UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Sanja S. Ćirković ISPITIVANJE SENZITIVNOSTI GENOMA KOD PACIJENATA SA BOLESTIMA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI doktorska disertacija Beograd, 2012 UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Sanja S. Ćirković GENOME SENSITIVITY IN PATIENTS WITH CHROMOSOMAL INSTABILITY DISORDERS doctoral dissertation Belgrade, 2012 MENTOR: Prof. dr Marija Guć-Šćekić Biološki fakultet u Beogradu ČLANOVI KOMISIJE: Prof. dr Jelena Milašin Stomatološki fakultet u Beogradu Prof. dr Branka Vuković-Gačić Biološki fakultet u Beogradu DATUM ODBRANE: 2012. DATUM PROMOCIJE: U medicinskoj genetici reč: nasleđe se uobičajeno koristi da označi poreklo neke bolesti... Ono na šta mene ova reč prvo asocira jeste znanje i povezanost među ljudima. U to ime najveću zahvalnost dugujem svom mentoru prof. dr Mariji Guć-Šćekić, bez čijeg bi znanja, zalaganja i podrške, ovaj rad ostao samo „dobra ideja za jednu disertaciju“. Posebno se zahvaljujem prof. dr Branki Vuković-Gačić, Karolini Sunjog i dr Tatjani Srdić na svesrdnoj pomoći u izradi rada, kao i prof. dr Jeleni Milašin na korisnim savetima i sugestijama. Ne znam drugi način kako da se zahvalim porodicama obolelih, njihovim lekarima, kao i svim kolegama iz NAŠE laboratorije (Maši, Daci, Nini, Marini i dr.) i kolegama iz Laboratorije Katedre za mikrobiologiju Biološkog fakulteta, sem jedno veliko, iskreno: HVALA!!! Rad posvećujem: tati Selimiru, mami Srbijanki, sestri Danijeli, sestričinama Jovani i Jeleni, i drugima... koji nisu sumnjali... Naslov: ISPITIVANJE SENZITIVNOSTI GENOMA KOD PACIJENATA SA BOLESTIMA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI Rezime: U cilju ispitivanja senzitivnosti genoma i potvrde klinički postavljene dijagnoze bolesti hromozomske nestabilnosti, korišćeni su uzorci dve grupe pacijenata sa kliničkom slikom: Fankonijeve anemije (FA) i Nijmegenovog sindroma nestabilnosti (NSN) (eng. Nijmegen Breakage syndrome, NBS). Specifična hipersenzitivnost ćelija obolelih od FA na diepoksibutan (DEB), odnosno kod obolelih od NSN na bleomicin (BLC), iskorišćena je u diferencijalno dijagnostičke svrhe. Studija je obuhvatila ukupno 100 pacijenata: 90/100 sa kliničkom slikom FA i 10/100 pacijenata sa kliničkim znacima NSN, koji su dijagnostikovani na Institutu za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Srbije „Dr Vukan Čupić“. U detekciji DEB-om indukovane hromozomske nestabilnosti obolelih od FA primenjene su standardne citogenetičke metode. Za potvrdu ili isključenje mozaičnog fenotipa FA korišćene su dodatne metode: analiza oštećenja DNK komet testom i protočno citometrijska analiza zastoja ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa. Hromozomska osetljivost ćelija obolelih od NSN je analizirana primenom bleomicinovog testa (BLC test). Molekularna analiza prisustva ili odsustva c.657_661del5 mutacije u NBN genu obolelih od NSN, urađena je korišćenjem modifikovane PCR metode uz analizu heterodupleksa. Kod 11,11% (10/90) pacijenata pod sumnjom da boluju od FA (FA grupa), otkrivena je povećana hromozomska osetljivost na DEB u odnosu na kontrolnu grupu (Mann-Whitneyev test: p < 0,05), dok su kod 3,33% (3/90) pacijenata dobijene granične vrednosti iste analize (FA* grupa). U cilju preciznijeg klasifikovanja pacijenata u FA grupi, primenjen je indeks hromozomske fragilnosti. Na ovaj način je u FA grupi, kod 40% (4/10) pacijenata otkriven ćelijski fenotip FA nemozaičnog tipa, dok je kod 60% (6/10) pacijenata dobijen mozaični odgovor na DEB. Kod svih pacijenata sa mozaičnim fenotipom FA, kao i kod dva pacijenta sa graničnim vrednostima diepoksibutanovog testa (DEB testa), daljim analizama primenom komet testa i analizom zastoja ćelija u G2 fazi, potvrđena je dijagnoza FA. U drugoj grupi od 10 bolesnika sa sumnjom da boluju od NSN analizirana je BLC-om indukovana hromozomska nestabilnost, koja je bila povećana kod 40% (4/10) pacijenata (NBS grupa). Kod 30% (3/10) pacijenata dobijeni rezultati su se preklapali sa rezultatima kontrolne grupe (ne-NBS grupa), dok je kod preostala tri pacijenta analiza bila neuspešna zbog slabog mitotskog indeksa. Molekularnim analizama je otkriveno homozigotno prisustvo c.657_661del5 mutacije u NBN genu kod sva četiri pacijenta iz NBS grupe, kao i kod tri pacijenta kod kojih je citogenetička analiza bila neuspešna, i tako potvrđena konačna dijagnoza NSN. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da su analize korišćene u ovoj studiji omogućile potvrdu klinički postavljene dijagnoze FA i NSN, što opravdava njihovu dalju primenu u diferencijalnoj dijagnostici ovih oboljenja. . Ključne reči: Fankonijeva anemija (FA), Nijmegenov sindrom nestabilnosti (NSN), diepoksibutan (DEB), bleomicin (BLC), hromozomska nestabilnost, citogenetika, komet test, analiza ćelijskog ciklusa, c.657_661del5 mutacija Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Medicinska genetika UDK broj: 575.113:575.224 (043.3) Title: GENOME SENSITIVITY IN PATIENTS WITH CHROMOSOMAL INSTABILITY DISORDERS Abstract: In order to determine the sensitivity of the genome and to confirm a clinical diagnosis of chromosomal instability disorders, blood samples from patients with clinical suspicion of Fanconi’s anemia (FA) and Nijmegen Breakage syndrome (NBS), were collected for chromosome fragility evaluation by the diepoxybutane (DEB) and bleomycin (BLC) tests. The study considered a total of 100 patients: 90/100 with the hematological and/or congenital phenotypic symptoms reminiscent of FA and 10/100 patients with clinical features of NBS, all diagnosed at the Mother and Child Health Care Institute of Serbia "Dr Vukan Čupić”. The DEB-induced chromosomal fragility analysis in patients with FA symptoms was carried out by using standard cytogenetic methods. The additional methods, such as: DNA damage analysis by comet assay and flow cytometric analysis of G2 phase cell cycle arrest, were used in order to confirm FA phenotype in patients with mosaic cytogenetic response to DEB. Chromosomal sensitivity of cells in patients with NBS symptoms was analyzed using a BLC test. Molecular analysis for the presence of the c.657_661del5 mutation in NBN gene in patients with NBS was carried out using modified PCR method and heteroduplex analysis on PAGE gel. In this study 11.11% (10/90) of patients with clinical suspicion of FA were found to have an increased chromosomal sensitivity to DEB (FA group), comparing to healthy controls (Mann-Whitney test: p < 0.05), while 3.33% (3/90) of patients showed borderline results of the same analysis (FA* group). The chromosome fragility index was used in order to provide a clear cut-off diagnostic level distinguishing FA mosaic from other patients in the FA group. In this group, 40% (4/10) of FA patients revealed non-mosaic FA phenotype, while the remaining 60% (6/10) of FA patients showed a mosaic response to DEB. In all of FA mosaic patients, and two patients with borderline DEB-sensitivity, further analyses were performed using comet assay and analysis of G2 phase cell cycle arrest, in order to confirm the diagnosis of FA. In the second group of 10 patients with clinical suspicion of NBS, the cytogenetic analysis revealed an increased chromosomal sensitivity to BLC in 40% (4/10) of them (NBS group). The BLC-induced chromosome fragility values in 30% (3/10) of these patients were overlapping those in the control group (non-NBS group). In the remaining of three patients the cytogenetic analysis was unsuccessful, due to the low mitotic index. Molecular analysis confirmed the presence of homozygous c.657_661del5 mutation in all seven NBS patients, including three patients with unsuccessful cytogenetic analysis, which confirmed the final diagnosis of NBS. Based on these results it can be concluded that the analyses used in this study are useful in confirmation of clinical diagnosis of FA and NBS, which justifies their further application in the differential diagnosis of these two diseases. . Keywords: Fanconi’s anemia (FA), Nijmegen Breakage syndrome (NBS), diepoxybutane (DEB), bleomycin (BLC), chromosomal fragility, cytogenetic, comet assay, cell cycle, c.657_661del5 mutation Scientific field: Biology / Medical genetics UDC number: 575.113:575.224 (043.3) SADRŽAJ 1. UVOD................................................................................................................................. 1 1.1. GENOM I HROMOZOMI................................................................................................... 1 1.2. ĆELIJSKI CIKLUS I HROMOZOMI ............................................................................... 2 1.3. POPRAVKA OŠTEĆENJA DNK ....................................................................................... 3 1.4. GENETIČKA NESTABILNOST I KANCER ................................................................... 5 1.5. BOLESTI HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI ........................................................... 6 1.5.1. VERNEROV SINDROM.............................................................................................................. 7 1.5.2. BLUMOV SINDROM .................................................................................................................. 8 1.5.3. KSERODERMA PIGMENTOZUM............................................................................................. 8 1.5.4. ICF SINDROM ............................................................................................................................. 9 1.5.5. ROBERTSOV SINDROM............................................................................................................ 9 1.5.6. ATAKSIJA-TELANGIEKTAZIJA ............................................................................................ 10 1.6. FANKONIJEVA ANEMIJA.............................................................................................. 10 1.6.1. KLINIČKE KARAKTERISTIKE FA......................................................................................... 11 1.6.2. HROMOZOMSKA NESTABILNOST KOD OBOLELIH OD FA .......................................... 12 1.6.3. MOLEKULARNA OSNOVA FA .............................................................................................. 12 1.6.4. PROTEINSKI KOMPLEKS FA – STRUKTURA I FUNKCIJA............................................... 14 1.6.5. DIJAGNOSTIKA FA.................................................................................................................. 16 1.6.5.1. Analiza hromozomske nestabilnosti ................................................................................... 17 1.6.5.2. Protočno citometrijska analiza ćelijskog ciklusa ................................................................ 18 1.6.5.3. Komet test za detekciju oštećenja DNK ............................................................................. 18 1.6.5.4. Komplementacione analize................................................................................................. 19 1.6.5.5. Mutacione analize u genima za FA..................................................................................... 20 1.6.6. TERAPIJA OBOLELIH OD FA................................................................................................. 20 1.7. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI ............................................................. 20 1.7.1. KLINIČKE KARAKTERISTIKE NSN ...................................................................................... 21 1.7.2. HROMOZOMSKA NESTABILNOST KOD OBOLELIH OD NSN ........................................ 22 1.7.3. MOLEKULARNA OSNOVA NSN............................................................................................ 23 1.7.4. NIBRIN PROTEIN – STRUKTURA I FUNKCIJA................................................................... 24 1.7.5. DIJAGNOSTIKA NSN............................................................................................................... 25 1.7.5.1. Analiza hromozomske nestabilnosti ................................................................................... 26 1.7.5.2. Protočno citometrijska analiza ćelijskog ciklusa ................................................................ 27 1.7.5.3. Molekularna analiza mutacija u NBN genu ........................................................................ 27 1.7.6. TERAPIJA OBOLELIH OD NSN.............................................................................................. 28 2. CILJEVI........................................................................................................................... 29 2.1. FANKONIJEVA ANEMIJA............................................................................................. 29 2.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI ............................................................ 30 3. MATERIJAL I METODE............................................................................................... 31 3.1. MATERIJAL....................................................................................................................... 31 3.2. METODE............................................................................................................................. 31 3.2.1. FANKONIJEVA ANEMIJA....................................................................................................... 31 3.2.1.1. Metode citogenetičke analize ............................................................................................. 31 3.2.1.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturi limfocita periferne krvi primenom DEB testa .................................................................................................................. 31 3.2.1.1.2. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturi fibroblasta kože primenom DEB testa ........................................................................................................................... 34 3.2.1.2. Analiza oštećenja DNK primenom komet testa .................................................................. 35 3.2.1.2.1. Izolacija i zamrzavanje mononuklearnih ćelija periferne krvi ................................... 36 3.2.1.2.2. Odmrzavanje i kultivacija mononuklearnih ćelija...................................................... 37 3.2.1.2.3. Metoda alkalnog komet testa ..................................................................................... 37 3.2.1.3. Protočno citometrijska metoda analize ćelijskog ciklusa ................................................... 39 3.2.1.3.1. Kultivisanje limfocita periferne krvi i priprema za analizu........................................ 40 3.2.1.3.2. Kultura fibroblasta kože i priprema za analizu .......................................................... 40 3.2.1.3.3. Analiza ćelijskog ciklusa............................................................................................ 41 3.2.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI........................................................................ 42 3.2.2.1. Metode citogenetičke analize ............................................................................................. 42 3.2.2.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturi limfocita periferne krvi primenom BLC testa .................................................................................................................. 42 3.2.2.2. Metode molekularne analize............................................................................................... 43 3.2.2.2.1. Izolacija DNK iz periferne krvi.................................................................................. 43 3.2.2.2.2. Detekcija c.657_661del5 mutacije ............................................................................. 44 4. REZULTATI.................................................................................................................... 46 4.1. FANKONIJEVA ANEMIJA.............................................................................................. 46 4.1.1. ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM DIEPOKSIBUTANOVOG TESTA........................................................................................... 46 4.1.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom FA primenom DEB testa ...................................................................... 46 4.1.1.1.1. Analiza DEB-om indukovane hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi............................................................................................................. 47 4.1.1.1.2. Analiza spontane hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi ............................................................................................................................ 55 4.1.1.2. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturama fibroblasta kože primenom DEB-ovog testa.................................................................................................................................... 56 4.1.1.2.1. Analiza hromozomske nestabilnosti primenom DEB testa na fibroblastima kože zdravih osoba ............................................................................................................ 56 4.1.1.2.2. Analiza hromozomske nestabilnosti primenom DEB testa na fibroblastima kože pacijenata sa mozaičnim tipom FA ........................................................................... 57 4.1.1.2.3. Analiza hromozomske nestabilnosti primenom DEB testa na fibroblastima kože graničnog FA* pacijenta ........................................................................................... 58 4.1.2. ANALIZA OŠTEĆENJA DNK PRIMENOM ALKALNOG KOMET TESTA ........................ 59 4.1.2.1. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita zdravih osoba........................................... 59 4.1.2.2. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita FA pacijenata ............................................ 60 4.1.2.3. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita FA* pacijenata .......................................... 62 4.1.2.4. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita ne-FA pacijenata ....................................... 62 4.1.2.5. Rezultati komet analize na limfocitima pacijenata sa kliničkom slikom FA ...................... 63 4.1.3. PROTOČNO CITOMETRIJSKA ANALIZA ĆELIJSKOG CIKLUSA .................................... 65 4.1.3.1. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturi limfocita periferne krvi ............................................... 65 4.1.3.1.1. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod zdravih osoba .................. 65 4.1.3.1.2. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod FA pacijenata................... 66 4.1.3.1.3. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod FA* pacijenata................. 67 4.1.3.1.4. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod ne-FA pacijenata.............. 68 4.1.3.1.5. Rezultati protočno citometrijske analize na limfocitima pacijenata sa kliničkom slikom FA.................................................................................................................. 69 4.1.3.2. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturi fibroblasta kože ........................................................... 71 4.1.3.2.1. Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod zdravih osoba ................ 71 4.1.3.2.2. Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod pacijenata sa mozaičnom formom FA ............................................................................................ 71 4.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI ............................................................ 73 4.2.1. ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM BLEOMICINOVOG TESTA....................................................................................................................................... 73 4.2.1.1. Rezultati analize BLC testom na limfocitima periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom NSN ....................................................................................................................... 73 4.2.2. ANALIZA PACIJENATA SA KLINIČKOM SLIKOM NSN PRIMENOM METODA MOLEKULARNE GENETIKE ................................................................................................ 75 4.2.2.1. Identifikacija homozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod pacijenata sa kliničkom slikom NSN ...................................................................................................... 75 4.2.2.2. Identifikacija heterozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod članova porodica obolelih od NSN................................................................................................................ 76 5. DISKUSIJA ..................................................................................................................... 77 5.1. FANKONIJEVA ANEMIJA.............................................................................................. 77 5.1.1.ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM DIEPOKSIBUTANOVOG TESTA....................................................................................................................................... 77 5.1.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi limfocita periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom FA ............................................................................ 78 5.1.1.1.1. Heterogenost odgovora na DEB: mozaicizam unutar FA grupe ................................ 80 5.1.1.1.2. Indeks indukovane fragilnosti hromozoma ............................................................... 82 5.1.1.1.3. Uticaj dužine trajanja indukcije DEB-om na hromozomsku nestabilnost kod pacijenata u FA i graničnoj FA* grupi ...................................................................... 84 5.1.1.2. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože ....... 84 5.1.1.2.1. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože zdravih osoba .................................................................................................... 85 5.1.1.2.2. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože pacijenata sa mozaičnim tipom FA................................................................... 85 5.1.1.2.3. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože graničnog FA* pacijenata ................................................................................. 86 5.1.2. ANALIZA OŠTEĆENJA DNK PRIMENOM ALKALNOG KOMET TESTA ........................ 86 5.1.2.1. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita zdravih osoba ........................................... 87 5.1.2.2. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita FA pacijenata ............................................ 88 5.1.2.3. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita graničnih FA* pacijenata .......................... 89 5.1.2.4. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita ne-FA pacijenata ....................................... 90 5.1.2.5. Prednosti analize komet testom u dijagnostici FA.............................................................. 90 5.1.3. PROTOČNO CITOMETRIJSKA ANALIZA ĆELIJSKOG CIKLUSA .................................... 91 5.1.3.1. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturama limfocita priferne krvi ............................................ 91 5.1.3.1.1. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa zdravih osoba ......................... 92 5.1.3.1.2. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa FA grupe................................. 92 5.1.3.1.3.Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa granične FA* grupe ................. 93 5.1.3.1.4. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa ne-FA grupe............................ 94 5.1.3.2. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturama fibroblasta kože...................................................... 95 5.1.3.2.1 Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa zdravih osoba........................ 95 5.1.3.2.2. Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa pacijenata sa mozaičnom formom FA................................................................................................................ 95 5.1.3.3. Značaj primene analize ćelijskog ciklusa u cilju potvrde fenotipa FA ............................... 96 5.1.4. ZNAČAJ ISPITIVANJA SENZITIVNOSTI GENOMA U DIJAGNOZI FA ............................ 96 5.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI ............................................................ 97 5.2.1. ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM BLEOMICINOVOG TESTA....................................................................................................................................... 97 5.2.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane BLC-om u kulturi limfocita periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom NSN ......................................................................... 98 5.2.2. ANALIZA PACIJENATA SA KLINIČKOM SLIKOM NSN PRIMENOM METODA MOLEKULARNE GENETIKE ................................................................................................ 99 5.2.2.1. Identifikacija homozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod pacijenata sa kliničkom slikom NSN ...................................................................................................... 99 5.2.2.2. Identifikacija heterozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod članova porodica obolelih od NSN................................................................................................................ 99 6. ZAKLJUČAK ................................................................................................................. 101 6.1. FANKONIJEVA ANEMIJA........................................................................................... 101 6.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI .......................................................... 103 7. LITERATURA ............................................................................................................... 104 11. UVOD Poznati nemački citolog Walther Flemming je još 1882.god, proučavajući ćelijsku deobu uočio izvesne jedarne strukture, čije je ponašanje pokušao da objasni vezujući ih za različite stupnjeve mitoze. Termin “hromozom1” uveden je šest godina kasnije od strane nemačkog anatoma Heinricha Waldeyera, a na osnovu specifičnog bojenja ovih struktura jedarnim bojama (Neitzel i Trimborn 2007). Od tada, pa sve do polovine 20. veka uslediće niz otkrića, kao što je linearan raspored osnovnih jedinica nasleđivanja (gena) duž hromozoma i dr, koja će u kombinaciji sa Mendelovim pravilima i citološkim saznanjima, činiti okosnicu hromozomske teorije nasleđivanja. Do 1953.god. bila je poznata funkcija i ponašanje genetičkog materijala ćelije, ali ne i njegova molekulska struktura. Naučnici James Watson i Francis Crick (1953) su opisujući helikoidnu strukturu deoksiribonukleinske kiseline (DNK) – osnove naslednog materijala, započeli novo poglavlje genetike – molekularnu genetiku. Pedesetih godina prošlog veka kao rezultat brojnih istraživanja, utvrđen je tačan broj hromozoma (Tjio i Levan 1956) i prvi put opisana aneuploidija kod čoveka (Lejeune i dr. 1959). Šezdesetih i sedamdesetih godina 20. veka dolazi do razvića novih tehnika in vitro kultivisanja ćelija kao i različitih tehnika citogenetike, među kojima su najvažnije bile: preparacija hromozoma iz in vitro kultivisanih limfocita (Nowell 1969), tehnike diferencijalnog bojenja hromozoma kao i niza drugih metoda kojima je napravljen je značajan pomak u ovoj oblasti. Naglim razvitkom citogenetike došlo se do novih saznanja o strukturi i funkciji hromozoma čoveka, što je u narednim godinama, zahvaljujući savremenoj citogenetičkoj dijagnostici dovelo do otkrića velikog broja hromozomskih sindroma. 1.1. GENOM I HROMOZOMI Poznato je da se u zavisnosti od sastava i broja ponavljanja sekvence u genomu čoveka mogu razlikovati dve vrste DNK: sekvence koje se nalaze u po jednoj kopiji 1 Hromozom - grčki: chromos što znači “boja” i soma što znači “telo” UVOD 2 (60%) i visoko repetativne sekvence (40%). Način pakovanja DNK u hromatin, odnosno hromozome je karakterističan za sve sisare, pa i za čoveka, i može se vizuelizovati na svetlosnom mikroskopu primenom tehnika bojenja hromozoma kao što su: G-, R-, Q- i C-traka (Holmquist 1992; Korenberg i Rykowski 1988). Hromatinski domeni su na osnovu razlika u AT/GC sastavu, prisustva repetitivnosti DNK sekvenci, vremena replikacije i genske aktivnosti podeljeni u euhromatinske i heterohromatinske regione (Neitzel i Trimborn 2007). G-, R- i Q-trake definišu euhromatin, koji predstavlja difuzan deo hromatina, svetlije obojen, koji uglavnom sadrži kodirajuće sekvence DNK, za razliku od heterohromatina koji je kondenzovan, boji se tamno, kasno se replicira, i ostaje neaktivan tokom transkripcije. U ćelijskom ciklusu čoveka postoji tačno definisan redosled u replikaciji ovih domena. Najpre se sintetišu euhromatinski, a zatim heterohromatinski regioni, što se može videti nakon inkorporacije sintetičkog timidina tokom S faze (Neitzel i Trimborn 2007). 1.2. ĆELIJSKI CIKLUS I HROMOZOMI Deobni ciklus većine eukariotskih ćelija čine četiri procesa: ćelijski rast, replikacija DNK, raspodela dupliciranih hromozoma ćerkama ćelijama i ćelijska deoba (Cooper 2007). Ćelijski ciklus (somatskih ćelija) kod čoveka deli se na dva osnovna dela: mitozu i interfazu. Mitoza (ćelijska deoba; M faza) predstavlja stadijum ćelijskog ciklusa kada dolazi do pakovanja i razdvajanja dupliciranog genetičkog materijala, a završava se deobom na dve ćerke ćelije (Cooper 2007). Period između dve mitoze naziva se interfaza, u kojoj su hromozomi dekondenzovani, i koja se sastoji iz tri faze: G1, S i G2 faze. Faza G1 je faza rasta ćelije sa povećanom metaboličkom aktivnošću, koja se ogleda u povećanju količine citoplazme, odnosno pripremi ćelije za duplikaciju DNK tokom S faze (Neitzel i Trimborn 2007). Ćelijski rast i aktivnosti vezane za pripremu ulaska u mitozu se nastavljaju u G2 fazi, tako da tokom M faze mogu nastati ćerke ćelije koje dobijaju replicirane hromatide (Neitzel i Trimborn 2007). Kako je za genetičke procese od presudne važnosti očuvanje hromozomskog integriteta u svim fazama ćelijskog ciklusa, postoji složena mreža kontrolnih tačaka UVOD 3 (eng. checkpoints) kojom se prati struktura hromozoma i koordinira progresija ćelijskog ciklusa, kao i popravka DNK i formiranje deobnog vretena (Neitzel i Trimborn 2007). Pod kontrolnim tačkama se podrazumevaju usklađene serije odgovora, koji odlažu prelazak u sledeću fazu ćelijskog ciklusa, ukoliko nisu ispunjeni odgovarajući uslovi za to. Ovo kašnjenje daje ćeliji vreme neophodno da popravi greške u molekulu DNK, pre nego uđe u deobu ili podlegne apoptozi (Clarke i Gimenez-Abian 2000; Hartwell i Weinert 1989; Hartwell i Kastan 1994; Nurse 1997; Morrison i Rieder 2004). Ulazak ćelije u mitozu se nalazi pod kontrolom strogo regulisane mreže kinaznih proteina, ciklina i fosfataznih proteina, kao što su: ciklin-zavisne kinaze (MPF2 i dr.) i APC3 kompleks koji promoviše anafazu (Pines i Rieder 2001). 