UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Ivan I. Šoštarić Fitohemijska i genetička varijabilnost vrsta iz sekcije Serpyllum (Mill.) Benth. roda Thymus L. (Lamiaceae) u Srbiji doktorska disertacija Beograd, 2012 ii UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Ivan I. Šoštarić Phytochemical and genetical variability of species from section Serpyllum (Mill.) Benth. genus Thymus L. (Lamiaceae) in Serbia Doctoral Dissertation Belgrade, 2011 iii Ovde idu mentor i ĉlanovi komisije iv Najveću zahvalnost dugujem svojim mentorima prof. dr Zori Dajić Stevanović i prof. dr Petru Marinu, koji su me od poĉetka usmeravali, davali dragocene savete i podstrek da ovaj rad dovedem do kraja. TakoĊe ţelim da se zahvalim dr Sofiji Pekić Quarrie, dr Marini Maĉukanović Jocić, dr Dragani Ranĉić, mr Ilinki Pećinar, Svetlani Aćić, Radenku Radoševiću i Maji Terzić, mojim kolegama sa Katedre za agrobotaniku Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beograd, koji nisu ţalili truda da mi pomognu u svakoj situaciji. Prof. dr Radiši Janĉiću, mr Danilu Stojanoviću i ostalim ĉlanovima Katedre za Botaniku Farmaceutskog fakulteta Univerziteta u Beogradu sam zahvalan na pomoći i brojnim savetima. Veliko hvala prof. dr Vladi Matevskom koji mi je pomogao svojim neizmernim iskustvom pri determinaciji vrsta ovog komplikovanog roda. Izrada ove disertacije ne bi bila moguća bez svesrdne pomoći prof. dr Zlatka Šatovića i prof. dr Zlatka Libera i njihovih saradnika sa Sveuĉilišta u Zagrebu, te im se ovom prilikom od srca zahvaljujem. TakoĊe, veliko hvala i dr Monique Simmonds, dr Renée Grayer i ostalim ĉlanovima Jodrell Laboratory, Royal Botanical Gardens Kew, na omogućavanju izvoĊenja fitohemijskih analiza, kao i na pruţenoj pomoći. Neizmerno hvala i velikim botaniĉarima i ljudima dr Mark W. Chase-u i dr Maichael Fay-u od kojih sam mnogo nauĉio kako o molekularnim markerima, tako i o strpljenju i toleranciji. Veliku zahvalnost dugujem i dr Stephen Quarrie-u na pomoći i korisnim savetima. Ţelim i da se zahvalim i mnogobrojnim kolegama, sa kojima sam delio dobro i zlo na terenskim i laboratorijskim ispitivanjima, mr Ivani Bjedov, mr Verici Stojanović, Jeleni Arsenijević, Milici Petrović i Milošu Bokorovu. Naroĉito se zahvaljujem svojim mnogobrojnim preijatelima bez kojih ţivot ne bi bio zanimljiv. Hvala i mojim roditeljima na podršci i strpljenju tokom celog ţivota. Ova disertacija je posvećena Tanji, Sofiji i Marti bez kojih ništa ne bi imalo smisla. v Fitohemijska i genetička varijabilnost vrsta iz sekcije Serpyllum (Mill.) Benth. roda Thymus L. (Lamiaceae) u Srbiji Sažetak Rod Thymus je po broju vrsta jedan od najznaĉajnijih u okviru familije Lamiaceae. U zavisnosti od pristupa autora broj vrsta unutar roda varira, meĊutim ukoliko se izabere pristup minimalne varijabilnosti, prema raspoloţivim podacima opisano je 215 vrsta ovog roda. Vrste ovog roda podeljene su u osam sekcija. U flori Srbije opisana je, do sada, 31 vrsta i preko 100 infraspecijskih taksona, koje sve pripadaju podsekciji Serpyllum, sa izuzetkom vrsta Thymus comptus i Th. striatus (Sect. Hyphodromi) i Th. vulgaris (Sect. Thymus). Reproduktivna izolacija izmeĊu vrsta ovog roda je izuzetno slaba što ĉini taksonomska istraţivanja još teţim. Vrste roda Thymus koriste se kao lekovite i aromatiĉne biljke u tradicionalnoj i zvaniĉnoj medicini u svim krajevima u kojima se javljaju. Cilj ovog rada je bio da se opišu razliĉiti hemotipovi unutar vrsta i populaciju ovog roda kao i da se analizom površinskih flavonoida i AFLP markera poboljša uvid u genetiĉke i evolutivne odnose izmeĊu populacija vrsta ovog roda sa podruĉja Srbije. U ovo istrţivajne ukljuĉene su populacije vrsta Th. pulegioides (Subsect. Alternantes), Th. glabrescens, Th. maschallianus i Th. pannonicus (Subsect. Isolepides), Th. balcanus i Th. praecox (Subsect. Peudomarginati) Analiza sastava etarskih ulja vršena je pomoću TD-GC-MS sistema, a jedinjenja su odreĊen uporeĊivanjem RI i/ili masenog spektra sa literaturnim podacima. Identifikovana su ukupno 103 jedinjenja. Identifikovane su, po brojnosti, tri glavne grupe jedinjenja: seskviterpenski ugljovodonici, oksigenovani monoterpenski ugljovodonici i monoterpenski ugljovodonici. Statistiĉka obrada sastava etarskih ulja ukljuĉila je korelacije, analizu glavnih komponenti i klaster analizu. Statistiĉka obrada je pokazala da se, po relativnoj zastupljenosti jedinjenja, mogu razlikovati geraniolni, fenolni, germakren-D, citralni, linaloolni, (E)-kariofilen, α-terpinil acetat i linalil acetatni hemotip. Analiza površinskih flavonoida vršena je pomoću LC-DAD i LC-APCI-MS. UtvrĊeno je prisustvo 15 površinskih flavonoida. Ispitivane populacije se mogu podeliti vi u dve grupe. U prvoj grupi su vrste koje imaju niske i srednje koliĉine površinskih flavonoida, kao i one kod kojih su se površinski flavonoidi nalazili samo u tragovima. Kod ove grupe su najzastupljeniji flavoni sa 5,6-diOH-7-OMe i 5,6-diOH-7,8-diOMe supstitucionom šemom u A prstenu. U drugu grupu bi se mogle svrstati populacije koje, uglavnom, imaju malu koliĉinu površinskih flavonoida i kod kojih je su najzastupljeniji flavoni sa 5-OH-6,7-diOMe i 5-OH-6,7,8-triOMe supstitucionom šemom u A prstenu. Prvoj grupi pripadaju populacije vrsta Th. pulegioides, Th. glabrescens i Th. balcanus, kao i neke populacije Th. pannonicus, dok drugoj grupi pripadaju populacije Th. marschallianus, neke populacije Th. pannonicus i Th. praecox. AFLP markeri su korišćeni da bi se utvrdili genetiĉki odnosi izmeĊu odabranih populacija vrsta roda Thymus, sekcija Serpyllum. Analiza molekularne varijanse (AMOVA) je pokazala da najviše genetiĉkog diverziteta potiĉe od razlika meĊu individuama unutar populacija, dok je ostatak diverziteta gotovo jednako raspodeljen izmeĊu vrsta i izmeĊu populacija unutar vrsta. Dvosmerna AMOVA je dalje pokazala da je diferencijacija meĊu vrstama bila znaĉajna u svim sluĉajevima osim izmeĊu Th. marschallianus i Th. pannonicus. Sve jedinke koje su pripadale Th. pulegioides (Podsekcija Alternantes) formirale su dobro podrţanu kladu, koja je najviše divergirala od ostalih vrsta. Prema dobijenim rezultatima podsekcija Isolepides je polifiletska. Th. glabrescens se jasno odvaja od druge dve vrste ove podsekcije (Th. marschallianus, Th. pannonicus). Th. marschallianus i Th. pannonicus, iako se jasno razlikuju morfološki po indumentumu, na molekularnim nivo se ne mogu razdvojiti. Vrste koje pripadaju podsekciji Pseudomarginati su formirale monofiletsku kladu, mada ova nije bila podrţana visokom bootstrap vrednošću. Ova klada se dalje delila u tri dobro podrţane klade koje su predstavljale pojedinaĉne vrste (Th. balcanus, Th. praecox i Th. moesiacus). vii Primena AFLP markera, u sluĉaju izabranih vrsta roda Thymus, se pokazala prikladnom za razrešavanje kompleksnih genetiĉkih odnosa koji ukljuĉuju i ĉeste hibridizacije meĊu vrstama, mada striktna retikulatna evolucija ne moţe biti odreĊena. Svi pokazatelji populacione genetike u sekcij Serpyllum ukazuju da je reproduktivna izolacija meĊu vrstama slaba i ukljuĉuje izraţen retikulatni sistem, naroĉito u sluĉajevima kada se dve ili više vrsta javljaju simpatriĉki. Ključne reči: Thymus, etarska ulja, hemotip, površinski flavonoidi, AFLP, genetiĉki diverzitet, retikulatna evolucija. viii Phytochemical and genetical variability of species from section Serpyllum (Mill.) Benth. genus Thymus L. (Lamiaceae) in Serbia Abstract In terms of the number of species, the genus Thymus is one of the most important genera within the Lamiaceae family. The number of species may vary depending on the approach of the author, but if the concept of minimal variability is chosen 215 species have been described. This genus is divided into 8 sections. In Flora of Serbia, 31 species and more than 100 ifraspecific taxa have been described, all of which belong to section Serpyllum, except Thymus comptus and Th. striatus (Sect. Hyphodromi) and Th. vulgaris (Sect. Thymus). Reproductive isolation between species seems to be weak, which makes taxonomical studies in this genus even more difficult. Species of genus Thymus are used as aromatic and medicinal plants in both traditional and modern medicine in all regions where they grow. The aim of this work was to describe different chemotypes within species and population of this genus and, by analysis of surface flavonoids and AFLP markers, provide better insight into genetic and evolutional relationships among the populations and species of the genus Thymus from Serbia. This work included populations of Th. pulegioides (Subsect. Alternantes), Th. glabrescens, Th. maschallianus and Th. pannonicus (Subsect. Isolepides), Th. balcanus and Th. praecox (Subsect. Peudomarginati). Analysis of essential oils was done by TD-GC-MS system, and compounds were identified by comparing RI and/or mass spectra with published data. 103 compounds were identified. Three major group of essential oil compounds were identified: monoterpene hydrocarbons, oxygenated monoterpene hydrocarbons and sesquiterpene hydrocarbons. Based on relative abundance of compounds, Corelation, PCA and Cluster analysis were performed, and it revealed the existence of several chemotypes, such as geraniol, phenol, germacrene-D, citral, linalool, (E)-caryophyllene, α-terpinyl acetate and linalyl acetate chemotype. Analysis of surface flavonoids was done by LC-DAD i LC-APCI-MS. Fifteen different flavones were identified. The analysed populations can be divided into two main profile groups; the first group comprises populations containing generally low and medium concentrations, as well as thoese with trace concentrations of surface ix flavonoids. In this group the dominant flavones were with a 5,6-diOH-7-OMe and 5,6- diOH-7,8-diOMe A-ring substitution pattern. The second group comprises populations containing generally low quantities of surface flavonoids, and with dominant 5-OH-6,7- diOMe and 5-OH-6,7,8-triOMe A-ring substitution pattern. Th. pulegioides, Th. glabrescens i Th. balcanus, and some populations of Th. pannonicus belong to first group, while Th. marschallianus, some populations of Th. pannonicus and Th. praecox belong to the second group. Amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers were used to assess genetic relations of 32 Thymus populations belonging to seven species of genus Thymus, section Serpyllum from Serbia. Analysis of molecular variance (AMOVA) revealed that most of the genetic diversity was attributable to differences among individuals within populations, while the remaining variability was almost equally distributed among species and among populations within species. The pairwise AMOVA analyses further showed that species differentiation was significant in all cases, except between Th. marschallianus and Th. pannonicus. All the individuals belonging to Th. pulegioides (subsection Alternantes) formed a well-supported clade, the most divergent from all other species in this study. According to these results, the subsection Isolepides is polyphyletic. Th. glabrescens is clearly separated from the other two species of this subsection (Th. marschallianus, Th. pannonicus). Although morphologically distinguishable by leaf indumentum, individuals belonging to Th. marschallianus and Th. pannonicus could not be differentiated at the molecular level. The species belonging to subsection Pseudomarginati formed a monophyletic clade, although not supported by high bootstrap value. The clade is further divided into three well-supported clades representing distinct species (Th. balcanus, Th. praecox and Th. moesiacus). x AFLP markers demonstrated, in the case of selected species of genus Thymus, that they could be suitable for studying complex genetic relationships, including frequent interspecies hybridization events, although strict reticulate evolutionary history could not be determined. All the population genetic parameters in the section Serpyllium suggests that the reproductive incompatibility between species is very weak indicating strong reticulating system, especially in the case when two or more species occur sympatrically. Key words: Thymus, essential oil, chemotype, surface flavonoids, AFLP, genetic diversity, reticulate evolution. Sadržaj 1. UVOD ........................................................................................................................... 2 1.1. Taksonomski pregled familije Lamiaceae ............................................................. 2 1.2. Taksonomski pregled roda Thymus i rasprostranjenje .......................................... 4 1.2.1. Istorijska pozadina statusa i infrageneriĉke klasifikacije roda Thymus .......... 4 1.2.2. Savremena klasifikacija roda Thymus ............................................................ 7 1.3. Nauĉni pristupi i metode u klasifikaciji vrsta roda Thymus ................................ 12 1.3.1. Morfologija i biologija roda Thymus ............................................................ 12 1.3.2 Fitohemijska istraţivanja u okviru roda Thymus ........................................... 15 1.3.3 Kariološka, palinološka i mikromorfološka istraţivanja vrsta roda Thymus 31 1.3.5 Molekularna istraţivanja ............................................................................... 32 1.4. Opis izabranih taksona roda Thymus ................................................................... 33 1.5 Ciljevi rada ........................................................................................................... 40 2. Metrijal i metode ........................................................................................................ 41 2.1 Fitohemijska ispitivanja ........................................................................................ 41 2.1.1 Biljni materijal ............................................................................................... 41 2.1.2 Etarska ulja .................................................................................................... 41 2.1.3 Površinski flavonoidi ..................................................................................... 45 2.2 Molekularna ispitivanja ........................................................................................ 46 2.2.1 Biljni materijal ............................................................................................... 46 2.2.2 Ekstrakcija DNA i AFLP analiza .................................................................. 47 2.2.3 Analiza podataka ........................................................................................... 48 3. Rezultati ...................................................................................................................... 50 3.1 Fitohemijska ispitivanja ........................................................................................ 50 3.1.1 Etarska ulja .................................................................................................... 50 3.1.2 Površinski flavonoidi ..................................................................................... 91 3.2 AFLP markeri ....................................................................................................... 97 4. Diskusija ................................................................................................................... 103 4.1 Sastav etarskih ulja ............................................................................................. 103 4.2 Površinski flavonoidi .......................................................................................... 109 4.3 AFLP analiza ...................................................................................................... 112 4.4 Opšta diskusija .................................................................................................... 115 5. Zakljuĉci ................................................................................................................... 119 Literatura ...................................................................................................................... 123 2 1. UVOD 1.1. Taksonomski pregled familije Lamiaceae Predstavnici familije Lamiaceae imaju široko rasprostranjenje na Zemljinoj kugli, prisutni su na svim kontinentima izuzev Arktika. U okviru ove familije nalazi se oko 240 rodova i preko 7200 vrsta (Braüchler i sar., 2010). Klasifikacijom familije Lamiaceae bavili su se mnogi autori, ali najpoznatiji su radovi iz druge polovine XIX veka. Bentham (1876) je podelio familiju Lamiaceae na osam tribusa. Reviziju ove klasifikacije izvršio je Briquet (1895-1897) uzdiţući neke od tribusa i subtribusa na nivo podfamilija i kao najupeĉatljiviju izmenu spojio dva njaveća tribusa i dva manja u jedinstvenu podfamiliju Stachyoideae. Ovaj Briquet-ov sistem klasifikacije je do danas ostao u najširoj upotrebi (Cantino i Sanders, 1986). Erdtman (1945) je predloţio podelu familije Lamiaceae na dve prirodne podfamilije, podfamiliju Lamioideae, sa trikolpatnim polenovim zrnima (retko tetrakolpatnim), koja se raznose u dvoćelijskoj fazi, i podfamiliju Nepetoideae, sa heksakolpatnim polenovim zrnima (retko 8-, 10- ili 12-kolpatna), koja se raznose u troćelijskom obliku. Ovakvu podelu familije Lamiaceae podrţala su brojna kasnija istraţivanja, koja su osim palinoloških ukljuĉila i fitohemijska, embriološka i morfološka istraţivanja (Cantino i Sanders, 1986). MeĊutim, ovakvom podelom familije Lamiaceae, ostao je problem, što je familija Verbenaceae parafiletska, dok je familija Lamiaceae polifiletska. Harley i sar. (2004) su familiju Lamiaceae podelili u sedam podfamilija: Ajugoideae, Lamioideae, Nepetoideae, Prostantheroideae, Scutellarioideae, Symphorematoideae i Viticoideae. Od ovih podfamilija, Nepetoideae su najbolje definisane i odlikuju se, uz već navedene karakteristike, i prisustvom rozmarinske kiseline (Harley i sar., 2004). TakoĊe, molekularne analize su potvrdile da je ova grupa monofiletska (Wagstaff i sar., 1995; Wagstaff i Olmstead, 1997). Dalja podela ove podfamilije na tribuse uveliko zavisi od viĊenja autora. Na osnovu morfoloških karaktera, ali i molekularnih istraţivanja, Cantino i sar. (1992) su predloţili novu podelu podfamilije Nepetoideae na ĉetiri tribusa: Elsholtzieae, Ocimeae, Lavanduleae i 3 Mentheae, pri ĉemu je ovaj poslednji pretrpeo najveće promene u odnosu na prethodne klasifikacije. Ovakvu podelu su prihvatili i Harley i sar. (2004), s tim da su Lavanduleae ukljuĉili u Ocimeae. Tribus Mentheae obuhvata tri subtribusa, Salviinae, Nepetinae i Menthinae, ovom potonjem pripada oko 43 roda, od ukupno 66 rodova tribusa Mentheae, od kojih su mnogi lekovite i aromatiĉne biljke. Rod Thymus pripada tribusu Mentheae u subfamiliji Nepetoideae (Cantino et al, 1992). Najbliţi su mu rodovi Origanum, Satureja, Micromeria i Thymbra. Thymus se smatra dobro definisanim rodom, što je zasnovano na morfološkim i hemijskim karakteristikama (Morales, 2002). U zavisnosti od pristupa autora broj vrsta unutar roda varira, meĊutim ukoliko se izabere pristup minimalne varijabilnosti, prema raspoloţivim podacima opisano je 215 vrsta ovog roda (Morales, 1996) i jedino su u ovoj familiji veći rodovi Salvia, Hyptis, Scutellaria, Stachys, Teucrium, Nepeta i Plectranthus. Hibridizacija u okviru roda Thymus je veoma ĉesta kada dve ili više vrsta ţive simpatriĉki. Do danas je na Iberijskom poluostrvu opisano oko 60 hibrida uz 35 vrsta koje su prisutne na ovom podruĉju (Morales, 1995). Neka hemijska istraţivanja ukazuju da je ovaj rod veoma homogen, za razliku od rodova Teucrium i Sideritis koji su hemijski veoma heterogeni (Morales, 1986). Ove dve karakteristike ukazuju da je rod najverovatinije monofiletski (Morales, 2002). Unutar roda genetska nekompatibilnost izimeĊu vrsta gotovo da ne postoji, što ĉini taksonomska istraţivanja veoma teškim, naroĉito u nekim grupama kao što su na primer sekcija Hyphodromi a naroĉito sekcija Serpyllum, kod koje je jako teško primeniti koncept vrste (Morales 2002). Prema Moralesu (2002) ukoliko se primeni sinoptiĉki kriterijum, verovatno bi se veliki broj formi, ponekada i ekoloških formi, ukljuĉio kao proste populacije u neki takson, meĊutim ukoliko bi se primenio analitiĉki kriterijum, rizikuje se da se previde postojeće vrste kao prirodne celine. U sluĉaju nedoumice Morales predlaţe primenu sinoptiĉkog kriterijuma. Na nivou vrsta u upotrebi je veliki broj imena, više od 1000, od kojih su mnoga sinonimi (Morales, 2002). 4 Tabela 1.1 Pregled tradicionalne klasifikacije familije Lamiaceae, prema Cantino i Sanders (1986). Bentham 1876 Briquet 1895-1897 Erdtman 1945 Tribus Ajugeae Subfam. Ajugoideae (ukljuĉuje i Rosmarinus iz Bentham-ovih Salvieae) Subfam. Lamioideae Tribus Prostanthereae Subfam. Prostantheroideae Tribus Prasieae Subfam. Prasioideae Tribus Lamieae Subfam. Scutellarioideae Subfam. Lamioideae Tribus Nepeteae Subfam. Nepetoideae Tribeus Salvieae Tribus Mentheae Tribus Ocimeae Subfam. Ocimoideae Subfam. Lavanduloideae Subfam. Catopherioideae 1.2. Taksonomski pregled roda Thymus i rasprostranjenje 1.2.1. Istorijska pozadina statusa i infrageneričke klasifikacije roda Thymus Status i infragenerička klasifikacija roda Thymus pre Linné-a Postoji nekoliko pretpostavki o poreklu imena Thymus. Neki autori smatraju da je latinski naziv Thymus izveden iz grĉke reĉi thyo (miris), dok drugo tumaĉenje uzima grĉku reĉ thymos (snaga, hrabrost) kao etimološki koren imena roda. Isprva je naziv „thymus― obuhvatao grupu aromatiĉnih biljaka sa sliĉnim svojstvima, koje su korišćene za stimulaciju vitalnih funkcija. Mnoga narodna imena za vrste roda Thymus u romanskim jezicima izvedena su iz latinskog naziva. Isto vaţi i za englesko ime. U srpskom jeziku vrste ovog roda se nazivaju majĉina ili majkina dušica, babina dušica, 5 bakina dušica, materina duša, materinka, duša, dušica, paprica, poponac, tamjanika, pismena trava, trup, vrijes (Simonović, 1959; Ĉajkanović, 1985). U svom delu iz prvog veka, koje je preveo Laguna 1555. godine, Dioskorides piše o „Thymo―. MeĊutim, Laguna ne nalazi pod ovim imenom ni jednu vrstu roda Thymus, već biljku koja odgovara rodu Stureja. Na strani 294 Laguna opisuje Serpol, sa dva varijeteta, gajenim i samoniklim, gde bi ovaj drugi Zygis, mogao biti vrsta Thymus-a. Status i infragenerička klasifikacija roda Thymus po Linné-u Interesantno je kako se Linné odnosio prema rodu Thymus u svojim razliĉitim delima. Njegovo znanje se uglavnom zasnivalo na preĊašnjim autorima. U delu Hortus Califfortianus (1737) on navodi šest vrsta, od kojih dve poslednje, kako to danas znamo, pripadaju rodovima Satureja i Acinos. Njegov Br. 1 je Th. erectus, što je u stvari Th. vulgaris, Br. 2 je Th. repens, odnosno neka vrsta iz sekcije Serpyllum, Br. 3 je Thymbra capitata i Br. 4 Th. mastichina. U njegovom delu Hortus Upsalensis (1748) pominju se samo Th. vulgaris i Th. mastichina. U delu referentnom za botaniĉku binomnu nomenklaturu, Species Plantarum 1. izdanje (1753), ukljuĉeno je osam vrsta u rod Thymus: 1. Th. serpyllum, 2. Th. vulgaris, 3. Th. zygis, 4. Th. acinos (danas Acinos arvensis), 5. Th. alpinus (danas Acinos alpinus), 6. Th. cephalotos (danas Th. lotocephalus), 7. Th. villosus i 8. Th. pulegioides. U okviru Satureja je 4. Satureja mastichina (danas Th. mastichina). U Genera Plantarum (1754) Linné navodi, 646. Thymus: Serpyllum, Acinos i Mastichina. U Species Plantarum 2. izdanje (1762) Linné je premestio Th. mastichina (ranije Satureja mastichina) pod rednim brojem 8 u Thymus. U prvom izdanju pod ovim brojem je bio Th. pulegioides. Line ovu promenu objašnjava sliĉnošću ove vrste sa oba roda. U Systema Nature 2 (12. izdanje, 1767) prvi put se pominje Th. piperella. Status i klasifikacija roda Thymus nakon Linné -a Brotero (1804) je opisao novu vrstu Th. caespititus. TakoĊe, Hoffmannsegg i Link (1809) u svom radu, Flora Portugalije, opisuju nekoliko novih vrsta, Th. albicans, Th. capitellatus, Th. camphoratus i Th. sylvestris. Bentham (1834) je prvi podelio rod 6 Thymus u sekcije: Mastichina, sa Th. mastichina i Th. tomentosus; Serpyllum sa Th. vulgaris, Th. piperella, Th. villosus, Th. capitellatus i Th. capitatus; i Pseudothymbra sa Th. cephalotos (danas Th. lotocephalus). Edmund Boisser (1839-1845), ĉuveni švajcarski botaniĉar iz Ţeneve, tokom svojih proputovanja kroz Španiju prouĉavao je i opisivao vrste roda Thymus sa Iberijskog poluostrva. TakoĊe je ostavio i vredne opise vrsta ovog roda iz severne Afrike, kao i iz Grĉke i Turske, u svom delu Flora Orientalis (1867-1884). U svom delu Elenchus (1838) on je opisao Th. willdenovi, Th. granatensis, Th. longiflorus i Th. membranaceus. 1845 formirao je sekciju Pseudothymbra, a kasnije je opisao Th. carnosus, Th. lusitanicus i Th. baeticus kao varijetet Th. hirtus. Willkomm (1868), nemaĉki botaniĉar i autor dela Prodromus Florae Hispanicae, zajedno sa svojim danskim kolegom Lange, smatrao je da se rod Thymus sastoji iz pet sekcija, Mastichina, Zygis, Piperella, Serpyllum i Pseudothymbra. Sekcija Serpyllum bi obuhvatala dve grupe, prva sa Th. chamaedrys, Th. serpyllum i Th. herba-barona i druga sa Th. bracteatus, Th. serpylloides i Th. granatensis. Briquet (1897) je izvršio reviziju Englerovog monumentalnog dela i opisao dve sekcije, Pseudothymbra i Serpyllum. Ovu drugu je podelio u pet podsekcija: Bracteatae (Th. capitellatus, Th. villosus, Th. algarbiensis, Th. albicans), Serpylla, Piperellae (Th. piperella, Th. caespititus, Th.origanoides, Th. bovei), Vulgares (Th. vulgaris, Th. sabulicola, Th. hyemalis, Th. zygis, Th. carnosus, Th. hirtus) i Mastichinae (Th. mastichina, Th. tomentosus, Th. welwitschii, Th. fontanesii). Velenovsky (1906) u svom radu o rodu Thymus opisao deset sekcija: Coridothymus, Vulgares, Orientales, Anomali (Th. antoninae, Th. portae), Mastichina (Th. fontanesii), Thymastra (Th. algarbiensis, Th. albicans, Th. capitellatus), Pseudothymbra sa dve grupe (suffructosi: Th. membranaceus, Th. longiflorus, Th. funkii i herbacei: Th. cephalotos, Th. villosus, Th. granatensis), Piperella, Micantes i Serpyllum (u koju je ukljuĉio i Th. serpyllastrum). Najvaţniji španski autor koji je prouĉavao Thymus je Pau, ĉiji se interes za vrste ovog roda protezao kroz ĉitav njegov rad. U svom radu iz 1929. godine, ―Introducción de los tomillos españoles―, analizirao je predhodne radove Linnéa, Boissera i Willkomma. U ovom radu je dao zanimljive osvrte na vrste roda Thymus. I drugi 7 španski autori su se bavili ovim rodom, Huguert del Villar (1934), Vicioso (1974) i Elena-Rosselló (1976), kao i mnogi drugi. Iako je Španija uvek bila centar taksonomskih istraţivnja na Thymus-u, mnogi veliki botaniĉari van Iberijskog poluostrava su se bavili ovim rodom. Treba posebno istaći Ronniger-a koji je saĉinio veoma vaţan herbarijum, koji se danas nalĉazi u Beĉu, i Jakko Jalas-a, finskog botaniĉara koji je priredio rod Thymus u Flora Europaea (1972), Flora Iranica (1982) i Flora of Turkey and the East Aegean Islands (1982). Klasifikacija roda Thymus u Flori Srbije Panĉić je u svom delu Flora u okolini Beogradskoj (1865) opisao samo Thymus serpyllum. U delu Flora kneţevine Srbije (1874) Panĉić, uz Th. serpyllum, navodi i Th. nummularius, a u delu Dodatak Flori kneţevine Srbije (1884) i Th. striatus. U delu Flora okoline Niša (1882), Petrović navodi vrste Th. serpyllum i Th. striatus, s time da u okviru vrste Th. serpyllum navodi i niţe kategorije genuinus, latifolius, nummularis i Pannonicus. U delu Dodatak Flori okoline Niša (1885) Petrović ne navodi nove vrste ali navodi nove odlike angustifolius, acicularis, Serbicus, montanus i citrodus. Diklić (1974) je u Flori Srbije opisao 31 vrstu i preko 100 infraspecijskih taksona. 1.2.2. Savremena klasifikacija roda Thymus Vrste roda Thymus su rasprostranjene u aridnim, toplim i hladnim regionima Starog Sveta, severno od Ekvatora pa do obala Grenlanda (Slika 1) (Morales 1989). Region zapadnog Mediterana se smatra centrom diverziteta ovog roda. Rod je podeljen na osam sekcija: Mastichina, Micantes, Piperella, Pseudothymbra, Thymus, Teucrioides, Hyphodromi i Serpyllum (Jalas 1971). 