BIOLOŠKI FAKULTET UNIVERZITET U BEOGRADU Milena Radaković UTICAJ ADRENALINA I EFEDRINA NA POJAVU PRIMARNIH OŠTEĆENJA DNK U LIMFOCITIMA ČOVEKA IN VITRO doktorska disertacija Beograd, 2013. FACULTY OF BIOLOGY UNIVERSITY OF BELGRADE Milena Radaković INFLUENCE OF ADRENALINE AND EPHEDRINE ON PRIMARY DNA DAMAGE OF LYMFOCYTES OF MAN IN VITRO Doctoral Dissertation Belgrade, 2013. Mentori: akademik Marko Anđelković, redovni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu u penziji dr Ninoslav Đelić, redovni profesor Fakulteta veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu Članovi Komisije: akademik Marko Anđelković, redovni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu u penziji dr Ninoslav Đelić, redovni profesor Fakulteta veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu dr Marina Stamenković-Radak, vanredni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu dr Zoran Stanimirović, redovni profesor Fakulteta veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu dr Lada Živković, docent Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu Datum odbrane: Ovaj rad je urađen u Laboratoriji za genetiku životinja na Katedri za biologiju Fakulteta veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu u okviru projekta III 46002- „Molekularno-genetička i ekofiziološka istraživanja u zaštiti autohtonih animalnih genetičkih resursa, očuvanja dobrobiti, zdravlja i reprodukcije gajenih životinja i proizvodnji bezbedne koji je finansiran od strane Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije. Izrada ovog rada sigurno ne bi bila moguća bez pomoći i podrške mojih kolega zbogo čega sam im neizmerno zahvalna. Najlepše se zahvaljujem svom mentoru, profesoru dr Ninoslavu Đeliću na predloženoj tematskoj oblasti istraživanja, na stručnom i naučnom rukovodstvu, korisnim savetima i velikoj pomoći tokom izrade ovog rada. Takođe sam izuzetno zahvalna mentoru, akademiku dr Marku Anđelkoviću na dragocenim savetima, sugestijama i pomoći pri sagledavanju i kritičkoj analizi dobijenih rezultata. Iskrenu zahvalnost dugujem profesoru dr Zoranu Stanimiroviću na podršci, podstiaju i korisnim savetima tokom izrade ovog rada. Dalju reč zahvalnosti dugujem dr Ladi Živković i dr Marini Stamenković-Radak. Vaši saveti i sugestije su mi bili veoma korisni. Zahvaljujem se prof. dr Bosiljki Plećaš-Solarević na velikoj pomoći u statističkoj obradi rezultata. Na kraju, posebno bih se zahvalila mojoj porodici na bezuslovnoj ljubavi, podršci i ohrabrenju tokom svh ovih godina. REZIME UTICAJ ADRENALINA I EFEDRINA NA POJAVU PRIMARNIH OŠTEĆANJA DNK U LIMFOCITIMA ČOVEKA IN VITRO U ovom radu cilj istraživanja je bilo ispitivanje primarnih oštećenja DNK izolovanih limfocita čoveka pod uticajem adrenalina i efedrina. Oštećenja DNK su evaluirana primenom in vitro Komet testa. Ispitivan je širok spektar koncentracija adrenalina i efedrina (u rasponu od 0,0005 μM do 500 μM) u različitim vremenskim intervalima (15 min, 60 min, 120 min, 240 min i 24 sata). Najizraženije oštećenje DNK ustanovljeno je nakon 15 min tretmana adrenalinom, pri čemu su sve koncetracije izuzev najniže (0.0005 µM) dovele do povećane migracije DNK. Nakon 60 min, 120 min, 240 min tretmana adrenalinom indukovano je oštećenje DNK u opsegu od 5 do 300 µM. Najslabiji efekat ispoljen je nakon 24 sata, tako da su samo najviše koncetracije adrenalina (150 µM i 300 µM) dovele do povećanog stepena oštećenja DNK. Radi utvrđivanja mogućeg učešća reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS) u indukovanju DNK oštećenja pod dejstvom adrenalina upotrebili smo antiokisanse katalazu (100 IU i 500 IU) i kvercetin (100 µM i 500 µM). Kotretman limfocita adrenalinom (300 µM) i antioksidansima nakon 15 ili 60 minuta doveo je do značajnog smanjenja količine DNK u repovima kometa. Prema tome, može se zaključiti da adrenalin ispoljava svoje genotoksične efekte indukcijom reaktivnih kiseoničnih vrsta i da se neka oštećenja poprave tokom prva četiri sata nakon tretmana adrenalinom. Za razliku od adrenalina, efedrin nije doveo do povećanja migracije DNK u odnosu na negativnu kontrolu tokom različitih vremenskih intervala. Jedino je koncetracija efedrina od 500 µM nakon 15 minuta tretmana indukovala oštećenje DNK koje je bilo statistički značajno. Odabrane koncetracije efedrina (1, 50, 300 µM) su dalje testirane u prisustvu inhibitora reparacije (citozin arabinozid - AraC i hidroksiurea - HU) radi ispitivanja eventualnog povećanja oštećenja DNK. Tretman sa inhibitorima reparacije uzrokovao je značajna povećanja DNK oštećenja u svim koncetracijama efedrina (1, 50 and 300 µM) nakon 15 i 60 min. S obzirom da su inhibitori reparacije takođe doveli do povećane migracije DNK i kod negativne kontrole povećana oštećenja u kotretmanu sa inhibitorima reparacije (AraC i HU) rezultat su postojanja DNK oštećenja koja su posledica već prisutnih endogenih oštećenja. Shodno tome, zaključuje s da efedrin ne ispoljava genotoksične efekte u in vitro Komet testu na humanim limfocitima. Ključne reči: adrenalin, efedrin, genotoksičnost, Komet test, antioksidansi, inhibitori reparacije Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Genetika UDK broj: [577.175.5 + [547.94 : 582.685.2]] : 577.212 ABSTRACT INFLUENCE OF ADRENALINE AND EPHEDRINE ON PRIMARY DNA DAMAGE OF LYMPHOCYTES OF MAN IN VITRO The objectives of these investigations were to investigate primary DNA damage in isolated human lymphocytes exposed to adrenaline and ephedrine. DNA damage was evaluated by the in vitro Comet assay. A broad spectrum of adrenaline and ephedrine concentrations (range from 0.0005 µM to 300 µM) were examined in the Comet assay for various treatment times (15 min, 60 min, 120 min, 240 min and 24 h). The most profound DNA damage was observed after 15 min of adrenaline treatment, as all concentrations tested except the lowest one (0.0005 µM) caused an increase in DNA migration. After 1 h, 2 h and 4 h of treatment, adrenaline induced DNA damage at concentration range from 5 µM to 300 µM. The slightest DNA damage was observed after 24 h of adrenaline treatment, therefore only the highest concentrations of adrenaline (150 μM and 300 μM) caused increased level of DNA damage. In order to evaluate the potential contribution of reactive oxygen species (ROS)-induced DNA damage exposed to adrenaline, we used antoxidants catalase (100 IU and 500 IU) and quercetin (100 µM and 500 µM). Co-treatment of lymphocytes with adrenaline (300 µM) and antioxidants for 15 or 60 min, significantly reduced the quantity of DNA in the comet tails. Therefore, it can be concluded that adrenaline exhibits genotoxic effects mainly through induction of reactive oxygen species and that some of the DNA damage is repaired during the first four hours following the treatment with adrenaline. Unlike adrenaline, ephedrine did not induce increased level of DNA migration in comparison to the negative control for various treatment times. Only the highest concentration of ephedrine (500 μM) induced a statistically significant DNA damage. The chosen concentrations of ephedrine (1, 50, 300 µM) were further tested with inhibitors of DNA repair (cytosine arabinoside and hydroxyurea) in order to evaluate the possible increase in DNA damage. Treatment with inhibitors of DNA repair caused significant rise in DNA damage in all chosen concentrations of ephedrine at 15 and 60 min. Since inhibitors of DNA repair also increased level of DNA migration in the negative control, increases of DNA damage co-treated with inhibitors of DNA repair (AraC + HU) resulted from unrepaired endogenous DNA damage. Hence, it can be concluded that ephedrine does not exhibit genotoxic effects in the in vitro Comet assay on human lymphocytes. Keywords: adrenaline, ephedrine, genotoxicity, Comet assay, antioxidants, inhibitors of DNA repair Scientific field: Biology Narrower scientific field: Genetics UDC number: [577.175.5 + [547.94 : 582.685.2]] : 577.212 SADRŽAJ SPISAK TABELA I GRAFIKONA 1. UVOD 1 2. OPŠTI DEO 3 2.1. Kateholamini 3 2.1.1. Mehanizmi dejstva kateholamina 5 2.1.2. Metabolizam kateholamina 8 2.2. Genotoksičnost hormona 10 2.2.1. Genotoksični efekti kateholamina 12 2.3. Efedrin 15 2.3.1 Mehanizmi dejstva efedrina 16 2.4. Kateholamini i ROS 19 2.4.1. Oksidativna DNK oštećenja 22 2.4.2. Detekcija oksidativnih oštećenja Komet testom 25 2.4.2.1. Evaluacija oštećenja DNK primenom antioksidanasa u Komet testu 28 2.4.2.2. Evaluacija oštećenja DNK primenom inhibitora reparacije u Komet testu 29 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA 31 4. MATERIJAL I METODE 32 4.1. 4.2. Materijal Metode 32 33 4.2.1. Izolacija humanih limfocita i tretman 33 4.2.2. Određivanje broja vijabilnosti ćelija 36 4.2.3. Komet test 36 4.2.4. Analiza podataka 37 4.2.5 Statistička analiza 38 5. REZULTATI 39 5.1. Komet test kod limfocita čoveka izloženih dejstvu adrenalina 39 5.2. Efekat antioksidanasa na oštećenje DNK izazvana adrenalinom 48 5.3. Komet test kod limfocita čoveka izloženih dejstvu adrenalina 55 5.4. Efekat inhibitora reparacije na oštećenja DNK u prisustvu efedrina 62 6. DISKUSIJA 73 6.1. Ispitivanja Komet testom 73 6.2. Uticaj antioksidanasa na genotoksičan efekat adrenalina 76 6.3. Uticaj inhibitora reparacije u prisustvu efedrina 80 7. ZAKLJUČCI 83 8. LITERATURA 84 SPISAK TABELA I GRAFIKONA TABELE Tabela 1. Prikaz primenjenih koncentracija adrenalina sa različitim vremenskim intervalima inkubacije u Komet testu Tabela 1a. Prikaz primenjenih koncentracija adrenalina koje odgovaraju određenim dozama Tabela 2. Prikaz primenjenih koncentracija efedrina sa različitim vremenskim intervalima inkubacije u Komet testu Tabela 3. Analiza DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon različitih tretmana adrenalinom. Tabela 4. Efekat katalaze i kvercetina naspram DNK oštećenje adrenalina u limfocitima čoveka nakon 15 minuta. Tabela 5. Efekat katalaze i kvercetina naspram DNK oštećenje adrenalina u limfocitima čoveka nakon 60 minuta. Tabela 6. Analiza DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon različitih tretmana efedrinom. Tabela 6. Analiza DNK oštećenje na limfocitima čoveka nakon 15 minuta tretmana efedrina i DNK inhibitora reparacije (citozin arabinoza i hidrokisiurea) Tabela 7. Analiza DNK oštećenje na limfocitima čoveka nakon 30 minuta tretmana efedrina i DNK inhibitora reparacije (citozin arabinoza i hidrokisiurea) GRAFIKONI Grafikon 1. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u humanim limfocitima nakon 15 minuta. Grafikon 2. Distribucija klasa kometa nakon 15 minuta izlaganja adrenalinom. Grafikon 3. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u humanim limfocitima nakon 60 minuta. Grafikon 4. Distribucija klasa kometa nakon 60 minuta izlaganja adrenalinom. Grafikon 5. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u humanim limfocitima nakon 120 minuta. Grafikon 6. Distribucija klasa kometa nakon 120 minuta izlaganja adrenalinom. Grafikon 7. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 240 minuta. Grafikon 8. Distribucija klasa kometa nakon 240 minuta izlaganja adrenalinom. Grafikon 9. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 15 minuta. Grafikon 10. Distribucija klasa kometa nakon 240 minuta izlaganja adrenalinom. Grafikon 11. Antioksidativni efekat katalaze i kvercetina u tretmanu sa adrenalinom nakon 15 minuta. Grafikon 12. Nivo DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon 15 minuta delovanja katalaze u tretmanu sa adrenalinom Grafikon 13. Nivo DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon 15 minuta delovanja kvercetina u tretmanu sa adrenalinom Grafikon 14. Antioksidativni efekat katalaze i kvercetina u tretmanu sa adrenalinom nakon 60 minuta. Grafikon 15. Nivo DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon 15 minuta delovanja katalaze u tretmanu sa adrenalinom Grafikon 16. Nivo DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon 60 minuta delovanja kvercetina u tretmanu sa adrenalinom Grafikon 17. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 15 minuta. Grafikon 18. Distribucija klasa kometa nakon 15 minuta izlaganja efedrinom. Grafikon 19. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 60 minuta. Grafikon 20. Distribucija klasa kometa nakon 60 minuta izlaganja efedrinom. Grafikon 21. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 120 minuta. Grafikon 22. Distribucija klasa kometa nakon 120 minuta izlaganja efedrinom. Grafikon 23. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 240 minuta. Grafikon 24. Distribucija klasa kometa nakon 240 minuta izlaganja efedrinom . Grafikon 25. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 24 sata. Grafikon 26. Distribucija klasa kometa nakon 24 sata izlaganja efedrinom. Grafikon 27. Efekat citozin arabinoze (20 µM) i hidrokisiuree (2000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 15 minuta. Grafikon 28. Efekat citozin arabinoze (40 µM) i hidrokisiuree (4000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 15 minuta. Grafikon 29. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 15 minuta u limfocitima čoveka sa i bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 20μM i HU 2000 μM). Grafikon 30. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 15 minuta u limfocitima čoveka sa i bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 20μM i HU 2000 μM). Grafikon 31. Efekat citozin arabinoze (20 µM) i hidrokisiuree (2000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 60 minuta. Grafikon 32. Efekat citozin arabinoze (40 µM) i hidrokisiuree (4000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 60 minuta. Grafikon 33. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 60 minuta u limfocitima čoveka sa i bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 20μM i HU 2000 μM). Grafikon 34. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 60 minuta u limfocitima čoveka sa i bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 20μM i HU 2000 μM). 1. UVOD Ljudi su danas konstantno izloženi mnogobrojnim agensima koji mogu da oštete genetički materijal. Poznato je da se dejstva hemijskih agenasa na DNK povezuju sa mutagenim događajima, koji mogu biti polazna tačka u razvoju kancera. Stoga mogućnost da neke hemikalije mogu narušiti genetički integritet ćelije privlači značajnu pažnju naučne javnosti. To je dovelo da razvoja niza testova koji mogu detektovati različite tipove genotoksičnih efekata kako bi predvideli potecijalnu genotoksičnost, a time i određeni stepen mutagenosti agenasa uključujući pre svega farmaceutske proizvode, kao i širok spektar fizičkih i hemijskih polutanata životne sredine (Stanimirović i sar., 2005; Stanimirović i sar., 2007). Procena oštećenja genetičkog materijala endogenih јedinjenja, kao što su hormoni veoma je delikatna. Malo je verovatno očekivati da će prirodna selekcija u procesu evolucije dozvoliti prisustvo endogenih jedinjenja koja su sposobna da naruše genetički integritet (Djelic 1997), naročito ako se uzme u obzir značajna i nezamenljiva uloga hormona u održavanju vitalnih funkciјa tela, uključuјući rast, razvoј i reprodukciјu. Opravdanost njihovih ispitivanja je stoga veća s obzirom na njihovu široku primenu u medicini u lečenju raznih bolesti i stanja (Dhillon i sar., 1994; Hundal i sar., 1997; Shadab i sar., 1999). Postoje dokazi koji ukazuju da hormoni, posebno steroidni, pod određenim uslovima mogu ispoljiti genotoksične efekte (Ahmad i sar., 2000; Dhillon i Dhillon, 1995; Yared i sar., 2002). Iako steroidni hormoni vezivanjem za receptore utiču na nastanak malignih ćelija, otkriće različitih tipova DNK oštećanja indukovanih produktima metabolizma estrogena dovelo je do zaključka da estrogeni mogu ispoljiti mutageni potencijal nezavistan od hormonalne aktivnosti. Utvrđeno je da metaboličkom konverzijom fenolne grupe estrogena dolazi do formiranja reaktivnih kiseoničnih vrsta (ROS) i intermedijera sposobnih da oštete DNK (Liehr, 2001). 1 Podatak da fenolne grupe nekih nesteroidnih hormona (tireoidni hormoni, adrenalin) i neurotransmitera (dopamin, noradrenalin) mogu da se uključe u redoks cikluse praćene stvaranjem ROS i oksidativnog stresa, navelo nas je da izvršimo proučavanja genotoksičnog potencijala adrenalina. Uz to, evaluiran je genotoksičan efekat simpatomimetika efedrina koji ima sličnu hemijsku strukturu kao adrenalin, ali ne poseduje kateholnu grupu, kako bi se ispitao značaj prisustva kateholne grupe u ispoljavanju genotoksičnog efekta. 2 2. OPŠTI DEO 2.1. Kateholamini Kateholamini čine klasu hemijskih neurotransmitera i hormona koji imaju važnu ulogu prevashodno u fiziološkim hemodinamičkim regulatornim mehanizmima. Integralni deo strukture adrenalina, noradrenalina i dopamina jeste hidroksilisani aromatični benzenov prsten, poznat kao katehol i bočni aminski lanac na osnovu čega su i dobili naziv kateholamini (slika 1). Iako kateholamini nisu esencijanlni za život, praktično svi organi u telu su pod uticajem kateholamina (Sherwood, 2009). Primarno dejstvo adrenalina jeste mobilizacija fizioloških resursa u odgovoru na emocionalni i fizički stres. Adrenalin se intezivno oslobađa tokom stresa dovodeći do povećavanja srčanog ritma, tonusa krvnih sudova i volumena ekstracelularne tečnosti čime doprinosi povećanju krvnog pritiska (Seifter i sar., 2005). S druge strane, adrenalin prouzrokuje glikogenolizu i lipolizu što se manifestuje povišenjem nivoa glukoze i koncentracije slobodnih masnih kiselina u krvi i time se obezbeđuje odgovarajuća energija za potrebe organizama. Na ovaj način adrenalin priprema organizam za „bori se ili beži” odgovor (engl. fight or flight) (Sherwood, 2009). Adrenalin je takođe značajan regulator sekrecije hormona. Sekrecija insulina može biti povećana ili snižena pod uticajem adrenalina (Lundoquist i Ericson, 1978). Uz to, adrenalin podstiče agregaciju trombocita preko prostaglandina E1 koji ispoljava inhibitorni efekat na sam proces (Bentley, 2011). Adrenalin osim u „bori se ili beži” odgovoru učestvuje u temperaturnoj regulaciji, regulaciji intermedijarnog metabolizma, a kod nekih životinja adrenlin igra značajnu ulogu u buđenju iz hibernacije (Bentley, 2011). 