1.3. POPRAVKA OŠTEĆENJA DNK Oštećenja na molekulu DNK mogu nastati pod uticajem različitih spoljašnjih i unutrašnjih faktora sredine, kao i usled grešaka u procesu replikacije. Ovakva oštećenja mogu dovesti do zastoja u ćelijskom ciklusu, programirane ćelijske smrti (apoptoza), ili se mogu fiksirati u mutacije, i dovesti do genetičkog oboljenja ili do razvoja kancera. Spontana stopa mutacija varira od vrste do vrste, a kod čoveka se procenjuje da iznosi oko 2 x 10-7 po genu po ćelijskoj deobi (Oller i dr. 1989). Sredinski agensi mogu delovati kao mutageni, tako da mogu uticati na povećanje frekvence javljanja mutacija. U neke od najpoznatijih agenasa spadaju: ultravioletno (UV) svetlo, jonizujuće zračenje (IR4) i razni drugi karcinogeni. Izlaganje sredinskim faktorima se može u manjoj ili većoj meri redukovati, za razliku od grešaka nastalih u procesu replikacije DNK ili oštećenja nastalih dejstvom normalnih produkata ćelijskog metabolizma i lipidne peroksidacije (Hisama i dr. 2003). Stoga je ćelija razvila mehanizme za popravku oštećenja DNK, kao jedan od glavnih izvora mutacija. 2 MPF – eng. Mitosis Promoting Factor – prev. mitozni-promovišući faktor 3 APC – eng. Anaphase Promoting Complex 4 IR – eng. Ionizing Radiation UVOD 4 U zavisnosti od vrste oštećenja na molekulu DNK, ćelija pokreće i različite mehanizme za njihovu popravku. Ukoliko je do lezije došlo samo na jednom lancu DNK, drugi lanac može poslužiti kao matrica za ispravku greške. Ponekad, zbog oštećenja nastalih u oba lanca, to nije moguće, pa se pribegava mehanizmima koji nisu tako precizni i skloni su greškama (eng. „error-prone“) (Hisama i dr. 2003). Detekcija oštećene DNK, od strane faktora uključenih u procese reparacije, zasniva se na promeni konfiguracionog statusa helikoidne strukture. Nakon prepoznavanja, sledi niz reakcija vezivanja i aktivacije drugih molekula, koji formiraju kompleks koji će omogućiti popravku (Hisama i dr. 2003). Prema vrsti DNK lezije i načinu ispravke, u mehanizme reparacije svrstavaju se:  direktna reverzija – ispravljanje pirimidinskih dimera (indukovani UV svetlom) i metilovanih guanina direktnim delovanjem enzima kao što su: fotoliaza, metil guanin metil transferaza (MGMT) i dr;  eksciziona reparacija – uklanjanje pojedinačno oštećene baze (bazna ekscizija (BER5)) ili nukleotida u okviru oligonukleotida (nukleotidna ekscizija (NER6));  reparacija pogrešno sparenih baza (MMR7) – ispravlja greške nastale tokom replikacije;  rekombinaciona reparacija – uključuje najmanje tri mehanizma kojima se popravljaju dvolančani prekidi, među- i unutarlančane DNK-unakrsne veze: mehanizam homologih rekombinacija, spajanje mikrohomologih krajeva i spajanje nehomologih krajeva;  mehanizmi tolerancije – ispravljanje lezija koje zaustavljaju replikaciju translalezijskom sintezom smanjene specifičnosti. 5 BER – eng. Base Excision Repair 6 NER – eng. Nucleotide Excision Repair 7 MMR – eng. Mismatch Repair UVOD 5 1.4. GENETIČKA NESTABILNOST I KANCER Pojam stabilnosti genoma se u prvim molekularno biološkim studijama pominje u kontekstu kancerogeneze, koja se objašnjava nagomilavanjem mutacija u genima odgovornim za očuvanje integriteta i stabilnosti genoma (Zhang 2004). Rasprava na temu genetičke nestabilnosti, kao potencijalnog uzročnika tumora kod čoveka, vodi se decenijama. Većina kancera se odlikuje nekom vrstom genomske nestabilnosti, ali je njeno prisustvo uočeno i u premalignim lezijama, tako da stepen ovih promena može imati dodatni prognostički značaj vezano za procese maligne transformacije (Lengauer i dr 1998; Tanic i dr. 2009). Ono što se sigurno zna je da se genetička nestabilnost u kancerima kod čoveka javlja na dva različita nivoa. U manjem procentu tumora primećena je genetička nestabilnost na nivou nukleotida, i odnosi se na promene u sekvenci: zamene baznih parova, delecije ili insercije. Kod većine drugih kancera prevalentna genetička nestabilnost koja se javlja je na nivou hromozoma (Lengauer i dr 1998). Pod hromozomskom nestabilnošću podrazumeva se dinamično stanje kontinuiranih hromozomskih alteracija, kako numeričkog tako strukturnog tipa, sa stopom učestalosti većom nego u normalnim ćelijama (Gisselsson 2001; Hittelman 2001; Lengauer i dr 1998). Promene u broju hromozoma mogu biti posledica abnormalne segregacije tokom ćelijske deobe i mogu uključivati niz poremećaja u regulaciji gena vezanih za nastanak aneuploidija, hipo- i poliploidija. Hromozomski prekidi i disfunkcionalne telomere mogu s druge strane dovesti do nastanka različitih strukturnih rearanžmana: delecija, duplikacija, inverzija, insercija, translokacija i dr. (Zhang 2004). S obzirom da sve ove promene u manjoj ili većoj meri mogu povećati stopu gubitka heterozigotnosti, koji je u čvrstoj sprezi sa karcinogenezom, od presudnog je značaja efikasnost mehanizama kontrole ćelijskog ciklusa, popravke DNK i sprečavanja akumulacije hromozomskih aberacija. Visok nivo hromozomskih prekida i aberacija, karakterističan za niz sindroma hromozomske nestabilnosti, jedan je od najvažnijih faktora u procesu maligne transformacije ćelija i razvoja tumora kod obolelih osoba (Zhang 2004). UVOD 6 1.5. BOLESTI HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI Bolesti hromozomske nestabilnosti čine grupu pojedinačno retkih i klinički vrlo heterogenih, ali genetički determinisanih oboljenja kao što su: Vernerov sindrom (eng. Werner’s syndrome), Rotmund-Tomsonov sindrom (eng. Rothmund-Thomson’s syndrome), Hučinson-Gilfordova progerija (eng. Hutchinson-Gilford’s progeria), Blumov sindrom (eng. Bloom’s syndrome), kseroderma pigmentozum (Xeroderma pigmentosum), Kokejnov sindrom (Cockayne’s syndrome), sindrom imunodeficijencije udružene sa nestabilnošću centromera i facijalnim anomalijama (ICF8), Robertsov sindrom (Roberts syndrome), diskeratozis kongenita (dyskeratosis congenita), Ataksija- Telangiektazija (Ataxia-Telangiectasia), Nijmegenov sindrom nestabilnosti (eng. Nijmegen Breakage syndrome), Fankonijeva anemija (eng. Fanconi’s anemia) i dr. (tabela 1) (Gordon i dr. 2011; Hisama i dr. 2003; Zhang 2004). Tabela 1. Bolesti hromozomske nestabilnosti. Oboljenje Osnovne kliničke karakteristike Predispozicija za razvoj kancera Naziv gena Vernerov sindrom prerano starenje, katarakta sarkom WRN Rotmund-Tomsonov sindrom promene na koži, telangijektazija osteosarkom RECQL4 Hačinson-Gilfordova progerija osteoporoza, ubrzano starenje - LMNA Blumov sindrom fotosenzitivnost leukemija, limfom, solidni tumori BLM Kseroderma pigmentozum fotosenzitivnost, mentalna retardacija kancer kože, maligni melanom XPA, XPB, XPC, XPD, XPE, XPF, XPG, XPV Kokejnov sindrom zastoj u rastu, neurodegeneracija - CS-A, CS-B ICF sindrom imunodeficijencija - DNMT3B Robertsov sindrom zastoj u rastu i razvoju - ESCO2 Diskeratozis kongenita promene u pigmentaciji kože Hodgkinov limfom DKC1 Ataksija- Telangiektazija neurodegeneracija leukemija ATM Nijmegenov sindrom nestabilnosti zastoj u rastu, imunodeficijencija limfom NBN Fankonijeva anemija kongenitalne anomalije, pancitopenija leukemija FANCA,-B,-C, BRCA2, FANCD2,-E,-F,-G,-I, BRIP1, -L,-M, PALB2, RAD51C i SLX4 8 ICF – eng. Immunodeficiency, Centromere instability and Facial anomalies UVOD 7 Osim povećane učestalosti spontanih, odnosno indukovanih prekida na hromozomima, zajedničke karakteristike ovih bolesti, su i da se nasleđuju uglavnom autozomno recesivno, kao i da oboleli imaju povišenu predisponiranost za razvoj malignih oboljenja (izuzetak su neki sindromi) (tabela 1). Iako su ove bolesti prvo opisane na osnovu kliničkih karakteristika, bez poznavanja mehanizama koji dovode do razvoja oboljenja, danas se zna da se u osnovi bolesti hromozomske nestabilnosti nalaze poremećeni mehanizmi popravke DNK, kontrole ćelijskog ciklusa ili apoptoze, koji mogu da dovedu do neoplastičnih procesa u ćeliji (Zhang 2004). 1.5.1. VERNEROV SINDROM Vernerov sindrom (MIM ID #277700) (VS) je oboljenje koje se klinički karakteriše sklerodermalnim promenama na koži, posebno ekstremitetima, kataraktom, muskularnom atrofijom i često se opisuje kao sindrom preranog starenja (Oshima 2003; Zhang 2004). Ostali klinički znaci ovog oboljenja kao što su: diabetes mellitus, hipogonadizam, osteoporoza, arteroskleroza, kao i sklonost ka neoplaziji, mogu da variraju. Međutim, glavni uzrok smrti pacijenata obolelih od VS (10%) jesu različiti oblici kancera, i to pre svega: maligni sarkomi, meningiomi i ostali karcinomi. Stopa spontanih hromozomskih prekida u ćelijama ovih pacijenata nije tako upečatljivo povećana, kao što je to slučaj kod ostalih bolesti ovog tipa, ali se u kulturama fibroblasta kože obolelih od VS mogu naći brojni hromozomski rearanžmani u vidu različitih translokacija. Takođe je primećena i znatno umanjena sposobnost ovih ćelija da se dele, u odnosu na kulture fibroblasta zdrave populacije, što je dovedeno u vezu sa smanjenom telomeraznom aktivnošću i skraćenjem telomera (Wyllie i dr. 2000). Gen odgovoran za nastanak VS je WRN gen lociran na kratkom kraku hromozoma 8 (8p12) i kodira DNK helikazni protein koji pripada RecQ familiji proteina, a koji igraju važnu ulogu u procesima popravke, rekombinacije, transkripcije i replikacije molekula DNK (Yu i dr. 1996). UVOD 8 1.5.2. BLUMOV SINDROM Blumov sindrom (MIM ID # 210900) (BS) je retko autozomno recesivno oboljenje čiju kliničku sliku čine: zastoj u rastu i razvoju, osetljivost na sunčeve zrake, promene u pigmentaciji kože, imunodeficijencija i sklonost za razvoj različitih tipova maligniteta, uključujući leukemije, limfome i solidne tumore (Hisama i dr. 2003; Zhang 2004). Simetrične formacije kvadriradijalnih hromozomskih struktura pre mitoze, jedna su od prvo uočenih manifestacija genetičke nestabilnosti u ćelijama pacijenata sa BS, nastale usled nejednake razmene delova hromatida u centromernom regionu homologih hromozoma. Ipak, najkarakterističnija citogenetička odlika ove bolesti je značajno povišena stopa razmena sestrinskih hromatida (SCE9) kako u limfocitima, tako i u drugim ćelijama obolelih (10 puta više SCE nego kod zdravih osoba) (Zhang 2004). U osnovi BS nalazi se BLM gen smešten na hromozomu 15 (15q26.1), koji nosi informaciju za sintezu proteina RecQL3, uključenog u procese reparacije i replikacije DNK tokom ćelijskog ciklusa, a posebno u formiranju sinaptonemalnog kompleksa i mejotičkih sinapsi (Ellis i dr. 1995; Walpita i dr. 1999). Mutacije u BLM genu uzrokuju gubitak enzimske funkcije RecQL3 helikaze, što narušava stabilnost kompleksa replikacione viljuške i izaziva povećanje stope rekombinacija (Karow i dr. 2000). Najčešća mutacija koja je identifikovana u populaciji Aškenazi Jevreja (98%) je delecija 6bp / insercija 7bp u egzonu 10 BLM gena (c.2207_2212del insTAGATTC), što je našlo primenu u molekularnoj dijagnostici i potvrdi ove bolesti (Ellis i dr. 1998; Sanz i German 2010). 1.5.3. KSERODERMA PIGMENTOZUM Kseroderma pigmentozum (KP) predstavlja autozomno recesivno oboljenje čiju kliničku sliku čine: zastoj u rastu i razvoju, osetljivost na sunčeve zrake, promene u pigmentaciji kože, imunodeficijencija i predispozicija za razvoj kancera (leukemije, 9 SCE – eng. Sister Chromatide Exchange UVOD 9 limfomi i solidni tumori) (Hisama i dr. 2003; Zhang 2004). Karcinomi skvamoznih i bazalnih ćelija u regionima izloženim sunčevim zracima čine 90% slučajeva neoplazmi pacijenata sa KP (Zhang 2004). KP se javlja sa učestalošću od oko 1:250 000 do 1:1000 0000 i do sada je otkriveno devet komplementacionih grupa (A, B, C, D, E, F, G, V i jedna grupa prethodno nazvana H), odnosno gena koji su lokalizovani i klonirani (Jaspers i dr. 2007; Kraemer i DiGiovanna 2012). Povećana stopa spontanih prekida nije uočena kod ovih pacijenata, ali je primećeno povećanje stope razmene sestrinskih hromatida nakon izlaganja UV zracima (Kraemer i Ruenger 2008). Naime, ćelije obolelih od KP zbog defektne DNK reparacije (NER) nisu u mogućnosti da adekvatno odgovore na oštećenja nastala UV zracima, tako da pribegavaju alternativnim putevima reparacije. 1.5.4. ICF SINDROM ICF sindrom je bolest imunodeficijencije udružene sa nestabilnošću centromera i facijalnim anomalijama. ICF sindrom predstavlja autozomno recesivno oboljenje, koje nastaje kao posledica mutacija u genu za DNK metiltransferazu 3B (DNMT3B) (Hansen i dr. 1999). Osnovna klinička obeležja ovog sindroma su: redukovan nivo imunoglobulina u serumu i dismorfija lica (hipertelorizam, makroglosija i dr.). Na citogenetičkom nivou u limfocitima periferne krvi uočljiva je dekondenzacija heterohromatina i formiranje multiradijalnih struktura u oblasti centromernog regiona hromozoma 1, 9 i 16, a na molekularnom nivou hipometilacija udružena sa nukleaznom hipersenzitivnošću i skraćenjem trajanja replikacije (Hansen i dr. 2000; Sumner i dr. 1998). 1.5.5. ROBERTSOV SINDROM Robertsov sindrom (RBS) karakteriše prisustvo kraniofacijalnih anomalija, kao i prenatalni i postnatalni zastoj u rastu sa različitim defektima ekstremiteta. Prerano razdvajanje centromera i dekondenzacija u centromernom regionu hromozoma 1, 9 i 16 su neke od najčešćih citogenetičkih anomalija koje se mogu uočiti u metafaznim UVOD 10 figurama kod oko 80% obolelih od RBS (Zhang 2004). ESCO2 gen je jedini gen koji se vezuje za ovu bolest (Vega i dr. 2005). 1.5.6. ATAKSIJA-TELANGIEKTAZIJA Ataksija-Telangiektazija (MIM ID # 208900) (A-T) je autozomno recesivno oboljenje sa cerebelarnom degeneracijom, telangijektazijama na koži, imunodeficijencijom, hromozomskom nestabilnošću, radiosenzitivnošću i predispozicijom za razvoj kancera. Pacijenti koji boluju od A-T najčešće razvijaju B- ćelijske limfome, leukemije T-ćelijskog tipa i solidne tumore, kao što su meduloblastomi i gliomi (Zhang 2004). Učestalost javljanja A-T iznosi oko 1:89 000 i može da varira od populacije do populacije (Swift i dr. 1986; Swift i dr. 1991). Gen čije mutacije vode nastanku ove bolesti nazvan je ATM gen i lociran je na dugom kraku hromozoma 11 (11q22.3), a kodira protein pod nazivom ATM kinaza. Ovaj protein je jedan od ključnih enzima u reparaciji dvolančanih prekida na molekulu DNK, koji učestvuje i u regrutovanju drugih proteina slične funkcije na mesta oštećenja, kao i u regulaciji ćelijskog ciklusa (Gatti 2010; Lavin 2008; Savitsky i dr. 1995). Spontani hromozomski prekidi, a pogotovu rearanžmani koji uključuju hromozome 7 i 14 se često mogu videti citogenetičkom analizom limfocita periferne krvi pacijenata sa A-T (Zhang 2004). X-zraci, kao i neki radiomimetici, kao što je bleomicin mogu povećati stopu fragilnosti hromozoma, čije uzroke treba tražiti u poremećenim procesima rekombinacija DNK. Pored prethodno spomenutih, u jedne od najčešćih bolesti hromozomske nestabilnosti ubrajaju se još: Fankonijeva anemija i Nijmegenov sindrom nestabilnosti. 1.6. FANKONIJEVA ANEMIJA Fankonijevu anemiju (FA) je 1927.god. prvi put opisao Guido Fanconi, kao oboljenje koje se karakteriše prisustvom makrocitoze, pancitopenije i kongenitalnih anomalija (Fanconi 1927). Naime, radi se o retkoj bolesti sa uglavnom autozomno UVOD 11 recesivnim načinom nasleđivanja (jedan redak oblik FA se nasleđuje X-vezano) i frekvencom javljanja od oko 1:360 000 živorođene dece (Swift 1971). U nekim populacijama kao što su Aškenazi Jevreji, Španski Romi i dr. učestalost heterozigotnih nosilaca je vrlo visoka i iznosi oko 1:67 (Callen i dr. 2005; Kutler i Auerbach 2004). 1.6.1. KLINIČKE KARAKTERISTIKE FA Osim različitih kongenitalnih anomalija i pancitopenije, koje su primećene ranije, kliničku sliku FA čine još i, insuficijencija kostne srži i povećan rizik za razvoj maligniteta (Alter i Kupfer 2011). Malformacije kao što su: nizak rast, promene u pigmentaciji kože poznatije pod nazivom: „mrlje bele kafe“ (fran. „café au lait“, eng. spots), anomalije palčeva na rukama ili palčeva i radijalnih kostiju, i niz drugih abnormalnosti koje uključuju skeletni, gonadalni, urinarni i dr. organske sisteme, mogu biti prisutne kod oko 60% - 75% obolelih od FA (slika 1) (Alter i Kupfer 2011). Slika 1. Pacijent oboleo od FA (izvor: Alter i Young 1993). Izrazita heterogenost simptoma FA i njihove ekspresije dodatno otežava postavljanje dijagnoze, a samim tim i otpočinjanje terapije ove teške bolesti. Naime, progresivno propadanje kostne srži sa pancitopenijom pacijenata obolelih od FA, obično počinje trombocitopenijom ili leukopenijom u prvoj dekadi života, da bi sa 40 - 50 godina oko 90% njih razvilo aplaziju kostne srži, 10% - 30% hematološke malignitete (akutnu mijeloidnu leukemiju) i 25% - 30% solidne tumore (glave, vrata, kože, UVOD 12 urogenitalnog trakta i dr.) (Alter i Kupfer 2011; Butturini i dr. 1994; Kutler i dr. 2003). Veliki broj pacijenata sa FA karakteriše prisustvo različitih poremećaja endokrinog sistema, u prvom redu nedostatak hormona rasta (53%), zatim hipotireoidizam (37%), dislipidemija (55%) i dr. (Wajnrajch i dr. 2001). 1.6.2. HROMOZOMSKA NESTABILNOST KOD OBOLELIH OD FA Pojava spontane hromozomske nestabilnosti u ćelijama obolelih od FA i autozomno recesivni način nasleđivanja, prvi put su prepoznati i opisani u literaturi od strane Tanie Schroeder, i to sredinom šezdesetih godina prošloga veka (Schroeder i dr. 1964; Schroeder 1966; Swift i Hirschhorn 1966). Schuler i saradnici su 1969.god. ispitivanjem ćelija ovakvih bolesnika došli do zaključka da se pod dejstvom alkilirajućih agenasa povećava njihova senzitivnost. Kasnije se do istog zaključka došlo vezano za radiosenzitivnost, kao i za veliki broj drugih DNK-unakrsno vezujućih jedinjenja (kofein, hloramfenikol, aktinomicin D, MMS, HN2, mitomicin C, DCMMC, MNNG, 4NQO, 8-metoksipsoralen) (Higurashi i Conen 1971; Sasaki i Tonomura 1973). Unakrsno-vezujući agensi reaguju sa molekulom DNK na dve različite pozicije, bilo u okviru istog ili na dva različita lanca, izazivajući prekide, koji ukoliko se ne poprave, mogu dovesti do zastoja ćelijskog ciklusa ili apoptoze. Hromozomska nestabilnost ćelija obolelih od FA ogleda se u povećanom prisustvu hromozomskih i hromatidnih prekida, dicentrika, ring-hromozoma, acentričnih fragmenata, a posebno radijalnih struktura nastalih putem inter- i intrahromatidnih razmena (Berger i dr. 1993). Posledice dejstva unakrsno-vezujućih agenasa u ćelijama FA, osim na citogenetičkom nivou, uočljive su i na molekularnom nivou. 1.6.3. MOLEKULARNA OSNOVA FA Prve komplementacione analize u hibridima ćelija sa hipersenzitivnim odgovorom na DNK-unakrsno-vezujuće agense, kod četiri pacijenta obolela od FA, pokazale su postojanje najmanje dve (Duckworth-Rysiecki i dr. 1985), odnosno četiri (Strathdee i dr. 1992a) komplementacione grupe ove bolesti. Identifikovan je i prvi gen FA koji je UVOD 13 pripadao komplementacionoj grupi C, i stoga dobio ime FACC (Strathdee i dr. 1992b), koje je kasnije promenjeno u FANCC. Hipotezu o postojanju većeg broja gena FA, koji kodiraju produkte jednog jedinog biohemijskog puta, podržalo je i otkriće drugog gena FA: FANCA (Lo Ten Foe i dr. 1996). Zatim, je usledio niz otkrića i drugih gena odnosno, komplementacionih grupa (poređane po abecednom redu): FA-B, FA-D1, FA- D2, FA-E, FA-F, FA-G, FA-I, FA-J, FA-L, FA-M, FA-N, FA-O i FA-P (tabela 2) (de Winter i dr. 2000; Joenje i dr. 1997; Joenje i dr. 2000; Joenje i Patel 2001; Kim i dr. 2011; Levitus i dr. 2004; Meetei i dr. 2003; Meetei i dr. 2004; Nagase i dr. 2000; Timmers i dr. 2001; Vaz i dr. 2010; Waisfisz i dr. 1999b; Xia i dr. 2007). Tabela 2. Komplementacione grupe i geni FA. Komplementaciona grupa Naziv gena Učestalost Lokacija gena FA-A FANCA 60%-70% 16q24.3 FA-B FANCB ~2% Xp22.3 FA-C FANCC ~14% 9q22.3 FA-D1 BRCA2 ~3% 13q12.3 FA-D2 FANCD2 ~3% 3p25.3 FA-E FANCE ~3% 6p22-p21 FA-F FANCF ~2% 11p15 FA-G FANCG ~10% 9p13 FA-I FANCI ~1% 15q25-q26 FA-J BRIP1 ~2% 17q22 FA-L FANCL ~0.2% 2p16.1 FA-M FANCM ~0.2% 16p12 FA-N PALB2 ~0.7% 14q21.3 FA-O RAD51C ~0.2% 17q22 FA-P SLX4 ~0.2% 16p13.3 Kao što se u tabeli 2. može videti, do sada je otkriveno ukupno 15 gena čiji produkti učestvuju u procesima reparacije DNK, u okviru biohemijskog puta, poznatog kao: FA/BRCA put ili put FA (eng. FA/BRCA pathway), kojim se reguliše ćelijska rezistentnost na DNK-unakrsno vezujuće agense (Taniguchi i D’Andrea 2006). Mutacije u nekom od ovih gena, kada se nađu u homozigotnom stanju (sem mutacija u FANCB genu, koje se ispoljavaju u hemizigotnom stanju zbog X-vezanog načina nasleđivanja) dovode do narušavanja puta FA i razvoja ćelijskih, odnosno kliničkih anomalija karakterističnih za ovu bolest (Garcia-Higuera i dr. 2001). Najveći broj UVOD 14 obolelih od FA pripada: FA-A (60% - 70%), FA-C (~14%) i FA-G (~10%) grupama, dok su ostale komplementacione grupe zastupljene u znatno manjem procentu (tabela 2) (Shimamura i Alter 2010). Pored većeg broja gena, genetičkoj heterogenosti ovog oboljenja, doprinosi i činjenica da postoji i veliki broj do sada detektovanih mutacija, različitog tipa. Ipak, za izvesne mutacije je ustanovljeno da se javljaju češće, i to u određenim populacijama:  mutacije u FANCA genu: c.1115_1118del i c.3788_3790del kod osoba poreklom iz Severne Evrope (Levran i dr. 1997; Morgan i dr. 1999; Wijker i dr. 1999),  mutacije u FANCC genu: c.345+4A>T u populaciji Aškenazi Jevreja, a c.1642C>T i c.67delG kod naroda Severne Evrope (Whitney i dr. 1993),  mutacije u FANCG genu: c.307+1G>C u Koreji i Japanu, c.925-2A>G u Brazilu, c.1480+1G>C u Kanadi, a c.1183-1192del i c.1480+1G>C mutacije u Severnoj Evropi (Demuth i dr. 2000; Nakanishi i dr. 2002). 1.6.4. PROTEINSKI KOMPLEKS FA – STRUKTURA I FUNKCIJA Osam proteina FA (FANCA, FANCB, FANCC, FANCE, FANCF, FANCG, FANCL i FANCM), zajedno sa još dva: FAAP24 (Ciccia i dr. 2007) i FAAP100 (Ling i dr. 2007) čine jedarni kompleks, koji se naziva proteinski kompleks FA (eng. FA core complex). Šematski prikaz modela, kojim se opisuje funkcija ovog kompleksa, a koji je vezan za reparaciju DNK putem homologih rekombinacija, prikazan je na slici 2. (Kennedy i dr. 2005; Thompson i dr. 2005). Naime, specifična oštećenja na molekulu DNK, pokrenuta bilo dejstvom alkilirajućih agenasa bilo unutarćelijskim faktorima (u S fazi), dovode do formiranja ubikvitin-ligaznog kompleksa FA, kojeg čine tri subkompleksa: FANCA-FANCG, FANCC-FANCE-FANCF i FANCB-FANCL-FAAP100 (Garcia-Higuera i dr. 2001). FANCL protein koji je po funkciji E3 ubikvitin-ligaza, vrši monoubikvitinaciju (dodavanje jednog molekula ubikvitina) FANCD2 i FANCI proteina u jedru, aktivirajući ih za dalji proces reparacije DNK u vidu FANCD2-I kompleksa (Garcia- Higuera i dr. 2001; Meetei i dr. 2005; Moldovan i D’Andrea 2009). UVOD 15 Slika 2. Šematski prikaz puta FA (izvor: Taniguchi i D’Andrea 2006). Monoubikvitinacija FANCD2-I proteina zauzima centralno mesto u biohemijskom putu FA. Na ovaj način je omogućena njihova interakcija sa molekulom DNK na mestu gde postoji oštećenje, zajedno sa FANCD1, FANCJ, FANCN i nizom drugih proteina uključenim u procese popravke DNK (Garcia-Higuera i dr. 2001; Moldovan i D’Andrea 2009). Iako, nije poznata tačna funkcija FANCD2-I kompleksa, prema dosadašnjim istraživanjima mnogobrojni proteini pokazuju zajedničko prisustvo sa FANCD2 proteinom (Moldovan i D’Andrea 2009). Neki od tih proteina su: ATR10 kinaza (Andreassen i dr. 2004), proteinske komponente homologih rekombinacija (RAD51, BRCA1, BRCA2) (Taniguchi i dr. 2002), proteini puta reparacije DNK spajanjem nehomologih krajeva (NHEJ11) (Nakanishi i dr. 2002; Pichierri i dr. 2004), BLM helikaza i delimično ostali proteini FA (FANCE, FANCC, FANCJ) (Pace i dr. 10 ATR – eng. Ataxia Telangiectasia and Rad3-related 11 NHEJ – eng. Non-Homologous End-Joining UVOD 16 2002; Taniguchi i D’Andrea 2006). FANCM može da se veže direktno za molekul DNK, slično kao FANCJ i FANCD1, koji nisu neophodni u procesu monoubikvitinacije FANCD2 (Ciccia i dr. 2007; Park i dr. 2005). Poznato je da je ATR kinaza, takođe neophodna za izmeštanje i monoubikvitinaciju FANCD2. Aktivacija FANCD2 proteina zavisi pre svega od celovitosti strukture i funkcije kompleksa FA, ali i od prisustva drugih činilaca mehanizama reparacije, kao što je nibrin, čime se implicira regulatorna povezanost kompleksa MRE11/RAD50/nibrin sa proteinima FA i učešće u NHEJ reparaciji (Anderssen i dr. 2004; Nakanishi i dr. 2002). 1.6.5. DIJAGNOSTIKA FA Specifična hipersenzitivnost ćelija FA na DNK-unakrsno-vezujuće mutagene, kao što su: diepoksibutan (DEB), mitomicin C (MMC) i dr, iskorišćena je u diferencijalnoj dijagnozi ove bolesti, u vidu testova za detekciju hromozomske nestabilnosti, ali i za detekciju zastoja ćelija FA u G2 fazi ćelijskog ciklusa. Poligenska osnova FA, kao i veliki broj različitih mutacija, dodatno otežavaju potvrdu ovog oboljenja na molekularnom nivou. Stoga citogenetička analiza fragilnosti hromozoma indukovane DEB-om ili MMC-om, pre svega u kulturama limfocita periferne krvi, predstavlja „zlatni standard“ u inicijalnom skriningu ćelijskog fenotipa FA kod pacijenata sa kliničkom slikom ove bolesti. Kod pacijenata sa povećanom osetljivošću ćelija na DNK-unakrsno-vezujuće agense indikovano je sprovođenje komplementacione analize u cilju identifikacije mutiranog gena FA, kao i identifikacija mutacije/mutacija (mutacione analize, analiza sekvence). U pojedinim slučajevima citogenetička analiza na limfocitima, nakon tretmana može da pokaže postojanje dve populacije ćelija: ćelije sa hromozomskim aberacijama i ćelije bez hromozomskih aberacija, i ta pojava se naziva somatski mozaicizam. Kod ovakvih pacijenata, kao i kod pacijenata sa negativnim rezultatom citogenetičkog testa, a kod kojih više kliničkih parametara ukazuje na FA, neophodno je uraditi dodatne analize na istom, odnosno još jednom tkivu pacijenta, u cilju potvrde ili isključenja mozaika. UVOD 17 1.6.5.1. Analiza hromozomske nestabilnosti Analiza fragilnosti hromozoma je citogenetički test koji je zbog svoje jednostavnosti našao široku primenu u dijagnostici genetički vrlo heterogenih naslednih oboljenja. FA je jedna od ovih bolesti, kod kojih broj spontano nastalih hromozomskih aberacija može veoma da varira, tako da na osnovu ovog parametra često nije moguće postaviti dijagnozu FA. U tu svrhu se koriste specifični mutageni, kao napr. DEB ili MMC, koji mogu da indukuju povećanje stope hromozomskih promena i do nekoliko desetina puta (Wegner i Stumm 1999). Hromozomske aberacije koje se javljaju u ćelijama FA najčešće su po tipu: hromozomskih i hromatidnih prekida, acentričnih fragmenata, dicentrika, ring-hromozoma i dr, a posebno je zapaženo prisustvo radijalnih hromozomskih struktura, nastalih razmenama između i unutar hromozoma, odnosno hromatida. DEB je bifunkcionalni alkilirajući agens, koji može da indukuje formiranje monoalkilovanih produkata DNK, kao i DNK-unakrsnih veza, koje podrazumevaju unakrsne veze tipa: DNK-DNK i DNK-protein (Wen i dr. 2011). Zdrave ćelije izložene dejstvu DEB-a, ispravljaju oštećenja nastala na molekulu DNK, posredstvom mehanizama reparacije (homologe rekombinacije), dok u ćelijama FA to nije moguće. Upravo iz ovih rszloga pacijenti oboleli od FA mogu imati i do nekoliko desetina puta veći broj hromozomskih aberacija u kariotipu, nakon indukcije DEB-om. U 15% - 20% pacijenata obolelih od FA na jednom od stupnjeva hematopoeze dolazi do reverzije mutacije, što će rezultirati u pojavi određenog procenta limfocita bez hromozomskih aberacija u perifernoj krvi (Auerbach i Alter 1989) ovakvih bolesnika. Somatski mozaicizam je pojava koja se vezuje i za druge bolesti hematopoetskih tkiva, a ne samo za FA. Mozaični fenotip FA se može dijagnostikovati diepoksibutanovim testom (DEB test) na limfocitima periferne krvi, a proveriti ponavljanjem ovog testa na fibroblastima kože kod ovakvih pacijenata (Lo Ten Foe i dr. 1997; Soulier i dr. 2005). UVOD 18 1.6.5.2. Protočno citometrijska analiza ćelijskog ciklusa Proučavajući limfocite FA, Dutrillaux i dr. (1982) su uočili da postoji izvestan poremećaj u njihovom ćelijskom ciklusu u odnosu na zdrave ćelije, odnosno da u G2/M fazi ima oko dva puta više FA ćelija i da im je ciklus sporiji, u poređenju sa kontrolama. Pojava spontanog zastoja ćelija obolelih od FA, u G2/M fazi, koji je mogao biti indukovan dejstvom DNK-unakrsno vezujućih agenasa, je našla primenu u dijagnostici FA (Fabio i dr. 2000; Kaiser i dr. 1982; Kubbies i dr. 1985; Miglierina i dr. 1991). Protočno citometrijskom analizom moguće je detektovati ćelije kojima je zbog nemogućnosti ispravke oštećenja DNK, posredstvom različitih regulatornih mehanizama, odložen prelazak iz G2 u M fazu ćelijskog ciklusa (Schindler i Hoehn 1999). Ovom metodom se relativno brzo može analizirati veliki broj ćelija, ali je ona ponekad nedovoljno precizna (Schindler i Hoehn 1999). 1.6.5.3. Komet test za detekciju oštećenja DNK Ostling i Johanson (1984) su bili prvi koji su primenili metod mikrogel- elektroforeze za potrebe merenja jednolančanih prekida na molekulu DNK, koji je kasnije modifikovan (alkalni uslovi) (Singh i dr. 1988) i označen kao „gel elektroforeza pojedinačnih ćelija“ (SCGE12). Metod se zasniva na kombinaciji dva svojstva DNK: različita elektroforetska pokretljivost u zavisnosti od veličine molekula i mogućnost vizuelizacije DNK na gelu (obeležavanje fluorescentnim bojama). Tokom kratke elektroforeze kojoj su bile izložene pojedinačne ćelije u agaroznom mikrogelu, oštećeni fragmenti negativno naelektrisanog molekula DNK, su putovali brže, odnosno brže migrirali ka anodi, u odnosu na neoštećenu DNK. Ova pojava se mogla videti pod fluorescentnim mikroskopom, nakon bojenja, gde je bilo moguće kvantifikovati relativnu količinu oštećene DNK koja je migrirala, u svakoj ćeliji ponaosob. Metod je modifikovan 1990.god od strane Olive i saradnika i preimenovan u analizu „kometa“ (eng. Comet Assay) zbog vizuelnog efekta DNK (Olive 1989; Olive i dr. 1990). Naime, „glava“ komete koja se sastojala iz kompaktne, neoštećene DNK veće molekulske mase 12 SCGE – eng Single Cell Gel Electrophoresis UVOD 19 i „rep“ komete kojeg su činili migrirajuću fragmenti, mogli su biti zabeleženi (putem digitalnih slika) i mereni korišćenjem softvera, koji je razvijen posebno u tu svrhu (Olive i dr. 1990; Olive i Banáth 2006). Kombinacijom dva parametra: relativna količina DNK u repu i dužina repa, dobijen je moment repa (engl. Tail Moment), kojim se uobičajeno kvantifikuju oštećenja na molekulu DNK (Olive i dr.1990). S obzirom na to da je potrebno svega nekoliko hiljada ćelija za analizu i da je moguće meriti oštećenje u bilo kojoj vrsti ćelija sa jedrom, komet test se široko primenjuje (Müller 2007), pogotovu za merenje genotoksičnog dejstva različitih agenasa na molekul DNK (Olive i Banáth 2006). Alkalnim komet testom moguće je detektovati kako jednolančane, tako i dvolančane prekide i dr. oštećenja DNK. Jonizujućim zračenjem ili delovanjem unakrsno-vezujućih agenasa, moguće je indukovati oštećenja u ćelijama FA, koja su, u odnosu na kontrolne uzorke, znatno veća, a zatim meriti količinu oštećenosti, odnosno efikasnost mehanizama popravke DNK (Djuzenova i dr. 2001; Mohseni-Meybodi i dr. 2009; Olive i Banáth 2006). Prednosti komet testa su: jednostavna, laka i brza primena u detekciji oštećenja u svim fazama ćelijskog ciklusa (ne samo tokom deobe), bez prethodnog kultivisanja ćelija. Međutim, ova metoda ima izvesna ograničenja koja podrazumevaju uticaj drugih faktora na rezultate analize, kao što su godine ispitanika, zagađenje životne sredine i dr. (Moller i dr. 2000; Moller 2006; Müller 2007). 