8 Slika 1.1 Areal roda Thymus (Prema Morales, 2002). Prvih pet se nalaze samo na Iberijskom poluostrvu, severozapadnoj Africi i Makroneziji (Zapadni Region). Ovih pet sekcija je manje više dobro prouĉeno (Morales 1986, 1994). Sekcija Mastichina obuhvata dve vrste koje se nalaze samo na Iberijskom poluostrvu: Th. mastichina, ili divlji majoran, i Th. albicans. Skcija Micantes obuhvata zeljastu Iberijsko-Makronezijsku vrstu Th. caespititus koja se nalazi u severozapadnom Atlanskom regionu Pirinejskog poluostrva i na Maderi i Azorskim ostrvima, i drvenaste vrste iz Maroka, Th. saturejoides i Th. riatarum. Sekcija Piperella se sastoji od samo jedne endemiĉne vrste Th. piperella iz istoĉne Španije. Sekcija Pseudothymbra se karakteriše sa prisustvom dugih brakteja i cvetova. U nekim sluĉajevima su krunice dugaĉke i do 2 cm. Od 9 vrsta, 7 su naĊene na jugu Pirinejskog poluostrva (Th. lotocephalus, Th. villosus, Th. longiflorus, Th. membranaceus, Th. moroderi, Th. funkii, Th. antoninae) dok 2 rastu u severozapadnoj Africi (Th. bleicherianus, Th. munbyanus). Sekcija Thymus zastupljena je samo u zapadnom Mediteranu, i najvaţnije vrste su Th. vulgaris, Th. zygis i Th. willdenowii. Th. vulgaris je rasprostranjena u severnoj Italiji, juţnoj Francuskoj i u istoĉnom delu Španije, ova vrsta se danas inaĉe gaji kao lekovita i zaĉinska biljka u mnogim delovima Sveta. Th. zygis je veoma ĉesta vrsta na Iberijskom poluostrvu, dok je Th. willdenowii rasprostranjen u Maroku, Alţiru i Gibraltaru. Ovoj sekciji, takoĊe, pripadaju i vrste Th. capitellatus i Th. camphoratus iz 9 Portugalije, Th. carnosus koji se javlja samo na jugo-zapadu Iberijskog poluostrva, Th. baeticus, Th. loscosii, Th. serpylloides, svi endemit Španije, i Th. hyemalis sa jugo- istoka Španije i severnog Maroka. Sekcija Teucrioides je endemiĉna za Balkansko poluostrvo. Vrste ove sekcije naseljavaju planine Grĉke i Albanije. Ovom sekcijom su obuhvaćene tri vrste: Th. teucrioides, Th. rechingeri i Th. leucospermus. Ovu sekciju je prouĉavao Hartvig (1987), meĊutim, broj hromozoma još uvek nije poznat. Sekcija Hyphodromi se javlja u celom regionu Mediterana i obuhvata oko 60 vrsta, svrstanih u tri podsekcije, Subbracteati, Serpyllastrum i Thymbropsis. Podsekcija Subbracteati se karakteriše manje više revolutnim ili konvolutnim listovima i ima najverovatnije poreklo iz istoĉnog Mediterana. Samo jedna vrsta je prisutna u severnoj Africi, Th. algeriensis, od Maroka pa do Libije. Th. mastigophorus se javlja u centralnoj Španiji. Th. spinulosus je prisutan na Sicililji i u Italiji, a Th. striatus se javlja na Apeninskom i Balkanskom poluostrvu. Ove poslednje dve vrste su veoma varijabilne. Th. aragaeus, Th. brachychilus, Th. cappadocicus, Th. cherlerioides, Th. convolutus, Th. pulvinatus i Th. revolutus se javljaju u Turskoj, Th. boisseri, Th. comptus, Th. dolopicus i Th. plasonii na Balkanskom poluostrvu, Th. atticus, Th. paranassicus i Th. leucotrichus u Turskoj i Balkanskom poluostrvu, s tim da se poslednja vrst javlja i u Siriji i Libanu. Th. integer je endemit Kipra, meĊutim verovatno se ne razlikje od Th. leucotrichus. Th. samius se javlja na ostrvima u Egejskom moru. Th. borysthenicus i Th. pallasianus imaju areal severno od Crnog Mora, Th. persicus se javlja juţno od Kavkaza, meĊutim poznat je samo jedan lokalitet ove vrste. Podsekcija Serpyllastrum je grupa vrsta karakteristiĉnih po prostratnim stablima i ravnim listovima koji su manje više široki. Pet vrsta iz ove podsekcije naseljava Španiju: Th. bracteatus, Th. leptophyllus, Th. fontqueri, Th. granatensis i Th. lacaitae. Ova podsekcija je takoĊe rasprostranjena na istoku Mediterana, meĊutim ni jedna vrsta ne nastanjuje severnu Afriku i Italiju. Th. aznavoutii i Th . bracteosus se javljaju na Balkanskom poluostrvu. Th. canoviridis, Th. hausskenechtii, Th. pectinatus i Th. spathulifolius su rasprostranjeni u Turskoj, dok se areal vrste Th. zygoides proteţe preko Balkanskog i Krimskog poluostrva i Turske. Ova vrsta i endemit Španije, Th. lacaitae su morfološki izuzetno sliĉni. Ovoj podsekciji pripada i grupa vrsta koje se javljaju samo na Kavkazu: Th. dagestanicus, Th. hadzhievii, Th. helendzihcus, Th. karjaganii, 10 Th. ladjanuricus, Th. lipskyi, Th. majkopiensis i Th. sosnowskyi; kao i sedam vrsta iz centralne Azije: Th. cuneatus, Th. eremita, Th. incertus, Th. irtychensis, Th. kirgisorum, Th. nerczensis i Th. petraeus. Podsekcija Thymbropsis obuhvata severnoafriĉke vrste Th. broussonetii, Th. maroccanus, Th. lanceolatus, Th. numidicus, Th. pallescens kao i dva endemita Grĉke, Th. laconicus i Th. holosericus. Ovde spadaju još pet vrsta iz Turske, Th. cariensis, Th. cilicicus, Th. eigii, Th. leucostomus i Th. sipyleus. Th. syriacus se javlja u Libanu, Siriji i jednom lokalitetu u severnom Iraku, Th. bovei se javlja na Sinajskom poluostrvu, u Izraelu, Jordanu, Iraku i Saudijskoj Arabiji, dok se Th. decussantus javlja na Sinaju i u Saudijskoj Arabiji. Ovo je grupa uglavnom severnoafriĉkih i istoĉnoazijskih vrsta. Sekcija Serpyllum se smatra najstarijom u rodu. Obuhvata oko 125 vrsta i pokriva ceo areal roda, osim Madeire i Azorskih ostrva. U okviru ove sekcije javlja se i najveća varijabilnost u broju hromozoma. Ovoj sekciji pipadaju kako manje više drvenaste vrste koje naseljavaju planine u suvim regionima, kao na primer Th. origanoides sa Kanarskih ostrva, Th. serrulatus i Th. schimperii iz Etiopije i Th. laevigatus sa jugo-zapada Arabijskog poluostrva, tako i manje više zeljaste vrste koje nastanjuju planine Mediteranskog regiona i ostatak Evroazije sve do Japana i juţnih obala Grenlanda. Ova potonja grupa izgleda da je u evolutivnom smislu mlaĊa i verovatno intenzivno evoluira i kolonizuje nova podruĉja od poslednje glaciacije. Sekcija Serpyllum obuhvata sedam podsekcija. Podsekcija Insulares sadrţi vrstu Th. willkommii koja je endemit Španije, zatim Th. richardii sa tri podvrste; supsp. richardii koja se javlja na Majorci i u Jugoslaviji, subsp. ebusitanus sa Ibice i subsp. nitidus sa ostrva Maretimo pored Sicilije. Th. dreatensis i Th. guyonii su severnoafriĉke vrste, dok je Th. origanoides endemit Kanarskih ostrva. Th. bornmulleri je endemit severozapadne Turske. Podsekcija Kotschyani obuhvata veliki broj Azijskih vrsta i u podruĉju Mediterana se javljaju samo Th. transcaucasicus i Th. fallax u Turskoj. Iz ove podsekcije su još zanimljve vrste Th. laevigatus iz planina Jemena, Th. schimperi i Th. serrulatus iz Etiopije. Podsekcija Pseudopiperellae obuhvata vrste Th. herba-barona, koja je rasprostranjena na Majorci, Korzici i Sardiniji (Mayol et al, 1990), i Th. nitens sa juga Francuske. 11 Pet vrsta koje naseljavaju Balkansko poluostrvo pripada podsekciji Isolepides. To su Th. bulgaricus, Th. glabrescens, Th. longedentatus, Th. pannonicus i Th. sibthorpii. Podsekcija Alternantes obuhvata Th. linearis sa Himalaje i evropske vrste Th. pulegioides, Th. feoelichianus, Th. alpestris, Th. oehmianus, Th. bihorensis i Th. comosus. Podsekciji Pseudomarginati pripadaju vrste Th. longicaulis i Th. praecox koje su veoma ĉeste u Evropi i Turskoj, kao i Th. nervosus koji je endemit Pirinejskog poluostrva i Centralniog masiva u Francuskoj. Ovoj podsekciji takoĊe pripadaju Th. ocheus, Th. stojanovii i Th. tracicus sa Balkanskog poluostrav i istoĉnog Mediterana. Podsekcija Serpyllum obuhvata Th. quinquecostatus iz Japana, evropsku vrstu Th. serpyllum, Th. talijevii i još neke vrste rasprostranjene u Rusiji. Podela roda Thymus koju je dao Menitsky (1973) znaĉajno se razlikuje od one koju je dao Jalas (1972), i kasnije, podrţao Morales (1985). On je rod Thymus podelio na jedanaest sekcija. Sekcije Thymus, Teucrioides, Mastchina, Pseudothymbra i Piperella se ne razlikuju izmeĊu ova dva autora. Menitsky ne navodi sekciju Hyphodromi već podsekciji Subbracteati, kako je shvata Jalas, odgovaraju sekcija Orientales i gupa Th. striatus iz sekcije Serpyllum, podsekcija Isolepides. Podsekcija Thymbropsis je izdvojena u posebnu sekciju, a podsekcija Serpyllastrum, po Menitsky-om, pripada sekciji Serpyllum. Menitsky navodi sekciju Saturejoides i u okviru sekcije Serpyllum podsekciju Micantes koje bi odgovarala Jalasovoj sekciji Micantes. Najveće razlike izmeĊu dva sistema klasifikacije su u odnosu na sekciju Serpyllum. Menitsky je Th. serrulatus iz podsekcije Koschyana uvrstio u sekciju Serrulatus, a ostale vrste iz podsekcije Koschyana ukljuĉio u sekciju Marginati. Ostale podsekcije, sekcije Serpyllum, kako ih vidi Menitsky, su Micantes, Serpyllastrum, Isolepides, koja nikako ne odgovara onoj kod Jalasa, i Serpyllum. Menitsky opisuje sekciju Marginati sa dve podsekcije, Marginatii i Verticillati. Predstavnici iz ove sekcije, po Jalas-u, pripadaju sekciji Serpyllum i to podsekcijama Pseudopiperella, Insulares, Kotschyana, Alternantes, Pseudomarginati i Isolepides. U ovom radu koristiće se klasifikacija roda Thymus po Jalas-u (1971). 12 Sve vrste opisane u našoj flori pripadaju skciji Serpyllum osim vrsta Thymus comptus i Th. striatus (Sect. Hyphodromi) i Th. vulgaris (Sect. Thymus), koja je unesena u našu floru i gaji se kao zaĉinska i lekovita biljka. 1.3. Naučni pristupi i metode u klasifikaciji vrsta roda Thymus 1.3.1. Morfologija i biologija roda Thymus Biljke roda Thymus se karakterišu prema svom habitusu odnosno ţivotnoj formi. Mogu se razlikovati dve grupe, jednu ĉine predstavnici koji imaju oblik ţbunova, ne viši od 50 cm, kao na primer Th. baeticus i Th. hyemalis sa Iberijskog poluostrva, i druge koja obuhvata predstavnike sa puzećim stablima katkada sa adventivnim korenima. Ova ţivotna forma je veoma ĉesta kod vrsta iz skcija Serpyllum i Hypodromi. Th. caespititus predstavlja izuzetak sa cespitoznim habitusom koji moţe da ima veoma dugaĉke izdanke. Kao i veĉina predstavnika Lamiaceae, Thymus na popreĉnom preseku ima ĉetvrtasta stabla. Mladi izdanci su prekriveni dlakama. Dlake mogu prekrivati sve ĉetiri strane stabla (holotrichous), dve naspramne strane, koje se smenjuju po internodijama (alelotrichous) ili se mogu nalaziti samo na rebrima (goniotrichous) (Slika 3). Uloga razliĉitih tipova dlaka na stablu još uvek nije razjašnjena. 13 Slika 1.2. Pokrivenost stabla trihomima: a) alelotrichous (Th. praecox); b) goniotrichous (Th. pulegioides) i c) holotrichous (Th. piperella) (iz Morales, 2002). Listovi mogu biti uţi ili širi sa ravnom lisnom ploĉom ili mogu biti sa podavijenim ivicama (revolutni). Indumentum je veoma varijabilan. Tektorne dlake kod Thymus-a su uvek proste, ali retko jednoćelijske. Listovi su ĉesto sa trepljama na obodu, bilo celom duţinom, bilo samo pri osnovi i petioli. Glandularni trihomi su veoma bitni pošto sadrţe etarska ulja. Postoje dve vrste grandularnih trihoma: kapitatne ţlezde sa gornjom ćelijom punom etarskih ulja i peltatne ţlezde sa ćelijama u osnovi koje su tipiĉne za Lamiaceae. Cvetovi se uglavnom javljaju u grupama u nodusima. Mali broj vrsta ima samo dva cveta po nodusu (Th. antoninae), a znatno ĉešće se u nodusima nalazi veći broj cvetova. Vrste sa kraćim internodijama imaju loptaste i glaviĉaste cvasti. Ukoliko je ovo sluĉaj, brakteje se razlikuju po obliku i veliĉini od ostalih listova. Ovo naroĉito vaţi za Th. membranaceus, Th. carnosus i druge pripadnike skcija Pseudothymbra i Thymus. Kod nekih vrsta brakteje mogu biti izuzetno dugaĉke, kao npr kod Th. satureioides. Ĉašica kod Thymus-a u suvom stanju igra veoma vaţnu ulogu pri rasejavanju plodova. S tim u vezi grlo je zatvoreno sa dlakama i vetar je moţe preneti na velike udaljenosti. Ĉašice kod nekih vrsta, kao npr. Th. mastichina, imaju izduţeni zub prekriven cilijama koji sluţi za rasejavanje sliĉno papusu kod Asteraceae. Ĉašica obiĉno 14 ima pet zubaca, tri gornja i dva donja, gde su ovi potonji uvek duţi i obiĉno savijeni na gore. Oni verovatno imaju ulogu u priĉvršćivanju cevi krunice. Kod nekih vrsta tri gornja zupca su redukovana na jedan (Th. caespititus). Krunica varira od 4 do10 mm u duţinu i završava se sa jednim gornjim i tri donja lobusa. Ovo je tipiĉna struktura za oprašivanje pĉelama ili drugim sliĉnim insektima. Produkcija polena u ĉetiri prašnika je niska. Kod populacija iz roda Thymus je ĉesta ginodiecija, odnosno da se u populacijama javljaju dva tipa jedinki, one koje imaju hermafroditne cvetove i one sa cvetovima bez prašnika. Pokazano je da oprašivaĉi brţe oprašuju ţenske cvetove od hermafroditnih. Plod je merikarpijum koji se raspada na ĉetiri orašice, meĊutim ĉesto neke abortiraju tokom ranih faza razvića. Ukoliko se ovi svi karakteri posmatraju sa evolutivnog stanovišta, smatra se da su vrste sa ravnim listovima i bez dlaka primitivnije od onih sa revolutnim listovima i trepljama na obodu. TakoĊe loptiĉaste cvasti sa cvetovima ĉije se brakteje razlikuju od ostalih listova smatraju se izvedenijim. Drvenaste vrste sa uspravnim odrvenelim stablima su, verovatno, filogenetski starije od onih sa zeljastim izdancima, odrvenelim samo pri osnovi (Morales, 2002), prikaz evolutivne istorije roda dat je na Slici 1.3. 15 Slika 1.3. Evolutivni odnosi unutar roda Thymus, u zagradama je dat broj vrsta (Morales 2002). 1.3.2 Fitohemijska istraživanja u okviru roda Thymus 1.3.2.1 Sastav etarskih ulja Vrste roda Thymus, kao i mnogi drugi predstavnici familije Lamiaceae, su aromatiĉne biljke, ţlezdani trihomi na listovima i drugim delovima biljke su bogati monoterpenoidnim etarskim uljima (Thompson, 2002). Najveći broj komponenti etarskih ulja pripadaju grupi monoterpena, ĉak i do 90%. Seskviterpenska jedinjenja su 16 uvek prisutna u etarskom ulju kod Thymus, meĊutim, uglavnom u veoma malom procentu. U uljima roda Thymus opisano je prisustvo oko 270 terpena. MeĊutim njihovo samo prisustvo nije dovoljno za karakterizaciju roda već se treba uzeti u obzir i kvantitativni aspekt svake komponente (Stahl-Biskup, 2002). Prema broju taksona u kojima su zastupljeni, timol i karvakrol su najznaĉajnije komponente etarskih ulja. Taksoni koji ne sadrţe ova fenolna jedinjenja mogu se svrstati u nefenolnu grupu. U okviru fenolne grupe su i taksoni sa bilo timolom ili karvakrolom, bilo i sa jednom i sa drugom koponentom. Osim kod Thymus-a ova dva jedinjenja se javljaju u veoma ograniĉenom broju taksona. Unutar familije Lamiaceae samo neke vrste iz rodova Coridothymus, Origanum, Satureja i Monarda imaju timol i karvakrol kao glavne komponente etarskih ulja. U ostatku biljnog sveta samo je kod vrste Trachyspermium copticum (Apiaceae) utvrĊeno prisustvo ove dve komponente (Stahl-Biskup, 2002). Prisustvo i visok procenat monoterpenskih ugljovodonika, p-cimena i γ- terpinena, ne moţe se posmatrati nezavisno od prisustva timola i karvakrola, pošto su ova jedinjenja prkursori fenolnih jedinjenja, tako da se ona uglavnom javljaju istrovremeno u etarskim uljima, mada ponekad procenat ova dva jedinjenja prelazi procenat prisustva fenola, ovakva ulja se ipak mogu smatrati „fenolnim― (Stahl-Biskup, 2002). Linalool je treća komponenta po vaţnosti u okviru roda Thymus. U etarskom ulju kod velikog broja populacija javlja se sa preko 10%. Za razliku od fenolnih komponenti linalol ima slatkast miris i biljke sa dominantnim linalolom imaju sasvim drukĉiji karakter. Ovo takoĊe vaţi i za geraniol. Linalol je veoma široko rasprostranjena komponenta u biljnom svetu i Thymus nije glavni izvor ove komponente već su mnogo znaĉajnija lavanda (Lavandula angustifolia), ili muskatna ţalfija (Salvia sclarea), kao i Coriandrum sativum (Apiaceae). Kod nekih vrsta roda Thymus, populacije sadrţe i fenolne jedinke i linalolne jedinke. Sa borneolom na šestom mestu po prisutnosti, bicikliĉna monoterpenska struktura dobija na znaĉaju. Kod taksona kod kojih prelazi 10% uglavnom se nalazi zajedno sa strukturno sliĉnim monoterpenima, kao što su kamfor i kamfen. 1,8-cineol se nalazi na sedmom mestu. U etarskim uljima ĉesto se javlja zajedno sa kamforom i borneolom, i odgovoran je za relativno ĉesto prisustvo kamfora koji je ĉest i u uljima 17 borneolnog tipa. Eukaliptol (1,8-cineol) je ĉesta komponenta kod predstavnika familije Myrtaceae, naroĉito u okviru vrsta roda Eucalyptus, ali je takoĊe glavna komponenta ulja vrste Rosmarinus officinalis (Lamiaceae). Ostale komponente etarskih ulja nisu prisutne u znaĉajnom broju taksona roda Thymus, ipak po znaĉaju se mogu izdvojiti α- terpinil acetat, α-terpineol, geranil-acetat, kamfor, citral (geranial+neral), linalil-acetat, mircen i terpinen-4-ol. Kako je već navedeno, kod vrsta roda Thymus seskviterpenska jedinjenja nisu previše znaĉajna. Najĉešći je β-kariofilen koji je prisutan u etarskim uljim mnogih biljnih vrsta. Ovo jedinjenje je registrovano kod odreĊenog broja vrsta Thymus u procentu većem od 10%, ali nikada nije registrovan kao glavna komponenta etarskih ulja. Ovo takoĊe vaţi i za germakren-D koji je veoma ĉesto prisutan u etarskim uljima, ali retko prelazi 10%. Znatno je reĊe prisustvo oksigenovanih germakrena koji su uz T- kadinol i nerolidol široko rasprostranjeni kod vrsta Thymus-a severne Evrope. Neterpenoidna alifatiĉna jedinjenja prisutna su u etarskim uljima mnogih vrsta roda Thymus, ali u malim procentima. Jedinjenja sa lancem od osam ugljenikovih atoma su najĉešće, kao na primer oktanol-3, okten-1-ol-3, oktil-3 acetat i okten-1-il-3 acetat. Odgovarjući heksanski derivati su sledeći po zastupljenosti, a potom nonanski derivati. Uz ova jedinjena ĉesti su i odreĊena jedinjenja sa razgranatim lancima. Do sada je opisano prisustvo 62 neterpenoidna alifatiĉna jedinjenja u etarskim uljima razliĉitih vrsta roda Thymus. Neterpenoidna aromatiĉna jedinjenja saĉinjavaju C6C1-, C6C2- i C6C3-derivati, od kojih su ova poslednja poznata i kao fenilpropanska jedinjenja. Sva zajedno saĉinjavaju negde oko 7,8% konstituenata ulja kod Thymus. Od ove grupe jedinjenja najznaĉajnija su izoeugenol i cinamol, pošto se bar kod jedne vrste Thymus javljaju sa više od 10%. Sva ostala jedinjenja iz ove grupe se, uglavnom, javljaju u tragovima. 1.3.2.2 Populaciona varijabilnost sastava etarskih ulja Biljke u okviru iste populacije mogu varirati u odnosu na glavnu monoterpensku komponentu etarskih ulja. U prirodnim populacijama Th. vulgaris sa juga Francuske uoĉeno je prisustvo jednog ili nekoliko od ukupno šest hemotipova. Ovih šest hemotipova dobili su oznaku prema glavnoj komponenti etarskih ulja, geraniol, α- 18 terpineol, tujanol-4, linalool, karvakrol i timol (Passet, 1971; Vernet i sar., 1986). U populacijama iz Španije nije utvrĊeno prisustvo geraniol hemotipa, dok je primećen sedmi hemotip 1,8-cineol (Adzet i sar., 1977a). Neki od ovih hemotipova se mogu prepoznati i na terenu samo na osnovu ĉula mirisa, što je naroĉito iskazano kod geraniol tipa, koji ima izraţen miris na limun, kao i kod dva fenolna hemotipa koji imaju karakteristiĉan miris timijana, što ih jasno razlikuje od nefenolnih hemotipova. Prvi opisi varijabilnosti etarskih ulja kod Th. vulgaris javili su se ranih šezdesetih godina XX veka (Granger i sar., 1963), a usledile su znatno podrobnije studije u narednih nekoliko godnia. Ekološka uloga sekundarnih metabolita moţe se podvesti pod tri kriterijuma, adaptacija na abiotiĉke uslove sredina, kompetitivne interakcije sa drugim biljkama (McPherson i Muller, 1969) i hemijska odbrana od herbivora i patogena (Simeon de Bouchberg i sar., 1976; Bryant i sar., 1991; Shonle i Bergelson, 2000). Jasno je da ovi faktori ne deluju nezavisno jedan od drugog, već je dinamika sekundarnih metabolita uslovljena kombinovanim uticajem abiotiĉkih i biotiĉkih faktora sredine. Postoji odreĊeni dokazi koji pokazuju da varijabilnost monoterpenske komponente moţe predstavljati adaptivnu strategiju u relaciji sa uslovima sredine (Thompson, 2002). Prvi dokaz adaptivne varijacije predstavlja geografska i lokalizovana distribucija hemotipova kod Th. vulgaris u juţnoj Francuskoj. Na osnovu podataka dobijenih analizom sekundarnih metabolita zdruţenih uzoraka biljaka iz juţne Francuske primećeno je da fenolni hemotipovi (timol i karvakrol) dominiraju u populacijama timijana sa toplih i suvih staništa blizu Sredozemnog mora, dok nefenolni hemotipovi (geraniol, linalol, alfa-terpinol i tujanol-4) dominiraju u populacijam koje su dalje u kopnu, naroĉito iznad 400m nadmorske visine, to jest, na staništima sa vlaţnijom i hladnijom klimom (Passet, 1971; Granger i Passet, 1973). Ovo je potvrĊeno ispitivnajem i uporeĊivanjem uĉestalosti biljaka svakog hemotipa u 15 populacija od kojih su neke bile sa malih nadmorskih visina (ispod 300m), a neke sa nadmorskih visina preko 400m (Thompson i sar., 2003). Kod populacija koje sus rasle preko 400m nadmorske visine nisu pronaĊene fenolne jedinke. Prostorni raspored hemotipova kod Th. vulgaris javlja se i na manjim podruĉjima, od svega 8x10 km u dolini Martin-de-Londres, u okolini Monpeljea u Francuskoj (Vernet i sar., 1977 a, b; Gouyon i sar., 1986). Ova dolina ima specifiĉnu 19 mikroklimu, gde tokom zime temperatura u dolini moţe biti i nekoliko stepeni niţa nego na obroncima brda koja je okruţuju. Ovde je na osnovu zbirnih uzoraka biljaka utvrĊeno da u dolini dominiraju nefenolni hemotipovi, dok na plićim zemljištima i toplijim mestima na obroncima brda dominiraju fenolni hemotipovi. U studiji 336 populacija Th. vulgaris utvrĊeno je prisustvo oko 20% populacija sa samo jednim hemotipom, 165 populacija, ili oko 50%, sa dva hemotipa, od kojih je 72 bilo sa dva nefenolna hemotipa, 69 sa dva fenolna hemotipa, dok je svega 24 populacije sadrţavalo jedan fenolni i jedan nefenolni hemotip (Gouyon i sar., 1986). Ovo ukazuje da, iako su populacije sa dva hemotipa ĉeste, on sa nefenolnim i fenolnim hemotipom predstavljaju retkost. Raspored hemotipova je u korelaciji sa tipom zemljišta na kojem se neka populacija razvija. Fenolne populacije se javljaju na suvljim i plićim zemljištima nego nefenolne populacije koje su vezane za vlaţnija i dublja zemljišta. MeĊu nefenolnim hemotipovima utvrĊeno je da je α-terpineol hemotip najĉešći na najvlaţnijim podlogama, dok je, što se fenolnih tiĉe, karvakrol hemotip najĉešći na najsuvljim podlogama, a timolni hemotip nije u toj meri specijalizovan (Gouyon i sar., 1986). Drugi jasan faktor koji utiĉe na zastupljenost odreĊenih hemotipova je temperatura. Uoĉeno je odsustvo fenolnih hemotipova, a naroĉito karvakrolnog, iz delova staništa koja su izloţena temperaturama ispod 0°C. Ovo je moguća posledica što su nefenolne jedinke manje izloţene oštećenjima usled niskih temperatura od fenolnih, s obzirom da su fenolna jedinjenja toksiĉnija od nefenolnih ukoliko doĊe do oštećenja ćelija (Thompson, 2002). Kod populacija razliĉitih vrsta roda Thymus sa Balkana, takoĊe je utvrĊeno postojanje razliĉitih hemotipova. U flori Makedonije opisan je veliki broj taksona ovog roda. Za Th. albanus ssp. albanus navodi se da je glavna komponenta etarskih ulja (E)-neroldiol, a sledi β- kariofilen (Kulevanova i sar., 1998c), za Th. jankae, kod koga su ispitivana tri varijeteta, var. jankae, var. pantotrichus i var. patentipilus, utvrĊeno je da je glavna komponenta linalool, a na drugom mestu geranial (Kulevanova i sar., 1998a). Kod Th. longidens var. dassareticus glavna komponenta je α-terpinil acetate, a slede sa pribliţno istim koncentracijama, α-terpineol, linalool i geraniol (Kulevanova i sar., 1996a). Kod Th. longidens var. lanicaulis utvrĊeno je postojaje dva hemotipa, kod jednoga je glavna 20 komponeta karvakrol, a kod drugog timol, dok je u oba sluĉaja drugi po zastupljenosti geraniol (Kulevanova i sar., 1996a). Kod Th. macedonicus ssp. macedonicus utvrĊeno je postojanje hemotipa kod koga je glavana komponenta geraniol (Kulevanova i sar., 1996; 1999), linalool i α-terpinil acetat (Kulevanova i sar., 1999). Glavna komponenta ispitivanog etarskog ulja Th. moesiacus iz Makedonije je geraniol (Kulevanova i sar., 1996b), a kod Th. rohlenae p-cimen (Kulevanova i sar., 1998b). Kod vrste Th. tosevii ispitivano je više infraspecijskih takson i utvrĊeno postojanje nekoliko hemotipova sa razliĉitim glavnim komponentama etarskog ulja, geraniol, α-terpinil acetat, timol i karvakrol (Kulevanova i sar.,1995; 1996c; 1997). 1.3.2.2 Flavonoidi Do sada je identifikovan veliki broj biljnih pigmenata, koji su podeljeni u ĉetiri osnovne grupe: flavonoidi, karotenoidi, hinonoidi i betalaini. Flavonoidi su dalje podeljeni na antocijane, ţute falvonoide i bezbojne flavonoide (Marin, 1995). Antocijanini su najznaĉajnija grupa hemijskih komponenti odgovornih za boju odreĊenog biljnog organa i tkiva. Sa njihovim ispitivanjem je poĉeto u prvoj polovini 20. veka, ali struktura pojedinih antocijanina nije bila potpuno objašnjena te je postojala potreba za ponovnim ispitivanjem. Nakon otkrića da su malonilovani (zwitterionic) antocijanini veoma ĉesti kod Lamiaceae, mnoge vrste su ponovo ispitane (Harborne i Boardley, 1985; Harborne i sar., 1986). Ţuti flavonoidi su odgovorni za ţutu boju kod niza biljnih vrsta. Ovo je kompleksna grupa pigmenata koja je dalje podeljena na sledeće grupe: ţuti flavonoli, ţuti flavoni, halkoni i auroni. Poslednje dve grupe poznate su još pod nazivom antohlori. Ţuti flavonoli zasnovani su na dve komponente – gosipetinu i kvercetagetinu (Marin, 2003). Gosipetin i njegovi derivati su, do sada, naĊeni u 12 familija cvetnica, a ĉak su detektovani i kor rastavića (Equisetum). Kvercetagetin je nešto manje rasprostranjen, detektovan je kod oko 8 familija. Oba tipa ţutih flavonola prisutna su u dve velike familije cvetnica, Asteraceae i Fabaceae (Harborne, 1975). Najpoznatiji ţuti flavoni, koji odgovaraju gore pomenutim flavonolima, su hipolaetin i 6-hidroksiluteolin. MeĊutim oni su ĉešći u listovima nego u cvetovima. 21 Glavnina biljnih flavonoida nije direktno obojena, apsorbuju ultraljubiĉasti deo spektra, i nevidljivi su u vidljivom delu spektra, ali su vaţni kao kopigmenti antocijaninima (Harborne i Turner, 1984). Najĉešći bezbojni flavonoidi su flavonoli i flavoni. Kod predstavnika familije Lamiaceae poznati su sledeći flavonoidi: flavoni, flavonoli, flavanoni, dihidroflavonoli i halkoni (Marin, 1995). TakoĊe, kod Origanum vulgare, utvrĊeno je prisustvo i jednog aurona (Barberán, 1986). Halkoni su veoma retki u ovoj familiji (Tomimori i sar., 1984, 1985; Messana i sar., 1990) Flavoni su glavna grupa bezbojnih flavonoida prisutnih u familiji Lamiaceae. Veoma su ĉesti i aglikoni i glikozidi flavonoida (67-75%) (Marin, 1995). Od ukupno 147 flavonoida koji su identifikovani u familiji Lamiaceae, oko 60% su flavoni (Tomás- Barberán i Gil, 1992). Verovatno najĉešći flavonski aglikon u ovoj familiji je apigenin kao i odgovarajući metil etri (acetatin, hrizoeriol, diosmetin, itd). Jedna od prvih studija flavona listova i petala kod Lamiaceae, navodi luteolin kao glavni flavon kod rodova Teucrium, Mentha, Lycopus, Salvia, Thymus, Stachys i Lavandula (Hörhammer i Wagner, 1962). Neki veoma interesantni i retki flavoni su, izgleda, prisutni kod samo malog broja rodova familije Lamiaceae. Tako su baikalein i skutelarein locirani u korenu i listovima vrsta roda Scutellaria, dok kod nekih vrsta Scutellaria javlju kao 7- glukoronidi. Kod Satureja douglasii je otkriven ksantomikrol. Nakon ovih rezultata Harborne (1967) je saopštio da je ostalo da se utvrdi prisustvo još velikog braoja retkih i zanimljivih flavona u ovoj familiji. I zaista, brojni visoko metoksiolovani flavoni su utvrĊeni kod raznih vrsta Lamiaceae. Salvigenin kod Salvia virgata, sideritoflavon (5,3',4'-trihidroksi-6,7,8-trimetoksiflavon) kod Sideritis leucanta, timonin kod Tymus vulgaris, timusin kod Thymus membranaceus (Ferreres i sar., 1985; Barberán, 1986), 5,6-dihidroksi-7-8,3',4'-tetrametoksiflavon kod Mentha piperita (Jullien i sar., 1984), 8- metoksicirzilineol kod Sideritis mugronensis (Rodriguez 1977). Nepetin (5,7,3',4'- tetrahidroksi-6-metoksilflavon) je prvo detektovan kod Nepeta, a potom i kod rugih rodova (Rosmarinus i Salvia). Flavoni sa oxigenovanim C-6 i C-8 mogu se smatrati karakteristiĉnim za familiju Lamiaceae. 22 Sideritoflavon je utvrĊen i kod drugih rodova, na primer Thymus, Mentha i Stachys, kao i salvigenin kod Thymus, Rosmarinus, Ballota, Coleus, itd (Tomás- Barberán i Wollenweber, 1990). U tribusu Menthae (=Saturejeae) prisutne su sledeće komponente: timonin (5,6,4'-trihidroksi-7,8,3'-trimetoksiflavon), timusin (5,6,4'-trihidroksi-7,8- dimetoksiflavon), pebrelin (5,6-dihidroksi-7,8,4'-trimetoksiflavon), ladanein (5,6- dihidroksi-7,4'-dimetoksiflavon), 5,6-dihidroksi-7,8,3',4'-tetrametoksiflavon i 5,6- dihidroksi-7,3',4'-trimetoksiflavon. Ova se jedinjenja kod Micromeria, Satureja i srodnih vrsta uglavnom nalaze na površini listova rastvorena u terpenoidnom matriksu (Tomás-Barberán i sar., 1988b; Tomás-Barberán i Gil, 1992). Posmatrajući flavone moţe se zakljuĉiti da su kod Lamiaceae uglavnom povezani sa šećerima (glikozidi). Najĉešća veza izmeĊu razliĉitih šećera sa flavonskim aglikonima je na 7. mestu. Najĉešća komponente su mono-O-glikozidi (glikozidi, glukuronidi i retko ksilozidi, ramnozidi arabinozidi i galaktozidi). Od diglikozida, rutinozidi, soforozidi i alozil (1,2) glikozid (Tomás-Barberán i Gil, 1992) su najĉešći. Flavon C-glikozidi su manje ĉesti u ovoj familiji. Apigenin 6,8-diC-glikozid (vicenin-2) je pronaĊen kod Teucrium, Origanum i nekih srodnih rodova (Husain i sar., 1982). Viteksin je identifikovan kod Majorana hortensis, luteolin C-glikozid (orienin) kod Phlomis, Ajuga, Dracocephalum i Majorana i dva hrizin C-glikozida kod Scutellaria (Takagi i sar., 1981). U literaturi se navodi da flavonol aglikoni ĉine oko 16%, a flavonol glikozidi oko 10% ukupnih flavonoida kod familije Lamiaceae (Tomás-Barberán i Gil, 1992). MeĊutim, ispitivanja vrta skoro 50 rodova su pokazala da flavonol aglikoni nisu zastupljeni u toj meri. UtvrĊeno je prisustvo kaempferola kod Origanum vulgare, izokampferida, retusina ajanina i kumatakenina kod Salivia glutinosa (Barberán, 1986), kao i purpurascenina kod Pogostemon (Patwardhan i Gupta, 1981), itd. Kod vrsta familije Lamiaceae pronaĊeno je nekoliko flavonol glikozida, kvercetin 3-O-glikozid i 3-O-galaktozid kod Glechoma hederacea (Barberán, 1986), kao i još neki derivati kvercetina kod drugih vrsta (Harborne, 1967). Flavanoni se, takoĊe, pojavljuju kod familije Lamiaceae u formi aglikona (oko 20%) i glikozida (oko 13%). 23 Flavanon aglikoni su pronaĊeni kod razliĉitih rodova Lamiaceae, naringenin kod Micromeria i srodnih rodova (Bellino i sar., 1980), eriodiktol kod Mentha spp. (Burzanska-Hermann, 1978; Marin, 1989). Kod vrsta Micromeria, Acinos i Calamintha utvrĊeno je prisustvo flavanon glikozida kao što je neoponcirin (Bellino i sar., 1980), dok su kod Mentha i Sutellaria spp. naĊeni razni eriodiktiol glikozidi. TakoĊe, kod Mentha spp. i Hyssopus je utvrĊeno prisustvo hesperetin glikozida (Barberán, 1986). Dihidro flavonoli i halkoni su retki kod familije Lamiaceae, i kao aglikoni i kao glikozidi. Njihovo prisustvo je utvrĊeno kod malog broja vrsta (Barberán, 1986; Venturella i sar., 1980) Na osnovu veoma obimne literature pokazalo se da su flavonoidi, kao taksonomski markeri, pokazali najbolje rezultate na nivou roda (Marin, 2003), ali se koriste i kod viših i kod niţih nivoa klasifikacije. OdreĊena populaciona varijabilnost flavonoida je utvrĊena kod Mentha (Marin, 1989), ali glavne komponente su uvek bile iste u okviru jedne vrste. Kod Sideritis leucantha je praćena sezonska donamika slobodnih flavonski aglikona i utvrĊeno je da se njihov sastav tokom sezone ne menja, već samo njihova koliĉina, te da se oni mogu koristiti kao pouzdani taksonomski karakteri (Barberán i sar., 1985). Kod vrste Thymus striatus primećena je varijabilnost u dlakavosti, veliĉini listova i ĉašice (Menitsky, 1973). Analizom površinskih flavonoida populacija ove rvrste iz crne Gore, utvrĊeno je da ne postoji znaĉajna razlika u flavonoidnim profilima izmeĊu populacija, kako razliĉitih po ovim morfološkim karakterima, tako i po geografskoj distribuciji (Marin i sar., 2005). Kod većine ispitivanih populacija ksantomikrol je bio glavna komponenta, a kod dva uzorka kod kojih je bio dominantan javljao se u veoma visokom procentu (Marin i sar., 2005). Horwath i sar. (2008) su prouĉavali varijabilnost u sastavu površinskih falvonoida 71 populacije vrsta Thymus hyemalis i Th. baeticus, kao i njihovih putativnih hibrida sa podruĉja Andaluzije u Španiji, i utvrdili prisustvo 22 flavona, 5 flavanona, 2 dihidrofalvonola, 1 flavonol i dve nedeterminisane komponente. Većina površinskih falvona je imala 3',4'-oxigenovan prsten za razliku od taksona sa Balkana gde je dominirala 4'-oksigenacija B-prstena tj. derivati apigenina (Marin i sar., 2003). Ova znaĉajna razlika ukazuje da je geografska izolacija dovela do genetiĉke divergencije 24 ovih taksona tokom vremena, što za posledicu ima da su vrste ustalile enzimsku konsitituciju koja favorizuje odreĊene flavonoide. Primećena geografska varijabilnost i distribucija flavonoida ukazuje na znaĉaj ovih sekundarnih metabolita pri adaptaciji biljaka na lokalne uslove u kojima ţive (Tomás-Barberán i Gil, 1992), tj. da jedinke Thymus iz razliĉitih regiona su razvile specifiĉne fiziološke adaptacije na uslove sredine u kojima ţive (Horwath i sar., 2008). Kod mnogih rodova familije Lamiaceae je utvrĊeno postojanje hibrida, a naroĉito su ĉesti kod Thymus, Mentha, Stachys, Sideritis, itd. Postoje ĉak i hibridi vrsta razliĉitih rodova, kao na primer Micromeria i Calamintha (Šilić, 1979). Upravo ĉesta hibridizacija i odsustvo morfoloških karaktera po kojima bi se hibridi razlikovali je uzrok mnogih teškoća u taksonomiji ove familije, s toga je moguće traţiti odgovore primenom biohemijske taksonomije. Analizom sastava vakuolarnih i površinskih flavonoida, primenom HPLC i TLC, utvrĊeno je postojanje hibrida izmeĊu Sideritis incana i S. angustifolia (Tomas-Lorente i sar., 1989). Hibridi su imali flavonoidni profil karakteristiĉan za roditeljske vrste. TakoĊe, utvrĊena je i korelacija izmeĊu prisustva ţlezda i površinskih flavonoida kod prouĉavanih taksona. U drugoj studiji pokazano je prisustvo hibrida izmeĊu simpatriĉkih vrsta Sideritis bourgaeana i S. serrata HPLC analizom površinskih i vakuolarnih flavonoida. Hibridi su pokazali prisustvo komponenti koje su karakteristiĉne za roditeljske vrste (Ferreres i sar., 1989). Navedeni rezultati su pokazali i da su površinski flavonoidi pouzdaniji karakter od vakuolarnih flavonoidnih glikozida za utvrĊivanje hibridizacije. Ovo je navelo na zakljuĉak da površinski flavonoidi mogu biti veoma korisni pri rešavanju taksonomskih problema. Nekoliko ekstenzivnih studija flavonoida ukazuje da su ovi sekundarni metaboliti kod cvetnica najefikasniji u prouĉavanju taksonomije na nivou roda i unutar roda (Markham i sar., 1970; Swain, 1975; Harborne, 1975, 1977, 1984; Greger, 1978; Gurni i Kubitzki, 1981; Young i Sterner, 1981). I rodovi u okviru familije Lamiaceae su ekstenzivno prouĉeni sa aspekta flavonoida. Kod roda Origanum i srodnih rodova, pokazano je da se na osnovu prisustva ili odsustva derivata luteolina, hrizoeriola, apigenina i skutelareina ovaj rod moţe podeliti u šest grupa. Ovo podrţava podelu roda na dve sekcije, Origanum i Majorana (Fernandes i Heywood, 1972; Ietswaart, 1980). MeĊutim, ovi rezultati niti 25 podrţavaju izdvajanje Origanum amanum u zasebnu sekciju, kako je predloţio Ietswaart (1980), niti podelu preostalih vrsta, sekcija Amaracus, u posebnu sekciju. TakoĊe, pokazano je da da prisustvo apigenin 6,8-di-C- glikozida (vicenin-2) ne zavisi od geografskog poloţaja, već je prisutan samo kod vrsta iz sekcije Majorana, tako da moţe predstavljati vaţan taksonomski karakter na nivou sekcija kor roda Origanum. Vicenin-2 se pojavljuje i kod vrsta rodova Hyssopus i Thymus ukazujući na blisku srodnost ova tri roda u okviru tribusa Mentheae. Rod Thymus predstavlja još jedan zanimljiv rod sa aspekta hemotaksonomije. Taksonomski je veoma teţak zbog velikog polimorfizma mnogih vrsta, i predloţeno je nekoliko reklasifikacija (Jalas, 1972; Morales, 1985). Analizom površinski flavonoida 23 vrste sa Iberijskog poluostrva, registrovano je prisustvo 16 slobodnih flavonskih aglikona (Hernándes i sar., 1987). Prikazani rezultati podrţavaju podelu roda Thymus na dve dobro definisane grupe, koje se mogu tretirati i kao podrodovi, ali je potrebna i potvrda morfoloških karaktera (Hernándes i sar., 1987). Uopšteno govoreći, sastav površinskih flavonoida prouĉavanih vrsta, podrţava taksonomsku reviziju roda Thymus datu na osnovu morfoloških karaktera (Morales, 1985). Rezultati prouĉavanja površinskih flavonoida 40 vrsta i infraspecijskih taksona sa podruĉja Makedonije pokazala su da se ove vrste mogu svrstati u dva flavonoidna profila (Marin i sar., 2003). Prvoj grupi pripadaju vrste sa visokim do umerenim sadrţajem poršinskih flavonoida koji ukljuĉuju flavanone eriodiktiol i naringenin, kao i jedinjenja sa 5,6-dihidroksi-7,8-dimetoksi-, a naroĉito, 5,6-dihidroksi-7-metoksi substitucijam u A prstenu, pri ĉemu je 5,6-dihidroksi-7,3’,4’-trimetoksiflavon najprisutnija komponenta u najvećem broju sluĉajeva. Ggrupa 2 sadrţi vrste sa malom do umerenom koliĉinom površinskih flavonoida, i u kojoj je osim eriodiktiola i naringenina prisutani i metoksilovani flavanoni, kao na primer izosakuranetin. 