3 Osim u adrenalnoj srži, kateholamini se endogeno stvaraju u simpatičkim nervnim završecima, u ćelijama želuca kao i u limfocitima (Goldstein i sar., 2003). Tokom normalnog fiziološkog stanja ne postoji stalna sekrecija adrenalina. Bazalni nivo adrenalina u plazmi čoveka je u nanomolarnom opsegu Međutim, u odgovoru na hipoglikemiju, hemoragijsku hipotenziju (Goldstein i sar., 2003), fizičku aktivnost (Kjaer, 1998), feohromocitoma (Gerlo i Sevens, 1994) i pojedine srčane poremećaje (Lameris i sar., 2000) koncentracija adrenalina može se znatno povećati. Zbog značajnog uticaja na kardiovaskularni sistem kateholamini su se decenijama primenjivali u kardiovaskularnoj terapiji, a sam adrenalin koristio se više od sto godina u kardiopulmonarnom oživljavanju (Zhong i Dorian, 2005). Danas se u medicini adrenalin najčešće koristi kao lek izbora u otkljanjanju znakova izazvanim anafilaktičkim reakcijama. Adrenali se dodaje rastvorima lokalnih anastetika kako bi se produžilo njihovo delovanje na mestu aplikacije. Zbog vazokonstriktornog dejstva primenjuje se i kao lokalni hemostatik u zaustavljanju kapilarnih krvarenja kože i sluzokože, a u oftamologiji se primenjuje u terapiji glaukoma (NTP, 1990). Na našem tržištu, adrenalin se može naći u vidu injekciong rastvora adrenalin-hidrohlorida (1:1 000 ili 1 mg/mL) koji se primenjuje subkutano ili intramuskularno (0.2-1.0 mL) ili u vidu aerosola (5.5 mg/mL) gde se po tretmanu oslobođa 0.22-0.25 mg adenalina (NTP, 1990). Slika 1. Strukturna formula adrenalina (preuzeto sa http://www.worldofmolecules.com/emotions/Epinephrine.png) 4 2.1.1. Mehanizam delovanja kateholamina Kateholamini spadaju u jedinjenja koja ne prolaze kroz memebranu target ćelija već svoje delovanje ostvaruju interakcijom sa različitim adrenergičkim receptorima (adrenoreceptori) koji se nalaze u membranama odgovarajućih ćelija. Ovi receptori ne utiču direktno na ekspresiju gena, već prenose poruku tj. signal kroz ćelijsku membranu u citosol gde se pokreće novi mehanizam specifičnih reakcija u kome učestvuju sekundarni glasnici. Adrenoreceptori se klasifikuju u šest podtipova α i tri podtipa β adrenoreceptora. U poslednje dve decenije postoje dokazi da veliki broj ćelijskih tipova poseduje na svojoj površini adrenoreceptore, delujući na niz ćelijskih funkcija. Mnogi organi sadrže samo α - ili samo β - adrenoreceptore. Krvni sudovi kože, sluznica, bubrega i drugih visceralnih organa imaju više α - nego β - adrenoreceptora, dok krvni sudovi srca, skeletnih mišića imaju više β – adrenoreceptora. Adrenalin stimuliše oba tipa receptora, ali veći afinitet ima prema β – adrenoreceptorima dok noradrenalin više deluje na α - adrenoreceptore. U osnovi, β - adrenoreceptori deluju ekscitatorno na srčani mišić; stimulacija vaskularnih α - adrenoreceptora vodi vazokonstrikciji, a stimulacija vaskularnih β - adrenoreceptora vodi vazodilataciji. Svaki adrenoreceptor osvaruje vezu sa G-proteinom koji ima značajnu ulogu u transmembranskom prenošenju signala. Većina poznatih G proteina su heterotrimeri sastavljeni od α subjedinice labavo vezane za βγ dimer i imaju ulogu kao posrednici između receptora i raznih efektornih proteina čiju funkciju regulišu ovi receptori (Varagić i Milošević, 2003). Adrenoreceptori imaju različito dejstvo u zavisnosti od podtipa G proteina sa kojim su povezani i mehanizma signalne transdukcije vezanog za specifičan G protein što je veoma važno jer će izazavana fiziološka dejstva varirati u zavisnosti od specifičnosti receptora za koji se kateholamin veže (Molina, 2004). Aktivacijom α1 receptora aktivira se fosfoinozitol-specifična fosfolipaza C posredstvom stimulantnog G-proteina (Gs) koja prouzrokuje razlaganje fosfoinozitida na dva sekundarna glasnika: inozitol-trifosfat (IP3) i diacil glicerol 5 (DAG) (Jezdimirović, 2005) (slika br. 2). IP3 povećava koncentraciju kalcijumovih jona (Ca2+) u citosolu (Minneman, 1988) čime se aktivira odgovarajuća protein kinaza preko proteina kalmodulina. Kalmodulin ne poseduje enzimsku aktivnost, nego se vezuje za druge ciljne proteine ili pojedinim enzimima može poslužiti kao stalna regulatorna subjedinica. Na taj način kalmodulin aktivira enzime koji vrše fosforilaciju odgovarajućih proteina. DAG, sekundarni glasnik, aktivira protein kinazu C koja dalje vrši fosforilaciju ciljnih proteina u ćeliji. U izvesnim glatkomišićnim ćelijama aktivacija α1 receptora dovodi do pojačanog ulaska Ca2+ kroz membranu otvaranjem receptorskih kalcijumovih kanala (Tsujimoto i sar., 1989). Slika 2. Šematski prikaz signalnih transdukcionih puteva vezani za adrenergičke receptore (preuzeto iz Raymond i sar., 1990, Hypertenzion) 6 Aktivacijom β receptora dolazi do konformacione promene receptora koja omogućuje zamenu GDP sa GTP na α subjedinici. Aktivna α subjedinica se odvaja od βγ proteina i aktivira adenilat ciklazu koja katalizuje sintezu cAMP od ATP-a. cAMP dalje aktivira protein kinazu zavisnu od cAMP (A-kinazu) katališući fosforilaciju odgovarajućih proteina. Adenilat ciklaza je aktivna sve dok je GTP intaktan, a kad dođe do hidrolize GTP u GDP, prestaje stimulisanje adenilat ciklaze. α2 receptori inhibišu adenilat ciklazu posredstvom inhibitornog G-proteina (Gi), usled čega se smanjuje intracelularna koncentracija cAMP-a (Varagić i Milošević, 2003). Poznato je da su kateholamini značajni regulatori kardiovaskularnih funkcija i energetskog metabolizma. Postoji sve više dokaza o značajnoj modulatornoj ulozi kateholamina u proliferaciji imunih ćelija, stvaranju citokina i antitela (Sanders i Kohm, 2002; Madden, 2003). Svoje antiproliferativno dejstvo na limfocite adrenalin ostvaruje preko  adrenoreceptora. S obzirom da limfociti sadrže adrenoreceptore, pretpostavlja se da molekularnim mehanizimima signalne transdukcije, adrenalin indukuje povećanu količinu cAMP, što vodi narušavanju citoskeletnih elemenata koji učestvuju u ćelijskoj deobi (Sanders i sar., 2001; Kavelaars, 2002) Takođe, preko cAMP-a kateholmini deluju na citokine i time učestvuju u regulaciji supresivnih i stimulatornih efektata imunog odgovora. Stoga kateholamini predstavljaju veoma bitnu kariku između nervnog, endokrinog i imunog sistema. 7 2.1.2. Metabolizam kateholamina Adrenalin je prirodni hormon koji se nakon sinteze distribuira do svih delova tela, izuzev mozga (zbog krvno-moždane barijere). Krajnji enzimatski korak u biosintezi adrenalina uključuje N-metilaciju noradrenalina putem enzima feniletanolamin N-metiltransferaze (PNMT) koji je pre svega lokalizovan u adrenalnoj srži. Kateholamini u svojoj strukturi poseduju 3,4-dihidrofenolni prsten koji potiče od prekusora tirozina (unešen putem ishrane ili hidroksilacijom fenilalanina) koji se konvertuje u 3,4 dihidrofenilalanin (DOPA) dejstvom enzima tirozin hidroksilaze u prisustvu kiseonika i tetrahidrobiopterinskog kofkatora (slika 3). Transformacija tirozina u DOPA predstavlja ograničavajući korak u biosintezi kateholamina s obzirom da je količina pomenutog enzima 200 puta manja u odnosu na ostale enzime. DOPA je supstrat za enzim dopamin dekarboksilazu pri čemu se stvara dopamin. Pomenuti enzim nalazi se u čitavom telu i zahteva pirodoksal fosfat za svoje delovanje. Hidroksilacijom dopamina nastaje noradrenalin aktivnošću enzima dopamin β-hidroksilaze u prisustvu Ca2+ jona, askorbinske kiseline i kiseonika. Konačno, noradrenalin se konvertuje do adrenalina putem enzima PNMT. Enzimi tirozin hidroksilaza, dopamin β- hidroksilaza i PNMT poseduju sličan proteinski domen u svojoj primarnoj strukturi i imaju veliki stepen podudarnosti u kodirajućim sekvencama odgovarajućih gena (Beaulieu i Kelly, 1990). U katabolizmu adrenalina učestvuju dva enzima (slika 4.) koji su odgovorni za stvaranje šest metabolita uključujući sulfate i glukoronit konjugate (Copper i sar., 1982). Katehol-O-metil transferaza (COMT), citoplazmatički enzim lokalizovan u jetri i bubrezima odgovoran za ekstraneuralni katabolizam, prevodi adrenalin i njegove deaminovane metabolite do O-metil derivata na poziciji 3-hidroksilne grupe kateholnog prstena. S druge strane, monoamino oksidaza (MAO), mitohondrijalni flavoprotein, koji se nalazi u većini tkiva, katališe deaminaciju adrenalina do aldehida koji se dalje redukuju do odgovarajućih alkoholnih metabolita kao što je 3,4- dihidroksifenil glikol (DOPEG) ili se oksidiše do 3,4- dihidroksimendelične kiseline (DOMA). 8 Oksidativnom deaminacijom O-metil derivata (metanefrina) vodi formiranju vanilmandelične kiseline (VMA) (Eisenhofer i sar., 2004). Slika 3. Biosinteza kateholamina (preuzeto sa http://themedicalbiochemistrypage.org/images/catecholaminesynthesis.jpg) Slika 4. Katebolizam adrenalina 9 2.2. Genotoksičnost hormona U poslednjih dvadeset godina mnoštvo podataka preplavilo je naučnu i širu javnost o uticaju egzogenih agenasa u mutagenezi. Kako se senzitivnost i specifičnost testova povećavala pretpostavka da se genetička struktura može narušiti jedino sredinskim uticajima počela se dovoditi pod sumnju. Postavlja se pitanje u kojoj meri endogeni agensi mogu doprineti mutagenezi? Poznato je da hormoni kao endogene supstance ispoljavaju svoju aktivnost uglavnom vezivanjem za odgovarajuće receptore. Međutim, osim svojih fizioloških uloga, neki hormoni pod određenim okolnostima mogu da naruše genetički integritet ćelije indukujući nastanak DNK adukata, oksidativna oštećenja DNK ili poremećaj mitotičkog aparata ćelije (Metzler, 2002). Poznato je da akumulacija genetičkih promena nastalih kao rezultat DNK oštećenja može voditi aktivaciji onkogena ili inaktivaciji tumor supresor gena (Weinberg, 1996). Na osnovu kliničkih i eksperimentalnih podataka utvrđeno je da steroidni hormoni igraju značajnu ulogu u nastanku kancera mlečnih žlezda i reproduktivnih organa kod ljudi i životinja (Ulfelder, 1976; Bishun and Williams, 1977). Zbog široke primene steroidnih hormona u hormonskoj terapiji i kontracepciji posebna pažnja se pridala ispitivanjima potenijalih genotoksičnih efekata pomenutih hormona. Estradiol, kao najvažniji ženski polni hormon indukuje prekide DNK u humanim limfocitima i MCF-7 ćelijama (Anderson i sar., 1997; Yared i sar., 2002). Mutageni potecijal estradiola potvrđen je praćenjem razmene sestrinskih hromatida (SCE) na humanim limfocitima gde je ispoljen pozitivan efekat (Dhillon i Dhillon, 1995; Ahmad i sar., 2000). U pogledu delovanja estradiola na hromozome, nađeno je da estradiol indukuje numeričke aberacije u humanim limfocitima i u V79 ćelijama kineskog hrčka (Schuler i sar., 1998, Sato i sar., 1992) kao i strukturne aberacije u humanim fibroblastim embriona i epitelnim ćelijama bubrega (Serova i Kerkis, 1974). Međutim, estradiol nije indukovao genske mutacije u sisarskim ćelijama (Richold, 1988; Tsutsui i sar., 2000). 10 Među sintetičkim estrogenim preparatima, snažan citotoksični efekat ispoljio je dietilstilbestrol (DES) koji pored toga, poseduje kancerogeni i teratogeni efekat (Folkman, 1971). Međutim, dostupni podaci o genetičkoj aktivnosti DES-a u različitim test sistemima su kontradiktorni. DES nije stvarao mutacije u Salmonella typhimurium testu, u V79 ćelijama kineskog hrčka i u kulturama embriona Sirijskog hrčka (Glatt, 1979; McCann i sar., 1975). S druge strane, DES je indukovao SCE u humanim fibroblastima i limfocitima (Rudiger i sar., 1979; Hill i Wolff, 1982). Osim pomenutog DES-a, nađeno je da etinil- estradiol i mestranol poseduju genotoksični potencijal  indukovanjem visoko značajne frekvence hromozomskih aberacija i razmene sestrinskih hromatida (SCE) u humanim limfocitima kao i visoku frekvencu mikronukleusa u kostnoj srži miševa (Dhillon i sar., 1994; Pinto, 1986; Wheeler i sar., 1986). Za razliku od estrogena i njegovih sintetičkih produkata testesteron i njegovi estri nisu ispoljili aneugeni i klastogeni efekat (Morita i sar., 1997; Wheeler i sar., 1986). Međutim, indukcija SCE u kulturama humanih limfocita i ćelija kostne srži miševa zabeležena je kod anaboličkog steroida fluoksimesterona (Dhillon i sar., 1995). Takođe, ispitivani su i ostali steroidni hormoni kao što su kortikosteroidi mada su podaci o njihovom mutagenom delovanju veoma oskudni. Postoje slabi dokazi da sintetički kortiokosteroid deksametazon ispoljava klastogeni efekat i povećava frekvencu SCE u humanim limfocitima i ćelijama kostne srži pacova (Singh i sar., 1994). Osim steroidnih hormona za koje postoji mnoštvo podataka u pogledu njihovog mutagenog delovanja, nađeno je da i nesteroidni hormoni mogu ispoljiti navedeni efekat. U pogledu genotoksičnog delovanja tiroidnih hormona postoje oprečni rezultati. Primenom in vitro Komet testa utvrđeno je da su tireoidni hormoni indukovali DNK oštećenja u humanim limfocitima i spermatozoidima (Djelić i Anderson, 2003; Dobrzynska i sar., 2004 ). Međutim, tiroksin je ispoljio slab klastogeni efekat praćenjem frekvence SCE u kulturama humanih limfocita, dok je negativan rezultat zabeležen u mikronukleus testu (Djelic i sar., 2006) i u in vitro citogenetičkom testu (Djelic i sar., 2007). 11 Genotoksični potencijal insulina ispitivan je primenom in vitro SCE testa i analize mikronukleusa u binuklearnim limfocitima u kojima je insulin dao negativan rezultat (Đelić, 2001). S druge strane, postoje dokazi da insulin može uticati na stvaranje tumora povećanjem DNK sinteze što dovodi do podsticanja mitogeneze (Gupta i sar., 2002). Melatonin kao prirodni onkostatski faktor i poznati antioksidans nije ispoljio genotoksični efekat u Ames-ovom i Komet testu na CHOK1 ćelijama (Musatov i sar., 1999). Odsustvo genotoksičnosti melatonina uočeno je i primenom in vitro SCE testa, ali je zapaženo inhibitorno dejstvo melatonina na proliferaciju humanih limfocita (Vijayalaxmi i sar., 1996). 2.2.1. Genotoksični efekti kateholamina Još ranih 80-tih godina prošlog veka Moldeus i sar., (1983) su pokazali da dopamin indukuje jednolančane prekide u humanim fibroblastima kože i genske mutacije u ćelijama limfoma miša, ali je ispoljio negativan efekat u Ames-ovom testu, SCE testu na humanim limfocitima, testu polno vezanih recesivno-letalnih mutacija i mikronukleus testu kod miša i pacova. Zbog zaštitnog efekta primenjene superoksid dismutaze (SOD), zaključeno je da genotoksičnost dopamina može biti uzrokovana stvaranjem reaktivnih kiseoničnih vrsta. Da bitnu ulogu u mutagenezi kateholamina imaju kiseonični derivati potvrđeno je u testu genskih mutacija na L5178Y ćelijama limfoma miša u kome su dopamin i adrenalin ispoljili mutageni potencijal (McGregor, 1988). Takođe, zabeležen je genotoksični potencijal L-dopa, prekusora dopamina. L-dopa je ispoljio mutageni efekat u Ames-ovom testu genskih mutacija i testu genskih mutacija na V79 ćelijama kineskog hrčka (Glatt, 1990). U mikronukleus testu u V79 ćelijama L-DOPA je ispoljio klastogeni efekat u prisustvu Mn2+ i Cu2+ (Snyder i Friedman, 1998). Halliwel i sar. (1990) su ukazali da dopamin, L-DOPA i 3-O-metil-DOPA mogu uzrokovati modifikacije azotnih baza. Uz to, L-dopa u prisustvu Cu2+ može uzrokovati DNK oštećenje 12 putem reaktivnih kiseoničnih vrsta kao što je hidroksi radikal (Husain i Hadi, 1998). Noradrenalin, strukturno sličan adrenalinu indukuje jednolančane prekide u srčanim ćelijama mioblasta (Okamoto i sar., 1996). Isto tako, pokazano je da noradrenalin i adrenalin mogu indukovati jednolančane prekide u plazmidnoj DNK u prisustvu ADP-Fe3+ (Miura i sar., 2000). Djelić i Anderson (2003) su ukazali da su za delovanje noradrenalina odgovorni reaktivni kiseonični derivati pošto je antioksidant katalaza smanjivala efekte noradrenalina u in vitro Komet testu na humanim limfocitima. Genotoksičnost noradrenalina je zabeležena i u humanoj spermi primenom Komet testa, a stepen oštećenja DNK pod uticajem noradrenalina je redukovan u kotretmanu sa katalazom (Dorbzynska i sar., 2004). Slično tome, nađeno je da adrenalin stimuliše stvaranje DNK prekida u testu fluoroscentne analize neodmotane DNK (Crespo i Bicho, 1995). Stepen oštećenja DNK pod uticajem adrenalina značajno se smanjuje primenom enzima katalaze i superoksid dismutaze (Crespo i Bicho, 1995). S druge strane, Djelić i sar. (2003) su zabeležili odsustvo klastogenog efekta adrenalina u kulturama cele krvi humanih limfocita. Navedeni rezultati su u saglasnosti sa otkrićima da adrenalin i drugi kateholamini mogu biti uključeni u redoks ciklus (Genova i sar., 2006) pri čemu nastaju ROS (Masserano i sar., 2000; Levay i sar., 1997). Stvaranje DNK- reaktivnih vrsta odvija se preko oksidacionih produkata kateholamina, hinona i semihinona neezimatskim putem u prisustvu metala (Levay i sar., 1997; Spencer i sar., 2011) ili putem enzima (Bindoli i sar., 1992) U vezi stim, zabeleženo je da kateholamini stvaraju značajan nivo oksidacionih produkata u organizmu (Dhalla i sar., 1989; Dhalla i sar., 2001). Stvoreni superoksidni anjon može uzrokovati hromozomske prekide, razmenu sestrinskih hromatida (SCE) u humanim limfocitima in vitro (Emerit i sar., 1982), kao i hromozomske aberacije u fibroblastima i jajnim ćelijama kineskog hrčka (Sofuni i Ishidate, 1984; Philips i sar., 1982). S druge strane, sposobnost nastanka DNK adukata putem stvaranja reaktivnih seminhinona i hinona je dokazan na različitim humanim ćelijskim linijama (Stokes i sar., 1999; Levay i Bodell, 1993). 13 S obzirom da kateholamini svoja dejstva ostvaruju preko receptora i podatka da receptor aktivisane signalne kaskade mogu biti uključene u indukciji DNK oštećenja otvorio se novi pristup u pogledu ispitivanja genotoksičnosti kateholamina. Stopper i sar. (2009) su ispitivali genotoksičnost dopamina primenom hvatača slobodnih radikala (2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oksill - TEMPOL i dimetiltiourea - DMTU) i inhibitora transportera dopamina (DAT) kao što su GBR 12909 i nomifenzin u Komet testu i mikronukleus testu u kulturama sisarskih ćelija. Ispoljeni genotoksičan efekat je redukovan nakon istovremenog tretmana dopaminom i hvatačima radikala ili DAT inhibitorima. S obzirom da dopamin ulazi u ćeliju putem DAT, ovi rezultati ukazuju da dopamin ispoljava genotoksičnost nakon ulaska u ćeliju i stvaranja radikala unutar nje. Do sličnih rezultata su došli Fazeli i sar. (2012) otkrivši da je dopamin ispoljio genotoksičnost nakon transporta u ćeliju i okidacije putem MAO. Primenjen enzim (MAO) je redukovao nastanak mikronukleusa i oksidativnog DNK adukta 8-oxodG. Interesantno istraživanje sproveli su Flint i sar. (2007) ispitujući mehanizame kojima stres hormoni (noradrenalin i adrenalin) utiču na oksidativna DNK oštećenja i na procese popravke u prekanceroznim 3T3 ćelijama. Autori sugerišu da stres hormoni vezivanjem za receptore pokreću seriju kaskadnih puteva. U navedenom istraživanju stres hormoni su povećavali stepen oštećenja DNK i modulirali transkripciju gena, posebno onih koji su odgovorni za odlaganje ćelijskog ciklusa nakon DNK oštećenja. Antagonist β-adrenergičnih receptora propranolol je blokirao genotoksične efekte noradrenalina i adrenalina, što ukazuje da su indukovana DNK oštećenja izazvana hormonima specifična i nezavisna. Rezultati ovih istraživanja svedoče o kompleksnosti molekularnih mehanizama u osnovi genotoksičnih efekata kateholamina. Naime, genotoksični efekti pod uticajem kateholamina nisu prouzrokovani samo njihovim uključivanjem u redoks cikluse praćene stvaranjem ROS, već jednim delom i preko citobiohemijskih promena nastalih direktnim uticajima na adrenergičke receptore. 14 2.3. Efedrin Efedrin je prirodni alkaloid biljaka roda Ephedra. Najpoznatija biljka među njima je Ma Huang (Ephedra sinica) koja sadrži 1 do 2% efedrina kao najzastupljenijeg alkaloida, dok efedrin i pseudoefedrin čine čak 80% sadržaja alkaloida kod biljaka u osušenom stanju (Haller i sar., 2002; Sheu, 1997). Efedrin je takođe glavni alkaloid belog sleza (Sida cardifolia) (Franzotti i sar., 2000). Osim u prirodi, efedrin i slični alkaloidi se mogu dobiti sintetskim putem (slika 5). U tradicionalnoj kineskoj medicini Ma Huang se već hiljadama godina korisiti u lečenju astme, bronhijalnog spazma (Roman, 2004). Takođe, Ma Huang se koristi za lečenje artritisa, povišene temperature, osipa, glavobolje, bolova u zglobovima i kostima i niskog krvnog pritiska (Leung i Foster, 1996). U zapadnoj medicini efedrin je našao primenu u lečenju astme, prehlada, zapušenja nosne duplje, alergijskog rinitisa (WHO, 1999). Zbog termogenetskih i lipolitičkih osobina dijetetski suplementi koji sadrže ekstrakte efedre se komercijalno koriste kao sredstva za smanjene telesne težine i jačanje sportskih performansi (Josefson, 1995; Shekelle i sar., 2003). Ovi dodaci se često kombinuju sa drugim botaničkim sastojcima kao što su kantarion i karnitin (CANTOKS, 2000). Pretpostavlja se da se broj konzumenata koji koriste efedrin broji milionima. Čist efedrin alkaloid je dostupan kao farmaceutski preparat i koristi se kao bronholdilatator, vazopresor i sastojak različitih dekondezanata (Pederson i sar., 2001; Kernan i sar., 2000). Druga dostupna forma ovog alkaloida je u vidu dijetetskog suplementa koji sadrži oko 20 mg efedrina (Haller i sar., 2004). Nakon oralne primene efedrin alkaloidi se veoma brzo apsorbuju. Delovanje efedrina traje oko 1 čas, dok je njegov poluživot između 3-11 sati. Najveći procenat (8-20%) aplikovanog efedrina metaboliše se N-demetilacijom do noradrenalina, dok 4-13% podleže okidativnoj deaminaciji stvarajući 1- fenilpropan-1,2-diol dalje do benzoične i hipurične kiseline (Wilkinson i Beckett, 1968; Sever i sar., 1975). 15 Slika 5. Sinteza efedrina i sličnih alkaloida (preuzeto sa http://www.epharmacognosy.com/2012/07/phenylalanine-derived- alkaloids.html) 2.3.1. Mehanizmi dejstva efedrina Hemijska struktura efedrina je slična neurotransmiteru adrenalinu (slika 6). Mehanizam delovanja efedrina zasniva se na strukturnoj sličnosti sa pomenutim kateholaminom. Slika 6. Poređenje strukturnih formula efedrina i adrenalina (preuzeto iz Rietjens i sar., 2004, Mol Nutr Food Res) 16 Efedrin poseduje dva hiralna centra i može postojati u četiri izomerne forme (1R,2S- i 1S,2R-efedrin i 1R,2R- i 1S,2S pseudoefedrin (Griffith i Johnson, 1995). Poznato je da se dejstva efedrina i sličnih analoga odvijaju putem receptora direktnim intrakcijama sa α – i β – adrenergičkim receptorima. Kao simpatomimetički agonist α i β adrenergičih receptora efedrin utiče na povećanje srčanog ritma, kontraktilnost, perifernu vazokonstrikciju, bronhodilataciju i stimulaciju CNS-a (Schaneberg i sar., 2003). Uz direktna dejstva, efedrin ispoljava indirektno simpatomimetičku aktivnost oslobađanjem kateholamina iz nervnih završetaka (Abourashed i sar., 2003). Povećano oslobađanje kateholamina nakon upotrebe efedrina zasniva se na sistemu negativne povratne sprege, koji ima tendenciju da inhibira delovanje i oslobađanje kateholamina. Sistem negativne povratne sprege uključuje oslobađanje adenozina u sinaptičke pukotine i povećanje aktivnosti fosfodiesteraze, što rezultuje u degradaciji cikličnog adenozin monofosfata (cAMP). Smatra se da alkaloidi Efedre 1R, 2S konfiguracije ispoljavaju direktan efekat na adrenergične receptore dok izomeri 1S, 2S- i 1S, 2R- konfiguracije imaju indirektno dejstvo (Vansal i Feller, 1999; Liles i sar., 2006). Međutim, poslednjih godina efedrin zaokuplja sve veću pažnju zbog ozbiljnih neželjenih efekata povezanih sa upotrebom ovog alkaloida. Neadekvatnom primenom efedrin alkaloida rezultovalo je u više od 1000 slučajeva trovanja, uključujući i smrt u periodu od 1993.