1.6.5.4. Komplementacione analize Genetička subtipizacija, odnosno determinacija komplementacione grupe FA obično se sprovodi korišćenjem analize reverznog ćelijskog fenotipa (senzitivnost na MMC ili analiza zastoja u G2 fazi), dobijenog nakon uvođenja kopije „zdravog“ gena FA u ćelije obolelog pacijenta, putem retroviralnih vektora (Casado i dr. 2007; Chandra i dr. 2005; Hanenberg i dr. 2002). U nekim slučajevima, u dijagnostičke svrhe se može koristiti i „Western blot“ (WB) analiza ekspresije odgovarajućeg gena ili analiza monoubikvitiranog FANCD2 proteina, u cilju otkrivanja uzroka defektne funkcije proteinskog kompleksa FA (Pilonetto i dr. 2009; Soulier i dr. 2005). WB analiza kod obolelih od FA može da utvrdi nedostatak monoubikvitinirane forme FANCD2 ili potpuno odsustvo FANCD2 proteina, što daje neophodne informacije vezane za UVOD 20 pojedine komplementacione grupe. Važno je napomenuti da ova analiza ima izvesna ograničenja (ne mogu se detektovati pacijenti koji pripadaju FA-D1, FA-J i FA-N grupama), zbog čega se preporučuje njeno korišćenje u dijagnostičke svrhe, isključivo uz upotrebu citegenetičkih, citometrijskih i drugih molekularnih testova. 1.6.5.5. Mutacione analize u genima za FA Komplementacionu grupu kod obolelog od FA, moguće je odrediti i analizom mutacija koje se češće javljaju u određenim populacijama (Ameziane i dr. 2008). Mutacione analize su neophodne kako za subtipizaciju pacijenta, tako i za konačnu potvrdu dijagnoze FA (Chandra i dr. 2005). S obzirom na veliki broj komplementacionih grupa i još veći broj različitih mutacija u genima za FA, u upotrebi je nekoliko tehnika molekularne genetike. Za detekciju mutacija u vidu amplifikacija kodirajućih sekvenci obično se koristi tehnika denaturišuće visokoperformantne tečne hromatografije (DHPLC13), dok se detekcija velikih delecija obično vrši primenom tehnike amplifikacije multipnih ligand-zavisnih proba (MLPA14) (Alter 2008). 1.6.6. TERAPIJA OBOLELIH OD FA Terapija pacijenata sa FA se zasniva na lečenju simptoma bolesti i usmerena je na popravljanje funkcije kostne srži. Najviše korišćena za suzbijanje simptoma bolesti je androgena terapija (Diamond i Shahidi 1967; Shahidi i Diamond 1961), dok je transplantacija kostne srži jedina terapija kojom je moguće izlečiti ovakve pacijente. U tom smislu je od presudnog značaja brzo i precizno postavljanje dijagnoze FA kod obolelih još u dečijem uzrastu, odnosno pre nego se razviju teški znaci bolesti. 1.7. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI Nijmegenov sindrom nestabilnosti (NSN) (eng. Nijmegen Breakage syndrome) (MIM ID # 210900) je retko autozomno recesivno oboljenje čija učestalost varira i 13 DHPLC – eng. Denaturing High Performance Liquid Chromatography 14 MLPA – eng. Multiple Ligation-dependent Probe Amplification UVOD 21 kreće se od 1:95 000 do 1:100 000, zavisno od populacije (Concannon i Gatti 2011). Ovo oboljenje je prvi put opisao naučnik C.M. Weemaes 1981.god i do danas je njegova incidenca ostala nepromenjena, mada najveći broj opisanih slučajeva u literaturi potiče iz Poljske i Češke (Chrzanowska i dr. 1995; Digweed i Sperling 2004; Weemaes i dr. 1981). 1.7.1. KLINIČKE KARAKTERISTIKE NSN Najčešće fenotipske odlike NSN su prisustvo progresivne mikrocefalije, intrauterini i postnatalni zastoj u rastu i razvoju, nizak rast, rekurentne sinopulmonarne infekcije, kao i veoma povećana predispozicija za razvoj malignih tumora limfnog sistema. Jedna od karakterističnih stigmata ove bolesti je i hipoplazija donje vilice ovih pacijenata, koja se opisuje kao „lice ptičijeg izgleda“, a osim mikrocefalije mogući su i poremećaji u pigmentaciji kože, ovarijalna disgeneza i druge kongenitalne anomalije (slika 3) (Concannon i Gatti 2011). Slika 3. Pacijent oboleo od NSN (izvor: Chrzanowska i Janniger 2012). Česte plućne infekcije kod obolelih od NSN povezane su sa izraženom imunodeficijencijom, kako ćelijskog tako i humoralnog tipa. Kod oko trećine pacijenata javlja se agamaglobulinemija, a smanjen je i procenat CD3+ i CD4+ T-ćelija, koje su UVOD 22 uglavnom otporne na dejstvo mitogena (fitohemoaglutinin), kod većine bolesnika (Digweed i Sperling 2004; Hiel i dr. 2000). Za pacijente NSN je karakteristično prisustvo spontane, ali i indukovane hromozomske nestabilnosti, sa izraženom osetljivošću na jonizujuće zračenje, kao i povećanim rizikom za razvoj kancera limfnog sistema (non-Hodgkinov limfom, limfomi T-ćelija, meduloblastomi, rabdomiosarkomi, akutna limfoblastna leukemija i dr.) (Digweed i Sperling 2004). 1.7.2. HROMOZOMSKA NESTABILNOST KOD OBOLELIH OD NSN Pacijenti oboleli od NSN imaju približno dva puta veću osetljivost na jonizujuće zračenje u odnosu na zdrave ljude (van der Burgt i dr. 1996; Weemaes i dr. 1981). Ćelijska hipersenzitivnost NSN se takođe odnosi i na izlaganje različitim radiomimetičkim agensima, kao što su: bleomicin, streptonigrin, etopozid i dr, kao i DNK-unakrsno vezujućim agensima (mitomicin C i dr.) (Nove i dr. 1986; Kraakman- van der Zwet i dr. 1999; Sullivan i dr. 1997). Dejstvo ovih faktora se zasniva na produkciji dvolančanih prekida, putem različitih mehanizama, koje ove ćelije nisu u mogućnosti da isprave. Indukovanje dvolančanih prekida dovodi do zastoja u nekoj od faza ćelijskog ciklusa, koji se ogleda u odlaganju prelaska u narednu fazu, što je regulisano kontrolnim tačkama u ćelijskom ciklusu. Pored toga, značajna karakteristika ćelijskog fenotipa NSN je i redukovana inhibicija sinteze DNK nakon jonizujućeg zračenja, pojava poznata pod imenom „radiorezistentna sinteza DNK“ (RDS) (Houldsworth i dr. 1980; Taalman i dr. 1983). Spontana hromozomska nestabilnost u T-limfocitima obolelih od NSN ogleda se u prisustvu čestih rearanžmana između hromozoma 7 i 14, i to u 10% - 50% metafaza, u regionima gde su locirani geni za imunoglobuline i T-ćelijski receptor: 7p13, 7q35, 14q11 i 14q32 (Chrzanowska i dr. 1995; Concannon i Gatti 2011; van der Burgt i dr. 1996). Kulture limfocita ovakvih pacijenata pokazuju povećanu učestalost hromatidnih i hromozomskih prekida, dicentrika i drugih aberacija, u odnosu na normalne ćelije, što se nakon dejstva mutagenih agenasa višestruko uvećava. UVOD 23 1.7.3. MOLEKULARNA OSNOVA NSN Metodom pozicionog kloniranja 1998.god. mapiran je gen na dugom kraku hromozoma 8 (8q21.3), čija mutacija dovodi do nastanka NSN. Ovaj gen je ubrzo po otkrivanju nazvan NBS1 (Varon i dr. 1998), ali kada je ustanovljeno da je ovo jedini gen koji se vezuje za NSN, ime gena je preinačeno u NBN gen (Concannon i Gatti, 2011). NBN gen čine 16 egzona i oko 50 kb genomske DNK. Analize su pokazale da NBN gen nosi informaciju za dve vrste iRNK: od 2,4 i 4,4 kb (Carney i dr. 1998; Varon i dr. 1998). U ovarijumu i testisima otkriven je povećan nivo 2,4-kb-iRNK što je ukazivalo na moguću ulogu ovog gena u mejotičkim rekombinacijama (Carney i dr. 1998; Matsuura i dr. 1998; Varon i dr. 1998). Protein, kodiran od strane NBN gena sastoji se od 754 aminokiseline sa dva domena karakteristična za proteine kontrolnih tačaka ćelijskog ciklusa (karboksi-terminalni i fosfopeptid-prepoznajući domen) i naziva se nibrin. Iste godine kad je grupa naučnika na čelu sa R.Varon klonirala NBS1 gen, jedna druga grupa istraživača (Carney i dr. 1998) otkrila je gen koji kodira protein reparacionog kompleksa dvolančanih prekida (MRE11/RAD50) prethodno označen kao p95. Poređenjem komplementarnih DNK p95 i NBS1 došlo se do zaključka da su istovetni (Carney i dr. 1998; Varon i dr. 1998). Molekularne analize pacijenata obolelih od NSN su pokazale da je delecija 5 bp u egzonu 6 (c.657_661del5) (tabela 3), najčešća mutacija u NBN genu, čije homozigotno prisustvo uzrokuje ispoljavanje bolesti kod čak > 90% bolesnika slovenskog porekla (Poljska, Češka, Rusija, Ukrajina i dr.) (Matsuura i dr. 1998; Resnick i dr. 2003; Tekin i dr. 2002; Varon i dr. 1998). Manji broj ovih pacijenata su složeni heterozigotni nosioci za c.657_661del5 i neku drugu mutaciju, a još je ređa pojava da su homozigotni nosioci drugih retkih mutacija (Concannon i Gatti 2011). Kod obolelih iz Sjedinjenih Američkih Država (SAD) c.657_661del5 mutacija je u 70% slučajeva prisutna u homozigotnom stanju, dok se u 15% javlja u kombinaciji sa drugim retkim mutacijama, koje se u homozigotnom stanju nalaze kod preostalih 15% bolesnika (tabela 3) (Concannon i Gatti 2011; Warcoin i dr. 2009). Razlog visoke učestalosti c.657_661del5 mutacije u populacijama Slovena leži u poreklu ove populacione grupe (prisustvu mutacije u UVOD 24 osnivačkoj populaciji slovenske grupe naroda i efektu osnivača) (Concannon i Gatti 2011). Tabela 3. Mutacije u NBN genu. Mutacija Egzon Promena aminokiseline u proteinu Broj porodica sa obolelim od NSN – poreklo c.330T>G 4 p.Tyr110X 1 c.643C>T 6 p.Arg215Trp 1 - Češko c.657_661del5 (657del5) 6 p.Lys219AsnfsX15 >90% - Slovensko c.681delT 6 p.Phe228LeufsX3 1 - Rusko c.698_701del4 6 p.Lys233SerfsX4 2 - Englesko c.741_742dup (742insGG) 7 p.Glu248GlyfsX5 1 - Italijansko c.835_838del4 7 p.Gln279ProfsX1 1 - Italijansko c.842insT 7 p.Leu281PhefsX3 1 - Meksičko c.900del25 8 p.Gly301LysfsX5 1 - Marokansko c.976C>T 8 p.Gln326X 1 - Dansko c.1089C>A 9 p.Tyr363X 3 - Pakistansko c.1125G>A 10 p.W375X 1 c.1142delC 10 p.Pro381GlnfsX22 2 - Kanadsko 1.7.4. NIBRIN PROTEIN – STRUKTURA I FUNKCIJA Nibrin (p95) je protein koji se sastoji od 754 aminokiseline i eksprimira se u svim tkivima (Concannon i Gatti 2011). Na svom N-terminalnom kraju nibrin sadrži dva domena: domen koji služi za prepoznavanje fosfopeptida (FHA15) i domen koji je zajedno sa prethodnim uključen u procese regulacije ćelijskog ciklusa (BRCT16) (Dong i dr 1999). Naime, nibrin predstavlja deo MRE11-RAD50-nibrin proteinskog kompleksa koji igra važnu ulogu u prepoznavanju i popravci dvolančanih prekida DNK, a čije odsustvo ima letalni efekat (Hisama i dr. 2003). 15 FHA – eng. „forkhead associated“ 16 BRCT – eng. „breast cancer carboxy-terminal“ UVOD 25 Posledica najčešće mutacije, delecije 5 bp u egzonu 6 NBN gena (c.657_661del5) je pomeranje okvira čitanja, što u procesu transkripcije, odnosno translacije uzrokuje ranu terminaciju originalnog proteinskog lanca (Digweed i Sperling 2004). Kao rezultat ove promene dobijaju se dva proteinska fragmenta: kratki, najverovatnije nefunkcionalni „N-terminalni“ protein od oko 26 kDa i dugi „C-terminalni“ protein od oko 70 kDa, nastao alternativnim okvirom čitanja (Uhrhammer i dr. 2002). C-terminalni proteinski fragment je delom aktivan, što najverovatnije ima suprimirajuće dejstvo na letalni efekat nedostatka obe normalne kopije gena (Digweed i Sperling 2004). Dvolančani prekidi molekula DNK predstavljaju lezije kritične za opstanak ćelije i važan su izvor mutacija i hromozomskih aberacija, kao i V(D)J rekombinacija gena za imunoglobuline i T-ćelijske receptore (slika 4) (Ries i Digweed, 1999). Slika 4. Šematski prikaz funkcije nibrina. U ćeliji postoje kontrolni mehanizmi za detekciju i ispravku dvolančanih prekida u čijem središtu se nalazi ataksija-telangiektazija-mutirana (ATM17) protein kinaza. ATM svojom kinaznom funkcijom aktivira čitav niz regulatornih proteina (p53, CHK1, CHK2, BRCA1) među kojima je i nibrin, a u zavisnosti od njihovog odgovora dešava se zastoj u G1 ili G2 fazi ćelijskog ciklusa radi reparacije oštećenja, ili ćelija podleže 17 ATM – engl. ataxia-telangiectasia mutated, UVOD 26 apoptozi (Digweed i Sperling 2004). Fosforilacija nibrina, inicirana FHA i BRCT domenima, dovodi do konformacione promene MRE11-RAD50-nibrin kompleksa, interakcije sa H2AX histonom i njegovog regrutovanja na mesto popravke dvolančanog prekida. S obzirom da proteinu nibrinu, u ćelijama obolelih od NSN, nedostaje dugi fragment sa regulatornim domenima, onemogućena je interakcija sa H2AX histonom, kao i aktivacija nibrina putem ATM kinaze. Defektna funkcija MRE11-RAD50-nibrin kompleksa rezultira u poremećajima u odgovoru na dvolančane prekide DNK i regulaciji ćelijskog ciklusa, kao i u povišenim nivoima reaktivnih vrsta kiseonika (eng. Reactive Oxygen Species, ROS) koji dovode do oksidativnog stresa (Krenzlin i dr. 2012). Krajnja posledica ovih promena je aktivacija onkogena i kancerogeneza. Homologe rekombinacije u mejozi, u osnovi su inicirane, takođe dvolančanim prekidima, što u slučaju NSN dovodi do defekta mejoze i najverovatnije vodi ka gonadalnoj disgenezi i infertilitetu (Digweed i Sperling 2004). Uzroke imunodeficijencije ovih pacijenata treba tražiti u ulozi nibrina u rekombinacijama V, D i J gena za lake i teške lance imunoglobulina, kao i za receptore B- i T-limfocita, a koje su osnovni izvor varijabilnosti ovih proteina i osnova potentnosti imunog odgovora (Digweed i Sperling 2004; Kracker i dr. 2005). Poremećena funkcija nibrina dovodi do defekta i češćih grešaka u sistemu V(D)J rekombinacija, što za posledicu ima smanjenje nivoa efikasnosti imunog odgovora (Digweed i Sperling 2004; Kracker i dr. 2005). 1.7.5. DIJAGNOSTIKA NSN S obzirom na kliničku heterogenost NSN i dosadašnje podatke vezane za ćelijski fenotip i molekularnu osnovu, nekoliko metoda je našlo primenu u dijagnostici ove bolesti, a to su: analiza hromozomske nestabilnosti, protočno citometrijska analiza ćelijskog ciklusa i molekularna analiza prisustva/odsustva mutacija u NBN genu. 1.7.5.1. Analiza hromozomske nestabilnosti Analiza hromozomskih prekida i rearanžmana predstavlja jednu od najčešće primenjivanih metoda u dijagnostici bolesti hromozomske nestabilnosti, među kojima je UVOD 27 i NSN. Spontana stopa hromozomskih aberacija, koje uključuju hromozomske i hromatidne prekide, acentrične fragmente, dicentrike i dr, a posebno translokacije, inverzije, izohromozome i druge rearanžmane između hromozoma 7 i 14, može da varira i kreće se od 10% do 50% (Concannon i Gatti 2011). Ova inicijalna hromozomska nestabilnost može biti povećana kako dejstvom jonizujućeg zračenja (dva puta), tako i dejstvom različitih radiomimetika, čijoj grupi pripada i bleomicin (Kraakman-van der Zwet i dr. 1999). Bleomicin je po strukturi glikopeptid sa svojstvom antibiotika, a izaziva jednolančane i dvolančane prekide u molekulu DNK, posredstvom svog helatnog kompleksa i kiseonika, odnosno produkcijom slobodnih radikala (Chen i dr. 2008). Zbog slabog odgovora limfocita na mitogeno dejstvo fitohemoaglutinina i samim tim smanjene proliferacije ćelija, citogenetičku analizu je ponekad teško sprovesti. Tada se pribegava drugim metodama dijagnostikovanja NSN, kao što je analiza ćelijskog ciklusa ili molekularna analiza prisustva/odsustva najčešće c.657_661del5 mutacije. 1.7.5.2. Protočno citometrijska analiza ćelijskog ciklusa Zastoj ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa predstavlja, pored hromozomske nestabilnosti još jedan od indikatora neispravljenog oštećenja molekula DNK. Protočno citometrijski test ima dve velike prednosti: analizom su obuhvaćene ćelije u svim fazama ćelijskog ciklusa i može se detektovati veliki broj ćelija (50.000 – 100.000) (Schindler i Hoehn 1999). Bazični zastoj u G2 fazi može biti povećan primenom jonizujućeg zračenja ili dejstvom hemijskih mutagena. Nedostaci ove metode su da nije uvek precizna i da nije moguća detekcija dijagnostički relevantnog prisustva rearanžmana između hromozoma 7 i 14 (Schindler i Soneck 1999). 1.7.5.3. Molekularna analiza mutacija u NBN genu Kada je 1998.god. identifikovan i sekvenciran gen odgovoran za sintezu nibrina, identifikovane su i mutacije koje dovode do nastanka NSN (Varon i dr. 1998). S obzirom da se za mutaciju c.657_661del5 može reći da je daleko najučestalija mutacija u NBN genu, pogotovo kod bolesnika slovenskog porekla, to dodatno olakšava pristup u molekularnoj dijagnostici NSN (Concannon i Gatti 2011; Drábek i dr. 2002). Samo je UVOD 28 detekcijom mutacije u NBN genu obolelog moguće i definitivno potvrditi dijagnozu NSN. Ovom analizom pored homozigotnih, moguće je detektovati i heterozigotne nosioce mutacije, što može biti iskorišćeno u prenatalnoj dijagnostici u porodicama obolelih. 1.7.6. TERAPIJA OBOLELIH OD NSN Uprkos značajnom napretku medicine, za NSN koje predstavlja veoma teško oboljenje sa letalnim posledicama, trenutno ne postoji terapija. Većina obolelih je dijagnostikovana kasno, sa već razvijenom neoplazijom, često i kao sekundarna posledica radio- ili hemoterapije. Rano postavljanje precizne dijagnoze kod obolelih od ovih teških bolesti, kao što su: NSN i FA, od presudnog je značaja za budući tretman bolesnika, pre svega u smislu prevencije razvitka tumora. S obzirom na veliku heterogenost i variranje parametara kliničke slike kod ovakvih pacijenata, neophodno je sprovođenje laboratorijskih testova u cilju potvrde ili isključenja dijagnoze kod svih pacijenata sa kliničkom sumnjom da boluju od jedne od ovih bolesti. 29 2. CILJEVI Cilj ove studije je bio da se kod pacijenata sa kliničkom FA i NSN, primenom savremenih metoda citogenetike, citometrije i molekularne genetike, omogući neophodna potvrda ili isključenje klinički postavljene dijagnoze bolesti. 2.1. FANKONIJEVA ANEMIJA Kod bolesnika sa kliničkim znacima FA postavljeni su sledeći ciljevi: 1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi u cilju potvrde ili isključenja FA kroz: a) praćenje spontane hromozomske osetljivosti na osnovu sledećih parametara: procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji, indeks fragilnosti hromozoma; b) praćenje DEB-om indukovane hromozomske osetljivosti (DEB test), određivanjem vrednosti parametara kao što su: procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji, broj prekida/aberantnoj ćeliji, broj prekida/multiaberantnoj ćeliji i indeks fragilnosti hromozoma, u cilju:  definisanja raspona vrednosti ovih parametara,  klasifikovanja bolesnika,  razlikovanja pacijenata sa mozaičnim fenotipom u odnosu na nemozaičan oblik FA,  utvrđivanja uticaja dužine trajanja indukcije na hromozomsku nestabilnost. 2. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturama fibroblasta kože u cilju potvrde ili isključenja mozaičnog fenotipa FA dobijenog na limfocitima: definisanje parametara hromozomske osetljivosti (procenat aberantnih ćelija i broj prekida/ćeliji) u fibroblastima. CILJEVI 30 3. Analiza oštećenja DNK u limfocitima periferne krvi primenom komet testa: određivanje raspona vrednosti Olive-momenta repa. 4. Analiza zastoja limfocita periferne krvi i fibroblasta kože u G2 fazi ćelijskog ciklusa: utvrđivanje vrednosti procenta ćelija u G2 fazi. 5. Izdvajanje pacijenata sa fenotipom FA dijagnostikovanim na osnovu svih gore urađenih analiza, u cilju određivanja komplementacionih grupa i potvrde konačne dijagnoze FA. 2.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI Ciljevi citogenetičkih i molekularnih analiza kod bolesnika sa kliničkom slikom NSN su bili: 1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi u cilju potvrde ili isključenja fenotipa NSN: a) određivanje raspona vrednosti parametara hromozomske osetljivosti limfocita indukovane BLC-om: procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji, procenat ćelija sa strukturnim aberacijama i dr, b) klasifikacija bolesnika na osnovu gore navedenih parametara. 2. Molekularna analiza prisustva ili odsustva c.657_661del5 mutacije kod pacijenata sa NSN u cilju konačne potvrde dijagnoze bolesti, kao i utvrđivanje statusa nosioca za ovu mutaciju u porodicama obolelih. 31 3. MATERIJAL I METODE 3.1. MATERIJAL U ovoj studiji su korišćeni uzorci periferne krvi i biopsije kože od ukupno 100 pacijenata sa kliničkim znacima FA (90) i NSN (10), koji su bili upućeni u Laboratoriju za medicinsku genetiku Instituta za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Srbije „Dr Vukan Čupić, u cilju potvrde kliničke dijagnoze. Klinički parametri kao što su: aplastična anemija, pancitopenija, nizak rast i druge anomalije, koji su ukazivali na FA, bili su prisutni kod ukupno 90 bolesnika pretežno dečijeg uzrasta. Preostalih deset bolesnika, takođe mlađih od 18 godina, imalo je kliničke znake NSN, kao što su: mikrocefalija, izrazita imunodeficijentnost, lice „ptičijeg izgleda“ i dr. Za potrebe analize, kao kontrolni uzorci korišćeni su limfociti periferne krvi i fibroblasti kože preko 100 klinički zdravih osoba, uglavnom zdravih članova porodice (roditelji) obolelih. 3.2. METODE 3.2.1. FANKONIJEVA ANEMIJA 3.2.1.1. Metode citogenetičke analize 3.2.1.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturi limfocita periferne krvi primenom DEB testa Analiza senzitivnosti limfocita pacijenata sa kliničkom slikom FA, na DNK- unakrsno vezujuće dejstvo DEB-a, sprovedena je korišćenjem standardnih metoda uz izvesne modifikacije (Auerbach 1988; Auerbach 2003; Wegner i Stumm 1999). Postavljane su netretirane i DEB-om tretirane kulture limfocita periferne krvi pacijenata, pod istim uslovima kao i kulture limfocita zdravih osoba (članova porodice). Ćelije su tretirane DEB-om poslednjih 24h i 48h kultivacije u finalnoj koncentraciji od 0,1 µg/ml (Wegner i Stumm 1999). Nakon 70h kultivacije dodavan je MATERIJAL I METODE 32 kolcemid (finalna koncentracija: 2,5 µg/ml) i preparacija hromozoma je urađena prema standardnom protokolu (Wegner i Stumm 1999). Za svakog pacijenta, za dva različita vremena indukcije DEB-om analizirano je po 50 – 100 metafaznih figura na prisustvo hromozomskih/hromatidnih prekida i aberacija. Analiza kariotipa svih pacijenata urađena je primenom tehnike G traka (ISCN18 (2009)). Hromatidni i hromozomski prekidi, kao i acentrični fragmenti računati su kao jedan prekid, dicentrici i ring hromozomi kao dva prekida, a radijalne strukture su brojane kao dva i više prekida u zavisnosti od broja hromozoma uključenih u formiranje strukture (Wegner i Stumm 1999). Parametri procene hromozomske nestabilnosti bili su: procenat aberantnih ćelija, broj prekida po ćeliji, broj prekida po aberantnoj ćeliji, broj prekida po multiaberantnoj ćeliji, indeks fragilnosti hromozoma i dr. (Auerbach 1988; Auerbach 2003; Castella i dr. 2011; Wegner i Stumm 1999). 3.2.1.1.1.1. Kultivisanje limfocita periferne krvi i indukcija DEB-om Uzorak od 3 ml periferne krvi (0,5 ml rastvora heparina19 sa 2,5 ml krvi) se zasadi u šest sterilnih epruveta sa po 4,5 ml prethodno pripremljene hranljive podloge (RPMI 1640 sa 20% seruma (FBS20), 1% antibiotika (streptomicin i penicilin) i 1% fitohemoaglutinina (PHA21)) i položi u termostat na 37 °C. Dve limfocitne kulture (u epruvetama) se ostave netretirane, dok se u dve kulture nakon 24h kultivacije (48- časovni tretman), a u preostale dve epruvete nakon 48h kultivacije (24-časovni tretman) dodaje po 50 µl radnog rastvora DEB-a (10 μg/ml), da bi se postigla finalna koncentracija od 0,1 μg/ml, i ostave u mraku. 18 ISCN – eng. International System for Cytogenetic Nomenclature (prev. Internacionalni sistem za citogenetičku nomenklaturu) 19 Rastvor heparina (antikoagulansa) - 20% rastvor heparina (5000 i.j.) u fiziološkom rastvoru 20 FBS – eng. Foetal Bovine Serum 21 PHA – eng. phytohaemoagglutinin MATERIJAL I METODE 33 3.2.1.1.1.2. Preparacija hromozoma iz limfocita periferne krvi Nakon 70 h kultivacije u netretirane i DEB-om tretirane kulture se ubaci kolcemid (radni rastvor 12,5 g/ml) u finalnoj koncentraciji od 2,5 μg/ml. Dva sata od ubacivanja kolcemida, kulture u epruvetama se resuspenduju i centrifugiraju 10 min na 25000 obrtaja. Odlije se supernatant i talogu doda 1ml hipotoničnog rastvora (5,6% KCl i 3,8% Na-citrat u odnosu 1 : 1), resuspenduje, doda još 9 ml istog hipotoničnog rastvora i ostavi u termostatu 20 min na 37°C. U svaku epruvetu se doda po 5 kapi tritona i centrifugira na 2500 obrtaja 10 min. Supernatant se odlije, a talogu doda 1 ml fiksativa (CH3COOH i CH3OH u odnosu 1 : 3), resuspenduje, dopuni fiksativom do 10 ml i ostavi na sobnoj temperaturi 20 min. Zatim sledi centrifugiranje na 2500 obrtaja 10 min, supernatant se odlije, talogu doda 1 ml fiksativa, resuspenduje i centrifugira na 2500 obrtaja 10 min. Supernatant se odlije, a talogu, zavisno koliko ga ima, doda 3 – 4 kapi fiksativa i 3 – 4 kapi 60% sirćetne kiseline. Na čistu prethodno ohlađenu i opranu staklenu pločicu stavi se 2 – 3 kapi materijala i suši preko plamena. Bojenje hromozoma po Gimzi se vrši tako što se „Gimza“ boja rastvori u fosfatnom puferu pH 7,6 (4,14 g Na2HPO4 i 0,35 g KH2PO4 u 500 ml destilovane vode) u odnosu 1 : 10 i tako napravljenim rastvorom preparat boji 7 – 10 min. 3.2.1.1.1.3. Tehnika G traka Bojenje hromozoma tehnikom G traka se radi tako što se preparat izloži dejstvu rastvora 0,25% tripsina i GKN-a (80 mg NaCl, 4 mg KCl i 10 mg glukoze u 10 ml destilovane vode) u odnosu 1 : 1 u trajanju od 1 – 2 sekunde, zatim ispira fosfatnim puferom pH 6,8 (2,78 g Na2HPO4 i 0,48 g limunske kiseline u 500 ml destilovane vode) i boji rastvorom Gimze 7 – 10 min. 3.2.1.1.1.4. Analiza kariotipa i hromozomskih aberacija Analizira se 50 – 100 metafaznih figura obojenih Gimza rastvorom (prebrojavanje i konvencionalna analiza hromozoma) na prisustvo: hromatidnih i hromozomskih prekida, dicentrika, acentričnih fragmenata, ring hromozoma, radijalnih struktura i dr, a potom se hromozomi oboje tehnikom G traka i analizira kariotip bolesnika na 11 metafaza (finiji strukturni rearanžmani). MATERIJAL I METODE 34 3.2.1.1.1.5. Statističke analize χ2 testom (u Microsoft Excel programu) se testira polazna hipoteza da su nalazi pacijenata i kontrole isti, i to upoređivanjem procenta aberantnih ćelija pacijenata sa procentom nađenim u kontroli. Rezultat analize DEB testom se smatra pozitivnim (odbacuje se polazna hipoteza) ukoliko je vrednost verovatnoće, da su nalazi pacijenta i kontrole isti, manja od 0,05 (p<0,05). t-nezavisnim i Mann-Whitneyjevim testovima (u Statistica programu) se proverava polazna hipoteza da nema razlike među nalazima bolesnika grupisanih prema vrednostima: procenta aberantnih ćelija, broja prekida po ćeliji i dr. (pozitivni i negativni na DEB testu). Smatra se da između određenih grupa bolesnika postoji statistički značajna razlika (odbacuje se polazna hipoteza) ukoliko je vrednost verovatnoće manja od 0,05 (p < 0,05). 3.2.1.1.2. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturi fibroblasta kože primenom DEB testa U cilju potvrde ili isključenja mozaika kod pacijenata sa kliničkim znacima FA urađena je analiza hromozomske nestabilnosti primenom DEB testa u kulturi fibroblasta kože korišćenjem standardnog protokola (Auerbach 2003) uz izvesne modifikacije. Kao kontrolni uzorci korišćeni su fibroblasti kože zdravih osoba. U poslednjih 24 h kultivacije fibroblasti su tretirani DEB-om u finalnoj koncentraciji od 0,01 µg/ml (Auerbach 2003). Kulturama je dva sata pre preparacije dodavan kolcemid (finalna koncentracija: 5 µg/ml) i preparacija hromozoma je sprovedena prema standardnom protokolu (Auerbach 2003). Analizirano je najmanje 20, a najviše 100 metafaznih figura iz svake kulture na prisustvo hromozomskih aberacija, a parametri procene hromozomske nestabilnosti su bili: procenat aberantnih ćelija, broj prekida po ćeliji i dr. (Auerbach 2003). 3.2.1.1.2.1. Kultivisanje fibroblasta kože i indukcija DEB-om Uzorak dobijen biopsijom kože se iseče sterilnim skalpelom na sitne komade i prebaci u dva sterilna suda (Nunc – 25 cm3), koji se ostave da odstoje 4h-6h, kako bi se komadići kože zalepili za dno suda. Potom se sudovi naliju sa 5ml hranljive podloge (HAM F-10 sa 20% FBS i 1% antibiotika) i kultivišu u termostatu na 37°C. Podešavanje MATERIJAL I METODE 35 pH u kulturama fibroblasta kože se postiže aeriranjem smešom gasa (CO2 4,8 vol%, O2 4,8 vol% i do 100 vol% N2), a podloga se u sudovima menja u zavisnosti od rasta ćelija. Pasaža kulture se vrši tripsin-EDTA rastvorom kojim se ćelije odlepe sa dna suda, zatim im se doda hranljiva podloga i prebace se u potreban broj sudova. Kultura fibroblasta se ostavi netretirana u bar jednom sudu, dok se u dve kulture 24 h pre preparacije doda po 50 µl rastvora DEB-a (1 μg/ml), da bi se postigla finalna koncentracija od 0,01 μg/ml, i tretirane kulture se ostave u mraku. 3.2.1.1.2.1. Preparacija hromozoma iz fibroblasta kože Dva sata pre preparacije u kulture fibroblasta se ubacuje kolcemid u finalnoj koncentraciji 5 μg/ml. Nakon dejstva kolcemida kulturama se dodaje rastvor tripsin- EDTA (2 ml), kako bi se ćelije odlepile sa dna suda. Zatim se ćelijama u rastvoru tripsina doda hranljiva podloga i čitav sadržaj suda prebaci u epruvete. Ćelije se centrifugiraju 5 min na 1600 obrtaja. Supernatant se dekantira, doda 3 – 4 kapi hipotoničnog rastvora (kao kod preparacije limfocita), zatim nalije do 2 ml ovog istog rastvora, resuspenduje i stavi u termostat 20 min na 37 °C. Smeša se centrifugira 5 min na 1600 obrtaja, supernatant dekantira, a talogu doda fiksativ do 1 ml, resuspenduje i ostavi na sobnoj temperaturi 20 min. Ponovo se centrifugira 5 min na 1600 obrtaja, supernatant dekantira, a talogu doda 2 – 3 kapi fiksativa i 1 – 3 kapi 60% CH3COOH. Materijal se na kraju nanosi u kapima na hladne i oprane staklene pločice i suši na plamenu. Bojenje hromozoma po Gimzi, tehnika G traka i analiza hromozomskih aberacija se sprovodi isto kao i u kulturi limfocita. 3.2.1.2. Analiza oštećenja DNK primenom komet testa Analiza elektroforezom pojedinačnih ćelija, nazvana još i analiza komet testom, je metoda koja se koristi za izučavanje oštećenja na molekulu DNK, a koju su 1984. god razvili naučnici O. Ostling i K.J. Johanson. Singh i saradnici (1988) su modifikovali metodu tako da se pored dvolančanih, mogu detektovati i jednolančani prekidi DNK, MATERIJAL I METODE 36 korišćenjem alkalnih uslova elektroforeze pri kojima dolazi do denaturacije molekula DNK. Iz uzorka periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom FA i zdravih osoba (kontrola) na gradijentu inertnog rastvora polisaharida (Histopaque 1077) izolovani su limfociti (i dr. mononuklearne ćelije) koji su odmah zamrznuti na -196 C°. Ovako zamrznuti uzorci su čuvani do dve godine, a zatim odmrzavani i kultivisani. U kulturama odmrznutih limfocita ispitivana je senzitivnost ćelija na DEB, pod istim uslovima kao i u kulturi svežih limfocita periferne krvi. Alkalnim komet testom analizirana su spontana i DEB-om indukovana oštećenja u kulturama limfocita pacijenata i zdravih kontrola. U svakom uzorku je analizirano po 50 ćelija, i to za vrednosti momenta repa prema Olive i saradnicima (1990) (OTM22). U prikazu rezultata je korišćena srednja vrednost momenta repa svih ćelija u analiziranom uzorku (OTM). 