UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Ana Ž. Dragičević MODULACIJA FUNKCIJE HUMANIH DENDRITSKIH ĆELIJA KOMBINOVANOM PRIMENOM AGONISTA ENDOZOMNIH TOLL-SLIČNIH RECEPTORA, DEKTIN-1 RECEPTORA I PROINFLAMATORNIH CITOKINA Doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE BIOLOGICAL FACULTY Ana Ž. Dragičević MODULATION OF THE FUNCTION OF HUMAN MONOCYTE DERIVED DENDRITIC CELLS BY COMBINED USE OF THE ENDOSOMAL TOLL-LIKE RECEPTORS, DECTIN-1 RECEPTOR AGONISTS AND PROINFLAMMATORY CYTOKINES Doctoral dissertation Belgrade, 2012. Podaci o mentorima i članovima komisije MENTORI: akademik Miodrag Čolić redovni profesor Medicinskog fakulteta VMA Univerziteta odbrane u Beogradu i Medicinskog fakulteta Univerziteta u Nišu dr Biljana Božić vanredni profesor Biološkog fakulteta Univerziteta u Beogradu ČLAN KOMISIJE: dr Dragana Vučević vanredni profesor Medicinskog fakulteta VMA Univerziteta odbrane u Beogradu Izjave zahvalnosti: Svojim mentorima, akademiku Miodragu Čoliću i dr Biljani Božić izražavam duboko poštovanje i izuzetnu zahvalnost na ukazanom poverenju, podršci i strpljenju od prvih koraka u laboratorijskom radu do konačne realizacije ove teze. Veliku zahvalnost dugujem članu komisije dr Dragani Vučević na neizmernoj pomoći i prijateljskim savetima tokom višegodišnjeg rada na ovoj tezi. Zahvaljujem se kolegi sa Instituta za medicinska istraživanja dr Saši Vasilijiću na stručnoj pomoći i korisnim savetima tokom izrade ove teze. Svojim kolegama doktorantima, dr Tanji Džopalić, dr Ivanu Rajkoviću i Sergeju Tomiću se zahvaljujem na svesrdnoj pomoći i prijateljskim savetima od samog početka do finalizacije ove teze. Svoju veliku zahvalnost dugujem mr Petru Milosavljeviću, dr Gordani Anđelić i Oliveri Čolić na prijateljskoj podrsci i ohrabrivanju. Zahvaljujem se Ivani Majstorović na pomoći u realizaciji ovog rada. Zahvaljujem se svojoj profesorki biologije iz gimnazije „Bora Stanković“ Lozanki Tošić koja mi je svojim predavanjima ulila ljubav prema biologiji i odredila moje profesionalno interesovanje. Zahvaljujem se Katarini Laković na nesebičnoj pomoći i prijateljskoj podršci. Svim svojim prijateljima zahvaljujem na razumevanju i podršci koja mi je izuzetno značila. Neizmernu zahvalnost dugujem svojim roditeljima na podršci, razumevanju, strpljenju i ohrabrivanju tokom mog celokupnog školovanja. Last, but not least, special thanks to my english proof reader, Reg Thorne. Ova doktorska disertacija je realizovana u okviru projekta Primena funkcionalizovanih ugljeničnih nanocevi i nanočestica zlata za pripremu dendritskih ćelija u imunoterapiji tumora (evidencioni broj: 175102) koje finansira Ministarstvo prosvete i nauke Republike Srbije i NI zadatka Optimizacija protokola za kultivaciju dendritskih ćelija u cilju terapije tumora u okviru projekta Genetički i ćelijski bioinžinjering u medicini (evidencioni broj: VMA/06-10/A.5) koje je finansiralo Ministarstvo odbrane Republike Srbije. Modulacija funkcije humanih dendritskih ćelija kombinovanom primenom agonista endozomnih toll-sličnih receptora, dektin-1 receptora i proinflamatornih citokina Rezime Uvod/cilj. Agonisti PRR, posebno TLR agonisti, imaju veliku primenu u modulaciji funkcija DĆ u eksperimentalnim i kliničkim ispitivanjima u oblasti imunoterapije tumora. U fokusu aktuelnih istraživanja pripreme anti-tumorskih vakcina je primena Poly (I:C), sintetskog analoga dvolančane RNK (TLR3 agonist). Kultivacija MoDĆ u prisustvu Poly (I:C) dovodi do njihovog fenotipskog i funkcionalnog sazrevanja, pa su tako pripremljene ćelije efikasne u pokretanju imunskog odgovora. TLR3 zajedno sa TLR7-9 predstavlja subfamiliju TLR specifičnih za nukleinske kiseline lokalizovanih na membrani endozoma. Uprkos ohrabrujućim rezultatima, biološki potencijal DĆ za in vivo stimulaciju anti-tumorskog odgovora još uvek nije maksimalno iskorišćen. U te svrhe se kombinovanom primenom većeg broja TLR agonista ispituje potencijal MoDĆ da integrišu signale sa različitih receptora. Stoga je jedan od ciljeva naše studije bio da se ispita efekat kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina, selektivnog TLR7 agoniste na funkcionalne i fenotipske karakteristike MoDĆ. Dendritske ćelije (DĆ), najpotentnije antigen-prezentujuće ćelije (APĆ), integrišu signale koje primaju sa različitih receptora u jedinstveni odgovor. Ključni značaj u ostvarivanju funkcija DĆ imaju receptori za prepoznavanje konzervisanih struktura, tzv. molekularnih obrazaca patogena (engl. Pattern Recognition Receptor, PRR). Aktivacija pojedinačnih PRR, posebno Toll-sličnih receptora (engl. Toll-like receptor, TLR) ili lektinskih receptora C-tipa poput dektina-1, dovodi do sazrevanja DĆ, dok je za razvoj efikasnog imunskog odgovora neophodna kooperacija više receptora. Dektin-1 receptor je, pored TLR, jedini receptor urođenog imuniteta čija aktivacija samostalno indukuje signalnu kaskadu koja dovodi do sazrevanja MoDĆ sa sposobnošću indukcije Th1 i Th17 odgovora. Imajući navedno u vidu, sledeći cilj ovog istraživanja je bio da se ispita efekat kombinovane primene Poly (I:C) i kurdlana, agonista dektin-1 receptora, na funkcionalne i fenotipske karakteristike MoDĆ. Za modulaciju sazrevanja i funkcija DĆ, pored stimulacije PRR, značajnu ulogu imaju i citokini prirodnog imuniteta koji se produkuju prilikom infekcije. Najnovija istraživanja ukazuju na ulogu TNF-α, jednog od najznačajnijih proinflamatornih citokina, u sazrevanju DĆ u ranim fazama infekcije kao i razvoju antigen-specifičnog odgovora. Naredni cilj našeg istraživanja bio je ispitivanje dozno- i vremenski- zavisnog efekta kombinovane primene TNF-α i Poly (I:C) na funkcionalne i fenotipske karakteristike MoDĆ. Poslednji deo istraživanja se odnosio na ispitivanje uticaja signala stečenog imuniteta koje DĆ dobijaju tokom interakcije sa T-limfocitima, uključujući signalizaciju preko CD40 receptora i receptora za IFN-γ na njihove karakteristike. Metode. Nezrele MoDĆ, dobijene kultivacijom humanih monocita, su stimulisane samim Poly (I:C) ili njegovom kombinacijom sa loksoribinom, kurdlanom ili TNF-α tokom 48h. Da bi ispitali uticaj signala stečenog imuniteta, MoDĆ stimulisane samim Poly (I:C) ili u kombinaciji sa TNF-α dalje su kultivisane u prisustvu ćelija J558 transfektovanim ligandom za CD40, solubilnog CD40L ili IFN-γ. U cilju ispitivanja uticaja kinetike aktivacije na kapacitet MoDĆ da polarizuju imunski odgovor, MoDĆ su stimulisane kombinacijama različitih koncentracija Poly (I:C) i TNF-α tokom 24h i 48h. Protočnom citofluorimetrijom su analizirane fenotipske karakteristike MoDĆ. Alostimulatorna sposobnost MoDĆ je određena testom mešane leukocitne reakcije. Produkcija citokina je određena ELISA metodom i testom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica. Rezultati. Stimulacija MoDĆ optimalnom koncentracijom Poly (I:C) dovela je do povećanja ekspresije HLA-DR, CD86, CD40, CD54, CD83 i CCR7 molekula, povećanja produkcije IL- 12, umerene produkcije IL-23 i niske produkcije IL-10. Ovako stimulisane MoDĆ dovode do povećane produkcije IFN-γ i umerene produkcije IL-17 tokom kokultivacije sa CD4+ T limfocitima. U preliminarnim eksperimentima nezrele MoDĆ su stimulisane različitim koncentracijama Poly (I:C) (5 μg/ml, 10 μg/ml, 25 μg/ml i 50 μg/ml), loksoribina (34 μg/ml i 85 μg/ml) i kurdlana (10 μg/ml , 50 μg/ml, 100 μg/ml i 200 μg/ml). Na osnovu fenotipskih i funkcionalnih karakteristika MoDĆ procenjeno je da je optimalna koncentracija za aktivaciju MoDĆ za Poly (I:C) 25 μg/ml, za loksoribin 85 μg/ml i za kurdlan 100 μg/ml, dok je koncentracija Poly (I:C) od 10 μg/ml i loksoribina od 34 μg/ml suboptimalna. Optimalne i suboptimalne koncentracije agonista su dalje korišćene za stimulaciju nezrelih MoDĆ u ovom istraživanju. MoDĆ kultivisane u prisustvu suboptimalnih koncentracija agonista TLR3 i TLR7 povećano su eksprimirale HLA-DR, CD86, CD83, CD54 i CD40 molekule i produkovale su veće nivoe IL-27, IL-23 i IL-10, u poređenju sa ćelijama tretiranim pojedinačnim agonistima. Ovako pripremljene MoDĆ su dovele do povećanja produkcije IFN-γ i IL-17 u kokulturi sa alogenim CD4+ T limfocitima. Tretman MoDĆ suboptimalnom koncentracijom Poly (I:C) i optimalnom koncentracijom loksoribina u poređenju sa efektima pojedinačnih agonista, doveo je do povećanja ekspresija CD86, smanjenja HLA-DR, povećanja produkcije IL-12 i IL-23 i smanjenja produkcije IL-10 i IL- 27. MoDĆ diferencirane na ovaj način u kokulturi sa CD4 + T ćelijama su indukovale povećanje produkcije IFN-γ i smanjenje produkcije IL-4 i IL-10. Stimulacija MoDĆ optimalnim koncentracijama oba TLR agonista dovela je do smanjenja ekspresije HLA- DR, CD83 i CD40 molekula, kao i povećanja produkcije IL-12, IL-27 i IL-10, dok je nivo IL-23 bio značajno smanjen, u poređenju sa efektima pojedinačnih TLR agonista. MoDĆ stimulisane na ovaj način su u kokulturi sa CD4 + T limfocitima dovele do povećanja produkcije IFN-γ i smanjenje produkcije IL-4, IL-10 i IL-17. Stimulacija MoDĆ kurdlanom dovela je do povećanja produkcije IL-23 koji je tokom kokultivacije sa CD4 + T limfocitima usmerio odgovor T limfocita u Th17 pravcu uz manje izražen Th1 odgovor. MoDĆ kultivisane u prisustvu Poly (I:C) i kurdlana su ispoljile fenotip zrelih ćelija i stimulisale su proliferaciju alogenih CD4 + T limfocita. Kostimulacija TLR3 i dektina-1 na MoDĆ je dodatno povećala produkciju IL-12, IL-23 i IL-10 u poređenju sa efektima angažovanja pojedinačnih receptora. Ovi rezultati su u korelaciji sa indukcijom snažnijeg Th1 i Th17 imunskog odgovora, procenjivanog na osnovu produkcije IFN-γ od strane naivnih (CD45RA+) CD4+ T limfocita, odnosno IL-17 od strane memorijskih (CD45RO + ) CD4 + T limfocita. MoDĆ stimulisane optimalnom koncentracijom Poly (I:C) i TNF-α ispoljile su povećane nivoe CD80, CD86 i CD54 molekula i smanjile produkciju IL-12, što je uticalo na smanjenje proliferacije T limfocita i produkcije IFN-γ u kokulturi sa alogenim CD4+ T ćelijama, u poređenju sa efektom MoDĆ tretiranih samim Poly (I:C). Dozno-zavisni efekti Poly (I:C) i TNF-α na funkciju MoDĆ su izraženiji nakon 24h kultivacije u poređenju sa 48h, što je procenjeno na osnovu smanjenja produkcije IL-12 i IL-23 od strane MoDĆ i smanjenog nivoa IFN-γ i IL-17 u kokulturi sa CD4+ T ćelijama. Uticaj interakcije CD40 i CD40L je najizraženiji u slučaju produkcije IL-12 od strane MoDĆ tretiranih najvećom koncentracijom Poly (I:C) i TNF-α. Smanjenje produkcije IL-12 od strane MoDĆ stimulisanih ovom kombinacijom je dovelo do smanjenja produkcije IFN- γ u kokulturi sa CD4+ T ćelijama. Povezivanje CD40 molekula na MoDĆ stimulisanim najvećom koncentracijom Poly (I:C) i TNF-α je dovelo do smanjenja produkcije IL-23 i povećanja IL-10. Stoga su ovako pripremljene MoDĆ u kokulturi sa CD4+ T ćelijama dovele do smanjenja produkcije IL-17, a povećanja IL-10. Povezivanje CD40 molekula ili tretiranje sa IFN-γ nezrelih i MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) značajno je povećalo njihov alostimulatorni potencijal. Povezivanje CD40 molekula na nezrelim MoDĆ dovelo je do povećanja produkcije IL-12 i IL-23, što je praćeno povećanjem produkcije IFN-γ tokom kokultivacije ovako stimulisanih ćelija i CD4 + T limfocita. Međutim, povezivanje CD40 molekula na MoDĆ pretretiranim sa Poly (I:C) dovelo je do povećanja produkcije IL-12, IL-23 i IL-10. Ovako stimulisane ćelije u kokulturi sa CD4+ T ćelijama dovele su do povećanja produkcije IL-17, a smanjenja produkcije IFN-γ i IL-10. Nezrele MoDĆ stimulisane sa IFN-γ produkovale su veći nivo IL-12, a u kokulturi sa CD4+ T limfocitima su dovele do smanjenja produkcije IL-5 i IL-17. Suprotno tome, tretman sa IFN-γ je doveo do smanjenja produkcije IL-12, a povećanja produkcije IL-10 od strane MoDĆ prethodno stimulisanih sa Poly (I:C). MoDĆ pripremljene na ovaj način su tokom kokultivacije sa T limfocitima dovele do smanjenja IFN-γ a povećanja nivoa IL-10. Zaključak. Ključne reči: CD40, CD4+ T-ćelijski odgovor, Dektin-1 receptor, humane dendritske ćelije monocitnog porekla, imunoterapija tumora, IFN-γ, TNF-α, Toll-sličan receptor 3, Toll-sličan receptor 7 Poly (I:C) dovodi do sazrevanja MoDĆ i stimulacije Th1 i Th17 imunskog odgovora. Primena veće koncentracije Poly (I:C) u kombinaciji sa loksoribinom utiče na karakteristike MoDĆ za polarizaciju Th1 imunskog odgovora. Kostimulacija MoDĆ sa Poly (I:C) i kurdlanom potencira efekte pojedinačnih agonista pa tako stimulisane MoDĆ indukuju snažniji Th1 i Th17 odgovor, u poređenju sa efektima pojedinačnih agonista. Povećanjem koncentracije Poly (I:C) u kombinaciji sa TNF-α moduliše se Th polarizujući potencijal MoDĆ od Th17 ka imunoregulatornom. IFN-γ i povezivanje CD40 molekula su aktivatori sazrevanja MoDĆ koje stimulišu razvoj Th1 odgovora. Ligacija CD40 molekula na MoDĆ aktiviranim Poly (I:C) usmerava sposobnost ovih ćelija da stimulišu Th17, a inhibiraju Th1 odgovor. U istom modelu IFN-γ inhibira Th1 odgovor, a stimuliše imunoregulatorne mehanizme. Dobijeni rezultati pokazuju veliku plastičnost u funkcionalnom odgovoru MoDĆ. Značajna imunogena svojstva Poly (I:C) koja su do sada iskorišćena u pripremi MoDĆ kao tumorskih vakcina se mogu dodatno pospešiti primenom stimulatora dektinskih receptora i TNF-α. Ipak neki od povoljnih efekata mogu biti umanjeni ili usmereni u suprotnom pravcu dodavanjem solubilnog CD40L i IFN-γ. Ovi rezultati mogu pomoći u boljem razumevanju biološkog ponašanja MoDĆ nakon transfera in vivo. Naučna oblast: Fiziologija životinja i čoveka Uža naučna oblast: Imunologija UDK: 576: 612.017; 615: 616-006: 616-097 Modulation of the function of human monocyte derived dendritic cells by combined use of the endosomal Toll-like receptors, dectin-1 receptor agonists and proinflammatory cytokines Abstract Background/aim. Immune modulating strategies based on use of TLR-specific agonists are in the focus of current investigations in the field of tumor immunotherapy. There is currently much interest in the use of TLR3 agonist, Polyinosinic-polycytidylic acid (Poly (I:C)), in vaccine developement. Poly (I:C), a synthetic analogue of double stranded (ds)RNA, may be an appropriate activation agent for obtaining mature MoDCs competent to prime effective immune responses. TLR3 together with TLR7-9 represents a group of TLRs localized within an endosome specialised for recognition of nucleic acids. Cooperation of different TLR signals in the induction of immune responses is an emerging field in innate immune research. Therefore, we wanted to evaluate whether combined effect of Poly (I:C) and loxoribine, a selective TLR7 agonist, could be more advantageous over the use of single agonists for the maturation of MoDCs. Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells (APCs) which receive and integrate multiple signals to initiate and direct a response appropriate to extracellular milleu. These APCs perform these functions mostly due to the expression of a wide variety of pattern recognition receptors (PRRs). PRRs discriminate self-tissues from infectious non-self tissues through molecular pattern (MPs) recognition. Although triggering of a single pattern recognition receptor (PRR), especially Toll-like receptors (TLRs) or C-type lectins, results in phenotypic changes in DCs, for functional maturation cooperativity between multiple PRRs is needed in order to achieve an effective immune response. Recent studies have shown that the ligation of Dectin-1, C-type lectin receptor, on MoDCs elicits their maturation. Dectin-1, a DC-associated C-type lectin, is the first of many PRRs which mediate their own signaling and induces the maturation of DCs capable of eliciting the generation of different T helper (Th) effectors. The next aim of this work was to study the response of MoDCs to the combined effect of Poly (I:C) and curdlan, selective Dectin-1 agonists. Tumor necrosis factor (TNF)-α is important for early DC maturation and as a bridge between initiation of the inflammatory cascade and generation of the antigen- specific response. To gain insight into this scientific problem we investigated the kinetics of maturation and the length of exposure of MoDCs to a pathogen (mimicked by Poly (I:C) in our study) in an inflamed tissue (mimicked by TNF-α) on phenotypic and functional characteristics of MoDCs. Finally, little is known about how subsequent interaction of MoDCs with T cell- derived stimuli, such as CD40 or interferon-γ (IFN-γ), modulates MoDC functions. Therefore, this problem was the last objective of this study. Methods. Immature MoDCs (iMoDCs), generated from human monocytes, were treated with Poly (I:C) alone or in combination with loxoribine, curdlan or TNF-α for 48h. To investigate the influence of T-cell derived stimuli, MoDCs cultivated for 24h with Poly (I:C) alone or in combination with TNF-α were incubated either with CD40 ligand (L)-transfected J558 cells, soluble CD40L or IFN-γ for additional 24h. To examine the influence of kinetics of activation on the Th polarizing capability of MoDCs, we stimulated MoDCs with different doses of Poly (I:C) in combination with TNF-α for 24h and 48h. Phenotypic characteristics of MoDCs were determined by flow cytometry. Allostimulatory capability of MoDCs was tested using a mixed leukocyte reaction assay. Cytokine production was measured by ELISA and FlowCytomix. Results. Optimal concentration of Poly (I:C) stimulated the maturation of MoDCs as judged by the up-regulation of HLA-DR, CD86, CD40, CD54, CD83 and CCR7 expression. Poly (I:C)-treated MoDCs were potent producers of interleukin (IL)-12, moderate producers of IL-23 and weak producers of IL-10, which was followed by high production of IFN-γ and moderate production of IL-17 by allogeneic CD4+ T cells. In preliminary experiments iMoDCs were treated with Poly (I:C) (5 μg/ml, 10 μg/ml, 25 μg/ml and 50 μg/ml), loxoribine (34 μg/ml and 85 μg/ml) or curdlan (10 μg/ml , 50 μg/ml, 100 μg/ml and 200 μg/ml). Based on phenotypic characteristics and functional capabilities of MoDCs, the concentrations of Poly (I:C) (25 μg/ml), loxoribine (85 μg/ml) and curdlan (100 μg/ml) were found to be optimal for activation of MoDCs, while the concentrations of Poly (I:C) (10 μg/ml) and loxoribine (34 μg/ml) were found to be suboptimal. For stimulation of iMoDCs we used these concentrations of the agonists. The combined treatment of MoDCs with suboptimal concentrations of TLR3 and TLR7 agonists resulted in slight potentiation of HLA-DR, CD86, CD83, CD54 and CD40 molecules and stimulation of IL-27, IL-23 and IL-10 secretion, compared to effects of single agonists. This was followed by up-regulated secretion of IFN-γ and IL-17 in the co-culture with allogeneic CD4+ T cells. When the suboptimal concentration of Poly (I:C) was combined with the optimal concentration of loxoribine, MoDCs down- regulated HLA-DR and up-regulated CD86 expression, enhanced the production of IL- 12 and IL-23 and down-regulated the levels of IL-10 and IL-27, compared to the effects of single agonists. MoDCs pretreated in this way stimulated the production of IFN-γ and lowered the levels of IL-4 and IL-10 by CD4+ T cells. The treatment of MoDCs with optimal concentrations of both TLR agonists was followed by down-regulation of HLA- DR, CD83 and CD40 expression and augmented the production of IL-12, IL-27 and IL-10, whereas the level of IL-23 was significantly lower, compared to relevant controls. These MoDCs promoted the production of IFN-γ and inhibited the production of IL-4, IL-10 and IL-17 in co-culture, compared to the effect of corresponding controls. The combination of Poly (I:C) and curdlan induced phenotypic maturation of MoDCs with the capability to stimulate alloreactive response. Such treated MoDCs up- regulated the production IL-12, IL-23 and IL-10, compared to the effect of Poly (I:C), alone. The opposite effect was observed for IFN-γ production. When combined, these agonists primed MoDCs to further increase the production of IFN-γ by CD4+ T cells in co-culture, especially those of naïve (CD45RA+) phenotype, and IL-17 by memory (CD45RO + ) CD4 + T cells. MoDCs stimulated with optimal concentration of Poly (I:C) and TNF-α up- regulated the expression of CD80, CD86 and CD54 molecules and lowered the production of IL-12 which was followed with inhibition of cellular proliferation and IFN-γ production in co-culture with allogeneic CD4+ T cells, compared to the effect of Poly (I:C)-treated MoDCs. Dose- and time- dependent effect of Poly (I:C) and TNF-α on the functions of MoDCs were more pronounced after 24h than 48h of stimulation, as judged by down-regulation of IL-12 and IL-23 production by this cells and reduced levels of IFN-γ and IL-17 in co-cultures with CD4+ T cells. The influence of CD40:CD40L interaction was most prominent in the case of production of IL-12 when MoDCs were pretreated with the highest dose of Poly (I:C) and TNF-α. This effect was reflected on reduced production of IFN-γ by allogeneic CD4+ T cells co-cultured with MoDCs treated with this combination. The addition of CD40L lessen the levels of IL-23 and increased the production of IL-10 in cultures of MoDCs stimulated with the highest dose of Poly (I:C) and TNF-α which was reflected on significant reduction of the levels of IL-17 and up-regulation of IL-10 produced by allogeneic CD4+ T cells. Ligation of CD40 or treatment with IFN-γ of iMoDCs or Poly (I:C)-treated MoDCs significantly up-regulated their allostimulatory activity. Ligation of CD40 on iMoDCs up-regulated the production of IL-12 and IL-23 which was accompanied by increased secretion of IFN-γ in co-culture. Stimulation of CD40 on Poly (I:C)-treated MoDCs significantly enhanced the production of IL-12, IL-23 and IL-10. However, such treated MoDCs decreased the production of IFN-γ and IL-10 and up-regulated the secretion of IL-17. iMoDCs treated with IFN-γ up-regulated IL-12 production, but lowered the production of IL-5 and IL-17 by CD4+ T cells. Treatment of Poly (I:C)-activated MoDCs with IFN-γ down-regulated the production of IL-12 and up-regulated IL-10 by these cells and increased/decreased the levels of IL-10/ IFN-γ, respectively, in co-culture with CD4 + T cells. Conclusions. Key words: CD40, Dectin-1 receptor, human monocyte-derived dendritic cells, IFN-γ, TNF-α, T helper immune response, Toll-like receptor 3, Toll-like receptor 7, tumor immunotherapy Higher concentrations of Poly (I:C) combined with loxoribine divert Th polarizing capabilities of MoDCs from Th1 and Th17 towards Th1. Co- stimulation of MoDCs with Poly (I:C) and curdlan induces superior Th1 and Th17 immune responses, compared to effects of single agonists. Higher concentrations of Poly (I:C) combined with TNF-α redirect Th polarizing capabilities of MoDCs from Th17-promoting to immunoregulatory influence. Ligation of CD40 on iMoDCs induces their maturation into a phenotype that supports Th1 response, while on Poly (I:C)- treated MoDCs the immune response shifts towards Th17. Treatment of iMoDCs with IFN-γ down-regulated Th2 and Th17 responses, while adding IFN-γ to Poly (I:C)- activated MoDCs down-regulated Th1 response and promoted T-regulatory mechanisms. Each of these findings may have therapeutic implications for the use of MoDCs in immunotherapy. Scientific field: Animal and human physiology Narrower scientific field: Immunology UDC: 576: 612.017; 615: 616-006: 616-097 SADRŽAJ 1. UVOD ....................................................................................................................................................... 1 1.1. Karakteristike dendritskih ćelija....................................................................................................... 2 1.1.1. Toll-slični receptori ....................................................................................................................... 6 1.1.2. Lektinski receptori C-tipa ............................................................................................................. 9 1.1.2.1. Imunomodulacija fenotipa i funkcija dendritskih ćelija aktivacijom dektin-1 receptora ........... 9 1.2. Poreklo dendritskih ćelija ................................................................................................................ 11 1.3. Klasifikacija dendritskih ćelija ........................................................................................................ 14 1.3.1. Konvencionalne dendritske ćelije .............................................................................................. 14 1.3.2. Plazmacitoidne dendritske ćelije ............................................................................................... 17 1.4. In vitro priprema dendritskih ćelija ............................................................................................... 19 1.5. Uloga dendritskih ćelija u polarizaciji imunskog odgovora ........................................................ 21 1.6. Struktura TNF-α, receptori za TNF-α i biološki efekti TNF-α ...................................................... 24 1.7. Struktura, receptori i biološki efekti IFN-γ .................................................................................... 26 1.8. Značaj CD40:CD40L interakcije u ćelijskom imunskom odgovoru .............................................. 28 1.9. Terapeutski potencijal dendritskih ćelija ...................................................................................... 29 2. HIPOTEZA I CILJEVI ISTRAŽIVANJA ...................................................................................................... 32 3. MATERIJALI I METODE .......................................................................................................................... 35 3.1. Medijumi, hemikalije, supstance ..................................................................................................... 36 3.1.1. Medijumi ....................................................................................................................................... 36 3.1.1.1. RPMI 1640 ............................................................................................................................................. 