5,6- dihidroksi-7,3’,4’-trimetoksiflavon i drugi flavoni sa 5,6-dihidroksi-7-metoksi A prstenom uglavnom nisu prisutni u ovoj grupi, s izuzetkom ladaneina koji se kod nekih predstavnika javlja u tragovima. Ove grupe, donekle, odgovaraju podeli na sekcije koje je dao Menitsky (1973). Flavonoidnom profilu grupe 1 pripada pet od osam prouĉavanih vrsta iz sekcije Marginati, podsekcija Marginati i pet od sedam ispitivanih vrsta sekcija Marginati, podsekcija Verticillati. Flavonoidni profil grupe 2 javlja se kod dve vrste iz sekcije Pseudothymbra, dok je kod preostale tri prouĉavane vrste sadrţaj 26 flavonoida izuzetno nizak, te se njihov sastav ne moţe sa sigurnošću odrediti, kod dve vrste iz sekcije Serpyllum, podsekcija Isolepides, i kod tri od osam prouĉavanih vrsta iz sekcije Marginati, podsekcija Marginati, Th. jankae, Th. albanus i Th. balcanus. Podela sekcije Marginati, podsekcija Marginati na dva flavonoidna profila je veoma neoĉekivana, pošto sve prouĉavane vrste pripadaju agregatu Th. praecox, i neki ih autori smatraju jednom vrstom, meĊutim u ovoj studiji se pokazlo da Th. longicaulis, Th. rohlenae i Th. moesiacus pripadaju grupi 1, a da Th. jankae, Th. albanus i Th. balcanus pripadaju grupi 2. Ipak, iako obe grupe imaju veoma sliĉan habitus, postoje morfološke razlike meĊu njima (Marin i sar., 2003). Kod vrsta iz Th. paraecox agregata sa Iberijskog poluostrva utvrĊeno je prisustvo razliĉitih komponenti (Hernándes i sar., 1987) u odnosu na one iz Makedonije, ali bi se oni mogli svrstati u flavonoidini profil 2. Kod makedonskih vrsta ovog agregata primećena je razlika ne samo izmeĊu razliĉitih vrsta ovog agregata, već i meĊu podvrstama i varijetetima iste vrste (Marin i sar., 2003). Kod vrste Th. pulegioides takoĊe je postojala znaĉajna razlika izmeĊu uzoraka sa Iberijskog i Balkanskog poluostrva. Prema rezultatima Hernándes i sar. (1987) Th. pulegioides sa Iberijskog poluostrva je, za razliku od makedonskih populacija, pripadao bi profilu grupe 1, a ovi profilu grupe 2. Ovo ukazuje na veoma visoku populacionu varijabilnost ove vrste (Marin i sar., 2003). Najveći broj vrsta iz podsekcije Verticillati pokazuje flavonoidni profil 1, s time da su kod najvećeg broja vrsta iz ove podsekcije prisutna jedinjeja 5,6,4’-trihidroksi- 7,3’-dimetoksiflavon i timusin, koji nisu utvrĊeni ni kod jedne druge ispitivane vrste iz podsekcije Marginati, osim Th. oehmianus koji sadrţao 5,6,4’-trihidroksi-7,3’- dimetoksiflavon kao glavnu komponentu. Menitsky (1973) razlikuje dva agregata u ovoj podsekciji, agregate Th. marschlianus i Th. glabrescens, meĊu kojima su morfološke razlike neznantne tako da su tu mnoga takosonomska pitanja otvorena (Marin i sar., 2003). Iz sekcije Pseudothymbra Marin i sar. (2003) su ukljuĉili sedam vrsta i u svima, osim Th. karadzicensis i Th. paranassicus, je detektovana veoma mala koliĉina površinskih flavonoida koji nisu mogli sa sigurnošću biti odreĊeni. Flavonoidni profili kod Th. karadzicensis i Th. paranassicus su bili sliĉni, karakteristiĉni po prisustvu flavonoida sa 5-hidroksi-6,7,8-trimetoksi supstitucijama u A prstenu i potpunom 27 odsustvu sa drukĉijim A prstenom. Flavanoni eriodiktol i naringenin su, takoĊe, izgledna otsutni kod ovih taksona. Kod dve vrste, Th. pseudoatticus i Th. comptus iz sekcije Serpyllum, podsekcija Isolepides, utvrĊen je flavonoidni profil sliĉan vrstama iz podsekcije Pseudothymbra, s time da su kod Th. pseudoatticus bili prisutni i flavoni sa 5-hidroksi-6,7-metoksi supstitucijama u A prstenu, a eriodiktiol i naringenin su bili prisutni kod obe vrste. TakoĊe, postojale su i odreĊene sliĉnosti sa flavonoidnim profilima Th. jankae, Th. albanus i Th. balcanus iz sekcije Marginati, podsekcija Marginati (Marin i sar., 2003). Iz svega iznetog Marin i sar. (2003) smatraju da je infargeneriĉka klasifikacija od strane Menitskog (1973) bolje podrţana rezultatima dobijenim analizom površinskih flavonoida nego ona koju je predloţio Jalas (1972). U nekim sluĉajevima površinski flavonoidi mogu se koristiti pri odluci kom rodu neki takson pripada. Tako su flavonoidi Thymbra capitata (L.) Griseb. prouĉavanu sa hemotaksonomskog aspekta (Barberán i sar., 1986). Do tada se smatralo da ova vrsta pripada rodu Thymus, Thymus capitatus (L) Hoffmann i Link, ili Corydothymus, Corydothymus capitatus (L) Reichenb. fill. Ovi rezultati u kombinaciji sa prethodnim istraţivanjima su ustanovili prisustvo nekih zajedniĉkih flavonoida sa Thymbra capitata i time sugerisali da ova vrsta pripadad rodu Thymbra (Barberán i sar., 1986). Flavonoidi mogu biti korisni taksonomski markeri i pri odreĊivanju granica izmeĊu blisko srodnih rodova, kao na primer Micromeria, Calamintha, Acinos, Satureja i Clinopodium (Marin 1996). Thomas-Barberán i sar. (1988) su pokazali da distribucija 5,6-dihidroksiflavona, koji su izuzetno lipofilni, moţe biti znaĉajna za razlikovanje blisko srodnih rodova. TakoĊe, pokazali su da je prisustvo ovih jedinjenja vezano samo za neke rodove podfamilije Nepetoideae i to uglavnom iz tribusa Mentheae. Površinski flavaonoidi su kod Satureja veoma prikladni hemotaksonomski karakteri na nivou sekcija (Thomas-Barberán i sar., 1991). Uz to, poruĉavanja vakuolarnih flavonoida kod Micromeria su pokazala neophodnost podele ovog roda na sekcije i potvrdila Boisser- ovu klasifikaciju (1879) na sekcije Pseudomelissa i Eumicromeria. Flavonoidi su prouĉavani i kao taksonomski karakteri i na nivo tribusa, podfamilija i familija kod viših biljaka (Harborne, 1984). Ova grupa jedinjenja je takoĊe bila analizirana i unutar fmilije Lamiaceae kao i odnosa ove familije sa srodnim familijama (Verbenaceae, Scrophulariaceae, Boraginaceae, itd). U radovima koji se 28 bave prouĉavanjem flavonoida kao taksonomskih karaktera u okviru familije Lamiaceae, pokazano je da rodovi iz tribusa Mentheae (Micromeria, Acinos, Calamintha, Origanum, Thymus, Mentha i Satureja) imaju sliĉan sastav, naroĉito, površinskih flavonoida. Vrste iz ovih rodova akumuliraju 5,6-dihidroksi-7,8- dimetoksiflavone koji nisu prisutni u ostalim rodovima iz familije Lamiaceae (Thomas- Barberán i sar., 1988; Thomas-Barberán i Gill., 1992). Ove se komponente, dakle, mogu smatrati taksonomskim karakterima na nivou tribusa, ali treba napomenuti da nisu pronaĊene kod roda Clinopodium koji takoĊe pripada ovom tribusu. TakoĊe, rezultati prouĉavanja flavonoidinih glikozida su pokazali da su rodovi Galeopsis, Leonurus, Ballota, Anisomeles, Marubium, Phlomis, Stachys, Sideritis i Pogostemon blisko srodni (Thomas-Barberán i Gill., 1992). Vrste iz ovih rodova sintetišu ili flavonoid p-kumaroil-glikozid ili 8-hidroksiflavon 7-alozil-glikozid, koji nisu prisutni kod ostalih rodova iz familije Lamiaceae. 1.3.2.3 Biološka aktivnost sekundarnih metabolita Vrste roda Thymus su veoma znaĉajne i dobro poznate kao lekovite i aromatiĉne biljke, u upotrebi skoro u svim regionima gde rastu. Njihova etarska ulja se dobijaju industrijski putem destilacije. TakoĊe se koriste i kao ukrasne biljke i dobijen je veliki broj sorti. Fadli i sar. (2012) su ispitivali antibakterijsku aktivnost etarskih ulja vrsta Th. maroccanus i Th. broussonetii na bakterijske sojeve otporne na antibiotike i pokazali da etarska ulja obe vrste imaju antibakterijsku aktivnost koja se moţe povezati sa visokim koncentracijama karvakrola. Antibakterijska aktivnost etarskih ulja deset biljnih vrsta je ispitivana i na bakterijske sojeve patogene za ĉoveka i tom prilikom je pokazano da najjaĉu aktivnost imaju etarska ulja Th. vulgaris i Origanum vulgare (Soković i sar., 2007), odnosno da su komponente sa najvećom antibakterijskom aktivnošću mentol, timol, a naroĉito karvakrol. Ovi autori takoĊe navode da je antibakterijska aktivnost jaĉa protiv Gram-pozitivnih nego Gram-negativnih bakterija. Inhibitorna aktivnos protiv Gram-pozitivnih bakterija, kao i antifungalna aktivnost, je pokazana i kod etarskog ulja vrste Th. algeriensis kod kojeg su dominirale ne fenolne komponente (Zouari i sar., 2011). 29 Antifungalna aktivnos etarskih ulja Cymbopogon citratus, Ocimum gratissimum i Thymus vulgaris ispitivana je na vrsti Penicillium expansum (Nguefack i sar., 2012) pokazano je da najveće dejstvo ima etarsko ulje Ocimum gratissimum kod kojeg je glavna komponenta timol. TakoĊe je primećeno da je antifungalni efekat etarskog ulja Th. vulgaris manji nego onaj kod Cymbopogon citratus, mada je glavna komponenta etarskog ulja ove vrste citral (neral i geranial), što objašnjavaju prisustvom borneola i bornil-acetata u etarskom ulju kod Th. vulgaris što samnjuje aktivnost. Antifungalna aktivnost je ispitivana i kod Th. zygis subsp. sylvestris, pri ĉemu je utvrĊeno postojanje hemotipovi, kao i da je karvakrolni hemotip imao najjaĉu antifungalnu aktivnost na dermatofitne sojeve (Gonçalves i sar., 2010). Pri tretmanu gljiviĉnie infekcije izazvane dermatomicetama kod laboratorijskih pacova etarsko ulje Th. vulgaris, a thimol naroĉito, su pokazali visoku antifungalnnu i terapeutsku aktivnost (Soković i sar., 2008). Soković i sar. (2009) su poreĊenjem antifungalne aktivnosti etarskih ulja vrsta Th. tosevii, Th. vulgaris, Mentha spicata i M. piperita, konstatovali da je ova mnogo izraţenija kod etarskih ulja vrsta roda Thymus, odnosno da je u zavisnosti od koncentracije fenolnih komponenti. Etarska ulja imaju i antioksidativnu aktivnost za koju su takoĊe odgovorne fenolne komponente, timol i karvakrol. Ispitivajem antioksidativne aktivnosti etarskog ulja Th. pulegioides metodom gašenja stabilnih slobodnih 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikala i ABTS metodom, utvrĊeno je da hemotipovi sa visokom koncentracijom timola i/ili karvakrola imaju jaĉe dejstvo (Loţienė i sar., 2007). Visoka koncentracija karvakrola u etarskom ulju Th. caramanicus, takoĊe, je uslovljavala visoki DPPH inhibitorni potencijal (Safaei-Ghomi i sar., 2009). Navodni terapeutski efekti mnogih narodnihg lekova mogu biti pripisani prisustvu flavonoida, ĉiji je farmakološki efekat u vezi sa njihovom inhibicijom odeĊenih enzima i njihove antioksidativne aktivnosti (Marin, 2003). Pokazano je da ekstrakti Scutellaria, Mentha, Nepeta, Origanum i Thymus imaju antibakterijaska dejstva. UtvrĊeno je da flavonoid aglikoni cirsimaritin, baikalein i drugi imaju znaĉajna antibakterijska dejstva (Barberán, 1986). Antibakterijaska aktivnost je utvrĊena za metanolni ekstrakt Marrubium globosum ssp. libanoticum, a od ĉistih komponenti, kvercetin 3-O-β-D-rutinozid, verbaskozid i naringenin 7-O-β -D-glucozid su imali najveću antibakterijsku aktivnost (Rigano i sar., 2007). 30 Antiviralna aktivnost flavonida je razmatrana u studiji Wang i sar. (1998). Neki od virusa na koje flavonoidi imaju uticaj su herpes samplex virus, respiratorni sincitijalni virus, virus parainfluence i adenovirus. Kvercetin je pokazao da ima i antinfekcijska i antireplikacijska svojstva (Kaul i sar., 1985). Abad i sar. (1997) su analizirali etanolne ekstrakte dvanaest biljnih vrsta i, takoĊe, utvrdili da neki od njih imaju inhibitorno dejstvo na herpes simplex virus. Barberán (1986) je u analizi flavonoida familije Lamiaceae dao i pregled do tada poznatih podataka o antiinflamatornoj aktivnosti flavonoida iz ove failije. Navedeni su rodovi Stachys, Mosla, Sideritis i Nepeta, ĉije se vrste koriste u te svrhe u narodnoj medicini. Kod ekstrakata tri vrste roda Salvia utvvrĊena je antiinflamatorna aktivnost za koju se smatra da su odgovorni flavonoidi (Çadirci i sar., 2012). Antioksidativna aktivnost je narolĉito interesantna u industriji hrane zbog usporavanja oksidativne degradacije lipida. Ekstrakti Origanum mogu se koristiti kao antioksidanti s obzirom da sadrţe znaĉajnu koliĉinu flavonoida . Luteolin, siderito flavon i 8-metoksicirsineol, mogu se smatrati veoma aktivnim antiosidantima hrane (Marin, 2003). Marinova i Yanishlieva (1996) su analizirale antioksidativnu aktivnost ekstrakta iz odabranih vrsta familije Lamiacceae i utvrdile da, od ispitivanih vrsta, etanolni ekstrakt Satureja hortensis ima najveću aktikvnost. Natioksidativna aktivnost je utvrĊena i kod vodenog ekstrakta vrsta Scutellaria immaculata i S. ramosissima, s time da izolovani skutelarin i ma jeaĉu aktivnosto od drugih prisutnih flavonoida (Mamadalieva i sar., 2011). Pri in vitro ispitivanju antioksidativne aktivnosti ekstrakata 18 vrsta iz familije Lamiaceae, najjaĉi efekat imali su polarni ekstrakti Lycopus europaeus, Melissa officinalis, Origanum vulgare subsp. virens and Lavandula latifolia (López i sar, 2007). Sve ovo pokazuje da sekundarni metaboliti imaju široki spektar delovanja koja su u velikoj meri od koristi za ĉoveka. Od sastava etarskih ulja i od flavonoidnog profila zavisi i spektar biološke aktivnosti, tako da je njihovo poznavanje veoma bitno pri izboru odreĊene biljne vrste za upotrebu u narodnoj i oficijelnoj medicini. 31 1.3.3 Kariološka, palinološka i mikromorfološka istraživanja vrsta roda Thymus Hromozomi su kod roda Thymus veoma sitni (Morales, 2002). Veliĉina im se kreće od 1 do 2 µm i pod svetlosnim mikroskopom vide se kao taĉke. Poznati su sledeći brojevi hromozoma 2n=24, 26, 28, 30, 32, 42, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 84 i 90, koji odgovaraju diploidnom, tetraploidnom i heksaploidnom nivou. Od osnovnog broja x=7, verovatno su nastali sekundarni osnovni brojevi x=14 i x=15. Najĉešći brojevi hromozoma su 2n=28, 30, 56 i 60. Aneuploidi zauzimaju vaţno mesto u evoluciji ovog roda i odgovorni su za ostale brojeve. Polenova zrna u okviru ovoga roda su veoma homogena, uglavnom heksakolpatna i sa supraretikularnom ornamentacijom. Veliĉina im varira izmeĊu 21 – 46 m i P/E izmeĊu 0,9 i 1,3 (Morales, 1986). Kod vrsta iz Fmilije Lamiaceae su raĊena i ispitivanja mikromorfoloških karaktera, kao što su izgled i graĊa ţlezdanih i neţlezdanih trihoma, kao i skulpturacija orašica. Kod familije Lamiaceae taksonomski znaĉaj nekih karktera orašica opisan je kod više rodova (Marin, 1996). Kod tribusa Menthae, ispitivanjem vrsta 57 rodova, utvrĊeno je znaĉajno variranje u obliku, morfologiji abscisionog oţiljka, distribuciji trihoma i površinskoj skulpturiranosti orašica (Moon i sar., 2009a), Primećeno je pet tipova površine orašica, i ove karakterisitke se mogu korikstiti za filogenetske analize na nivou roda. Özkan i sar. (2009) su ispitivali orašice vrsta roda Salvia iz Turske i uporeĊivanjem oblika, veliĉine, boje i površinske skulpturiranosti orašica došli do zakljuĉka da su ovi karkter korisni pri razlikovanju grupa vrsta, kao i samih vrsta i podvrsta. TakoĊe, kod vrsta roda Nepeta (Kaya i Dirmenci, 2008) i vrsta roda Stachys (Salmaki i sar., ‚2008) mikromorfološke karakteristike orašica, naroĉito spoljašnaj skulpturiranost, mogu posluţiti kao taksonomski karkteri. Analizom površinskih karaktera orašica kod tribusa Westringieae utvrĊeni su, dosta dobro, filogenetski odnosi (Guerin, 2005). Kod vrsta iz roda Thymus analizirane su vrste Th. pulegioides, iz sekcije Serpyllum, i Th. zygis, iz sekcije Thymus, kao i jedna vrsta ovog roda koja nije bila u potpunosti determinisana (Marin, 1996). Merikarpi kod vrste Th. pulegioides i Th. zygis su imali razliĉiti tip skulpturiranost. Površina orašica kod Th. pulegioides je nepravilno 32 naborana, bez jasnih struktura. Orašice Th. zygis su imale ovalna jasno omeĊena polja sa talasastim marginama. Ornamentisanost orašica kod nepotpuno odreĊene vrste je bilo veoma sliĉno vrsti Th. zygis. MeĊutim, Marin (1996) smatra da bi za sigurnije zakljuĉke o znaĉaju ornamentacije orašica u infrageneriĉkoj klasifikaciji ovog roda trebalo izvršiti šire uzorkovanje. Moon i sar. (2009b) su utvrdili prisustvo dve grupe trihoma na listovima u okviru tribusa Menthae, neţlezdane i ţlezdane. Kod neţlendanih su razlikovali unicelularne, uniserijatne i razgranate trihome, dok sus od ţlezdanih kod ovog tribusa opisali kapitatne, pilatne i peltatne trihome. Ovi autori smatraju da su mikromorfološki karaktreri listova sa taksonomskog aspekta ograniĉeni na subtribalni nivo, i da za jasniju sliku treba koristiti veći broj karaktera. Kod vrsta Thymus maly (Marin i sar., 2008) i Th. glabrescens (Dajic Stevanovic i sar., 2008) su takoĊe opisane glandularne i peltatne trihome, kao i negladularne trihome. 1.3.5 Molekularna istraživanja Za dve decenije od kako je opisana, PCR (Polymerase Chain Reaction) je postala skoro sinonim za istraţivanja u molekularnoj biologiji. Najveći doprinos PCR metode molekularnoj sistematici je brza amplifikacija pojedinaĉnih regiona DNK, što omogućuje sekvenciranje redosleda nukleotida. U poĉetku primene PCR metoda za filogenetske studije kod biljaka najviše se koristio hloroplastni genom, a kasnije su poĉele da se koriste i nuklearne sekvence DNK (kao na primer ITS i 18S rDNK). U zasvisnosti od tksonomskog nivoa koji se prouĉava, koriste se razliĉiti hloroplastni, nuklearni ili mitohondrijalni regioni DNK (Soltis i Soltis, 2000). Za filogenetska ispitivanja neki od njaĉešće korišćenih plastidnih markera su trnL-trnF, atpB-rbcL, ndhF, matK i rps16. Za filogenetsku analizu i radijaciju u flori Kapske oblasti 73 vrste roda Moraea (Iridaceae) korišćeni su markeri rbcL egzon, trnL intron, trnL-trnF intergenski spejser i rps16 intron (Goldblatt i sar., 2002). Pri ispitivanju filogenetskih odnosa unutar familije Fabaceae Sulaiman i sar. (2003) su koristili rbcL dok su Chase i sar. (1993) analizirali filogeniju semenjaĉa na osnovu rbcL. 33 Od nuklearnih molekularnih markera najviše se koriste ITS, 26S rDNK i 18S rDNK. 26S rDNK i 18S rDNK su pogodni markeri za ispitivanje filogenija na višem taksonomskom nivou (Kuzoff i sar., 1998). U redu Cornales je utvrĊeno postojanje osam dobro podrţanih klada, i to: Cornus, Alangium, nyssoide (Nyssa, Davidia, and Camptotheca), mastixioide (Mastixia and Diplopanax), Hydrangeaceae, Loasaceae, Grubbia-Curtisia, and Hydrostachys (Fan i Qiu-Yun Xiang, 2003). ITS se uglavnom koristi za prouĉavanje filogenija na nivou rod i vrsta. Tako je, na primer, analizirano monofiletsko poreklo i filogenija roda Monandra (Prather i sar., 2002) i divergencija u okviru roda Cuminia (Ruiz i sar., 2001). AFLP markeri (Amplified fragment length polymorphism) su za mnoge taksonome prvi izbor pri odabiru molekularnih markera za rešavanje filogenije na nivou rodova i vrsta u sluĉaju kada su klade imale radijaciju u bliskoj evolutivnoj prošlosti (na pr. Dixon i sar., 2009; Moghaddam i sar., 2009; Rahimmalek i sar., 2011). U poslednje vreme pojavio se veliki broj studija koje se bave molekularnom sistematikom podfamilije Nepetoideae, sa fokusom na Ocimeae (Paton i sar., 2004), a naroĉito Mentheae. Većina se bavila odreĊenim rodovima, kao npr. Bystropogon (Trusty i sar., 2004, 2005), Conradina (Edwards i sar., 2006, 2008a,b), Mentha (Bunsawat i sar., 2004), Micromeria (Bräuchler i sar., 2005), Minthostachys (Schmidt- Lebuhn, 2007, 2008), Monarda (Prather i sar., 2002) i Salvia (Walker i sar., 2004; Walker and Sytsma, 2007), dok su neki bili usredsreĊeni na na subtribalni nivo (Bräuchler et al, 2010). Postoje brojne studije koje se bave hemijskim polimorfizmom i biološkim interakcijama kod roda Thymus (npr. Horwath i sar., 2008; Rota i sar., 2008; Maksimović i sar., 2008b), ali jako mali broj istraţivanja je vršen na molekularnom nivou u okviru ovog roda, i to iskluĉivo na jednoj vrsti (Echeverrigaray i sar., 2001; Trindade i sar., 2008; Trindade i sar., 2009). 1.4. Opis izabranih taksona roda Thymus Thymus balcanus Borb. (Slika 1.4) Stabljike dugaĉke, puze po zemlji, na krajevima se završavaju sterilnom rozetom listova. Cvetne grane se razvijaju u nizovima duţ poloţenog stabla. Listovi debeli, koţasti eliptiĉni ili loptiĉasti, 2 do 3 put duţi od širine, dugaĉki oko10 mm, sa razvijenom lisno drškom, na licu goli ili pokriveni 34 proreĊenim dugaĉkim dlakama, boĉni nervi na naliĉiju liske jako istaknuti, debeli, jako luĉno savijeni, najĉešće se ne spajaju u jedan obodni nerv. Cvetovi sloţeni na vrhu grana u okruglaste, reĊe izduţene cvasti. Cveta od maja do avgusta. Javlja se na kamenjarima, na kreĉnjaku i serpentinu u planinskom i subalpijskom pojasu. Endemit je Balkanskog poluostrva. Prema Flori Evrope Th. balcanus je opisan kao Th. praecox subsp. polytrichus. Slika 1.4. Thymus balcanus, populacija P25 (Foto I. Šoštarić). Thymus glabrescens Willd (Slika 1.5) rasprostranjen je u centralnoj i istoĉnoj Evropi i u Srbiji je veoma ĉesta vrsta, koja uspeva na zatravljenim, osunĉanim površinama. Stabljika je prividno puzeća, leţi na zemlji, a zatim se izdiţe i završava fertilnim izdankom. Cvetne grane su ravnomerno pokrivene stršećim dlakama. Listovi na cvetnim granama izduţeno lancetasti ili izduţeno eliptiĉni, na vrhu zaobljeni, sa lisno drškom izdvojenom i kratkom, na licu goli, a pri osnovi pokriveni dugaĉkim trepljama. Od vrha ka osnovi grana listovi se postepeno smanjuju. Cvetovi sakupljeni na vrhu 35 grana i stabljike u klasolike cvasti. Vrsta je rasprostranjena u centralnoj i istoĉnoj Evropi. Slika 1.5. Thymus glabrescens, populacija P33 (Foto: D. Stojanović). Thymus marschallianus Willd. (Slika 1.6) je rasprostranjen u celoj Evropi i na Balkanskom poluostrvu. U Srbiji ova vrsta ima veoma široko rasprostranjenje na livadama, sušnim breţuljcima i pored drumova. Glavno stablo je odrvenelo, uspravno ili se izdiţe, završava se cvašću, najĉešće sa brojnim fertilnim izdancima, koji su pokriveni stršećim dlakama. Listovi su linearno lancetasti do široko lancetasti ili eliptiĉni, svi iste veliĉine ili su donji nešto sitniji, goli, samo pri osnovi sa dugaĉkim trepljama. Cvetovi skupljeni u klasolike cvasti. Prema Flori Srbije, vrsta je rasprostranjena u Evropi i na balkanskom poluostrvu. Flora Evrope ovu vrstu tretira kao deo vrste Th. pannonicus. 36 Slika 1.4. Thymus marschallianus, populacija P13 (Foto I. Šoštarić). Thymus moesiacus Vel. (Slika 1.7) je vrsta sa stabljikom koja je puzeća, jako izduţena, vrhom neprestano raste i zavšava se sterilnom rozetom listova. Neţne cvetne grane se javljaju u nizovima duţ poloţenog stabla iz pazuha listova, dugaĉke 5 do 8 cm, pokrivene celom duţinom naniţe okrenutim dlakama. Listovi koji se nalaze pri osnovi cvetnih grana, rozetasto su zbijeni, šilasti, mali, dugaĉki svrga 5 do 6 mm i ĉiroki oko 1 mm, dok su listovi na sredini i u gornjem delu cvetnih grana veći, objajasti i dugaĉki 11 do 20 mm i široki 2 do 5 mm sa utisnutim sitnim ţlezdama. Listovi na stolonama su najĉešće veći, ali ne i širi od listova na cvetnim granama. Svi listovi su na licu goli, a vrlo retko pokriveni dlakama. Cvetovi su sloţeni na vrhu cvetnih grana u kratke okruglaste, reĊe nezbatno izduţene, cvasti. Ĉašica je dugaĉka oko 3 mm i sa svih strna pokrivena dugaĉkim, stršećim dlakama. Ĉašiĉna cev je široko zvonasta, ĉesto kraća od ĉašiĉnih zubaca. Cvetne drške nisu pokrivene ţlezdama sa drškama. Krunica spolja gola ili skoro gola. Ova vrsta je rasprostranjena na Balkanskom poluostrvu. U Flori Evrope navodi se da je Th. moesiacus sinonim za vrstu Th. longicaulis. 37 Slika 1.7. Th. moesiacus, populacija P30 (Foto: I. Šoštarić). Thymus pannonicus All. (Slika 1.8) je biljka sa odrvenelom stabljikom koja donjim delom puzi po zemlji, dok se srednjim i donjim izdiţe. Cvetne grane i sterilni izdanci su manje više uspravni. Ceo izdanak je gusto pokriven dlakama, cvetne grane i listovi su sa stršećim dugaĉkim dlakama. Listovi su linearno lancetasti ili izduţeno lancetasti sa razvijenom lisno drškom. Na licu i na naliĉiju su utisnute subsesilne ţlezde. 38 Cvasti je klasoliko izduţena ili reĊe okruglasta i skraćena. Cveta od maja do jula.Ova vrsta se javlja na osunĉenim, zatravnjenim staništima. Rasprostranjena je u celoj Evropi, dok se u Srbiji javlja sporadiĉno i to subvar. griseus. Slika 1.8. Th. pannonicus, populacija P23 (Foto: I. Šoštarić). Thymus pulegioides L. (Slika 1.9) je busenasta biljka sa skoro uspravnim stabljikama, ili ove delimiĉno delom leţe na zemllji, dok krajevi sa cvastima stoje manje više uspravno. Stolone ili nisu razvijene ili su kratke. Cvetne grane su oštro ĉetvorouglaste, uglovi malo istaknuti, sve do cvasti pokriveni naniţe okrenutim dlakama. Stranice su gole. Listovi jajasti, eliptiĉno jajasti, izduţeni ili lancetasti. Cvetovi sakupljeni na vrhu cvetnih grana u vršne, izduţene klasolike ili okruglaste cvasti. Ĉašiĉna cev i zupci na gornjoj usni goli ili pokriveni dlakama, zupci donje ĉašiĉne usne uvek duţ oboda pokriveni trepljama. Ova vrsta ima veoma široko rasprostranjenje. Javlja se u severnoj, centralnoj i jugoistoĉnoj Evropi. 39 Slika 1.9. Th. pulegioides, populacija P05 (Foto: I. Šoštarić). Thymus praecox Opiz. je sa stabljikama koje su dugaĉke, puze po zemljii završavaju se sterilnom rozetom listova. Cvetne grane se razvijaju u nizovima, duţ poloţenog stabla i visoke su 3 do 5 cm, pokrivene stršećim dlakama koje su kraće od preĉnika stabljike. Donji listovi cvetnih grana loptiĉasto okruglasti sa dugaĉkom lisno drškom, nisu zbijeni u rozete, srednji listovi su jajasti, a gornji jajasto okruglasti, postepeno sve veći, svi sa dobro razvijenom lisno drškom, koţasti na licu goli, boĉni nervi na naliĉiju liske istaknuti, debeli, me ulivaju se u isto tako debeli obodni nerv. Cvetovi su sloţeni na vrhu cvetnih grana u okruglaste cvasti. Ĉašica je dugaĉka oko 4 mm i sa trbušne strane je pokrivena dlakama. Prema Flori Srbije ova vrsta je endemit 40 Balkanskog poluostrva, dok Flora Evrope navodi da je areal ove vrste znatno širi, od juţnih obala Grenlanda, pa sve do jugoistoĉne Evrope. 1.5 Ciljevi rada Vrste roda Thymus koriste se kao lekovite i aromatiĉne biljke u tradicionalnoij i zvaniĉnoj medicini u svim krajevima u kojima se javljaju. Aktivne supstance uglavnom su u sastavu etarskih ulja te je poznavanje razliĉitih hemotipova od velikog znaĉaja pri odabiru populacija za kolekcionisanje biljnog materijala. Pri determinaciji vrsta roda Thymus morfološki karakteri ĉesto su nedovoljno jasni, tako da se ukazuje potreba za dodatnim karakterima za odreĊivaje vrsta. Shodno tome, analiza površinskih flavonoida i AFLP molekularnih markera poboljšaćeuvid u genetiĉke i evolutivne odnose izmeĊu populacija vrsta ovog roda sa podruĉja Srbije. Na kraju, na osnovu dobijenih rezultata fitohemijskih i molekularnih istraţivanja i utvrĊenih srodniĉkih odnosa izmeĊu istraţivanih vrsta kao model sistema unutar roda Thymus, oĉekuje se i rasvetljavanje odreĊenih taksonomskih pitanja. Dobijeni rezultati treba da ukaţu na smernice za dalja taksonomska i filogenetska istraţivanja ne samo vrsta iz drugih sekcija roda Thymus, nego i srodnih rodova iz tribusa Mentheae, jedne od najznaĉajnijih, najkompleksnijih i najintrigantnijih grupa familije Lamiaceae. 41 2. Metrijal i metode 2.1 Fitohemijska ispitivanja 2.1.1 Biljni materijal Biljni materijal za fitohemijska ispitivanja sakupljan je tokom vegetacione sezone 2008. godine sa svojih prirodnih staništa. Spisak vrsta sa lokalitetom i njegovom geografskom duţinom i širinom dat je u tabeli 2.1. Uzorci su determinisani u skladu sa Flora Europaea i Florom SR Srbije. Herbarski uzorci se ĉuvaju u Herbarijumu Katedre za agrobotaniku Poljoprivrednog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. 2.1.2 Etarska ulja 2.1.2.1 Analiza sastava etrskih ulja TD-GC-MS sistem se sastojao od an ATD400 termo-desorpcoine jedinice, AutoSystem XLGC i TurboMass quadrupole MS (Perkin-Elmer, Waltham, MA). Oko 3mg vazdušno sušenog biljnog materijala je drţano izmeţu staklene vune u staklenoj cevi i stavljeno u standardnu desorpcionu cev od nerĊajućeg ĉelika. Uzorak je potom desorbovan 10 minuta na 150°C u toku helijuma od 60 mL/min koji je prolazio do Tenax TA trap (80-100 mesh) drţanog na 4 °C bez rascepa ulaza. Nakon desorpcije Tenax trap je grejana na 300 °C u helijumovoj atmosferi na 15 psi sa ispustnim rascepljenim protokom od 18.75 mL/min. Isparljive komponente su propuštane kroz deaktivacionu staklenu kapilarnu liniju na 200 °C na 30 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 μm DB-5MS kapilarnu GC kolonu (Agilent J&W, Santa Clara, CA) i hromatografija je bila nastavljena upotrebom temperaturnog programa od 60-300 na 6 °C/min pod pritiskom ATD. MS je bio opremljen EI izvorom koji je radio na 70 eV sa temperaturom izvora od of 180 °C, dok su maseni spektri bili zabeleţeni u opsegu m/z 38-600. Operativni 42 softver je bio Turbomass version 4.1.1. Retencioni indeksi (RI) su bili odreĊeni u relaciji sa serijom n-alkana (C8-C20, Supelco, United Kingdom), dok je integracija pikova bila izvedena do RI 1900 (t.j. pre izlaska palmitinske kiseline). Jedinjenja su odreĊen uporeĊivanjem RI i/ili masenog spektra sa literaturnim podatcima (Adams, 2001; Ausloos i sar., 1992). 