umnoţavanje groEL gena. Svih 26 testiranih sojeva, osim negativne kontrole, uspešno je umnoţeno, što je potvrĎeno prisustvom fragmenta odgovarajuće veličine od oko 1800 bp u direktnoj, odnosno 1200 bp u nested PCR reakciji. Na Slici 14 su radi lakše preglednosti prikazani produkti ovih PCR reakcija kod samo nekoliko testiranih sojeva. Slika 14. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima P1/P7 (levo) i R16F2n/R16R2 (desno). Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 1kb, pogledati Sliku 13. Pošto se kao standardna metoda identifikacije fitoplazmi koristi RFLP metoda na amplikone R16F2n/R16R2 uz pomoć 17 restrikcionih enzima za sve grupe i 2000 bp 1500 bp 1000 bp Mitrović REZULTATI 59 podgrupe fitoplazmi, a s obzirom na to da su ispitivani izolati pripadnici samo 16SrI grupe, primenjena su samo tri restrikciona enzima Tru1I, HhaI i RsaI uz pomoć kojih je moguće razlikovati podgrupe 16SrI-A, I-B, I-C i I-F. Sve razlike koje postoje izmeĎu podgrupe 16SrI-B i podgrupa 16SrI-M i I-L se u literaturi pripisuju postojanju razlika izmeĎu dva operona 16S rDNK gena (intergenskoj heterogenosti) kod podgrupa 16SrI- M i I-L tako da oni imaju RFLP profile identične profilima podgrupe 16SrI-B osim kada se primene HinfI i HaeIII restrikcioni enzimi (Marcone i sar., 2000). S obzirom na to da su tri soja iz podgrupa 16SrI-M i I-L koja se koriste u ovoj analizi referentni sojevi ovih podgrupa čuvani u kolekciji, kao i da postoje njihove 16S rDNK sekvence, analiza sa HinfI i HaeIII restrikcionim enzimima nije uraĎena. Na Slici 15 su prikazani samo odabrani sojevi koji predstavljaju odreĎene grupe RFLP profila, a ostali sojevi su imali profil koji je bio identičan nekom od prikazanih profila. Slika 15. Prikaz digeriranih amplikona R16F2n/R16R2 pomoću restrikcionih enzima Tru1I (A), HhaI (B) i RsaI (C) razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu (A i B) i 2% agaroznom gelu (C). A i B - M, marker PhiX174 (videti Sliku 13 sa strane 56). C - M, marker 100 bp, veličine fragmenata u bp od vrha su: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 i 100. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. Nakon primene Tru1I restrikcionog enzima svi sojevi osim sojeva CA, PPT, KVF i LEO su imali identičan profil kao sojevi PrG i CHRYM, dok su četiri gore pomenuta soja imala profil identičan profilu soja CA (Slika 15, A). PoreĎenjem profila dobijenih nakon primene restrikcionog enzima HhaI, uočeno je da sojevi AVUT, A B C Mitrović REZULTATI 60 AY2192, PRIVA, AY-W, DIV, PYR, RV, GLAWC, NA, SAY, ca2006/9, AY-27, AY- J, ca2006/5 i MBSColombia imaju meĎusobno identične profile kao soj PrG sa Slike 15, B, dok ostali sojevi imaju drugi tip profila koji odgovara profilu sojeva CA i CHRYM sa iste slike. Nakon primene RsaI restrikcionog enzima uočeno je da samo soj AY-A ima specifičan RFLP profil koji se razlikuje od svih ostalih. Prema dobijenim podacima primenom RFLP metode sa ova tri restrikciona enzima, a poreĎenjem sa literaturnim podacima o izgledu RFLP profila kada se primene ovi restrikcioni enzimi, sojevi CHRYM, NJ-AY, PVM, ca2006/1 i GD su identifikovani kao pripadnici podgrupe 16SrI-A, sojevi AVUT, AY2192, PRIVA, AY-W, DIV, PrG, PYR, RV, GLAWC, NA, SAY, ca2006/9, AY-27, AY-J, ca2006/5 i MBSColombia su identifikovani kao pripadnici podgrupe 16SrI-B, sojevi CA, PPT, KVF i LEO kao pripadnici podgrupe 16SrI-C, a soj AY-A kao pripadnik podgrupe 16SrI-F (Tabela 8). Na ovaj način je potvrĎeno da su dobijeni rezultati u skladu sa literaturnim podacima. Radi kompletnije analize 16S rDNK, P1/P7 amplikoni sojeva kod kojih ne postoje javno dostupne sekvence ovog gena su prečišćene i sekvencirane, a nakon obrade su deponovane u NCBI Banku gena (Tabela 8). Tabela 8. Oznake svih testiranih sojeva, njihovi osnovni epidemiološki podaci, pripadnost 16SrI podgrupi i njihovi pristupni brojevi 16S rDNK Oznaka soja Domaćin Bolest koju izaziva Zemlja porekla 16SrI podgrupa (Literatura) Pristupni broj 16S rDNA (*) CHRYM Hrizantema (Chrysanthemum frutescens) Chrysanthemum yellows Nemačka A (Marcone i sar., 2000) AY265214 (1527) ca2006/1 Šargarepa (Daucus carota) Carrot yellows Srbija A (Duduk i sar., 2009) EU215424 (1720) PVM Bokvica jelenja (Plantago coronopus) Plantago virescence Nemačka A (Bertaccini i sar., 2000) AY265216 (1525) NJ-AY Aster New Jersey aster yellows Nju Dţerzi, SAD A (Lee i sar., 1993) HM590622# (1504) GD (GD1) Dren (Cornus racemosa) Grey dogwood stunt Njujork, SAD A (Lee i sar., 2004b) DQ112021 (1529) AVUT Lepa kata (Callistephus chinensis) Aster yellows Nemačka M (Marcone i sar., 2000) AY265209 (1527) Mitrović REZULTATI 61 Tabela 8 (nastavak). Oznake svih testiranih sojeva, njihovi osnovni epidemiološki podaci, pripadnost 16SrI podgrupi i njihovi pristupni brojevi 16S rDNK Oznaka soja Domaćin Bolest koju izaziva Zemlja porekla 16SrI podgrupa (Literatura) Pristupni broj 16S rDNA (*) AY2192 Lepa kata (Callistephus chinensis) Aster yellows Nemačka L (Marcone i sar., 2000) AY180957 (1527) PRIVA Jagorčevina (Primula spp). Primrose virescence Nemačka L (Marcone i sar., 2000) AY265210 (1525) AY-W Aster American aster yellows Florida, SAD B (Bertaccini i sar., 2000) HM590617# (1740) DIV Divlja rukola (Diplotaxis erucoides) Diplotaxis virescence Španija B (Bertaccini i sar., 2000) HM590618# (1705) PrG Jagorčevina (Primula spp). Primula green yellows Velika Britanija B (Ovaj doktorat) HM590623# (1730) PYR Breskva (Prunus persica) Peach yellows Italija B (Ovaj doktorat) HM590624# (1591) RV Uljana repica (Brassica napus) Oilseed rape virescence Francuska B (Bertaccini i sar., 2000) HM590625# (1655) GLAWC Gladiola (Gladiolus spp.) Gladiolus witches‟-broom Holandija B (Bertaccini i sar., 2000) HM590619# (1739) NA Nepoznat Periwinkle virescence Italija B (Ovaj doktorat) HM590621# (1760) SAY Celer (Apium graveolens) Aster yellows Kalifornija, SAD B (Bertaccini i sar., 2000) AF222063 (1830) ca2006/9 Šargarepa (Daucus carota) Carrot yellows Srbija B (Duduk i sar., 2009) EU215426 (1735) AY-27 Aster Aster yellows Kanada B (Lee i sar., 1993) HM467127# (1738) AY-J Vinka (Vinca minor) Aster yellows Francuska B (Ovaj doktorat) HM590616# (1688) ca2006/5 Šargarepa (Daucus carota) Carrot yellows Srbija B (Duduk i sar., 2009) EU215425 (1829) GQ175789 (1829) MBSColom bia Kukuruz (Zea mays) Maize bushy stunt Kolumbija B (Duduk i sar., 2008c) HQ530152# (1482) CA Šargarepa (Daucus carota) Carrot yellows Italija C (Bertaccini i sar., 2000) HM448473# (1797) LEO Lavlji zub (Leontodon hispidus) Leontodon yellows Italija C (Bertaccini i sar., 2000) HM590620# (1563) KVF Detelina (Trifolium spp.) Clover phyllody Francuska C (Marcone i sar., 2000) HQ530150# (1501) Mitrović REZULTATI 62 Tabela 8 (nastavak). Oznake svih testiranih sojeva, njihovi osnovni epidemiološki podaci, pripadnost 16SrI podgrupi i njihovi pristupni brojevi 16S rDNK Oznaka soja Domaćin Bolest koju izaziva Zemlja porekla 16SrI podgrupa (Literatura) Pristupni broj 16S rDNA (*) PPT Krompir (Solanum tuberosum) Potato purple top Francuska C (Marcone i sar., 2000) HQ530151# (1548) AY-A (ACLR-AY) Kajsija (Prunus armeniaca) Apricot chlorotic leafroll Španija F (Lee i sar., 2004b) AY265211 (1525) PopD Topola (Populus nigra) Populus decline Srbija P (Ovaj doktorat) HM590626# (1494) 79/10 Vinka (Vinca minor) / Srbija (Kalemegdan) C (Ovaj doktorat) / 92/10 Topola (Populus nigra) / Srbija (InĎija) P (Ovaj doktorat) / 205/10 Vinka (Vinca minor) / Srbija (Kalemegdan) C (Ovaj doktorat) / 84/11 Vinka (Vinca minor) / Srbija (Tašmajdan) B (Ovaj doktorat) / 87/11 Vinka (Vinca minor) / Srbija (Kalemegdan) B (Ovaj doktorat) / 90/11 Vinka (Vinca minor) / Srbija (Kalemegdan) B (Ovaj doktorat) / 91/11 Vinka (Vinca minor) / Srbija (Kalemegdan) B (Ovaj doktorat) / *- duţina sekvence u bp; #- sekvence dobijene kao rezultat ove doktorske teze 4.2.3. Ostali sojevi Aster yellows fitoplazmi iz Srbije Uzorci sa simptomima ţutila listova, virescencije i pojave filodija sakupljeni u Beogradu i okolini tokom 2010. i 2011. godine su podvrgnuti izolaciji DNK, a potom je uraĎena prethodno opisana detekcija i identifikacija (identična kao za referentne sojeve) primenom P1/P7 i R16F2n/R2 prajmera, a potom RFLP analizom sa Tru1I, HhaI i RsaI restrikcionim enzimima. Iz šest simptomatičnih biljaka vinki su izolovani sojevi 79/10, 205/10, 84/11, 87/11, 90/11 i 91/11, dok je iz topole iz okoline Beograda izolovan soj 92/10 (Tabela 8). Pošto primenom Tru1I, HhaI i RsaI restrikcionih enzima nije moguće razlikovati podgrupu 16SrI-P od ostalih podgrupa, a s obzirom na to da je dokazano da je soj PopD, koji je takoĎe poreklom iz topole, pripadnik ove podgrupe, uraĎen je virtuelni RFLP u programu pDRAW32 na osnovu 16S rDNK sekvence soja PopD i generisani su in silico gelovi da bi se pronašao restrikcioni enzim koji jasno odvaja pripadnike ove podgrupe Mitrović REZULTATI 63 od ostalih. In silico analiza je pokazala da upotrebom Tsp509I restrikcionog enzima na R16F2n/R2 amplikon sve podgrupe osim 16SrI-P daju jedan isti profil koji se jasno razlikuje od profila pripadnika 16SrI-P podgrupe. Zbog toga su R16F2n/R2 amplikoni odabranih sojeva koji pripadaju svim podgrupama, kao i dva soja poreklom iz topole, PopD i 92/10, digerirani i sa enzimom Tsp509I (Slika 16). Slika 16. Prikaz digeriranih amplikona R16F2n/R2 pomoću restrikcionog enzima Tsp509I razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59). Analizom dobijenih profila sa sva četiri restrikciona enzima utvrĎeno je da sojevi 84/11, 87/11, 90/11 i 91/11 pripadaju podgrupi 16SrI-B, sojevi 79/10 i 205/10 pripadaju podgrupi 16SrI-C, dok soj 92/10 poreklom sa topole pripada podgrupi 16SrI-P kao i soj PopD koji je takoĎe sa topole (Tabela 8). Pošto je podgrupa 16SrI-P novoopisana i još uvek nedovoljno ispitana podgrupa, P1/P7 amplikon soja 92/10 je prečišćen i sekvenciran. Dobijena sekvenca duţine 1465 bp je poreĎena sa sekvencom soja PopD i uočeno je postojanje jednog varijabilnog mesta. Soj PopD, kao i referentni soj podgrupe I-P iz banke gena, na mestu 992 od početka P1 regiona imaju T, dok se kod soja 92/10 na ovom nukleotidnom mestu nalazi C. TakoĎe je uraĎena i in silico analiza upotrebom online servera iPhyClassifier kojom je utvrĎeno da sekvenca 16S rDNK soja 92/10 ima 99.2% sličnosti sa referentnim sojem Mitrović REZULTATI 64 AY fitoplazmi (M30790) i da ima koeficijent sličnosti virtuelnih RFLP profila 1.00 sa referentnim sojem podgrupe I-P iz Hrvatske (AF503568). 4.3. ANALIZA groEL GENA KOD ASTER YELLOWS FITOPLAZMI 4.3.1. Sojevi Aster yellows fitoplazmi iz kolekcije i iz šargarepe Kod svih 27 identifikovanih referentnih AY sojeva je umnoţen i analiziran groEL gen upotrebom para prajmera AYgroelF/R u direktnoj PCR reakciji ili u nested PCR reakciji nakon direktne gde je upotrebljen AYgroesF/AYampR par prajmera. Radi utvrĎivanja specifičnosti dizajniranih prajmera u analizu su takoĎe uključeni soj 'Ca. P. japonicum' i dva soja Stolbur fitoplazmi (16SrXII) koji su bliski AY fitoplazmama, kao i pripadnici grupa 16SrIII, 16SrV i 16SrX koji su detektovani i identifikovani u ranijim istraţivanjima. Kod svih 27 sojeva AY fitoplazmi je uspešno umnoţen ţeljeni amplikon veličine od oko 1400 bp, dok kod ostalih testiranih sojeva koji ne pripadaju 16SrI grupi ili nije došlo do umnoţavanja ili je došlo do nespecifičnog umnoţavanja fragmenta veličine 300 bp ili 4000 bp (Slike 17 i 18). U svim PCR reakcijama u uzorku negativne kontrole takoĎe nije došlo do umnoţavanja. Slika 17. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroelF/R referentnih sojeva dobijenih u direktnoj PCR reakciji. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 56). Mitrović REZULTATI 65 Slika 18. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroelF/R sojeva drugih 16Sr grupa dobijenih u direktnoj PCR reakciji. Kao pozitivna kontrola je upotrebljen AY soj ca2006/1. M, marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 56). Nakon uspešnog umnoţavanja groEL gena kod svih ispitivanih uzoraka, uraĎena je RFLP analiza pomoću tri restrikciona enzima TaqI, Tru1I i AluI (Slika 19). Pošto je genom fitoplazmi bogat A/T parovima kao i regionima koji se sastoje samo od A i T nukleotida a enzim Tru1I prepoznaje TTAA sekvencu kao restrikciono mesto, onda bi ovaj restrikcioni enzim trebalo da bude najbolji pokazatelj varijabilnosti ispitivanog regiona i stoga je uključen u analizu. Prema dobijenim rezultatima je utvrĎeno da upotrebom restrikcionog enzima TaqI amplikoni ostaju nedigerirani tj. da ovaj region ne poseduje TaqI restrikciono mesto. Stoga slika gela sa produktima digestije ovog restrikcionog enzima nije prikazana. Analizom ostalih dobijenih profila utvrĎeno je da se pomoću Tru1I restrikcionog enzima moţe jasno razlikovati šest različitih profila, dok se upotrebom AluI restrikcionog enzima uočava osam različitih profila. Na osnovu kombinacije dobijenih profila upotrebom ova dva restrikciona enzima moguće je identifikovati devet groELI podgrupa (Slika 19). Mitrović REZULTATI 66 Slika 19. Prikaz digeriranih amplikona AYgroelF/R pomoću restrikcionih enzima Tru1I i AluI razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker PhiX174 (videti Sliku 13 sa strane 57), s tim što na gelu Tru1I nisu prikazana četiri gornja fragmenta. Pošto su sojevi CHRYM, ca2006/1, PVM i NJ-AY upotrebom oba restrikciona enzima imali meĎusobno identične profile a različite od ostalih profila (Slika 19, profil soja NJ-AY), ovim sojevima je dodeljena podgrupa groELI-I. Soj GD koji pripada podgrupi 16SrI-A, kao i prethodna četiri soja, u analizi groEL gena pokazao je jasne razlike. Naime, nakon digestije Tru1I i AluI restrikcionim enzimima, soj GD je imao jedinstvene profile karakteristične samo za njega (Slika 19). Zbog toga je ovom soju dodeljena podgrupa groELI-II. Sojevi AVUT, AY2192 i PRIVA su imali meĎusobno identične profile nakon digestije sa oba upotrebljena restrikciona enzima ali i identične sa sojevima AY-W, DIV, PrG, PYR, RV, GLAWC, NA, SAY, ca2006/9 i AY-27 (Slika 19, profil soja RV) koji svi pripadaju podgrupi 16SrI-B. Iz tog razloga je ovih 13 sojeva svrstano u podgrupu groELI-III. Sojevi AY-J i ca2006/5, koji su takoĎe pripadnici 16SrI-B podgrupe, imali su meĎusobno identične Tru1I i AluI profile, ali različite od ostalih pripadnika 16SrI-B podgrupe (Slika 19, profil soja AY-J), tako da je ovim sojevima dodeljena podgrupa groELI-IV. Soj MBSColombia, takoĎe pripadnik 16SrI-B podgrupe, imao je Tru1I profil skoro identičan kao prethodna dva soja (jedva vidljiva razlika postoji u obliku dodatnog benda veličine oko 40 bp), ali je zato imao jedinstven Tru1I AluI Mitrović REZULTATI 67 AluI profil (Slika 19) zbog čega je kao rezultat kolektivnih RFLP profila odvojen u posebnu podgrupu groELI-V. Četiri soja koja pripadaju podgrupi 16SrI-C (CA, LEO, KVF i PPT) su imala meĎusobno identične Tru1I RFLP profile a različite od ostalih sojeva (Slika 19, Tru1I gel, profil sojeva CA i PPT), meĎutim analizom AluI RFLP profila ova četiri soja su pokazala dva tipa profila. Sojevi CA i LEO su sa jedne strane imali meĎusobno identične AluI profile, kao što su i sojevi PPT i KVF sa druge strane imali drugi tip meĎusobno identičnih AluI profila (Slika 19, AluI gel, sojevi CA i PPT). Zbog ovoga je sojevima CA i LEO dodeljena podgrupa groELI-VI, a sojevima PPT i KVF podgrupa groELI-VII. Soj AY-A koji je pripadnik podgrupe 16SrI-F je imao Tru1I RFLP profil identičan profilu pripadnika podgrupe 16SrI-A (Slika 19, Tru1I gel, profili sojeva NJ-AY i AY-A), meĎutim AluI RFLP profil je imao skoro identičan profilu sojeva PPT i KVF (podgrupa 16SrI-C) pri čemu je kod soja AY-A najviši bend veličine oko 450 bp i on je nešto viši nego kod pripadnika 16SrI-C (Slika 19, AluI gel, profili sojeva PPT i AY-A). Bez obzira što ovaj soj ne poseduje profile karakteristične samo za njega kao što to imaju pripadnici ostalih podgrupa, ovaj soj je na osnovu kolektivnih profila koji se poklapaju sa profilima iz dve različite podgrupe (16SrI-A i 16SrI-C) odvojen u posebnu podgrupu, a to je podgrupa groELI-VIII. Soj PopD (16SrI- P) je imao i Tru1I i AluI RFLP profile koji su se razlikovali od svih ostalih profila (Slika 19) tako da je njemu dodeljena posebna podgrupa groELI-IX (Tabela 9). Nakon analize AYgroelF/R amplikona RFLP metodom, DNK referentnih izolata je poslata na sekvenciranje, a dobijene i obraĎene sekvence groEL gena su deponovane u NCBI Banku gena pod pristupnim brojevima prikazanim u Tabeli 9. Mitrović REZULTATI 68 Tabela 9. Podela sojeva na osnovu RFLP profila AYgroelF/R amplikona sa Tru1I i AluI restrikcionim enzimima u groELI podgrupe i pristupni brojevi groEL sekvenci Oznaka soja Pristupni broj groEL gena Duţina sekvence u bp RFLP profili AYgroelF/R amplikona Dodeljena groEL podgrupa (groELI-) Tru1I AluI CHRYM AB599692 # 1611 3 3 I ca2006/1 AB599708 # 1611 3 3 PVM AB599706 # 1611 3 3 NJ-AY AB599703 # 1611 3 3 GD AB599694 # 1611 5 6 II AVUT AB599686 # 1611 1 1 III AY2192 AB599687 # 1611 1 1 PRIVA AB599705 # 1611 1 1 AY-W AB599691 # 1611 1 1 DIV AB599693 # 1611 1 1 PrG AB599696 # 1611 1 1 PYR AB599697 # 1611 1 1 RV AB599698 # 1611 1 1 GLAWC AB599700 # 1611 1 1 NA AB599702 # 1611 1 1 SAY AB599707 # 1611 1 1 ca2006/9 AB599709 # 1611 1 1 AY-27 AB599688 # 1611 1 1 AY-J AB599689 # 1611 2 2 IV ca2006/5 AB599711 # 1611 2 2 MBSColombia AB599712 # 1611 2* 8 V CA AB599690 # 1611 4 4 VI LEO AB599701 # 1611 4 4 KVF AB599695 # 1611 4 5 VII PPT AB599704 # 1611 4 5 AY-A AB599699 # 1611 3 5* VIII PopD AB599710 # 1611 6 7 IX 79/10 / 4 5 VII 205/10 / 4 5 VII 92/10 / 6 7 IX 84/11 / 1 1 III 87/11 / 1 1 III 90/11 / 1 1 III 91/11 / 1 1 III # - sekvence dobijene kao rezultat ove doktorske teze; *- postoji slabo vidljiva razlika u profilu Upotrebom Tru1I i AluI restrikconih enzima na dobijene AYgroelF/R amplikone i analizom dobijenih RFLP profila, podgrupe 16SrI-A i I-C su dalje diferencirane u dve groELI podgrupe, 16SrI-B je dalje diferencirana u tri groELI podgrupe, dok podgrupe Mitrović REZULTATI 69 16SrI-M i I-L nisu pokazale nikakve meĎusobne razlike u odnosu na jedan deo podgrupe 16SrI-B (Tabela 10). Podgrupe 16SrI-F i I-P razlikuju se od ostalih i na nivou groEL gena kao i na nivou 16S rDNK. Tabela 10. Kratak pregled podele na groELI podgrupe u odnosu na 16SrI podgrupe na osnovu restrikcionih enzima Tru1I i AluI 16SrI- A A M L B B B C C F P Tru1I 3 5 1 1 1 2 2 4 4 3 6 AluI 3 6 1 1 1 2 8 4 5 5 7 groELI- I II III III III IV V VI VII VIII IX Nakon dobijanja sekvenci uraĎena je Blast analiza pri čemu su dobijene sekvence poreĎene sa svim dostupnim sekvencama iz NCBI Banke gena, uključujući i sekvence četiri genoma fitoplazmi kompletno sekvenciranih ('Ca. P. asteris' sojevi AYWB (16SrI-A) i OY-M (16SrI-B), 'Ca. P. australiense' (16SrXII-B) i 'Ca. P. mali' soj AT (16SrV)), kao i sekvencu njima filogenetski srodne molikute Acholeplasma laidlawii, soj PG-8A. Pošto je BLAST analizom pokazano da imaju od 69% do 100% sličnosti sa sekvencama groEL gena pet gore pomenutih kompletno sekvenciranih genoma, na ovaj način je uraĎena potvrda identifikacije dobijenih sekvenci (Tabela 11). Iz Tabele 11 se uočava da postoji jasna razlika soja GD u odnosu na ostale pripadnike podgrupe 16SrI-A u procentu sličnosti sekvene groEL gena. Dok svi ostali članovi ove podgrupe imaju 99% sličnosti sa sojem AYWB (koji je pripadnik podgrupe 16SrI-A), soj GD ima 98% sličnosti sa njim. Ovaj soj se izdvaja i po vrednosti procenta sličnosti sa sojem OY-M (koji je pripadnik podgrupe 16SrI-B) koji iznosi takoĎe 98% dok ostali pripadnici podgrupe 16SrI-A imaju 97% sličnosti sa sojem OY-M. TakoĎe se iz tabele uočava i da postoji velika razlika u sekvenci groEL gena soja PopD u odnosu na sve ostale sekvence jer maksimalna vrednost sličnosti ovog soja sa oba soja 'Ca. P. asteris' iznosi 95% dok kod svih ostalih testiranih sojeva ona minimalno iznosi 97%. Mitrović REZULTATI 70 Tabela 11. Procenat sličnosti sekvenci testiranih sojeva sa sekvencama groEL gena pet kompletno sekvenciranih genoma (fitoplazme i Acholeplasma laidlawii) Oznaka soja 'Ca. P. asteris' AYWB (CP000061) % 'Ca. P. asteris' OY-M (AP006628) % 'Ca. P. australiense' (AM422018) % 'Ca. P. mali' (CU469464) % Acholeplasma laidlawii (CP000896) % CHRYM 99 97 80 76 69 ca2006/1 99 97 80 76 69 PVM 99 97 80 76 69 NJ-AY 100 97 80 76 69 GD 98 98 80 77 69 AVUT 97 99 80 77 69 AY2192 97 99 80 77 69 PRIVA 97 99 80 77 69 AY-W 97 99 80 77 69 DIV 97 99 80 77 69 PrG 97 99 80 77 69 PYR 97 99 80 77 69 RV 97 99 80 77 69 GLAWC 97 99 80 77 69 NA 97 99 80 77 69 SAY 97 99 80 77 69 ca2006/9 97 99 80 77 69 AY-27 97 99 80 77 69 AY-J 97 99 80 77 69 ca2006/5 97 99 80 77 69 MBSColombia 97 99 80 77 69 CA 98 98 80 76 69 LEO 98 98 80 76 69 PPT 98 98 80 76 69 KVF 98 98 80 76 69 AY-A 98 97 80 76 69 PopD 94 95 81 81 69 Radi provere dobijenih realnih RFLP profila i podele na groELI podgrupe u odnosu na njih, uraĎena je in silico analiza na osnovu dobijenih sekvenci referentnih sojeva i generisani su virtuelni RFLP profili sa MseI (Tru1I) i AluI restrikcionim enzimima u programu pDRAW32 (Slika 20). TakoĎe su u ovom programu napravljene restrikcione mape ostalih 15 enzima koji se upotrebljavaju pri identifikaciji svih fitoplazmi, kao i onih koji se upotrebljavaju pri analizi tuf, rp i secY gena po literaturnim podacima. Na osnovu napravljenih restrikcionih mapa ukupno 19 enzima (AluI, BamHI, BfaI, BstUI, DraI, EcoRI, HaeIII, HhaI, HinfI, HpaI, HpaII, KpnI, MboI, MboII, MseI, RsaI, SspI, Tsp509I i TaqI) uočeno je da restrikcioni enzimi BamHI, BstUI, EcoRI, Mitrović REZULTATI 71 HhaI, HpaII, KpnI, SspI i TaqI nemaju nijedno restrikciono mesto, a da BfaI, DraI, HaeIII, HinfI, HpaI, MboI i MboII imaju izmeĎu 0 i 4 restrikciona mesta u zavisnosti od soja i enzima. Enzimi sa većim brojem restrikcionih mesta su RsaI (od 5 do 8), AluI (od 10 do 13), MseI (od 17 do 22) i Tsp509I (od 25 do 28). Od ova poslednja četiri enzima, AluI, MseI i Tsp509I enzimi su se pokazali kao najinformativniji, meĎutim enzim Tsp509I ima veliki broj fragmenata veličine od 5 do 136 bp, pa u realnom gelu razlike ne bi bile vidljive. Slika 20. Prikaz dobijenih virtuelnih RFLP profila amplikona AYgroelF/R digeriranih pomoću MseI (Tru1I) i AluI restrikcionih enzima razdvojenih u 2% gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker NEB 100bp, veličine fragmenata u bp od vrha su: 1517, 1200, 1000, 900, 800, 700, 600, 517, 500, 400, 300, 200 i 100. Na osnovu generisanih AluI i MseI (Tru1I) RFLP profila potvrĎeno je da postoji devet groELI podgrupa i da kod soja MBSColombia u Tru1I RFLP profilu postoji bend veličine 47 bp koji je slabo uočljiv u realnom RFLP profilu, kao i da postoji razlika u AluI RFLP profilima izmeĎu soja AY-A i sojeva KVF i PPT gde je najviši bend veličine 381 bp odnosno 351 bp. MseI AluI Mitrović REZULTATI 72 4.3.2. Ostali sojevi Aster yellows fitoplazmi poreklom iz Srbije Nakon definisanja metode na referentnim uzorcima, groEL gen je analiziran kod novodetektovanih sojeva AY fitoplazmi iz Srbije. Po već definisanom protokolu koristeći AYgroesF/AYampR prajmere u direktnoj PCR reakciji koju je pratila nested PCR reakcija sa AYgroelF/R prajmerima, uspešno je umnoţen groEL gen kod sedam sojeva fitoplazmi izolovanih iz biljaka vinke i topole poreklom iz Srbije (Slika 21). Nakon PCR reakcije uraĎena je analiza dobijenih amplikona RFLP metodom sa Tru1I i AluI restrikcionim enzimima (Slika 22). Slika 21. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYgroelF/R dobijenih u direktnoj (sojevi 79/10, 84/11, 87/11, 90/11 i 91/11) ili nested (sojevi 205/10 i 92/10) PCR reakciji. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Soj 92/10 se po svojim Tru1I i AluI RFLP profilima nije razlikovao od soja PopD, koji je pripadnik podgrupe 16SrI-P, tako da je on klasifikovan kao pripadnik podgrupe groELI-IX. Sojevi 79/10 i 205/10 (podgrupa 16SrI-C) su imali Tru1I RFLP profil 4, a AluI RFLP profil 5 kao i sojevi KVF i PPT, pa su ova dva soja definisana kao pripadnici podgrupe groELI-VII. Sojevi 84/11, 87/11, 90/11 i 91/11 (podgrupa 16SrI-B) su imali Tru1I i AluI RFLP profil 1 kao i većina referentnih sojeva iz ove podgrupe, i stoga su ova četiri soja definisana kao pripadnici podgrupe groELI-III (Slika 22, Tabela 9). Mitrović REZULTATI 73 Slika 22. Prikaz digeriranih amplikona AYgroelF/R pomoću restrikcionih enzima Tru1I i AluI razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M (levo), marker PhiX174 (videti Sliku 13 sa strane 57); M (desno), marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59). 4.4. ANALIZA OSTALIH GENA KOD ASTER YELLOWS FITOPLAZMI Radi odreĎivanja nivoa diferencijacije groEL gena, uraĎena je analiza tuf, rp i secY gena koji se po literaturnim podacima već koriste kao dodatni molekularni markeri za diferencijaciju fitoplazmi, a potom su uporeĎeni dobijeni podaci. Analiza ovih gena je uraĎena kod 22 odabrana soja od 34 testirana soja (kako referentnih tako i sojeva poreklom iz Srbije). Sojevi su odabrani tako da predstavljaju po jednu groELI podgrupu kao i da pripadaju svakoj od testiranih 16SrI podgrupa. Tako su u analizu tuf, rp i secY gena uključeni sojevi CHRYM, ca2006/1, PVM, NJ-AY, GD, AVUT, AY2192, PRIVA, PrG, RV, SAY, ca2006/9, AY-J, ca2006/5, MBSColombia, CA, LEO, KVF, PPT, AY-A, PopD i 92/10. 4.4.1. Analiza tuf gena kod Aster yellows fitoplazmi Kod sva 34 testirana soja uspešno je umnoţen tuf gen (gen faktora elongacije EF-Tu) u direktnoj PCR reakciji korišćenjem prajmera f/rTufAy jer je došlo do umnoţavanja fragmenta veličine oko 950 bp što odgovara literaturnim podacima (Slika 23). Tru1I Tru1I AluI Mitrović REZULTATI 74 Slika 23. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima f/rTufAy dobijenih u direktnoj PCR reakciji. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Nakon uspešnog umnoţavanja kod svih sojeva, dobijeni fragmenti 22 odabrana soja su analizirani RFLP metodom koristeći MboI, Tsp509I i Tru1I restrikcione enzime (Slike 24 i 25). Enzim MboI je odabran na osnovu literaturnih podataka (enzim MboI je izošizomer enzima Sau3AI već korišćenog za diferencijaciju drugih sojeva AY fitoplazmi na osnovu f/rTufAy amplikona, Marcone i sar., 2000), dok su enzimi Tsp509I i Tru1I odabrani na osnovu in silico analize (odraĎene u pDRAW32 programu) javno dostupnih sekvenci tuf gena sedam sojeva korišćenih u ovom doktoratu (Tabela 12). Analizom dobijenih RFLP profila uočava se da se upotrebom MboI i Tsp509I restrikcionih enzima razlikuju četiri tipa, a upotrebom Tru1I dva tipa profila. Kao i kod analize groEL gena, soj GD se po dobijenim tuf RFLP profilima razlikuje od ostalih pripadnika podgrupe 16SrI-A bilo upotrebom MboI bilo Tsp509I restrikcionog enzima, pri čemu je Tsp509I RFLP profil ovog soja identičan RFLP profilima sojeva AY-A i PopD. Sa druge strane, pripadnici podgrupa 16SrI-M, I-L i I-B imaju identične RFLP profile nakon upotrebe bilo kog od tri navedena enzima. Svi pripadnici podgrupe 16SrI- C imaju meĎusobno identične MboI, Tsp509I i Tru1I RFLP profile, dok je sojeve AY-A i PopD moguće meĎusobno razlikovati upotrebom MboI enzima što nije moguće pomoću enzima Tsp509I (Slika 24). S obzirom na to da sojevi GD i AY-A imaju identične MboI i Tsp509I RFLP profile, uvoĎenjem restrikcionog enzima Tru1I moguće je razlikovati ova dva soja jer upotrebom ovog enzima svi pripadnici podgrupe 16SrI-A 750 bp 1000 bp Mitrović REZULTATI 75 imaju isti profil koji se razlikuje od drugog profila koji imaju svi ostali testirani sojevi koji su pripadnici podgrupa 16SrI-B, I-C, I-F i I-P (Slika 25). Slika 24. Prikaz digeriranih amplikona f/rTufAy pomoću restrikcionih enzima MboI razdvojenih u 2% agaroznom gelu (levo) i Tsp509I u 6% poliakrilamidnom gelu (desno). Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59). Slika 25. Prikaz digeriranih amplikona f/rTufAy pomoću restrikcionog enzima Tru1I razdvojenih u 6% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 100 bp, veličine fragmenata od vrha su 200 i 100 bp. MboI Tsp509I Mitrović REZULTATI 76 Kada se uporede svi dobijeni RFLP profili, moguće je testirane sojeve klasifikovati u šest tufI podgrupa. Tako su sojevi CHRYM, ca2006/1, PVM i NJ-AY klasifikovani kao propadnici podgrupe tufI-A, soj GD kao pripadnik tufI-M, sojevi AVUT, AY2192, PRIVA, PrG, RV, SAY, ca2006/9, AY-J, ca2006/5 i MBSColombia kao pripadnici podgrupe tufI-B, sojevi CA, LEO, KVF i PPT kao pripadnici podgrupe tufI-C, soj AY-A kao pripadnik podgrupe tufI-E, a sojevi PopD i 92/10 kao pripadnici podgrupe tufI-O (Tabela 12). Ovim je pokazano da su novodobijeni rezultati u skladu sa rezultatima preuzetim iz literature. Tabela 12. Podela sojeva na osnovu RFLP profila f/rTufAy amplikona sa MboI, Tsp509I i Tru1I restrikcionim enzimima i pristupni brojevi tuf sekvenci Oznaka soja Pristupni broj sekvence tuf gena Duţina sekvence u bp Literaturni podaci o podeli na podgrupe u odnosu na tuf gen RFLP profili f/rTufAy amplikona Podela na tuf podgrupu (tufI-) MboI Tsp509I Tru1I CHRYM / / A a a a A ca2006/1 / / A a a a PVM AJ271321 1083 A a a a NJ-AY / / A a a a GD KC354601 # 899 / c d a M AVUT AJ271307 1083 B b b b B AY2192 AJ271306 1083 B b b b PRIVA AJ271320 1083 B b b b PrG / / / b b b RV / / B b b b SAY AJ271323 1083 B b b b ca2006/9 KC354602 # 902 B b b b AY-J / / / b b b ca2006/5 KC354603 # 902 B b b b MBSColombia KC354604 # 902 B b b b CA KC354605 # 902 / c c b C LEO / / / c c b KVF AJ271317 1083 C c c b PPT / / C c c b AY-A AJ271308 1083 E c d b E PopD KC354606 # 906 / g d b O 92/10 / / / g d b # - sekvence dobijene kao rezultat ove doktorske teze Mitrović REZULTATI 77 Upotrebom MboI, Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima na dobijene f/rTufAy amplikone i analizom dobijenih RFLP profila, podgrupa 16SrI-A je dalje diferencirana u dve tufI podgrupe, dok podgrupe 16SrI-B, I-M i I-L nisu pokazale nikakve meĎusobne razlike, što je potvrĎeno poreĎenjem njihovih tuf sekvenci. Podgrupe 16SrI- C, I-F i I-P se razlikuju od ostalih podgrupa i na nivou tuf gena, kao i na nivou 16S rDNK (Tabela 13). Tabela 13. Kratak pregled podele na tufI podgrupe u odnosu na 16SrI podgrupe na osnovu MboI, Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima 16SrI- A A B M L C F P MboI a c b b b c c g Tsp509I a d b b b c d d Tru1I a a b b b b b b tufI- A M B B B C E O Radi potvrde rezultata dobijenih RFLP metodom i tačnije filogenetske analize, f/rTufAy amplikoni sojeva GD, ca2006/9, ca2006/5, MBSColombia, CA i PopD su prečišćeni i poslati na sekvenciranje. Nakon obrade sekvenci one su deponovane u NCBI Banku gena pod pristupnim brojevima prikazanim u Tabeli 12. 4.4.2. Analiza rp gena kod Aster yellows fitoplazmi Nakon upotrebe rpL2F3/rp(I)R1A para prajmera u direktnoj PCR reakciji, kod sva 34 testirana soja došlo je do umnoţavanja fragmenta veličine oko 1600 bp, što odgovara očekivanoj veličini ovog amplikona (Slika 26). Na ovaj način su umnoţeni sledeći geni: 3' deo rplB, ceo rpsS, rplV i skoro ceo rpsC. Primenom RFLP metode na 22 odabrana soja pomoću HhaI, AluI i Tsp509I restrikcionih enzima na dobijene rpL2F3/rp(I)R1A amplikone (Slike 27 i 28) moguće je razlikovati sedam rpI podgrupa (Tabela 14). Ovi enzimi su odabrani na osnovu podataka iz literature i in silico analize (odraĎene u pDRAW32 programu) javno dostupnih sekvenci rp gena osam sojeva korišćenih u ovom doktoratu (Tabela 14). Mitrović REZULTATI 78 Slika 26. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima rpL2F3/rp(I)R1A dobijenih u direktnoj PCR reakciji. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Slika 27. Prikaz digeriranih amplikona rpL2F3/rp(I)R1A pomoću restrikcionih enzima HhaI razdvojenih u 1% agaroznom gelu (levo) i AluI u 6% poliakrilamidnom gelu (desno). Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59). HhaI AluI 1500 bp Mitrović REZULTATI 79 Slika 28. Prikaz digeriranih amplikona rpL2F3/rp(I)R1A pomoću restrikcionog enzima Tsp509I razdvojenih u 6% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59). Upotrebom HhaI i AluI restrikcionih enzima na rpL2F3/rp(I)R1A amplikone razlikuje se po pet tipova profila, dok se upotrebom Tsp509I razlikuje sedam. Analizom dobijenih RFLP profila uočava se da je sa jedne strane moguće razlikovati soj GD od ostalih koji su pripadnici 16SrI-A podgrupe upotrebom HhaI i Tsp509I restrikcionih enzima, što nije moguće upotrebom AluI enzima. Upotrebom Tsp509I restrikcionog enzima moguće je razlikovati sojeve ca2006/5, AY-J i MBSColombia od ostalih pripadnika podgrupe I-B, dok sa druge strane nije moguće razlikovati podgrupe 16SrI- M, I-L od ostalih sojeva podgrupe I-B jer imaju identične HhaI, AluI i Tsp509I restrikcione profile. Podgrupe 16SrI-C, I-F i I-P razlikuju se od ostalih upotrebom sva tri restrikciona enzima kao i na nivou 16S rDNK. Na osnovu ovih podataka sojevi CHRYM, ca2006/1, PVM i NJ-AY su klasifikovani kao pripadnici podgrupe rpI-A, dok je soj GD klasifikovan kao pripadnik podgrupe rpI-M. Sojevi AVUT, AY2192, PRIVA, PrG, RV, SAY i ca2006/9 koji su pripadnici 16SrI-M, I-L i I-B podgrupa su klasifikovani kao podgrupa rpI-B, dok su sojevi AY-J, ca2006/5 i MBSColombia koji takoĎe pripadaju podgrupi I-B klasifikovani kao podgrupa rpI-L. Svi sojevi iz podgrupe 16SrI-C nisu se razlikovali ni u jednom od upotrebljenih restrikcionih enzima, pa su svi klasifikovani kao podgrupa rpI-C. Soj AY-A je imao jedinstvene HhaI, AluI i Tsp509I restrikcione profile i klasifikovan je kao rpI-N. Sojevi PopD i 92/10 koji su pripadnici Mitrović REZULTATI 80 podgrupe 16SrI-P su imali meĎusobno identične profile koji su se jasno razlikovali od svih ostalih profila primenom sva tri restrikciona enzima, pa su klasifikovani kao podgrupa rpI-O (Tabela 14). Upotrebom HhaI, AluI i Tsp509I restrikcionih enzima na dobijene rpL2F3/rp(I)R1A amplikone i analizom dobijenih RFLP profila razlikuje se ukupno sedam rpI podgrupa, pri čemu su podgrupe 16SrI-A i I-B dalje diferencirane u dve rpI podgrupe, dok podgrupe 16SrI-M i I-L nisu pokazale nikakve razlike u odnosu na jedan deo podgrupe I-B (Tabela 15). Podgrupe 16SrI-C, I-F i I-P se razlikuju od ostalih podgrupa i na nivou rp gena kao i na nivou 16S rDNK. Tabela 14. Podela sojeva na osnovu RFLP profila rpL2F3/rp(I)R1A amplikona sa HhaI, AluI i Tsp509I restrikcionim enzimima i pristupni brojevi rp sekvenci Oznaka soja Pristupni broj sekvence rp gena Duţina sekvence u bp Literaturni podaci o podeli na podgrupe u odnosu na rp gen RFLP profili f/rTufAy amplikona Podela na rp podgrupu (rpI-) HhaI AluI Tsp509I CHRYM / / A a a a A ca2006/1 EU215428 1137 A a a a PVM AY264867 1174 A a a a NJ-AY / / A a a a GD AY264864 1174 M b a f M AVUT AY264855 1174 B b b b B AY2192 AY183708 1240 B b b b PRIVA / / B b b b PrG / / / b b b RV / / / b b b SAY / / B b b b ca2006/9 EU215430 1132 B b b b AY-J / / / b b g L ca2006/5 EU215429 1123 / b b g MBSColombia AY264858 1174 L b b g CA KC354607 # 1458 / c c c C LEO / / / c c c KVF KC354608 # 1458 / c c c PPT / / / c c c AY-A AY264866 1174 N d d d N PopD KC354609 # 1454 / e e e O 92/10 / / / e e e # - sekvence dobijene kao rezultat ove doktorske teze Mitrović REZULTATI 81 Tabela 15. Kratak pregled podele na rpI podgrupe u odnosu na 16SrI podgrupu na osnovu HhaI, AluI i Tsp509I restrikcionih enzima 16SrI- A A B B M L C F P HhaI a b b b b b c d e AluI a a b b b b c d e Tsp509I a f b g b b c d e rpI- A M B L B B C N O Radi potvrde rezultata dobijenih RFLP metodom i tačnije filogenetske analize, rpL2F3/rp(I)R1A amplikoni sojeva CA, KVF i PopD su prečišćeni i poslati na sekvenciranje. Nakon dobijanja i obrade sekvenci one su deponovane u NCBI Banku gena pod pristupnim brojevima prikazanim u Tabeli 14. 4.4.3. Analiza secY gena kod Aster yellows fitoplazmi Gen secY je nakon direktne PCR reakcije sa AYsecYF1/R1 parom prajmera umnoţen kod sva 34 testirana soja jer je došlo do pojave fragmenata veličine oko 1400 bp (Slika 29) što je i očekivana veličina ovog regiona. Jedino su se kod sojeva PopD i 92/10 pojavili i slabo vidljivi dodatno umnoţeni nespecifični fragmenti veličine oko 1200 bp koji su se nalazili neposredno ispod ţeljenog fragmenta. Nakon RFLP analize AYsecYF1/R1 amplikona 22 odabrana soja pomoću Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima (Slika 30), testirani sojevi su podeljeni u sedam secYI podgrupa (Tabela 16). Ovi enzimi su odabrani za analizu nakon generisanja virtuelnih RFLP profila pomoću javno dostupnih sekvenci secY gena osam sojeva korišćenih u ovoj doktorskoj tezi (Tabela 16). Mitrović REZULTATI 82 Slika 29. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima AYsecYF1/R1 dobijenih u direktnoj PCR reakciji. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Upotrebom oba restrikciona enzima, Tsp509I i Tru1I, na AYsecYF1/R1 amplikone moguće je razlikovati soj GD od ostalih sojeva koji su pripadnici 16SrI-A podgrupe, dok upotrebom ovih enzima nije moguće razlikovati pripadnike podgrupa 16SrI-M i I-L od pripadnika 16SrI-B. MeĎutim, poreĎenjem dobijenih Tsp509I restrikcionih profila uočava se razlika izmeĎu soja MBSColombia i ostalih pripadnika kako podgrupa 16SrI-M i I-L tako i 16SrI-B podgrupe. Pripadnike podgrupe 16SrI-F je moguće razlikovati od pripadnika drugih podgrupa upotrebom Tru1I restrikcionog enzima, dok to nije moguće upotrebom Tsp509I restrikcionog enzima pošto pripadnici ove podgrupe imaju identičan Tsp509I restrikcioni profil kao i pripadnici podgrupe 16SrI-C. Upotrebom bilo kog od ova dva restrikciona enzima moguće je razlikovati pripadnike podgrupe 16SrI-P od svih ostalih sojeva jer imaju vidljivo drugačije RFLP profile. 1000 bp 1500 bp Mitrović REZULTATI 83 Slika 30. Prikaz digeriranih amplikona AYsecYF1/R1 pomoću restrikcionih enzima Tsp509I i Tru1I razdvojenih u 6% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 8. M, marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59). Na osnovu ovih podataka sojevi CHRYM, ca2006/1, PVM i NJ-AY su klasifikovani kao pripadnici podgrupe secYI-A, dok je soj GD klasifikovan kao pripadnik podgrupe secYI-M. Sojevi AVUT, AY2192, PRIVA, PrG, RV, SAY, ca2006/9, AY-J i ca2006/5 koji su pripadnici 16SrI-M, I-L i I-B podgrupa su klasifikovani kao podgrupa secYI-B, dok je soj MBSColombia (16SrI-B) klasifikovan kao podgrupa secYI-L. Svi sojevi iz podgrupe 16SrI-C su klasifikovani kao podgrupa secYI-C, dok je soj AY-A klasifikovan kao secYI-N. Sojevi PopD i 92/10 su imali meĎusobno identične profile a različite od svih ostalih pa su klasifikovani kao podgrupa secYI-O (Tabela 16). Upotrebom Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima na dobijene AYsecYF1/R1 amplikone i analizom dobijenih RFLP profila, podgrupe 16SrI-A i I-B su dalje diferencirane u po dve secYI podgrupe, dok podgrupe 16SrI-M i I-L nisu pokazale nikakve meĎusobne razlike u odnosu na jedan deo podgrupe 16SrI-B (Tabela 17). Podgrupe 16SrI-C, I-F i I-P se razlikuju od ostalih i na nivou secY gena kao i na nivou 16S rDNK. Tsp509I Tru1I Mitrović REZULTATI 84 Tabela 16. Podela sojeva na osnovu RFLP profila AysecYF1/R1 amplikona sa Tsp509I i Tru1I restrikcionim enzimima i pristupni brojevi secY sekvenci Oznaka soja Pristupni broj sekvence secY gena Duţina sekvence u bp Literaturni podaci o podeli na podgrupe u odnosu na secY gen RFLP profili AYsecYF1/R1 amplikona Podela na secY podgrupu (secYI-) Tsp509I Tru1I CHRYM AY803170 1358 A a a A ca2006/1 / / / a a PVM AY803185 1358 A a a NJ-AY GU004345 2833 / a a GD AY803171 1358 M f h M AVUT AY803168 1358 B b b* B AY2192 AY803167 1358 B b b PRIVA / / / b b PrG / / / b b RV / / / b b SAY / / / b b ca2006/9 KC354610 # 1287 / b b AY-J / / / b b ca2006/5 KC354611 # 1287 / b b MBSColombia AY803175 GU004341 1358 2833 L g b* L CA KC354612 # 1276 / c c* C LEO / / / c c KVF KC354613 # 1273 / c c PPT / / / c c AY-A AY803166 1358 N c* f** N PopD KC354614 # 995 / e g O 92/10 / / / e g # - sekvence dobijene kao rezultat ove doktorske teze; *- profil potvrĎen u virtuelnoj RFLP analizi; **- postoji slabo vidljiva razlika u profilu koja je potvrĎena u virtuelnoj RFLP analizi Radi potvrde rezultata dobijenih RFLP metodom i tačnije filogenetske analize, AYsecYF1/R1 amplikoni sojeva ca2006/5, ca2006/9, CA, KVF i PopD su prečišćeni i poslati na sekvenciranje. Nakon dobijanja i obrade sekvenci one su deponovane u NCBI Banku gena pod pristupnim brojevima prikazanim u Tabeli 16. Mitrović REZULTATI 85 Tabela 17. Kratak pregled podele na secYI podgrupe u odnosu na 16SrI podgrupe na osnovu Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima 16SrI- A A B B M L C F P Tsp509I a f b g b b c c e Tru1I a h b b b b c f g secYI- A M B G B B C N O 4.5. STOLBUR FITOPLAZME 4.5.1. Detekcija i identifikacija Stolbur fitoplazmi Tokom 2009, 2010. i 2011. godine u Srbiji su uzorkovane biljke iz devet biljnih vrsta sa simptomima karakterističnim za prisustvo fitoplazmi. Nakon izolacije DNK i detekcije fitoplazmi uz pomoć P1/P7, odnosno R16F2n/R16R2 para prajmera u direktnoj ili nested PCR reakciji, u 116 uzoraka je dokazano prisustvo fitoplazmi pojavom fragmenta veličine 1800 bp odnosno 1200 bp (Tabela 18). Nakon RFLP analize pomoću Tru1I restrikcionog enzima na R16F2n/R16R2 amplikone, dobijeni su profili koji poreĎenjem sa podacima iz literature klasifikuju sve detektovane fitoplazme kao pripadnike 16SrXII grupe odnosno kao Stolbur fitoplazme. Svi detektovani sojevi su imali identičan Tru1I RFLP profil, osim soja 284/09 poreklom sa duvana čiji se profil nešto razlikovao od ostalih kako nakon digestije P1/P7, tako i nakon digestije R16F2n/R16R2 amplikona (Slika 31). Da bi se potvrdilo postojanje ove razlike soja 284/09, ponovo je uraĎena izolacija DNK iz istog uzorka, umnoţen 16S rRNK gen prajmerima P1/P7, a dobijeni amplikon digeriran Tru1I restrikcionim enzimom. Novodobijeni restrikcioni profil se i ovog puta razlikovao od svih ostalih, a bio je identičan sa prethodno dobijenim profilom ovog soja. Da bi se proverio stepen varijabilnosti 16S rRNK gena kod Stolbur fitoplazmi, odabrano je 10 sojeva čiji su P1/P7 amplikoni prečišćeni i sekvencirani (Tabela 18). MeĎu odabranim sojevima se nalazio i soj 284/09. Nakon obrade dobijenih sekvenci, njihovog poravnanja i meĎusobnog poreĎenja, uočeno je da su sekvence 16S rDNK identične kod svih osim kod soja 284/09, kao i da soj 99/10, poreklom