36 3.1.1.2. PBS (Phosphate Buffered Saline) ....................................................................................................... 36 3.1.1.3. Pufer za magnetno sortiranje ............................................................................................................ 37 3.1.1.4. K-PBS ..................................................................................................................................................... 37 3.1.2. Citokini .......................................................................................................................................... 37 3.1.2.1. Rekombinantni humani GM-CSF (rhGM-CSF ) ................................................................................. 37 3.1.2.2. Rekombinantni humani IL-4 (rhIL-4) ................................................................................................ 37 3.1.2.3. Rekombinantni humani (rhTNF-α) ................................................................................................... 37 3.1.2.4. Rekombinantni humani (rhIFN-γ) ..................................................................................................... 38 3.1.3. Imunomodulatorne i druge supstance ...................................................................................... 38 3.1.3.1. Poliinosinsko-policitidilinska kiselina, (Poly (I:C)) ......................................................................... 38 3.1.3.2. Loksoribin (Loxoribine) ...................................................................................................................... 38 3.1.3.3. Kurdlan (Curdlan) ................................................................................................................................ 38 3.1.3.4. Rekombinantni humani ligand za CD40 molekul (CD40 ligand, CD40L) ....................................... 39 3.1.3.5. 2-merkaptoetanol (2-ME) ................................................................................................................... 39 3.1.3.6. Radioaktivno obeležen timidin .......................................................................................................... 39 3.1.3.7. Limfoprep gradijent za izdvajanje humanih mononuklearnih ćelija (Lymphoprep) ................. 39 3.1.3.8. Monenzin (monensin sodium) ........................................................................................................... 39 3.2. Izolacija i kultivacija humanih mononukelarnih ćelija iz periferne krvi .................................. 40 3.2.1. Izolacija humanih mononuklearnih ćelija iz periferne krvi ................................................... 40 3.2.2. Izolacija monocita periferne krvi ............................................................................................... 40 3.2.3. Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija monocitnog porekla (MoDĆ) ................................ 41 3.2.4. Izolacija alogenih CD4+ T limfocita tehnikom magnetnog sortiranja .................................... 41 3.2.5. Izolacija alogenih naivnih (CD45RA+) i memorijskih (CD45RO+) T limfocita imunomagnetnim sortiranjem ukupnih CD4+ T limfocita ...................................................................... 42 3.3. Fenotipske karakteristike MoDĆ ..................................................................................................... 43 3.3.1. Monoklonska antitela .................................................................................................................. 43 3.3.2. Protočna citofluorimetrija .......................................................................................................... 43 3.4. Funkcionalne karakteristike MoDĆ ................................................................................................ 44 3.4.1. Alostimulatorni potencijal MoDĆ ............................................................................................... 44 3.4.2. Određivanje produkovanih citokina od strane kultivisanih MoDĆ ....................................... 45 3.4.2.1. IL-12p70 ................................................................................................................................................ 45 3.4.2.2. IL-27....................................................................................................................................................... 46 3.4.2.3. IL-23....................................................................................................................................................... 47 3.4.2.4. IL-10....................................................................................................................................................... 48 3.4.2.5. IL-6 ......................................................................................................................................................... 49 3.4.2.6. TNF-α ..................................................................................................................................................... 50 3.4.3. Određivanje citokina produkovanih od strane T limfocita u kokulturi sa MoDĆ ................ 51 3.4.3.1. IL-17....................................................................................................................................................... 51 3.4.3.2. IL-5 ......................................................................................................................................................... 52 3.4.3.3. IL-10....................................................................................................................................................... 53 3.4.3.4. IFN-γ i IL-2 ............................................................................................................................................ 54 3.4.3.5. Intracitoplazmatska detekcija citokina aktivisanih T limfocita .................................................... 56 3.5. Statistička obrada podataka............................................................................................................. 56 4. REZULTATI ............................................................................................................................................. 57 4.1. Uticaj Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ ....................................................... 58 4.1.1. Uticaj Poly (I:C) na morfološke i fenotipske karakteristike MoDĆ ......................................... 58 4.1.2. Alostimulatorna aktivnost MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) ................................................... 60 4.1.3. Produkcija citokina od strane MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) ............................................. 61 4.1.4. Produkcija citokina u kokulturi alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ stimulisanih u prisustvu Poly (I:C) ....................................................................................................................................................... 62 4.2. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ ............................................................................................................................................................. 64 4.2.1. Efekti kombinacije Poly (I:C) i loksoribina na fenotipske karakteristike MoDĆ .................. 64 4.2.2. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina na produkciju citokina od strane MoDĆ ........................................................................................................................................................ 66 4.2.3. Produkcija citokina u kokulturi alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ stimulisanih kombinacijom Poly (I:C) i loksoribina....................................................................................................... 68 4.3. Uticaj kurdlana i njegove kombinacije sa Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ 70 4.3.1. Efekat kurdlana i njegove kombinacije sa optimalnom koncentracijom Poly (I:C) na fenotipske karakteristike MoDĆ ................................................................................................................ 71 4.3.2. Alostimulatorni potencijal MoDĆ stimulisanih kurdlanom i njegovom kombinacijom sa Poly (I:C) ....................................................................................................................................................... 73 4.3.3. Kombinovani efekat Poly (I:C) i kurdlana na produkciju citokina od strane MoDĆ ............ 74 4.3.4. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i kurdlana na potencijal MoDĆ da usmere efektorske funkcije CD4+ T limfocita ......................................................................................................... 75 4.4. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na diferencijaciju MoDĆ ................................ 79 4.4.1. Efekat kombinovane primene optimalne koncentracije Poly (I:C) i TNF-α na fenotipska svojstva MoDĆ .............................................................................................................................................. 79 4.4.2. Alostimulatorni potencijal MoDĆ stimulisanih kombinacijom optimalne koncentracije Poly (I:C) i TNF-α.......................................................................................................................................... 81 4.4.3. Produkcija citokina od strane MoDĆ stimulisanih kombinacijom optimalne koncentracije Poly (I:C) i TNF-α.......................................................................................................................................... 82 4.4.4. Dozno- i vremenski- zavisan efekat kombinacije Poly (I:C) i TNF-α na produkciju citokina od strane MoDĆ ........................................................................................................................................... 84 4.4.5. Dozno- i vremenski- zavisan efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na Th polarizacionu aktivnost MoDĆ .................................................................................................................. 86 4.4.6. Efekat povezivanja CD40 molekula na produkciju citokina i Th polarizacionu aktivnost MoDĆ pretretiranih kombinacijom Poly (I:C) i TNF-α ............................................................................ 88 4.5. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na funkcionalne karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) ............................................................................................................. 92 4.5.1. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na produkciju citokina od strane MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) ............................................................................................................................ 92 4.5.2. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na alostimulatornu aktivnost MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) ........................................................................................................ 93 4.5.3. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na Th polarizacionu aktivnost MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) ........................................................................................................ 95 5. DISKUSIJA .............................................................................................................................................. 97 5.1. Uticaj Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ ....................................................... 99 5.2. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ ........................................................................................................................................................... 102 5.3. Uticaj kurdlana i njegove kombinacije sa Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ ........................................................................................................................................................... 107 5.4. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na diferencijaciju MoDĆ .............................. 112 5.5. Uticaj povezivanja CD40 molekula i IFN-γ na funkcionalne karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) ........................................................................................................... 119 5.6. Terapeutski potencijal DĆ diferenciranih u prisustvu agonista endozomnih toll-sličnih receptora, dektin-1 receptora i proinflamatornih citokina ..................................................................... 122 6. ZAKLJUČCI ........................................................................................................................................... 