2.1.2.2 Statistička obrada sastava etarskih ulja U statistiĉku obradu sastava etarskih ulja za svaku podsekciju ukljuĉene su komponente koje se u makar jednom uzorku javljaju sa 10 ili više procenata. Kod podsekcije Alternantes u analizu je ukljuĉeno 5 komponenti etarskih ulja, kod popdsekcije Isolepides 15 komponenti i kod podsekcije Pseudomarginati 10 komponenti (Tabela 2.2). Korelacije: Na osnovu Pearsonovog korelacijskog koeficijenta izraĉunate su korelacije izmeĊu najzasupljenijih komponenti etarskog ulja unutar svake podsekcije upotrebom programa programa Statistica 8.0 (StatSoft). Analiza glavnih komponenti: PCA(Principal Component Analysis) je multivarijacion statisticka metoda koja veliki broj korelisanih promenljivih transformise u nekorelisanih skup promenjljivih koje se nazivaju glavne pomponente. Analiza glavnih komponenti je sprovedena na osnovu najzastupljenijih komponenti etarskog ulja unutar svake podsekcije pomoću programa Statistica 8.0 (StatSoft). IzraĊeni su dijagrami, za svaku podsekciju, u kojima je u koordinatnom sistemu taĉkama prikazan poloţaj analiziranih populacijama, kao i dijagrami u kojima je taĉkama prikazan poloţaj pojedinih komponenti etarskog ulja. Klaster Analiza: Na osnovu najzastupljenijih komponenti etarskog ulja izraĉunata je Euklidska udaljenost izmeĊu populacija unutar svake podsekcije. Matrica Euklidske udaljenosti korištena je u Analizi skupina (Cluster Analysis) u svrhu izrade dendrograma odnosno utvrdjivanja stepena slicnsti medju populacijama. Klaster analiza je izvršena neponderisanom metodom za sparivanje skupina na temelju proseĉnih vrednosti (Unweighted pair-group method using arithmetic averages; UPGMA). Klaster analiza je izvršena na standarzizovanim podacima. 43 Tabela 2.1. Populacije vrsta roda Thymus ukljuĉene u fitohemijska ispitivanja. ThAFLP_No Vrsta Podsekcija Geografska širina (N) Geografska duţina (E) Nadmorska visina (m) P01 Th. pulegioides Alternantes 43.84 21.68 592 P02 Th. pulegioides Alternantes 43.88 20.66 473 P03 Th. pulegioides Alternantes 43.45 21.47 648 P04 Th. pulegioides Alternantes 43.61 20.55 264 P05 Th. pulegioides Alternantes 43.38 22.60 1163 P06 Th. pulegioides Alternantes 44.17 21.12 877 P09 Th. pulegioides Alternantes 45.16 19.75 474 P10 Th. glabrescens Isolepides 44.82 21.34 80 P11 Th. glabrescens Isolepides 45.07 21.38 132 P12 Th. glabrescens Isolepides 45.29 20.43 84 P13 Th. glabrescens Isolepides 45.10 21.39 155 P14 Th. glabrescens Isolepides 45.48 20.34 79 P15 Th. glabrescens Isolepides 45.16 19.75 474 P33 Th. glabrescens Isolepides 45.28 20.38 83 P16 Th. marschallianus Isolepides 45.00 20.89 145 P17 Th. marschallianus Isolepides 44.90 21.22 114 P18 Th. marschallianus Isolepides 43.60 21.88 793 P19 Th. pannonicus Isolepides 43.59 21.89 926 P20 Th. pannonicus Isolepides 43.73 21.85 802 P21 Th. pannonicus Isolepides 44.17 21.12 877 P22 Th. pannonicus Isolepides 44.18 22.13 975 P23 Th. pannonicus Isolepides 45.12 21.32 402 P34 Th. pannonicus Isolepides 44.19 22.16 869 P24 Th. balcanus Pseudomarginati 43.36 22.58 1491 P25 Th. balcanus Pseudomarginati 43.37 22.62 1758 P26 Th. balcanus Pseudomarginati 43.27 22.81 1551 P27 Th. balcanus Pseudomarginati 43.25 22.81 1454 44 ThAFLP_No Vrsta Podsekcija Geografska širina (N) Geografska duţina (E) Nadmorska visina (m) P31 Th. moesiacus Pseudomarginati 43.61 20.55 275 P32 Th. praecox Pseudomarginati 44.18 22.14 1162 Tabela 2.1 Nastavak Tabela 2.2. Sastojci etarskog ulja ukljuĉena u statistiĉku obradu. Jedinjenje KI Literaturno Tip jedinjenja Podsekcija kod koje je ukljuĉena * α-Pinene 939 Monoterpenski ugljovodonici I; Myrcene 991 Monoterpenski ugljovodonici I; P; p-Cymene 1025 Ostalo (aromatiĉni ugljovodonik) A; I; Limonene 1029 Monoterpenski ugljovodonici I; (E)-β-Ocimene 1050 Monoterpenski ugljovodonici I; γ-Terpinene 1060 Monoterpenski ugljovodonici A; I; Linalool 1097 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici I; P; α-Terpineol 1189 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici I; Thymol methyl ether 1235 Ostalo (fenolni etar) I; Neral 1238 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici I; P; Geraniol 1253 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici A; Linalyl acetate 1257 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici P; Geranial 1267 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici I; P; Thymol 1290 Ostalo (fenol) A: I; Carvacrol 1299 Ostalo (fenol) A; I; alpha-Terpinyl acetate 1349 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici P; Neryl acetate 1362 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici P; (E)-Caryophyllene 1419 Seskviterpenski ugljovodonik I; P; Germacrene-D 1485 Seskviterpenski ugljovodonik I; Bicyclogermacrene 1500 Seskviterpenski ugljovodonik P; (E)-gamma-Bisabolene 1531 Seskviterpenski ugljovodonik I; P; * A – Alternantes; I – Isolepides; P- Pseudomarginati; 45 2.1.3 Površinski flavonoidi 2.1.3.1 Ekstrakcija površinskih flavonoida Za analizu je korišćeno 0.5g vazdušno sušenih, celih listova su bili potopljeni u 10ml dietil etra i ostavljeni na sobnoj temperaturi preko noći. Dietil etar je filtriran i ostavljen da ispari u digestoru. Suvi ostatak je zatim rastvoren u 80% MeOH, filtriran i prebaĉen u autosampler HPLC vijalu. 2.1.3.2 Analitički HPLC sa diodnom UV detekcijom (LC-DAD) HPLC sistem se sastojao od Waters LC 600 pumpe i 996 fotodiodnim UV detektorom. Korištene su kolone Merck LiChrospher 100RP-18 (5 μm), 4.0 mm (i.d.)× 250 mm.Gradijentni profili su bili zasnovani na dva rastvaraĉa, 2% vodenim HOAc i MeOH–HOAc–H2O, 18:1:1. Poĉetni uslovi su bili 75% vodenog rastvaraĉa i 25% metanolnog rastvaraĉa. Proporcija ovog drugog rastvaraĉa je rasla sa linearnim gradijentom, dostiţući 100% sa t=20min. Posle ovoga je sledila izokratska elucija 100% metanolnog rastvaraĉa do t=25min, nakon ĉega se program vraćao na poĉetni odnos rastvaraĉa. Temperatura kolone je odrţavana na 30°C, a protok na 1.0 ml min-1. Injekcije (40 μl) su vršene autosamplerom. 2.1.3.3 HPLC sa hemijski jonizujućom masenom spektrometrijom na atmosferskom pritisku (LC-APCI-MS) LC-MS analiza je izvedena na sliĉan naĉin kao i analitiĉka HPLC metoda, s tim što je koncentracija sirćetne kisleine u mobilnim fazama bila 1%. Maseni spektri su snimljeni kvadrupol – jonska zamka masenim spektrometrom (ThermoFinnigan LCQ 'classic') sa hemijskim jonizacionim izvorom pri atmosferskom pritisku (APCI) u pozitivnom modu. Temperatura grejaĉa jonske probe je bila 550 °C, pritisci gasa pri direktnom i kruţnom protoku kroz jonsku probu iznosili su 80 i 20 psi, respektivno, temperatura kapilare 150 °C, a jaĉina jonizacione struje je bila 5 μA. Masenim 46 spektrometrom je upravljano preko programa Xcalibur 1.2 (ThermoFinnigan). Spektri su snimani u opsegu 125 – 500 m/z. Najobilniji joni u svakom spektru su izdvojeni u jonskoj zamci (širina izolovanja od 5 amu) i zatim podvrgnuti kolizionoj disocijaciji (CID) primenom kolizione energije od 45% (bez energije aktivacije). CID spektri koeluirajućih komponenti su zabeleţeni automatski dinamiĉkim iskljuĉivanjem bez prethodnog poznavanja njihovih molekulskih masa. 2.2 Molekularna ispitivanja 2.2.1 Biljni materijal Biljni materijal za molekularna ispitivanja sakupljan je tokom vegetacione sezone 2008. godine sa svojih prirodnih staništa. Spisak vrsta sa lokalitetom i njegovom geografskom duţinom i širinom dat je u tabeli 2.3. Uzorci su determinisani u skladu sa Flora Europaea i Florom SR Srbije. Herbarski uzorci se ĉuvaju u Herbarijumu Katedre za agrobotaniku Poljoprivrednog fakulteta, Univerziteta u Beogradu. 47 Tabela 2.3. Vrste i populacije roda Thymus ukluĉene u AFLP analizu. Poulacija Vrsta Podsekcia Geografska širina (N)  Geografska duţina (E) Broj uzoraka. P01 Th. pulegioides Alternantes 43.84 21.68 3 P02 Th. pulegioides Alternantes 43.88 20.66 3 P03 Th. pulegioides Alternantes 43.45 21.47 3 P04 Th. pulegioides Alternantes 43.61 20.55 3 P05 Th. pulegioides Alternantes 43.38 22.60 2 P06 Th. pulegioides Alternantes 44.17 21.12 3 P07 Th. pulegioides Alternantes 43.19 22.14 3 P08 Th. pulegioides Alternantes 44.26 19.89 3 P09 Th. pulegioides Alternantes 45.16 19.75 2 P10 Th. glabrescens Isolepides 44.82 21.34 2 P11 Th. glabrescens Isolepides 45.07 21.38 3 P12 Th. glabrescens Isolepides 45.29 20.43 3 P13 Th. glabrescens Isolepides 45.10 21.39 3 P14 Th. glabrescens Isolepides 45.48 20.34 2 P15 Th. glabrescens Isolepides 45.16 19.75 3 P16 Th. marschallianus Isolepides 45.00 20.89 3 P17 Th. marschallianus Isolepides 44.90 21.22 2 P18 Th. marschallianus Isolepides 43.60 21.88 3 P19 Th. pannonicus Isolepides 43.59 21.89 2 P20 Th. pannonicus Isolepides 43.73 21.85 3 P21 Th. pannonicus Isolepides 44.17 21.12 1 P22 Th. pannonicus Isolepides 44.18 22.13 2 P23 Th. pannonicus Isolepides 45.12 21.32 3 P24 Th. balcanus Pseudomarginati 43.36 22.58 1 P25 Th. balcanus Pseudomarginati 43.37 22.62 2 P26 Th. balcanus Pseudomarginati 43.27 22.81 3 P27 Th. balcanus Pseudomarginati 43.25 22.81 3 P28 Th. balcanus Pseudomarginati 44.17 21.12 3 P29 Th. balcanus Pseudomarginati 44.17 21.12 2 P30 Th. moesiacus Pseudomarginati 43.88 20.66 3 P31 Th. moesiacus Pseudomarginati 43.61 20.55 3 P32 Th. praecox Pseudomarginati 44.18 22.14 3 2.2.2 Ekstrakcija DNA i AFLP analiza Totalna genomska DNA je ekstrkovana iz 20mg suvih listova sušenih u silika gelu upotrebom DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen ® ). Koncentracija DNA je merena upotrebom Qubit Fluorometer (Invitrogen ® ). AFLP je izveden u skladu sa protokolom kako su ga opisali Vos et al. (1995), ali uz nekoliko modifikacija. Restrikciona digestija i ligacija adaptera su vršene simultano na 200ng genomske DNA u totalnoj zapremini 48 33µl u trajanju od 2 sata na 37ºC, a potom 14 sati na 23ºC. Restrikciona digestija i ligacija adaptera, preamplifikacija i selektivna amplifikacija su izvoĊene na GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems ® ). Za amplifikaciju je izabrano osam kombinacija prajmera, i to:  FAM-EcoRIACA+Tru1ICAG,  NED-EcoRIAGC+Tru1ICGG,  VIC-EcoRIACGC+Tru1ICAG,  PET-EcoRIATG+Tru1ICGG,  FAM-EcoRIACT+Tru1ICAG,  NED-EcoRIAGC+Tru1ICAG,  VIC-EcoRIACG+Tru1ICGA i  PET-EcoRIACC+Tru1ICGA. Pripremljeni uzorci su detektovani pomoću ABI3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems ®). Prisustvo ili odsustvo fragmenata je zabeleţeno sa GeneMapper 4.0 software (Applied Biosystems ®). Svi fragmenti izmeĊu 50 i 500 bp su zabeleţeni. Dobijeni pikovi su automatski prebaĉeni u binarni matriks. Ukolio je pik prelazio apsolutnu vrednost od 50, prema automatskom podešavanju donje granice amplitude GeneMapper 4.0, pik je bio registrovan kao prisutan (1), a u suprotnom kao odsutan (0). 2.2.3 Analiza podataka Šenonov inforamacioni indeks kao mera diverziteta AFLP unutar vrste je raĉunat kao Hj = -Σ (pi log2 pi), gde je pi fenotipska frekvencija (Lewontin, 1972). Šenonov indeks je korišćen i za izraţavanje totalnog diverziteta (Ht) kao i za proseĉni intraspecijski diverzitet (Hsp) i proporciju diverziteta unutar (Hsp/Ht) i meĊu vrstama [(Ht–Hsp)/Ht]. Analiza molekularne varijanse (AMOVA; Excoffier et al., 1992) je sprovedena na Nei i Lievoj matrici udaljenosti meĊu jedinkama upotrebom Arlequin ver. 2.000 (Schneider et al., 2000). 49 Dvosmerna AMOVA je korišćena da bi se totalna varijansa rašĉlanila meĊu vrstama, meĊu populacijama unutar vrsta i unutar populacionih komponenti. Dodatne jednosmerne AMOVA-e su sprovedene da bi se totalna varijabilnost rašĉlanila na, meĊu i unutar populacionu komponentu svake vrste Thynus (osim Th. praecox kod kojega je ispitivana samo jedna populacija). Komponentne varijanse su testirane statistiĉki neparametarskim nasumiĉnim testom uz upotrebu 10.000 permutacija. MeĊusobno poreĊenje vrsta pomoću AMOVA-e rezultovalo je sa ST vrednostima koje su ekvivalentne totalnoj varijansi koja je podeljena izmeĊu dve vrste i moţe biti interpretirana kao proseĉna meĊuspecijska udaljenost izmeĊu bilo koje dve vrste (Huff, 1997). Klaster analiza zasnovana na Nei i Lijevoj matrici rastojanja izmeĊu individual je izvedena upotrebom Neighbour Joining metoda (Saitou i Nei, 1987)primenom TREECON for Windows ver. 1.3 b (Van de Peer i De Wachter, 1994). Bootstrap analiza je izvršena na 1000 bootstrap uzoraka (Felsenstein, 1985). Modelno zasnovan klasterski metod je primenjen na multilocus AFLP podatke da bi se dobila genetska struktura i odredio broj klastera u skupu podataka upotrebom softvera STRUCTURE (Pritchard et al., 2000). Za datu vrednost broja klastera, ovaj metod pridruţuje pojedinaĉne genotipove iz ukupnog uzorka klasterima na takav naĉin da neuravnoteţenost povezivanja (LD) bude najbolje objašnjena. Za svaku vrednost K izvršeno je 10 prolaza uzimajući broj klastera (K) od 1 do 10. Svaki prolaz se sastojao od burn-in perioda od 20.000 koraka, posle ĉega je izvršeno 105 MCMC (Monte Carlo Markov Chain) replikacija uz pretpostavku admixture modela i korelacije alelskih frekvencija. Nisu korišćene nikakve prethodne informacije za definisanje klastera. Izbor najverovatnijeg broja klastera (K) izvršen je uporeĊivanjem proseĉnih procena sliĉnosti podataka ln[Pr(X|K)], za svaku vrednost K (Pritchard et al. 2000), kao i izraĉunavanjem ad hoc statistike ΔK, zasnovane na stopi promene logaritma verovatnoće podataka za uzastopne vrednosti K, kako je opisano u Evanno et al. (2005). 50 3. Rezultati 3.1 Fitohemijska ispitivanja 3.1.1 Etarska ulja U etarskim uljima ispitivanih populacija roda Thymus sa podruĉja Srbije utvrĊeno je prisustvo ukupno 103 jedinjenja, dok se uĉešće determinisanih jedinjenja kretalo od 88.98% kod Th. praecox (P32) do 99.47% kod Th. glabrescens (P13). Najbrojnija grupa jedinjenja, sa ukupno 39 detrerminisanih komponenti, su seskviterpenski ugljovodonici. Nakon njih po brojnosti dolaze oksigenovani monoterpenski ugljovodonici, sa ukupno 30 jedinjenja, i monoterpenski ugljovodonici sa 17 jedinjenja. Osim toga, u sastav etarskih ulja ispitivanih vrsta roda Thymus, ulaze i 4 aromatiĉna ugljovodonika, 3 oksigenovana seskviterpenaska ugljovodonika, 3 fenolna jedinjenja, 3 nezasićena alkohola, 2 fenolna etra i po 1 nezasićeni alkohol i keton. 3.1.1.1 Sastav etraskih ulja Thymus pulegioides Kod sedam ispitivanih populacija vrste Th. pulegioides utvrĊeno je prisustvo 73 komponente u etarskim uljima, i to 16 monoterpenskih ugljovodonika, 18 oksigenovanih ugljovodonika, 26 seskviterpenskih ugljovodonika i 12 jedinjenja koja ne pripadaju ni jednoj od tri glavne grupe (Tabela 3.1) . Kod populacije P02 determinisana je ukupno 41 komponenta, kod populacije P05 i populacije P01 39 komponenti, kod populacije P06 38 komponenti, kod populacije P03 32 komponente, kod populacije P04 30 i kod populacije P09 26 komponenti. Monoterpenski ugljovodonici: U etarskim uljima ispitivanih populacija Th. pulegioides identifikovano je prisustvo 16 monoterpenskih ugljovodonika. Uĉešće ove grupe jedinjenja kretao se od 0,86%, kod populacije P06, do 27,01%, kod populacije P02. U etarskim uljima populacije P06 od 10 jedinjejna iz ove grupe ni jedno nije imalo 51 znaĉajnu zastupljenost, što je bio sluĉaj i kod populacija P01 (11 jedinjenja, 0,95%), P04 (11 jedinjenja, 3,44%), P03 (12 jedinjenja, 1,21%), P09 (8 jedinjenja, 2,64%) i P05 (13 jedinjenja, 6,56%). Kod populacije P02 pojedinaĉno je jedino γ-terpinen imao koncentraciju od 21,39%. Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici: Uĉešće ove grube jedinjenja u etarskim uljima ispitivanih populacija se kretalo od 0,27%, kod populacije P04, pa do 88,60% kod populacije P03 . Koncentracija oksigenovanih monoterpensjih ugljovodonika je bila visoka i kod populacija P06 (87,47%) i P01 (87,32%). Kod ove tri populacije najzastupljenija komponenta etarskih ulja bio je geraniol sa 87,92% kod populacije sa P03, 87,12% kod populacije P01 i 86,97% kod populacije P06. U preostalim populacijama ni jedno iz ove grupe jedinjenja nije bilo zastupljeno u znaĉajnijem procentu. Seskviterpenski ugljovodonici: Ova grupa jedinjenja nije bila znaĉajnije zastupljena u etarskim uljima ni jedne ispitivane populacije. Kod populacije P06 17 jedinjenja ĉinilo je ukupno 8,93%, kod populacije P01 19 jedinjenja ĉinilo je ukupno 8,48%, kod populacije P02 12 jedinjenja ĉinilo je ukupno 7,53%, kod populacije P03 10 jedinjenja ĉinilo je ukupno 6,50%, kod populacije P04 7 jedinjenja ĉinilo je ukupno 6,27%, kod populacije P05 10 jedinjenja ĉinilo je ukupno i kod populacije P09 3 jedinjenja ĉinilo je ukupno 3,69%. Ostala jedinjenja: Kod ispitivanih populacija Th. pulegioides utvrĊeno je prisustvo 12 jedinjenja koja ne pripadaju ni jednoj od gore pomenutih grupa. Timol, koji je fenolno jedinjenje je glavna komponenta u etarskim uljima populacija P02 sa 52,95% i u etarskim uljima populacije P05 sa 62,92%. Timol je znaĉajno zastupljen i kod populacije P09 sa 22,12%. Cimen, koji je aromatiĉni ugljovodonik, je glavna komponenta etarskih ulja kod populacije P09 sa 48,59% i P04 sa 42,59% kod koje je znaĉajno zastupleno i fenolno jedinjenje karvakrol sa 39,95%. U etarskim uljima populacija P03 , P01 i P06 ova jedinjenja nisu znaĉajno zastupljena. 52 3.1.1.2 Sastav etarskih ulja Thymus glabrescens Kod sedam ispitivanih populacija Th. glabrescens u etarskim uljima je determinisano ukupno 73 jedinjenja, koja se mogu svrstati u tri osnovne grupe jedinjenja, monoterpenski ugljovodonici, sa 17 jedinjenja, oksigenovani monoterpenski ugljovodonici, sa 12 jedinjenja, i seskviterpenski ugljovodonic, sa 31 jedinjenjem. TakoĊe, utvrĊeno je i prisustvo 11 jedinjenja koja ne pripadaju ni jednoj od ovih grupa (Tabela 3.2). Etarska ulja populacije P10 imala su 53 determinisane komponente, kod populacije P13 47, kod populacije P11 41, kod populacije P33 34, kod populacije P12 50, kod populacije P14 41 i populacije P15 31 komponenta. Monoterpenski ugljovodonici: Kod ispitivanih populacija ove vrste determinisano je bilo 17 monoterpenskih ugljovodonika i njihova zastupljenost se kretala od 3,04% kod populacije P33 do 37,08% kod populacije P15. U etarskim uljima populacije P10 utvrĊeno je prisustvo 15 monoterpenskih ugljovodonika (17,25%) i jedino je γ-terpinen prisutan u znaĉajnijoj koncentraciji od 11,91%. Kod populacije P13 13 jedinjenja iz ove grupe ĉinilo je ukupno 14,02% etarskih ulja, a γ-terpinen je jedino jedinjenje sa znaĉajnijom koncentracijom od 10,67%. Kod populacije P11 determinisano je 16 komponenti iz ove grupe koje su ĉinile 6,95% etarskih ulja, pri ĉemu ni jedna komponenta nije imala znaĉajniji procenat. Etarska ulja populacije P33 sadrţala su 11 monoterpenskih ugljovodonika, koja su uĉestvovala sa 3,04%. U etarskim uljima populacije P12 utvrĊeno je prisustvo 14 jedinjenja iz ove grupe koja su ĉinila 27,22%, pri ĉemu je γ-terpinen bio zastupljen sa 19,61%. Kod populacije P14 od 11 monoterpenskih ugljovodonika, koji su ĉinili ukupno 18,55%, γ-terpinen je bio najzastupljeniji sa 13,25%. U etarskim uljima populacije P15 13 monoterpenskih ugljovodonika ĉinilo je 37,08% i γ-terpinen je bio druga po zastupljenosti komponenta sa 31,26%. Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici: U etarskim uljima ispitivanih populacija Th. glabrescens utvrĊeno je prisustvo ukupno 12 oksigenovanih monoterpenskih jedinjenja ĉija se zastupljenosst kretala od 1,38%, kod populacije P13 (6 jedinjenja) do 7,06% kod populacije P12 (8 jedinjenja). Ni jedno jedinjenje iz ove grupe nije imalo znaĉajne procese, Kod populacije P10 8 jedinjenja iz ove grupe ĉinilo je ukupno 3,33%, kod populacije P11 4 jedinjenja iz ove grupe ĉinila su 6,66%, kod 53 populacije P33 4 jedinjenja ĉinila su 2,54%, kod populacije P14 7 jedinjenja ĉinilo je 4,93% i kod populacije P15 4 jedinjenja ukupno 1,54%. Seskviterpenski ugljovodonici: Determinisano je ukupno 31 jedinjenje koje pripada ovoj grupi i njihova se zastupljenost kretala od 5,06%, kod populacije P11 (11 jedinjenja) do 10,10% kod populacije P13 (19 jedinjenja). U etarskim uljima ni jedne populacije pojedinaĉna jedinjenja iz ove grupe nisu imala znaĉajniji procenat. U etarskim uljima populacije P10 18 seskvi terpenskih ugljovodonika ĉinilo je 5,24%, kod populacije P33 10 jedinjenja ĉinilo je 7,27%, kod populacije P12 19 jedinjenja ĉinilo je 9,82%, kod populacije P14 13 jedinjenja ĉinilo je 6,85% i kod populacije P15 7 jedinjenja ĉinilo je 6,06%. Ostala jedinjenja: Kod ispitivanih populacija Th. glabrescens utvrĊeno je prisustvo 13 jedinjenja koja ne pripadaju ni jednoj od gore pomenutih grupa. Timol, koji je fenolno jedinjenje je glavna komponenta u etarskim uljima populacija P10 (56,29%), P13 (64,51%), P11 (61,94%) i P15 (44,53%). Cimen, koji je aromatiĉni ugljovodonik, je glavna komponenta etarskih ulja kod populacije P33 (75,76%) i kod populacije P14 (42,56%). Populacija P14 ima takoĊe i visoko uĉeše timola u etarskim uljima od 16,56%. Etarska ulja populacije P12 sadrţe 19,02% timola, 18,43% cimena i 13,11% timol metil etra. 3.1.1.3 Sastav etraskih ulja Thymus marschallianus Kod tri ispitivane populacije vrste Th. marschallianus ustanovljeno je prisustvo ukupno 65 komponenata etarskih ulja. Prisutne su bile tri glavne grupe jedinjenja, monoterpenski ugljovodonici, sa 17 jedinjenja, oksigenovani monoterpenski ugljovodonici, sa 11 jedinjenja, i seskviterpenski ugljovodonic, sa 27 jedinjenja (Tabela 3.3). U etarskim uljima populacije P16 bilo je determinisano 45 komponenti, kod populacije iz Gtrebenca 53 komponente, a kod populacije P18 44 komponente. Monoterpenski ugljovodonici: U etarskim uljima ispitivanih populacija Th. marschallianus je utvrĊeno prisustvo 17 monoterpenskih ugljovodonika. Njihova se zastupljenost kretala od 7,49% kod populacije P17 do 20,04% kod populcije P16. U etarskim uljima populacije P17 bilo je prisutno ukupno 11 monoterpenskih ugljovodonika, i jedino je silvestren imao znaĉajniju koncentraciju od 3,75%. Kod 54 etarskih ulja populcije P18 od 11 monoterpenskih ugljovodonika ĉinili su zajedno 14,38% i samo je α-pinen bio prisutan u znaĉajnom procentu (11,29%). Kod populacije P16 bilo je prisutno 14 monoterpenskih ugljovodonika, pri ĉemu su (E)-β-Ocimen (9,75%) i mircen (4,75%) imali znaĉajne koncentracije. Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici: Kod populacija Th. marschallianus, obuhvaćenih ispitivanjem, utvrĊeno je prisustvo 11 oksigenovanih monoterpenski ugljovodonika ĉija se zastupljenost kretala od 3,58% kod populacije P16 do 8,42% kod populacije P17. U etarskim uljima populacije P17 od ukupno 9 jedinjenja iz ove grupe ni jedno nije imalo neku znaĉajniju koncentraciju, što je bio sluĉaj i od ukupno 6 jedinjenja kod populacije P16 tj. 7 kod populacije P18. Seskviterpenski ugljovodonici: U etarskim uljima kod ispitivanih populacija Th. marschallianus, ova grupa jedinjenja je bila najzastupljenija. Prisustvo seskviterpenskih ugljovodonika se kretalo od 64,04%, kod populacije P16, do 79,98%, kod populacije P18. Kod populacije P17 bio je 67,50%. Kod populacije P16 konstatovano je prisustvo 18 komponenti iz ove grupe i germakren-D je imao koncentraciju od 34%, a biciklogermakren 12,30%. Kod populacije P17 determinisano je 24 seskviterpenska ulgjovodonika i germakren-D je bio zastupljen sa 20,40%, a znaĉajnu koncentraciju je imao i (E)-kariofilen sa 14,57%. Kod populacije P18, determinisano je 20 jedinjenja iz ove grupe i germakren-D je bio glavna komponenta sa zastupljenošću od 66,66%. Ostala jedinjenja: Kod tri ispitivane populacije Th. marschallianus, utvrĊeno je prisustvo ukupno 10 jedinjenja koja nisu pripadala ni jednoj od prethodnih grupa. Ova jedinjenja su bila zastupljena u malom procentu kod sve tri populacija, od 1,82%, kod populacije P18 do 8,52% kod populacije P17 i 5,32% kod populacije P16. 3.1.1.4 Sastav etarskih ulja Thymus pannonicus Kod šest ispitivanih populacija vrste Th. pannonicus ustanovljeno je prisustvo ukupno 78 komponenata etarskih ulja. Prisutne su bile tri glavne grupe jedinjenja, monoterpenski ugljovodonici, sa 15 jedinjenja, oksigenovani monoterpenski ugljovodonici, sa 18 jedinjenja, i seskviterpenski ugljovodonic, sa 32 jedinjenja (Tabela 3.4). Etarska ulja populacije P21 sadrţala su ukupno 40 komponenti, populacija iz 55 Vršca, P19 i Ponorišta sadarţala su ukupno 41 komponentu, a kod populacija P20 i P22 49 komponenti. Monoterpenski ugljovodonici: Kod popoulacija Th. pannonicus utvrĊeno je prisustvo 15 razliĉitih monoterpenskih ugljovodonika i njhova procentualna zastupljenost u etarskim uljim se kretala od 0,49% kod populacije iz Vršca do 59,39% kod populacije P19. U uljima populacije P23 determinisano je 9 jedinjenja iz ove grupe i sva su bila u koncentracijama ispod 1% . Kod populacije P19 u etarskim uljima je bilo prisutno 14 monoterpenskih jedinjenja i ona su predstavljala glavnu grupu jedinjenja sa 59,39%. MeĊu njima najveću koncentraciju imao je α-pinen sa 19.90%, a slede ga (E)- β-ocimen (14,24%) i limonene (12,45%). 14 monoterpenskih ugljovodonik saĉinjavali su 32,45% etarskih ulja kod populacije P19, α-pinen je ĉinio 13,88%, dok su miceren i (E)-β-ocimen ĉinili 7,56% i 5,61%. Ostale komponente nisu prelazile 5%. U etarskim uljima P22, prisutno je bilo 13 monoterpenskih ugljovodonika i ova grupa jedinjenja je ĉinila 35,33% od ukupnog sastava, s time da je limonene predstavljao 24,82% a (E)-β- ocimen 6,56%, dok ostale komponente nisu prelazile ni 1%. Kod populacije P21 u etarskim uljim nalazilo se 14 monoterpenskih ugljo vodonika, koji su zajedno ĉinili 7,93%, pri ĉemu ni jedna komponenta nije prelazila 5%. Kod populacije P34 prisutno je bilo 13 jedinjenja iz ove gruope, koja su zajedno ĉinila 35,14% ukupnih etarskih ulja, od kojih je samo miceren (25,85%) imao znaĉajnu koncentraciju. Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici: Kod ispitivanih populacija Th. pannonicus utvrĊeno je prisustvo 18 oksigenovanih monoterpenskih ugljovodnika i njihova koncentracija se kretala od 2,58% kod populacije P20 do 88,14% kod populacije P23. Kod populacije P23 nalazilo se 11 oksigenovanih monoterpenskih ugljovodonika i ovo je bila glavna grupa jedinjenja u etarskim uljima ove populacije, pri ĉemu izuzetno visoku koncentraciju su imali neral i geranijal, sa 34,05% odnosno 51,74%. Ostala jedinjenja iz ove grupe nisu prelazila 1%. U etarskim uljima populacije P19 prisutno je bilo 5 jedinjenja iz ove grupe i jedino 1, 8-cineol (8,21%) i kamfor (7,58%) su imali znaĉajnije koncentracije. Kod populacije P20 ovoj grupi jedinjenja je pripadalo 5 komponenti koje su zajedno ĉinile 2,58% etarskih ulja, pri ĉemu ni jedna komponenta nije dostizala niti 1%. U etarskim uljima populacije P22 konstatovano je prisustvo 9 jedinjenja iz ove gupe i jedino je 1, 8-cineol imao znaĉajniju koncentraciju od 5,65%. Kod populacije P21 ova grupa jedinjenja je bila predstavljena sa 7 56 komponenti i sa zastupljenošću od 75,61% predstavljala je glavnu grupu jedinjenja. Linalool je bio prisutan u koncentraciji od 66,06% i jedino je jos kamfor bio prisutan u znaĉajnijoj koncentraciji od 6,01%. 5 oksigenovanih monoterpenskih ugljovodonika ĉinili su 23,83% etarskih ulja kod populacije P34, pri ĉemu je jedino α-terpineol bio u znaĉajnoj koncentraciji (20,01%). Seskviterpenski ugljovodonici: U etarskim uljimaetarskim uljima ispitivanih populacija Th. pannonicus utvrĊeno je prisustvo 32 seskviterpenska ugljovodonika i njihovo uĉešće se kretalo od 1,85% kod populacije P23 do 58,17% kod populacije P20. Ukupno 13 jedinjenja iz ove grupe nalazilo se u etarskim uljima populacije P23 i ni jedno nije nije bilo zastupljeno u znaĉajnom procentu. U etarskim uljima populacije P19 ova grupa jedinjenja je bila predstavljena sa 17 komponenti koje su zajedno ĉinile 13,01% ukupnih ulja, pri ĉemu ni jedna pojedinaĉna komponenta nije dostizala 5%. Kod populacije P20 seskviterpenski ugljovodonici predstavljali su glavnu grupu jedinjenja i po broju komponenti, 22, i po zastupljenosti, 58,17%, s time da je germakren-D bio glavna komponenta etarskih ulja sa 36,91%. U etarskim uljima populacije P22 nalazilo se ukupno 19 seskviterpenskih ugljovodonika koj su zajedno ĉinili 53,35% i predstavljali glavnu grupu jedinjenja. Najzastupljeniji je bio (E)- kariofilen sa 40,30% i jedino je još α-humulen imao znaĉajniju zastupljenost sa 6,15%. Kod populacije P21, nalazilo se ukupno 14 jedinjenja iz ove grupe i ĉinila su 14,09% pri ĉemu je jedino β-biosabolen imao koncentraciju od 7,76%. Kod populacije P34 determinisano je 19 jedinjenja iz ove grupe koja ĉine 35,63% etarskih ulja, pri ĉemu dva jedinjenja imaju pribliţno jednake koncentracije, (E)-kariofilen (11,75%) i (E)-γ- bisabolen (11,93%), dok je germakren-D zastupljen sa 6,29%. Ostala jedinjenja: U etarskim uljima kod šest ispitivanih populacija Th. pannonicus utvrĊeno je bilo i prisustvo 13 komponenti koje ne pripadaju ni jednoj od prethodnih grupa jedinjenja i njihova ukupna zastupljenost se kretala od 0,36% kod populacije P34 do 2,37% kod populacije P23. Ni jedna pojedinaĉna komponenta nije imala znaĉajniji procenat. 57 3.1.1.5 Sastav etarskih ulja Thymus balcanus U ispitivanje je bilo ukljuĉeno ĉetiri populacije Th. balcanus u ĉijim je etarskim uljima bilo determinisano ukupno 60 komponenti (Tabela 3.5). Poulacija P25 je imala 46 determinisanih komponenti, populacija P26 49 komponenti, populacija P24 48, a populacija P27 33 komponente. Monoterpenski ugljovodonici: Sadrţaj ove grupe jedinjenja se kretao od 7,93%, kod populacije Babinog zuba (12 komponenti), do 30,27%, kod populacije P27 (12 komponenti). Kod populacije P24 13 monoterpenskih ugljovodonika u etarskim uljima ĉinilo je 27, 37%, a u etrarskim uljima popuulacije P26 14 komponenti je ĉinilo 11,84%. Pojedinaĉno je samo mircen bio znaĉajno zastupljen i to 18,08% u etarskim uljima populacije P24, 14,24% u etarskim uljima populacije P27, 7,51% u etarskim uljima populacije P26 i 4,26% u etarskim uljima populacije P25. Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici: Kod ispitivanih populacija Th. balcanus sadrţaj ove grupe jedinjenja se kretao od 43,46%, kod populacije P24 gde je determinisano 12 ovih komponenti, do 60,22%, kod populacije P27 gde je determinisano 8 jedinjenja iz ove grupe. U etarskim uljima populacije P25 utvrĊeno je prisustvo 10 oksigenovanih monoterpenskih ugljo vodonika koji su ukupno ĉinili 54,50%, a kod populacije P26 12 jedinjenja iz ove grupe ĉinilo je 53,30% etarskih ulja. Kod populacije P25 znaĉajnu kocentraciju, od jedinjenja koja pripadaju ovoj grupi, su imali geranial (19,06%), neral (12,70%) i neril acetat (12,44%). U preostale tri populacije jedinjenja koja su bila sa znaĉajnom koncentracijom su linalol i linalil acetat. Kod populacije P26 linalil acetat je imao koncentraciju od 33,89% i bio je najzastupljenija komponenta etarsih ulja, dok je linalol imao koncentraciju od 17,05%. Kod populacije P24 linalil acetat je sa 22,94% takoĊe bio najzastupljenija komponenta etarskih ulja, dok je linalol imao koncentraciju od 11,74%. Kod populacije P27 linalol je, sa 34,42%, bio najzastupljenija komponenta, a linalil acetat je imao koncentraciju od 14,56%. Seskviterpenski ugljovodonici: Sadrţaj seskviterpenskih ugljovodonika u etarskim uljim ispitivanih populacija Th. balcanus se kretao od 3,57%, kod populacije P27 (9 jedinjenja), do 27,04%, kod populacije P26 (17 jedinjenja). Kod populacije P24 17 jedinjenja iz ove grupe ĉinilo je 21,01% etarskih ulja, dok je 18 jedinjenja iz ove 58 grup ĉinilo 20,67% etarskih ulja populacije P25. Od pojedinaĉnih komponenti, jedino je biciklogermakren imao koncentraciju od 11,88% u etarskim uljima populacije P26. Ostala jedinjenja: Sadrţaj ostalih jedinjenja u etarskim uljuima ispitivanih populacija je bio veoma nizak. Najveći je bio kod populacije P25, 11,73%, dok je kod populacije P24 bio 2,73%, kod populacije P26 0,88% i kod populacije P27 0,83%. 3.1.1.6 Sastav etarskih ulja Thymus moesiacus U ispitivanja je bila ukljuĉena samo jedna populacija vrste Th. moesiacus, P31, u ĉijem su etarskom ulju determinisane 44 komponente tj. 98,04% (Tabela 3.5). Monoterpenski ugljovodonici: Ova grupa jedinjenja imala je 14 komponenti i ĉinala je ukupno 13,91%. Ni jedno jedinjenje iz ove grupe nije pojedinaĉno uĉestvovalo u znaĉajnoj koncentraciji u sastavu etarskih ulja. Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici: U etarskim uljima ispitivane populacije Th. moesiacus determinisano je 11 jedinjenja iz ove grupe i ona su ĉinila 81,97%. Glavna komponenta etarskih ulja ove populacije je bio α-terpinil acetat sa 66,59%. Seskviterpenski ugljovodonici: Ukupno 12 jedinjenja iz ove grupe ĉinilo je svega 1,74% etarskih ulja ispitivane populacije. Ostala jedinjenja: Ukupno 7 jedinjenja nije pripadalo ni jednoj od galvnih grupa i ona su zajedno ĉinila 0,43% etarskih ulja ove populacije. 3.1.1.7 Sastav etarskih ulja Thymus praecox U ova ispitivanja je bila ukljuĉena samo jedna populacija vrste Th. praecox, P32. Kod ove populacije determinisano je ukupno 47 komponenti koje su ĉinile 88,98% etarskih ulja (Tabela 3.5). Monoterpenski ugljovodonici: Ova grupa jedinjenja imala je 13 komponenti i ĉinala je ukupno 12,33%. Ni jedno jedinjenje iz ove grupe nije pojedinaĉno uĉestvovalo u znaĉajnoj koncentraciji u sastavu etarskih ulja. 59 Oksigenovani monoterpenski ugljovodonici: Ukupno 7 jedinjenja iz ove grupe ĉinilo je 8,67% etarskih ulja. Ni jedno jedinjenje pojedinaĉno nije imalo znaĉajiju zastupljenost. Seskviterpenski ugljovodonici: Ova grupa jedinjenja je bila najzastupljenija u etarskim uljima ispitivane populacije vrste Th. praecox. Determinisano je bilo ukupno 19 seskviterpenskih ugljovodonika koji su ĉinili 62,96% etarskih ulja. Najznaĉajnije komponente su bile (E)-kariofilen sa 20,48%, γ-kadinen sa 17,84% i germakren-D sa 7,72%. Ostala jedinjenja: Kod ispitivane populacije Th. praecox utrvĊeno je prisustvo 8 jedinjenja koja ne pripadaju ni jednoj od navedenih grupa i ĉine ukupno 5,02% etarskih ulja i ni jedna pojedinaĉna komponenta nije zastupljena u znaĉajnoj koncentraciji. 60 Tabela 3.1 Sastav etarskog ulja Th. pulegioides. Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P01 P02 P03 P04 P05 P06 P09 Tricyclene 927 MH - 0.02 0.02 - - - - α-Thujene 930 MH 0.01 0.83 0.01 0.73 0.75 - 1.15 α-Pinene 939 MH 0.02 0.73 0.08 0.40 0.40 0.01 0.60 Camphene 954 MH 0.03 0.76 0.15 0.04 0.05 0.01 0.25 Sabinene 975 MH - 0.02 - 0.02 0.02 - - β-Pinene 979 MH - 0.11 0.01 0.09 0.09 - 0.14 Myrcene 991 MH 0.45 1.14 0.50 0.09 0.49 0.42 0.01 α-Phellandrene 1003 MH 0.03 0.19 - 0.04 0.09 0.04 - α-Terpinene 1017 MH 0.02 1.45 0.02 0.51 0.73 0.02 0.10 Limonene 1029 MH 0.08 0.17 0.09 - - 0.06 0.12 β-Phellandrene 1030 MH - 0.08 - - - - - Sylvestrene 1031 MH - - - - 0.14 - - (Z)-β-Ocimene 1037 MH 0.11 0.04 0.12 0.01 0.03 0.10 - (E)-β-Ocimene 1050 MH 0.17 0.03 0.17 - 0.01 0.16 - γ-Terpinene 1060 MH 0.02 21.39 0.01 1.51 3.71 0.03 0.27 Terpinolene 1089 MH 0.02 0.04 0.03 0.02 0.04 0.02 - cis-Dehydroxy-linalool oxide 1008 OMHD - - - - - - - (Z)-Sabinene hydrate 1067 OMHD - - - - - - 0.11 trans-Furanoid-linalool oxide 1073 OMHD - - - - - - - Linalool 1097 OMHD 0.12 0.05 - - - 0.11 0.21 α-Pinene oxide 1099 OMHD - 0.01 0.10 0.03 0.11 0.07 0.05 Camphor 1146 OMHD - - 0.01 - - - - 61 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P01 P02 P03 P04 P05 P06 P09 β-Pinene oxide 1159 OMHD 0.02 - - - - - - Borneol 1169 OMHD 0.06 1.57 0.37 0.03 0.04 0.01 0.61 3-Thujanol 1169 OMHD - - 0.01 0.09 0.04 - - trans-Dihydro carvone 1209 OMHD - - - - 0.01 - - Nerol 1230 OMHD - - - - - - - Neral 1238 OMHD - - - - - - - Thymoquinone 1252 OMHD - - - 0.11 3.09 - 5.49 Geraniol 1253 OMHD 87.12 - 87.92 - - 86.97 - Geranial 1267 OMHD - - - - - - - Bornyl acetate 1289 OMHD - 0.02 0.02 - - - 0.08 Methyl geranate 1325 OMHD - - 0.18 - - - - Geranyl acetate 1381 OMHD - - - - - 0.31 - Caryophyllene oxide 1583 R 0.02 0.02 - 0.44 0.08 - - p-Cymene 1025 R - 4.89 - 42.59 17.36 0.01 48.59 m-Cymenene 1085 R - - - - - - 0.04 p-Cymenene 1091 R - - - - 0.03 - - 3-Octanone 984 R 0.05 0.12 0.06 0.01 0.10 0.10 6.14 Thymol 1290 R 0.05 52.95 - 0.05 62.82 0.07 22.12 Carvacrol 1299 R - 0.14 - 39.95 0.61 - 0.04 Thymohydroquinone 1555 R - - - 2.72 0.46 - - Thymol methyl ether 1235 R - 2.75 - 0.91 0.91 - 4.05 Carvacrol methyl ether 1245 R - 1.14 - - 0.93 0.03 2.68 3-Octanol 991 R 0.35 0.04 0.11 - 0.03 1.10 0.63 Oct-1-en-3-ol 979 R 0.39 1.19 0.26 0.20 1.14 0.05 0.95 Bergamol 1057 R - - - - - - - 62 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P01 P02 P03 P04 P05 P06 P09 α-Cubebene 1351 SH 0.01 - - - - 0.03 - α-Copaene 1377 SH 0.02 0.01 - - - 0.01 - β-Bourbonene 1388 SH - - 0.03 - - - 0.09 α-Bourbonene 1390 SH 0.14 0.02 - 0.02 0.01 0.15 - β-Elemene 1391 SH 0.01 - - - - - - (E)-Caryophyllene 1419 SH 2.71 0.86 1.87 6.00 0.66 0.19 0.19 β-Copaene 1432 SH 0.03 0.01 - 0.01 - 0.02 - trans-α Bergamotene 1435 SH 0.02 0.02 0.03 - 0.01 0.03 - Aromadendrene 1441 SH - - - - - 0.02 - trans-β-Farnesene 1443 SH - - - - 0.16 0.01 - trans-Muurola-3,5 diene 1454 SH 0.01 - 0.01 - - - - α-Humulene 1455 SH 0.27 0.04 - 0.14 0.04 - - Alloaromadendrene 1460 SH 0.01 - 0.08 - - 0.05 - γ -Muurolene 1480 SH 0.04 0.06 - - - - - α-Amorphene 1485 SH - 0.01 - 0.01 - - - Germacrene-D 1485 SH 1.69 0.02 0.08 0.02 - 0.55 - γ-Amorphene 1496 SH - - - - - 0.02 - Bicyclogermacrene 1500 SH 0.01 - 0.10 - 0.01 0.46 - α-Muurolene 1500 SH 0.02 0.01 - - 0.01 - - β-Bisabolene 1506 SH 3.40 6.47 4.24 0.08 3.70 7.28 3.41 δ-Amorphene 1512 SH - - - - - 0.02 - γ-Cadinene 1514 SH 0.02 - - - - - - β-Sesquiphellandrene 1523 SH 0.05 - 0.06 - 0.04 0.07 - trans-Cadina-1,4 diene 1535 SH 0.01 - - - - - - α-Cadinene 1539 SH 0.02 - - - - - - 63 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P01 P02 P03 P04 P05 P06 P09 β-Atlantol 1608 SH - - - - 0.01 0.02 - Procenat determinacije 97.62 99.43 96.75 96.84 98.97 98.63 98.13 KI – Kovaĉev indeks; MH – monoterpenski ugljovodonici; OMHD – oksigenovani monoterpenski ugljovodonici; R – ostala jedinjenja; SH – seskviterpenski ugljovodonici; Tabela 3.2. Sastav etarskog ulja Th. glabrescens. Jedinjenje KI Literature Tip jedinje nja P10 P11 P12 P13 P14 P15 P33 Tricyclene 927 MH 0.02 0.04 0.06 - - - - α-Thujene 930 MH 0.98 0.73 1.28 0.56 1.35 0.98 0.76 α-Pinene 939 MH 0.64 0.78 1.46 0.34 1.00 0.39 0.39 Camphene 954 MH 0.49 0.82 2.13 0.08 1.01 0.07 0.09 Sabinene 975 MH 0.03 0.06 0.13 0.02 0.05 0.04 0.07 β-Pinene 979 MH 0.18 0.17 0.30 0.08 0.18 0.14 0.14 Myrcene 991 MH 1.26 0.58 0.80 1.00 0.45 1.21 0.05 α-Phellandrene 1003 MH 0.16 0.16 0.25 0.11 0.10 0.26 0.16 α-Terpinene 1017 MH 1.27 0.38 0.83 0.87 1.00 2.23 0.18 Limonene 1029 MH 0.13 0.21 0.28 0.11 0.13 0.23 0.17 β-Phellandrene 1030 MH 0.08 0.23 - 0.10 - 0.16 - Sylvestrene 1031 MH - 0.66 - - - - - (Z)-β-Ocimene 1037 MH - 0.04 - 0.03 - - - 64 Jedinjenje KI Literature Tip jedinje nja P10 P11 P12 P13 P14 P15 P33 Ocimene 1043 MH - 0.02 - - - - - (E)-β-Ocimene 1050 MH 0.03 - 0.02 - - 0.04 - γ-Terpinene 1060 MH 11.91 2.00 19.61 10.67 13.25 31.26 0.92 Terpinolene 1089 MH 0.04 0.08 0.06 0.06 0.03 0.06 0.13 1,8-Cineole 1031 OMH D 1.13 - 1.05 0.15 0.26 1.27 0.40 (Z)-Sabinene hydrate 1067 OMH D - - - 0.30 - - - Dehydro-linalool 1091 OMH D 0.34 - - - - - - Linalool 1097 OMH D - - 0.27 0.03 0.26 - - α-Pinene oxide 1099 OMH D 0.03 - 0.07 0.04 0.08 0.08 0.18 Camphor 1146 OMH D 0.01 - 0.01 - - - - β-Pinene oxide 1159 OMH D 0.02 0.12 - - - - - Borneol 1169 OMH D 0.66 1.51 3.36 0.12 2.33 - 0.12 3-Thujanol 1169 OMH D - 0.20 - - - - - α-Terpineol 1189 OMH D 0.04 - 0.08 - 0.04 0.07 - Thymoquinone 1252 OMH D 1.09 4.84 2.20 0.75 1.91 0.12 1.84 Bornyl acetate 1289 OMH D - - 0.02 - 0.05 - - Elemol 1550 R - - - - - - Spathulenol 1578 R 0.14 - 0.28 - - - - 65 Jedinjenje KI Literature Tip jedinje nja P10 P11 P12 P13 P14 P15 P33 Caryophyllene oxide 1583 R 0.05 0.03 0.06 0.05 0.08 - 0.14 p-Cymene 1025 R 9.76 11.40 18.43 5.38 42.56 3.98 75.76 m-Cymenene 1085 R 0.03 - - - - - - p-Cymenene 1091 R - - - - - - 0.12 3-Octanone 984 R 0.36 0.09 0.46 0.19 0.14 2.09 0.37 Thymol 1290 R 56.29 61.94 19.02 64.51 16.56 44.53 1.03 Carvacrol 1299 R 0.04 0.02 - 0.04 0.01 - - Thymohydroquinone 1555 R 0.05 0.09 0.06 - 0.43 - - Thymol methyl ether 1235 R 1.21 2.06 13.11 1.23 4.93 0.63 3.89 Carvacrol methyl ether 1245 R 2.49 2.46 1.65 1.82 1.52 1.04 1.10 3-Octanol 991 R 0.07 0.03 - 0.03 0.03 0.87 0.17 Oct-1-en-3-ol 979 R 1.75 0.10 0.62 0.71 0.31 0.30 1.22 α-Cubebene 1351 SH - - 0.02 - 0.01 - - α-Copaene 1377 SH 0.03 - 0.03 - - - - α-Bourbonene 1390 SH 0.05 0.21 0.17 0.13 0.08 - 0.15 β-Elemene 1391 SH 0.02 - - 0.01 - - - 7-epi-Sesquithujene 1391 SH - - - 0.06 - - - α-Funebrene 1403 SH - - 0.03 - - - - (E)-Caryophyllene 1419 SH 0.91 0.58 0.60 2.07 1.07 0.49 0.69 β-Copaene 1432 SH 0.03 0.06 0.07 0.05 0.04 - 0.05 trans-α Bergamotene 1435 SH 0.03 0.03 0.03 0.03 0.02 0.03 0.05 Aromadendrene 1441 SH 0.19 0.07 0.03 - - 0.09 0.04 trans-β-Farnesene 1443 SH - - - - - - - trans-Muurola-3,5 diene 1454 SH - 0.03 0.02 0.01 - - - 66 Jedinjenje KI Literature Tip jedinje nja P10 P11 P12 P13 P14 P15 P33 α-Humulene 1455 SH - - - 0.09 0.04 - - Alloaromadendrene 1460 SH 0.06 - 0.08 0.02 - - 0.08 Dehydro-aromadendrene 1463 SH - 0.08 - - - 0.07 - γ -Muurolene 1480 SH 0.16 0.09 0.10 0.32 0.11 0.20 0.05 α-Amorphene 1485 SH - - - 0.04 - - - Germacrene-D 1485 SH 0.03 - 0.69 0.01 0.14 0.24 0.07 γ-Amorphene 1496 SH - - 0.08 0.08 0.03 - - Viridiflorene 1497 SH 0.29 - - - - - - Bicyclogermacrene 1500 SH - 0.01 0.18 - - - - α-Muurolene 1500 SH 0.04 - - 0.02 0.03 - - (E,E)-α-Farnesene 1506 SH - - - 6.66 - - - β-Bisabolene 1506 SH 3.27 3.89 7.60 - 5.08 4.94 6.06 δ-Amorphene 1512 SH - - - 0.37 - - - γ-Cadinene 1514 SH 0.04 - - - 0.03 - - β-Sesquiphellandrene 1523 SH - - 0.05 0.07 - - 0.04 δ-Cadinene 1523 SH 0.04 - - - 0.15 - - trans-Cadina-1,4 diene 1535 SH 0.02 - 0.01 0.04 - - - α-Cadinene 1539 SH 0.01 - 0.02 0.03 - - - β-Atlantol 1608 SH 0.02 0.01 0.02 - - - - Procenat determinacije 98.06 96.90 97.78 99.47 96.89 98.12 96.65 KI – Kovaĉev indeks; MH – monoterpenski ugljovodonici; OMHD – oksigenovani monoterpenski ugljovodonici; R – ostala jedinjenja; SH – seskviterpenski ugljovodonici; 67 Tabela 3.3 Sastav etarskog ulja Th. marschallianus. Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P16 P17 P18 Tricyclene 927 MH 0.07 - - α-Thujene 930 MH 0.12 0.14 0.02 α-Pinene 939 MH 0.90 0.71 11.29 Camphene 954 MH 1.81 0.13 0.29 Sabinene 975 MH 0.13 0.24 0.11 β-Pinene 979 MH 0.25 0.26 0.23 Myrcene 991 MH 4.75 0.25 0.51 α-Phellandrene 1003 MH 0.15 0.13 0.13 α-Terpinene 1017 MH 0.06 0.09 - Limonene 1029 MH 0.81 - - β-Phellandrene 1030 MH - - - Sylvestrene 1031 MH - 3.75 0.95 (Z)-β-Ocimene 1037 MH 0.91 0.31 0.06 Ocimene 1043 MH - - - (E)-β-Ocimene 1050 MH 9.75 1.48 0.75 γ-Terpinene 1060 MH 0.24 - 0.05 Terpinolene 1089 MH 0.09 - - 1,8-Cineole 1031 OMHD 0.37 2.58 1.19 (Z)-Sabinene hydrate 1067 OMHD 0.34 0.39 0.11 Linalool 1097 OMHD 1.50 4.21 0.20 α-Pinene oxide 1099 OMHD 0.12 0.51 0.11 Camphor 1146 OMHD 1.15 - 0.36 68 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P16 P17 P18 Citronellal 1153 OMHD - 0.05 - δ-Terpineol 1166 OMHD - - 0.05 α-Terpineol 1189 OMHD 0.10 0.20 0.16 cis-Dihydro carvone 1203 OMHD - 0.15 - trans-Dihydro carvone 1209 OMHD - 0.06 - Thymoquinone 1252 OMHD - 0.29 - Elemol 1550 R - 0.29 - Spathulenol 1578 R 3.54 - - Caryophyllene oxide 1583 R 0.17 5.45 0.10 p-Cymene 1025 R 0.22 0.17 0.06 3-Octanone 984 R 0.39 0.44 0.25 Thymol 1290 R 0.24 0.88 0.20 Carvacrol 1299 R - 0.06 - Thymol methyl ether 1235 R - 0.16 - 3-Octanol 991 R 0.19 0.25 0.03 Oct-1-en-3-ol 979 R 0.58 0.82 1.17 α-Cubebene 1351 SH 0.26 0.42 0.11 α-Ylangene 1375 SH 0.11 0.14 0.08 α-Copaene 1377 SH 0.35 1.10 0.33 β-Bourbonene 1388 SH 2.59 9.17 2.31 α-Bourbonene 1390 SH - 0.76 1.02 β-Elemene 1391 SH 1.13 0.42 - (E)-Caryophyllene 1419 SH 4.03 14.57 2.53 β-Copaene 1432 SH 0.80 1.46 - 69 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P16 P17 P18 trans-α Bergamotene 1435 SH - 0.14 0.52 Aromadendrene 1441 SH 1.13 0.88 0.04 trans-Muurola-3,5 diene 1454 SH - 0.40 0.51 α-Humulene 1455 SH - 1.11 0.14 Alloaromadendrene 1460 SH 0.84 1.68 - cis-Muurola-4(14),5- diene 1467 SH - 0.81 0.85 γ -Muurolene 1480 SH 0.81 1.17 - Germacrene-D 1485 SH 34.00 20.40 66.66 γ-Amorphene 1496 SH - 1.20 0.33 Viridiflorene 1497 SH 1.02 - - Bicyclogermacrene 1500 SH 12.30 0.49 0.18 α-Muurolene 1500 SH - 1.04 0.16 (E,E)-α-Farnesene 1506 SH 1.99 1.50 2.35 γ-Cadinene 1514 SH 0.93 2.78 0.55 β- Sesquiphellandrene 1523 SH - - - δ-Cadinene 1523 SH 1.33 4.60 0.98 trans-Calamenene 1529 SH - 0.42 - trans-Cadina-1,4 diene 1535 SH 0.18 0.86 0.08 α-Cadinene 1539 SH 0.26 - 0.25 Procenat determinacije 92.98 91.93 98.37 KI – Kovaĉev indeks; MH – monoterpenski ugljovodonici; OMHD – oksigenovani monoterpenski ugljovodonici; R – ostala jedinjenja; SH – seskviterpenski ugljovodonici; 70 Tabela 3.4. Sastav etarskog ulja Th. pannonicus. Jedinjenje Tip jedinjenja KI Literature P19 P20 P21 P22 P23 P34 Tricyclene MH 927 0.17 0.05 0.11 - - 0.03 α-Thujene MH 930 0.18 0.06 0.09 0.05 - 0.09 α-Pinene MH 939 19.90 13.88 1.68 0.81 0.05 1.75 Camphene MH 954 4.03 1.11 3.28 0.06 0.07 0.77 Sabinene MH 975 0.58 0.16 0.21 0.37 0.03 1.09 β-Pinene MH 979 1.16 0.50 0.39 0.40 0.01 0.81 Myrcene MH 991 4.81 7.56 0.38 0.62 0.15 25.85 α-Phellandrene MH 1003 0.38 0.17 0.04 0.08 0.08 - α-Terpinene MH 1017 0.16 0.05 0.04 0.03 - 0.03 Limonene MH 1029 12.45 1.98 0.26 24.82 0.02 0.73 (Z)-β-Ocimene MH 1037 0.93 1.14 0.44 1.38 - 0.98 Ocimene MH 1043 - - 0.92 - - - (E)-β-Ocimene MH 1050 14.24 5.61 - 6.56 - 2.89 γ-Terpinene MH 1060 0.16 0.15 0.05 0.14 0.03 0.07 Terpinolene MH 1089 0.23 0.02 0.04 0.02 0.04 0.05 1,8-Cineole OMHD 1031 8.21 0.75 2.73 5.65 0.14 1.29 (Z)-Sabinene hydrate OMHD 1067 - 0.27 - 0.26 0.22 - Linalool OMHD 1097 - 0.77 66.06 0.03 0.04 0.22 α-Pinene oxide OMHD 1099 0.42 0.16 - 0.15 0.31 2.27 Camphor OMHD 1146 7.58 0.59 6.01 0.15 0.11 - Citronellal OMHD 1153 - - - - 0.05 - 71 Jedinjenje Tip jedinjenja KI Literature P19 P20 P21 P22 P23 P34 β-Pinene oxide OMHD 1159 - - - - 0.95 - Borneol OMHD 1169 - - 0.20 - - 0.03 3-Thujanol OMHD 1169 0.94 - - - - - α-Terpineol OMHD 1189 0.13 - 0.25 - 0.06 20.01 cis-Dihydro carvone OMHD 1203 - - - 0.12 - - trans-Dihydro carvone OMHD 1209 - - - 0.18 - - Neral OMHD 1238 - - - - 34.05 - Thymoquinone OMHD 1252 - 0.05 - - - - Geraniol OMHD 1253 - - - 0.62 - - Geranial OMHD 1267 - - 0.02 - 51.74 - Bornyl acetate OMHD 1289 - - 0.32 - - - Neryl acetate OMHD 1362 - - - 0.07 0.46 - Spathulenol OMHD 1578 - - - - 0.14 - Caryophyllene oxide OMHD 1583 - 0.19 0.03 1.00 - - p-Cymene R 1025 - 0.14 - 0.07 0.09 - p-Cymenene R 1091 - - - - 0.06 - 3-Octanone R 984 0.15 0.29 0.16 0.12 - 0.07 Thymol R 1290 0.21 0.24 0.08 0.12 0.05 - Carvacrol R 1299 - - - - 0.03 0.08 Thymol methyl ether R 1235 0.19 0.03 - 0.10 - - Carvacrol methyl ether R 1245 - - 0.05 0.03 - - 3-Octanol R 991 0.17 0.35 - 0.08 - 0.03 Oct-1-en-3-ol R 979 0.81 1.11 0.25 0.83 1.43 0.17 72 Jedinjenje Tip jedinjenja KI Literature P19 P20 P21 P22 P23 P34 Bergamol R 1057 - - - - 0.02 - 6-methyl-5-hepten-2- one R 986 - - - - 0.55 - α-Cubebene SH 1351 0.13 0.13 - 0.04 - 0.03 α-Ylangene SH 1375 - 0.06 - - - - α-Copaene SH 1377 0.22 0.39 - 0.11 - 0.07 β-Bourbonene SH 1388 - - - - 0.22 - α-Bourbonene SH 1390 0.51 2.46 - 0.68 - 0.28 β-Elemene SH 1391 0.12 0.72 - 0.23 0.02 0.16 (E)-Caryophyllene SH 1419 1.33 4.16 1.92 40.30 0.08 11.75 β-Cedrene SH 1421 - - 0.05 - - - β-Copaene SH 1432 0.21 0.59 - 0.11 0.03 0.07 trans-α Bergamotene SH 1435 - - 0.05 - - 0.05 Aromadendrene SH 1441 - 0.10 - - - - trans-β-Farnesene SH 1443 - - - - 0.21 - trans-Muurola-3,5 diene SH 1454 0.09 0.41 0.32 0.07 0.02 0.04 α-Humulene SH 1455 - - 0.49 6.15 - 3.32 (E)-β-Farnesene SH 1457 2.73 6.96 - - - - Alloaromadendrene SH 1460 - - 0.05 - 0.03 0.02 cis-Muurola-4(14),5- diene SH 1467 - 0.89 0.48 0.08 - - γ -Muurolene SH 1480 0.45 0.54 0.02 0.10 0.03 - Germacrene-D SH 1485 4.60 36.91 0.23 3.94 0.54 6.29 γ-Amorphene SH 1496 0.28 0.27 - 0.20 - 0.15 Bicyclogermacrene SH 1500 0.18 0.21 0.25 0.05 - 0.39 73 Jedinjenje Tip jedinjenja KI Literature P19 P20 P21 P22 P23 P34 α-Muurolene SH 1500 0.19 0.24 - 0.08 0.08 0.06 (E,E)-α-Farnesene SH 1506 0.47 0.18 - 0.50 0.23 0.48 β-Bisabolene SH 1506 0.57 0.27 7.76 - 0.33 0.20 δ-Amorphene SH 1512 - - - - 0.04 - γ-Cadinene SH 1514 - 0.75 2.24 0.21 - 0.23 β- Sesquiphellandrene SH 1523 - - 0.14 - - 0.12 δ-Cadinene SH 1523 - 1.48 - 0.39 - - trans-Calamenene SH 1529 0.51 - - - - - (E)-gamma- Bisabolene SH 1531 - - - - - 11.93 trans-Cadina-1,4 diene SH 1535 - 0.10 - 0.04 - - α-Cadinene SH 1539 0.42 0.35 0.07 0.07 - - Procenat determinacije 91.22 95.55 98.20 98.24 92.85 94.96 KI – Kovaĉev indeks; MH – monoterpenski ugljovodonici; OMHD – oksigenovani monoterpenski ugljovodonici; R – ostala jedinjenja; SH – seskviterpenski ugljovodonici; 74 Tabela 3.5 Sastav etarskog ulja populacija vrsta iz podsekcije Pseudomarginati. Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P24 P25 P26 P27 P31 P32 Tricyclene 927 MH - - 0.06 - 0.06 - α-Thujene 930 MH 0.09 0.07 0.07 - 0.15 0.36 α-Pinene 939 MH 0.77 0.95 1.41 0.14 1.27 1.62 Camphene 954 MH 0.98 0.95 1.22 0.07 2.59 1.28 Sabinene 975 MH 0.23 0.16 0.06 0.05 1.58 0.41 β-Pinene 979 MH 0.31 0.26 0.23 0.06 0.22 0.48 Myrcene 991 MH 18.08 4.26 7.51 14.24 4.06 3.02 α-Phellandrene 1003 MH 0.25 0.09 0.07 0.24 0.05 0.17 α-Terpinene 1017 MH 0.18 - 0.05 0.22 0.15 0.35 Limonene 1029 MH 0.92 0.72 0.34 3.15 2.95 0.66 (Z)-β-Ocimene 1037 MH 1.79 0.05 0.31 3.79 - 0.15 (E)-β-Ocimene 1050 MH 3.14 0.32 0.40 7.43 0.01 0.89 γ-Terpinene 1060 MH 0.37 0.05 0.04 0.21 0.50 2.86 Terpinolene 1089 MH 0.29 0.04 0.08 0.67 0.33 0.08 1.8-Cineole 1031 OMHD 1.47 1.62 0.07 0.43 0.05 3.43 (Z)-Sabinene hydrate 1067 OMHD 0.51 0.29 0.19 0.19 1.19 1.23 Linalool 1097 OMHD 11.74 - 17.05 34.42 - 0.70 α-Pinene oxide 1099 OMHD 0.28 0.26 0.08 0.80 0.03 0.61 Camphor 1146 OMHD 1.67 0.14 1.47 - 0.01 0.06 β-Pinene oxide 1159 OMHD - 0.70 - - - Borneol 1169 OMHD 0.19 - 0.07 0.10 0.55 1.54 3-Thujanol 1169 OMHD - - - - 0.15 - 75 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P24 P25 P26 P27 P31 P32 α-Terpineol 1189 OMHD - - - - 5.81 - trans-Dihydro carvone 1209 OMHD - - - - 0.02 - Linalyl formate 1216 OMHD - - 0.02 - - - Neral 1238 OMHD 0.07 12.70 0.02 - - - Carvone 1243 OMHD - - - - 0.07 - Thymoquinone 1252 OMHD - - - - - 1.10 Geraniol 1253 OMHD - 2.57 - - - - Linalyl acetate 1257 OMHD 22.94 - 33.89 14.56 - - Geranial 1267 OMHD - 19.06 - - - - Isobornyl acetate 1286 OMHD 0.08 - 0.06 - - - Bornyl acetate 1289 OMHD 0.11 - 0.06 - 7.50 - alpha-Terpinyl acetate 1349 OMHD - - - - 66.59 - Neryl acetate 1362 OMHD 1.38 12.44 - 3.08 - - Geranyl acetate 1381 OMHD 3.01 4.72 0.31 6.64 - - Elemol 1550 R - 5.96 - - - - Caryophyllene oxide 1583 R 0.18 0.16 0.07 - 0.07 1.19 p-Cymene 1025 R 0.15 - 0.03 - 0.27 1.73 p-Cymenene 1091 R - - - - 0.03 - 3-Octanone 984 R 0.18 0.62 0.07 0.06 0.01 0.06 Thymol 1290 R 0.07 0.26 0.14 0.10 0.04 0.38 Thymol methyl ether 1235 R - 3.35 - - - 1.03 Carvacrol methyl ether 1245 R - - - - 0.26 76 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P24 P25 P26 P27 P31 P32 3-Octanol 991 R 0.19 - 0.09 0.32 - 0.10 Oct-1-en-3-ol 979 R 1.97 1.39 0.49 0.35 - 0.27 α-Cubebene 1351 SH 0.25 0.07 0.16 0.40 - - α-Ylangene 1375 SH 0.12 - 0.07 - - - α-Copaene 1377 SH 0.10 0.16 0.20 0.14 - 0.21 α-Bourbonene 1390 SH 0.16 - 0.05 0.28 0.03 0.66 β-Elemene 1391 SH 0.22 0.21 0.28 - - 0.44 (E)-Caryophyllene 1419 SH 9.85 6.66 4.93 - 1.05 20.48 β-Copaene 1432 SH - 0.06 - - 0.01 0.16 trans-α Bergamotene 1435 SH - - - - 0.03 - Aromadendrene 1441 SH 0.06 0.18 0.09 0.87 0.01 0.09 trans-Muurola-3.5 diene 1454 SH 0.06 0.24 0.11 - - 1.35 α-Humulene 1455 SH - 0.44 - - 0.04 7.92 (E)-β-Farnesene 1457 SH 6.00 - 2.26 0.10 - - Alloaromadendrene 1460 SH 0.53 0.82 1.70 0.27 - - α-Amorphene 1485 SH 0.16 0.10 0.37 0.81 - 0.36 Germacrene-D 1485 SH 0.94 0.87 1.88 - 0.07 7.72 γ-Amorphene 1496 SH - 0.22 - - - 0.27 cis-Cadina-1.4- diene 1496 SH - - - 0.13 - - Bicyclogermacrene 1500 SH 1.13 3.38 11.88 0.56 0.19 2.34 α-Muurolene 1500 SH - - - - - 0.27 (E.E)-α-Farnesene 1506 SH - 3.35 - - - 0.74 β-Bisabolene 1506 SH - 0.07 - - 0.31 - 77 Jedinjenje KI Literature Tip jedinjenja P24 P25 P26 P27 P31 P32 δ-Amorphene 1512 SH 0.11 - 0.35 - - - γ-Cadinene 1514 SH 0.40 2.90 0.80 - - 17.84 β- Sesquiphellandrene 1523 SH - - - - - - δ-Cadinene 1523 SH 0.88 0.82 1.81 - - - trans-Calamenene 1529 SH - - - - - 1.03 trans-Cadina-1.4 diene 1535 SH 0.06 - 0.11 - - 0.10 α-Cadinene 1539 SH - 0.11 - - - 0.60 β-Atlantol 1608 SH - - - - 0.01 0.39 Procenat determinacije 94.57 93.06 94.90 98.04 88.98 KI – Kovaĉev indeks; MH – monoterpenski ugljovodonici; OMHD – oksigenovani monoterpenski ugljovodonici; R – ostala jedinjenja; SH – seskviterpenski ugljovodonici; 78 3.1.1.8 Statistička obrada sastava etarskih ulja Statistička obrada sastava etarskih ulja podsekcije Alternantes Pearsonov koeficijent korelacije za pet sastojaka etarskog ulja koji prelaze 10%, dat je u tabeli 3.6. Iz tabele se vidi da ni u jednom sluĉaju ne postoji statisticki znacajna korelacija (P < 0,5) izmeĊu posmatranih sastojaka. Tabela 3.6 Korelacije izmeĊu pet najzastupljenijih komponenti etarskog ulja podsekcije Alternantes p-Cimen γ- pinen geraniol Timol Karvakrol p-Cimen 1,00 ns ns ns ns γ -pinen -0,19 1,00 ns ns ns geraniol -0,72 -0,46 1,00 ns ns Timol 0,05 0,65 -0,67 1,00 ns Karvakrol 0,55 -0,13 -0,36 -0,30 1,00 ns - nema znacaj, * (0.050,5) ni sa jednim glavnim sastojkom etarskog ulja. 82 Tabela 3.9 Korelacije izmeĊu pet najzastupljenijih komponenti etarskog ulja podsekcije Isolepides α-Pinene Myrcene p-Cymene Limonene (E)-ß-Ocimene γ-Terpinene Linalool α-Pinene 1.00 ns ns ns *** ns ns Myrcene 0.15 1.00 ns ns ns ns ns p-Cymene -0.25 -0.23 1.00 ns ns ns ns Limonene 0.25 -0.03 -0.20 1.00 * ns ns (E)-ß-Ocimene 0.64 0.26 -0.32 0.59 1.00 ns ns G-Terpinene -0.29 -0.22 0.13 -0.23 -0.38 1.00 ns Linalool -0.09 -0.12 -0.15 -0.11 -0.16 -0.18 1.00 α-Terpineol -0.08 0.94 -0.14 -0.08 0.02 -0.16 -0.06 Thymol methyl ether -0.21 -0.21 0.48 -0.18 -0.31 0.47 -0.15 Neral -0.15 -0.12 -0.13 -0.11 -0.16 -0.16 -0.07 Geranial -0.15 -0.12 -0.13 -0.11 -0.16 -0.16 -0.07 Thymol -0.34 -0.24 0.02 -0.26 -0.42 0.57 -0.20 (E)-Caryophyllene -0.13 0.13 -0.24 0.80 0.27 -0.29 -0.08 Germacrene-D 0.47 0.06 -0.30 -0.11 0.22 -0.35 -0.13 (E)-γ-Bisabolene -0.08 0.94 -0.14 -0.08 0.02 -0.16 -0.07 α-Terpineol Thymol methyl ether Neral Geranial Thymol (E)-Caryophyllene Germacrene-D (E)-γ-Bisabolene α-Pinene ns ns ns ns ns ns ns ns Myrcene *** ns ns ns ns ns ns *** p-Cymene ns ns ns ns ns ns ns ns Limonene ns ns ns ns ns *** ns ns (E)-ß-Ocimene ns ns ns ns ns ns ns ns γ-Terpinene ns ns ns ns * ns ns ns Linalool ns ns ns ns ns ns ns ns α-Terpineol 1.00 ns ns ns ns ns ns *** Thymol methyl ether -0.14 1.00 ns ns ns ns ns ns Neral -0.07 -0.14 1.00 *** ns ns ns ns 83 α-Terpineol Thymol methyl ether Neral Geranial Thymol (E)-Caryophyllene Germacrene-D (E)-γ-Bisabolene Geranial -0.07 -0.14 1.00 1.00 ns ns ns ns Thymol -0.18 0.14 -0.18 -0.18 1.00 ns ns ns (E)-Caryophyllene 0.16 -0.24 -0.14 -0.14 -0.30 1.00 ns ns Germacrene-D -0.06 -0.29 -0.14 -0.14 -0.39 0.02 1.00 ns (E)-γ-Bisabolene 1.00 -0.14 -0.07 -0.07 -0.18 0.17 -0.06 1.00 Tabela 3.9 Nastavak; ns - nema znacaj, * (0.051.0 Absorpcione Jedinice AU); m, srednja (UV absorpcija najvišeg pika u ekstraktu je 0.1–1.0 AU); l, niska (UV absorpcija najvišeg pika u ekstraktu je 0.01–0.1 AU); tr, u tragovima (UV absorpcija najvišeg pika u ekstraktu je <0.01 AU). bFlavanoni: E, eriodictyol; M, metoksilovani flavanoni (nekoliko razliĉitih jedinjenja, MH+m/z 331, 347 i 361). 97 3.2 AFLP markeri Osam kombinacija prajmera dalo je ukupno 2591 polimorfni marker u setu od 83 ispitaivana uzorka Thymus-a. Najveći i najmanji udeo polimorfnih traka kao i Šenonov informacioni indeks je utvrĊen kod Th. pulegioides, odnosno Th. praecox (Tabela 3.17). Particija Šenonovog indeksa je pokazala da je totalni diverzitet (Ht) bio 0,488, dok je proseĉni diverzitet unutar vrsta (Hsp) bio 0,355. Proporcija diverziteta unutar vrsta (72.61%) je bila znatno viša nego proporcija diverziteta meĊu vrstama (27.39%). Table 3.17 Molekularni diverzitet dobijen od 2591 AFLP markera kod kod sedam vrsta roda Thymus Vrsta (Podsekcija*) n %P Npr Hj (stdev) Th. pulegioides (A) 25 73.41 80 0.406 (0.332) Th. glabrescens (I) 16 64.61 32 0.392 (0.346) Th. marschallianus (I) 8 51.18 2 0.366 (0.380) Th. pannonicus (I) 11 58.78 10 0.392 (0.366) Th. balcanus (P) 14 64.76 26 0.403 (0.350) Th. moesiacus (P) 6 40.06 7 0.314 (0.395) Th. praecox (P) 3 22.69 7 0.208 (0.385) Average 11.86 53.64 23.43 0.355 (0.072) Total 83 100 164 0.488 (0.248) n – veliĉina uzorka; %P – proporcija polimorfnih traka; Npr – broj osobenih traka; Hj (stdev) - Shannonov informacioni indeks i njegova standardna devijacija *Podsekcija: (A) Alternantes, (I) Isolepides, (P) Pseudomarginati Nei i Lijeve distance zasnovane na AFLP podacima su se kretale od 0,43 do 0,76, sa proseĉnom vrednošću od 0,62. Tabela 3.18 Jednosmerna analiza molekularne varijanse (AMOVA) za prticiju AFLP variacije izmeĊu sedam vrsta roda Thymus, meĊu populacijama unutar vrste i unutar populacija Izvor varijacije df Komponenta varijacije Procenat varijacije -statistics P() Among species 6 0.033 10.45 CT = 0.104 < 0.0001 Among populations within species 25 0.032 10.18 SC = 0.114 < 0.0001 Within populations 51 0.253 79.38 ST = 0.206 < 0.0001 P() - -statistics probability level after 10,000 permutations 98 Slika. 3.4 Neighbor-joining stablo zasnovano na Nei i Lijevom distancionom matriksu izvedenom iz AFLP podataka za sedam vrsta roda Thymus. Boostrap podrška vrednosti (BS; u procentima) P04S3 P01S2 P03S1 P01S3 P01S1 P04S2 P04S1 P06S3 P02S2 P02S3 P02S1 P03S3 P06S1 P06S2 P03S2 P09S2 P09S1 P08S3 P08S2 P08S1 P05S2 P07S1 P05S1 P07S3 P07S2 P12S3 P12S1 P12S2 P14S2 P14S1 P15S1 P15S3 P15S2 P11S2 P10S2 P10S1 P11S3 P11S1 P13S3 P13S2 P13S1 P21S1 P20S2 P20S1 P22S2 P20S3 P22S1 P19S1 P16S2 P18S1 P18S3 P19S2 P18S2 P17S1 P16S3 P17S2 P16S1 P23S1 P23S3 P23S2 P24S1 P26S2 P27S1 P27S3 P26S3 P27S2 P26S1 P25S1 P25S2 P29S1 P29S2 P28S2 P28S1 P28S3 P32S1 P32S2 P32S3 P30S1 P30S2 P30S3 P31S1 P31S2 P31S3 0.05 Th. balcanus Pseudomarginati Th. moesiacus Pseudomarginati Th. praecox Pseudomarginati Th. glabrescens Isolepides Th. pulegioides Alternantes Th. pannonicus Isolepides Th. marschallianus Isolepides 94 90 61 56 90 62 53 85 62 62 54 67 55 89 82 93 62 93 86 90 70 79 98 71 79 96 70 88 95 98 79 95 100 76 77 53 63 90 61 55 68 99 88 88 55 62 100 62 100 100 80 99 69 99 Dvosmerna Analiza molekularne varijanse (AMOVA) je pokazala da najviše genetiĉkog diverziteta proizilazi iz razlike meĊu jedinkama unutar populacija (79.38%) (Tabela 3.18). Preostala varijabilnost bila je skoro podjednako distribuirana izmeĊu vrsta (10.18%) i izmeĊu populacija unutar vrsta (10.45%). Ipak, oba izvora varijabilnosti su imala veoma visoku znaĉajnost (P < 0.0001). Serija jednosmernih AMOVA za svaku vrstu pokazala je da se komponenta varijabilnosti unutar vrste kretala od 85,5% kod Th. glabrescens do 92,3% kod Th. marschallianus, ukazujući da sve analizirane vrste imaju sliĉnu distribuciju meĊupopulacijske i unutarpopulacijske varijabilnosti (Tabela 3.19). U svim sluĉajevima ST-vrednosti su imale visoku znaĉajnost, potvrĊujući postojanje populacione strukture. Tabela 3.19 Jednosmerna analiza molekularne varijanse (AMOVA) za particiju AFLP variacije izmeĊu i unutar svake populacione komponente za svaku vrstu roda Thymus Vrsta (Podsekcia*) Procenat varijacije -statistics P() MeĊu populacijama Unutar populacija Th. pulegioides (A) 11.15 88.85 0.112 <0.0001 Th. glabrescens (I) 14.46 85.54 0.145 <0.0001 Th. marschallianus (I) 7.68 92.32 0.077 <0.0001 Th. pannonicus (I) 9.11 90.89 0.091 0.002 Th. balcanus (P) 9.95 90.05 0.100 <0.0001 Th. moesiacus (P) 11.83 88.17 0.118 <0.0001 *Podsekcije: (A) Alternantes, (I) Isolepides, (P) Pseudomarginati Uzajamne AMOVA analize (Tabela 3.20) su dalje pokazale da je diferencijaija meĊu vrstama bila znaĉajna u svim sluĉajevima (P < 0.05), osim izmeĊu Th. marschallianus i Th. pannonicus (P = 0.07). Neighbour-joining analiza (Slika 3.4) je pokazala tri dobro podrţane klade: Th. pulegioides kladu (Bootstrap podrška [BS] od 94 %), Th. glabrescens klada (BS 93%), i klada koja je sadrţavala preostale vrste (BS 95 %). Ova poslednja klada je sadrţala dve nepodrţane grupe, jednu koja je obuhvatala dve vrste iz podsekcije Isolepides (Th. marschallianus, Th. pannonicus) i drugu u kojoj su bile tri vrste iz podsekcije Pseudomarginati (Th. balcanus, Th. moesiacus, Th. praecox). Pojedinaĉne jedinke koje pripadaju Th. pannonicus i Th. maschallianus nisu se razdvojile u skladu sa pripadnošću vrstama. S drug strane, vrste iz podsekcije Pseudomarginati su bile jasno razdvojene i dobro podrţane, Th. preacox i Th. moesiacus sa BS 100 % i Th. balcanus sa BS 62 %. 100 Tabela 3.20 Interspecijska ST vrednost (ispod dijagonale) i srednja vrednost Nei i Lijeve distance (iznad dijagonale) meĊu sedam vrsta roda Thymus. Srednja vrednost intraspeciiske Nei i Lijeve distance data je u dijagonali (u kurzivu) No. Vrsta (Podsekcija) Species 1 2 3 4 5 6 7 1 Th. pulegioides (A) 0.568 0.659 0.635 0.647 0.651 0.661 0.646 2 Th. glabrescens (I) 0.130 *** 0.578 0.616 0.627 0.660 0.657 0.667 3 Th. marschallianus (I) 0.128 *** 0.094 *** 0.534 0.551 0.604 0.592 0.603 4 Th. pannonicus (I) 0.132 *** 0.097 *** 0.013 ns 0.553 0.613 0.603 0.611 5 Th. balcanus (P) 0.122 *** 0.126 *** 0.080 *** 0.079 *** 0.575 0.612 0.624 6 Th. moesiacus (P) 0.168 *** 0.157 *** 0.109 *** 0.108 *** 0.100 *** 0.521 0.629 7 Th. praecox (P) 0.163 *** 0.180 ** 0.148 ** 0.137 ** 0.130 ** 0.199 * 0.478 *** Signifikantnos priP < 0.001; ** Signifikantnos priP < 0.01; Signifikantnos priP < 0.05; ns - Nesignifikantna vrednost Procena proseĉnog oĉekivanja podataka, u zavisnosti od datog broja klastera, ln[Pr(X|K)], se povećavala sa porastom K do K=5, dok je standardna devijacija meĊu razliĉitim prolazima za svako K bila relativno niska (Slika 3.5). Ukoliko je K bilo veće od 5, srednje vrednosti za ln[Pr(X|K)] su bile niţe, dok su varijanse znaĉajnije rasle, pokazujući da su hipoteze o postojanju više od 5 klastera daleko od optimalnih. Kao i u sluĉaju ln[Pr(X|K)], najveće vrednosti ΔK su zapaţene za K=5. 