sa ljute papričice, Mitrović REZULTATI 86 ima jedno nukleotidno mesto koje moţe biti pokazatelj postojanja razlika izmeĎu dva operona 16S rDNK. Slika 31. Prikaz digeriranih amplikona P1/P7 (levo) i R16F2n/R16R2 (desno) pomoću restrikcionog enzima Tru1I razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su date u Tabeli 18. M (levo), marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59); M (desno), marker PhiX174 (videti Sliku 13 sa strane 57). Naime, u poreĎenim sekvencama (gde je prvi nukleotid onaj posle prajmera P1 koji je isečen i isključen iz analize) kod soja 284/09 se na nukleotidnom mestu 196 nalazi A dok se kod svih ostalih tu nalazi nukleotid G. Postojanjem nukleotida A na ovom mestu dobija se novo restrikciono mesto za enzim Tru1I (jer su prethodna tri nukleotida TTA) što je u skladu sa dobijenim Tru1I RFLP profilima. Kod soja 99/10 se u istim poreĎenim sekvencama na nukleotidnom mestu 161 nalaze i nukleotid T, kao i kod svih ostalih, ali i nukleotid C. Postojanjem nukleotida C na ovom mestu dobija se novo restrikciono mesto za enzim MboII. Zbog toga je uraĎena RFLP analiza P1/P7 amplikona sa MboII restrikcionim enzimom da bi se potvrdilo ili odbacilo postojanje ove razlike (Slika 32). Pošto se nakon digestije dobio nešto drugačiji profil kod soja 99/10 nego kod soja 142/09 sa čijim RFLP profilom je i poreĎen, uraĎena je virtuelna analiza 16S rDNK mogućih sekvenci dva operona soja 99/10 u pDRAW32 programu. Napravljen je virtuelni MboII RFLP profil mogućeg P1/P7 R16F2n/R16R2 Mitrović REZULTATI 87 operona2 kod soja 99/10 i operona1 koji odgovara sekvenci 16S rDNK ostalih sojeva Stolbur fitoplazmi. Potom su ova dva dobijena profila spojena u jedan zajednički (Slika 32) da bi se dobila moguća slika realnog RFLP profila. PoreĎenjem dobijenog realnog RFLP profila kod soja 99/10 i virtuelnog nastalog kombinacijom moguća dva operona, vidi se da su dobijeni profili identični što potvrĎuje da kod soja 99/10 postoji realna razlika izmeĎu dva 16S rDNK operona. Slika 32. Prikaz digeriranih amplikona P1/P7 pomoću restrikcionog enzima MboII razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu (levo) i u 2% virtuelnom gelu (desno). Oznake sojeva su date u Tabeli 18. M (levo), marker PhiX174 (videti Sliku 13 sa strane 57); M (desno), marker NEB 100 bp (videti Sliku 20 sa strane 71). Oba varijabilna nukleotidna mesta, i kod soja 284/09 i kod soja 99/10, nalaze se u okviru R16F2n/R16R2 regiona, jer on počinje od 119. nukleotidnog mesta a varijabilna mesta su na 196. nukleotidnom mestu za soj 284/09, odnosno 161. za soj 99/10. Od 10 sekvenciranih sojeva sekvence osam sojeva su deponovane u NCBI Banci gena pod pristupnim brojevima prikazanim u Tabeli 18 sa strane 90. Mitrović REZULTATI 88 4.5.2. Analiza tuf gena kod Stolbur fitoplazmi Za umnoţavanje tuf gena kod Stolbur fitoplazmi korišćen je isti par prajmera kao i za umnoţavanje ovog regiona kod AY fitoplazmi, f/rTufAy. Uzorci koji se nisu umnoţili u direktnoj PCR reakciji sa f/rTufAy parom prajmera podvrgnuti su nested PCR reakciji sa ovim parom prajmera pri čemu je tada u direktnoj PCR reakciji korišćen par prajmera f/rTuf1. Nakon upotrebe f/rTufAy para prajmera, bilo u direktnoj ili u nested PCR reakciji, na svih 116 uzoraka pozitivnih na prisustvo Stolbur fitoplazmi, kod 103 uzorka je došlo do pojave fragmenta veličine oko 950 bp (Slika 33, A) što je i očekivana veličina ovog regiona kod Stolbur fitoplazmi. Na pozitivne f/rTufAy amplikone je uraĎena RFLP analiza upotrebom HpaII restrikcionog enzima koji je prema literaturnim podacima pokazatelj varijabilnosti ovog regiona (Langer i Maixner, 2004). Nakon vizuelizacije produkata digestije, a poreĎenjem sa podacima iz literature, utvrĎeno je da svi testirani sojevi imaju identičan HpaII RFLP profil koji se podudara sa profilom pripadnika tuf type II podgrupe (Slika 33, B). Slika 33. Prikaz A - amplikona umnoţenih prajmerima f/rTufAy dobijenih u direktnoj PCR reakciji i B - digeriranih amplikona f/rTufAy pomoću restrikcionog enzima HpaII, vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu. Svi prikazani sojevi su poreklom sa duvana iz Bavaništa. M (levo), marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 57); M (desno), marker 100 bp (videti Sliku 15 sa strane 59, pri čemu je ovde na slici prikazano samo pet donjih fragmenata). 4.5.3. Analiza groEL gena kod Stolbur fitoplazmi Radi provere dizajniranih prajmera i pronalaţenja najboljeg ciklusa za njih, uraĎena je preliminarna analiza upotrebom tri soja Stolbur fitoplazmi. Kod njih je 750 bp 1000 bp A B Mitrović REZULTATI 89 uraĎena PCR reakcija upotrebom STOLgroesF/STOLstampR para prajmera korišćenjem istog ciklusa kao za umnoţavanje ovog regiona kod AY fitoplazmi. Nakon vizuelizacije PCR produkata uočeni su fragmenti veličine oko 2000 bp kod svih testiranih uzoraka, što odgovara veličini očekivanog fragmenta od 2024 bp. TakoĎe je uočeno da nije došlo do umnoţavanja dodatnih nespecifičnih fragmenata, kao i da je došlo do jakog umnoţavanja očekivanog fragmenta (bendovi su bili dobro vidljivi). Iz tog razloga je ovaj ciklus odabran kao najbolji za umnoţavanje groEL gena kod Stolbur fitoplazmi kada se koriste prajmeri STOLgroesF/STOLstampR. Od 116 pozitivnih uzoraka za dalju analizu groEL gena je odabrano 39 uzoraka iz Srbije sa različitih domaćina. Pošto su svi sojevi iz Srbije klasifikovani kao tuf type II podgrupa, a radi kompletnije slike o groEL genu kod Stolbur fitoplazmi, u analizu su uključena i dva soja Stolbur fitoplazmi iz Hrvatske poreklom sa vinove loze kao kontrolni sojevi Stolbur fitoplazmi tuf type I podgrupe (Tabela 18). Od 41 testiranog uzorka, kod 40 uzoraka je došlo do umnoţavanja očekivanog fragmenta veličine oko 2000 bp i ni ovaj put ni kod jednog uzorka nije uočeno prisustvo dodatno umnoţenih fragmenata (Slika 34). Slika 34. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima STOLgroesF/STOLstampR. Oznake sojeva su date u Tabeli 18. M, marker 1kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Da bi se potvrdila specifičnost dizajniranih prajmera, uraĎena je i PCR reakcija sa STOLgroesF/STOLstampR prajmerima na uzorke koji pripadaju drugim grupama fitoplazmi, kako onih filogenetski srodnih Stolbur fitoplazmama, tako i onih koje su udaljene. Testirano je pet uzorka sa vrste Convolvulus arvensis od kojih je u tri 1500 bp 2000 bp Mitrović REZULTATI 90 detektovana vrsta 'Ca. P. convolvuli', a u druga dva vrsta 'Ca. P. cynodontis'; dva uzorka poreklom sa vrste Cynodon dactylon u kojima je takoĎe detektovana 'Ca. P. cynodontis'; sojevi koji pripadaju AY fitoplazmama iz podgrupa I-A, I-B, I-C i I-P, kao i po dva uzorka u kojima su detektovane fitoplazme iz grupa 16SrX i 16SrV. Kao pozitivna kontrola je korišćen već pozitivan uzorak Stolbur fitoplazme poreklom sa šargarepe. Nakon vizuelizacije svi uzorci su bili negativni osim pozitivne kontrole, čime je dokazana specifičnost dizajniranih prajmera (Slika 35, A). Tabela 18. Osnovni podaci o analiziranim Stolbur sojevima i pristupni brojevi sekvenci 16S rDNK i groEL gena Domaćin Lokalitet Broj groEL testiranih/ pozitivnih uzoraka Pristupni brojevi sekvenciranih sojeva soj 16SrDNK (*) groEL (*) Duvan Ečka 3/3 142/09 JQ730739 (1707) KC417486 # (1958) 284/09 JQ730740 (1706) FO393427 Bavanište 2/2 159/10 / KC417488# (1954) InĎija 1/1 / / / Šargarepa Begeč 2/2 / / / Ljuta papričica Begeč 4/4 96/10 / KC417487 # (1956) 99/10 KC417485 # (1700) KC417490# (1907) Paprika Pirot 2/2 / / / Kukuruz Perlez 1/1 121/09 JQ730750 (1735) / Vinova loza Radmilovac 2/2 / / / Bela Crkva 3/3 138/10 / (1709) / Krčedin 1/1 / / / Aleksandrovac 5/5 125/10 JQ730745 (1712) KC417489 # (1955) Hrvatska 2/2 SB1 / KC477428/(1958) 21OS / KC477429/(1953) Vinka Beograd 8/8 198/10 JQ730743 (1645) / 204/10 / (1687) / Ečka 1/1 / / / Peršun Pančevo 3/3 231/09 JQ730741 (1707) FO393428 Valerijana Pančevo 1/1 224/09 JQ730742 (1690) / UKUPNO 41/41 / 10 9 *- duţina sekvence u bp; #- sekvence dobijene kao rezultat ove doktorske teze Radi mogućnosti korišćenja druge PCR reakcije, na jedini negativan STOLgroesF/STOLstampR uzorak Stolbur fitoplazmi, soj 123/10 poreklom sa vinove loze iz Aleksandrovca i na još dva pozitivna uzorka, uraĎena je druga (nested) PCR Mitrović REZULTATI 91 A B reakcija sa AYgroelF/STOLgroelR2 parom prajmera korišćenjem istog ciklusa kao i u direktnoj reakciji. Pošto se sekvenca prajmera AYgroelF razlikuje u samo dva nukleotida u odnosu na sekvencu regiona gde se ovaj prajmer nalazi kod Stolbur fitoplazmi, onda je on odabran za upotrebu u nested reakciji i kod Stolbur fitoplazmi. Nakon vizuelizacije uočeni su fragmenti veličine oko 1500 bp, što i odgovara očekivanoj veličini ovog fragmenta (Slika 35, B). Slika 35. Prikaz amplikona vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu umnoţenih prajmerima A - STOLgroesF/STOLstampR i B - AYgroelF/STOLgroelR2 u drugoj (nested) PCR reakciji nakon STOLgroesF/STOLstampR reakcije. Uzorak 78/10 je poreklom sa vinke iz Ečke, ostali uzorci su ili dati u Tabeli 18 ili objašnjeni u tekstu. M, marker 1kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Nakon uspešnog umnoţavanja groEL gena kod svih ispitivanih Stolbur uzoraka, uraĎena je RFLP analiza pomoću restrikcionih enzima Tru1I i AluI kao i kod AY fitoplazmi (Slike 36 i 37). Svi testirani sojevi (ukupno 41) imali su meĎusobno identične AluI RFLP profile, za razliku od Tru1I RFLP profila gde su uočena dva tipa profila (Slika 36). Od sva 41 testirana soja, 26 je imalo Tru1I RFLP profil 1 (Slika 36, desno, profil sojeva 121/09, 284/09, 147/09, 149/09, 152/09 i 93/10), a 15 profil 2 (Slika 36, desno, profil sojeva 142/09 i 96/10). Sojevi poreklom sa kukuruza i sa valerijane, kao i svi sojevi sa peršuna i šargarepe su imali profil 1, svi testirani sojevi poreklom sa paprike su imali profil 2, dok su se kod sojeva sa duvana, ljute papričice, vinke i vinove loze mogla naći oba profila (Tabela 19). Mitrović REZULTATI 92 Slika 36. Prikaz digeriranih amplikona STOLgroesF/STOLstampR pomoću restrikcionih enzima AluI (levo) i Tru1I (desno) razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu. Oznaka soja, domaćin, lokalitet: 147/09, vinka, Beograd; 149/09, peršun, Pančevo; 152/09, šargarepa, Begeč; 93/10, vinova loza, Krčedin; ostale oznake sojeva su date u Tabeli 18. M, marker PhiX174 (videti Sliku 13 sa strane 57). Slika 37. Prikaz digeriranih amplikona AYgroelF/STOLgroelR2 pomoću restrikcionog enzima Tru1I razdvojenih u 8% poliakrilamidnom gelu. Oznake sojeva su kao na Slici 35, B. M, marker 1 kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Mitrović REZULTATI 93 Tabela 19. Prikaz broja uzoraka odreĎenog Tru1I RFLP profila u odnosu na domaćina Domaćin Tru1I RFLP profil 1 Tru1I RFLP profil 2 Duvan 3 3 Šargarepa 2 0 Ljuta papričica 1 3 Paprika 0 2 Kukuruz 1 0 Vinova loza 11 2 Vinka 4 5 Peršun 3 0 Valerijana 1 0 UKUPNO 26 15 Od 41 testiranog soja kod koga je uspešno umnoţen groEL gen, osam je odabrano za sekvenciranje. MeĎu odabranim sojevima su se nalazili oni koji su imali kako Tru1I RFLP profil 1 tako i Tru1I RFLP profil 2, kao i dva soja iz Hrvatske. Nakon dobijanja i obrade sekvenci, one su deponovane u NCBI Banci gena pod pristupnim brojevima prikazanim u Tabeli 18. Analizom dobijenih sekvenci duţina od 1953 do 1958 bp utvrĎeno je da postoje tri varijabilna mesta na pozicijama 76, 597 i 1215 od početka STOLgroesF sekvence. Prvo varijabilno mesto 76 se nalazi u okviru groES gena i na ovoj poziciji se nalazi nukleotid T ili C, ali ova razlika u nukleotidu ne rezultuje u promeni predviĎene AK. Druga dva varijabilna mesta se nalaze u okviru groEL gena i na njima se nalazi ili nukleotid A ili G i oni rezultuju u promeni predviĎene AK. Na osnovu ova tri varijabilna mesta moţemo razlikovati ukupno pet različitih genotipova i to su T76A597G1215, T76G597G1215, C76A597G1215, C76G597G1215 i C 76 G 597 A 1215. Nakon uraĎene in silico analize u programu pDRAW32 utvrĎeno je da se ovih pet genotipova moţe meĎusobno razlikovati upotrebom četiri restrikciona enzima - CviJI, Hpy188I, MseI i TspDTI (Slika 38). Genotip T 76 A 597 G 1215 imaju sojevi 142/09 izolovan iz duvana i 96/10 iz ljute papričice, T76G597G1215 imaju sojevi 284/09 iz duvana i 231/09 iz peršuna, C76A597G1215 ima 159/10 iz duvana, C 76 G 597 G 1215 ima soj 125/10 izolovan iz vinove loze, a genotip C 76 G 597 A 1215 imaju dva soja iz Hrvatske iz vinove loze i pripadnici podgrupe tuf type I. Sekvenca soja 99/10 iz ljute papričice je nešto kraća od ostalih (nedostaje oko 50 bp od početka fragmenta), tako da se ne zna da li on ima genotip T76A597G1215 ili C76A597G1215. Mitrović REZULTATI 94 Virtuelnim RFLP gelovima je potvrĎeno da je pomoću Tru1I (MseI) restrikcionog enzima moguće razlikovati dve grupe fitoplazmi kao i da se ova razlika nalazi unutar groEL gena, pa je moguće koristiti Tru1I enzim i na AYgroelF/STOLgroelR2 amplikonima. TakoĎe je utvrĎeno da se pomoću enzima Hpy188I mogu razlikovati tuf type I sojevi od tuf type II sojeva na osnovu STOLgroesF/STOLstampR amplikona. Slika 38. Prikaz virtuelno digeriranih amplikona STOLgroesF/STOLstampR pomoću restrikcionih enzima CviJI, Hpy188I, MseI i TspDTI razdvojenih u 2% gelu pet postojećih genotipova. Veličine fragmenata PhiX174 markera od vrha su: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 i 72. 4.6. MULTIPLEKS PCR Pošto je na nekim biljnim vrstama moguće detektovati i AY i Stolbur fitoplazme, kao na primer kod šargarepe, vinke, peršuna, celera i pošto su prajmeri za umnoţavanje groEL gena kako kod AY fitoplazmi tako i kod Stolbur fitoplazmi dizajnirani tako da koriste isti ciklus, proverena je mogućnost korišćenja multipleks PCR reakcije za detekciju ili AY ili Stolbur fitoplazmi, kao i mogućnost detektovanja Mitrović REZULTATI 95 mešane infekcije ove dve grupe u istom uzorku. Za preliminarna istraţivanja su odabrana po dva soja AY i Stolbur fitoplazmi. Nakon upotrebe AYgroelF/R i STOLgroes/STOLstampR parova prajmera u PCR reakciji na temperaturi hibridizacije od 55ºC nije došlo do umnoţavanja, meĎutim kada je temperatura spuštena na 50ºC, došlo je do umnoţavanja fragmenata kod sva četiri ispitivana uzorka. Kod uzoraka AY fitoplazmi došlo je do umnoţavanja fragmenta veličine oko 1400 bp, što je i očekivana veličina, meĎutim kod uzoraka Stolbur fitoplazmi je pored umnoţavanja očekivanog fragmenta veličine oko 2000 bp, došlo do pojave još jednog veličine oko 1900 bp (Slika 39, A). Pošto je pokazano da prajmer AYgroelF moţe da se upotrebljava za umnoţavanje groEL gena, kako kod AY fitoplazmi tako i kod Stolbur fitoplazmi i pošto je pojavom dodatnog benda veličine 1900 bp pokazano da moţe da se koristi i u kombinaciji sa prajmerom STOLstampR, u sledećoj PCR reakciji su upotrebljeni samo prajmeri AYgroelF, AYgroelR i STOLstampR. Slika 39. Prikaz produkata multipleks PCR reakcije vizuelizovanih u 1% agaroznom gelu A - na 55ºC sa četiri prajmera; B i C - na 52ºC sa tri prajmera; sojevi 84/11 i 91/11 su sojevi AY fitoplazmi poreklom sa vinke, dok su 97/11 i 284/09 sojevi Stolbur fitoplazmi poreklom sa vinke odnosno duvana; sojevi sa slike C su nepoznati sojevi prethodno detektovanih fitoplazmi (videti u tekstu); M, marker 1kb (videti Sliku 13 sa strane 57). Da bi se skratilo vreme trajanja ciklusa, vreme denaturacije i hibridizacije je skraćeno, a temperatura hibridizacije podignuta na 52ºC. Pošto se prajmer AYgroelF koristi kao jedini uzvodni prajmer, u reakciji je upotrebljena dupla količina ovog prajmera u odnosu na druga dva nizvodna prajmera. Na ovaj način je došlo samo do umnoţavanja ţeljenih fragmenata veličine oko 1400 i 1900 bp kod AY, odnosno Stolbur fitoplazmi (Slika 39, B). Da bi se potvrdila specifičnost i mogućnost upotrebe A B C Mitrović REZULTATI 96 multipleks PCR reakcije u uzorcima sa mešanom infekcijom, ova metoda je primenjena na uzorke fitoplazmi poreklom sa topole (16SrI-P), poponca (‟Ca. P. convolvuli‟), bresta (16SrV), vinove loze (16SrV) i kruške (16SrX) uzorkovane i analizirane tokom 2012. godine, kao i na uzorak u kome se nalazilo po 1µl 100 puta razreĎene DNK sojeva 97/11 (AY fitoplazma) i 84/11 (Stolbur fitoplazma). Nakon multipleks PCR reakcije, do pojave fragmenta veličine oko 1400 bp je došlo samo kod uzorka topole, dok je kod uzorka sa mešanom DNK došlo do pojave oba fragmenta 1400 i 1900 bp (Slika 39, C). Na ovaj način je potvrĎena specifičnost multipleks PCR reakcije za detektovanje samo AY i Stolbur fitoplazmi, kako u pojedinačnim tako i u mešanim infekcijama. 4.7. ANALIZA SEKVENCI I FILOGENETSKA ANALIZA 4.7.1. Analiza sekvenci groEL gena kod Aster yellows fitoplazmi MeĎusobnim poreĎenjem sekvenci groEL gena 27 testiranih sojeva AY fitoplazmi kod kojih je sekvenciran ovaj region, kao i sekvenci dva soja AY fitoplazmi sekvenciranih u celosti, AYWB koji pripada podgrupi 16SrI-A i OY-M koji pripada podgrupi I-B, utvrĎeno je da duţina celog groEL gena kod AY fitoplazmi iznosi 1611 bp. TakoĎe je uočeno da postoje ukupno 144 varijabilna mesta (što znači da je u proseku svako 11. mesto varijabilno) od kojih 55 rezultuje u promeni predviĎene AK, dok je 89 sinonimno. Uočeno je još da kod svih sinonimnih mesta do promene nukleotida dolazi na trećoj kodonskoj poziciji. Kada se nukleotidna sekvenca prevede u AK niz dobija se protein duţine 536 AK kod koga se uočava da postoji ukupno 50 AK razlike meĎu proučavanim sojevima. Posmatranjem podgrupa pojedinačno, uočava se da je podgrupa 16SrI-A najvarijabilnija jer ima ukupno 33 varijabilna mesta od kojih je 19 sinonimno. MeĎutim, kada se iz analize izuzme soj GD koji se razlikuje po RFLP profilima od ostalih pripadnika I-A podgrupe i kome je dodeljena posebna groELI podgrupa, ostaju samo tri varijabilna mesta koja rezultuju u promeni predviĎene AK. Sojevi koji pripadaju podgrupi I-B imaju ukupno osam varijabilnih mesta, pri čemu je isti broj sinonimnih i nesinonimnih mesta. Sekvence sojeva podgrupe I-C se meĎusobno razlikuju u samo Mitrović REZULTATI 97 jednom nukleotidu koji ne rezultuje u promeni predviĎene AK tako da im je AK sekvenca identična. Kada se sekvenca groEL gena kod AY fitoplazmi uporedi sa sekvencom kod vrste Escherichia coli kod koje je protein GroEL najproučavaniji, uočava se da je GroEL protein kod E. coli nešto veći jer je duţine 548 AK za razliku od AY fitoplazmi kod kojih je on 536 AK dug. PoreĎenjem sa AK sekvencom E. coli, moguće je kod AY fitoplazmi odrediti gde počinje i gde završava svaki od tri strukturna domena. Tako kod AY fitoplazmi ekvatorijalni domen čine AK 5 do 132 kao i 406 do 521 u kome se uočava pet konzervativnih regiona sa samo par mesta razlike u odnosu na E. coli, pri čemu su promenjene AK istog polariteta. Ovi konzervativni regioni u okviru ekvatorijalnog domena se nalaze od AK 26 do 41, od 51 do 61, od 67 do 96, od 406 do 417 i od 490 do 516. Apikalni domen čine AK od 189 do 373, i ovde se uočava konzervativni domen koji se nalazi od AK 189 do 294. Treći domen je intermedijerni domen i njega čine AK 133 do 188 kao i 374 do 405. U intermedijernom domenu se uočavaju kozervativni regioni koji se nalaze od AK 156 do 177 i od 362 do 405. Po literaturnim podacima u okviru GroEL proteina postoje mesta koja imaju odreĎenu ulogu tokom procesa savijanja proteina i eksperimentalno je utvrĎeno da promenom AK na tim mestima neka od funkcija proteina se gubi. MeĎutim kod GroEL proteina AY fitoplazmi postoje odreĎena odstupanja u tim mestima. Tako se na AK mestu '452' kod AY fitoplazmi umesto arginina (R) nalazi tirozin (Y) i nigde u blizini se ne nalazi arginin, a ove dve AK se razlikuju meĎusobno po polaritetu. MeĎutim, na mestu '461' umesto glutaminske kiseline (E) nalazi se serin (S) kod svih sojeva osim kod soja PopD kod koga je tu alanin (A), a na mestu '463' se umesto serina (S) nalazi asparaginska kiselina (D). Na mestu '464' se nalazi valin (V), a na mestu '398' se nalazi asparaginska kiselina (D) što pokazuju i literaturni podaci. Na mestu '197', odnosno '386' se umesto arginina (R) nalazi lizin (K), odnosno umesto glutaminske kiseline (E) nalazi se asparaginska (D). Za ova dva mesta je značajno da čak iako se ne nalazi ista AK, nju je zamenila AK čiji je bočni lanac istog karaktera. Naime, i arginin i lizin su bazne AK (sa pozitivno naelektrisanim bočnim lancima) dok su i glutaminska i asparaginska kiselina kisele AK (sa negativno naelektrisanim bočnim lancima). Mitrović REZULTATI 98 Kada se poredi veličina GroEL proteina kod AY fitoplazmi sa veličinom ovog proteina kod mikoplazmi kod kojih postoji GroEL, kao i sa veličinom kod vrsta Spiroplasma citri, Acholeplasma laidlawii i Bacillus subtilis (Tabela 20), uočava se da AY fitoplazme imaju jedan od najmanjih GroEL proteina pri čemu je od njih manji jedino GroEL protein kod M. gallisepticum, kao i da je identične veličine sa GroEL proteinom kod A. laidlawii. Tabela 20. Veličina groEL gena i proteina kod AY fitoplazmi, mikoplazmi koje ga imaju, Acholeplasma laidlawii, Bacillus subtilis i Escherichia coli Vrsta (soj) veliĉina u bp veliĉina u AK Reference E. coli (K12) 1647 548 Blattner i sar., 1997 M. penetrans (HF-2) 