UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Marija M. Kostić VARIJABILNOST GENA UKLJUČENIH U INFLAMATORNE, IMUNOMODULATORNE I APOPTOTSKE PROCESE KAO FAKTOR RIZIKA ZA NASTANAK BAZOCELULARNOG KARCINOMA GLAVE I VRATA Doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Marija M. Kostić VARIABILITY OF GENES INVOLVED IN INFLAMMATORY, IMMUNOMODULATORY AND APOPTOTIC PROCESSES AS A RISK FACTOR FOR HEAD AND NECK BASAL CELL CARCINOMAS Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. PODACI O MENTORIMA I ČLANOVIMA KOMISIJE MENTORI dr Marina Stamenković-Radak, vanredni profesorUniverzitet u Beogradu - Biološki fakultet dr Jelena Milašin, redovni profesorUniverzitet u Beogradu - Stomatološki fakultet ČLAN KOMISIJE dr Ivana Novaković, vanredni profesorUniverzitet u Beogradu - Medicinski fakultet Datum odbrane: _______________2012. godine Z A H V A L N I C A Najsrdačnije se zahvaljujem svojim profesorkama i mentorkama prof.dr Jeleni Milašin i prof.dr Marini Stamenković-Radak na ukazanom poverenju, strpljenju, iscrpnim sugestijama i diskusijama tokom eksperimentalnog rada i pisanja teze, kao i na znanju koje su mi nesebično prenele i na svoj podršci i pomoći u mom naučnom usavršavanju. Zahvaljujem se i prof.dr Ivani Novaković na predusretljivosti, čitanju teze i korisnim primedbama. Posebnu zahvalnost dugujem dr Branki Popović na konstruktivnim sugestijama i komentarima, kao i na spremnosti da sasluša, saučestvuje i pomogne. Najiskrenije se zahvaljujem dr Katarini Zeljić na velikom i nesebičnom zalaganju i pomoći u svim fazama izrade teze. Njena stručnost, znanje i bezrezervna prijateljska podrška su umnogome doprineli kvalitetu ove teze. Dragim koleginicama iz laboratorije, Nađi i Bobi, izražavam zahvalnost na stručnoj pomoći, podršci i kolegijalnosti. Dragim koleginicama Jasmini, Mariji i Milici na prijateljskoj podršci prilikom nastojanja da ova disertacija postane stvarnost. Ogromnu zahvalnost dugujem mojim najdražima: suprugu Srđanu, mami, tati, Mileni i Bojani na razumevanju, strpljenju i ljubavi koju su mi pružili tokom čitavog školovanja. Vi ste bili moja najveća podrška i inspiracija. Ovaj doktorat i posvećujem vama. Marija Kostić Varijabilnost gena uključenih u inflamatorne, imunomodulatorne i apoptotske procese kao faktor rizika za nastanak bazocelularnog karcinoma glave i vrata Rezime Uvod: Bazocelularni karcinom (BCK), poznat kao i bazaliom, je najčešći oblikkancera u populaciji Kavkazijanaca. BCK čini oko 75% svih karcinoma kože.Metastazira veoma retko, ali sa porastom veličine tumora povećava se i incidencametastaza. U najvećem broju slučajeva ovaj karcinom se javlja na delovima kožeizloženim Sunčevom (UV) zračenju, ali faktori kao što su starost, postojanje ranijihopekotina od Sunca mogu doprineti povećanom riziku za razvoj BCK-a. Preciznimehanizmi nastanka BCK-a još uvek nisu poznati, ali se pretpostavlja dapatogeneza BCK-a najčešće podrazumeva apsorpciju UVB zraka od strane DNKmolekula, što dalje dovodi do mutacija u različitim genima, posebno u genimauključenim u proces ćelijske proliferacije, diferencijacije i smrti, kao što su survivin i TP53. Poznato je i da keratinocite pod dejstvom UV zračenja oslobađaju iprostaglandine i citokine, između ostalog i TNF-alpha koji ostvaruje svoje biološkeefekte u ćelijama preko molekula koji su svrstani u porodicu receptora za TNF,među kojima su najznačajnija dva TNF-R1 i TNF-R2. Produkcija citokina je bliskopovezana sa produkcijom matriks metaloproteinaza (MMP) koje su odgovorne zalokalnu tkivnu destrukciju. Na funkciju i stabilnost ovih proteina, mogu da utičurazličiti polimorfizmi prisutni u kodirajućim i nekodirajućim sekvencama njihovihgena. Bazocelularni karcinomi, se javljaju kao posledica različitih štetnih uticajaspoljašnje sredine, ali isto tako pokazuju i izraženu naslednu predispoziciju, pa se uposlednje vreme sve više pažnje usmerava upravo na proučavanje doprinosagenskih polimorfizama kao modulatora predispozicije za malignu transformaciju. Cilj: Cilj ove doktorske disertacije je analiza funkcionalnih polimorfizama u genimaza TNF-alpha, TNF-R1, TNF-R2, MMP-9, survivin i TP53, kao i analiza njihovepovezanosti sa patološkim karakteristikama BCK-a. Materijal i metode: Studijska grupa je obuhvatala 80 pacijenata sadijagnostikovanim BCK-om i 80 zdravih osoba, kontrolne grupe, koji premastarosti i polu odgovaraju grupi ispitanika, svi su srpske nacionalnosti. DNK jeizolovana iz tkiva negativnih margina tumora u grupi pacijenata i periferne krvikontrolne grupe. Restrikcionom digestijom PCR produkata i analizom dužinerestrikcionih fragmenata (PCR-RFLP) analizirani su polimorfizmi u genima za TNF- alpha (-308G/A), TNF-R1 (+36A/G), TNF-R2 (+676T/G), MMP-9 (-1562C/T), Survivin (-31G/C), TP53 (Pro47Ser), kao i insercioni polimorfizam (TP53 PIN3 Ins 16bp)kako bi se utvrdila distribucija učestalosti genotipovai alela u grupi pacijenata ikontrolnoj grupi. Hi-kvadrat i Fišerov egzaktni test su korišćeni za utvrđivanjerazlika u distribuciji učestalosti različitih genotipova i alela. Logističkomregresionom analizom utvrđivan je rizik za oboljevanje od BCK-a. Sve vrednosti psmatrale su se statistički značajnim ako su bile manje od 0.05. Dobijeni rezultati suobrađeni statističkim programom SPSS 13.0. Rezultati: Najveći broj obolelih od BCK-a su osobe starije od 60 godina (84%), štopotvrđuje ranije podatke da je BCK češći u starijoj populaciji, kao i da se incidencenjegovog nastanka povećava sa godinama života. Što se tiče lokacije BCK-a,najzastupljeniji je u predelu nosa, kao najisturenijem delu lica. Zabeležene suznačajne razlike u distribuciji genotipova u analizi polimorfizma +676T/G TNF-R2gena, (p=0.001, χ2 test) i PIN3 Ins 16bp TP53 gena (p=0.043, χ2 test). Statističkiznačajna razlika u distribuciji alela je zabeležena samo u slučaju polimorfizma +676T/G TNF-R2 gena, (p=0.011, χ2 test). Značajno povećanje rizika za razvoj BCK-a utvrđeno je kod heterozigota TG u analizi polimorfizma +676T/G TNF-R2 gena,(OR=4.86, p‹0.001) u poređenju sa wild type TT genotipom, kao i kod heterozigotaA1/A2 u analizi polimorfizma PIN3 Ins 16bp TP53 gena (OR=2.40, p=0.027) upoređenju sa wild type A1/A1 genotipom. Interesantno je da polimorfizam -31G/C gena za survivin je pokazao značajno smanjenje rizika za razvoj BCK-a tek nakonšto je računat Adjusted OR, za heterozigote GC genotipa (OR=0.46, p=0.047) uodnosu na homozigote GG genotipa. Ostali polimorfizmi u genima za TNF-alpha (- 308G/A), TNF-R1 (+36A/G), MMP-9 (-1562C/T), TP53 (Pro47Ser) nisu pokazali postojanje značajne razlike u distribuciji učestalosti genotipova i alela izmeđugrupe pacijenata i kontrolne grupe. Zaključak: Ovo istraživanje bazirano na analizi polimorfizama nekoliko odabranihgena, pokazalo je da su polimorfizmi nukleotidne sekvence +676T/G u TNF-R2genu i -31G/C u promotoru gena za survivin, kao i insercioni polimorfizam PIN3 Ins 16bp u TP53 genu modulatori rizika za razvoj BCK-a u našoj populaciji. Ključne reči: bazocelularni karcinom, polimorfizmi nukleotidne sekvence, TNF-alpha, TNF receptori, MMP-9, survivin, TP53. Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Genetika UDK: 575.22:[616.006.6:611.92/93](043.3) Variability of genes involved in inflammatory, immunomodulatory and apoptotic processes as a risk factor for head and neck basal cell carcinomas Abstract Introduction: Basal-cell carcinoma (BCC), also known as basalioma, is the mostfrequent type of cancer among the Caucasus. BCC accounts for approximately 75%of all skin cancers. It metastasizes extremely rarely, however its growth increasesthe risk and incidence of metastases. In the majority of cases, this cancer appearson the skin areas exposed to the sun rays (UV), but factors including age and theexistence of earlier sunburn may considerably enhance the risk of BCCdevelopment. The precise mechanisms of BCC development are yet unknown, butBCC pathogenesis most commonly relates to the DNA molecule absorption of UVBrays, which furthermore, leads to mutations in various genes, especially in thoseincluded in the process of cell proliferation, differentiation, and death, like survivinand TP53. It is also known that keratinocytes under influence of UV rays releaseprostaglandins and cytokines and, among others, TNF-alpha which exerts itseffects in cells via molecules belonging to the family of TNF receptors, the mostsignificant of which are TNF-R1 and TNF-R2. The production of cytokines is closelyconnected to the production of matrix metalloproteinases (MMP) that areresponsible for the local tissue destruction. Different polymorphisms can affect thefunction and stability of these proteins, which are present in the coding andnoncoding sequences of their genes. Basal cellcarcinomas occuras a result ofvarious adverse environmental impacts, but also show an expressed hereditarypredisposition, so more attention is recently directed precisely to the study of thecontribution of genetic polymorphisms as modulators of predisposition tomalignant transformation. Aim: The aim of this doctoral dissertation is the analysis of functionalpolymorphisms in genes for TNF-alpha, TNF-R1, TNF-R2, MMP-9, survivin and TP53,but also the analysis of their association with pathological features of BCC. Material and methods: The study group included 80 patients diagnosed withbasal cell carcinoma and 80 healthy individuals, the control group, matched in ageand gender with the examinees, all of them of Serbian nationality. In the patientsgroup, DNA was isolated from the tissue of histologically negative tumor margins,and in the control group from peripheral blood samples. The polymorphisms in TNF-alpha gene (-308G/A), TNF-R1 (+36A/G), TNF-R2 (+676T/G), MMP-9 (- 1562C/T), survivin (-31G/C), TP53 (Pro47Ser), and insertion polymorphism (TP53 PIN3 Ins 16bp) were analyzed by restriction digestion of PCR products and byanalysis of restriction fragment length, in order to determine the distributionfrequency of genotype and allele in the patient and control group. Chi square testand Fisher exact test were used for determination of differences in the genotypeand allele distribution frequencies. Logistic regression was used for BCC riskassessment. If amounting to less than 0.05, all the p values were consideredstatistically significant. Calculations were performed by using SPSS 13.0 statisticalsoftware. Results: The largest number of patients with BCC is among patients over 60 years(84%), which confirms earlier reports that BCC is more common in the olderpopulation, and that its incidence increases with age. As for the location of BCC, itaffects most commonly the nose area, as the most protruding part of the face.Statistically significant differences in the distribution of alleles and genotypes ofthe polymorphisms+6 76T/G TNF-R2 (p=0.001, χ2 test) and PIN3 Ins 16bp TP53gene (p=0.043, χ2 test) were observed. A significant increase of BCC developmentrisk was observed in TG heterozygotes for the polymorphism +676T/G TNF-R2 incomparison to wild type TT genotypes (OR=4.86, p‹0.001), and also in A1/A2heterozygotes of PIN3 Ins 16bp analyzed polymorphism in TP53 gene incomparison to the wild type A1/A1 genotypes (OR=2.40, p=0.027). Interestingly,GC heterozygotes for the polymorphism -31G/C in the survivin gene showed asignificant decrease of BCC development risk after calculating the adjusted OR incomparison to GG genotypes (OR=0.46, p=0.047). The remaining polymorphismsin TNF-alpha gene (-308G/A), TNF-R1 (+36A/G), MMP-9 (-1562C/T), TP53 (Pro47Ser) did not show significant difference in the frequencies of genotypes andalleles between patients and control group. Conclusion: This research, based on the analysis of polymorphisms in severalselected genes, showed that the polymorphisms +676T/G of TNF-R2 gene, PIN3Ins 16bp of TP53 gene, and -31G/C of survivin gene are modulators of the risk forBCC development in Serbian population. Key words: basal cell carcinoma, single nucleotide polymorphisms, TNF-alpha,TNF receptors, MMP-9, survivin, TP53. Scientific field: Biology Narrower scientific field: Genetics UDC: 575.22:[616.006.6:611.92/93](043.3) S A D R Ž A J: 1. U V O D ................................................................................................................................11.1.KANCER..............................................................................................................................................................................31.2.GENETIČKA OSNOVAKANCERA..............................................................................................................................41.3.KARCINOMI KOŽE..........................................................................................................................................................6 1.3.1.GRAĐA KOŽE ............................................................................................................................................................6 1.3.2.TIPOVI KARCINOMA KOŽE .................................................................................................................................91.3.2.1.Bazocelularni karcinom (BCK) ................................................................................................................................... 101.3.2.2.Klasifikacija bazocelularnog karcinoma ................................................................................................................ 121.3.2.3.Epidemiologija bazocelularnog karcinoma .......................................................................................................... 171.3.2.4.Etiologija bazocelularnog karcinoma ...................................................................................................................... 191.3.2.5.UV zračenje i bazocelularni karcinom .................................................................................................................... 211.4.GENETIČKI POLIMORFIZMI ...................................................................................................................................231.5.FAKTORI UKLJUČENI U INVAZIJE IMETASTAZE ..........................................................................................26 1.5.1.CITOKINI................................................................................................................................................................. 261.5.1.1.Faktor nekroze tumora (TNF-alpha) ....................................................................................................................... 271.5.1.2.Polimorfizam u genu za TNF-alpha (-308 G/A) ................................................................................................. 291.5.1.3.Receptori TNF-alpha (TNF-R1, TNF-R2) ............................................................................................................... 311.5.1.4.Polimorfizmi u genima za TNF receptore:TNF-R1 (+36 A/G), TNF-R2 (+676 T/G) ........................ 34 1.5.2.MATRIKS METALOPROTEINAZE................................................................................................................... 351.5.2.1.Matriks metaloproteinaza 9 (MMP- 9) ................................................................................................................... 381.5.2.2.Polimorfizam u genu za matriks metaloproteinazu 9(-1562 C/T) ........................................................... 401.6.FAKTORI UKLJUČENI U KONTROLU ĆELIJSKE PROLIFERACIJE, DIFERENCIJACIJE I SMRTI.....41 1.6.1.APOPTOZA, programirana smrt ćelije ........................................................................................................ 41 1.6.2.PROTEINI INHIBITORI APOPTOZE .............................................................................................................. 431.6.2.1.Survivin .................................................................................................................................................................................. 431.6.2.2.Polimorfizam u genu za survivin (-31 G/C) ......................................................................................................... 46 1.6.3.TUMOR PROTEIN 53 .......................................................................................................................................... 471.6.3.1.Polimorfizmi u genu za TP53(Pro47Ser, PIN3 Ins 16bp).............................................................................. 51 2. CILJEVI RADA................................................................................................................. 55HIPOTEZA ISTRAŽIVANJA ..............................................................................................................................................56 3. PACIJENTI,MATERIJAL I METODE .......................................................................... 573.1. PACIJENTI I BIOLOŠKIMATERIJAL ....................................................................................................................583.2. METODE .........................................................................................................................................................................58 3.2.1. Izolacija DNK iz limfocita periferne krvi................................................................................................... 58 3.2.2. Izolacija DNK iz tumorskog tkiva ................................................................................................................ 60 3.2.3. Određivanje koncentracije DNK u uzorku ................................................................................................ 61 3.2.4. Lančana reakcija polimeraze (PCR metoda) .......................................................................................... 623.2.4.1. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-alpha .............................................................................. 633.2.4.2. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-R1 .................................................................................... 643.2.4.3. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-R2 .................................................................................... 653.2.4.4. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za MMP-9 ..................................................................................... 663.2.4.5. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za survivin ................................................................................... 673.2.4.6. PCR reakcija u analizi polimorfizma TP53 gena ............................................................................................... 68 3.2.5. Poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE)............................................................................................... 69 3.2.6. Restrikciona digestija PCR produkata i analiza dužine restrikcionih fragmenata (RFLP) 70 3.2.6.1. RFLP u analizi polimorfizma gena za TNF alpha -308 G/A............................................................................ 70 3.2.6.2. RFLP u analizi polimorfizma TNF-R1 gena za +36 A/G ................................................................................... 72 3.2.6.3. RFLP u analizi polimorfizma TNF-R2 gena za +676 T/G................................................................................. 73 3.2.6.4. RFLP u analizi polimorfizma MMP-9 gena za -1562 C/T ............................................................................... 74 3.2.6.5. RFLP u analizi polimorfizma gena za SURVIVIN za -31 G/C.......................................................................... 75 3.2.6.6. RFLP u analizi polimorfizma TP53 gena (Pro47Ser, PIN3 Ins 16bp)........................................................ 76 3.2.7. Statistička analiza ............................................................................................................................................. 78 4. REZULTATI..................................................................................................................... 794.1.DISTRIBUCIJA PACIJENATA PREMAGODINAMA STAROSTI ...................................................................804.2.LOKACIJA TUMORA....................................................................................................................................................814.3.VELIČINA TUMORA I PROTEKLOVREMEODUOČAVANJA PRVE PROMENE...................................834.4.ANALIZA GENETIČKIH REZULTATA ..................................................................................................................85 4.4.1.Analiza polimorfizma u genu za TNF-alpha............................................................................................. 85 4.4.2.Analiza polimorfizma u genu za TNF-R1................................................................................................... 87 4.4.3.Analiza polimorfizma u genu za TNF-R2................................................................................................... 90 4.4.4.Analiza polimorfizma u genu za MMP-9.................................................................................................... 92 4.4.5.Analiza polimorfizma u genu za survivin .................................................................................................. 95 4.4.6.Analiza polimorfizma u TP53 genu.............................................................................................................. 97 5. DISKUSIJA ....................................................................................................................1015.1.POLIMORFIZAMUGENUZA TNF-ALPHA...................................................................................................... 1025.2.POLIMORFIZMI U GENIMA ZA TNFRECEPTORE: TNF-R1 I TNF-R2................................................. 1085.3.POLIMORFIZAMUGENUZAMMP-9................................................................................................................ 1125.4.POLIMORFIZAM -31G/C U GENU ZA SURVIVIN.......................................................................................... 1155.5.POLIMORFIZMI U TP53 GENU, PRO47SER I PIN3 INS 16BP ................................................................. 118 6. ZAKLJUČCI ....................................................................................................................123 7. LITERATURA................................................................................................................126 8. BIOGRAFIJA AUTORA ...............................................................................................155 9. PRILOZI..........................................................................................................................157 1. U V O D Uvod 2 Razvoj velikog broja molekulsko-bioloških i molekulsko-genetičkih metodaposlednjih decenija u značajnoj meri je doprineo boljem razumevanju strukture iorganizacije genetičkog materijala. To nam je dalo i uvid u različite aspektenormalnog funkcionisanja ćelija, kao i patoloških promena u njima.Procesi poput apoptoze, zatim složeni mehanizmi regulacije ćelijskogciklusa, kao i procesi neoplastične transformacije danas su u osnovnim crtamadobro opisani. Razvijene su mnoge eksperimentalne tehnike koje namomogućavaju bolju dijagnostiku i razumevanje etiologije malignih oboljenja. Ubudućnosti će nam pružiti i načine za bolju prevenciju, efikasniju terapiju, i, uvelikoj meri, personalizovanu medicinu. Uvod 3 1.1. KANCERTumori predstavljaju masu izmenjenih ćelija koje se karakterišunepravilanim i progresivnim rastom. Mogu biti maligni (zloćudni) i benigni(dobroćudni). Razlika između njih je u agresivnosti rasta. Zapravo, maligni sekarakterišu metastazama i šire se (infiltriraju) u okolno tkivo, dok benigni tumorine daju metastaze u druge organe i ne infiltriraju okolno zdravo tkivo, već gapotiskuju.Rak (ili još kancer, maligna neoplazma, maligni tumor) nastajeneoplastičnom transformacijom ćelija i tkiva. Neoplastična transformacija jeproces narušavanja tkivne homeostaze u pravcu nekontrolisane proliferacije ćelijai inhibicije ćelijskog umiranja nekim od oblika programirane ćelijske smrti. To jevišestepeni proces, a svaki stepen odražava genetičke izmene koje dovode dotransformacije normalne ćelije u malignu. Ćelija prolazi kroz različite morfološke ibiohemijske izmene, što sve dovodi do nekontrolisane deobe ćelije i, konačno,usled poremećaja u imunološkom nadzoru i angiogenezi do metastaze naudaljenim mestima u telu.U zavsnosti od porekla ćelija od kojih nastaju, maligni tumori se dele unekoliko grupa:  Karcinomi – počinje na pokrovnom epitelu kože, sluznica ili tkiva kojepokrivaju unutrašnje organe,  Sarkomi – rak mišićnog i vezivnih tkiva (kostiju, hrskavice, masnog tkivakrvnih sudova ili vezivnih tkiva u i oko zglobova),  Leukemije – rak krvi - počinje u kostnoj srži, gde se obrazuju sve ćelijekrvnih elementa, odakle kao izmenjene ćelije odlaze u cirkulaciju,  Limfomi i mijelomi – rak limfnog sistema (limfnih čvorova-žlezda i limfnihsudova)  Tumori centralnog nervnog sistema – mozga, kičmene moždine i ovojnicase razvija u tkivima koje sačinjavaju mozak i kičmena moždina. Uvod 4 1.2. GENETIČKA OSNOVA KANCERADanas je prihvaćen stav da je kancer u osnovi bolest povezana sapromenama u genima, koja se razvija u više faza. Za malignu transformaciju jenajčešće potrebno 5−7 nezavisnih mutacija, a u ovaj proces su neposrednouključene dve glavne klase gena: protonkogeni i tumor-supresor geni. Onkogeni su geni čiji proteinski produkti stimulišu ćelijski rast i deobu. Uformi proto-onkogena (normalni, nemutirani) oni se vremenski i prostorno strogokontrolisano eksprimiraju. Mutacijom proto-onkogeni prelaze u formu onkogena,koji se nekontrolisano eksprimiraju. Te mutacije mogu biti:- tačkaste mutacije- genske delecije- amplifikacije gena- hromozomski rearanžmani (najčešće translokacije) Mutacije u proto-onkogenima su dominantne u odnosu na malignitet –dovoljna je jedna kopija aktiviranog onkogena da bi se ispoljio kancerogeni efekat.Na osnovu funkcije proto-onkogeni mogu biti: - faktori rasta (c-sis) - receptori faktora rasta (c-erbB) - prenosioci signala (c-abl, c-src, c-ras) - regulatorni proteini nukleusa (c-myc, c-fos, c-erbA). Tumor-supresorni geni (antionkogeni) su geni čija je osnovna funkcijaregulisanje ćelijskog ciklusa, kontrola procesa proliferacije i diferencijacije iočuvanje ukupne stabilnosti genoma. Nedostatak ekspresije ovih gena dovodi dogubitka kontrole ćelijskog ciklusa i povezuje se sa malignom alteracijom ćelije. Zarazliku od onkogena, ovde se mutacije u odnosu na malignitet ponašaju recesivno –neophodna je izmena oba alela (homozigotno stanje) da bi došlo do kancerogenogefekta. Uvod 5 Na osnovu funkcije antionkogeni mogu biti: - regulatori ćelijskog ciklusa - regulatori signalne transdukcije - geni uključeni u međućelijske interakcije i interakcije ćelije i matriksa - regulatori apoptoze - citoskeletni geni - neklasifikovani Savremene podele u posebne kategorije svrstavaju gene uključene u procesapoptoze i u popravke DNK oštećenja. Ovi geni se po svojm krajnjem efektu mogutakođe klasifikovati u onkogene i antionkogene (npr. proapoptotski geni bili biantionkogeni, a antiapoptotski onkogeni).Danas je jasno da su procesi maligne transformacije u velikoj meri posledicarazličitih štetnih uticaja spoljašnje sredine. Takođe, poznato je da mnoga malignaoboljenja nose i naslednu predispoziciju za svoj nastanak. U poslednje vreme sveviše pažnje se usmerava na proučavanje doprinosa genetičkih polimorfizama umalignoj transformaciji. To će nam omogućiti i da bolje pratimo tok razvoja bolestii preciznije utvrdimo prognostičke parametre pri terapiji različitih pacijenata.Najučestaliji tip karcinoma kod čoveka, o čijoj se genetici i epigenetici jošuvek nedovoljno zna, čine karcinomi kože, zloćudne promene koje u 90% slučajevanastaju na fotoeksponiranim delovima tela i direktno se povezuju sa oštećenjimakože nastalim pri dugotrajnom izlaganju ultraljubičastim zracima (UVA, UVB).Njihova incidence je u konstantnom porastu poslednjih decenija i sve češće sejavljaju i u mlađem uzrastu tako da predstavljaju sve izraženiji medicinskiproblem. Uvod 6 1.3. KARCINOMI KOŽEDa bi se bolje razumela patogeneza malignih tumora kože, izuzetnorasprostranjenog oboljenja današnjice, neophodno je dati osnovne informacije ohistološkoj građi i karakteristikama kože kao najvećeg organa našeg tela i njegovogomotača koji je u neposrednom kontaktu sa spoljašnjom sredinom. 1.3.1.GRAĐA KOŽEGrađa kože je izuzetno složena. Podeljena je u dva različita, ali funkcionalnozavisna sloja, epidermisa (pokožice) i dermisa (krzna). Funkcija kože je na prvommestu zaštitna, štiti telo od mehaničkih povreda, hemijskih, termičkih uticaja,patogenih mikroorganizama i uticaja UV zračenja. EpidermisEpidermis je površinski sloj kože izgrađen od velikog broja epitelijalnihćelija koje su zbijene jedna uzdrugu i grade kompaktan sloj.Njegova debljina varira od 0,1mmna telu, tek 0,02mm na licu do 1-5mm na tabanima i šakama.Keratinocite su raspoređena takoda grade 5 slojeva epidermisa: stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum i stratum corneum (Slika 1). Stratum basale činekeratinocite ravnomernoraspoređene na bazalnojmembrani koja oštro razgraničavaepidermis od dermisa i koje suSlika 1. Građa epidermisapreuzeto:http://lcsdanatomyphysiology.wikispaces.com/Epedermal+cells,+p1, modifikovano Uvod 7 aktivne u toku celog života i svojim deobama obrazuju gornje slojeve ćelija. Ućelijama gornjih slojeva epidermisa dolazi do procesa orožnjavanja, odnosnoizumiranja ćelija i taj sloj epidermisa se odbacuje. U bazalnom sloju smeštene su imelanocite, ćelije koje stvaraju pigment i pružaju zaštitu od mutageneze izazvaneUV zračenjem. Bazalna membranaBazalna membrana je zona između bazalnih keratinocita i dermisa. Njenaosnovna uloga je da deluje kao propustljiva barijera i da kontroliše ćelijskuorganizaciju i diferencijaciju između receptora na površini ćelija i molekula unutarekstraćelijskog matriksa. DermisDermis je sastavljen od rastresitog vezivnog tkiva u kome su dominantnakolagena vlakna utopljena u matriksu koji sadrži ćelije: fibroblaste, makrofage,limfocite, adipozne ćelije. Pored toga u dermisu su smešteni i završeci krvnih ilimfnih sudova, nervni završeci, razni čulni organi, snopovi glatkih mišićnihvlakana, derivati epidermisa i krzna, čulni organi, razne egzokrine žlezde kojepreko izvodnih kanala izbacuju sekret na površinu kože.Površina dermisa obrazuje mnoga ispupčenja koja zalaze u epidermis čimeje ostvarena tesna veza između ova dva dela. Ekstraćelijski matriks (ECM)Popunjava prostor između ćelija i povezuje ćelije istog ili različitih tkiva. Triglavna konstituenta ECM-a su:• kolagena vlakna• adhezivni proteini koji formiraju mrežu (elastin, laminin, fibronektin)• interfibrilarni solubilni polimeri- proteoglikani Uvod 8 Njegove uloge su:  strukturna potpora ćelijama i tkivima  regulacija ćelijskog ponašanja (utiče na razviće, oblik, polarizaciju,ponašanje i funkciju ćelija i tkiva, pričvršćuje ih i omogućava migracijućelija). Podela kože po fototipovimaPrema načinu i brzini reakcije kože na delovanje Sunčevih zraka razlikuje sešest fototipova kože. Najosetljivije su osobe sa tipovima kože I i II.  