124 7. LITERATURA ........................................................................................................................................ 127 8. PRILOZI ................................................................................................................................................ 162 9. BIOGRAFIJA AUTORA ........................................................................................................................... 198 1 1. UVOD Uvod 2 Imunski sistem je evoluirao sa ciljem da održi homeostazu u organizmu štiteći ga od širokog spektra patogena spoljašnje sredine. Komponente ovog jedinstvenog sistema odbrane, urođeni i stečeni imunitet, udružuju svoje efektorske mehanizme u cilju što efikasnije eliminacije patogena. Urođeni imunski sistem predstavlja prvu liniju odbrane i ima ključnu ulogu u kontroli infekcije tokom vremenskog perioda neophodnog za pokretanje efektorskih mehanizama stečenog imuniteta (Janeway i Medzhitov, 2002). Stečeni imunitet je evoluirao kasnije u odnosu na urođeni i zasniva se na specifičnom prepoznavanju antigena od strane receptora na T limfocitima i antitela. Pretpostavka o prefinjenoj ulozi urođene imunosti kao sistema koji precizno detektuje tip patogena koji narušava homeostazu organizma (Janeway, 1992) potvrđena je nakon identifikacije receptora koji prepoznaju evolutivno konzervirane strukture patogena (tzv. molekularne obrasce karakteristične za patogene (engl. Pathogen-Associated Molecular Patterns, PAMP) (Medzhitov i sar., 1997; Medzhitov i Janeway, 1997). Dendritske ćelije imaju ključnu ulogu u aktivaciji, regulaciji i povezivanju ove dve grane imunskog sistema zahvaljujući svojim jedinstvenim morfološkim, fenotipskim i funkcionalnim karakteristikama (Banchereau i Steinman, 1998). 1.1. Karakteristike dendritskih ćelija Dendritske ćelije (DĆ) predstavljaju sistem antigen-prezentujućih ćelija (APĆ) koje efikasno stimulišu komponente urođenog i stečenog imuniteta integrišući njihove efektorske mehanizme u jedinstveni imunski odgovor. Jedan od podtipova DĆ, Langerhansove ćelije (LĆ), kao zasebna populacija ćelija opisane su još 1868. godine (Langerhans, 1868). Nova vrsta ćelija, identifikovana u slezini miša, je na osnovu jedinstvenih morfoloških karakteristika, izraženih dužih i kraćih citoplazmatskih nastavaka, nazvana dendritskim ćelijama 1973. godine (Steinman i Cohn, 1973). Potencijal ovih ćelija da stimulišu T-ćelijski imunski odgovor pokazan je pet godina kasnije u mešanoj leukocitnoj kulturi (Steinman i Witmer, 1978) i potvrđen u brojnim studijama koje su usledile. Uvod 3 U poređenju sa drugim APĆ, makrofagama i B limfocitima, ove ćelije se izdvajaju kao najznačajnije APĆ zbog svoje jedinstvene sposobnosti da aktiviraju naivne CD4 + i CD8 + T limfocite i obezbede signale neophodne za njihovu potpunu aktivaciju (Banchereau i Steinman, 1998; Steinman i Hemmi, 2006) (Slika 1). Pored ove ključne uloge u ćelijskom imunskom odgovoru, DĆ su važne za pokretanje humoralne imunosti aktiviranjem B limfocita (Jego i sar., 2005; Qi i sar., 2006), dok u okviru urođene imunosti aktiviraju ćelije prirodne ubice (engl. natural killer, NK) (Lucas i sar., 2007) i NKT ćelije (Fujii i sar., 2002). Takođe, DĆ imaju centralnu ulogu u uspostavljanju imunološke tolerancije u timusu i perifernim organima (Steinman i sar., 2003). Za obavljanje pomenutih brojnih, često i međusobno suprotstavljenih, funkcija neophodna je uska specijalizacija subpopulacija u okviru ovog heterogenog sistema APĆ. Slika 1. Funkcije dendritskih ćelija u ćelijskom imunskom odgovoru Uvod 4 DĆ se morfološki karakterišu prisustvom brojnih dendritskih nastavaka pomoću kojih stupaju u blizak kontakt sa ostalim ćelijama imunskog sistema. U zavisnosti od svog porekla, stepena zrelosti i funkcionalnog statusa, DĆ se mogu fenotipski karakterisati različitim nivoom ekspresije molekula glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase I i II (engl. major histocompatibility complex, MHC); CD1(a-e) molekula koji prezentuju lipidne i glikolipidne antigene endogenog i egzogenog porekla; kostimulatornih molekula: B7 familije, B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86), i CD40 molekula; adhezivnih molekula koji pripadaju klasi integrina ili receptora za integrine: molekula CD11 familije (CD11a, CD11b i CD11c), CD54 (intraćelijski adhezivni molekul-1, engl. intracellular adhesion molecule, ICAM-1), familije antigena asociranih sa funkcijom leukocita (engl. leukocyte function- associated antigen, LFA) i markera zrelih DĆ, CD83 molekula (Banchereau i sar., 2000; Liu i sar., 2001; Wu i Dakic, 2004; Steinman i Hemmi, 2006). Prema tradicionalnom stanovištu, DĆ su strateški pozicionirane tako da se nalaze na mestima kontakta sa spoljašnjom sredinom, uključujući kožu, creva i pluća (Nelson i Loffert, 1994; Nestle i sar., 1993; Sertl i sar., 1986), gde imaju ulogu nadzornika koji detektuje “opasne” signale, pa regrutuje i aktivira ostale ćelije imunskog sistema (Fernandez i sar., 1999; Foti i sar., 1999; Rescigno i sar., 1998). Fenotipski i funkcionalno nezrele DĆ se odlikuju izraženim svojstvima internalizacije i proteolitičke obrade antigena (Banchereau i Steinman, 1998). Nezrele DĆ ispoljavaju nizak nivo MHC molekula klase II kao i kostimulatornih i adhezivih molekula CD40, CD54, CD80 i CD86 (Sallusto i Lanzavecchia, 1994). DĆ mogu biti aktivirane brojnim signalima, među koje spadaju patogeni, apoptotične ćelije, produkti inflamacije, kao i ostale ćelije imunskog sistema. DĆ se odlikuju izuzetnom plastičnošću i sposobnošću prilagođavanja svog odgovora u zavisnosti od tipa stimulusa kome su izložene. Na primer, ove ćelije su sposobne da naprave razliku između pristustva infekcije i inflamacije. In vitro studije su pokazale da su proinflamatorni medijatori manje efikasni od patogena u pogledu aktivacije DĆ. DĆ izložene dejstvu proinflamatornih medijatora su efikasne u stimulisanju proliferacije T limfocita, ali ne i stvaranju efektorskih CD4+ T limfocita. Sa druge strane, izlaganje DĆ patogenima dovodi do kompletne aktivacije DĆ koje pokreću Uvod 5 odgovarajući CD4+ T-ćelijski odgovor (Sporri i Reis e Sousa, 2005). Dakle, priroda signala koje DĆ detektuju u svojoj mikrosredini utiče na karakteristike stečenog imunskog odgovora koji će one pokrenuti. Nakon aktivacije, DĆ menjaju morfologiju koja se ogleda u reorganizaciji citoskeleta, gubitku adhezivnih struktura i povećanju pokretljivosti ćelija. Aktivirane DĆ ispoljavaju hemokinski receptor 7 (engl. chemokine receptor 7, CCR7) zahvaljujući kome migriraju u sekundarne limfne organe i na taj način povezuju mesta inicijacije imunskog odgovora sa perifernim inficiranim tkivima. Naime, blizak kontakt između aktiviranih DĆ i T limfocita je prvi korak u efikasnom pokretanju imunskog odgovora. Migracija je praćena sazrevanjem koje se ogleda u smanjenju kapaciteta obrade antigena i povećanju sposobnosti njihove prezentacije, povećanju ekspresije kostimulatornih molekula i produkcijom citokina (Banchereau i Steinman, 1998). Fenomen sazrevanja DĆ je pokazan u in vitro i in vivo eksperimentima. Najpre je u in vitro studijama pokazano da LĆ nakon 2-3 dana kultivacije efikasnije stimulišu proliferaciju T limfocita u odnosu na proliferativni odgovor indukovan sveže izolovanim LĆ koje su, sa druge strane, efikasnije u prezentaciji peptidnih antigena (Schuler i Steinman, 1985; Romani i sar., 1989). Sekvencijalno smenjivanje funkcija DĆ tokom njihove migracije potvrđeno je i in vivo. Nakon stimulacije lipopolisaharidom (engl. lipopolysaccharide, LPS) ili ekstratkom Toxoplasma gondii, dolazi do redistribucije DĆ slezine iz marginalne zone i crvene pulpe, gde obrađuju antigene, u belu pulpu, u kojoj su lokalizovane T ćelije kojima prezentuju antigene (De Smedt i sar., 1996; Reis e Sousa i sar., 1997). Razvojni put, tzv. “paradigma Langerhansovih ćelija”, predstavlja prototip životnog ciklusa DĆ (Villadangos i Heath, 2005) (Slika 2). Uvod 6 DĆ imaju sposobnost da detektuju patogene zahvaljujući receptorima za prepoznavanje molekularnih obrazaca patogena (engl. pattern recognition receptors, PRR) (Akira, 2009). Određeni tip patogena se odlikuje jedinstvenom kombinacijom PAMP. PRR je velika familija receptora među kojima su do sad najbolje okarakterisane subfamilije Toll-sličnih receptora (engl. Toll like receptors, TLR) i lektinskih receptora C-tipa (engl. C-type lectin receptors, CLR). 1.1.1. Toll-slični receptori TLR su najveća familija receptora urođene imunosti koja je do sada identifikovana. Njihovo otkriće je vezano za eksperimente koji su pokazali da su mutanti za Toll protein Drosophila melanogaster vrlo podložni gljivičnim infekcijama. Tokom embriogeneze vinske mušice Toll protein je neophodan za uspostavljanje dorzo-ventralne ose, dok kod odraslih mušica ima ulogu u razviću imunosti na gljivice. Homologni sistem receptora je na osnovu homologije sa Toll proteinom identifikovan i kod sisara (Hoffmann i sar., 1996; Lemaitre i sar., 1996; Medzhitov i sar., 1997). Otkriće TLR je bilo od suštinskog značaja, slično kao i Slika 2. Aktivacija i sazrevanje dendritskih ćelija Uvod 7 otkriće receptora na limfocitima, za razumevanje kompleksnosti urođenog imunskog odgovora i mehanizama kojima se uspostavlja balans između zaštitnog imunskog odgovora i imunopatologije. TLR su transmembranski proteini tipa I izgrađeni od ekstraćelijskog domena koji prepoznaje ligande i sadrži ponovke bogate leucinom, transmembranskog regiona i intraćelijskog domena homologog receptoru za IL-1 koji je neophodan za prenos signala u ćeliju (engl. Toll-interleukin 1 receptor domain, TIR) (Medzhitov i sar., 1997). Do sada je identifikovano 10 humanih i 12 TLR u mišjem sistemu. TLR1-9 su konzervisane strukture u oba sistema. TLR10 je funkcionalan kod ljudi, dok je kod miševa njegova funkcija poremećena insercijom endogenog retrovirusa. Ligand za TLR10 još uvek nije poznat. TLR 11-13 nisu prisutni u humanom genomu (Kawai i Akira, 2010). Funkcionalne analize pojedinačnih TLR receptora su pokazale da svaki član prepoznaje različite molekulske obrasce mikroorganizama i to u okviru plazma membrane, endozoma, lizozoma i endolizozoma (Akira i sar., 2006). Receptori su pozicionirani tako da se osigura kolokalizacija sa odgovarajućim ligandima, ali i da se spreči interakcija sa „sopstvenim“ molekulima i održi imunološka tolerancija. Sve više podataka ide u prilog tome da se u određenim patološkim stanjima za TLR vezuju i endogeni molekuli što može biti povezano sa razvojem autoimunskih bolesti (Kawai i Akira, 2010). TLR su klasifikovani u dve grupe u zavisnosti od lokalizacije i odgovarajućih liganada. U prvu grupu su svrstani TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 i TLR11 koji su ispoljeni na plazma membrani i prepoznaju komponente membrana patogena, uključujući lipide, lipoproteine i proteine. Prvi sisarski homolog Toll proteina, TLR4, identifikovan je 1998. godine kao receptor za LPS kodiran Lps lokusom (Poltorak i sar., 1998). LPS je komponenta membrane Gram-negativnih bakterija i uzročnik je septičkog šoka. TLR4 i mijeloidni faktor diferencijacije 2 (engl. myeloid differentiation factor 2, MD2) formiraju kompleks za koji se vezuje LPS (Park i sar., 2009; Akashi-Takamura i Miyake, 2008). TLR2 prepoznaje širok spektar PAPM poreklom od bakterija, virusa, mikoplazme i gljivica (Akira i sar., 2006). Ligandi za TLR2 su lipoproteini bakterija, peptidoglikan i lipotejhnoična kiselina Gram-pozitivnih bakterija, Uvod 8 lipoarabinomanan mikoplazme, zimozan gljivica i hemaglutinin virusa iz Paramyxovirus familije. TLR2 formira heterodimere sa TLR1 ili sa TLR6. TLR1/TLR2 kompleks prepoznaje triacil lipopeptide Gram-negativnih bakterija i mikoplazme, a TLR2/TLR6 kompleks vezuje diacil lipopeptide Gram-pozitivnih bakterija i mikoplazme (Jin i sar., 2007; Kawai i Akira, 2010). TLR5 je najviše ispoljen na DĆ lamina propria u tankom crevu gde prepoznaje flagelin, protein bakterijskih flagela (Akira i sar., 2006). TLR11 je prisutan kod miševa u bubrezima i bešici gde prepoznaje uropatogene bakterije. Njegov homolog u humanom sistemu je TLR5 (Zhang i sar., 2004; Yarovinsky i sar., 2005). Drugu grupu ovih receptora čine TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9 koji se isključivo nalaze u intraćelijskim vezikulama, uključujući endoplazmatski retikulum (ER), endozome, lizozome i endolizozome gde prepoznaju nukleinske kiseline (Akira i sar., 2006; Kawai i Akira, 2010). TLR3 prepoznaje dvolančanu RNK poreklom od virusa i njen sintetski analog, poliinozinsku:policitidilinsku kiselinu (engl. polyinosinic:polycytidylic acid, Poly (I:C)) (Akira i sar., 2006). TLR3 prepoznaje i genomsku RNK reovirusa, dvolančanu RNK koja nastaje tokom replikacije virusa koji imaju jednolančanu RNK i pojedine male interferirajuće RNK (Kawai i Akira, 2010). TLR7 je najpre okarakterisan kao receptor koji prepoznaje derivate imidazokvinolina (imikvimod i rezikvimod) i analoge guanina (loksoribin). Pored ovih analoga purina, mišji TLR7/8 i humani TLR7 vezuju virusnu jednolančanu RNK i male interferirajuće RNK (Hornung i sar., 2005; Akira i sar., 2006). Humani TLR8 prepoznaje jednolančanu RNK i jedinjenje rezikvimod (Akira i sar., 2006). Ligandi za TLR9 su nemetilovana DNK sa CpG motivima poreklom od bakterija i virusa (Haas i sar., 2008) i nerastvorljivi kristal hemozin koji predstavlja nusprodukt digestije hemoglobina od strane parazita Plasmodium falciparum (Coban i sar., 2010). TLR3, TLR7 i TLR9 se nalaze u ER i nakon stimulacije se transportuju u endolizozome. Sprečavanje acidifikacije endolizozoma dovodi do izostanka efekata karakterističnih za stimulaciju ovih receptora što ukazuje na to da se u endolizozomima odvija interakcija liganada sa ovim receptorima (Kim i sar., 2008). Translokacija receptora se nalazi pod kontrolom proteina ER, UNC93B1. UNC93B1 se specifično vezuje za transmembranske regione TLR3, TLR7 i TLR9 u ER (Brinkmann i sar., 2007). Kod miševa koji su mutanti za ovaj protein javljaju se Uvod 9 poremećaji u produkciji citokina i ekspresiji kostimulatornih molekula, kao i povećana podložnost infekcijama od strane bakterija i virusa čiji su PAMP ligandi za TLR3, TLR7 i TLR9 (Tabeta i sar., 2006). 