1638 545 Sasaki i sar., 2002 B. subtilis (168) 1635 544 Kunst i sar., 1997 M. genitalium (G37), M. pneumoniae (FH) 1632 543 Glass i sar., 2006 Krishnakumar i sar., 2010 Spiroplasma citri (GII3) 1614 537 Carle i sar., 2010 A. laidlawii (PG-8A) i AY fitoplazme 1611 536 Lazarev i sar., 2011 - M. gallisepticum (R, high) 1605 534 Szczepanek i sar., 2010 4.7.2. Analiza sekvenci groEL gena kod Stolbur fitoplazmi Ceo protein GroEL kod Stolbur fitoplazmi je duţine 534 AK (gen je duţine 1605 bp) i u njemu se kod svih Stolbur fitoplazmi nalaze samo dva varijabilna mesta koja rezultuju u promeni predviĎene AK. Ono što se uočava je da se na AK mestu 338 kod svih sojeva iz Srbije koji pripadaju tuf type II podgrupi tu nalazi alanin (A) dok se kod sojeva iz Hrvatske, koji predstavljaju tuf type I fitoplazme, nalazi treonin (T). Kod Stolbur fitoplazmi u GroEL proteinu ekvatorijalni domen čine AK od 5 do 132 i od 406 do 521, apikalni domen čine AK od 189 do 373, a intermedijerni domen čine AK od 133 do 188 i od 374 do 405. Kao i kod AY fitoplazmi i kod Stolbur fitoplazmi se na AK mestu '452' umesto arginina (R) nalazi tirozin (Y) i nigde u blizini se ne nalazi arginin, a takoĎe se na mestima '197' i '386' umesto arginina (R), odnosno glutaminske kiseline (E) nalaze lizin (K), odnosno asparaginska kiselina (D) čiji su bočni lanci istih karaktera. I kod Stolbur fitoplazmi se zadrţala AK D'398'. Za razliku od AY fitoplazmi, kod Stolbur fitoplazmi se na mestu '461' umesto glutaminske kiseline (E) nalazi asparaginska kiselina (D), pri čemu su obe AK kisele, na mestu '463' se nalazi Mitrović REZULTATI 99 histidin (H) umesto serina (S), pri čemu ove aminokiseline imaju različito naelektrisane bočne lance (histidin je bazna AK, dok je serin AK sa polarnom bočnom grupom koja omogućava formiranje vodoničnih veza), a na mestu '464' izoleucin (I) umesto valina (V) pri čemu je njegov bočni lanac nepolaran kao i kod valina. U Tabeli 21 prikazano je koje se aminokiseline nalaze na ovih sedam pozicija kod AY i Stolbur fitoplazmi u odnosu na 'Ca. P. mali', 'Ca. P. australiense', mikoplazme koje imaju groE operon, A. laidlawii, B. subtilis i E. coli. Iz tabele se uočava da je najkonzervativnije mesto D '398' , da se kod A. laidlawii nalaze AK iste kao kod fitoplazmi, kao i da se M. penetrans razlikuje od ostale tri posmatrane vrste mikoplazmi. Tabela 21. Prikaz aminokiselina koje se po literaturnim podacima nalaze na mestima odgovornim za funkionisanje GroEL proteina kod AY i Stolbur fitoplazmi, 'Ca. P. mali', 'Ca. P. australiense', mikoplazmi koje imaju groE operon, A. laidlawii, B. subtilis i E. coli. '452' '461' '463' '464' '398' '197' '386' E.coli R E S V D R E B. subtilis R E S V D R E M. penetrans S D G V D R E M. genitalium R D K I D G E M. galisepticum R N K I D G E M. pneumoniae R N K V D G E A. laidlawii Y D D I D K E ’Ca. P. mali’ Y D H V D K E ’Ca. P. australiense’ Y D H I D K D ’Ca. P. solani’* Y D H I D K D ’Ca. P. asteris’ Y S/A** D V D K D *- vrsta još nije zvanično opisana; **- A se nalazi samo kod soja PopD dok ostale testirane AY fitoplazme imaju S Pošto je iz draft sekvenci dva soja Stolbur fitoplazmi dobijena sekvenca celog groES, groEL i stamp gena, moguće je ceo ovaj region Stolbur fitoplazmi porediti sa sve četiri fitoplazme sekvencirane u celosti kao i sa A. laidlawii i ostalim mikoplazmama koje poseduju ovaj region (Tabela 22 sa strane 103). Iz Tabele 22 uočava se da izmeĎu poreĎenih vrsta fitoplazmi i mikoplazmi kao i A. laidlawii postoje velike razlike u duţini introna, kako izmeĎu groES i groEL gena, Mitrović REZULTATI 100 tako i izmeĎu groEL gena i narednog gena. TakoĎe se uočava da postoji razlika u orijentaciji groE operona, kao i da se različiti geni nalaze nakon njega, čak i kod pripadnika fitoplazmi. Što se tiče veličine samih proteina, veličina GroES proteina je varijabilnija u odnosu na GroEL, pri čemu se najmanji GroES nalazi kod A. laidlawii dok je najmanji GroEL kod Stolbur fitoplazmi. Sa druge strane najveći GroES se nalazi kod M. pneumoniae dok je najveći GroEL kod M. penetrans. 4.7.3. Analiza sekvenci 16S rRNK, tuf, rp i secY gena kod Aster yellows fitoplazmi Gen za 16S ribozomalnu RNK je kod AY fitoplazmi duţine 1535 bp i ima 51 varijabilno mesto što znači da je u proseku svako 30. mesto polimorfno. Kod nekih sojeva se u sekvenci 16S rRNK nalaze delecije/insercije, duţine jednog nukleotida, u odnosu na sekvence ostalih sojeva što moţe biti i rezultat pojave grešaka u procesu čitanja hromatograma i pri obradi sekvenci. Kod tri soja, ca2006/5, AYWB i OY-M, sekvencirani su 16S rRNK geni u okviru oba operona i kod sva tri soja se uočava postojanje razlika izmeĎu dva operona. Tako se kod soja ca2006/5 uočava šest različitih nukleotidnih mesta, kod soja OY-M tri, a kod soja AYWB dva. Duţina tuf gena kod AY fitoplazmi iznosi 1185 bp odnosno 394 AK. Kod 16 fitoplazmi kod kojih je poreĎena sekvenca tuf gena, nalazi se 121 varijabilno mesto (što znači da je u proseku svako 10. mesto polimorfno) od kojih je 79 sinonimno, a preostale 42 nesinonimne mutacije rezultuju u promeni 32 AK. Od 121 varijabilnog mesta, 62 su bila prisutna samo jednom (“singleton polimorfna mesta”) i odnose se na individualne razlike nekog od sojeva, što čini oko 50% ukupnih polimorfnih mesta. Geni ribozomalnih proteina se kod fitoplazmi nalaze u okviru većih operona, pa tako i rpL2F3/rp(I)R1A amplikon koji je sekvenciran obuhvata četiri rp gena - rplB, rpsS, rplV i rpsC. Ceo ovaj region duţine 1531 bp ima ukupno 132 varijabilna mesta (što znači da je u proseku svako 11. mesto polimorfno) od kojih se nijedno ne nalazi u intronu, već su sva unutar gena za ribozomalne proteine. Tako se osam nalazi u rplB genu koji je duţine 89 bp (pet je sinonimno), 17 je unutar rpsS gena duţine 282 bp (od kojih je 13 sinonimno), 26 je unutar rplV gena duţine 390 bp (16 je sinonimno), a 81 je u rpsC genu koji je dug 756 bp (od kojih je 44 sinonimno). Zanimljivo je da soj OY-M Mitrović REZULTATI 101 jedini ima deleciju od četiri bp unutar introna izmeĎu rpsS i rplV, kao i da se u regionu preklapanja rplV i rpsC gena ne nalazi ni jedno varijabilno mesto kod svih posmatranih sekvenci. Što se tiče nesinonimnih mutacija one kod rplB i rpsS rezultuju u promeni tri predviĎene AK, dok kod rplV i rpsC rezultuju u promeni devet odnosno 29 predviĎenih AK. Pošto se geni rplV i rpsC preklapaju, START kodon za rpsC gen je GTG, a okvir čitanja za ovaj gen je pomeren za jedno mesto unapred u odnosu na okvir čitanja kod rplV gena. Kod gena secY uočava se najveća varijabilnost sekvenci, gde je u proseku svaki šesti nukleotid varijabilan jer se u prvih 361 bp nalazi 60 varijabilnih mesta. Sva varijabilna mesta ukupno rezultuju u promeni 87 predviĎenih AK. TakoĎe je uočeno da jedino soj PopD ima delecije unutar secY gena, pa kada se ovaj soj isključi iz analize, onda se dobijaju 54 mesta sa različitom predviĎenom AK. To znači da više od 1/3 varijabilnih mesta secY gena pripada soju PopD. Zanimljivo je da je jedino kod soja AY-A START kodon GTG dok je kod svih ostalih on ATG. Kada se porede duţine ovih gena i groE operona kod tri vrste fitoplazmi sekvencirane u potpunosti, Stolbur fitoplazmi, A. laidlawii i mikoplazmi koje poseduju groE operon, uočava se da je tuf gen najkonzervativniji što se tiče varijabilnosti veličine gena, jer njegova standardna devijacija iznosi 4.5 bp na nivou svih posmatranih vrsta (Tabela 22). Nakon tuf gena slede rplB i groEL geni čija standardna devijacija iznosi 16.5 bp. Najvarijabilniji geni u odnosu na duţinu su geni rplV sa standardnom devijacijom od 345 bp i secY sa 136.5 bp. Standardna devijacija za duţinu gena kod 16S rRNK gena iznosi 40.5 bp, što ga svrstava meĎu srednje varijabilne gene zajedno sa rpsS (24 bp), rpsC (48 bp) i groES (45 bp) genima. Ako posmatramo duţinu gena samo u okviru navedenih fitoplazmi (Tabela 22), situacija je nešto drugačija. Najkonzervativniji je gen rpsS čija standardna devijacija iznosi 0 bp, a potom slede geni tuf i groEL sa standardnom devijacijom od 3 bp. Najvarijabilniji je groES gen čija standardna devijacija duţine gena iznosi 31.5 bp. Iz Tabele 22 se takoĎe uočava da su kod fitoplazmi u globalu srednje vrednosti duţina posmatranih gena manje nego kod mikoplazmi, pri čemu je i sam opseg duţina posmatranih gena kod fitoplazmi meĎu niţim vrednostima u odnosu na opseg kod mikoplazmi. Tako je i srednja vrednost duţine groEL gena kod fitoplazmi 1608 bp a Mitrović REZULTATI 102 kreće se u opsegu od 1605 do 1611 bp, dok je kod mikoplazmi ona 1621.5 bp, pri čemu većina mikoplazmi ima duţinu groEL gena izmeĎu 1632 i 1638 bp. Duţina groES gena kod fitoplazmi je 295.5 bp, dok kod mikoplazmi ona iznosi 312 bp. Ako posmatramo duţinu ovih gena kod vrste A. laidlawii u odnosu na fitoplazme i mikoplazme, uočava se da je njena duţina gena pribliţnija duţini kod fitoplazmi nego kod mikoplazmi, pa je tako i duţina groEL gena kod A. laidlawii 1611 bp, kao i kod većine fitoplazmi, a groES gena 261 bp, pri čemu je to i najmanja duţina ovog gena kod svih posmatranih vrsta. Mitrović REZULTATI 103 Tabela 22. Duţina i orijentacija 16S rDNK, tuf, secY, groES, groEL gena i gena ribozomalnih proteina, kao i duţina introna u rp i groE operonu kod fitoplazmi, mikoplazmi koje poseduju groE operon i A. laidlawii o.- orijentacija gena/operona; *- vrsta još nije zvanično opisana; $- pretpostavljena veličina na osnovu poreĎenja sa sekvencom AY fitoplazmi; **- standardna devijacija gen /vrsta 16S rRNK o. tuf o. rplB ITS rpsS ITS rplV ITS rpsC o. secY o. groES ITS groEL ITS (st)amp /imp o. 'Ca. P. asteris' AYWB 1535 +/+ 1185 - 831 12 282 20 390 -17 759 - 1242 - 270 125 1611 157 495 - 'Ca. P. asteris' OY-M 1535 +/- 1185 + 831 12 282 16 390 -17 759 + 1242 + 270 191 1611 157 702 + 'Ca. P. solani'* 1535 $ / 1185 / 831 13 282 20 384 -17 726 / 1224 / 267 28 1605 141 474 / 'Ca. P. australiense' 1533 -/- 1185 - 831 13 282 20 369 -17 753 - 1248 - 327 25 1611 319 447 + 'Ca. P. mali' 1521 +/+ 1179 + 843 15 282 17 396 -17 738 + 1245 + 264 177 1611 726 / (nrdF) + A. laidlawii 1506 + 1188 + 831 12 279 12 336 7 771 + 1299 + 261 25 1611 154 /(hypo) - M. genitalium 1519 + 1185 + 858 -1 264 2 435 2 807 + 1428 + 333 12 1632 16 /(leucyl aminop eptidase ) - M. penetrans 1454 - 1185 + 840 57 234 17 1026 22 / rplP - 1422 - 273 29 1638 59 / dUTPas e + M. gallisepticum 1505 + 1185 + 852 20 264 10 435 2 792 + 1497 + 294 -1 1605 102 / msrB - M. pneumoniae 1516 + 1185 - 864 -1 264 1 480 1 822 + 1434 + 351 2 1632 13 / pepA - Srednja vrednost duţine gena kod fitoplazmi (**) 1528 (7) 1162 (3) 837 (6) 282 (0) 382.5 (13.5) 742.5 (16.5) 1236 (12) 295.5 (31.5) 1608 (3) Srednja vrednost duţine gena kod mikoplazmi (**) 1486.5 (32.5) 1185 (0) 852 (12) 249 (15) 730.5 (295.5) 807 (15) 1459.5 (37.5) 312 (39) 1621.5 (16.5) Mitrović REZULTATI 104 4.7.4. Filogenetska analiza sekvenci 16S rDNK, groEL, tuf, rp i secY gena Da bi se odredila genetička sličnost i evolutivna bliskost proučavanih sojeva, izračunata je veličina nukleotidnih razlika proučavanih gena izraţena genetičkom udaljenošću (p-distance), a potom je rekonstruisano filogenetsko stablo. Filogenetska stabla su generisana pomoću Maximum Parsimony metode upotrebom programa MEGA5. Uporednom analizom sekvenci 16S rRNK i groEL gena utvrĎeno je da srednja vrednost procenta meĎusobne identičnosti svih sojeva AY fitoplazmi iznosi 99.5% odnosno 98.1% za ova dva gena, pri čemu je njen opseg za 16S rRNK od 98.7 do 100%, a za groEL gen od 93.7 do 100%. Najveća razlika u sekvencama iskazana najmanjim procentom identičnosti je uočena izmeĎu sojeva CHRYM (16SrI-A) i PopD (16SrI-P), kako za 16S rRNK gen tako i za groEL gen (Tabela 23). Vrednosti identičnosti sekvenci meĎu testiranim sojevima AY fitoplazmi kao i sojeva 'Ca. P. australiense', 'Ca. P. mali' i A. laidlawii su prikazane u Tabeli 23 pri čemu su, zbog preglednijeg prikaza, izostavljeni sojevi koji su imali identičnost i 16S rDNK i groEL gena od 99.9 i 100%. Najveća identičnost sekvenci unutar podgrupe je uočena kod sojeva iz podgrupe 16SrI-C kako za 16S rRNK gen tako i za groEL gen čija srednja vrednost procene evolucione divergencije unutar grupe iznosi 0, dok je ova vrednost najveća kod pripadnika podgrupe 16SrI-A gde ona iznosi 0.004 (16S rRNK), odnosno 0.007 (groEL gen). Ova vrednost kod pripadnika podgrupe 16SrI-B iznosi 0.002 za 16S rRNK odnosno 0.001 za groEL gen. Kada se poredi identičnost 16S rRNK sekvenci izmeĎu 16SrI podgrupa, uočava se da je najveća razlika izmeĎu pripadnika podgrupe 16SrI-P i podgrupa 16SrI-C i I-F i čija srednja vrednost iznosi 98.8%, dok je najmanja izmeĎu podgrupa I-A i I-B kao i izmeĎu podgrupe I-B i podgrupa I-C i I-F i ona iznosi 99.4%. U odnosu na groEL gen ove vrednosti su nešto drugačije, pa je tako najmanja vrednost izmeĎu podgrupa 16SrI-P i I-A i iznosi 93.9%, a najveća izmeĎu I-A i I-C i iznosi 97.7% (Tabela 24). Mitrović REZULTATI 105 Tabela 23. Vrednosti identičnosti sekvenci 16S rRNK i groEL gena izmeĎu testiranih sojeva AY fitoplazmi (uključujući i sojeve AYWB i OY-M) i vrsta 'Ca. P. australiense', 'Ca. P. mali' i A. laidlawii *- za računanje identičnosti je uzeta sekvenca jednog od dva meĎusobno različita i javno dostupna operona; **- u gornjem redu se nalazi vrednost identičnosti nukleotidnih, a u donjem aminokiselinskih sekvenci groEL gena 16S rRNK Soj 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 groEL ** 1 CHRYM (I-A) 0.997 0.996 0.995 0.991 0.991 0.992 0.991 0.991 0.991 0.992 0.992 0.991 0.992 0.989 0.987 0.997 0.991 0.961 0.916 0.861 2 ca2006/1 (I-A) 0.999 0.998 0.999 0.997 0.995 0.994 0.995 0.993 0.994 0.993 0.995 0.995 0.994 0.995 0.991 0.990 0.999 0.994 0.963 0.917 0.861 3 PVM (I-A) 0.999 0.996 0.998 0.994 0.997 0.993 0.993 0.994 0.993 0.993 0.993 0.994 0.994 0.993 0.994 0.991 0.989 0.999 0.993 0.963 0.918 0.864 4 NJ-AY (I-A) 0.999 0.996 0.999 0.998 0.999 0.996 0.992 0.992 0.993 0.993 0.992 0.991 0.993 0.993 0.992 0.993 0.989 0.988 0.998 0.992 0.961 0.917 0.862 5 GD (I-A) 0.980 0.977 0.980 0.979 0.980 0.977 0.981 0.981 0.995 0.996 0.994 0.995 0.994 0.995 0.996 0.993 0.994 0.992 0.990 0.994 0.995 0.963 0.920 0.865 6 AY-W (I-B) 0.969 0.968 0.970 0.969 0.969 0.968 0.971 0.971 0.978 0.977 0.999 0.998 0.999 0.999 0.997 0.998 0.995 0.995 0.993 0.990 0.994 1.000 0.965 0.920 0.864 7 DIV (I-B) 0.969 0.966 0.970 0.968 0.969 0.966 0.971 0.969 0.978 0.975 0.999 0.998 0.997 0.998 0.999 0.997 0.999 0.995 0.995 0.994 0.991 0.995 0.999 0.966 0.921 0.865 8 PYR (I-B) 0.970 0.968 0.971 0.969 0.970 0.968 0.971 0.971 0.979 0.977 0.999 1 0.999 0.998 0.998 0.997 0.996 0.997 0.994 0.994 0.993 0.990 0.993 0.998 0.965 0.920 0.866 9 NA (I-B) 0.970 0.968 0.971 0.969 0.970 0.968 0.971 0.971 0.979 0.977 0.999 1 0.999 0.998 1 1 0.998 0.997 0.998 0.995 0.995 0.993 0.990 0.994 0.999 0.966 0.921 0.867 10 SAY (I-B) 0.970 0.968 0.971 0.969 0.970 0.968 0.971 0.971 0.979 0.977 0.999 1 0.999 0.998 1 1 1 1 0.996 0.997 0.994 0.994 0.993 0.990 0.993 0.999 0.966 0.921 0.867 11 ca2006/5* (I-B) 0.968 0.964 0.969 0.966 0.968 0.964 0.969 0.967 0.977 0.973 0.998 0.996 0.998 0.994 0.998 0.996 0.998 0.996 0.998 0.996 0.998 0.994 0.994 0.993 0.991 0.995 0.997 0.967 0.921 0.869 12 MBSCol. (I-B) 0.968 0.962 0.969 0.964 0.968 0.962 0.969 0.966 0.977 0.971 0.998 0.994 0.998 0.992 0.998 0.994 0.998 0.994 0.998 0.994 0.999 0.998 0.995 0.995 0.994 0.993 0.995 0.998 0.966 0.921 0.866 13 LEO (I-C) 0.976 0.968 0.975 0.966 0.976 0.968 0.976 0.968 0.981 0.971 0.975 0.962 0.975 0.960 0.975 0.962 0.975 0.962 0.975 0.962 0.973 0.958 0.973 0.956 1.000 0.992 0.988 0.994 0.995 0.968 0.925 0.869 14 PPT (I-C) 0.976 0.968 0.976 0.966 0.976 0.968 0.976 0.968 0.982 0.971 0.975 0.962 0.975 0.96 0.976 0.962 0.976 0.962 0.976 0.962 0.974 0.958 0.974 0.956 0.999 1 0.992 0.988 0.995 0.995 0.967 0.924 0.868 15 AY-A (I-F) 0.973 0.975 0.974 0.977 0.973 0.975 0.974 0.979 0.978 0.973 0.971 0.966 0.971 0.964 0.972 0.966 0.972 0.966 0.972 0.966 0.970 0.964 0.970 0.962 0.975 0.966 0.975 0.966 0.988 0.991 0.993 0.965 0.922 0.868 16 PopD (I-P) 0.937 0.946 0.938 0.948 0.937 0.946 0.939 0.950 0.946 0.958 0.947 0.962 0.947 0.96 0.948 0.962 0.948 0.962 0.948 0.962 0.946 0.960 0.946 0.958 0.944 0.952 0.945 0.952 0.942 0.948 0.990 0.990 0.960 0.918 0.863 17 AYWB* (I-A) 0.999 0.996 0.999 0.998 0.999 0.996 1 1 0.981 0.981 0.971 0.971 0.971 0.969 0.971 0.971 0.971 0.971 0.971 0.971 0.969 0.967 0.969 0.966 0.976 0.968 0.976 0.968 0.974 0.979 0.939 0.950 0.994 0.964 0.918 0.864 18 OY-M* (I-B) 0.971 0.968 0.971 0.969 0.971 0.968 0.972 0.971 0.980 0.977 0.999 1 0.999 0.998 0.999 1 0.999 1 0.999 1 0.998 0.996 0.998 0.994 0.976 0.962 0.977 0.962 0.973 0.966 0.948 0.962 0.972 0.971 0.965 0.920 0.866 19 Ca_P_austra liense* 0.747 0.766 0.746 0.766 0.747 0.766 0.747 0.769 0.747 0.759 0.746 0.761 0.745 0.759 0.746 0.761 0.746 0.761 0.746 0.761 0.747 0.758 0.744 0.756 0.743 0.756 0.743 0.756 0.741 0.761 0.751 0.774 0.747 0.769 0.746 0.761 0.914 0.862 20 Ca_P_mali* 0.683 0.645 0.682 0.645 0.683 0.645 0.683 0.648 0.690 0.642 0.685 0.651 0.685 0.648 0.686 0.651 0.686 0.651 0.686 0.651 0.688 0.650 0.686 0.651 0.682 0.637 0.682 0.637 0.685 0.648 0.689 0.651 0.683 0.648 0.686 0.651 0.666 0.659 0.866 21 A_laidlawii* 0.520 0.578 0.520 0.578 0.520 0.578 0.522 0.581 0.531 0.575 0.537 0.578 0.536 0.575 0.537 0.578 0.537 0.578 0.537 0.578 0.537 0.577 0.537 0.578 0.526 0.584 0.528 0.584 0.525 0.575 0.514 0.578 0.522 0.581 0.536 0.578 0.510 0.565 0.541 0.596 Mitrović REZULTATI 106 Kada se nukleotidna sekvenca groEL gena prevede u aminokiselinsku sekvencu koristeći “bacterial plastid“ genetički kod, uočava se da je srednja vrednost identičnosti sekvenci AY sojeva 97.8%, a kreće se od 94.6% izmeĎu soja PopD (16SrI-P) i sojeva CHRYM i PVM (16SrI-A) do 100% izmeĎu nekih sojeva podgrupe 16SrI-B. Najveća identičnost sekvenci unutar grupe izraţena kao vrednost srednje evolucione divergencije ustanovljena je kod pripadnika podgrupe 16SrI-C i iznosi 0, dok je najmanja opet kod pripadnika pogrupe 16SrI-A gde iznosi 0.009. Ova vrednost kod podgrupe 16SrI-B je ista i na nivou nukleotidne i na nivou aminokiselinske sekvence i iznosi 0.002. Srednja vrednost identičnosti sekvenci izmeĎu 16SrI podgrupa je najmanja izmeĎu I-P i I-F i iznosi 94.8%, a najveća je izmeĎu I-F i I-A gde iznosi 97.7% (Tabela 24). Tabela 24. Vrednosti identičnosti sekvenci 16S rRNK i groEL gena izmeĎu 16SrI podgrupa, 'Ca. P. australiense', 'Ca. P. mali' i A. laidlawii 16S rRNK 16SrI podgrupa 1 2 3 4 5 6 7 8 groEL* 1 I-A 0.994 0.993 0.990 0.989 0.964 0.918 0.863 2 I-B 0.972 0.994 0.994 0.991 0.967 0.921 0.867 0.970 3 I-C 0.977 0.975 0.991 0.988 0.968 0.925 0.870 0.968 0.961 4 I-F 0.974 0.971 0.975 0.988 0.966 0.922 0.868 0.977 0.965 0.966 5 I-P 0.939 0.947 0.945 0.942 0.961 0.918 0.863 0.949 0.961 0.952 0.948 6 'Ca. P. australiense' 0.746 0.747 0.743 0.741 0.751 0.916 0.864 0.761 0.766 0.756 0.761 0.774 7 'Ca. P. mali' 0.686 0.684 0.682 0.685 0.689 0.666 0.866 0.651 0.646 0.637 0.648 0.651 0.659 8 A. laidlawii 0.537 0.522 0.527 0.525 0.514 0.510 0.541 0.577 0.578 0.584 0.575 0.578 0.565 0.596 *- u gornjem redu se nalazi vrednost identičnosti nukleotidnih, a u donjem aminokiselinskih sekvenci groEL gena Procenat identičnosti aminokiselinskih sekvenci groEL gena izmeĎu AY fitoplazmi, Stolbur fitoplazmi, 'Ca. P. australiense' i 'Ca. P. mali' kreće se izmeĎu 64.1 i 84.8%. Njima najbliţa je A. laidlawii sa kojom pomenute fitoplazme dele 56.8-59.4% Mitrović REZULTATI 107 identičnosti, za razliku od mikoplazmi sa kojima dele izmeĎu 7.4 i 21%, vrste B. subtilis sa kojom dele 29.1-36.3% i vrste E. coli sa kojom dele 18.5-21%. Sa druge strane, procenat identičnosti aminokiselinskih sekvenci groEL gena izmeĎu četiri vrste mikoplazmi koje poseduju groE operon kreće se od 6.8 do 83.8%. PoreĎenjem vrednosti identičnosti sekvenci izmeĎu dva operona 16S rRNK gena sojeva ca2006/5, AYWB, OY-M, 'Ca. P. australiense', 'Ca. P. mali' i A. laidlawii kod kojih su sekvencirana oba operona, uočava se da kod soja ca2006/5 postoji najveća razlika izmeĎu dva operona jer je njihova vrednost identičnosti sekvenci 99.6%, dok se kod ostalih sojeva ona kreće od 99.8 do 100% (Tabela 25). Kada se poredi razlika vrednosti identičnosti sekvenci svakog od operona u odnosu na sekvence 16S rDNK svih ostalih testiranih sojeva, ona se uglavnom kreće od 0 do 0.2%, osim kod soja ca2006/5 kod koga ona ide čak i do 0.4% (operon A ima identičnost od 100%, dok operon B ima identičnost od 99.6% sa sojem AY-J). Analizom sekvenci tuf, rp i secY gena kod 14 do 16 sojeva (u zavisnosti od gena) kod kojih su sekvencirani ovi geni, utvrĎeno je da srednja vrednost procenta meĎusobne identičnosti svih sojeva AY fitoplazmi za tuf gen iznosi 97.2% (opseg je od 93 do 99.9%), za rp gen 97.4% (opseg je od 93.2 do 100%), a za secY gen iznosi 94.8% (opseg je od 84 do 100%). Najniţu vrednost procenta sličnosti sekvenci ima soj PopD sa nekim od sojeva iz podgrupe 16SrI-A kod rp i secY gen, odnosno sa sojem ca2006/5 (16SrI-B) kod tuf gena. Zanimljivo je da soj ca2006/9 koji je poreklom sa šargerepe iz Srbije i koji pripada podgrupi 