101 Slika 3.5 Izbor najverovatnijeg broja klastera (K) na osnovu multilokusnih AFLP podataka uz upotrebu model-zasnovanog klastering metoda po Pritchard i sar. (2000): ln P(X|K) vrednosti za svaki od deset nezavisnih ranova za svako K i K vrednost za svako K zasnovano na stopi drugog reda promene funkcije sliĉnosti sa obzirom na K kako je opisano kod Evanno et al. (2005) Proporcije pripadnosti svake individue u svakom klasteru su bile izraĉunate za K=2 do K=5 zasnovane na prolazu sa najvišim ln[Pr(X|K)] (Slika 3.5). Kada je K=2 sve individue vrste Th. pulegioides su bile izdvojene u zaseban klaster (Klaster A) za razliku od individua svih ostalih vrsta (Klaster B). Za K=3, novoformirani klaster (Klaster C) obuhvatio je jedinke koje pripadaju vrsti Th. glabrescens. Za K=4 je identifikovan dodatni klaster u koji su se delimiĉno izdvojile jedinke vrsta Th. pulegioides, Th. balcanus i Th. glabrescens (Klaster D). Na kraju, za K=5, većina jedinki koje pripadaju Th. marschallianus i Th. pannonicus bila je ukljuĉena u novoformirani Klaster E. -300000 -250000 -200000 -150000 -100000 -50000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ln P (X |K ) 0 50 100 150 200 250 300  K ln P(X|K) values (10 runs for each K; primary y axis - left) K values for each K (secondary y axis - right) K ln P (X |K )  K 102 Slika 3.6. Genetiĉka struktura sedam vrsta roda Thymus. Proporcije ućešća za K = 2 do 5 klastera su date prema proceni programa Structure. Svaka pojedinaĉna biljka je predstavljena jednom vertikalnom linijom podeljenom bojama. Svaka boja predstavlja po jedan klaster, a duţina pojedine boje predstavlja procenjenu proporciju savake individue u odreĊenom klasteru. Bele linije odvajaju vrste koje su oznaĉene ispod slike. 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 K = 2: A B K = 3: A B C K = 4: A B C D K = 5: A B C D E T h. p ra ec ox T h. p ul eg io id es T h. g la br es ce ns T h. m ar sc ha lli an us T h. p an no ni cu s T h. b al ca nu s T h. m oe si ac us P ro p o rt io n o f m e m b e rs h ip PseudomarginatiAlternantes Isolepides P ro p o rt io n o f m e m b e rs h ip 103 4. Diskusija 4.1 Sastav etarskih ulja Postojanje hemotipova kod samoniklih populacija roda Thymus je dobro poznato, pa tako, na primer, u populacijama Th. vulgaris sa juga Francuske ustanovljeno je postojanje šest hemotipova od kojih svaki nosi naziv po dominnantnom monoterpeunu u etarskom ulju (Passet, 1971; Vernet i sar., 1986). Kod ispitivanih populacija vrste Th. pulegioides se moţe konstatovati prisustvo dva jasno definisana hemotipa. Kod populacija P01, P03 i P06 geraniol je u etarskom ulju zastupljen u izuzetno visokom procentu, dok bi se populacije P02, P04, P05 i P09 mogle okarakterisati kao fenolni hemotipovi. U etarskom ulju populacije P01 geraniol je zastupljen sa 87,12%, u etarskom ulju populacije P03 sa 87,92% i u etarskom ulju P06 sa 86,97%. Ni jedna druga komponenta nije bila prisutna u nekom znaĉajnijem procentu. Geraniol kao glavna komponenta etarskih ulja već je opisan kod nekih populacija Th. pulegioides (Mockuté i Bernotiené, 1998, 1999, 2001; Mastelic i sar., 1992; Karuza-Stojakovic i sar., 1989). Populacije P01, P03 i P06 PCA1 osa odvaja u posebnu grupu, upravo na osnovu visoke koncentracije geraniola (Graf. 3.1). Sliĉne rezultate da je i primena klaster analize, gde ove tri formiraju klaster A (Slika 3.1).U etarskim uljima P02, P04, P05 i P09 je visoka koncentracija jedinjenja koja pripadaju istom metaboliĉkom putu, tj. p-cimen i γ- terpinen su prekursori u sintezi timola i karvakrola, tako da se ova jedinjenja uvek javljaju zajedno. Ukupan sadrţaj ovih komponenti se kretao od 71,02% kod P09 do 84,50% kod P05. U etarskom ulju populacije P02 timol je glavna komponenta sa 52,95%, dok je koncentracija p-cimena 4,89% i γ-terpinena 21,39%. Kod populacije P04 karvakrol je u etarskom ulju zastupljen sa 39,95%, dok je p-cimen glavna komponenta sa 42,59%, a γ-terpinen uĉestvuje 1,51%. Ovo je jedina populacija sa visokom koncentracijom karvakrola. Kod populacije P05 glavna komponenta etarskog ulja je timol sa 62,82%, dok su p-cimen i γ-terpinen zastupljeni sa 17,36%, odnosno sa 3,31%. U etarskom ulju populacije P09 najzastupljenija komponenta je p-cimen sa 104 48,59%, dok je timol zastupljen sa 22,12%, a γ-terpinen sa 0,27%. Na osnovu sadrţaja sastojaka etaraskog ulja, PCA2 osa razdvaja ove populacije na dve grupe, one sa timolom i γ-terpinenom i one sa karvakrolom i p-cimenom (Grafik 3.1). Sliĉni rezultati dobijeni su i primenom klaster analize. P02, P05 i P09 grupišu se u klaster B, dok se P04 nalazi u klasteru C (slika 3.1). Timol i karvakrol su najvaţnije komponente etarskih ulja kod vrsta roda Thymus i javljaju se kod velikog broja taksona, najĉešće u koncentracijama izmeĊu 20 i 50% (Thompson, 2002). Ovo je sluĉaj i sa mnogim ispitivanim populacijama vrste Th. pulegioides koje su pripadale fenolnom hemotipu. Kod ispitivanih populacija iz Litvanije konstatovano je prisustvo i timolnog i karvakrolnog hemotipa (Loţienė i sar., 2003). Kod populacija sa Britanskih ostrva, takoĊe su opisani i timolni i karvakrolni hemotip (Stahl-Biskup, 1986), kao i kod populacija iz Hrvatske (Kuštrak i sar., 1990). Sve ispitvane populacije vrste Th. glabrescens mogu se po sastavu etarskih ulja okarakterisati kao fenolni hemotip. Sve ispitivane populacije u etarskim uljima imale su visoke koncentracije p-cimena, γ-terpinena i timola. Ukupan sadrţaj ove tri komponente se kreće od 57,06%, kod P12, do 80,60%, kod P13. Kod populacije P10 timol predstavlja 56,29% etarskog ulja, dok su p-cimen i γ-terpinen zastupljeni sa 9,76%, odnosno 11,91%. Kod P11 timol je takoĊe glavna komponenta sa 61,94%, a p-cimen i γ-terpinen su zastupljeni sa 11,40%, odnosno 2%. U etarskim uljima P12, γ-terpinen je najzastupljenija komponenta sa 19,61%, dok je timol drugi sa 19,02%, p-cimen je zastupljen sa 18,43%. Kod ove populacije znaĉajno je zastupljen i timol metil etar sa 13,11%. Kod populacije P13 timol je najzastupljenija komponenta etarskog ulja sa 64,51%, a slede γ-terpinen sa 10,67% i p-cimen sa 5,38%. Glavna komponenta etarskog ulja populacije P14 je p-cimen sa 42,56%, dok su timol i γ-terpinen zastupljeni sa 16,56%, odnosno 13,25%. Kod populacije P15 u etarskom ulju najzastupljenija komponenta je timol sa 44,53%, prati ga γ-terpinen sa 31,26%, dok je p-cimen zastupljen sa 3,98%. Kod populacije P33 glavna komponenta etarskog ulja je p-cimen sa 75,76%, dok timol i γ-terpinen imaju male koncentracije od 1,03%, odnosno 0,92%. PCA1 osa na osnovu visokog sadrţaja timola, γ-terpinena, p-cimena i timol metil etra grupiše sve populacije vrste Th. glabrescens, dok PCA6 daje razdvajanje populacije ove vrste na one koje imaju više koncentracije p-cimena i timol metil etra i one koje imaju više koncentracije timola i γ-terpinena (Grafik 3.2). Sliĉno grupisanje populacija ove 105 vrste dobijeno je i klaster analizom, gde se populacije Th. glabrescens izdvajaju u klaster A, u okviru kojeg se razlikuju podklasteri A1, sa populacijama P12, P14 i P33, i podklaster A2, sa populacijama P10, P11, P13 i P15 (Slika 3.2). Timol je daleko najznaĉajniji sastojak etarskih ulja kod roda Thymus (Thompson, 2002) i javlja se kod mnogih vrsta kao glavna komponenta (Kulevanova i sar., 1996c; Dajic Stevanovic i sar., 2008). Kod nekih populacija vrste Th. zygis timol se javljao u koncentraciji od 30,7%, dok je p-cimen bio zastupljen sa 23,3% (Richard i sar., 1985). Kod nekih populacija vrste Th. longicaulis timol je ĉinio 40,1% etarskog ulja, a p-cimen 26,3% (Kuštrak i sar., 1990). Kod Th. tosevii ssp. substriatus timol je predstavljao 24,5%, odnosno 45,6% etarskog ulja (Kulevanova i sar., 1997). Kod svih ispitivanih populacija vrste Th. marschallianus germakren-D je glavna komponenta, tako da se moţe konstatovati da je, što se tiĉe sastava etarskog ulja, ovo jedna homogena grupa. Kod populacije P16 germakren-D je zastupljen sa 34,00%, kod populacije P17 sa 20,40% i kod populacije P18 sa 66,66%. Na grafiku 3.2 se vidi da se na osnovu PCA1 ose grupišu sve populacije Th. marschallianus, kao i jedna populacija Th. pannonicus (P20), koja sadrţi visoku koncentraciju germakrena-D. U UPGMA dendogramu ove populacije formiraju klaster B (Slika 3.2). Thompson (2002) navodi da je ovo jedinenje ĉesto prisutno u etarskim uljima kod roda Thymus, ali da retko prelazi 10%, ovaj hemotip je opisan kod populacija Th. bracteosus sa zapadnog Balkana (Bucar i sar., 2005; Slavkovska i sar., 2006). Kod populacije P16 biciklogermakren je zastupljen sa 12,30%, a (E)-β-ocimen sa 9,75%, kod populacije P17 jedino još (E)-kariofilen ima znaĉajnu zastupljenost sa 14,57%, a kod populacije P18 α-pinen je zastupljen sa 11,29%. Ispitivane populacija vrste Th. pannonicus su raznovrsne, što se tiĉe sastava etarskog ulja. U literaturi su do sada navedena tri hemotipa ove vrste, α-terpinil acetat (Karuza-Stojakovic i sar., 1989), timol/p-cimen (Pluhár i sar., 2007) i geranial/neral (Maksimović i sar., 2008a). Kod populacije P19 α-pinen, koji se navodi kao komponenta zastupljena sa više od 10% u etarskim uljima samo deset ispitivanih taksona ovog roda, je najzastupljenija komponenta sa 19,90% (Thompson, 2002), ova komponenta je glavni sastojak etarskih ulja još samo kod nekih populacija Th. baeticus sa Iberijskog poluostrva (Morales, 1986) TakoĊe, još dva monoterpenska ugljovodonika su prisutna u koncentracijama preko 10%, limonen (12,45%) i (E)-β-ocimen (14,23%), dok su kamfen i mircen 106 zastupljeni sa 4,03% odnosno 4,81% i uz još devet komponenti ĉine da je ova grupa jedinjenja najzastupljenija. Na PCA biplotu ova populacija se nije izdvojila ni pojednoj osi, a takoĊe u u UPGMA dendogramu ne pripada niti jednom klasteru (Slika 3.2). U etarskom ulju ove populacije je relativno visoka koncentracija dva oksigenovana monoterpenska ugljovodoniĉna derivata, 1,8-cineola i kamfora. Ove dve komponente se ĉesto javljaju zajedno u etarskim uljima razliĉitih vrsta roda Thymus (Morales, 1986). U etraskom ulju populacije P20 monoterpenski ugljovodonici predstavljaju znaĉajnu grupu jedinjenja s obzirom da je α-pinen zastupljen sa 13,88%, mircen i (E)-β- ocimen takoĊe imaju zastupljenost od preko 5%. U ulju ove populacije oksigenovani monoterpenski ugljovodonici nisu prisutni u znaĉajnom procentu dok s druge strane, iako se seskviterpenski ugljovodonici ne smatraju znaĉajnom komponentom etarskih ulja kod roda Thymus (Thompson, 2002), germakren-D je najzastupljenija komponenta sa 36,91%. PCA pokazuje da je po sastavu etarskog ulja ova populacija bliska populacijama vrste Th. marschallianus, tako da i na UPGMA dendogramu ulazi u klaster B (Slika 3.2). Kod populacije P21 u etarskom ulju linalool je glavna komponenta sa 66,06%, a veću koncentraciju ima još i β-bisabolen sa 7,76%. Kod ove populacije su takoĊe prisutni i 1,8-cineol i kamfor sa 2,73%, odnosno 6,01%. Na osnovu visokog sadrţaja linaloola ova populacija se izdvaja na PCA6 osi (Grafik 3.2), dok je na UPGMA dendogramu u klasteru F (Slika 3.2). Linalool je bio znaĉajna komponenta i kod nekih drugih populacija vrsta roda Thymus. Kod Th. pulegioides iz Austrije linalool je bio zastupljen izmeĊu 33,4 i 92,3% (Mártonfi i sar., 1994), kod nekih populacija Th. mastichina takoĊe je bio glavna komponenta, i koncentracija mu se kretala izmeĊu 74% (Adzet i sar., 1977a, b) i 82,9% (García Vallejo i sar., 1984). Kod tri ispitivana varijeteta Th. jankae (var. jankae, var. pantotrichus i var. patentipilus) linalool je bio glavna komponenta i njegova koncentracija u etarskim uljima se kretala od 28,1 do 31,2% (Kulevanova i sar., 1998a). Kod populacije P22 (E)-kariofilen predstavlja glavnu komponentu etarskog ulja sa zastupljenošću od 40,30%. Znaĉajno je prisustvo još dva monoterpenska ugljovodonika, limonena sa 24,82% i (E)-β-ocimena sa 6,56%. PCA odvaja ovu populaciju od ostalih populacija iz podsekcije Isolepides na osnovu PCA4 ose, odnosno zbog visoke koncentracije (E)-kariofilena i limonena (Grafik 3.2). U klaster analizi ova 107 populacija formir klaster E. Iako seskviterpenski ugljovodonici nisu znaĉajna komponenta etarskih ulja kod roda Thymus, (E)-kariofilen je svakako najrasprostranjeniji (Thompson, 2002). Kod odreĊenog broja taksona (E)-kariofilen je prelazio koncentraciju od 10%, kod nekih populacija Th. praecox ssp. arcticus iz Britanije predstavljao je 31,5%, kod Th. pulegioides iz Litvanije od 11,4 do 15,9% (Mockuté i Bernotiené, 1998, 1999, 2001), iz Hrvatske 11,5% (Kuštrak i sar., 1990), iz MaĊarske od 14,8 do 29,6% (Mártonfi i sar., 1994), kod Th. alpestris iz Slovaĉke 10,5% (Mártonfi, 1992), ali ni u jednom sluĉaju nije predstavljao glavnu komponentu. Kod populacije P23 dominantna komponenta etarskog ulja je citral (geranial i neral) koji ĉini 85,80% ukupnog etarskog ulja. Ovaj nalaz je saglasan sa prethodnim istraţivanjima ove vrste sa istog podruĉja gde je citral ĉinio 71,03% etarskog ulja (Maksimović i sar., 2008a). PCA3 osa odvaja ovu populaciju od ostalih (Grafik 3.2), a na UPGMA dendogramu P23 formira klaster D (Slika 3.2). U etarskom ulju ove populacije ni jedna druga komponenta nije imala znaĉajan procenat zastupljenosti. Kod populacije P34 dominantna komponenta etarskog ulja je mircen sa 25,85%, a znaĉajno su zastupljeni još i α-terpineol (20,01%) i (E)-kariofilen (11,75%). Na osnovu PCA2 ose ova populacija se izdvaja od ostalih (Grafik 3.2). I na UPGMA dendogramu ova populacija formira klaster C (Slika 3.2). Koncentracija mircena od preko 10% je do sada opisana kod svega 11 taksona roda Thymus (Thompson, 2002), s time da je bio glavna komponenta kod nekih populacija vrste Th. granatensis (Cabo i sar., 1986a, b), Th. hyemalis (Cabo i sar., 1987) i Th. mastigophorus (Velasco Negueruela i Pérez-Alonso, 1986). Kod svih ispitivanih populacija vrste Th. balcanus javljaju se dva hemotipa. Kod P25 u etarskim uljima su dominantne komponente geranial i neral, što ovu populaciju svrstava u citralni hemotip. U etarskom ulju ove populacije znaĉajnu koncentraciju ima još i neril acetat sa 12,45%. PCA1 osa odvaja ovu populaciju upravo zbog visoke koncentracije nerala, geraniala i neril acetata (Grafik 3.3), dok u UPGMA dendogramu formira klaster D (Slika 3.3). Kod populacija P24, P26 i P27 najznaĉajnije su komponente linalil acetat, linalool i mircen. PCA1 osa odvaja ove populacije od oszalih na osnovu koncentracije ovih komponenti (Grafik 3.3), a na UPGMA dendogramu formiraju klaster A (Slika 3.3). U etarskom ulju populacije P24 najzastupljenija komponenta je linalil acetat sa 22,94%, dok je linalool zastupljen sa 11,74%, a mircen 108 sa 18,08%. Kod populacije P26 najzastupljenija komponenta etarskog ulja je, takoĊe, linalil acetat sa 33,89%, a slede linalol sa 17,05% i mircen sa 7,51%. Kod ove populacije znaĉajna komponenta etarskog ulja je i biciklogermakren sa 11,88%. U etarskom ulju populacije P27 najzastupljenija komponenta je linalool sa 34,42%, a slede linalil acetat sa 14,56% i mircen sa 14,24%. Ovakav hemotip koji se karakteriše znaĉajnim uĉešćem linaloola i linalil acetata je opisan kod nekih populacija taksona sa Iberijskog poluostrva, Th. leptophyllu ssp. leptophyllu (Blázquez i sar., 1989), Th. zygis (García Martín i GarcíaVallejo, 1983) i Th. camphoratus (Salgueiro i sar., 1997a). Kod ispitivane populacije vrste Th. moesiacus P31, najzastupljenija komponenta etarskog ulja je α-terpinil acetat, pri ĉemu ni jedna druga komponenta ne prelazi koncentraciju od 10%. PCA3 osa jasno odvaja ovu populaciju od ostalih iz podsekcije Pseudomarginati na osnovu koncentracije α-terpinil acetata (Grafik 3.3), dok na UPGMA dendogramu formira klaster B (Slika 3.3). Ovaj hemotip je odsta redak kod vrsta roda Thymus i javlja se kod nekih populacija Th. herba-barona (Corticchiato i sar., 1998), kao i kod Th. longicaulis (Grujić Jovanović i sar., 2009). Kod ispitivane populacije vrste Th. praecox P32 glavna komponenta etarskog ulja je (E)-kariofilen sa 20,48%, dok je γ-kadinen zastupljen sa 17,84%. koji se ne navodi kao komponenta koja prelazi 10% ni kod jedne isopitivane populacije. Ova populacija se odvaja na PCA2 osi na osnovu koncentracije ove dve komponente, dok na UPGMA dendogramu formira klaster C. Postojanje hemotipova kod roda Thymus je poznato i dobro dokumentovano i samatra se da se na rasprostranjenje hemotipa imaju uticaj ekološki faktori (Thompson i sar., 2003). Poznavanje hemotipa odreĊene populacije je od znaĉaja s obzirom da etarska ulja biljaka mogu imati razliĉite biološke aktivnosti. Biološka aktivnos etarskih ulja ispitivana je kod mnogih vrasta roda Thymus i pokazano je da imaju izrazita antibakterijska i antifungalna svojstva (Sakagami i sar., 2005; Kizil i Uyart, 2006; Saad i sar, 2010) koja su posledica prisustva fenolnih komponenti timola, karvakrola, γ- terpinena i p-cimena (Nedorostova i sar., 2008). Kod populacija Th. glabrescens je utvrĊeno da antioksidativna svojstva zavise od koncentracije fenolnih komponenti etarskog ulja (Maksimović i sar., 2008b). 109 4.2 Površinski flavonoidi U Tabeli 3.16 se zapaţa da se na osnovu sastava površinskih flavonoida ispitivane populacije vrsta roda Thymus sa podruĉja Srbije mogu podeliti u dve grupe. Prvoj grupi bi pripadale vrste koje imaju niske i srednje koliĉine površinskih flavonoida, kao i one kod kojih su se površinski flavonidi nalazili samo u tragovima. Kod ove grupe su najzastupljeniji flavoni sa 5,6-diOH-7-OMe i 5,6-diOH-7,8-diOMe supstitucionom šemom u A prstenu. U drugu grupu bi se mogle svrstati populacije koje, uglavnom, imaju malu koliĉinu površinskih flavonoida i kod kojih je su najzastupljeniji flavoni sa 5-OH-6,7-diOMe i 5-OH-6,7,8-triOMe supstitucionom šemom u A prstenu. Većina ispitivanih populacija Th. pulegioides (podsekcija Alternantes), po prisustvu površinskih flavonoida pripada prvoj grupi vrsta. Kod populacija P02, P03, P04, P05 i P09 najzastupljeniji flavon je 5,6,-diOH-7,3′,4′-triOMe, dok je drugi po zastupljenosti 5,6-diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe. Kod populacije P06, ova dva jedinjenja su u obrnutom odnosu, a kod populacije P01, je luteloin bio najzastupljenija komponenta. Luteolin se javlja kao komponenta druga po zastupljenosti i kod P03 i P04, dok je kod P06 i timonin dobro zastupljen. Ovi rezultati su u saglasnosti sa rezultatima koje su dobili Marin i sar. (2003), koji su ispitivali vrste roda Thymus iz Makedonije. Kod Th. pulegioides iz Makedonije najzastupljeniji površinski flavon je takoĊe bio 5,6,-diOH- 7,3′,4′-triOMe, dok je drugi po zastupljenosti bio ladanein, koji je u većini uzoraka iz Srbije prisutan, ali ne u velikom procentu. Kod uzoraka Th. pulegioides sa Pirinejskog poluostrva glavni površinski flavonoid je bio 5,4′-diOH-6,7-diOMe (cirsimaritin), a 5,6,4′-triOH-7,8-diOMe (timusin) i 5,6,4′-triOH-7,8,3′-triOMe (timonin) su takoĊe bili vaţne komponente u ovim uzorcima (Hernández i sar., 1987). Ni jedan od ovih površinskih flavonoida se nije nasao ni u tragovima kod populacija iz Srbije, osim timonina, što je već pomenuto kod P06. Ovo dodatno ukazuje, kako su naveli Marin i sar. (2003), da u okviru ove vrste koja ima široko rasprostranjenje postoji izraţena infraspecijska varijabilnost. Iz podsekcije Isolepides su ispitivane populacije vrsta Th. glabrescens, Th. marschallianus i Th. pannonicus. U okviru ove podsekcije ispitivane vrste pripadaju obema grupama. 110 Kod ispitivanh populaciaj Th. glabrescens glavni površinski flavon je 5,6,- diOH-7,3′,4′-triOMe, a još su znaĉajno zastupljeni i 5,6-diOH-7,4′-diOMe (ladenein) i 5,6-diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe. Izuzetak je samo P12 kod koje je glavni površinski flavonoid 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin), koji je kod ostalih populacija prisutan ali ne u velikoj koliĉini. Kod uzorka Th. glabrescens iz Makedonije glavni površinski flavonoid je bio 5,6-diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe, a zanaĉajni su bili i 5,6,-diOH-7,3′,4′- triOMe i 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin) (Marin i sar., 2003). Kod populacija vrste Th. marschallianus P17 i P18 dominantan površinski flavonoid je 5-OH-6,7,4′-triOMe (salvigenin), a drugi po zastupljenosti je 5-OH- 6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B). Kod populacije P16 dominantan je 5-OH-6,7,8,4′- tetraOMe (gardenin B), drugi je 5-OH-6,7,4′-triOMe (salvigenin). Kod P18 je takoĊe utvrĊeno prisustvo i flavanona eriodiktiola i metoksilovanih flavanona. Za ispitivane populacije Th. pannonicus utvrĊena je niska koliĉina, osim kod P23 gde je bila srednja, kao i velika varijabilnosti u sastavu površinskih flavonoida. Kod P19 i P20 dominantan je flavon je 5-OH-6,7,4′-triOMe (salvigenin), dok je drugi po znaĉaju 5-OH-6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B). Populacija P34 ima 5-OH-6,7,8,4′- tetraOMe (gardenin B) kao dominantan flavon, dok je 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin) drugi po znaĉaju. Kod populacije P23 5,6,4′-triOH-7,8-diOMe (thymusin) je dominantan, a drugi po koliĉini su 5,6,4′-triOH-7,3′-diOMe i 5,6,-diOH-7,3′,4′-triOMe. Kod P22 su prisutni 5,4′-diOH-6,7,8-triOMe (xanthomicrol) i 5-OH-6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B), a kod P21 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin) i 5-OH-6,7,8,3′,4′- pentaOMe (5-desmethylnobiletin), u malim koliĉinama. Kod populacija Th. pannonicus prisutni su i metoksilovani flavanoni, osim kod P23 i P34. Podela podsekcije Isolepides na dve grupe prema flavonoidnim profilima ukazuje da se Th. glabrescens izdvaja od druge dve vrste iz ove podsekcije, ali i da je ova vrsta sliĉnija po profilu površinskih flavonida vrsti Th. pulegioides., od kojih se razlikuje po nešto većim koliĉinama ladaneina. Vrste Th. marschallianus i Th. pannonicus jasno pripadaju drugoj grupi po flavonoidnom profilu. Iz ove grupe se izdvaja P23 koja je jedina od ispitivanih populacija kod koje je glavni flavon timusin, što je znaĉajan flavon kod vrsta roda Thymus sa Iberijskog poluostrva (Horwath i sar., 2008; Hernández i sar., 1987; Corticchiato i sar., 1995). 111 Kod ispitivanih vrsta iz podsekcije Pseudomarginati koliĉina površinskih flavonoida je mala ili samo u tragovima. Kod sve ĉetiri populacije Th. balcanus, P24, P25, P26 i P27, najzastupljeniji je 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin), a znaĉajan je još i 5,6-diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe. Marin i sar. (2003) su u svom radu ukljuĉili bili tri varijeteta vrste Th. balcanus iz Makedonije. Kod Th. balcanus var. balcanus glavni površinski flavonoid je bio 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin), a kod Th. balcanus var. vandasii i Th. balcanus var. micevskii glavni površinski flavonoid je bio 5-OH-6,7,8,4′- tetraOMe (gardenin B), koji kod uzoraka iz Srbije nije pronaĊen ni u tragovima. Kod uzoraka iz Makedonije je znaĉajno bio zastupljen i 5-OH-6,7,8,3′,4′-pentaOMe (5- desmethylnobiletin) koji kod uzoraka iz Srbije nije konstatovan ni u tragovima. Kod populacije vrste Th. moesiacus, P31, utvrĊeno je prisustvo male kolĉine površinskih flavonoida i po prisustvu 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin) i 5,6-diOH-7,8,3′,4′- tetraOMe pripadaju istom flavonoidnom profilu kao i Th. balcanus, mada je luteolin iamo najveću prisutnost. Kod Th. moesiacus var. moesiacus iz Makedonije najznaĉajniji je bio 5,6,-diOH-7,3′,4′-triOMe (Marin i sar., 2003) što ga, po sastavu površinski flavonoida ĉini sliĉnijim Th. pulegioides i Th. glabrescens iz Srbije. Kod Th. praecox je determinisana mala koliĉina flavonoida i kao dominantan se javlja 5-OH-6,7,4′-triOMe (salvigenin), a utvrĊeno je još i prisustvo 5-OH-6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B), kao i prisustvo metoksilovanih flavanona, što nije sluĉaj ni kod jedne druge vrste iz ove podsekcije. Ovakav flavonoidni profil pribliţava ovu populaciju ispitivanim populacijama vrsta Th. marschallianus i nekim populacijama Th. pannonicus. Ovakva razlika izmeĊu flavonoidnih profila Th. balcanus i Th. moesiacus, s jedne strane i Th. praecox, s druge, ukazuje da njihovo grupisanje u Th. praecox agregat treba preispitati. I kod populacija iz Makedonije došlo je do razdvajanja vrsta iz ovog agregata i do grupisanja u razliĉite flavonoidne profile (Marin i sar., 2003). Gardenin B je bio vaţan flavon i kod nekih ispitivanih populacija Th. striatus iz Crne Gore (Marin i sar., 2005), vrsti koja pripada sekciji Hyphodromi, dok je kod Th. praecox sa Pirinejskog poluostrva glavni površinski flavonoid 8-methoxycirsilineol, uz znaĉajne koliĉine cirsiliola i 5- desmethylnobiletin i 5-desmethylsinensetina (Hernández i sar., 1987). Analiza populacija vrsta Thymus hyemalis i Thymus baeticus kao i velikog broja njihovih putativnih hibrida iz jugoistoĉne Španije pokazala je zavisnost površinskih flavonnida i lokaliteta (Horwath i sar., 2008). Veza izmeĊu flavonoidnog profila, lokaliteta i 112 klimatskih uslova takoĊe je utvrĊena i kod Parahebe catarractae (Grayer-Barkmeijer, 1978), roda Phlomis (Tomás i sar., 1986) i kod Mimulus aurantiacus (Hare, 2002). 4.3 AFLP analiza U ranijim ispitivanjima vrsta roda Thymus, analiza ITS markera (Internal Transcribed Spacer) se pokazala neprikladnom za rešavanje filogenetskih odnosa izmeĊu vrsta ovoga roda sakupljenih na podruĉju Srbije (Dajić Stevanović i Šoštarić, 2006), mada je ITS uspešno korišćen pri analizi nekih bliskih rodova iz familije Lamiaceae (Jamzad et al., 2003). Na višim taksonomskim nivoima upotreba AFLP markrea za rešavanje filogenetskih odnosa se ponekad smatra kontoverznom zbog mogućeg visokog nivoa homoplazija (Meudt and Clarke, 2007), ali s druge strane, na niţim taksonomskim nivoima AFLP analiza se pokazala izuzetno korisnom za donošenje procena o filogenijama koje nisu dovoljno rešene upotrebom DNK sekvenci kada varijacija izmeĊu sekvenci nije izraţena (Beardsley et al., 2003; Després et al., 2003; Safer et al., 2011). Ovom prilikom, pri ispitivanju taksona roda Thymus iz Srbije, upotreba AFLP markera se ĉini prikladnom za utvrĊivanje komplikovanih odnosa koji ukljuĉuju i ĉeste sluĉajeve hibridizacije izmeĊu razliĉitih vrsta. PoreĊenjem granica taksona roda Thymus kako su date u Flori SR Srbije (Diklić, 1974) i Flora Europaea (Jalas, 1972) vidljivo je veliko neslaganje, kako u morfološkim karakteristikama pojedinih vrsta, tako i u rasprostranjenju odrĊenih vrsta u Evropi. Th. pulegioides pripada podsekciji Alternantes i u Flora Europaea i u Flori SR Srbije ovaj takson ima iste okvire. TakoĊe, prema oba izvora široko je rasprostranjen u Evropi. Sve ispitivane jedinke vrste Th. pulegioides formiraju posebanu kladu koja ima visoku bootstrap podrušku i ujedno cela ova grupa je najviše divergirala od ostalih vrsta koje su ukljuĉene u ovu analizu, sa najvišom srednjom ST vrednošću. Za K=2 sve jedinke se grupišu u Klaster A, ĉime su izdvojene od ostalih jedinki. Genetiĉka izdvojenost vrste Th. pulegioides je podrţana i morfološkim karakterima, pošto je za ovu vrstu karakeristiĉno gonotrihno stablo po ĉemu se lako razlikuje od ostalih vrsta ukljuĉenih u ovo ispitivanje. Prema dobijenim rezultatima podsekcija Isolepides je polifiletska, mada su morfološke razlike meĊu obuhvaćenim vrstama veoma male. Prema Flora Europaea 113 vrsta Th. glabrescens ima rasprostranjenje u centralnoj i jugo-istoĉnoj Evropi i Turskoj. Klada koja obuhvata jedinke ove vrste ima visoku bootstrap podršku. Za K=3 sve jedinke vrste Th. glabrescens su grupisane u Klaster B. Th. marschallianus se u Flora Europaea tretira kao sinonim za Th. pannonicus, koji je opisan kao vrsta sa rasprostranjenjem u centralnoj i jugo-istoĉnoj Evropi. Klada koju formiraju jedinke koje pripadaju Th. marschallianus i Th. pannonicus nema bootstrap podršku veću od 50% i jedinke ove dve vrste su meĊusobno izmešane. AMOVA pokazuje da je ST vrednost izmeĊu ove dve vrste veoma niska, što ukazuje da ove dve vrste meĊusobno nisu diferencirane. Za K=5 jedinke obe vrste su preteţno svrstane u Klaster E. Morfološke razlike izmeĊu Th. glabrescens i Th. maschallianus veoma male i njihovo grupisanje u razliĉite klade je neoĉekivano. MeĊutim, i ranije je utvrĊeno da su unutar ove grupe taksonomski odnosi veoma nejasni (Marin i sar., 2003). Th. marschallianus i Th. pannonicus se morfološki jasno razlikuju po indumentumu na listovima, dok su kod Th. pannonicus listovi prekriveni višećelijskim neţlezdanim dlakama; listovi kod Th. marschallianus su goli. Sliĉna situacija je uoĉena i kod irskih populacija Quercus petrea i Q. robur, koje su se znatno bolje razlikovale na osnovu morfoloških karaktera nego analizom molekularnih markera (AFLP) (Kelleher i sar., 2005). Bez obzira na ovu jasnu morfološku razliku ove dve vrste roda Thymus, su genetiĉki nedovoljno razliĉite, što podrţava pristup iz Flora Europaea da se tretiraju kao jedna vrsta. Unutar podsekcije Pseudomarginati i Jalas, (1972) (Flora Europaea) i Diklić (1974) i (Flora SR Srbije) navode da je prisutana velika morfološka varijabilnost, kako izmeĊu vrsta, tako i unutar samih vrsta. Jedinke sve tri vrste iz ove podsekcije, koje su ukljuĉene u ovo ispitivanje, formiraju monofiletsku kladu, koja ipak nije podrţana visokom bootstrap vrednošću, dok su, s druge strane, na nivou vrste, Th. balcanus, Th. praecox i Th. moesiacus dobro podrţani. Za K=5 jedinke ove tri vrste su preteţno grupisane u Klaster B. Prema Jalas-u (1972) Th. balcanus je opisan kao Thymus praecox Opiz subsp. polytrichus (A. Kern. ex Borbás) Jalas, vrsta sa alelotrihnim stablom i rasprostranjenjem u juţnojEvropi i juţnom delu centralne Evrope. Prema istom izvoru Th. praecox, kako je opisan u Flori SR Srbije, je Thymus praecox Opiz subsp. skorpilii (Velen.) Jalas, 114 vrsta sa holotrihnim stablom i rasprostranjenjem u severnim i centralnim delovima Balkanskog poluostrva. Jedinke vrsta Th. balcanus i Th. praecox su se odvojeno grupisale. TakoĊe, ST vrednost izmeĊu ove dve vrste je visoka, što ukazuje na postojanje genetiĉke diferencijacije izmeĊu ove dve vrste. Th. moesiacus je u Flora Europaea opisan kao Th. longicaulis C. Presl, vrsta sa alelotrihnim stablom i rasprostranjenjem u centralnoj i jugo-istoĉnoj Evropi. Pri prouĉavanjima blisko srodnih, meĊusobno ukrštajućih vrsta, utvrĊeno je da je najveći deo genetiĉka varijabilnost, dobijena analizom AFLP markera, unutar samih vrsta, a ne izmeĊu vrsta. U sluĉaju ĉetiri vrste iz roda Quercus preko 90% varijabilnosti je utvrĊeno unutar samih vrsta (Dodd i Kashani, 2003 ). IzmeĊu populacija svih analiziranih vrsta je primećena visoka vrijabilnost (Tabela 3.19), dok je komponenta varijabilnosti izmeĊu vrsta bila relativno niska, što ukazuje da diferencijacija izmeĊu vrsrta nije izraţena (Tabela 3.18). Razlog za ovo moţe biti ili brza evolucija AFLP markera ili retikulatna evolucija. Ova druga hipoteza je verovatnija, naroĉito ukoliko se ima u vidu da reproduktivna izolacija izmeĊu vrsta sekcije Serpyllum gotovo da ne postoji (Morales, 2002). Vrste ukljuĉene u ovo ispitivanje odaju utisak izraţenog retikulatnog sistema, koji se javlja ĉesto kod blisko srodnih vrsta (Sang i sar., 1995), a naroĉito u sluĉajevima kada se dve ili više vrsta javljaju simpatriĉki. U mnogim sluĉajevima kada je došlo do retikulatne evolucije utvrĊeni su razliĉiti nivoi ploidije unutar vrste ili roda (Guo et al., 2005, 2008; Ishikawa et al., 2009). Aneuploidija je odigrala vaţnu ulogu tokom evolucije roda Thymus, i ovaj fenomen je odgovoran za razliĉite brojeve hromozoma ĉak i unutar iste vrste (Morales, 1997). UtvrĊeni su razliĉiti brojevi hromozoma kod svih vrsta koje su ukljuĉene u ovo ispitivanje, kod Th. pulegioides 2n=28, 30, kod Th. glabrescens 2n=28, 32, 52, 56 i 58, kod Th. pannonicus 2n=28 i 35 i kod Th. praecox 2n=24, 28, 50, 54, 56 i 58 (Morales, 1997). Rezultati pokazuju da se podsekcije Alternantes i Pseudomarginati mogu smatrati dobrim podsekcijama. S druge strane, u podsekciji Isolepides, Th. glabrescens se jasno izdvaja od druge dve vrste iz ove podsekcije, iako su morfološki karakteri veoma sliĉni onima kod Th. marschallianus. IzmeĊu vrsta Th. marschallianus i Th. pannonicus, koje su takoĊe iz podsekcije Isolepides, genetiĉka diferencijacija nije izraţena, mada se morfološki znaĉajno razlikuju. Sliĉno je primećeno u zonama hibridizacije dve vrste roda Cardamine (Brassicaceae), gde je skorašnja studija pokazala da morfološki karakteri, 115 posmatrani nezavisno, mogu da navedu na pogrešan zakljuĉak o psmatranim genotipovima (Lihova et al., 2007). Sliĉni rezultati su dobijeni i ispitivanjem mikrosatelitnih regiona kod hibrida Quercus coccifera L. i Quercus ilex L. (Ortego and Bonal, 2009), kao pri ispitivanju skorih hibridizacija u okviru Ĉileanskih vrsta roda Puya (Bromeliaceae) pomoću AFLP markera (Shulte et al., 2010). Ovi rezultati govore u prilog hipotezi o stalnom protoku gena izmeĊu bliskih vrsta u sekciji Serpyllum roda Thymus. U sluĉajevima kada se dve, ili više vrsta javljaju simpatriĉki, ekološki faktori, kao na primer senovito i vlaţnije stanište u odnosu na suvlje, otvoreno stanište, mogu da utiĉu na selekciju razliĉitih morfoloških i fizioloških tipova (na primer: dlakavost jedinki i/ili postojanje razliĉitih hemotipova), i na taj naĉin ih stabilizuju, uprkos pretpostavljenom stalnom protoku gena (Schmidt-Lebuhn, 2007). Iz svega iznetog, moţe se smatrati neprikladnim da se sve ispitivane populacije svrstaju u svega dve ili tri vrste, jer bi se na taj naĉin zanemarila ekološka i regionalna diferencijacija. TakoĊe, lošije bi se razumela morfološka, genetiĉka i ekološka varijabilnost. Stoga je najuputnije da se na vrste roda Thymus primeni filogenetski koncept vrste, prema kojem vrste predstavljaju deo filogenije izmeĊu dve taĉke grananja. Drugim reĉima, vrste bi bile najmanji agregat populacija, kod seksualne reprodukcije, ili linija, kod aseksualne reprodukcije, koje su, na osnovu stanja odreĊenih karaktera razlikuju od drugih grupa date filogenije (semaforonti). Filogenetska definicija vrste je zasnovana na karakterima i orijentisana na obrasce (Nixon and Wheeler, 1990). Ovakva definicija dopušta genetiĉku razmenu sa drugim vrstama sve dok ova razmena ne spreĉava nezavisni evolutivni razvoj ovih populacija (Luckow, 1995), što je izrazito istinit opis naroĉito za vrste podsekcije Isolepides. 