3.2.1.2.1. Izolacija i zamrzavanje mononuklearnih ćelija periferne krvi U izolaciji mononuklearnih ćelija (limfocita) iz periferne krvi korišćena je metoda centrifugiranja na gradijentu inertnog polisaharida (Histopaque 1077) (Boyum 1968) uz izvesne modifikacije. Uzorak krvi dobijen od pacijenata i zdravih kontrola u proseku je iznosio od 6 – 8 ml, i sadržao je dovoljan broj limfocita (više od 2 x 106), neophodnih za dalje analize. Histopaque 1077 se sipa u sterilne epruvete (po 4 ml). Dobijeni uzorak od 6 ml periferne krvi (1 ml antikoagulansa sa 5 ml krvi) se razblaži fiziološkim rastvorom u odnosu 1 : 2. Razblažena krv se polako sipa u epruvete sa Histopaqueom do 10 ml, tako da se ne probije gradijent (odnos Histopaquea i razblažene krvi je 1 : 1,5). Zatim se centrifugira 10 min, na 1200 obrtaja, i odmah potom 15 min na 3000 obrtaja. Pipetom se polako pokupi prsten limfocita i prebaci u sterilnu epruvetu. Zatim se ćelijama doda hranljiva podloga (HAM F-10) i centrifugiraju se 10 min na 2000 obrtaja, odlije se 22 OTM – eng. Olive Tail Moment MATERIJAL I METODE 37 supernatant i talogu doda 1 ml hranljive podloge. Ćelije se broje na hemocitometru i u koncentraciji od 1 x 106/ml hranljive podloge (HAM F-10) sa 10% FBS, prebacuju u krioepruvete, u koje se dodaje 8% DMSO, i ćelije podležu dubokom zamrzavanju u automatizovanom sistemu. 3.2.1.2.2. Odmrzavanje i kultivacija mononuklearnih ćelija Uzorci limfocita koji su čuvani na -196 °C u tečnom azotu, se odmrzavaju i kultivišu po istom principu kao i limfociti iz sveže krvi. Epruvete sa zamrznutim ćelijama se trenutno odmrznu izlaganjem temperaturi od 37 °C i ćelijama se odmah doda hranljiva podloga (HAM F-10). Zatim se centrifugiraju 10 min na 1800 obrtaja. Odlije se supernatant i talogu doda hranljiva podloga, resuspenduje i ponovo centrifugira 10 min na 1800 obrtaja. Ćelije se izbroje na hemocitometru i podesi koncentracija od > 300 000 ćelija u 1 ml kompletne podloge (RPMI 1640 sa 20% FBS, 1% antibiotika i 1% PHA) za 72-časovnu kultivaciju u termostatu na 37 °C. Ćelije se tretiraju DEB-om kao i u slučaju kulture limfocita iz sveže krvi. Dejstvo DEB-a se prekida ispiranjem ćelija podlogom (centrifugiranje 10 min na 2000 obrtaja i odbacivanje supernatanta). Talog ćelija se, zatim rastvori u 1 ml hranljive podloge, ćelije se izbroje na hemocitometru i podesi koncentracija od 200 000 do 500 000 ćelija/ml. 3.2.1.2.3. Metoda alkalnog komet testa Metodom alkalnog komet testa (Singh i dr. 1988) analizirano je prisustvo oštećenja DNK u netretiranim i DEB-om (24h i 48h) tretiranim kulturama odmrznutih limfocita pacijenata i zdravih kontrola. I dan:  priprema staklenih pločica i gela:  staklene pločice se urone u apsolutni metanol i tako stoje 3 h,  zatim se pločice spale, suve potope u 1% agarozu sa normalnom tačkom topljenja (eng. normal melting point, NMP) i ostave da se suše preko noći. MATERIJAL I METODE 38 II dan:  dalja priprema pločica i nanošenje ćelija:  na ovako pripremljene pločice se nanese sloj 1% NMP agaroze (80 µl) i preko se stavi pokrovno staklo,  pločice se stave u frižider na +4 °C 5 min, nakon čega se uklanja pokrovno staklo,  ćelije u hranljivoj podlozi se prebace u ependorf-epruvete i centrifugiraju 10min na 2000 obrtaja,  supernatant se dekantira, a talog od 60 µl resuspenduje i podeli u dve ependorf-epruvete (po 30 µl),  30 µl ćelija se pomeša sa 70 µl 1% LMP (eng. low melting point) agaroze sa niskom tačkom topljenja, nanosi na sloj 1% NMP agaroze na pločici i pokriva pokrovnim staklom,  pločice se stave u frižider na +4 °C 5 min, nakon čega se uklanja pokrovno staklo.  Liza ćelija:  pločice se zatim stave u kadicu za lizu,  preko pločica se sipa rastvor za lizu pH 10 (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10mM Tris i 1% Triton X-100), i tako ostave 1 h na +4 °C u mraku,  alkalna denaturacija DNK:  odlije se rastvor za lizu i pločice prebace u kadicu za elektroforezu,  zatim se u kadicu doda 1 L elektroforetskog pufera (30 ml 10 M NaOH, 5 ml 0,2 M EDTA i do 1 L dest. vode) i ostavi na +4 °C 20 min.  elektroforeza:  elektroforeza traje 20 min na +4 °C pri naponu od 0,5 – 1 V/cm; MATERIJAL I METODE 39  neutralizacija:  neutralizacija se vrši 15 min u puferu za neutralizaciju pH 7,5 (48,44 g Tris i do 800 ml dest. vode);  bojenje:  na svaki gel se nanosi po 20 µl etidijum bromida (5 µg/ml u dest. vodi) i pokrije se pokrovnim staklom;  analiza kometa:  pod fluorescentnim mikroskopom se analiziraju oštećenja DNK u vidu kometa, u 50 nasumično izabranih ćelija, primenom softvera Comet IV;  statističke analize:  u Microsoft Excel programu se računaju osnovni statistički parametri (srednja vrednost, standardna devijacija i dr.) i vrednost oštećenja DNK u uzorku ćelija predstavlja u vidu srednje vrednosti Olive-momenta repa (OTM) za svih 50 ćelija,  testiranje grupa bolesnika vršeno je u Statistica programu, kao u prethodnim analizama. 3.2.1.3. Protočno citometrijska metoda analize ćelijskog ciklusa Protočno citometrijska analiza DNK predstavlja metodu kojom se meri sadržina DNK u ćeliji, te na osnovu toga određuje faza ćelijskog ciklusa i broj ćelija u njoj (Ormerod 2000). S obzirom da je poznato (Dutrillaux i dr. 1982) da u ćelijama obolelih od FA dolazi do specifičnog zastoja u G2 fazi, za potrebe analize postavljane su kulture ćelija bolesnika sa kliničkom slikom FA i zdravih kontrola, i ispitivan njihov ćelijski ciklus prema nešto modifikovanoj proceduri (Moreira i dr. 2008; Ormerod 2000; Schindler i Hoehn 1999). MATERIJAL I METODE 40 3.2.1.3.1. Kultivisanje limfocita periferne krvi i priprema za analizu Uzorci periferne krvi (3ml krvi sa rastvorom heparina) pacijenata i kontrola se zasade u hranljivoj podlozi (RPMI 1640, 20% FBS, 1% antibiotika i 1% PHA) slično kao u slučaju citogenetičke analize DEB testom (u šest epruveta). Dve kulture se ostave netretirane 72h, a u četiri kulture se odmah po sađenju dodaje DEB (finalna koncentracija 0,1 μg/ml). Tretman se prekida u dve kulture posle 24 h, a u preostale dve nakon 48 h, i to ispiranjem ćelija u fiziološkom rastvoru (po 5 ml i centrifugiranjem na 2000 obrtaja 5 min). Priprema suspenzije limfocita:  ćelije se centifugiraju u zagrejanom fiziološkom rastvoru 10 min na 2000 obrtaja i reuspenduju,  supernatant se odlije, talogu ćelija doda 1 ml fiziološkog rastvora i resuspenduje,  zatim se do 10 ml doda fiksativ i centrifugira na 2000 obrtaja 10 min (ovaj korak ponoviti još jednom),  kada talog bude beličast doda se 70% etanola do 10 ml i centrifugira na 2000 obrtaja 10 min,  odlije se supernatant, talogu se doda 2 ml 96% etanola i čuva se na -20 °C do analize. 3.2.1.3.2. Kultura fibroblasta kože i priprema za analizu Fibroblasti kože se prema već opisanoj proceduri kultivišu u tri suda: jedan su je netretiran, u jednom se DEB (finalna koncentracija 0,01 μg/ml) drži 24 h i jedan sud gde tretman DEB-om traje 48 h. Dejstvo DEB-a se prekida ispiranjem ćelija u fiziološkom rastvoru (po 5 ml i centrifugiranjem na 2000 obrtaja 5min). Priprema suspenzije fibroblasta:  ćelije se centifugiraju u zagrejanom fiziološkom rastvoru 10 min 2000 obrtaja i reuspenduju, MATERIJAL I METODE 41  supernatant se odlije, talogu doda po 10 ml 70% etanola i centrifugira na 2000 obrtaja 10 min,  odlije se supernatant, talogu doda 2 ml 96% etanola i čuva na na -20 °C do analize. 3.2.1.3.3. Analiza ćelijskog ciklusa U analizi ćelijskog ciklusa korišćena je protočno citometrijska metoda za analizu DNK (limfocita i fibroblasta) (Ormerod 2000), koja je delimično modifikovana. Analiza ćelijskog ciklusa na Becton-Dickinson (BD) FACSCaliburovom citometru:  suspenzija ćelija u apsolutnom alkoholu se prebaci u epruvete, doda se 2 ml rastvora fosfatnog pufera (PBS23) pH 7,4 (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,78 g Na2HPO4 • 2 H2O i 0,27 g KH2PO4 u 1 L dest. vode) i centrifugira 5 min na 2000 obrtaja,  supernatant se odlije, talogu ćelija se doda 270 ml PBS rastvora, koji se zatim resuspenduje i prebaci u epruvete za protočni citometar (12 x75 mm),  suspenziji ćelija se zatim doda 80 µl svežeg rastvora RNAze (koncentracije 1 mg/ml u PBS), resuspenduje i inkubira na 37 °C 20 min,  zatim se doda 50 µl rastvora propidijum jodida (PI) (koncentracije 400 µg/ml u PBS) i ostavi u mraku 10 min na sobnoj temperaturi,  DNK ćelija se zatim analizira na BD citometru pri niskoj brzini protoka (eng.“low flow“), gde se sakupi po 10.000 ćelija i na osnovu količine DNK (2N, 4N) u ćeliji odredi u kojoj se fazi ćelijskog ciklusa nalazi, 23 PBS – eng. Phosphate buffered saline MATERIJAL I METODE 42  broj ćelija po fazama se određuje postavljanjem graničnika na histogramu DNK koji odvajaju tri grupe ćelija označene sa M1, M2 i M3,  da bi se dobio procenat ćelija po fazama vrši se dekonvolucija histograma DNK, i to tako što se:  G0/G1 faza računa kao M1-M2/4  S faza kao M2x2  G2/M faza se računa kao M3-M2/4.  broj ćelija u G2/M fazi se izražava u vidu procenta ćelija u G2 fazi. 3.2.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI 3.2.2.1. Metode citogenetičke analize 3.2.2.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturi limfocita periferne krvi primenom BLC testa Analiza BLC testom u kulturi limfocita periferne krvi je urađena prema standardnom protokolu (Wegner i Stumm 1999). Uporedo sa kulturama limfocita zdravih osoba, postavljane su netretirane i BLC-om tretirane kulture limfocita periferne krvi bolesnika sa kliničkom slikom NSN. BLC je dodavan kulturama ćelija u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml, četiri sata pre preparacije (Wegner i Stumm 1999). Nakon 70 h kultivacije (dva sata od ubacivanja BLC-a) ćelijama je dodavan kolcemid (finalna koncentracija: 2,5µg/ml) i preparacija hromozoma sprovedena je po standardnom postupku (Wegner i Stumm 1999). Analizirano je od 20 – 50 metafaznih figura svake kulture na prisustvo hromozomskih i hromatidnih prekida, i drugih strukturnih aberacija. Zatim je analiziran kariotip bolesnika primenom tehnike G traka na svim prethodno konvencionalno analiziranim metafazama (ISCN (2009)). Broj hromatidnih/hromozomski prekida je računat kao i u analizi hromozomske nestabilnosti pacijenata sa kliničkim znacima FA, MATERIJAL I METODE 43 a parametri procene su bili: procenat aberantnih ćelija, broj prekida po ćeliji i dr. (Wegner i Stumm 1999). 3.2.2.1.1.1. Kultivisanje limfocita periferne krvi i indukcija BLC-om Uzorak od 5ml periferne krvi (1 ml rastvora heparina sa 4 ml krvi) se zasadi u 10 sterilnih epruveta sa po 4,5 ml prethodno pripremljene hranljive podloge (RPMI 1640 sa 20% seruma (FBS), 1% PHA i 1% antibiotika) i položi u termostat na 37°C. Pet limfocitnih kultura se ostavi netretirano, a u pet epruveta se nakon 68 h kultivacije menja hranljiva podloga (RPMI 1640) kojoj se dodaje po 200 µl radnog rastvora BLC-a (5 μg/ml), da bi se postigla finalna koncentracija od 1 μg/ml, i ostavi u mraku 4h. Preparacija i bojenje hromozoma, analiza kariotipa i hromozomskih aberacija, kao i statističke analize se vrše isto kao i u kulturi limfocita u prethodno opisanoj analizi DEB testom. 3.2.2.2. Metode molekularne analize 3.2.2.2.1. Izolacija DNK iz periferne krvi U izolaciji DNK iz periferne krvi korišćena je metoda “isoljavanja” (Miller i dr. 1988) uz neznatne modifikacije. I dan:  uzorak periferne krvi (1ml antikoagulansa (4,5% EDTA/0,7% NaCl) sa 5 – 10 ml krvi) se rastvori u 10 ml litičkog pufera, pH 7,4 (155mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 1 mM EDTA)  smeša se inkubira 30 min na +4 °C i centrifugira na 5000 obrtaja 15 min na +4 °C;  zatim se odbaci supernatant, talog resuspenduje u 10 ml litičkog pufera; centrifugira (15 min, +4 °C, 5000 obrtaja); ovaj korak se još jednom ponovi; MATERIJAL I METODE 44  odbaci se supernatant, talog resuspenduje u 12 ml litičkog pufera, pH 8,0 (10 mM TrisHCl, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA), 140 μl 10% proteinase K i 800 μl 10% SDS;  smeša se inkubira u vodenom kupatilu sa šejkerom, na 37 °C, preko noći. II dan:  smeša se inkubira u vodenom kupatilu sa šejkerom, na 55 °C, 60 min;  doda se 4 ml 6 M NaCl i centrifugira 15 min, na +4 °C, na 5000 obrtaja;  supernatant se prebaci u novu epruvetu i centrifugira 15 min, +4 °C, 5000 obrtaja;  zatim se supernatant prebaci u novu epruvetu, doda 10 ml apsolutnog etanola i istaloži DNK;  DNK se ispira sa 70% etanolom i prebacuje u sterilnu ependorf-epruvetu sa odgovarajućom količinom redestilovane vode;  uzorci se čuvaju na +4 °C ili -20 °C. 3.2.2.2.2. Detekcija c.657_661del5 mutacije Za detekciju c.657_661del5 mutacije u NBN genu, a na osnovu poznavanja sekvence (Varon i dr. 1998), konstruisani su prajmeri za dobijanje produkata reakcije lančanog umnožavanja (PCR24), koji su mogli da se analiziraju sistemom vertikalne elektroforeze na poliakrilamidnom gelu (PAGE25). S obzirom da ova metoda nije ranije korišćena za dijagnostiku ovog oboljenja, za uspostavljanje novog protokola i utvrđivanje pojedinosti reakcije (koncentracije i količine osnovnih sastojaka PCR smeše, dužina trajanja pojedinih temperatura PCR ciklusa i dr.) primenjene su metode 24 PCR – eng. Polymerase Chain Reaction 25 PAGE – eng. Polyacrylamide Gel Electrophoresis MATERIJAL I METODE 45 (analiza heterodupleksa) korišćene u dijagnostici cistične fibroze (Kerem i dr. 1989; Radivojević i dr. 2004; Rommens i dr 1990). PCR analiza:  PCR reakcionu smešu (25 l po uzorku) su činile sledeće komponente: 200 – 300 ng izolovane DNK, 0,2 µM prajmera NBSF i NBSR, 0,2 mM dNTPs, 2 U Taq DNK polimeraze, 3 mM MgCl2, 10 x koncentrovani reakcioni pufer (TRIS, NH4SO4, BSA) i ddH2O;  korišćeni su oligonukleotidi sa sledećim sekvencama: NBS-F 5’ CCA CCT CTT gAT gAA CCA TCT ATT g 3’ NBS-R 5’ ACA TAA TTA CCT gTT Tgg CAT TCA AA 3’  uslovi PCR-a su bili sledeći: denaturacija uzorka na 95o C 5 min, 32 ciklusa (95oC, 15 sekundi; 57oC, 20 sekundi; 72oC, 30 sekundi) i finalna elongacija na 72oC 10min;  analiza heterodupleksa se radi nakon završenog PCR-a, tako što se u nove ependorf-epruvete prebaci po 10 l od svakog PCR produkta (pacijenta, pozitivne i negativne kontrole) i u posebnim epruvetama se napravi smeša PCR produkata svakog pacijenta sa PCR produktom pozitivne i negativne kontrole (10 l + 10 l). Uzorci se inkubiraju 5 min na 94oC i 5 min na 65oC, nakon čega se brzo prebace na led;  PCR produkti se nanose sa 7 l boje (15% Ficoll, 0,25% Bromphenolblue, 0,25% Xylene-cyanolFF) na poliakrilamidni gel (8% akrilamid/bisakrilamidni gel) u sistemu vertikalne elektroforeze. U poslednje ležište na gelu se sipa 10 l DNK markera, a uzorci putuju oko 135 min, pri naponu struje od 180 V;  vizuelizacija produkata se vrši bojenjem gela sa rastvorenim EtBr (1 ml 10% EtBr rastvoren u 1 L destilovane vode), i posmatranjem na UV transiluminatoru, dok je mutacija identifikovana poređenjem sa kontrolnim uzorcima. 46 4. REZULTATI 4.1. FANKONIJEVA ANEMIJA 4.1.1. ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM DIEPOKSIBUTANOVOG TESTA Spontana hromozomska nestabilnost u ćelijama obolelih od FA, može biti povećana dejstvom specifičnih mutagena kao što su: mitomicin C, mefalan ili diepoksibutan. U diferencijalnoj dijagnostici FA kod bolesnika čija je klinička slika ukazivala na ovo oboljenje, korišćena je citogenetička analiza diepoksibutanovim testom (DEB test). 4.1.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom FA primenom DEB testa U Laboratoriji za medicinsku genetiku, Instituta za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Srbije „Dr Vukan Čupić“, sprovedeni su citogenetički testovi za detekciju hromozomske nestabilnosti kod 90 bolesnika sa kliničkim znacima FA. Na limfocitima periferne krvi svakog od njih ispitivana je spontana i DEB-om (24h i 48h) indukovana nestabilnost hromozoma. Parametri analize su bili:  procenat aberantnih ćelija,  broj prekida po ćeliji,  broj prekida po aberantnoj ćeliji,  broj prekida po multiaberantnoj ćeliji (sa dva i više prekida) i  indeks fragilnosti hromozoma (CFI26). 26 CFI – eng. Chromosome Fragility Index REZULTATI 47 4.1.1.1.1. Analiza DEB-om indukovane hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi Kod 10 od 90 (11,11%) bolesnika je uočeno povećanje procenta aberantnih ćelija i broja prekida po ćeliji, indukovanih DEB-om (u trajanju od 24h), u odnosu na zdrave osobe (χ2 test: p < 0,05) (slika 5). Slika 5. DEB-om indukovane aberacije hromozoma kod bolesnika sa Fankonijevom anemijom: a – hromozomski prekid, b – hromatidni prekid, c – dicentrični hromozom, d – radijalna struktura. Ova grupa je shodno tome označena kao FA grupa pacijenata (DEB-pozitivni pacijenti) (tabela 4). U poređenju sa kontrolama, 77 (77/90 ili 85,56%) bolesnika nije pokazalo značajnija DEB-om (24h) indukovana oštećenja na nivou hromozoma (χ2 test: p > 0,05), pa su stoga svrstani u ne-FA grupu pacijenata (DEB-negativni pacijenti) (tabela 4). Kod preostala tri od 90 (3,33%) ispitivanih bolesnika zabeležene su vrednosti parametara indukovane hromozomske nestabilnosti koje su se nalazile između intervala vrednosti FA i ne-FA grupe, tako da su svrstani u graničnu FA* grupu pacijenata (tabela 4). b b d a cd d b d REZULTATI 48 Tabela 4. Spontana i DEB-om indukovana (24h) hromozomska nestabilnost u limfocitima pacijenata u FA, graničnoj FA*, ne-FA i kontrolnoj grupi. Grupa N N° prekida/ćeliji Aberantne ćelije (%) N° prekidi/ aberantnoj ćeliji σ Interval σ Interval σ Interval Spontana hromozomska nestabilnost FA 10 0,14 0,13 0,00 - 0,39 10,50 9,17 0,00 - 29,00 1,11 0,43 0,00 -1,50 FA* 3 0,08 0,03 0,06 - 0,12 8,00 3,61 5,00 - 12,00 1,07 0,12 1,00 -1,20 Ne-FA 77 0,01 0,01 0,00 - 0,06 0,98 1,27 0,00 - 6,00 0,57 0,59 0,00 -2,00 Kontrola 87 0,00 0,01 0,00 - 0,03 0,38 0,69 0,00 - 3,00 0,26 0,45 0,00 -1,50 DEB-om indukovana (24h) hromozomska nestabilnost FA 10 1,47 1,16 0,48 - 4,39 52,52 18,50 32,00 - 82,00 2,58 0,17 1,20 -5,35 FA* 3 0,20 0,06 0,15 - 0,26 15,67 5,51 12,00 - 22,00 1,33 0,29 1,15 -1,67 Ne-FA 77 0,02 0,03 0,00 - 0,08 1,82 1,53 0,00 - 6,00 0,86 0,48 0,00 -2,67 Kontrola 87 0,02 0,02 0,00 - 0,17 1,41 1,60 0,00 - 8,00 0,74 0,78 0,00 -3,40 N-broj, -srednja vrednost, σ-standardna devijacija. Procenat DEB-om 24h indukovanih aberantnih ćelija u FA grupi se kretao u rasponu od 32% do 82% sa srednjom vrednošću27 52,52% ± 18,50%, dok je u ne-FA grupi srednja vrednost iznosila 1,82% ± 1,53%, sa intervalom vrednosti od 0% do 6%, bez međusobnog preklapanja (tabela 4; slika 6). Slika 6. Procenat aberantnih limfocita kod pacijenata u FA, graničnoj FA*, ne-FA i kontrolnoj grupi: bez i sa indukcijom DEB-om (24h i 48h). 27 Srednja vrednost predstavljena kao srednja vrednost ± standardna devijacija ( ± σ). REZULTATI 49 Analizom broja prekida po ćeliji utvrđeno je da se rasponi vrednosti ovog parametra u FA i ne-FA grupi pod indukcijom DEB-om (24h), takođe nisu preklapali (slika 7). Međutim, intervali broja indukovanih prekida/aberantnoj ćeliji u ove dve grupe se nisu jasno razdvojili, tako da na osnovu ovog parametra nije bilo moguće razlikovati FA pacijente od ne-FA (tabela 4). Slika 7. Broj prekida/ćeliji u limfocitima pacijenata u FA, graničnoj FA*, ne-FA i kontrolnoj grupi: bez i sa indukcijom DEB-om (24h i 48h). Na osnovu dobijenih rezultata Kolmogorov-Smirnov testa (p < 0,05) u statističkoj analizi vrednosti indukovane hromozomske nestabilnosti u FA i ne-FA grupi, korišćen je Mann-Whitneyjev neparametrijski test. Mann-Whitneyjev test je pokazao da se vrednosti u FA i ne-FA grupi pacijenata statistički značajno razlikuju (p < 0,01) kako u procentu aberantnih ćelija, tako i u broju prekida/ćeliji. REZULTATI 50 Procenat aberantnih ćelija i broj prekida/ćeliji, indukovanih DEB-om (24h), u grupi FA* graničnih pacijenata su bili oko 8 odnosno, 10 puta veći od prosečnih vrednosti u ne-FA grupi. Međutim, FA* pacijente nije bilo moguće pojedinačno statistički značajno razlikovati u odnosu na kontrole (χ2 test: p > 0,05) (tabele 4 i 5). Tabela 5. Spontane i DEB-om indukovane (24h) hromozomske aberacije pacijenata u graničnoj FA* grupi. Pacijent Spontane hromozomske aberacije DEB-indukovane (24 h)hromozomske aberacije Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Nº prekida/ aberantnoj ćeliji Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Nº prekida/ aberantnoj ćeliji FA*-1. 0,06 5,00 1,20 0,26 22,00 1,18 FA*-2. 0,12 12,00 1,00 0,15 13,00 1,15 FA*-3. 0,07 7,00 1,00 0,20 12,00 1,67 0,08 8,00 1,07 0,20 15,67 1,33 σ 0,03 3,61 0,12 0,06 5,51 0,29 4.1.1.1.1.1. Heterogenost odgovora na DEB: mozaicizam unutar FA grupe Na osnovu krivi distribucije procenta aberantnih ćelija i broja prekida/ćeliji u FA grupi pod 24-časovnom indukcijom DEB-om (slika 8), utvrđeno je postojanje dve podgrupe FA pacijenata. 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 % aberantnih ćelija 0 1 2 U čestalost 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Broj prekida/ćeliji 0 1 2 3 4 U čestalost Slika 8. Distribucija vrednosti: a) procenta aberantnih limfocita i b) broja prekida/ćeliji pod dejstvom DEB-a (24h) u FA grupi pacijenata. a) b) REZULTATI 51 Jedna podgrupa koju su činili četiri FA pacijenta (Nº FA-1, -7, -8 i -10) je imala procent aberantnih ćelija > 60% i broj prekida/ćeliji od 1,31 do 4,39 (tabela 6). Vrednosti procenta aberantnih ćelija kod preostalih šest FA pacijenata (Nº FA-2, -3, -4, - 5, -6 i -9) su se kretale u intervalu od 32% do 49%, sa brojem prekida/ćeliji od 0,48 do 1,50 (tabela 6). Tabela 6. Spontane i DEB-om indukovane (24h) hromozomske aberacije u limfocitima pacijenata u FA grupi. Pacijent Spontane hromozomske aberacije DEB-indukovane (24h) hromozomske aberacije Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Nº prekida/ aberantnoj ćeliji Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Nº prekida/ aberantnoj ćeliji FA-1. 0,01 1,00 1,00 2,15 72,22 2,97 FA-2. 0,07 5,00 1,40 1,50 49,00 3,06 FA-3. 0,00 0,00 0,00 0,95 32,00 2,97 FA-4. 0,08 8,00 1,00 0,68 35,00 1,94 FA-5. 0,27 18,00 1,50 0,58 41,00 1,41 FA-6. 0,12 9,00 1,33 0,48 40,00 1,20 FA-7. 0,18 15,00 1,20 1,75 73,00 2,40 FA-8. 0,39 29,00 1,34 4,39 82,00 5,35 FA-9. 0,03 3,00 1,00 0,91 37,00 2,46 FA-10. 0,22 17,00 1,29 1,31 64,00 2,05 0,14 10,50 1,11 1,47 52,52 2,58 σ 0,13 9,17 0,43 1,16 18,50 1,17 Napomena: podgrupa nemozaičnih FA (FA-1, FA-7, FA-8, FA-10) i podgrupa mozaičnih FA pacijenata (FA-2, FA-3, FA-4, FA-5, FA-6, FA-9). FA pacijenti iz podgrupe sa procentom aberantnih ćelija > 30% i < 50% su označeni kao mozaični FA pacijenti, dok su pacijenti sa vrednostima višim od 60% svrstani u podgrupu nemozaičnih FA pacijenata (tabela 7). Kada je kao parametar analize korišćen broj prekida po multiaberantnoj ćeliji, razlika između mozaičnog i nemozaičnog tipa FA je bila značajno manja (t-test: p > 0,05) i iznosila je u proseku manje od jednog i po puta (tabela 7). REZULTATI 52 Tabela 7. DEB-om (24h) indukovane hromozomske aberacije u limfocitima pacijenata u ne-FA, FA* i FA grupama, kao i u FA podgrupama: mozaičnih i nemozaičnih FA pacijenata. Parametar Grupa N σ Interval Nº prekida/ćeliji FA 10 1,47 1,16 0,48 - 4,39 Nemozaična FA 4 2,40 1,37 1,31 - 4,39 Mozaična FA 6 0,85 0,37 0,48 - 1,51 Granična FA* 3 0,20 0,06 0,15 - 0,26 Ne-FA 77 0,02 0,03 0,00 - 0,08 Aberantne ćelije (%) FA 10 52,52 18,50 32,00 - 82,00 Nemozaična FA 4 72,81 7,36 64,00 - 82,00 Mozaična FA 6 39,00 5,90 32,00 - 49,00 Granična FA* 3 15,67 5,51 12,00 - 22,00 Ne-FA 77 1,82 1,53 0,00 - 6,00 Nº prekida/ multiaberantnoj ćeliji FA 10 3,70 1,30 2,33 - 6,78 Nemozaična FA 4 4,51 1,63 3,12 - 6,78 Mozaična FA 6 3,16 0,75 2,33 - 4,32 Granična FA* 3 2,00 0,00 2,00 - 2,00 Ne-FA 77 0,55 1,85 0,00 - 2,67 4.1.1.1.1.2. Indeks indukovane fragilnosti hromozoma Kombinovanjem dva parametra: procenat aberantnih ćelija i broj prekida/multiaberantnoj ćeliji dobijene su vrednosti indeksa fragilnosti hromozoma (CFI), a prema formuli (Castella i dr. 2011): [CFI = (% aberantnih ćelija) x (broj prekida/ multiaberantnoj ćeliji)], u ne-FA, FA*, mozaičnoj FA i nemozaičnoj FA podgrupi pacijenata (tabela 8). Tabela 8. Indeks DEB-om (24h) indukovane fragilnosti hromozoma (I-CFI) limfocita u: neFA, FA* grupi i FA podgrupama: nemozaičnih FA i mozaičnih FA pacijenata. Grupa N σ Raspon FA 10 197,48 150,66 73,99 – 555,96 Nemozaična FA 4 336,75 115,64 199,68 – 555,96 Mozaična FA 6 104,63 21,46 73,99 – 138,24 Granična FA* 3 31,33 11,02 24,00 – 44,00 Ne-FA 77 0,53 1,82 0,00 – 8,00 REZULTATI 53 Rasponi I-CFI28 vrednosti, pri indukciji DEB-om, za FA, graničnu FA* i ne-FA grupu se nisu međusobno preklapali (tabela 8). Na osnovu dobijenih vrednosti ovog istog parametra u FA grupi bolesnika bilo je moguće, takođe jasno razlikovati mozaične od nemozaičnih FA pacijenata (slika 9). Slika 9. Distribucija I-CFI vrednosti indukovanih DEB-om (24h) u limfocitima pacijenata u ne-FA, FA*, mozaičnoj FA i nemozaičnoj FA podgrupi. U uzorku od 90 pacijenata sa kliničkom slikom FA, analizom hromozomske nestabilnosti u limfocitima, primenom DEB testa, utvrđeno je da:  FA pacijenti (11,11%) imaju I-CFI > 73 i to: nemozaični FA (4,44%) imaju I-CFI > 199, a mozaični FA (6,67%) pacijenti imaju 73 < I-CFI < 139,  ne-FA pacijenti (85,56%) imaju I-CFI < 9,  granični FA* pacijenti (3,33%) imaju 23 < I-CFI < 45. 28 I-CFI – eng. Induced-CFI REZULTATI 54 4.1.1.1.1.3. Uticaj dužine trajanja indukcije DEB-om na hromozomsku nestabilnost kod pacijenata u FA i graničnoj FA* grupi Poređenjem vrednosti procenta aberantnih ćelija kod četiri pacijenta iz FA i granične FA* grupe za dva različita vremena indukcije DEB-om: 24h i 48h, uočeno je neznatno povećanje (oko 1,43 puta) u korist 48-časovne indukcije (tabela 9). Tabela 9. DEB-om indukovane (24h i 48h) hromozomske aberacije u limfocitima pacijenata u FA, graničnoj FA*, ne-FA i kontrolnoj grupi. Grupa N N° prekida/ćeliji Aberantne ćelije (%) σ Interval σ Interval 24h -indukovane hromozomske aberacije FA 10 1,47 1,16 0,48 - 4,39 52,52 18,50 32,00 - 82,00 FA* 3 0,20 0,06 0,15 - 0,26 15,67 5,51 12,00 - 22,00 ne-FA 77 0,02 0,03 0,00 - 0,08 1,82 1,53 0,00 - 6,00 Kontrolna 87 0,02 0,02 0,00 - 0,17 1,41 1,60 0,00 - 8,00 48h -indukovane hromozomske aberacije FA 4 2,01 1,70 0,56 - 4,47 55,53 21,05 38,00 - 86,11 FA* 2 0,32 0,17 0,20 - 0,44 22,00 9,90 14,00 - 28,00 Ne-FA 10 0,04 0,04 0,01 - 0,08 3,60 3,03 1,00 - 8,00 Kontrolna 6 0,04 0,01 0,02 - 0,06 3,67 0,82 2,00 - 4,00 Upoređivanjem broja prekida po ćeliji u FA i graničnoj FA* grupi pacijenata, nakon indukcije DEB-om u trajanju od 48h, zabeležene su vrednosti ovog parametra, koje su u proseku bile oko 1,50 puta veće u odnosu na 24-časovnu indukciju. REZULTATI 55 4.1.1.1.2. Analiza spontane hromozomske nestabilnosti u kulturama limfocita periferne krvi Citogenetička analiza u kulturi limfocita periferne krvi, u ispitivanom uzorku pacijenata sa kliničkom slikom FA, pokazala je da se intervali vrednosti svih parametara spontane hromozomske nestabilnosti u FA, graničnoj FA* i ne-FA grupi, međusobno preklapaju (tabele 10 i 11). Tabela 10. Spontane hromozomske aberacije u limfocitima pacijenata u ne-FA i FA* grupama, kao i u FA podgrupama: mozaičnih i nemozaičnih FA pacijenata. Parametar Grupa N σ Raspon Nº prekida/ćeliji FA 10 0,14 0,13 0,00 - 0,39 Nemozaična FA 4 0,20 0,15 0,01 - 0,39 Mozaična FA 6 0,10 0,09 0,00 - 0,27 Granična FA* 3 0,08 0,03 0,06 - 0,12 Ne-FA 77 0,01 0,01 0,00 - 0,06 Aberantne ćelije (%) FA 10 10,50 9,17 0,00 - 29,00 Nemozaična FA 4 15,50 11,47 1,00 - 29,00 Mozaična FA 6 7,17 6,24 0,00 - 18,00 Granična FA* 3 8,00 3,61 5,00 - 12,00 Ne-FA 77 0,98 1,27 0,00 - 6,00 Nº prekida/ multiaberantnoj ćeliji FA 10 1,57 1,12 0,00 - 2,80 Nemozaična FA 4 1,73 1,18 0,00 - 2,50 Mozaična FA 6 1,47 1,18 0,00 - 2,80 Granična FA* 3 0,67 1,15 0,00 - 2,00 Ne-FA 77 0,18 0,58 0,00 - 2,00 Napomena: Stopa spontane hromozomske nestabilnosti je u FA grupi bila uvećana oko 10 puta prema procentu aberantnih ćelija i 14 puta prema broju prekida/ćeliji, u odnosu na vrednosti odgovarajućih parametara ne-FA grupe. Analizom spontanih hromozomskih aberacija je utvrđeno da se grupe FA, graničnih FA* i ne-FA pacijenata ne mogu međusobno razlikovati, na osnovu parametara ove analize. REZULTATI 56 Tabela 11. Indeks spontane fragilnosti hromozoma (S-CFI) u limfocitima pacijenata u: ne-FA, FA* grupi, i FA podgrupama: nemozaičnih i mozaičnih FA pacijenata. Grupa N σ Raspon FA 10 22,64 24,50 0,00 – 70,47 Nemozaična FA 4 35,49 28,81 0,00 – 70,47 Mozaična FA 6 14,07 19,04 0,00 – 50,40 Granična FA* 3 3,33 5,77 0,00 – 10,00 Ne-FA 77 0,34 1,60 0,00 – 10,00 Napomena: Indeks spontane fragilnosti hromozoma u FA grupi je bio oko sedam puta veći od indeksa ne-FA grupe, ali su se intervali vrednosti ove dve grupe preklapali. 4.1.1.2. Analiza hromozomske nestabilnosti u kulturama fibroblasta kože primenom DEB testa U grupi od 10 pacijenata sa kliničkom slikom FA, koji su se na osnovu rezultata citogenetičke analize DEB testom na limfocitima izdvojili od ostalih pacijenata, uočene su dve podgrupe: FA pacijenti označeni kao nemozaični tip FA i FA pacijenti sa mozaičnom formom ove bolesti. Pacijenti koji su u odgovoru na DEB pokazali granične vrednosti procenta aberantnih ćelija i broja prekida/ćeliji (FA*) posmatrani su, takođe kao mozaični FA pacijenti. U cilju potvrde ili isključenja mozaičnog fenotipa FA dobijenog na limfocitima, bilo je neophodno uraditi ovu istu analizu na fibroblastima kože. 4.1.1.2.1. Analiza hromozomske nestabilnosti primenom DEB testa na fibroblastima kože zdravih osoba U cilju utvrđivanja vrednosti parametara hromozomske nestabilnosti u kulturama fibroblasta kože zdravih osoba, sprovedena je citogenetička analiza na uzorcima sedam ovakvih osoba (kontrolna grupa). Procenat aberantnih ćelija indukovan DEB-om (24h) u ovoj grupi se kretao u rasponu od 0% - 6%, dok je interval broja prekida/ćeliji iznosio: 0,00 – 0,06 (tabela 12). REZULTATI 57 Tabela 12. Spontane i DEB-om indukovane (24h) hromozomske aberacije u fibroblastima pacijenata u FA, FA* i kontrolnoj grupi. Hromozomske aberacije Parametar Pacijenti N σ Interval Spontane N° prekida/ćeliji Mozaični FA 6 0,04 0,06 0,00 - 0,15 Granični FA* 1 0,32 - - Kontrolni 7 0,01 0,01 0,00 - 0,02 Aberantne ćelije (%) Mozaični FA 6 4,00 5,90 0,00 - 15,00 Granični FA* 1 24,00 - - Kontrolni 7 0,57 0,68 0,00 - 2,00 24h DEB-om indukovane N° prekida/ćeliji Mozaični FA 6 0,18 0,14 0,02 - 0,38 Granični FA* 1 0,58 - - Kontrolni 7 0,02 0,02 0,00 - 0,06 Aberantne ćelije (%) Mozaični FA 6 15,50 12,13 2,00 - 34,00 Granični FA* 1 38,70 - - Kontrolni 7 1,86 1,95 0,00 - 6,00 4.1.1.2.2. Analiza hromozomske nestabilnosti primenom DEB testa na fibroblastima kože pacijenata sa mozaičnim tipom FA Kod šest pacijenata iz mozaične FA podgrupe (№ FA-2, -3, -4, -5, -6 i -9) analizirana je hromozomska osetljivost na DEB u fibroblastima kože. Povećane vrednosti hromozomskih aberacija u fibroblastima pod indukcijom u odnosu na kontrolnu grupu, uočene su kod četiri (4/6 ili 66,67%) FA pacijenta (№ FA-2, -5, -6 i - 9) (tabela 12). Kod pacijenta označenog kao № FA-4, nađene su granične vrednosti, dok su se vrednosti pacijenta № FA-3, nalazile u granicama kontrolne grupe (tabela 13). Srednje vrednosti procenta aberantnih fibroblasta i broja prekida/ćeliji u mozaičnoj FA podgrupi pacijenata su bile oko osam, odnosno devet puta veće nego u kontrolnoj grupi (tabela 12). Iako je u ove dve grupe zabeleženo delimično preklapanje raspona dobijenih vrednosti, postojala je statistički značajna razlika između njih (Mann- Whitneyjev test: p < 0,01). REZULTATI 58 Tabela 13. Spontane i DEB-om indukovane (24h) hromozomske aberacije u fibroblastima pacijenata u mozaičnoj FA podgrupi. Pacijent Spontane hromozomske aberacije DEB-indukovane (24h)hromozomske aberacije Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Nº prekida/ aberantnoj ćeliji Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Nº prekida/ aberantnoj ćeliji FA-2. 