16SrI-B ima 100% identičnost sekvenci rp i secY gena sa sojem AV2192 (16SrI-L) poreklom sa lepe kate (Callistephus chinensis) iz Nemačke i 99.9% identičnosti sekvence tuf gena sa sojem PRIVA (takoĎe 16SrI-L) poreklom sa jagorčevine (Primula sp.) iz Nemačke, a u odnosu na sekvencu groEL gena ima 100% identičnosti i sa sojem AV2192 i sa sojem PRIVA. U odnosu na 16S rDNK, soj ca2006/9 ima 99.9% identičnosti sekvenci sa dva gore navedena soja. Sa druge strane, soj ca2006/9 ima 99.8% identičnosti sekvenci groEL gena, 99.7% identičnosti 16S rRNK i tuf gena, 99.6% identičnosti rp gena i 99.4% identičnosti secY gena sa sojem ca2006/5 koji je takoĎe poreklom sa šargarepe iz Srbije i koji pripada podgrupi 16SrI-B. Mitrović REZULTATI 108 Tabela 25. Vrednosti identičnosti sekvenci 16S rRNK gena dva operona sojeva kod kojih su oba operona sekvencirana i testiranih Aster yellows fitoplazmi c a 2 0 0 6 /5 A c a 2 0 0 6 /5 B M B S C o lo m b ia C A L E O K V F P P T A C L R -A Y P o p D A Y W B r 0 1 A Y W B r 0 4 O Y -M r 0 1 O Y -M r 0 6 ‘C a . P . a u st ra li en se ’ r 0 1 ‘C a . P . a u st ra li en se ’ r 0 2 ‘C a . P . m a li ’ R 0 0 0 1 ‘C a . P . m a li ’ R 0 0 1 7 A . la id la w ii 0 0 6 7 A . la id la w ii 1 1 4 7 AYWB r01/r04 0.995 0.993 0.995 0.993 0.994 0.993 0.995 0.991 0.990 / / / / / / / / / / 0.993 0.992 0.993 0.991 0.993 0.992 0.993 0.990 0.988 0.999 / / / / / / / / / OY-M r01/r06 0.997 0.997 0.998 0.993 0.995 0.994 0.995 0.993 0.990 0.994 0.993 / / / / / / / / 0.998 0.998 0.999 0.995 0.996 0.995 0.996 0.995 0.992 0.995 0.994 0.998 / / / / / / / ‘Ca. P. australiense’ r01/r02 0.967 0.966 0.966 0.967 0.968 0.966 0.967 0.965 0.960 0.964 0.962 0.965 0.967 / / / / / / 0.969 0.968 0.968 0.969 0.970 0.969 0.970 0.967 0.962 0.966 0.964 0.967 0.969 0.998 / / / / / ‘Ca. P. mali’ R0001 0.921 0.921 0.921 0.924 0.925 0.927 0.924 0.922 0.918 0.918 0.917 0.920 0.921 0.914 0.917 / / / / 0.921 0.921 0.921 0.924 0.925 0.927 0.924 0.922 0.918 0.918 0.917 0.920 0.921 0.914 0.917 1.000 / / / A. laidlawii 0067/1147 0.869 0.867 0.866 0.869 0.869 0.875 0.868 0.868 0.863 0.864 0.865 0.866 0.868 0.862 0.865 0.866 0.866 / / 0.869 0.867 0.866 0.869 0.869 0.875 0.868 0.868 0.863 0.864 0.865 0.866 0.868 0.862 0.865 0.866 0.866 1.000 / ca2006/5 A/B / / 0.998 0.993 0.994 0.993 0.994 0.993 0.991 0.995 0.993 0.997 0.998 0.967 0.969 0.921 0.921 0.869 0.869 0.996 / 0.999 0.993 0.994 0.993 0.994 0.993 0.991 0.993 0.992 0.997 0.998 0.966 0.968 0.921 0.921 0.867 0.867 C H R Y M c a 2 0 0 6 /1 P V M N J -A Y G D 1 A V U T A V 2 1 9 2 P R IV C A Y -W D IV P R G P Y R R V G L A W C N A c a 2 0 0 6 /9 S A Y A Y -2 7 A Y -J AYWB r01/r04 0.997 0.999 0.999 0.998 0.994 0.995 0.995 0.995 0.994 0.995 0.995 0.993 0.995 0.995 0.994 0.994 0.993 0.995 0.995 0.995 0.998 0.997 0.998 0.993 0.994 0.994 0.994 0.993 0.993 0.994 0.992 0.993 0.993 0.993 0.993 0.992 0.993 0.993 OY-M r01/r06 0.991 0.994 0.993 0.992 0.995 1.000 0.999 0.999 1.000 0.999 0.999 0.998 0.999 0.999 0.999 1.000 0.999 0.999 0.997 0.993 0.995 0.995 0.993 0.996 1.000 1.000 1.000 0.999 0.999 1.000 0.998 0.999 0.999 0.999 0.999 0.998 0.999 0.998 ‘Ca. P. australiense’ r01/r02 0.961 0.963 0.963 0.961 0.963 0.968 0.968 0.968 0.965 0.966 0.967 0.965 0.966 0.966 0.966 0.965 0.966 0.966 0.966 0.963 0.965 0.965 0.964 0.965 0.970 0.970 0.970 0.967 0.968 0.969 0.967 0.968 0.968 0.968 0.967 0.968 0.968 0.968 ‘Ca. P. mali’ R0001/R0017 0.916 0.917 0.918 0.917 0.920 0.923 0.924 0.923 0.920 0.921 0.921 0.920 0.922 0.921 0.921 0.920 0.921 0.920 0.919 0.916 0.917 0.918 0.917 0.920 0.923 0.924 0.923 0.920 0.921 0.921 0.920 0.922 0.921 0.921 0.920 0.921 0.920 0.919 A. laidlawii 0067/1147 0.861 0.861 0.864 0.862 0.865 0.869 0.869 0.869 0.864 0.865 0.866 0.866 0.868 0.865 0.867 0.864 0.867 0.865 0.866 0.861 0.861 0.864 0.862 0.865 0.869 0.869 0.869 0.864 0.865 0.866 0.866 0.868 0.865 0.867 0.864 0.867 0.865 0.866 ca2006/5 A/B 0.992 0.995 0.994 0.993 0.995 0.998 0.998 0.998 0.997 0.997 0.998 0.996 0.997 0.997 0.997 0.997 0.996 0.997 1.000 0.991 0.993 0.993 0.991 0.994 0.998 0.998 0.998 0.997 0.997 0.998 0.996 0.997 0.997 0.997 0.997 0.996 0.997 0.996 Mitrović REZULTATI 109 Od pripadnika podgrupe 16SrI-P u NCBI Banci gena se nalaze tri sekvence tuf gena (JN005713 (842 bp), JN005714 (842 bp) i JN005717 (841 bp)) i četiri sekvence rp gena (JN005718 (1240 bp), JN005719 (1240 bp), JN005722 (1240 bp) i JN005723 (1240 bp)). Sve sekvence su od sojeva izolovanih iz topole iz Hrvatske. Soj PopD ima 99.8-99.9% identičnosti nukleotidnih i 100% aminokiselinskih sekvenci tuf gena, odnosno 99.7-99.8% nukleotidnih i 99.5-100% aminokiselinskih sekvenci rp gena sa navedenim sekvencama. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci skoro celog 16S rRNK gena u okviru AY fitoplazmi pokazuje jasno odvajanje sojeva podgrupe I-C u zaseban klaster sa visokom vrednošću stabilnosti (bootstrap vrednost) od 93%, kao i odvajanje sojeva podgrupe I-A, osim soja GD, u zaseban klaster sa još većom vrednošću stabilnosti od 95% (Slika 40). Jasno se uočava i odvajanje sojeva ACLR-AY (AY-A) i PopD koji predstavljaju podgrupe 16SrI-F i I-P u zasebne linije. MeĎutim, njihovo mesto u filogenetskom stablu nije jasno odreĎeno pošto su njihove vrednosti stabilnosti jako niske, odnosno manje su od 50%, pa nisu prikazane na stablu. Sojevi koji pripadaju podgrupama I-M i I-L se nalaze meĎu članovima podgrupe I-B, ali ni njihovo mesto nije jasno definisano s obzirom na to da je vrednost stabilnosti manja od 50%. MeĎutim, ono što se uočava na ovom filogenetskom stablu jeste da se u okviru klastera podgrupe I-B jedan od 16S rDNK operona soja ca2006/5 nalazi u zasebnom klasteru zajedno sa sojem AY-J, pri čemu je vrednost stabilnosti visoka i iznosi 90%. Drugi operon soja ca2006/5 se nalazi u klasteru zajedno sa sojevima MBSColombia (16SrI-B) i sojem PopD (16SrI-P) meĎutim vrednost stabilnosti je ispod 50%. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu celog groEL gena ima u osnovi istu topologiju kao i stablo 16S rRNK, s tim što je ovde došlo još i do izdvajanja novih klastera unutar podgrupa 16SrI-A, I-B i I-C (Slika 41). Naime, soj GD se pojavljuje odvojeno od ostalih sojeva iz podgrupe 16SrI-A, kao što i sojevi MBSColombia, AY-J i ca2006/5 formiraju zaseban klaster unutar podgrupe 16SrI-B (vrednost stabilnosti je 85%), pri čemu sojevi AY-J i ca2006/5 grupišu zajedno u odnosu na MBSColombia sa vrednošću stabilnosti od 73%. Unutar podgrupe 16SrI-C se uočavaju dva klastera koja se sastoje od sojeva CA i LEO (vrednost stabilnosti od 70%) odnosno KVF i PPT. Sa druge strane sojevi AVUT, AY2192 i PRIVA koji pripadaju podgrupama 16SrI-M i I-L se nalaze u jednom klasteru zajedno sa ostalim sojevima iz podgrupe 16SrI-B koji ceo Mitrović REZULTATI 110 ima vrednost stabilnosti od 99%. Soj AY-A, pripadnik podgrupe 16SrI-F, nalazi se kao zasebna grana izmeĎu soja GD i ostalih sojeva iz podgrupe 16SrI-A, meĎutim vrednost stabilnosti je manja od 50%, pa vrednost nije prikazana na slici. Soj PopD (16SrI-P) čini potpuno odvojenu granu od svih ostalih sojeva, pri čemu vrednost stabilnosti za grupisanje ostalih sojeva u jedan klaster iznosi 99%. Što se tiče meĎusobnog odnosa podgrupa, na filogenetskom stablu se jasno uočavaju tri grupacije sojeva - jednu čine grupisani sojevi iz podgrupa 16SrI-A, I-F i I-C, drugu čine sojevi iz podgrupe 16SrI-B, i treći je soj PopD koji je odvojen u zasebnu liniju. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu aminokiselinskih sekvenci groEL gena (podatak nije prikazan) je pokazalo identično grupisanje sojeva u klastere kao i kod stabla rekonstruisanog na osnovu nukleotidnih sekvenci, osim kod sojeva podgrupe 16SrI-C koji su se svi nalazili u jednom nepodeljenom klasteru. To je iz razloga što se nukleotidne sekvence ovih sojeva razlikuju u jednom nukleotidu koji ne utiče na promenu aminokiselinskog sastava, tako da je identičnost njihove aminokiselinske sekvence 100%, pa samim tim nema ni podele u dva klastera na osnovu aminokiselinske sekvence. Devet zasebnih linija koje se uočavaju na filogenetskom stablu rekonstruisanom na osnovu sekvenci groEL gena, u skladu su sa podelom na groELI podgrupe, napravljenu na osnovu RFLP analize. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu zdruţenih sekvenci tuf, rp i secY gena ima identičnu topologiju kao i stablo rekonstruisano na osnovu groEL gena (Slika 42). Na ovom filogenetskom stablu se uočava jasno odvajanje šest linija sa visokim vrednostima stabilnosti. Sojevi koji pripadaju podgrupama 16SrI-B, I-M i I-L se nalaze u klasteru čija vrednost stabilnosti iznosi 100% i u okviru koga se odvaja još jedan klaster koga čine sojevi MBSColombia i ca2006/5 sa vrednošću stabilnosti od 99%. Pripadnici podgrupa I-A (osim soja GD) i I-C se takoĎe nalaze u zasebnim klasterima sa vrednošću stabilnosti od 100%. Ono što se uočava na ovom rekonstruisanom filogenetskom stablu je da se soj GD jasno odvojio u zasebnu liniju u odnosu na ostale članove podgrupe I-A, kao i da se sojevi iz podgrupa I-A, I-F i I-C nalaze grupisani zajedno, u odnosu na sojeve podgrupe I-B, sa vrednošću stabilnosti od 95%. Soj PopD Mitrović REZULTATI 111 (16SrI-P) se nalazi u zasebnoj liniji odvojenoj od svih ostalih sojeva AY fitoplazmi koji se nalaze grupisani zajedno sa vrednošću stabilnosti od 100%. Slika 40. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci skoro celog 16S rRNK gena korišćenjem Maximum Parsimony metode i analize stabilnosti sa 1000 ponavljanja. Sekvenca A. laidlawii upotrebljena je kao spoljna grupa sa svrhom da ukoreni stablo. Na filogenetskom stablu su prikazane samo vrednosti stabilnosti veće od 50%, a pripadnost soja odreĎenoj podgrupi prikazana je sa desne strane stabla. Sojevi označeni zvezdicom su oni kod kojih je sekvenca dobijena u ovom doktoratu. Mitrović REZULTATI 112 Slika 41. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci celog groEL gena korišćenjem Maximum Parsimony metode i analize stabilnosti sa 1000 ponavljanja. Sekvenca A. laidlawii upotreblljena je kao spoljna grupa sa svrhom da ukoreni stablo. Na filogenetskom stablu su prikazane samo vrednosti stabilnosti veće od 50%, a pripadnost soja odreĎenoj podgrupi, kako 16SrI- tako i groELI-, prikazana je sa desne strane stabla. Sojevi označeni zvezdicom su oni kod kojih je sekvenca dobijena u ovom doktoratu. Mitrović REZULTATI 113 Slika 42. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu sekvenci tuf, rp i secY gena korišćenjem Maximum Parsimony metode i analize stabilnosti sa 1000 ponavljanja. Sekvenca A. laidlawii upotrebljena je kao spoljna grupa sa svrhom da ukoreni stablo. Na filogenetskom stablu su prikazane samo vrednosti stabilnosti veće od 50%, a pripadnost soja odreĎenoj 16SrI podgrupi prikazana je sa desne strane stabla. Sojevi označeni zvezdicom su oni kod kojih je neka od sekvenci ova tri gena dobijena u ovom doktoratu. Mitrović DISKUSIJA 114 5. DISKUSIJA Od kada su identifikovane (Doi i sar., 1967), fitoplazme su vremenom sve intenzivnije proučavane i utvrĎeno je da su one patogeni mnogobrojnih biljnih vrsta kod kojih izazivaju različita oboljenja, a u nekim slučajevima su izazivači ozbiljnih epidemija ekonomski vaţnih biljaka. Pošto fitoplazme još uvek nisu uspešno odgajene u in vitro uslovima, njihova identifikacija kao i klasifikacija se uglavnom bazira na molekularnim tehnikama kao što je PCR koji je obično praćen RFLP metodom (Lee i sar., 1998b; Bertaccini, 2007). Upotreba molekularnih metoda koje su se intenzivno razvile tokom poslednje decenije, pokazala se kao precizniji i pouzdaniji metod od kriterijuma biološke prirode koji su se dugo upotrebljavali pri detekciji i identifikaciji fitoplazmi. Najčešće upotrebljavan visokokonzervativan gen za 16S rRNK se pokazao kao odličan molekularni marker za klasifikaciju fitoplazmi na nivou 16Sr grupa (Lee i sar., 2000). MeĎutim, zbog njegove visoke konzervativnosti sekvenci, kao i ne tako retke pojave razlika meĎu 16S rDNK operonima u okviru jedinke, ovaj gen nije toliko informativan marker pri identifikaciji i diferencijaciji srodnih sojeva ili sojeva koji imaju različita biološka i ekološka svojstva. Da bi se omogućio brţi i bolji razvoj mera kontrole bolesti, neophodno je znati odnos izmeĎu raznih sojeva fitoplazmi i njihovih jedinstvenih ekoloških niša. Često ove sojeve nije moguće razlikovati analizom sekvenci 16S rDNK, pa se javlja potreba za razvojem dodatnih molekularnih markera za finiju diferencijaciju srodnih sojeva fitoplazmi. Iz ovih razloga, pri identifikaciji i klasifikaciji sojeva fitoplazmi neophodno je uključiti dodatne jedinstvene biološke karakteristike (vrsta vektora i biljke domaćina) kao i dodatne molekularne markere (Lee i sar., 2010). Do danas su kao dodatni molekularni markeri upotrebljavani manje ili više konzervativni geni kao što je gen faktora elongacije (tuf gen), gen koji pripada opštem sistemu za sekreciju proteina (secY gen) i geni ribozomalnih proteina (rplB, rpsS, rplV, rpsC i rplP) (Schneider i sar., 1997; Marcone i sar., 2000; Langer i Maixner, 2004; Lee i sar., 2004a, 2004b; Martini i sar., 2007; Lee i sar., 2010). Gen koji kodira veliku subjedinicu šaperonina, groEL gen, spada u grupu sveprisutnih i konzervativnih gena koji je od strane mnogih autora upotrebljavan kao Mitrović DISKUSIJA 115 molekularni marker za identifikaciju i bolju tipizaciju vrsta (Goh i sar., 1996; Satheesh i sar., 2002; Woo i sar., 2002; Karenlampi i sar., 2004). TakoĎe je proučavan i kod šest vrsta mikoplazmi, pri čemu je utvrĎeno da postoji visoka homologija sekvenci ovog gena meĎu proučavanim vrstama (Scherm i sar., 2002). U ovoj doktorskoj tezi je, uz upotrebu prajmera P1/P7, kod svih testiranih sojeva AY fitoplazmi iz kolekcije i iz Srbije uspešno umnoţen 16S rRNK gen čime je potvrĎeno postojanje ciljne DNK, DNK fitoplazmi. Na sve testirane sojeve je potom primenjena nested PCR reakcija uz upotrebu prajmera R16F2n/R16R2, a na dobijene amplikone je primenjena RFLP metoda upotrebom restrikcionih enzima HhaI, Tru1I, RsaI i Tsp509I. Na ovaj način su svi testirani sojevi klasifikovani kao pripadnici AY fitoplazmi (16SrI ribozomalna grupa), podgrupa 16SrI-A, I-B, I-C, I-F ili I-P. Upotrebom novodizajniranih prajmera AYgroelF/R kod svih testiranih sojeva AY fitoplazmi je uspešno umnoţen skoro ceo groEL gen (duţina dobijenog fragmenta iznosi oko 1.4 kb), dok kod sojeva koji pripadaju drugim ribozomalnim grupama nije došlo do umnoţavanja ovog fragmenta. Na ovaj način je potvrĎena specifičnost novodizajniranih prajmera. Dobijeni fragmenti su podvrgnuti RFLP analizi pomoću restrikcionih enzima TaqI, Tru1I i AluI što je rezultiralo dobijanjem šest (Tru1I), odnosno osam (AluI) različitih restrikcionih profila. Na osnovu dobijenih profila svi sojevi AY fitoplazmi su na osnovu groEL gena klasifikovani u devet groELI podgrupa (I-IX), dok su na osnovu 16S rDNK klasifikovani u pet 16SrI podgrupa. Od osam sojeva AY fitoplazmi izolovanih iz biljaka topole i vinke poreklom iz Srbije, a na osnovu PCR-RFLP metode 16S rDNK, četiri su identifikovana kao pripadnici podgrupe 16SrI-B (84/11, 87/11, 90/11 i 91/11-svi su poreklom sa vinke), dva kao pripadnici podgrupe 16SrI-C (79/10 i 205/10-takoĎe poreklom sa vinke) i dva kao pripadnici podgrupe 16SrI-P (PopD i 92/10-oba poreklom sa topole). Analizom groEL gena je utvrĎeno da četiri soja iz podgrupe I-B pripadaju podgrupi groELI-III kao i većina referentnih sojeva iz ove 16SrI podgrupe, a dva soja iz podgrupe I-C pripadaju podgrupi groELI-VII kao i referentni sojevi KVF i PPT koji su oba poreklom iz Francuske. Preostala dva soja poreklom sa topole iz Srbije koji su pripadnici podgrupe I-P su analizom groEL gena klasifikovani kao pripadnici podgrupe groELI- IX, pri čemu su ova dva soja jedini pripadnici ove groELI podgrupe. Mitrović DISKUSIJA 116 S obzirom na to da se soj ca2006/5 (I-B) iz Srbije nalazi u okviru podgrupe groELI-IV zajedno sa sojem AY-J (takoĎe I-B) koji je poreklom iz Francuske, pri čemu su ova dva soja jedini pripadnici ove groELI podgrupe, kao i da sojevi 79/10 i 205/10 (I-C, iz Srbije) pripadaju podgrupi groELI-VII zajedno sa sojevima KVF i PPT (I-C, iz Francuske), nameće se pitanje meĎusobnog odnosa sojeva iz Srbije i Francuske (filogenetskih, bioloških, epidemioloških karakteristika i dr.). Odgovor na ovo pitanje moţe biti dat u nekim budućim istraţivanjima pri analizi većeg broja sojeva iz ove dve zemlje, kao i analizom AY fitoplazmi u vektorima. Upotrebom f/rTufAy, rpL2F3/rp(I)R1A i AYsecYF1/R1 prajmera, koji se koriste za umnoţavanje tuf, dela rp operona i secY gena, kod svih testiranih sojeva AY fitoplazmi došlo je do umnoţavanja fragmenata očekivanih veličina. Primenom MboI, Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima na f/rTufAy amplikone, HhaI, AluI i Tsp509I restrikcionih enzima na rpL2F3/rp(I)R1A amplikone, odnosno Tsp509I i Tru1I restrikcionih enzima na AYsecYF1/R1 amplikone, testirani sojevi AY fitoplazmi su klasifikovani u šest tufI i po sedam rpI i secYI podgrupa. PoreĎenjem dobijenih rezultata groEL, tuf, rp i secY gena na osnovu PCR-RFLP metode primenjene na sojeve AY fitoplazmi koji pripadaju podgrupama 16SrI-A, I-B, I- C, I-F i I-P, uočava se da je došlo do dalje diferencijacije podgrupe I-A u odnosu na sva četiri proučavana gena, kao i podgrupe I-B u odnosu na groEL, rp i secY gen. Naime, sojevi GD i MBSColombia su pokazali jasno odvajanje od ostalih pripadnika podgrupe I-A odnosno I-B, kao što su i sojevi AY-J i ca2006/5 pokazali meĎusobnu sličnost i povezanost sa sojem MBSColombia, a različitost od ostalih pripadnika podgrupe I-B. Pripadnici podgrupa I-L i I-M sa druge strane nisu pokazali nikakvu razliku u odnosu na pripadnike podgrupe I-B u odnosu na sva četiri proučavana gena. Proučavanjem groEL gena došlo je i do izdvajanja još jednog dela pripadnika podgrupe I-B, čime je ona diferencirana na tri nove groELI podgrupe, a takoĎe je došlo i do diferencijacije u okviru podgrupe I-C na dve groELI podgrupe, što nije bio slučaj pri proučavanju ostalih gena. Na ovaj način je na osnovu PCR-RFLP metode pokazano da je groEL gen informativniji u odnosu na 16S rRNK, tuf, rp i secY gen. Podgrupa 16SrI-P je prvi put opisana od strane Šeruge i sar. (2003) kada je i utvrĎeno da se ova podgrupa nalazi na biljkama topole a postavljena je hipoteza da je Mitrović DISKUSIJA 117 ova podgrupa ili vezana za biljku domaćina ili za oblast Hrvatske u kojoj je i detektovana. Pronalaskom podgrupe I-P na dve biljke topole u Srbiji potvrĎeno je da se ova podgrupa javlja na topoli. Na osnovu analize javno dostupnih sekvenci 16S rDNK sojeva AY fitoplazmi iz različitih podgrupa i podgrupe I-P i na osnovu generisanih virtuelnih RFLP profila, utvrĎeno je da je upotrebom Tsp509I restrikcionog enzima na R16F2n/R16R2 amplikon moguće razlikovati pripadnike podgrupe I-P od ostalih podgrupa i na ovaj način ih identifikovati. Ovaj podatak je u skladu sa restrikcionom mapom koju su dali Šeruga i sar. (2003) na kojoj se vidi da podgrupa I-P ima jedno Tsp509I restrikciono mesto više u odnosu na ostale podgrupe. Pored 16S rDNK, isti autori su analizirali rp gen, pri čemu je članovima podgrupe 16SrI-P dodeljena podgrupa rpI-O, i tuf gen pri čemu nije odreĎena tufI podgrupa. U ovoj doktorskoj tezi su pored tri gore pomenuta gena analizirani i secY i groEL geni podgrupe 16SrI-P a u odnosu na članove podgrupa I-A, I-B, I-C i po prvi put I-F. Članovima podgrupe 16SrI- P su pri tome dodeljene tufI-O i secYI-O podgrupe sledeći literaturne podatke o dodeli podgrupe i groELI-IX podgrupa. TakoĎe su sekvencirani amplikoni svih pet analiziranih gena soja PopD (16SrI-P) koji je poreklom iz Srbije, a sekvence su deponovane u NCBI Banku gena. Ove sekvence predstavljaju prve javno dostupne sekvence secY i groEL gena pripadnika podgrupe 16SrI-P. Upotrebom P1/P7 i R16F2n/R16R2 prajmera u direktnoj ili nested PCR reakciji i primenom Tru1I restrikcionog enzima na dobijene R16F2n/R16R2 amplikone, u Srbiji je u periodu od 2009. do 2011. godine detektovano i identifikovano 116 sojeva Stolbur fitoplazmi poreklom sa devet biljnih vrsta. Svi sojevi su imali identične RFLP profile osim soja 284/09 poreklom sa duvana koji je pokazao manja odstupanja kada je digeriran sa Tru1I restrikcionim enzimom. Na osnovu sekvence 16S rDNK ovog soja potvrĎeno je postojanje dodatnog Tru1I restrikcionog mesta. TakoĎe na osnovu sekvence 16S rDNK soja 99/10 poreklom sa ljute papričice je detektovano postojanje razlika izmeĎu dva 16S rDNK operona kod ovog soja, pri čemu jedan operon poseduje dodatno MboII restrikciono mesto, a drugi ne. Ovaj podatak je potvrĎen primenom RFLP metode pomoću MboII restrikcionog enzima na R16F2n/R16R2 amplikon pri čemu je došlo do pojave mešanih profila oba operona. Postojanje razlika u okviru R16F2n/R16R2 regiona koji obuhvata 1.2 kb 16S rDNK, a koje se nalaze u okviru nekog od restrikcionih mesta, kod sojeva 99/10 i 284/09 u odnosu na sve druge Stolbur Mitrović DISKUSIJA 118 sojeve, je vaţno iz razloga što su sve grupe i skoro sve podgrupe fitoplazmi klasifikovane na osnovu postojanja razlika u ovom regionu