Tip I: keltski tip kože: lako gori, uvek pocrveni, nikada ne tamni. Svetle oči,beo ten sa pegama, riđa ili plava kosa. Najčešće zastupljen u Kanadi i nakrajnjem severu Evrope.  Tip II: germanski tip kože: lako gori, uvek pocrveni, vrlo malo tamni. Očiplave, smeđe ili boje lešnika, kosa riđa ili svetla i ten svetao.  Tip III: srednje evropski, kavkaski tip kože: umereno gori, postepeno iravnomerno tamni. Ten je srednje svetao. Svetla koža, kestenjasta kosa i oči.  Tip IV: mediteranski, mongolski, orijentalni ili hispano tip kože: minimalnogori i uvek dobro tamni do srednje tamne nijanse. Koža je svetla ili umerenotamna, oči i kosa su tamnosmeđe boje.  Tip V: hispano, indijanski tip kože: retko gori, dobro tamni do tamnobraonnijanse. Nesunčana koža je vrlo tamna, tamne oči i kosa.  Tip VI: crni (afrički i američki crnci,i Aboridžini): koža nikad ne gori, imaveliku količinu pigmenata, potpuno je crna i bez sunčanja. Crne oči i kosa. Uvod 9 1.3.2.TIPOVI KARCINOMA KOŽEMaligni epitelni karcinomi kože, pa i regiona glave i vrata, dele se namelanomske i nemelanomske (amelanotične).Nemelanomske karcinome kože (NMKK) ili keratinocitne karcinome činenajvećim delom bazocelularni karcinom (BCK) koji zahvata bazalni epitel iskvamocelularni karcinom (SCK), poreklom od pločastog epitela (oko 95%, Slika 2). Melanomi čine svega 5% malignih tumora kože.Incidenca nemelanomskih karcinoma kože u konstantnom je porastu.Utvrđeno je da svake godine oboli 2-3 miliona ljudi od ovog tipa karcinoma(Foster, 2008; WHO, 2009). Samo u SAD-u oboli 1,3 miliona ljudi svake godine, aočekuje se da će se taj broj udvostručiti u narednih 30 godina (Rhee, 2007). Najvećitrendovi oboljevanja od ovog karcinoma su u pojedinim delovima Evrope, uKanadi, SAD-u, Australiji (u proseku 3-8% populacije svake godine). Slika 2. Najčešći oblici karcinoma kože sa procentualnim učestalostima preuzeto:http://www.doctorsapproach.com/blog/category/skin-cancer/, modifikovano Uvod 10 1.3.2.1. BAZOCELULARNI KARCINOM (BCK)Bazocelularni karcinom (sinonimi: epithelioma basocellulare, bazaliom)neosporno je najčešći maligni karcinom kože, a njegova učestalost je u stalnomporastu. Prvi put je opisan 1824. godine i čini oko 75% (Slika 2) svih karcinomakože, posebno u populaciji Kavkazijanaca (Chung, 2012). To je relativno spororastuća, bezbolna, lokalno invazivna i rekurentna maligna epidermalna neoplazma(Wong i sar., 2003). Razvija se od nediferenciranih ćelija bazalnog sloja epidermisa(Slika 3) ili iz gornjeg dela spoljnjeg lista korena dlake koji neprekidno pratifolikularni epidermis i podleže keratinizaciji kao i epidermis (Wong i sar., 2003).Bazocelularni karcinomi su histološki solidni epitelni tumori čiji celularni elementiliče na stratum basale epidermisa. Parenhim tumora grade ćelije sa velikim,ovalnim bazofilnim jedrima, dok je stroma oskudna. Tumorske ćelije su grupisaneu trake koje od epidermisa rastu u korijum. Spoljašnji sloj ćelija je palisadnograsporeda, dok su u centru tumora ćelije nepravilno raspoređene. Između trakatumorskih ćelija nalazi sevezivno tkivo koje je više(sklerodermiformni tip)ili manje zastupljeno. Slika 3: Prikaz ćelija epidermisa u zdravom obliku i u karcinomima preuzeto:http://www.mayoclinic.com/health/medical/IM00941, modifikovano Uvod 11 Slika 4. Zastupljenost BCK-a na delovima tela (a) i u regionu glave i vrata (b) Studije pokazuju da se u najvećem broju slučajeva ovaj karcinom javlja nadelovima kože izloženoj sunčevim (UV) zracima, odnosno u regionu glave i vrata (Tilli i sar., 2005) Slika 4a, a najčešće u gornjim dvema trećinama lica, iznad linijekoja spaja ugao usana i tragus ušne školjke, u predelu usana, očnih kapaka,nazolabijalnog puta, nosa (Slika 4b), a zatim na trupu i na gornjim i donjimekstremitetima. Bazocelularni karcinom kože najčešće se javlja de novo, ređe izprekanceroza, kao što su senilne keratoze, radijacione dermatoze. Bazocelularnikarcinomi mogu da se jave kod oboljenja Xeroderma pigmentosum. Postoje rasne (etničke) i geografske razlike u javljanju bazocelularnihkarcinoma, a takođe na njegovu pojavu jasan je i uticaj profesije i načina života(osobe poput farmera, zemljoradnika daleko češće obolevaju od ovog tipa kanceranego oni koji svoje radne obaveze obavljaju u zatvorenim prostorijama; takođežene imaju veću incidencu ovog karcinoma na nogama u odnosu na muškarce, zbogveće izloženosti ovih delova tela UV zracima). Značaj ekspozicije Suncu i uopšte a b Uvod 12 značaj uticaja faktora spoljašnje sredine priznaju praktično svi autori. Međutim,veliki procenat BCK-a na delovima tela koji nisu izloženi UV zračenju ukazuje na toda i drugi faktori mogu imati značajnu ulogu u razvoju BCK-a (Gallagher, 1996). 1.3.2.2. Klasifikacija bazocelularnog karcinoma Ne postoji opšteprihvaćena klasifikacija BCK-a i nekoliko sistemaklasifikacije je u primeni (Vantuchova, 2006), Tabela 1. Tabela 1: Poređenje klasifikacije BCK-a prema različitim autorima Uvod 13 Međutim, danas se ipak najviše koristi klasifikacija BCK-a predložena odstrane AJCC (eng. American Joint Committee on Cancer Classification), koja vršipodelu prema tzv. TNM-sistemu: Na osnovu svih navedenih parametara (T, N, M) izvodi se podela nastadijume (Tabela 5), s obzirom da su kod BCK-a parametri N i M uvek jednaki 0,stadijum zavisi direktno od veličine tumora (T). Stadijum kancera je jako bitanparametar koji lekaru pokazuje kojom brzinom se kancer zapravo širi, a to je važnojer dalji tretman pacijenta uglavnom od toga zavisi. TX Tumor se ne može oceniti T0 Nema znakova tumora Tis Karcinom in situ T1 Tumor veličine 2cm ili manji u najvećem dijametru T2 Tumori veći od 2cm, ali manji od 5cm T3 Tumor veličine 5cm i veći, u najvećem dijametru, tzv. džinovski BCK T4 Velika invazija tumora duboko u tkivo NX Reg.limf.čvorovi se ne mogu oceniti N0 Nema metastaza u reg.limf.čvorovima N1 Metastaze su prisutne, tumor se proširio na najbliže ili mali brojreg.limf.čvorova, u najširem dijametru 3cm N2 Metastaze su prisutne u dijametru većem od 3cm, ali manjem od 6 cm N3 Metastaze su prisutne u dijametru većem od 6 cm M0 Nema udaljenih metastaza M1 Metastaze u udaljenim organima (izvan reg.limf.čvorova) Tabela 3 : Stepen širenja tumora prema regionalnim limfnim čvorovima (N) Tabela 2: Kategorije tumora prema njegovoj veličini (T) Tabela 4: Prisustvo metastaza (M) Uvod 14 Spates i saradnici (2003) navode da prvi opis metastazirajućeg BCK-a datiraiz 1894. godine. Iako metastazira relativno retko (0,028%-0,55%), porast veličinekarcinoma povećava incidencu metastaza. Karcinomi veći od 3cm imaju incidencumetastaziranja 2%; veći od 5cm povećavaju taj rizik na 25%; sa porastom veličinekarcinoma do 10 cm u prečniku, rizik od pojave metastaza raste do 50%; a kadakarcinom dostigne veličinu od 25cm u prečniku i više, metastaze su gotovo sigurnoprisutne.Opisani su mnogobrojni morfološki podtipovi BCK-a. Kao najčešći ističu se: epithelioma basocellulare nodulare:50-80% svih slučajeva BCK-a pripadaju ovoj grupi, a 85-90% slučajeva je u regionuglave i vrata i karakterističan je za stariji deo populacije. Formira se u vidu čvorićaveličine čiodine glave, tvrdoelastičnekonzistencije, boje normalne kože ili lakopresijavajuće. Tumefakt se sporo uvećava, ana površini se primećuju telangiektazije(prošireni kapilari). Karcinom može danaraste do nekloliko centimetara, madačešće, posle nekog vremena, u centru tumoranastaje nekroza, koja se prekriva slaboadherentnom krastom, dok se po ivici videsitni perlasti tumefakti. Stadijum 0 Tis; N0; M0 Stadijum 1 T1; N0; M0 Stadijum 2 T2; N0; M0 Stadijum 3 T3; N0; M0 ili T1 do T3; N1; M0 Stadijum 4 T1 do T3; N2; M0 ili bilo koje T; bilo koje N; M1 Tabela 5: Stadijum kancera Slika 5. Nodularni BCK preuzeto: Chung, 2012. Uvod 15 epithelioma basocellulare superficiale:Drugi po učestalosti sa oko 10-15% slučajevaBCK-a, najčešće se javlja na trupu (40%) ilidonjim ekstremitetima (14%) i to kod mlađihljudi. Ima veoma spor razvoj i može dadostigne nekoliko centimetara u prečniku.Manifestuje se u vidu plaža nepravilnogoblika, lako uzdignutih, transparentnih iliperlastih ivica. Površina mu je eritematoznasa ožiljnim ili atrofičnim arealima i sivkastim,umereno čvrstim prominencijama izmeđukojih se mogu naći tačkaste erozije pokrivenekrustoskvamama. Ovo je najuobičajnija formaBCK-a kod pacijenata obolelih od HIV-a. ulcus rodens (Jacobi ulcus):počinje malom ranicom obično posle nekemikro povrede, ogrebotine i sl. Ranica jenepravilnog oblika, bezbolna, pokrivenaprljavo žutom, braonkastom do mrkomkrustom, koja povremeno otpada i zamenjujese novom, a ranica ne zarasta već se postepenoširi i produbljuje. Ivice su nepravilne, oštre, uravni okolne kože ili neznatno uzdignute.  ulcus terebrans: prethodna ulceracija najednom počinje naglo da se širi iprodubljuje izazivajući destrukciju okolnog tkiva. Destruktivni procesi su veomajaki, tako da za kratko vreme zahvate kožu, mišićno tkivo ispod krvne i nervnestrukture, koštane elemente, dovodeći veoma brzo do veoma opsežnih razaranja iunakaženja. Lokalizuje se obično u predelu lica i poglavine. Slika 7. Ulcus rodens preuzeto: Chung,2012. Slika 6. Superficijalni BCK preuzeto: Detanac, 2010. Uvod 16 epithelioma basocellulare sclerodermiformis: 5% svih BCK-a, obično se javljana licu u vidu lako uzdignutog, bledožućkastog čvorića glatke površine, koji nijeoštro ograničen u odnosu na okolnu zdravu kožu. epithelioma basocellulare pigmentosum:čini oko 6% svih BCK-a. Karakteriše setamnobraon do potpuno mrkompigmentacijom koja je prisutna od samognastanka tumora. Najčešće poprima osobinenodularnog ili nodozno-ulceroznog BCK-a.Češće se javlja kod osoba tamne kože, kose iočiju, a smatra se uobičajenom formom upopulaciji Azijata. Retki su infundibulocistični, metatipični, bazoskvamozni, infiltrativni,mikronodularni tipovi BCK-a, ali oni važe i za mnogo agresivnije i karakteriše ihveća stopa recidiva (Jacobs, 1982).Sindrom nevoidnog BCK-a (Sy Gorlin-goltz) je redak nasledni oblik BCK-a.Nasleđuje se autozomno dominantno, a mutacija gena lokalizovana je nahromozomu 9q22.3-q31. Javlja se na licu ili trupu u vidu većeg broja tumorskihčvorića, boje normalne kože, glatke površine. Promene na koži praćene suanomalijama u razvoju koštanog sistema i/ili intelektualnim i drugimporemećajima (Epstein, 1999).Metode lečenja BCK-a uključuju: ranu hiruršku eksciziju in toto uzpatohistološku analizu, krioterapiju, kiretažu i elektrodisekciju, radioterapiju,fotodinamsku terapiju, te lokalnu primenu citostatika i imunomodulatora.Nelečen ili neodgovarajuće lečen BCK može da postane invazivan i lokalnoagresivan, iako veoma retko metastazira (Lear i sar., 2007). Slika 8. Pigmentovani BCK preuzeto: Chung, 2012. Uvod 17 1.3.2.3. Epidemiologija bazocelularnog karcinomaBazocelularni karcinom može da se javi već u trećoj deceniji života, ali je to,pre svega, bolest zrelog i starijeg životnog doba i incidenca izrazito raste sagodinama života kod oba pola (Slika 9). Svega 5-15% obolelih su osobe između 20i 40 godina, a 70% obolelih čine osobe starije od 70 godina (Chung, 2012; Slika 9).Noviji rezultati istraživanja govore da su detinjstvo i adolescencija kritični periodiza kasniji razvoj malignih karcinoma kože jer se u tom životnom dobu apsorbujedo 80% UV zraka, dok se ostalih 20% apsorbuje u ostalim periodima života. Ovonameće zaključak da rana i pravilna fotozaštita može da smanji rizik od kasnijegnastanka malignih karcinoma kože (Pašić, 1998). Korišćenje kreme za sunčanje savisokim faktorom zaštite tokom prvih 18 godina života, može da smanji incidencuoboljevanja od BCK-a čak do 70% (Diffey, 1991).Bazocelularni karcinom kože češći je kod starijih muškaraca nego kod žena,taj odnos se kreće oko 2:1 (Chung, 2012), odnosno na 100 000 Kavkazijancagodišnje oboli 475 muškaraca i 250 žena. Međutim, zbog upotrebe solarijuma isredstava za potamnjivanje kože, broj žena obolelih od BCK-a između 16 i 29godine života, u poslednjih 30 godina se udvostručio. Slika 9 . Incidenca pojave BCK-a i stopa mortaliteta u odnosu na godine života kod muškaraca i žena preuzeto: http://www.ucalgary.ca/familymedicine/Skin_Cancer Uvod 18 Incidenca BCK-a je relativno niska u populaciji Azijata, Crnaca i Hispanaca(Chung, 2012), dok je među Kavkazijancima visoka, posebno kod osoba satipovima kože I i II (Boukamp, 2005). Uzrok tome je što koža belaca nema velikumogućnost stvaranja pigmenta pa je, samim tim, izloženija štetnom uticajuultraljubičastog (UV) zračenja. Nekoliko epidemioloških studija pokazalo je daučestalost zavisi od godišnjeg broja sunčanih dana, odnosno da postoji značajnapovezanost sa geografskom širinom. Tako su najveće zabeležene incidence usevernom delu Australije (Cancer Council Australia, 2008). Idući od ekvatoraprema polovima, za svakih 10 stepeni geografske širine učestalost se smanjuje zaoko 50%. Ovo je samo još jedna potvrda već poznate činjenice da porastgeografske širine, počev od ekvatora i smanjenje pigmentacije kože u značajnoj suvezi sa povećanjem inicidence različitih tipova kancera ili povećanjem agresivnostikancera (Bouillon i sar., 2006; Deeb i sar., 2007).Najnovija istraživanja pokazuju porast incidence BCK-a za 3-8% godišnje,širom sveta. Zabeležen je znatan porast u Evropi, Sjedinjenim AmeričkimDržavama i Australiji, u toku nekoliko prošlih decenija (Massari i sar., 2007). Ubudućnosti se procenjuje da će ova incidenca biti još veća (Slika 10). Razlog tome Slika 10. Prikaz povećanja broja umrlih od BCK-a kroz vreme sa prognozama za budućnost preuzeto: Global Benefits and Costs of the Montreal Protocol on Substance that Deplete the Ozone Layer Uvod 19 su povećana izloženost UV zracima, sve veća oštećenja ozonskog omotača,promene kulturoloških navika, duži životni vek ljudi (Gloster, 1996) i dr. 1.3.2.4. Etiologija bazocelularnog karcinoma U nastanku BCK-a važnu ulogu ima mnoštvo endogenih i egzogenihetiopatogenetskih faktora. Od egzogenih faktora najvažnija uloga pridaje se uticajuSunčevih, nejonizujućih, ultraljubičastih (UV) elektromagnetnih talasa, čije jedelovanje potencirano tanjenjem ozonskog omotača i širenjem ozonskih rupa.Količina UV zraka koja dolazi do površine Zemlje zavisi od stanja u atmosferi iokolini (npr. oblačno vreme, zagađenje vazduha), nadmorske visine, godišnjegdoba i geografske širine (ozonski sloj je tanji oko ekvatora). Slika 11. Uloga egzogenih i endogenih faktora u nastanku nemelanomskog karcinoma kože Uvod 20 Osim izrazitog mutirajućeg efekta na ćelijsku DNK, UV zračenje može dadeluje i suprimirajuće na imuni odgovor (Slika 11). Imunodeficijentni iimunosuprimirani bolesnici (oboleli od hroničnih leukemija, od AIDS-a, posletransplantacije organa, na sistemskoj kortikosteroidnoj terapiji i dr.) imaju izrazitopovećan rizik za nastanak BCK-a. Važnu ulogu u nastanku BCK-a imaju i različitehemijske materije i jonizujuće zračenje. Hemijske supstance koje mogu uticati narazvoj ovog karcinoma su katrani, parafinsko ulje i arsen. U prošlosti su searsenska jedinjenja koristila u obliku Fowler-ovih rastvora (trovalentni neorganskiarsen) za lečenje astme i psorijaze, što je dovodilo do nastanka karcinoma kože,doduše uz vreme latencije od 20 do 30 godina. Multiple lezije superficijalnog BCK-amogu biti povezane sa unošenjem arsena u lekovima, hrane ili vode kontaminiranearsenom ili tokom profesionalne izloženosti u industriji. Duvanski dim je takođepovezan sa pojavom nemelanomskog karcinoma kože, ali je ta veza daleko jača kodSCK-a u odnosu na BCK. Međutim, Boyd i saradnici (2001) su utvrdili da postojiznačajna povezanost duvanskog dima i pojave BCK-a kod mlađih žena.Jonizujuće zračenje takođe može dovesti do nastanka BCK-a, najčešće kodljudi koji su profesionalno izloženi rendgenskim zracima, ali je ovaj rizik smanjenusled dobro kontrolisane profesionalne ekspozicije.Više autora je ukazalo na asocijaciju infekcije humanim papiloma virusom(HPV) i pojave BCK-a. Harwood i Proby (2002) su pokazali da HPV može sprečitiapoptozu ćelija indukovanu UV zračenjem.U endogene činioce ubrajaju se genetički (konstituciono) određen tip kože(fototip), koji se razlikuje prema osnovnoj boji kože kao i mogućnosti tamnjenjatokom izlaganja UV zračenju. Naročitu sklonost za razvoj BCK-a imaju tipovi kože Ii II. Drugi značajan endogeni faktor je količina lipida na površini kože. Viši nivolipida štiti od UV zračenja, te smanjuje njegov uticaj u nastanku BCK-a. Poznato jeda bolesnici sa seboroičnom kožom, sklonom nastanku akni, imaju manjuverovatnoću nastanka BCK-a (Kennedy i sar., 2003). Uvod 21 1.3.2.5. UV zračenje i bazocelularni karcinomSunce emituje dve vrste UV zraka koji mogu dospeti do površine Zemlje(Slika 12), UVA (talasne dužine 320 - 400 nm) i UVB (talasne dužine između 290 i320 nm), dok su UVC zraci (talasne dužine 200 - 290 nm) uglavnom filtriraniozonskim omotačem u gornjim delovima atmosfere. Sa stanovišta kancerogenezenajštetniji deo spektra Sunčeve svetlosti su UVB zraci. Samo jedan procenat UVBzraka dospe do površine Zemlje. Izloženost kože UVzracima je najčešći uzroknastanka BCK-a. KonceptUV zračenja, kao glavnogetiološkog faktora upatogenezi BCK-a, potiče spočetka XX veka, kada sulekari zapazili da sekarcinom češće javlja naSuncem oštećenoj koži,mahom kod osoba koje sebave poslovima naotvorenom. Tako jeSunčeva svetlost bilajedan od prvihprepoznatih kancerogenihfaktora za ljude. Od tadasu brojne epidemiološkestudije potvrdile da UVzračenje izaziva karcinom kože. Najubedljivija je činjenica da se karcinomdominantno pojavljuje na delovima tela koji su stalno izloženi Suncu, to suprevashodno lice, glava i vrat. Slika 12. Tipovi UV zraka i njihova prodornost na koži preuzeto: http://www.coolasuncare.com/sun- science/uva-vs-uvb Uvod 22 Osamdesetih godina prošlog veka utvrđeno je da se ozonski sloj smanjujedelovanjem hlorofluorokarbona i drugih hemikalija koje se koriste u industriji iotpuštaju u atmosferu. Zbog toga danas oštećenje ozonskog omotača i povećanakumulativna izloženost UV zračenju usled produženog životnog veka, znatnopovećavaju rizik za dobijanje BCK-a (Slika 13). Međutim, važno je napomenuti da incidenca skvamocelularnog karcinoma(SCK-a) više zavisi od izloženosti Sunčevim zracima nego što je to slučaj sa BCK-om, ukazujući na to da i drugi faktori, uz izloženost Sunčevim zracima, mogu bitiodgovorni za razvoj BCK-a. Nekoliko epidemioloških studija pokazalo je daincidenca BCK-a u slaboj asocijaciji s kumulativnom izloženošću Sunčevoj svetlostitokom života i da je više povezana s povremenim, intenzivnim izlaganjem Suncu iizlaganjem u toku detinjstva, praćenim bolnim opekotinama. Skorašnja, kohortnastudija, sprovedena među 966 ispitanika (Kennedy i sar., 2003) analizirala jefaktore sredine i genetičke faktore rizika za karcinom kože. Rezultati studije su Slika 13. Uticaj oštećenja ozonskog omotača na povećan rizik za oboljevanje od BCK-a preuzeto: http://ucce.ucdavis.edu/files/repository/calag/fig4903p26.jpg Uvod 23 pokazali povezanost bolnih opekotina od Sunca koje su se javljale pre dvadesetegodine života sa skvamocelularnim i bazocelularnim karcinomom, kao i saaktiničnom keratozom. Međutim, kumulativna izloženost Suncu u toku života uvezi je sa skvamocelularnim karcinomom i aktiničnom keratozom, alizanemarljivom stepenu sa BCK-om (Wikonakal i Brash, 1999). 1.4. GENETIČKI POLIMORFIZMI Genom čoveka sadrži oko 3,2 milijarde baznih parova po haploidnom setu ioko 20 000 gena (Turnpenny i Ellard, 2009). Varijabilnost (raznovrsnost) međujedinkama ili grupama jedinki u populaciji može se posmatrati na morfološkomnivou, na nivou protein, hromozoma i konačno na nivou DNK sekvenci.Populaciono genetičkim analizama utvrđeno je da postoji velika genetičkavarijabilnost u ljudskim populacijama, pri čemu najveći deo varijabilnosti odlazi naindividualne razlike unutar lokalne populacije (oko 85%), a da na nivou celeljudske populacije postoji genetička uniformnost.Genetička varijabilnosti obično se meri pomoću dva parametra – proporcijepolimorfnih lokusa i heterozigotnosti populacije.Za neki gen/lokus se kaže da je polimorfan ako u populaciji postoje bar dvenjegove varijante (aleli), pri čemu je učestalost ređeg (ili najređeg) alela bar 1%, tj.pri čemu je ona dovoljno velika da se ne smatra proizvodom samo mutacionogprocesa (Frazer i sar., 2009). Proporcija polimorfnih lokusa u populacijipredstavlja odnos broja polimorfnih lokusa i ukupnog broja ispitanih lokusa upopulaciji. Bolja mera varijabilnosti u populaciji je heterozigotnost.Heterozigotnost za određeni lokus predstavlja proporciju heterozigotnih jedinki zataj lokus, a ako se ispituje više lokusa, odredi se i prosek za sve lokuse. Uvod 24 Postoji više različitih DNK polimorfizama:  SNP (polimorfizmi pojedinačnih nukleotida)  VNTR (varijabilni broj tandemskih ponovaka)  Del/Ins polimorfizmi-nastaju kao rezultat insercije ili delecije određenogdela DNKSNP-ovi čine oko 85% svih polimorfizama. Procenjeno je da humani genomsadrži čak 11 miliona SNP-ova (Frazer i sar., 2009). Njihova lokacija na molekuluDNK može biti unutar promotorskog regiona (kada polimorfizam ima negativanpredznak ″-″) u egzonu (kodirajućem regionu) ili u intronu (nekodirajućemregionu), kada polimorfizam ima pozitivan predznak ″+″.Svi ovi polimorfizmi nam daju važne podatke o nivou genetičkevarijabilnosti u populacijama, njihovim evolucionim istorijama, filogenetskimodnosima među vrstama, a koriste nam i u identifikaciji individua i analizamarodoslova itd.Iako genetički polimorfizmi predstavljaju izraz normalnih varijacija unaslednoj osnovi, zanimljiv je njihov uticaj na fenotip, a naročito je aktuelnopovezivanje prisustva određenog SNP-a sa sklonošću ka različitim bolestimauključujući i malignitete. Poznavanje SNP-ova iz tih razloga predstavlja još jedanelement u razumevanju genetičke osnove velikog broja bolesti. U tzv. studijamaasocijacije (Slika 14) ispituje se učestalost pojedinih genskih varijanti, tj. genetičkihpolimorfizama u grupi obolelih i upoređuje se sa podacima u zdravoj populaciji.Rezultati različitih studija su često protivurečni, pa je još uvek mali brojpolimorfizama sa jasno potvrđenom ulogom genetičkog markera predispozicije. Alitreba napomenuti da broj ispitivanih polimorfizama gotovo eksponencijalno rasteiz dana u dan, pa se tako može očekivati da bude otkriveno više njih koji imajumanju ili veću ulogu u razvoju bolesti. Uvod 25 Patogeneza bazocelularnog karcinoma najčešće podrazumeva apsorpcijuUVB zraka od strane DNK molekula koja rezultuje stvaranjem pirimidinskihdimera, odnosno nastankom mutacija u različitim genima, između ostalih i ugenima uključenim u regulaciju ćelijske proliferacije, diferencijacije i smrti. Uvažne predstavnike ove grupe gena spadaju i geni za antiapoptotski protein survivin i proapototski TP53. Keratinocite pod dejstvom UV zračenja oslobađajuprostaglandine kao i proinflamatorne i imunomodulatorne citokine. Izmeđuostalih, oslobađaju se interleukin 1 i 6, zatim interleukin 10 i faktor nekrozetumora (TNF). Produkcija citokina je blisko povezana sa produkcijom matriksmetaloproteinaza (MMP), odgovornih za lokalnu tkivnu destrukciju. Dokazano jeda UV zraci mogu da utiču i na aktivnost različitih molekula lociranih kako naćelijskoj membrani, tako i u citoplazmi, ali precizni mehanizmi nastanka BCK jošuvek nisu poznati.Dalje u radu su opisani geni čiji su polimorfizmi ispitivani kao faktoripredispozicije za pojavu bazocelularnog karcinoma u regionu glave i vrata injegovih manifestacija u našoj populaciji. Slika 14. Učestalost pojedinih genskih varijanti u zdravoj populaciji i grupi obolelih od kancera i njihovo upoređivanje u tzv.studijama asocijacije preuzeto: http://www.cancerresearchuk.org/cancer- info/cancerstats/causes/genes/inheritedrisk/inherited-cancer-risk Uvod 26 1.5. FAKTORI UKLJUČENI U INVAZIJE I METASTAZE 1.5.1.CITOKINICitokini predstavljaju veliku familiju proteinskih molekula koji funkcionišukao medijatori i regulatori ćelijskih komunikacija, kako u fiziološkim tako i upatološkim uslovima. Rast tumora, invazija i metastaze su olakšani kada dođe doporemećaja produkcije citokina. To su solubilni proteini, odgovorni zakomunikaciju između samih leukocita i između leukocita i drugih ćelija. Premakonvenciji, većina molekulski definisanih citokina nazivaju se interleukini, saciljem da se naglasi da su to molekuli koje produkuju leukociti (makrofagi i T-ćelije) i da deluju na leukocite. U stvarnosti je drugačije jer citokine produkuju idruge ćelije ili oni deluju na druge ćelije koje ne pripadaju leukocitima.Citokini su proteini iz porodice glikoproteina, male molekulske mase, od 6-70 kDa, koji deluju kao posrednici između elemenata imunskog sistema (Mire-Sluisi sar., 1998). Citokini se odlikuju plejotropnošću (jedan citokin može da deluje naviše različitih tipova ćelija i ima više različitih dejstava) i izrođenošću(redundantnošću, više različitih citokina može da ispolji istu aktivnost). Mnogi secitokini izlučuju i deluju u kaskadi, odnosno jedan citokin može da indukuje iliinhibira produkciju drugih citokina (Rubin, 1992).Citokini učestvuju u svim etapama inflamacijskog procesa uključujućiadheziju i migraciju ćelija, aktivaciju, diferencijaciju i proliferaciju. Neophodni suza normalno odvijanje svih faza imunog odgovora i značajan su faktor regulacijetipa, jačine i dužine imune reakcije. Nema imunog odgovora u organizmu bezprodukcije citokina tako da oni regulišu i nespecifični i specifični imuni odgovor.Citokini deluju preko specifičnih receptora u samoj ćeliji i na ćelijskoj membrani.Oni mogu biti pozitivni i negativni regulatori imunog odgovora i neka vrstaprenosioca („glasnika“) koji, pored hormona i neurotransmitera, spadaju u vrlovažne činioce u komunikaciji između ljudskih ćelija u organizmu. Citokini predajuinformaciju ciljnoj ćeliji, koja ispoljava odgovarajući receptor. Nakon predajeinformacije dolazi do aktivacija gena sa posledičnim fenotipskim ili funkcionalnimpromenama ciljne ćelije. Sintezu i otpuštanje citokina mogu zaustaviti razne ćelije Uvod 27 (Mire-Sluis i sar., 1998) inhibitori, modulirajući biološku aktivnost citokina iliinhibirajući sposobnost odgovora ciljne ćelije.Većina citokina deluje na same ćelije koje ih stvaraju (autokrino dejstvo) ilina susedne ćelije (parakrino dejstvo).Citokini se prema svojim funkcijama (odnosno biološkim osobinama) dele utri grupe:  Medijatori i regulatori nespecifične (urođene) imunosti:  Proinflamatorni: faktor nekroze tumora (TNF), Interleukin-1 (IL-1),IL-6  Aktivatori NK i T ćelija: IL-12, IL-18  Hemokini: IL-8  Medijatori i regulatori stečene imunosti: IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ,TGF-β  Stimulatori hematopoeze: IL-3 i faktori rasta kolonija (GMCSF, GCSF,MCSF) koji stimulišu proliferaciju matičnih ćelija kosne srži 1.5.1.1. Faktor nekroze tumora (TNF-alpha)Faktor nekroze tumora (eng. Tumor Necrosis Factor, TNF-alpha ili kahektin)je solubilni, multifunkcionalni protein koga izlučuju makrofagi, aktiviraniT-limfociti, keratinocite i Langerhansove ćelije (Slika 15), a zbog svojihmnogobrojnih bioloških uloga smatra se jednim od najvažnijih lokalnihhumoralnih faktora u posredovanju i regulaciji imunoloških i upalnih reakcija uorganizmu (Jacob, 1992; Bentzen, 1988; Artese i sar., 1991). Primarna uloga TNF-alpha je regulacija imunih ćelija.Gen koji kodira TNF-alpha nalazi se na hromozomu 6p21.3, sadrži oko 3kb iima 4 egzona (Muller i sar., 1987). U ovom delu hromozoma nalazi se regionglavnog kompleksa histokompatibilnosti (eng. Major Histocompatibility Complex,MHC) koji karakteriše najveća gustina lokusa koji su odgovorni za određivanje Uvod 28 individualnog imunog odgovora i region sa najvećim brojem polimorfizama ugenomu (Hajeer, 2000). TNF se sintetiše u formi propeptida (pro-TNF), veličine 26 kDa, a oslobađase delovanjem TNF-konvertujućeg enzima (eng. TNF-Converting Enzyme, TACE).TACE takođe može da uklanja receptore za TNF sa površine ćelije, tj. sa ćelijskemembrane, tako da se regulacijom broja membranskih receptornih proteina vršikontrola biološke aktivnosti solubilnog TNF po principu negativne povratnesprege. Po strukturi je heterotrimerni protein molekulske mase 17 kDa (Kriegler isar., 1988) ekspresija TNF-alpha podrazumeva regulaciju na nivou transkripcije,translacije i posttranslacione produkcije proteina.TNF igra važnu ulogu u regulaciji rasta, ćelijske diferencijacije, odgovoru navirusne, bakterijske, gljivične ili parazitske infekcije. Međutim, ukazano je dapovećana ekspresija TNF gena ima ulogu u patogenezi mnogih poremećaja:autoimunih (multipla skleroza, reumatoidni artritis), alergijskih, rezistencije nainsulin (Oppenheim, 2001).Iako je dokazan njegov antineoplastični efekat, TNF takođe može indukovatimalignu transformaciju, tj. dovesti do tumorogeneze. TNF mogu produkovati Slika 15. Izvori lučenja TNF-alpha u koži preuzeto: Younes, 1996. Uvod 29 tumor-infiltrirani makrofagi i nekoliko tipova kancera (ovarijuma, kolorektalni,ezofagalni, karcinom prostate, mokraćne bešike i bubrega, melanomi i hematološkimaligniteti).U in vitro modelima, niska doza TNF-alpha može dovesti do proliferacijenekih maligno transformisanih ćelijskih linija. TNF-alpha takođe može da delujekao autokrini faktor rasta tumora indukujući ćelijsko preživljavanje aktivacijomNF-kB, PI3K-PKB/Atk- i MAPK-zavisnih anti-apoptotskih, proliferativnih, odnosnoputeva koji vode preživljavanju ćelije (Mocellin i sar., 2005).U eksperimentima sa nokaut (eng. knockout) životinjama (kada jeinaktiviran određeni gen), utvrđena je povećana incidenca razvoja karcinoma kodTNF+/+ životinja u odnosu na one koje su TNF-/- genotipa (Korner i sar., 2000).Ova rezistencija TNF-/- životinja na hemijski indukovanu kancerogenezu može sepovezati sa privremenim kašnjenjem aktivacij protein kinaze C (PKC) itranskripcionog faktora AP-1. Ovo kašnjenje verovatno utiče na ekspresiju gena zakoje se zna da su uključeni u procese tumorogeneze, kao što su matriksnemetaloproteinaze -3 i -9, koje su suprimirane kod TNF-/- miševa, ali ne kod wild- typemiševa koji su izloženi delovanju kancerogenih supstanci.Predložen je i model po kome TNF može da dovede do oštećenja DNK iinhibicije DNK reparacije povećanom produkcijom genotoksičnih agenasa (kakavje npr. NO) od strane ćelija kancera ili okolnih makrofaga.Slična otkrića dobijena su kod TNF-R nokaut životinja. U modelu indukcijekancerogeneze kože, da bi došlo do razvoja tumora, potrebno je prisustvo i TNF-R1i TNF-R2. Sa druge strane, u modelu kancerogeneze jetre, ona zavisi isključivo odekspresije TNF-R1 gena, odnosno receptora. 