-2000. godine u Americi (FDA, 2000). Uočena neželjena dejstva su: ishemijski i hemoragijski udar, psihoze, akutni infarkt miokarda, pa čak i smrt (Bruno i sar., 1993; Haller i Benowitz, 2000; Doyle i Kargin, 1996). Najviše zabeleženih slučajeva trovanja efedrinom vezano je za kardiovaskularni sistem (Samenuk i sar., 2002). Pretpostavlja se da se mehanizam toksičnosti efedrina zasniva na povećanom nivou Ca2+ koji menja električnu i kontrakcijsku sposobnost srca (Dunnick i sar., 2007). Efedrin vezivanjem za adrenergične receptore uzrokujuje oslobađanje kateholamina, praćenim povećanjem IP3 koji dovodi do sloboađanja Ca2+ jona iz intracelularnih depoa. Toksičnost ne mora biti ograničena na farmakološka dejstva samih alkaloida. Lee i sar. (2000) ukazali na citoksične efekte efedrina i ekstrakata Efedre na ćelijskim linijama neuroblastoma miševa i humanih hepatoblastoma. Do sličnih rezultata je došao Fukushima (2004) ispitivanjem citotoksičnog 17 efekta efedrina i ekstraktima Efedre na humanim neuroblastomima i mioblastomima pacova. S druge strane, efedrin nije ispoljio toksični efekat na humanim limfocitima već imunostimulatornu aktivnost što bi moglo imati značaj u imunologiji tumora (Attard i Vella, 2009). Zanimljivo je da postoje indicije da efedrin i ekstrakti Efedre poseduju antimutagena svojsva. Horikawa i sar. (1994) su ispitivali antimutagenu aktivnost vodenog ektrakta E. sinica. Rezultati su ukazali da pri koncetraciji od 1 mg, ekstrakt ispoljava antimutageno dejstvo. Takođe je zabeležena antitumorska aktivnost efedrina i ekstrakata Efedre na ćelijskim linijama melanoma pacova (Kuznetsova i sar., 2004; Nam i sar., 2003). Uprkos mnogobrojnim podacima o toksičnim efektima efedrina, podaci o potencijalnom genotoksičnom efektu efedrina su veoma oskudni. U in vitro i in vivo proučavanjima efedrina i ekstrakata biljke Ephedra, efedrin nije ispoljio genotoksični efekat na Salmonella typhimurium niti u kulturama ovarijalnih ćelija kineskog hrčka (NTP, 1986). Efedrin nije indukovao oštećenja hromozoma u in vitro testu hromozomskih aberacija u sisarskim ćelijama (Hillard i sar. 1998). Odsustvo genotoksičnosti efedrina zabeležili su i Brambilla i Martelli (2009) u testu bakterijskih mutacija i u in vitro citogenetičkim proučavanjima. Na osnovu dostupnih podataka zapaža se da efedrin nije ispoljio genotoksične efekte u nekim testovima na genotoksičnost, ali za sada nije ispitivan u Komet testu. Stoga smo genotoksičnost efedrina ispitivali na humanim limfocitima primenom Komet testa, kao veoma senzitivne metode za detekciju oštećenja DNK. S obzirom da efedrin umesto kateholnog prstena poseduje benzenov prsten, evalucijom efekata efedrina ispitaćemo značaj kateholne grupe za koju se smatra da je odgovorna za ispoljavanje genotoksičnih efekata pojedinih hormona i neurotransmitera. 18 2.4. Kateholamini i ROS Iako kateholamini igraju značajnu ulogu u fiziološkim procesima posebno kod ekstremnih situacija, pod određenim okolnostima mogu ispoljiti toksičan efekat (Dhalla i sar., 2001; Smythies i sar., 2002; Miura i sar., 2000; Djelić i Anderson, 2003). Dugi niz godina postojalo je uverenje da se osnovni mehanizam toksičnosti kateholamina ostvaruje putem stimulacije adrenergičkih receptora. Najviše podataka o toksičnosti kateholamina vezuje se za kardiotoksičnost. Putem stimulacije adrenergičkih receptora (Adameova i sar., 2009) dolazi do intraćelijskog povećanja Ca2+, oslobađanje energije hidrolizom fosfatnih grupa ATP-a, i subćelijskih promena što vodi oštećenju miokarda, ventrikularnim aritmijama i iznenadnom srčanom zastoju (Dhalla i sar., 2010). Visoke koncetracije kateholamina ostvaruju kardiotoksičan efekat preko povećanja cAMP-a koji utiče na visok nivo Ca2+ u ćeliji (Adameova i sar., 2009; Dhalla i sar., 2001). Međutim, postoji sve više dokaza koji ukazuju da oksidativni procesi igraju značajnu ulogu u ispoljavanju toksičnih efekata kateholamina (Dhalla i sar., 2001; Smythies i sar., 2002; Miura i sar., 2000; Djelić i Anderson, 2003). U prilog tome, zabeleženo je da adrenohrom i reaktivne kiseonične vrste nastaju procesom oksidacije kateholamina u organizmu (Dhalla i sar., 1989; Dhalla i sar., 2001). Oksidacioni produkt adrenalina, adrenohrom, povezan je sa nekoliko patoloških stanja (Roberts i sar., 2003; Rump i Klaus, 1994). Toksični efekti u srcu uglavnom se pripisuju adrenohromu (Behonick sar., 2001) koji se višestruko povećava pri oksido-redukcionim procesima kateholamina izazvanim enzimima ili metalnim jonima (Singal i sar., 1993). Adrenohrom kao visoko toksično ortohinonsko jedinjenje deluje na ćelijsku memebranu i stvara poremećaj u katjonskim kanalima i nivou Ca2+ (Adameova i sar., 2009) i zajedno sa ROS izaziva toksičan efekat na kardiomiocite (Rump i Klaus, 1994). Adrenohrom deluje i na ćelijski metabolizam inhibiranjem aktivnosti pojedinih enzima (Bindoli i sar., 1992). Aminohromi ispoljavaju toksične efekte i na nervnom tkivu (Bindoli i sar., 1989). Gubitak neurona povezan je sa 19 oksidacionim produktima kateholamina i stvaranjem ROS (Levay i sar.,1997; Miyazaki i Asanuma, 2008). Jedan od izvora ROS i oksidacionih produkata koji mogu oštetiti ćeliju jeste uključivanje adrenalina u redoks cikluse. Autoksidacija adrenalina je alternativni put metabolizma kateholamina i veoma je spora pri fiziološkom pH (Bindoli i sar., 1992; Remião i sar., 2001). U prisustvu metalnih katjona kao što su Cu2+, Mn2+, Co2+, Ni2+ i Fe3+ i enzima ksantin oksidaze, peroksidaze ili tirozinaze oksidacija kateholamina se može znatno ubrzati (Foppoli i sar., 1997; Bindoli i sar., 1992). Oksidativnim metabolizmom adrenalina stvaraju se o- hinoni preko inermedijarnih produkata o-semihinona uz redukciju kiseonika (O2) do superoksidnog aniona (O2• - ) (slika 7). Stvoreni o-hinon može podleći 1,4 intermolekularnoj ciklizaciji dovodeći do stvaranja nestabilnog leukoaminohroma koji se može brzo oksidovati do odgovarajućih aminohroma (Bindoli i sar., 1989; Remião i sar., 2004). Jedan od krajnjih produkata oksidacije, adrenohrom u prisustvu redukcionog sistema stimuliše oksidaciju adrenalina pri čemu nastaje O2•- i H2O2. S druge strane, adrenohrom se može redukovati pomoću superoksidnog radikala do odgovarajućeg semihinona koji reagujući sa kiseonikom može stvoriti superoksid i ponovo adrenohrom (Bindoli i sar., 1990). Hinoni stvoreni oksidativnim metabolizmom mogu ispoljavati citotoksične, imunotoksične i karcinogene efekte in vivo. (Bolton i sar., 2000; Monks i Lau, 1990). Hinon kao visoko reaktivno jedinjenje podleže redukciji do semihinon radikala koji lako ulazi u redoks ciklus vodeći do nastanka ROS. Drugi mehanizam toksičnosti hinona zasniva se na reakciji sa nukleofilima kao što su glutation, proteini ili DNK i formiranju kovalentnih adukata koji mogu značajno uticati na integritet i funkciju ćelije (Bolton i sar., 2000; Remião i sar., 2004). O-hinon stvoren putem redoks ciklusu adrenalina (Bindoli i sar., 1999) u prisustvu glutationa (GSH), može formirati 5-glutationil adrenalin detektovan u živim sistemima pomoću glutation-S-transferaze (Baez i sar., 1997). Katehol tioetri za razliku od nesupstituisanih hinona imaju sposobnost veće redoks aktivnosti (Monks i Lau, 1990), što doprinosi citotoksičnosti ovih adukata (Spencer i sar., 1998). Uz to, GSH konjugati mogu napustiti DNK i stvoriti 20 apurinska mesta pri čemu nastaju mutacije koje mogu voditi nastaku kancera (Cavalieri i sar., 2002). Veoma bitnu ulogu u štetnim efektima na ćeliju imaju i ROS nastale tokom redoks ciklusa kateholamina jer je pokazano da antioksidansi umanjuju njihove genotoksične efekte (Djelić i Anderson, 2003; Dorbzynska i sar., 2004). Za nas je od posebnog značaja učešće ROS u indukciji oksidativnih oštećenja DNK, kao jedan od najčešćih tipova oštećenja humane DNK. Slika 7. Oksidativni metabolizam adrenalina (modifikovano iz Costa i sar., 2007, Chem Res Toxicol.) 21 2.4.1. Oksidativna DNK oštećenja Treba istaći da se ROS normalno stvaraju u ćeliji tokom metaboličkih procesa koji uključuju kiseonik. Postoji čak 60 enzimskih reakcija u kojima se koristi kiseonik prilikom čega nastaju slobodni radikali. ROS se oslobađaju tokom ćelijskog disanja, procesa biosinteze, biodegradacije, biotransformacije ksenobiotika i aktivnosti fagocita. ROS igraju dvojnu ulogu u biološkim sistemima, jer mogu da budu korisni ili štetni za žive sisteme (Valko i sar., 2004). U niskim koncentracijama ROS učestvuju u regulaciji ćelijskih funkcija kao što je nivo Ca2+ jona i glukozne homeostaze (Higaki i sar., 2008) endocitnoznih puteva, autofagije (Chen i sar., 2008), a kao sekundarni prenosioci učestvuju u intracelularnim signalnim putevima (Scandalios, 2002; Klein i Ackerman, 2003). Nivo ROS se održava u balansu zahvaljujući mehanizmima antioksidativne odbrane koja ima ulogu da inaktiviše ROS ili da prekida reakcije u kojima ove kiseonične vrste nastaju. Među najznačajnije antioksidativne enzime spadaju: superoksid-dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation-peroksidaza (GSH-Px). Ukoliko dođe do disbalansa između slobodnih radikala i antioksidativne odbrane nastupa stanje koje se naziva oksidativni stres. Naime, nivo ROS se može značajno povećati toliko da ćelija više nije sposobna da se zaštiti i tada ove kiseonične vrste prouzrokuju oštećenja ćelijskih komponenti uključujući proteine, lipide i DNK. Učešće oksidativnog stresa potvrđeno je kod mnogih bolesti i patoloških stanja uključujući kardiovaskularne bolesti, diabetes, neurološka oboljenja, različite plućne bolesti i zapaljenske procese, kao i sterilitet (Cooke i sar., 2003; Halliwell i sar., 1990; Shen i Ong, 2000). Međutim, neke bolesti mogu biti uzrokovane oksidativnim oštećenjem ćelije, ali isto tako oksidativni stres može biti posledica, a ne uzrok primarnih procesa kod mnogih bolesti. Sem toga, oksidativni stres vezan je za teoriju starenja. Prema ovoj teoriji, u procesu starenja propada i slabi prirodna antioksidativna sposobnost organizma što potencira delovanje ROS i dovodi do oštećenja različitih molekula (Harman, 1956). ROS su posebno privukle pažnju naučne javnosti kao uzročnici kancerogeneze. Naime, postoje mnogobrojni dokazi koji ukazuju na snažnu 22 povezanost oksidativnog stresa, genske nestabilnosti i razvoja kancera (Klaunig i Kamendulis, 2004; Toyokuni i sar., 1995; Loft i Poulsen, 1996). Kod normalnih ćelija oksidativne lezije DNK izose oko 1 × 106 baza, što je vrednost koja je viša nego nivo adukata detektovanih kod ćelijama izloženim mutagenima na osnovu čega možemo zaključiti da endogena oštećenja DNK putem slobodnih radikala imaju izvestan doprinos u razvoju kancera (Loft i Poulsen, 1996). Stoga oksidativna oštećenja mogu biti korisni indikatori rizika za nastanak kancera. Pretpostavlja se da mutacije izazvane oksidativnim oštećenjem putem ROS značajno doprinose kancerogenzi (Guyton i Kensler, 1993). Treba naglasiti da su mutacije u genomu često bezopasne, ali specifične mutacije posebno u delovima odgovornim za regulaciju ćelijskog rasta mogu biti povezane sa inicijacijom kancera. Protoonkogeni tj. geni koji tokom razvića učestvuju u regulaciji ćelijskog procesa mogu mutirati u onkogene i dovesti do ćelijske transformacije. Mnoge vrste kancera imaju mutacije u genu koji kodira p53, protein koji učestvuje u supresiji rasta tumora, aktiviranjem usporavanja progresije kroz ćelijski ciklus. Kada je ćelija oštećena putem ROS, dolazi do usporavanja progresije kroz ćelijski ciklus i sprečava se replikacija pre nego oštećenje bude popravljeno. Ukoliko ćelija nije sposobna da popravi oštećenja uzrokovana ROS, obično se aktivira apoptoza, programirana ćelijska smrt. Poremećene funkcije u ovim kontrolnim tačkama omogućuju razvoj tumora. Na osnovu navedenog se zaključuje da je redoks ciklus kateholamina od izuzetnog značaja za žive sisteme u kojima nastaju reaktivni hinoni i ROS kao što su H2O2, O2•-, OH• (Graham, 1978; Miller i sar., 1990). Sve prisutne modifikacije u DNK molekulu mogu se povećati u in vitro ili in vivo sistemima stvaranjem ROS. Stepen DNK oštećenja zavisi od reaktivne kiseonične vrste koja je uključena, od mesta nastanka ROS-a kao i prisustva jona metala. Najznačajnija reakcija u kojoj nastaje O2•- je oksidacija o-semihinona do o-hinona. O2•- može sniziti aktivnost nekih enzima uključujući antioksidativne enzime odbrane kao što je katalaza, glutation peroksidaza i NADH dehidrogenaza. Takođe O2•- može delovati i na ribonukleotid reduktazu koji učestvuje u sintezi DNK (Willcox i sar., 2004). Iako O2•- nije jak oksidans pomoću superoksid dismutaze O2•- može biti konvertovan u H2O2 u reakciji poznatoj kao Fentonova reakcija sa tranzicijom metalnog jona kao katalizatora pri čemu se produkuje veoma reaktivan hidroksi radikal (OH•). 23 Vodonik peroksid (H2O2) je veoma difuzibilan i može lako proći ćelijsku membranu. Putem katalaze ili glutation peroksidaze H2O2 se metaboliše do vode i kiseonika. H2O2 indukuje porast slobodnih jona Ca2+ i aktivira poli- (ADP-riboza) polimerazu (PARP) (Herson i sar., 1999; Okamoto, 1985) što vodi ka smrti ćelije. Iako je H2O2 najmanje reaktivan molekul među ROS, veoma je opasan zato što se može prevesti do hidroksil radikala (OH•) u prisustvu jona metala kao što su Fe2+ili Cu2+. Hidroksi radikal (OH•) je glavni oksidant odgovoran za oštećenje molekula DNK. OH• može da reaguje sa svim komponentama DNK tj. sa azotnim bazama i šećerno-fosfatnim lancem. Stopa reakcije OH• sa azotnim bazama je približno pet puta veća nego sa šećernom komponentom DNK. Proučavanja su pokazala da iako sve četiri baze mogu biti modifikovane putem OH•, mutacije se uglavnom povezane sa modifikacijom GC baznog para dok AT bazni par ređe vodi mutaciji (Retel i sar., 1993). Ove mutacije su obično supstitucije baznih parova dok su delecije i insercije baza ređe učastale. Iako postoji preko 100 različitih DNK adukata nastalih reakcijom između OH• i baze, najpoznatiji među njima je 8-oksoguanin (8-OHdG) nasatao kao rezultat modifikacije guanina uzrokujući G→T trasverziju. Kod pojedinih humanih tumora G→T trasverzija spada u najčešće učestale mutacije kod p53 supresor gena (Brash i sar., 1991; Harris i Hollstein, 1993). Mutacije gena p53 nađene su kod čak 50% kancera. U sisarskim sistemima 8-OhdG može indukovati kodon 12 aktivaciju c-Ha-ras ili K-ras onkogena transverzijom G→T (Behrend i sar., 2003; Wu i sar., 2004). Konverzija guanina u 8-OHdG može delovati na enzime odgovorne za metilaciju citozina i uticati na regulaciju genske ekspresije (Willner, 2004). Osim toga oksidovane baze su neplanarne i mogu promeniti lokalnu strukturu molekula DNK što se može odraziti na tačnost DNK polimeraze u procesu replikacije i voditi nastanku mutacija (Wiseman i Halliwell, 1996). Iako modifikovane baze predstavljaju najčešći tip oksidativnih oštećenja, OH• može napasti i šećerno-fosfatni lanac DNK i dovesti do nastanka apurinskih mesta (AP) gde je baza uklonjena u reakaciji posredovanoj oksidantima. Jedan od indikatora napada OH• na lanac DNK je i fragmentacija dezoksiriboze. Jednolančani prekid DNK lanca odvija se preko vodonika 24 napadom na C-4 poziciju, vodeći do oksidacije šećernog prstena, a zajedno sa drugom oksidacijom šećerne komponente komplementarnog lanca vodi dvolančanom prekidu. Jednolančani prekidi u DNK molekulu mogu se pokazati mutagenim ili čak smrtonosnim za ćeliju (Friedberg i sar., 1995). 2.4.2. Detekcija genotoksičnih efekata Komet testom Komet test (test elektroforeze pojedinačnih ćelija, engl. the Comet assay – single cell gel electrophoresis) je ekonomična, brza i jednostavna metoda kojom se detektuju oštećenja DNK u pojedinačnim ćelijama. Osting i Johanson su 1984. godine razvili ovu mikrogel elektroforetsku tehniku, a 1988. godine Singh i saradnici su modifikovali ovaj test uvođenjem alkalnih uslova tokom elektroforeze. Kod poslednje verzije testa moguće je detektovati jednolančane prekide, apurinska mesta, nekompletna mesta popravke, DNK-protein i DNK- DNK ukrštene veze (engl. crosslinks) u bilo kojom tipu ćelija od koje se može dobiti ćelijska suspenzija. Osnovni princip Komet testa je otkrivanje oštećenja DNK ćelija praćenjem migracije iste u agaroznom gelu (slika 8.) Prvo se ćelije izlažu testiranoj supstanci određeno vreme, nakon čega se unose u agarozu niske tačke topljenja (engl. low melting point agarose, LMPA) i nanose na predmetna stakla na kojima se već nalazi osušen sloj agaroze koji omogućuje bolju atheziju. Obično se preko toga dodaje još jedan sloj agaroze, da bi se nakon toga pristupilo liziranju u cilju dezintegricija ćelijskih membrana kako bi se uklonili ćelijski i jedarni proteini. U alkalnoj verziji Komet testa, tretmanom sa bazama (obično 10 M NaOH), pri veoma visokom pH (pH > 13) dolazi do denaturacije DNK (engl. DNA unwinding). Nakon toga, pod uticajem električnog polja fragmenti DNK migriraju prema anodi formirajući rep komete. Količina DNK u repu proporcionalna je stepenu DNK oštećenja – što je više DNK u repu utoliko je stepen oštećenja izraženiji. Nakon elektroforeze uzorci se tretiraju neutrališućim puferom kako bi se snizio pH i time izbeglo ometanje prilikom 25 bojenja sa etidijum bromidom ili nekom drugom fluorescentnom bojom sa visokim afinitetom prema molekulu DNK (npr. sybergreen, DAPI itd.) U poređenju sa drugim genotoksičnim testovima prednosti ove metode su: visoka senzitivnost u otkrivanju niskog stepena oštećenja DNK; mogućnost otkrivanja genotoksičnosti u odsustvu mitotičke aktivnosti; zahteva mali broj ćelija po uzorku; fleksibilnost; jedostavna primena i relativno kratak period je potreban da bi se obavio eksperiment. Poslednjih dvadesetak godina Komet test je postala jedna od osnovnih metoda koju koriste istraživači u širokom spektru naučnih polja uključujući genetičku toksikologiju, ekogenotoksikologiju, proučavanja popravke DNK i humanog biomonitoringa (Rojas i sar., 1999; Andersson i sar., 2003; Cotelle i Ferard 1999; Collins i Harrington 2002; Marcon i sar., 2003; Albertini i sar., 2000; Moller, 2005). 26 Slika 8. Ilustrativan prikaz principa Komet testa 27 2.4.2.1. Evaluacija oštećenja DNK primenom antioksidanasa u Komet testu Senzitivnost Komet testa i njegova specifičnost se može povećati primenom određenih antiksidanasa pomoću kojih možemo indirektno da utvrdimo mehanizam DNK oštećenja nastalih dejstvom različitih agenasa. Katalaza je enzim koji se nalazi u skoro svim telesnim organima, ali naročito je prisutna u jetri. Ovaj enzim katališe redukciju H2O2 na O2 i H2O na osnovu čega je katalaza našla primenu u određivanju da li je mehanizam nastanka oštećenja DNK indukovan reaktivnim kiseoničnim vrstama. Za potrebe našeg istraživanja izabrali smo katalazu jer je u brojnim israživanjima (Djelic i Anderson, 2003; Diaz-Llera i sar., 2002; Cemelli i sar., 2006) potvrđeno da katalaza poseduje antioksidativno dejstvo što je rezultovalo u snižavanju oštećenja DNK izazvanih brojnim jedinjenjima. Katalaza je snižavala efekat DNK oštećenja u humanim limfocitima i u spermi izazvanim estrogenim jedinjenjima što ukazuje da je za njihovo delovanje odgovoran H2O2. Takođe, katalaza je ispoljila zaštitni efekat pri istovremenom tretmanu sa noradrenalinom i tiroidnim hormonima. U našim istraživanjima koja su sprovedena sa katalazom primenjivane su koncentracije od 100 ili 500 IU/ml i pokazalo se da pri ovim koncentracijama dolazi do značajnog smanjenja stepena DNK oštećenja u prisustvu adrenalina ili H2O2. Sama katalaza nije ispoljila genotoksičan efekat pri koncentraciji od 500 IU/ml, čime se isključuje bilo koja prooksidativna aktivnost. Kvercetin spada u najzastupljeniji flavanoid ljudske ishrane, uz to poznat je i kao čistač visoko reaktivnih vrsta kao što su hidroksil radikali, superoksid radikali i peroksinitriti. Nedavna istraživanja ukazuju da kvercetin smanjuje oksidativna oštećenja u Komet testu. Uočeno je da kvercetin poseduje zaštitnu ulogu protiv oksidativnih oštećenja DNK kao što su jednolančani prekidi u humanim limfocitima in vitro i spermi. Antioksidativno dejstvo kvercetina potvrđeno je i na ćelijskim linijama Caco-2, HepG2 i V79 (Aherne i Brien, 2000). U humanim melanoma ćelijskim linijama (HMB-2) kvercetin je redukovao frekvencu hromozomskih aberacija nastalih putem H2O2 (Horvatova 28 i sar., 2005) Uz to, kvercetin je redukovao oštećenja DNK izazvanim estrogenim jedinjenjima i H2O2 kao pozitivnom kontrolom u spermi i limfocitima. Postoje istraživanja koja su pokazala da flavanoidi mogu biti genotoksični i mogu delovati kao prooskidanti/antioksidanti u zavisnosti od primenjene doze (Szeto i sar., 2002; Laughton i sar., 1989) Prooksidativni efekat kvercetina je ostvaren na koncentracijama od 100 mM dok je antioksidativni efekat zabeležen na 500 mM. Smatra se da je autoksidacija kvercetina odgovorna za ispoljena prooksidativna svojstva. 