koje rezultuju promenom RFLP profila. Sam sistem klasifikacije na osnovu RFLP profila je postavljen jer se smatra da su restrikciona mesta veoma konzervativna. Kod 103 soja od svih 116 testiranih a prethodno detektovanih i identifikovanih sojeva Stolbur fitoplazmi, uspešno je umnoţen tuf gen upotrebom f/rTufAy prajmera. Nakon primene HpaII restrikcionog enzima svi sojevi su identifikovani kao pripadnici tuf type II podgrupe. Primenom novodizajniranih STOLgroesF/STOLstampR prajmera na 39 odabranih sojeva Stolbur fitoplazmi iz Srbije, kao i na dva soja Stolbur fitoplazmi iz Hrvatske koji pripadaju tuf type I podgrupi, uspešno je umnoţen groEL gen kod svih testiranih sojeva osim jednog koji je takoĎe uspešno umnoţen u nested reakciji primenom AYgroelF/STOLgroelR2 prajmera. Analizom groEL gena kod Stolbur fitoplazmi pomoću novodizajniranih specifičnih prajmera, a upotrebom PCR-RFLP metode, utvrĎeno je postojanje dve grupe Stolbur fitoplazmi koje se na nivou 16S rDNK ne mogu identifikovati. Analizom sekvenci groE operona utvrĎeno je postojanje pet genotipova Stolbur fitoplazmi kao i postojanje razlika na nivou groEL gena izmeĎu sojeva Stolbur fitoplazmi koji pripadaju različitim podgrupama na nivou tuf gena, pri čemu ove razlike takoĎe nije moguće detektovati na nivou 16S rDNK. Ovom metodom je pokazano da je gen za veliku subjedinicu šaperonina kod Stolbur fitoplazmi takoĎe informativniji, kao i kod AY fitoplazmi, kako u odnosu na 16S rDNK tako i u odnosu na tuf gen. Kako se u nekim biljnim vrstama mogu naći i Stolbur i AY fitoplazme u odvojenim infekcijama, pri čemu razlika u tipovima simptoma koje ove dve grupe fitoplazmi izazivaju kod istih domaćina nije jasno uočljiva, upotreba multipleks PCR reakcija za umnoţavanje groEL gena kod ovih grupa fitoplazmi igra značajnu ulogu u njihovoj identifikaciji. U samo jednom koraku PCR reakcije moguće je detektovati ili AY ili Stolbur fitoplazme, pa čak i obe ako se naĎu u mešanoj infekciji. Na ovaj način se proces identifikacije ovih grupa fitoplazmi značajno ubrzava, pri čemu su i troškovi analize smanjeni. S obzirom na to da su AY i Stolbur fitoplazme srodne grupe fitoplazmi, svi do sada u literaturi opisani specifični prajmeri za umnoţavanje 16S Mitrović DISKUSIJA 119 rDNK, tuf, rp ili secY gena su manje ili više umnoţavali ove gene kod obe grupe fitoplazmi. U ovoj doktorskoj tezi su prvi put dizajnirani prajmeri koji specifično umnoţavaju samo jednu od ove dve grupe fitoplazmi, pa je samim tim i omogućena upotreba multipleks PCR reakcije pri njihovoj identifikaciji. Kako su prajmeri dizajnirani da se upotrebljavaju i u drugoj (nested) reakciji, moguće ih je upotrebljavati ne samo pri identifikaciji već i pri detekciji fitoplazmi. Na osnovu podataka iz literature i poreĎenjem sa dobijenim bioinformatičkim podacima kod AY i Stolbur fitoplazmi, uočava se da postoje razlike u aminokiselinskom sastavu kod obe grupe fitoplazmi u odnosu na mesta u GroEL proteinu kod E. coli koja su po literaturnim podacima vaţna za obavljanje funkcije savijanja proteina. Naime aminokiseline R 452 , E 461 , S 463 i V 464 su po literaturnim podacima odgovorne za meĎusobno vezivanje prstenova kod E. coli (Ranson i sar., 1998). Kod AY fitoplazmi se na ovim mestima nalaze Y 452 , S 461(459) , D 463(462) i V 464(463) , a kod Stolbur fitoplazmi Y 452 , D 461(459) , H 463(462) i I 464(463) . Pitanje značaja promenjene AK na mestu 452, praktično zamene AK na mestima 461 (kod fitoplazmi je to mesto 459) i 463 (odnosno 462) kod AY fitoplazmi, odnosno promene AK na ovim mestima kod Stolbur fitoplazmi, ostaje otvoreno. Na osnovu karaktera bočnih lanaca AK moţe se spekulisati da kod AY fitoplazmi moţda funkcija nije promenjena jer se kod E. coli na mestima 461 i 463 nalaze jedna neutralno polarna i jedna negativno naelektrisana (kisela) AK, što je i slučaj kod AY fitoplazmi. Odgovor na pitanje značaja zamene ovih aminokiselina, postojanja jedne AK više u ovom regionu i mogućnosti da se kod fitoplazmi tokom evolucije razvio nešto drugačiji način meĎusobnog vezivanja prstenova, najverovatnije će biti dat onda kada bude moguće ispitati funkcionisanje celog GroE sistema nakon njegove izolacije iz fitoplazmi, što je za sada praktično nemoguće zbog odrţavanja fitoplazmi isključivo unutar biljke domaćina. O značaju hidrolize ATP-a pri procesu savijanja proteina i očuvanju asparaginske kiseline na mestu 398 govori i činjenica da je kod AY i Stolbur fitoplazmi, kao i kod ‟Ca. P. mali‟, ‟Ca. P. australiense‟, A. laidlawii, kod četiri vrste mikoplazmi kod kojih je dokazano da imaju groE operon i kod B. subtilis ova aminokiselina nepromenjena. Po literaturnim podacima Arg 197 iz apikalnog domena i Glu 386 iz intermedijernog domena zajedno stvaraju soni most u krajnjoj konformaciji velike subjedinice šaperonina, koji je odgovoran za vezivanje ATP-a za oba prstena (Ranson i sar., 1998). Kod AY i Stolbur Mitrović DISKUSIJA 120 fitoplazmi se na ovim mestima nalaze lizin (K) i asparaginska kiselina (D), meĎutim ove aminokiseline imaju bočne lance istog karaktera kao i arginin (R) i glutaminska kiselina (E) koje su zamenile, odnosno i one su bazne/kisele. S obzirom na to da po literaturnim podacima soni most grade jedna bazna (npr. arginin) i jedna kisela (npr. glutaminska kiselina) aminokiselina (Kumar i Nussinov, 2002), kod AY i Stolbur fitoplazmi je u ovom smislu situacija nepromenjena. Zbog toga je moguće izvesti zaključak da, iako se na mestima 197 i 386 kod AY i Stolbur fitoplazmi ne nalaze očekivane aminokiseline, funkcija stvaranja sonog mosta izmeĎu ove dve AK ostaje nepromenjena. Uporednom analizom sekvenci 16S rDNK i groEL gena utvrĎeno je da srednja vrednost procenta sličnosti za 16S rDNK iznosi 99.5% a kreće se od 98.7 do 99.6% izmeĎu podgrupa, odnosno izmeĎu 99.1 i 100% unutar podgrupa. Najmanja vrednost procenta sličnosti je uočena izmeĎu podgrupe 16SrI-P i ostalih podgrupa. Sa druge strane, srednja vrednost procenta sličnosti nukleotidnih sekvenci groEL gena posmatranih sojeva AY fitoplazmi iznosi 98.1% a kreće se od 93.7 do 97.8% izmeĎu podgrupa, odnosno od 98 do 100% unutar njih. I u odnosu na groEL gen najmanja sličnost se uočava izmeĎu podgrupe 16SrI-P i ostalih podgrupa. Kada se sekvenca groEL gena prevede u aminokiselinsku sekvencu, uočava se da srednja vrednost procenta sličnosti tada iznosi 97.8% krećući se od 94.6 do 97.9% izmeĎu podgrupa, odnosno od 97.7 do 100% unutar njih. Ovaj opseg se za soj PopD (16SrI-P) kreće od 94.6 do 96.2% sličnosti aminokiselinskih sekvenci prevedenog groEL gena. Posmatrajući procenat sličnosti sekvenci unutar podgrupa utvrĎeno je da se soj GD kao pripadnik podgrupe 16SrI-A najviše razlikuje od ostalih članova ove podgrupe nego bilo koji drugi soj unutar bilo koje druge podgrupe i na nivou 16S rDNK i na nivou groEL gena. Njegov procenat sličnosti sekvenci 16S rDNK se kreće od 99.1 do 99.5%, a groEL gena od 98 do 98.1% dok se u okviru drugih podgrupa unutargrupna sličnost kreće od 99.4 do 100% za 16S rDNK, odnosno od 99.7 do 100% za groEL gen. Na osnovu ovih rezultata se vidi da groEL gen poseduje manju meĎugrupnu sličnost sekvenci nego 16S rDNK i stoga ima veću moć razdvajanja srodnih sojeva što je i potvrĎeno filogenetskom analizom. Mitrović DISKUSIJA 121 Analizom sekvenci tuf, rp i secY gena jednog broja testiranih sojeva utvrĎeno je da srednja vrednost procenta meĎusobne identičnosti sojeva AY fitoplazmi za tuf gen iznosi 97.2% a kreće se od 93 do 97.9% izmeĎu podgrupa, za rp gen iznosi 97.4% pri čemu je opseg od 93.2 do 98.3% izmeĎu podgrupa, a za secY gen iznosi 94.8% a kreće se od 84 do 97.2% izmeĎu podgrupa. Najniţu vrednost procenta sličnosti sekvenci ima soj PopD sa nekim od sojeva iz podgrupe 16SrI-A ili sojem ca2006/5 iz podgrupe 16SrI-B, u odnosu na sva tri posmatrana gena. Filogenetska analiza izvedena na osnovu nukleotidnih sekvenci groEL gena AY fitoplazmi je pokazala odvajanje istih linija kao i ona izvedena na osnovu aminokiselinske sekvence ovog gena, sa tom razlikom da su se unutar podgrupe 16SrI- C odvojile dve linije na nivou nukleotidnih sekvenci, što nije bio slučaj na nivou aminokiselinskih sekvenci. To je iz razloga što sojevi unutar podgrupe I-C imaju jednu nukleotidnu razliku koja ne rezultuje u promeni prevedene aminokiseline. Filogenetska stabla rekonstruisana na osnovu sekvenci groEL gena, 16S rRNK gena i zdruţenih sekvenci tuf, dela rp operona i secY gena su imala u osnovi istu topologiju. MeĎutim, u filogenetskom stablu rekonstruisanom na osnovu nukleotidnih sekvenci groEL gena došlo je do dalje podele podgrupa 16SrI-A, I-B i I-C. Naime, soj GD (16SrI-A) se nalazi u zasebnoj liniji odvojenoj od ostalih članova podgrupe I-A, a soj MBSColombia (16SrI-B) se nalazi u klasteru zajedno sa sojevima AY-J i ca2006/5 (takoĎe I-B) unutar podgrupe I-B. Sa druge strane sojevi iz podgrupa 16SrI-M i I-L se nalaze zajedno sa ostalim sojevima podgrupe I-B. Unutar podgrupe 16SrI-C sojevi CA i LEO grupisani su zajedno u odnosu na sojeve KVF i PPT. Soj AY-A (16SrI-F) se nalazi u zasebnoj liniji što je u skladu sa 16S rDNK, dok je soj PopD (16SrI-P) izdvojen u posebnu liniju odvojenu od svih ostalih sojeva. Filogenetsko stablo rekonstruisano na osnovu zdruţenih sekvenci tuf, rp i secY gena ima identičnu topologiju kao i stablo rekonstruisano na osnovu groEL gena. Na ovom filogenetskom stablu se uočava jasno odvajanje šest linija sa visokim vrednostima butstrapa. I ovde se sojevi koji pripadaju podgrupama 16SrI-B, I-M i I-L nalaze u jednom klasteru u okviru koga se odvaja još jedan klaster koga čine sojevi MBSColombia i ca2006/5, dok se pripadnici podgrupa I- A (osim soja GD) i I-C nalaze u zasebnim klasterima. Ono što se uočava na ovom rekonstruisanom filogenetskom stablu je da se i ovde soj GD jasno odvojio u zasebnu liniju u odnosu na ostale članove podgrupe I-A, kao i da se sojevi iz podgrupa I-A, I-F i Mitrović DISKUSIJA 122 I-C nalaze grupisani zajedno, u odnosu na sojeve podgrupe I-B. I ovde se, kao i kod filogenetskog stabla rekonstruisanog na osnovu nukleotidnih sekvenci groEL gena, soj PopD (16SrI-P) nalazi u zasebnoj liniji odvojenoj od svih ostalih sojeva AY fitoplazmi koji se nalaze grupisani zajedno. Devet linija izdvojenih filogenetskom analizom sekvenci groEL gena su u skladu sa podelom sojeva na groELI podgrupe na osnovu njihovih RFLP profila. Na ovaj način je potvrĎena dalja diferencijacija sojeva AY fitoplazmi izvedena upotrebom PCR-RFLP metode na umnoţene amplikone veličine 1397 bp. I filogenetskom analizom i na osnovu RFLP profila groEL gena utvrĎeno je da se soj GD razlikuje od ostalih članova podgrupe 16SrI-A što je i potvrĎeno istim ovim analizama tuf, rp i secY gena. Ovi rezultati pokazuju da je upotreba groEL gena i njegova analiza PCR-RFLP metodom pouzdana metoda kako za detekciju, tako i za identifikaciju sojeva AY fitoplazmi i to ne samo onih iz kolekcije, već i iz uzoraka uzetih iz prirode. Mitrović ZAKLJUĈCI 123 6. ZAKLJUĈCI  Za brţi i bolji razvoj mera kontrole bolesti neophodno je znati odnos izmeĎu raznih sojeva fitoplazmi i njihovih jedinstvenih ekoloških niša i stoga je pri identifikaciji i klasifikaciji sojeva fitoplazmi neophodno uključiti dodatne jedinstvene biološke karakteristike i to vrste vektora i biljke domaćina, kao i dodatne molekularne markere, s obzirom na to da ove sojeve često nije moguće razlikovati analizom sekvenci 16S rDNK.  Dizajniranjem sedam specifičnih prajmera i njihovom primenom kod Aster yellows i Stolbur fitoplazmi, omogućeno je uspešno umnoţavanje groEL gena kod ovih grupa fitoplazmi, kako upotrebom direktne tako i nested PCR reakcije.  Primenom RFLP metode pomoću Tru1I i AluI restrikcionih enzima na dobijene amplikone groEL gena moguće je razlikovati srodne sojeve fitoplazmi, što nije moguće na nivou 16S rDNK. Svi testirani sojevi AY fitoplazmi se na osnovu groEL gena klasifikuju u devet groELI podgrupa u poreĎenju sa klasifikacijom na osnovu 16S rDNK gde su isti sojevi klasifikovani u pet 16SrI podgrupa.  Analizom tuf, rp i secY gena testirani sojevi AY fitoplazmi su klasifikovani u šest tufI i po sedam rpI i secYI podgrupa pri čemu su analiziranim sojevima podgrupe 16SrI-P (dva soja sa topole poreklom iz Srbije) dodeljene podgrupe tufI-O i secYI-O.  U Srbiji su detektovani novi sojevi AY fitoplazmi koji pripadaju podgrupama 16SrI-B, I-C i I-P. Analizom groEL gena ovih sojeva utvrĎeno je da pripadaju podgrupama groELI-III, I-VII i I-IX.  Analizom groEL gena sojeva Stolbur fitoplazmi detektovanih u Srbiji pokazano je da je gen za veliku subjedinicu šaperonina kod Stolbur fitoplazmi takoĎe informativniji, kao i kod AY fitoplazmi, kako u odnosu na 16S rDNK tako i u odnosu na tuf gen i utvrĎeno je postojanje pet genotipova na nivou ovog gena.  U aminokiselinskom sastavu GroEL proteina kod AY i Stolbur fitoplazmi postoje razlike u odnosu na mesta u GroEL proteinu kod E. coli koja su po literaturnim podacima vaţna za obavljanje funkcije savijanja proteina. Mitrović ZAKLJUĈCI 124  Upotrebom multipleks PCR reakcije za umnoţavanje groEL gena kod AY i Stolbur fitoplazmi moguće je u samo jednom koraku detektovati AY ili Stolbur fitoplazme, čak i obe ako se naĎu u mešanoj infekciji. Kako su prajmeri dizajnirani da se upotrebljavaju i u drugoj (nested) reakciji, moguće je primeniti multipleks PCR metodu ne samo pri identifikaciji već i pri detekciji fitoplazmi.  Filogenetska stabla rekonstruisana na osnovu sekvenci groEL gena, 16S rRNK gena i zdruţenih sekvenci tuf, dela rp operona i secY gena imaju u osnovi istu topologiju, a devet linija izdvojenih filogenetskom analizom sekvenci groEL gena su u skladu sa podelom sojeva na groELI podgrupe na osnovu njihovih RFLP profila.  groEL gen poseduje manju meĎugrupnu sličnost sekvenci nego 16S rDNK i stoga ima veću moć razdvajanja srodnih sojeva što je i potvrĎeno filogenetskom analizom.  Upotreba groEL gena i njegova analiza PCR-RFLP metodom je pouzdana metoda kako za detekciju tako i za identifikaciju sojeva i AY i Stolbur fitoplazmi, i to ne samo onih iz kolekcije već i iz uzoraka uzetih iz prirode. Mitrović LITERATURA 125 7. LITERATURA 1. Aleksić, Ţ., Šutić, D., i Aleksić, D. (1967): Ispitivanje intenziteta prenošenja stolbur virusa cikadom Hyalesthes obsoletus Sign. na neke biljke domaćine. Zaštita bilja, 93-95: 67-73. 2. Anfinsen, C. B. (1973): Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181 (4096): 223–230. 3. Aoki, S., Uehara, K., Imafuku, M., Hasebe, M., and Ito, M. J. (2004): Phylogeny and divergence of basal angiosperms inferred from APETALA3- and PISTILLATA-like MADSbox genes. Plant Research, 117: 229-244. 4. Arnaud, G., Malembic-Maher, S., Salar, P., Bonnet, P., Maixner, M., Marcone, C., Boudon-Padieu, E., and Foissac, X. (2007): Multilocus sequence typing confirms the close genetic interrelatedness of three distinct Flavescence dorée phytoplasma strain clusters and group 16SrV phytoplasmas infecting grapevine and alder in Europe. Applied and Environmental Microbiology, 73 (12): 4001-4010. 5. Atanasoff, D. (1973): Stammhexenbessen bei Ulmen und anderen Baümen. Archiv für Phytopathologie und Pflanzenschutz, 9: 241–243. 6. Bai, X., Zhang, J., Ewing, A., Miller, S. A., Jancso Radek, A., Shevchenko, D. V., Tsukerman, K., Walunas, T., Lapidus, A., Campbell, J. W., and Hogenhout, S. A. (2006): Living with genome instability: the adaptation of phytoplasmas to diverse environments of their insect and plant hosts. Journal of Bacteriology, 188 (10): 3682-3696. 7. Beanland, L., Hoy, C. W., Miller, S. A., and Nault, L. R. (1999): Leafhopper (Homoptera: Cicadellidae) transmission of Aster Yellows phytoplasma: Does gender matter? Environmental Entomology, 28: 1101-1106. 8. Beanland, L., Hoy, C. V., Miller, S. A., and Nault, L. R. (2000): Influence of aster yellows phytoplasma on the fitness of aster leafhopper (Homoptera: Cicadellidae). Annals of the Entomological Society of America, 93 (2): 271–276. 9. Berges, R., Cousin, M.-T., Roux, J., Mäurer, R., Seemüller, E. (1997): Detection of phytoplasma infections in declining Populus nigra „Italica‟ trees and molecular differentiation of the aster yellows phytoplasmas identified in various Populus species. European Journal of Forest Pathology, 27 (1): 33–43. 10. Bertaccini, A., Davis, R. E., and Lee, I.-M. (1990): Distinctions among mycoplasmalike organisms (MLOs) in Gladiolus, Ranunculus, Brassica, and Hydrangea through detection with nonradioactive cloned DNA probes. Phytopathologia Mediterranea, 29: 107-113. 11. Bertaccini, A., Arzone, A., Alma, A., Bosco, D., and Vibio, M. (1993): Detection of mycoplasmalike organisms in Scaphoideus titanus Ball reared on flavescence dorée infected grapevine by dot hybridizations using DNA probes. Phytopathologia Mediterranea, 32: 20-24. Mitrović LITERATURA 126 12. Bertaccini, A. and Martini, M. (1999): Ribosomal and nonribosomal primers for sensitive detection and identification of phytoplasmas. Petria, 9: 89-92. 13. Bertaccini, A., Carraro, L., Davies, D., Laimer da Câmara Machado, M., Martini, M., Paltrinieri, S., and Seemüller, E. (2000): Micropropagation of a collection of phytoplasma strains in periwinkle and other host plants. Congress of IOM, ACROS, Fukuoka, Japan, p. 101. 14. Bertaccini, A. (2007): Phytoplasmas: diversity, taxonomy, and epidemiology. Frontiers in Bioscience, 12: 673-689. 15. Bertaccini, A. (2010): http://www.ipwgnet.org/index.php?option=com_content&view= article&id=29&Itemid=5 16. Bertin, S., Palermo, S., Marzachì, C., and Bosco, D. (2004): A comparison of molecular diagnostic procedures for the detection of aster yellows phytoplasmas (16Sr-I) in leafhopper vectors. Phytoparasitica, 32: 141-145. 17. Blattner, F. R., Plunkett III, G., Bloch, C. A., Perna, N. T., Burland, V., Riley, M., Collado-Vides, J., Glasner, J. D., Rode, C. K., Mayhew, G. F., Gregor, J., Davis, N. W., Kirkpatrick, H. A., Goeden, M. A., Rose, D. J., Mau, B., and Shao, Y. (1997): The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science, 277 (5331): 1453-62. 18. Bosco, D., Minucci, C., Boccardo, G., and Conti, M. (1997): Differential acquisition of chrysanthemum yellows phytoplasma by three leafhopper species. Entomologia Experimentalis et Applicata, 83: 219-224. 19. Braun, E. J. and Sinclair, W. A. (1979): Phloem necrosis of elms: symptoms and histopathological observations in tolerant hosts. Phytopathology, 69: 354-358. 20. Brcák, J. (1979): Leafhopper and planthopper vectors of plant disease agents in central and southern Europe. In: Leafhoppers and Plant Disease Agents. Eds: K. Maramorosch and K. F. Harris. Academic Press, New York, pp. 97-155. 21. Bressan, A., Girolami, V., and Boudon-Padieu, E. (2005): Reduced fitness of the leafhopper vector Scaphoideus titanus exposed to Flavescence dorée phytoplasma. Entomologia Experimentalis et Applicata, 115: 83-290. 22. Brousseau, R., Hill, J. E., Préfontaine, G., Goh, S.-H., Harel, J., and Hemmingsen, S. M. (2001): Streptococcus suis Serotypes Characterized by Analysis of Chaperonin 60 Gene Sequences. Applied and Environmental Microbiology, 67 (10): 4828-4833. 23. Brown, D. R. (2012): Phylum XVI. Tenericutes Murray 1984a. In Bergey‟s Manual of Systematic Bacteriology (2 nd ed., volume 4: The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes (Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres, Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Verrucomicrobia, Chlamydiae, and Planctomycetes). Eds.: N. R. Krieg, J. T. Staley, D. R. Brown, B. P. Hedlund, B. J. Paster, N. L. Ward, W. Ludwig and W. B. Whitman. New York: Springer, pp. 567. Mitrović LITERATURA 127 24. Brown, D. R., May, M., Bradbury, J. M., and Johansen, K.-E. (2012): Class I. Mollicutes Edward and Freundt 1967, 267 AL. In Bergey‟s Manual of Systematic Bacteriology (2 nd ed., volume 4: The Bacteroidetes, Spirochaetes, Tenericutes (Mollicutes), Acidobacteria, Fibrobacteres, Fusobacteria, Dictyoglomi, Gemmatimonadetes, Lentisphaerae, Verrucomicrobia, Chlamydiae, and Planctomycetes). Eds.: N. R. Krieg, J. T. Staley, D. R. Brown, B. P. Hedlund, B. J. Paster, N. L. Ward, W. Ludwig and W. B. Whitman. New York: Springer, pp. 568-573. 25. Carle, P., Saillard, C., Carrere, N., Carrere, S., Duret, S., Eveillard, S., Gaurivaud, P., Gourgues, G., Gouzy, J., Salar, P., Verdin, E., Breton, M., Blanchard, A., Laigret, F., Bove, J. M., Renaudin, J., and Foissac, X. (2010): Partial chromosome sequence of Spiroplasma citri reveals extensive viral invasion and important gene decay. Applied and Environmental Microbiology, 76 (11): 3420-3426. 26. Carraro, L., Loi, N., and Ermacora, P. (2001): Transmission characteristics of the European stone fruit yellows phytoplasma and its vector Cacopsylla pruni. European Journal of Plant Pathology, 107: 695-700. 27. Carraro, L., Ferrini, F., Martini, M., Ermacora, P., and Loi, N. (2008): A serious epidemic of stolbur on celery. Journal of Plant Pathology, 90 (1): 131-135. 28. Chen, K., Guo, J. R., Wu, X., Loi, N., Carraro, L., Guo, Y. H. , Chen, Y. D., Osler, R., Pearson, R., and Chen, T. A. (1993): Comparison of monoclonal antibodies, DNA probes, and PCR for detection of the grapevine yellows disease agent. Phytopathology, 83: 915-22. 