1.1.2. Lektinski receptori C-tipa Lektinski receptori C-tipa (engl. C-type lectin receptor, CLR) prepoznaju antigene koji su po strukturi ugljeni hidrati, prisutni kod širokog spektra patogena (Figdor i sar., 2002; Geijtenbeek i sar., 2004). Ekspresija CLR je specifična za određene subpopulacije DĆ, pa je tako BDCA-2 karakterističan za plazmacitoidne DĆ (Dzionek i sar., 2001), langerin (CD207) za LĆ (Valladeau i sar., 2000), a DC-SIGN (engl. DC-specific intercellular adhesion molecule-3 (ICAM-3)-grabbing non- integrin, CD209) je specifičan za intersticijalne DĆ (Geijtenbeek i sar., 2000a; Geijtenbeek i sar., 2000b). Poznato je da CLR imaju brojne funkcije. DC-SIGN stupa u interakcije sa: CD11b/CD18 i CEACAM 1 (engl. carcinoembryonic antigen (CEA)- related cellular adhesion molecule 1) ispoljenim na neutrofilima i time posreduje u aktivaciji DĆ od strane neutrofila (van Gisbergen i sar., 2005); ICAM-2 ispoljenim na ćelijama endotela čime se omogućava migracija DĆ iz krvnih i limfnih sudova u periferna tkiva i ICAM-3 koji je ispoljen na T limfocitima čime se olakšava njihova aktivacija od strane DĆ (Geijtenbeek i sar., 2000a). Neki od CLR, poput DC-SIGN i dektina-1, u citoplazmatskom domenu poseduju imunoreceptor tirozinske aktivacione sekvence (engl. immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM) putem kojih prenose aktivacione signale DĆ (Geijtenbeek i sar., 2000a; Ariizumi i sar., 2000; Brown, 2006). Sa druge strane, DCIR (engl. dendritic cell immunoreceptor) i MICL (engl. myeloid inhibitory C-type lectin receptor) u citoplazmatskom domenu imaju imunoreceptor tirozinske inhibitorne sekvence (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM) čija funkcija nije u potpunosti ispitana (Bates i sar., 1999; Marshall i sar., 2004). 1.1.2.1. Imunomodulacija fenotipa i funkcija dendritskih ćelija aktivacijom dektin-1 receptora Imunomodulatori su jedinjenja koja pri interakciji sa imunskim sistemom menjaju karakteristike imunskog odgovora pospešujući ili smanjujući neka njegova Uvod 10 svojstva. Primena imunomodulatora ima za cilj manipulisanje imunskim sistemom u cilju njegove kontrole, posebno razvoja efikasnijeg imunskog odgovora, uključujući i pospešivanje anti-tumorskog imunskog odgovora (Tzianabos, 2000). Polisaharidi su jedna od klasa imunomodulatora a među njima su najznačajniji β glukani. β-glukani su polimeri glukoze koji se sastoje od β(1→3) skeleta za koji su vezane β-D-glukoporanozil jedinice sa β(1→4) ili β(1→6) bočnim lancima varijabilne dužine. β-glukani su komponente ćelijskog zida gljivica, kvasaca i bakterija, a sadrže ih i ovas i ječam. Ova jedinjenja se ne nalaze kod životinja i predstavljaju molekulske obrasce koji pokreću mehanizme urođene i adaptivne imunosti (Brown i Gordon, 2001; Brown i Gordon, 2005). Efekti koje β- glukani imaju na komponente imunskog sistema zavise od njihove molekulske mase, konformacije, dužine bočnih lanaca, stepena grananja i rastvorljivosti (Zekovic i sar., 2005). β-glukani velike molekulske mase (>100 kDa), poput zimozana, pokreću fagocitne i antimikrobne aktivnosti makrofaga kao i produkciju proinflamatornih citokina i hemokina (Fadok i sar., 2000; Brown, 2006; Czop, 1986). β-glukani srednje i male molekulske mase (5-10 kDa) sa niskim stepenom grananja su biološki neaktivni (Zekovic i sar., 2005; Miyazaki i sar., 1979). β-glukani rastvorljivi u vodi su snažniji imunomodulatori od nerastvorljivih (Xiao i sar., 2004). Konformacija je još jedan od ključnih faktora koji utiču na biološku aktivnost β- glukana. Naime, β-glukani mogu imati tri konformacije: trostruki heliks, jednostruki heliks ili nasumičnu spiralu. U literaturi postoje kontradiktorni rezultati u pogledu biološke aktivnosti β-glukana zavisno od konformacije. Prema jednoj grupi autora β-glukani su najaktivniji kada imaju konformaciju jednostrukog heliksa (Aketagawa i sar., 1993) dok je prema drugima biološki najaktivnija konformacija trostrukog heliksa (Falch i sar., 2000; Ohno i sar., 1987). Ova jedinjenja su u in vivo uslovima snažni stimulatori imunskog odgovora usmerenog protiv razvoja tumora, kao i infekcija izazvanih gljivicama, virusima i bakterijama (Brown i Gordon, 2003). Pored imunomodulatorne uloge β-glukani kao molekulski obrasci predstavljaju ligande za brojne receptore ćelija imunskog sistema. Laktozilceramid je glikofosfolipid na plazma membrani neutrofila i endotelnih ćelija koji prepoznaje β(1→3) glukane iz gljivica (Zimmerman i sar., 1998). Komplement receptor 3 (engl. complement receptor 3, CR3), heterodimer koji se Uvod 11 sastoji od CD11b i CD18, prepoznaje β-glukane i ispoljen je na NK ćelijama, neutrofilima i monocitima (Ross, 2000). Receptori čistači (engl. scavenger receptors) koji su ispoljeni na mijeloidnim i endotelnim ćelijama takođe interaguju sa β-glukanima (Rice i sar., 2002). Dektin-1, receptor CLR familije, je nedavno identifikovan kao glavni receptor koji posreduje u efektima β-glukana (Brown i Gordon, 2001). Najpre je identifikovan kao receptor na DĆ koji prepoznaje tada još uvek neidentifikovan ligand na T ćelijama (Ariizumi i sar., 2000) i prvobitno je nazvan lektin-1 tipa C na DĆ. Kasnije je utvrđeno da je ispoljen i na drugim tipovima ćelija kao što su neutrofili, makrofage, monociti i podtipu T ćelija (Taylor i sar., 2002). Kod ljudi ispoljen je i na B ćelijama i eozinofilima (Willment i sar., 2005). Dektin-1 je transmembranski receptor sa ekstraćelijskim domenom koji prepoznaje ugljene hidrate (engl. carbohydrate recognition domain, CRD) i intraćelijskim domenom koji sadrži ITAM preko koje se odvija signalizacija. Dektin-1 prepoznaje β(1→3) i β(1→6) glukane (Brown i Gordon, 2001). Takođe prepoznaje i zimozan koji pored β- glukana sadrži hitin, manan, proteine i lipide (Brown, 2006). Dektin-1 receptor je jedini, pored TLR, koji pokreće signalnu kaskadu. Signalna komponenta dektin-1 receptora je ITAM sekvenca koja je takođe prisutna kod receptora na B i T limfocitima kao i Fcγ receptoru. Veliki broj studija je proučavao efekat zimozana koji pored dektin-1 receptora aktivira i TLR2. Ispitivanja na makrofagama i DĆ korišćenjem zimozana su pokazala da dektin-1 zajedno sa TLR2 dovodi do produkcije TNF-α, IL-2, IL-10 (Brown i Gordon, 2003; Gantner i sar., 2003), indukcije respiratornog praska (Gantner i sar., 2003; Underhill i sar., 2005), kao i fagocitoze (Herre i sar., 2004; Underhill i sar., 2005). Ispitivanja na mišjim i humanim DĆ su pokazala da stimulacija dektin-1 receptora dovodi do fenotipskog sazrevanja ovih ćelija i polarizacije imunskog odgovora u Th1 i Th17 pravcu (LeibundGut-Landmann i sar., 2007; Skrzypek i sar., 2009; Gringhuis i sar., 2009; Ferwerda i sar., 2008). 1.2. Poreklo dendritskih ćelija U cilju održavanja homeostaze populacija DĆ se mora kontinuirano osvežavati novim DĆ koje se razvijaju iz prekursora. Poput ostalih ćelija Uvod 12 hematopoetskog porekla, DĆ nastaju diferencijacijom matičnih ćelija kostne srži koje integrišu signale iz svoje mikrosredine i usmeravaju svoj dalji razvoj ka mijeloidnoj ili limfoidnoj liniji (Manz i sar., 2001; Kondo i sar., 2003). Shodno tome, a u skladu sa markerima ispoljenim na površini DĆ, poreklo DĆ može biti mijeloidno odnosno limfoidno (Shortman i Naik, 2007). Najpre se smatralo da su sve DĆ mijeloidnog porekla. Najranija istraživanja su pokazala da se u prisustvu faktora stimulacije rasta kolonija granulocita i makrofaga (engl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) mijeloidni prekursori iz kostne srži miša razvijaju u makrofage, granulocite i DĆ (Inaba i sar., 1993). Takođe, humane CD34+ ćelije kultivisane u prisustvu GM-CSF i TNF-α su se diferencirale u CD1a- monocite, prekursore granulocita i DĆ, odnosno u makrofage, u prisustvu faktora stimulacije rasta kolonija makrofaga (engl. macrophage colony-stimulating factor, M-CSF) (Reid i sar., 1992; Szabolcs i sar., 1996; Caux i sar., 1996). Direktna potvrda mijeloidnog porekla DĆ usledila je nakon detektovanog obnavljanja populacija DĆ u slezini i timusu miševa posle transplantacije zajedničkih mijeloidnih progenitora (ZMP) iz kostne srži u radioaktivno ozračene primaoce (Traver i sar., 2000; Wu i sar., 2001; Manz i sar., 2001). Ispitivanjem membranskih markera na DĆ timusa, slezine i limfnih čvorova pokazano je da su neki od njih (CD8α, CD4, CD2, BP1 i CD25) karakteristični za ćelije limfoidnog porekla (Vremec i sar., 1992). Iz ove studije je proistekla pretpostavka o limfoidnom poreklu DĆ koja je potvrđena u eksperimentima sa transferom CD4low timusnih limfoidnih prekursora u timus ozračenih primalaca od kojih su nastali T limfociti i CD8 + timusne DĆ (Wu i sar., 1995; Ardavin i sar., 1993). Ovi prekursori su imali potencijal diferenciranja i u CD8+ i CD8- DĆ slezine (Wu i sar., 2001; Martin i sar., 2000). Takođe je pokazano da zajednički limfoidni progenitori (ZLP) u mišjem sistemu imaju sposobnost da se diferenciraju u DĆ i in vivo i in vitro (Wu i sar., 2001; Manz i sar., 2001; Izon i sar., 2001). Uvod 13 Kada je pokazano da i mijeloidni i limfoidni progenitori mogu da se razviju u CD8α+ i CD11b+ DĆ (Wu i sar., 2001), kao i u plazmacitoidne DĆ (Karsunky i sar., 2005) postavilo se pitanje biološkog značaja višestrukih razvojnih puteva DĆ (Schmid i sar., 2010). Smatra se da je značaj multilinijskog razvojnog programa DĆ osiguravanje efikasne selekcije funkcionalnih B i T limfocita koji nisu autoreaktivni (Rolink i sar., 2001; Goldrath i Bevan, 1999). U prilog ovoj hipotezi ide podatak da su u timusu najzastupljenije DĆ limfoidnog porekla, dok u svim ostalim organima dominiraju DĆ mijeloidnog porekla (Ardavin i sar., 1993; Wu i sar., 1996; Merad i Manz, 2009). DĆ se mogu razviti direktno, od ZMP i ZLP, ili indirektno, od delimično ili potpuno diferenciranih ćelija mijeloidne i limfoidne linije. ZLP i ZMP od kojih će nastati DĆ eksprimiraju Flt-3 molekul (engl. FMS-related tyrosine kinase 3, Flt) (Shortman i Naik, 2007) koji je receptor za Flt-3 ligand, najznačajniji faktor za diferencijaciju DĆ in vivo (Waskow i sar., 2008). Flt-3 molekul je tirozin kinaza kontinuirano eksprimirana od stadijuma progenitora do potpuno diferenciranih DĆ (Dong i sar., 2002) i predstavlja obeležje ovog razvojnog puta DĆ. DĆ se indirektno mogu razviti od monocita, granulocitno-monocitnih prekursora u okviru mijeloidnog puta, odnosno od timusnih limfoidnih prekursora u okviru limfoidnog puta (D'Amico i Wu, 2003; Traver i sar., 2000; Manz i sar., 2001; Wu i sar., 2001; Karsunky i sar., 2005). Monociti imaju značajnu ulogu kao prekursori DĆ (Cella i sar., 1997). Ove ćelije imaju sposobnost da se diferenciraju u različite subpopulacije fagocita u zavisnosti od lokalnih faktora kojima su izložene u tkivu u kome se nalaze. Monociti eksprimiraju CD11b, CD11c, CD13, CD14 i CD33 (Liu i sar., 2001), manozni receptor kao i CD1a, b, c i d. Monociti se u prisustvu M-CSF diferenciraju u makrofage, dok se pri kultivaciji sa GM-CSF i IL-4 diferenciraju u nezrele DĆ. Ove nezrele DĆ poreklom od monocita (MoDĆ) su nalik intersticijalnim DĆ i mogu se aktivirati i sazreti pod uticajem proinflamatornih citokina, produkata patogena ili signalima poreklom od T ćelija (CD40L) (Cella i sar., 1996). Dodavanje TGF-β u kulturu monocita u prisustvu GM-CSF i IL-4 usmerava diferencijaciju monocita ka LĆ (Geissmann i sar., 1998). Mogućnost diferenciranja monocita u DĆ je potvrđena i Uvod 14 in vivo i praćena je migracijom ovih DĆ u T ćelijske oblasti regionalnih limfnih čvorova (Randolph i sar., 1999). 