4.4 Opšta diskusija Ispitivane populacije vrsta roda Thymus pripadaju trima podsekcijama skcije Serpyllum, i njihovo grupisanje na osnovu fitohemijskih karaktera i molekularnih marker ne odgovara u potpunosti njihovom taksonomskom poloţaju. Unutar Th. pulegioides (podsekcije Alternantes) jasno se uoaĉavaju dva hemotipa, geraniolni (P02, P05 i P09) i fenolni tip (P01, P03, P06 i P04). Po sastavu površinskih flavonoida, takoĊe, se mogu uoĉiti dve grupe vrsta. P02, P03, P04, P05 i 116 P09 najzastupljeniji flavon je 5,6,-diOH-7,3′,4′-triOMe, dok je drugi po zastupljenosti 5,6-diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe. Kod populacije P06, ova dva jedinjenja su u obrnutom odnosu, a kod populacije P01, je luteloin bio najzastupljenija komponenta. Analiza AFLP markera je, s druge strane, pokazala da sve populacije vrste Th. pulegioides formiraju jednu monofiletsku kladu sa visokom Bootstrap podrškom BS 94%. U podsekciji Isolepides, populacije vrste Th. glabrescens su jednoobrazne i po sastavu eetraskih ulja i po sastavu površinskih flavonoida. Naime, sve populacije se mogu okarakterisati kao fenolni hemotip, a najzastupljeniji površinski flavonoidi su 5,6,-diOH-7,3′,4′-triOMe, 5,6-diOH-7,4′-diOMe (ladenein) i 5,6-diOH-7,8,3′,4′- tetraOMe. Kod populacije P12 glavni površinski flavonoid je 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin), koji je kod ostalih populacija prisutan ali ne u velikoj koliĉini. Po sastavu etarskih ulja i površinskih flavonoida populacije Th. glabrescens su mnogo sliĉnije populacijama P01, P03, P06 i P04 vrste Th. pulegioides nego populacijama drugih vrsta iz podsekcije Isolepides, ali u Neighbour joining dendogramu dobijenom na osnovu AFLP podataka populacije Th. glabrescens se grupišu se u monofiletsku kladu sa Bootstrap podrškom od 93%. Populacije druge dve vrste podsekcije Isolepides, Th. marschallianus i Th. pannonicus, izuzetno su heterogene i po sastavu etarskih ulja i po sastavu površinskih flavonoida. Sve populacije Th. marschallianus, P16, P17 i P18, imaju germakren-D kao glavnu komponentu etarskog ulja što je sluĉaj i sa populacijom P20 vrste Th. pannonicus, Populacije Th. marschallianus, P16, P17 i P18, i populacija Th. pannonicus P20 pripadaju istoj grupi i po sastavu površinskih flavonoida, s obzirom da je najzastupljeniji 5-OH-6,7,4′-triOMe (salvigenin) i 5-OH-6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B). Isti odnos površinskih flavonoida ima i populacija Th. pannonicus P19, kod koje ni jedan sastojak etarskog ulja nije dominantan, već α-pinen, limonen i (E)-β- ocimen javljaju u sliĉnom procentu. Za etarsko ulje populacije Th. pannonicus P21 karakteristiĉno je prisustvo linaloola u visokom procentu, dok su od površinskih flavonoida prisutni samo 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrelin) i 5-OH-6,7,8,3′,4′- pentaOMe. Populacija Th. pannonicus P22se odlikuje visokim procentom E-kariofilena, a potom, i limonena u etarskom ulju, dok je su od površinskih flavonoida prisutni 5,4′- diOH-6,7,8-triOMe (ksantomikrol) i 5-OH-6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B). Populacija Th. pannonicus P23 karakteristiĉna je po izuzetno visokoj koncentraciji nerala i geraniala u etarskom ulju. Ovo je jedina populacija ove vrste koja ima srednju 117 koncentraciju površinskih flavonoida i kod koje je 5,6,4′-triOH-7,8-diOMe (timusin) najznaĉajniji, a slede po znaĉaju 5,6,4′-triOH-7,3′-diOMe i 5,6,-diOH-7,3′,4′-triOMe. U etarskom ulju populacije Th. pannonicus P34 dominantna jedinjenja su mikren i α- terpinel, dok je 5-OH-6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B) najznaĉajniji flavon, a 5,6-diOH- 7,8,4′-triOMe (pebrellin) drugi po znaĉaju. Na Neighbour-joining stablu (Slika 3.4), klada koju formiraju jedinke koje pripadaju jedinke Th. marschallianus i Th. pannonicus nema bootstrap podršku veću od 50% i jedinke ove dve vrste su meĊusobno izmešane. AMOVA pokazuje da je ST vrednost izmeĊu ove dve vrste veoma niska, što ukazuje da ove dve vrste meĊusobno nisu diferencirane. Od ispitivanih populacija podsekcije Pseudomarginati, tri populacije vrste Th. balcanus, P24, P27 i P26, imaju visok sadrţaj mikrena, linaloola i linalil acetata u etarskom ulju, dok su kod P25 u etarskom ulju najzastupljeniji neral, geranial i uz ova dva jedinjenja i neril acetat. S druge strane, kod sve ĉetiri populacije Th. balcanus najznaĉajniji površinski flavonoid je5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin), a zatim 5,6- diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe. Kod populacije Th. moesiacus P31, glavni sastojak etarskog ulja je α-terpinil aceta, dok je od površinskih flavonoida najznaĉajniji je luteolin, s time što po prisustvu 5,6-diOH-7,8,4′-triOMe (pebrellin) i 5,6-diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe ova populacija je po flavonoidnom profilu sliĉna populacijama Th. balcanus. U etarskom ulju populacije Th. praecox P32 najveću koncentraciju imaju (E)-kariofilen i γ-kadinen. Koliĉina površinskih flavonoida je niska i prisutni su 5-OH-6,7,4′-triOMe (salvigenin) i 5-OH-6,7,8,4′-tetraOMe (gardenin B). Jedinke sve tri vrste iz ove podsekcije, koje su ukljuĉene u ispitivanje AFLP markera, formiraju monofiletsku kladu, koja ipak nije podrţana visokom bootstrap vrednošću, dok s druge strane, na nivou vrste, Th. balcanus, Th. praecox i Th. moesiacus dobro podrţani. Sastav etarskih ulja ispitivanih populacija je izuzetno raznovrstan tako da ne daje sliku o filogenetskim odnosim meĊu ispitivanim populacijama. Satatistiĉka analiza sastava etarskih ulja za interperetaciju razliĉitih odnosa meĊu lekovitim i aromatiĉnim biljkama se pokazala u nekim sluĉajevima izuzetno prikladnom, kao na primer za karakterizaciju dve podvrste vrste Cistus creticus L. (Paolini i sar., 2009) ili populacija Helichrysum italicum (Roth) G. ssp. italicum (Morone-Fortunato i sar., 2010). S druge strane, kod ispitivanja gajenih sorti Ocimum basilicum L. poreĊenjem sastava etarskih ulja i AFLP markera, utvrĊeno je da genetiĉka sliĉnost ili razliĉitost ne odraţava 118 obavezno sliĉnost ili razliĉitost karaktera kao što je sastav etarskog ulja (Labra i sar., 2004). Trinidade i sar. (2008) su ispitujući genetiĉki diverzitet, pomoću RAPD markera, kao i hemijski polimorfizam kod populacija Thymus caespititius sa ostrva Pico, São Jorge i Terceira, koja pripadaju Azorskom arhipelagu, dobili raziliĉito grupisanje populacija na osnovu ovih karaktera. Kod pet vrsta roda Thymus iz juţne Italije, takoĊe je analiziran sastav etarskih ulja, meĊutim hemotipovi nisu korespondirali sa taksonomskom pripadnošću (De Lisi i sar., 2011), što je sluĉaj i sa vrstama iz Srbije. 119 5. Zaključci 1. Na osnovu ispitivanja sastava etarskih ulja, površinskih flavonoida i analize AFLP markera izabranih populacija vrsta iz sekcije Serpyllum roda Thymus moţe se zakljuĉiti da meĊu vrstama ove sekcije postoji visoki stepen genetiĉke kompatibilnosti, da ne postoji ĉvrsta reproduktivna barijera izmeĊu vrsta, te postoji mogućnost hibridizacije ukoliko jedna ili više vrsta ţive simpatriĉki. Ipak, na osnovu rezultata moţe se konstatovati da populaciona struktura postoji i da su, sa izuzetkom Th. pannonicus i Th. marschallianus, sve ispitivane vrste – dobre vrste. 2. Vrsta Th. pulegioides, koja je jedina ispitivana vrsta iz podsekcije Alternantes, pokazala se kao dobra vrsta po svim ispitivanim kriterijumima. U okviru populacija ove vrste utvrĊeno je postojanje samo dva hemotipa, fenolnog i geraniolnog. Mada je postojanje hemotipova poznato kod vrsta iz roda Thymus, pa se ĉesto i u istoj populaciji nalaze dva, a nekada i više hemotipova, ova hemijska uniformnost se moţe smatrati odrazom genetiĉke koherentnosti. TakoĊe, sve ispitivane populacije ove vrste pripadaju istom flavonoidnom profilu. Kod svih populacija su utvrĊene niske i srednje koliĉine flavonoida, kao i 5,6-diOH-7-OMe i 5,6-diOH-7,8-diOMe supstitucione šeme u A prstenu. Molekularni markeri, tj. AFLP analiza, podrţavaju zakljuĉak da je Th. pulegioides dobra vrsta. Naime, sve ispitivane jedinke vrste Th. pulegioides formiraju posebanu kladu koja ima visoku bootstrap podrušku i ujedno cela ova grupa je najviše divergirala od ostalih vrsta koje su ukljuĉene u ova istraţivanja. 3. U okviru podsekcije Isolepides, vrsta Th. glabrescens se jasno izdvaja od druge dve vrste ove podsekcije. Sve populacije Th. glabrescens po sastavu etarskih ulja pripadaju fenolnom hemotipu, s obzirom da su kod svih populacija utvrĊene visoke koncentracije p-cimena, γ-terpinena i timola. Po sadrţaju površinskih flavonoida sve ispitivane populacije pripadaju istoj grupi, sa niskim i srednjim koliĉnama flavonoida i 5,6-diOH-7-OMe i 5,6-diOH-7,8-diOMe supstitucionim šemama u A prstenu. AFLP markeri, takoĊe, navode na zakljuĉak da je Th. 120 glabrescens dobra vrsta, pošto sve ispitivane jedinke ove vrste formiraju posebnu kladu sa visokom bootstrap podrškom. 4. Vrsta Th. marschallianus, iz podsekcije Isolepides, je po sastavu etarskih ulja ispitivanih populacija, veoma jednoobrazna, pošto sve ispitivane populacije imaju kao najzastupljeniju komponentu germakren-D. Po sadrţaju površinskih flavonoida sve ispitivane populacije pripadaju istoj grupi, sa niskim koliĉinama flavonoida i 5-OH-6,7-diOMe i 5-OH-6,7,8-triOMe supstitucionim šemama u A prstenu. AFLP markeri, meĊutim, ne izdvajaju ispitivane jedinke ove vrste u jednu kladu, već formiraju zajedniĉku kladu sa jedinkama vrste Th. pannonicus. U ovoj kladi jedinke ove dve vrste su izmešane i klada ima bootstrap podršku ispod 50%. 5. Podsekciji Isolepides pripada i vrsta Th. pannonicus. Ova vrsta je po sastavu etarskih ulja najheterogenija od svih ispitivanih taksona ovog roda. Svaka od ispitivanih populacija ima svoj hemotip. Po sadrţaju površinskih flavonoida populacije ove vrste se razlikuju kako po koliĉinama, tako i po tipovima supstitucije u A prstenu. Kod dve populacije prisutna je 5-OH-6,7-diOMe i 5- OH-6,7,8-triOMe supstituciona šema u A prstenu, kod jedne 5,6-diOH-7-OMe i 5,6-diOH-7,8-diOMe, kod jedne 5,6-diOH-7,8-diOMe i 5-OH-6,7,8-triOMe, a kod preostale dve populacije koliĉine površinskih flavonoida su male. Analizom AFLP markera, jedinke ispitivanih populacija su pomešane u zajedniĉkoj kladi sa jedinkama Th. marschallianus. 6. Rrezultati ispitivanja, i fitohemijskih i molekularnih markera, navode na zakljuĉak da je podsekcija Isolepides polifiletska. Prema našim rezultatima, Th. glabrescens je dobra vrsta, dok ne postoji dovoljna genetiĉka diferencijacija izmeĊu populacija Th. pannonicus i Th. marschallianus. U sluĉaju ove dve vrste, a imajući u vidu jasne morfološke razlike, prikladno bi bilo primeniti filogenetski koncept vrste. 7. Iz podsekcije Pseudomarginati ispitivane su populacije vrsta Th. balcanus, Th. moesiacus i Th. praecox. Kod tri ispitivane populacije Th. balcanus, glavne komponente etarskih ulja su linalil acetat, linalool i mircen, dok su kod jedne geranial i neral. Kod ispitivane populacije Th. moesiacus najzastupljenija komponenta etarskog ulja bio je α-terpinil acetat, a kod Th. praecox glavna 121 komponenta etarskog ulja je (E)-kariofilen. Kod ispitivanih vrsta iz ove podsekcije koliĉina površinskih flavonoida je mala ili samo u tragovima. Kod sve ĉetiri populacije Th. balcanus i populacije Th. moesiacus najzastupljeniji je bio pebrellin, a znaĉajan je još bio i 5,6-diOH-7,8,3′,4′-tetraOMe. Ispitivana populacija Th. praecox pripada drugom flavonoidnom profilu, posto su prisutni salvigenin i gardenin B, kao i metoksilovani flavanoni. Molekularni markeri grupišu sve jedinke iz ove podsekcije u monofiletsku kladu, koja ima nisku bootstrap podršku. Na nivou vrste, Th. balcanus, Th. praecox i Th. moesiacus dobro podrţani. Svi ovi rezultati navode na zakljuĉak da je podsekcija Pseudomarginati monofiletska, a ispitivane vrste mogu se smatrati dobrim vrstama. 8. Rezultati i fitohemijskih i molekularnih ispitivanja pokazuju da su, sa izuzetkom Th. marschallianus i Th. pannonicus, dobro genetiĉki diferencirane vrste. U budućim ispitivanjima vrste Th. pulegioides treba ukljuĉiti populacije sa većeg prostora, s obzirom da ova vrsta ima veoma širok areal, kao i populacije drugih vrsta iz podsekcije Alternantes, kao na primer Th. alpestris i Th. comosus. 9. Kod podsekcije Isolepides, Th. glabrescens je dobro diferencirana vrsta I, da bi se to potvrdilo u daljim istraţivanjima, treba ukljuĉiti veći broj populacija sa šireg prostora. Imajući u vidu da se Th. marschallianus i Th. pannonicus genetiĉki nedovoljno razlikuju, za dobijanje jasnije slike odnosa ove dve vrste, u istraţivanja treba ukljuĉiti veći broj populacija, naroĉito onih koje su geografski udaljenije. TakoĊe, trebalo bi primeniti još neke molekulane tehnike prikladne za ispitivanja populacione varijabilnosti, kao što su mikrosateliti. 10. Da bi se dobila jasnija slika o najverovatnije monofiletskom poreklu podsekcije Pseudomarginati kao i potvrda o odgovarajućem shvatanju okvira vrsta, u daljim ispitivanjima treba ukljuĉiti veći broj vrsta i populacija, uz primenu drugih molekularnih markera.. 11. Na osnovu rezultata istraţivanja, moţe se zakljuĉiti da su hemotaksonomski i molekularni pristup i na ovom modelu pokazali znaĉajnu kompatibilnost. To ukazuje na potrebu prouĉavanja ciljnih taksona sa hemotaksonomskog, molekularnog, kao i drugih aspekata u rešavanju filogenetskih odnosa i njihovog taksonomskog statusa. Kombinovanje pristupa je posebno vaţno u sluĉajevima 122 kada se radi o grupama ĉiji su predstavnici morfološki veoma varijabilni i nedovoljno diferencirani, kao što su taksoni iz sekcije Serpyllum, kao i iz drugih sekcija izuzetno kompleksnog roda Thymus. Jedino takav sveobuhvatan pristup moţe da pruţi pouzdaniju sliku o evoluciji i filogenetskim odnosima unutar istraţivane srodniĉke grupe biljaka. 123 Literatura Abad, M.J., Bermejo, P., Villar, A., Sanchez Palomino, S.S., Carrasco, L. (1997). Antiviralactivity of medicinal plant extracts. Phytother. Res. 11: 198–202. Adams, R. P. (2001). Identification of Essential Oil Components by Gas Chromatography / Quadrupole Mass Spectroscopy. Allured Publishing Corporation: Illinois. Adzet, T., Granger, R., Passet, J., San Martin, R. (1977a). Le polymorphisme chimique dans le genre Thymus: ca signification taxonomique. Biochem. Syst. Ecol. 5: 269-72. Adzet, T., Granger, R., Passet, J., San Martin, R. (1977b) Chimiotypes de Thymus mastichina L. Plant. Méd. Phytothér. 11: 275-280. Ausloos, P., Clifton, C., Lias, S. G., Shamim, A., Stein, S. (1992). NIST/EPA/NIH Mass Spectral Database, v. 4.0; U.S. Department of Commerce: Gaitherburg, MD. Barberán, F.A.T. (1986). The flavonoid compounds from the Labiatae. Fitoterapia 57: 67-95. Barberán, F.A.T., Hernándes, L., Tonás, F. (1986). Chmotaxonmic study of flavonoids in Thymbra capitata. Phytochemistry 25 (2): 561-562. Barberán, F.A.T., Nunez, J.M., Tomas F. (1985). An HPLC study of flavones from some Spanish Sideritis species. Phytochemistry 24: 1285-1288. Beardsley, P.M., Yen, A., Olmstead, R.G., (2003). AFLP phylogeny of Mimulus section Erythranthe and the evolution of Hummingbird pollination. Evolution 57: 1397–1410. Bellino, A., Venturella, P., Marcenó, C. (1980). Naringenin and neopocirin from Micromeria species and Calamintha nepeta. Fitoterapia 51: 163-165. 124 Bentham, G. (1834). Lab. Gen. Sp.: Thymus, London. Bentham, G. (1876). Labiatae. In G. Bentham, J. D. Hooker ed(s). Genera plantarum, vol. 2, London: Reeve & Co. Pp. 1160-1223. Blázquez, M.A., Zafra-Polo, M.C., Villar, A. (1989) The volatile oil of Thymus leptophyllus growing in Spain. Planta Med., 55: 198. Boissier, E. (1839-1845). Voyage botanique dans le Midi de I'Espagne, Paris. Brauchler, C., Meimberg, H., Heubl, G. (2010). Molecular phylogeny of Menthinae (Lamiaceae, Nepetoideae, Mentheae) - Taxonomy, biogeography and conflicts. Mol. Phylogenet. and Evol. 55: 501–523. Brauchler, C., Meimberg, H., Abele, T., Heubl, G. (2005). Polyphyly of the genus Micromeria (Lamiaceae) – evidence from cpDNA sequence data. Taxon 54: 639– 650. Briquet, J. (1897). Labiatae. In A. Engler and K. Prantl (eds), Die Nutilrlichen Pflanzenfdmilien IV 36 (a), Leipzig. Brotero, F. A. (1804). Flora Lwitanica, Lisbon. Bryant, J.P., Provenza, F.D., Pastor, J., Reichardt, P.B., Clausen, T.P., Toit (du), J.T. (1991). Interactions between woody plants and browsing mammals mediated by secondary metabolites. Annu. Rev. Ecol. Syst. 22: 431-446. Bucar, F., Males, Z., Plazibat, M. (2005). Essential oil of Thymus bracteosus Vis. ex Benth., an Endemic Species of Dinaric Karst. J. Essent. oil Res.17 (4): 457-458. Bunsawat, J., Elliott, N.E., Hertweck, K.L., Sproles, E., Alice, L.A., (2004). Phylogenetics of Mentha (Lamiaceae): evidence from chloroplast DNA sequences. Syst. Bot. 29: 959–964. Burzanska-Hermann, Z. (1978). Isolation and identification of components of the flavonoid fraction of native Mentha herbs. Acta Pol. Pharm. 35 (6): 673-680. 125 Cabo, J., Cabo, M.M., Crespo, M.E., Jiménez, J., Navarro, C. (1986a). Thymus granatensis Boiss.: II. Etude de son cycle evolutif. Plant. Méd. Phytothh. 20: 129- 134. Cabo, J., Cabo, M.M., Crespo, M.E., JimCnez, J. and Navarro, C. (1986b). Thymus granatensis Boiss.: I. Etude qualitative et quantitative de son huile essentielle. Plant. Méd. Phytothh. 20: 18-24. Cabo, J., Crespo, M.E., Jiménez, J., Navarro, C., Risco, S. (1987). Seasonal variation of essential oil yield and composition of Thymus hyemalis. Planta Med. 53: 380-383. Çadirci, E., Süleyman, H., Gürbüz, P., Kuruüzüm Uz, A., Güvenalp, Z., Demirezer, L. O. (2012). Anti-inflammatory effects of different extracts from three Salvia species. Turk. J. Biol. 36: 59-64. Cantino, P.D., Harley, R.M., Wagstaff, S.J. (1992). Genera of Labiatae: Status and Classification. In R.M. Harley & T. Reynolds (editors.). Advances in Labiate Science: 511-522 (1992). Cantino, P.D., Sanders, R.W. (1986). Subfamilial classification of Labiatae. Syst. Bot. 11: 163-85. Carović-Stanko, K., Liber, Z., Politeo, O., Strikić, F., Kolak, I., Milos, M., Kolak, I., Satovic, Z. (2011). Molecular and chemical characterization of the most widespread Ocimum species. Plant. Syst. Evol. 294: 253–262. Chase, M.W., Soltis, D.E., Olmstead, R.G., Morgan, D., Mishler, B.D., Duvall, M.R., Price, R.A., Hills, H.G., Qiu, Y.-L, Kron, K.A., Rettig, J.H., Conti, E., Palmer, J.D., Manhart, J.R., Sytsma, K.J., Michaels, H.J., Kress, W.J., Karol, K.G., Clark, W.D., Hedren, M., Gaut, B.S., Jansen, R.K., Kim, K.-J., Wimpee, C.F., Smith, J.F., Furnier, G.R., Strauss, S.H., Xiang, Q.-Y., Plunkett, G.M., Soltis, P.S., Swensen, S.M., Williams, S.E., Gadek, P.A., Quinn, C.J., Eguiarte, L.E., Les, D.H., Golenberg, E., Learn, G.H.J., Graham, S.W., Barrett, S.C.H., Dayanandan, S., Albert, V.A., (1993). Phylogenetics of seed plants: an analysis of nucleotide 126 sequences from the plastid gene rbcL. Ann. Missouri Botanical Garden 80: 528– 580. Corticchiato, M., Bernardini, A., Costa, J., Bayet, C., Saunois, A., Voirin, B. (1995). Free flavonoid aglycones from Thymus herba-barona and its monoterpenoid chemotypes. Phytochemistry 40: 115-120. Corticchiato, M., Tomi, F., Bernardini, A.F., Casanova, J. (1998). Composition and infraspecific variability of essential oil from Thymus herba-barona Lois. Biochem. Syst. Ecol. 26: 915-932. Ĉajkanović, V. (1985). Reĉnik srpskih narodnih verovanja o biljkama. SANU, SKZ, Beograd, 1985. Dajic Stevanovic, Z., Sostaric, I. (2006). Review of some useful methods in taxonomical interpretation of difficult taxa of medicinal and aromatic plants. Case: Thymus L. Proceedings of the 4 th Conference on Medicinal and Aromatic Plants of South-East European Countries, 28-31 May, Iasi, Romania: 63-71. Dajic Stevanovic, Z., Sostaric, I., Marin, P.D., Stojanovic, D., Ristic, M. (2008). Population variability in Thymus glabrescens Willd. from Serbia: morphology, anatomy and essential oil composition. Arch. Biol. Sci., Belgrade, 60 (3): 475-483. De Lisi, A., Tedone, L., Montesano, V., Sarli, G., Negro, D. (2011). Chemical characterisation of Thymus populations belonging from Southern Italy. Food Chemistry 125: 1284–1286. Després, L., Gielly, L., Redoutet, B., Taberlet, P. (2003). Using AFLP to resolve phylogenetic relationshipsin a morphologically diversified plant species complex when nuclear and chloroplast sequences fail to reveal variability. Molecular Phylogenetics and Evolution 27: 185-196. Didry, N., Dubreuil L., Pinkas, M. (1994). Activity of thymol, carvacrol, cinnamaldehyde and eugenol on oral bacteria, Pharm. Acta Helv. 69: 25–28. 127 Didry, N., Dubreuil, L., Pinkas, M. (1993). Antibacterial activity of thymol, carvacrol and cinnamaldehyde alone or in combination. Pharmazie. 48: 301–304. Diklić, N., 1974. Thymus L. In: Josifović, M. (Ed.), Flora R. Srbije, SANU, Belgrade, pp. 475-509. Dixon, C. J., Schönswetter, P., Suda, J., Wiedermann, M. M., Schneeweiss, G. M. (2009). Reciprocal Pleistocene origin and postglacial range formation of an allopolyploid and its sympatric ancestors (Androsace adfinis group, Primulaceae). Mol. Phyl. Evol. 50: 74–83. Dodd, R. S., Kashani, N. (2003). Molecular differentiation and diversity among the California red oaks (Fagaceae; Quercus section Lobatae). Theoretical and Applied Genetics 107: 884 – 892 . Dorman, H.J., Deans, S.G. (2000). Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. J. Appl. Microbiol. 88: 308-316. Echeverrigaray, S., Agostini, G., Atti-Serfini, L., Paroul, N., Pauletti, G.F., Atti dos Santos, A.C. (2001). Correlation between the chemical and genetic relationships among commercial thyme cultivars. J. Agric. Food Chem. 49: 4220–4223. Edwards, C., Soltis, D.E., Soltis, P.S. (2006). Molecular phylogeny of Conradina and other shrub mints (Lamiaceae) from the southeastern USA: evidence for Hybridization in Pleistocene refugia? Syst. Bot. 31: 193–207. Edwards, C.E., Lefkowitz, D., Soltis, D.E., Soltis, P.S. (2008a). Phylogeny of Conradina, related southeastern scrub mints (Lamiaceae) based on GapC genesequences. Int. J. Plant Sci 169 (4): 579–594. Edwards, C.E., Soltis, D.E., Soltis, P.S., (2008b). Using patterns of genetic structure based on microsatellite loci to distinguish between hybridization and incomplete lineage sorting in Conradina. Mol. Ecol. 17: 5157–5174. Elena-Rossell, J.A. (1976). Projet d’une etude de tuxonomie exphimentale du genre Thymus. Doctoral thesis, Montpellier. 128 Erdtman, G. (1945). Pollen morphology and plant taxonomy. IV. Labiatae, Verbenaceae, and Avicenniaceae. Svensk Bot. Tidskr. 39:279-285. Evanno, G., Regnaut, S., Goudet, J., (2005). Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study. Molecular Ecology 14, 2611-2620. Excoffier, L., Smouse, P.E., Quattro, J.M., (1992). Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131, 479-491. Fadli, M., Saada, A., Sayadib, S., Chevalierc, J., Mezriouia, N. E., Pagèsc, J. M., Hassani, L. (2012). Antibacterial activity of Thymus maroccanus and Thymus broussonetii essential oils against nosocomial infection – bacteria and their synergistic potential with antibiotics. Phytomedicine 19: 464– 471. Fan, C., Qiu-Yun Xiang, J. (2003). Phylogenetic analyses of Cornales based on 26S rDNA and combined 26S rDNA-matK-rbcL sequence data. American Journal of Botany 90: 1357-1372. Felsenstein, J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791. Fernandes, R, Heywood, V.H. (1972) In: Flora Europaea Vol. 3. Tutin T.G., Heywood V.H., Burges N.A., Moore D.M., Valentine D.H., Walters S.M., et al. (eds.) Cambridge University Press, Cambridge. Ferreres, F., Barberán, F.A.T., Tomas, F. (1985). 5,6,4’-trihidroxy-7,8- dimethoxyflavone from Thymus membranaceus. Phitochemistry 24 (8): 1869-1871. Ferreres, F., Tomás-Lorente, F., Tomás-Barberán, F.A. (1989). Biochemical Identification of Sideritis serrata x S. bourgaeana hybrids by HPLC analyses of flavonoids. Z. Naturforsch 44c: 568-572. 129 García Martín, D. and García Vallejo, M.C. (1983). Chemotypes of Thymus zygis (Lofl.) L. of Guadarramma Sierra and other places in Castile (Spain). 9th International Essential Oil Congress, Singapore 1983: 134-140. García Vallejo, M.C., Garcia Martín, D., Muñoz, F. (1984). Avance de un estudio sobre las esencias de Thymus mastichina L. español ("Mejorana de españa"). An. Inst. Nac. Inv. Agr. (Madrid), Ser. Forestal, 8: 201-218. Goldblatt, P., Savolainen, V., Porteous, O., Sostaric, I., Powell, M., Reeves, G., Manning, J.C., Barraclough, T.G., Chase, M.W. (2002). Radiation in the Cape flora and the phylogeny of peacock irises Moraea (Iridaceae) based on four plastid DNA regions. Molec. Phylogenet. Evol. 25. (2): 241-360. Gonçalves, M.J., Cruzb, M.T., Cavaleiroa, C., Lopesb, M.C., Salgueiro, L. (2010). Chemical, antifungal and cytotoxic evaluation of the essential oil of Thymus zygis subsp. sylvestris. Industrial Crops and Products 32: 70–75. Gouyon, P.H., Vernet, P., Guillerm, J.L., Valdeyron, G. (1986). Polymorphisms and environment: the adaptive value of the oil polymorphism in Thymus vulgaris L. Heredity, 57: 59-66. Granger, R, Passet, J. (1973). Thymus vulgaris spontane de France: races chimiques et chemotaxonomie. Phytochemistry 12. (7): 1683-1691 Granger, R., Passet, J., Teulade-Arbousset, G. (1963). Diversite des essences de Thymus vulgarir L. La France et ses Parfums, 6: 225-230. Grayer-Barkmeijer, R.J., (1978). Flavonoids in Parahebe and Veronica: a chemotaxonomic study. Biochem. Syst. Ecol. 6, 131-137. Grayer, R.J., Veitch, N.C., Kite, G.C., Price, A.M., Kokubun, T. (2001). Distribution of 8-oxygenated leaf-surface flavones in the genus Ocimum. Phytochemistry 56: 559-567. Greger, H. (1978). Comparative phytochemistry and systematics of Anacyclus. Biochem. Syst. Ecol. 6. (1): 11-17. 130 Grujić Jovanović, S., Marin, P.D., Dzamić, A., Ristić, M. (2009). Essential oil composition of Thymus longicaulis from Serbia. Chemistry of Natural Compounds 45 (2): 265-266. Guerin, G.R. (2005). Nutlet morphology in Hemigenia R.Br. and Microcorys R.Br. (Lamiaceae). Pl. Syst. Evol. 254: 49–68. Gurni, A.A., Kubitzki, K. (1981). Flavonoid chemistry and systematics of the Dilleniaceae. Biochem. Syst. Ecol. 9: 109-114. Guo, Y.-P., Saukel, J., Mittermayr, R., Ehrendorfer, F. (2005). AFLP analyses demonstrate genetic divergence, hybridization, and multiple polyploidization in the evolution of Achillea (Asteraceae-Anthemideae). New Phytologist 166: 273–290. Guo, Y.-P., Saukel, J., Ehrendorfer, F. (2008). AFLP Trees versus scatterplots: evolution and phylogeography of the polyploidy complex Achillea millefolium agg. (Asteraceae). Taxon 57 (1): 153-169. Hammer, Ø., Harper, D.A.T., Ryan P.D. (2001). PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontolo Electron 4(1): 9. Harborne, J.B. (1967). Comparative biochemistry of the flavonoids. Academic Press, London and New York. Harborne, J.B. (1975). Biochemical systematic of flavonoids. In: Harborne, J.B., Marby, T,J., Mabry, H. (EdS), The Flavonoids. Chapman and Hall, London. 1056- 1095. Harborne, J.B. (1977). Variation in pigment patterns in Pyrrhopappus and related taxa of the Cichorieae. Phytochemistry 16: 927-928. Harborne, J.B. (1984). Plant Chemosystematics. Academic Press, London. Harborne, J.B., Boardley, M. (1985). The widespread occurrence zwitterions in nature of anthocyanins as zwitterions. Z. Naturfrosch. C. 40: 305-308 131 Harborne, J.B., Tomas-Barberan, F.A., Williams, C.A., Gil, M.I. (1986). A chemotaxonomic study of flavonoids from European Teucrium species. Phytochemistry. 