2.4.2.2. Evaluacija oštećenja DNK primenom inhibitora reparacije u Komet testu Osim antioksidanasima, senzitivnost Komet testa može biti povećana uvođenjem inhibitora reparacije kao što su citozin arabinozid (Ara-C) i hidroksiurea (HU). Inkubacija sa inhibitorima reparacije ima za cilj da blokira popravku i uzrokuje nagomilavanje prekida DNK što omogućuje senzitivan način otkrivanja efekata štetnih tretmana ili spontanih DNK oštećenja. Uvođenje inhibitora reparacije u standardni Komet test omogućava otkrivanje šireg opsega genetičkih oštećenja i genetoksičnog potencijala većeg broja genotoksičnih jedinjenja. Na upotrebljivost navedenih inhibitora reparacije prvi put su ukazali Martin i sar. (1999), kada su zapazili da nekoliko jedinjenja koji indukuju mikronukleuse u MLC-5 ćelijama ispoljavaju povećani efekat jedino u Komet testu u prisustvu inhibitora reparacije HU i Ara-C. Ovi inhibitori reparacije omogućavaju prepoznavanje i isecanje baza u procesu ekscizione reparacije, ali inhibiraju naredni korak, DNK sintezu što rezultuje u akumulaciji jednolančanih prekida. Naime, Ara-C blokira korak popravke tj. DNK sintezu inhibiranjem DNK polimeraze koji se noramlno odvija nakon ekscizije baza (base excision repair, BER) ili ekscizije nukleotida (nukleotide excision repair, NER. Inhibitorni efekat Ara-C ostvaruje bilo direktnim delovanjem na DNK polimerazu ili indirektno, ubacivanjem u region popravke DNK čineći ga nestabilnim za dalje delovanje enzima. Pokazalo se da je efikasnost Ara-C povećana dodatkom HU. Hidroksiurea inhibira popravku blokiranjem 29 ribonukleotid reduktaze i time utiče na replikacione kontrolne tačke što vodi povećanju citotoksičnosti. Na osnovu navedenih efekata primena pomenutih inhibitora reparacije može biti veoma korisna u proučavanjima doprinosa DNK popravke (Speit i Hartman, 1995) u efektima viđenim u Komet testu kao i u određivanju kapaciteta DNK popravke (Cipollini i sar., 2005). 30 3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA Istraživanja u oblasti genotoksikologije uglavnom su obuhvatala različite agense životne sredine koji uglavnom nastaju usled snažnog razvoja hemijske i ostalih industrija. Međutim, sve je više podataka da u telima životinja i čoveka postoje i tzv. endogeni mutageni – supstance koje pod određenim okolonstima, mogu da dovedu do oštećenja naslednog materijala. Među najbolje proučene endogene mutagene ubrajamo steroidne hormone koji ispoljavaju genotoksičan efekat putem metaboličke konverzije fenolne grupe pri čemu se stvaranju reaktivne kiseonične vrste koje mogu da dovedu do kovalentih oštećenja genetskog materijala. Interesantno je da fenolne grupe nekih nesteroidnih hormona (tireoidni hormoni, adrenalin) i neurotransmitera (dopamin, noradrenalin) mogu da se uključe u redoks cikluse praćene stvaranjem reaktivnih kiseoničnih vrsta i oksidativnog stresa. Imajući u vidu podatke o potencijalnim genotoksičnom efektima nesteroidnih hormona i značaju prisustva kateholne grupe u ispoljavanja datih efekata ciljevi ove doktorske disertacije definisani su na sledeći način: - Evaluacija stepena oštećenja DNK u humanim limfocitima tretiranih širokim spektrom koncetracija adrenalina primenom Komet testa - Evaluacija stepena oštećenja DNK u humanim limfocitima tretiranih širokim spektrom koncetracija efedrina primenom Komet testa - Praćenje kinetike ispoljavanja oštećenja DNK pod uticajem adrenalina i efedrina u funkciji vremena. - Utvrđivanje mehanizma potencijalnih genotoksičnih efekata testiranih supstanci primenom antioksidanasa (katalaza i kvercetin). - Ispitivanje da li dolazi do povećanog ispoljavanja oštećenja DNK u prisustvu inhibitora reparacije. 31 4. MATERIJAL I METODE 4.1. Materijal U ovom istraživanju ispitivani su genotoksični efekti adrenalin- hidrohlorida (CAS No. 329-63-5, Jugoremedija, Zrenjanin) i efedrin- hidrohlorida (CAS No 50-98-6, Sigma, St. Louis, MO, USA). Kao pozitivna kontorola korišćen je vodonik peroksid (100μM) (Galafarm, Skoplje, Makedonija), a za negativnu kontrola uzet je sam rastvarač, osnosno PBS (Torlak, Beograd, Srbija). Za izolaciju humanih limfocita upotrebljen je: RPMI 1640 medijum sa dodatkom L-glutamina i hepesa (PAA Laboratories GmbH), Ficoll-PaqueTM Plus (GE Healtcare Biosciences AB Švedska) i natrijum heparin (Galenika, Beograd, Srbija). Za Komet test upotrebljene su sledeće hemikalije: agaroza normalne tačke topljenja (NMPA) (CAS No 9012-36-6), agaroza niske tačke topljenja (LMPA) (CAS No 39346-81-1), EDTA (CAS No 6381-92-6), natrijum hlorid (CAS No 7647-14-5), Tris (hidroksimetil aminometan) (CAS No 77-86-1), kvercetin dihidrat 98% HPLS (CAS No 6151-25-3), katalaza iz goveđe jetre (CAS No 9001-05-2), hidroksiurea (CAS No 127-07-1) i citozin-arabinozid (CAS No 147- 94-4). Sve gore navedene hemikalije za Komet test su nabavljene od Sigma Chemical Co., St. Louis, SAD. Dimetil sulfoksid (DMSO) i natrijum hidroksid su nabavljeni od Merck KGaA, Darmstadt, Nemačka. Triton X–100 Plus One naručeni su od Amersham Biosciences, Švedska. Za vizuelizaciju kometa upotrebljen je etidijum-bromid (2µg/mL) (Serva, Heidelberg, Nemačka). 32 4.2. Metode 4.2.1. Izolacija limfocita čoveka i tretman Prema potrebi istraživanja korišćena je periferna venska krv troje muških osoba starosti ispod 30 godina. Uzorci krvi su heparinizovani nakon čega je pristupljeno procesu izolacije limfocita Humani limfociti su izolovani naslojavanjem fikola (Ficoll-PaqueTM Plus) i centrifugiranjem 15 minuta na 1900 rpm. Limfociti su formirali prsten ispod krvne plazme koja je uklonjena, a ćelije su prikupljene i resuspendovane dva puta u RPMI 1640 medijumu, između ispiranja obavljeno je centrifugiranje 10 minuta na 1800 rpm. Na kraju, supernatant je pažljivo uklonjen, a talog je resuspendovan u RPMI 1640 medijumu. Uticaj adenalina na stepen oštećenja DNK evaluiran je u širokom opsegu (tabela 1a) počev od koncetracije koja odgovara fiziološkoj vrednosti kod čoveka (0,0005 µM) do 100× veće vrednosti od maksimalne terapijske doze (500 µM) u različitim vremenskim intervalima na 37°C (tabela 1). Koncentracije adrenalina (300, 50 i 1 µM) sa prihvatljivom ćelijskom vijabilnošću (preko 90% u „Trypan Blue” testu) korišćena su za dalja ispitivanja. Izolovani limfociti su tretirani sa odabranom koncetracijom adrenalina (300 µM) i antioksidansom katalazom (CAT) u dve različite koncentracije (100 IU/mL i 500 IU/mL) u vremenskim intervalima od 15 minuta ili 1 čas. Isti postupak je ponovljen sa drugim antioksidansom kvercetinom (QUE) u koncentracijama od 100 µM i 500 µM. Takođe, ispitivan je efekat efedrina na stepen oštećenja DNK u širokom spektru koncentracija u različitim vremenskim intervalima na 37°C (tabela 2). Nakon toga, odabrane koncetracije efedrina od 300, 50 i 1 µM inkubirane su na 37 °C u vremenskom intervalu od 15 minuta ili 1 čas sa inhibitorima reparacije citozin arabinozidom (AraC) i hidroksiureom (HU). Prema tome, obavljen je 33 zajednički tretman limfocita sa pojedničnim koncentracijama efedrina i inhibitorima reparacije (20 μM AraC + 2000 μM HU), a zatim smo upotrebili iste koncentracije efedrina sa inhibitorima reperacije viših koncentracija (40 μM AraC + 4000 μM HU). Isti tretman je obavljen bez prisustva inhibitora reparacije. Tabela 1. Prikaz primenjenih koncentracija adrenalina sa različitim vremenskim intervalima inkubacije u Komet testu SUPSTANCE  KONCENTRACIJE  (µΜ)  VREME INKUBIRANJA  (sati)  Negativna kontrola,  PBS  /  0.25  1  2  4  24  Adrenalin  0.0005  0.25  1  /  /  /  Adrenalin  0.001  0.25  1  /  /  /  Adrenalin  0.01  0.25  1  2  4  24  Adrenalin  0.2  0.25  1  /  /  /  Adrenalin  1  0.25  1  2  4  24  Adrenalin  5  0.25  1  2  4  24  Adrenalin  50  0.25  1  2  4  24  Adrenalin  150  0.25  1  /  /  /  Adrenalin  300  0.25  1  /  /  /  Adrenalin  500  0.25  1  /  /  /  Pozitivna kontrola, H2O2 100  0.25  1  2  4  24  34 Tabela 1a. Prikaz primenjenih koncentracija adrenalina koje odgovaraju određenim dozama DOZE  KONCENTRACIJE  ADRENALINA(µΜ)  Fiziološki nivo kod čoveka  0.0005  50x fiziološki nivo  0.001  500x fiziološki nivo  0.01  Minimalna terapijska doza u  humanoj medicini  0.2  Srednja terapijska doza  1  Maksimalna terapijska doza  5  10x maksimalna terapijska doza  50  30x maksimalna terapijska doza  150  60x maksimalna terapijska doza  300  Tabela 2. Prikaz primenjenih koncentracija efedrina sa različitim vremenskim intervalima i inkubacije u Komet testu SUPSTANCE  KONCENTRACIJE  (µΜ)  VREME INKUBIRANJA  (sati)  Negativna kontrola,  PBS  /  0.25  1  2  4  24  Efedrin  0.0005  0.25  1  /  /  /  Efedrin  0.001  0.25  1  /  /  /  Efedrin   0.01  0.25  1  2  4  24  Efedrin  0.2  0.25  1  /  /  /  Efedrin  1  0.25  1  2  4  24  Efedrin  5  0.25  1  2  4  24  Efedrin  50  0.25  1  2  4  24  Efedrin   150  0.25  1  /  /  /  Efedrin  300  0.25  1  /  /  /  Efedrin  500  0.25  1  /  /  /  Pozitivna kontrola, H2O2 100  0.25  1  2  4  24  35 4.2.2. Određivanje broja i vijabilnosti ćelija Manualno ćelijsko brojanje i procena ćelijske vijabilnosti obavljeni su „Trypan Blue” testu u hemocitometru. 20 µL ćelijske suspenzije je pomešano sa 20 µL 0.4% boje Tripan plavo (Sigma) i inkubirano 5 min na sobnoj temperaturi, nakon čega je uzeto 10µl obojene suspenzije i stavljeno u komoru (Neubauer). Brojanje ćelija je izvršeno pod svetlosnim mikroskopom (Olympus, CX21) na uvećanju 40×. Da bi israživanje Komet testom bilo validno, neophodno je da vijabilnost ćelija bude najmanje 80%, dovoljno da se izbegnu citotoksični artefakti u testu (Henderson i sar. 1998). 4.2.3. Komet test Bazni Komet test je obavljen prema Sing-u i sar., (1988) i Tice i sar., (1991) uz neznatne modifikacije. Pre izvođenja eksperimenta mikroskopske pločice su premazane 1% agarozom agarozom normalne tačke topljenja (NMA) (Sigma, St. Louis, MO) i ostavljene na sobnoj temperaturi najmanje 48 sati kako bi se agaroza osušila. Suspenzije limfocita su inkubirane u rastvoru PBS sa različitim koncetracijama testiranih supstanci. Nakon tretmana, ćelijske suspenzije su centrifugirane na 2000 rpm, 5 min., i dobijeni ćelijski talog je pomešan sa jednakom količinom 1% agaroze niske tačke topljenja (LMPA) (Sigma, St. Louis, MO), a zatim naslojen na prethodno premazane mikroskopske pločice.Pločice se drže 5 minuta na 4°C kako bi agarozni sloj očvrsnuo, a nakon toga na pločice se nasloj treći sloj agaroze (0.5% LMPA). Nakon polimerizacije gela, pločice se potapaju u lizirajući rastvor (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris, 1% Triton X–100, 10% DMSO, pH 10) i ostave preko noći na 4°C. Sutradan, pločice se postavljaju u kadicu za horizontalnu gel elektroforezu i potapaju u hladni alkalni elektroforetski pufer (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH ≥ 13) da bi se omogućila denaturacija DNK. Nakon 30 min obavljena je elektroforeza pod sledećim uslovima: 25 V, 300 mA, 30 min. Svi navedeni 36 koraci su obavljeni u tamnoj prostoriji kako bi se sprečilo dodatno oštećenje DNK pod uticajem UV zračenja. Nakon završene elektroforeze pločice se ispiraju neutrališućim rastvorom (0,4 M Tris baza, pH 7.5) tri puta po 5 min. Pločice se zatim fiksiraju u hladnom metanolu, osuše na 55-60ºC i odlažu na suvom i do trenutka analize kometa. Kako bi se omogućila vizualizacija ćelija, osušene pločice se najpre potope 15 min u ledeno hladnu destilovanu vodu i zatim se svaka pločica boji sa 50 µL ethidijum bromida (20 µg/mL). 4.2.4. Analiza podataka Ćelije su posmatrane na Olympus BX 50 mikroskopu (Hamburg, Nemačka) korišćenjem fluorescentne svetlosti, talasne dužine 510-560 nm. Kod svakog donora i za svaku pojedinačnu koncentraciju analizirano je 100 nasumično odabranih ćelija tj. po 50 ćelija po pločici jer za svaku eksperimentalnu tačku postoje 2 pločice. Za kvalitativnu procenu ćelije su svrstane u pet kategorija (slika 9.) u zavisnosti od stepena DNK oštećenja : (A) bez oštećenja, <5%; (B) nizak nivo oštećenja, 5–20%; (C) srednji nivo oštećenja, 20–40%; (D) visok nivo oštećenja 40–95%; (E) potpuno oštećenje >95% (Anderson i sar., 1994). Kako bismo izvršili semi- kvantitativnu analizu podataka, vrednost DNK oštećenja sračunat i izražen preko TCS vrednosti (eng. Total Comet Scor)., pri čemu je TCS = 2×B + 3×C + 4×D + 5×E, gde B do E označavaju procente ćelija u okviru gore navedenih kategorija. 37 Slika 9. Različiti stepeni DNK oštećenja na humanim limfocitima u Komet testu A) neoštećena ćelija B) slabo oštećena ćelija C) srednje oštećena ćelija C) viskoko oštećena ćelija E) totalno oštećena ćelija (preuzeto iz Radakovic i sar., 2011, Acta Vet) 4.2.3. Statistička analiza Statistička obrada podataka je izvršena pomoću analize varijanse (ANOVA) praćene Tukey multiplim testom. Vrednost total komet skora (TCS) je data kao srednja vrednost±SEM. P vrednost od najmanje ≤ 0.05 se smatra statistički značajnom. 38 5. REZULTATI 5.1. Komet test kod limfocita čoveka izloženih dejstvu adrenalina Vijabilnost limfocita tretiranih adrenalinom u testu tripan plavim je bila veća od 90% čime su se stekli uslovi za dalja istraživanja. Analiza DNK oštećenja primenom Komet testa izvršena je na izolovanim humanim limfocitima izloženim širokom spektru koncentracija adrenalina (0.0005µM do 500 µM)  u vremenskim intervalima od 15, 60, 120, 240 minuta i 24 časa. Oštećenja DNK su predstavljena preko TCS vrednosti. Radi ispitivanja senzitivnosti testa korišćen je 100µM vodonik peroksid (H2O2) kao pozitivna kontrola koja je u svakom tretmanu pokazala visoko značajno oštećenje DNK (p 0.001) u odnosu na negativna kontrolu (PBS). Efekti adrenalina na oštećenja DNK u humanim limfocitima nakon 15 min. su sumirani u tabeli 3 i grafikonima 1 i 2. Uočava se trend povećanja DNK oštećenja sa povećanjem koncentracije testiranog kateholamina. Adrenalin je ispoljio najizraženiji efekat u oštećenju DNK nakon 15 minutnog tretmana, jer su sve koncentracije izuzev najniže (0.0005 µM, fiziološki nivo) statistički značajno indukovale DNK oštećenje u odnosu na netretirane ćelije (p0.01, p0.001). Procenat ćelija bez oštećenja u tretmanu adrenalina bio je u opsegu od 27% - 44%. Posebno su tretmani višim koncetracijama adrenalina (50 µM - 500µM) rezultovali u povećanom broju ćelija sa visokim stepenom DNK oštećenja - vrednost TCS je bila 1.4 do 1.9 puta veća od TCS vrednosti kontrole. 39 Analiza DNK oštećenja adrenalina nakon 60 min. je predstavljena je u tabeli 3 i na grafikonima 3 i 4. Koncentracije adrenalina od 0.001 µM do 1 µM nisu statistički značajno indukovale DNK oštećenja (p>0.05) u poređenju sa istim koncetracijama nakon kraćeg vremenskog intervala. Značajno povećenje TCS vrednosti tj. oštećenja DNK je uočeno pri koncentracijama adrenalina od 5 µM (maksimalna terapijska doza) do 300 µM (p<0.05), gde je procenat neoštećenih ćelija bio ispod 46%. Uočava se da najviša koncetracija adrenalina (500 µM) blago, ali statisitčki značajno oštećenja DNK u limfocitima (p<0.05), verovatno da je došlo do ukrštenih veza (engl. crosslinks) što je uzrokovalo smenjenje stepena migracije DNK. Efekti adrenalina na stepen DNK oštećenja u humanim limfocitima nakon 120 min. su predstavljeni u tabeli 3 i grafikonima 5 i 6. Nakon 120 minuta jasno se uočava veći nivo oštećenja DNK humanih limfocita sa porastom doze adrenalina. Koncentracije adrenalina od 0.01 i 1 µM indukovala su blaga oštećenja DNK, ali ne statistički značajna (p>0.05) u odnosu na kontrolu. Visoko značajna razlika u nivou DNK oštećenja (p0.001) je uočena u tretmanima adrenalinom od 50, 150 i 300 µM u odnosu na netretirane ćelije. Na višim koncetracijama adrenalina (50 µM – 300µM), 36% - 55% humanih limfocita nije pretrpelo DNK oštećenje. Koncetracija adrenalina od 300 µM je ispoljila najveći efekat, što se ogleda u najvećem broju ćelija sa jakim oštećenjem (21%, klasa D i E) u odnosu na ostale grupe. S druge strane, koncentracija adrenalina od 5 µM (maksimalna terapijska doza) dovela je do nešto slabijeg oštećenja DNK, koje je ipak bilo statistički značajno u odnosu na negativnu kontrolu (p 0.05). U tabeli 3 i na grafikonima 7 i 8 prikazan je efekat adrenalina nakon 240 min. na limfocitima čoveka. Adrenalin je ispoljio sličan efekat zavisno od doze kao i pri upola kraćem tretmanu. Tretamni adrenalinom od 0.01 i 1 µM nisu značajno uticale na migraciju DNK (p>0.05) u odnosu a netretirane ćelije. Koncetracije adrenalina od 5 µM do 300 µM su značajno indukovale oštećenje DNK (p0.001). Posebno su veće koncetracije adrenalina (150 µM i 300 µM) indukovale jako oštećenje u humanim limfocitima (17%, klasa D i E). 40 41 Efekat adrenalina na DNK oštećenja adrenalina u humanim limfocitima nakon 24 sata su predstavljeni u tabeli 3 i na grafikonima 9. i 10. Adrenalin je ispoljio najslabiji efekat posle jednodnevnog tretmana, jer su samo visoke koncetracije adrenalina od 150 i 300 µM indukovala značajno oštećenje DNK (p0.001). Tretmani visokim koncentracijama adrenalina (150 i 300 µM) uzrokovala su smanjenje procenta neoštećenih ćelija za 8% i 11.3%, a naročito se povećao procenat ćelija sa oštećenjem u klasi C i D. Tabela 3. Analiza DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon različitog vremena tretmana adrenalinom. KONCENTRACIJE VREME INKUBACIJE (X±SE) 0.25 h 1 h 2 h 4 h 24 h Negativna kontrola PBS 72.50±2.062 71.17±2.056 60.50±0.563 60.83±3,971 57.17±3,545 Adrenalin 0,0005 85.25±4.516 81.17±6.096 / / / 0,001 93.75±3.860** 91.50±5.182 / / / 0,01 91.75±4.990*** 94.83±6.720 61.50±0.719 61.17±1.276 56.33±0.881 0,2 99.00±4.143*** 96.67±5.352 / / / 1 104.50±3.979*** 99.17±6.353 63.33±1.229 69.67±2.936 57.50±0.718 5 106.00±3.317*** 102.20±7.115* 72.33±2.616* 75.33±3.048*** 60.33±1.054 50 122.00±3.742*** 105.30±6.365* 75.83±2.301** 92.50±2.680*** 61.00±1.366 150 130.00±3.582*** 106.20±11.58* 94.83±1.759** 104.50±2.778*** 64.83±1.302*** 300 134.50±1.848*** 119.00±9.471* 108.20±1.249** 116.70±1.626*** 66.67±1.116*** 500 136.30±2.287*** 02.50±2.349* / / / Pozitivna kontrola H2O2 199.0±8.010*** 188.0±1.025*** 195.50±7.279*** 189.30±4.595*** 189.30±4.344*** . *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 1. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 15 minuta. K 0,0 00 5 0,0 01 0,0 1 0,2 1 5 50 15 0 30 0 50 0 0 50 100 150 ************ ************** koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola ** p 0.01,***p 0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 2. Distribucija klasa kometa nakon15 minuta izlaganja adrenalinom. K – negativna kontrola, K+ - pozitvna kontrola **p 0.01, ***p  0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 3. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 60 minuta. K 0,0 00 5 0,0 01 0,0 1 0,2 1 5 50 15 0 30 0 50 0 0 50 100 150 * * * ** koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola * p 0.05 vs. negativna kontrola Grafikon 4. Distribucija klasa kometa nakon 60 minuta izlaganja adrenalinom K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola * p 0.05, ***p  0.001 vs. negativna kontrola 44 Grafikon 5. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 120 minuta. K 0,0 1 1 5 50 15 0 30 0 0 50 100 150 * *** *** *** koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola * p 0.05, ***p  0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 6. Distribucija klasa kometa nakon 120 minuta izlaganja adrenalinom K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola * p 0.05, ***p  0.001 vs. negativna kontrola 45 Grafikon 7. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 240 minuta. K 0,0 1 1 5 50 15 0 30 0 0 50 100 150 ********* *** koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola ***p  0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 8. Distribucija klasa kometa nakon 240 minuta izlaganja adrenalinom. K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola ***p  0.001 vs. negativna kontrola 46 Grafikon 9. Efekat adrenalina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 24 sata. K 0,0 1 1 5 50 15 0 30 0 0 20 40 60 80 ****** koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola ***p  0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 10. Distribucija klasa kometa nakon 24 sata izlaganja adrenalinom K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola ***p  0.001 vs. negativna kontrola 47 5.2. Efekti antioksidanasa na oštećenja DNK izazvana adrenalinom Kako bismo ispitivali moguće učešće ROS u ispoljavanju genotoksičnog efekta adrenalina uveli smo u Komet test antioksidanase katalazu i kvercetin. Efekti katalaze na indukciju DNK oštećenja pod dejstvom adrenalina nakon 15 minuta predstavljeni su u tabeli 4 i na grafikonima 11 i 12. Očekivano, humani limfociti su pretrpeli najveće oštećenje DNK (p<0.001) u tretmanu sa vodonik peroksidom (100 µM) kao pozitivnom kontrolom. Odabrana doza adrenalina od 300 µM je značajno indukovala DNK oštećenja u humanim limfocitima (p<0.001). U tretmanu sa adrenalinom 69.3% ćelija je pretrpelo DNK oštećenje. Nivo DNK oštećenja u humanim limfocitima je značajno smanjen (p<0.001) dodatkom katalaze (100 IU /mL) u odnosu na tretman samim adrenalinom. Procenat oštećenih limfocita tretiranih sa adrenalinom i katalazom je smanjen i iznosio je 44%. Visoko značajna razlika (p<0.001) u oštećenju DNK se uočava i u ko-tretmanu adrenlina i više konentracije katalaze 500 IU /mL u odnosu na efekat samog adrenalina. Uočava se doza efekat katalaze jer je pri višoj koncetraciji (500 IU/mL) antioksidant uzrokovao još uočljivije smanjenje oštećenih ćelija (38.6%). Efekti kvercetina na DNK oštećenja adrenalina nakon 15 minuta predstavljeni su u tabeli 4 i na grafikonima 11 i 13. Kvercetin je takođe ispoljio zaštitni efekat, jer je u tretmanu sa adrenalinom značajno smanjio oštećenje DNK u humanim limfocitima (p<0.001). Kvercetin (100 µM) je redukovao broj ćelija sa oštećenjem sa 69.3% na 51.3%. Značajno smanjenje DNK oštećenja (p<0.001) je uočeno i kod tretmana adrenalina sa kvercetinom veće koncetracije (500 µM), procenat oštećenih ćelija je smanjen za još 7.3%. U tabeli 5, grafikonu 14. i 15. prikazan je efekat katalaze na DNK oštećenja adrenalina nakon 60 minuta. Tretman sa adrenalinom (300 µM) je 48 značajno povećao oštećenje DNK u humanim limfocitima (p<0.001) u odnosu na netretirane ćelije. Humani limfociti su u tretmanu sa adrenalinom pretreli oštećenje od 66.6%. Pozitivna kontrola (H2O2, 100 µM) je uzrokovala uočljivo oštećenje DNK (83%). Nakon 60 min antioksidans katalaza (100 IU/mL) je značajno snizila (p<0.05) oštećenje DNK uzrokovano adrenalinom, smanjenjem broja oštećenih ćelija (41.6%). Trend značajnog smanjenja (p<0.01) DNK oštećenja sa povećanjem koncentracije katalaze (500 IU/mL) uočen i je nakon dužeg tretmana, jer je broj broj oštećenih ćelija je smanjen za još 5%. Efekti kvercetina na DNK oštećenja u humanim limfocitima u tretmanu sa adranalinom nakon 60 min. su prikazani u tabeli 5 i na grafikonima 14 i 16. Tretman adrenalina sa kvercetinom (100 µM) je pokazao trend smanjenja DNK ćelija u humanim limfocitima, ali nije dostignuta statistička značajnost (p>0.05). Međutim, na većoj koncentraciji kvercetin (500 µM) je značajno smanjio oštećenje DNK u humanim limfocitima (p<0.01). Procenat limfocita sa oštećenjem DNK dodatkom kvercetina je značajno smanjeno (35.6%). 49 Tabela 8. Efekat katalaze i kvercetina naspram DNK oštećenja adrenalina u limfocitima čoveka nakon 15 minuta. TRETMAN X ± SE S.D. Negativna kontrola PBS 64.00±1.571 3.847 ADR 300µM ADR 300µM + 100U/ml CAT ADR 300µM + 500U/ml CAT 126.30±1.783***. 92.33±1.256*** 86.17±1.797*** 4.367 3.077 4.401 ADR 300µM + 100 µM QUE 98.17±1.797***. 4.401 ADR 300µM + 500 µM QUE 91.17±1.078 *** 2.639 Pozitivna kontrola H2O2 182.50±4.193*** 10.27 ADR – adrenalin, CAT- katalaza, QUE- kvercetin . ***p<0.001 vs. adrenalin  Tabela 9. Efekat katalaze i kvercetina naspram DNK oštećenja adrenalina u limfocitima čoveka nakon 60 minuta. TRETMAN X ± SE S.D. Negativna kontrola PBS 74.00±4.817 11.800 ADR 300µM ADR 300µM + 100U/ml CAT ADR 300µM + 500U/ml CAT 123.00±3.173 95.33±6.988* 93.33±4.341** 7.772 17.120 10.630 ADR 300µM + 100 µM QUE 105.00±4.517 11.060 ADR 300µM + 500 µM QUE 88.83±5.540** 13.230 Pozitivna kontrola H2O2 177.7±1.687 *** 4.131 ADR – adrenalin, CAT- katalaza, QUE- kvercetin *p<0.05, **p<0.01,***p<0.001 vs. adrenalin  50 Grafikon 11. Antioksidativni efekat katalaze i kvercetina u tretmanu sa adrenalinom nakon 15 minuta K AD R AD R/ CA T1 00 AD R/ CA T5 00 AD R/ QU E1 00 AD R/ QU E5 00 0 50 100 150 *** *** *** *** negativna kontrola adrenalin adrenalin + katalaza 100 ili 500 IU/mL adrenalin + kvercetin 100 ili 500 µMTC S ***p<0.001 vs. adrenalin 51 Grafikon 12. Nivo DNK oštećenja u humanim limfocitima nakon 15 minuta delovanja katalaze u tretmanu sa adrenalinom K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola Grafikon 13. Nivo DNK oštećenja u humanim limfocitima nakon 15 minuta delovanja kvercetina u tretmanu sa adrenalinom K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrol 52 Grafikon 14. Antioksidativni efekat katalaze i kvercetina u tretmanu sa adrenalinom nakon 60 minuta K AD R AD R/ CA T1 00 AD R/ CA T5 00 AD R/ QU E1 00 AD R/ QU E5 00 0 50 100 150 ** *** negativna kontrola adrenalin adrenalin + katalaza 100 ili 500 IU/mL adrenalin + kvercetin 100 ili 500 µMTC S *p<0.05, **p<0.01 vs. adrenalin 53 Grafikon15. Nivo DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon 60 minuta delovanja katalaze u tretmanu sa adrenalinom K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola Grafikon 16. Nivo DNK oštećenja u u limfocitima čoveka nakon 60 minuta delovanja kvercetina u tretmanu sa adrenalinom K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola 54 55 5.3. Komet test kod limfocita čoveka izloženih dejstvu efedrina Širok spektar koncentracije efedrina (0.0005 μM do 500 μM) ispitan je u Komet testu na izolovanim humanim limfocitima u vremenskim intervalima od 15, 60, 120, 240 minuta i 24 časa. Sve primenjene koncetracije efedrina uzrokovale su manje od 10% citotoksičnosti u „Trypan Blue” testu, tako da su uslovi bili odgovarajući za detekciju DNK oštećenja. Efekti efedrina na oštećenja DNK u humanim limfocitima sumirani su u tabela 6 i grafikonima 17-26. Očekivano, pozitivna kontrola (100 μM H202) u svim vremenski intervalima je dala značajno povećanje DNK oštećenja (p<0.001), procenat neoštećenih ćelija je bio u opsegu od 22-32%. Statističkom analizom rezultata nije uočeno značajno povećanje stepena DNK oštećenja pod uticajem efedrina u humanim limfocitima u odnosu na negativnu kontrolu (p>0.05). Procenat humanih limfocita izloženih efedrinom koji nije pretrpeo oštećenje je bio u opsegu od 80-90%. Primećuje se da je jedino tretman efedrina na koncetraciji od 500 μM indukovao slabo, ali statisitički značajno oštećenje DNK nakon 15 minuta (p<0.05). Distribucija DNK oštećenja u ćelijama tretiranih sa 500 μM efedrina pokazuje blago povećanje procenta DNK oštećenja za svaku od četiri kategorije (B do E) koje je statistički značajno (p<0.05). Tabela 4. Analiza DNK oštećenja u limfocitima čoveka nakon različitog vremena tretmana efedrinom. KONCENTRACIJE VREME INKUBACIJE X±SE 0.25 h 1 h 2 h 4 h 24 h Negativna kontrola PBS 52.50±0.957 57.25±0.478 57.50±1.000 58.00±0.5774 56.25±1.109 Efedrin 0,0005 53.50±1.041 58.00±1.225 / / / 0,001 53.25±0.478 59.25±1.190 / / / 0,01 54.50±1.190 59.00±1.134 58.50±1.190 60.75±1.797 58.50±2.630 0,2 57.75±0.853 59.50±1.190 / / / 1 57.70±1.826 58.00±0.816 58.75±1.190 62.50±0.500 60.00±1.780 5 54.75±1.109 58.25±0.750 58.75±1.181 62.00±1.291 60.50±2.062 50 56.25±1.103 58.75±0.750 59.00±1.000 62.00±1.291 63.50±1.555 150 57.75±1.493 60.25±1.315 60.00±2.309 62.25±1.493 63.25±2.250 300 58.00±1.080 59.75±1.031 60.25±1.436 62.50±0.645 63.25±2.250 500 58.25±0,853* 59.00±0.707 / / / Pozitivna kontrola H2O2 189.00±3.000*** 184.5±2.784*** 183.50±2.255*** 191.30±3.521*** 173.30±3.705*** *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 17. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 15 minuta. K 0,0 00 5 0,0 01 0,0 1 0,2 1 5 50 15 0 30 0 50 0 0 20 40 60 80 koncentracije (µM) * TC S K – negativna kontrola p*<0.05 vs. negativna kontrola Grafikon 18. Distribucija klasa kometa nakon 15 minuta izlaganja efedrinom. K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola p*<0.05, ***p  0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 19. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 60 minuta. K 0,0 00 5 0,0 01 0,0 1 0,2 1 5 50 15 0 30 0 50 0 0 20 40 60 80 koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola Grafikon 20. Distribucija klasa kometa nakon 60 minuta izlaganja efedrinom. K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola ***p  0.001 vs. negativna kontrola 58 Grafikon 21. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 120 minuta. K 0,0 1 1 5 50 15 0 30 0 0 20 40 60 80 koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola Grafikon 22. Distribucija klasa kometa nakon 120 minuta izlaganja efedrinom. K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola ***p  0.001 vs. negativna kontrola 59 Grafikon 23. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 240 minuta. K 0,0 1 1 5 50 15 0 30 0 0 20 40 60 80 koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola Grafikon 24. Distribucija klasa kometa nakon 240 minuta izlaganja efedrinom. – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola K ***p  0.001 vs. negativna kontrola 60 Grafikon 24. Efekat efedrina na DNK oštećenje u limfocitima čoveka nakon 24 sata. K 0,0 1 1 5 50 15 0 30 0 0 20 40 60 80 koncentracije (µM) TC S K – negativna kontrola Grafikon 26. Distribucija klasa kometa nakon 24 sata izlaganja efedrinom. K – negativna kontrola, K+ - pozitivna kontrola ***p  0.001 vs. negativna kontrola 61 5.4. Efekti inhibitora reparacije na oštećenja DNK u prisustvu efedrina Rezultati efekata inhibitora reparacije (AraC i HU) na humanim limfocitima u prisustv C i HU) na humanim limfocitima u prisustv Sličan efekat su ispoljili AraC i HU većih koncetracija (40 μM i 4000 μM). Analiza u efedrina nakon 15 min. predstavljeni su tabeli 7 i grafikonima 27 i 29. Sam efedrin (1, 50, i 300 µM) nije indukovao značajno povećanje oštećenja DNK u humanim limfocitima (p>0.05). Procenat ćelija bez oštećenja je bio u opsegu od 79% do 85%. Pozitivna kontrola (vodonik peroksid) je indukovala najveći stepen oštećenja DNK (p<0.001), 74% ćelija pretrpelo je oštećenje DNK. Rezultati efekata inhibitora reparacije (Ara u efedrina predstavljeni su tabeli 7 grafikonu 27 i 29. Statističkom analizom utvrđeno je da istovremeni tretman efedrinom (1, 50, i 300 µM) sa inhibitorima reparacije indukuju povećanje oštećenja DNK u odnosu na netretirane ćelije. U tretmanu inhibitora reparacije (20 µM AraC i HU 2000 µM) i efedrina viših koncentracija (50 i 300 µM) znatno je povećeno oštećenje DNK (p<0.01) što je rezultovalo u smanjenju broja ćelija bez oštećenja za 25 i 27% uslovilo povećanje procenata oštećenih ćelija paralelno u svim kategorijama (B-E). Dok su AraC i HU (20 µM i 2000 µM) ispoljili slabiji efekat (19%) u kotretmanu sa efedrinom niske koncetracije (1 µM) u poređenju sa netretiranim ćelijma (p<0.01). Nivo oštećenja DNK u ćelijama tretiranih efedrinom nisu se značajno razlikovala u odnosu na oštećenja ćelija tretiranih efedrinom i AraC i HU (20 µM i 2000 µM). Međutim, uočena je statistički značajna razlika u stepenu DNK oštećenja između negativne kontrole sa i bez prisustva inhibitora reparacije (p<0.05). Kod limfocita tretiranih inhibitorima reparacije došlo je do povećanja procenta ćelija naročito u kategorija B i C. DNK oštećenje efedrina sa i bez prisustva inhibitora reparacije prikazan je u tabeli 7 i na grafikonima 28 i 30. AraC i HU (40 μM i 4000 μM) u prisustvu efedrina indukovali su statstički značajno povećanje migracije DNK u odnosu na negativnu kontrolu (p<0.01). U tretmanu AraC i HU (40 μM i 4000 μM) i efedrina (300 µM) procenat neoštećenih ćelija je redukovan za 29% odnosno za 25 i 14% u tretmanu sa 62 efedrinom nižih koncetracija (1 i 50 µM) u odnosu na netretirane ćelije. Uočava se da je kotretman negativne kontrole sa AraC (40 µM) i HU (4000 µM) doveo do statističkog značajnog povećanja DNK oštećenja u odnosu na negativnu kontrolu (p<0.05) Rezultati efekata inhibitora reparacije nižih koncetracija (20 µM AraC i 2000 µM ni efedrina sa inhibitorima reparacije indukuju (20µM Za razliku od kraćeg tretmana, nakon 60 min. uočava da su AraC i Hu (20µM i mfoci HU) na limfocitima čoveka u prisustvu efedrina nakon 60 min. su predstavljeni u tabeli 8 i grafikonima 31 i 33. Limfociti čoveka izloženi efedrinu nisu ispoljili značajno povećanje oštećenja DNK u odnosu na netretirane ćelije (p>0.05). Procenat ćelija koje nisu pretrpele oštećenje bile su u opsegu od 83-87%. Najveći stepen oštećenja DNK indukovala je pozitivna kontrola odnosno vodonik peroksid (p<0.001), pri čemu je 79% ćelija je pretrpelo oštećenje DNK. Rezultati ukazuju da tretma AraC i 2000HU µM) značajno povećanje DNK oštećenja u odnosu na ćelije koje nisu tretirane datim alkaloidom i inhibitorima (p<0.001). Tretman sa 300 µM efedrina u prisustvu AraC i HU dovodi do smanjenja broja neoštećenih ćelija za 20% i povećanja procenata ćelija sa većim stepenom oštećenja. S druge strane tretmani efedrina nižim koncetracijama (1 µM i 50 µM) uticali na smanjenje broja neoštećenih ćelija za 16 %. 2000 HU) u tretmanu sa efedrinom ispoljili značajno povećanje (p<0.001) oštećenja DNK u odnosu na efekat samog efedrina. Limfociti koji su izloženi efedrinu (300 µM) pretrpeli su povećano oštećenje DNK u prisustvu AraC i HU - broj neoštećenih ćelija sa smanjio za 12% u odnosu na tretman sa samim efedrinom. Sličan efekat su ispoljili AraC i HU sa efedrinom nižih koncetracija (1 µM i 50 µM), smanenjem broja neoštećenih ćelija za 11% odnosno 14 %. Uz to, kotretman negativne kontrole sa AraC i HU doveo je do statističkog značajnog povećanja DNK oštećenja (p<0.001) u odnosu na kontrolu. Efekti inhibitora reparacije viših koncetracija (40µM AraC i 4000 µM HU) na li tima čoveka u prisustvu efedrina predstavljeni su u tabeli 8, grafikonu 32 i 34. Kotretmani efedrina sa AraC i HU viših koncetracija (40µM AraC i 4000 µM HU) takođe indukuju značajno povećanje oštećenja DNK (p<0.001) u odnosu na netretirane ćelije. Uočava se da sa povećanjem koncetracije AraC i HU broj neoštećenih ćelija smanjuje. Najveći efekat je ispoljio tretmana efedrina (300 µM) sa AraC i HU jer je broj neoštećenih ćelija opao za 22%. Tretmani efedrina nižih koncetracija (1 µM i 50 µM) sa 63 AraC i HU uticali su na smanjenje broja ćelija neoštećenih ćelija za 16 % tj. 18 % u odnosu na netretirane ćelije. Takođe, postoje značajne razlike (p<0.001) u nivou DNK oštećenja između tretmana efedrina (1, 50, i 300 µM) sa i bez prisustva AraC i HU. AraC i Hu (40µM i 4000 HU) u tretamanu sa efedrinom (300 µM) indukovali su povećanje oštećenja DNK, povećan je procenat ćelija u svim klasama (B-E ) što se odrazilo i na smanjenje broja neoštećenih ćelija za 18%. Nešto slabije, ali takođe značajan efekat su ispoljili i tretmani AraC i Hu i efedrina nižih koncetracija. Procenat neoštećenih ćelija je u tretmanu sa AraC i Hu smanjen za 15 odnosno 16% u odnosu na efekat tretmana bez prisustva AraC i Hu. Na kraju, kotretman negativne kontrole sa AraC i HU indukovao značajnu migraciju DNK (p<0.001) u odnosu na kontrolu. 64 Tabela 7. Analiza DNK oštećenje na limfocitima čoveka nakon 15 minuta tretmana efedrina i DNK inhibitora reparacije (citozin arabinoza i hidrokisiurea) TRETMAN X ± SE S.D. Negativna kontrola (K) K + AraC (20μM) i HU (2000 μM) K + AraC (40μM) i HU (4000 μM) 66.33±0.802 71.17±2.583* 72.33±0.988* 1.966 6.338 2.422 Efedrin 1µM (EF 1) EF1 + AraC (20μM) i HU (2000 μM) EF1 + AraC (40μM) i HU (4000 μM) 69.50±1.708 73.83±0.654* 75.50±0.806** 2.383 3.545 1.975 Efedrin 50µM (EF 50) EF50 + AraC (20μM) i HU (2000 μM) EF50 + AraC (40μM) i HU (4000 μM) 70.00±1.862 74.50±0.652** 75.33±2.142** 4.561 1.378 5.203 Efedrin 300µM (EF 300) EF300 + AraC (20μM) i HU (2000μM) EF300 + AraC (40μM) i HU (4000μM) 70.33±1.687 74.83±0.473** 76.33±0.404** 2,098 1,169 0,983 Pozitivna kontrola H2O2 175.00±3.376*** 8,270 AraC – citozin arabinoza, HU- hidroksiurea *p<0.05, **p<0.01 , ***p<0.001 vs. negativna kontrola 65 Tabela 8. Analiza DNK oštećenje na limfocitima čoveka nakon 60 minuta tretmana efedrina i DNK inhibitora reparacije (citozin arabinoza i hidrokisiurea) TRETMAN X ± SE S.D. Negativnakontrola (K) K + AraC (20μM) i HU (2000 μM) K + AraC (40μM) i HU (4000 μM) 58.50±0.500 68.75±0.853*** 69.75±0.853*** 1.000 1.708 1.708 Efedrin 1µM (EF 1) EF1 + AraC (20μM) i HU (2000 μM) EF1 + AraC (40μM) i HU (4000 μM) 59.75±0.750 73.25±0.478*** 73.50±0.288*** 1.500 0.957 0.577 Efedrin 50µM (EF 50) EF50 + AraC (20μM) i HU (2000 μM) EF50 + AraC (40μM) i HU (4000 μM) 61.75±0.478 75.25±1.031*** 74.75±2.136*** 0.957 2.062 4.272 Efedrin 300µM (EF 300) EF300 + AraC (20μM) i HU (2000 μM) EF300 + AraC (40μM) i HU (4000 μM) 62.50±1.041 76.25±1.250*** 76.50±0.652*** 2.082 2.500 2.065 Pozitivna kontrola H2O2 179.30±2.323** 4.646 AraC – citozin arabinoza, HU- hidroksiurea *** p<0.001 vs. negativna kontrola 66 Grafikon 27. Efekat citozin arabinoze (20 µM) i hidrokisiuree (2000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 15 minuta K K inh EF 1 EF 1 i nh EF 50 EF 50 in h EF 30 0 EF 30 0 i nh 0 20 40 60 80 100 negativna kontrola neg.kont + inhib.reparacije efedrin (1, 5, 300 µM) efedrin + inhib.reparacije ****** TC S *p  0.05, **p  0.01 vs. negativna kontrola 67 Grafikon 28. Efekat citozin arabinoze (40 µM) i hidrokisiuree (4000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 15 minuta K K inh EF 1 EF 1 i nh EF 50 EF 50 in h EF 30 0 EF 30 0 i nh 0 20 40 60 80 100 negativna kontrola neg.kont + inhib.reparacije efedrin (1, 5, 300 µM) efedrin + inhib.reparacije * ** ** ** TC S *p  0.05, **p  0.01 68 Grafikon 29. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 15 minuta u limfocitima čoveka sa i bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 20μM i HU 2000 μM) *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 30. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 15 minuta u humanim limfocitima sa i bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 40μM i HU 4000 μM) *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. negativna kontrola 69 Grafikon 31. Efekat citozin a ree (2000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 60 minuta rabinoze (20 µM) i hidrokisiu C C inh EF 1 EF 1 i nh EF 50 EF 50 in h EF 30 0 EF 30 0 i nh 0 20 40 60 80 100 negativna kontrola negativna kontrola efedrin (1, 5, 300 µM) efedrin + inhib.reparacije *** *** *** *** TC S ***p<0.001 vs. negativna kontrola 70 Grafikon 32. Efekat citozin a ree (4000 µM) u tretmanu sa efedrinom nakon 60 minuta rabinoze (40 µM) i hidrokisiu C C inh EF 1 EF 1 i nh EF 50 EF 50 in h EF 30 0 EF 30 0 i nh 0 20 40 60 80 100 negativna kontrola neg.kont + inhib.reparacije efedrin (1, 5, 300 µM) efedrin + inhib.reparacije ****** *** *** TC S ***p<0.001 vs. negativna kontrola 71 Grafikon bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 20μM i HU 2000 μM) 33. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 60 minuta u limfocitima čoveka sa i ***p<0.001 vs. negativna kontrola Grafikon 3 citima sa i bez prisustva inhibitorima reparacije (Arac 40μM i HU 4000 μM) 4. Nivo DNK oštećenja efedrina nakon 60 minuta u humanim limfo ***p<0.001 vs. negativna kontrola 72 6. DISKUSIJA ncijalnog genotoksičnog dejstva adrenalina i efedrina, u Komet test smo sidanse (katalaza i kvercetin) i inhibitore reparacije (citozin arabinozu i hudruksiureu). .1. Ispitivanja Komet testom na i noradrenalina u 3T3 ćelijama pacova u Komet testu. Cilj ove doktorske teze bio je da utvrdimo stepen primarnih oštećenja DNK u humanim limfocitima pod dejstvom adrenalina i efedrina. Evaluacija potencijalnog DNK oštećujućeg efekta adrenalina i efedrina obavljena je primenom Komet testa, veoma senzitivne metode u detekciji genotoksičnosti potencijalnih mutagena ili genotokičnih kancerogena na nivou ćelija (Sasaki i sar., 2000). Kako bismo preciznije utvrdili mehanizme pote uveli antiok 6 U našem eksperimentu kulture humanih limfocita podvrgnute širokom spektru koncentracija adrenalina (0.0005µM-500µM) pokazale su značajan porast TCS vrednosti u odnosu na kontrolu, ukazujući na povećano oštećenje DNK sa porastom koncentracije datog kateholamina. Ovi rezultati ukazuju da adrenalin indukuje DNK oštećenja u humanim limfocitima merenim Komet testom što je u saglasnosti sa istraživanjima Flint i sar. (2007) koji su ispitivali efekat stres hormona (adrenalina, noradrenalina i kortizola) na stepen oštećenja DNK u prekanceroznim 3T3 ćelijama u Komet testu. Adrenalin je u koncetraciji koja odgovara fiziološkom povećanju ovog hormona tokom akutnog stresa (10-7 M) značajno indukovao DNK oštećenje već nakon 10 minuta. Dok je u našem istraživanju takođe u veoma kratkom vremenskom periodu (15 min.) sto puta manja koncetracija adrenalina (10- 9M) ispoljila genotoksičan efekat, što je značajan podatak s obzirom da smo izvršili testiranje na humanim limfocitima. Isti autori su ispitivali efekte 24-časovnog izlaganja adrenali 73 Zabeleženo je značajno povećanje DNK oštećenja što je takođe u skladu sa našim rezultatima (Flin i sar., 2012). Na potencijalni genotoksičan efekat adrenalina ukazali su i drugi autori. U testu fluorescentne analize neodmotane DNK adrenalin je indukovao jednolančane prekide DNK u humanim leukocitima (Crespo i Bicho, 1995). Slično tome, rezultati Miura i sar. (2000) ukazali su da adrenalin i noradrenalin indukuju jednolančane prekide u plazmidnoj DNK u prisustvu ADP-Fe3+. Genotoksičan efekat adrenalina ispitivan je i u ent izveden u kulturi, a ne na prečišćenim limfocitima. Naime, u krvi odgovornih za reparacione 0 ćelijskog ciklusa, dok veći DNK reparacion kapacitet postoji ulaskom ćelije u G1 fazu bakterijskim test sistemima u kojima je adrenalin indukovao mutageni efekat (Murakami i sar., 1979; Yamaguchi, 1991). Međutim, postoje radovi koji ukazuju da nije došlo do ispoljavanja mutagenog efekta adrenalina. Adrenalin nije ispoljio genotoksični efekat analizom hromozoma u kulturi humanih limfocita (Djelić i sar., 2003). Negativan rezultat je verovatno posledica toga što je eksperim postoje antioksidativni enzimi katalaza i glutation peroksidaza koji eliminišu slobodne radikale kiseonika. Radi sagledavanja vremenske kinetike pojave oštećenja DNK pratili smo dejstvo adrenalina na humane limfocite tretirane 15, 60, 120, 240 min i 24 sata. Na osnovu trenda distribucije DNK oštećenja u humanim limfocitima indukcija DNK oštećenja adrenalina opada sa vremenom. Efekat adrenalina na stepen oštećenja DNK je opadao s vremenom. Humani limfociti tretirani adrenalinom nakon 15 min su pretrpeli značajno oštećenje DNK u svim koncetracijama, jedino fiziološka koncentracija od 0,0005 µM nije indukovala značajno oštećenje DNK. Posebno su koncentracije adrenalina od 5, 50, 150 i 300 µM imale značajnog udela u oštećenju DNK jer su dale pozitivan odgovor u svim vremeskim intervalima sem kod jednodnevnevnog tretmana gde je ispoljen najslabiji efekat, tj. jedino su koncetracije od 150 i 300 µM indukovale značajno oštećenje DNK. Ispoljeno DNK oštećenje verovatno je posledica ograničenog kapaciteta enzimske popravke u humanim limfocitima. Limfociti poseduju slab kapacitet popravke zbog niske aktivnosti enzima procese (Scudiero i sar., 1976). U našem eksperimentu u većini tretmana (15, 60, 120, 240 min.) limfociti su se nalazili u G fazi nakon 20 sati što je moglo da doprinese slabijem DNK oštećujućem efektu adrenalina nakon 24 sata. 74 Za razliku od adrenalina, tretmani efedrinom (u opsegu od 0.0005 μM do 500 μM) nisu ispoljili povećano DNK oštećenje u Komet testu. Samo je koncetracija efedrina od 500 μM ispoljila slabo, ali statistički značajno (p<0.05) povećanje oštećenja DNK u humanim limfocitima nakon 15 minuta tretmana. Efedrin kao i kateholamini poseduje direktnu adrenergičku aktivnost vezivanjem za odgovarajuće receptore. Postoje dokazi koji ukazuju da adrenalin i noradrenalin indukuju oštećenja DNK transudukcionim signalnim putem, s obzirom da je antagonist β-adrenergičkog receptora propranolol đe, u kulturama ovarijalnih ćelija kineskog hrčka, efedrin nije indukovao razmene sestrinskih hromatida (SCE) i hromozomske vira limfocite putem α- drenergične aktivnosti koja nema inhibitorni efekat na ćelije. Ovaj podatak može biti osebno značajan u imunologiji tumora (Zvetkova i sar., 1979). blokirao efekte adrenalina i noradrenalina (Flint i sar., 2007). Pretpostavljamo da je efedrin na sličan način indukovao povećano oštećenje DNK. Odsustvo genotoksičnog efekta efedrina dobijeno u ovom proučavanju je u saglasnosti sa rezultatima genotoksikoloških istraživanja efedrina i ekstrakata efedre. Efedrin nije ispoljio genotoksičan efekat u bakterijskim test sistemima (Brambila i Martelli, 2009; Morimoto i sar., 1982) Tako aberacije (NTP, 1986; Hillard i sar., 1998). Iako efedrin nije ispoljio genotoksičan efekat u različitim test sistemima, potencijalna citotoksična aktivnost efedrina je zabeležena u ćelijskim linijama neuroblastoma miševa i humanih hepatoblastoma (Lee i sar., 2000; Fukushima, 2004). S druge strane, Attard i Vella (2009) zabeležili su da efedrin alkaloidi poseduju stimulatornu efekat, pre nego citotoksičan efekat na humanim limfocitima. Smatra se da je β-hidroksilni prsten posebno važan za β-adrenergičnu aktivnost (Ruffolo i sar. 2005) koja deluje inhibitorno na ćelije uključujući limfocite. Pošto efedrin ne poseduje hidroksilnu grupu u svojoj strukturi smatra se da efedrin akti a p 75 6 Uticaj antioksidanasa na genotoksični efekat adrenalina Uvidom u literaturne podatake o značaju ROS u oštećenju DNK pod uticajem kateholamina, verujemo da slobodni radikali mogu .2. da igraju bitnu ulogu u ispoljavanju st kvercetina anim ateholamina čini ova jedinjenja idealnim za ključi efekata kateholamina istakli ačaj genotoksičnih efekata adrenalina. Kako bismo potvrdili našu hipotezu tj. ispitali mehanizam i identifikovali učešće ROS u DNK oštećenju posredovanom adrenalinom upotrebili smo antioksidanasa katalazu i kvercetin. Rezutati dobijeni Komet testom primenom antioksidanasa ukazuju da adrenalin može dovesti do stvaranja ROS koji oštećuju DNK, s obzirom da su katalaza i kvercetin umanjili štetne efekte adrenalina. Katalaza je pokazala jasan dozno-zavistan protektivan efekat na humanim limfocitima što ukazuje na učešće ROS u DNK oštećenju. Kvercetin kao jedan od uspešnih hvatača OH• je takođe značajno redukovao DNK oštećenje izazvano adrenalinom, ali je nakon dužeg tretmana sa adrenalinom, aktivno opala. Verovatno da se tokom produženog vremena inkubacije kvercetin metabolisao u manje efektivnu formu putem citohrom P450 oksidacionog sistema (Sousa i sar., 1985; Obermeier i sar., 1995) što se odrazilo u manjem broju neoštećenih ćelija. Naši rezultati su saglasni sa rezultatima Crespo i Bicho (1995) u kome su katalaza i superoksid dismutaza smanjili nivo oštećenja DNK pod uticajem adrenalina u hum leukocitima. Takođe, rezultati Miura i sar. (2000) u kojima je katalaza ispoljila zaštitini efekat protiv gentoksičnog dejestva adrenalina i noradrenalina potvrđuju značajan doprinos ROS u ispoljavanju genotoksičnih efekata kateholamina. Na osnovu naših rezultata i dostupnih podataka možemo zaključiti da bitnu ulogu u ispoljavanju genotoksičnosti adrenalina mogu imati reaktivni derivati kiseonika. Očigledno je da hemijska struktura k u vanje u redoks cikluse. Adrenalin u svojoj strukturi poseduje kateholni prsten koji zbog nestabilne prirode može lako da oksiduje do semihinona i hinona pri čemu nastaju ROS koji mogu oštetiti DNK (slika 10). McGregor i sar. (1988) su ispitivanjem mutagenih zn prisustva kateholne grupe u ispoljavanju štetnih efekata kateholamina. Autori 76 smatraju da fenolne grupe nisu mutagene, ali je dodatak druge hidroksilne grupe koja stvara katehol, dovoljan za ispoljavanje mutagenog efekta. Da kateholna grupa može biti važna u ispoljavanju biološke aktivnosti ukazuju nam i eksperimentalni podaci ispitivanja genetoksičnog efekta efedrina koji su provedeni u našem istraživanju. Iako efedrin poseduje sličnu hemijsku strukturu kao a lkaloid nije ispol notoksičan efekat. Raz žemo tražiti u odsustvu kateholne grupe za koju se smatra da je odgovorna u ispoljavanju genotoksičnih efekata kateholamina. s drenalin, ispitani a jio značajan ge loge mo H2O2 OH + OH ). OH u reakciji sa bazama i šećernom komponentom DNK može da dovede do oksidacije baza ili prekida DNK koja se eksprimira u Komet testu u vidu komete sa KATEHOLAMIN SEMIHINON HINON SOD OH· OKSIDATIVNO OŠTEĆENJE DNK Slika 10. Predloženi put nastanka oksidativnog oštećenja DNK Naši rezultati sugerišu da značajnu ulogu u nastanku oštećenja DNK igra stvaranje vodonik peroksida, s obzirom da katalaza značajno umanjuje štetne efekte adrenalina zapažene u ovim istraživanjima. DNK oštećenje je verovatno uzrokovano nastankom visoko reaktivnog hidroksil radikala (OH•) iz vodonik peroksida u Fenton ili Haber-Weiss-ovoj reakaciji (Fe2+ + H2O2→ Fe3+ + OH- + OH•; O2•- + H2O2 → O2 + - • • KOVALENTNO VEZIVANJE DNK 77 repom (DNK koja je migrirala). Superoksidni anion (O2•-) koji takođe nastaje pri okisidativnom metabolizmu u reakciji sa vodonik peroksidom može biti konvertovan u OH• i odre sami se utaza i glutation peroksidaza. Usled narušene ravnoteže između nastanka ROS i antioksidativnog zaštitinog sistem ponenti kao što su lipidi, proteini i aviti kod hipoglikemije, fizičke aktivnosti, hemoragijske hipotenzije kao i kod patoloških anku oksidativnog stresa. Pretpostavka je da su primenjene koncentracije adrenalina uslovile povećanje oksidativnog metabolizma i nastanka veće đenim uslovima može stimulisati dalju oksidaciju kateholamina. Međutim i mihinoni i hinoni takođe mogu oštetiti DNK i doprineti stvaranju ROS (Cavalieri i sar., 2002). Treba naglasiti da se pod normalnim okolnostima nivo ROS održava pod kontrolom zahvaljujući aktivnosti antioksidativnih enzima kao što su katalaza, superoksid dismum a dolazi do stanja koji se naziva oksidativni stres. Oksidativni stres doprinosi oštećenju ćelijskih kom DNK. Postavlja se pitanje pod kakvim okolnostima nastaje oksidativni stres koji vodi oštećenju DNK u odgovoru na kateholamine? Fiziološki nivo adrenalina u plazmi je u nanomolarnom opsegu. Međutim, visoke koncetracije se mogu j stanja kao što su infarkt miokarda i cirkulatori šok u kojima se nivo adrenalina može povećati i do 100 puta (Goldstein i ar., 2003; Kjaer, 1998; Grossman, 1998; ) U normalnim uslovima katabolizam kateholamina uključuje oksidativnu deaminaciju, O-metilaciju i konjugaciju. Kada je visok nivo kateholamina prisutan u cirkulaciji enzimi katabolizma gube na efikasnosti i pokreće se proces autooksidacije koji predstvalja inicijalni događaj u seriji slobodno radikalskih reakcija vodeći do povećanja reaktivnih intermedijera i nast količine ROS čije povećane vrednosti nisu eliminisane zbog nedovoljnog antioksidativnog kapaciteta. Postoje mnogobrojni nalazi koji ističu značaj ROS u patogenezi bolesti ukazujući da stvorene reaktivne kiseonične vrste mogu uticati na razvoj bolesti, odnosno da je jedan od faktora u etiologiji oksidativni stres. Produkti redoks ciklusa adrenalina su zabeleženi u srcu, skeletnim mišićima, jetri i krvi (Dhalla i sar., 2001). U vezi s tim, osobe koje imaju visoko koncentracije adrenalina kao što su srčani bolesnici gde su zabeležene 78 vrednosti od 20-58 nM (Raymondos i sar., 2000) ili osobe koji boluju od feohromacitoma (11 nM) (Hegedus, 2000) mogu biti skloniji povećanom oštećenju DNK na osnovu naših dobijenih rezultata gde je adrenalin indukovao oštećenje pri koncentracijama od 1nM do 5×105 nM. S obzirom da ROS imaju sposobnost da uzrokuju oštećenje DNK i promene ekspresiju gena stvara se mogućnost da budu uključeni u sve korake kancerogeneze (Burcham h efekata kateholamina, rezultati dobijeni u našem istraživanju pokazuju da katalaza u kotretm i β arestin, aktivira DNK oštećenje i suprimira nivo p53 gena i time sinergisti nergične aktivacije adrenalin stimuliše proliferaciju kanceroznih skvam 1998). Oksidovane DNK baze imaju sposobnost da indukuju mutacije koje aktiviraju protoonkogene čime dolazi do ćelijske transformacije (Behrend i sar., 2003; Wu i sar., 2004). Iako većina navedenih radova ističe značajan uticaj oksidativnog metablizma u ispoljavanju genotoksični anu sa adrenalinom nije redukovala nivo DNK oštećenja do nivoa negativne kontrole što ukazuje da postoje drugi mehanizmi kojim adrenalin indukuje DNK oštećenje Flint i sar., (2007) smatraju da hormoni stresa (adrenalin, noradrenlin i kortizol) indukuju oštećenje DNK vezivanjem za receptore što vodi aktivaciji određenih gena koji su uključeni u ispoljavanje mutagenih efekata. Naime, hormoni stresa indukuju DNK oštećenje na molekularnom nivou, sprečavajući ulazak ćelije u apoptozu kao i zaustavljanje ćelijskog ciklusa što doprinosi transformaciji ćelija. Međutim, tačan mehanizam kojim se DNK oštećenja javljaju u odgovoru na stres je nepoznat. Hara i sar. (2011) pretpostavljaju da adrenalin signalnim putem preko β adrenoreceptora deluju na Gs-PKA kompleks čki dovodi do akumulacije DNK oštećenja. Ovi nalazi navode na zaključak da je adrenalin značajan medijator stresa koji utiče na genomsku nestabilnost i osetljivost za nastanak tumora. Pored genotoksičnog efekta adrenalin može mehanizmom transdukcije signalnih puteva da podstakne kancerogenezu s obzirom da mnoge ćelije kancera na svojoj površini poseduju adrenergičke receptore. Nađeno je da adrenalin utiče na invazivni potencijal tumorskih ćelija jajnika putem β-adrenergične regulacije MMP proteina (Waldum i sar., 1998). Takođe, putem β- adre oznih ćelija jednjaka (Liu i sar., 2008). Kod ćelija kancera dojke i debelog creva adrenalin je indukovao hemorezistenciju preko α-adrenergičkih receptora (Su i sar., 2005; Yao i sar., 2009). 79 Naše in vitro istraživanje ukazuje da je adrenalin uticao na povećanje stepana oštećenja DNK u humanim limfocitima. Međutim, kako bismo dobili što potpuniju sliku o uticaju adrenalina na pojavu oštećenja DNK neohodno je izvršiti evaluaciju na različit vne prirode, zbog pozitivnog odgovora antioksidanasa, na osnovu dobijenog reziltata ne možemo tačno definisati mehanizam delovanja adrenalina zbog čega su neophodna dalja ispitivanja koje bi omogućila bolje sagledavanje mehanizma 6.3. da se poprave mehnanizmima popravke DNK, u Komet test smo uveli inhibitore reparacije (citozin arabinozid stojanje povećanog DNK oštećenja u humanim limfocitima tretiranih inihibitorima reparacije im tipovima ćelija zbog razlike u prolifercionim statusu i metabičkom kapacitetu među ćelijama, što utiče na njihovu sposobnosti reparacije, a time i na krajnji efekat adrenalina. Iako ovo istraživanje ukazuje da adrenalin indukuje DNK oštećenja koja su dobrim delom oksidati delovanja adrenalina. Uticaj inhibitora reparacije u prisustvu efedrina Kako bismo ispitali da li efedrin dovodi do oštećenja DNK u humanim limfocitima koja mogu i hidroksiureu). AraC deluje inhibiranjem DNK sinteze i koraka ligacije dok HU inhibira ribonukleotid reduktazu u popravci DNK (Martin i sar., 1999). U našem eksperimentu upotreba AraC i HU bez prisustva efedrina nakon 15 minuta rezultovalo je u značajnom povećanju oštećenja DNK, sugerišući na prisustvo endogenog DNK oštećenja u ćelijama što su zabeležili Ori i sar., 2005 i Guerci i sar., 2009. Po verovatno je rezultat nepopravljenog DNK oštećenja. Međutim, značajna migracija DNK nije uočena kod limfocita tretiranih različitim koncentracijama efedrina. Dodatkom inibitora reparacije DNK u kulturi humanih limfocita izloženih efedrinom (1, 50 i 300 µM) dovelo je do značajnog povećanja oštećenja DNK nakon 15 minuta. Postojanje reparacionih procesa u humanim limfocitima je očigledno zato što je tretman efedrinom (1, 50 i 300 µM) i inhibitorima reparacije (AraC i HU) rezultovalo u povećanju prekida DNK tj. inhibiciji DNK popravke što se manifestovalo povećanom 80 vrednosti TCS-a u odnosu na netretirane ćelije. Viši nivo DNK oštećenja zabeležen je prilikom tretmana efedrina i viših koncetracijam inhibitora (40 µM AraC+ 4000 µM HU), a naročito je izražena razlika između tretmana efedrina (1 µM) i viših koncetracija inhibitora u odnosu na isti tretman sa nižim koncentracijam AraC i HU. Nesumnjivo je da remena inkubacije (60 min.) takođe se uočava prisustvo endogenog ošte i inhibitora reparacije nakon produženog tretmana. AraC i HU su pokazali efekat zavistan od doze tj. više koncetracije između dva procesa popravke tj. ekscizije i ligacije. Dodatkom inhibitora reparacije (AraC i HU) uzrokovalo je disbalans izm K posledica prisutnog endogenog oštećenja pre nego dejstva sam su procesi popravke aktivirani što je rezultovalo u enzimskoj aktivnosti koja pri nižim koncentracijama inhibitora nije inhibirana. Nakon produženog v ćenja jer je kontrola sa inhibitorima reparacije DNK pri nižim (20 µM AraC+ 2000 µM HU) i višim koncetracijama (40 µM AraC + 4000 µM HU) značajno indukovala migraciju DNK. Efedrin (1, 50 i 300 µM) nije značajno uticao na povećanje DNK oštećenja, ali je dodatkom AraC i HU došlo do akumulacije prekida što je rezultovalo u povećanju TCS vrednosti koje je bilo značajno u kotretmanu efedrina inhibitora (40 µM AraC + 4000 µM HU) indukovale su veći stepen oštećenja u odnosu na niže koncentracije AraC i HU u tremanu sa efedrinom. Uočava se da su limfociti tretirani efedrinom i inhbitorim reparacije nakon 60 minuta pretrpeli veće oštećenje DNK u odnosu na isti tretman nakon kraćeg vremena inkubacije Zabeleženo je da se najviši nivo DNK prekida uočava nakon 30-60 min. inkubacije (Tuck i sar., 2000; Holmberg, 1989). Pretpostavlja se da to vreme predstavlja balans eđu dva navedena procesa što se manifestovalo u većem nivo DNK prekida odnosno većem broju ćelija sa oštećenjem DNK. Pretpostavljamo da je prisutno endogeno oštećenje aktiviralo mehanizme popravke koji su inhibirani sa AraC i Hu i doveli do još većeg oštećenja DNK što nas navodi na zaključak da je povećenje oštećenja DN og efedrina. Naime, tokom procesa popravke stvaraju se prekidi u vidu intremedijera koji su odgovrni za povećavanje stope migracije DNK što se može detektovati Komet testom ( Tuck i sar., 2000). 81 Poznato je da inicijalna primarna DNK oštećenja kao što su stopa i efikasnost DNK popravke takođe utiču na mutageni potencijal hemikalije. Treba imati na umu da su u našem eksperimentu upotrebljeni humani limfociti, koji imaju ograničen kapacitet popravke i da je detektovano endogeno oštećenje zabeleženo i u drugim istraživanjima (Ori i sar., 2005; a reparacije došlo je do povećanog DNK oštećenja. Flint i sar. (2007) su u DNK uti vku da efedrin kao adrenergički agonist mogao dovesti do zastoja u popravci DNK oštećenja. va inhibitora reparacje u in vivo uslovima i uz primenu drugih tipova ćelija. U živim sistemima, genotoksičan napad povlači širok stepen ćeljskih odgovora uključujući promenu genske ekspresije, odlaganje ćelijskog ciklusa kao i stimulaciju DNK popravke Uz to eventualna akumulacija ovakvog oštećenja može aktivirati programiranu ćelijsku smrt.           