1.5.1.2. Polimorfizam u genu za TNF-alpha (-308 G/A, rs 1800629)Polimorfizmi u genu za TNF-alpha kao i u njegovoj okolni imaju veliki uticajna produkciju ovog citokina (Hajeer i Hutchinson, 2000). Studije na pacijentimakoji imaju solidne tumore i hematološke malignitete, pokazale su postojanjeasocijacije između povišenog nivoa TNF-alpha u plazmi i lošeg kliničkog ishoda Uvod 30 (Dosquet i sar., 1997; Warzocha i sar., 1998; Ferrajoli i sar., 2002; Michalaki i sar.,2004). Takođe, neki hemioterapijski agensi (talidomid) umanjuju nivo solubilnogTNF-alpha, što navodi na teoriju da je za njihovu antikancerogenu aktivnostzaslužna njihova sposobnost da deluju kao nespecifični TNF antagonisti (Dredge isar., 2002).U TNF lokusu, nađen je veći broj SNP-ova (Slika 16) i polimorfizama manjegbroja ponovaka (mikrosatelita). Ima ih u 5’ regulatornim sekvencama kao i u 3’nekodirajućim i kodirajućim sekvencama. Nekoliko studija pokazalo je asocijacijuizmeđu SNP (polimorfizama jednog nukleotida) u TNF-alpha genu i rizika odrazvoja različitig tipova karcinoma. Jedan od takvih polimorfizama na poziciji -308G/A (u okviru promotorskog regiona) je povezan sa povećanom osetljivošću, tj.podložnošću različitim karcinomima. Međutim, mnogi autori došli su do drugačijih saznanja. Na primer, nemaznačajne asocijacije između TNF haplotipa i kliničkog ishoda kod dece salimfoblasnom leukemijom. Slika 16. Promotorski region TNF-alpha gena; posebno je označena većina SNP-ova mapiranih u distalnom regionu promotora, kao i većina mesta vezivanja transkripsionih faktora u proksimalnom regionu promotora preuzeto: http://www.clinsci.org/cs/104/0493/cs1040493f05.htm?resolution=STD Uvod 31 Zanimljivo je da neki autori ne samo da pokazuju odsustvo korelacijeizmeđu -308 TNF-alpha polimorfizma i rizika od kancerogeneze, već opisuju iprotektivnu ulogu dva polimorfizma (-238A i +857T) u incidenci različitih tumora. 1.5.1.3. Receptori TNF-alpha (TNF-R1, TNF-R2)TNF-alpha ostvaruje svoje biološke efekte u ćelijama preko molekula koji susvrstani u porodicu (superfamiliju) receptora za TNF, među kojima sunajznačajnija dva:1. TNF-R1, poznat još i kao CD120a ili p55/60 (veličine 55 kDa)2. TNF-R2, ili CD120b ili p75/80 (veličine 75 kDa)Oba receptora pripadaju velikoj superfamiliji TNF receptora. Od otkrićaTNF-alpha do danas, utvrđeno je postojanje 20 članova tzv. superfamilije TNFproteina (do 15-20% identični međusobno) koji prenose signale u ćeliju preko 29receptornih proteina, koji se pak mogu svrstati u tri veće grupe. Jedna grupa nacitoplazmatskom repu sadrži takozvane domene smrti (eng. Death Domains, DDs).U ovu grupu receptora spada i TNF-R1, jedan od receptora preko kojih TNF-alphapokreće ćelijsku signalnu kaskadu.TNF-R1 je prisutan u većini tkiva, nema ga samo u eritrocitima inestimulisanim limfocitima i može biti aktiviran sa obe forme TNF-alpha i samembranski vezanom i sa solubilnom formom. Za razliku od njega, TNF-R2 semože naći samo u ćelijama imunog sistema i odgovara na formu TNF-alphavezanom za membranu. Ni jedan od ovih receptora ne poseduje enzimskuaktivnost, već signal prenose “regrutovanjem” mnoštva drugih singnalnih proteina,koji zajedno iniciraju signalne kaskade aktivirajući tako efektorne proteine(kaspaze) i protein kinaze (MMKK, IKK, koje uglavnom dovode do aktivacijetranskripcionih faktora AP-1 i NF-kB). Aktivacijom ovih signalnih puteva, tj.transkripcionih faktora započinje inflamatorni, proliferativni ili antiapoptotskiodgovor ćelije na signal dobijen od strane TNF-alpha. Uvod 32 TNF-alpha u većini slučajeva prenosi signale u ćeliju preko TNF-R1. TNF-alpha se vezuje u svojoj heterotrimernoj (aktivnoj) formi za ekstracelularni domenreceptora, inicirajući na taj način njegovu trimerizaciju. Na taj način, saintracelularnog DD receptora se oslobađa inhibitorni protein SODD (eng. Silencer Of Death Domains). Kada je oslobođen inhibitornog uticaja, dovodi do“regrutovanja” intracelularnih adaptornih proteina kao što su FADD (eng. Fas- Associated DD) i TRADD (eng. TNF-R Associated DD). Nakon TRADD vezivanja, trisignalna puta mogu biti inicirana (Chen, 2002; Gaur, 2003), Slika 17:1. Aktivacija NF-κB: TRADD regrutuje TRAF2 (eng. TNF Receptor Associated Factor 2) i RIP. TRAF2 zatim regrutuje multikomponentni protein kinazuIKK, što omogućava serin-treonin kinazi RIP da ga aktivira. Inhibitorniprotein, IκBα, koji se normalno vezuje za NF-κB i inhibira njegovutranslokaciju, se fosforiliše IKK kinazom i naknadno se degradira, čime seoslobađa NF-κB. NF-κB je heterodimerni transkripcioni faktor koji setranslocira u nukleus i posreduje transkripciju velikog broja proteina kojiimaju udela u ćelijskom preživljavanju i proliferaciji, inflamatornomodgovoru, kao i stvaranju anti-apoptoznih faktora. 2. Indukcija signala smrti: TRADD vezuje FADD, koji onda regrutuje cisteinproteazu kaspazu-8. Visoka koncentracija kapsaze-8 indukuje njegovu auto-proteolitičku aktivaciju i naknadno cepanje efektorskih kaspaza, što dovodido ćelijske apoptoze. 3. Aktivacija MAPK puta: Od tri glavne MAPK (eng. Mitogen Activated Protein Kinase) kaskade, TNF indukuje jaku aktivaciju stres-vezane JNK grupe,evocira umereni p38-MAPK odgovor, i odgovoran je za minimalnu aktivacijuklasičnih ERK proteina. TRAF2 aktivira JNK-indukujuće nizvodne kinazeMEKK1 i ASK1 (bilo direktno ili kroz GCK i Trx, respektivno), i te dve kinazefosforilizuju MKK7, koja onda aktivira JNK. JNK se translocira u nukleus iaktivira transkripcione faktore kao što su c-Jun i ATF2. JNK signalni put Uvod 33 učestvuje u ćelijskoj diferencijaciji, proliferaciji, i generalno je pro-apoptozan. Za razliku od nekih drugih membranskih receptornih proteina koji direktnoregrutuju FADD, TNF-R1 dovodi do programirane ćelijske smrti samo pododređenim uslovima (npr. kada je blokirana sinteza proteina). Kod već razvijenihorganizama, TNF-R1 mnogo češće dovodi do indukcije transkripcije i samim timaktivacije inflamatornih gena (Locksley i sar., 2001). Genetički izmenjeni miševi,bez gena za TNF-R1, ispoljavali su veći poremećaj u proinflamatornom odgovoru uodnosu na one bez gena za TNF-R2, što ukazuje da je receptor TNF-R1 važniji zafunkcionisanje ovog citokina (Locksley i sar., 2001). Takođe, TNF-R2 signalizacijaje uglavnom ograničena na endotelne i hematopoetske ćelije. Slika 17. Signalna kaskada indukovana od TNF-alpha preuzeto: Haider i Knöfler, 2009. Uvod 34 Kod zdravih osoba nivo serumskih receptora je veoma stabilan i genetičkiregulisan. Porast nivoa cirkulišućih receptora zapažen je kod starijih osoba, što jepovezano sa smanjenim antitumorskim i antiinfektivnim efektima TNF-alpha.Ovakva slična pojava uočena je i kod pacijenata sa autoimunim, infektivnim imalignim oboljenjima (Krajcik i sar., 2003). 1.5.1.4. Polimorfizmi u genima za TNF receptore: TNF-R1 (+36 A/G, rs767455), TNF-R2 (+676 T/G, rs1061622)Gen koji kodira sintezu TNF-R1 nalazi se na kratkom kraku hromozoma 12(12p13.2), a gen za TNF-R2 nalazi se na hromozomu 1 na poziciji 1p36.2 (Baker isar., 1991).Brojni polimorfizmi su identifikovani u ovim genima i dovedeni u vezu sapojavom različitih oboljenja. U promotoru gena za TNF-R1 identifikovano jenekoliko SNP-ova, kao u egzonu 1 (tiha supstitucija) i intronima 2, 4, 6, 7 i 8(Aksentijevich i sar., 2001). Gen za TNF-R2 u svom sastavu ima 10 egzona i 9introna, a polimorfizmi su nađeni u egzonima 4, 6, 9 i 10 (Pantelidis i sar., 1999).Među svima njima, posebno se izdvajaju polimorfizam +36 A/G u egzonu 1 TNF-R1gena i +676 T/G u egzonu 6 gena za TNF-R2, kao i njihove povezanosti sa različitimoboljenjima kao što su reumatoidni artritis, neke autoimune i infektivne bolesti(Brinkman i sar., 1997; Barton i sar., 2001; Buchs i sar., 2001; Fabris i sar.,2002;Sashio i sar., 2002; Dieude i sar., 2004). Nađena je veza između specifičnih varijantiu TNF-R1 i R2 genima i prevremenih porođaja u crnačkoj populaciji u Americi(Menon i sar., 2006). Takođe, povećana koncentracija TNF-R1 i R2 u makrofagimauočena je kod kancera jajnika, dok se povaćana koncentracija TNF-R1 dovodi uvezu sa različitim krvnim oboljenjima, posebno limfomima (Warzocha i sar., 2000). Uvod 35 1.5.2. MATRIKS METALOPROTEINAZEZa normalan razvoj i funkcionisanje organizma neophodna je interakcijaćelija sa ekstraćelijskim matriksom. Regulacija ove interakcije se dešava putemjedinstvenog proteolitičkog sistema matriks metaloproteinaza (MMP), odgovornogza hidrolizu različitih komponenti ECM-a, kao i kontrolu signala matriksnihmolekula koji regulišu rast i razvoj ćelija. Remodeliranje ECM-a mora biti strogoregulisano jer u suprotnom, svaka nekontrolisana proteoliza može dovesti dopatoloških pojava, koje se karakterišu ili prekomernom degradacijom iliodsustvom degradacije komponenti ECM-a (Mandal i sar., 2003), a karakterističnesu za rast tumora, njegovu invazivnost i metastaze (Overall i Lopez-Otin, 2002).Invazija i metastaza malignih ćelija predstavljaju veliki klinički problem i glavniuzrok smrti pacijenata obolelih od kancera. Metastaze su višestepeni proces kojiuključuje vezivanje tumorskih ćelija za komponente ekstraćelijskog matriksa,degradaciju ekstraćelijskog matriksa, kretanje tumorskih ćelija kroz degradiranprostor, indukciju angiogeneze i proteolitičkih enzima i njihovih inhibitora iproliferaciju u udaljenim organima. Sposobnost tumorskih ćelija da invadiraju imetastaziraju zavisi od stepena diferencijacije, s obzirom da su slabo diferenciranećelije invazivnije u poređenju sa ćelijama koje se nalaze na višem stupnjudiferencijacije. Prekidi u bazalnoj membrane su neophodni za prolaz malignihćelija sa primarnog, na neka druga, udaljena mesta (Han i sar., 2002).Matriks metaloproteinaze su homogena familija od 23 strukturno sličneendopeptidaze koje razgrađuju komponente ekstraćelijskog matriksa sazajedničkim strukturnim i funkcionalnim elementima. To su enzimi zavisni od Ca2+i Zn2+ sintetisani kao transmembranski ili pro-enzimi za sekreciju, koji nakonuklanjanja 10 kDa amino-terminalnog propeptida postaju aktivni. Nakonaktiviranja, njihovu proteolitičku aktivnost inhibiraju tkivni inhibitori poznati kaotkivni inhibitori metaloproteinaza (eng. Tissue Inhibitors of Metalloproteinases,TIMPs). MMP-e se mogu aktivirati različitim agensima, članovima MMP familije ilidrugim proteazama. Na osnovu supstrata koji degraduju ili sličnih strukturnihdomena MMP-e se mogu podeliti u 6 podgrupa kao: kolagenaze, želatinaze,stromelizini, matrilizini, membranske MMP-e i ostale MMP (Slika 18). Uvod 36 Struktura MMP-aza:Matriksne metaloproteinaze se uglavnom sastoje od:  Propeptida ili pro-domena (pro)  Katalitičkog domena (cat)  Peptida koji povezuje (cat sa Hpx) ili zglobnog područja (L1)  Hemopeksinskih domena Izuzetak su MMP-7, MMP-23 i MMP-26 koje nemaju L1 i Hpx. MMP-23 imadomen bogat cisteinskim ostacima (CysR) i domen sličan imunoglobulinima (Ig), Slika 19. Dve od MMP (MMP-2 i MMP-9) sadrže domen sličan fibronektinu ugrađen Slika 18. Podela matriks metaloproteinaza na osnovu supstrata koji degraduju ili sličnih strukturnih domena preuzeto: http://www.clip.ubc.ca/archive/mmp_timp_folder/mmp_schematic_master.gif, modifikovano Uvod 37 unutar katalitičkog domena, verovatno radi boljeg vezivanja za supstrat. MMP-9takođe sadrži i domen sličan kolagenu V, koji povećava specifičnost i jače vezivanjeza supstrat.Zajedničke strukturne karakteristike MMP-a su motivi koji vezuju Zn2+unutar katalitičkog domena (HEXXHXXGXXH) i motiv cisteinske „sklopke“ unutarpropeptida (PRCXXPD). MMP se sintetišu u neaktivnoj, zimogenoj formi. Aktivacija zimogena(proMMP) važan je regulacijski korak u aktivaciji MMP (Slika 20): uklanja seprodomen (interakcija SH (Cys) u pro i Zn2+). Aktivne MMP mogu učestvovati uaktivaciji drugih MMP. Izuzetak je MMP-26 koja se auto-aktivira. Slika 19. Domeni matriksnih metaloproteinaza Slika 20. Aktivacija matriks metaloproteinaza, prevođenje inaktivne u aktivnu formu preuzeto: Page-McCaw i sar., 2007. modifikovano Uvod 38 U većini tkiva odraslih koncentracija MMP je vrlo niska (Birkedal-Hansen isar., 1993), ali se ona drastično povećava tokom tkivnog remodeliranja. Njihovaaktivnost je strogo regulisana na nekoliko načina (Sorsa i sar., 2004):  proteolitička degradacaija i inaktivacija  nespecifičnim endogenim inhibitorima kao što je α2 makroglobulin  specifičnim tkivnim inhibitorima MMP (TIMPs)TIMPs su najveća grupa endogenih regulatora aktivnosti MMP u tkivima ido danas ih je identifikovano 4 (Ricou i sar., 1996; Jackson i sar., 2001; Asahina isar., 2001; Ho i sar., 2005). Neravnoteža između aktivnosti TIMP-a i MMP podstičerazgradnju komponenti ECM-a, rast primarnog tumora i metastaziranje. Ali porednjih efektori mogu biti i raznovrsni faktori rasta, citokini, hemijski agensi, fizičkistres, kao i onkogene ćelijske transformacije (Nagase i Woessner, 1999).Osnovna uloga matriksnih metaloproteinaza je degradacija proteina,regulacija različitih ćelijskih ponašanja sa stanovišta biologije kancera. Uključenesu u rast ćelija, diferencijaciju, apoptozu, migraciju i invaziju, regulaciju tumorskeangiogeneze i imunskog odgovora (Egeblad i Werb, 2002). Ekspresija i aktivacijaMMP uočena je kod gotovo svih vrsta tumora (posebno MMP-1, 2, 3, 7, 9, 10, 11,13, 14). Među svima njima, želatinaze MMP-2 i MMP-9 su povezane sa malignimfenotipom tumorskih ćelija zbog njihove jedinstvene sposobnosti da degradirajukolagen tipa IV, kao najveću komponentu bazalne membrane (Devarajan i sar.,1992), koja odvaja epidermis od dermisa i predstavlja prvu barijeru za invazijutumorskih ćelija (Thomas i sar., 1999). 1.5.2.1. Matriks metaloproteinaza 9 (MMP- 9)MMP-9 (želatinaza B) je inducibilan enzim iz podgrupe želatinaza. Aktivirase uklanjanjem prodomena (∼10 kD) koji biva odvojen delovanjem MMP-2,-3,-13ili plazmina (Mandal i sar., 2003), mada se MMP-3 izdvaja kao najčešći aktivator(Goldberg i sar., 1992.). MMP-9 je uključena u razgradnju želatina, kolagena (IV, V,XI, XVII) i elastina (Ito i sar., 2005). Uvod 39 Gen za želatinazu B (MMP-9) nalazi se na hromozomu 20q11.2-q13.1 i ima13 egzona (Huhtala i sar., 1991).Ekspresija želatinaze B je uglavnom ograničena na neutrofile, ali sedetektuje u različitim ćelijama povezanim sa tumorskim metastazama.Inflamatorna stimulacija, odnosno citokini kao što su TNF-alpha i IL-1β indukujuekspresiju MMP-9 u mnogim ćelijama uključujući endotelijalne ćelije, makrofage,fibroblaste, koronarne arterije i glatkim mišićnim ćelijama (Galis i sar., 1994;Coussens i sar., 2000; Schwingshackl i sar., 1999; Yao i sar., 1997), Slika 21. MMP-9učestvuje i u angiogenezi koja je uključena u razvoj tumora (Bergers i sar., 2000),mada ima izveštaja koji ukazuju na njen antiangiogenetski efekat (Heljasvaara isar., 2005). Takođe, prisutna je u malim količinama u zdravim plućima odraslih, alije mnogo izražajnija u nekim plućnim bolestima (Atkinson, 2003). Slika 21. Ekspresija MMP-9 u različitim tipovima ćelija preuzeto: Barnes, 2002. Uvod 40 1.5.2.2. Polimorfizam u genu za matriks metaloproteinazu 9 (-1562 C/T, rs3918242) Studija Zhanga i saradnika (1999) je pokazala da polimorfizam (-1562 C/T)u promotorskom regionu MMP-9 gena ima funkcionalne efekte na transkripciju ida je povezan sa težinom ateroskleroze kod pacijenata sa koronarnom arterijskombolešću. Podstaknuti time oni su katalogizirali varijante sekvenci u 2.2 kbpromotorske sekvence i svih 13 egzona (ukupno 3.3 kb) MMP-9 gena.Identifikovali su ukupno 10 varijabilnih mesta: 4 u promotorskom regionu, 5 ukodirajućem regionu i 1 u 3’ netranslatiranoj sekvenci. Analiza sekvenci ukazuje dabi neke varijante mogle imati uticaja na nivo ekspresije ili na enzimatsku aktivnost.Polimorfizmi u promotoru MMP-9 gena su dovedeni u vezu sa izmenjenomgenskom ekspresijom i sklonošću ka različitim oboljenjima. Dve od petidentifikovanih varijanti sekvence su funkcionalno relevantne: SNP na -1562 bp(C/T) i jedan (CA)n mikrosatelit na poziciji -131 bp. C/T supstitucija na poziciji -1562 rezultuje gubitkom vezivanja jedarnog proteina i povećanjem transkripcioneaktivnosti kod makrofaga (Van den Steen i sar., 2002). Slično tome, najvišaaktivnost promotora je primećena kod reporter - konstrukta koji sadrže 21 ili 23(CA) ponovaka, što nagoveštava da broj ponovaka oblikuje transkripcionuaktivnost (Van den Steen i sar., 2002).Pored nekoliko polimorfnih promena u regulatornom regionu gena (Zhang isar., 1995), -1562 C/T polimorfizam dovodi do povećanja promotorske aktivnostiovog gena (Zhang i sar., 1999) i do izmenjene transkripcije. Pokazano je da ovajpolimorfizam igra značajnu ulogu u razvoju ateroskleroze (Zhang i sar., 1999), kaoi da je povezan sa emfizemom kod pacijenata sa hroničnom opstruktivnom bolešćupluća (Ito i sar., 2005). Pored ovih bolesti, povećana ekspresija i aktivnost MMP-9je zapažena i kod akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS)(Ricou i sar.,1996), poliomiozitisa, dermatomiozitisa, reumatoidnog artritisa (Jackson i sar.,2001), Alchajmerove bolesti (Asahina i sar., 2001) i drugih neurodegenerativnihbolesti (Ilzecka i sar., 2001), kao i u raznim malignitetima (Mandal i sar., 2003). Uvod 41 1.6. FAKTORI UKLJUČENI U KONTROLU ĆELIJSKE PROLIFERACIJE, DIFERENCIJACIJE I SMRTI 1.6.1. APOPTOZA, programirana smrt ćelijeApoptoza ili programirana ćelijska smrt je ključan proces uključen unormalan razvoj, održavanje tkivne homeostaze i imunog odgovora. To je genetičkideterminisan proces koji ima ulogu u regulaciji broja ćelija u tkivu tokommorfogeneze i u odstranjivanju inficiranih ili ćelija sa oštećenjem potencijalnoopasnim po ceo organizam. Pravilan tok apoptotskih procesa ključan je za pravilanembrionalni razvoj, ali se nastavlja i nakon rođenja, pa tako na primer, keratinocitepri migraciji iz dubljih slojeva kožedo njene površine podležu apoptozipretvarajući se u spoljašnji, zaštitnisloj odumrlih ćelija. Poremećajiapoptoze vezani su za patogenezubolesti kao što su tumori, nekeautoimune bolesti, različitidegenerativni procesi, itd.Apoptozu mogu iniciratirazličiti stimulusi kao što su UV ijonizujuće zračenje, hipoksija,hemioterapeutici, nedostatakfaktora rasta, ali i aktivacijatakozvanih aporeceptora. U osnovi,bez obzira na početni stimulus,postoje dva mehanizma indukcijeapoptoze (Slika 22): Slika 22. Dva mehanizma indukcije apoptoze preuzeto: Baskic i sar., 2002. Uvod 42 1) pozitivna indukcija ili spoljašnji put, nakon vezivanja liganda zamembranske aporeceptore,2) negativna indukcija ili unutrašnji put, zbog prestanka supresijeOba puta dovode do aktivacije cistein proteaza (kaspaza) odgovornih zakontrolisanu razgradnju ćelije.Pozitivna indukcija apoptoze podrazumeva aktivaciju membranskihaporeceptora iz superfamilije faktora nekroze tumora (TNF). Ligandi i receptoriuključeni u indukciju apoptoze nazivaju se i ligandi i receptori smrti. Vezivanjeaporeceptora i liganda dovodi do angažovanja adaptorskih proteina i posledičneaktivacije prokaspaze 8, prve u nishodnoj kaskadi kaspaza, koja preko kaspaze 3aktivira proces apoptoze (Kroemer i sar., 1998).Sa druge strane, ostarele ili oštećene ćelije veoma često kreću u pravcusamoubistva bez prethodne aktivacije aporeceptora. U ovom modelu negativneindukcije apoptoze glavnu ulogu igraju ćelijske organele, na prvom mestumitohondrije, koje imaju funkciju pojačala koje amplifikuje početni apoptotičnisignal (Green, 1998). Nakon prijema ovog signala integritet mitohondrijalnemembrane se menja tako da dolazi do pada transmembranskog potencijala,povećanja koncentracije kalcijuma u mitohondrijama i disrupcije transportnoglanca elektrona. Porast nivoa kalcijuma dovodi do otvaranja tranzitornih poramitohondrija i oslobađanja niskomolekularnih proteina kao što je citohrom c ucitoplazmu, čime se preko kaspaze 9, a zatim i kaspaze 3, pokreće nishodnakaskada kaspaza.U regulaciji apoptoze učestvuju proapoptotični i antiapoptotični proteiniove familije (Reed, 1997). Uvod 43 1.6.2. PROTEINI INHIBITORI APOPTOZEProteini inhibitori apoptoze (eng. Inhibitors of Apoptosis Proteins, IAP) suporodica funkcionalno i strukturno srodnih proteina, endogenih inhibitoraapoptoze. Trenutno je poznato ukupno 8 takvih proteina (c-IAP1, c-IAP2, XIAP,NAIP, Survivin, Apollon, ML-IAP livin, ILP-2 (Reed, 1997)). Za njih je zajedničko dasadrže tzv. BIR domen (Baculovirus IAP Repeat ~70 amino kiselina dug motiv) ujednoj do tri kopije, koji je neophodan za antiapoptotičnu aktivnost IAPs-a, jerupravo interakcija između BIR domena i kaspaza (-3, -7, -8, -9) inhibira njihovuaktivnost. Takođe sadrže i na C-terminusu RING motiv ili tzv. CARD domen (eng. Caspase Activation Recruitment Domain).Pojačana aktivnost ovih proteina dovodi se u vezu s tumorskomrezistencijom jer onemogućavaju realizaciju apototskog programa u ćelijama saoštećenjima naslednog materijala i ujedno promovišu nekontrolisanu proliferacijutransformisanih ćelija (Oltvai i sar., 1993). 1.6.2.1. SURVIVINSurvivin je bifunkcionalni 16,5 kD protein, najmanji je član proteinskefamilije inhibitora apoptoze i regulator ćelijskog ciklusa (podstiče deobu ćelije timešto stimuliše prelaz ćelije iz G2 u M fazu; Salvesen, 2002). Prisutan je i u jedrima i ucitoplazmi ćelija i pretpostavlja se da citoplazmatski survivin ima antiapoptotskuulogu, dok onaj u jedrima ćelija je zadužen za kontrolu deoba ćelija. Za razliku odsvih ostalih protein IAP familije, ima samo jedan BIR domen i ne poseduje RINGmotiv. Gen za survivin (eng. Baculoviral Inhibitor of apoptosis Repeat Containig 5-BIRC5) je lociran na hromozomu 17 (17q25) i čine ga 4 egzona i 3 introna.Alternativnim iskrajanjem primarnog transkripta dobija se nekoliko izoformisurvivina (Caldas i sar., 2005), Slika 23: Uvod 44  Survivin 2B: sadrži alternativni egzon 2B  Survivin ΔEx3: bez egzona 3. Isključivanjem egzona 3 dolazi do vanfaznemutacije kojom se generiše jedinstveni COOH terminus sa novom funkcijomkoja podrazumeva signal za jedarnu i mitohondrijsku lokalizaciju  Survivin 3B: sadrži alternativni egzon 3B  Survivin 2α: ima, kao i izoforma survivin 2B, proapoptotsku funkciju zarazliku od wt, 3B i ΔEx3 varijante.Putevi kojima survivin blokira apoptozu nisu do kraja jasni, pretpostavlja seda svoju antiapoptotsku funkciju obavlja inhibirajući kaspaze 3, 7 i 9 (Banks i sar.,2000; Shin i sar., 2001). U to je uključena i inhibicija apoptoze zavisne odmitohondrija (i citohroma C), preko ΔEx3 varijante, uz učešće još nekih proteina.Survivin se eksprimira u toku embrionalnog razvića i u različitim kancerimaomogućavajući ćelijama kancera izbegavanje apoptoze i mitozu (Salvesen, 2002; Li,2005). Kao posledica toga, povećana ekspresija survivina je povezana saprogresijom kancera, skraćenim vremenom preživljavanja pacijenata, lošijomprogonozom i rezistencijom na terapiju (Grabowski i sar., 2003; Ito i sar., 2000;Javle i sar., 2004; Altieri, 2003) kod mnogih tipova kancera, ali postoje i suprotnirezultati (Lehner i sar., 2002; Kennedy i sar., 2003; Trieb i sar., 2003). Unormalnim, diferenciranim ćelijama i tkivima ga nema (Ambrosini i sar., 1997),osim u malim količinama u timusu, bazalnom epitelu debelog creva, CD34+ Slika 23. Različite izoforme survivina preuzeto: Altieri, 2003. Uvod 45 ćelijama kosne srži, u keratinocitama bazalnih ćelija normalnog epidermisa(Altieri, 2001). Muzio i saradnici su pokazali ekspresiju survivina u 100%metastaza, dok u normalnom oralnom epitelijumu nije uočena ekspresija.Iako mehanizam kojim survivin reguliše ćelijski ciklus nije u potpunostirazjašnjen, njegova lokalizacija tokom mitoze kao i vezivanje za komponentemitotskog aparata – centrozom, mikrotubule metafaznog i anafaznog deobnogvretena, upućuju na njegovu ulogu u ovim procesima.Kod tumorskih ćelija koje su nokaut za survivin (inaktiviraju ga), dolazi doporemećaja u organizaciji mikrotubula što na kraju dovodi do poliploidije imasovne apoptoze.Regulacija njegove ekspresije je prilično kompleksna. Ona može biti (Slika 24):a. zavisna od faze ćelijskog ciklusa (eng. cell-cycle-dependent), i to:  na nivou transkripcije (što uključuje tzv. CDE/CHR regulatorneelemente u promotorskom regionu), ekspresija survivina je najvećatokom G2/M faze. Ovaj mehanizam regulacije podržava i nalaz da jesurvivin poli-ubikvitiniziran i degradovan proteazomima tokominterfaze ćelijskog ciklusa (Altieri, 2003), a kolokalizovan je sakomponentama deobnog vretena tokom metafaze i anafaze mitoze.Još jedan vid kontrole ekspresije survivina na transkripcionomnivou je interakcija između proteina TP53 i promotorskog regionasurvivina u kome su pronađena dva TP53 vezujuća mesta. Ovominterakcijom TP53 vrši inhibiciju transkripcije survivina.  na posttranskripcionom nivou, ostvarena modifikacijom tipafosforilacije Thr 34, koja povećava stabilnost proteina u G2/M fazićelijskog ciklusa (Altieri, 2003). Fosforilacija survivina dovodi doinhibicije apoptoze i do ćelijske deobe.b. nezavisna od faze ćelijskog ciklusa (određeni citokini) Uvod 46 1.6.2.2. Polimorfizam u genu za survivin (-31 G/C, rs9904341)Do danas je identifikovano 199 SNP-ova u BIRC5 genu kod ljudi. Međusvima njima svakako su najinteresantniji oni u promotorskom regionu ovog gena (-644 T/C, -625 G/C, -241 T/C, -31 G/C). CDE/CHR deo promotora gena za survivin,veoma je važan za regulaciju njegove ekspresije i zato je jedan od najispitavanijihpolimorfizama na poziciji – 31, kod koga je pokazano da mutacija G/C dovodi dopovećane ekspresije survivina pa i do povećanja rizika od oboljevanja od različitihtipova kancera, kao što su kancer pluća, dojke, debelog creva, pankreasa, želuca,jednjaka, materice, jajnika, zatim je povećana ekspresija uočena i u leukemijama,neuroblastomima, melanomima i nemelanomskim tipovima kancera (Ambrosini isar., 1997; Altieri, 2001).Gotovo da ne postoje studije asocijacije ovog polimorfizma sabazocelularnim karcinomom, ali postoje podaci o asocijaciji ekspresije survivina i Slika 24. Regulacija ekspresije survivina preuzeto: Altieri, 2003. modifikovano Uvod 47 različitim tipovima kancera. Survivin je izrazito eksprimiran u skvamocelularnimkarcinomima, ali praktično izostaje u bazocelularnim. Međutim, rezultati studijeAl-Khalaf i Aboussekhra (2012) su pokazali povećanu ekspresiju u starijimćelijama i organima, odnosno povećanu ekspresiju survivina sa godinama života ufibroblastima kože, što ide u prilog asocijacije sa bazocelularnim karcinomom, sobzirom da je on daleko učestaliji u starijoj populaciji. 1.6.3. TUMOR PROTEIN 53Ključni događaj u transformaciji premaligne ćelije u malignu je inaktivacijanegativnih regulatora ćelijske proliferacije – tumor supresorskih gena tačkastimmutacijama, delecijama i rearanžmanima gena ili hipermetilacijom. TP53 (Tumor protein 53, p53) je jedan od najbolje proučenih tumorsupresor gena sa ključnom ulogom u genezi humanih kancera (Ruddon, 2007).Mutacije tumor supresorskog gena TP53 najučestalije su genetičke alteracije uhumanom kanceru koje pogađaju specifični gen (Olivier i sar., 2009; Petitjean i sar.,2007). Gen koji kodira za TP53 lociran je na hromozomu 17 (17p13.1)(Isobe isar., 1986) i čini ga 11 egzona i 10 introna, s tim što je egzon 1 nekodirajući (Slika 19). Od ovog gena kodira se humani TP53 protein, sačinjen od 393 aminokiselinekoji obavlja brojne antiproliferativne funkcije kroz kontrolu transkripcije različitihciljnih gena i kroz protein-protein interakcije. Pošto ima važnu ulogu u regulacijićelijskog ciklusa i očuvanju stabilnosti genoma sprečavanjem mutacija, često senaziva i “čuvarem genoma” (Matlashewski i sar., 1984). Ova zaštitna funkcija seogleda u zaustavljanju replikacije oštećene DNK. Ako je DNK oštećena, tada seTP53 akumulira i zaustavlja replikaciju DNK i deobu ćelije za vreme dok se DNK nereparira. Ako su reparacioni mehanizmi neuspešni, TP53 okida apoptotičniodgovor, a konačan rezultat je smrt ćelije. Ali, ako je TP53 izgubljen ili je mutirao,ćelija replikuje leziju na DNK. Ovakve ćelije su genetički manje stabilne,akumuliraju mutacije i dovode do generisanja malignog stanja koje se zatim jošpojačava, što se ogleda u progresiji tumora (Frebourg i sar.,1992; Levine, 1993;Agarwal i sar., 1995;). Uvod 48 Protein TP53 poseduje 5 domena svaki sa specifičnom funkcijom (Slika 25): 1. Amino terminalni deo od 1-42 amino kiseline (AK), sadrži kiselitransaktivacioni domen i MDM2 vezujuće mesto. Takođe sadrži visokokonzervirani domen I (eng. Highly Conserved Domain, HCDI); 2. Region od 40-92 AK, sadrži niz ponovljenih prolinskih ostatakakonzerviranih kod većine TP53; kao i drugi transaktivacioni domen; 3. Centralni region od 101-306 AK, sadrži DNK vezujući domen. 90% mutacijau TP53 koje se javljaju u humanim kancerima je u ovom regionu. On sadržiHCD od II-V; 4. Oligomerizacioni domen (307-355 AK, TET), sadrži β-lanac koji interagujesa drugim TP53 monomerom formirajući dimer, dok α-lanac omogućavadimerizaciju dva TP53 u formu tetramera. Jedarni signal za izvoz (NES)lokalizovan je u ovom oligomerizacionom domenu; 5. Karboksilni kraj TP53 od 356-393 AK, sadrži tri jedarna lokalizacionasignala (NLS) i nespecifični DNK vezujući domen koji se vezuje za oštećenuDNK. Ovaj region je uključen u nizvodnu regulaciju vezivanja centralnogdomena za DNK. Slika 25. Strukturna organizacija TP53 gena i proteina preuzeto:http://www.stjude.org/stjude/v/index.jsp?vgnextoid=ed17ca796f775310VgnVCM10000 0290115acRCRD&vgnextchannel=d645ff98a6775310VgnVCM100000290115acRCRD Uvod 49 Mutacije koje inaktiviraju TP53 u kancerima se obično odigravaju ucentralnom regionu. Većina ovih mutacija onemogućava proteinu da se veže zaciljnu DNK sekvencu i stoga sprečava transkripcionu aktivaciju tih gena.Karakteristično je da su ovi visokokonzervirani domeni najčešće pogođenimutacijama, što ukazuje na to da imaju posebno značajnu ulogu u regulatornimfunkcijama TP53.TP53 se aktivira u odgovoru na mnoštvo različitih tipova stresa, koji moguuključivati DNK oštećenje indukovano UV zračenjem ili hemijskim agensima,oksidativni stres, osmotski šok, neregulisanu ekspresiju onkogena i drugeraznovrsne vidove stresa.Do prevođenja latentne u aktivnu formu TP53 dolazi fosforilacijom,acetilacijom ili glikozilacijom C-terminalnog domena. Fosforilaciju katalizuju S iG2/M ciklin-zavisne kinaze koje utiču na odabir ciljne sekvence na DNK za koju ćese vezati TP53 čime moduliraju aktivaciju TP53 ciljnog gena (Rodier i sar., 2007).Protein kinaze koje fosforilišu aminokiseline u N terminusu mogu se podeliti u dvegrupe. Prva grupa protein kinaza pripada MAPK familiji (JNK1-3, ERK, p38 MAPK)za koju se zna da odgovara na nekoliko različitih tipova stresa, kao što je oštećenjećelijske membrane, oksidativni stres, osmotski šok i dr. Druga grupa protein kinaza(ATR, ATM, CHK1 i CHK2, DNA-PK, CAK) je uključena u molekularnu kaskadu kojadetektuje i odgovara na nekoliko tipova DNK oštećenja prouzrokovanihgenotoksičnim stresom. Onkogeni takođe mogu stimulisati aktivnost TP53,posredstvom proteina p14ARF (eng. Alternative Reading Frame) koji interaguje saMDM2, čime ga inaktivira i omogućava aktivaciju TP53 (Kaelin, 1999). wt TP53 ufiziološkim uslovima ima veoma kratak period polu-života od 4-5 minuta, a kaoodgovor na stres biva stabilizovan fosforilacijom N-terminusa (Giaccia, 1998).Ovim post-translacionim modifikacijama vreme poluživota stabilizovanog TP53 jeproduženo na nekoliko časova. Mutirane forme TP53 su značajno stabilnije, savremenom poluživota od 6 časova.U normalnim ćelijama TP53 se održava na niskom nivou kroz neprekidnudegradaciju. Protein HDM2, humani homolog MDM2 (lociran na mouse double Uvod 50 minute 2 hromozomu) onkogena, je negativni regulator TP53, koji se vezuje za N-terminalni kraj TP53, čime inhibira traskripcionu aktivnost TP53 proteina. Takođe,MDM2 funkcioniše kao ubikvitin ligaza i kovalentno vezuje ubikvtin za TP53, čimeobeležava TP53 za degradaciju u proteazomima. Međutim, vezivanje ubikvitina zaTP53 je reverzibilno. Ubikvitin specifična proteaza USP7 može da ukloni ubikvitinsa TP53, štiteći ga pritom od degradacije u proteazomima. Ovo je jedan način kojimse TP53 stabilizuje u odgovoru na onkogeni “napad”.Aktivirani TP53 se vezuje za DNK i reguliše ekspresiju nekoliko gena.Između ostalog, TP53 funkcioniše kao transkripcioni aktivator gena za protein p21(ciklin-zavisni inhibitor kinaze, CDK1), koji je kodiran WAF1/CIP genom (eng. Wild Type p53 Activated Fragment 1/cdk Interacting Protein). Protein p21 se vezuje zaG1-S/CDK (CDK2) i S/CDK komplekse (molekule važne za prelazak iz G1 u S fazućeliskog ciklusa) inhibirajući njihovu aktivnost (el-Deiry i sar., 1998). Kada je p21 ukompleksu sa CDK2, ćelija ne može preći u sledeću fazu ćelijske deobe. Međutim,ukoliko je protein TP53 mutiran, izostaje sinteza proteina p21, a samim timizostaje i njegova uloga stop-signala za ćelijsku deobu, pa će se ćelije nekontolisanodeliti i formirati tumore.Generalno je prihvaćeno stanovište da se tumor supresorska funkcija TP53ostvaruje putem niza mehanizama u kojima učestvuje TP53:1) TP53 blokira ćelijsku deobu na prelazu iz G1 u S fazu ćelijskog ciklusa,2) stimuliše popravak oštećenja DNK i3) indukuje apoptozuZaustavljanjem ćelijskog ciklusa TP53 omogućava vreme da sereparacionim mehanizmima uklone oštećenja pre replikacije DNK (S faze),aktivacijom integriše različite signale stresa, nakon čega inicira ili prolaznozaustavljanje ćelijskog ciklusa, ili trajno zaustavljanje ćelijskog ciklusa ili iniciraapoptozu, u zavisnosti od stepena oštećenja ćelije. U slučaju gubitka funkcije TP53dolazi do akumulacije mutacija i kancera (Rodier i sar., 2007). Nakon aktivacije, uzavisnosti od signala stresa, obrasca posttranslacionih modifikacija i ćelijskogkonteksta, TP53 deluje kao aktivator/represor transkripcije velikog broja gena. Uvod 51 Translokacijom u mitohondrije TP53 inicira mitohondrijalnu apoptotsku kaskadu,a osobina da preko C-terminusa prepoznaje jednolančane prekide DNK, dovodi dolokalizacije TP53 na lezijama DNK i regrutovanja reparacionih mehanizama(Rodier i sar., 2007).