1.3. Klasifikacija dendritskih ćelija DĆ su heterogena populacija ćelija čije su razlike u fenotipskim i funkcionalnim svojstvima rezultat brojnih faktora kao što su stadijumi ontogeneze, putevi migracije, tkivna distribucija i uticaj faktora mikrosredine (Shortman i Naik, 2007). Potreba za podelom DĆ na podtipove se javila sedamdesetih godina prošlog veka kad je ustanovljeno da se LĆ razlikuju od DĆ slezine kod miša. U to vreme se ovaj fenomen pripisivao različitim stupnjevima u razvoju DĆ i smatralo se da su DĆ slezine kasniji stupanj razvoja LĆ. Konačan dokaz o postojanju različitih podvrsta DĆ usledio je identifikacijom DĆ slezine miša koje su se međusobno razlikovale po ekspresiji CD8 molekula (CD8α+ i CD8α- DĆ) (Vremec i sar., 1992). Paralelno sa studijama na mišjem sistemu ispitivane su humane DĆ i izvršena je klasifikacija na mijeloidne DĆ (mDĆ), limfoidne i plazmacitoidne DĆ (pDĆ) (Grouard i sar., 1997). Ovakva podela je primenjena i na DĆ u mišjem sistemu (Asselin-Paturel i sar., 2001; O'Keeffe i sar., 2002). Aktuelna klasifikacija zanemaruje ontogenetsko poreklo DĆ usled izrazite plastičnosti fenotipskih i funkcionalnih karakteristika ovih ćelija i prema njoj DĆ se dele na konvencionalne DĆ (kDĆ) i pDĆ (Shortman i Naik, 2007). 1.3.1. Konvencionalne dendritske ćelije Podela kDĆ na subpopulacije u mišjem sistemu se zasniva na ekspresiji CD4, CD8, CD205, CD11b i langerina. DĆ slezine se dele na tri podvrste uključujući CD4 + CD8α-CD11b+CD205-, CD4-CD8α+CD11b-CD205+ i CD4-CD8α-CD11b+CD205- DĆ (Vremec i sar., 2000). Ove DĆ vode poreklo od prekursora koji su se razvili u slezini (Naik i sar., 2006; Diao i sar., 2006). DĆ slezine su fenotipski i funkcionalno nezrele (Wilson i O'Neill, 2003) i imaju ulogu u detektovanju patogena prisutnih u krvi (Lundie i sar., 2008; Sponaas i sar., 2006). CD8α- DĆ su zastupljene u marginalnoj zoni slezine, subkapsularnim sinusima limfnih čvorova i subepitelnom regionu Pajerovih ploča, dok su CD8α+ DĆ prisutne u T-ćelijskim zonama limfoidnih organa Uvod 15 (Pulendran i sar., 1997; Shortman i Liu, 2002). CD8α- DĆ mogu da migriraju u T- ćelijske zone nakon stimulacije (De Smedt i sar., 1996). U timusu miša prisutne su dve subpopulacije DĆ koje su CD4 - CD11b - CD205 + i međusobno se razlikuju po nivou ekspresije CD8α molekula (Vremec i sar., 2000). U limfnim čvorovima su prisutne dve subpopulacije CD4 - CD11b + CD205 + koje se razlikuju po intenzitetu ekspresije CD8α molekula i prisustvu odnosno odsustvu ekspresije langerina (Henri i sar., 2001). U koži su identifikovane tri različite subpopulacije DĆ: LĆ, dermalne DĆ i langerin + CD11b - CD103 + DĆ (Heath i Carbone, 2009). U humanom sistemu najbolje su okarakterisane DĆ prisutne u koži i krvi (Slika 3). Slika 3. Tipovi dendritskih ćelija u humanom sistemu U epidermisu kože se nalaze LĆ, dok su u dermisu prisutne 3 podvrste tzv. intersticijalnih DĆ uključujući CD1a+CD14-, CD1a-CD14+ i CD1a-CD14- DĆ (Nestle i sar., 1993; Angel i sar., 2006). LĆ eksprimiraju CD1a, langerin, E-kadherin, Uvod 16 Birbekove granule, CD39 i CCR6. CCR6 se specifično se ispoljava na LĆ i omogućava migraciju nezrelih LĆ u epidermis, vezujući se za MIP-3α, koji se isključivo ispoljava na epitelu (Romani i sar., 2003; Santegoets i sar., 2008). Dermalne CD14+ DĆ ispoljavaju receptore iz CLR familije (DC-SIGN, DEC -205, LOX-1, CLEC-6, Dektin-1 i DCIR). CD1a + DĆ eksprimiraju manozni receptor, DC-SIGN, CD36, faktor XIIIa i CCR5. LĆ i DĆ koje eksprimiraju CD1a se međusobno razlikuju po fenotipskim i funkcionalnim svojstvima. CD1a + DĆ su aktivirane, migratorne DĆ koje eksprimiraju visoke nivoe kostimulatornih, adhezivnih molekula, hemokina i hemokinskih receptora (CCL22, MIP-1α, MIP-1β, CCR7 i CXCR4) i sekretuju proinflamatorne citokine u odsustvu stimulusa. Sa druge strane, CD1a+ LĆ se odlikuju niskom ekspresijom kostimulatornih molekula i slabom produkcijom proinflamatornih citokina (Santegoets i sar., 2008). Prema novim nalazima, LĆ se smatraju transporterima antigena koje prenose iz kože u regionalne limfne čvorove i predaju rezidentnim DĆ koje imaju ulogu u stimulaciji T-ćelija (Allan i sar., 2006). U perifernoj krvi ljudi prisutno je 5 podtipova DĆ. U okviru CD11c + subpopulacije DĆ podela je izvršena na osnovu ekspresije CD16, CD1b/c i BDCA-3 (engl. blood dendritic cell antigen, BDCA). Najbrojnije su CD1c+CD16+ DĆ koje imaju nisku ekspresiju CD14 i CD33, HLA-DR i ne ispoljavaju kutani limfocitni antigen (engl. cutaneous lymphocyte antigen, CLA). CD1c + CD16 + DĆ ispoljavaju visoke nivoe kostimulatornih molekula, CD86 i CD40. CD11c+CD1b/c+ DĆ eksprimiraju CD33, HLA- DR i vrlo niske nivoe CD14. Najmanje brojna subpopulacija CD11c + DĆ u krvi su BDCA-3+ DĆ koje ispoljavaju niske nivoe CD11c i ne eksprimiraju CD14. BDCA-3+ DĆ imaju najnižu ekspresiju CD86 i najveću ekspresiju CD40 i DEC-205 u poređenju sa ostalim podtipovima DĆ u krvi. CD11c - DĆ se prema ekspresiji CD123 i CD34 mogu podeliti na dve subpopulacije, CD123 + DĆ i CD34+ DĆ. CD11c-CD123+ DĆ imaju slabu ekspresiju CD86 molekula i umerenu ekspresiju CD86, dok CD11c-CD34+ DĆ ne eksprimiraju CD86 i umereno ispoljavaju HLA-DR (MacDonald i sar., 2002). Uvod 17 1.3.2. Plazmacitoidne dendritske ćelije Lennert i Remmele su 1958. godine opisali ćelije prisutne u T-ćelijskoj zoni limfoidnog tkiva ljudi koje po morfologiji podsećaju na plazma ćelije, ali ne ispoljavaju markere B ćelija i plazma ćelija. Ove ćelije su nazvane plazmacitoidne T ćelije. Dvadeset godina kasnije pokazano je da nakon izlaganja leukocita periferne krvi virusima ili virusom inficiranim ćelijama jedan mali broj ćelija produkuje interferone tipa I (IFN-α i IFN-β) koji stimulišu citotoksične funkcije NK ćelija (Trinchieri, 1978). Ove IFN tip I- produkujuće ćelije nisu imale karakteristike T limfocita, B limfocita, NK ćelija niti monocita, a ispoljavale su MHC molekule klase II i niskoafinitetne Fcγ receptore (Trinchieri, 1978; Abb i sar., 1983; Ronnblom i sar., 1983; Perussia i sar., 1985). Deset godina kasnije u perifernoj krvi ljudi identifikovane su CD11c- nezrele DĆ sa niskom ekspresijom MHC molekula klase II i slabom sposobnošću stimulacije proliferacije T limfocita (O'Doherty i sar., 1994). Nakon kultivacije u kondicioniranom medijumu ove ćelije su povećale ekspresiju MHC molekula klase II. Potom su iz tonzila izolovane CD11c-CD4+CD45RA+ ćelije sa gotovo identičnim karakteristikama kao i CD11c - ćelije periferne krvi. Ove ćelije su opstajale u kulturi samo u prisustvu IL-3 i CD40L pod čijim uticajem su se diferencirale u ćelije sa morfologijom DĆ (Grouard i sar., 1997). Uticaj IL-3 na preživljavanje ovih ćelija se bazirao na visokom nivou ekspresije α-lanca IL-3 receptora (IL-3Rα, CD123). Krajem XX veka je definitivno potvrđeno da se radi o posebnom podtipu DĆ koje su prisutne u perifernoj krvi i sekundarnim limfoidnim organima i nakon stimulacije virusima produkuju IFN tipa I (Siegal i sar., 1999; Cella i sar., 1999a). U krvi, kostnoj srži i sekundarnim limfoidnim organima miša nalaze se CD11c + CD45RA + CD19–Gr1 + pDĆ (Nikolic i sar., 2002). Humane pDĆ su fenotipski okarakterisane kao CD4 + CD45RA + CD123 + ILT3 + ILT1 - CD11c - ćelije. Niskoafinitetni Fcγ receptor identifikovan u ranijim studijama je FcγRIIa (CD32) koji moduliše produkciju IFN tipa I od strane pDĆ (Bave i sar., 2003). pDĆ prisutne u krvi i kostnoj srži ispoljavaju i dva specifična markera, BDCA-2 i BDCA-4. BDCA-2 je Uvod 18 transmembranski glikoprotein koji pripada CLR familiji receptora sa svojstvima internalizacije antigena u cilju prezentacije T limfocitima. Primena antitela specifičnih za BDCA-2 inhibira produkciju IFN tipa I od strane pDĆ (Dzionek i sar., 2001). BDCA-4 je identičan neuropilinu-1, neuronalnom receptoru za klasu 3 semaforinske subfamilije i koreceptor je za vaskularni endotelni faktor rasta prisutan na endotelnim i tumorskim ćelijama. Primena antitela specifičnih za BDCA-4 nema uticaj na funkciju pDĆ i mogu se koristiti za izolaciju ovih ćelija pozitivnom selekcijom (Dzionek i sar., 2002). Poreklo pDĆ je predmet brojnih debata i istraživanja. Za diferencijaciju pDĆ od hematopoetskih matičnih ćelija i kod čoveka i kod miša je ključan Flt3-ligand (Blom i sar., 2000; Karsunky i sar., 2003), a za njihovu migraciju iz kostne srži faktor stimulacije rasta kolonija granulocita (engl. Granuclocyte colony-stimulating factor, G-CSF) (Pulendran i sar., 2000; Arpinati i sar., 2000). Prisustvo transkripta za pre-T-ćelijski receptor α (pre-Tα), λ5 i spi-B je išlo u prilog hipotezi o limfoidnom poreklu pDĆ (Rissoan i sar., 2002; Corcoran i sar., 2003) dok nije pokazano da se Flt3 + ćelije mogu diferencirati i u mDĆ i u pDĆ (Karsunky i sar., 2003; D'Amico i Wu, 2003). Intrigantni su rezultati istraživanja sprovedenih od strane dve istraživačke grupe koji su ukazali na moguće postojanje zajedničkog prekursora pDĆ i kDĆ u mišjem sistemu. U kostnoj srži miša identifikovane su ćelije koje su okarakterisane kao CD11c - MHC II-Lin-Flt3+M-CSFR+c-Kitint koje se nakon tranfera u slezinu i limfni čvor miša diferenciraju u CD8 + DĆ, CD8- DĆ i pDĆ. Ove ćelije se in vitro diferenciraju u kDĆ i pDĆ u prisustvu Flt-3L. Razviću u kDĆ, za razliku od pDĆ, prethodi stupanj CD11c - MHC II + pre-DĆ (Onai i sar., 2007; Naik i sar., 2007) (Slika 4). Uvod 19 Slika 4. Hipotetički model diferencijacije DĆ od jedinstvenog DĆ prekursora pDĆ u krvi ispoljavaju i L-selektin (Cella i sar., 1999a) čija se ekspresija smanjuje u limfoidnim organima u kojima su pDĆ prisutne u blizini visokih endotelnih venula (Grouard i sar., 1997; Facchetti i sar., 2003). Aktivacija pDĆ je praćena morfološkim promenama i povećanjem ekspresije MHC molekula klase I i II, kostimulatornih molekula (CD40, CD80 i CD86) kao i produkcijom IFN tipa I. Uprkos opisanim fenotipskim i funkcionalnim promenama pDĆ su manje efikasne APĆ od kDĆ (Asselin-Paturel i sar., 2001). 1.4. In vitro priprema dendritskih ćelija DĆ čine svega 0.1-1% ukupnog broja ćelija u organizmu i odlikuju se širokom tkivnom distribucijom i heterogenošću. Značajan napredak u istraživanju DĆ je usledio tek dve decenije od njihove identifikacije, kada su razvijene metode za njihovu in vitro pripremu (Inaba i sar., 1992; Talmor i sar., 1998; Lutz i sar., 1999). Kako je priprema DĆ iz kostne srži miša bila najefikasniji i najzastupljeniji metod Uvod 20 većina studija je izvođena upravo na ovom tipu DĆ. U početku je korišćen koktel antitela (antitela specifična za CD4, CD8, B220) u cilju eliminacije limfocita i GM-CSF kao jedini faktor za stvaranje DĆ od progenitora. Nakon nedelju dana kultivacije dobijao se dovoljan broj DĆ, ali je postojala kontaminacija sa granulocitima i makrofagima (Inaba i sar., 1992). Kasnije su modifikovani protokoli produženjem vremena kultivacije, smanjenjem koncentracije GM-CSF i uvođenjem IL-4 (Lutz i sar., 1999; Garrigan i sar., 1996). DĆ dobijene kultivisanjem progenitora iz kostne srži miša u prisustvu GM-CSF i IL-4 su fenotipski i funkcionalno nalik MoDĆ, ali razlike ipak postoje. Sallusto i Lanzavecchia su prvi kultivisali humane monocite iz periferne krvi u prisustvu IL-4 i GM-CSF u cilju dobijanja MoDĆ (Sallusto i Lanzavecchia, 1994) (Slika 5). Slika 5. In vitro priprema DĆ Postoji još jedan način za pripremu DĆ iz krvi i to je kultivacija preko noći sortiranih mononuklearnih ćelija u RPMI 1640 medijumu sa AB serumom kojom se dobijaju CD11c + DĆ. Ove ćelije eksprimiraju CD86 i u manjoj meri HLA-DR. Razlika između CD11c + DĆ i MoDĆ je u tome što CD11c+ DĆ ne eksprimiraju DC-SIGN, manje su efikasne u prezentaciji antigena i indukuju jači Th1 odgovor (Osugi i sar., 2002). Za pripremu DĆ korišćeni su i CD34 + hematopoetske progenitorske ćelije iz kostne srži i periferne krvi (Bernhard i sar., 1995) i CD14+ monociti dobijeni metodom imunomagnetnog sortiranja mononukleara periferne krvi (Babatz i sar., 2003). Postoji još jedan tip kratkotrajnih kultura u kojima DĆ dobijaju kultivacijom humanih CD14 + monocita tokom prvih 24h u prisustvu GM-CSF i IL-4 i tokom Uvod 21 sledećih 24h u prisustvu proinflamatornih medijatora (TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2) (Dauer i sar., 2003). 