Guerci i sar., 2009; McKelvey-Martini sar., 1993). U limfocitima čoveka uočena akumulacija prekida nastalih procesom popravke je posledica slabe snabdevenosti nukleotidima (Collins, 2004). S druge strane odgovor genotoksičnih tretmana može biti zavisan od tipa ćelije (Little i sar., 1989). Stoga, efikasnost enzima popravke u tretmanu sa efedrinom nam ipak ne dozvoljava da zaključimo da je efedrin genotoksični agens, imajući u vidu prethodne rezultate, ali postoje indicije efedrin može uticati na procese popravke jer je u zajedničkom tretmanu sa inhibitorim kazali da adrenalin i noradrenalin osim što indukuju oštećenja ču i na popravku DNK oštećenja mehanizmima transdukcionih signalnih puteva što nas navodi na pretposta Na kraju, postavlja se pitanje u kojoj meri povećana migracija DNK u Komet testu predstavlja rezultat endogenih oštećenja DNK ili je nastala direktnim delovanjem oštećujućeg agensa? Dobijeni rezultati nas navode da izvršimo evaluaciju efekata efedrina sa i bez prisust 82 . ZAKLJUČCI tećenja DNK u humanim limfocitima primenom Komet testa, ožemo izvesti sledeće zaključke: 00 μM) postignut nakon jednodnevnog tretmana n efekat putem reaktivnih kiseoničnih vrsta - inhibitori reparacije (arabinoza i hidroksiurea) u tretmanu sa efedrinom su ćenje DNK u humanim limfocitima što ukazuje na prisustvo endogenog oštećenja u humanim limfocitima s obziriom da su inhibitori   7 Na osnovu eksperimentalnih rezultata testiranja uticaja adrenalina i efedrina na pojavu primarnih oš m - adrenalin je ispoljio značajno povećanje oštećenja DNK u humanim limfocitima u svim ispitanim koncetracijama (0,001-500 μM) sem kod najniže koncetracije (0,0005 μM) - postoji razlika u kinetici ispoljavanja oštećenja DNK pod uticajem adrenalina u funkciji vremena. Najizraženiji efekat (0,001-500 μM) adrenalin ispoljo je u najkraćem vremenskom periodu (15 min.) dok je naslabiji efekat (150-3 - antioksidanti (katalaza i kvercetin) su značajno smanjili stepen oštećenja DNK u istovremenom tretmanu sa adrenalinom na osnovu čega se može zaključiti da adrenlin ispoljava genotoksiča - efedrin nije ispoljio značajno povećanje oštećenja DNK u humanim limfocitima u ispitanim koncetracijama. Jedino je tretman efedrinom visoke koncetracije (500 μM) indukavao slabo ali statistički značajno oštećenje DNK u humanim limfocitima nakon 15 minuta značajno povećali stepen ošte povećali stepen oštećenja DNK u kotrermanu sa negativnom kontrolom. 83 8. LITERATURA Abourashed, E.A., El-Alfy, A.T., Khan, I.A., Walker, L. (2003) Ephedra in perspective – a current review. Phytother Res., 17: 703-712. meova, A., Abdellatif, Y., Dhalla, N.S. (2009) RoleAda of the excessive amounts of Ahm effects of Alb uker, D.E., Tice, R., Waters, M.D., Aitio, A. (2000) And us genotoxins and Att hedra fragilis Crude Extracts J., 324: 25-28. ation. Biochem Soc Trans., 31: 1441-1444. circulating catecholamines and glucocorticoids in stress-induced heart disease. Can J Physiol Pharmacol., 87: 493–514. Aherne, S.A., O’Brien, N.M. (2000) Lack of effect of the flavonoids, myricetin, quercetin, and rutin, on repair of H2O2-induced DNA single-strand breaks in Caco-2, Hep G2, and V79 cells. Nutr Cancer, 38 (1): 106-115. ad, M.E., Shadab, G.G.H.A., Hoda, A., Afzal, M. (2000) Genotoxic estradiol-17 on human lymphocyte chromosomes. Mutat Res., 466: 109–115. ertini, R.J., Anderson, D., Douglas, G.R., Hagmar, L., Hemminki, K., Merlo, F., Natarajan, A.T., Norppa, H., Sh IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans. International Programme on Chemical Safety. Mutat Res., 463(2): 111-72. erson, D., Dobrzynska, M.M., Basaran, N., (1997) Effect of vario reproductive toxins in human lymphocytes and sperm in the Comet assay. Teratog Carcinog Mutagen., 17: 29–43. Andersson, M., Agurell, E., Vaghef, H., Bolcsfoldi, G., Hellman, B. (2003) Extended- term cultures of human T-lymphocytes and the comet assay: a useful combination when testing for genotoxicity in vitro? Mutat Res., 540(1): 43-55. ard, E., Vella, K. (2009) The Effects of Ephedrine and Ep on Human Peripheral Lymphocytes. Phcog Res., 1(2): 38-42. Baez, S., Segura-Aguilar, J., Widersten, M., Johansson, A.S., Mannervik, B. (1997) Glutathione transferases catalyse the detoxication of oxidized metabolites (O- quinones) of catecholamines and may serve as an antioxidant system preventing degenerative cellular processes. Biochem Beaulieu, É-É, Kelly, P.A. (1990) Hormones: from molecules to disease, Hermann, 697. Behonick, G.S., Novak, M.J., Nealley, E.W., Baskin, S.I. (2001) Toxicology update: the cardiotoxicity of the oxidative stress metabolites of catecholamines (aminochromes). J Appl Toxicol., 21 Suppl 1:S15-22. Behrend, L., Henderson, G., Zwacka, R.M. (2003) Reactive oxygen species in oncogenic transform 84 Bentley, P. J. (2011) Endocrine Pharmacology: Physiological Basis and Therapeutic Applications. Cambridge University Press; Reissue edition Bindoli, A., Rigobello, M.P., Galzigna, L. (1989) Toxicity of aminochromes. Toxicol Bindoli., A., Deeble, D.J., Rigobello, M.P., Ga nochrome. Biochim Biophys Acta., 1016(3): Boerrigter M.E., Vijg, J. (1992) Single-strand Break Disappearance in Quiescent and -101. rambilla, G., Martelli, A., (2009) Update on genotoxicity and carcinogenicity testing of Brash, D.E., Rudolph, J.A., Simon, J.A., Lin, A., McKenna, G.J., Baden, H.P., Halperin, u peroxidation products: their DNA damaging Buxton, G.V., Greenstock, C.L., Helman, W.P., Ross, A.B. (1988).Critical review of rate CA ation of a Tolerable Upper Limit for Cav ogan, E.G. (2002) Catechol ortho-quinones: the electrophilic Cem water disinfection Lett., 48: 3–20. lzigna, L. (1990) Direct and respiratory chain-mediated redox cycling of adre 349-356. Bindoli, A., Rigobello, M.P., Deeble, D.J. (1992) Biochemical and toxicological properties of the oxidation products of catecholamines. Free Radic Biol Med., 13: 391–405. Bishun, N.P., Williams D.C. (1977) Stilbestrol and human cancer. Clin Oncol., 3: 75-80. Phytohaemagglutinin-stimulated Human Peripheral Blood Lymphocytes Exposed to a Single Low Dose of γ-radiation. Int J Radiat Biol., 61(1): 95 Bolton, J.L., Trush, M.A., Penning, T.M., Dryhurst, G., Monks, T.J. (2000) Role of quinones in toxicology. Chem. Res. Toxicol., 13:135–160. B 472 marketed pharmaceuticals. Mutat Res., 681: 209-229. A.J., Ponten, J. (1991) A role for sunlight in skin cancer : UV-induced p53 mutations in squamous cell carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 88: 10124-10128. Bruno, A., Nolte, K., Chapin, J. (1993) Stroke associated with ephedrine use. Neurology, 43: 1313-1316. rcham, P.C. (1998) Genotoxic lipidB properties and role in formation of endogenous DNA adducts. Mutagenesis, 13:287- 305. constants for reactions of hydrated electrons, hydrogen atoms and hydroxylradicals. Phys Chem Ref Data, 17: 513-517. NTOX (2000). Safety Assessment and Determin Ephedra (Ontario, Canada, CANTOX Health Sciences International). alieri, E.L, Li, K.M, Balu, N., Saeed, M., Devanesan, P., Higginbotham, S., Zhao, J., Gross, M.L., R compounds that form depurinating DNA adducts and could initiate cancer and other diseases. Carcinogenesis, 23: 1071-1077. eli, E., Wagner, E.D., Anderson, D., Richardson, S.D., Plewa, M.J. (2006) Modulation of the cytotoxicity and genotoxicity of the drinking 85 byproduct lodoacetic acid by suppressors of oxidative stress. Environ Sci Technol., Ch med and Cip ., Barale, R. (2006) Coo neuropharmacology, 4th ed. New York: Oxford University Press, pp. 80-128. mião F. (2007) Oxidation process of adrenaline in Cotelle, S., Ferard, J.F. (1999) Comet assay in genetic ecotoxicology: a review. Environ Cre ocytes: The Role of Reactive Oxygen Species abstract. Biol. Dh roduct of catecholamines in plasma. Mol Cell Dh u, X., Elimban, V. (2001) death. Fundam Clin Pharmacol., 24(5): 539-546. 3–183. 40: 1878–1883. en, Y., McMillan-Ward, E., Kong, J., Israels, S.J., Gibson, S.B. (2008) Oxidative stress induces autophagic cell death independent of apoptosis in transfor cancer cells. Cell Death Differ., 15: 171–182. ollini, M., He, J., Rossi, P., Baronti, F., Micheli , A.,Rossi, A.M Can individual repair kinetics of UVC-induced DNA damage in human lymphocytes be assessed through the comet assay? Mutat. Res., 601: 150–161. Collins, A., Harrington, V. (2002) Repair of oxidative DNA damage: assessing its contribution to cancer prevention. Mutagenesis 17(6): 489-493. Collins, A.R. (2004). The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molec Biotechnol., 26: 249–261. Cooke, M.S., Evans, M.D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. (2003) Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J, 17: 1195 –1214. per, J.R, Bloom, F.E., Roth, R.H. (1982) The biochemical basis of Costa, V.M., Silva, R., Ferreira, L.M., Branco, P.S., Carvalho, F., Bastos, M.L., Carvalho, R.A., Carvalho, M., Re freshly isolated rat cardiomyocytes: formation of adrenochrome, quinoproteins, and GSH adduct. Chem Res Toxicol., 20(8):1183-1191. Mol Mutagen., 34(4): 246-255. spo M.E., Bicho, M.P. (1995) Membrane-Mediated Effects of Catecholamines on the DNA of Human Leuk Signals, 4: 78-85. alla, K.S., Ganguly, P.K., Rupp, H., Beamish, R.E., Dhalla, N.S. (1989) Measurement of adrenolutin as an oxidation p Biochem., 87: 85–92. alla, N.S., Sasaki, H., Mochizuki, S., Dhalla, K.S., Li Catecholamine-induced cardiomyopathy. In: Cardiovascular Toxicity, Acosta D (ed.). Raven Press: New York, 269–318. Dhalla, N.S., Adameova, A., Kaur, M. (2010) Role of catecholamine oxidation in sudden cardiac Dhillon, V.S.,. Singh, J.R., Singh, H., Kler R.S. (1994) In vitro and in vivo genotoxicity evaluation of hormonal drugs V. Mestranol, Mutation Res., 322, 17 86 Dhillon, V.S., Dhillon, I.K. (1995) Genotoxicity evaluation of estradiol. Mutat Res., 345: 87–95. Dhillon, V.S., Singh, J., Singh, H., Kler, R.S. (1995) In vitro and in vivo genotoxicity of Dia Y.,Prieto-Gonzalez, E.A., Azoy, A. (2002) Genotoxic effect of ozone in human peripheral blood leukocytes, Mutat Res., 517: Djelic N. Cytogenetic effects of estradiol, thyroxine, insulin and epinephrine on human Djelic, N. (2001) Analysis of sister-chrom icronuclei in cultured Djelic, N., Djelic, D., Sprem of the effects of epinephrine on cultured human Djelic, N., Anderson, D. (2003) The effect of aline in the Comet assay, Teratog Carcinog Mutagen., Dje hromatid exchange and micronuclei in human peripheral blood lymphocytes treated with thyroxine in Dje c effects of L-thyroxine in whole-blood Dorbzynska, M.M., Baum nderson, D. (2004) Antioxidants modulate Doyle, H., Kargin, M. (1996) ulant containing ephedrine has also caused Dunnick, J.K., Kissling, G., Gerken, D.K., Vallant, M.A., Nyska, A. (2007) ang/caffeine or ephedrine/caffeine in a rodent model system. Eisenhofer, G., Kopin, I.J., Goldstein, r physiology and medicine. Pharmacol Rev., hormonal drugs. VI. Fluoxymesterone. Mutat Res., 342: 103–111. z-Llera, S., Gonzalez-Hernandez, 13–20. lymphocytes in vitro (1997) Belgrade, Serbia,Yugoslavia: Faculty of Biology, University of Belgrade (PhD thesis). atid exchanges and m human lymphocytes treated with insulin. Folia Biol (Praha), 47(1): 28-31. o-Potparevic, B., Markovic, B., Zivkovic, L. (2003) Cytogenetic analysis lymphocytes. Acta Veterinaria, 53: 113-120. the antioxidant catalase on oestrogens, triiodothyronine and noradren 23: 69–81. lic, N., Spremo-Potparevic, B., Bajic, V., Djelic, D. (2006) Sister c vitro. Mutat Res., 604: 1-7. lic, N., Djelic, D., Spremo-Potparevic, B., Zivkovic L., Markovic, B., Lozance, O., Blagojevic, M. (2007) Lack of clastogeni cultured human lymphocytes. Genet Mol Biol., 30(4): 1415-4757. gartner, A., A thyroid hormone and noradrenaline induced DNA damage in human sperm. Mutagenesis, 19: 325-330. Herbal stim psychosis. BMJ, 313: 756 Cardiotoxicity of MaHu Toxicol Pathol., 35(5): 657-664. D.S. (2004) Catecholamine metabolism: a contemporary view with implications fo 56(3):331-349. 87 Emerit, I., Kec,k M., Levy, A., Feingold, J., Michelson, A.M. (1982) Activated Fitzpatrick, F.A. (2001) Inflammation, carcinogenesis and cancer. Int Immuno Flin DNA damage, alteration of DNA repair and transcriptional activation by stress hormones. Flint, M.S., Baum, A., Episcopo, B., Knickelbein, K.Z., Liegey, A.J., Chambers, W.H., 37 Foppoli, C., Coccia, R., Cini, C., Rosei, M.A. (1997) Catecholamines oxidation by ranzotti, E.M., Santos, C.V., Rodrigues, H.M., Mourão, R.H., Andrade, M.R., J Ethnopharmacol., 72: 273–278. ukushima, Kazuko (2004) Bioactivity of Ephedra: Integrating Cytotoxicity Assessment oxygen species as the origin of chromosome breakage and sister-chromatide changes. Mutat Res., 103: 165-172. Fazeli G, Oli RG, Schupp N, Stopper H. (2011) The role of the dopamine transporter in dopamine-induced DNA damage. Brain Pathol., 21(3): 237-248. pharmacol., 1:(9-10) 1651-1667. t, M.S., Baum, A., Chambers, W.H., Jenkins, F.J. (2007) Induction of Psychoneuroendocrinology, 32(5): 470-479. Jenkins, F.J. (2012) Chronic exposure to stress hormones promotes transformation and tumorigenicity of 3T3 mouse fibroblasts. Stress. PMID 225068 Folkman, J. (1971) Transplacental carcinogenesis by stilbestrol. N Eng J Med., 285(7): 404-405. Food and Drug Administration (2000) Assessment of Public Health Risks Associated with the use of ephedrine alkaloid-containing dietary suplements. xanthine oxidase. Biochim Biophys Acta., 1334: 200–206. F Antoniolli, A.R. (2000) Anti-inflammatory, analgesic activity and acute toxicity of Sida cordifolia L. (Malva-branca). Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W. (1995) DNA Repair and Mutagenesis. Washington, DC:ASM Press, F with Real-Time Biosensing thesis Genova, M.L,, Abd-Elsalam, N.M., Mahdy el, S.M., Bernacchia, A., Lucarini, M., Pedulli, G.F., Lenaz, G. (2006) Redox cycling of adrenaline and adrenochrome catalysed by mitochondrial Complex I. Arch Biochem Biophys., 447(2): 167-173. Gerlo, E., Sevens, C. (1994) Urinary and plasma catecholamines and urinary catecholamine metabolites in pheochromocytoma: Diagnostic value in 19 cases. Clin Chem., 40: 250–256. Glatt, H. (1990) Endogenous mutagens derived from amino acids. Mutat Res., 238: 235-243. 88 Glatt, H.R., Metzler, M., Oesch, F. (1979) Diethylstilbestroland 11 derivatives: a mutagenicity study with Salmonella typhimunum Mutat Res., 67: 113-121 nin and cytotoxic quinones. Mol Pharmacol., 14(4): 633-643. ra-C and hydroxyurea in three different cell types. Cell Biol Toxicol., 25(1): 73-80. Gu ogenesis. Am J Med Sci., 323(3): 140-145. Haller, C.A, Duan, M., Benowitz, N.L., Jacob, P.I. (2004) Concentrations of ephedra Haller, C.A., Jacob, P. 3rd, Benowitz, N.L. (2002) Pharmacology of ephedra alkaloids alliwell, B., Gutteridge, J.M. (1990) Role of free radicals and catalytic metal ions in K., Shenoy, S.K., Gregory, S.G., Ahn, S., Duckett, D.R., Lefkowitz, R.J.(2011) A stress response pathway regulates DNA Har theory based on free-radical and radiation-chemistry. J Geront., 11: 298–300. Goldstein, D.S., Eisenhofer, G., Kopin, I.J. (2003) Sources and significance of plasma levels of catechols and their metabolites in humans. J Pharmacol Exp Ther., 305: 800–811. Graham, D.G. (1978) Oxidative pathways for catecholamines in the genesis of neuromela Griffith RK and Johnson EA (1995) Adrenergic drugs, in Principles of Medicinal chemistry (Foye WO, Lemke TL and Williams DA eds) pp 345–365, Williams & Wilkins, Baltimore. Grossman, A. (1998). Clinical Endocrinology. Maiden, Mass, Blackwell Science, 2nd ed. 1184 pp. Güerci, A., Liviac, D., Marcos, R. (2009) Detection of excision repaired DNA damage in the comet assay by using A pta, K., Krishnaswamy, G., Karnad, A., Peiris, A.N. (2002) Insulin: a novel factor in carcin Guyton, K.Z,. Kensler, T.W. (1993) Oxidative mechanisms in carcinogenesis, Br Med Bull., 49: 523–544. alkaloids and caffeine in commercial dietary supplements. J Anal Toxicol. 28: 145– 151. and caffeine after single-dose dietary supplement use. Clin Pharmacol Ther., 71(6): 421-432. Haller, C.A., Benowitz, N.L. (2000) Adverse cardiovascular and central nervous system events associated with dietary supplements containing ephedra alkaloids. N Engl J Med., 343: 1833-1838. H human disease: an overview. Methods Enzymol, 186: 1-85. Hara, M.R., Kovacs, J.J., Whalen, E.J., Rajagopal, S., Strachan, R.T., Grant, W., Towers, A.J., Williams, B., Lam, C.M., Xiao, damage through β2-adrenoreceptors and β-arrestin-1. Nature, 477(7364):349-353. man, D. (1956). Aging—a 89 Harris, C.C., Hollstein, M. (1993) Clinical implications of the p53 tumor-suppressor gene. N Engl J Med., 329: 1318-1327. Hegedus, Z.L. (2000) The probable involvement of soluble and deposited melanins, their er , Hughes, J., Ashford, M.L. (1999) Hydrogen Hig , Fujii N., Hirshman M.F., Koyama K., Seino T., Tanaka K., Goodyear, L.J. (2008) Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake Hill, A., an r Horikawa, K., Mohri, T., Tanaka, Y., Tokiwa, H. (1994) Moderate inhibition of y Chinese medicinal herbs. Mutagenesis, 9(6): 523-526. s. Mutat Res., Hu tential of estrogens. Mutat Res., 389: 173-181. Husain, S., Hadi, S.M. (1998) DNA breakage by L-DOPA and Cu(II): breakage by melanin and bacteriophage inactivation. Mutat Res., 397: 161-168. Jez logija, III prerađeno i dopunjeno izdanje intermediates and the reactive oxygen side-products in human diseases and aging. Toxicology, 145: 85–101. Henderson, L., Wolfreys, A., Fedyk, J., Bourner, C., Windebank, S. (1998) The ability of the Comet assay to discriminate between genotoxins and cytotoxins. Mutagenesis, 13:89–94. son, P.S., Lee, K., Pinnock, R.D.H Peroxide induces intracellular calcium overload by activation of a non-selective cation channel in an insulin-secreting cell line. J Biol Chem., 274(2): 833-841. aki Y., Mikami T. through a phosphatidylinositol-3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab., 294: 889–897. d Wolff, S. (1982) Increased induction of sister chromatid exchange by diethylstilbestrol in lymphocytes from pregnant and premenopausal women. Cance Res., 42: 893-896. Hilliard, C.A, Armstrong, M.J., Bradt, C.I., Hill, R.B., Greenwood, S.K., Galloway, S.M. (1998) Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons. Environ Mol Mutagen. 31(4):316-326. Holmberg, M. (1989) The effect of deoxynucleosides on repair of DNA breaks in UVC irradiated human lymphocytes. Mutat. Res., 218: 33–39. mutagenicity and carcinogenicity of benzo[a]pyrene, 1,6-dinitropyrene and 3,9- dinitrofluoranthene b Horváthová, K., Chalupa, I., Sebová, L., Tóthová, D., Vachálková, A. (2005) Protective effect of quercetin and luteolin in human melanoma HMB-2 cell 565(2):105-112. ndal, B.S., Dhillon, V.S., Sidhu, I.S. (1997) Genotoxic po dimirović, B.M. (2005) Veterinarska Farmako A. D. štamparija “KULTURA”, Bački Petrovac, 189-190. 90 Guyton, K.Z., Kensler, T.W. (1993) Oxidative mechanisms in carcinogenesis, Br. Med. Bull. 49 523–544. J Med., 343: 1826-1832. Klaunig, J.E., Ka ndulis, L.M. (2004). The role of oxidative stress in carcinogenesis. Kle Lam ma, F., Duncker, D.J., Verdouw, P.D., myricetin, effect on Leung, A.Y., Foster, S. (1996) Encyclopedia of common natural ingredients used in food, Kavelaars, A. (2002) Regulate dexpression of alpha-1adrenergic receptors the immune system. Brain Behav Immun., 16: 799–807. Kernan, W.N., Viscoli, C.M., Brass, L.M. et al (2000) Phenylpropanolamine and the risk of hemorrhagic stroke. N Engl Kjaer, M. (1998) Adrenal medulla and exercise training. Eur J Appl Physiol Occup Physiol., 77:195–199. me Annu Rev Pharmacol Toxicol., 44: 239-267. in, J.A., Ackerman, S.L. (2003) Oxidative stress, cell cycle, and neurodeneneration. J Clin Invest., 111: 785-793. Kuznetsova, N.N., Khashimova, Z.S., Sadikov, A.A. (2004) Effect of Ephedrine and Its Derivatives in KML Cell Culture and on Tumor Strains of Animals. Chem Nat Comp 40: (3) 258-260. eris, T.W., Zeeuw, S., Alberts, G., Booms Man in’t Veld, A.J., vanden Meiracker, A.H. (2000) Time course and mechanism of myocardial catecholamine release during transient ischemia in vivo. Circulation., 101: 2645–2650. Laughton, M.J., Halliwell, B., Evans, P.J., Hoult, J.R.S. (1989) Antioxidant and pro- oxidant actions of the plant phenolics quercetin, gossypol and lipid peroxidation, hydroxyl radical generation and bleomycin dependent damage to DNA, Biochem Pharmacol., 38: 2859–2865. Lee, M.K., Cheng, B.W., Che, C.T., Hsieh, D.P. (2000) Cytotoxicity Assessment of ma- huang (Ephedra) under different conditions of preparation. Toxicol Sci. 56: 424-430. drugs, and cosmetics, 2nd ed. edn (New York, Wiley). Levay, G., Bodell, W.J. (1993) Detection of dopamine DNA adducts : potential role in Parkinson's disease. Carcinogenesis 14(6): 1241-1245. Lev Exp Neurol., 146: 570–574. Lie cancer development, Human Reprod Update, ay, G., Ye, Q., Bodell, W.J. (1997) Formation of DNA adducts and oxidative base damage by copper-mediated oxidation of dopamine and 6-hydroxydopamine. hr, J.G. (2001) Genetoxicity of the steroidal estrogens oestrone and oestradiol: posible mechanism of uterine and mammary 7: 273-281. 