Ćelijska senescenca i starenje tkiva važne su biološke posledice aktivacijeTP53 genotoksičnim stresom i značajno doprinose njegovoj tumor-supresorskojaktivnosti. Kod TP53 +/m miševa, ekspresija mutantnog alela sa delecijom prvih 6egzona TP53 i skraćenim mutantnim proteinskim produktom dovela je doredukcije broja spontanih tumora, ali je indukovala ubrzano starenje ovih miševa uodnosu na one koji nose divlji tip gena (Tyner i sar., 2002). Ovakav fenotipposledica je permanentne aktivacije TP53 koja nastaje kao rezultat interakcijemutantnog i normalnog TP53. U ispitivanju ćelijskog odgovora na inflamacijuindukovanu donorima azot oksida, utvrđeno je da TP53 inicira senescencu prekonishodnog efektora mikroRNA miR-34a. Pojačana ekspresija miR-34a zaustavljaćelijski rast i replikaciju i dovodi do starenja tkiva (Hussain i Harris, 2007). 1.6.3.1. Polimorfizmi u genu za TP53 (Pro47Ser, PIN3 Ins 16bp - rs17878362)U naučnoj literaturi opisano je preko 27.000 mutacija u TP53 genu. Mutacijesu pronađene u gotovo svim tipovima kancera sa različitom učestalošću javljanja ipo svojoj prirodi su veoma raznovrsne. Događaju se rano u kancerogenezi iotkrivaju često u premalignim lezijama, pogotovo kad postoji izloženostkancerogenima iz sredine. Istraživanja kancera jetre i ezofagusa pokazala su da seTP53 mutacije mogu desiti na samom početku prirodnog toka ovih maligniteta(Olivier i sar., 2004). Mutacije TP53 nemaju presudni značaj za samu inicijacijukancerogeneze, već dozvole ćelijama da prevaziđu ograničenje deobe koje postoji ustanju distresa, tj. da ignorišu odgovor na signale koji alterisane ćelije vode uapoptozu ili zastoj ciklusa. Tako je ćelijama sa oštećenom DNK na kratkoomogućena proliferacija, što konačno povećava rizik za progresiju kancera.Generalno, identifikovan je veliki broj polimorfizama TP53 gena i ukodirajućim i u nekodirajućim regionima (Costa i sar., 2008). Najučestalije izmene Uvod 52 TP53 gena u humanim malignim neoplazmama su tačkaste (eng. point) mutacije uvidu supstitucije jednog nukleotida koje dovode do sinteze mutantnog proteinakoji se od produkta divljeg alela razlikuje u jednoj aminokiselini (eng. missensemutacije) Slika 26. To obično uzrokuje izmenu tercijarne strukture molekula ilionemogućava vezivanje za DNK usled zamene argininskih ostataka u DNK-vezujućem domenu TP53 molekula koji direktno interaguju sa DNK (Joerger i sar.,2006), te izostaje transkripciona aktivacija ciljnih gena. Do danas, kako je evidentirano u bazi podataka međunarodne agencije zaistraživanje kancera (the International Agency for Research on Cancer TP53Mutation Database: http://www-p53.iarc.fr/PolymorphismView.asp), opisano je85 SNP-ova TP53 gena od kojih je više od 80% u nekodirajućim sekvencama i kaotakvi nisu dovedeni u asocijaciju sa pojavom i razvojem kancera. Međutim del/inspolimorfizam u intronu 3, insercija 16bp (TP53PIN3 Ins 16bp) je istraživan odstrane velikog broja autora i povezan je sa pojavom različitih tipova kancera,posebno dojke, pluća i kolorektalnim kancerom. Utvrđeno je da je ovajpolimorfizam asociran sa povećanom incidencom metastaza limfnih čvorova.Što se tiče kodirajućih regiona TP53 gena, dva polimorfizma privlačenajveću pažnju naučnika: Arg72Pro i Pro47Ser, oba locirana na egzonu 4. To suujedno i najbolje proučeni polimorfizmi TP53 gena. Utvrđeno je da polimorfizamna kodonu 47, egzona 4 smanjuje sposobnost TP53 da indukuje apoptozu. Kodon47 kodira prolin (CCG) kod wild type varijante TP53, ali kod malog broja ljudi možeda kodira i serin (TCG), što su prvi identifikovali Felley-Bosco i saradnici (1993).Ser 47 varijanta je vrlo retka, sa alelskom učestalošću manjom od 5% u Slika 26. Najučestalije izmene TP53 gena u malignim neoplazmama preuzeto: Brosh i Rotter, 2009. Uvod 53 populacijama Afričkog porekla (Pietsch i sar., 2006; Whibley i sar., 2009), dok je upopulaciji Kavkazijanaca 0%. Da bi istražili posledicu ove aminokiselinske zamenekonstruisana je cDNK koja je sadržala mutaciju, i konstrukt je unet uadenokarcinomsku ćelijsku liniju (Calu-6) koja ne eksprimira p53. Rezultati supokazali da ovaj polimorfizam ne bi trebalo da utiče na supresorsku aktivnost p53.Istraživanja koja se odnose na regulaciju apoptoze su posebno interesantnabudući da su poremećaji na ovom nivou jedan od ključnih mehanizama nastankatumora. Pokazano je da fosforilacija N-terminalnog domena p53 reguliše njegovatransaktivaciona svojstva. P38 i HIPK2 (eng. Homeodomain-Interacting Protein Kinase 2) fosforilišu Ser46, što pojačava transkripciju apoptotski povezanih gena iprema tome promoviše p53 posredovanu apoptozu. Ove dve kinaze su usmereneda fosforilišu mesta prolinskih rezidua u okolini Ser46. Stoga bi se očekivalo dazamena Pro47, koja se dešava u Pro47Ser polimorfizmu smanjuje fosforilaciju uSer46, smanjujući samim tim i transaktivaciju proapoptotskih ciljnih gena što bipotencijalno povećalo rizik za nastanak kancera (Feng i sar., 2006; Kurihara i sar.,2007). Li i sar. (2005) su uočili u ćelijskim linijama čoveka transfeciranim sa p53-Ser47 varijantom da smanjenje fosforilacije Ser46 u p53 proteinu smanjujesposobnost indukcije dva p53 ciljna proapoptotska gena P53AIP1 (eng. p53- regulated apoptosis-inducing protein 1) i BBC3 (eng. BCL2 binding component 3), ismanjuje apoptozu. Oni su pokazali da se Ser47 i wt protein ne razlikuju posposobnosti vezivanja za DNK, prenosu u mitohondrije, ili regulaciji ekspresijevećine p53 ciljnih gena. Međutim, funkcionalni dokazi u različitimeksperimentalnim sistemima pokazuju neusaglašenost. U miševima, blokiranjeSer46 fosforilacije ima samo skromne fenotipske posledice (Toledo i Wahl, 2006).Moguće je da ovaj SNP utiče na p53 funkciju samo pod specifičnim stresnimuslovima (Olivier i sar., 2010). Preostaje da se uticaj ovog polimorfizma napredispoziciju za razvoj kancera dalje prouči.Vrlo interesantnu povezanost su pokazale studije molekularneepidemiologije TP53 mutacija između ekspozicije specifičnim karcinogenima i Uvod 54 karakteristične sheme mutacija u razvoju određenih neoplazmi (Soussi i sar., 2006;Harris, 1993). Najmarkantniji je primer tandem mutacija koje se često sreću ubazocelularnom i skvamocelularnom karcinomu kože, dok je njihova pojava udrugim neoplazmama izuzetno retka (Brash, 1998). U ovim tumorima registrovanaje visoka učestalost C/T tranzicija na dipirimidinskim mestima (CC), te se smatrada je mutacija indukovana ekspozicijom ultravioletnom zračenju. Za karcinompluća, rak jednjaka i tumore glave i vrata karakteristična je visoka učestalosttransverzija G/T (čak 65% za kancere glave i vrata). Transverzija G u T nakodonima 157, 158, 248 i 273 javlja se u karcinomu pluća u 30% slučajeva, a udrugim tumorima u manje od 10% i smatra se posledicom izloženosti duvanskomdimu, odnosno mutagenom dejstvu benzopirena (Denissenko i sar., 1996). 2. CILJEVI RADA Ciljevi rada 56 Predmet doktorske disertacije je analiza funkcionalnih polimorfizamanukleotidne sekvence u genu za TNF alpha, TNF-R1, TNF-R2, MMP-9, SURVIVIN i TP-53, odnosno analiza njihove povezanosti sa patološkim karakteristikamabazocelularnog karcinoma, ishodom bolesti, kao i utvrđivanje postojanjaasocijacije između određenih genotipova ispitivanih polimorfizama i nastankaovog karcinoma. Iz ovoga proističu zadaci istraživanja:  Utvrđivanje starosne strukture pacijenata s obzirom da je bazocelularnikarcinom očekivano češći među starijim delom populacije  Genotipizacija i utvrđivanje učestalosti alela gena za TNF alpha, TNF-R1, TNF-R2, MMP-9, SURVIVIN i TP-53 u grupi pacijenata sa bazocelularnimkarcinomom i u kontrolnoj grupi;  Utvrđivanje povezanosti polimorfizama navedenih gena i rizika za pojavubazocelularnog karcinoma, kao i kliničko-patoloških karakteristika tumora(stadijum bolesti, veličina tumora) i ishoda bolesti;  Ispitivanje postojanja asocijacije između etioloških faktora i genotipovaispitivanih gena, kao i njihove veze sa ishodom i tokom bolesti. HIPOTEZA ISTRAŽIVANJA  Prisustvo specifičnih genotipova u okviru ispitivanih polimorfizama (TNF alpha, TNF-R1, TNF-R2, MMP-9, SURVIVIN i TP-53) može da se pokaže kaofaktor rizika (ili alternativno kao protektivni faktor) u patogenezibazocelularnog karcinoma. 3.PACIJENTI, MATERIJAL I METODE Materijal i metode 58 Ova studija je odobrena od strane Etičkog komiteta StomatološkogFakulteta Univerziteta u Beogradu.3.1. PACIJENTI I BIOLOŠKI MATERIJAL U eksperimentalnom radu korišćena je DNK izolovana iz krvi ili brisevabukalne sluzokože zdravih osoba (kontrolna grupa) i genomska DNK pacijenatalečenih na Klinici za Maksilofacijalnu hirurgiju Stomatološkog fakultetaUniverziteta u Beogradu, izolovana iz tkiva histološki negativnih margina nakonhirruškog odstranjivanja bazocelularnog karcinoma kože glave i vrata.Molekulano genetičko istraživanje je izvršeno u Laboratoriji za GenetikuStomatološkog fakulteta u Beogradu. Grupa pacijenata je obuhvatala 36 muškaracai 44 žene, starosti od 33 do 90, prosečna starost 69.89 godina, medijana 71 godina.Specijalista patologije je obavio disekciju tumorskog tkiva i izvršio TMNklasifikaciju. Kontrolnu grupu činilo je 80 zdravih osoba, dobrovoljnih davaocakrvi, koji i prema polu i starosti odgovaraju grupi ispitanika.3.2. METODE 3.2.1. Izolacija DNK iz limfocita periferne krvi Genomska DNK je izolovana iz limfocita periferne krvi zdravih osoba,pripadnika kontrolne grupe metodom čija je osnovna karakteristika hemijska lizaćelije i provođenje DNK u vodenu fazu kao i hemijsko uklanjanje proteina i RNKmolekula iz izolata. Mnogobrojni koraci centrifugiranja imaju za svrhuodstranjivanje membrane liziranih ćelija krvi i membrane jedara razbijenihleukocita. Tretman smeše različitim jonskim deterdžentima, kao što je SDS, imadvojaku ulogu:a) omogućava da se izvrši denaturacija proteina, tj.da se DNK oslobodi iznukleoprteinskog kompleksa ib) da se inaktivira enzim DNK-aza (denaturacijom enzima), tako da seizolacija može vršiti na sobnoj temperaturi. Materijal i metode 59 Celokupan metodološki proces izolacije DNK iz limfocita periferne krvi, podanima, je opisan u tekstu koji sledi. Prvi danUzorak od 5mL venske krvi sa antikoagulansima (Na-citrat,EDTA) sepomeša istom količinom pufera za lizu 15 do 20 min na +4ºC. Dobro seresuspenduje i drži 10 -15 min na ledu.Uzorak se potom centrifugira 15 min na 2000 obrtaja (2000kpm), nakončega se supernatant odbacuje, a talog se resuspenduje u 5mL fizio-pufera(fiziološkog rastvora).Uzorak se potom centrifugira 15 min na 2000 obrtaja, a ovaj postupak“ispiranja” se ponavlja 2 - 3 puta dok talog ne pobeli.Nakon poslednjeg ispiranja supernatant se odbaci, a talog se rastvori u 3mLpufera A, pa se doda 200 μL 10% SDS (Na-dodecisulfat) i 20 μL proteinaze K(finalne koncentracije 200μg/mL).Uzorak se dobro resuspenduje i inkubira preko noći na 37ºC u termostatu. Drugi danSledećeg dana dodaje se 1mL 6M NaCl (saturisanog) i dobro promućka 15sec. Ovo finalno dodavanje NaCl ima za posledicu povećanje rastvorljivosti DNK.Precipitirani denaturisani proteini se talože centrifugiranjem na 3000 rpm 15 min.Supernatant, u kome se nalazi rastvorena DNK, se prenosi u čiste epruvete icentrifugira 15 min na 3000 rpm.Supernatant se preliva u graduisanu epruvetu, a zatim se dodaje isitvolumen izopropanola, koji omogućava precipitaciju molekula DNK.Pažljivim mućkanjem izdvaja se DNK u vidu beličastog končića. Materijal i metode 60 Končić se hvata Pasterovom pipetom i potapa 30 sec u 70% etanol da bi seuklonio višak soli.DNK se suši na vazduhu 30 sec i zatim se rastvara u 100 μL TE-pufera iliredestilovane vode, zatim se koncentracija DNK određuje spektrofotometrijski natalasnoj dužini 260/280 nm. Pufer za lizu:  0,32M SAHAROZA  10 mM TRIS HCl, pH 7.5  1% TRITON x 100  5 mM MgCl2Autoklavirati i čuvati na +4°C Fiziološki pufer:  0.075 M NaCl  0.025 M EDTA, pH 8 Pufer A:  10 mM TRIS HCl, pH8  400ml NaCl  2 mM EDTA TE pufer:  10 mM TRIS HCl  1 mM EDTA 3.2.2. Izolacija DNK iz tumorskog tkivaIz tumorskog tkiva pacijenata sa dijagnostikovanim BCK-om, DNK jeizolovana metodom koja je detaljnije opisana u narednom tekstu.Tumorsko tkivo macerirati i dodati 500 μL NE pufera.Uzorak se potom centrifugira 2 min na 13 000 obrtaja, nakon čega sesupernatant odbacuje i dodaje se 500 μL NE pufera, 10 μL 10% SDS (Na-dodecisulfat) i 20 μL proteinaze K ( konc. 10 mg/mL). Zatim sledi šejkiranje, a ondai inkubacija 24h na 50 ºC u termostatu. Materijal i metode 61 Nakon isparavanja etanola ćelijski materijal tretiran je digestivnim TNEpuferom sa proteinazom K u finalnoj koncentraciji 200µg/mL i SDS u finalnojkoncentraciji 1%. Ćelijski talog je preko noći inkubiran na 37°C. Ovim postupkomse razbijaju ćelijske i jedarne membrane.Tretman fenol/hloroform/izoamil alkoholom ekstrahuje i prevodi DNK, izorganske u vodenu fazu. DNK je precipitirana u apsolutnom etanolu sa 3M Na-acetatom, a zatim je talog opran u 70% etanolu sa ciljem da se uklone soli. Suvtalog DNK rastvoren je u dH20.Koncentracija DNK određena je spektrofotometrijski. NE pufer:  150 mM NaCl  25 mM EDTA TNE pufer:  100 mM NaCl  10 mM TRIS HCl pH 8.0  25 mM EDTA 3.2.3. Određivanje koncentracije DNK u uzorkuNa spektrofotometru (Gene Quant, Pharmacia LKB, Švedska) su mereneapsorbance na 260 i 280 nm. Koncentracije DNK su izračunate po formuli: c (μg/μL) = (A260 x R x F x OP)/1 000,gde je A260 - apsorbanca uzorka na 260 nm, R - razblaženje (R=100, 5 μL uzorkarastvoreno sa 495 μL sterilne redestilovane vode), F - faktor konverzije zadvolančanu DNK, (F=50), a OP - optički put svetlosti (OP=1 cm). Određen je odnosapsorbanci R=A260/A280 , gde je na osnovu odnosa apsorbanci na 260nm i 280 nmodređivana čistoća uzorka, odnosno kontaminacija proteinima. Materijal i metode 62 3.2.4. Lančana reakcija polimeraze (PCR metoda) Lančana reakcija polimeraze (eng. Polymerase Chain Reaction, PCR) je in vitro amplifikacija definisane DNK sekvence i predstavlja imitaciju procesa DNKreplikacije. Sinteza DNK je katalizovana termostabilnom Taq DNK polimerazom.Ponavljanje ciklusa, od kojih se svaki sastoji od denaturacije DNK, hibridizacijeprajmera i ekstenzije hibridizovanih prajmera od strane termostabilne DNKpolimeraze, rezultuje u eksponencijalnoj amplifikaciji specifičnog DNK fragmenta.PCR se izvodi u mikrotubi zapremine 25µL, gde se u PCR aparatimapodvrgava preciznim, cikličnim promenama temperature. Reakcija se odvija u 35ponovljenih ciklusa DNK sinteze. Materijal i metode 63 3.2.4.1. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-alphaZa PCR reakciju korišćeni su prajmeri čije su sekvence prikazane u Tabeli 6,proizvođača „Metabion“, kao i uslovi pod kojima se odvijala PCR reakcija. Reakcionu smešu u ukupnoj zapremini od 25 µL su činile sledećekomponente prikazane u Tabeli 7: Gen Sekvence prajmera Veličina PCR produkta TNF alpha Fw: 5’- AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT -3’Rv: 5’- ACA CTC CCC ATC CTCCCT GCT -3’ 117 bp35 CIKLUSA Inicijalna denaturacija Denaturacija Hibridizacija Elongacija Finalna ekstenzija 3 minuta 94 o C 1 minut 94 o C 1 minut 59o C 1 minut 72 o C 7 minuta 72 o C MgCl 2 (25 mM) 2,0 µL 10 x PCR pufer 2,5 µL dNTP ( 10mM) 1,0 µL prajmer F 0,25 µL prajmer R 0,25 µL ddH2O 18,0 µL Taq polimeraza 0,15 µL DNK uzorak ( c = 200 µg/ µL ) 1 µL Tabela 7: Reakciona smeša za PCR reakciju TNF alpha Tabela 6: Sekvence prajmera i uslovi PCR reakcije za TNF alpha Materijal i metode 64 3.2.4.2. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-R1 Za PCR reakciju korišćeni su prajmeri čije su sekvence prikazane u Tabeli 8,proizvođača „Metabion“, kao i uslovi pod kojima se odvijala PCR reakcija. Reakcionu smešu u ukupnoj zapremini od 25 µL su činile sledećekomponente prikazane u Tabeli 9: Gen Sekvence prajmera Veličina PCR produkta TNF R1 Fw: 5’-GAC CCC AAA TGG GGG AGT GAG AGG -3’Rv: 5’- ACC AGG CCC GGG CAG GAG AG - 3’ 183 bp35 CIKLUSA Inicijalna denaturacija Denaturacija Hibridizacija Elongacija Finalna ekstenzija 3 minuta 95 o C 1 minut 94 o C 1 minut 65o C 1minut 72 o C 7 minuta 72 o C MgCl 2 (25 mM) 0,5 µL 10 x PCR pufer 2,5 µL dNTP ( 10mM) 0,5 µL prajmer F 0,15 µL prajmer R 0,15 µL ddH2O 20,1 µL Taq polimeraza 0,1 µL DNK uzorak ( c = 200 µg/ µL) 1 µL Tabela 9: Reakciona smeša za PCR reakciju TNF-R1 Tabela 8: Sekvence prajmera i uslovi PCR reakcije za TNF-R1 Materijal i metode 65 3.2.4.3. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za TNF-R2 Za PCR reakciju korišćeni su prajmeri čije su sekvence prikazane u Tabeli 10, proizvođača „Metabion“, kao i uslovi pod kojima se odvijala PCR reakcija. Reakcionu smešu u ukupnoj zapremini od 25 µL su činile sledećekomponente prikazane u Tabeli 11: Gen Sekvence prajmera Veličina PCR produkta TNF R2 Fw: 5’- TTC TGG AGT TGG CTG CGT GT - 3’Rv: 5’- ACT CTC CTA TCC TGC CTG CT -3’ 242 bp35 CIKLUSA Inicijalna denaturacija Denaturacija Hibridizacija Elongacija Finalna ekstenzija 3 minuta 95 o C 1 minut 94 o C 1 minut 58o C 1minut 72 o C 7 minuta 72 o C MgCl 2 (25 mM) 3,5 µL 10 x PCR pufer 2,5 µL dNTP ( 10mM) 1,0 µL prajmer F 0,25 µL prajmer R 0,25 µL ddH2O 16,3 µL Taq polimeraza 0,15 µL DNK uzorak ( c = 200 µg/ µL ) 1 µL Tabela 11: Reakciona smeša za PCR reakciju TNF-R2 Tabela 10: Sekvence prajmera i uslovi PCR reakcije za TNF-R2 Materijal i metode 66 3.2.4.4. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za MMP-9 Za PCR reakciju korišćeni su prajmeri čije su sekvence prikazane u Tabeli 12, proizvođača „Metabion“, kao i uslovi pod kojima se odvijala PCR reakcija. Reakcionu smešu u ukupnoj zapremini od 25 µL su činile sledećekomponente prikazane u Tabeli 13: Gen Sekvence prajmera Veličina PCR produkta MMP 9 Fw: 5’- AAG AGG GCG TGC GCT CCC GACA-3’Rv: 5’- GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA AA -3’ 151 bp35 CIKLUSAInicijalna denaturacija Denaturacija Hibridizacija Elongacija Finalna ekstenzija 4 minuta 95 o C 45 sec 95 o C 45 sec 60 o C 1 minut 72 o C 10 minuta 72 o C MgCl 2 (25 mM) 3,0 µL 10 x PCR pufer 2,5 µL dNTP ( 10mM) 0,5 µL prajmer F 0,2 µL prajmer R 0,2 µL ddH2O 16,6 µL Taq polimeraza 0,2 µL DNK uzorak ( c = 200 µg/ µL ) 2 µL Tabela 13: Reakciona smeša za PCR reakciju MMP-9 Tabela 12: Sekvence prajmera i uslovi PCR reakcije za MMP 9 Materijal i metode 67 3.2.4.5. PCR reakcija u analizi polimorfizma gena za survivin Za PCR reakciju korišćeni su prajmeri čije su sekvence prikazane u Tabeli 14, proizvođača „Metabion“, kao i uslovi pod kojima se odvijala PCR reakcija. Reakcionu smešu u ukupnoj zapremini od 25 µL su činile sledećekomponente prikazane u Tabeli 15: Gen Sekvence prajmera Veličina PCR produkta SURVIVIN Fw: 5’- AAG AGG GCG TGC GCT CCC GACA-3’Rv: 5’- GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA AA -3’ 151 bp35 CIKLUSA Inicijalna denaturacija Denaturacija Hibridizacija Elongacija Finalna ekstenzija 4 minuta 95 o C 45 sec 95 o C 45 sec 60 o C 1 minut 72 o C 10 minuta 72 o C MgCl 2 (25 mM) 3,0 µL 10 x PCR pufer 2,5 µL dNTP ( 10mM) 0,5 µL prajmer F 0,2 µL prajmer R 0,2 µL ddH2O 16,6 µL Taq polimeraza 0,2 µL DNK uzorak ( c = 200 µg/ µL) 2 µL Tabela 15: Reakciona smeša za PCR reakciju SURVIVINA Tabela 14: Sekvence prajmera i uslovi PCR reakcije za SURVIVIN Materijal i metode 68 3.2.4.6. PCR reakcija u analizi polimorfizma TP53 gena Za PCR reakciju korišćeni su prajmeri čije su sekvence prikazane u Tabeli 16, proizvođača „Metabion“, kao i uslovi pod kojima se odvijala PCR reakcija. Reakcionu smešu u ukupnoj zapremini od 25 µL su činile sledećekomponente prikazane u Tabeli 17: Gen Sekvence prajmera Veličina PCR produkta TP 53 A-Fw: 5’- CTG GTA AGG ACA AGG GTT GG -3’A-Rv: 5’ – TCA TCT GGA CCT GGG TCT TC -3’B-Fw: 5’- GAA GAC CCA GGT CCA GAT GA -3’B-Rv: 5’ –CTG CCC TGG TAG GTT TTC TG – 3’ 201 bp/ 185 bp35 CIKLUSA Inicijalna denaturacija Denaturacija Hibridizacija Elongacija Finalna ekstenzija 5 minuta 94 o C 30 sec 94 o C 30 sec 60o C 1 sec 60 o C 5 minuta 72 o C MgCl 2 (25 mM) 1,0 µL 10 x PCR pufer 2,5 µL dNTP ( 10mM) 0,5 µL prajmer F 0,15 µL prajmer R 0,15 µL ddH2O 18,6 µL Taq polimeraza 0,15 µL DNK uzorak ( c = 200 µg/ µL ) 2 µL Tabela 17: Reakciona smeša za PCR reakciju TP 53 Tabela 16: Sekvence prajmera i uslovi PCR reakcije za TP 53 Materijal i metode 69 3.2.5. Poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE)Gel elektroforeza je metoda koja koristi razlike koje postoje izmeđubiomakromolekula u njihovoj pokretljivosti u gelu kada se nađu u električnompolju. Razlike u pokretljivosti počivaju na razlikama u molekulskim masama,prostornoj konformaciji, količini i iznad svega u naelektrisanju koje je presudno zasmer kretanja makromolekula u električnom polju. Zbog ovih razlika oni imajurazličitu pokretljivost u gelu pod uticajem električne struje, pri čemu manjimolekuli putuju brže kroz gel u električnom polju nego veći. U slučaju DNK, koja jezahvaljujući prisustvu velikog broja fosfatnih grupa koje su na fiziološkom pH ujonizovanom stanju, tj.negativno naelektrisane, kretanje ovog makromolekula je odkatode (negativne elektrode) ka anodi (pozitivnoj elektrodi).PCR produkti su analizirani vertikalnom elektroforezom napoliakrilamidnom gelu. Poliakrilamidni gel se dobija mešanjem akrilamida i bis-akrilamida uz korišćenje adekvatnih katalizatora. Polimerizacijom monomeraakrilamida nastaju dugački lanci polimera. Bis-akrilamid formira poprečne veze,kojima se povezuju polimeri akrilamida, te se na taj način dobija mrežastastruktura. Kao inicijatori i katalizatori procesa polimerizacije akrilamida dodaju seAmonijum persulfat (APS) i TEMED (N, N, N’, N’-tetrametiletilendiamin).Zahvaljujući brzini kojom se izvodi i visokoj rezoluciji, PAGE je jedna od najboljihmetoda koja se koristi za razdvajanje i vizuelizaciju nukleinskih kiselina. Elektoforeza je vršena na 8% gel u 1xTBE puferu, pri konstantnom naponustruje od 220 V u trajanju od 60 minuta. ddH2O 3,6 mL 5 x TBE 1,2 mL Akrilamid / Bis-akrilamid 40 % 1,2 mL APS 10% 42 µL TEMED 7,8 µL Tabela 18: 8% poliakrilamidni gel Materijal i metode 70 Za vizuelizaciju fragmenata DNK korišćen je etidium bromid, supstanca kojase interkalira između lanaca DNK molekula i koja fluorescira kada se osvetli UVsvetlom na transiluminatoru. 3.2.6. Restrikciona digestija PCR produkata i analiza dužine restrikcionih fragmenata (RFLP)Restrikciona analiza zasniva se na korišćenju restrikcionih endonukleaza,koje imaju sposobnost da prepoznaju specifične sekvence na dsDNK, dužine 4-6bp, i da iseku DNK molekul u okviru ili veoma blizu tih specifičnih sekvenci.Restrikciona analiza ima primenu u detekciji RFLP-ova, odnosnopolimorfizama restikcionih mesta, kao genetičkih markera u genealoškimistraživanjima. Ovi polimorfizmi javljaju se zbog razlika među individuama u brojurestrikcionih mesta u okviru ispitivanog DNK fragmenta. Savremeni pristup urestrikcionoj analizi podrazumeva:  amplifikaciju specifične sekvence (PCR) u kojoj se odigrala mutacija tipanukleotidne zamene, potom,  restrikcionu digestiju amplifikovanih fragmenata i na kraju  proveru veličine produkata digestije na PAA gelu.Prisustvo ili odsustvo restrikcionog mesta je signal za prisustvo ili odsustvomutacije. Prednost ove metode je u njenoj jednostavnosti, dostupnosti imogućnosti da se analizira veći broj uzoraka. 3.2.6.1. RFLP u analizi polimorfizma gena za TNF alpha -308 G/A Restrikcija PCR produkata dužine 117bp vršena restrikcionim enzimom Nco I (Fermentas). Enzim prepoznaje specifičnu sekvencu 5’…C ↓ CATG G…3’. Uslučaju odsustva mutacije, enzim prepoznaje navedeni niz nukleotida i iseca PCRprodukt čime ga deli na dva fragmenta: od 97bp i 20bp. Restrikcija enzimom Nco Ise odvija u restrikcionoj smeši prikazanoj u Tabeli 19. Inkubacija se odvija prekonoći na temperaturi od 37°C. Materijal i metode 71 Analiza produkata digestije vršena je elektroforezom na 8% PAA gelu. Uokviru amplifikovanog fragmenta postoji jedno restrikciono mesto za enzim Nco I,a mutacija G/A ukida restrikciono mesto, genotipovi obolelih i zdravih osoba mogubiti (Slika 27):  Homozigoti bez mutacije - divlji tip (eng.wild type, WT) (genotipa G/G)poseduju dva fragmenta dužine 97bp i 20bp;  Heterozigoti (HT) za mutaciju (genotipa G/A) poseduju tri fragmentadužine 117bp, 97bp i 20bp;  Homozigoti za mutaciju (MUT - genotipa A/A) poseduju jedan fragment,dužine 117bp. S obzirom da je fragment od 20bp mali i samim tim brzo putuje kroz gel,nakon sat vremena odvijanja elektroforeze neće se vizuelizovati na gelu. Ipak, ovone predstavlja problem, s obzirom da postojanje traka od 117bp i 97bp svakakouslovljava postojanje i trake od 20bp. Komponente smeše: Zapremina (ukupno 20,2μL): Voda 5 μL Pufer 2 μL Enzim Nco I 0,2 μL PCR amplifikat 13 μL Tabela 19: Komponente smeše za digestiju TNF-alpha i njihove zapremine Slika 27: Prikaz PCR produkata (levo) i digestije (desno) na PAA gelu za TNF alpha Materijal i metode 72 3.2.6.2. RFLP u analizi polimorfizma TNF-R1 gena za +36 A/G Restrikcija PCR produkata dužine 183bp vršena restrikcionim enzimom MspA1I. Enzim prepoznaje specifičnu sekvencu 5’…CACG↓ CGTG…3’. U slučajuprisustva mutacije, za razliku od prethodnog polimorfizma, enzim prepoznajenavedeni niz nukleotida i iseca PCR produkt čime ga deli na dva fragmenta: od108bp i 75bp. Restrikcija enzimom MspA 1I se odvija u restrikcionoj smešiprikazanoj u Tabeli 20. Inkubacija traje 3 sata na temperature od 37°C. Analiza produkata digestije vršena je elektroforezom na 8% PAA gelu. Ovdeje situacija drugačija od prethodnog polimorfizma. Prisustvo mutacije A/G dovodido isecanja PCR produkta,pa genotipovi obolelih i zdravih osoba mogu biti:  Homozigoti bez mutacije - WT, (genotipa G/G) poseduju jedan fragmentdužine 183bp;  Heterozigoti (HT) za mutaciju (genotipa A/G) poseduju tri fragmentadužine 183bp, 108bp i 75bp;  Homozigoti za mutaciju (MUT - genotipa A/A) poseduju dva fragmentadužine 108bp i 75bp. Komponente smeše: Zapremina (ukupno 20,4 μL): Voda 5 μL Multicor Pufer 2 μL BSA 0,2 μL Enzim MspA 1I 0,2 μL PCR amplifikat 13 μL Tabela 20: Komponente smeše za digestiju TNF-R1 i njihove zapremine Materijal i metode 73 3.2.6.3. RFLP u analizi polimorfizma TNF-R2 gena za +676 T/GRestrikcija PCR produkata dužine 242bp vršena restrikcionim enzimom Hin 1II. Enzim prepoznaje specifičnu sekvencu 5’…CATG↓…3’. Restrikcijaenzimom Hin 1II se odvija u restrikcionoj smeši prikazanoj u Tabeli 21. Reakcijainkubacije traje 12 sati na temperature od 37°C. Analiza produkata digestije vršena je elektroforezom na 8% PAA gelu. Kodovog polimorfizma prisustvo mutacije T/G ukida restrikciono mesto, pagenotipovi mogu biti (Slika 28):  Homozigoti bez mutacije - wild type (WT) (genotipa T/T) poseduju dvafragmenta dužine 134bp i 108bp;  Heterozigoti (HT) za mutaciju (genotipa T/G) poseduju tri fragmenta,dužine 242bp, 134bp i 108bp;  Homozigoti za mutaciju (MUT - genotipa G/G) poseduju jedan fragmentdužine 242bp. Komponente smeše: Zapremina (ukupno 20,3 μL): Voda 3 μL Pufer 2 μL Enzim Hin 1II 0,3 μL PCR amplifikat 15 μL Tabela 21: Komponente smeše za digestiju TNF-R2 i njihove zapremine Slika 28: Prikaz PCR produkata (levo) i digestije (desno) na PAA gelu za TNF-R2 Materijal i metode 74 3.2.6.4. RFLP u analizi polimorfizma MMP-9 gena za -1562 C/TRestrikcija PCR produkata je vršena restrikcionim enzimom Sph I. Enzimprepoznaje niz nukleotida 5´… GCATG ↓ C…3´ i u slučaju postojanja mutacije vršizasecanje DNK lanca na mestu T, čime PCR produkt veličine 442bp deli na dvafragmenta: od 264bp i 178bp (Slika 29). Restrikcija enzimom Sph I se odvija urestrikcionoj smeši koja sadrži: Inkubacija restrikcione smeše je trajala 16 sati na 37ºC. Analiza produkatadigestije je usledila nakon elektroforeze u 8% PAA gelu, imajući u vidu da:  Homozigoti bez mutacije - wild type (WT) (genotipa C/C) poseduju jedanfragment dužine 442bp;  Heterozigoti (HT) za mutaciju (genotipa C/T) poseduju tri fragmenta,dužine 442bp, 264bp i 178bp;  Homozigoti za mutaciju (MUT - genotipa T/T) poseduju dva fragmenta,dužine 264bp i 178bp. Komponente smeše: Zapremina (18 μL): Voda 4,5 μL Pufer 2 μL Enzim Hin 1II 1,5 μL PCR amplifikat 10 μL Tabela 22: Komponente smeše za digestiju MMP-9 i njihove zapremine Materijal i metode 75 3.2.6.5. RFLP u analizi polimorfizma gena za SURVIVIN za -31 G/CRestrikcija PCR produkata dužine 151bp vršena restrikcionim enzimom Msp I (Fermentas). Enzim prepoznaje specifičnu sekvencu 5’… C↓ CG G…3’, i vršizasecanje DNK lanca na mestu C. U slučaju odsustva mutacije, enzim prepoznajenavedeni niz nukleotida i iseca PCR produkt čime ga deli na dva fragmenta: od90bp i 61bp. Restrikcija enzimom Msp I se odvija u restrikcionoj smeši prikazanoju Tabeli 23. Komponente smeše: Zapremina (ukupno 20 μL): Voda 6 μL Pufer 2 μL Enzim MspI 1 μL PCR amplifikat 11 μL Analiza produkata digestije vršena je elektroforezom na 8% PAA gelu. Poštou okviru amplifikovanog fragmenta postoji jedno restrikciono mesto za enzim Slika 29: Prikaz PCR produkata (gore) i digestije (dole) na PAA gelu za MMP-9 Tabela 23: Komponente smeše za digestiju SURVIVINA i njihove zapremine Materijal i metode 76 MspI, a mutacija -31 G/C ukida restrikciono mesto, genotipovi obolelih i zdravihosoba mogu biti (Slika 30):  Homozigoti bez mutacije - wild type (WT) (genotipa C/C) poseduju dvafragmenta, dužine 90bp i 61bp ;  Heterozigoti (HT) za mutaciju (genotipa G/C poseduju tri fragmenta,dužine 151bp, 90bp i 61bp;  Homozigoti za mutaciju (MUT - genotipa G/G) poseduju jedan fragment,dužine 151bp. 3.2.6.6. RFLP u analizi polimorfizma TP53 gena (Pro47Ser, PIN3 Ins 16bp)Restrikcija PCR produkata je vršena restrikcionim enzimom Msp I(Fermentas). U okviru amplifikovanog fragmenta postoji jedno restrikciono mestoza enzim Msp I , kod wt alela dolazi do sečenja u okviru datog restrikcionog mesta ii PCR produkt se deli na dva fragmenta od 156/140bp i 45bp. Mutacija C/T uokviru restrikcionog mesta ukida dato restrikciono mesto i stoga ne dolazi do Slika 30: Prikaz PCR produkata (gore) i digestije (dole) na PAA gelu za SURVIVIN Materijal i metode 77 sečenja. Razlike u dužini dužeg fragmenta su posledica mogućeg prisustva insercijeod 16bp, pri čemu originalna sekvenca od 185bp posle sečenja daje fragment od140bp, a usled prisustva polimorfizma PIN3 Ins16bp uočava se dužina fragmentaod 156 bp. Inkubacija restrikcione smeše je trajala 3 sata na 37ºC. Analiza produkata digestijeje usledila nakon elektroforeze u 8% PAA gelu (Slika 31). Mogući genotipovizdravih i obolelih osoba su :  Homozigoti genotipa TP-53 C/C (bez mutacije - wt) poseduju dvafragmenta različite dužine 156 ili 140bp i 45bp;  Heterozigoti za mutaciju (HT), genotipa C/T, poseduju tri fragmenata201 ili 185bp, 156 ili 140bp i 45bp.  