0,06 6,00 1,00 0,38 34,00 1,12 FA-3. 0,00 0,00 0,00 0,02 2,00 1,00 FA-4. 0,00 0,00 0,00 0,08 6,00 1,33 FA-5. 0,03 3,00 1,00 0,10 10,00 1,00 FA-6. 0,00 0,00 0,00 0,17 16,00 1,06 FA-9. 0,15 15,00 1,00 0,30 25,00 1,20 0,04 4,00 0,50 0,18 15,50 1,12 σ 0,06 5,90 0,55 0,14 12,13 0,13 Na osnovu ovih rezultata kod četiri od ukupno šest pacijenata koji su nakon DEB testa na limfocitima periferne krvi svrstani u mozaičnu FA podgrupu, potvrđen je fenotip FA i na fibroblastima kože. 4.1.1.2.3. Analiza hromozomske nestabilnosti primenom DEB testa na fibroblastima kože graničnog FA* pacijenta Kod jednog (FA*-2) od tri bolesnika sa graničnim vrednostima DEB testa na limfocitima, nakon analize fibroblasta kože nađeno je povećano prisustvo kako spontanih, tako i 24h DEB-om indukovanih hromozomskih aberacija, u odnosu na odgovarajuće vrednosti kontrolne grupe (tabela 12). Citogenetičkom analizom fibroblasta kože kod ovog pacijenta je potvrđen fenotip FA. REZULTATI 59 4.1.2. ANALIZA OŠTEĆENJA DNK PRIMENOM ALKALNOG KOMET TESTA U citogenetičkoj analizi (DEB test) limfocita periferne krvi bolesnika sa kliničkom slikom FA, tri od ukupno 90 pacijenata nije bilo moguće svrstati u FA ili u ne-FA grupu, pa su stoga označeni kao granični FA* pacijenti. U cilju precizne klasifikacije ovakvih bolesnika, ispitivana su oštećenja na nivou genomske DNK (komet test), prvo kod klinički zdravih osoba, a zatim kod citogenetički već potvrđenih FA pacijenata, kao i kod pacijenata iz ne-FA grupe. U Laboratoriji Katedre za mikrobiologiju, Biološkog fakulteta u Beogradu, primenom alkalnog komet testa za detekciju jednolančanih i dvolančanih oštećenja molekula DNK analizirani su uzorci limfocita: šest zdravih osoba (kontrolna grupa), pet pacijenata iz FA grupe (FA-nemozaični: № FA-8 i -10; FA-mozaični: № FA-4, -6 i -9), dva pacijenta iz granične FA* grupe (№ FA*-1 i -2), kao i 10 pacijenata iz ne-FA grupe. Analizirana su spontana i DEB-om indukovana (24h i 48h) oštećenja DNK. Kao parametar analize korišćen je Olive-moment repa, odnosno srednja vrednost Olive- momenta repa u uzorku pacijenta (OTM). 4.1.2.1. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita zdravih osoba U cilju korišćenja komet testa za detekciju oštećenja DNK na nivou pojedinačnih ćelija i potvrdu, odnosno isključenje fenotipa FA, bilo je pre svega potrebno odrediti intervale variranja OTM vrednosti u kontrolnoj grupi. Ovom analizom su formirane granične vrednosti spontanih i DEB-om indukovanih oštećenja molekula DNK zdravih osoba (negativnih na komet testu), koje je bilo moguće uporediti sa odgovarajućim vrednostima kod bolesnika sa kliničkim znacima FA (tabela 14). REZULTATI 60 Tabela 14. Spontana i DEB-om indukovana (24h i 48h) oštećenja DNK limfocita u: FA, FA*, ne-FA i kontrolnoj grupi, izražena u OTM vrednostima uzorka. Grupa N OTM σ Interval Spontana DNK oštećenja FA 5 3,14 0,51 2,63 – 3,93 FA* 2 3,31 2,52 1,53 – 5,10 Ne-FA 10 1,77 0,96 0,81 – 3,58 Kontrolna 6 1,49 0,39 0,94 – 1,85 24h indukovana DNK oštećenja FA 5 4,27 1,44 2,72 – 6,04 FA* 2 3,32 2,06 1,86 – 5,56 Ne-FA 10 2,21 1,24 0,87 – 4,21 Kontrolna 6 1,53 0,37 0,84 – 1,83 48h indukovana DNK oštećenja FA 5 5,46 2,73 2,09 – 9,19 FA* 2 2,42 0,85 1,82 – 3,03 Ne-FA 10 2,34 0,82 1,08 – 3,73 Kontrolna 6 2,07 0,42 1,35 – 2,50 4.1.2.2. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita FA pacijenata Kao što se u tabeli 14. može videti, svih pet FA pacijenata je pokazalo povećane vrednosti oštećenja DNK nastalih bez indukcije u odnosu na kontrole (oko dva puta više) (tabela 14). Intervali OTM vrednosti u ove dve grupe su se jasno razdvojili tako da ih je bilo moguće statistički značajno razlikovati (t-test p < 0,01) (tabela 14). Analizom uzoraka limfocita u FA grupi pacijenata, utvrđeno je povećanje vrednosti oštećenja DNK pod indukcijom (DEB u trajanju od 24h i 48h) u odnosu na spontano nastala oštećenja (u proseku oko 1,3 do 1,7 puta više) (tabela 14). Srednja OTM vrednost indukovana DEB-om u grupi FA pacijenata je bila preko dva i po puta veća nego u kontrolnoj grupi (tabela 14). Rasponi OTM vrednosti u ove dve grupe, dobijeni nakon 24-časovnog dejstva DEB-a, se nisu preklapali i razlika između grupa je bila statistički značajna (t-test: p < 0,01). Mada su se intervali istih vrednosti pod 48- časovnom indukcijom u ispitivanim grupama delimično preklapali, ipak ih je bilo moguće statistički značajno razlikovati (t-test: p = 0,01) (slika 10). REZULTATI 61 Slika 10. Oštećenja DNK u FA i kontrolnoj grupi pacijenata nastala spontano i DEB-om indukovano 24h i 48h. Analiza komet testom je potvrdila ćelijski fenotip FA kod svih pet pacijenata kod kojih je otkrivena povećana hromozomska osetljivost, odnosno pozitivan odgovor na DEB, bilo mozaičnog ili nemozaičnog tipa (tabela 15). Rezultati dobijeni u kontrolnoj i FA grupi pacijenata su korišćeni kao referentne vrednosti pri klasifikovanju pacijenata sa kliničkim znacima FA, koji su citogenetičkom analizom (DEB test) dali granične (FA* grupa) ili negativne rezultate (ne-FA grupa). Tabela 15. Spontana i DEB-om indukovana (24h i 48h) oštećenja DNK limfocita kod pet FA pacijenata. Podgrupe FA pacijenata Pacijent OTM Spontana oštećenja DEB-om 24h indukovana oštećenja DEB-om 48h indukovana oštećenja Nemozaična FA-8. 2,63 5,56 6,97 FA-10. 2,87 3,65 2,09 ± σ 2,75±0,17 4,60±1,35 4,53±3,45 Mozaična FA-4. 3,34 2,72 4,99 FA-6. 2,93 3,39 4,04 FA-9. 3,93 6,04 9,19 ± σ 3,40±0,51 4,05±1,76 6,07±2,74 UKUPNO 3,14 4,27 5,46σ 0,51 1,44 2,73 REZULTATI 62 4.1.2.3. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita FA* pacijenata U cilju potvrde, odnosno isključenja fenotipa FA, komet analiza sprovedena na uzorcima dva pacijenta sa graničnim vrednostima DEB testa (N° FA*-1 i -2) pokazala je povećana oštećenja DNK kod jednog od njih (FA*-2; tabela 16). Naime, OTM vrednosti ovog pacijenta su se nalazile u granicama vrednosti nađenim u FA grupi (tabele 14 i 16), tako da je na osnovu rezultata ove analize potvrđen fenotip FA. Kod drugog FA* pacijenta (FA*-1) nisu nađena značajna oštećenja DNK, u odnosu na kontrolnu grupu (tabela 16). Tabela 16. Spontana i DEB-om indukovana (24h i 48h) oštećenja DNK limfocita kod dva FA* granična pavijenta. Pacijent OTM Spontana oštećenja DEB-om 24h indukovana oštećenja DEB-om 48h indukovana oštećenja FA*-1. 1,53 1,86 1,82 FA*-2. 5,10 4,78 3,03 3,31 3,32 2,42 σ 2,52 2,06 0,85 4.1.2.4. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita ne-FA pacijenata S obzirom na osetljivost alkalnog komet testa, pre svega u pogledu mogućnosti detekcije oštećenja DNK u svim fazama ćelijskog ciklusa, a ne samo tokom deobe, ova metoda je korišćena za ispitivanje eventualnih oštećenja genomske DNK kod pacijenata koji su imali kliničke znake FA, a koji su bili negativni na DEB testu (ne-FA grupa). Od ukupno 77 pacijenata u ne-FA grupi, kod 10 pacijenata čiji su uzorci limfocita bili dostupni za dalje analize, primenjen je alkalni komet test. Analize su pokazale da se četiri pacijenta (N° ne-FA-3, -4, -5 i -7) izdvojilo u pogledu oštećenja DNK pod indukcijom (DEB, 24h), u odnosu na ostale (tabela 17). Kod ovih pacijenata OTM vrednosti su bile u intervalu odgovarajućih vrednosti FA grupe (tabele 14 i 17). Preostalih šest ne-FA pacijenata (N° ne-FA-1, -2, -6, -8, -9 i -10) (tabela 17) je pokazalo OTM vrednosti u granicama kontrolnih uzoraka, tako da je kod njih i ovom vrstom analize potvrđeno da se radi o ne-FA pacijentima (negativni na komet testu). REZULTATI 63 Tabela 17. Spontana i DEB-om indukovana (24h i 48h) oštećenja DNK limfocita kod 10 ne-FA pacijenata. Pacijent OTM Spontana oštećenja DEB-om 24h indukovana oštećenja DEB-om 48h indukovana oštećenja ne-FA-1. 1,39 1,22 2,17 ne-FA-2. 1,12 1,88 1,83 ne-FA-3. 2,79 3,23 2,82 ne-FA-4. 3,58 3,21 3,73 ne-FA-5. 1,72 3,57 2,20 ne-FA-6. 0,98 0,87 2,21 ne-FA-7. 2,87 4,21 3,60 ne-FA-8. 1,43 1,93 1,99 ne-FA-9. 0,81 0,92 1,08 ne-FA-10. 1,01 1,03 1,79 1,77 2,21 2,34 σ 1,41 1,90 2,19 4.1.2.5. Rezultati komet analize na limfocitima pacijenata sa kliničkom slikom FA Analiza komet testom, kojom je obuhvaćeno ukupno 17 pacijenata sa kliničkom slikom FA (pet FA, dva FA* i 10 ne-FA), pokazala je da 10 pacijenata (pet FA, jedan FA* i četiri ne-FA) ima povećana DEB-om (24h) indukovana oštećenja DNK (komet- pozitivni, K+) (tabele 18 i 19). Preostalih sedam pacijenata (jedan FA* i šest ne-FA) ima negativne rezultate ovog testa (K-) (tabele 18 i 19). Tabela 18. Spontana i DEB-om indukovana (24h i 48h) oštećenja DNK u limfocitima pacijenata pozitivnih (K+) i negativnih na komet testu (K–) u: FA, FA* i ne-FA grupama pacijenata. Oštećenja DNK Grupa N OTM σ Interval Spontana K+ 10 3,17 0,90 2,63 – 5,10K– 7 1,18 0,27 0,81 – 1,53 24h DEB-om indukovana K+ 10 4,04 1,09 2,72 – 6,04 K– 7 1,39 0,48 0,87 – 1,93 48h DEB-om indukovana K+ 10 4,27 2,25 2,09 – 9,19 K– 7 1,84 0,38 1,08 – 2,21 REZULTATI 64 Tabela 19. Rezultati analize komet testom u zavisnosti od grupa pacijenata prema rezultatima citogenetičke analize (DEB test). Rezultati analize komet testom (24h-DEB-om indukovana oštećenja) Grupa (prema citogenetičkoj analizi) K+ K- UKUPNO FA 5 0 5 FA* 1 1 2 Ne-FA 4 6 10 UKUPNO 10 7 17 U grupi pacijenata sa pozitivnim rezultatima komet analize postojala je slaba pozitivna korelacija između OTM vrednosti dobijenih u kulturama bez i sa indukcijom DEB-om (24h) koja nije bila statistički značajna (Pearsonov test: r > 0,30; p > 0,05). Uočena je i pozitivna korelacija (Pearsonov test: r = 0,70) OTM vrednosti kod DEB-om 24h tretiranih uzoraka K+ pacijenata, u odnosu na 48h tretirane, koja se u ovom slučaju pokazala kao statistički značajna (p = 0,02) (slika 11). OTM/ćelij i indukovan DEB-om: 24h vs. 48h Korelacija (Pearsonov test): r = 0.70; p = 0.02 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 Oštećenja indukovana DEB-om 24h (OTM/ćelij i) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 O šte ćenja indukovana D EB-om 48h (O TM /ćeliji) 95% pouzdanost Slika 11. Korelacija oštećenja DNK indukovanih 24h DEB-om sa oštećenjima indukovanim 48h u K+ grupi pacijenata. Oštećenja DNK (OTM) indukovana DEB-om: 24h vs. 48h Oštećenja DNK indukovana DEB-om 24h O št eć en ja D N K in du ko va na D EB - o m 48 h REZULTATI 65 4.1.3. PROTOČNO CITOMETRIJSKA ANALIZA ĆELIJSKOG CIKLUSA Kod pacijenata koji su analizom hromozomske nestabilnosti DEB testom dali granične (FA* grupa) i negativne vrednosti (ne-FA grupa), a komet analizom pokazali fenotip FA sa značajnim oštećenjima DNK, bilo je neophodno utvrditi da li dolazi do zastoja njihovih ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa, u cilju konačne potvrde ili isključenja ćelijskog fenotipa FA. Primenom ove analize prvo na kulturama limfocita periferne krvi zdravih osoba, a zatim i kod pacijenata u FA, graničnoj FA* i ne-FA grupi, i njihovim međusobnim poređenjem bilo bi moguće, i dodatno potvrditi ili isključiti fenotip FA. Kod FA pacijenata, kod kojih nije bio dostupan uzorak periferne krvi, analiza ćelijskog ciklusa je sprovedena u kulturama fibroblasta kože. Dobijeni rezultati su prikazani u vidu procenta ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa kojim su pored G2/M bile obuhvaćene još i, G0/G1 i S faza. 4.1.3.1. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturi limfocita periferne krvi Analiza ćelijskog ciklusa je urađena na uzorcima limfocita: dve zdrave osobe (kontrolna grupa), pet pacijenata FA grupe (№ FA-4, -6, -8, -9 i -10), dva pacijenta granične FA* grupe (№ FA*-1 i -2), kao i sedam pacijenata ne-FA grupe. U kulturama limfocita periferne krvi ovih osoba, ispitivan je spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj ćelijskog ciklusa u G2 fazi. 4.1.3.1.1. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod zdravih osoba Pre analize ćelijskog ciklusa FA i graničnih FA* pacijenata, bilo je neophodno uraditi ovu analizu na uzorcima zdravih osoba, kako bi se utvrdile vrednosti procenta ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa u kontrolnoj grupi. U tu svrhu su korišćene netretirane i DEB-om tretirane (24h i 48h) kulture limfocita periferne krvi dve klinički zdrave osobe. Rezultati su pokazali da se 2,83% ± 1,80% limfocita zdravih kontrola nalazi u G2 fazi pod indukcijom DEB-om u trajanju od 24h, a da se vrednosti kreću u intervalu od 1,56% – 4,11%, dok su se pod 48-časovnom indukcijom vrednosti zastoja kretale u rasponu od 4,34% – 7,21% (srednja vrednost: 5,78% ± 2,03%) (tabela 20). REZULTATI 66 Tabela 20. Spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj limfocita (procenat ćelija) u G2 fazi ćelijskog ciklusa pacijenata u FA, FA*, ne-FA i kontrolnoj grupi. Zastoj u G2 fazi Grupa N σ Raspon Spontani FA 5 14,63 2,73 11,20 – 18,48 FA* 2 11,88 8,98 5,53 – 18,24 ne-FA 7 7,67 3,08 3,69 – 13,73 kontrolna 2 6,77 1,29 5,86 – 7,68 24h DEB-om indukovani FA 5 7,76 2,24 4,41 – 10,45 FA* 2 6,03 1,30 5,11 – 6,95 ne-FA 7 3,80 1,51 0,69 – 5,31 kontrolna 2 2,83 1,80 1,56 – 4,11 48h DEB-om indukovani FA 5 13,42 8,76 4,31 – 26,95 FA* 2 7,98 3,14 5,76 – 10,20 ne-FA 7 8,85 3,44 4,01 – 15,63 kontrolna 2 5,78 2,03 4,34 – 7,21 4.1.3.1.2. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod FA pacijenata U cilju analize zastoja limfocita u G2 fazi korišćeni su uzorci pet pacijenata FA grupe, pozitivnih na DEB testu (№ FA-4, -6, -8, -9 i -10). Srednja vrednost procenta limfocita, spontano zaustavljenih u G2 fazi ćelijskog ciklusa, u FA grupi je iznosila: 14,63% ± 2,73%, sa rasponom vrednosti od 11,20% – 18,48% (tabele 20 i 21). Zastoj limfocita ovih pacijenata indukovan DEB-om bio je nešto niži, i iznosio je: 7,76% ± 2,24% pri 24-časovnom dejstvu DEB-a i 13,42% ± 8,76% pri 48-časovnoj indukciji, ali je u oba slučaja bio oko dva i po puta, odnosno dva puta veći nego u kontrolnoj grupi (tabele 20). U slučaju spontanog i DEB-om 24h indukovanog zastoja intervali procenta ćelija u G2 fazi u ove dve grupe se nisu preklapali (tabela 20). REZULTATI 67 Tabela 21. Spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod pet FA pacijenata. Pacijent Ćelije u G2 fazi (%) Spontani zastoj u G2 fazi DEB-om 24h indukovani zastoj u G2 fazi DEB-om 48h indukovani zastoj u G2 fazi FA-4. 15,02 10,45 13,15 FA-6. 11,20 4,41 15,39 FA-8. 18,48 7,71 4,31 FA-9. 15,38 8,92 7,31 FA-10. 13,08 7,32 26,95 14,63 7,76 13,42 σ 2,73 2,24 8,76 Kod svih pet FA pacijenata je potvrđen fenotip FA u vidu povećanog zastoja limfocita periferne krvi u G2 fazi ćelijskog ciklusa indukovanog 24-časovnim dejstvom DEB-a. Analiza t-nezavisnim testom je pokazala značajnu razliku između kontrolne i FA grupe pacijenata (p < 0,05). Pri indukciji zastoja limfocita DEB-om u trajanju od 48h došlo je do delimičnog preklapanja vrednosti, tako da na osnovu ovog parametra nije bilo moguće izdvojiti FA pacijente od zdravih kontrola (tabela 21). 4.1.3.1.3. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod FA* pacijenata Kulture limfocita periferne krvi dva pacijenta (№ FA*-1 i -2) sa graničnim vrednostima DEB testa, analizirane su protočno citometrijskim metodama u cilju potvrde ili isključenja ćelijskog fenotipa FA. Rezultati su pokazali da se procenti limfocita u G2 fazi pod 24-časovnom indukcijom DEB-om kod oba pacijenta nalaze na donjoj granici raspona vrednosti istog parametra u FA grupi (tabele 20 i 22). Protočno citometrijskom analizom kod oba granična FA* pacijenata (№ FA*-1 i - 2) je utvrđeno da dolazi do zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa, što je karakteristično za fenotip FA (tabela 22). REZULTATI 68 Tabela 22. Spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod dva FA* granična pacijenta. Pacijent Ćelije u G2 fazi (%) Spontani zastoj u G2 fazi DEB-om 24h indukovani zastoj u G2 fazi DEB-om 48h indukovani zastoj u G2 fazi FA*-1. 18,24 6,95 10,20 FA*-2. 5,53 5,11 5,76 11,88 6,03 7,98 σ 8,98 1,30 3,14 4.1.3.1.4. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod ne-FA pacijenata Kod pacijenata sa negativnim rezultatima DEB testa na limfocitima, a s obzirom na rezultate alkalnog komet testa, primenjena je protočno citometrijska analiza u cilju ispitivanja procenta ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa, odnosno fenotipa FA. Analiza ćelijskog ciklusa urađena kod sedam pacijenata iz ne-FA grupe, kod kojih je sproveden i komet test, pokazala je da se intervali procenata DEB-om tretiranih (24h) limfocita u G2 fazi ovih, ne-FA i pacijenata FA grupe, delimično preklapaju (tabela 20). Ipak, statističkom analizom (t-nezavisni test) je utvrđeno postojanje značajne razlike među ispitivanim grupama (p < 0,05). Uzrok delimičnog preklapanja je bio u vrednostima indukovanog (DEB, 24h) zastoja dva ne-FA pacijenta (28,57% или 2/7) (№ ne-FA-2 i -5) (tabela 23), koji se nalazio na donjoj granici intervala istih vrednosti u FA grupi (tabela 20). Kod preostalih pet (71,43% или 5/7) ne-FA pacijenata (№ ne-FA- 1, -3, -4, -6 i -7) nije utvrđeno da dolazi do zastoja ćelijskog ciklusa nakon 24-časovnog dejstva DEB-a (tabele 20 i 23). REZULTATI 69 Tabela 23. Spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod sedam pacijenata ne-FA grupe. Pacijent Ćelije u G2 fazi (%) Spontani zastoj u G2 fazi DEB-om 24h indukovani zastoj u G2 fazi DEB-om 48h indukovani zastoj u G2 fazi ne-FA-1. 13,73 4,24 15,63 ne-FA-2. 8,70 4,87 8,85 ne-FA-3. 3,69 4,17 7,89 ne-FA-4. 7,57 0,69 4,01 ne-FA-5. 6,57 5,31 8,51 ne-FA-6. 6,35 4,01 8,20 ne-FA-7. 7,07 3,32 8,93 7,76 3,80 8,85 σ 3,08 1,51 3,44 Poređenjem rezultata komet testa, kao i rezultata analize ćelijskog ciklusa, kod pacijenta № ne-FA-5 kod koga su nađena povećana oštećenja DNK, uočen je i 24h DEB-om indukovani zastoj limfocita u okviru raspona vrednosti istog parametra karakterističnog za ćelije FA pacijenata. Pacijent № ne-FA-2, čiji je procenat limfocita u G2 fazi odgovarao vrednostima FA grupe, nije pokazao oštećenja DNK u limfocitima analiziranim komet testom (tabele 17 i 23). Međutim, kod tri bolesnika: № ne-FA-3, -4 i -7, kod kojih su komet testom nađena povećana oštećenja na molekulu DNK, analizom ćelijskog ciklusa nije utrvrđeno da dolazi do povećanog zastoja limfocita u G2 fazi (tabele 17 i 23). 4.1.3.1.5. Rezultati protočno citometrijske analize na limfocitima pacijenata sa kliničkom slikom FA Protočno citometrijska analiza limfocita periferne krvi urađena kod ukupno 14 pacijenata sa kliničkim znacima FA (pet FA, dva FA* i sedam ne-FA), pokazala je da devet od 14 bolesnika (pet FA, dva FA* i dva ne-FA) ima povećani DEB-om (24h) indukovani zastoj limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa (G2+) (tabele 24 i 25). Vrednosti istog parametra kod preostalih pet ne-FA pacijenata se nisu razlikovale od vrednosti dobijenih u kontrolnoj grupi (G2-) (t-test: p < 0,05). REZULTATI 70 Tabela 24. Spontani i DEB-om indukovani (24h) zastoj limfocita u G2 fazi u G2+ i G2– grupi pacijenata. Zastoj limfocita u G2 fazi Grupa N Ćelije u G2 fazi (%) σ Interval Spontani G2+ 9 12,47 4,79 5,53 – 18,48 G2– 5 7,68 3,70 3,69 – 13,73 24h DEB-om indukovani G2+ 9 6,78 2,05 4,41 – 10,45 G2– 5 3,28 1,49 0,69 – 4,24 U grupi pacijenata sa povećanim zastojem (G2+), postoji pozitivna korelacija između procenta ćelija u G2 fazi u netretiranim i DEB-om (24h) tretiranim kulturama limfocita periferne krvi, koja je bila statistički značajna (Pearsonov test: r = 0,68; p < 0,05) (slika 12). Tabela 25. Rezultati protočno citometrijske analize u zavisnosti od grupa pacijenata prema rezultatima DEB-ovog testa (citogenetičkom analizom). Rezultati zastoja limfocita u G2 fazi (DEB, 24h) Grupa (prema citogenetičkoj analizi) G2+ G2- UKUPNO FA 5 0 5 FA* 2 0 2 Ne-FA 2 5 7 UKUPNO 9 5 14 Scatterplot: Var1 vs. Var4 (Casewise MD deletion) Var4 = 3,1837 + ,28869 * Var1 Correlation: r = ,67618 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Var1 4 5 6 7 8 9 10 11 V ar4 95% confidence Slika 12. Korelacija spontanog i 24h DEB-om indukovanog zastoja limfocita u G2 fazi kod devet G2+ pacijenata. Spontani vs. 24h DEB-om indukovani zastoj % ćelija spontano prisutnih u G2 fazi% ć el ija u G 2 fa zi p od 2 4h - in du kc ijo m D EB - o m REZULTATI 71 4.1.3.2. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturi fibroblasta kože U cilju ispitivanja zastoja ćelija u G2 fazi, kao i potvrde fenotipa FA, kod pacijenata sa pozitivnim, ali mozaičnim odgovorom limfocita na DEB (FA grupa), protočno citometrijska analiza je urađena na kulturama fibroblasta kože. U tu svrhu su korišćeni uzorci četiri pacijenta FA grupe sa mozaičnim tipom bolesti i uzorci dve zdrave osobe (kontrole). 4.1.3.2.1. Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod zdravih osoba Analiza ćelijskog ciklusa u kulturi fibroblasta kože je prvo sprovedena na uzorcima dve zdrave osobe. Ispitivan je spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa kako bi se odredili rasponi vrednosti ovih parametara u kontrolnoj grupi. Na osnovu dobijenih rezultata prikazanih u tabeli 26. definisane su vrednosti procenta ćelija u G2 fazi, karakteristične za zdrave kontrole. Tabela 26. Spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj fibroblasta kože (procenat ćelija) u G2 fazi ćelijskog ciklusa pacijenata u FA i kontrolnoj grupi. Zastoj u G2 fazi Grupa N σ Raspon Spontani FA 4 11,68 2,55 9,03– 15,00 Kontrolna 2 12,19 0,61 11,76 – 12,62 24h DEB-om indukovani FA 4 15,74 7,18 7,12– 24,66 Kontrolna 2 7,20 3,86 4,48 – 9,93 48h DEB-om indukovani FA 4 15,01 3,37 11,61 – 19,46 Kontrolna 2 4,45 2,17 2,92 – 5,99 4.1.3.2.2. Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod pacijenata sa mozaičnom formom FA Kod četiri pacijenta iz FA grupe sa mozaičnim tipom bolesti analiziran je ćelijski ciklus fibroblasta kože, i to: dva pacijenta (N° FA-3 i -5) kod kojih periferna krv nije bila dostupna za ovu vrstu analize i dva FA pacijenta (N° FA-6 i -9) kod kojih je već uočen povećan DEB-om indukovani zastoj limfocita u G2 fazi (tabela 20). REZULTATI 72 Rezultati analize su pokazali da se intervali procenata fibroblasta pacijenta FA grupe, u G2 fazi, bilo spontano ili 24h-DEB-om indukovano, delimično preklapaju sa nalazima kontrolne grupe (tabele 26 i 27). Tabela 27. Spontani i DEB-om indukovani (24h i 48h) zastoj fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa kod pet FA pacijenata. Pacijent Ćelije u G2 fazi (%) Spontani zastoj u G2 fazi DEB-om 24h indukovani zastoj u G2 fazi DEB-om 48h indukovani zastoj u G2 fazi FA-3. 12,11 16,11 13,45 FA-5. 15,00 24,66 19,46 FA-6. 10,57 15,06 15,52 FA-9. 9,03 7,12 11,61 11,68 15,74 15,01 σ 2,55 7,18 3,37 Međutim, zastoj fibroblasta indukovan 48-časovnim dejstvom DEB-a kod četiri FA pacijenta se kretao u rasponu od 11,61% – 19,46%, bez preklapanja sa odgovarajućim vrednostima u kontrolnoj grupi (tabela 27). Na osnovu rezultata, dobijenih pod 48-časovnom indukcijom, bilo je moguće razlikovati FA grupu mozaičnih pacijenata od kontrolne grupe (t-test: p < 0,05), čime je dodatno potvrđen ćelijski fenotip FA ovih pacijenata. REZULTATI 73 4.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI 4.2.1. ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM BLEOMICINOVOG TESTA Poznato je da pacijenti oboleli od NSN, u svom kariotipu imaju spontano prisutne hromozomske aberacije čiji se procenat može specifično povećati primenom različitih radiomimetika, kao što je BLC. Ovo svojstvo ćelija pacijenata sa NSN je iskorišćeno u diferencijalnoj dijagnozi ovog oboljenja. 4.2.1.1. Rezultati analize BLC testom na limfocitima periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom NSN Analiza hromozomske nestabilnosti primenom BLC testa uspešno je urađena kod sedam od 10 pacijenata sa kliničkom slikom NSN, dok kod preostala tri pacijenata zbog malog mitotskog indeksa, nije bilo moguće uraditi ovu analizu. Kod svakog pacijenata, u odvojenim kulturama limfocita periferne krvi analizirane su spontane i BLC-om indukovane hromozomske aberacije (hromozomski i hromatidni prekidi, kao i strukturne aberacije koje uključuju hromozome 7, 14 i dr.). Osnovni parametri koji su analizirani u cilju procene hromozomske nestabilnosti bili su:  procenat aberantnih ćelija,  broj prekida po ćeliji i  procenat ćelija sa strukturnim rearanžmanima hromozoma. Četiri od sedam (57,14%) pacijenata sa kliničkim znacima NSN je pokazalo povećan procenat aberantnih ćelija i broja prekida po ćeliji, kao i niz hromozomskih rearanžmana indukovanih BLC-om, koji su uključivali hromozome 7 i 14 (slika 13), u odnosu na zdrave osobe kontrolne grupe (tabela 28). Ova grupa pacijenata, koja je imala pozitivan odgovor na BLC označena je kao NBS29 grupa (tabele 28 i 29). 29 NBS – eng. Nijmegen Breakage syndrome REZULTATI 74 Slika 13. BLC-om indukovane aberacije hromozoma u limfocitima pacijenata sa NSN: translokacija 7;14 (p14;q11). Kod preostala tri pacijenta procenat BLC-om indukovanih hromozomskih aberacija se nije statistički (χ2 test) razlikovao u odnosu na kontrolnu grupu, tako da je ta grupa pacijenata označena kao ne-NBS grupa (tabela 28). Tabela 28. Spontane i BLC-om indukovane hromozomske aberacije u limfocitima pacijenata u NBS, ne-NBS i kontrolnoj grupi. Hromozomske aberacije limfocita Parametar Grupa N σ Raspon Spontane Prekidi/ćeliji NBS 4 0,22 0,28 0,00 – 0,60 Ne-NBS 3 0,02 0,00 0,02 – 0,02 Kontrolna 6 0,01 0,02 0,00 – 0,06 Aberantne ćelije (%) NBS 4 12,5 15,52 0,00 – 32,00 Ne-NBS 3 1,67 0,58 1,00 – 2,00 Kontrolna 6 1,14 2,27 0,00 – 6,00 Indukovane Prekidi/ćeliji NBS 4 0,56 0,24 0,27 – 0,81 Ne-NBS 3 0,04 0,02 0,02 – 0,06 Kontrolna 6 0,05 0,04 0,02 – 0,13 Aberantne ćelije (%) NBS 4 33,67 5,69 26,67 – 40,00 Ne-NBS 3 4,00 2,00 2,00 – 6,00 Kontrolna 6 3,86 1,86 2,00 – 6,00 REZULTATI 75 U NBS grupi procenat aberantnih ćelija indukovanih BLC-om, odnosno broj prekida/ćeliji je bio oko osam, odnosno 14 puta veći nego odgovarajuće vrednosti u ne- NBS grupi (tabele 28 i 29). Rasponi vrednosti u ove dve grupe se nisu preklapali, kako u pogledu procenta aberantnih ćelija, tako i prema broju prekida/ćeliji (tabela 28). Tabela 29. Spontane i BLC-om indukovane hromozomske aberacije u limfocitima NBS pacijenata Pacijent Spontane hromozomske aberacije BLC-indukovane hromozomske aberacije Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Ćelije sa strukturnim aberacijama (%) Nº prekida/ ćeliji Aberantne ćelije (%) Ćelije sa strukturnim aberacijama (%) NBS-1. 0,00 0,00 0,00 0,47 32,00 10,00 NBS -2. 0,60 32,00 24,00 0,81 40,00 10,00 NBS -3. 0,23 23,08 0,00 0,27 26,67 0,00 NBS -4. 0,26 18,00 8,00 0,68 35,00 14,00 0,22 12,50 8,00 0,56 33,67 8,50 σ 0,28 15,52 0,43 0,24 5,69 5,97 4.2.2. ANALIZA PACIJENATA SA KLINIČKOM SLIKOM NSN PRIMENOM METODA MOLEKULARNE GENETIKE 4.2.2.1. Identifikacija homozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod pacijenata sa kliničkom slikom NSN Molekularnom analizom je obuhvaćeno ukupno sedam pacijenata sa kliničkom slikom NSN: četiri pacijenta iz NBS grupe i tri pacijenata kod kojih citogenetička analiza bila neuspešna. Kod svih sedam pacijenata je dokazano da su homozigotni nosioci c.657_661del5 mutacije u NBN genu i potvrđena je dijagnoza NSN (slika 14). REZULTATI 76 Slika 14. PCR produkti egzona 6 u NBN genu na PAGE gel elektroforezi za detekciju mutacije c.657_661del5: 1 – pacijent (homozigot za c.657_661del5), 2 i 3 – roditelji pacijenta (heterozigoti za c.657_661del5), 4 – kontrolni uzorak (homozigot za c.657_661del5) i 5 – kontrolni uzorak (nije nosilac mutacije). 4.2.2.2. Identifikacija heterozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod članova porodica obolelih od NSN U cilju identifikacije heterozigotnog statusa za mutaciju c.657_661del5 urađena je i molekularna analiza kod ukupno 13 članova porodica obolelih od NSN (12 roditelja i jedan brat). Kod svih 13 ispitivanih članova porodica, potvrđeno je heterozigotno prisustvo c.657_661del5 mutacije u NBN genu. 77 5. DISKUSIJA 5.1. FANKONIJEVA ANEMIJA 5.1.1. ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM DIEPOKSIBUTANOVOG TESTA Postavljanje dijagnoze FA na bazi kliničkih nalaza je veoma teško, zbog velike fenotipske varijabilnosti koja je karakteriše. Podaci iz literature, takođe pokazuju da približno 30% obolelih od FA nema urođene anomalije tipične za ovu bolest (Alter i Kupfer 2011; Bagby i dr. 2004; Dokal i Vulliamy 2010). Sem kliničke, FA karakteriše i velika genetička heterogenost, koja se ogleda u postojanju većeg broja gena, čije mutacije dovode do razvoja bolesti (Alter i Kupfer 2011). Od ranije je poznato da se u ćelijama obolelih od FA mogu javiti spontane hromozomske promene u vidu različitih hromozomskih prekida i drugih rearanžmana (Schroeder i dr. 1964; Schroeder 1966), kao i kod niza drugih sindroma hromozomske nestabilnosti. Međutim, pacijenti oboleli od FA se mogu izdvojiti od ostalih bolesnika sa sličnim simptomima zahvaljujući hipersenzitivnom odgovoru na DNK-unakrsno- vezujuće agense, kao što je DEB (Sasaki i Tonomura 1973). Posledica dejstva ovog mutagena je prisustvo velikog broja hromozomskih i hromatidnih prekida u kariotipu ovakvih bolesnika. Ovo svojstvo ćelija sa fenotipom FA je danas u celom svetu iskorišćeno kao diferencijalno dijagnostički test u procesu skrininga obolelih od FA (Auerbach 1993). U ovoj studiji su, prema podacima dostupnim iz literature, prvi put prikazani rezultati analize hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om, na uzorcima pacijenata sa kliničkom slikom FA, iz Srbije. Ovom analizom je obuhvaćeno ukupno 90 pacijenata i preko 80 uzoraka klinički zdravih osoba (članova porodice i dr.). Cilj ove analize je bio da se na osnovu poznatih parametara hromozomske nestabilnosti (procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji, broj prekida/multiaberantnoj ćeliji, indeks fragilnosti hromozoma i dr.) utvrde intervali njihovih variranja, i prvi put u Srbiji definišu referentne vrednosti hromozomske osetljivosti, kako za obolele od FA, tako i za ostale (ne-FA) pacijente i zdrave kontrole. DISKUSIJA 78 5.1.