91 Liles J.T., Dabisch, P.A., Hude, K.E., Pradhan, L., Varner, K.J., Porter, J.R., Hicks, A.R., Corll, C., Baber, S.R., Kadowitz, P.J. (2006) Pressor responses to ephedrine are mediated by a direct mechanism in the rat. J Pharmacol Exp Ther., 316: 95–105. ittle, J.B., Ueno, A.M., Dahlberg, W.K. (1989) Differential response of human and Biophys., 28: 193–202. proliferation via beta adrenoceptor-dependent transactivation of extracellular signal-regulated kinase Lof Martin, F.L., Cole, K.J., Orme, M.H., Grover, P.L., Phillips D.H., Venitt, S. (1999) The 5(1): 21-43. arcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R. Crebelli, R. (2003) Masserano, J. M., Baker, I., Venable, D., Gong, L., Zullo, S.J., Merril, C.R., Wyatt, R.J. substances in mouse lymphoma L5178Y Cell assay for mutagens. Environ Mol Mutagen, 11: 523-544. Mc Collins, A. (1993) The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): a European L rodent cell lines to chemical inhibition of the repair of potentially lethal damage. Radiat Environ Liu, X., Wu, W.K., Yu, L., Sung, J.J, Srivastava, G., Zhang, S.T., Cho, C.H. (2008) Epinephrine stimulates esophageal squamous-cell carcinoma cell /cyclooxygenase-2 pathway. J Cell Biochem., 105(1): 53-60. t, S., Poulsen, H. (1996) Cancer risk and oxidative DNA damage in men. J Mol Med., 74: 297- 312. Lundoquist, I., Ericson, L.E. (1978) 8-Adrenergic insulin releaseand adrenergic innervation of mouse pancreatic islets. Cell Tissue Res., 193: 73-85. DNA repair inhibitors hydroxyurea and cytosine arabinoside enhance the sensitivity of the alkaline single-cell gel electrophoresis ('comet') assay in metabolically- competent MCL-5 cells. Mutat Res. 44 Manfred Metzler (2002) Endocrine Disruptors – Part II The Handbook of Environmental Chemistry, Genotoxic Potential of Natural and Synthetic Endocrine Active Compounds Volume 3M, 492-493 M Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy Mutat Res 541(1-2): 1-8. (2000) Dopamine induces cell death, lipid peroxidation and DNA base damage in a catecholaminergic cell line derived from the central nervous system. Neurotox Res., 1:171–179. McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B.N. (1975) Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proc Nat J Acad Sei U. S. A., 72: 5135-5139. McGregor, D.B., Raich, C.G., Brown, A., Edwards, I., Reynolds, D., West K., Willington S. (1988) Reactivity of catecholamines and related Kelvey-Martin, V.J., Green, M.H., Schmezer, P., Pool-Zobel, B L., De Meo, M.P., review. Mutat Res., 288(1): 47- 63. 92 Miller, D.M., Buettner, G.R., Aust, S.D. 1990 Transition metals as catalysts of "autoxidation" reactions. Free Radic Biol Med., 8(1): 95-108. techol Mi fic oxidative stress caused by dopamine itself. Acta Med Okayama, 62: 141–150. Moldeus, P., Nordenskjold, M., Bolcsfoldi, G., Eiche, A., Haglund, U., Lambert, B. Mo Mo Mo crude drugs with Bacillus subtilis rec-assay and Salmonella/microsome Mo ., Sofuni, T., Hayashi, M. (1997) Evaluation of the rodent micronucleus t. ational Toxicology Program (NTP) (1986). Toxicology and Carcinogenesis Studies of Ephedrine Sulfate (CAS No. 134-72-5) in F344/N Rats and B6C3F1 Mice (Feed Studies). Natl Toxicol Program Tech Rep Ser 307, 1-186. Minneman, K.P. (1988) α1-adrenergic receptor subtypes, inositol phosphates and sources of cell calcium. Pharmacol Rev., 40: 87-119. Miura T., Muraoka S., Fujimoto Y., Zhao K. (2000) DNA damage induced by ca derivates. Chem Biol Interact., 126: 125-136. yazaki, I., Asanuma, M. (2008) Dopaminergic neuron-speci (1983) Genetic toxicity of dopamine. Mutat Res., 124: 9-24. lina P.E. (2004) Endocrine physiology. The McGraw-Hill Companies Inc, 298. Moller, P. (2005) Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic Clin Pharmacol Toxicol., 96 Suppl 1: 1-42. nks, T.J., Lau, S.S. (1992) Toxicology of quinone-thioethers. Crit Rev Toxicol., 22: 243–270. rimoto, I., Watanabe, F., Osawa, T., Okitsu, T., Kada, T. (1982) Mutagenicity screening of reversion assay. Mutat Res. 97: 81-102. rita, T., Asano, N., Awogi, T., Sasaki, Y.F., Sato, S., Shimada, H., Sutou, S., Suzuki, T., Wakata, A assay in the screening of IARC carcinogens (groups 1, 2A and 2B). The summary report of the 6th collaborative study by CSGMT/JEMS MMS. Collaborative Study of the Micronucleus Group Test. Mammalian Mutagenicity Study Group. Mutat Res., 389: 3–122. Murakami, H., Shirahata, S., Hori, C., Yoshii, H., Yamada, K., Shinohara, K., Omura, H. (1979) DNA breaking reaction with catecholamines. Agric Biol Chem., 43: 1619-1624. Musatov, S.A., Anisimov, V.N., André, V., Vigreux, C., Godard, T, Sichel, F. (1999) Effects of melatonin on N-nitroso-N-methylurea-induced carcinogenesis in rats and mutagenesis in vitro (Ames test and COMET assay). Cancer Lett. 138(1-2): 37-44. Nam, N.H., Lee, C.W., Hong, D.H., Kim, H.M., Bae, K.H., Ahn, B.Z. (2003) Antiinvasive, antiangiogenic and antitumour activity of Ephedra sinica extrac Phytother Res. 17(1):70-76. N 93 National Toxicology Program (NTP) (1990). Toxicology and Carcinogenesis Studies of l-Epinephrine hydrochloride (CAS No. 55-31-2) in F344/N Rats and B6C3F1 Mice eier, M.T., White, R.E., Yang, C.S. Oberm (1995) Effects of bioflavonoids on hepatic P450 activities. Xenobiotica 25: 575–584. Okamoto H (1985) The molecular basis of experimental diabetes. Degeneration, oncogenesis and regeneration of pancreatic β-cells of the islets of Langerhans.  Bioessays, 2: 15–21 moto T., Adachi K., Muraishi A., Seki Y., Hidaka T.H. (1996) Induction of DNA breaks in cardiac myoblast cells by norepinephrine. Bioc Oka hem Mol Biol Int., 38: 821– Ori an peripheral blood mononuclearcells. Biochem Pederson, K.J., Kuntz, D.H., Garbe, G.J. ( into, M.R. (1986) Possible effects of hormonal contraceptives on human mitotic Radakovic, M., Djelic, N., Stanimirovic, Z., Plecas-Solarovic, B., Spremo-Potparevic, B., Zivkovic Lada, Bajic, V. (2011). Evaluation of the effects of ephedrine on human Ray patients with severe cardiac disease. Ann Rem yocytes: effects on oxidative Rem n, D., Carvalho, F., Bastos, M.L., Cadenas, E. (2004) Leucoisoprenochrome-o-semiquinone formation in freshly isolated adult rat 827. , Y., Herman, M., Weinstein, T., Chagnac, A., Zevin, D., Milo, G. (2005) Spontaneous DNA repair in hum Biophys Res Commun.,320:578–586. 2001) Acute myocardial ischemia associated with ingestion of bupropion and pseudoephedrine in a 21-year-old man. Can J Cardiol., 17: 599-601. Philips, B.J, James, T.B., Anderson, D. (1982) Genetic damage in in CHO cells exposed to enzymically generated active oxygen species. Mutat Res.,126: 265-271. P chromosomes, Mutat Res., 69, 149–157. lymphocytes in the comet assay. Acta Vet., 61: 363-371. mond, J.R., Hnatowich, M., Lefkowitz, R.J., Caron, M.G. (1990) Adrenergic receptors. Models for regulation of signal transduction processes. Hypertension, 15:119-131. Raymondos, K., Panning, B., Leuwer, M., Brechelt, G., Korte, T., Niehaus, M., Tebbenjohanns, J., Piepenbrock S. (2000) Absorption and hemodynamic effects of airway administration of adrenaline in Intern Med, 132: 800–803. ião, F., Carvalho, M., Carmo, H., Carvalho, F., Bastos, M.L. (2001) Copper enhances isoproterenol toxicity in isolated rat cardiom stress. Cardiovasc Toxicol., 1: 195–204. ião, F., Rettori, D., Ha cardiomyocytes. Chem Res Toxicol., 17: 1584–1590. 94 Retel, J., Hoebee, B., Braun, J.E., Lutgerink, J.T., Van den Akker E., Wanamarta, A.H, Joenje, H., Lafleur, M.V. (1993) Mutational specificity of oxidative DNA damage. Mutat Res, 299: 165-182. Richold, M. (1988) The genotoxicity of trenbolone, a synthetic steroid. Arch Toxicol., 61: 249–258. tjens, I.M., Martena, M.J., Boersma, M.G., Spiegelenberg, W., Alink, G.M. (2005) Mole Rie cular mechanisms of toxicity of important food-borne phytotoxins. Mol Nutr Ro 04(4):755- 757. Ro J Chromatogr B Biomed Sci Appl., 722(1-2): 225-254. Rudiger, H.W., Haenisch, F., Metzler, M., Oesch, F., Glatt, H. R. (1979) Metabolites of Sam ang, P. J., Proc., 77: 12–16. San n with the Sas mouse organs: comparison of comet assay the IARC monographs and U.S. NTP Carcinogenicity Database. Crit Rev Toxicol., 30, 629–799. Food Res.,49(2):131-158. berts, A., Bar-Or, D., Winkler, J.V., Rael, L.T. (2003) Copper-induced oxidation of epinephrine: protective effect of D-DAHK, a synthetic analogue of the high affinity copper binding site of human albumin. Biochem Biophys Res Commun., 3 jas, E., Lopez, M.C., Valverde, M. (1999) Single cell gel electrophoresis assay: methodology and applications. Roman, M.C. (2004) Determination of ephedrine alkaloids in botanicals and dietary supplements by HPLC-UV: collaborative study. J AOAC Int., 87(1):1-14. diethylstilbestrol induce sister chromatid exchange In human cultured fibroblasta. Nature (Lond.), 287: 392-394. Ruffolo, R.R., Bondinell, W., Hieble, J.P. (1995) α- and b- Adrenoceptors, From the gene to the Clinic. 2. Structure activity relationships and therapeutic applications. J Med Chem., 38: 3681-3716 Rump, A.F., Klaus, W. (1994) Cardiotoxicity of adrenochrome in isolated rabbit hearts assessed by epicardial NADH fluorescence. Arch Toxicol., 68(9): 571-575. enuk, D., Link, M S., Hormoud, M. K., Caonteras, R., Theoharides, T.C.,W Estes, N.A I. (2002). Adverse cardiovascular events temporally associated with Ma Huang, a herbal source of ephedrine. Mayo Clin Sanders, V.M., Kasprowicz, D.J., Kohm, A.P., Swanson, M.A. (2001) Neurotransmitter receptors on lymphocytes and other lymphoid cells.In: Ader,V.M.,Cohen, Felten (Eds.),Psychoneuroimmunology, 3rded R Academic Press, San Diego. ders, V.M., Kohm, A.P. (2002) Sympathetic nervous system interactio immune system. Int Rev Neurobiol., 52: 17-41. aki, Y.F., Sekihashi, K., Izumiyama, F., Nishidate, E., Saga, A., Ishida, K. Tsuda, S. (2000) The comet assay with multiple results and carcinogenicity with 208 chemicals selected from 95 Sato, Y., Sakakibara, Y., Oda, T., Aizu-Yokota, E., Ichinoseki, K. (1992) Effect of estradiol and ethinylestradiol on microtubule distribution in Chinese hamster V79 Sca Sch of chemical fingerprinting: application to Ephedra. Phytochemistry, 62(6): 911-918. Sch of the induction of hyperdiploidy and polyploidy by diethylstilbestrol and 17β-estradiol in cultured human lymphocytes using multicolor Scudiero, D., Norin, A., Karran, P., Strauss, B. (1976) DNA excision-repair deficiency of 7–392. Shadab, G.G.H.A., Ahmad, M.E, Afzal, M. (1999) Effect of hydrocortisone on human osomes in vitro. Indian Biologist., 31:1-10. She , es, S.L. , Jungvig, L., Gagne, J. (2003) Efficacy and safety of ephedra and ephedrine for weight loss and athletic performance. J Am Med Assoc., 289(12): Shen, H.-M., Ong, C.N. (2000) Detection of oxidative DNA damage in human sperm and Sheu, S.J. (1997) Identification by chemical analysis of botanical sources of commercial Singal, P.K., Dhalla, A.K., Hill, M., Thomas, T.P. (1993) Endogenous antioxidant changes in the myocardium in response to acute and chronic stress conditions. Mol Cell Biochem., 129: 179-186. cells. Chem Pharm Bull., 40: 182–184. ndalios, J.G. (2002) The rise of ROS. TIBS, 27: 483-486. aneberg, B.T., Crockett, S., Bedir, E., Khan, I.A. (2003) The role uler, M., Hasegawa, L., Parks, R., Metzler, M., Eastmond, D.A. (1998) Dose- response studies fluorescence in situ hybridization. Environ Mol Mutagen., 31: 263–273. human peripheral blood lymphocytes treated with chemical carcinogens. Cancer Res., 36(4): 1397-1403. Seifter, J. Ratner, A., Sloane, D. (2005) Concepts in Medical Physiology. Lippincott Williams & Wilkins. Serova J.A., Kerkis Y.Y. (1974) Cytogenetic effect of some steroid hormones and change in the activity of lysosomal enzymes in vitro. Sov Genet., 10: 38 Sever, P.S., Dring, L.G., Williams, R.T. (1975) The metabolism of (−)-ephedrine in man. Eur J Clin Pharm., 9: 193–198. lymphocyte chrom kelle, P.G., Hardy, M.L. , Morton, S.C. , Maglione, M., Mojica, W.A., Suttorp, M.J. Rhod 1537–1545. its association with sperm function and male infertility. Free Rad Biol Med., 28:529– 536. Sherwood, L. (2009) Human Physiology: From Cells to Systems. Thomson Brooks/Cole. English 7th Revised ed. 928. samples of Chinese herbal drugs. J Food Drug Anal., 5: 285–294. 96 Singh, N.P, Mc Coy, M.T., Tice, R.R., Schneider, E.L. (1988) A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res., 175: 184-191 scussion. Sny pamine by manganese and copper. Mutat Res., 405(1): 1-8. hys., 240: 345–357. Spe pencer, J.P., Jenner, A., Aruoma, O.I., Evans, P.J., Kaur, H., Dexter, D.T., Jenner, P., pencer, J.P.E., Jenner, P., Daniel, S.E., Lees, A.J., Marsden, D.C., Halliwell, B. (1998) 71: Stan tic tests in vivo. Mutat Res., 628(1): 1-10. pencer, W.A., Jeyabalan, J., Kichambre, S., Gupta, R.C. (2011) Oxidatively generated reactive oxygen species. Free Radic Biol Med., 50(1):139-147. Sto rosci Res.. 55(6): 659-65. Singh, H., Singh, J.R., Dhillon, V.S., Bali, D., Paul, H. (1994) In vitro and in vivo genotoxicity evaluation of hormonal drugs II. Dexamethasone. Mutat Res., 308: 89– 97. Smythies, J., Iuliis, A.D., Zanatta, L., Galzigna, L. (2002) The biochemical basis of Parkinson’s disease: the role of catecholamine o-quinones: a review-di Neurot Res., 4: 77–81. der, R.D., Friedman, M.B. (1998) Enhancement of cytotoxicity and clastogenicity of l- DOPA and do Sousa, R.L., Marletta, M.A. (1985) Inhibition of cytochrome P450 activity in rat liver microsomes by the naturally occurring flavonoid, quercetin. Arch Biochem Biop it, G., Hartmann, A. (1995) The contribution of excision repair to the DNA effects seen in the alkaline single cell gel test (comet assay), Mutagenesis 10: 555–559. S Lees, A.J., Marsden, D.C., Halliwell, B. (1994) Intense oxidative DNA damage promoted by L-dopa and its metabolites: implications for neurodegenerative disease. FEBS Lett., 353: 246–250. S Conjugates of catecholamines with cysteine and GSH in Parkinson’s disease: possible mechanisms of formation involving reactive oxygen species. J Neurochem., 2112–2122. imirović, Z., Stevanovic, J., Jovanovic S., Andjelkovic, M. (2005) Evaluation of genotoxic effects of fumagillin by cytogene Stanimirović, Z., Stevanovic, J., Bajic V., Radovic, I. (2007) Evaluation of genotoxic effects of Apitol (cymiazole hydrochloride) in vitro by measurement of sister chromatid exchange. Mutat Res., 588(2): 152-157. S DNA damage after Cu(II) catalysis of dopamine and related catecholamine neurotransmitters and neurotoxins: Role of kes, A.H., Hastings,T.G., Vrana K.E. (1999) Cytotoxic and genotoxic potential of dopamine. J Neu 97 Stopper, H., Schupp, N., Fazeli, G., Dietel, B., Queisser, N., Walitza, S., Gerlach, M. Su, F., Ouyang, N., Zhu, P., Ouyang, N., Jia, W., Gong, C., Ma, X., Xu, H., Song, E. Szeto, Y.T., Collins, A. odified comet assay procedure Mutat Res., 500: 31– Tice R. R. (1995) The single cell gel/comet assay: a microgel electrophoresis technique Toyokuni, S., Oka Tsu ity stimulates a putative alfa1-adrenergic receptor subtypes (alfa1) that sutsui, T., Tamura, Y., Hagiwara, M., Miyachi, T., Hikiba, H.,Kubo, C., Barrett, J.C. genous metabolite of estrogen. Carcinogenesis, 21:735– Tuc ack the capacity to repair UVC-induced lesions, Mutat Res., 459: 73–80. Ulf carcinogen. Teratol Valko, M., Izakovic, M., Mazur, M., Rhodes, C.J., Telser, J. (2004) Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence, Mol Cell Biochem., 266: 37–56. Van armacol., 58: 807–810. tonin on mitotic and proliferation indices, and sister chromatid exchange in human peripheral blood lymphocytes. Mutat Res., 357: 187-192. (2009) Genotoxicity of the neurotransmitter dopamine in vitro. Toxicol In Vitro 23(4): 640-646. (2005) Psychological stress induces chemoresistance in breast cancer by upregulating mdr1.Biochem Biophys Res Commun., 329(3): 888-897 R., Benzie, I.F.F. (2002) Effects of dietary antioxidants on DNA damage in lysed cells using a m 38. for the detection of DNA damage and repair in individual cells. Phillips D. H. Venitt S. eds. Environ Mutagen, 315-339, Bios Scientific Publishers Oxford, United Kingdom. moto, K., Yodoi, J., Hiai, H. (1995) Persistent oxidative stress in cancer. FEBS Lett., 358: 1-3 jimoto, G., Tsujimoto, A., Suzuki, E., Hashimoto, K. (1989) Glycogen phosphorilase activation by two different alfa1-adrenergic receptor subtypes: metoxamine selectiv couples with Ca2+ influx. Mol Pharmacol., 36: 166-176. T (2000) Induction of mammalian cell transformation and genotoxicity by 2- methoxyestradiol, an endo 740. k, A., Smith, S., Larcom, L. (2000) Chronic lymphocytic leukemia lymphocytes l elder, H. (1976) DES transplacental teratogen and possibly also Cancer Res., 40: 102-103. sal, S.S., Feller, D.R. (1999). Direct effects of ephedrine isomers on human beta- adrenergic receptor subtypes. Biochem Ph Varagic, V.M., Miloševic, M.P. (2003) Farmakologija (18.izd.), Beograd, Elit-Medica, 250-252. Vijayalaxmi, Reiter, R.J., Leal, B. Z. Meltz, M.L. (1996) Effect of mela 98 Waldum, H. L., Brenna, E., Sandvik ,A. K., Syversen, U., Falkmer, S. (1998) Hormones and carcinogenesis. Endocrine-Related Cancer 5(1): 45-48 arises. Scientific AmWeinberg, R. A. (1996) How cancer erican, 62-70. Wilkinson, G., Beckett, A., (1968) Absorption and excretion of the ephedrine illcox JK, Ash SL, Catignani GL. (2004) Antioxidants and prevention of chronic illner, C. (2004) An overview of the pathophysiology of neurodegenerative disorders. Wise Wo 999) Herba Ephedrae. In WHO monographs on selected medicinal plants (Geneva, Switzerland, World Health Organization), pp. 145-153. Wu .T. (2004) Urinary 8-OHdG: a marker of r cancer, atherosclerosis and diabetics. Ya systems. Agric Biol Chem., 45: 327-330. nd the Comet assay. Mutagenesis, 17: 345– Zho during Cardio pulmonary resuscitation. Resuscitation, 66: 263–269. ucleoproteins ytes of patients with lung cancer. Folia Haematol. 106:205-223 http://www.worldofmolecules.com/emotions/Epinephrine.png Wheeler, W.J., Cherry, L.M., Downs, T., Hsu, T.C. (1986) Mitotic occuring and aneuploidy induction by naturally occurring and synthetic estrogens in Chinese hamster cells in vitro. Mutat Res., 171: 31–41. metabolism in man: II. Pharmacokinetics. J Pharm Sci., 57: 1933–1938. W disease.Crit Rev Food Sci Nutr., 44(4): 275-95. W Altern Ther Health Med, 10: 26-34. man, H., Halliwell, B.(1996) Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer.Biochem J.313:17-29. rld Health Organization (1 , L.L., Chiou, C.C., Chang, P.Y., Wu, J oxidative stress to DNA and a risk factor fo Clin Chim Acta, 339: 1-9. maguchi, T. (1981). Mutagenicity of low molecular substances in various generating Yao, H., Duan, Z., Wang, M., Awonuga, A.O., Rappolee, D., Xie, Y. (2009) Adrenaline induces chemoresistance in HT-29 colon adenocarcinoma cells. Cancer Genet Cytogenet., 190(2): 81-87. Yared, E., McMillan, T.J., Martin, F.L. (2002) Genotoxic effects of oestrogens in breast cells detected by the micronucleus assay a 352. ng, J.-q., Dorian, P. (2005) Epinephrine and vasopressin Zvetkova, E., Koshucharoff S., Hadjioloff, A.I. (1979) Cytochemistry of n (RNP and DNP) and some cationic proteins in the peripheral blood leucoc calbiochemistrypage.org/images/catecholaminesynthesis.jpghttp://themedi acognosy.com/2012/07/phenylalanine-derived-alkaloids.htmlhttp://www.epharm 99 100 2007. godine. Iste godine upisala je doktorske studije na Biološkom saopštenjem na skupu od nacionalnog čaja. Učestvovala je na tri Nacionalna projekta finansirana od strane Ministarstva za nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije. Član je Srpskog biološkog društva, Društva genetičara Srbije i sekcije za mutagenezu Društva genetičara Srbije. Ima aktivno znanje kim jezikom. Biografija Milena Radaković je rođena 11.03.1983. godine u Beogradu. Srednju školu je završila u Beogradu u Medicinskoj školi Zvezdara. Na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu diplomirala je jula fakultetu Univerziteta u Beogradu, smer Genetika. U periodu od 2008-2010. godine je bila stipendista ministarstva za Nauku i tehnološki razvoj. Od 2011. zaposlena je kao istraživač saradnik na Katedri za biologiju Fakulteta veterinarske medicine Univerziteta u Beogradu. Milena Radaković je do sada publikovala 5 naučnih radova sa SCI liste (3 rada kategorije M21 i 2 rada kategorije M23). Učestvovala je sa 9 saopštenja na međunarodnim naučnim skupovima i jednim zna engleskog i služi se francus 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.