29. Chen, K. H., Redi, R. C., Loi, N., Maixner, M., and Chen, T. A. (1994): Identification and grouping of mycoplasmalike organisms associated with grapevine yellows and clover phyllody diseases based on immunological and molecular analyses. Applied and Environmental Microbiology, 60: 1905-1913. 30. Choi, Y. H., Tapias, E. C., Kim, H. K., Lefeber, A. W. M., Erkelens, C., Verhoeven, J. T. J., Brzin, J., Zel, J., and Verpoorte, R. (2004): Metabolic discrimination of Catharanthus roseus leaves infected by phytoplasma using 1H- NMR spectroscopy and multivariate data analysis. Plant Physiology, 135: 2398- 2410. 31. Christensen, N. M., Axelsen, K. B., Nicolaisen, M., and Schulz, A. (2005): Phytoplasmas and their interactions with hosts. TRENDS in Plant Science, 10 (11): 526-535. 32. Chuang, J. G. and Lin, C. P. (2000): Cloning of gyrB and gyrA genes of phytoplasma associated with peanut witches‟ broom. Plant Pathology Bulletin, 9 (4): 157-166. 33. Clair, D., Larrue, J., Aubert, G., Gillet, J., Cloquemin, G., and Boudon-Padieu, E. (2003): A multiplex nested-PCR assay for sensitive and simultaneous detection and direct identification of phytoplasma in the Elm yellows group and Stolbur group and its use in survey of grapevine yellows in France. Vitis, 42 (3): 151–157. 34. Clark, G. W. and Tillier, E. R. M. (2010): Loss and gain of GroEL in the Mollicutes. Biochemistry and Cell Biology, 88 (2): 185–194. Mitrović LITERATURA 128 35. Cole, J. R., Wang, Q., Cardenas, E., Fish, J., Chai, B., Farris, R. J., Kulam-Syed- Mohideen, A. S., McGarrell, D. M., Marsh, T., Garrity, G. M., and Tiedje, J. M. (2009): The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic Acids Research, 37: (Database issue): D141-D145. 36. Cordova, I., Jones, P., Harrison, N. A., and Oropeza, C. (2003) In situ PCR detection of phytoplasma DNA in embryos from coconut palms with lethal yellowing disease. Molecular Plant Pathology, 4 (2): 99–108. 37. Cousin, M.-T., Roux, J., Maurer, R., and Seemüller, E. (1996): Witches‟ broom: a phytoplasma disease of poplar. In: Forest Trees and Palm Diseases and Control. Eds: K. Maramorosch and S. P. Raychaudhuri. New Delhi: Oxford and IBH Publishing Company, pp. 245–262. 38. Cousin, M.-T., Roux, J., Boudon-Padieu, E., Berges, R., Seemuller, E., and Hiruki, C. (1998): Use of Heteroduplex Mobility Analysis (HMA) for Differentiating Phytoplasma Isolates Causing Witches' Broom Disease on Populus nigra cv Italica and Stolbur or Big Bud Symptoms on Tomato. Journal of Phytopathology, 146 (2-3): 97-102. 39. D'Agostino, G. G. A. (1991): Ultrastructural features of primula yellows mycoplasma-like organism (MLO) in cryosections of Catharanthus roseus leaves. Journal of Structural Biology, 107 (1): 56-64. 40. Daire, X., Clair, D., Reinert, W., and Boudon-Padieu, E. (1997): Detection and differentiation of grapevine yellows phytoplasmas belonging to the elm yellows group and to the stolbur subgroup by PCR amplification of non-ribosomal DNA. European Journal of Plant Pathology, 103: 507–514. 41. D'Arcy, C. J. and Nault, L. R. (1982): Insect transmission of plant viruses and mycoplasmalike and rickettsialike organisms. Plant Disease, 66 (2): 99-104. 42. Davis, R. E., Lee, I.-M., Dally, E. L., Dewitt, N., and Douglas, S. M. (1988): Cloned nucleic acid hybridization probes in detection and classification of mycoplasmalike organisms (MLOs). Acta Horticulturae, 234: 115-122. 43. Davis, R. E., Dally, E. L., Gundersen, D. E., Lee, I.-M., Habili, N. (1997): „Candidatus Phytoplasma australiense‟, a new phytoplasma taxon associated with Australian grapevine yellows. International Journal of Systematic Bacteriology, 47 (2): 262-269. 44. Del Serrone, P., Marzachi, C., Bragaloni, M., and Galeffi, P. (2001): Phytoplasma infection of tomato in central Italy. Phytopathologia Mediterranea, 40: 137–142. 45. Deng, S. and Hiruki, C. (1991): Amplification of 16S rRNA genes from culturable and nonculturable Mollicutes. Journal of Microbiological Methods, 14: 53-61. 46. Diederen, B. M. W., Vermeulen, M. J., Verbakel, H., van der Zee, A., Bergmans, A., and Peeters, M. F. (2007): Evaluation of an internally controlled real-time polymerase chain reaction assay targeting the groEL gene for the detection of Bartonella spp. DNA in patients with suspected cat-scratch disease. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 26: 629–633. Mitrović LITERATURA 129 47. Doi, Y., Teranaka, M., Yora, K., and Asuyama, H. (1967): Mycoplasma- or PLT group-like microorganisms found in the phloem elements of plants infected with mulberry dwarf, potato witches‟ broom, aster yellows, or paulownia witches‟ broom. Annual of Phytopathological Society of Japan, 33 (4): 259–266. 48. Doyle, J. J. and Doyle, J. L. (1990): Isolation of plant DNA from fresh tissue. BRL Focus, 12: 13-15. 49. Duduk, B. and Bertaccini, A. (2006): Corn with symptoms of reddening: New host of stolbur phytoplasma. Plant Disease, 90: 1313-1319. 50. Duduk, B., Perić, P., Marčić, D., Drobnjaković, T., Picciau, L., Alma, A., and Bertaccini, A. (2008a): Phytoplasmas in carrots: disease and potential vectors in Serbia. Bulletin of Insectology, 61 (2): 327-331. 51. Duduk, B., Ivanović, M., Paltrinieri, S., and Bertaccini, A. (2008b): Phytoplasmas Infecting Fruit Trees in Serbia. Acta Horticulturae, 781. 52. Duduk B., Mejia, J. F., Paltrinieri, S., Contaldo, N., Alvarez, E., Varo´n, F., and Bertaccini, A. (2008c): Molecular differentiation of phytoplasmas affecting corn in Colombia and Serbia. In Second International Phytoplasma Workshop, 22–26 September 2008, Havana, Cuba. http://www.ipwgnet.org/doc/cuba- 2008/workshop%20abstracts.doc. 53. Duduk, B., Calari, A., Paltrinieri, S., Duduk, N., and Bertaccini, A. (2009): Multigene analysis for differentiation of aster yellows phytoplasmas infecting carrots in Serbia. Annals of Applied Biology, 154 (2): 219-229. 54. Ebbert, M. A. and Nault, L. R. (2001): Survival in Dalbulus leafhopper vectors improves after exposure to maize stunting pathogens. Entomologia Experimentalis et Applicata, 100 (3): 311-324. 55. Ellis, R. J. (1990): The molecular chaperone concept. Seminars in Cell Biology, 1(1): 1-9. 56. Errampalli, D., Fletcher, J., and Claypool, P. L. (1991): Incidence of yellows in carrot and lettuce, and characterization of mycoplasmalike organism isolates in Oklahoma. Plant Disease, 75: 579-584. 57. Favali, M. A., Musetti, R., Benvenuti, S., Bianchi, A., and Pressacco, L. (2004): Catharanthus roseus L. plants and explants infected with phytoplasmas: alkaloid production and structural observations. Protoplasma, 223: 45-51. 58. Fayet, O., Ziegelhoffer, T., and Georgopoulos, C. (1989): The groES and groEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperatures. Journal of Bacteriology, 171 (3): 1379–1385. 59. Fialová, R., Válová, P., Balakishiyeva, G., Danet, J.-L., Šafárová, D., Foissac, X. and Navrátil, M. (2009): Genetic variability of stolbur phytoplasma in annual crop and wild plant species in South Moravia. Journal of Plant Pathology, 91 (2): 411- 416. 60. Firrao, G., Gobbi, E., and Locci, R. L. (1994): Rapid diagnosis of apple proliferation mycoplasma-like organism using a polymerase chain reaction procedure. Plant Pathology, 43 (4): 669-674. Mitrović LITERATURA 130 61. Firrao, G., Gibb, K., and Streten, C. (2005): Short taxonomic guide to the genus „Candidatus Phytoplasma‟. Journal of Plant Pathology, 87: 249-263. 62. Firrao, G., Garcia-Chapa, M., and Marzachì, C. (2007): Phytoplasmas: Genetics, Diagnosis and Relationships with the Plant and Insect Host. Frontiers in Bioscience, 12: 1353-1375. 63. Freitag, J. H. (1964). Interaction and mutual suppression among three strains of aster yellows virus. Virology, 24: 401413. 64. Garnier, M. (2000). The stolbur phytoplasma: an ubiquitous agent. Comptes Rendus de l’Academie d’Agriculture France, 86: 27–33. 65. Garrity, G. M., Lilburn, T. G., Cole, J. R., Harrison, S. H., Euzéby, J., and Tindall, B. J. (2007): Taxonomic outline of the Bacteria and Archaea (Formerly the Taxonomic Outline of the Prokaryotes), Release 7.7, Part 11 - The Bacteria: Phyla Planctomycetes, Chlamydiae, Spirochaetes, Fibrobacteres, Acidobacteria, Bacteroidetes, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Dictyoglomi, Gemmatomonadetes, and Lentisphaerae. pp. 540-595 (http://www.taxonomicoutline.org/). 66. Glass, J. I., Assad-Garcia, N., Alperovich, N., Yooseph, S., Lewis, M. R., Maruf, M., Hutchison, C. A. III, Smith, H. O., and Venter, J. C. (2006): Essential genes of a minimal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103 (2): 425-430. 67. Goh, S. H., Potter, S., Wood, J. O., Hemmingsen, S. M., Reynolds, R. P., and Chow, A. W. (1996): HSP60 gene sequences as universal targets for microbial species identification: studies with coagulase-negative staphylococci. Journal of Clinical Microbiology, 34 (4): 818-823. 68. Golino, D. A., Oldfield, G. N., and Gumpf, D. J. (1989): Experimental hosts of the beet leafhopper transmitted virescence agent. Plant Disease, 73: 850-854. 69. Gundersen, D. E., Lee, I.-M., and Davis, R. E. (1994a). RFLP analyses of ribosomal protein genes reveal strain diversity in MLO 16S rRNA groups I and III. (Abstr.) Phytopathology, 84:1128. 70. Gundersen, D. E., Lee, I.-M., Rehner, S. A., Davis, R. E., and Kingsbury, D. E. (1994b): Phylogeny of mycoplasmalike organisms (phytoplasmas): a basis for their classification. Journal of Bacteriology, 176 (17): 5244–5254. 71. Gundersen, D. E. and Lee, I.-M. (1996): Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested-PCR assays using two universal primer pairs. Phytopathologia Mediterranea, 35 (3): 144-151. 72. Hartl, F. U. and Martin, J. (1995): Molecular chaperones in cellular protein folding. Current Opinion in Structural Biology, 5 (1): 92-102. 73. Hiruki, C. and Rocha, A. D. (1986): Histochemical diagnosis of mycoplasma infections in Catharanthus roseus by means of a fluorescent DNA-binding agent, 4'-6'-diamidino-2-phenylindole-HC1 (DAPI). Canadian Journal of Plant Pathology, 8 (2): 185-188. Mitrović LITERATURA 131 74. Hodgetts, J. and Dickinson, M. (2010): Phytoplasma Phylogeny and detection Based on Genes other than 16S rRNA. In: Phytoplasmas: Genomes, Plant Hosts and Vectors. Eds: P.G. Weintraub and P. Jones. CAB International, Cambridge, USA, pp 93-113. 75. Horwich, A. L., Low, K. B., Fenton, W. A., Hirshfield, I. N., and Furtak, K. (1993): Folding in vivo of bacterial cytoplasmic proteins: Role of GroEL. Cell, 74 (5): 909-917. 76. http://paulownia.bg/en/tissue-culture.html 77. Hu, Y., Henderson, B., Lund, P. A., Tormay, P., Ahmed, M. T., Gurcha, S. S., Besra, G. S., and Coates, A. R. (2008): A Mycobacterium tuberculosis mutant lacking the groEL homologue cpn60.1 is viable but fails to induce an inflammatory response in animal models of infection. Infection and Immunity, 76 (4): 1535–1546. 78. IRPCM Phytoplasma/Spiroplasma Working Team – Phytoplasma Taxonomy Group (2004): „Candidatus Phytoplasma‟, a taxon for the wall-less, non-helical prokaryotes that colonize plant phloem and insects. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54 (Pt 4): 1243–1255. 79. Jarausch, W., Lansac, M., Saillard, C., Broquaire, J. M., and Dosba, F. (1998): PCR assay for specific detection of European stone fruit yellows phytoplasmas and its use for epidemiological studies in France. European Journal of Plant Pathology, 104 (1): 17-27. 80. Jomantiene, R., Davis, R. E., Maas, J., and Dally, E. L. (1998): Classification of new phytoplasmas associated with diseases of strawberry in Florida, based on analysis of 16S rRNA and ribosomal protein gene operon sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 48: 269-277. 81. Jović, J., Ember, I., Mitrović, M., Cvrković, T., Krstić, O., Krnjajić, S., Acs, Z., Kölber, M., and Toševski, I. (2011): Molecular detection of potato stolbur phytoplasma in Serbia. Bulletin of Insectology, 64: S83-S84. 82. Kakizawa, S., Oshima, K., Jung, H.-Y., Suzuki, S., Nishigawa, H., Arashida, R., Miyata, S., Ugaki, M., Kishino, H., and Namba, S. (2006): Positive selection acting on a surface membrane protein of the plant-pathogenic phytoplasmas. Journal of Bacteriology, 188 (9): 3424–3428. 83. Karenlampi, R. I., Tolvanen, T. P., and Hanninen, M. L. (2004). Phylogenetic analysis and PCR-restriction fragment length polymorphism identification of Campylobacter species based on partial groEL gene. Sequence. Journal of Clinical Microbiology, 42 (12): 5731-5738. 84. Katayama, H., Janowiak, B. E., Brzozowski, M. , Juryck, J. , Falke, S., Gogol, E. P., Collier, R. J., and Fisher, M. T. (2008): GroEL as a molecular scaffold for structural analysis of the anthrax toxin pore. Nature Structural & Molecular Biology, 15: 754 - 760. 85. Khadhair, A.-H., Kawchuk, L. M., Taillon, R. C., and Botar, G. (1998): Detection and molecular characterization of an aster yellows phytoplasma in parsley. Canadian Journal of Plant Pathology, 20 (1), 55-61. Mitrović LITERATURA 132 86. Kirkpatrick, B. C., Fisher, G. A., Fraser, J. D., and Purcell, A. H. (1987): Cloning and detection of DNA from a nonculturable plant pathogenic mycoplasmalike organism. Science, 238 (4824): 197-200. 87. Ko, H. C. and Lin, C. P. (1994): Development and application of cloned DNA probes for a mycoplasmalike organism associated with sweetpotato witches‟- broom. Phytopathology, 84 (5):468-473. 88. Kobayashi, K., Ehrlich, S. D., Albertini, A., Amati, G., Andersen, K. K., Arnaud, M., et al. (2003): Essential Bacillus subtilis genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100 (8): 4678–4683. 89. Kollar, A. and Seemüller, E. (1989): Base composition of the DNA of mycoplasma-like organisms associated with various plant diseases. Journal of Phytopathology, 127 (3): 177-186. 90. Krishnakumar, R., Assad-Garcia, N., Benders, G. A., Phan, Q., Montague, M. G., and Glass, J. I. (2010): Targeted Chromosomal Knockouts in Mycoplasma pneumonia. Applied and Environmental Microbiology, 76(15): 5297-5299. 91. Kuan, C. P. and Su, H. J. (1998): Development of cloned DNA probes for phytoplasma associated with loofah witches' broom. Journal of Phytopathology, 146 (7): 309-313. 92. Kube, M., Schneider, B., Kuhl, H., Dandekar, T., Heitmann, K., Migdoll, A. M., Reinhardt, R., and Seemüller, E. (2008): The linear chromosome of the plant- pathogenic mycoplasma 'Candidatus Phytoplasma mali'. BMC Genomics, 9: 306. 93. Kube, M., Mitrovic, J., Duduk, B., Rabus, R., and Seemüller, E. (2012): Current view on phytoplasma genomes and encoded metabolism. The Scientific World Journal, doi:10.1100/2012/185942. 94. Kumar, S. and Nussinov, R. (2002): Close-range electrostatic interactions in proteins. A European Journal of Chemical Biology, 3 (7): 604-617. 95. Kunkel, L. O. (1926): Studies on aster yellows. American Journal of Botany, 13 (10):646-705. 96. Kunst, F., Ogasawara, N., Moszer, I., Albertini, A. M., Alloni, G., Azevedo, V., Bertero, M. G., et al. (1997): The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature, 390 (6657): 249-256. 97. Langer, M. and Maixner, M. (2004): Molecular characterization of grapevine yellows associated with phytoplasmas of stolbur group based on RFP-analysis of non-ribosomal DNA. Vitis, 43:185-189. 98. Lazarev, V. N., Levitskii, S. A., Basovskii, Y. I., Chukin, M. M., Akopian, T. A., Vereshchagin, V. V., Kostrjukova, E. S., et al. (2011): Complete genome and proteome of Acholeplasma laidlawii. Journal of Bacteriology, 193(18): 4943-53. 99. Lee, I.-M. and Davis, R. E. (1992): Mycoplasmas which infect plants and insects. In: Mycoplasmas: Molecular Biology and Pathogenesis. Eds: J. Maniloff, R. N. McElhansey, L. R. Finch, and J. B. Baseman. American Society for Microbiology, Washington, DC, pp 379-390. Mitrović LITERATURA 133 100. Lee, I.-M., Hammond, R. W., Davis, R. E., and Gundersen, D. E. (1993). Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms. Phytopathology, 83 (8):834-842. 101. Lee, I.-M., Gundersen, D. E., Hammond, R. W., and Davis, R. E. (1994): Use of mycoplasmalike organism (MLO) groupspecific oligonucleotide primers for nested-PCR assays to detect mixed-MLO infections in a single host plant. Phytopathology, 84 (6): 559-566. 102. Lee, I.-M., Gundersen-Rindal, D. E., and Bertaccini, A. (1998a). Phytoplasma: Ecology and genomic diversity. Phytopathology, 88 (12):1359-1366. 103. Lee, I.-M., Gundersen-Rindal, D. E., Davis, R. E., and Bartoszyk, I. M. (1998b): Revised classification scheme of phytoplasmas based on RFLP analyses of 16S rRNA and ribosomal protein gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 48: 1153-1169. 104. Lee, I.-M., Davis, R. E., and Gundersen-Rindal, D. E. (2000) Phytoplasma: phytopathogenic mollicutes. Annual Review of Microbiology, 54: 221–255. 105. Lee, I.-M., Martini, M., Bottner, K. D., Dane, R. A., Black, M. C., and Troxclair, N. (2003) Ecological implications from a molecular analysis of phytoplasmas involved in an aster yellows epidemic in various crops in Texas. Phytopathology, 93 (11): 1368–1377. 106. Lee, I.-M., Martini, M., Marcone, C., and Zhu, S. F. (2004a): Classification of phytoplasma strains in the elm yellows group (16SrV) and proposition of „Candidatus Phytoplasma ulmi‟ for the phytoplasma associated with elm yellows. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 337-347. 107. Lee, I.-M., Gundersen, D. E., Davis, R. E., Bottner, K. D., Marcone, C., and Seemüller, E. (2004b): „Candidatus Phytoplasma asteris‟, a novel phytoplasma taxon associated with aster yellows and related diseases. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 54: 1037-1048. 108. Lee, I.-M., Zhao, Y., and Bottner, K. D. (2006): SecY gene sequence analysis for finer differentiation of diverse strains in the aster yellows phytoplasma group. Molecular Cell Probes, 20 (2): 87-91. 109. Lee, I.-M., Zhao, J., and Davis, R. E. (2010): Prospects of Multiple Gene-based Systems for Differentiation and Classification of Phytoplasmas. In: Phytoplasmas: Genomes, Plant Hosts and Vectors. Eds: P. G. Weintraub and P. Jones. CAB International, Cambridge, USA, pp 51-63. 110. Lee, S. and Tsai, F. T. F. (2005): Molecular chaperones in Protein Quality control. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 38(3): 259-265. 111. Lee, W. T., Terlesky, K. C., and Tabita, F. R. (1997). Cloning and characterization of two groESL operons of Rhodobacter sphaeroides: transcriptional regulation of the heat-induced groESL operon. Journal of Bacteriology, 179 (2): 487–495. 112. Lepka, P., Stitt, M., Moll, E., and Seemüller, E. (1999): Effect of phytoplasmal infection on concentration and translocation of carbohydrates and amino acids in periwinkle and tobacco. Physiological and Molecular Plant Pathology, 55 (1): 59–68. Mitrović LITERATURA 134 113. Lessio, F. and Alma, A. (2004): Seasonal and daily movement of Scaphoideus titanus ball (Homoptera : Cicadellidae). Environmental Entomology, 33 (6): 1689- 1694. 114. Li, M. and Wong, S. L. (1992): Cloning and characterization of the groESL operon from Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology, 174 (12): 3981–3992. 115. Lim, P. O. and Sears, B. B. (1989): 16S rRNA sequence indicates that plant- pathogenic mycoplasmalike organisms are evolutionarily distinct from animal mycoplasmas. Journal of Bacteriology, 171 (11):5901-5906. 116. Lim, P. O. and Sears, B. B. (1991): DNA sequence of the ribosomal protein genes rp12 and rps19 from a plant-pathogenic mycoplasma-like organism. FEMS Microbiology Letters, 68 (1): 71–73. 117. Lim, P. O. and Sears, B. B. (1992). Evolutionary relationships of a plant- pathogenic mycoplasmalike organism and Acholeplasma laidlawii deduced from two ribosomal protein gene sequences. Journal of Bacteriology, 174 (8): 2606- 2611. 118. Lim, P. O., Sears, B. B., and Klomparens, K. L. (1992): Membrane properties of a plant-pathogenic mycoplasmalike organism. Journal of Bacteriology, 174 (3): 682-686. 119. Ludwig, W. and Schleifer, K. H. (2005): Molecular phylogeny of bacteria based on comparative sequence analysis of conserved genes. In: Microbial Phylogeny and Evolution, Concepts and Controversies. Ed: Sapp. Oxford University Press, New York, pp. 70-98. 120. Ludwig, W., Schleifer, K. H., and Whitman, W. B. (2009): Revised road map to the phylum Firmicutes. In: Bergey‟s Manual of Systematic Bacteriology (2nd ed., vol. 3: The Firmicutes). Eds.: P. De Vos, G. Garrity, D. Jones, N. R. Krieg, W. Ludwig, F. A. Rainey, K.-H. Schleifer and W. B. Whitman. Springer, New York, pp. 1-13. 121. Maniloff, J. (2000): Reconstructing the timing and selective events of mycoplasma evolution. Proceedings of the 13 th International Congress of the International Organization for Mycoplasmology (IOM), 65. 122. Marcone, C., Ragozzino, A., Credi, R., and Seemüller, E. (1996): Detection and characterization of phytoplasmas infecting grapevine in southern Italy and their genetic relatedness to other grapevine yellows phytoplasmas. Phytopathologia Mediterranea, 35 (3): 207-213. 