1.5. Uloga dendritskih ćelija u polarizaciji imunskog odgovora DĆ oblikuju CD4 + T-ćelijski odgovor u skladu sa prirodom patogena koji su prepoznali a koji ugrožava homeostazu organizma (Lafaille, 1998). Stimulusi koji aktiviraju DĆ i dovode do njihovog sazrevanja povećavaju efikasnost obrade antigena i produžavaju ispoljavanje kompleksa antigen-MHC molekul klase II na površini DĆ (Cella i sar., 1997). Kada dođe do interakcije T-ćelijskog receptora sa antigenom u sklopu MHC molekula II klase na DĆ i kada T-ćelije uspostave stabilan kontakt sa DĆ dolazi do formiranja imunološke sinapse (Al-Alwan i sar., 2001). Prepoznavanje antigena je praćeno aktivacijom intraćelijskih signalnih molekula uključujući protein kinazu C (PKC), jone kalcijuma i nuklearni faktor κB (engl. nuclear factor kappa-B, NF-κB) (Constant i Bottomly, 1997; Noble i sar., 2000; Rogers i Croft, 2000). Kostimulatori ispoljeni na DĆ (CD40, CD80, CD86, PD-L1 (engl. programmed death-1 ligand), PD-L2 i ICOS-L (engl. inducible costimulator ligand) se vezuju za odgovarajuće molekule na T ćelijama (CD40L, CD28/CTLA-4, PD-1 i ICOS) (Van Gool i sar., 1996; Greenwald i sar., 2005). Za odgovarajuću diferencijaciju aktiviranih naivnih T ćelija neophodni su citokini. Optimalno vreme za sekreciju citokina je nakon uspostavljanja kontakta DĆ i T ćelija i uspostavljanja interakcije CD40:CD40L. Dakle, fenotip polarizovanih T-ćelija koje se diferenciraju od naivnih CD4+ T limfocita je rezultat kompleksnih interakcija sa DĆ uz učešće citokina, kostimulatornih molekula i polarizujućih faktora. Ovi faktori aktiviraju intraćelijske signalne puteve i ekspresiju gena specifičnih za određeni podtip CD4+ T ćelija. Aktivacija je praćena klonalnom ekspanzijom antigen-specifičnih efektorskih ćelija koje se mogu diferencirati u Th1, Th2, Th17 ili Treg fenotip (Slika 6). Uvod 22 Slika 6. Uticaj DĆ na polarizaciju Th ćelijskog odgovora Razvoj Th1 imunskog odgovora stimulisan je u prisustvu IL-12, IL-18, IFN-α i IFN-β. Ove citokine oslobađaju makrofage i DĆ nakon aktivacije intraćelijskim patogenima (Farrar i sar., 2002). IL-12 stimuliše produkciju IFN-γ od strane APĆ uspostavljajući pozitivnu povratnu spregu koja dovodi do dodatne produkcije IL-12. Sa druge strane, IFN-γ deluje inhibitorno na razvoj Th2 ćelija (Murphy i sar., 2000). IFN-γ u naivnim T ćelijama dovodi do aktivacije transkripcionog faktora STAT-1 (engl. signal transducer and activator of transcription 1) koji potom pokreće aktivaciju transkripcionog faktora T-bet. T-bet dovodi do remodelovanja genskog lokusa za IFN-γ, produkcije IFN-γ i ekspresije receptora za IL-12 (Mullen i sar., 2001). IL-12 se potom vezuje za svoj receptor ispoljen na Th1 ćelijama i signalna kaskada pokrenuta ovim receptorom aktivira transkripcione faktore STAT-3, STAT- 4 i NF-κB čime se stabilizuje produkcija citokina koji su karakteristični za Th1 fenotip (Afkarian i sar., 2002). Th1 ćelije su efikasne u zaštiti od intraćelijskih patogena kao i eliminaciji tumorskih ćelija (Kidd, 2003). Uvod 23 Th2 ćelije se razvijaju pod uticajem IL-2 IL-4, IL-6, IL-10 i IL-11 (Swain i sar., 1990; Curti i sar., 2001; Laouini i sar., 2003; Cote-Sierra i sar., 2004; Krishnamoorthy i sar., 2007). DĆ ne produkuju IL-4 i smatra se da ovaj citokin produkuju NKT ćelije, eozinofili ili mast ćelije (Wang i sar., 2006). IL-4 aktivira transkripcioni faktor STAT-6 u naivnim T ćelijama što je praćeno aktivacijom transkripcionog faktora GATA-3 (Kaplan i sar., 1996; Ouyang i sar., 1998). GATA-3 i T-bet deluju antagonistički. Kada su prisutne visoke koncentracije IFN-γ, IL-12 i T-bet, inhibira se GATA-3, a visok nivo produkcije GATA-3 i IL-4 je praćen supresijom T-bet (Mullen i sar., 2001; Ouyang i sar., 1998). GATA-3 je odgovoran za produkciju citokina karakterističnih za Th2 fenotip, IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 i IL-13 (Farrar i sar., 2002). c-MAF je još jedan transkripcioni faktor specifičan za Th2 ćelije odgovoran je za regulaciju sinteze IL-4 (Ho i sar., 1996). Th2 ćelije produkuju sve veće količine IL- 4 i uspostavlja se pozitivna povratna sprega kojom se održava Th2 fenotip (Kidd, 2003). Tokom ranog Th2 imunskog odgovora produkuje se IL-6 koji povećava produkciju IL-4 i inhibira fosforilaciju STAT-1 (Dodge i sar., 2003; Detournay i sar., 2005). Sa druge strane, IL-11 deluje direktno na T ćelije stimulišući sintezu IL-4 i IL- 5 a istovremeno inhibira produkciju IFN-γ. Takođe, IL-11 suprimira sekreciju IL-12 od strane makrofaga (Curti i sar., 2001). IL-10 smanjuje ekspresiju IL-12Rβ2 receptora (Romano i sar., 2005) čime smanjuje usmeravanje ka Th1. Za razliku od Th1 ćelija koje posreduju u ćelijskom, Th2 ćelije posreduju u humoralnom imunskom odgovoru. Tako je IL-4 neophodan za produkciju IgE, IL-5 za aktivaciju eozinofila, dok IL-4 i IL-13 stimulišu proliferaciju i degranulaciju mast ćelija. Th17 ćelije eksprimiraju transkripcioni faktor RORγt i produkuju IL-17A, IL- 17F, IL-21 i IL-22. Osnovna uloga Th17 ćelija je zaštita od ekstraćelijskih patogena, uključujući i gljivice. IL-17A je uključen i u regrutovanje, aktivaciju i migraciju neutrofila (Dubin i Kolls, 2008). Kod miša Th17 ćelije se razvijaju od naivnih T ćelija pod uticajem IL-6 i TGF-β dok su IL-21 i IL-23 neophodni za održavanje Th17 fenotipa (Mangan i sar., 2006; Veldhoen i sar., 2006; Huber i sar., 2008). Za diferencijaciju Th17 ćelija kod ljudi neophodni su IL-1, IL-6 i TGF-β (Benwell i Lee, 2010). Specifično je da se Th17 ćelije ljudi odlikuju izaženom plastičnošću. Naime, Uvod 24 ustanovljeno je postojanje Th1/Th17 ćelija koje sekretuju kako IL-17 tako i IFN-γ ispoljavaju istovremeno IL-23R, IL-12Rβ2 i transkripcione faktore RORC i T-bet (Annunziato i sar., 2007). Takođe su kod ljudi i miša identifikovane Th2/Th17 ćelije koje koeksprimiraju transkripcione faktore GATA3 i RORγt i pored Th2 citokina produkuju IL-17 i IL-22, a imaju ulogu razvoju astme (Wang i sar., 2010). Funkcije efektorskih Th1, Th2 i Th17 ćelija se nalaze pod kontrolom CD4 + CD25 + T regulatornih ćelija (Treg). Treg ćelije su neophodne za uspostavljanje imunološke tolerance i regulaciju imunskog odgovora. Ove ćelije inhibiraju proliferaciju i produkciju citokina od strane CD4 + i CD8+ T limfocita, produkciju imunoglobulina od strane B limfocita, citotoksičnu aktivnost NK ćelija kao i sazrevanje DĆ. Za diferencijaciju ovih ćelija ključni transkripcioni faktor je Foxp3 (engl. Forkhead box P3, FoxP3) (Sakaguchi, 2005; Akbar i sar., 2007). Kao i u slučaju Th17 ćelija, za razvoj Treg neophodan je TGF-β. Kada su DĆ aktivirane mikroorganizmima koji dovode do produkcije proinflamatornih citokina IL-1 i IL-6, prisustvo TGF-β ih usmerava ka Th17 fenotipu. Sa druge strane, izostanak proinflamatornih citokina dovodi do razvoja Treg ćelija. Regulatorne T ćelije sekretuju IL-10, IL-35 TGF-β i imaju imunosupresorsku ulogu (O'Garra i sar., 2004; Vignali i sar., 2008; Collison i sar., 2010). 1.6. Struktura TNF-α, receptori za TNF-α i biološki efekti TNF-α Sposobnost imunskog sistema da razvije anti-tumorski imunski odgovor uočena je pre više od 100 godina zahvaljujući hirurgu William Coley-u koji je uočio regresiju tumora nakon bakterijske infekcije pacijenta obolelog od sarkoma (Coley, 1906). U istraživanjima koja su usledila identifikovan je faktor koji ispoljava citotoksičan efekat na tumorske ćelije i dovodi do nekroze tumora kod animalnih modela kancera (Shear i sar., 1943; Shear, 1944; O'malley i sar., 1962). Izolovana su dva različita proteina sa sličnim sekvencama: faktor nekroze tumora alfa (engl. tumor necrosis factor, TNF-α) i limfotoksin beta (danas poznatiji pod imenom TNF- β) (Aggarwal i sar., 1985; Aggarwal i sar., 1984). Otkriće da se TNF-α i TNF-β vezuju za isti receptor (Aggarwal i sar., 1985) je bilo prva indikacija o postojanju Uvod 25 superfamilije za koju se danas zna da se sastoji od 19 liganada i 30 receptora uključenih u regulaciju funkcija imunskog sistema (Croft, 2009; Sabbagh i sar., 2007; Hehlgans i Pfeffer, 2005). TNF-α se primarno sintetiše kao transmembranski protein tipa II u vidu homotrimera (Kriegler i sar., 1988; Tang i sar., 1996). Od ove membranske forme proteolitičkom delovanjem metaloproteaze TNF-α konvertujućeg enzima (engl. TNF alpha coverting enzyme, TACE) oslobađa se citokin u vidu solubilnog heterotrimera (Black i sar., 1997). TNF-α se vezuje za dva različita tipa receptora: TNF receptor tipa 1 (TNFR1; p55; CD120a) i TNF receptor tipa 2 (engl. TNF receptor type, TNFR2; p75; CD120b) (Vandenabeele i sar., 1995). Ovi receptori se međusobno razlikuju po tipu ćelija na kojima se eksprimiraju, stabilnosti, afinitetu za vezivanje liganda, dužini poluživota kompleksa ligand-receptor, kao i signalnim putevima koje pokreću (Beutler i Cerami, 1989; McCoy i Tansey, 2008). TNFR1 je konstitutivno eksprimiran na svim ćelijama izuzev eritrocita, dok je ekspresija TNFR2 regulisana i ograničena na ćelije imunskog sistema, endotelne ćelije i pojedine populacije neurona. Smatra se da TNF-α većinu svoju funkcija ispoljava vezivanjem za TNFR1 za koji se vezuje solubilna forma TNF-α, dok se za TNFR2 vezuje membranska forma TNF-α (Grell i sar., 1995; Grell i sar., 1998). Ekstraćelijski domeni ovih receptora su podložni proteolitičkoj obradi čime se oslobađaju solubilni fragmenti receptora koji imaju neutrališuće efekte (Wallach i sar., 1991). TNFR2 se proteolitički obrađuje TACE enzimom (Solomon i sar., 1999), dok enzim odgovoran za proteolizu TNFR1 još uvek nije identifikovan. Intraćelijski domen TRAF1 sadrži tzv. domen smrti (engl. death domain, DD). U signalnoj kaskadi koju pokreće aktivacija TNFR1 učestvuju i članovi iz familije faktora asociranih sa TNF receptorom (engl. TNF receptor-associated factor, TRAF). Finalno dolazi do aktivacije NF-κB i produkcije proinflamatornih i antiapoptotskih proteina ili do apoptoze putem aktivacije kaspaza 3 i 8 (Tracey i sar., 2008). Signalizacija preko TNFR2 dovodi do produkcije proinflamatornih medijatora aktivacijom NF-κB (Yang i sar., 2002). Ovaj receptor ne poseduje DD tako da može biti uključen u apoptozu samo indirektno putem kooperacije sa TNFR1 (Tartaglia i sar., 1993) ili na nivou intraćelijskih signalnih puteva amplifikacijom signala poreklom od TNFR1 (Fotin-Mleczek i sar., 2002). Uvod 26 TNF-α je zajedno sa IL-1 ključni citokin u modelima za uspostavljanje hronične inflamacije u mišjem sistemu, poput reumatoidnog artritisa (Williams i sar., 2000). Sve je više dokaza koji idu u prilog tome da hronična inflamacija prethodi razvoju kancera i da, pored anti-tumorskih efekata, TNF-α ima i protumorska svojstva (Szlosarek i sar., 2006). Ovaj citokin, između ostalog, dovodi do apoptoze T limfocita koji se infiltriraju u tumore (Mocellin i sar., 2005) i doprinosi neoplastičnoj transformaciji stimulacijom produkcije reaktivnih kiseoničnih intermedijera i azot oksida (Szlosarek i sar., 2006). Stimulacija DĆ sa TNF-α dovodi do njihovog fenotipskog sazrevanja koje se ogleda u povećanju ekspresije MHC molekula klase II i kostimulatornih molekula. Međutim, ovaj citokin je slab stimulus i DĆ koje se diferenciraju u njegovom prisustvu produkuju niske nivoe proinflamatornih citokina (Lutz i Schuler, 2002; Repnik i sar., 2008). Sa druge strane, TNF-α ispoljava svoju regulatornu ulogu uspostavljajući balans u produkciji proinflamatornih i anti-inflamatornih citokina od strane DĆ u prisustvu liganada TLR. Pokazano je da u mišjem sistemu, TNF-α pojačava produkciju anti-inflamatornog citokina IL-10 od strane DĆ poreklom iz kostne srži (Hirata i sar., 2011) dok u humanom sistemu dovodi do povećanja produkcije IL-12 od strane MoDĆ stimulisanih ligandom za TLR3 (Spisek i sar., 2001). Kako je balans u produkciji proinflamatornih i anti-inflamatornih citokina od ključnog značaja za uspostavljanje homeostaze i sprečavanja razvoja imunopatologija, ispitivanje imunoregulatorne uloge TNF-α je predmet aktuelnih istraživanja pogotovo zbog moguće primene u imunoterapiji. 1.7. Struktura, receptori i biološki efekti IFN-γ Interferoni su otkriveni u eksperimentima sa horioalantoinskom membranom pileta kao faktori prisutni u fluidu nakon dodavanja virusa influence na osnovu svoje sposobnosti da spreče replikaciju virusa (Isaacs i Lindenmann, 1957). Najpre su klasifikovani prema tipu ćelija koji ih sekretuje, dok se prema aktuelnoj klasifikaciji dele na tip I i tip II. IFN tipa I su IFN-α, IFN-β i IFN-ω koji se sekretuju od strane leukocita i fibroblasta nakon virusne infekcije (Adolf, 1995). IFN-γ je INF tipa II koji se po strukturi i receptorima razlikuje od IFN tipa I. Uvod 27 Najpre se smatralo da IFN-γ produkuju isključivo Th1 ćelije, CD8+ T limfociti i NK ćelije (Bach i sar., 1997). Kasnije je pokazano da ga sekretuju i B limfociti, NKT ćelije i APĆ (Gessani i Belardelli, 1998; Yoshimoto i sar., 1998; Carnaud i sar., 1999; Frucht i sar., 2001). Produkcija IFN-γ se nalazi pod kontrolom citokina IL-12 i IL-18 koje sekretuju APĆ (Otani i sar., 1999; Munder i sar., 2001). Negativni regulatori produkcije IFN-γ su IL-4, IL-10 i TGF-β (Schindler i sar., 2001; Hochrein i sar., 2001). IFN-γ je biološki aktivan u formi homodimera (Boehm i sar., 1997). Receptor za IFN-γ (IFNGR) je heterotetramer koji se sastoji od dva IFNGR1 lanca, koji vezuju ligand, i dva IFNGR2 lanca, koji posreduju u prenosu signala. IFNGR1 i IFNGR2 su članovi klase II familije citokinskih receptora (Bazan, 1990; Thoreau i sar., 1991). Oba lanca se konstitutivno eksprimiraju sa tom razlikom što je IFNGR1 lanac prisutan u višku, dok je nivo ekspresije IFNGR2 lanca vrlo nizak. Ekspresija IFNGR2 se nalazi pod striktnom kontrolom i ova subjedinica IFNGR predstavlja ograničavajući faktor u prenosu signala poreklom od IFN-γ (Bach i sar., 1997; Bernabei i sar., 2001). Intraćelijski domen IFNGR1 sadrži sekvencu za koju se vezuje Jak1 (engl. janus tyrosine kinase 1) i STAT-1 koji fosforilišu receptor i neophodni su za dalji prenos signala i ispoljavanje bioloških efekata IFN-γ (Farrar MA, i sar., 1991; Kaplan i sar., 1996; Greenlund i sar., 1994). Intraćelijski domen IFNGR2 sadrži sekvencu za koju se vezuje Jak2 (Kotenko i sar., 1995). IFN-γ je multifunkcionalan citokin čiji su plejotropni efekti rezultat modulacije funkcije velikog broja gena pod uticajem ovog citokina. Nakon vezivanja liganda za IFNGR, Jak1 i Jak2 fosforilišu STAT-1 što dovodi do formiranja STAT-1 homodimera, poznatog i kao faktor aktiviran gamom (engl. gamma activated factor, GAF). GAF se translocira u nukleus gde se vezuje za GAS sekvencu (engl. gamma