Homozigoti za mutaciju, genotipa T/T, poseduju jedan fragment 201 ili185bp. Komponente smeše: Zapremina (ukupno 20 μL): Voda 7,5 μL Pufer 2 μL Enzim MspI 0,5 μL PCR amplifikat 10 μL Tabela 24: Komponente smeše za digestiju TP53 i njihove zapremine Slika 31: Prikaz PCR produkata (gore) i digestije (dole) na PAA gelu za TP53 Materijal i metode 78 Insercioni polimorfizam TP 53 genaMeđu polimorfizmima identifikovanim u intronima, polimorfizam introna 3PIN3 Ins16bp gde dolazi do insercije 16bp je privukao najveću pažnju. Uslučajevima izostanka ove insercije, imamo homozigote A1/A1, a na geluuočavamo samo jednu traku od 185bp, ako je insercija prisutna na samo jednomalelu dobijamo heterozigote A1/A2 i uočavamo dve trake od 185 i 201bp, a uslučaju prisustva na oba alela, homozigote A2/A2 i opet se uočava jedna traka, alivisine 201bp. 3.2.7. Statistička analiza Statistička obrada podataka urađena je uz pomoć nekoliko testova: Hikvadrat (χ2) test za utvrđivanje razlika u distribuciji učestalosti različitih alela igenotipova u grupama obolelih od bazocelularnog karcinoma i kontrolnoj grupi.Fišerovim testom egzaktne verovatnoće (eng. Fisher Exact Probability Test) sutestirane razlike u slučaju da se radi o uzorku manjem od 5. Logističkomregresionom analizom računat je odnos verovatnoća (eng. Odds Ratio) zautvrđivanje rizika oboljevanja od bazocelularnog karcinoma, sa intervalompoverenja (eng. Confidence Interval, CI) od 95%. Sve vrednosti p smatrale su sestatistički značajnim ako su bile manje od 0.05. Dobijeni rezultati su obrađenistatističkim programom SPSS (verzija 13.0, IBM SPSS Inc.). 4. REZULTATI Rezultati 80 Poglavlje rezultati je podeljeno u 4 dela. U prva tri dela su detaljnijepredstavljene karakteristike grupe pacijenata sa dijagnostifikovanim BCK-om:prema starosti (4.1.), lokaciji tumora (4.2.) i veličini tumora (4.3.). Poslednje,četvrto poglavlje (4.4.) obuhvata analizu genetičkih rezultata, odnosno povezanostiispitivanih polimorfizama sa razvojem bazocelularnog karcinoma. 4.1.Distribucija pacijenata prema godinama starosti Analizom je obuhvaćeno 160 ispitanika, od toga 80 pacijenata obolelih odbazocelularnog karcinoma lečenih na klinici za Maksilofacijalnu hirurgijuStomatološkog Fakulteta Univerziteta u Beogradu. Kontrolnu grupu činilo je 80zdravih osoba, dobrovoljnih davaoca krvi, koji i prema polu i starosti odgovarajugrupi ispitanika. Grupa pacijenata je obuhvatala muškarace i žene, starosti od 33do 90, prosečna starost 69.89 godina, medijana 71 godina (Slika 32). Premapodacima u literaturi, 5-15% obolelih su između 20 i 40 godina, dok je čak 70%starosti do 70 godina. U odnosu na navedene podatke možemo reći da naša studijaima svega 1.25% obolelih između 20 i 40 godina, a najveći broj pacijenata su starijiod 60 godina (84%) , sa maksimumom na kategoriji između 70 i 79 godina (Slika 33). Naši rezultati potvrđuju da je BCK češći u starijem delu populacije i da seincidenca njegovog nastanka povećava sa godinama. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Go din e ži vo ta Broj pacijenata Slika 32: Prikaz odnosa broja pacijenata sa BCK-om u odnosu na godine života Rezultati 81 Grupu pacijenata sa bazocelularnim karcinomom činilo je 36 muškarca i 44žene, pri čemu je odnos među polovima M:Ž=1:1.2. Ranije je pomenuto da jeincidenca oboljevanja od BCK-a veća u muškoj populaciji, ako se posmatraju svidelovi tela. U našem uzorku žene su neznatno brojnije (Slika 33), ali je naša analizaobuhvatila samo BCK regiona glave i vrata, gde je odnos polova oko 1:1, što značida se naša populacija uklapa u svetske podatke. 4.2. Lokacija tumoraU Tabeli 25 su prikazane lokacije bazocelularnog karcinoma u regionu glavesa njihovim procentualnim zastupljenostima, dok Slika 34 prikazuje njihovuzastupljenost u odnosu na pol. Većina bazocelularnih karcinoma je locirana usamom središtu lica. Najveći procenat obuhvata region nosa, čak 26%, što se upotpunosti poklapa sa podacima iz literature, s obzirom da je to najistureniji deo 0 5 10 15 20 25 ‹40 Br oj pa cij en ata Slika 33: Prikaz odnosa broja pacijenata sa BCK-om u odnosu na godine života i pol 40_49 50_59 60_69 70_79 Godine života ›80 Rezultati 82 glave. Takođe, treba napomenuti da je nešto veća zastupljenost na ovoj lokacji kodženskog pola. Odmah za njim sledi očni region (21,9%). Razlika među polovima jemanja nego u regionu nosa, dok je na svim ostalim delovima lica bazocelularnikarcinom ravnomerno raspoređen u odnosu na polove (Slika 34). Red.br. Lokacija tumora % 1 Occipitalis (potiljak) 2,7 2 Frontalis (čelo) 8,288,3 Frontotemporalis (spoj čela i slepoočnice) 1,4 1,44 Temporalis (slepoočnica) 4,1 5 Dorsi nasi (koren nosa) 16,4 6 Alae nasi (nosno krilce) 9,6 7 Canthi medialis (unut.ugao oka) 5,5 8 Palpebrae inferioris (donji očni kapak) 2,7 9 Orbitae (očne duplje) 1,4 10 Infraorbitalis (ispod očne duplje) 10,9 11 Lateroorbitalis (spolj.strana očne duplje) 1,4 12 Zygomatica (jagodice) 5,5 13 Buccae (obrazi) 9,6 14 Sulci nasolabialis (od nozdrva do usana) 2,7 15 Labi oris superioris (gornja usna) 6,8 16 Arotidomassterica (od zgloba donje vilice do ugla donje vilice) 1,4 17 Preauricularis (pre ušne školjke) 5,5 18 Auriculae (uši) 4,1 Tabela 25: Procentualna zastupljenost bazocelularnog karcinoma u regionu glave i vrata Rezultati 83 4.3. Veličina tumora i proteklo vreme od uočavanja prve promeneVeličina tumora iznosila je od 5 do 80mm. Većina tumora bila je manja od10mm (42.25%), sledeći po zastupljenosti bili su tumori veličine 11-20mm(38.03%), a samo 19.72% tumora bilo je veće od 20mm i klasifikovano kao T2prema TNM klasifikaciji predloženoj od strane American Joint Commite (Slika 35). 0 5 10 15 20 25 30 35 0 1_10 mm Br oj pa cij en ata Slika 35: Prikaz odnosa broja pacijenata i veličine tumora (crvenom bojom označen tumor manji od 20mm, plavom veći od 20mm) 5,5% 5,5% 9,6% 9,6% 6,8% 4,1% 16,4% 2,7% 11% 12,3% potiljak i čelo očni region nos uši usne 9,6% 6,9%obrazi i vilica Slika 34: Prikaz odnosa broja pacijenata sa BCK-om u odnosu na delove glave i lica 11_20 mm 21_30 mm 31_40 mm 41_50 mm 51_60+ mm Rezultati 84 Kada analiziramo vreme koje je proteklo od kako je pacijent uočio prvupromenu na koži do trenutka operacije, opseg se kreće od minimalnih mesec danado maksimalnih 25 godina. Najveći broj pacijenata, čak 49% su oni koji sureagovali odmah u prvoj godini nakon uočene prve promene na koži, a odmah zanjima po zastupljenosti, su pacijenti koji su se javili lekaru tokom druge godine odtrenutka uočavanja prve promene (21%). Važno je napomenuti da broj pacijenatakoji su duže od 10 godina nosili promene na koži pre nego što su se obratili lekaruu našem uzorku iznosi svega oko 10% (Slika 36). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Br oj pa cij en ata 1 2 3 4 5 10 13 15 20 25 Slika 36: Prikaz odnosa broja pacijenata i proteklog vremena od uočavanja prve promene na koži do trenutka operacije Vreme prikazano godinama Rezultati 85 4.4. Analiza genetičkih rezultata 4.4.1. Analiza polimorfizma u genu za TNF-alphaDistribucija učestalosti genotipova i alela, kao rezultat mutacije upromotorskom regionu gena za TNF-alpha na poziciji -308, odnosno supstitucijeguanina u adenin, prikazani su u Tabeli 26. N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, χ2-hi-kvadrat vrednost, p-Pirsonov (Pearson’s) koeficijentU grupi obolelih od bazocelularnog karcinoma od ukupno 50 ispitanika 29ima GG genotip (58%), GA genotip 21 ispitanik (42%), a nema ni jednogmutiranog homozigota. U kontrolnoj grupi od 60 ispitanika, 39 ima GG genotip(65%), 21 GA genotip (35%), a takođe izostaje mutirani homozigot (Tabela 27, Slika 37). Iz učestalosti genotipova slede učestalosti alela. Wild type alel G jezastupljen sa 79% u grupi ispitanika oboleloj od BCK-a, dok je u kontrolnoj grupinešto veća i iznosi 82.5%, a mutirani alel je znatno manje zastupljen u obeispitivane grupe, sa 21% i 17.5% redom.Hi-kvadrat test je pokazao da nema statistički značajnih razlika (p>0.05) uučestalostima ispitivanih alela i genotipova gena za TNF alpha između grupepacijenata i kontrolne grupe (Tabela 26). Takođe, kada su testirane međusobnoupoređene grupe odgovarajuće starosti, nije dobijena značajna razlika. Gen/SNP Genotip BCK K χ2 p N N TNF alp ha rs18006 29 GG 29 39 0.57 0.452GA 21 21AA / / Aleli G 79 99 0.62 0.512 A 21 21 Tabela 26: Distribucija učestalosti genotipova i alela u ispitivanim grupama u analizi polimorfizma gena za TNF-alpha Rezultati 86 Rezultati prikazani u Tabeli 27, ukazuju da nosioci alela A imaju 25%(OR=1.25, 95%CI=0.64-2.46) veći rizik oboljevanja od BCK-a. Kod heterozigotnihosoba je taj rizik povećan na 34% (OR=1.34, 95%CI=0.62-2.91), dok mutiranehomozigote nismo našli ni u jednoj od ispitivanih grupa. Nijedna vrednost nijestatistički značajna (Tabela 27). N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća) Gen/Genotip BCK K Crude OR(95% CI) pN % N % TN F a lph a rs18006 29 GG 29 58.0 39 65.0 1.00 Ref.GA 21 42.0 21 35.0 1.34 (0.62-2.91) 0.452 AA / 0.0 / 0.0 0.00 (0.00-0.00) 1.000 GA+AA 21 42.0 21 35.0 1.34 (0.62-2.91) 0.452 Aleli G 79 79.0 99 82.5 1.00 Ref. A 21 21.0 21 17.5 1.25 (0.64-2.46) 0.512 Slika 37: Procentualna zastupljenost genotipova u ispitivanim grupama Tabela 27: Polimorfizam u genu za TNF-alpha i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - crude Odds Ratio 0 20 40 60 80 100 % zas tup lje no st TN F a lph a rs18006 29 58 42 0 65 35 0GG GA AA BCC kontrole TN F a lph a rs18006 29 Rezultati 87 Ako u analizu uključimo podatke o ispitanicima vezane za njihove godine,pol, konzumiranje cigareta i alkohola i izračunamo tzv. Adjusted OR (Tabela 28),vidimo da heterozigoti GA genotipa imaju 1.51 puta veći rizik za oboljevanje odBCK-a u poređenju sa wild type homozigotima, GG genotipa. N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća) 4.4.2. Analiza polimorfizma u genu za TNF-R1 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, χ2-hi-kvadrat vrednost, p-Pirsonov (Pearson’s) koeficijent U Tabeli 29 prikazane su učestalosti genotipova i alela u grupi ispitanikaoboloelih od BCK-a i u kontrolnoj grupi, za polimorfizam u egzonu 1, na poziciji+36 gena za TNF-R1. Analiza učestalosti genotipova je pokazala da je u grupi Gen/Genotip BCK K Adjusted OR (95% CI) pN % N % TN F a lph a rs1 80 06 29 GG 29 58.0 39 65.0 1.00 Ref. GA 21 42.0 21 35.0 1.51 (0.66-3.45) 0.326 AA / 0.0 / 0.0 0.00 (0.00-0.00) 1.000 GA+AA 21 42.0 21 35.0 1.51 (0.66-3.45) 0.326 Gen/SNP Genotip BCK K χ2 p N N TN F– R1 rs7 67 45 5 AA 19 21 2.88 0.237AG 29 31 GG 2 8 Aleli A 67 73 0.65 0.343 G 33 47 Tabela 29: Distribucija učestalosti genotipova i alela u ispitivanim grupama u analizi polimorfizma gena za TNF-R1 Tabela 28: Polimorfizam u genu za TNF-alpha i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - Adjusted Odds Ratio Rezultati 88 pacijenata najzastupljeniji AG genotip sa 58%, potom wt homozigot, AA sa 38%, aonda i mutirani homozigot, GG sa 4%. U kontrolnoj grupi redosled genotipovaprema zastupljenosti je isti kao i u grupi pacijenata, sa vrednostima: AG genotip51.6 %, AA genotip 35%, GG genotip sa 13.4%. Učestalost mutiranog homozigota jeveća u kontrolnoj grupi, ali nema statistički značajne razlike (Tabela 30, Slika 38). Na osnovu učestalosti genotipova izračunate su i učestalosti alela, A (wild type) i mutiranog G alela. Razlike u njihovim učestalostima u dve ispitivane grupenisu statistički značajne (χ2=0.65, p=0.343), Tabela 29.U cilju utvrđivanja postojanja asocijacije između određenog genotipa genaza TNF-R1 i rizika za razvoj BCK-a, računat je Crude Odds Ratio logističkomregresionom analizom (Tabela 30). Rezultati prikazani u Tabeli 30 ukazuju da alelG ispoljava 1,3 puta manji rizik za oboljevanje od BCK-a u odnosu na alel A(OR=0.76, 95%CI=0.44-1.33), ali ta vrednost nije statistički značajna. Takođe,heterozigoti AG genotipa ne iskazuju rizik za nastanak BCK-a, dok mutiranihomozigoti genotipa GG pokazuju čak 3.7 puta manji rizik za oboljevanje od BCK-a 0 20 40 60 80 100 % zas tup lje no st Slika 38: Procentualna zastupljenost genotipova u ispitivanim grupama 38 58 4 35 52 13 AA AG GG BCC kontrole Rezultati 89 (OR=0.27, 95%CI=0.05-1.47), Tabela 30. Međutim, kada u logističku regresionuanalizu uključimo godine, pol i podatke vezane za konzumiranje alkohola i cigerataispitanika, dobijamo Adjusted OR (Tabela 31), koji pokazuje da je rizik zaoboljevanje od BCK-a 1.32 puta veći kod heterozigota AG genotipa u odnosu na AAgenotip, dok se vrednost za GG genotip nije značajno promenila. N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća), *-Fisher Exact Probability Test N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća), *-Fisher Exact Probability Test Gen/Genotip BCK K Crude OR (95% CI) pN % N % TN F– R1 rs7 67 45 5 AA 19 38.0 21 35.0 1.00 Ref. AG 29 58.0 31 51.6 1.03 (0.46-2.30) 0.920 GG 2 4.0 8 13.4 0.27 (0.05-1.47) 0.110* AG+GG 31 62.0 39 65.0 0.88 (0.40-1.91) 0.740 AleliA 67 67.0 73 60.8 1.00 Ref. G 33 33.0 47 39.2 0.76 (0.44-1.33) 0.343 Gen/Genotip BCK K Adjusted OR (95% CI) pN % N % TN F-R 1 rs7 67 45 5 AA 19 38.0 21 35.0 1.00 Ref.AG 29 58.0 31 51.6 1.32 (0.56-3.12) 0.526 GG 2 4.0 8 13.4 0.28 (0.05-1.57) 0.149* AG+G G 31 62.0 39 65.0 1.06 (0.46-2.42) 0.887 Tabela 30: Polimorfizam u genu za TNF-R1 i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - crude Odds Ratio Tabela 31: Polimorfizam u genu za TNF-R1 i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - Adjusted Odds Ratio Rezultati 90 4.4.3. Analiza polimorfizma u genu za TNF-R2Analizom polimorfizama u egzonu 6, na poziciji +676 gena za TNF-R2dobijene su distribucije učestalosti genotipova i alela, prikazane u Tabeli 32 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, χ2-hi-kvadrat vrednost, p-Pirsonov (Pearson’s) koeficijent,* - statistička značajnost (p‹0.05)Najzastupljeniji genotip u grupi ispitanika obolelih od BCK-a je heterozigot,TG sa 76%, a za njim homozigot wild type sa 20% i na kraju mutirani homozigot,GG 4%. U kontrolnoj grupinajzastupljeniji je wt homozigot sa53.4%, zatim heterozigot sa 41.6%, aonda i GG genotip sa 5% (Slika 39). Izovih vrednosti izračunate su i učestalostialela u obe analizirane grupe (Tabela 32, Slika 40). Hi-kvadrat testom je utvrđenoda postoji statistički značajna razlika udistribuciji učestalosti ispitivanihgenotipova (χ2=13.61, p=0.001) i alela(χ2=5.72, p=0.011), Tabela 32, izmeđugrupe pacijenata sa bazocelularnimkarcinomom i kontrolne grupe u genu zaTNF-R2. Gen/SNP Genotip BCK K χ2 p N N TN F– R2 rs1 06 16 22 TT 10 32 13.61 0.001*TG 38 25 GG 2 3 Aleli T 58 89 5.72 0.011* G 42 31 20 76 53 42 0 20 40 60 80 100 TT TG BCC kontrole % zas tup lje no st Tabela 32: Distribucija učestalosti genotipova i alela u ispitivanim grupama u analizi polimorfizma gena za TNF-R2 Slika 39: Procentualna zastupljenost genotipova u ispitivanim grupama TN F– R2 rs1 06 16 22 4 5 GG TN F– R2 rs1 06 16 22 Rezultati 91 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja), p-probability (verovatnoća), * -Fisher Exact Probability Test, **-statistička značajnost (p‹0.05) Rezultati dati u Tabeli 33 pokazuju da alel G nosi čak 2.08 puta veći rizik zaoboljevanje od BCK-a nego wild type alel T (OR=2.08, 95%CI=1.17-3.67) i ovavrednost je statistički značajna, p‹0.05 i iznosi p=0.011. Najveći rizik za oboljevanjeod BCK-a imaju heterozigotne osobe genotipa TG, čak 4.86 puta veći u poređenjusa wild type homozigotima TT (OR=4.86, 95%CI=2.03-11.62). Ova vrednostpokazuje statističku značajnost manju i od 0.01, Tabela 33. Gen/Genotip BCK K Crude OR (95% CI) pN % N % TN F– R2 rs1 06 16 22 TT 10 20.0 32 53.4 1.00 Ref. TG 38 76.0 25 41.6 4.86 (2.03-11.62) ‹ 0.001** GG 2 4.0 3 5.0 2.13 (0.31-14.62) 0.379* TG+GG 40 80.0 28 46.6 4.57 (1.94-10.79) ‹ 0.001**AleliT 58 58.0 89 74.2 1.00 Ref. G 42 42.0 31 25.8 2.08 (1.17-3.67) 0.011** q 42%p 58% a Slika 40: Procentualna zastupljenost alela TNF-R2 gena u grupi ispitanika i kontrolnoj grupi a) uzorci b) kontrole Tabela 33: Polimorfizam u genu za TNF-R2 i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - crude Odds Ratio TN F– R2 rs1 06 16 22 q 26% p 74% b TN F– R2 rs1 06 16 22 Rezultati 92 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća), * -Fisher Exact Probability Test, **-statistička značajnost (p‹0.05) Nakon izračunavanja Adjusted OR (Tabela 34), kada se u analizu uključepodaci o godinama ispitanika, njihovom polu i konzumaciji alkohola i cigareta, rizikza oboljevanje od BCK-a se još dodatno povećava. Heterozigoti imaju čak 6.28 putaveći rizik za oboljevanje od ovog tipa karcinoma u odnosu na osobe sa wild typegenotipom, a kod mutiranih homozigota ovaj rizik jeste uvećan, ali neznatno. 4.4.4. Analiza polimorfizma u genu za MMP-9U Tabeli 35 prikazane su učestalosti genotipova i alela u grupi ispitanikaoboloelih od BCK-a i u kontrolnoj grupi, koji su posledica C/T supstitucije napoziciji -1562 promotorskog regiona gena za MMP-9. Najzastupljeniji genotip uobe ispitivane grupe je wild type homozigot, CC sa 81.4% u kontrolnoj i 72.9% ugrupi ispitanika, potom sledi heterozigot genotipa CT sa 15.7% u kontrolnoj i27.1% u grupi ispitanika sa BCK-om, dok mutirani homozigot u grupi ispitanikaizostaje, a u kontrolnoj je zastupljen sa 2.9% (Slika 41). Hi-kvadrat testom jeutvrđeno da nema statistički značajne razlike u distribuciji učestalosti analiziranihgenotipova (χ2=1.46, p=0.227), Tabela 35. Gen/Genotip BCK K Adjusted OR (95% CI) pN % N % TN F– R2 rs1 06 16 22 TT 10 20.0 32 53.4 1.00 Ref. TG 38 76.0 25 41.6 6.28 (2.43-16.25) 0.000** GG 2 4.0 3 5.0 2.26 (0.31-16.55) 0.422* TG+GG 40 80.0 28 46.6 5.76.(2.27-14.63) 0.000** Tabela 34: Polimorfizam u genu za TNF-R2 i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - Adjusted Odds Ratio Rezultati 93 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, χ2-hi-kvadrat vrednost, p-Pirsonov (Pearson’s) koeficijentU tabeli 35 prikazane su i učestalosti alela, izračunate na osnovu učestalostigenotipova. Ova vrednost nije statistički značajna (χ2=0.30, p=0.462). Rezultati prikazani u Tabeli 36 ukazuju da alel T ispoljava 1.31 puta većirizik za oboljevanje od BCK-a u odnosu na alel C (OR=1.31, 95%CI=0.63-2.69), alita vrednost nije statistički značajna. Takođe, heterozigoti CT genotipa iskazuju 1.93puta veći rizik za oboljevanje od BCK-a (OR=1.93, 95%CI=0.84-4.44), Tabela 36. Gen/SNP Genotip BCC K χ2 p N N MM P-9 rs3 91 82 42 CC 51 57 4.47 0.107CT 19 11 TT / 2 Aleli C 121 125 0.30 0.462 T 19 15 0 20 40 60 80 100 % zas tup lje no st Slika 41: Procentualna zastupljenost genotipova u ispitivanim grupama Tabela 35: Distribucija učestalosti genotipova i alela u ispitivanim grupama u analizi polimorfizma gena za TNF-R2 MM P-9 rs3 91 82 42 73 27 0 81 16 3 CC CT TT BCC kontrole MM P-9 rs3 91 82 42 Rezultati 94 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća), * -Fisher Exact Probability TestRezultat logističke regresione analize sa uključenim podacima oispitanicima o konzumaciji alkohola i cigaretama, Adjusted OR, njihovim godinama ipolu pokazuje neznatno smanjenje rizika za oboljevanje od BCK-a u odnosu na Crude OR (Tabela 37). N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća) Gen/Genotip BCK K Crude OR (95% CI) pN % N % MM P-9 rs3 91 82 42 CC 51 72.9 57 81.4 1.00 Ref. CT 19 27.1 11 15.7 1.93 (0.84-4.44) 0.118 TT / 0.0 2 2.9 0.00 (0.00-0.00) 0.285* CT+TT 19 27.1 13 18.6 1.63 (0.73-3.64) 0.227Aleli C 121 86.4 125 89.3 1.00 Ref. T 19 13.6 15 10.7 1.31 (0.63-2.69) 0.462 Gen/Genotip BCK K Adjusted OR (95% CI) p N % N % MM P-9 rs3 91 82 42 CC 51 72.9 57 81.4 1.00 Ref. CT 19 27.1 11 15.7 1.81 (0.76-4.29) 0.177 TT / 0.0 2 2.9 0.00 (0.00-0.00) 0.999 CT+TT 19 27.1 13 18.6 1.60 (0.70- 3.67) 0.269 Tabela 36: Polimorfizam u genu za MMP-9 i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - crude Odds Ratio Tabela 37: Polimorfizam u genu za MMP-9 i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - Adjusted Odds Ratio Rezultati 95 4.4.5. Analiza polimorfizma u genu za survivinMutacija u promotorskom regionu na poziciji -31 gena za survivin dovodido supstitucije citozina guaninom. Kao posledica te supstitucije u populaciji semogu naći osobe sa tri različita genotipa: CC (wild type), GC heterozigot i GGmutirani homozigot.Raspodela genotipova po ispitivanim grupama je sledeća: u grupi obolelihod bazocelularnog karcinoma od ukupno 70 ispitanika 9 ima CC genotip (13%), GCgenotip 25 ispitanika (36%), 36 ima GG genotip (51%). U kontrolnoj grupi odtakođe 70 ispitanika, 8 ima CC genotip (11%), 34 GC genotip (49%) i 28 ima GGgenotip (40%), Tabela 38, Slika 42.Na osnovu učestalosti genotipova izračunate su i učestalosti alela C i G genaza survivin i njihove vrednosti su: za alel C 35.7% u kontrolnoj i 30.7% u grupiispitanika oboleloj od BCK-a, za mutirani alel G, 64.3% i 69.3% respektivno. N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, χ2-hi-kvadrat vrednost, p-Pirsonov (Pearson’s) koeficijent Hi-kvadrat testom je utvrđeno da nema statistički značajnih razlika(p>0,05) u učestalostima ispitivanih alela i genotipova gena za survivin međuispitivanim grupama (Tabela 38). Gen/SNP Genotip BCK K χ2 p N N Su rvi vin rs9 90 43 41 CC 9 8 2.43 0.150GC 25 34 GG 36 28 Aleli C 43 50 0.58 0.374 G 97 90 Tabela 38: Distribucija učestalosti genotipova i alela u ispitivanim grupama u analizi polimorfizma gena za survivin Rezultati 96 U cilju ispitivanja postojanja asocijacije između određenog genotipa i rizikaza razvoj BCK-a, računat je Crude Odds Ratio logističkom regresionom analizom(Tabela 39). N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća) Gen/Genotip BCK K Crude OR (95% CI) pN % N % Su rvi vin rs9 90 43 41 CC 9 12.9 8 11.4 0.87 (0.30-2.56) 0.807 GC 25 35.7 34 48.6 0.57 (0.28-1.17) 0.125 GG 36 51.4 28 40.0 1.00 Ref. CC+GC 34 48.6 42 60.0 0.63 (0.32-1.23) 0.175 Aleli C 43 30.7 50 35.7 0.79 (0.48-1.31) 0.374 G 97 69.3 90 64.3 1.00 Ref. 0 20 40 60 80 100 % zas tup lje no st Tabela 39: Polimorfizam u genu za survivin i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - crude Odds Ratio Slika 42: Procentualna zastupljenost genotipova u ispitivanim grupama Su rvi vin rs9 90 43 41 13 36 51 11 49 40 CC CG GG BCC kontrole Su rvi vin rs9 90 43 41 Rezultati 97 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća), *-statistička značajnost (p‹o.o5)Na osnovu rezultata iz Tabele 39 se vidi da nosioci alela C imaju 1.26 putamanji rizik za oboljevanje od bazocelularnog karcinoma u odnosu na G alel(OR=0.79, 95%CI=0.48-1.31). Genotipovi CC i CG takođe imaju manji rizikoboljevanja od BCK-a u odnosu na GG genotip, ali vrednosti nisu statističkiznačajne. Međutim, Adjusted Odds Ratio kombinovan sa podacima o godinama,polu, konzumiranju alkohola i pušenju pokazao statistički značajan smanjen rizikza oboljevanje od BCK-a kod heterozigota CG u odnosu na homozigote GG(OR=0.46, 95%CI=0.21-0.99, p=0.047), Tabela 40. 4.4.6. Analiza polimorfizma u TP53 genuKodon 47 u okviru egzona 4 kodira prolin (CCG) kod wild type varijante, alikod malog broja ljudi, usled mutacije C/T, može da kodira i serin (TCG). Ser47varijanta u populacijama je vrlo retka. U našem uzorku populacije pokazalo se daova varijanta u potpunosti izostaje u obe ispitivane grupe, odnosno da se u našojpopulaciji sreću samo wild type homozigoti sa 100% u obe analizirane grupe. Kaoposledica toga, ne postoji statistički značajna razlika u učestalostima genotipova ialelela u grupi ispitanika u odnosu na kontrolnu grupu (Tabela 41, Slika 43). Gen/Genotip BCK K Adjusted OR (95% CI) pN % N % Su rvi vin rs9 90 43 41 CC 9 12.9 8 11.4 0.73 (0.24-2.28) 0.591 GC 25 35.7 34 48.6 0.46(0.21-0.99) 0.047* GG 36 51.4 28 40.0 1.00 Ref. CC+CG 34 48.6 42 60.0 0.55 (0.27-1.13) 0.102 Tabela 40: Polimorfizam u genu za survivin i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - Adjusted Odds Ratio Rezultati 98 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, χ2-hi-kvadrat vrednost, p-Pirsonov (Pearson’s) koeficijent U Tabeli 42 prikazani su rezultati polimorfizma TP53PIN3 Ins 16bp, uintronu 3 TP53 gena, insercije 16bp. U odsustvu insercije, genotip je A1/A1. Ako jena jednom alelu prisutna insercija, a na drugom nije genotip je A1/A2, dok seprisustvo insercije na oba alela označava kao A2/A2 genotip. U grupi ispitanikaobolelih od BCK-a najzastupljeniji su homozigoti bez pomenute insercije (A1/A1),sa 62.9%, a za njima heterozigoti sa 35.7%. Svega 1.4% čine homozigoti sa Gen/SNP Genotip BCK K χ2 p N N TP 53 Pr o4 7S er CC 70 70 0.00 1.000CT / / TT / / Aleli C 140 140 0.00 1.000 T / / Tabela 41: Distribucija učestalosti genotipova i alela u ispitivanim grupama u analizi polimorfizma Pro47Ser TP53 gena 70 0 70 00 20 40 60 80 100 CC CT BCC kontrole % zas tup lje no st Slika 43: Procentualna zastupljenost genotipova u ispitivanim grupama za polimorfizam Pro47Ser (levo) i TP53PIN3 Ins 16bp (desno) TP 53 Pr o4 7S er 63 36 79 0 20 40 60 80 100 A1/A1 A1/A2 BCC kontrole % zas tup lje no st TP53PIN3 Ins 16bp 0 0 TT TP 53 Pr o4 7S er 1 18 3 A2/A2 Rezultati 99 insercijom od 16bp na oba alela. U kontrolnoj grupi takođe su najzastupljenijihomozigoti bez insercije, ali je njihova učestalost ovde veća i iznosi 78.6%, sledeheterozigoti sa manjom zastupljenošću u odnosu na prethodnu grupu sa 18.6% ina kraju homozigoti sa insercijom, 2.8%. Hi-kvadrat test je pokazao da međuučestalostima genotipova postoji statistički značajna razlika (χ2=6.30, p=0.043),dok nije uočena (p›0.05) pri analizi učestalosti alela (Tabela 42). N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, χ2-hi-kvadrat vrednost, p-Pirsonov (Pearson’s) koeficijent, *- statistička značajnost Tabela 43 prikazuje rezultate logističke regresione analize koja je rađena ucilju ispitivanja postojanja asocijacije između određenog genotipa i rizika za razvojBCK-a, računat je Crude Odds Ratio, za polimorfizam PIN3 Ins 16bp TP53 gena. ZaPro47Ser polimorfizam ova analiza nije rađena, jer je u obe ispitivane grupeprisutan samo wild type homozigot. Ova analiza je pokazala da prisustvo insercijeod 16bp u ovom polimorfizmu, nosi 1.73 puta veći rizik za oboljevanje od BCK-a, uodnosu na alel bez ove insercije, ova vrednost nije statistički značajna, ali je veomablizu značajnosti (Tabela 43). Heterozigoti nose čak 2.40 puta veći rizik zaoboljevanje od BCK-a u poređenju sa homozigotima bez insercije (OR=2.40,95%CI=1.10-5.24), kao i udruženi heterozigoti sa homozigotima sa insercijom(OR=2.16, 95%CI=1.02-4.58), Tabela 43. Ove vrednosti su statistički značajne(p=0.025 i p=0.041). Gen/SNP Genotip BCK K χ2 p N N TP 53 rs1 78 78 36 2 A1/A1 44 55 6.30 0.043*A1/A2 25 13 A2/A2 1 2 Aleli A1 113 123 2.18 0.100 A2 27 17 Tabela 42: Distribucija učestalosti genotipova i alela u ispitivanim grupama u analizi polimorfizma PIN3 Ins 16bp TP53 gena Rezultati 100 N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća), *-Fisher Exact Probability Test, **-statistička značajnost Adjusted Odds Ratio, prikazan u Tabeli 44, pokazuje da kada u analizuuključimo podatke o godinama, polu, konzumaciji alkohola i cigareta, rizik zaoboljevanje od BCK-a je manji nego u analizi Crude OR. N-broj ispitanika, K-kontrolna grupa, OR-Odds Ratio, CI-Confidence Interval (interval poverenja),p-probability (verovatnoća) Gen/Genotip BCK K Adjusted OR (95% CI) PN % N % TP 53 rs1 78 78 36 2 A1/A1 44 62.9 55 78.6 1.00 Ref.A1/A2 25 35.7 13 18.6 2.00 (0.87-4.57) 0.100 A2/A2 1 1.4 2 2.8 0.99 (0.08-12.04) 0.999 A1/A2+ A2/A2 26 37.1 15 21.4 1.89 (0.85-4.19) 0.118 Gen/Genotip BCK K Crude OR (95% CI) pN % N % TP 53 rs1 78 78 36 2 A1/A1 44 62.9 55 78.6 1.00 Ref.A1/A2 25 35.7 13 18.6 2.40 (1.10-5.24) 0.027** A2/A2 1 1.4 2 2.8 0.63 (0.05-7.12) 0.588* A1/A2 A2/A2 26 37.1 15 21.4 2.16 (1.02-4.58) 0.041** Aleli A1 113 80.7 123 87.9 1.00 Ref. A2 27 19.3 17 12.1 1.73 (0.90-3.34) 0.069 Tabela 43: Polimorfizam PIN3 Ins 16bp u TP53 genu i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - crude Odds Ratio Tabela 44: Polimorfizam u genu za survivin i rizik za nastanak bazocelularnog karcinoma - Adjusted Odds Ratio 5.DISKUSIJA Diskusija 102 Bazocelularni karcinom predstavlja najčešći oblik karcinoma kože kod ljudii njegova učestalost je u konstantnom porastu. Veoma retko metastazira, aliinvazijom okolnih tkiva može da dovede do njihovog oštećenja. Rizik za nastanakbazocelularnog karcinoma povezan je sa mnogim endogenim i egzogenimfaktorima, ali UV zračenje se izdvaja kao najznačajniji etiološki faktor za nastanakBCK-a. Zbog toga se ovaj karcinom najčešće pojavljuje na koži koja je izloženaSuncu, posebno u regionu glave i vrata, a nešto ređe na trupu i ekstremitetima.Tačan mehanizam nastanka bazocelularnog karcinoma kože nije u potpunostirazjašnjen, ali se pretpostavlja da postoji genetička predispozicija u sprezi safaktorima sredine. Verovatnoća razvijanja ovog karcinoma raste sa godinamaživota. U ovoj doktorskoj disertaciji analizirana je asocijacija nekolikopolimorfizama u različitim genima sa rizikom za nastanak bazocelularnogkarcinoma. Uvidom u dostupnu literaturu, nisu pronađeni podaci o sličnimanalizama za našu populaciju, a vrlo su oskudni i podaci o asocijaciji ovihpolimorfizama sa bazocelularnim karcinomom u drugim svetskim populacijama. 