123. Marcone, C., Neimark, A., Ragozzino, A., Lauer, U., and Seemüller, E. (1999): Chromosome sizes of phytoplasmas composing major phylogenetic groups and subgroups. Phytopathology, 89 (9): 805–810. 124. Marcone, C., Lee, I.-M., Davis, R. E., Ragozzino, A., and Seemüller, E. (2000). Classification of aster yellows-group phytoplasmas based on combined analyses of rRNA and tuf gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50: 1703–1713. Mitrović LITERATURA 135 125. Martini, M., Lee, I.-M., Bottner, K. D., Zhao, Y., Botti, S., Bertaccini, A., Harrison, N. A., Carraro, L., Marcone, C., and Osler, R. (2007): Ribosomal protein gene-based phylogeny for finer differentiation and classification of phytoplasmas. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 57: 2037-2051. 126. Martinović, M. i Bjegović, P. (1950): O nekim bolestima i štetočinama utvrĎenim u NR Srbiji u 1949 godini. Plant Protection, 2: 59-68. 127. Mäurer, R., Roux, J., Seemüller, E., and Cousin, M.-T. (1994): Characterization of witches‟ broom MLO disease by a polymerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16S rRNA gene and RFLP (restriction fragment length polymorphysm). IOM Letters, 3:265. 128. Maust, B. E., Espadas, F., Talavera, C., Aquilar, M., Santamaría, J. M., and Oropeza, C. (2003) Changes in carbohydrate metabolism in coconut palms infected with the lethal yellowing phytoplasma. Phytopathology, 93 (8): 976–981. 129. Mayhew, M., da Silva, A. C. R., Martin, J., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., and Hartl, F. U. (1996): Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex. Nature, 379 (6564): 420-426. 130. McCoy, R. E., Caudwell, A., Chang, C. J., Chen, T. A., Chiykowski, L. N., Cousin, M. T., Dale, J. L., et al. (1989): Plant diseases associated with mycoplama-like organisms. In: The Mycoplasmas (volume 5). Eds: R. F. Whitcomb and J. G. Tully. Academic Press, San Diego, CA, pp. 545-640. 131. Milne, R. G., Ramasso, E., Lenzi, R., Masenga, V., Sarindu, S., and Clark, M. F. (1995): Pre- and Post-embedding immunogold labeling and electron microscopy in plant host tissues of three antigenically unrelated MLOs: primula yellows, tomato big bud and bermudagrass whiteleaf. European Journal of Plant Pathology, 101 (1): 57-67. 132. Mitrović, J. and Duduk, B. (2011): Occurrence of a new stolbur strain in tobacco in Serbia. Bulletin of Insectology, 64 (Supplement): S107-S108. 133. Mori, H. and Ito, K. (2001): The Sec protein-translocation pathway. Trends in Microbiology, 9 (10): 494-500. 134. Murral, D. J., Nault, L. R., Hoy, C. W., Madden, L. V., and Miller, S. A. (1996): Effects of temperature and vector age on transmission of two Ohio strains of aster yellows phytoplasma by the aster leafhopper (Homoptera: Cicadellidae). Journal of Economic Entomology, 89 (5): 1223-1232. 135. Musetti, R., Loi, N., Carraro, L., and Ermacora, P. (2002): Application of immunoelectron microscopy techniques in the diagnosis of phytoplasma diseases. Microscopy Research and Technique, 56 (6): 462- 464. 136. Nipah, J. O., Jones, P., Hodgetts, J., and Dickinson, M. (2007): Detection of phytoplasma DNA in embryos from coconut palms in Ghana, and kernels from maize in Peru. Bulletin of Insectology, 60 (2): 385-386. Mitrović LITERATURA 136 137. Oshima, K., Kakizawa, S., Nishigawa, H., Jung H.Y., Wei, W., Suzuki, S., Arashida, R., Nakata, D., Miyata, S., Ugaki, M., and Namba, S. (2004): Reductive evolution suggested from the complete genome sequence of a plant-pathogenic phytoplasma. Nature Genetics, 36 (1): 27-29. 138. Palermo, S., Arzone, A., and Bosco, D. (2001): Vector-pathogen-host plant relationships of chrysanthemum yellows (CY) phytoplasma and the vector leafhoppers Macrosteles quadripunctulatus and Euscelidius variegatus. Entomologia Experimentalis et Applicata, 99 (3): 347-354. 139. Paltrinieri, S., Botti, S., Bertaccini, A., Mori, N., Dal Motin, F., and Fiore, N. (2006): Are phytoplasmas involved in a severe peach decline? ISHS Acta Horticulturae, 713 (VI International Peach Symposium): 421-426. 140. Purcell, A. H. and Suslow, K. G. (1987): Pathogenicity and effects on transmission of a mycoplasmalike organism of a transovarially infective bacterium on the leafhopper Euscelidius variegatus (Homoptera: Cicadellidae). Journal of Invertebrate Pathology, 50 (3): 285-290. 141. Ranford, J. C., Coates, A. R., and Henderson, B. (2000): Chaperonins are cell- signalling proteins: the unfolding biology of molecular chaperones. Expert Reviews in Molecular Medicine, 2 (8), 1-17. 142. Ranson, N. A., White, H. E., and Saibil, H. R. (1998): Review article- Chaperonins. Biochemistry Journal, 333: 233-242. 143. Ranson, N. A., Farr, G. W., Roseman, A. M., Gowen, B., Fenton, W. A., Horwich, A. L., and Saibil, H. R. (2001): ATP-bound states of GroEL captured by cryo- electron microscopy. Cell, 107 (7): 869–879. 144. Ranson, N. A., Clare, D. K., Farr, G. W., Houldershaw, D., Horwich, A. L., and Saibil, H. R. (2006): Allosteric signalling of ATP hydrolysis in GroEL-GroES complexes. Nature Structural & Molecular Biology, 13 (2): 147–152. 145. Razin, S., Yogev, D., and Naot, Y. (1998): Molecular biology and pathology of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62 (4): 1094– 1156. 146. Rhode, W., Kullaya, A., Mpunami, A., and Becker, D. (1993): Rapid and sensitive diagnosis of mycoplasmalike organisms associated with lethal disease of coconut palm by a specifically primed polymerase chain reaction for the amplification of 16S rDNA. Oleagineux, 48: 319-322. 147. Richard-Molard, M., Garressus, S., Malatesta, G., Orny, G., Valentin, P., Reinbold, C., Gerst, M., Blech, F., Fonne, G., Putz, C., Grousson, C., and Boudon- Padieu, E. (1995): Le syndrome des basses richesses – Investigations au champ et tentatives d‟identification de l‟agent pathogène et du vecteur. 58ème Congrès de l‟IIRB, Dijon-Beaune, pp. 299–309. 148. Rodríguez-Quiñones, F., Maguire, M., Wallington, E. J., Gould, P. S., Yerko, V., Downie, J. A., and Lund, P. A. (2005): Two of the three groEL homologues in Rhizobium leguminosarum are dispensable for normal growth. Archives of Microbiology, 183 (4): 253–265. Mitrović LITERATURA 137 149. Sasaki, Y., Ishikawa, J., Yamashita, A., Oshima, K., Kenri, T., Furuya, K., Yoshino, C., Horino, A., Shiba, T., Sasaki, T., and Hattori, M. (2002): The complete genomic sequence of Mycoplasma penetrans, an intracellular bacterial pathogen in humans. Nucleic Acids Research, 30 (23): 5293-5300. 150. Satheesh, N, Thong, K. L., Tikki, P, and Martin, A. (2002). Characterization of Salmonella Serovars by PCR-Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis. Journal of Clinical Microbiology, 40 (7): 2346-2351. 151. Scherm, B., Gerlach, G.-F., and Runge, M. (2002): Analysis of heat shock protein 60 encoding genes of mycoplasmas and investigations concerning their role in immunity and infection. Veterinary Microbiology, 89 (2-3): 141-150. 152. Schneider, H. (1977): Indicator hosts for pear decline: symptomatology, histopathology, and distribution of mycoplasmalike organisms in leaf veins. Phytopathology, 67 (5): 592-601. 153. Schneider, B., Ahrens, U., Kirkpatrick, B. C., and Seemüller, E. (1993): Classification of plant-pathogenic mycoplasma-like organisms using restriction- site analysis of PCR-amplified 16S rDNA. Journal of General Microbiology, 139: 519-527. 154. Schneider, B., Seemuller, E., Smart, C. D., and Kirkpatrick, B. C. (1995). Phylogenetic classification of plant pathogenic mycoplasmalike organisms or phytoplasmas. In: Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology (vol. I). Eds: R. Razin and J. G. Tully. Academic Press, San Diego, pp. 369-380. 155. Schneider, B., Gibb, K. S., and Seemüller, E. (1997): Sequence and RFLP analysis of the elongation factor Tu gene used in differentiation and classification of phytoplasmas. Microbiology, 143: 3381-3389. 156. Sears, B. B. and Kirkpatrick, B. C. (1994): Unveiling the evolutionary relationships of plant pathogenic mycoplasmalike organisms. ASM News, 60 (6): 307–312. 157. Seemüller, E. and Lederer, W. (1988): MLO-associated decline of Alnus glutinosa, Populus tremula and Crataegus monogyna. Journal of Phytopathology, 121 (1): 33–39. 158. Seemüller, E., Garnier, M., and Schneider, B. (2002) Mycoplasmas of plant and insects. In: Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Eds: S. Razin and R. Herrmann. Kluwer Academic, pp. 91–115. 159. Servant, P., Thompson, C., and Mazodier, P. (1993): Use of new Escherichia coli/Streptomyces conjugative vectors to probe the functions of the two groEL-like genes of Streptomyces albus G by gene disruption. Gene, 134 (1): 25–32. 160. Sharma, A. K. and Cousin, M.-T. (1986): Mycoplasmalike organisms (MLOs) associated with the witches‟ broom disease of poplar. Journal of Phytopathology, 117 (4), 349–356. Mitrović LITERATURA 138 161. Siewert, C., Mitrovic, J., Duduk, B., Hecht, J., Mölling, K., Bröcker, F., Beyerlein, P., Büttner, C., Bertaccini, A., and Kube, M. (2012): Enrichment of phytoplasma DNA by selected oligonucleotides and Phi29 polymerase amplification. Book of abstracts of the 22 nd International Conference on Virus and Other Graft Transmissible Diseases of Fruit Crops, Rome, p. 100. 162. Smart, C. D., Schneider, B., Blomquist, C. L., Guerra, L. J., Harrison, N. A., Ahrens, U., Lorenz, K. H., Seemüller, E., and Kirkpatrick, B. (1996): Phytoplasma-specific PCR primers based on sequences of the 16S-23S rRNA spacer region. Applied and Environmental Microbiology, 62 (8): 2988-2993. 163. Stephanou, A. and Latchman, D. S. (2011): Transcriptional modulation of heat- shock protein gene expression. Biochemistry Research International, doi:10.1155/2011/238601. 164. Streten, C. and Gibb, K. S. (2005): Genetic variation in Candidatus Phytoplasma australiense. Plant Pathology, 54: 8-14. 165. Szczepanek, S. M., Tulman, E. R., Gorton, T. S., Liao, X., Lu, Z., Zinski, J., Aziz, F., Frasca, S. Jr., Kutish, G. F., and Geary, S. J. (2010): Comparative Genomic Analyses of Attenuated Strains of Mycoplasma gallisepticum. Infection and Immunity, 78 (4): 1760-1771. 166. Swenson, K. G. (1971): Relation of age, sex and mating of Macrosteles fascifrons to transmission of Aster yellows. Phytopathology, 61 (6): 657-659. 167. Šeruga, M., Škorić, D., Botti, S., Paltrinieri, S., Juretić, N., and Bertaccini, A. (2003): Molecular characterization of a phytoplasma from the aster yellows (16SrI) group naturally infecting Populus nigra L. „Italica‟ trees in Croatia. Forest pathology, 33 (2):113-125. 168. Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., and Kumar, S. (2011): MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution, 28: 2731-2739. 169. Tedeschi, R., Bosco, D., and Alma, A. (2002): Population dynamics of Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae), a vector of apple proliferation phytoplasma in northwestern Italy. Journal of Economic Entomology, 95 (3): 544-551. 170. Tran-Nguyen, L. T., Kube, M., Schneider, B., Reinhardt, R., and Gibb, K. S. (2008): Comparative genome analysis of ‟Candidatus Phytoplasma australiense‟ (subgroup tuf-Australia I; rp-A) and ‟Ca. Phytoplasma asteris‟ Strains OY-M and AY-WB. Journal of Bacteriology, 190 (11): 3979-3991. 171. Tsai, J. H. (1979): Vector transmission of mycoplasmal agents of plant diseases. In: The Mycoplasmas (Vol. 3.). Eds: R. E. Whitcomb and J. G. Tully, eds. Academic Press, New York, pp. 265-307. 172. Tseng, T.-T., Tyler, B. M., and Setubal, J. C. (2009): Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiology, 9 (Suppl 1):S2, doi:10.1186/1471-2180-9-S1-S2. 173. Van Der Meer, F. A. (1980) Witches‟ Broom in Poplars. Populier, 17 (2): 42-43. Mitrović LITERATURA 139 174. Van Der Meer, F. A. (1981): Mozaiekvirus, heksenbezem en knoBbelziekte bij populier, en een virusachtige groeiremmeng bij wilg. Populier, 18: 51-59. 175. Viczián, O., Süle, S., and Gáborjányi, R. (1998): Detection and identification of stolbur phytoplasma in Hungary by PCR and RFLP methods. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica, 33(3/4): 255-260. 176. Webb, D. R., Bonfiglioli, R. G., Carraro, L., Osler, R., and Symons, R. H. (1999): Oligonucleotides as hybridization probes to localize phytoplasmas in host plants and insect vectors. Phytopathology, 89 (10), 894–901. 177. Wei, W., Lee, I.-M., Davis, R. E., Suo, X., and Zhao, Y. (2008): Automated RFLP pattern comparison and similarity coefficient calculation for rapid delineation of new and distinct phytoplasma 16Sr subgroup lineages. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58: 2368-2377. 178. Weintraub, P. G. and Beanland, L. (2006): Insect Vectors of Phytoplasmas. Annual Review of Entomology, 51: 91-111. 179. Woese, C. R. (2000): Inetrpreting the universal phylogenetic tree. Proceedings of the National Acaddemy of Science of the USA, 97: 8392-8396. 180. Wong, P. and Houry, W. A. (2004): Chaperone networks in bacteria: analysis of protein homeostasis in minimal cells. Journal of Structural Biology, 146 (1-2): 79- 89. 181. Woo, P. C. Y., Woo, G. K. S., Lau, S. K. P., Wong, S. S. Y., and Yuen, K. (2002): Single gene target bacterial identification: groEL gene sequencing for discriminating clinical isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Diagnostic Microbiology & Infectious Disease, 44 (2): 143–149. 182. Xu, Z., Horwich, A. L., and Sigler, P. B. (1997): The crystal structure of the asymmetric GroEL–GroES–(ADP)7 chaperonin complex. Nature, 388 (6644): 741-750. 183. Yoshikada, N., Nakamura, H., Shashi, N., Kubono, T., Katsube, K., Shoji, T., and Takahashi, T. (1994): Amplification and nucleotide sequences of ribosomal protein and 16S rRNA genes of mycoplasma-like organism associated with paulownia witches‟-broom. Annual of Phytopathological Society of Japan, 60 (5): 569-575. 184. Yushan, H., Lei, L., Weijia, L., and Xiaoguang, C. (2010): Sequence analysis of the groEL gene and its potential application in identification of pathogenic bacteria. African Journal of Microbiology Research, 4 (16): 1733-1741. 185. Zhao, Y., Wei, W., Lee, I.-M., Shao, J., Suo, X., and Davis, R. E. (2009): Construction of an interactive online phytoplasma classification tool, iPhyClassifier, and its application in analysis of the peach X-disease phytoplasma group (16SrIII). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 59: 2582-2593. 186. Zhao, J., Wei, W., Davis, R. E., and Lee, I.-M. (2010): Recent Advances in 16S rRNA Gene-based Phytoplasma Differentiation, Classification and Taxonomy. In: Phytoplasmas: Genomes, Plant Hosts and Vectors. Eds: P.G. Weintraub and P. Jones. CAB International, Cambridge, USA, pp. 64-92. Mitrović LITERATURA 140 187. Zwolínska, A., Krawczyk, K. and Pospieszny, H. (2012): Molecular Characterization of Stolbur Phytoplasma Associated with Pea Plants in Poland. Journal of Phytopathology, 160 (7-8): 317–323. Mitrović PRILOZI 141 PRILOZI PRILOG A Priprema pufera i rastvora supstanci korišćenih u ovoj doktorskoj tezi ● 0.5M EDTA pH8 za 100 ml rastvora: bidestilovana voda 100 ml EDTA 18.61 g -naĉin pripreme: U erlenmajer, u koji je prethodno stavljen magnet, sipano je 70 ml bidestilovane vode, erlenmajer je stavljen na magnetnu mešalicu a potom je sipan EDTA. Nakon 5-10 minuta kada je rastvor postao mlečno bele boje a EDTA se rastvorio, izmerena je pH vrednost rastvora a potom podešena na pH8 dodavanjem natrijum hidroksida (NaOH). Kada je pH podešena, rastvor je sipan u menzuru i dopunjen bidestilovanom vodom do 100 ml. Rastvor je potom autoklaviran pri temperaturi 121ºC u trajanju 21 minut. Ovako pripremljen rastvor EDTA je čuvan na 4ºC. ● 1M TRIS pH8 za 100 ml rastvora: bidestilovana voda 100 ml TRIS baza 12.1 g -naĉin pripreme: U erlenmajer, u koji je prethodno stavljen magnet, sipano je 60 ml bidestilovane vode, erlenmajer je stavljen na magnetnu mešalicu a potom je sipana TRIS baza. Nakon 5 minuta kada se TRIS baza rastvorila, izmerena je pH vrednost rastvora a potom podešena na pH8 dodavanjem HCl-a. Kada je pH podešena, rastvor je sipan u menzuru i dopunjen bidestilovanom vodom do 100 ml. Ovako pripremljen pufer je autoklaviran pri temperaturi 121ºC u trajanju 21 minut, a potom čuvan na 4ºC. Mitrović PRILOZI 142 ● 10% APS za 1 ml rastvora: bidestilovana voda 1 ml APS 0.1 g -naĉin pripreme: U tubicu od 1.5 ml je sipan 1 ml bidestilovane vode a potom je dodat APS. Tubica je par puta invertovana, nakon čega je čuvana na 4ºC. ● 3% CTAB ekstrakcioni pufer za 500 ml rastvora: CTAB 15 g TRIS baza 60.55 g natrijum hlorid (NaCl) 40.90 g 0.5M EDTA pH8 20 ml -naĉin pripreme: U erlenmajer, u koji je prethodno stavljen magnet, sipano je 300 ml bidestilovane vode, erlenmajer je stavljen na magnetnu mešalicu a potom su sipane sve hemikalije. Kada su se sve supstance rastvorile, izmerena je pH vrednost rastvora a potom podešena na pH8 dodavanjem koncentrovane hlorovodonične kiseline (HCl). Kada je pH podešena, rastvor je sipan u menzuru i dopunjen bidestilovanom vodom do 500 ml. Ovako pripremljen pufer je autoklaviran pri temperaturi 121ºC u trajanju 21 minut. ● 1xTE pufer za 200 ml rastvora: 1M TRIS 2 ml 0.5M EDTA pH8 0.4 ml bidestilovana voda 197.6 ml Mitrović PRILOZI 143 -naĉin pripreme: U erlenmajeru su sa bidestilovanom vodom pomešani ostali rastvori nakon čega je ovako pripremljen 1xTE pufer autoklaviran pri temperaturi 121ºC u trajanju 21 minut, a potom čuvan na 4ºC. ● 10xTBE pufer za 200 ml rastvora: TRIS baza 21.6 g borna kiselina 11 g 0,5M EDTA pH8 8 ml -naĉin pripreme: U erlenmajer, u koji je prethodno stavljen magnet, sipano je 100 ml bidestilovane vode, erlenmajer je stavljen na magnetnu mešalicu a potom su sipane hemikalije. Kada su se hemikalije rastvorile, rastvor je sipan u menzuru i dopunjen bidestilovanom vodom do 200 ml. Ovako pripremljen pufer je čuvan na 4ºC. ● 1xTBE pufer za 500 ml rastvora: U menzuri je odmereno 50 ml 10xTBE pufera i 450 ml destilovane vode koji su potom spojeni i sipani u staklenu bocu. Ovako pripremljen 1xTBE pufer je čuvan na 4ºC. Mitrović PRILOZI 144 PRILOG B Koliĉine svih hemikalija potrebnih za pripremu poliakrilamidnih gelova ● 6% poliakrilamidni gel 10 bunarĉića 14 bunarĉića zapremine 5 ml zapremine 25 ml bidestilovana voda 3.68 ml 18.43 ml 10xTBE 0.5 ml 2.5 ml akrilamid (40% rastvor) 0.75 ml 3.75 ml APS (10%) 62 µl 310 µl TEMED (99%) 3.12 µl 15.6 µl ● 8% poliakrilamidni gel 10 bunarĉića 14 bunarĉića zapremine 5 ml zapremine 25 ml bidestilovana voda 3.44 ml 17.2 ml 10xTBE 0.5 ml 2.5 ml akrilamid (40% rastvor) 1 ml 5 ml APS (10%) 62 µl 310 µl TEMED (99%) 3.12 µl 15.6 µl Mitrović Biografija 145 Biografija Jelena Mitrović roĎena je 4. marta 1981. godine u Beogradu. Završila je osnovnu školu „Lazar Savatić“ u Zemunu i Zemunsku I gimnaziju, prirodno- matematički smer. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu, upisala je školske 2000/01. godine. Studije na smeru Biologija završila je aprila 2007. godine sa prosečnom ocenom tokom studiranja 9,29. Diplomski rad sa temom „Embrionalno razviće mozga čoveka” odbranila je sa ocenom 10. U osnovnoj školi „Gornja Varoš“ u Zemunu radila je kao profesor biologije od 15. maja 2007. godine do 5. decembra 2008. godine. Doktorske studije je upisala na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu, školske 2008/2009. godine na smeru Biologija, modul Genetika. Od 1. februara 2009. godine bila je anagaţovana kao stipendista sadašnjeg Ministarstva prosvete, nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije u Institutu za pesticide i zaštitu ţivotne sredine, Zemun, u Laboratoriji za primenjenu fitopatologiju, na projektu „Razvoj i unapreĎenje bioracionalnih metoda zaštite bilja od bolesti i štetočina” - rukovodilac projekta dr Pantelija Perić, TR20036, a od 2011. godine angaţovana je na projektu „Proučavanje biljnih patogena, artropoda, korova i pesticida u cilju razvoja metoda bioracionalne zaštite bilja i proizvodnje bezbedne hrane“ - rukovodilac projekta dr Dejan Marčić, TR31043. TakoĎe je angaţovana na meĎunarodnom projektu COST action FA0807: Integrated Management of Phytoplasma Epidemics in Different Crop Systems od 2009. godine, u okviru koga je bila na četvoromesečnom usavršavanju u Berlinu, Nemačka, u institutu „Max Planck Institutute for molecular genetics“ kod dr Michael Kube. Od 1. avgusta 2012. godine zaposlena je u Institutu za pesticide i zaštitu ţivotne sredine, Zemun, u Laboratoriji za primenjenu fitopatologiju gde je i stekla zvanje istraţivač saradnik 6. septembra 2012. godine. Od početka naučnoistraţivačkog rada bavi se proučavanjem fitoplazmi - njihovom identifikacijom i karakterizacijom. Do sada je objavila i saopštila na naučnim skupovima preko 20 radova. Govori engleski, španski i francuski jezik i član je udruţenja FEMS society i Internacionalnog društva za mikoplazmologiju (IOM - International Organization for Mycoplasmology). 146 147 148 149 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.