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi limfocita periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom FA U kulturama limfocita periferne krvi kod ukupno 90 pacijenata, koji su imali simptome FA, analizirano je prisustvo kako spontanih tako i DEB-om indukovanih hromozomskih aberacija prema već definisanim parametrima (procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji i dr.). Analize hromozomskih prekida, indukovanih DEB-om u trajanju od 24h, u limfocitnim kulturama ispitivanih bolesnika, su pokazale da:  11,11% (10/90) pacijenata ima povećanu hromozomsku osetljivost (procenat aberantnih ćelija ≥ 32%; broj prekida/ćeliji ≥ 0,48) što odgovara ćelijskom fenotipu FA (FA grupa);  85,56% (77/90) pacijenata nema povećanu indukovanu hromozomsku nestabilnost (procenat aberantnih ćelija ≤ 6%; broj prekida/ćeliji ≤ 0,08) i stoga su označeni kao ne-FA grupa;  3,33% (3/90) pacijenata imaju hromozomsku osetljivost (procenat aberantnih ćelija: 12% - 22%; broj prekida/ćeliji: 0,15 – 0,26) koja se nalazi na granici između FA i ne-FA pacijenata (granična FA* grupa). Učestalost FA u ispitivanoj grupi pacijenata sa kliničkim znacima ove bolesti (aplastična anemija, odnosno aplazija kostne srži i dr.), bila je niža od vrednosti publikovanih u svetu, koje se kreću u proseku od 15% do 30% (Alter 1995; Cho i dr. 1997; Esmer i dr. 2004; Korgaonkar i dr. 2010; Oostra i dr. 2012). Ovo se može objasniti činjenicom da nisu svi ovakvi pacijenti upućivani na analizu DEB testom. Grupa pacijenata sa pozitivnim rezultatom analize DEB testom označena kao FA, imala je vrednosti procenta aberantnih ćelija koje su se kretale u rasponu od 32% do 82% i bile preko 28 puta više nego u ne-FA grupi (tabela 30). Ovi podaci su delom objavljeni u radovima Cirkovic i dr. (2006 i 2011). DISKUSIJA 79 Tabela 30. Rasponi procenta DEB-om indukovanih aberantnih ćelija kod pacijenata sa kliničkom slikom FA. Zemlja SV aberantnih ćelija (%) FA pacijenti ne-FA pacijenti Sjedinjene Američke države (Auerbach i dr. 1989b) 85,15% 5,12% Španija (Castella i dr. 2011) 68,10% 5,83% Srbija30 52,52% 1,82% Slični rezultati su dobijeni i kada je u analizi korišćen drugi parametar hromozomske nestabilnosti: broj prekida po ćeliji. Rasponi vrednosti prekida/ćeliji u FA i ne-FA grupi su se, takođe jasno razdvojili (tabela 31) i bili su u saglasnosti sa prethodno objavljenim sličnim studijama (Auerbach i dr. 1989b; Ilgin i dr. 1999; Kook i dr. 1998). Tabela 31. Rasponi vrednosti broja DEB-om indukovanih prekida/ćeliji kod pacijenata sa kliničkom slikom FA. Zemlja Interval broja prekida/ćeliji FA pacijenti ne-FA pacijenti Sjedinjene Američke države (Auerbach i dr. 1989b) 1,30 – 23,90 0,00 – 0,36 Koreja (Kook i dr. 1998) 0,45 – 4,25 0,00 – 0,15 Španija (Castella i dr. 2011) 0,31 – 10,00 0,00 – 0,26 Turska (Ilgin i dr. 1999)31 0,20 – multipli prekidi 0,00 – 0,16 Srbija 0,48 – 4,39 0,00 – 0,08 Poređenjem rezultata u ovoj studiji sa rezultatima objavljenim u studiji Internacionalnog registra Fankonijeve anemije (IFAR32) iz 1989. godine (tabele 30 i 31), uočeno je da su vrednosti procenta aberantnih ćelija i broja prekida/ćeliji bile nešto niže, i to u obe grupe: FA i ne-FA. S druge strane, rezultati ove studije se u potpunosti 30 Srbija – u ovoj studiji 31 Turska - DEB je u finalnoj koncentraciji 0,01µg/ml umesto 0,1µg/ml 32 IFAR – eng. International Fanconi’s Anemia Registry DISKUSIJA 80 slažu sa sličnim nalazima kod pacijenata iz Koreje (Kook i dr. 1998), Turske (Ilgin i dr. 1999) (tabela 31) i Španije (Castella i dr. 2011) (tabele 30 i 31). Rezultati analize DEB testom na limfocitima periferne krvi kod 3,33% (3/90) bolesnika, pokazali su vrednosti ispitivanih parametara hromozomske nestabilnosti (15,67% ± 5,51% aberantnih ćelija; 0,20 ± 0,06 prekida/ćeliji) koje su bile između istih vrednosti dobijenih za FA i ne-FA grupu. Ovi pacijenti su svrstani u posebnu grupu tzv. graničnih FA* pacijenata. Prema podacima iz literature oko 15% - 25% pacijenata koji boluju od FA ima znatno niže (od 10% - 50% aberantih ćelija), čak negativne vrednosti parametara DEB-om indukovane hromozomske nestabilnosti na limfocitima periferne krvi i svrstavaju se u grupu pacijenata sa mozaičnim tipom FA (Auerbach i Alter 1989; Castella i dr. 2011; Kwee i dr. 1983; Lo Ten Foe i dr. 1997; Soulier i dr. 2005). Zbog mogućnosti da ovi pacijenti, i pored nižih vrednosti ispitivanih parametara, ipak boluju od FA (Auerbach i Alter 1989; Auerbach i dr. 1989b; Castella i dr. 2011; Ilgin i dr. 1999), preporuka je da se oni podvrgnu daljem testiranju u cilju dokazivanja FA (Auerbach 2003; Auerbach 2009; Shimamura i dr. 2002; Soulier i dr. 2005). Na kraju, važno je naglasiti da u grupi od 10 pacijenata sa pozitivnim odgovorom na DEB, spontana hromozomska nestabilnost nije mogla da bude iskorišćena za dokazivanje fenotipa FA, zbog preklapanja ovih vrednosti u FA, graničnoj FA*, i ne-FA grupi. U analiziranom uzorku u FA grupi, samo 30% (3/10) pacijenata je pokazalo povećanu spontanu hromozomsku nestabilnost u odnosu na zdrave kontrole, što je u saglasnosti sa rezultatima iz literature, prema kojima ova vrednost iznosi približno 45,6% (Castella i dr. 2011). 5.1.1.1.1. Heterogenost odgovora na DEB: mozaicizam unutar FA grupe U grupi od 10 FA pacijenata procenat DEB-om indukovanih aberantnih ćelija je veoma varirao, i kretao se od 32% do 82%. Ova variranja su najverovatnije posledica prisustva pacijenata sa mozaičnom formom FA u ovoj grupi ispitanika, kod kojih su vrednosti indukovanih aberantnih ćelija obično niže. Somatski mozaicizam predstavlja pojavu reverzije mutacija u genima za FA, u određenim stadijumima hematopoeze, odnosno u određenom procentu ćelija, što DISKUSIJA 81 rezultira u pojavi dva klona ćelija kod ovakvih pacijenata: jednog osetljivog na dejstvo DEB-a i drugog bez odgovora na DEB zbog prisustva revertne mutacije (Gregory i dr. 2001; Gross i dr. 2002; Hoehn i dr. 2007; Lo Ten Foe i dr. 1997; Waisfisz i dr 1999a; Youssoufian 1996). Veći procenat ćelija neosetljivih na DEB, kod ovih pacijenata dodatno komplikuje postavljanje dijagnoze FA, uz mogućnost dobijanja lažno negativnih rezultata DEB testa. U cilju potvrde ili isključenja mozaičnog fenotipa FA, ranije je bilo neophodno ispitivanje senzitivnosti na drugim tkivima, kao i primena metoda molekularne genetike, kojom bi se sa sigurnošću utvrdila konačna dijagnoza kod ovakvih pacijenata (Shimamura i dr. 2002; Waisfisz i dr 1999a). Upravo iz ovih razloga, istraživanje grupe španskih naučnika predvođenih M. Castellom i publikovanje matematičkog modela indeksa fragilnosti hromozoma, kojim bi se lakše definisale podgrupe u okviru FA grupe, predstavljalo je veliki doprinos u smislu preciznije dijagnostike FA (Castella i dr. 2011). Prema podacima objavljenim u radu M. Castelle i dr. (2011), FA pacijenti sa vrednostima aberantnih ćelija < 40% - 50% se klasifikuju kao mozaični oblici. U potencijalne mozaične forme FA se ubrajaju pacijenti sa vrednostima aberantnih ćelija u rasponu od 40% do 60%, dok se FA pacijenti sa vrednostima aberantnih ćelija ≥ 60% smatraju kompletnim, nemozaičnim tipom FA (Castella i dr. 2011). Na osnovu rezultata dobijenih u ovoj studiji, FA pacijenti sa procentom aberantnih ćelija < 50% i > 30% su klasifikovani kao mozaični tip FA, što je u saglasnosti sa prethodno objavljenim podacima (Castella i dr. 2011). U cilju pronalaženja parametra hromozomske nestabilnosti, kojim bi se bolje mogao sagledati aspekt mozaičnog, ali još uvek hipersenzitivnog odgovora ćelija FA na DEB, u analizi dobijenih rezultata, korišćena je kombinacija dva postojeća parametra: procenat aberantnih ćelija i broj prekida/multiaberantnoj ćeliji, odnosno indeks fragilnosti hromozoma (CFI) (Castella i dr. 2011). DISKUSIJA 82 5.1.1.1.2. Indeks indukovane fragilnosti hromozoma S obzirom da korišćenje pojedinačnih parametara za analizu hromozomske osetljivosti, kao što su: broj prekida/ćeliji, broj prekida/multiaberantnoj ćeliji i procenat aberantnih ćelija, nije dalo zadovoljavajuće rezultate u pogledu jasnog razlikovanja mozaičnih od nemozaičnih FA pacijenata, u daljoj obradi rezultata je primenjena analiza indeksa fragilnosti hromozoma (CFI) (Castella i dr. 2011). Indukovanim indeksom fragilnosti, koji je dobijen množenjem procenta aberantnih ćelija i brojem prekida/multiabrrantnoj ćeliji ili brojem prekida/ćeliji, omogućeno je bolje razdvajanje ove dve podgrupe FA pacijenata (Castella i dr. 2011). Analizom I-CFI vrednosti u ispitivanom uzorku dobijeni su rezultati koji su pokazali da se grupe pacijenata označene kao: FA, granična FA* i ne-FA, mogu razlikovati i na osnovu ovog parametra, bez međusobnog preklapanja intervala variranja vrednosti, što je u skladu sa literaturnim podacima (tabela 32) (Castella i dr. 2011). Tabela 32. Rasponi DEB-om indukovanih CFI vrednosti (I-CFI) kod pacijenata sa kliničkom slikom FA. Zemlja Intervali I-CFI vrednosti FA grupa ne-FA grupa Španija (Castella i dr. 2011) 55,00 – 1180,00 2,00 – 40,00 Srbija 73,99 – 555,96 0,00 – 8,00 U okviru FA grupe od ukupno 10 analiziranih pacijenata, I-CFI vrednosti su se kod šest pacijenata nalazile u intervalu od 73,99 – 138,24 što je prema radu Castelle i dr. (2011), odgovaralo istim vrednostima nađenim u podgrupi mozaičnih FA pacijenata (tabela 33). Tabela 33. Rasponi I-CFI vrednosti kod pacijenata sa mozaičnom i nemozaičnom formom FA. Zemlja Intervali I-CFI vrednosti FA pacijenata nemozaični FA pacijenti mozaični FA pacijenti Španija (Castella i dr. 2011) 181,00 – 1180,00 55,00 – 220,00 Srbija 199,68 – 555,96 73,99 – 138,24 DISKUSIJA 83 Kod preostala četiri pacijenta I-CFI vrednosti su se kretale u rasponu od 199,68 – 555,96 koji se preklapao sa odgovarajućim vrednostima nemozaičnih FA pacijenata, prethodno objavljenim u literaturi (tabela 33) (Castella i dr. 2011). U ovoj studiji 60% (6/10) pacijenata iz FA grupe, sa procentom aberantnih ćelija > 30% i < 50% (0,48 – 1,50 prekida/ćeliji), su na osnovu I-CFI vrednosti označeni kao mozaični, dok su preostalih 40% (4/10) pacijenata svrstani u nemozaičnu FA podgrupu (procenat aberantnih ćelija > 60%; broj prekida po ćeliji > 1,31). Podgrupe mozaičnih i nemozaičnih pacijenata je u ovom slučaju, bilo moguće razlikovati i na osnovu procenta aberantnih ćelija, bez međusobnog preklapanja. Kada se poredi učestalost mozaičnog tipa među pacijentima obolelim od FA (60%) u ovoj studiji, sa učestalošću od 10% - 30% u već objavljenim radovima (Auerbach i dr. 1989a; Auerbach 2003; Castella i dr. 2011), uočava se znatno veći procenat ovakvih pacijenata u ispitivanoj grupi pacijenata iz Srbije. Uzrok ovome se najverovatnije nalazi u činjenici da nisu svi oboleli od FA u Srbiji, bili podvrgnuti analizi DEB testom. U grupi pacijenata sa kliničkom slikom FA, 3,33% (3/90) pacijenata su pokazali variranje I-CFI vrednosti od 24,00 – 44,00 koje se delimično poklapalo sa odgovarajućim vrednostima u grupi ne-FA pacijenata objavljenim u radu Castelle i dr. (2011) (tabela 32). Kod ovih pacijenata označenih kao granični FA* pacijenti, bila su neophodna dodatna testiranja za potvrdu ili isključenje dijagnoze FA. Primena analize indeksa fragilnosti hromozoma omogućila je formiranje graničnih vrednosti ovog parametra pomoću kojih se mogu izdvojiti pacijenti sa mozaičnim fenotipom FA u odnosu na ostale FA pacijente, i pre sprovođenja daljih analiza na drugim tkivima, kao i primene molekularnih metoda. Nalazi koji ukazuju da se mozaični FA pacijenti mogu otkriti na osnovu I-CFI vrednosti na limfocitima periferne krvi pod indukcijom DEB-om, dobijaju još više na značaju, s obzirom da molekularna dijagnostika ovog oboljenja može biti izuzetno složena i skupa za izvođenje. DISKUSIJA 84 5.1.1.1.3. Uticaj dužine trajanja indukcije DEB-om na hromozomsku nestabilnost kod pacijenata u FA i graničnoj FA* grupi Postoje brojni radovi i protokoli prema kojima se indukcija hromozomskih aberacija DEB-om u kulturama limfocita periferne krvi može vršiti u trajanju od 24h, 48h ili 72h (Auerbach i dr. 1989b; Auerbach 2003; Castella i dr. 2011; Ilgin i dr. 1999; Kook i dr. 1998). U ovoj studiji su upoređeni rezultati dobijeni 24- i 48-časovnim dejstvom DEB-a, u uzorcima pacijenata FA i granične FA* grupe. Analiza je pokazala da se prisustvo hromozomskih aberacija, generalno uzev, povećava sa vremenom trajanja tretmana u ovim grupama. Ipak, vrednosti hromozomske nestabilnosti, indukovane 48h DEB-om u kulturama limfocita FA pacijenata, bile su niže od do sada objavljenih rezultata za isto vreme indukcije (Auerbach i dr. 1989b; Castella i dr. 2011). Ovakav slučaj može biti posledica relativno visokog procenta mozaičnih pacijenata među obolelim od FA. S obzirom na rezultate analize pri 24-časovnom dejstvu DEB-a, čije su vrednosti omogućile jasno razlikovanje između grupa, može se zaključiti da su ovi uslovi indukcije dovoljni za izazivanje specifičnog povećanja hromozomske nestabilnosti u ćelijama FA pacijenata. 5.1.1.2. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože Kada analiza hromozomske osetljivosti na DEB u limfocitima periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom FA, pokaže da više od 50% - 70% ćelija nema hromozomske aberacije, neophodno je ispitati hromozomsku nestabilnost na drugom tkivu, najčešće fibroblastima kože (Auerbach 2003; Soulier i dr. 2005). U grupi od 10 pacijenata sa kliničkim znacima FA, a sa pozitivnim odgovorom limfocita na DEB, ova analiza je pokazala postojanje dve podgrupe pacijenata: nemozaični FA pacijenti sa procentom aberantnih ćelija > 60% i mozaični FA pacijenti sa nižim procentom aberantnih ćelija: od 30% do 50%. U cilju ispitivanja hromozomske nestabilnosti i potvrde, odnosno isključenja mozaika kod pacijenata sa nižim vrednostima, bilo je potrebno sprovesti analizu hromozomske nestabilnosti na fibroblastima kože (Alter i Kupfer 2011; Auerbach 2003; Gregory i dr. 2001). Potvrda ili isključenje mozaika na DISKUSIJA 85 fibroblastima kože je bila neophodna i kod pacijenata koji su na osnovu ove analize bili označeni kao FA* granični pacijenti. 5.1.1.2.1. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože zdravih osoba Citogenetičkom analizom u kulturi fibroblasta klinički zdravih osoba (kontrolna grupa) utvrđen je interval procenta aberantnih ćelija pri 24-časovnom dejstvu DEB-a (0% - 6%), kao i raspon broja prekida/ćeliji (0,00 – 0,06). Ovako dobijene vrednosti su bile u saglasnosti sa podacima iz literature (Auerbach 2003) i korišćene su za poređenje sa rezultatima pacijenata u FA grupi, kao referentni negativni nalazi testa. 5.1.1.2.2. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože pacijenata sa mozaičnim tipom FA Mozaičan odgovor limfocita na DEB kod određenog broja FA pacijenata, u smislu postojanja većeg broja ćelija neosetljivih na dejstvo ovog agensa, zahtevao je proveru hromozomske osetljivosti na još jednom tkivu ovakvih pacijenata. Kod četiri od ukupno šest pacijenata je potvrđen mozaični fenotip FA, i na fibroblastima kože (FA grupa: od 0,10 – 0,38 prekida/ćeliji naspram kontrolne grupe: od 0,00 – 0,06 prekida/ćeliji). Nađene vrednosti kod FA pacijenata su bile ispod vrednosti opisanih u literaturi (0,68 – 1,10 prekida/ćeliji) (Auerbach 2003), ali veće od kontrolnih vrednosti (p < 0,05). Međutim, dva FA pacijenta koji su u kulturama limfocita imali povećan broj hromozomskih aberacija u odgovoru na DEB, u kulturama fibroblasta kože nisu ispoljila povećanu hromozomsku osetljivost. Kod ovakvih pacijenata, kod kojih je dobijen različit odgovor na DEB testu u dva različita tkiva, tj. jedan pozitivan, a drugi negativan, neophodno je bilo uraditi neku drugu vrstu analize za dokazivanje FA, kao što je komet test ili protočno citometrijska analiza zastoja ćelija u G2 fazi. DISKUSIJA 86 5.1.1.2.3. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u kulturi fibroblasta kože graničnog FA* pacijenata U grupi od tri granična FA* pacijenta, samo kod jednog pacijenta (FA*-2) je bio dostupan uzorak biopsije kože, na kome je u daljem postupku analizirana osetljivost hromozoma na DEB. Analiza je pokazala prisustvo kako spontanih, tako i 24h DEB-om indukovanih hromozomskih aberacija u fibroblastima ovog pacijenta. Dobijeni rezultati su bili u okvirima vrednosti karakterističnih za FA pacijente i slagali su se sa rezultatima iz prethodnih studija (spontani broj prekida/ćeliji: 0,20 – 0,36) (Auerbach 2003). Ispitivanje hromozomske nestabilnosti u fibroblastima kože ovog pacijenata se pokazalo opravdanim, s obzirom da je na ovaj način potvrđeno da se radi o mozaičnoj formi FA, što je i bio razlog relativno niske osetljivosti limfocita na DEB. Primena analize hromozomskih aberacija, indukovanih DEB-om, na fibroblastima kože može biti korisna u slučaju kada nije dostupna druga vrsta uzorka (limfociti), ali njeno izvođenje mora biti strogo kontrolisano, kao i kvalitet hromozoma i mitotski indeks, zbog visoko toksičnog dejstva DEB-a (Auerbach 2003). 5.1.2. ANALIZA OŠTEĆENJA DNK PRIMENOM ALKALNOG KOMET TESTA Poslednjih godina, pored ispitivanja hromozomske osetljivosti indukovane DEB- om i MMC-om, kod pacijenata sa kliničkom slikom FA (Rojas i dr. 1999; Mohseni Meybodi i Mozdarani 2009), veliki značaj se pridaje i analizi oštećenja DNK (komet test) (Singh i dr. 1988) kod ovakvih pacijenata (Mohseni Meybodi i Mozdarani 2009). Alkalni komet test je zbog svoje osetljivosti u detekciji jednolančanih i dvolančanih prekida na molekulu DNK, nastalih bilo spontano, bilo pod uticajem određenih spoljašnjih faktora (zračenje, mutageni) (Collins 2004), našao primenu i u ispitivanju specifične osetljivosti ćelija obolelih od FA (Djuzenova i dr. 2001; Müller 2007). Na ovaj način, pored analize hromozomske nestabilnosti, i analiza oštećenja DNK komet testom se pokazala kao veoma informativna, dodatna metoda u postavljanju precizne dijagnoze FA (Djuzenova i dr. 2001; Mohseni-Meybodi i dr. 2009). DISKUSIJA 87 U cilju utvrđivanja oštećenja DNK i eventualne potvrde ćelijskog fenotipa FA, kod pacijenata koji su citogenetičkom analizom limfocita periferne krvi pokazali granične rezultate (FA* grupa), na istim ćelijama je primenjen i alkalni komet test. Kao parametar oštećenja korišćen je Olive-moment repa, koji na zadovoljavajući način opisuje oštećenja DNK (Olive i dr. 1990; Lee i dr. 2004). Za potrebe ove analize, prvo je bilo neophodno utvrditi granice variranja OTM vrednosti kod zdravih osoba (kontrola), a zatim kod FA (DEB-pozitivnih) pacijenata, radi međusobnog poređenja. 5.1.2.1. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita zdravih osoba Kod šest klinički zdravih osoba (kontrolna grupa) urađena je analiza komet testom na uzorcima limfocita periferne krvi u cilju utvrđivanja oštećenja DNK karakterističnih za zdravu populaciju ljudi. Rezultati ove analize su pokazali da se spontano nastala oštećenja (OTM) u limfocitima kontrolne grupe kreću u rasponu od 0,94 – 1,85 (SV: 1,49 ± 0,39). S obzirom da je poznato da rezultati ove analize mogu da variraju od laboratorije do laboratorije, uglavnom zbog razlika u proceduri testa (Møller i dr. 2010), ali i u interpretaciji rezultata (moment repa, procenat DNK u repu i dr.) vrlo je teško uporediti podatke dobijene u ovoj studiji sa postojećim sličnim radovima. Ipak, intervali OTM vrednosti kontrolne grupe u ovoj studiji, su u saglasnosti sa rezultatima studija koje su na sličan način interpretirale rezultate oštećenja DNK limfocita zdravih osoba (SV: 1,22 ± 0,26 (Lee i dr. 2004) i interval: 1,12 – 1,30 (Schabath i dr. 2003)). Kada su ove ćelije bile izložene dejstvu DEB-a, uočeno je povećanje (manje od jednog i po puta) oštećenja u odnosu na bazična. Prethodne studije, kojima je pomoću komet testa proučavano genotoksično dejstvo ovog jedinjenja u limfocitima periferne krvi i drugim ćelijama zdravih ljudi (Anderson i dr. 1997; Macioszek i Kononowicz 2004), pokazale su da se mutageni efekat DEB-a uglavnom zasniva na izazivanju unakrsnih veza unutar molekula DNK, jednolančanih prekida i drugih oštećenja (Wen i dr. 2011). S obzirom da su u ovim istraživanjima korišćeni različiti uslovi (koncentracija i vreme) indukcije oštećenja DEB-om, nije bilo moguće uporediti dobijene rezultate u ovoj studiji sa prethodno objavljenim podacima. Ipak, evidentno je da DEB uzrokuje oštećenja DNK, što je u saglasnosti sa prethodnim studijama (Anderson i dr. 1997). Ovako dobijeni rezultati komet testa na limfocitima zdravih DISKUSIJA 88 osoba, u daljem radu su korišćeni za poređenje sa rezultatima pacijenata sa kliničkom slikom FA. 5.1.2.2. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita FA pacijenata Primenom analize alkalnim komet testom ispitano je ukupno pet pacijenata koji su u prethodnim citogenetičkim analizama imali pozitivan odgovor limfocita na DEB (FA grupa). Prema I-CFI vrednostima i procentu aberantnih ćelija, dva od ovih pet FA pacijenata su svrstana u FA-nemozaičnu podgrupu, dok su preostala tri pacijenata svrstana u FA-mozaičnu podgrupu. Kod FA pacijenata, kod kojih je otkriveno prisustvo DEB-om indukovanih hromozomskih aberacija u preko 60% analiziranih limfocita (nemozaični FA pacijenti), OTM vrednosti su se kretale u intervalima: od 2,63 – 2,87 za spontana oštećenja; od 3,65 – 5,56 pod 24h-indukcijom DEB-om i od 2,09 – 6,97 pod 48h-indukcijom DEB- om. Međusobnim poređenjem OTM vrednosti dobijenih kod dva nemozaična FA pacijenata i u kontrolnoj grupi, utvrđeno je da se rasponi ovih vrednosti za spontana kao i za DEB-om indukovana oštećenja DNK u ove dve grupe ne preklapaju. Analize su pokazale da su oštećenja DNK u limfocitima nemozaičnih FA pacijenata bila pod 24- časovnim dejstvom DEB-a čak tri puta veća nego kod klinički zdravih osoba. Prema do sada dostupnim podacima, postoji mali broj studija koji se bavio analizom oštećenja DNK u ćelijama obolelih od FA primenom ove metode (Djuzenova i dr. 2001; Mohseni Meybodi i Mozdarani 2009; Mohseni-Meybodi i dr. 2009). Rezultati ove studije koji govore o povećanom prisustvu spontanih oštećenja u ćelijama FA pacijenata u odnosu na kontrolnu grupu, saglasni su sa već objavljenim podacima drugih autora (Djuzenova i dr. 2001; Mohseni-Meybodi i dr. 2009). U analizama komet testom, objavljenim u prethodnim studijama, za indukciju i povećanje oštećenja DNK u ćelijama obolelih od FA, do sada je korišćeno jonizujuće zračenje i MMC (Djuzenova i dr. 2001; Mohseni Meybodi i Mozdarani 2009; Mohseni- Meybodi i dr. 2009). Koliko je poznato iz dostupne literature, DNK-unakrsno vezujući efekat DEB-a u ćelijama pacijenata sa FA, do sada nije analiziran komet testom, odnosno na nivou pojedinačnih ćelija. U ovoj studiji su po prvi put izneti rezultati DISKUSIJA 89 analize DEB-om indukovanih oštećenja DNK limfocita periferne krvi pacijenata obolelih od FA. Rezultati ove analize su se poklopili sa rezultatima hromozomske analize na limfocitima i na taj način još jednom potvrdili postojanje fenotipa FA kod ovih pacijenata. Za tri FA pacijenta koji su na osnovu hromozomske osetljivosti limfocita na DEB svrstani u mozaičnu FA podgrupu (procenat aberantnih ćelija: 32% - 49%), analizom oštećenja DNK utvrđene su OTM vrednosti koje su bile karakteristične za nemozaične FA pacijente. Analiza komet testom se na ovaj način pokazala kao senzitivnija od hromozomske analize, jer je kod tri pacijenta nedvosmisleno dokazala postojanje fenotipa FA. Na osnovu podataka iz literature, komet testom do sada nisu analizirani pacijenti sa mozaičnim fenotipom FA, u cilju isključenja mozaika i potvrde fenotipa FA. U budućnosti, ova metoda bi se kao veoma senzitivna, brza i jednostavna mogla koristiti za potvrdu ili isključenja mozaika kod svih pacijenata sa kliničkom slikom FA, koji pokažu hromozomsku neosetljivost limfocita na dejstvo DEB-a u 50% do 70% svojih ćelija. 5.1.2.3. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita graničnih FA* pacijenata Analiza komet testom je urađena kod dva granična FA* pacijenta koja su tako klasifikovana na osnovu vrednosti hromozomske nestabilnosti indukovane DEB-om u limfocitima. Kod jednog od ovih pacijenata dobijene su OTM vrednosti karakteristične za FA grupu pacijenata. Na ovaj način je, kod pacijenta kod kojeg je putem DEB testa otkriveno samo 13% limfocita sa indukovanim hromozomskim aberacijama, zahvaljujući senzitivnijem komet testu, nedvosmisleno potvrđen ćelijski fenotip FA. Na osnovu gore iznetih rezultata, u budućnosti bi kod svih pacijenata sa kliničkim znacima FA, koji pokažu hromozomsku osetljivost na DEB u čak samo 10% - 30% svojih limfocita, pa ih na osnovu toga nije moguće svrstati u FA ili ne-FA grupu, trebalo savetovati primenu komet testa u cilju potvrde ili isključenja FA. Kod graničnih FA* pacijenata kod kojih, čak ni primena analize komet testom ne potvrdi postojanje FA, DISKUSIJA 90 indikovana je primena dodatnih testova, kao što je analiza ćelijskog ciklusa, za konačnu potvrdu ili isključenje ovog oboljenja. 5.1.2.4. Analiza oštećenja DNK u kulturama limfocita ne-FA pacijenata U analizi alkalnim komet testom ispitivan je i nivo oštećenja molekula DNK u limfocitima 10 pacijenata čija je klinička slika ukazivala na FA, ali koji nisu pokazali hromozomsku osetljivost na DEB (ne-FA grupa). Kod većine (6/10) ovakvih pacijenata utvrđene su OTM vrednosti koje su bile u granicama vrednosti onih u kontrolnoj grupi. Kod četiri (4/10) pacijenta, međutim, dobijene su vrednosti oštećenja DNK, koje su se kretale u rasponima istih vrednosti utvrđenih za FA pacijente. U tumačenju rezultata analize komet testom, kod bolesnika koji su prethodno (hromozomskom analizom) dali negativan odgovor na DEB, potrebna je izvesna doza opreznosti. Naime, ovde se radi o vrlo senzitivnom testu kojim je moguće detektovati i oštećenja koja se mogu povezati sa drugim sindromima hromozomske nestabilnosti (Nijmegenov sindrom nestabilnosti i dr.) (Smal i dr. 2010), ali i sa malignim i drugim oboljenjima (Kopjar i dr. 2006; Rajeswari i dr. 2000), koji imaju slične kliničke znake kao FA. Upravo je stoga neophodno sve pacijente sa pozitivnim reultatima analize komet testom, a negativnim rezultatima hromozomske osetljivosti na DEB, u budućnosti dalje pratiti uz primenu dodatnih metoda, ukoliko postoji više kliničkih parametara koji upućuju na FA. 5.1.2.5. Prednosti analize komet testom u dijagnostici FA Podaci iz literature pokazuju da komet test predstavlja relativno brz i pouzdan metod za ispitivanje senzitivnosti genoma pacijenata sa kliničkom slikom FA. Njegova primena u dodatnom testiranju ćelijskog fenotipa FA je opravdana i mogla bi naći mesto u potvrdi mozaičnog oblika ove bolesti. S obzirom na zastupljenost ovakvih i graničnih pacijenata, kao i na mogućnost negativnog odgovora limfocita na DEB u hromozomskoj analizi kod obolelih od FA, analiza oštećenja DNK bi se mogla koristiti kao dopunska metoda u skriningu ovog oboljenja (Djuzenova i dr. 2001; Shimamura i dr. 2002). S obzirom na postojeće podatke, vezane za oštećenja DNK u ćelijama heterozigotnih nosioca FA i mogućnosti njihovog razlikovanja u odnosu na zdrave osobe koje nisu DISKUSIJA 91 nosioci mutacija u genima za FA (Djuzenova i dr. 2001; Mohseni-Meybodi i dr. 2009), primena komet testa u te svrhe bi bila od velikog značaja za davanje preciznog genetičkog saveta u porodicama obolelih. 5.1.3. PROTOČNO CITOMETRIJSKA ANALIZA ĆELIJSKOG CIKLUSA Pre više od 20 god. grupa naučnika na čelu sa B. Dutrillauxom (1982), a zatim i M. Kubbies i saradnici (1985), su otkrili da ćelijski ciklus limfocita periferne krvi pacijenata sa FA, sporije teče nego kod klinički zdravih ljudi. Ispitivanjem brzine proliferacije ovih ćelija, metodama protočne citometrije uz korišćenje BrdU-Hoechstove tehnike, došlo se do zaključka da je G2 faza limfocita obolelih od FA značajno produžena (Kubbies i dr. 1985). U godinama koje slede, spontani zastoj ćelija FA u G2 fazi, koji može biti dodatno povećan dejstvom specifičnih mutagena, je iskorišćen u diferencijalno dijagnostičke svrhe (Fabio i dr. 2000; Kaiser i dr. 1982; Miglierina i dr. 1991). Analiza ćelijskog ciklusa u ovoj studiji, urađena je na uzorcima pacijenata sa kliničkom slikom FA, koji su nakon analiza: DEB i komet testom, pokazali oprečne rezultate (jedan test je bio pozitivan, a drugi negativan), a u cilju testiranja još jednog parametra (zastoj u G2 fazi) kojim se može potvrditi fenotip i dijagnoza FA. Pre početka analize kod ovih pacijenata sa kliničkom slikom FA, radi daljeg poređenja, prvo su dobijene vrednosti zastoja ćelija u G2 fazi kod već potvrđenih FA pacijenata (pozitivni na DEB i komet testu), kao i kod zdravih osoba (kontrola). Važno je napomenuti da su u ovoj studiji prikazani rezultati protočno citometrijske analize koja je po prvi put urađena kod pacijenata pod sumnjom da boluju od FA, poreklom iz Srbije. Rezultati ove studije su prikazani u vidu procenta ćelija u G2 fazi ćelijskog ciklusa koji je pored faza rasta (G1, S, G2 i M) obuhvatio i G0 fazu. 5.1.3.1. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturama limfocita periferne krvi Protočno citometrijska analiza je urađena prvo na limfocitima periferne krvi dve zdrave osobe i pet pacijenata iz FA grupe, a zatim i kod dva pacijenta iz granične FA* grupe i sedam pacijenata iz ne-FA grupe. Analizom je ispitivan spontani zastoj DISKUSIJA 92 limfocita, čije je povećanje bilo specifično indukovano primenom DEB-a i to u trajanju od 24h i 48h. 5.1.3.1.1. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa zdravih osoba Kako bi se utvrdio procenat limfocita koji ne ispoljavaju fenotip FA, a koji se normalno nalaze u G2 fazi ćelijskog ciklusa, korišćena su dva uzorka klinički zdravih osoba. Analize su pokazale da do spontanog zastoja dolazi u 5,86% – 7,68% limfocita kontrolne grupe koji su kultivisani ukupno 72h, dok se ovaj procenat pri 24-časovnoj kultivaciji uz indukciju DEB-om kretao u rasponu od 1,56% – 4,11%, odnosno od 4,34% – 7,21% pri 48-časovnoj indukciji. S obzirom na izvesne modifikacije metode (nije korišćena BrdU-Hoechstova tehnika) i simplifikovanu obradu dobijenih podataka (Ormerod 2000), bilo je teško uporediti rezultate ove studije sa prethodno objavljenim sličnim radovima. Naime, u studiji brazilske grupe naučnika procenat limfocita zdravih osoba u G2 fazi se kretao u rasponu od 1,83% - 1,94% u netretiranim, dok je u 48h DEB-om tretiranim kulturama limfocita taj procenat iznosio 1,97% - 3,69% (Moreira i dr. 2008). Pri poređenju rezultata, primećuje se da su vrednosti zastoja kontrolnih uzoraka u ovoj studiji nešto više u odnosu na objavljene u radu C.F.A. Moreire i saradnika, što može biti posledica razlika u veličini uzorka, kao i u pripremi ćelija za analizu. Međutim, srednja vrednost spontano nastalog zastoja kontrolne grupe (6,77% ± 1,29%) je u okvirima istih vrednosti prethodno objavljenih većih studija (Fabio i dr. 2000; Xing i dr. 2007). U daljoj analizi, rezultati kontrolne grupe su služili za poređenje sa vrednostima zastoja dobijenim kod pacijenata sa kliničkom slikom FA. 5.1.3.1.2. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa FA grupe Kod pet FA pacijenata (dva iz nemozaične i tri iz mozaične podgrupe) koji su nakon analiza DEB i komet testom pokazali fenotip karakterističan za FA, urađena je analiza ćelijskog ciklusa iz kulture limfocita periferne krvi. Dobijeni rezultati su pokazali da vrednosti zastoja u netretiranim uzorcima FA pacijenata variraju od 11,20% – 18,48% (SV: 14,63% ± 2,73%), što je bilo oko dva puta više nego u kontrolnoj grupi. Ovi rezultati se delimično preklapaju sa rezultatima sličnih studija (Moreira i dr. 2008) i DISKUSIJA 93 u skladu su sa podacima drugih radova koji govore u prilog postojanja povećanog spontanog zastoja limfocita FA u G2 fazi (Seyschab i dr. 1995). Kada su 24-časovne kulture limfocita FA pacijenata bile izložene dejstvu DEB-a, procenat ćelija u G2 fazi je bio preko dva i po puta viši i nije se preklapao sa vrednostima istog parametra u kontrolnoj grupi (FA: 4,41% – 10,45% naspram kontrolne: 1,56% – 4,11%). Na ovaj način je bilo moguće razlikovati FA pacijente kod kojih dolazi do specifičnog nagomilavanja ćelija u G2 fazi, u odnosu na zdrave osobe koje imaju normalan ćelijski ciklus (t-test: p < 0,05). Povećani zastoj limfocita ovih pacijenata uočen je i pri 48-časovnoj indukciji DEB-om, mada uz delimično preklapanje sa kontrolnom grupom. U prethodnim studijama za indukciju zastoja ćelija FA u G2 fazi najčešće je korišćen MMC (Heinrich i dr. 1998; Schindler i Hoehn 1999; Schindler i dr. 2007), ređe DEB (Moreira i dr. 2008), mefalan (Fabio i dr. 2000) i drugi agensi. Kada se dobijeni rezultati uporede sa sličnim radovima (48,29% - 62,23% (Moreira i dr. 2008)), uočavaju se nešto niže vrednosti zastoja limfocita FA pacijenata obrađenih u ovoj studiji, što je najverovatnije posledica postojanja većeg broja limfocita koji nisu senzitivni na DEB (mozaični FA pacijenti). S obzirom da je protočno citometrijskom analizom ćelijskog ciklusa na relativno brz i jednostavan način moguće utvrditi ćelijski fenotip FA, ova metoda kao i komet test može biti iskorišćena u dodatnoj potvrdi dijagnoze kod pacijenata sa mozaičnom formom bolesti. 