5.1. Polimorfizam u genu za TNF-alpha, rs1800629Citokini su mali sekretorni proteini ili proteini koji se vezuju za membranu injihova je uloga u regulaciji imuniteta, posredovanju tokom inflamacije ili uhematopoezi. Multifunkcionalni citokin faktor nekroze tumora alfa (TNF-alpha)igra značajnu ulogu u patogenezi inflamatornih, autoimunih i malignih oboljenja.Ima širok spektar aktivnosti, uključujući anti-kancerogene i pro-kancerogeneefekte. Produkovan od strane makrofaga, TNF-alpha ima važnu ulogu u regulacijiimunog odgovora i njegova povećana sekrecija nakon povrede indukuje citokinskukaskadu koja rezultuje u aktivaciji, proliferaciji i hipertrofiji mononukleusnih ifagocitnih ćelija. Ovakav sled događaja impliciran je u patogenezu i progresijuodređenih maligniteta.UVB zračenje na koži izaziva imunosupresiju koja može dovesti do razvojakarcinoma kože. Mehanizam te imunomodulacije još uvek nije u potpunostirazjašnjen, ali se pretpostavlja da TNF-alpha ima centralnu ulogu u tom procesu Diskusija 103 (Skov i sar., 2003). Pored toga što UVB zračenje indukuje oslobađanje TNF-alpha(Skov i sar., 1998), pokazano je i da samo ubrizgavanje TNF-alpha u kožu mišaizaziva imunosupresivne efekte slične onim izazvanim UVB zračenjem. Takođe jepokazano da ovi negativni efekti na kožu miša mogu biti blokirani TNF-alphaantitelima (Kurimoto i Streilein, 1992; Hajeer i Hutchinson, 2000). S obzirom da jepoznato da je UVB zračenje jedan od glavnih etioloških faktora u nastankubazocelularnog karcinoma, delimično i preko povećanja koncentracije TNF-alpha,naša studija imala je za cilj da ispita asocijaciju funkcionalnog polimorfizma u genuza TNF-alpha sa razvojem bazocelularnog karcinoma.Najinteresantnija zapažanja tiču se polimorfizama u promotorskom regionuza koje je pokazano da su odgovorni za povećanu transkripciju TNF-alpha gena(Magalhães i sar., 2010), u koje spada i SNP na poziciji -308. Ovaj polimorfizampovezan je sa velikom podložnošću različitim karcinomima: oralnomskvamocelularnom karcinomu (Liu i sar., 2005; Gupta i sar., 2008),nazofaringealnom karcinomu (Sousa i sar., 2011), karcinomu želuca (Lu PH i sar.,2010) itd. Guanin na poziciji -308 definiše TNF1 (G) alel, a adenin, manjezastupljen, TNF2 (A) alel koji je povezan sa visokom ekspresijom TNF-alpha(Bouma i sar., 1996; Louis i sar., 1998). Dosadašnja populaciona istraživanja supokazala da je oko 60-70% zdrave populacije Kavkazijanaca G/G genotipa za TNF-alpha, 30-40% su heterozigotne osobe G/A genotipa, a 1.5-3% su A/A homozigoti(Demeter i sar., 1997; Lauten i sar., 2002). G/G genotip je dominantan u mnogimpopulacijama, ali njegove učestalosti dosta variraju: Velika Britanija 52%(Kirkpatrick i sar., 2004), Indija 91% (Kohar i sar.,2007), Švajcarska 83.3%(Ivanson i sar., 2008), Meksiko 94.5% (Zuniga i sar., 2001), Kina 90.8% (Liu i sar.,2010). U našoj studiji u grupi obolelih od bazocelularnog karcinoma učestalostgenotipa G/G bila je 58%, G/A genotipa 42%, dok uopšte nije zabeleženo prisustvoosoba sa A/A genotipom. U kontrolnoj grupi 65% ispitanika bilo je sa G/Ggenotipom, 35% sa G/A genotipom, a takođe su izostali mutirani homozigoti.Distribucija genotipova i alela u našoj studijskoj grupi je u saglasnosti sadostupnim literaturnim podacima za populaciju Kavkazijanaca. Naši rezultati nisu Diskusija 104 ukazali na postojanje značajne razlike među ispitivanim grupama, ali je pokazanoda nosioci alela A (osobe genotipa G/A i A/A) imaju blago povećan rizik (1.34) zanastanak bazocelularnog karcinoma u odnosu na osobe sa G/G genotipom.Iako našom studijom nije utvrđena značajna povezanost proučavanogpolimorfizma TNF-alpha gena sa nastankom bazocelularnog karcinoma, trebanapomenuti da su ovakvi rezultati u skladu sa podacima iz dostupne literature (Slika 44), i gotovo su identični rezultatima dosadašnjih istraživanja za Evropskikontinent. Na Slici 44 se uočava da u udaljenijim populacijama sveta, u Japanu, Kini,Meksiku, itd. takođe nije zabeleženo prisustvo genotipa A/A, ali su distribucije G/Ai G/G genotipa drugačije od rezultata naše studije. Još od vremena kada je ovajpolimorfizam prvi put opisan (Wilson i sar., 1992) do danas, utvrđeno je da je Galel zastupljeniji, što je slučaj i sa našom populacijom, odnosno prisutan je sa 79%u grupi pacijenata sa BCK-om i 82.5% u kontrolnoj grupi. Studija Skov i sar. (2003),kojom je ispitivana povezanost polimorfizma u genu za TNF-alpha na poziciji -308 ikoncentracija oslobođenog TNF-alpha sa razvojem BCK-a, je pokazala odsustvoasocijacije ovog polimorfizma i BCK-a u populaciji Kavkazijanaca, ali da jebazocelularni karcinom povezan sa povećanom koncentracijom ovog citokina.Pored navedenog, u istoimenoj studiji je ispitivana povezanost ovog polimorfizma i Slika 44: Učestalost genotipova u analizi polimorfizma rs1800629 gena za TNF-alpha u različitim delovima sveta; A/A narandžasto, G/A zeleno, G/G plavo obojeno; prvi red CEU se odnosi na Evropski kontinent preuzeto: http://www.snpedia.com/index.php/Rs1800629 Diskusija 105 sklonost ka UVB indukovanoj imunosupresiji kod zdravih osoba (volontera) gde jetakođe zabeleženo odsustvo asocijacije. Interesantno je da su Hajeer i sar. (2000),grupu pacijenata obolelih od BCK-a podelili u 4 grupe: (1) sa samo jednim BCK-om,(2) sa 2-5 BCK-a, (3) 6-10 BCK-a i (4) pacijenti sa više od 10 BCK-a i nisu pronašlipovezanost sa navedenim polimorfizmom i rizikom za nastanak BCK-a, ali jeutvrđena asocijacija između mikrosatelitskih polimorfizama i bazocelularnogkarcinoma kože, kao i da su osobe sa većim brojem BCK-a bile GG genotipa. Sličnastudija, Ramachandran i sar. (2001), pokazala je da su osobe sa većim brojem BCK-a bile uglavnom GG genotipa i te vrednosti su bile statistički značajne. To ih jenavelo na zaključak da pacijenti koji su imali barem jedan BCK nose povećan rizikza nastanak novih BCK-a i da je TNF-alpha izuzetno važan medijator u razvojuBCK-a i kao takav opravdava sva buduća istraživanja. Još ranije, Kahn i sar. (1998)su zaključili da pacijenti sa istorijom nekog od nemelanomskih karcinoma kožeimaju povećan rizik za nastanak nekih drugih maligniteta, posebno limfoma.Cilj studije Gambichler-a i saradnika (2006) bio je da se ispita nivoekspresije iRNK TNF-alpha u delovima kože sa lezijama i bez lezija kod pacijenatasa bazocelularnim karcinomom, kao i u kontrolnoj grupi i nisu pronađenepovezanosti, odnosno razlike u delovima kože sa lezijama, odnosno bez njih ipoređenju sa kontrolnom grupom. Nedavno sprovedena studija Rizzato i saradnika(2011), koji su ispitivali povezanost polimorfizma TNF-alpha -308 sa rizikom zarazvoj BCK-a utvrdila je da postoji asocijacija, ali u zavisnosti od stepenaizloženosti kože Sunčevom zračenju. U grupi osoba koje su imale opekotine na kožiod Sunca, združeni genotipovi G/A i A/A pokazuju čak 2.4 puta veći rizik zanastanak BCK-a u poređenju sa homozigotima G/G. U drugoj grupi, sa manjomizloženosti kože Sunčevom zračenju, taj rizik je manji i iznosi 1.18 puta, dok utrećoj grupi pacijenata koji svoju kožu nisu izlagali sunčevom zračenju u većoj meriimaju čak 1.1 puta manji rizik za oboljevanje od ovog tipa karcinoma. Sa drugestrane, Marleen i saradnici (2011) nisu našli asocijaciju TNF-308 polimorfizma sanemelanomskim karcinomima kože, a dobijene učestalosti genotipova su vrloslične učestalostima dobijenim u našoj studiji. U navedenom istraživanju, osobe saAA genotipom su zastupljene sa 1.9% u grupi pacijenata i 2.7% u kontrolnoj, dok Diskusija 106 kod nas u potpunosti izostaju. Međutim, u ranije sprovedenim studijama jeutvrđeno postojanje asocijacije navedenog polimorfizma i skvamocelularnogkarcinoma oralne regije. Tako u okviru Azijske populacije, na Tajvanu, kodpacijenata lečenih od oralnog skvamocelularnog karcinoma (OSCK) dobijeni suprvi podaci o vezi između polimorfizma TNF-alpha -308 i rizika za nastanak OSCK.Uporedna studija asocijacije Vairaktaris-a i sar. (2008), na belcima nemačke i grčkenacionalnosti, tokom koje su ispitane potencijalne interakcije između sedampolimorfizama u genima za citokine i njihov kombinovani efekat na OSCkancerogenezu je pokazala da u svim modelima TNF-alpha ima jako bitandoprinos.Studija Magalhães i saradnika (2010) na Brazilskoj populaciji ispitivala jeasocijaciju ovog polimorfizma sa rizikom za razvoj psorijaze, jer je ta vezaprethodno u nekim populacijama uočena (Kavkazijanci), dok u drugima nije (uAzijskoj populaciji). Poznato je da je psorijaza kožno inflamatorno oboljenje sa vrlosloženom imunološkom osnovom, koja uključuje hiperproliferaciju keratinocita iaberantnu diferencijaciju epidermisa i kao takva je u interakciji sa mnogimproinflamatornim citokinima pa i TNF-alpha. Rezultati navedene studije supokazali da asocijacija ne postoji. Dobijene učestalosti alela u pomenutoj studiji,slične su učestalostima alela u našoj populaciji (u našoj kontrolnoj grupi alel Gzastupljen je sa 82.5%, a u brazilskoj kontrolnoj grupi sa 87.9%, dok je učestalostalela A iznosila u našoj populaciji 17.5%, u brazilskoj 12.1%).U literaturi postoji jako puno podataka o odsustvu asocijacije polimorfizmaTNF-alpha -308 sa mnogim bolestima i malignitetima, tako da naša studijaapsolutno nije izuzetak. Na primer, nema statistički značajne asocijacije izmeđuTNF haplotipa i kliničkog ishoda kod dece sa limfoblasnom leukemijom (Takeuchi isar., 2002). U studiji koja je uključivala 96 pacijenata sa karcinomom prostate,polimorfizam u promotorskom regionu TNF gena, na poziciji -308 ne korelira saincidencom kancera (Wu i sar., 2004). Studija koja je obuhvatila stanovnikeSeverne Evrope, ukazuje na nepostojanje asocijacije između podložnosti kancerudojke i polimorfizma -308 gena za TNF-alpha (Azmy i sar.,2004). Ahirwar isaradnici (2008) u Indiji istpitivali su doprinos polimorfizama u genima za IL4, IL6 Diskusija 107 i TNF (-308) riziku za razvoj karcinoma bešike i utvrdili su izostanak asocijacijeizmeđu prisustva TNF-308 A varijante gena i rizika od kancerogeneze. Ho isaradnici (2006) nisu uočili asocijaciju između ovog polimorfizma inazofaringealnog karcinoma. Njihov zaključak je bio da se alelske forme promotoraTNF-alfa gena ne mogu koristiti kao biomarkeri za podložnost nazofaringealnomkarcinomu.Sem ispitivanja TNF-alpha polimorfizma u tumorima glave i vrata brojnestudije su se bavile i povezanošću ovog SNP-a sa raznim drugim malignitetima inemalignim oboljenjima, kao i različitim kliničkim parametrima kao što su uspehterapije, stopa preživljavanja, period preživljavanja bez progresije bolesti itd. Takosu npr. Warzocha i saradnici (1998) ustanovili da je visoko produktivni alel -308TNF alpha polimorfizma (A) povezan sa bržim recidivom i progresijom kodpacijenata sa Non Hočkinovim limfomom. Prisustvo TNF2 alela (A/A homozigot) jetakođe povezano sa povećanom susceptibilnošću i težom kliničkom slikom kodoboljenja kao što su reumatoidni artritis, sistemski lupus eritematozus,Alchajmerova bolest, cerebralna malarija, itd. (Oppenhim, 2001). Duarte i sar.(2005) su utvrdili povezanost ovog polimorfizma i sa rizikom za invazivni kancercerviksa (IKC) i utvrdili su da je kod žena nosilaca A alela ovaj rizik uvećan dvaputa. Povećan rizik za oboljevanje od hepatocelularnog karcinoma (Ho i sar.,2004), kao i karcinoma bubrega (Baştürk i sar., 2005) takođe se mogu dovesti uvezu sa ovim polimorfizmom u TNF-alpha genu.U literaturi takođe postoji jako puno podataka o odsustvu asocijacijeizmeđu polimorfizma TNF-alpha -308 i različitih maligniteta, tako da naša studijane predstavlja izuzetak. Na primer, nema statistički značajne asocijacije izmeđuTNF haplotipa i kliničkog ishoda kod dece sa limfoblastnom leukemijom (Takeuchii sar., 2002). U studiji koja je uključivala 96 pacijenata sa karcinomom prostate,polimorfizam u promotorskom regionu TNF gena, na poziciji -308 ne korelira saincidencom kancera (Wu i sar., 2004). Studija koja je obuhvatila stanovnikeSeverne Evrope, ukazuje na nepostojanje asocijacije između podložnosti kancerudojke i polimorfizma -308 gena za TNF-alpha (Azmy i sar., 2004). Ahirwar isaradnici (Indija) istpitivali su doprinos polimorfizama u genima za IL4, IL6 i TNF Diskusija 108 (-308) riziku za razvoj karcinoma bešike i utvrdili su izostanak asocijacije izmeđuprisustva TNF-308 A varijante gena i rizika od kancerogeneze. Ho i saradnici nisuuočili asocijaciju između ovog polimorfizma i nazofaringealnog karcinoma. Njihovzaključak je bio da se alelske forme promotora TNF-alfa gena ne mogu koristiti kaobiomarkeri za podložnost nazofaringealnom karcinomu.Na osnovu gore iznetih rezultata različitih studija asocijacije, jasno je dapolimorfizam – 308 G/A u genu za TNF-alpha može uticati na rizik oboljevanja odrazličitih tipova kancera. S obzirom da ovaj polimorfizam dovodi do povećanetranskripcije TNF gena, na ovaj način uvećana produkcija TNF-alpha svakakoindukuje potencijalno patološke procese u organizmu. S obzirom da je glavnisredinski faktor koji doprinosi patogenezi u slučaju bazocelularnog karcinoma UV-zračenje, izvestan je kombinovani efekat genotipa i sredine u patogenezi ovogkarcinoma. Buduća istraživanja na našoj populaciji bi mogla da obuhvate i analizuekspresije TNF-alpha gena. Takođe, bitno je proučiti i postojanje interakcijeizmeđu gena, postojanje neravnoteže vezanosti i interakcije genotipa i sredinskihfaktora, kao što je npr. fotoeksponiranost. 5.2. Polimorfizmi u genima za TNF receptore: TNF-R1, rs767455 i TNF-R2, rs1061622Familija TNF receptora obuhvata TNF-R1 receptor koji je prisutan na svimćelijama izuzev eritrocita i nestimulisanih limfocita i pripada grupi receptora kojiposeduju domen smrti (engl. Death Domain, DD). Receptori koji posedujuunutarćelijski domen smrti (DD), adaptorni molekul, imaju sposobnost direktneaktivacije apoptoze i ćelijske proliferacije (Agrawal, 2003). Nijedan od ovihreceptora ne pokazuje enzimsku aktivnost već se signal prenosi kroz uključivanjeviše različitih proteina, koji iniciraju signalnu kaskadu, koja vodi aktivacijiefektornih proteina kaspaza i protein kinaza.Brojni eksperimenti dokazali su da je upravo TNF-R1 odgovoran za najvećideo bioloških aktivnosti TNF-alpha. U prvom egzonu TNF-R1 gena, na poziciji 36,nalazi se polimorfizam nastao tranzicijom adenina u guanin. Ovaj polimorfizam Diskusija 109 predstavlja tihu mutaciju u kodonu 12 (CCA>CCG) nazvan Pro12Pro (Pitts, 1998) ine utiče direktno na funkciju receptora (Tabor i sar., 2002).Naši rezultati pokazuju da u grupi zdravih osoba učestalost alela A iznosi60.8%, a G alela 39.2% što je u skladu sa podacima dobijenim u britanskojpopulaciji (Barton i sar., 2001) i što je takođe u saglasnosti (sa manjimodstupanjima) sa studijom Pitts-a i saradnika (1998) koji su utvrdili učestalostalela A od 54% i alela G od 46% u slučajno odabranoj populaciji belaca. Kadaposmatramo učestalosti genotipova u kontrolnoj grupi i uporedimo ih sa podacimaiz literature, možemo zaključiti da su oni podudarni sa podacima za Evropskikontinent (Slika 45), A/A 35%, A/G 51.6% i G/G 13.4%, sa malo većom razlikom uučestalosti G/G genotipa. Kada je reč o studiji asocijacije između Pro12Propolimorfizma i rizika za nastanak BCK, rezultati našeg istraživanja nisu pokazaliznačajne razlike učestalosti genotipova između pacijenata i kontrolne grupe, pasamim tim ni postojanje asocijacije između polimorfizma rs767455 u genu za TNF-R1 i pojave BCK-a. Slika 45 pokazuje da je ovaj polimorfizam slabo proučavan saaspekta asocijacije sa kancerom. Pored podataka za Evropsku populaciju, prikazanisu samo još rezultati za populacije Kine i Japana. Odsustvo učestalosti genotipovaza druge populacije može da znači da ovaj polimorfizam nije ispitivan u timpopulacijama, ili da HapMap-a nije ažurirana do ovog trenutka. Svakako, to samopotvrđuje značaj naših rezultata. Slika 45: Učestalost genotipova u analizi polimorfizma rs767455 gena za TNF-R1 u različitim delovima sveta; A/A narandžasto, A/G zeleno, G/G plavo obojeno; prvi red CEU se odnosi na Evropski kontinent preuzeto: http://www.snpedia.com/index.php/Rs767455 Diskusija 110 TNF-R2 receptor prisutan je na imunskim ćelijama, pre svega na limfocitimai pripada grupi receptora koji ne poseduju domen smrti, ali ipak može indukovatiapoptozu preko receptor-interaktivnog proteina (RIP). Neoplastične B ćelije iaktivisani normalni B limfociti eksprimiraju TNF receptore na svojoj površini(Eriksen i sar., 1991). Izolovani iz periferne krvi i tonzila, B limfociti nakonaktivacije eksprimiraju više TNF- R2 u odnosu na TNF-R1 (Heilig i sar., 1991).Polimorfizam +676T/G karakteriše se zamenom timina guaninom što dovodi dozamene aminokiseline metionina u položaju 196 argininom (M196R) i kao takavutiče na strukturu receptora u regionu CRD4, ekstraćelijskog dela TNF-R2, ali ne ina vezivanje TNF. Više različitih egzona TNF-R2 gena kodira ekstraćelijskifunkcionalni domen ovog receptora, a egzon 6 kodira deo transmembranskogregiona na kojem se nalazi proteolitičko mesto odgovorno za oslobađanjerastvorljive forme receptora (Beltinger i sar., 1996). Varijabilnost gena za TNF-R2utiče na ekspresiju samog receptora i smatra se da ima ulogu u patogenezi velikogbroja metaboličkih sindroma, kao što su hipertenzija, gojaznost, insulinskarezistencija, familijarna hiperlipidemija i koronarna arterijska bolest (Glenn i sar.,2000). Rezultati dobijeni u našem istraživanju pokazuju da učestalost T alelaiznosi 58% kod obolelih od BCK-a i 74.2% u kontrolnoj grupi, G alela 42% kodpacijenata sa BCK-om i 25.8% u kontrolnoj grupi. Ove razlike u učestalostima sustatistički značajne. Takođe je pokazano da nosioci G alela imaju čak 2 puta većirizik za nastanak BCK-a u poređenju sa osobama nosiocima T alela.Ispitivanjem učestalosti T/T genotipa utvrđeno je da je u kontrolnoj grupizastupljen sa 53.4%, a kod pacijenata sa 20%. Mutirani G/G genotip je nađen ukontrolnoj grupi sa učestalošću od 5%, a u grupi obolelih sa učestalošću od 4%.Heterozigoti T/G genotipa prisutni su sa učestalošću od 76% u grupi pacijenata, uodnosu na 41.6% u grupi zdravih ispitanika, a logistička regresiona analiza jepokazala da heterozigoti T/G iskazuju značajno povećan rizik za razvoj BCK-a.Dobijeni rezultati su time pokazali da ovaj polimorfizam može biti jedan od Diskusija 111 markera za razvoj BCK-a. Statistički značajan povećan rizik za razvoj BCK-a imajunosioci G alela, međutim, modifikovanom logističkom regresijom, ova značajnostse dodatno uvećava, što nam ukazuje da faktori sredine, kao što su pušenje,konzumacija alkohola, starost ispitanika mogu imati uticaja na povećanje rizika.Kada uporedimo dobijene učestalosti genotipova sa učestalostima izrazličitih studija na Evropskom kontinentu, možemo da konstatujemo da su oneprilično usaglašene (http://snpedia.com/index.php/Rs1061622) Slika 46, gotovoidentične. Slika 46 prikazuje raznovrsnost u učestalostima genotipova za navedenipolimorfizam u zavisnosti od regiona sveta, što je još jedna potvrda da postojerazlike u učestalostima alela i genotipova u zavisnosti od geografske odnosno etničke pripadnosti.U literaturi nema studije asocijacije navedenih polimorfizama u genima zareceptore TNF-alpha sa BCK-om, ali postoje potvrde o ascocijaciji sa drugimbolestima. Iste polimorfizme analizirali su Kammoun-Krichen i saradnici (2008) natunižanskoj populaciji i njihovu povezanost sa autoimunim tireoidnim oboljenjem,uključujući i Gravesov sindrom i ustanovili da polimorfizam u genu za TNF-R1 nijepokazao značajnost, dok u genu za TNF-R2 postoji značajna razlika između grupepacijenata i kontrola. Međutim, bitno je naglasiti za TNF-R1 kada su analizirani Slika 46: Učestalost genotipova u analizi polimorfizma rs1061622 gena za TNF-R2 u različitim delovima sveta; G/G narandžasto, T/G zeleno, T/T plavo obojeno; prvi red CEU se odnosi na Evropski kontinent preuzeto: http://www.snpedia.com/index.php/Rs1061622 Diskusija 112 haplotipovi sa mikrosatelitskim polimorfizmom, dva haplotipa su pokazalapovezanost sa ovim bolestima što potvrđuje značaj i snagu haplotipskih analiza.Studija koja je ispitivala značaj TNF-R2 polimorfizma u leukemijama,ukazala je na činjenicu da kod pacijenata obolelih od akutne mijeloidne leukemije(AML) heterozigotni genotip T/G ima uticaja na preživljavanje obolelih (Bazzoni isar., 2000).Ovakvi rezultati ukazuju da polimorfizmi rs767455 i rs1061622 ureceptorima TNF-R1 i TNF-R2 mogu da modulišu rizik oboljevanja od različitihmaligniteta, pa i bazocelularnog karcinoma. U budućnosti bilo bi dobro proučitiinterakcije između ova dva gena i postojanje neravnoteže vezanosti uvođenjemhaplotipske analize. Analizom polimorfizma u genu za TNF-R2 je pokazano dafaktori sredine uvećavaju rizik za razvoj bazocelularnog karcinoma, tako da bi bilodobro ispitati uticaj još nekih sredinskih faktora, kao što je npr. izloženost Suncu,zato što je već potvrđen njegov uticaj na razvoj bazocelularnog karcinoma. 5.3. Polimorfizam u genu za MMP-9, rs3918242Matriks metaloproteinaze (MMPs) predstavljaju grupu proteina koji igrajuvažnu ulogu u degradaciji i remodeliranju ekstraćelijskog matriksa i bazalnemembrane, stoga modulišu deobu ćelija, migraciju, angiogenezu i tumorskuinvaziju (Cotignola i sar., 2007). Za neke polimorfizme je pokazano da imaju uticajana gensku ekspresiju, aktivnost proteina, stabilnost, različite međuproteinskeinterakcije, a povezane su sa tumorskim fenotipom i povećanim rizikom za progreskancera i drugih bolesti.Poznato je da funkcionalna C/T supstitucija locirana u regionu promotorana poziciji -1562 utiče na transkripciju. Ređi T alel uslovljava dvostruko višuekspresiju MMP-9 gena nego C alel. Učestalost T alela u populaciji belaca i Azijataiznosi oko 12-15%. U našoj studiji učestalost ovog alela je 10.3% u kontrolnojgrupi i nije značajno različita u odnosu na grupu pacijenata sa BCK-om (13%).Učestalosti genotipova u obe analizirane grupe takođe nisu pokazale značajnu Diskusija 113 razliku, ali je utvrđeno da osobe C/T genotipa (heterozigoti) imaju 1.9 puta većirizik za oboljevanje od BCK-a u poređenju sa CC genotipom.Studija Zhang-a i saradnika (2012) na kineskoj populaciji koja je obuhvatila4124 pacijenta obolelih od različitih tipova kancera i 4728 kontrola ispitivala jenavedeni polimorfizam u MMP-9 genu i njegovu povezanost sa malignitetima, alinije utvrđeno postojanje asocijacije navedenog polimorfizma sa nekim od glavnihtipova kancera.Kada su u pitanju karcinomi kože, Cotignola i saradnici (2007) su ispitivalirazličite polimorfizme u genu za MMP-9, između ostalog i rs3918242 i njihovupovezanost sa malignim melanomom. Studija je obuhvatila 1002 pacijenta sadijagnistifikovanim malignim karcinomom kože, a od toga 96% pripadalo jepopulaciji Kavkazijanca. Ustanovili su da je ređi alel T bio prisutniji kod pacijenatakoji su imali opekotine usled dugotrajnog izlaganja Suncu, imali porodičnu istorijuove bolesti i viši melanomski stadijum, ali bez statističke značajnosti. Pored ovih,postoje i studije u kojima je analizirana ekspresija MMP-9 i njena uloga u razvojumelanoma. Ukazano je da ćelije invazivnog melanoma pokazuju višu ekspresijuMMP-9 u poređenju sa neinvazivnim tipom tumora (Zhao i sar., 2001; Shellman isar., 2006). Isto tako i serumski nivoi MMP-9 mogu biti korisni u predviđanju tokabolesti kod pacijenata sa ovim oblikom karcinoma kože (Zucker i sar., 1999;Makowski i Ramsby, 2003; Nikkola i sar., 2005; Jung i sar., 2005). Ovakvi nalazidobijeni za maligni melanom, ukazuju da bi proučavanje ekspresije MMP-9 genakod bazocelularnih karcinoma dodatno rasvetlelo značaj prisustva raličitih alelskihvarijanti -1562 C/T MMP-9 polimorfizma.Najnovija studija Fu-a i saradnika (2012), koji su ispitivali ekspresiju MMP-9 u nemelanomskim karcinomima kože pokazala je da ova matriksnametaloproteinaza može imati značajnu ulogu u razvoju, progresiji, invaziji imetastazama i skvamocelularnog i bazocelularnog karcinoma kože. Takođe, studijaiz okruženja, Zlatarova-e i saradnika (2011) na bazocelularnim karcinomima očnihkapaka, utvrdila je da je povišen nivo ekspresije MMP-9 povezan sa lošijom Diskusija 114 prognozom ovog tipa karcinoma i da ekspresija MMP-9 može poslužiti kaoprognostički marker za ranu invazivnost tumora.U analizama oralnog skvamocelularnog karcinoma značajno veća učestalostT alela je primećena među pacijentima pušačima, ali mali broj nepušača međupacijentima ne dozvoljava donošenje zaključaka o kombinovanom efektuduvanskog dima i visokih nivoa MMP-9. Sinergistički efekat pušenja i prekomernogkonzumiranja alkohola je značajno bio udružen sa većom učestalošću T alela, madaje ova grupa pacijenata bila brojno ograničena. Ispitivani MMP-9 polimorfizam je ujakoj asocijaciji sa povećanim rizikom za razvoj oralnog kancera. Činjenica danosioci T alela imaju povećani sklonost ka razvoju oralnog karcinoma samo uinicijalnim stadijumima, ali ne i u odmaklim, može se objasniti učešćem MMP-9 uinhibiciji angiogeneze produkcijom angiostatina iz plazminogena (Vairaktaris isar., 2008). Inače, koncentracije MMP-9 kod osoba koje puše su značajno više negokod nepušača i povezane su sa dužinom pušačkog staža (Nakamura i sar., 1998).Bez obzira na neosporan značaj MMP-9 kao pokazatelja patoloških procesakoji se događaju u organizmu, relativno je mali broj studija koje se bavepolimorfizmom u ovom genu, a posebno u bazocelularnim karcinomima.Prekomerna ekspresija MMP-9 je detektovana u 39.5% ispitivanih pacijenata saoralnim skvamocelularnim karcinomom u studiji Nagpal-a i Das-a (2003), dok je ustudiji Tu-a i saradnika (2007) pokazano da ne postoji asocijacija ovogpolimorfizma sa oralnim skvamocelularnim karcinomom, ali da postoje nekerazlike među pacijentima zavisno kom starosnom dobu pripadaju. Takođe, jednagrčka studija (Vairaktaris i sar., 2007) jasno pokazuje vezu ovog polimorfizma saskvamocelularnim karcinomom usne regije. Takođe, MMP-9 aktivnost je značajnopovećana kod pacijenata sa laringealnim i orofaringealnim kancerom u poređenjusa kontrolnom grupom. Približno 78% pacijenata sa karcinomom larinksa i 85%pacijenata sa malignim tumorima orofarinksa su pokazali visoke vrednosti ovogenzima, dok učestalost kod zdravih osoba sa visokim vrednostima ne prelazi 20%(Ranuncolo i sar., 2002 ). Naša analiza genotipova ljudi obolelih od bazocelularnogkarcinoma je isključila asocijaciju polimorfizma -1562 C/T sa ovim karcinomom.Ovakvi konfliktni rezultati o ulozi MMP-9 polimorfizma u različitim oboljenjima Diskusija 115 mogu biti rezultat etničkih varijacija učestalosti -1562T alela. Prethodno iznetipodaci ukazuju da polimorfizam -1562C/T MMP-9 gena može da moduliše rizikoboljevanja od nekih maligniteta, pa i bazocelularnog karcinoma. Takođe bitna je isprega faktora sredine (duvanski dim, alkohol) sa ovim SNP. Sledi da ukancerogenezi, MMP-9 polimorfizam predstavlja paradigmu interakcije genotipa isredine. 5.4. Polimorfizam u genu za survivin, rs9904341Survivin, član familije inhibitora apoptoze, eksprimiran je tokomembrionalnog razvića dok kasnije izostaje u većini normalnih tkiva adultnihindividua. Njegova prekomerna ekspresija javlja se u većem broju malignih ibenignih tumora (Altieri, 2006, 2010, Andrić, 2012). Sa stanovišta problematikeove disertacije, jako bitan podatak je da je survivin prisutan u manjim količinama ukeratinocitama bazalnih ćelija normalnog epidermisa. Zanimljivi su i najnovijirezultati Al-Khalaf-a i Abussekharra-e (2012) koji su pokazali povećanu ekspresijusurvivina u starijim ćelijama i organima, odnosno povećenje ekspresije survivinatokom procesa starenja. Ovo je veoma značajan podatak s obzirom da incidencamalignih tumora, pa i bazocelularnog karcinoma takođe raste sa godinama života.Polimorfizam u genu za survivin, smešten na poziciji -31 u promotorskomregionu, predstavlja supstituciju guanina citozinom. Ovaj deo promotorskogregiona važan je za regulaciju ekspresije survivina, na način zavistan od fazećelijskog ciklusa. Zato se danas sve više ispituju različiti polimorfizmi upravo uovom regionu. Za ovaj polimorfizam je pokazano da doprinosi povećanju rizikaoboljevanja od različitih tipova kancera, jer dovodi do derepresije, tj. povećaneekspresije survivina.Prema našem saznanju, u dostupnoj literaturi ne postoje podaci opovezanosti polimorfizma -31G/C sa bazocelularnim karcinomom, ali ih ima u vezisa drugim tipovima kancera. Cheng i saradnici (2008) su utvrdili da su učestalosti-31C alela i C/C genotipa značajno viši kod osoba obolelih od karcinoma želuca, Diskusija 116 nego kod zdravih osoba, ali da s druge strane prekomerno eksprimirana iRNK zasurvivin u tumorskim tkivima ne pokazuje značajne razlike u odnosu na pojedinegenotipove. Yang i sar. (2009) su, ispitujući takođe kinesku populaciju, ustanovilida nema statistički značajne veze između karcinoma želuca i varijantnihgenotipova (G/G+G/C). U slučaju urotelijalnog karcinoma u jednoj tajvanskojpopulaciji, pokazano je da C/C i C/G genotipovi u poređenju sa G/G genotipom višedoprinose nastanku, kao i napredovanju ovog tipa tumora (Wang i sar., 2009). Hani sar. (2009) su utvrdili da genotip C/C u odnosu na G/G više doprinosi (ali bezstatističke značajnosti) ranijem oboljevanju (u mlađoj životnoj dobi) od primarnogepitelijalnog karcinoma ovarijuma. U slučaju ezofagealnog skvamocelularnogkarcinoma, Yang i sar. (2009) su proučavali više polimorfizama u genu za survivin,među njima i -31G/C, i utvrdili da alel -31C povećava rizik od oboljevanja, a da sealel -31G ponaša kao protektivni alel. Jang i sar. su ustanovili da G/G i C/Ggenotipovi u odnosu na C/C genotip pokazuju niži rizik od oboljevanja od kancerapluća. Borbely i sar. (2008) su ispitivali vezu između ovog polimorfizma i razvojakarcinoma grlića materice u populaciji Mađarske i rezultati nisu ukazali napostojanje veze.S obzirom da se radi o kanceru koji obuhvata region glave i vrata, studijaUpadhyay i saradnika (2011) je bila vrlo interesantna. Oni su se bavili ispitivanjemovog polimorfizma i njegovom povezanošću sa kancerom jednjaka u populacijiseverne Indije. Analiza je ukazala na vezu C/C genotipa i povećanog rizika zaoboljevanje od kancera jednjaka. Takođe, pored indijske i u kineskoj populaciji, jepokazana asocijacija između skvamocelularnog karcinoma jednjaka i ovog SNP. Utajvanskoj populaciji je već ranije pokazano da je oralni kancer uglavnom uslovljenfaktorima sredine, kao što je žvakanje duvana, a analiza Weng i sar. (2012), na 439pacijenata i 424 kontrole koje su uključivale samo pripadnike muškog polaustanovila je i značaj polimorfizma u survivinu kao faktora rizika. Našli su da -31GG homozigoti pokazuju statistički značajno viši rizik za oboljevanje od ovogkancera, kao i da je -31G alel prisutniji u grupi pacijenata u odnosu na kontrolnugrupu. Diskusija 117 Studija Andrića i saradnika (2012) ispitivala je povezanost rs9904341polimorfizma sa razvojem keratocističnih odontogenih tumora (KCOT) i utvrdila jepostojanje asocijacije. U njihovoj studiji G alel je zastupljeniji u grupi pacijenata saKCOT u poređenju sa kontrolnom grupom, a C/G heterozigoti imaju manji rizik zarazvoj ovog tumora u poređenju sa G/G genotipom. Isto je potvrđeno i za C/G+C/Cu poređenju sa G/G genotipom. Zaključak je da G/G genotip može biti faktor rizikaza razvoj keratocističnih odontogenih tumora u populaciji Srbije.Naša studija je pokazala da nosioci C alela imaju manji rizik za oboljevanjeod bazocelularnog karcinoma u poređenju sa nosiocima G alela, kao i da C/C i C/Ggenotipovi u odnosu na G/G genotip imaju manji rizik za oboljevanje od ovog tipakarcinoma, što je u skladu sa rezultatima prethodno pomenute studije, ali tevrednosti nisu pokazale statističku značajnost. Međutim, kada se podaci učestalostigenotipova kombinuju sa podacima o starosti ispitanika, polu, konzumacijialkohola i cigareta, heterozigoti C/G genotipa ispoljavaju statistički značajnosmanjen rizik za oboljevanje od BCK-a u odnosu na homozigote G/G (p=0.047), kaoi u prethodno pomenutoj studiji. U našoj studiji u kontrolnoj grupi C/C genotip jezastupljen sa 11.4%, C/G 48.6%, a G/G sa 40%. Sumirane studije o ovompolimorfizmu i njegovim učestalostima genotipova na Evropskom kontinentu dalesu skoro identične rezultate: C/C oko 10%, C/G oko 40%, G/G oko 50%, doksumirane vrednosti svih studija u svetu imaju drugačiju raspodelu: C/C oko 20%,C/G 45%, G/G 35%. Na dalekom istoku, u Kini i Japanu, te vrednosti daleko sudrugačije: C/C oko 30%, C/G oko 55%, a G/G oko 15% kao najmanje zastupljengenotip. Ovi podaci jasno govore o velikim etničkim varijacijama učestalosti alela,pa tako ne iznenađuju često vrlo kontradiktorni podaci o značaju pojedinihpolimorfizama i njihovoj povezanosti sa različitim patologijama. Rezultati našestudije uklapaju se u podatke koji postoje za različite Evropske populacije upogledu učestalosti alela i genotipova. Diskusija 118 Meta-analiza Weng-a i sar. iz 2012. godine, na 3485 pacijenata obolelih odrazličitih tipova kancera i 3964 kontrole pokazala je da ovaj polimorfizam imaznačajnu ulogu u razvoju kancera, posebno u Azijskoj populaciji. Kada se analizauradi prema tipovima kancera gubi se statistička značajnost. Zbog sveganavedenog, Wang i sar. su zaključili da polimorfizam gena za survivin na poziciji -31 može da varira u svojoj ulozi zavisno od tipa kancera, ali i da zavisi od rase kaofaktora za predispoziciju razvoja kancera. Svakako, dalje proširivanje ove studije bitrebalo da uključi ispitivanje ekspresije gena za survivin, kao i uticaj još nekihsredinskih faktora i interakciju genotipa i sredine. 