25. 2811-16. Hare, J.D., (2002). Geographic and genetic variation in the leaf surface resin components of Mimulus aurantiacus from southern California. Biochem. Syst. Ecol. 30, 281-296. Harley, R.M., Atkins, S., Budanstev, A.L., Cantino, .PD., Conn, B.J., Grayer, R., Harley, M.M. (2004). Labiatae. In: Kubitzki, K. (Ed.), The Families and Genera of Vascular Plants VII. Springer, Berlin/Heidelberg. Hartvig, P. (1987). A taxonomical revision of Thymus sect. Teucrioides (Lamiaceae). Pl. Syst. Evol. 155: 197-213. Hernándes, L.M., Tomás-Barberán, F.A., Tomás-Lorente, F. (1987). A chemotaxnomic study of free flavone aglicons from some Iberian Thymus species. Biochem. Syst. Ecol. 15 (1): 61-76. Hörhamer, L., Wsagner, H. (1962). In: Gore, T.S. (EdS), Chemistry of Natural and Synthetic Colour Markers. Academic Press, London: 315. Horváth, G., Kocsis, B., Botz, L., Németh, J., Szabó, L.Gy. (2002). Antibacterial activity of Thymus phenols by direct bioautography. Acta Biol. Szeged. 46: 145- 146. Horwath, A.B., Grayer, R.J., Keith-Lucas, M.D., Simmonds, M.S.J., (2008). Chemical characterisation of wild populations of Thymus from different climatic regions in southeast Spain. Biochemical Systematics and Ecology 36, 117-133. Huff, D.R., (1997). RAPD characterization of heterogeneous perennial ryegrass cultivars. Crop Sci. 37, 557-594. Huguet del Villar, E. (1934). Quelques Thymus du Sud-est Ibérique. Cavanillesia, 6: 104-125. 132 Husain, S.Z., Heywood, V.H., Markham, K.R. (1982). Distribution of flavonoids as chemotaxonomic markers in the genus Origanum L. and related genera in Labiatae. In: Margaris, N,, Koedam, A., Vokou, D. ed(s). Aromatic plants: basic and applied aspects. Martinus Nijhoff, The Hague, Boston, London. 141-52. Ietswaart, J.H. (1980). A taxonomic revision of the genus Origanum (Labiatae). The Hague, Boston, London Leiden University Press. Ishikawa, N., Yokoyama, J., Tsukaya, H. (2009). Molecular evidence of reticulate evolution in the subgenus Plantago (Plantaginaceae). Am. J. Bot. 96 (9): 1627- 1635. Jalas, J . (1982) Thymus. In K.H. Rechinger (ed.), Flora Iranica. Graz. 532-551. Jalas, J. (1971). Notes on Thymus L. (Labiatae) in Europe. I. Supraspecific classification and nomenclature. Bot. J. Linn. Soc. 64(2): 199-215. Jalas, J. (1972). Thymus L. In: Flora Europaea Vol. 3. Tutin T.G., Heywood V.H., Burges N.A., Moore D.M., Valentine D.H., Walters S.M., et al. (eds.) Cambridge University Press, Cambridge. pp. 172-182. Jalas, J. (1973). Thymus subsect. Pseudomarginati in the Himalayas and adjoining western mountain ranges, and in Caucasia. Ann. Bot. Fennici 10: 104-122. Jalas, J. (1982) Thymus. In P.H. Davis (ed.), Flora of Turkey and the East Aegean Islands, Vol. 7, Edinburgh, pp. 349-382. Jamzad, Z, Chase, W.M., Ingrouille, M., Simmonds, M.S.J., Jalili, A., (2003). Phylogenetic relationships in Nepeta L. (Lamiaceae) and related genera based on ITS sequence data. Taxon 52: 21-32. Jullien, F., Voirin, B., Bermillon, J., Favre-Bonvin, J. (1984). Highly oxygenated flavones from Mentha piperita. Phytochemistry 23: 2972. 133 Karuza-Stojaković, L., Pavlović, S., Ţivanović, P., Todorović, B. (1989). Composition and yield of essential oils of various species of the genus Thymus L. Arh. Farm. 39: 105-111. Kaul, T.N., Middleton, E. Jr, Ogra, P.L. (1985). Antiviral effect of flavonoids on human viruses. J. Med. Virol.: 15, 71–79. Kaya, A., Dirmenci, T. (2008). Nutlet Surface Micromorphology of the Genus Nepeta L. (Lamiaceae) in Turkey. Turk. J. Bot 32: 103-112. Kelleher , C. T., Hodkinson, T. R., Douglas, G. C., Kelly, D. L. (2005). Species distinction in Irish populations of Quercus petraea and Q. robur : Morphological versus molecular analyses. Ann. Bot. 96 (7): 1237 – 1246 . Kizil, S., Uyart, F. (2006). Antimicrobial activities of some Thyme (Thymus, Staureja, Origanum and Thymbra) species against important plant pathogens. Asian J. Chem. 18: 1455–1461. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T. (1995). The composition of the essential oils from Thymus macedonicus (Degen et Urumov) Ronn. subsp. macedonicus and Thymus tosevii Velen. subsp. tosevii growing in Macedonia. Farmacija, 43: 13-14. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilof, T. (1996a). Comparative essential oils study of Thymus longidens Velen. var. lanicaulis Ronn. and Thymus longidens var. dassareticus Ronn. Bolletino Chimico Farmaceutico, 135: 239-243. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T. (1996b). Composition of the essential oil from Thymus moesiacus from Macedonia. Planta Med., 62: 78-79. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T., Dorevski, K. (1996c). Essential oil composition of Thymus tosevii ssp. tosevii var. longifrons. Acta Pharm. (Zagreb), 46, 303-308. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T., Dorevski, K. and Ristov, T. (1997). Composition of essential oils of Thymus tosevii ssp. tosevii and Thymus tosevii ssp. substriatus from Macedonia. Pharmazie, 52: 382-386. 134 Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T., Matevski, V. (1998a). Composition of the essential oils of Thymus jankae Chel. var. jankae, T. jankae var. pantotrichw Ronn. and T. jankae var. patentipilus Lyka from Macedonia. J. Essent. Oil Res., 10, 191- 194. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T., Matevski (1998b). Composition of the essential oil of Thymus rohlenae Velen. from Macedonia. J. Essent. Oil Res., 10, 537-538. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T., Matevski (1998c). Composition of the essential oil of Thymus albanus ssp. albanus H. Braun from Macedonia. J. Essent. Oil Res., 10: 335-336. Kulevanova, S., Ristic, M., Stafilov, T. (1999). Composition of the essential oil of Thymus macedonicus subsp. macedonicus (Degen et Urum.) Ronn. from Macedonia. Herba Pol., 45: 80-86. Kuštrak, D., Martinis, Z., Kuftinec, J., Blazevic, N. (1990). Composition of the essential oils of some Thymus and Thymbra species. Flavour Fragr. J., 5: 227-231. Kuzoff, R. K., Sweere, J. A., Soltis, D. E., Soltis, P. S., Zimmer, E. A. (1998). The phylogenetic potential of entire 26S rDNA sequences in plant. Molecular Biology Evolution 15: 251–263. Labra, M., Miele, M., Ledda, B., Grassi, F., Mazzei, M., Sala, F. (2004). Morphological characterization, essential oil composition and DNA genotyping of Ocimum basilicum L. cultivars. Plant Science 167: 725–731. Lewontin, R.C., (1972). The apportionment of human diversity. In: Dobzhansky, T., Hecht, M.K, Steere, W.C. (Eds), Evolutionary Biology 6. Appleton-Century-Crofts, New York, pp. 381–398. Lihova, J., Kuĉera, J., Perny, M., Marhold, K., (2007). Hybridization between two polyploid Cardamine (Brassicaceae) species in northwestern Spain: discordance between morphological and genetic variation patterns. Ann. Bot. 99 (6): 1083-1096. 135 López, V., Akerreta, S., Casanova, E., García-Mina, J. M., Cavero, R. Y., Calvo, M. I. (2007). In Vitro Antioxidant and Anti-rhizopus Activities of Lamiaceae Herbal Extracts. Plant Foods Hum. Nutr. 62:151–155. Loţienė, K., Vaiĉiunienė, J., Venskutonis, P.R. (2003). Chemical composition of the essential oil of different varieties of thyme (Thymus pulegioides) growing wild in Lithuania. Biochem. Syst. Ecol. 31: 249–259. Loţienė, K., Venskutonis, P.R., Šipailienė, A., Labokas, J. (2007). Radical scavenging and antibacterial properties of the extracts from different Thymus pulegioides L. chemotypes. Food Chemistry 103: 546–559. Luckow, M. (1995). Species concepts: assumptions, methods, and applications. Syst. Bot. 20, 589–605. Maksimović, Z., Milenković, M., Vuĉićević, D., Ristić M. (2008a). Chemical composition and antimicrobial activity of Thymus pannonicus All. (Lamiaceae) essential oil. Cent. Eur. J. Biol. 3: 149-154. Maksimović, Z., Stojanović, D., Šoštarić, I., Dajić, Z., Ristić, M., (2008b). Composition and radical-scavenging activity of Thymus glabrescens Willd. (Lamiaceae) essential oil. Journal of the Science of Food and Agriculture 88 (11): 2036-2041. Mamadalieva, N,Z,, Herrmann, F,, El-Readi, M,Z,, Tahrani, A,, Hamoud, R, Egamberdieva, D.R,, Azimova, S.S,, Wink, M. (2011). Flavonoids in Scutellaria immaculata and S. ramosissima (Lamiaceae) and their biological activity. J Pharm Pharmacol. 63(10): 1346-57. Marin, P.D. (1989). A chemotaxonomical and micromorphological study of Micromeria Benth. and related genera from tribe Saturejeae (Lamiaceae). Unpublished Ph. D. thesis, University of Belgrade. Marin, P.D. (1995). Diversity and Taxonomical significance of flavonoids in the Lamiaceae. Arch. Biol. Sci. Belgrade 47 (3-4): 101-109. 136 Marin, P.D. (1996). Orašice i trihome u familiji Lamiaceae. Biološki fakultet, Beograd. Marin, P.D. (2003). Biohemijska i molekularna sistematika biljaka. NNK Internacional, Beograd. Marin, P.D., Grayer, R.J., Kite, G.C., Matevski, V. (2003). External leaf flavonoids of Thymus species from Macedonia. Biochem. Syst. Ecol. 31. (11), 1291-1307. Marin, P.D., Grayer, R.J., Kite, G.C., Veljic, M. (2005). External flavones from Thymus striatus Vahl (Lamiaceae) (2005). Biochem. Syst. Ecol. 33 (11): 1179-1182. Marin, M., Koko, V., Duletic-Laušević, S., Marin, P.D. (2008). Micromorphology of trichomes of Thymus malyi (Lamiaceae). Journal of Microscopy 232: 406 – 409 Marinova, E.M. and Yanishlieva, N.V. (1996). Antioxidative activity of phenolic acids on triacylglycerols and fatty acid methyl esters from olive oil. Food Chem. 56: 139–145 Markham, K.R., Mabry, T..J, Swift, W.T. (1970). Distribution of flavonoids in the genus Baptisia (Leguminosae). Phytochemistry 9: 2359-2364. Mártonfi, P. (1992). Essential oil content in Thymus alpestris pestris in Slovakia. Thaiszia, Kosice 2: 75-78. Mártonfi, P. Greijtovsky, A., Repcak, M. (1994) Chemotype pattern differentiation of Thymus pulegioides on different substrates. Biochem. Syst. Ecol. 22: 819-825. Mastelic, J., Grzunov, K., Kravar, A. (1992). The chemical composition of terpene alcohols and phenols from the essential oil and terpene glycosides isolated from Thymus pulegioides L. grown wild in Dalmatia. Riv. Ital. 3: 19-22. Mayol, M., Rosselló, J.A., Mus, M., Morales, R. (1990). Thymus herba-barona Loisel., novedad para Espaňa, en Mallorca. Anales Jard. Bot. Madrid 47: 516. 137 McPherson, J. K. & Muller, C. H. (1969). Allelopathic effects of Adenostomafasciculatum, 'chamise', in the California chaparral. Ecological Monographs, 39: 177-198. Menitsky, G.L., (1973). Supraspecific taxa in the genus Thymus L. (Labiatae). I-II. Botaniceskyj Zurnal (Leningrad) 58, 794–805. Menitsky, G.L., (1973). Supraspecific taxa in the genus Thymus L. (Labiatae). I-II. Botaniceskyj Zurnal (Leningrad) 58, 994–998. Messana, I., Ferrari, F., Souza, M.A.M., Gacs-Bait, E. (1990). (-)-Salzol, an isopimaranediterpene, and a chalcone from Hyptis salzmanii. Phitochemistry 29: 329-332. Meudt, H. M., Clarke, A. C., 2007. Almost forgotten or latest practice? AFLP applications, analyses and advances. Trends Plant Sci. 12, 106–117. Mockuté, D. and Bernotiené, G. (1998). Essential oil of lemon-scented Thymus pulegioides L. grown wild in Vilnius vicinity. Rust. Res., 34, 131-134. Mockuté, D. and Bernotiené, G. (1999). The main citral-geraniol and cavacrol chemotype of the essential oil of Thymus pulegioides L. growing wild in Vilnius district. J. Agric. Food Chem., 47: 3787-3790. Mockuté, D. and Bernotiené, G. (2001). The α-terpenyl acetate chemotype of essential oil of Thymus pulegioides L. Biochem. Syst. Ecol. 29: 69-76. Moghaddam, M., Omidbiagi, R., Naghavi, M.R., 2011. Evaluation of genetic diversity among Iranian accessions of Ocimum spp. using AFLP markers. Biochem. Syst. Ecol. 39: 619-626. Moon, H.K., Hong, S.P., Smets, E., Huysmans, S. (2009a). Micromorphology and Character Evolution of Nutlets in Tribe Mentheae (Nepetoideae, Lamiaceae). Systematic Botany 34(4):760-776. 138 Moon, H.K., Hong, S.P., Smets, E., Huysmans, S. (2009b). Phylogenetic significance of leaf micromorphology and anatomy in the tribe Mentheae (Nepetoideae: Lamiaceae). Botanical Journal of the Linnean Society160: 211–231. Morales, R. (1986). Taxonomía de los géneros Thymus (excluida la sección Serpyllum) y Thymbra en la Península Ibérica. Ruizia 3: 1-324. Morales, R. (1989). El género Thymus L. en la región mediterránea occidental (Lamiaceae). Biocosme Mésogéen 6(4): 205-211. Morales, R. (1994). El género Thymus L. (Labiatae) en Africa. Anales Jard. Bot. Madrid 51(2): 205-236. Morales, R. (1996). Studies on the genus Thymus. Lamiales Newsletter. 4: 6-8. Morales, R. (1997). Synopsis of the Genus Thymus L. In the Mediterranean Area. Lagascalia 19 (1-2): 249-262. Morales, R., (2002). The history, botany and taxonomy of the genus Thymus. In: Stahl-Biskup, E.,. Sáez, F. (Eds.), Thyme: The Genus Thymus. Taylor and Francis, London and New York, pp. 1-43. Morone-Fortunato, I., Montemurro, C,. Ruta, C., Perrini, R., Sabetta, W., Blanco, A., Lorusso, E., Avato, P. (2010). Essential oils, genetic relationships and in vitro establishment of Helichrysum italicum (Roth) G. Don ssp. italicum from wild Mediterranean germplasm. Industrial Crops and Products 32: 639–649 Nedorostova, L., Kloucek, P., Kokoska, L., Stolcova, M., Pulkrabek, J. (2008). Antimicrobial properties of selected essential oils in vapour phase against foodborne bacteria. Food Control 20, 157–160. Nei, M., Li, W.H., (1979). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Academy of Sciences 76, 5269–5273. 139 Nixon, K.C., Wheeler, Q.D., (1990). An amplification of the phylogenetic species concept. Cladistics 6, 211–223. Nguefacka, J., Tamguea, O., Lekagne Dongmoa, J.B., Dakolea, C.D., Lethb, V., Vismerc, H.F., Amvam Zolloa, P.H., Nkengfackd, A.E. (2012). Synergistic action between fractions of essential oils from Cymbopogon citratus, Ocimum gratissimum and Thymus vulgaris against Penicillium expansum. Food Control 23: 377-383. Ortego, J., Bonal, R., (2009). Natural hybridisation between kermes (Quercus coccifera L.) and holm oaks (Q. ilex L.) revealed by microsatellite markers. Plant Biol.12, 234-238. Özkan, M., Aktaş K., Özdemir C., Guerin, G. (2009). Nutlet morphology and its taxonomic utility in Salvia (Lamiaceae: Mentheae) from Turkey. Acta Bot. Croat. 68 (1): 105–115. Panĉić, J. (1865). Flora u okolini Beogradskoj. Drţavna Štamparija, Beograd. Panĉić, J. (1874). Flora Kneţevine Srbije. Drţavna Štamparija, Beograd. Panĉić, J. (1884). Dodatak Flori kneţevine Srbije. Kralj.-Srp. Drţavne Štamparije, Beograd. Paolini, J., Falchi, A., Quilichini, Y., Desjobert, J.M., De Cian, M.C., Varesi, L., Costa, J. (2009). Morphological, chemical and genetic differentiation of two subspecies of Cistus creticus L. (C. creticus subsp. eriocephalus and C. creticus subsp. corsicus). Phytochemistry 70: 1146–1160. Passet, J. (1971). Thymus vulgaris L. chemotaxonomie et biogenese monoterpenique: (These Univ. Montpellier.) 153p.. Ref. in Bull. Signal., Biol. Physiol. Veg., 33(5): 4564 (1972) Paton, A.J., Springate, D., Suddee, S., Otieno, D., Grayer, R.J., Harley, M., Willis, F., Simmonds, M.S.J., Powel,l M., Savolainen, V., (2004). Phylogeny and evolution of Basils and allies (Ocimeae, Labiatae) based on three plastid DNA regions. Molec. Phylogenet. Evol. 31, 277–299. 140 Patwardhan, S.A., Gupta A.S. (1981). An octomethoxy flavones from Pogostemon purporosceus. Phytochemistry 20: 1458. Pau, L. (1929). Introducci6n a1 estudio de 1os tomillos españoles. Mem. Real. Soc. Esp. Hist. Nut. 5: 65-71. Petrović, S. (1882). Flora okoline Niša. Kralj.-Srp. Drţavne Štamparije, Beograd. Petrović, S. (1885). Dodatak flori okoline Niša. Kralj.-Srp. Drţavne Štamparije, Beograd. Pluhár, Zs., Héthelyi, É., Kutta, G., Kamondy, L. (2007). Evaluation of environmental factors influencing essential oil quality of Thymus pannonicus All. and Thymus praecox Opiz. J. Herbs Spices Med. Plants. 3: 23-43 Prather, L.A., Monfils, A.K., Posto, A.L., Williams, R.A., (2002). Monophyly and phylogeny of Monarda (Lamiaceae): implications of sequence data from the internal transcribed spacer (ITS) region of nuclear ribosomal DNA. Syst. Bot. 27, 127–137. Pritchard, J.K., Stephens, M., Donnelly, P. (2000). Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155, 945–959. Rahimmalek, M., Tabatabaei, B.E.S., Arzani, A., Etemadi, N. (2009). Assessment of genetic diversity among and within Achillea species using amplified fragment length polymorphism (AFLP). Biochem. Syst. Ecol. 37, 354-361. Richard, H., Benjilali, B., Banquour, N. and Baritaux, 0 . (1985) Étude de diverses huiles essentielles de Thym du Maroc. Lebensm.-Wiss. u. -Techno[., 18: 105-110. Rigano, D., Formisano, C., Basile, A., Lavitola, A., Senatore1, F., Rosselli, S., Bruno, M. (2007). Antibacterial Activity of Flavonoids and Phenylpropanoids from Marrubium globosum ssp. libanoticum, Phytother. Res. 21: 395–397. Ristić, M.D., Duletić-Laušević, S., Kneţević-Vukĉević, J., Marin, P.D., Simić, D., Vukojević, J., Janaćković, P., Vajs, V. (2000). Antimicrobial activity of essential 141 oils and ethanol extract of Phlomis fruticosa L. (Lamiaceae), Phytotherapy Research, 14 (4): 267-271. Rodriguez, B. (1977). 5,4’-dihydroxy-6,7,8,3’-tetrametoxyflavone from Sideritis mugronensis. Pytochemistry 16: 800. Rohlf, F.J. (2000). NTSYS-pc. Numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 2.1. Exeter Publications, New York. Rota, M.C., Herrera, A., Martínez, R.M., Sotomayor, J.A., Jordán, M.J. (2008). Antimicrobial activity and chemical composition of Thymus vulgaris, Thymus zygis and Thymus hyemalis essential oils. Food Control 19, 681–687. Ruiz, E., Marticorena, C., Crawford, D., Stuessy, T., Gonzalez, F., Montoya, R., Silva, M., Becerra, J. (2001). Morphological and ITS sequence divergence between taxa of Cuminia (Lamiaceae), an endemic genus of the Juan Fernandez Islands, Chile. Brittonia 52, 341–350. Saad, A., Fadli, M., Bouaziz, M., Benharref, A., Mezrioui, N.E., Hassani, L., 2010. Anticandidal activity of the essential oils of Thymus maroccanus and Thymus broussonetii and their synergism with amphotericin B and fluconazol. Phytomedicine 17, 1057–1060. Sáez, F.,Stahl-Biskup, E. (2002). Essential oil polymorphism in the genus Thymus. In: Stahl Biskup, E., Sáez, F. ed(s). Thyme: the genus Thymus. (Medicinal and aromatic plants: industrial profiles; v.24.). London: Taylor and Francis pp. 126-143. Safer, S., Tremetsberger, K., Guo, Y.-P., Kohl, G., Samuel, M. R., Stuessy, T. F., Stuppner, H. (2011). Phylogenetic relationships in the genus Leontopodium (Asteraceae: Gnaphalieae) based on AFLP data. Bot. J. Linn. Soc. 165, 364–377. Safaei-Ghomi, J., Ebrahimabadi, A.H., Djafari-Bidgoli. Z., Batooli, H. (2009). GC/MS analysis and in vitro antioxidant activity of essential oil and methanol extracts of Thymus caramanicus Jalas and its main constituent carvacrol. Food Chemistry 115: 1524–1528. 142 Saitou, N., Nei, M. (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4 (4), 406-25. Sakagami, Y., Iinuma, M., Piyasena, K.G.N.P., Dharmaratne, H.R.W., 2005. Antibacterial activity of a-mangostin against vancomycin resistant Enterococci (VRE) and synergism with antibiotics. Phytomedicine 12, 203–208. Salmaki, Y., Zarre, S. Jamzad, Z. (2008). Nutlet micromorphology and its systematic implication in Stachys L. (Lamiaceae) in Iran. Feddes Repertorium 119 7–8: 607–621.Sang, T., Crawford, D.J., Stuessy, T.F. (1995). Documentation of reticulate evolution in peonies (Paeonia) using internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA: Implications for biogeography and concerted evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 6813–6817. Salgueiro, L. R., Vila, R., Tomi, F., TomBs, X., Cafiigueral, S., Casanova, J., Proenga da Cunha, A., Adzet, T. (1997). Composition and infraspecific variability of essential oil from Thymus camphoratus. Phytochemistry 45: 1177-1183. Schmidt-Lebuhn, A.N. (2007). Using amplified fragment length polymorphism (AFLP) to unravel species relationships and delimitations in Minthostachys (Labiatae). Bot. J. Linn. Soc. 153, 9–19. Schmidt-Lebuhn, A.N., (2008). Monophyly and phylogenetic relationships of Minthostachys (Labiatae, Nepetoideae) examined using morphological and nrITS data. Plant Syst. Evol. 270, 25–38. Schneider, S., Roessli, D., Excoffier, L . (2000). Arlequin: a software for population genetic data. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. Schulte, K., Silvestro, D., Kiehlmann, E., Vesely, S., Novoa, P., Zizka, G. (2010). Detection of recent hybridization between sympatric Chilean Puya species (Bromeliaceae) using AFLP markers and reconstruction of complex relationships. Molecular Phylogenetics and Evolution 57, 1105-1119. 143 Shonle, I., Bergelson, J. (2000). Evolutionary ecology of the tropane alkaloids of Datura stramonium L. (Solanaceae). Evolution 54: 778-788. Simonović, D. (1959). Botaniĉki reĉnik imena biljaka. SANU, Beograd. Simeon de Bouchberg, M., Allegrini, J., Bessiere, C., Attisso, M., Passet, J., Granger, R. (1976) Proprietiès microbiologiques des huiles essentielles de chimiotypes de Thymus vulgaris L. Riv. Ital., 58: 527-536. Slavkovska, V., Lakusic, B., Jancic, R., Mimica-Dukic, N. and Vujicic, D. (2006). Chemical Composition of the Essential Oil of Thymus bracteosus Vis. ex Bentham (Lamiaceae). J. Essent. oil Res. 18: 310-311. Soković, M.D., Marin P D, Simić, D., Kneţević-Vukĉević, J., Vajs, V., Petrović, S. (2002). Antimutagenic activity of essential oil and crude extract of Phlomis fruticosa, Pharmaceutical Biology. 40 (4): 311-314. Soković, M., Marin, P., Brkić, D., Van Griensven, L.J.L.D. (2007). Chemical composition and antibacterial activiy of essential oils of ten aromatic plants against human pathogenic bacteria. Food Global Science Books, 1(2), 220-226. Soković, M., Glamoclija, J., Ćirić, A., Kataranovski, D., Marin, P.D., Vukojević, J., Brkić, D. (2008). Antifungal activity of the essential oil of Thymus vulgaris L. and thymol on experimentally induced dermatomycoses. Drug Development and Industrial Pharmacy34 (12) 1388-1393 Soković, M.D., Vukojević, J., Marin, P.D., Brkić, D.D., Vajs, V., Van Griensven L.J.L.D. (2009) Chemical composition of essential oils of Thymus and Mentha species and their antifungal activities. Molecules, 14 (1):238-249. Solitis, D., Soltis, P. (2000). Choosing an aproach and appropriate gene for phylogenetic analysis. In: Soltis, D., Soltis,P., Doyle, J.J. (eds) Molecular systematic of plants II, DNA sequencing. Kulwer academic Publishers, Boston, Dordrecht, London: 1-42. 144 Stahl-Biskup, E. (1986). Das ätherische Öl norwegischer Thymianarten II. Thymus pulegioides. Planta Med. 52: 223-235. Stahl-Biskup, E. (2002). Essential oil chemistry of the genus Thymus - a global view. In: Letchamo W, Saez F, Stahl-Biskup E (eds) Medicinal and aromatic plants— industrial profiles: the genus Thymus. Harwood Academic, Amsterdam: 75-124. Sulamian, S.F., Culham, A., Harborne, J.B. (2003). Molecular Phylogeny of Fabaceae based on rbcL sequence data: With special emphasis on the tribe Mimoseae (Mimosoideae). As. Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol., Vol. 11 (1): 9-35. Swain, T. (1975). Evolution of flavonoid compounds. In: Harborne, J.B., Marby, T,J., Mabry, H. (EdS), The Flavonoids. Chapman and Hall, London.1096-1129. Šilić, Ĉ. (1979). Monografija rodova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria Bentham, Acinos Miller i Clinopodium L. U flori Jugoslavije. Zemaljski muzej BiH. Sarajevo. Takagi, S., Yamaki, M., Inoue, K. (1981). Flavone di-C-glucosides from Scutellaria baicalensis, Phytochemistry 20 (10): 2443-2444. Thompson, J.D. (2002) Population structure and the spatial dynamics of genetic polymorphisms in thyme. In: Letchamo W, Saez F, Stahl-Biskup E (eds) Medicinal and aromatic plants—industrial profiles: the genus Thymus. Harwood Academic, Amsterdam: 44–74. Thompson, J.D., Chalchat, J.-C., Michet, A., Linhart, Y.B., Ehlers, B. (2003). Qualitative and quantitative variation in monoterpene co-occurrence and composition in the essential oil of Thymus vulgaris chemotypes. Journal of Chemical Ecology 29(4): 859-880. Tomás, F., Nieto, J.L., Barberán, F.A.T., Ferreres, F. (1986). Flavonoids from Phlomis lychnitys. Phytochemistry 25, 1253-1254. Tomás-Barberán, F.A., Wollenweber, E. (1990). Flavonoid aglycones from the leaf surfaces of some Labiatae species. Pl. Syst. Evol. 173. (3-4): 109-118. 145 Tomás-Barberán, F.A., Gil, M.I. (1992). Chemistry and natural distribution of flavonoids in the Labiatae. In: Harley, R.M., Reynolds, T. (Eds.), Advances in Labiate Science. Royal Botanic Gardens, Kew, pp. 299-305. Tomás-Barberán, F.A., Gil, M.I., Marin, P.D., Tomás-Lorente, F. (1991). Flavonoids from some Yugoslavian Micromeria species: chemotaxonomical aspects. Biochem. Syst. Ecol. 19. (8): 697-698. Tomás-Barberán, F.A., Husain, S.Z., Gil, M.I. (1988). The distribution of methylated flavones in the Lamiaceae. Biochem. Syst. Ecol. 16: 43-46. Tomás-Lorente, F., Ferreres, F., Tomás-Barberán, F.A., Rivera, D., Obón, C. (1989). Verification of Sideritis incana x S. angustifolia hybrids by flavonoid analysis. Phytochemistry 28 (8): 2141-2143. Tomimori, T., Miyaichi, Y., Imoto, Y., Kizu, H., Namba, T. (1985). Studies of Nepalese crude drugs. V. On the flavonoid constituents of the root of Scutellaria baicalensis Colebr. (1). Chem. Pharm. Bull. 33: 4457-4463. Tomimori, T., Miyaichi, Y., Imoto, Y., Kizu, H., Suzuki, C. (1984)Studies of the constituents of Scutellaria species. IV. On the flavonoid constituents of the root of Scutellaria baicalensis Georggi (4). J. Pharm. Soc. Japan 104: 529-534. Trindade, H., Costa, M.M., Lima, A.S., Pedro, L.G., Figueiredo, A.C., Barroso, J.G. (2008). Genetic diversity and chemical polymorphism of Thymus caespititius from Pico, Saõ Jorge and Terceira islands (Azores). Biochem. Syst. Ecol. 36, 790–797 Trindade H., Costa, M.M., Lima, S.B., Pedro, L.G., Figueiredo, A.C., Barroso J.G. (2009). A combined approach using RAPD, ISSR and volatile analysis for the characterization of Thymus caespititius from Flores,Corvo and Graciosa islands (Azores, Portugal). Biochem. Syst. Ecol. 37, 670–677 Trusty, J., Olmstead, R.G., Bogler, D.J., Santos-Guerra, A., Francisco-Ortega, J. (2004). Using molecular data to test a biogeographic connection of the Macaronesian genus Bystropogon (Lamiaceae) to the New World: a case of conflicting phylogenies. Syst. Bot. 29, 702–715. 146 Trusty, J.L., Olmstead, R.G., Santos-Guerra, A., Sa-Fontinha, S., Francisco-Ortega, J. (2005). Molecular phylogenetic of the Macaronesian endemic genus Bystropogon (Lamiaceae): palaeo-islands, ecological shifts and interisland colonizations. Mol. Ecol. 14, 1177–1189. Van de Peer, Y., De Wachter, Y. (1994). TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Applic. Biosci. 10, 569-570. Velasco Negueruela, A. and Perez Alonso, M.J. (1986) Aceites esenciales de tomillos ibericos. VI. Contribuci6n a1 estudio quimiotaxondmico (Terpenoides) del genero Thymus L. Trab. Dep. Bothica 13: 115-133. Velenovsky, J. (1906). Vorstudien zu einer Monographie der Gattung Thymus L. Bot. Zentralhl. Beih., 19 B2: 271-287. Venturella, P., Bellino, A., , M.L., Sorrentino, M. (1980). Aurapin, a new dihydroflavonol glycoside and other flavonoids from Acinos alpinus. Heterocycles 14 (12): 1979-1982. Vernet, P., Gouyon, P.H., Valdeyron, G. (1986). Genetic control of the oil content in Thymus valgaris L.: a case of polymorphism in a biosynthetic chain. Genetics, 69: 227-231. Vernet, P., Guillerm, J.L., Gouyon, P.H. (1977a). Le polymorphisme chimique de Thymus vulgaris L. (Labiée) I. Repartition des formes chimiques en relation avec certains facteurs écologiques. Oecol. Plant., 12, 159-179. Vernet, P., Guillerm, J.L., Gouyon, P.H. (1977b). Le polymorphisme chimique de Thymus vulgaris L. (Labiée) 11. Carte 2 l'echelle 1125000 des formes chimiques dans la region de Saint-Martin-de-Londres (Herault-France). Oecol. Plant., 12, 18 1- 194. Vicioso, C. (1974) Contribución a1 conocimiento de los tomillos españoles. In: J. Ruiz del Castillo (ed.), Anales Inst. Nac. Invest. Agrar. ser. Recursos Nat., 1: 11-63. 147 Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., Zabeau., M. (1995). AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23, 4407–4414. Wagstaff, S. J., Olmstead, R. G., Cantino, P.D. (1995). Parsimony analysis of cpDNA restriction site variation in subfamily Nepetoideae (Labiatae) . American Journal of Botany 82: 886 – 892. Wagstaff, S. J., Olmstead, R. G. (1997). Phylogeny of Labiatae and Verbenaceae inferred from rbcL sequences. Syst. Bot. 22:165–179. Walker, J.B., Sytsma, K.J. (2007). Staminal evolution in the genus Salvia (Lamiaceae): molecular phylogenetic evidence for multiple origins of the staminal lever. Ann. Bot. 100, 375–391. Walker, J.B., Sytsma, K.J., Treutlein, J., Wink, M. (2004). Salvia (Lamiaceae) is not monophyletic: implications for the systematics, radiation, and ecological specializations of Salvia and tribe Mentheae. Am. J. Bot. 91, 1115–1125. Wang, H.K., Xia, Y., Yang, Z.Y., Natschke, S.L., Lee, K.H. (1998). Recent advances in the discovery and development of flavonoids and their analogues as antitumor and anti-HIV agents. Adv Exp Med Biol. 439, 191–225. Willkomm, M. (1868). Labiatae. In M. Willkomm and J. Lange (eds), Prodr. Fl. Hisp., 96. vol. 2, Stuttgart: 389-480. Young, D.A., Sterner, R.W. (1981). Leaf flavonoids of primitive dicotyledonous angiosperms: Degeneria vitiensis and Idiospermum australiense. Biochem. Syst. Ecol. 9: 185-188. Zouaria, N., Fakhfakhc, N., Zouarid, S., Bougatefc, A., Karraya, A., Neffati, M., Ayadie, M.A. (2011). Chemical composition, angiotensin I-converting enzyme inhibitory, antioxidant and antimicrobial activities of essential oil of Tunisian Thymus algeriensis Boiss. et Reut. (Lamiaceae). Food and Bioproducts Processing 89: 257–265. 148 Biografija autora Ivan Šoštaarić roĊen je 16. Januara 1971. godine u Beogradu. U Beogradu je završio osnovnu školu 1985. godine i gimnaziju 1989. godine. Diplomirao je na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu 2001. godine, sa proseĉnom ocenom 8,41 i ocenom 10 na diplomskom ispitu. Dokotrske studije upisao je 2006. godine na Biološkom fakultetu Univerziteta u Beogradu. Govori engleski i francuski jezik. Od 2002. godine zaposlen je na Katedri za agrobotaniku, Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Uĉestvovao je na dva nacionalna projekta i jednom meĊunarodnom projektu. Tri puta je boravio na struĉnom usavršavanju u Jodrell Laboratory, Royal Botanical Gardens, Kew, Ujedinjeno Kraljevstvo. Prvi autor je dva rad objavljena u ĉasopisima meĊunarodnog znaĉaja i koautor tri radova u ĉasopisima meĊunarodnog znaĉaja i jednog rad objavljenog u ĉasopisu domaćeg znaĉaja, kao i većeg broja kongresnih saopštenja. 149 150 151