5.1.3.1.3.Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa granične FA* grupe Uzorci limfocita dva pacijenta kod kojih je analiza DEB testom pokazala granične vrednosti hromozomske osetljivosti (FA* grupa), korišćeni su za analizu zastoja ćelijskog ciklusa u cilju potvrde ili isključenja dijagnoze FA. Prethodno urađena analiza komet testom kod jednog od ova dva FA* pacijenta, nije pokazala značajnija oštećenja DNK u limfocitima. Stoga je kod ovog pacijenta bilo nephodno uraditi analizu ćelijskog ciklusa, kako bi se utvrdilo da li prema procentu ćelija u G2 fazi može da se klasifikuje u FA ili ne-FA grupu. DISKUSIJA 94 Protočno citometrijska analiza u kulturama limfocita oba granična FA* pacijenta je pokazala da dolazi do povećanog 24h DEB-om indukovanog zastoja, koji odgovara fenotipu FA. Ovom analizom je potvrđena dijagnoza FA kod pacijenata koji su na DEB testu imali čak 78% i 87% ćelija sa normalnim fenotipom (nesenzitivnih na DEB). Koliko je poznato, analize ciklusa limfocita uz indukciju DEB-om, kod pacijenata sa ovako niskim vrednostima DEB testa do sada nisu rađene, tako da su ovo prvi rezultati takve vrste. Ova metoda može biti iskorišćena u diferencijalnoj dijagnozi pacijenata sa kliničkom slikom FA, za koje se primenom prethodnih analiza (DEB test i komet analiza) ne može sa sigurnošću utvrditi da pripadaju FA grupi pacijenata. 5.1.3.1.4. Analiza zastoja limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa ne-FA grupe Analiza ćelijskog ciklusa urađena je kod sedam pacijenata sa kliničkim znacima FA koji nisu pokazali povećan broj indukovanih hromozomskih aberacija (ne-FA pacijenti), među kojima je bilo i četiri pacijenta sa povećanim oštećenjima DNK u limfocitima (pozitivni na komet testu). Kod većine (5/7) ne-FA pacijenata utvrđeno je da se zastoj limfocita u G2 fazi, nalazi u granicama istih vrednosti kao u kontrolnoj grupi. Samo kod dva (2/7) ne-FA pacijenta zastoj limfocita se kretao u rasponu vrednosti ovog parametra, karakterističnih za FA pacijente. Kod jednog od ta dva pacijenta, komet analiza je pokazala i povećana oštećenja na molekulu DNK, što je razlog više za dodatno praćenje ovog pacijenta i eventualno ponavljanje analize DEB testom. Od ranije je poznato da pacijenti sa aplastičnom anemijom mogu imati nešto veći zastoj limfocita u G2 fazi ćelijskog ciklusa, iako ne boluju od FA (Schindler i Hoehn 1999). Takođe se zna da ova analiza kod pacijenata sa već razvijenim malignim oboljenjem, može dati lažno negativne rezultate, što dodatno otežava postavljanje precizne dijagnoze bolesti (Seyschab i dr. 1995). U te svrhe je neophodno sistematizovati podatke iz više analiza (DEB test, komet test, zastoj u G2 fazi) i u skladu sa kliničkim znacima oboljenja tumačiti dobijene rezultate. DISKUSIJA 95 5.1.3.2. Analiza ćelijskog ciklusa u kulturama fibroblasta kože Kod jednog FA pacijenta koji je na osnovu analize indeksa fragilnosti (DEB test na limfocitima) svrstan u mozaičnu FA podgrupu, a čiji limfociti nisu bili dostupni za dalje analize (komet test, analiza ciklusa), ispitivan je zastoj fibroblasta u G2 fazi, u cilju potvrde ili isključenja mozaika. Analiza je prvo sprovedena u kulturama fibroblasta kože dve klinički zdrave osobe (kontrolna grupa), a zatim i kod četiri FA pacijenta mozaične podgrupe (uključujući i prethodno spomenutog) kako bi se utvrdile granice vrednosti zastoja fibroblasta u ove dve grupe. 5.1.3.2.1 Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa zdravih osoba Protočno citometrijska analiza ciklusa u kulturi fibroblasta kože u kontrolnoj grupi pokazala je da procenat fibroblasta u G2 fazi, pri 48-časovnom dejstvu DEB-a, varira u rasponu od 2,92% - 5,99%. Na ovaj način su određene granice vrednosti indukovanog zastoja fibroblasta u G2 fazi, karakteristične za fenotipski zdrave ćelije, što je bio neophodni preduslov za sprovođenje iste analize na fibroblastima FA pacijenata. Pošto je u većini prethodnih sličnih studija koje su se bavile ispitivanjem ćelijskog ciklusa fibroblasta, za indukciju korišćen MMC i drugi agensi (Kaiser i dr. 1982; van der Lelij i dr. 2010), nije bilo moguće uporediti rezultate dobijene u ovoj studiji sa već objavljenim podacima. 5.1.3.2.2. Analiza zastoja fibroblasta u G2 fazi ćelijskog ciklusa pacijenata sa mozaičnom formom FA U kulturama fibroblasta kože analiza ćelijskog ciklusa je kod sva četiri FA pacijenta sa mozaičnom formom bolesti, uključujući i bolesnika kod kojeg je rađen samo DEB test na limfocitima, pokazala povećani 48h DEB-om indukovani zastoj u odnosu na kontrolne uzorke. Procenat ćelija FA koji se nalazio u G2 fazi je bio u proseku oko tri puta viši nego u kontrolnoj grupi, što odgovara nalazima sličnih istraživanja u kojima je umesto DEB-a, korišćen MMC kao mutageni agens sa sličnim DNK-unakrsno vezujućim efektom (Kaiser i dr. 1982; Schindler i Hoehn 1999; van der Lelij i dr. 2010). DISKUSIJA 96 5.1.3.3. Značaj primene analize ćelijskog ciklusa u cilju potvrde fenotipa FA Kod FA pacijenata koji su prethodno pokazali mozaičnu hromozomsku osetljivost limfocita na DEB, analizom ćelijskog ciklusa u kulturi fibroblasta kože, omogućena je i konačna potvrda dijagnoze FA (Schindler i dr. 2007). Rezultati ove analize su od velikog značaja, za pacijente sa mozaičnim fenotipom FA, pogotovu kada uzorak limfocita ovakvih pacijenata iz određenih razloga (zbog transplantacije i dr.) nije dostupan za dalje analize (komet test). Na ovaj način su, takođe ostvareni preduslovi za eventualno sprovođenje prenatalne dijagnostike u porodicama obolelih u budućnosti, u vidu analize ćelijskog ciklusa u kulturi amnionskih ćelija. 5.1.4. ZNAČAJ ISPITIVANJA SENZITIVNOSTI GENOMA U DIJAGNOZI FA Primena analize DEB testom na limfocitima periferne krvi pacijenata sa kliničkim znacima FA, omogućila je skrining i izdvajanje FA pacijenata sa izuzetno povećanom hromozomskom osetljivošću (procenat aberantnih ćelija > 60%; nemozaični pacijenti), koji bi direktno bili upućivani na komplementacione i druge mutacione analize za otkrivanje uzroka, i potvrdu bolesti na molekularnom nivou. Ovom analizom je omogućena i selekcija pacijenata sa potencijalnim mozaičnim odgovorom na DEB, koji prema rezultatima ove studije mogi imati od 49% do čak samo 13% aberantnih limfocita (mozaični FA i granični FA* pacijenti). Kod ovakvih pacijenata brza i jednostavna analiza oštećenja DNK (komet test) na limfocitima omogućila je i dodatnu potvrdu fenotipa FA, pre daljih vrlo skupih i zahtevnih molekularnih analiza. Kada je kod mozaičnih FA pacijenata nakon DEB testa, jedino dostupan uzorak biopsije kože, tada se pristupa analizi ćelijskog ciklusa ili analizi hromozomske nestabilnosti u kulturi fibroblasta kože ovakvih pacijenata, u cilju potvrde ili isključenja mozaicizma FA. Pozitivni rezultati najmanje dve ovakve analize u slučaju mozaičnih FA pacijenata, mogu da potvrde dijagnozu FA na nivou ćelijskog fenotipa. Konačna potvrda dijagnoze i otkrivanje mutacija koje uzrokuju bolest moguća je samo primenom tehnika molekularne genetike, koje se za sada ne rade u našoj zemlji, ali je moguć kontakt sa specijalizovanim laboratorijama u inostranstvu. DISKUSIJA 97 5.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI 5.2.1. ANALIZA HROMOZOMSKE NESTABILNOSTI PRIMENOM BLEOMICINOVOG TESTA Kao u slučaju najvećeg broja bolesti hromozomske nestabilnosti, i kod obolelih od NSN simptomi kao što su: mikrocefalija, zastoj u rastu i razvoju, ponovljene plućne infekcije i dr, mogu predstavljati fenotipske karakteristike niza drugih oboljenja. Pre više od trideset godina, kada je prvi put otkriven NSN, otkrivena je i spontana osetljivost hromozoma kod ovakvih pacijenata, koja se ogledala u prisustvu hromatidnih i hromozomskih prekida, kao i mnogobrojnih rearanžmana između hromozoma 7 i 14 (Weemaes i dr. 1981). Ovo svojstvo hromozoma u ćelijama obolelih od NSN se može specifično indukovati bilo zračenjem, bilo dejstvom mutagena, kao što je BLC, i kao takvo koristiti u dijagnostičke svrhe (Wegner i Stumm 1999). Brzi razvoj i progres molekularne genetike omogućio je otkrivanje i mapiranje gena (NBN), čije mutacije dovode do nastanka bolesti (Varon i dr. 1998). Primenom tehnika molekularne genetike, ustanovljeno je da je mutacija c.657_661del5 vrlo česta kod pacijenata slovenskog porekla, što je u mnogome olakšalo konačnu potvrdu i postavljanje dijagnoze NSN na molekularnom nivou (Concannon i Gatti 2011). U ovoj studiji su izneti rezultati analize hromozomske osetljivosti na BLC u kulturi limfocita periferne krvi bolesnika sa kliničkom slikom NSN, poreklom iz Srbije. Koliko je poznato ovo su prvi rezultati tog tipa sa ovih prostora. Testirano je ukupno 10 pacijenata sa kliničkim znacima NSN, kao i šest uzoraka klinički zdravih osoba (kontrola). Na osnovu parametara hromozomske osetljivosti (procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji i dr.) bilo je moguće razgraničiti intervale variranja vrednosti u grupi obolelih od NSN u odnosu na kontrolnu grupu, i na taj način po prvi put okarakterisati hromozomsku nestabilnost ovakvih bolesnika u Srbiji. Potvrdom dijagnoze na citogenetičkom nivou bila je moguća selekcija pacijenata za dalja ispitivanja i konačnu potvrdu dijagnoze molekularnim metodama. DISKUSIJA 98 5.2.1.1. Analiza hromozomske nestabilnosti indukovane BLC-om u kulturi limfocita periferne krvi pacijenata sa kliničkom slikom NSN Kod ukupno 10 pacijenata sa kliničkim znacima NSN, analizirano je prisustvo spontanih i BLC-om indukovanih hromozomskih aberacija u kulturama limfocita periferne krvi. U ovoj studiji su prikazani rezultati analize (procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji i dr.) samo kod sedam pacijenata, s obzirom da kod tri pacijenta nije bilo dovoljno ćelija u deobi za analizu. Analiza BLC-om indukovane hromozomske osetljivosti pokazala je da:  57,14% (4/7) pacijenta ima povećan broj prekida/ćeliji (>0,27) i povećan procenat aberantnih ćelija (≥ 26,67%) (NBS grupa) u odnosu na kontrolnu grupu,  42,86% (3/7) pacijenta (ne-NBS grupa) ima vrednosti parametara analize koji se kreću u okvirima istih vrednosti u kontrolnoj grupi. U grupi pacijenata pod sumnjom da boluju od NSN, a sa pozitivnim odgovorom limfocita na BLC, označenoj kao NBS, procenat BLC-om indukovanih aberantnih ćelija (uključujući i ćelije sa strukturnim rearanžmanima hromozoma: 7, 14 i dr) se kretao u rasponu od 26,67% do 40% (Ćirković i dr. 2009; Jovanovic i dr. 2009). Ovakvi nalazi se poklapaju sa prethodno objavljenim rezultatima (20% - 40% aberantnih ćelija) drugih autora (Wegner i Stumm 1999). Аnalize su pokazale da su vrednosti broja prekida/ćeliji (0,27 – 0,80) u grupi NBS pacijenata, obrađenih u ovoj studiji, takođe u skladu sa literaturnim podacima (0,50 – 1,50 prekida/ćeliji) (Wegner i Stumm 1999). Nešto niže zabeležene vrednosti broja prekida/ćeliji u ovoj studiji, u odnosu na odgovarajuće vrednosti drugih autora, mogu biti posledica lošeg kvaliteta hromozoma i malog broja (od 20 do 50) ćelija za analizu. Iako je, na osnovu analize hromozomske osetljivosti limfocita na BLC, NBS pacijente bilo moguće izdvojiti u odnosu na ostale (ne-NBS), bilo je neophodno sprovesti molekularnu dijagnostiku ovakvih pacijenata u cilju konačne potvrde dijagnoze NSN (Concannon i Gatti 2011). Molekularna analiza u cilju potvrde bolesti je DISKUSIJA 99 bila indikovana i kod tri pacijenta sa kliničkom slikom NSN, čiji su limfociti pokazali otpornost na dejstvo fitohemoaglutinina, karakterističnu za ćelije obolelih (Digweed i Sperling 2004; Hiel i dr. 2000). 5.2.2. ANALIZA PACIJENATA SA KLINIČKOM SLIKOM NSN PRIMENOM METODA MOLEKULARNE GENETIKE 5.2.2.1. Identifikacija homozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod pacijenata sa kliničkom slikom NSN U ovoj studiji su prvi put u Srbiji dobijeni rezultati molekularne analize na prisustvo/odsustvo c.657_661del5 mutacije u NBN genu kod pacijenata sa ćelijskim fenotipom NSN. Analizom je obuhvaćeno ukupno sedam pacijenata: četiri NBS pacijenta sa pozitivnim rezultatima analize BLC testom i tri pacijenta sa slabim mitotskim indeksom. Dijagnoza NSN je potvrđena kod svih ispitanika na molekularnom nivou, kroz prisustva homozigotne mutacije c.657_661del5 (Jovanovic i dr. 2009), odnosno. Zastupljenost c.657_661del5 mutacije kod obolelih od NSN iz Srbije (100% ili 7/7) se podudarala sa učestalošću ove mutacije kod obolelih slovenskog porekla, iz drugih zemalja (Poljska, Češka, Rusija, Ukrajina i dr.) (Chrzanowska i dr. 2012; Matsuura i dr. 1998; Resnick i dr. 2003; Tekin i dr. 2002; Varon i dr. 1998). 5.2.2.2. Identifikacija heterozigotnog prisustva c.657_661del5 mutacije kod članova porodica obolelih od NSN Molekularna analiza 13 članova porodica obolelih od NSN, bez kliničkih simptoma bolesti, potvrdila je heterozigotno prisustvo c.657_661del5 mutacije kod svih ispitanika (12 roditelja i jedan brat obolelog). Na ovaj način je bilo omogućeno davanje preciznog genetičkog saveta u porodicama obolelih od NSN, pogotovu u pogledu mogućnosti prenatalne dijagnostike, a u cilju dobijanja zdravog potomstva. Analiza heterozigotnog prisustva ove mutacije u NBN genu, dobija na značaju, s obzirom na rezultate skorijih istraživanja koji pokazuju povećan rizik upravo heterozigotnih nosilaca da obole od neke vrste kancera (kancer dojke i prostate, melanom i dr.), u DISKUSIJA 100 odnosu na ostatak populacije (Bogdanova i dr. 2008; Cybulski i dr. 2004; di Masi i Antoccia 2008; Steffen i dr. 2004). Iako se radi o vrlo retkoj bolesti, s obzirom na relativno visoku zastupljenost heterozigotnih nosilaca c.657_661del5 mutacije u slovenskoj grupi naroda (1/177) (Chrzanowska i dr. 2012) i na relativno jeftinu molekularnu analizu, uvođenje skrininga kod novorođenčadi u daljoj budućnosti bi bilo od velikog značaja kako za obolele, u pogledu preventive, tako i za članove njihovih porodica. 101 6. ZAKLJUČAK Rezultati dobijeni primenom citogenetičkih, citometrijskih i molekularnih analiza u grupi od 100 pacijenata čija je klinička slika ukazivala na FA ili NSN, omogućili su donošenje sledećih zaključaka: 6.1. FANKONIJEVA ANEMIJA 1. Analizom parametara hromozomske osetljivosti indukovane 24h DEB-om u limfocitima periferne krvi (procenat aberantnih ćelija, broj prekida/ćeliji i I- CFI), precizno su definisane njihove vrednosti, na osnovu kojih se mogu razlikovati pacijenti oboleli od FA (aberantne ćelije ≥ 32%; broj prekida/ćeliji ≥ 0,48; I-CFI > 73) od zdravih osoba (aberantne ćelije ≤ 8%; broj prekida/ćeliji ≤ 0,17; I-CFI < 9). 2. Analizom istih parametara, ali spontane hromozomske osetljivosti u limfocitima nije bilo moguće izdvojiti čak 70% FA pacijenata, koji su imali pozitivan odgovor na DEB. 3. Izračunavanjem vrednosti indeksa indukovane (DEB, 24h) fragilnosti hromozoma i procenta aberantnih limfocita, definisani su precizni intervali kojima se bolesnici sa mozaičnom formom FA (aberantne ćelije: 32% – 49%; I-CFI: 73 – 139) mogu izdvojiti od obolelih sa nemozaičnim tipom FA (aberantne ćelije ≥ 64%; I-CFI: > 199). 4. Kod pacijenata koji se na osnovu pozitivnog odgovora limfocita na DEB (24h) klasifikuju kao mozaični tip FA, neophodno je uraditi dalje analize u cilju potvrde ili isključenja dijagnoze bolesti, a to su: a) analiza parametara 24h DEB-om indukovane hromozomske osetljivosti u fibroblastima kože, b) analiza indukovanih (DEB, 24h) oštećenja DNK u limfocitima periferne krvi primenom komet testa, ZAKLJUČAK 102 c) analiza DEB-om 24h indukovanog zastoja u G2 fazi ćelijskog ciklusa u limfocitima ili 48h DEB-om indukovanog zastoja u fibroblastima kože. 5. Analizom parametara DEB-om 24h indukovane hromozomske osetljivosti u fibroblastima kože moguće je potvrditi fenotip FA kod bolesnika sa mozaičnom formom ove bolesti (FA: broj prekida/ćeliji ≥ 0,10 i aberantne ćelije ≥ 10% u odnosu na zdrave osobe: broj prekida/ćeliji ≤ 0,06 i aberantne ćelije ≤ 6%). 6. Analizom oštećenja DNK u limfocitima periferne krvi primenom komet testa su utvrđene OTM vrednosti obolelih od FA, nakon 24-časovne indukcije DEB- om (FA: OTM ≥ 2,72 naspram zdravih osoba: OTM ≤ 1,83), pomoću kojih se može potvrditi dijagnoza bolesti i nakon mozaičnog, odnosno graničnog odgovora na DEB u hromozomskoj analizi ovih bolesnika. 7. Analizom DEB-om 24h indukovanog zastoja u G2 fazi ćelijskog ciklusa dobijeni su rasponi vrednosti u limfocitima (FA: ćelije u G2 fazi ≥ 4,41% vs. zdrave kontrole: ćelije u G2 fazi ≤ 4,11%) i fibroblastima kože (FA: ćelije u G2 fazi ≥ 11,61% u odnosu na zdrave kontrole: ćelije u G2 fazi ≤ 5,99%) karakteristični za obolele od FA. Na osnovu ovih vrednosti može biti potvrđena dijagnoza bolesti, posebno kod pacijenata kod kojih prethodni testovi nisu bili dovoljno informativni. 8. Nakon analize svih rezultata dobijenih primenom citogenetičkih, molekularnih i citometrijskih metoda, u uzorku od 90 pacijenta sa kliničkom slikom FA, postojanje ćelijskog fenotipa FA je potvrđeno kod 13,33% (12/90) bolesnika, koji će biti upućeni na dalje molekularne analize u cilju definitivne potvrde dijagnoze bolesti. ZAKLJUČAK 103 6.2. NIJMEGENOV SINDROM NESTABILNOSTI Primenom citogenetičkih i molekularnih analiza u porodicama obolelih od NSN zaključeno je sledeće:  Utvrđeni su rasponi vrednosti parametara BLC-om indukovane hromozomske osetljivosti u limfocitima periferne krvi, na osnovu kojih se oboleli od NSN mogu izdvojiti od ostalih bolesnika sa sličnim simptomima, kao i u odnosu na zdrave osobe (NSN: broj prekida/ćeliji ≥ 0,27 i aberantne ćelije ≥ 27% u odnosu na zdrave osobe: broj prekida/ćeliji ≤ 0,13 i aberantne ćelije ≤ 6%).  Kod svih pacijenata sa kliničkom slikom NSN i pozitivnim odgovorom limfocita na BLC (NBS grupa), kao i kod pacijenata kod kojih sprovođenje citogenetičke analize nije moguće, indikovana je molekularna analiza c.657_661del5 mutacije u cilju konačne potvrde dijagnoze bolesti.  Primenom modifikovane PCR metode identifikovano je homozigotno prisustvo c.657_661del5 mutacije u egzonu 6 NBN gena kod 100% ispitivanih pacijenata obolelih od NSN u Srbiji.  Primenom molekularnih metoda identifikovani su i heterozigotni nosioci u porodicama obolelih od NSN, što je od neprocenjivog značaja za davanje preciznog genetičkog saveta, pre svega u vezi mogućnosti sprovođenja prenatalne dijagnostike i prevencije rađanja deteta sa ovim teškim oboljenjem. 104 7. LITERATURA Alter BP, Young NS. The bone marrow failure syndromes. In: Eds. Nathan DG, Oski FA. Hematology of Infancy and Childhood, 4th ed. Philadelphia, PA: WB Saunders, Inc 1993;216-316. Alter BP. Inherited bone marrow failure syndromes. In: Eds. Handin RI, Stossel TP, Lux SE; Blood: Principles and Practice of Hematology. Philadelphia, JB Lippincott, 1995;227-91. Alter BP. Diagnostic Evaluation of FA. In: Eds. Eiler ME, Frohnmayer D, Frohnmayer L, Larsen K, Olsen J. Fanconi Anemia: Guidelines for Diagnosis and Management. 3 ed. Eugene, 2008;33-46. Alter BP, Kupfer G. Fanconi Anemia. Gene Reviews 2011; URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1401/. Ameziane N, Errami A, Leveille F, Fontaine C, de Vries Y, van Spaendonk RM, de Winter JP, Pals G, Joenje H. Genetic subtyping of Fanconi anemia by comprehensive mutation screening. Hum Mutat 2008;29(1):159-66. Anderson D, Dobrzynska MM, Basaran N. Effect of various genotoxins and reproductive toxins in human lymphocytes and sperm in the comet assay. Teratogen Carcinogen Mutagen 1997;17:29-43. Andreassen PR, D’Andrea AD, Taniguchi T. ATR couples FANCD2 monoubiquitination to the DNA-damage response. Genes Dev 2004;18:1958–63. Auerbach AD. A test for Fanconi's anemia. Blood 1988;72(1):366-7. Auerbach AD, Alter BP: Prenatal and postnatal diagnosis of aplastic anemia. In (eds): Alter BP. Methods in Hematology: Perinatal Hematology. Edinburgh, UK, Churchill Livingstone, 1989;225. Auerbach AD, Koorse RE, Ghosh R, Venkatraj VS. Zhang M, Chiorazzi N. Complementation studies in Fanconi anemia. In Eds: Schroeder-Kurth TM, Auerbach AD, Obe G. Fanconi Anemia. Clinical, Cytogenetic and Experimental Aspects. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag, 1989a;213-25. Auerbach AD, Rogatko A, Schroeder-Kurth TM. International Fanconi Anemia Registry: Relation of Clinical Symptoms to Diepoxybutane Sensitivity. Blood 1989b;73(2):391-6. LITERATURA 105 Auerbach AD. Fanconi anemia diagnosis and the diepoxybutane (DEB) test. Exp Hematol 1993;21:731–3. Auerbach AD. Diagnosis of Fanconi anemia by diepoxybutane analysis. In: Eds. Dracopoli NC, Haines JL, Korf BR, Moir DR, Morton CC, Seidman CE, Seidman JG, Smith DR. Current Protocols Human Genetics. John Wiley & Sons, Inc, Hoboken, NJ 2003;37:p. 8.7.1-8.7.15. Auerbach AD. Fanconi Anemia and its Diagnosis. Mutat Res 2009;668(1-2):4–10. Bagby GC, Lipton JM, Sloand EM, Schiffer CA. Marrow failure. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2004;2004(1):318-36. Berger R, Coniat ML, Gendron MC. Fanconi anemia: Chromosome breakage and cell cycle studies. Cancer Genetics and Cytogenetics 1993;69(1):13-6. Bogdanova N, Feshchenko S, Schürmann P, Waltes R, Wieland B, Hillemanns P, Rogov YI, Dammann O, Bremer M, Karstens JH, Sohn C, Varon R, Dörk T. Nijmegen Breakage Syndrome mutations and risk of breast cancer. Int J Cancer 2008;122(4):802-6. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand J Clin Lab Invest 1968;21:77-89. Butturini A, Gale RP, Verlander PC, Adler-Brecher B, Gillio AP, Auerbach AD. Hematologic abnormalities in Fanconi anemia: an International Fanconi Anemia Registry study. Blood 1994;84(5):1650-5. Callen E, Casado JA, Tischkowitz MD, Bueren JA, Creus A, Marcos R, Dasi A, Estella JM, Munoz A, Ortega JJ, de Winter J, Joenje H, Schindler D, Hanenberg H, Hodgson SV, Mathew CG, Surralles J. A common founder mutation in FANCA underlies the world's highest prevalence of Fanconi anemia in Gypsy families from Spain. Blood 2005;105:1946–9. Carney JP, Maser RS, Olivares H, Davis EM, Le Beau M, Yates JR 3rd, Hays L, Morgan WF, Petrini JH. The hMre11/hRad50 protein complex and Nijmegen breakage syndrome: linkage of double-strand break repair to the cellular DNA damage response. Cell 1998;93(3):477-86. Casado J, Callen E, Jacome A, Rio P, Castella M, Lobitz S, Ferro T, Munoz A, Sevilla J, Cantalejo A, Cela E, Cervera J, Sanchez-Calero J, Badell I, Estella J, Dasi A, LITERATURA 106 Olive T, Jose Ortega J, Rodriguez-Villa A, Tapia M, Molines A, Madero L, Segovia JC, Neveling K, Kalb K, Schindler D, Hanenberg H, Surralles J, Bueren JA. A comprehensive strategy for the subtyping of patients with Fanconi anaemia: conclusions from the Spanish Fanconi Anemia Research Network. J Med Genet 2007;44(4):241-9. Castella M, Pujol R, Callén E, Ramírez MJ, Casado JA, Talavera M, Ferro T, Muñoz A, Sevilla J, Madero L, Cela E, Beléndez C, de Heredia CD, Olivé T, de Toledo JS, Badell I, Estella J, Dasí Á, Rodríguez-Villa A, Gómez P, Tapia M, Molinés A, Figuera Á, Bueren JA, Surrallés J. Chromosome fragility in patients with Fanconi anaemia: diagnostic implications and clinical impact. J Med Genet 2011;48(4):242-50. Chandra S, Levran O, Jurickova I, Maas C, Kapur R, Schindler D, Henry R, Milton K, Batish SD, Cancelas JA, Hanenberg H, Auerbach AD, Williams DA. A rapid method for retrovirus-mediated identification of complementation groups in Fanconi anemia patients. Mol Ther 2005;12:976–84. Chen J, Ghorai MK,Kenney G, Stubbe JA. Mechanistic studies on bleomycin-mediated DNA damage: multiple binding modes can result in double-stranded DNA cleavage. Nucleic Acids Res 2008;36(11):3781–90. Cho SH, Kook H, Kim GM, Yoon WS, Cho TH, Hwang TJ. A Clinical Study of Fanconi's Anemia. Korean J Pediatr Hematol Oncol 1997;4(1):70-7. Chrzanowska KH, Kleijer WJ, Krajewska-Walasek M, Bialecka M, Gutkowska A, Goryluk-Kozakiewicz B, Michalkiewicz J, Stachowski J, Gregorek H, Lyson- Wojciechowska G, Janowicz,W, Jozwiak S. Eleven Polish patients with microcephaly, immunodeficiency and chromosomal instability: the Nijmegen breakage syndrome. Am J Med Genet 1995;57:462-71. Chrzanowska KH, Gregorek H, Dembowska-Bagińska B, Kalina MA, Digweed M. Nijmegen breakage syndrome (NBS). Orphanet Journal of Rare Diseases 2012;7(13):1-19. Chrzanowska KH, Janniger CK. Nijmegen Breakage Syndrome. 2012; URL: http://emedicine.medscape.com/article/1116869-overview. LITERATURA 107 Ciccia A, Ling C, Coulthard R, Yan Z, Xue Y, Meetei AR. Identification of FAAP24, a Fanconi anemia core complex protein that interacts with FANCM. Mol Cell 2007;25:331–43. Cirkovic S, Guc-Scekic M, Vujic D, Ilic N, Micic D, Skoric D, Jovanovic A: Diagnosis of Fanconi’s anemia by diepoxybutane analysis in children from Serbia. Balkan J of Med Genet 2011;14(2):65-70. Clarke DJ, Gimenez-Abian JF. Checkpoints controlling mitosis. BioEssays 2000;22:351–63. Collins AR. The Comet Assay for DNA Damage and Repair: Principles, Applications, and Limitations. Mol Biotechnol 2004;26(3):249-61. Concannon PJ, Gatti RA. Nijmegen Breakage Syndrome. Gene Reviews 2011; URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1176/. Cooper GM. The Eukaryotic Cell Cycle. In (eds): Cooper GM, Hausman RE. The cell: a molecular approach (4nd ed.). Washington, D.C: ASM Press. Chapter 16. 2007;649-88. Cybulski C, Gorski B, Debniak T, Gliniewicz B, Mierzejewski M, Masojc B, Jakubowska A, Matyjasik J, Zlowocka E, Sikorski A, Narod SA, Lubinski J. NBS1 is a prostate cancer susceptibility gene. Cancer Res 2004;64:1215–9. Ćirković S, Guć-Šćekić M, Vujić D, Mićić D. Cytogenetic Diepoxybutane sensitivity findings in Serbian children with Fanconi anemia. Arch Biol Sci 2006;58(4):215- 19. Demuth I, Wlodarski M, Tipping AJ, Morgan NV, de Winter JP, Thiel M, Gräsl S, Schindler D, D'Andrea AD, Altay C, Kayserili H, Zatterale A, Kunze J, Ebell W, Mathew CG, Joenje H, Sperling K, Digweed M. Spectrum of mutations in the Fanconi anaemia group G gene, FANCG/XRCC9. Eur J Hum Genet 2000;8:861– 8. de Winter JP, Rooimans MA, van der Weel L, van Berkel CGM, Alon N, Bosnoyan- Collins L, de Groot J, Zhi Y, Waisfisz Q, Pronk JC, Arwert F, Mathew CG, Scheper RJ, Hoatlin ME, Buchwald M, Joenje H. The Fanconi anaemia gene FANCF encodes a novel protein with homology to ROM. (Letter) Nature Genet 2000;24:15-6. LITERATURA 108 Diamond LK, Shahidi NT. Treatment of aplastic anemia in children. Semin Hematol 1967;4(3): 278-88. Digweed M, Sperling K. Nijmegen breakage syndrome: clinical manifestation of defective response to DNA double-strand breaks. DNA Repair 2004;S.1207-17. di Masi A, Antoccia A. NBS1 Heterozygosity and Cancer Risk. Curr Genomics 2008;9(4):275-81. Djuzenova CS, Rothfuss A, Oppitz U, Spelt G, Schindler D, Hoehn H, Flentje M. Response to X-irradiation of Fanconi anemia homozygous and heterozygous cells assessed by the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. Lab Invest 2001;81(2):185-92. Dong Z, Zhong Q, Chen PL. The Nijmegen Breakage Syndrome protein is essential for Mre11 phosphorylation upon DNA damage. The Journal of Biological Chemistry 1999;274(28):19513-6. Dokal I, Vulliamy T. Inherited bone marrow failure syndromes. Haematologica 2010;95(8):1236–40. Drábek J, Hajdúch M, Gojová L, Weigl E, Mihál V. Frequency of 657del(5) mutation of the NBS1 gene in the Czech population by polymerase chain reaction with sequence specific primers. Cancer Genet Cytogenet 2002;138(2):157-9. Duckworth-Rysiecki G, Cornish K, Clarke CA, Buchwald M. Identification of two complementation groups in Fanconi anaemia. Somat Cell Mol Genet 1985;11:35- 41. Dutrillaux B, Aurias A, Dutrillaux AM, Buriot D, Prieur M: The cell cycle of lymphocytes in Fanconi anemia. Hum Genet 1982;62:327–32. Ellis NA, Lennon DJ, Proytcheva M, Alhadeff B, Henderson EE, German J. Somatic intragenic recombination within the mutated locus BLM can correct the high SCE phenotype of Bloom syndrome cells. Am J Hum Genet 1995;57:1019-27. Ellis NA, Ciocci S, Proytcheva M, Lennon D, Groden J, German J. The Ashkenazic Jewish Bloom syndrome mutation blmAsh is present in non-Jewish Americans of Spanish ancestry. Am J Hum Genet 1998;63:1685–93. LITERATURA 109 Esmer C, Sánchez S, Ramos S, Molina B, Frias S, Carnevale A. DEB test for Fanconi anemia detection in patients with atypical phenotypes. Am J Med Genet A. 2004;124A(1):35-9. Fabio T, Crescenzio N, Saracco P, Leone L, Ponzio G, Ramenghi U. Cell cycle analysis in the diagnosis of Fanconi’s anemia. Haematologica 2000;85:431–2. Fanconi G. Familiäre infantile perniziosaartige Anämie (perniziöses Blutbild und Konstitution). Jahrbuch für Kinderheilkunde und physische 1927;117:257-80. Flemming W. Zellsubstanz, Kern und Zelltheilung. Vogel, Leipzig. 1882. Garcia-Higuera I, Taniguchi T, Ganesan S, Meyn MS, Timmers C, Hejna J, Grompe M, D'Andrea AD. Interaction of the Fanconi anemia proteins and BRCA1 in a common pathway. Mol Cell 2001;7:249. Gatti R. Ataxia-Tealangiectasia. Gene Reviews 2010; URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ NBK26468/. Gisselsson D. Chromosomal Instability in Cancer: Causes and Consequences. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol. 2001; URL:http://AtlasGeneticsOncology.org/Deep/ChromosomInstabilID20023.html. Gordon LB, Brown WT, Collins FS. Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome. Gene Reviews 2011; URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1121/. Gregory JJ Jr., Wagner JE, Verlander PC, Levran O, Batish SD, Eide CR, Steffenhagen A, Hirsch B, Auerbach AD. Somatic mosaicism in Fanconi anemia: evidence of genotypic reversion in lymphohematopoietic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:2532-7. Gross M, Hanenberg H, Lobitz S, Friedl R, Herterich S, Dietrich R, Gruhn B, Schindler D, Hoehn H. Reverse mosaicism in Fanconi anemia: natural gene therapy via molecular self-correction. Cytogenet Genome Res 2002;98(2-3):126-35. Hanenberg H, Batish SD, Pollok KE, Vieten L, Verlander PC, Leurs C, Cooper RJ, Gottsche K, Haneline L, Clapp DW, Lobitz S, Williams DA, Auerbach D. Phenotypic correction of primary Fanconi anemia T cells with retroviral vectors as a diagnostic tool. Exp Hematol 2002;30(5):410-20. LITERATURA 110 Hansen RS, Wijmenga C, Luo P, Stanek AM, Canfield TK, Weemaes CM, Gartler SM. The DNMT3B DNA methyltransferase gene is mutated in the ICF immunodeficiency syndrome. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96(25):14412–7. Hansen RS, Stoger R, Wijmenga C, Stanek AM, Canfield TK, Luo P, Matarazzo MR, D’Esposito M, Feil R, Gimelli G, Weemaes CMR, Laird CD, Gartler SM. Escape from gene silencing in ICF syndrome: evidence for advanced replication times as a major determinant. Hum Mol Genet 2000;9(18):2575–87. Hartwell LH, Weinert TA. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science 1989;246:629–34. Hartwell LH, Kastan MB. Cell cycle control and cancer. Science 1994;266:1821–8. Heinrich MC, Hoatlin ME, Zigler AJ, Silvey KV, Bakke AC, et al: DNA cross- linker-inducedG2/M arrest in group C Fanconi anemia lymphoblasts reflects normal checkpoint function. Blood 1998;91:275–287. Hiel JA, Weemaes CM, van den Heuvel LP, van Engelen BG, Gabreëls FJ, Smeets DF, van der Burgt I, Chrzanovska KH, Bernatowska E, Krajewska-Walasek M, Bialecka M, Abramczuk D, Gregorek H, Michalkiewicz J, Perek D, Midro AT, Seemanová E, Belohradsky BH, Sölder B, Barbi G, Wegner RD, Sperling K, Dixon J, Maraschio P, Marseglia GL, Green A, Taylor AM, Der Kaloustian VM, Komatsu K, Matsuura S, Conley ME, Concannon P, Gatti RA. The International Nijmegen Breakage Syndrome Study Group. Nijmegen breakage syndrome. Arch Dis Child 2000;82:400–6. Higurashi M, Conen PE. In Vitro Chromosomal Radiosensitivity in Fanconi's Anemia. Blood 1971;38:336-42. Hisama FM, Tekumalla PK, Weissman SM. Overview of Chromosomal Instability and Aging Mechanisms. In: Eds. Hisama FM, Weissman SM, Martin GM. Chromosomal Instability and Aging, Marcel Decker Inc, New York-Basel, 2003. Chapter 2. Hittelman WN. Genetic instability in epithelial tissues at risk for cancer. Ann NY Acad Sci 2001;952:1–12. Hoehn H, Kalb R, Neveling K, Friedl R, Bechtold A, Herterich S, Sun Y, Gruhn B, Hanenberg H, Schindler D. Revertant Mosaicism in Fanconi Anemia: Natural LITERATURA 111 Gene Therapy at Work. In: Eds. Schindler D, Hoehn H. Fanconi Anemia. A Paradigmatic Disease for the Understanding of Cancer and Aging. Monogr Hum Genet, Basel, Karger, 2007;15:149-72. Holmquist GP. Chromosome bands, their chromatin flavors, and their functional features. Am J Hum Genet 1992;51:17–37. Houldsworth J, Lavin MF. Effect of ionizing radiation on DNA synthesis in ataxia telangiectasia cells. Nucleic Acids Res 1980;8:3709–20. Hu P, Ellis NA. Bloom Syndrome: Genetic, Cellular, and Molecular Features as Compared to Werner Syndrome. In: Eds. Hisama FM, Weissman SM, Martin GM. Chromosomal Instability and Aging. Marcel Decker Inc, New York-Basel, 2003; Chapter 10. Ilgin H, Akarsu AN, Bokesoy FI. Cytogenetic and phenotypic findings in Turkish patients with Fanconi anemia. Tr J of Medical Sciences 1999;29(2):151-4. ISCN 2009. An International System for Cytogenetic Nomenclature. eds: Shaffer LG, Tommerup N. S Karger, Basel 2009. Jaspers NG, Raams A, Silengo MC, Wijgers N, Niedernhofer LJ, Robinson AR, Giglia- Mari G, Hoogstraten D, Kleijer WJ, Hoeijmakers JH, Vermeulen W. First reported patient with human ERCC1 deficiency has cerebro-oculo-facio-skeletal syndrome with a mild defect in nucleotide excision repair and severe developmental failure. Am J Hum Genet 2007;80:457–66. Joenje H, Oostra AB, Wijker M, di Summa FM, van Berkel CGM, Rooimans MA, Ebell W, van Weel M, Pronk JC, Buchwald M, Arwert F. Evidence for at least eight Fanconi anemia genes. Am J Hum Genet 1997;61:940-4. Joenje H, Levitus M, Waisfisz Q, D'Andrea A, Garcia-Higuera I, Pearson T, van Berkel CG M, Rooimans MA, Morgan N, Mathew CG, Arwert F. Complementation analysis in Fanconi anemia: assignment of the reference FA-H patient to group A. Am J Hum Genet 2000;67:759-62. Joenje H, Patel KJ. The emerging genetic and molecular basis of Fanconi anaemia. Nature Rev. Genet. 2001;2:446-57. LITERATURA 112 Jovanovic A, Minic P, Scekic-Guc M, Djuricic S, Cirkovic S, Weemaes C, Pasic S. Successful treatment of Hodgkin lymphoma in Nijmegen Breakage syndrome. J Pediatr Hematol Oncol 2009;31(1):46-52. Kaiser TN, Lojewski A, Dougherty C, Juergens L, Sahar E, Latt SA: Flow cytometric characterization of the response of Fanconi’s anemia cells to mitomycin C treatment. Cytometry 1982;2:291–297. Karow JK, Constantinou A, Li JL, West SC, Hickson ID. The Bloom’s syndrome gene product promotes branch migration of holliday junction. Pro Natl Acad Sci USA 2000;97:6504-8. Kennedy RD, D’Andrea AD: The Fanconi Anemia/BRCA pathway: new faces in the crowd. Genes Dev 2005;19:2925–40. Kerem BS, Rommens JM, Buchanon JA, Markiewitz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, Tsui LC. Identification of the cystic fibrosis gene: Genetic analysis. Science 1989;245:1073-80. Kim Y, Lach FP, Desetty R, Hanenberg H, Auerbach AD, Smogorzewska A. Mutations of the SLX4 gene in Fanconi anemia. Nature Genet 2011;43:142-6. Kook H, Cho D, Cho SH, Hong WP, Kim CJ, Park JY, et al. Fanconi Anemia Screening by Diepoxybutane and Mitomycin C Tests in Korean Children with Bone Marrow Failure Syndromes. J Korean Med Sci 1998;(6):623-8. Kopjar N, Milas I, Garaj-Vrhovac V, Gamulin M. Alkaline comet assay study with breast cancer patients: evaluation of baseline and chemotherapy-induced DNA damage in non-target cells. Clin Exp Med 2006;6(4):177-90. Korgaonkar S, Ghosh K, Jijina F, Vundinti BR. Chromosomal Breakage Study in Children Suspected With Fanconi Anemia in the Indian Population. J Pediatr Hematol Oncol 2010;32:606–10 Korenberg JR, Rykowski MC. Human genome organization: Alu, lines, and the molecular structure of metaphase chromosome bands. Cell 1988;53:391–400. Kraakman-van der Zwet M, Overkamp WJ, Friedl AA, Klein B, Verhaegh GW, Jaspers NG, Midro AT, Eckardt-Schupp F, Lohman PH, Zdzienicka MZ. Immortalization and characterization of Nijmegen breakage syndrome fibroblasts. Mutat Res 1999;434:17–27. LITERATURA 113 Kracker S, Bergmann Y, Demuth I, Frappart PO, Hildebrand G, Christine R, Wang Z, Sperling K, Digweed M, Radbruch A. Nibrin functions in Ig class-switch recombination. PNAS 2005;102(5):1584-9. Kraemer KH, Ruenger TM. Genome instability DNA repair and cancer In Eds: Wolff K, Goldsmith LA, Katz SI, Gilchrest BA, Paller AS, Leffell DJ. Fitzpatrick's Dermatology in General Medicine. New York, McGraw Hill 2008;977-86. Kraemer KH, DiGiovanna JJ. Xeroderma Pigmentosum. Gene Reviews 2012; URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1397/. Krenzlin H, Demuth I, Salewsky B, Wessendorf P, Weidele K, Burkle A, Digweed M. DNA Damage in Nijmegen Breakage Syndrome Cells Leads to PARP Hyperactivation and Increased Oxidative Stress. Plos Genet 2012;8(3):e1002557. Kubbies M, Schindler D, Hoehn H, Schinzel A, Rabinovitch PS: Endogenous blockage and delay of the chromosome cycle despite normal recruitment and growth phase explain poor proliferation and frequent endomitosis in Fanconi anemia cells. Am J Hum Genet 1985;37:1022–1030. Kutler DI, Singh B, Satagopan J, Batish SD, Berwick M, Giampietro PF, Hanenberg H, Auerbach AD. A 20-year perspective on the International Fanconi Anemia Registry (IFAR). Blood 2003;101(4):1249-56. Kutler DI, Auerbach AD. Fanconi anemia in Ashkenazi Jews. Fam Cancer 2004;3:241- 8. Kwee ML, Poll EH, van de Kamp JJ, de Koning H, Eriksson AW, Joenje H. Unusual response to bifunctional alkylating agents in a case of Fanconi anaemia. Hum Genet 1983;64(4):384-7. Lavin MF. Ataxia-telangiectasia: from a rare disorder to a paradigm for cell signalling and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:759–69. Lee E, Oh E, Lee J, Sul D, Lee J. Use of the Tail Moment of the Lymphocytes to Evaluate DNA Damage in Human Biomonitoring Studies. Toxicol Sci 2004;81(1):121-32. Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstain B. Genetic instabilities in human cancers. Nature 1998;396,643–9. LITERATURA 114 Lejeune J, Turpin R, Gautier M. Chromosomic diagnosis of mongolism. Arch Fr Pediatr.1959;16:962–3. Levitus M, Rooimans MA, Steltenpool J, Cool NFC, Oostra AB, Mathew CG, Hoatlin ME, Waisfisz Q, Arwert F, de Winter JP, Joenje H. Heterogeneity in Fanconi anemia: evidence for 2 new genetic subtypes. Blood 2004;103:2498-503. Levran O, Erlich T, Magdalena N, Gregory JJ, Batish SD, Verlander PC, Auerbach AD. Sequence variation in the Fanconi anemia gene FAA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:13051–6. Ling C, Ishiai M, Ali AM, Medhurst AL, Neveling K, Kalb R, Yan Z, Xue Y, Oostra AB, Auerbach AD, Hoatlin ME, Schindler D, Joenje H, de Winter JP, Takata M, Meetei AR, Wang W. FAAP100 is essential for activation of the Fanconi anemia- associated DNA damage response pathway. EMBO J. 2007;26:2104–14. Lo Ten Foe JR, Rooimans MA, Bosnoyan-Collins L, Alon N, Wijker M, Parker L, Lightfoot J, et al. Expression cloning of a cDNA for the major Fanconi anaemia gene, FAA. Nat Genet 1996; 14:320-3. Lo Ten Foe JR, Kwee ML, Rooimans MA, Oostra AB, Veerman AJ, van Weel M, et al. Somatic mosaicism in Fanconi anemia: molecular basis and clinical significance. Eur J Hum Genet 1997; 5(3):137-48. Macioszek VK, Kononowicz AK. The evaluation of the genotoxicity of two commonly used food colors: quinoline yellow (E 104) and brilliant black BN (E 151). Cellular & Molecular Biology Letters 2004;9:107-22. Matsuura S, Tauchi H, Nakamura A, Kondo N, Sakamoto S, Endo S, Smeets D, Solder B, Belohradsky BH, Der Kaloustian VM, Oshimura M, Isomura M, Nakamura Y, Komatsu K. Positional cloning of the gene for Nijmegen breakage syndrome. Nat Genet 1998;19:179–81. Meetei AR, de Winter JP, Medhurst AL, Wallisch M, Waisfisz Q, van de Vrugt HJ, Oostra AB, Yan Z, Ling C, Bishop CE, Hoatlin ME, Joenje H, Wang W. A novel ubiquitin ligase is deficient in Fanconi anemia. Nature Genet. 2003;35:165-70. Meetei AR, Levitus M, Xue Y, Medhurst AL, Zwaan M, Ling C, Rooimans MA, Bier P, Hoatlin M, Pals G, de Winter JP, Wang W, Joenje H. X-linked inheritance of Fanconi anemia complementation group B. Nature Genet. 2004;36:1219-24. LITERATURA 115 Meetei AR, Medhurst AL, Ling C, Xue Y, Singh TR, Bier P, Steltenpool J, Stone S, Dokal I, Mathew CG, Hoatlin M, Joenje H, de Winter JP, Wang W. A human ortholog of archaeal DNA repair protein Hef is defective in Fanconi anemia complementation group M. Nat Genet 2005;37:958–63. Miglierina R, Le Coniat M, Berger R: A simple diagnostic test for Fanconi anemia by flow cytometry. Anal Cell Pathol 1991;3:111–18. Miller SA, Dykes DD, Folesky HF. A simple salting out prosedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucl Acid Res 1988;16 (3):1215. Mohseni Meybodi A, Mozdarani H. DNA damage in leukocytes from Fanconi anemia (FA) patients and heterozygotes induced by mitomycin C and ionizing radiation as assessed by the comet and comet-FISH assay. Iran Biomed J 2009;13(1):1-8. Mohseni-Meybodi A, Mozdarani H, Mozdarani S. DNA damage and repair of leukocytes from Fanconi anaemia patients, carriers and healthy individuals as measured by the alkaline comet assay. Mutagenesis 2009;24(1):67-73. Moldovan GL, D’Andrea AD. How the Fanconi Anemia pathway guards the genome. Annu Rev Genet 2009 ; 43: 223–249. Moller P, Knudsen LE, Loft S, Wallin H. The comet assay as a rapid test in biomonitoring occupational exposure to DNA-damaging agents and effect of confounding factors. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2000;9:1005–15. Moller P. Assessment of reference values for DNA damage detected by the comet assay in human blood cell DNA. Mutat Res 2006;612:84–104. Møller P, Möller L, Godschalk RWL, Jones GDD. Assessment and reduction of comet assay variation in relation to DNA damage: studies from the European Comet Assay Validation Group. Mutagenesis 2010;25(2):109-11. Moreira CFA, Brito Júnior LC, Lemos JAR. Flow cytometry for diepoxybutane test analysis. Genetics and Molecular Research 2008;7(4):1353-9. Morgan NV, Tipping AJ, Joenje H, Mathew CG. High frequency of large intragenic deletions in the Fanconi anemia group A gene. Am J Hum Genet. 1999;65:1330– 41. Morrison C, Rieder CL. Chromosome damage and progression into and through mitosis in vertebrates. DNA Repair (Amst) 2004;3:1133–9. LITERATURA 116 Müller W-U. Comet Assay. In: Eds. Günter Obe, Vijayalaxmi. Chromosomal Alterations: Methods, Results and Importance in Human Health. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007;161-72. Nagase T, Kikuno R, Nakayama M, Hirosawa M, Ohara O. Prediction of the coding sequences of unidentified human genes. XVIII. The complete sequences of 100 new cDNA clones from brain which code for large proteins in vitro. DNA Res. 2000;7:273-81. Nakanishi K, Taniguchi T, Ranganathan V, New HV, Moreau LA, Stotsky M, Mathew CG, Kastan MB, Weaver DT, D'Andrea AD. Interaction of FANCD2 and NBS1 in the DNA damage response. Nat Cell Biol 2002;4:913–20. Neitzel H, Trimborn M. Human Chromosomes: Structural and Functional Aspects. In: Günter Obe, Vijayalaxmi (Eds). Chromosomal Alterations: Methods, Results and Importance in Human Health. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007;1-20. Nove J, Little JB, Mayer PJ, Troilo P, Nichols WW. Hypersensitivity of cells from a new chromosomal-breakage syndrome to DNA-damaging agents. Mutat Res 1986;163:255–62. Nowell PC. Phytohemagglutinin: an initiator of mitosis in cultures of normal human leukocytes. Cancer Res 1969;20:462–6. Nurse P. Checkpoint pathways come of age. Cell 1997;91:865–7. Olive PL. Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster V79 spheroids. Radiat Res 1989;117:79−92. Olive PL, Banáth JP, Durand RE. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the “comet” assay. Radiat Res 1990;122:86−94. Olive PL, Banáth JP. The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells. Nat Protoc. 2006;1(1):23-9. Oller AR, Rastogi P, Morgenthaler S, Thilly WG. A Statistical Model to Estimate Variance in Long Term–Low Dose Mutation Assays: Testing of the model in a human lymphoblastoid mutation assay. Mutat Res 1989;216:149–61. LITERATURA 117 Oostra AB, Nieuwint AW, Joenje H, de Winter JP. Diagnosis of Fanconi Anemia: Chromosomal Breakage Analysis. Anemia 2012;2012:238731, doi:10.1155/2012/238731. Ormerod MG. Analysis of DNA – general methods. In ed: Ornerod MG. Flow Cytometry, A Practical Approach (third edition). Oxford University Press 2000;83-96. Oshima Y. Werner Syndrome. In: Eds. Hisama FM, Weissman SM, Martin GM. Chromosomal Instability and Aging, Marcel Decker Inc, New York-Basel, 2003; Chapter 9. Ostling O, Johanson KJ. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 1984;123:291−8. Pace P, Johnson M, Tan WM, Mosedale G, Sng C, Hoatlin M, de Winter J, Joenje H, Gergely F, Patel KJ. FANCE: the link between Fanconi anaemia complex assembly and activity. EMBO J 2002;21:3414–23. Park WH, Margossian S, Horwitz AA, Simons AM, D’Andrea AD, Parvin JD. Direct DNA binding activity of the Fanconi anemia D2 protein. J Biol Chem 2005;280:23593–8. Pichierri P, Rosselli F. The DNA crosslink-induced S-phase checkpoint depends on ATR-CHK1 and ATR-NBS1-FANCD2 pathways. EMBO J 2004;23:1178–87. Pilonetto DV, Pereira NF, Bitencourt MA, Magdalena NI, Vieira ER, Veiga LB, Cavalli IJ, Ribeiro RC, Pasquini R. FANCD2 Western blot as a diagnostic tool for Brazilian patients with Fanconi anemia. Braz J Med Biol Res 2009;42(3):237-43. Pines J, Rieder CL. Re-staging mitosis: a contemporary view of mitotic progression. Nat Cell Biol 2001;3:E3–6. Radivojević D, Đurišić M, Lalić T, Guć-Šćekić M, Savić J, Minić P, Antoniadi T, Tzetis M, Kanavakis E. Spectrum of cystic fibrosis mutations in Serbia and Montenegro-strategy for prenatal diagnosis. Genet Test 2004; 8(3);276-280. Rajeswari N, Ahuja YR, Malini U, Chandrashekar S, Balakrishna N, Rao KV, Khar A. Risk assessment in first degree female relatives of breast cancer patients using the alkaline Comet assay. Carcinogenesis 2000;21(4):557–61. LITERATURA 118 Reis A, Digweed M. NBS: Nibrin-Mutationen als Ursache für gestörte DNA- Doppelstrangbruch-Reparatur, Chromosomeninstabilität und Strahlenempfindlichkeit. In Eds: Stuhrman M, Dörk T, Karstens JH (Hrsg). Ataxia teleangiectatica, medizinischegenetik ed. 1, München, 1999;S.34-8. Resnick IB, Kondratenko I, Togoev O, Vasserman N, Shagina I, Evgrafov O, Tverskaya S, Cerosaletti KM, Gatti RA, Concannon P. Nijmegen breakage syndrome: clinical characteristics and mutation analysis in eight unrelated Russian families. J Pediatr 2002;140:355–61. Rojas E, Lopez MC, Valverde M. Single cell gel electrophoresis assay: methodology and applications. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999;722(1-2):225-54. Rommens JM, Kerem BS, Greer W, Chang P, Tsui LC, Ray P. Rapid nonradioactive detection of the major cystic fibrosis mutation. Am J Hum Genet 1990;46:395-6. Sanz MM, German J. Bloom’s Syndrome. Gene Reviews 2010; URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/ NBK1398/. Sasaki MS, Tonomura A. A High Susceptibility of Fanconi's Anemia to Chromosome Breakage by DNA Cross-linking Agents. Cancer Res 1973;33:1829-36. Savitsky K, Bar-Shira A, Gilad S, Rotman G, Ziv Y, Vanagaite L, Tagle DA, Smith S, Uziel T, Sfez S, Ashkenazi M, Pecker I, Frydman M, Harnik R, Patanjali SR, Simmons A, Clines GA, Sartiel A, Gatti RA, Chessa L, Sanal O, Lavin MF, Jaspers NG, Taylor AM, Arlett CF, Miki T, Weissman SM, Lovett M, Collins FS, Shiloh Y. A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 1995;268:1749-53. Schabath MB, Spitz MR, Grossman HB, Zhang K, Dinney CP, Zheng PJ, Wu X. Genetic instability in bladder cancer assessed by the comet assay. J Natl Cancer Inst 2003;95(7):540-7. Schindler D, Hoehn H. Flow cytometric testing for syndromes with chromosomal instability, aplastic anemia and related haematological disorders. In: Ed. Wegner R-D; Diagnostic cytogenetics. Berlin: Springer-Verlag, 1999;1:269-81. Schindler D, Sobeck A. Diagnostik von Ataxia teleangiectatica mittels Durchflußzytometrie und Zellzyklusanalyse. In: Stuhrman M, Dörk T, Karstens LITERATURA 119 JH (Hrsg) Ataxia teleangiectatica, medizinischegenetik edition Band 1, München, 1999;S. 11-6. Schindler D, Friedl R, Gavvovidis I, Kalb R, Neveling K, Linka Y, Hanenberg H, Kubbies M, Hoehn H. Applications of Cell Cycle Testing in Fanconi Anemia. In eds: Schindler D, Hoehn H. Fanconi Anemia. A Paradigmatic Disease for the Understanding of Cancer and Aging. Monogr Hum Genet. Basel, Karger, 2007;15:110–30. Schroeder TM, Anschutz F, Knopp A. Spontane Chromosomenaberrationen bei familiarer Panmyelopathie. Humangenetik 1964;1:194-6. Schroeder TM. Cytogenetic and cytologic findings in enzymopenic panmyelopathies and pancytopenias. Familial myelopathy of Fanconi, glutathione-reductase deficiency anemia and megaloblastic B12 deficiency anemia. Humangenetik 1966;2(3):287-316. Schuler D, Kiss A, Fabian F. Chromosomal Peculiarities and “inVitro”Examinations in Fanconi's Anaemia. Humangenetik 1969;7:314-22. Seyschab H, Friedl R, Sun Y, Schindler D, Hoehn H, et al: Comparative evaluation of diepoxybutane sensitivity and cell cycle blockage in the diagnosis of Fanconi anemia. Blood 1995;85:2233–7. Shahidi NT, Diamond LK. Testosterone-induced remission in aplastic anemia of both acquired and congenital types. Further observations in 24 cases. N Engl J Med 1961;264:953-67. Shimamura A, Montes de Oca R, Svenson JL, Haining N, Moreau LA, Nathan DG, D'Andrea AD. A novel diagnostic screen for defects in the Fanconi anemia pathway. Blood 2002;100(13):4649-54. Shimamura A, Alter BP. Pathophysiology and management of inherited bone marrow failure syndromes. Blood Rev 2010;24:101–22. Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res 1988;175:184−91. Smal MP, Savina NV, Kuzhir TD, Goncharova RI. Estimation of Genome Instability by the Comet Assay in the Risk Groups. In Eds: Antonina Cebulska-Wasilewska, LITERATURA 120 Andreyan N. Osipov, Firouz Darroudi. Rapid Diagnosis in Populations at Risk from Radiation and Chemicals. IOS Press, Amsterdam, 2010;201-9. Soulier J, Leblanc T, Larghero J, Dastot H, Shimamura A, Guardiola P, Esperou H, Ferry C, Jubert C, Feugeas JP, Henri A, Toubert A, Socie G, Baruchel A, Sigaux F, D'Andrea AD, Gluckman E. Detection of somatic mosaicism and classification of Fanconi anemia patients by analysis of the FA/BRCA pathway. Blood 2005;105(3):1329-36. Steffen J, Varon R, Mosor M, Maneva G, Maurer M, Stumm M, Nowakowska D, Rubach M, Kosakowska E, Ruka W, Nowecki Z, Rutkowski P, Demkow T, Sadowska M, Bidziński M, Gawrychowski K, Sperling K. Increased cancer risk of heterozygotes with NBS1 germline mutations in Poland. Int J Cancer 2004;111(1):67-71. Strathdee CA, Duncan AMV, Buchwald M. Evidence for at least 4 Fanconi anaemia genes including FACC on chromosome 9. Nat Genet 1992a;1:196-8. Strathdee CA, Gavish H, Shannon WR, Buchwald M. Cloning of cDNAs for Fanconi's anaemia by functional complementation. Nature 1992b;356:763-7. Sullivan KE, Veksler E, Lederman H, Lees-Miller SP. Cell cycle checkpoints and DNA repair in Nijmegen breakage syndrome. Clin Immunol Immunopathol 1997;82:43–8. Sumner AT, Mitchell AR, Ellis PM. A FISH study of chromosome fusion in the ICF syndrome: involvement of paracentric heterochromatin but not of the centromeres themselves. J Med Genet 1998;35:833–5. Swift MR, Hirschhorn K. Fanconi's anemia. Inherited susceptibility to hromosome breakage in various tissues. Annals of Internal Medicine, 1966;65:496-503. Swift M. Fanconi's anaemia in the genetics of neoplasia. Nature. 1971;230:370–3. Swift M, Morrell D, Cromartie E, Chamberlin AR, Skolnick MH, Bishop DT. The incidence and gene frequency of ataxia-telangiectasia in the United States. Am J Hum Genet 1986;39:573–83. Swift M, Morrell D, Massey RB, Chase CL. Incidence of cancer in 161 families affected by ataxia-telangiectasia. N Engl J Med 1991;325:1831–6. LITERATURA 121 Taalman RD, Jaspers NG, Scheres JM, de Wit J, Hustinx TW. Hypersensitivity to ionizing radiation, in vitro, in a new chromosomal breakage disorder, the Nijmegen breakage syndrome. Mutat Res 1983;112:23–32. Tanic N, Tanic N, Milasin J, Vukadinovic M, Dimitrijevic B. Genomic instability and tumor-specific DNA alterations in oral leukoplakias. European Journal of Oral Sciences 2009;117(3):231–7. Taniguchi T, Garcia-Higuera I, Andreassen PR, Gregory RC, Grompe M, D’Andrea AD: S-phase-specific interaction of the Fanconi anemia protein, FANCD2, with BRCA1 and RAD51. Blood 2002;100:2414–20. Taniguchi T, D'Andrea AD. Molecular pathogenesis of Fanconi anemia: recent progress. Blood 2006;107:4223–33. Tekin M, Dogu F, Tacyildiz N, Akar E, Ikinciogullari A, Ogur G, Yavuz G, Babacan E, Akar N. 657del5 mutation in the NBS1 gene is associated with Nijmegen breakage syndrome in a Turkish family. Clin Genet 2002;62:84-8. Thompson LH, Hinz JM, Yamada NA, Jones NJ: How Fanconi anemia proteins promote the four Rs: Replication, recombination, repair, and recovery. Environ Mol Mutagen 2005;45:128–42. Timmers C, Taniguchi T, Hejna J, Reifsteck C, Lucas L, Bruun D, Thayer M, Cox B, Olson S, D'Andrea AD, Moses R, Grompe M. Positional cloning of a novel Fanconi anemia gene, FANCD2. Molec Cell 2001;7:241-8. Tjio JH, Levan A. The chromosome number of man. Hereditas 1956;42:1–6. Uhrhammer N, Bay JO, Gatti RA. Nijmegen breakage syndrome. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol 2002; URL: http://AtlasGeneticsOncology.org/Kprones/NijmegenID10020.html. van der Burgt I, Chrzanowska KH, Smeets D, Weemaes C. Nijmegen breakage syndrome. J Med Genet 1996;33:153–6. van der Lelij P, Oostra AB, Rooimans MA, Joenje H, de Winter JP. Diagnostic Overlap between Fanconi Anemia and the Cohesinopathies: Roberts Syndrome and Warsaw Breakage Syndrome. Anemia 2010;2010:1-7. Varon R, Vissinga C, Platzer M, Cerosaletti KM, Chrzanowska KH, Saar K, Beckmann G, Seemanová E, Cooper PR, Nowak NJ, Stumm M, Weemaes CM, Gatti RA, LITERATURA 122 Wilson RK, Digweed M, Rosenthal A, Sperling K, Concannon P, Reis A. Nibrin, a novel DNA double-strand break repair protein, is mutated in Nijmegen breakage syndrome. Cell 1998;93(3):467-76. Vaz F, Hanenberg H, Schuster B, Barker K, Wiek C, Erven V, Neveling K, Endt D, Kesterton I, Autore F, Fraternali F, Freund M, Hartmann L, Grimwade D, Roberts RG, Schaal H, Mohammed S, Rahman N, Schindler D, Mathew CG. Mutation of the RAD51C gene in a Fanconi anemia-like disorder. Nature Genet 2010;42:406- 9. Vega H, Waisfisz Q, Gordillo M, Sakai N, Yanagihara I, Yamada M, van Gosliga D, Kayserili H, Xu C, Ozono K, Jabs EW, Inui K, Joenje H. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet 2005;37:468–70. Waisfisz Q, Morgan NV, Savino M, de Winter JP, van Berkel CG, Hoatlin ME, Ianzano L, Gibson RA, Arwert F, Savoia A, Mathew CG, Pronk JC, Joenje H. Spontaneous functional correction of homozygous Fanconi anaemia alleles reveals novel mechanistic basis for reverse mosaicism. Nat Genet 1999a;22:379- 83. Waisfisz Q, Saar K, Morgan NV, Altay C, Leegwater PA, de Winter JP, Komatsu K, Evans GR, Wegner R-D, Reis A, Joenje H, Arwert F, Mathew CG, Pronk JC, Digweed M. The Fanconi anemia group E gene, FANCE, maps to chromosome 6p. Am J Hum Genet 1999b;64:1400-5. Wajnrajch MP, Gertner JM, Huma Z, Popovic J, Lin K, Verlander PC, Batish SD, Giampietro PF, Davis JG, New MI, Auerbach AD. Evaluation of growth and hormonal status in patients referred to the International Fanconi Anemia Registry. Pediatrics 2001;107(4):744-54. Walpita D, Plug AW, Neff NF, German J, Ashley T. Bloom's syndrome protein, BLM, colocalizes with replication protein A in meiotic prophase nuclei of mammalian spermatocytes. Proc Nat Acad Sci 1999;96:5622-7. Warcoin M, Lespinasse J, Despouy G, Dubois d'Enghien C, Laugé A, Portnoï MF, Christin-Maitre S, Stoppa-Lyonnet D, Stern MH. Fertility defects revealing germline biallelic nonsense NBN mutations. Hum Mutat 2009;30(3):424-30. LITERATURA 123 Watson GD, Crick FHC. Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953;171:737–8. Weemaes CM, Hustinx TW, Scheres JM, van Munster PJ, Bakkeren JA, Taalman RD. A new chromosomal instability disorder: the Nijmegen breakage syndrome. Acta Paediatr Scand 1981;70(4):557–64. Wegner R-D, Stumm M. Diagnosis of Chromosomal Instability Syndromes. In: Ed. Wegner R-D. Diagnostic cytogenetics. Berlin: Springer-Verlag, 1999;1:251-66. Wen Y, Zhang PP, An J, Yu YX, Wu MH, Sheng GY, Fu JM, Zhang XY. Diepoxybutane induces the formation of DNA-DNA rather than DNA-protein cross-links, and single-strand breaks and alkali-labile sites in human hepatocyte L02 cells. Mutat Res 2011;716(1-2):84-91. Whitney MA, Saito H, Jakobs PM, Gibson RA, Moses RE, Grompe M. A common mutation in the FACC gene causes Fanconi anaemia in Ashkenazi Jews. Nat Genet 1993;4:202–5. Wijker M, Morgan NV, Herterich S, van Berkel CG, Tipping AJ, Gross HJ, Gille JJ, Pals G, Savino M, Altay C, Mohan S, Dokal I, Cavenagh J, Marsh J, van Weel M, Ortega JJ, Schuler D, Samochatova E, Karwacki M, Bekassy AN, Abecasis M, Ebell W, Kwee ML, de Ravel T, Mathew CG. Heterogeneous spectrum of mutations in the Fanconi anaemia group A gene. Eur J Hum Genet 1999;7:52–9. Wyllie FS, Jones CJ, Skinner JW, Haughton MF, Wallis C, Wynford-Thomas D, Faragher RG, Kipling D. Telomerase prevents the accelerated cell ageing of Werner syndrome fibroblasts. Nature Genet 2000;24:16–7. Yu CE, Oshima J, Fu YH, Wijsman EM, Hisama F, Alisch R, Matthews S, Nakura J, Miki T, Ouais S, Martin GM, Mulligan J, Schellenberg GD. Positional cloning of the Werner’s syndrome gene. Science 1996;272:258–62. Xia B, Dorsman JC, Ameziane N, de Vries Y, Rooimans MA, Sheng Q, Pals G, Errami A, Gluckman E, Llera J, Wang W, Livingston DM, Joenje H, de Winter JP. Fanconi anemia is associated with a defect in the BRCA2 partner PALB2. Nature Genet 2007;39:159-61. LITERATURA 124 Xing J, Spitz MR, Lu C, Zhao H, Yang H, Wang W, Stewart DJ, Wu X. Deficient G2- M and S checkpoints are associated with increased lung cancer risk: a case-control analysis. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2007;16(7):1517-22. Youssoufian H. Natural gene therapy and the Darwinian legacy. Nat Genet 1996;13(3):255-6. Zhang X-X. Chromosome Instability. In: Eds. Gersen SL, Keagle MB. Principles of Clinical Cytogenetics. Totowa, NJ: Humana Press, 2004;347-61. 125 BIOGRAFIJA Sanja S. Ćirković je rođena 24.01.1977. godine u Požarevcu. Diplomirala je na Biološkom fakultetu u Beogradu (srednja ocena 8,57) 2002. godine, na studijskoj grupi: molekularna biologija i fiziologija, smer primenjena genetika. Diplomski rad pod nazivom: “Proband sa derivatom hromozoma 9 kao posledicom balansirane translokacije 9;20 kod roditelja”, odbranila je sa ocenom 10. Od 2003. godine, zaposlena je u Laboratoriji za medicinsku genetiku Instituta za zdravstvenu zaštitu majke i deteta Srbije “Dr Vukan Čupić”, gde radi na poslovima postnatalne i prenatalne dijagnostike hromozomopatija, kao i na citogenetičkoj i molekularnoj dijagnostici bolesti hromozomske nestabilnosti. U 2004., 2005. i 2008. godini dobila je stipendije Komiteta «European Human Genetics Conference» (Vienna Medical Academy, Alser Strasse 4, A-1090 Vienna, Austria), na čijim je konferencijama učestvovala sa poster prezentacijama. Doktorske studije na Biološkom fakultetu u Beogradu upisala je 2006. godine u oblasti Biologije, modul: Genetika. Tokom februara 2009. godine u Institutu za onkologiju i radiologiju Srbije se obučavala za analizu ćelijskog ciklusa na BD citometru, dok je u Laboratoriji Katedre za mikrobiologiju Biološkog fakulteta u Beogradu, u februaru 2011. godine bila obučavana za primenu komet metode u dijagnostici Fankonijeve anemije. Usmene ili poster prezentacije radova iz oblasti dijagnostike hromozomopatija i bolesti hromozomske nestabilnosti imala je na 6 domaćih i 11 stranih simpozijuma. Kao predavač, učestvovala je na tri seminara u zemlji. 126 Прилог 1. Изјава о ауторству Потписанa Сања Ћирковић ______________________ број уписа _______________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом Испитивање сензитивности генома код пацијената са болестима хромозомске нестабилности  резултат сопственог истраживачког рада,  да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа,  да су резултати коректно наведени и  да нисам кршила ауторска права и користила интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, _28.8.2012.________ _________________________ 127 Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора __Сања Ћирковић___ __________________________ Број уписа __________________________________________________________ Студијски програм __Биологија: Генетика_________________________________ Наслов рада _____Испитивање сензитивности генома код пацијената са болестима хромозомске нестабилности Ментор ____проф. др Марија Гућ Шћекић________________________________ Потписани ___ Сања Ћирковић_____________________________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, __28.8.2012.____________ _________________________ 128 Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Испитивање сензитивности генома код пацијената са болестима хромозомске нестабилности која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предала сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучила. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, _28.8.2012._________ Сања Ћирковић ____________________