5.5. Polimorfizmi u TP53 genu, Pro47Ser i rs17878362Bazocelularni karcinom je najčešća neoplazma u populaciji Kavkazijanaca iuglavnom je uzrokovan UV zračenjem, odnosno akumulacijom mutacijaindukovanih UV zračenjem. Ćelija i njeni procesi opstaju i pored stalne izloženostimutagenim događajima, zahvaljujući mogućnosti popravke nastalih DNK oštećenjakao i mogućnosti indukcije apoptoze, kojom se eliminišu oštećene ćelije. Zatomutacije u genima uključenim u reparacione mehanizme ili kontrolu ćelijskogciklusa mogu da dovedu do abnormalne ćelijske proliferacije i razvoja kancera. Slika 47: Učestalost genotipova u analizi polimorfizma rs9904341 gena za survivin u različitim delovima sveta; C/C narandžasto, C/G zeleno, G/G plavo obojeno; prvi red CEU se odnosi na Evropski kontinent preuzeto: http://www.snpedia.com/index.php/Rs9904341 Diskusija 119 Činjenica da je gubitak funkcije TP53 gena zabeležen u više od polovinehumanih kancera čini vrlo značajnim razmatranje uloge ovog gena ukancerogenezi. Mutacije ovog gena su nađene u skoro svim tipovima kancera, anjihova učestalost varira među različitim tipovima kancera. Ali, sem promena ustrukturi ovih gena, značajna je i promena u njihovoj ekspresiji. Utvrđeno je dapreko 80% pacijenata obolelih od bazocelularnog karcinoma imaju prekomernuekspresiju p53 proteina (Shea i sar., 1992). Štaviše, pokazano je da su agresivnijeforme BCK-a značajno povezane sa povećanom ekspresijom p53 proteina. AnalizaRajabi-a i saradnika (2006), bazirana na imunohistohemijskim analizama, jepokazala prekomernu ekspresiju ovog proteina i u netumorskom epidermisuosoba sa BCK-om, što je značajno asocirano sa izloženošću kože sunčevomzračenju. Takođe, u njihovoj studiji je pokazano da je ekspresija p53 proteinazavisna od godina starosti pacijenata, tako da bi rana akumulacija ovog proteinamogla biti jedan od pokazatelja za detekciju nemelanomskog karcinoma kože.Treći zaključak njihove studije je da imunohemijske tehnike ne mogu da detektujugenomsku nestabilnost ili abnormalnosti nastale u ćelijskom ciklusu, pa stogapreporučuju molekularne tehnike za preciznu i ranu detekciju mutacija u TP53genu. Naša analiza je imala za cilj da ispita asocijaciju bazocelularnog karcinoma ipolimorfizama u egzonu 4, kodona 47 koja indukuje zamenu aminokiseline prolinserinom i u intronu 3, inserciju od 16bp (rs17878362) i nastanak bazocelularnogkarcinoma. Pro47Ser je redak polimorfizam, odnosno Ser47 varijanta vrlo je retka,sa alelskom učestalošću od 5% u populacijama Afričkog porekla, dok je u populacijiKavkazijanaca 0%. Pretpostavlja se da ovaj polimorfizam smanjuje transaktivacijuproapoptotskih ciljnih gena, što bi potencijalno povećalo rizik za nastanak kancera(Feng i sar., 2006; Kurihara i sar., 2007). Međutim, Li i sar. (2005) su pokazali da seSer47 i wild type protein ne razlikuju po sposobnosti vezivanja za DNK, prenosu umitohondrije, regulaciji ekspresije većine TP53 ciljnih gena, ali funkcionalni dokaziu različitim eksperimentalnim sistemima pokazuju neusaglašenost. Studija Toledoi sar. (2006) na miševima je pokazala da blokirana Ser46 fosforilacija ima samoneznatne fenotipske posledice. To je navelo na zaključak Olivier i sar. (2010) da je Diskusija 120 moguće da ovaj polimorfizam utiče na p53 funkciju samo pod specifičnimuslovima. U literaturi se mogu naći različiti rezultati analize ovog polimorfizma injegovog uticaja na razvoj kancera. Jedino je studija Almeida i sar. (2009) pokazalaasocijaciju Ser47 alela sa razvojem ekstra-aksijalnih tumora mozga. Sameer i sar.(2010) nisu pronašli asocijaciju ovog polimorfizma sa razvojem kolorektalnogkancera u populaciji iz Kašmira, kao ni Pinto i sar. (2008) koji su ispitivali vezuizmeđu ovog polimorfizma i razvoja glioma u Brazilskoj populaciji. Rezultati našeanalize su pokazali potpuno odsustvo Ser47 varijante u našoj populaciji, odnosno uobe ispitivane grupe bili su prisutni samo wild type homozigoti. Iako nemaasocijacije ovog polimorfizma sa rizikom za nastanak bazocelularnog karcinoma,ovaj rezultat potvrđuje podatke iz literature o učestalosti ove mutirane alelskevarijante. S obzirom da nema puno studija o ovom polimorfizmu, ostaje da senjegov uticaj na predispoziciju za razvoj kancera dalje proučava.Drugi analizirani polimorfizam TP53 gena, je insercioni polimorfizam od16bp u intronu 3 (TP53PIN3 Ins 16bp), sa alelima koji se označavaju kao A1 i A2,pri čemu je alel A2 sa prisutnom insercijom. Biološki efekti ovog polimorfizma nisurazjašnjeni, ali je poznato da polimorfizmi u intronima mogu bitno da utiču nakodirajući region gena i da povećavaju verovatnoću nastanka štetnog fenotipa(Malkinson, 1994). Takođe, mutacije u intronskim sekvencama mogu da utiču naregulaciju genske ekspresije i interakcije DNK i proteina (Lozano i Levine, 1991;Shamsher i Montano, 1996; Avigad i sar., 1997). Meta-analiza Hu i sar. (2010), kojaje obuhvatila 9801 pacijenta obolelih od različitih tipova kancera i 10391 kontrolaiz 26 studija, pokazala je povezanost ovog polimorfizma sa povećanim rizikom zanastanak kancera, što ga čini potencijalno važnim i klinički relevantnim genetičkimmarkerom.Costa i sar. (2008) su utvrdili da žene sa A2/A2 genotipom imaju povećanrizik za razvoja kancera dojke, čak i bez familijarne istorije ove bolesti, kao i da jeovaj polimorfizam povezan sa pojavom metastaza u limfnim čvorovima. Takođe,studija sprovedena na populaciji Hrvatske potvrdila je povezanost ovogpolimorfizma i sporadičnog kancera dojke kod žena (Bisof i sar., 2010), kao istudija Faghani i sar. (2011) na populaciji Irana, gde su žene heterozigoti A1/A2 Diskusija 121 imale povećan rizik za nastanak ovog tipa kancera. Suprotno ovim rezultatima,Hrtska i sar. (2009) na češkoj populaciji nisu uočili povezanost ovog polimorfizma ikancera dojke, i pripisuju tu razliku u odnosu na prethodne studije postojanjugeografsko-rasnim razlikama. Međutim, oni su uočili povezanost sa većomincidencom metastaza limfnih čvorova, što pruža razloge za dalja ispitivanja. Istirezultat su dobili i Trifa i sar. (2010) na tunižanskoj populaciji. Khaliq i sar. (2000)su ispitivali ovaj polimorfizam i njegovu povezanost sa kancerom dojke u 9etničkih grupa Pakistana i pokazali da zaista postoje razlike u alelskimučestalostima. Odsustvo insercije 16bp bilo je uobičajeno za etničke grupe naseveru, a najveća učestalost ove alelske varijante je među grupom Hazara.U studiji na populaciji Nemačke, Wang-Gohrke i sar. (1999) su pokazalipovezanost ovog polimorfizma sa povećanim rizikom za kancer ovarijuma, ali ne uslučaju nosilaca BRCA1 i BRCA2 naslednih mutacija. Do sada je samo jedna studijapokazala da PIN3 A2 alel smanjuje nivo iRNK i pokazala je moguću vezu ove alelskevarijante TP53 sa rizikom za kolorektalni kancer (Gemignani i sar., 2004).Znatno slabija prognoza kod pacijenata sa nesitnoćelijskim karcinomompluća (engl. Non-Small Cell Lung Carcinoma, NSCLC) je takođe povezana sa ovimpolimorfizmom (Boldrini i sar., 2008). Zbog toga što postoji razlika u riziku zarazvoj kancera pluća među različitim etničkim grupama Wu i sar. (2002) suispitivali povezanost između pripadnosti određenoj etničkoj grupi i ovogpolimorfizma sa rizikom za kancer pluća. Takođe su ispitivali funkcionalnost TP53varijanti u apoptozi i DNK reparaciji. Raspodela učestalosti genotipova ihaplotipova je bila izuzetno zavisna od etničke grupe, ali u svim etničkim grupamaje PIN3 Ins 16bp polimorfizam bio povezan sa povećanim rizikom za kancer pluća.Limfoblastoidne ćelijske linije sa wt alelima su imale značajno veće apoptotskeindekse i sposobnost za reparaciju DNK nego ćelijske linije sa jednim mutiranimalelom.U literaturi nismo naišli na podatke o asocijaciji ovog polimorfizma TP53gena sa bazocelularnim karcinomom, što dodatno uvećava značaj našegistraživanja. Rezultati naše analize su pokazali da heterozigoti nose čak 2.40 puta Diskusija 122 veći rizik za oboljevanje od BCK-a u poređenju sa homozigotima bez duplikacije,kao i udruženi heterozigoti sa homozigotima sa insercijom, 2.16 puta veći rizik uodnosu na homozigote bez insercije. Obe vrednosti su statistički značajne, a kaozaključak se nameće činjenica da se u našoj populaciji TP53 PIN3 Ins 16bppolimorfizam može smatrati genetičkim markerom za razvoj bazocelularnogkarcinoma. Meta-analiza na 26 populacija Hu-a i sar. (2010) je pokazala da alel sainsercijom A2 nosi povećan rizik za razvoj kancera, posebno kada se analizirajuzdruženo heterozigoti i homozigoti sa insercijom u poređenju sa A1/A1homozigotima, OR=1.14, što znači da su podaci dobijeni u ovoj studiji u priličnojsaglasnosti sa podacima sličnih istraživanja urađenih na različitim tipovimakancera.Svakako, kako bi se ovo istraživanje proširilo u budućnosti bi bilo dobrouzeti u razmatranje analizu ekspresije proučavanih gena, kao i uticaj još nekihspoljašnjih faktora, npr. izloženost UV zračenju. 6. ZAKLJUČCI Zaključci 124 Na osnovu dobijenih rezultata ove doktorske disertacije, izvedeni su sledećizaključci:  Najveći broj pacijenata (84%) su stariji od 60 godina, što potvrđujedosadašnje tvrdnje da je bazocelularni karcinom češći u starijem delupopulacije i da se incidenca njegovog nastanka povećava sa godinama.Dobijeni rezultati pokazuju takođe da nema razlike među polovima uzastupljenosti bazocelularnog karcinoma u regionu glave i vrata.Istovremeno, najveći broj pacijenata je imao tumor na nosu, kaonajisturenijem delu lica.  Između grupe pacijenata sa bazocelularnim karcinomom i kontrolne grupenije uočena statistički značajna razlika u učestalosti alela i genotipova za -308 G/A promotorski polimorfizam u TNF alpha genu, pa se on ne možesmatrati faktorom rizika za nastanak ovog karcinoma.  Nije uočena statistički značajna razlika ni u distribuciji alela i genotipovaizmeđu pacijenata i zdravih kontrola za polimorfizam +36 A/G u genu zaTNF-R1, što znači da ni ovaj polimorfizam nije modulator rizika za nastanakbazocelularnog karcinoma u našoj populaciji.  Analiza polimorfizma +676 T/G gena za TNF-R2 pokazala je statističkiznačajnu razliku učestalosti i genotipova i alela između grupe pacijenata sabazocelularnim karcinomom i kontrolne grupe. Rezultati logističkeregresione analize pokazali su postojanje značajano povećanog rizika zaoboljevanje od BCK-a kod osoba nosiosa G alela.  Podaci dobijeni analizom učestalosti alela i genotipova pacijenata sabazocelularnim karcinomom kože, i njihovim poređenjem sa kontrolnomgrupom zdravih individua pokazali su odsustvo asocijacije promotorskogpolimorfizma -1562C/T MMP- 9 gena sa rizikom oboljevanja od ovog tipakancera. Zaključci 125  Ispitivanje polimorfizma -31G/C u genu za survivin je pokazalo daheterozigoti imaju značajno smanjen rizik za oboljevanje od bazocelularnogkarcinoma u poređenju sa G/G homozigotima kada su u analizu uključenipodaci o konzumaciji alkohola i cigareta, što ukazuje na jačinu kombinovanogefekta genotipa i sredine na krajnji ishod.  Nije uočena razlika u distribuciji alela i genotipova između grupe pacijanata ikontrolne grupe za polimorfizam Pro47Ser u TP53 genu, pa se tako ovajpolimorfizam nukleotidne sekvence ne može smatrati faktorom rizika zapojavu bazocelularnog karcinoma.  Insercioni polimorfizam u TP53 genu, PIN3 Ins 16bp, pokazao je značajnurazliku učestalosti genotipova u dve analizirane grupe. Heterozigoti A1/A2pokazuju značajno smanjen rizik za razvoj bazocelularnog karcinoma upoređenju sa homozigotima bez insercije, tako da se ovaj polimorfizamtakođe može smatrati modulatorom rizika za nastanak bazocelularnogkarcinoma kože.  Iako je ovo istraživanje bazirano na analizi polimorfizama nekoliko rezultatidaju dobre smernice za buduća istraživanja koja bi mogla da obuhvate ianalize ekspresije ovih gena, postojanje njihove interakcije, postojanjeneravnoteže vezanosti i interakcije genotipova i nekih sredinskih faktora. 7. LITERATURA Literatura 127 AAgarwal ML., Agarvval A., Taylor WR., Stark GR.: p53 controls both the G2/Mand the Gl cell cycle checkpoints and mediates reversible growth arrest in humanfibroblasts. Proc. Natl. Acad.Sci. USA. 1995; 92: 8493-9497.Aggrawal BB. Signalling pathways of the TNF superfamily: a double edgesword. Nat Rev Immunol 2003;3:745-756.Ahirwar D, Kesarwani P, Manchanda PK, Mandhani A, Mittal RD. Anti- andproinflammatory cytokine gene polymorphism and genetic predisposition:association with smoking, tumor stage and grade, and bacillus Calmette-Guérinimmunotherapy in bladder cancer. Cancer Genet Cytogenet. 2008 Jul;184(1):1-8.Aksentijevich I, Galon J, Soares M, Mansfield E, Hull K, Oh HH, at all.The tumnornecrosis factor receotor- associated periodic syndrome: new mutations in TNFRSF1A, ancestral origins, genotype-phenotype studies, and evidence for futuregenetic heterogeneity of periodic feveres, Am J Hum Genet 2001;69(2):301-14.Akyurek N, Yongsheng R, Rassidakis GZ, Schlette EJ, Medeiros LJ. Expression ofinhibitor of apoptosis proteins in B-cell non-Hodgkin and Hodgkin lymphomas.Cancer. 2006; 107:1844-51.Al-Khalaf HH, Aboussekhra A. Survivin expression increases during aging andenhances the resistance of aged human fibroblasts to genotoxic stress. Age(Dordr). 2012 Jan 15.Almeida LO, Custódio AC, Pinto GR, Santos MJ, Almeida JR, Clara CA, Rey JA,Casartelli C. Polymorphisms and DNA methylation of gene TP53 associated withextra-axial brain tumors. Genet Mol Res. 2009; 8(1):8-18.Altieri DC. The molecular basis and potential role of surviving in cancerdiagnosis and therapy. Trends Mol Med. 2001; 7:542–547.Altieri DC. Validating survivin as a cancer therapeutic target. Nat. Rev. Cancer.2003; 3 (1): 46–54. Literatura 128 Altieri DC. Survivin, versatile modulation of cell division and apoptosis incancer. Oncogene. 2003 Nov 24;22(53):8581-9.Ambrosini G, Adida C, Altieri DC. A novel anti-apoptosis gene, survivin,expressed in cancer and lymphoma. Nat Med 1997;3:917–21.Andric M, Nikolic N, Boskovic M, Milicic B, Skodric S, Basta Jovanovic G, MilasinJ. Survivin gene promoter polymorphism -31G/C as a risk factor for keratocysticodontogenic tumor development. Eur J Oral Sci. 2012 Feb;120(1):9-13. doi:10.1111/j.1600-0722.2011.00919.x.Asahina M, Yoshiyama Y, Hattori T: Expression of matrix metalloproteinase-9and urinary-type plasminogen activator in Alzheimer’s disease brain. ClinNeuropathol. 2001; 20: 60–63.Atkinson JJ, Senior RM. Matrix Metalloproteinase 9 in lung remodeling. Am JRespir Cell Mol Biol. 2003 Jan;28(1):12-24.Avigad S, Barel D, Blau O, Malka A, Zoldan M, Mor C, et al. A novel germ line p53mutation in intron 6 in diverse childhood malignancies. Oncogene 1997;14:1541–5. Azmy IA, Balasubramanian SP, Wilson AG, Stephenson TJ, Cox A, Brown NJ, etal. Role of tumour necrosis factor gene polymorphisms (-308 and -238) in breastcancer susceptibility and severity. Breast Cancer Res. 2004;6(4):R395–400.Azmy IA, Balasubramanian SP, Wilson GA, Stephenson JT, Cox A, Brown JN, andReed WM. Role of tumour necrosis factor gene polymorphisms (−308 and −238) inbreast cancer susceptibility and severity. Breast Cancer Res. 2004; 6, R395–R400. BBaker E, Chen LZ, Smith CA, Callen DF, Goodwin R, Sutherland GR:Chromosomal location of the human tumor necrosis factor receptor genes.Cytogenet Cell Genet. 1991, 57:117–118. Literatura 129 Banks DP, Plescia J, Altieri DC, Chen J, Rosenberg SH, Zhang H, Ng SC: Survivindoes not inhibit caspase-3 activity. Blood. 2000; 96:4002–3.Barnes PJ. New treatments for COPD. Nat Rev Drug Discov. 2002 Jun;1(6):437-46. Baskic D., Aćimović Lj., Đurđević P., Đukić A., Arsenijević N. Apoptoza,programirana ćelijska smrt. Medicus. 2002: 3(2): 22-25.Baştürk B, Yavaşçaoğlu I, Vuruşkan H, Göral G, Oktay B, Oral HB. Cytokine genepolymorphisms as potential risk and protective factors in renal cell carcinoma.Cytokine. 2005 Apr 7;30(1):41-5.Bazzoni F, Gatto I, Lenzi L, Vinante F, Pizzolo G, Zanolin E, De Gironcoli M.Identification of novel polymorphisms in the human TNFR1 gene;distribution inacute leukemia patients and healthy individuals. Immunogenetics.2000;51(2):159-63Beltinger CP, White PS, Maris JM, Sulman EP, Jensen SJ, LePaslier D, Stallard BJ,Goeddel DV, de Sauvage FJ, Brodeur GM. Physical mapping and genomic structureof the human TNFR2 gene. Genomics. 1996 Jul 1;35(1):94-100.Bergers G, Brekken R, McMahon G, Vu TH, Itoh T, Tamaki K, Tanzawa K, ThorpeP, Itohara S, Werb Z, Hanahan D. Matrix metalloproteinase-9 triggers theangiogenic switch during carcinogenesis. Nat Cell Biol. 2000 Oct;2(10):737-44.Birgander R, Själander A, Rannug A, Alexandrie AK, Sundberg MI, Seidegård J,Tornling G, Beckman G, Beckman L.P53 polymorphisms and haplotypes in lungcancer. Carcinogenesis. 1995 Sep;16(9):2233-6.Birkedal-Hansen H, Moore WG, Bodden MK, Windsor LJ, Birkedal-Hansen B,DeCarlo A, Engler JA.Matrix metalloproteinases: a review. Crit Rev Oral Biol Med.1993;4(2):197-250. Literatura 130 Bisof V, Salihović MP, Narancić NS, Skarić-Jurić T, Jakić-Razumović J, JanićijevićB, Turek S, Rudan P. TP53 gene polymorphisms and breast cancer in Croatianwomen: a pilot study. Eur J Gynaecol Oncol. 2010; 31(5):539-44.Boldrini L, Gisfredi S, Ursino S, Lucchi M, Greco G, Mussi A, Donati V, FontaniniG. Effect of the p53 codon 72 and intron 3 polymorphisms on non-small cell lungcancer (NSCLC) prognosis. Cancer Invest. 2008; 26(2):168-72.Borbély AA, Murvai M, Szarka K, Kónya J, Gergely L, Hernádi Z, Veress G.Survivin promoter polymorphism and cervical carcinogenesis. J Clin Pathol. 2007Mar;60(3):303-6. Epub 2006 May 19.Boukamp P. UV-induced skin cancer: similarities--variations. J Dtsch DermatolGes. 2005 Jul;3(7):493-503.Bouma G., Crusius J.B., Oudkerk P.M., Kolkman J.J., von Blomberg B.M., KostenseP.J., Giphart M.J., Schreuder G.M., Meuwissen S.G., Peńa A.S. Secretion of tumournecrosis factor alpha and lymphotoxin alpha in relation to polymorphisms in theTNF genes and HLA-DR alleles. Relevance for inflammatory bowel disease. Scand. J.Immunol. 43 (1996) 456–463.Boyd AS, Shyr Y, King LE Jr. Basal cell carcinoma in young women: anevaluation of the association of tanning bed use and smoking. J Am Acad Dermatol.2001; 46:706-9.Brash DE, Ponten J. Skin precancer. Cancer Surv. 1998; 32:69-113.Brosh R, Rotter V. When mutants gain new powers: news from the mutant p53field. Nat Rev Cancer. 2009 Oct;9(10):701-13.Buchs N, di Giovine FS, Silvestri T, Vannier E, Duff GW, Miossec P. IL-1B and IL-1Ra gene polymorphisms and disease severity in rheumatoid arthritis: interactionwith their plasma levels. Genes Immun. 2001; 2:222–8. Literatura 131 CCaldas H, Jiang Y, Holloway MP, Fangusaro J, Mahotka C, Conway EM, Altura RA.Survivin splice variants regulate the balance between proliferation and cell death.Oncogene. 2005 Mar 17;24(12):1994-2007.Cancer Council Australia and Australian Cancer Network. Basal cell carcinoma,squamous cell carcinoma (and related lesions) . A guide to clinical management inAustralia. Sydney, 2008.Cheng ZJ, Hu LH, Huang SJ. Correlation of -31G/C polymorphisms of survivinpromoter to tumorigenesis of gastric carcinoma. Ai Zheng. 2008 Mar;27(3):258-63.Chung S. Basal Cell Carcinoma. Arch Plast Surg. 2012; 39: 166-70.Costa S, Pinto DR, Pereira D, Rodrigues H, Cameselle-Teijeiro J, Medeiros R,Schmitt F. Importance of TP53 codon 72 and intron 3 duplication 16bppolymorphisms in prediction of susceptibility on breast cancer. BMC Cancer. 2008;8:32.Cotignola J, Reva B, Mitra N, Ishill N, Chuai S, Patel A, Shah S, Vanderbeek G, CoitD, Busam K, Halpern A, Houghton A, Sander C, Berwick M, Orlow I. MatrixMetalloproteinase-9 (MMP-9) polymorphisms in patients with cutaneousmalignant melanoma. BMC Med Genet. 2007 Mar 8;8:10.Coussens LM, Tinkle CL, Hanahan D, Werb Z. MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis. Cell. 2000 Oct 27;103(3):481-90. DDe Vecchi G, Verderio P, Pizzamiglio S, Manoukian S, Bernard L, Pensotti V,Volorio S, Ravagnani F, Radice P, Peterlongo P. The p53 Arg72Pro and Ins16bppolymorphisms and their haplotypes are not associated with breast cancer risk inBRCA-mutation negative familial cases. Cancer Detect Prev. 2008;32(2):140-3. Literatura 132 Demeter J, Porzsolt F, Rämisch S, Schmid M, Messer G. Polymorphism of thetumour necrosis factor-alpha and lymphotoxin-alpha genes in hairy cell leukaemia.Br J Haematol. 1997 Apr;97(1):132-4.Denissenko MF, Pao A, Tang MS, Pfeifer GP. Preferential formation ofbenzo[a]pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in P53. Science 1996;274:430-2.Detanac Dž: Etiopatogeneza bazocelularnog karcinoma, Med Čas: 2010; 4: 25-29. Devarajan P, Johnston JJ, Ginsberg SS, Van Wart HE, Berliner N. Structure andexpression of neutrophil gelatinase cDNA. Identity with type IV collagenase fromHT1080 cells. J Biol Chem. 1992 Dec 15;267(35):25228-32.Dieude P, Osorio J, Petit-Teixeira E, Moreno S, Garnier S, Cailleau-Moindrault S,et al. A TNFR1 genotype with a protective role in familial rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum. 2004;50:413–19.Diffey BL. Solar ultraviolet radiation effects on biological systems. Phys MedBiol. 1991 Mar;36(3):299-328.Dredge K, Marriott JB, Dalgleish AG. Immunological effects of thalidomide andits chemical and functional analogs. Crit Rev Immunol. 2002;22(5-6):425-37.Duarte I, Santos A, Sousa H, Catarino R, Pinto D, Matos A, Pereira D, Moutinho J,Canedo P, Machado JC, Medeiros R. G-308A TNF-alpha polymorphism is associatedwith an increased risk of invasive cervical cancer. Biochem Biophys Res Commun.2005 Aug 26;334(2):588-92. EEgeblad M, Werb Z. New functions for the matrix metalloproteinases in cancerprogression. Nat Rev Cancer. 2002 Mar;2(3):161-74. Literatura 133 el-Deiry WS, Tokino T, Velculescu VE, Levy DB, Parsons R, Trent JM, Lin D,Mercer WE, Kinzler KW, Vogelstein B. WAF1, a potential mediator of p53 tumorsuppression. Cell. 1993 Nov 19;75(4):817-25.Epstein EH Jr. Basal cell nevus syndrome. In: Freedberg IM, ed. Fitzpatrick'sdermatology in general Medicine. 5th ed. New York: Mcgraw-Hill, 1999: 1862–5. FFabris M, Di Poi E, D'Elia A, Damante G, Sinigaglia L, Ferraccioli G. Tumornecrosis factor-alpha gene polymorphism in severe and mild-moderaterheumatoid arthritis. J Rheumatol. 2002 Jan;29(1):29-33.Faghani M, Ghasemi FM, Nikhbakht M, Salehi M.TP53 PIN3 polymorphismassociated with breast cancer risk in Iranian women. Indian J Cancer. 2011 Jul-Sep;48(3):298-302.Felley-Bosco E, Weston A, Cawley HM, Bennett WP, Harris CC. Functionalstudies of a germ-line polymorphism at codon 47 within the p53 gene. Am J HumGenet. 1993 Sep;53(3):752-9.Feng L, Hollstein M, Xu Y. Ser46 phosphorylation regulates p53-dependentapoptosis and replicative senescence. Cell Cycle. 2006 Dec;5(23):2812-9.Ferrajoli A, Keating MJ, Manshouri T, Giles FJ, Dey A, Estrov Z, Koller CA,Kurzrock R, Thomas DA, Faderl S, Lerner S, O'Brien S, Albitar M. The clinicalsignificance of tumor necrosis factor-alpha plasma level in patients having chroniclymphocytic leukemia. Blood. 2002 Aug 15;100(4):1215-9.Foster PJ, Dunn EA, Karl KE, Snir JA, Nycz CM, Harvey AJ, Pettis RJ. Cellularmagnetic resonance imaging: in vivo imaging of melanoma cells in lymph nodes ofmice. Neoplasia. 2008 Mar;10(3):207-16.Frazer K, Murray S, Schor N, Topol E. Human genetic variation and itscontribution to complex traits. Nat Rev Genet 2009; 10: 241-251. Literatura 134 Fu XR, Zhang C, Chen CY, Zhang L, Wang LX, Wang BH, Liu XY, Zhang MZ.Expression and significance of matrix metalloproteinase and tissue inhibitor ofmatrix metalloproteinase in non-melanoma skin cancer. Zhonghua Zhong Liu ZaZhi. 2012 May;34(5):369-73. GGallagher RP, Bajdik CD, Fincham S, Hill GB, Keefe AR, Coldman A, McLean DI.Chemical exposures, medical history, and risk of squamous and basal cellcarcinoma of the skin. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1996 Jun;5(6):419-24.Gambichler T, Skrygan M, Hyun J, Bechara F, Tomi NS, Altmeyer P, Kreuter A.Cytokine mRNA expression in basal cell carcinoma. Arch Dermatol Res. 2006Aug;298(3):139-41. Epub 2006 Jul 7.Gaur U, Aggarwal BB. Regulation of proliferation, survival and apoptosis bymembers of the TNF superfamily. Biochem Pharmacol. 2003 Oct 15;66(8):1403-8.Gemignani F, Moreno V, Landi S, Moullan N, Chabrier A, Gutiérrez-Enríquez S,Hall J, Guino E, Peinado MA, Capella G, Canzian F. A TP53 polymorphism isassociated with increased risk of colorectal cancer and with reduced levels of TP53mRNA. Oncogene. 2004 Mar 11;23(10):1954-6.Giaccia AJ, Kastan MB. The complexity of p53 modulation: emerging patternsfrom divergent signals. Genes Dev. 1998 Oct 1;12(19):2973-83.Glenn CL, Wang WY, Benjafield AV, Morris BJ. Linkage and association of tumornecrosis factor receptor 2 locus with hypertension, hypercholesterolemia andplasma shed receptor. Hum Mol Genet. 2000 Aug 12;9(13):1943-9.Gloster HM Jr, Brodland DG. The epidemiology of skin cancer. Dermatol Surg.1996 Mar;22(3):217-26.Goldberg GI, Strongin A, Collier IE, Genrich LT, Marmer BL. Interaction of 92-kDa type IV collagenase with the tissue inhibitor of metalloproteinases prevents Literatura 135 dimerization, complex formation with interstitial collagenase, and activation of theproenzyme with stromelysin. J Biol Chem. 1992 Mar 5;267(7):4583-91.Grabowski P, Kühnel T, Mühr-Wilkenshoff F, Heine B, Stein H, Höpfner M,Germer CT, Scherübl H. Prognostic value of nuclear survivin expression inoesophageal squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 2003 Jan 13;88(1):115-9.Green DR, Reed JC. Mitochondria and apoptosis. Science. 1998 Aug28;281(5381):1309-12.Guan X, Liao Z, Ma H, Qian J, Liu Z, Yuan X, Gomez D, Komaki R, Wang LE, Wei Q.TNFRSF1B +676 T>G polymorphism predicts survival of non-small cell lung cancerpatients treated with chemoradiotherapy. BMC Cancer. 2011 Oct 14;11:447.Gupta R, Sharma SC, Das SN. Association of TNF-alpha and TNFR1 promotersand 3' UTR region of TNFR2 gene polymorphisms with genetic susceptibility totobacco-related oral carcinoma in Asian Indians. Oral Oncol. 2008 May;44(5):455-63. Epub 2008 Feb 21. HHaider S, Knöfler M. Human tumour necrosis factor: physiological andpathological roles in placenta and endometrium. Placenta. 2009 Feb;30(2):111-23.Epub 2008 Nov 22.Hajeer AH, Hutchinson IV. TNF-alpha gene polymorphism: clinical andbiological implications. Microsc Res Tech. 2000 Aug 1;50(3):216-28.Hajeer AH, Lear JT, Ollier WE, Naves M, Worthington J, Bell DA, Smith AG,Bowers WP, Jones PW, Strange RC, Fryer AA. Preliminary evidence of anassociation of tumour necrosis factor microsatellites with increased risk ofmultiple basal cell carcinomas. Br J Dermatol. 2000 Mar;142(3):441-5.Han CH, Wei Q, Lu KK, Liu Z, Mills GB, Wang LE. Polymorphisms in the survivinpromoter are associated with age of onset of ovarian cancer. Int J Clin Exp Med.2009 Oct 31;2(4):289-99. Literatura 136 Han YP, Nien YD, Garner WL. Tumor necrosis factor-alpha-induced proteolyticactivation of pro-matrix metalloproteinase-9 by human skin is controlled by down-regulating tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and mediated by tissue-associated chymotrypsin-like proteinase. J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):27319-27. Epub 2002 May 9.Harris CC. p53: at the crossroads of molecular carcinogenesis and riskassessment. Science. 1993 Dec 24;262(5142):1980-1.Harwood CA, Proby CM. Human papillomaviruses and non-melanoma skincancer. Curr Opin Infect Dis. 2002 Apr;15(2):101-14.Heilig B, Mapara M, Brockhaus M, Krauth K, Dörken B. Two types of TNFreceptors are expressed on human normal and malignant B lymphocytes. ClinImmunol Immunopathol. 1991 Nov;61(2 Pt 1):260-7.Heljasvaara R, Nyberg P, Luostarinen J, Parikka M, Heikkilä P, Rehn M, Sorsa T,Salo T, Pihlajaniemi T. Generation of biologically active endostatin fragments fromhuman collagen XVIII by distinct matrix metalloproteases. Exp Cell Res. 2005 Jul15;307(2):292-304.Ho SL, Dogar GF, Wang J, Crean J, Wu QD, Oliver N, Weitz S, Murray A, Cleary PE,O'Brien C.Elevated aqueous humour tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1and connective tissue growth factor in pseudoexfoliation syndrome. Br JOphthalmol. 2005 Feb;89(2):169-73.Ho SY, Wang YJ, Chen HL, Chen CH, Chang CJ, Wang PJ, Chen HH, Guo HR.Increased risk of developing hepatocellular carcinoma associated with carriage ofthe TNF2 allele of the -308 tumor necrosis factor-alpha promoter gene. CancerCauses Control. 2004 Sep;15(7):657-63.Ho SY, Wang YJ, Huang PC, Tsai ST, Chen CH, Chen HH, Chang CJ, Guo HR.Evaluation of the associations between the single nucleotide polymorphisms of thepromoter region of the tumor necrosis factor-alpha gene and nasopharyngealcarcinoma. J Chin Med Assoc. 2006 Aug;69(8):351-7. Literatura 137 Hrstka R, Beranek M, Klocova K, Nenutil R, Vojtesek B. Intronic polymorphismsin TP53 indicate lymph node metastasis in breast cancer. Oncol Rep. 2009Nov;22(5):1205-11.Hu Z, Li X, Qu X, He Y, Ring BZ, Song E, Su L. Intron 3 16 bp duplicationpolymorphism of TP53 contributes to cancer susceptibility: a meta-analysis.Carcinogenesis. 2010 Apr;31(4):643-7. Epub 2010 Jan 20.Huhtala P, Tuuttila A, Chow LT, Lohi J, Keski-Oja J, Tryggvason K. Completestructure of the human gene for 92-kDa type IV collagenase. Divergent regulationof expression for the 92- and 72-kilodalton enzyme genes in HT-1080 cells. J BiolChem. 1991 Sep 5;266(25):16485-90.Hussain SP, Harris CC. Inflammation and cancer: an ancient link with novelpotentials. Int J Cancer. 2007 Dec 1;121(11):2373-80.Hurt EM, Thomas SB, Peng B, Farrar WL. Reversal of p53 epigenetic silencing inmultiple myeloma permits apoptosis by a p53 activator. Cancer Biol Ther. 2006Sep;5(9):1154-60. Epub 2006 Sep 6. IIłzecka J, Stelmasiak Z, Dobosz B. Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) activityin cerebrospinal fluid of amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurol NeurochirPol. 2001 Nov-Dec;35(6):1035-43.Isobe M, Emanuel BS, Givol D, Oren M, Croce CM. Localization of gene forhuman p53 tumour antigen to band 17p13. Nature. 1986 Mar 6-12;320(6057):84-5. Ito I, Nagai S, Handa T, Muro S, Hirai T, Tsukino M, Mishima M. Matrixmetalloproteinase-9 promoter polymorphism associated with upper lungdominant emphysema. Am J Respir Crit Care Med. 2005 Dec 1;172(11):1378-82.Epub 2005 Aug 26. Literatura 138 Ito T, Shiraki K, Sugimoto K, Yamanaka T, Fujikawa K, Ito M, Takase K,Moriyama M, Kawano H, Hayashida M, Nakano T, Suzuki A. Survivin promotes cellproliferation in human hepatocellular carcinoma. Hepatology. 2000May;31(5):1080-5.Ivansson EL, Magnusson JJ, Magnusson PK, Erlich HA, Gyllensten UB. MHC lociaffecting cervical cancer risk: distinguishing the effects of HLA-DQB1 and non-HLAgenes TNF, LTA, TAP1 and TAP2. Genes Immun. 2008 Oct;9(7):613-23. Epub 2008Jul 24. JJackson C, Nguyen M, Arkell J, Sambrook P. Selective matrix metalloproteinase(MMP) inhibition in rheumatoid arthritis--targetting gelatinase A activation.Inflamm Res. 2001 Apr;50(4):183-6.Jacob CO. Tumor necrosis factor alpha in autoimmunity: pretty girl or oldwitch? Immunol Today. 1992 Apr;13(4):122-5.Jacobs GH, Rippey JJ, Altini M. Prediction of aggressive behavior in basal cellcarcinoma. Cancer. 1982 Feb 1;49(3):533-7.Jang JS, Kim KM, Kang KH, Choi JE, Lee WK, Kim CH, Kang YM, Kam S, Kim IS,Jun JE, Jung TH, Park JY. Polymorphisms in the survivin gene and the risk of lungcancer. Lung Cancer. 2008 Apr;60(1):31-9. Epub 2007 Oct 24.Javle MM, Tan D, Yu J, LeVea CM, Li F, Kuvshinoff BW, Gibbs JF. Nuclear survivinexpression predicts poor outcome in cholangiocarcinoma.Hepatogastroenterology. 2004 Nov-Dec;51(60):1653-7.Joerger AC, Ang HC, Fersht AR. Structural basis for understanding oncogenicp53 mutations and designing rescue drugs. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Oct10;103(41):15056-61. Epub 2006 Oct 2.Jung K, Meisser A, Bischof P. Blood sampling as critical preanalyticaldeterminant to use circulating MMP and TIMP as surrogate markers for Literatura 139 pathological processes. Int J Cancer. 2005 Oct 10;116(6):1000-1; author reply1002-3. KKaelin WG Jr. The emerging p53 gene family. J Natl Cancer Inst. 1999 Apr7;91(7):594-8.Kahn HS, Tatham LM, Patel AV, Thun MJ, Heath CW Jr. Increased cancermortality following a history of nonmelanoma skin cancer. JAMA. 1998 Sep9;280(10):910-2.Kalo E, Buganim Y, Shapira KE, Besserglick H, Goldfinger N, Weisz L,Stambolsky P, Henis YI, Rotter V. Mutant p53 attenuates the SMAD-dependenttransforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling pathway by repressing theexpression of TGF-beta receptor type II. Mol Cell Biol. 2007 Dec;27(23):8228-42.Epub 2007 Sep 17.Kammoun-Krichen M, Bougacha-Elleuch N, Makni K, Mnif M, Jouida J, Abid M,Rebai A, Ayadi H. A potential role of TNFR gene polymorphisms in autoimmunethyroid diseases in the Tunisian population. Cytokine. 2008 Aug;43(2):110-3. Epub2008 Jun 20.Kennedy C, Bajdik CD, Willemze R, De Gruijl FR, Bouwes Bavinck JN; LeidenSkin Cancer Study. The influence of painful sunburns and lifetime sun exposure onthe risk of actinic keratoses, seborrheic warts, melanocytic nevi, atypical nevi, andskin cancer. J Invest Dermatol. 2003 Jun;120(6):1087-93.Kennedy SM, O'Driscoll L, Purcell R, Fitz-Simons N, McDermott EW, Hill AD,O'Higgins NJ, Parkinson M, Linehan R, Clynes M. Prognostic importance of survivinin breast cancer. Br J Cancer. 2003 Apr 7;88(7):1077-83.Khaliq S, Hameed A, Khaliq T, Ayub Q, Qamar R, Mohyuddin A, Mazhar K,Qasim-Mehdi S. P53 mutations, polymorphisms, and haplotypes in Pakistani ethnicgroups and breast cancer patients. Genet Test. 2000;4(1):23-9. Literatura 140 Kirkpatrick A, Bidwell J, van den Brule AJ, Meijer CJ, Pawade J, Glew S. TNFalphapolymorphism frequencies in HPV-associated cervical dysplasia. Gynecol Oncol.2004 Feb;92(2):675-9.Kohaar I, Thakur N, Salhan S, Batra S, Singh V, Sharma A, Sodhani P, Das BC,Sarkar DP, Bharadwaj M. TNFalpha-308G/A polymorphism as a risk factor for HPVassociated cervical cancer in Indian population. Cell Oncol. 2007;29(3):249-56.Körner H, Cretney E, Wilhelm P, Kelly JM, Röllinghoff M, Sedgwick JD, Smyth MJ.Tumor necrosis factor sustains the generalized lymphoproliferative disorder (gld)phenotype. J Exp Med. 2000 Jan 3;191(1):89-96.Krajcik RA, Massardo S, Orentreich N. No association between serum levels oftumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) or the soluble receptors sTNFR1 andsTNFR2 and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2003Sep;12(9):945-6.Kriegler M, Perez C, DeFay K, Albert I, Lu SD. A novel form of TNF/cachectin is acell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complexphysiology of TNF. Cell. 1988 Apr 8;53(1):45-53.Kroemer G, Dallaporta B, Resche-Rigon M. The mitochondrial death/liferegulator in apoptosis and necrosis. Annu Rev Physiol. 1998;60:619-42.Kurihara A, Nagoshi H, Yabuki M, Okuyama R, Obinata M, Ikawa S. Ser46phosphorylation of p53 is not always sufficient to induce apoptosis: multiplemechanisms of regulation of p53-dependent apoptosis. Genes Cells. 2007Jul;12(7):853-61.Kurimoto I, Streilein JW. cis-urocanic acid suppression of contacthypersensitivity induction is mediated via tumor necrosis factor-alpha. J Immunol.1992 May 15;148(10):3072-8. Literatura 141 LLauten M, Matthias T, Stanulla M, Beger C, Welte K, Schrappe M. Association ofinitial response to prednisone treatment in childhood acute lymphoblasticleukaemia and polymorphisms within the tumour necrosis factor and theinterleukin-10 genes. Leukemia. 2002 Aug;16(8):1437-42.Lazar V, Hazard F, Bertin F, Janin N, Bellet D, Bressac B. Simple sequence repeatpolymorphism within the p53 gene. Oncogene. 1993 Jun;8(6):1703-5.Lear W, Dahlke E, Murray CA. Basal cell carcinoma: review of epidemiology,pathogenesis, and associated risk factors. J Cutan Med Surg. 2007 Jan-Feb;11(1):19-30.Lehner R, Lucia MS, Jarboe EA, Orlicky D, Shroyer AL, McGregor JA, Shroyer KR.Immunohistochemical localization of the IAP protein survivin in bladder mucosaand transitional cell carcinoma. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2002Jun;10(2):134-8.Li F, Yang J, Ramnath N, Javle MM, Tan D. Nuclear or cytoplasmic expression ofsurvivin: what is the significance? Int J Cancer. 2005 Apr 20;114(4):509-12.Li X, Dumont P, Della Pietra A, Shetler C, Murphy ME. The codon 47polymorphism in p53 is functionally significant. J Biol Chem. 2005 Jun24;280(25):24245-51. Epub 2005 Apr 25.Lindelöf B, Sigurgeirsson B, Tegner E, Larkö O, Johannesson A, Berne B,Christensen OB, Andersson T, Törngren M, Molin L, et al. PUVA and cancer: a large-scale epidemiological study. Lancet. 1991 Jul 13;338(8759):91-3.Liu C, Wang J, Zhou S, Wang B, Ma X. Association between -238 but not -308polymorphism of Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha)v and unexplainedrecurrent spontaneous abortion (URSA) in Chinese population. Reprod BiolEndocrinol. 2010 Sep 28;8:114. Literatura 142 Liu CJ, Wong YK, Chang KW, Chang HC, Liu HF, Lee YJ. Tumor necrosis factor-alpha promoter polymorphism is associated with susceptibility to oral squamouscell carcinoma. J Oral Pathol Med. 2005 Nov;34(10):608-12.Locksley RM, Killeen N, Lenardo MJ. The TNF and TNF receptor superfamilies:integrating mammalian biology. Cell. 2001 Feb 23;104(4):487-501.Louis E, Franchimont D, Piron A, Gevaert Y, Schaaf-Lafontaine N, Roland S,Mahieu P, Malaise M, De Groote D, Louis R, Belaiche J. Tumour necrosis factor(TNF) gene polymorphism influences TNF-alpha production in lipopolysaccharide(LPS)-stimulated whole blood cell culture in healthy humans. Clin Exp Immunol.1998 Sep;113(3):401-6.Lozano G, Levine AJ. Tissue-specific expression of p53 in transgenic mice isregulated by intron sequences. Mol Carcinog. 1991;4(1):3-9.Lu B, Gonzalez A, Massion PP, Shyr Y, Shaktour B, Carbone DP, Hallahan DE.Nuclear survivin as a biomarker for non-small-cell lung cancer. Br J Cancer. 2004Aug 2;91(3):537-40.Lu PH, Tang Y, Li C, Shen W, Ji L, Guo YJ, Tao GQ. Meta-analysis of association oftumor necrosis factor alpha-308 gene promoter polymorphism with gastric cancer.Zhonghua Yu Fang Yi Xue Za Zhi. 2010 Mar;44(3):209-14. MMagalhães RF, Biral AC, Pancoto JA, Donadi EA, Mendes CT Jr, Magna LA,Kraemer MH. Human leukocyte antigen (HLA) and single nucleotidepolymorphisms (SNPs) tumor necrosis factor (TNF)-alpha -238 and -308 asgenetic markers of susceptibility to psoriasis and severity of the disease in a long-term follow-up Brazilian study. Int J Dermatol. 2010 Oct;49(10):1133-40.Makowski GS, Ramsby ML. Use of citrate to minimize neutrophil matrixmetalloproteinase-9 in human plasma. Anal Biochem. 2003 Nov 15;322(2):283-6. Literatura 143 Malkinson AM, You M. The intronic structure of cancer-related genes regulatessusceptibility to cancer. Mol Carcinog. 1994 Jun;10(2):61-5.Mandal M, Mandal A, Das S, Chakraborti T, Sajal C. Clinical implications ofmatrix metalloproteinases. Mol Cell Biochem. 2003 Oct;252(1-2):305-29.Massari LP, Kastelan M, Gruber F. Epidermal malignant tumors: pathogenesis,influence of UV light and apoptosis. Coll Antropol. 2007 Jan;31 Suppl 1:83-5.Matlashewski G, Lamb P, Pim D, Peacock J, Crawford L, Benchimol S. Isolationand characterization of a human p53 cDNA clone: expression of the human p53gene. EMBO J. 1984 Dec 20;3(13):3257-62.Menon R, Velez DR, Thorsen P, Vogel I, Jacobsson B, Williams SM, Fortunato SJ.Ethnic differences in key candidate genes for spontaneous preterm birth: TNF-alpha and its receptors. Hum Hered. 2006;62(2):107-18. Epub 2006 Oct 17.Michalaki V, Syrigos K, Charles P, Waxman J. Serum levels of IL-6 and TNF-alpha correlate with clinicopathological features and patient survival in patientswith prostate cancer. Br J Cancer. 2004 Jun 14;90(12):2312-6.Mire-Sluis, Anthony R.; Thorpe, Robin, ed. (1998). Cytokines (Handbook ofImmunopharmacology). Boston: Academic Press. ISBN 0-12-498340-5.Mitra S, Misra C, Singh RK, Panda CK, Roychoudhury S. Association of specificgenotype and haplotype of p53 gene with cervical cancer in India. J Clin Pathol.2005 Jan;58(1):26-31.Mitra S, Sikdar N, Misra C, Gupta S, Paul RR, Roy B, Panda CK, Roychoudhury S.Risk assessment of p53 genotypes and haplotypes in tobacco-associatedleukoplakia and oral cancer patients from eastern Idia. Int J Cancer. 2005 Dec10;117(5):786-93.Mocellin S, Rossi CR, Pilati P, Nitti D. Tumor necrosis factor, cancer andanticancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev. 2005 Feb;16(1):35-53. Epub2004 Dec 19. Literatura 144 Müller U, Jongeneel CV, Nedospasov SA, Lindahl KF, Steinmetz M. Tumournecrosis factor and lymphotoxin genes map close to H-2D in the mouse majorhistocompatibility complex. Nature. 1987 Jan 15-21;325(6101):265-7. NNakamura T, Ebihara I, Shimada N, Koide H. Effect of cigarette smoking onplasma metalloproteinase-9 concentration. Clin Chim Acta. 1998 Aug28;276(2):173-7.Nagase H. and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem. 1999; 274:21491-94.Nagpal JK, Das BR. Oral cancer: reviewing the present understanding of itsmolecular mechanism and exploring the future directions for its effectivemanagement. Oral Oncol. 2003 Apr;39(3):213-21.Nikkola J, Vihinen P, Vuoristo MS, Kellokumpu-Lehtinen P, Kähäri VM,Pyrhönen S. High serum levels of matrix metalloproteinase-9 and matrixmetalloproteinase-1 are associated with rapid progression in patients withmetastatic melanoma. Clin Cancer Res. 2005 Jul 15;11(14):5158-66. OOlivier M, Hollstein M, Hainaut P. TP53 mutations in human cancers: origins,consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010Jan;2(1):a001008.Olivier M, Hussain SP, Caron de Fromentel C, Hainaut P, Harris CC. TP53mutation spectra and load: a tool for generating hypotheses on the etiology ofcancer. IARC Sci Publ. 2004;(157):247-70.Olivier M, Petitjean A, Marcel V, Pétré A, Mounawar M, Plymoth A, de FromentelCC, Hainaut P. Recent advances in p53 research: an interdisciplinary perspective.Cancer Gene Ther. 2009 Jan;16(1):1-12. Epub 2008 Sep 19. Literatura 145 Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with aconserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell. 1993 Aug27;74(4):609-19.Oppenheim JJ, Feldmann M. Cytokine reference. San Diego: Academic Press;2001.Overall CM, López-Otín C. Strategies for MMP inhibition in cancer: innovationsfor the post-trial era. Nat Rev Cancer. 2002 Sep;2(9):657-72. PPage-McCaw A, Ewald AJ, Werb Z. Matrix metalloproteinases and the regulationof tissue remodelling. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Mar;8(3):221-33.Pantelidis P, Lympany PA, Foley PJ, Fanning GC, Welsh KI, du Bois RM.Polymorphic analysis of the high-affinity tumor necrosis factor receptor 2. TissueAntigens. 1999 Dec;54(6):585-91.Pašić A., Dobrić I., Paljan D. Maligni epidermalni tumori kože. u: Dobrić i i sar.Dermatovenerologija. 2. izd. Zagreb: grafoplast, 1998: 403–8.Peart MJ, Prives C. Mutant p53 gain of function: the NF-Y connection. CancerCell. 2006 Sep;10(3):173-4.Perfumo C, Bonelli L, Menichini P, Inga A, Gismondi V, Ciferri E, Percivale P,Bianchi Scarrà G, Nasti S, Fronza G, Varesco L. Increased risk of colorectaladenomas in Italian subjects carrying the p53 PIN3 A2-Pro72 haplotype. Digestion.2006;74(3-4):228-35. Epub 2007 Mar 20.Petitjean A, Mathe E, Kato S, Ishioka C, Tavtigian SV, Hainaut P, Olivier M.Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumorphenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database. HumMutat. 2007 Jun;28(6):622-9.Pfeifer GP, Besaratinia A. Mutational spectra of human cancer. Hum Genet.2009 Jun;125(5-6):493-506. Epub 2009 Mar 24. Literatura 146 Pietsch EC, Humbey O, Murphy ME. Polymorphisms in the p53 pathway.Oncogene. 2006 Mar 13;25(11):1602-11.Pinto GR, Yoshioka FK, Silva RL, Clara CA, Santos MJ, Almeida JR, Burbano RR,Rey JA, Casartelli C. Prognostic value of TP53 Pro47Ser and Arg72Pro singlenucleotide polymorphisms and the susceptibility to gliomas in individuals fromSoutheast Brazil. Genet Mol Res. 2008 Feb 26;7(1):207-16.Pitts SA, Olomolaiye OO, Elson CJ, Westacott CI, Bidwell JL. An MspA1 Ipolymorphism in exon 1 of the human TNF receptor type I (p55) gene. Eur JImmunogenet. 1998 Apr-Jun;25(2-3):269-70. RRajabi MA, Rajabi P, Afshar-Moghaddam N. Determination of p53 expression inbasal cell carcinoma tissues and adjacent nontumoral epidermis from sun-exposedareas of the head and neck. Arch Iran Med. 2006 Jan;9(1):46-8.Ramachandran S, Fryer AA, Smith AG, Lear JT, Bowers B, Hartland AJ, WhitesideJR, Jones PW, Strange RC. Basal cell carcinomas: association of allelic variants witha high-risk subgroup of patients with the multiple presentation phenotype.Pharmacogenetics. 2001 Apr;11(3):247-54.Ranuncolo SM, Matos E, Loria D, Vilensky M, Rojo R, Bal de Kier Joffé E, InésPuricelli L. Circulating 92-kilodalton matrix metalloproteinase (MMP-9) activity isenhanced in the euglobulin plasma fraction of head and neck squamous cellcarcinoma. Cancer. 2002 Mar 1;94(5):1483-91.Reed JC. Cytochrome c: can't live with it--can't live without it. Cell. 1997 Nov28;91(5):559-62.Rhee JS, Matthews BA, Neuburg M, Logan BR, Burzynski M, Nattinger AB. Theskin cancer index: clinical responsiveness and predictors of quality of life.Laryngoscope. 2007 Mar;117(3):399-405. Literatura 147 Rizzato C, Canzian F, Rudnai P, Gurzau E, Stein A, Koppova K, Hemminki K,Kumar R, Campa D. Interaction between functional polymorphic variants incytokine genes, established risk factors and susceptibility to basal cell carcinoma ofskin.Carcinogenesis. 2011 Dec;32(12):1849-54.Rodier F, Campisi J, Bhaumik D. Two faces of p53: aging and tumorsuppression. Nucleic Acids Res. 2007;35(22):7475-84. Epub 2007 Oct 16.Rubin BY. TNF and viruses: multiple interrelationships. Immunol Ser.1992;56:331-40. SSalvesen GS, Duckett CS. IAP proteins: blocking the road to death's door. NatRev Mol Cell Biol. 2002 Jun;3(6):401-10.Sameer AS, Shah ZA, Syeed N, Banday MZ, Bashir SM, Bhat BA, Siddiqi MA. TP53Pro47Ser and Arg72Pro polymorphisms and colorectal cancer predisposition in anethnic Kashmiri population. Genet Mol Res. 2010 Apr 13;9(2):651-60.Sashio H, Tamura K, Ito R, Yamamoto Y, Bamba H, Kosaka T, Fukui S, Sawada K,Fukuda Y, Tamura K, Satomi M, Shimoyama T, Furuyama J. Polymorphisms of theTNF gene and the TNF receptor superfamily member 1B gene are associated withsusceptibility to ulcerative colitis and Crohn's disease, respectively.Immunogenetics. 2002 Mar;53(12):1020-7. Epub 2002 Feb 7.Schwingshackl A, Duszyk M, Brown N, Moqbel R. Human eosinophils releasematrix metalloproteinase-9 on stimulation with TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol.1999 Nov;104(5):983-9.Scian MJ, Stagliano KE, Anderson MA, Hassan S, Bowman M, Miles MF, Deb SP,Deb S. Tumor-derived p53 mutants induce NF-kappaB2 gene expression. Mol CellBiol. 2005 Nov;25(22):10097-110.Shamsher M, Montano X. Analysis of intron 4 of the p53 gene in humancutaneous melanoma. Gene. 1996 Oct 17;176(1-2):259-62. Literatura 148 Shea CR, McNutt NS, Volkenandt M, Lugo J, Prioleau PG, Albino AP.Overexpression of p53 protein in basal cell carcinomas of human skin. Am J Pathol.1992 Jul;141(1):25-9.Shellman YG, Makela M, Norris DA. Induction of secreted matrixmetalloproteinase-9 activity in human melanoma cells by extracellular matrixproteins and cytokines. Melanoma Res. 2006 Jun;16(3):207-11.Shin S, Sung BJ, Cho YS, Kim HJ, Ha NC, Hwang JI, Chung CW, Jung YK, Oh BH. Ananti-apoptotic protein human survivin is a direct inhibitor of caspase-3 and -7.Biochemistry. 2001 Jan 30;40(4):1117-23.Shriner DL, McCoy DK, Goldberg DJ, Wagner RF Jr. Mohs micrographic surgery.J Am Acad Dermatol. 1998 Jul;39(1):79-97.Singh H, Jain M, Sachan R, Mittal B. Association of TNFA (-308G>A) and IL-10 (-819C>T) promoter polymorphisms with risk of cervical cancer. Int J GynecolCancer. 2009 Oct;19(7):1190-4.Skov L, Allen MH, Bang B, Francis D, Barker JN, Baadsgaard O. Basal cellcarcinoma is associated with high TNF-alpha release but nor with TNF-alphapolymorphism at position--308. Exp Dermatol. 2003 Dec;12(6):772-6.Skov L, Hansen H, Allen M, Villadsen L, Norval M, Barker JN, Simon J,Baadsgaard O. Contrasting effects of ultraviolet A1 and ultraviolet B exposure onthe induction of tumour necrosis factor-alpha in human skin. Br J Dermatol. 1998Feb;138(2):216-20.Sorsa T, Tjäderhane L, Salo T. Matrix metalloproteinases (MMPs) in oraldiseases. Oral Dis. 2004 Nov;10(6):311-8.Sousa H, Breda E, Santos AM, Catarino R, Pinto D, Medeiros R. Genetic riskmarkers for nasopharyngeal carcinoma in Portugal: tumor necrosis factor alpha  -308G >A polymorphism. DNA Cell Biol. 2011 Feb;30(2):99-103. Epub 2010 Sep 28. Literatura 149 Soussi T, Ishioka C, Claustres M, Béroud C. Locus-specific mutation databases:pitfalls and good practice based on the p53 experience. Nat Rev Cancer. 2006Jan;6(1):83-90.Spates ST, Mellette JR Jr, Fitzpatrick J. Metastatic basal cell carcinoma. DermatolSurg. 2003 Jun;29(6):650-2.Sprague BL, Trentham-Dietz A, Garcia-Closas M, Newcomb PA, Titus-Ernstoff L,Hampton JM, Chanock SJ, Haines JL, Egan KM. Genetic variation in TP53 and risk ofbreast cancer in a population-based case control study. Carcinogenesis. 2007Aug;28(8):1680-6. Epub 2007 Apr 21. TTabor HK, Risch NJ, Myers RM. Candidate-gene approaches for studyingcomplex genetic traits: practical considerations. Nat Rev Genet. 2002May;3(5):391-7.Takeuchi S, Takeuchi N, Tsukasaki K, Bartram CR, Zimmermann M, Schrappe M,Taguchi H, Koeffler HP. Genetic polymorphisms in the tumour necrosis factor locusin childhood acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 2002 Dec;119(4):985-7. Tan XL, Nieters A, Hoffmeister M, Beckmann L, Brenner H, Chang-Claude J.Genetic polymorphisms in TP53, nonsteroidal anti-inflammatory drugs and therisk of colorectal cancer: evidence for gene-environment interaction?Pharmacogenet Genomics. 2007 Aug;17(8):639-45.Thomas GT, Lewis MP, Speight PM. Matrix metalloproteinases and oral cancer.Oral Oncol. 1999 May;35(3):227-33.Thornberry NA, Lazebnik Y. Caspases: enemies within. Science. 1998 Aug28;281(5381):1312-6. Literatura 150 Tilli CM, Van Steensel MA, Krekels GA, Neumann HA, Ramaekers FC. Molecularaetiology and pathogenesis of basal cell carcinoma. Br J Dermatol. 2005Jun;152(6):1108-24.Toledo F, Wahl GM. Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivoveritas. Nat Rev Cancer. 2006 Dec;6(12):909-23.Trifa F, Karray-Chouayekh S, Mabrouk I, Baccouche S, Khabir A, Sellami-Boudawara T, Gargouri A, Mokdad-Gargouri R. Haplotype analysis of p53polymorphisms: Arg72Pro, Ins16bp and G13964C in Tunisian patients withfamilial or sporadic breast cancer. Cancer Epidemiol. 2010 Apr;34(2):184-8. Epub2010 Mar 15.Tu HF, Wu CH, Kao SY, Liu CJ, Liu TY, Lui MT. Functional -1562 C-to-Tpolymorphism in matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) promoter is associatedwith the risk for oral squamous cell carcinoma in younger male areca users. J OralPathol Med. 2007 Aug;36(7):409-14.Turnpenny P.D.,Ellard S. (2009) Emerijevi Osnovi Medicinske Genetike, 13.Izdanje, Data Status, Beograd.Tyner SD, Venkatachalam S, Choi J, Jones S, Ghebranious N, Igelmann H, Lu X,Soron G, Cooper B, Brayton C, Park SH, Thompson T, Karsenty G, Bradley A,Donehower LA. p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotypes.Nature. 2002 Jan 3;415(6867):45-53. UUpadhyay R, Khurana R, Kumar S, Ghoshal UC, Mittal B. Role of survivin genepromoter polymorphism (-31G>C) in susceptibility and survival of esophagealcancer in northern India. Ann Surg Oncol. 2011 Mar;18(3):880-7. VVairaktaris E, Vassiliou S, Nkenke E, Serefoglou Z, Derka S, Tsigris C, Vylliotis A,Yapijakis C, Neukam FW, Patsouris E. A metalloproteinase-9 polymorphism which Literatura 151 affects its expression is associated with increased risk for oral squamous cellcarcinoma. Eur J Surg Oncol. 2008 Apr;34(4):450-5. Epub 2007 May 11.Vairaktaris E, Yapijakis C, Serefoglou Z, Avgoustidis D, Critselis E, SpyridonidouS, Vylliotis A, Derka S, Vassiliou S, Nkenke E, Patsouris E. Gene expressionpolymorphisms of interleukins-1 beta, -4, -6, -8, -10, and tumor necrosis factors-alpha, -beta: regression analysis of their effect upon oral squamous cell carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol. 2008 Aug;134(8):821-32. Epub 2008 Feb 14.Van den Steen PE, Dubois B, Nelissen I, Rudd PM, Dwek RA, Opdenakker G.Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9(MMP-9). Crit Rev Biochem Mol Biol. 2002 Dec;37(6):375-536.Vantuchova Y, Curik R. Histological tzpes of basal cell carcinoma. ScriptaMedica (Brno) 2006, 79:261-70. WWang YH, Chiou HY, Lin CT, Hsieh HY, Wu CC, Hsu CD, Shen CH. Associationbetween survivin gene promoter -31 C/G polymorphism and urothelial carcinomarisk in Taiwanese population. Urology. 2009 Mar;73(3):670-4. Epub 2008 Nov 26.Wang-Gohrke S, Weikel W, Risch H, Vesprini D, Abrahamson J, Lerman C,Godwin A, Moslehi R, Olipade O, Brunet JS, Stickeler E, Kieback DG, Kreienberg R,Weber B, Narod SA, Runnebaum IB. Intron variants of the p53 gene are associatedwith increased risk for ovarian cancer but not in carriers of BRCA1 or BRCA2germline mutations. Br J Cancer. 1999 Sep;81(1):179-83.Wang-Gohrke S, Becher H, Kreienberg R, Runnebaum IB, Chang-Claude J. Intron3 16 bp duplication polymorphism of p53 is associated with an increased risk forbreast cancer by the age of 50 years. Pharmacogenetics. 2002 Apr;12(3):269-72.Warzocha K, Bienvenu J, Ribeiro P, Moullet I, Dumontet C, Neidhardt-BerardEM, Coiffier B, Salles G. Plasma levels of tumour necrosis factor and its solublereceptors correlate with clinical features and outcome of Hodgkin's diseasepatients. Br J Cancer. 1998 Jun;77(12):2357-62. Literatura 152 Warzocha K, Ribeiro P, Bienvenu J, Roy P, Charlot C, Rigal D, Coiffier B, Salles G.Genetic polymorphisms in the tumor necrosis factor locus influence non-Hodgkin'slymphoma outcome. Blood. 1998 May 15;91(10):3574-81.Warzocha K, Ribeiro P, Renard N, Bienvenu J, Charlot C, Coiffier B, Salles G.Expression of genes coding for the tumor necrosis factor and lymphotoxin ligand-receptor system in non-Hodgkin's lymphomas. Cancer Immunol Immunother.2000 Nov;49(9):469-75.Weisz L, Oren M, Rotter V. Transcription regulation by mutant p53. Oncogene.2007 Apr 2;26(15):2202-11.Weng CJ, Hsieh YH, Chen MK, Tsai CM, Lin CW, Yang SF. Survivin SNP-carcinogen interactions in oral cancer. J Dent Res. 2012 Apr;91(4):358-63. Epub2012 Feb 8.Weston A, Pan CF, Ksieski HB, Wallenstein S, Berkowitz GS, Tartter PI,Bleiweiss IJ, Brower ST, Senie RT, Wolff MS. p53 haplotype determination in breastcancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1997 Feb;6(2):105-12.Whibley C, Pharoah PD, Hollstein M. p53 polymorphisms: cancer implications.Nat Rev Cancer. 2009 Feb;9(2):95-107.Wilson AG, di Giovine FS, Blakemore AI, Duff GW. Single base polymorphism inthe human tumour necrosis factor alpha (TNF alpha) gene detectable by NcoIrestriction of PCR product. Hum Mol Genet. 1992 Aug;1(5):353.Wikonkal NM, Brash DE. Ultraviolet radiation induced signature mutations inphotocarcinogenesis. J Investig Dermatol Symp Proc. 1999 Sep;4(1):6-10.Woelfelschneider A, Popanda O, Lilla C, Linseisen J, Mayer C, Celebi O, Debus J,Bartsch H, Chang-Claude J, Schmezer P. A distinct ERCC1 haplotype is associatedwith mRNA expression levels in prostate cancer patients. Carcinogenesis. 2008Sep;29(9):1758-64. Epub 2008 Mar 10. Literatura 153 Wong CS, Strange RC, Lear JT. Basal cell carcinoma. BMJ. 2003 Oct4;327(7418):794-8.World Health Organization. Skin cancers. Available from URL:http://www.who.int/uv/faq/ skincancer/en/print.html. [Accessed 2009September 14].Wu HC, Chang CH, Chen HY, Tsai FJ, Tsai JJ, Chen WC. p53 gene codon 72polymorphism but not tumor necrosis factor-alpha gene is associated withprostate cancer. Urol Int. 2004;73(1):41-6.Wu X, Zhao H, Amos CI, Shete S, Makan N, Hong WK, Kadlubar FF, Spitz MR. p53Genotypes and Haplotypes Associated With Lung Cancer Susceptibility andEthnicity. J Natl Cancer Inst. 2002 May 1;94(9):681-90. YYang L, Zhu H, Zhou B, Gu H, Yan H, Tang N, Dong H, Sun Q, Cong R, Chen G,Wang B. The association between the survivin C-31G polymorphism and gastriccancer risk in a Chinese population. Dig Dis Sci. 2009 May;54(5):1021-8. Epub2008 Aug 21.Yang X, Xiong G, Chen X, Xu X, Wang K, Fu Y, Yang K, Bai Y. Polymorphisms ofsurvivin promoter are associated with risk of esophageal squamous cell carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol. 2009 Oct;135(10):1341-9. Epub 2009 Apr 8.Younes F, Quartey EL, Kiguwa S, Partridge M. Expression of TNF and the 55-kDa TNF receptor in epidermis, oral mucosa, lichen planus and squamous cellcarcinoma. Oral Dis. 1996 Mar;2(1):25-31. ZZhang B, Henney A, Eriksson P, Hamsten A, Watkins H, Ye S. Genetic variation atthe matrix metalloproteinase-9 locus on chromosome 20q12.2-13.1. Hum Genet.1999 Nov;105(5):418-23. Literatura 154 Zhang B, Ye S, Herrmann SM, Eriksson P, de Maat M, Evans A, Arveiler D, Luc G,Cambien F, Hamsten A, Watkins H, Henney AM. Functional polymorphism in theregulatory region of gelatinase B gene in relation to severity of coronaryatherosclerosis. Circulation. 1999 Apr 13;99(14):1788-94.Zhao W, Liu H, Xu S, Entschladen F, Niggemann B, Zänker KS, Han R. Migrationand metalloproteinases determine the invasive potential of mouse melanoma cells,but not melanin and telomerase. Cancer Lett. 2001 Jan;162 Suppl:S49-S55.Zlatarova ZI, Softova EB, Dokova KG, Messmer EM. Expression of matrixmetalloproteinase-1, -9, -13, and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 in basalcell carcinomas of the eyelid. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2012Mar;250(3):425-31. Epub 2011 Sep 1.Zucker S, Hymowitz M, Conner C, Zarrabi HM, Hurewitz AN, Matrisian L, BoydD, Nicolson G, Montana S. Measurement of matrix metalloproteinases and tissueinhibitors of metalloproteinases in blood and tissues. Clinical and experimentalapplications. Ann N Y Acad Sci. 1999 Jun 30;878:212-27.Zúñiga J, Vargas-Alarcón G, Hernández-Pacheco G, Portal-Celhay C, Yamamoto-Furusho JK, Granados J. Tumor necrosis factor-alpha promoter polymorphisms inMexican patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Genes Immun. 2001Nov;2(7):363-6. 8. BIOGRAFIJA AUTORA Biografija autora 156 Diplomirani biolog Marija Kostić (rođ. Bošković) rođena je 12.04.1984.godine u Kraljevu. Biološki fakultet Univerziteta u Beogradu, studijska grupaBiologija, upisala je školske 2003/2004. godine. Diplomirala je 2008. godine nausmerenju Primenjena genetika sa prosečnom ocenom 9.82. Školske 2008/2009.godine upisala je doktorske studije na Biološkom fakultetu Univerziteta uBeogradu, modul Genetika. U periodu od 2009-2011. godine bila je stipendistaMinistarstva za nauku i tehnološki razvoj Republike Srbije u okviru projekata „Adaptivni značaj genetičkog polimorfizma populacija Drosophila“ (evidencioni broj143014, u periodu od 2009. do 2010. godine) i „Genetička kontrola i molekularni mehanizmi u malignim, inflamatornim i razvojnim patologijama orofacijalne regije”(evidencioni broj 175075, u period od 2010. do 2011. godine). Marija Kostić je u peroidu od 2006-2008. godine bila stipendista Fondacijeza razvoj talenata i naučnog podmlatka Republike Srbije, 2007. godine dobila jenagradu EFG banke za najbolje studente Srbije u okviru projekta „Investiramo uEvropske vrednosti”, iste godine dobila je nagradu “Najbolji najboljem Dr ZoranĐinđić” kao najbolji student na teritoriji opštine Vrnjačka Banja . Tokom školske 2009/2010. godine je kao student doktorskih studijaučestvovala u izvođenju praktične nastave na Katedri za genetiku i evolucijuBiološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Od oktobra 2011. godine je zaposlenana Fakultetu za hotelijerstvo i turizam u Vrnjačkoj Banji Univerziteta u Kragujevcu,kao asistent. Marija Kostić je do sada bila autor i koautor 3 naučne publikacija učasopisima međunarodnog značaja i 5 saopštenja na skupovima međunarodnogznačaja iz uže naučne oblasti. Uža naučna oblast interesovanja su: molekularna genetika kancera ihumana populaciona genetika. 9.PRILOZI Prilozi 158 Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Марија Костић ______________________ број индекса Б501/2008 _______________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Варијабилност гена укључених у инфламаторне, имуномодулаторне и апоптотске процесе као фактор ризика за настанак базоцелуларног карцинома главе и врата  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, ______25.10.2012._____ _________________________ Prilozi 159 Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора __Марија Костић__________________________________ Број индекса ______Б501/2008__________________________________________ Студијски програм ___Биологија, модул Генетика_________________________ Наслов рада Варијабилност гена укључених у инфламаторне, имуномодулаторне и апоптотске процесе као фактор ризика за настанак базоцелуларног карцинома главе и врата Ментор _Проф.др Марина Стаменковић-Радак, Проф.др Јелена Милашин______ Потписана _____Марија Костић____________________ Изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, _______25.10.2012.___ _________________________ Prilozi 160 Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Варијабилност гена укључених у инфламаторне, имуномодулаторне и апоптотске процесе као фактор ризика за настанак базоцелуларног карцинома главе и врата која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, ______25.10.2012.____________ _______________________________ Prilozi 161 1. Ауторство - Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце, чак и у комерцијалне сврхе. Ово је најслободнија од свих лиценци. 2. Ауторство – некомерцијално. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. 3. Ауторство - некомерцијално – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела. У односу на све остале лиценце, овом лиценцом се ограничава највећи обим права коришћења дела. 4. Ауторство - некомерцијално – делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца не дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. 5. Ауторство – без прераде. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, без промена, преобликовања или употребе дела у свом делу, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела. 6. Ауторство - делити под истим условима. Дозвољавате умножавање, дистрибуцију и јавно саопштавање дела, и прераде, ако се наведе име аутора на начин одређен од стране аутора или даваоца лиценце и ако се прерада дистрибуира под истом или сличном лиценцом. Ова лиценца дозвољава комерцијалну употребу дела и прерада. Слична је софтверским лиценцама, односно лиценцама отвореног кода.