activated site) i pokreće transkripciju nekoliko transkripcionih faktora (Boehm i sar., 1997). IFN-γ aktivira i fosfatidil-inozitol kinazu 3 (engl. phosphatidylinsositol-3-kinase, PI3K) što dalje dovodi do aktiviranja protein kinaze Cε, protein kinaze aktivirane mitogenom (engl. mitogen activated protein kinase MAPK) i aktivacije STAT-1 (Choudhury, 2004). Članovi familije faktora koje regulišu interferoni (engl. interferon regulation factors, IRF) IRF-1, IRF-2 i IRF-9, su takođe aktivirani sa IFN-γ (Mahboubi i Pober, 2002; Rouyez i sar., 2005). IFN-γ pokreće Uvod 28 brojne MAPK signalne puteve uključene u regulaciju proliferacije, diferencijacije i apoptoze ćelija. Kod makrofaga iz kostne srži IFN-γ aktivira p38 MAPK i pokreće ekspresiju gena uključenih u hemotaksu i inflamaciju uključujući CXCL10, TNF-α i iNOS. IFN-γ moduliše funkcije makrofaga selektivnom aktivacijom ERK (engl. extracellular signal-regulated kinases) i JNK (engl. c-Jun N-terminal kinases) kinaza. Naime, ERK signalni put posreduje u ekspresiji proinflamatornih gena, dok JNK signalni put posreduje u ekspresiji gena uključenih u prezentaciju antigena (Valledor i sar., 2008). Negativni regulatori Jak/STAT signalnog puta pokrenutog vezivanjem IFN-γ za svoj receptor su SOCS (engl. suppressor of cytokine signaling) proteini koji inhibiraju aktivnost Jak (Hilton i sar., 1998; Krebs i Hilton, 2001), kao i fosfataza SHP2 (engl. SH2 domain-containing tyrosine phosphatase) (David i sar., 1995). IFN-γ je uključen u pokretanje odgovora na virusnu infekciju povećanjem ekspresije brojnih molekula koji su uključeni u obradu i prezentaciju antigena, adhezivnih molekula i hemokina (Schroder i sar., 2004). Takođe, IFN-γ reguliše i inflamatorne procese, produkciju reaktivnih kiseoničnih intermedijera i azot oksida (Brewington i sar., 2001; Malu i sar., 2003; Prasanna i sar., 2007). NK ćelije produkuju IFN-γ u cilju uspostavljanja kontrole nad bakterijskim i virusnim infekcijama (Biron i sar., 1999). Za razvoj optimalnog anti-tumorskog imunskog odgovora neophodna je kooperacija u produkciji IFN-γ od strane NK ćelija, makrofaga i CD4 + T ćelija (Li i sar., 2007). Pored navedenog, IFN-γ ima značajnu ulogu i u humoralnom imunskom odgovoru i razvoju autoimunosti (Saha i sar., 2010). 1.8. Značaj CD40:CD40L interakcije u ćelijskom imunskom odgovoru CD40 molekul je transmembranski protein tipa I koji pripada superfamiliji TNF receptora (Stamenkovic i sar., 1989). CD40 je najpre opisan kao molekul ispoljen na B limfocitima čija aktivacija dovodi do proliferacije ovih ćelija (Ledbetter i sar., 1987). Istraživanja koja su usledila su pokazala da je CD40 molekul prisutan i na drugim ćelijama uključujući monocite, DĆ, endotelne ćelije i epitelne ćelije (Clark, 1990) (Hart i McKenzie, 1988; Romani i sar., 1989). Ligand za CD40 molekul (poznat kao CD40L, CD154, gp39, T-BAM ili TRAP) je integralni membranski Uvod 29 protein tipa II ispoljen na aktiviranim CD4+ i CD8+ T limfocitima, aktiviranim B limfocitima, trombocitima, glatkim mišićnim ćelijama i drugim tipovima ćelija (Banchereau i sar., 1994; Grewal i Flavell, 1996; Mach, i sar., 1997; Henn i sar., 1998). CD40L postoji i u solubilnoj formi i ima iste biološke funkcije kao i membranska forma (Ludewig i sar., 1996). Nizak nivo CD40 je konstitutivno eksprimiran na nezrelim DĆ (Banchereau i sar., 1994), a nakon aktivacije ovih ćelija njegova ekspresija se povećava (Kawai i Akira, 2007). CD40L se ispoljava na T limfocitima nakon aktiviranja T ćelijskog receptora i koreceptora (CD80 i CD86) (Cella i sar., 1996; Koch i sar., 1996). Interakcija CD40:CD40L je bidirekciona pa sa jedne stane ima važnu ulogu u kompletiranju procesa sazrevanja DĆ, dok je sa druge strane neophodna za diferencijaciju i sticanje efektorskih funkcija T ćelija. Naime, aktivacija CD40 molekula na DĆ dovodi do povećanja ekspresije kostimulatornih i adhezivnih molekula i produkcije IL-12 (VanKooten i Banchereau, 2000; Walzer i sar., 2005). Krajnji ishod ove interakcije je pospešivanje antigen-prezentujućih svojstava DĆ, polarizacija T ćelijskog odgovora ka Th1 tipu i aktivacija CTL (Bennett i sar., 1998). 1.9. Terapeutski potencijal dendritskih ćelija Usavršavanjem postupaka za izolaciju DĆ i njihovog stvaranja u in vitro uslovima od prekursora otvorene su brojne mogućnosti za primenu ovih ćelija. DĆ danas predstavljaju jedno od najznačajnijih savremenih oruđa u imunoterapiji tumora i infektivnih bolesti (van Duivenvoorde i sar., 2006; Gilboa, 2007). Pored uloge u odbrani od patogena, DĆ imaju značajnu ulogu i u razvoju anti-tumorskog imunskog odgovora. U tome su najefikasnije DĆ koje produkuju visok nivo IL-12 (Zheng i sar., 2008). Naime, IL-12 je neophodan u imunoterapiji tumora kao treći signal (Valenzuela i sar., 2002), pored prvog signala (antigen) i drugog signala (kostimulatorni molekuli) za usmeravanje imunskog odgovora ka Th1 tipu i aktivaciju tumor specifičnih citotoksičnih T limfocita (Xu i sar., 2003). Pored jasno dokazanog povoljnog efekta Th1 odgovora u odbacivanju tumora, značajnu ulogu ima i Th17 imunski odgovor. Terapeutski potencijal Th17 odgovora Uvod 30 je predmet aktuelnih istraživanja (Muranski i sar., 2008; Martin-Orozco i sar., 2009). Sa obzirom da je kod obolelih od tumora imunski odgovor suprimiran istraživanja iz oblasti imunoterapije tumora su usmerena ka rekonstituciji anti-tumorskog odgovora. Naime, tumori brojnim mehanizmima izbegavaju efektorske funkcije imunskog sistema i usmeravaju razvoj DĆ u pravcu tolerogenih ćelija koje nemaju sposobnost aktivacije CD8 + T limfocita (Gilboa, 2007). Dosadašnja istraživanja su pokazala da zrele DĆ efikasno stimulišu anti-tumorski odgovor i zbog toga je značajan cilj imunoterapije tumora poboljšanje protokola za stimulaciju DĆ radi obrazovanja dovoljnog broja imunogenih DĆ. Smatra se da se „zlatni standard“ za pripremu DĆ u cilju imunoterapije kancera sastoji od koktela proinflamatornih citokina TNF-α, IL-1β, IL-6 i PGE2 (Jonuleit i sar., 1997). Međutim, DĆ stimulisane ovim koktelom slabo produkuju IL-12 i samim tim nisu efikasne u pokretanju efikasnog Th1 imunskog odgovora (Pedersen i sar., 2006). Agonisti PRR, pogotovo TLR, imaju veliku primenu u modulaciji funkcija DĆ u eksperimentalnim i kliničkim studijama iz oblasti imunoterapije tumora (Cella i sar., 1999; Verdijk i sar., 1999; Rouas i sar., 2004; Gilboa, 2007). Uprkos brojnim studijama, biološki potencijal DĆ za in vivo stimulaciju anti-tumorskog imunskog odgovora još uvek nije maksimalno iskorišćen. U fokusu aktuelnih istraživanja je priprema zrelih DĆ kombinovanom primenom različitih agonista PRR i citokina koja se zasniva na sposobnosti DĆ da integrišu signale sa različitih receptora u jedinstven odgovor. Sa druge strane, uprkos efikasnoj supresiji replikacije HIV-1 i rekonstituciji CD4 + T ćelijske populacije, kombinovana antiretroviralna terapija ne nudi mogućnost eradikacije HIV-1 i razvoja HIV-1 specifičnog ćelijskog imunskog odgovora (Plana i sar., 1998; Ogg, i sar., 1998; Carcelain i sar., 2001; Blankson i sar., 2002). Za kontrolu replikacije HIV-1 virusa neophodna je aktivacija specifičnih citotoksičnih limfocita uz pomoć CD4 + T limfocita (Ostrowski i sar., 2000; Letvin i Walker, 2003; Day i Walker, 2003). HIV-1 specifični CD4+ i CD8+ T limfociti produkuju IFN-γ, ali ne dolazi do replikacije CD4+ T ćelija i citolitička aktivnost CD8 + T limfocita je narušena (Pitcher i sar., 1999; Garcia i sar., 1999; Seder i Ahmed, 2003; Yokomaku i sar., 2004). Disfunkciji ćelijskog odgovora kod inficiranih sa HIV- Uvod 31 1 doprinose i imunosupresivni efekti DĆ tako da tolerogene DĆ ne samo da služe kao „rezervoar“ HIV-1 virusa već i indukuju tolerancu na HIV-1 (Chehimi i sar., 2002; Steinman i Nussenzweig, 2002; Kawamura i sar., 2003). Kao mogući terapeutski pristup koji bi imao za cilj prevazilaženje navedenih problema predložena je primena ex vivo pripremljenih DĆ. Ispitivanja na animalnim modelima su pokazala da DĆ pretretirane sa lizatom HIV-1, glikoproteinima omotača, inaktivisanim virusom ili nanočesticama imaju potencijal da pokrenu snažan imunski odgovor usmeren protiv HIV-1 (Lapenta i sar., 2003; Yoshida i sar., 2003; Aline i sar., 2007). U do sada publikovanim rezultatima kliničkih studija pokazano je da imunoterapija HIV-1 sa DĆ do izvesnog stepena dovodi do razvoja HIV-1 specifičnog imunskog odgovora, ali su rezultati istraživanja veoma varijabilni zbog različitog i nest iardizovanog dizajna studija (Garcia i sar., 2011). Funkcionalna plastičnost DĆ nudi brojne mogućnosti za primenu ovih ćelija u različite terapeutske svrhe. DĆ mogu imati primenu i u transplantacionoj imunologiji i kod autoimunskih bolesti. Terapijski pristup kod ovih stanja se zasniva na primeni lekova koji nespecifično blokiraju imunski sistem što pacijente čini podložnim infekcijama (Penn, 2000a; Penn, 2000b). Za razliku od imunoterapije kancera, u transplantaciji i kod autoimunskih bolesti cilj je indukcija antigen- specifične supresije imunskog odgovora čime bi se izbegli neželjeni efekti generalne nespecifične supresije. DĆ imunosupresivnih karakteristika se mogu dobiti in vitro primenom biološkog, farmakološkog i genetskog pristupa (Ehser i sar., 2008). 32 2. HIPOTEZA I CILJEVI ISTRAŽIVANJA Hipoteza i ciljevi istraživanja 33 Zahvaljujući specijalizaciji za prepoznavanje specifičnih struktura patogena od strane PRR, pogotovo TLR, DĆ vrše diskriminaciju vrste patogena koja ugrožava homeostazu organizma i u skladu sa primljenim informacijama aktiviraju i usmeravaju imunski odgovor. Tokom infekcije različite komponente patogena istovremeno aktiviraju veći broj PRR, a interakcija između signalnih puteva pokrenutih nakon aktivacije ovih receptora ima ključni uticaj na krajni ishod imunskog odgovora. Dakle, iako aktivacija pojedinačnog receptora dovodi do fenotipskih i funkcionalnih promena DĆ, za pokretanje efikasnog imunskog odgovora neophodna je kooperacija između više receptora (Roelofs i sar., 2005; Trinchieri i Sher, 2007; Bagchi i sar., 2007; Ouyang i sar., 2007). Za modulaciju funkcija DĆ, pored stimulacije PRR, značajnu ulogu imaju i citokini prirodnog imuniteta koji se produkuju tokom infekcije, kao i signali stečenog imuniteta koje DĆ dobijaju tokom njihove interakcije sa T limfocitima. Sposobnost DĆ da primaju signale sa različitih receptora koje integrišu u jedinstveni odgovor se sve više koristi za generisanje zrelih DĆ kombinovanom primenom različitih agonista PRR i citokina. Na osnovu rezultata dosadašnjih istraživanja, postavljena je radna hipoteza: kombinovana primena TLR3 agonista sa TLR7 agonistom, agonistom dektin-1 receptora, citokinom urođenog imuniteta i signalima stečenog imuniteta poboljšava fenotipske i funkcionalne karakteristike humanih MoDĆ in vitro u odnosu na tretman pojedinačnim stimulatorima. U cilju provere radne hipoteze postavljeni su sledeći ciljevi istraživanja: • Ispitati fenotipske i funkcionalne karakteristike humanih MoDĆ stimulisanih TLR3 agonistom, Poly (I:C); • Ispitati efekat kombinovane primene selektivnih TLR3 i TLR7 agonista (Poly (I:C) i loksoribina) na fenotipske i funkcionalne karakteristike humanih MoDĆ; • Ispitati modulatorni efekat ko-aktivacije dektin-1 receptora i TLR3 na fenotipske i funkcionalne karakteristike humanih MoDĆ; Hipoteza i ciljevi istraživanja 34 • Ispitati dozno- i vremensku- zavisnost modulatornog efekta kombinovane primene Poly (I:C) i citokina prirodnog imuniteta, TNF- α, na fenotipska i funkcionalna svojstva humanih MoDĆ; • Ispitati uticaj signala stečenog imuniteta koje DĆ dobijaju tokom njihove interakcije sa T ćelijama, uključujući signalizaciju preko CD40 molekula i receptora za IFN-γ na funkcionalne karakteristike humanih MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C). 35 3. MATERIJALI I METODE Materijali i metode 36 3.1. Medijumi, hemikalije, supstance 3.1.1. Medijumi 3.1.1.1. RPMI 1640 Kao osnovni medijum za izolaciju i kultivisanje ćelija korišćen je RPMI 1640 medijum (ICN Flow, SAD) kome je dodato 1% L-glutamina (ICN Flow, SAD), 1% gentamicina (ICN-Galenika, Beograd) i 7.5% NaHCO3 (Apoteka VMA, Beograd) kao pufer. Za izolaciju mononuklearnih ćelija periferne krvi (MNĆ) korišćen je osnovni medijum kome je dodato 0.02% NaEDTA (Apoteka VMA, Beograd). Za ispiranje MNĆ korišćen je osnovni medijum kome je dodato 2% fetalnog telećeg seruma (Fetal calf serum, FCS, ICN Flow, SAD). Za kultivaciju ćelija korišćen je kompletni medijum koji predstavlja osnovni medijum u koji je dodato 10% fetalnog telećeg seruma, 50μM 2-merkaptoetanola (2- ME), 50 i.j/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina. (0.1% penicilina i streptomicina) 3.1.1.2. PBS (Phosphate Buffered Saline) Fiziološki rastvor puferovan fosfatnim puferom (Phosphate Buffered Saline, PBS) pravljen je u dejonizovanoj vodi po sledećoj recepturi: 14 ml 0.2M NaH2PO4 (Serva, Nemačka) 36 ml 0.2M Ha2HPO4 (Serva, Nemačka) 50 ml 16% NaCl (Zorka, Šabac) 900 ml destilovane vode Modifikovani puferi za pripremu ćelija za fenotipsku analizu metodom protočne citofluorimetrije su pravljeni dodavanjem natrijum-azida (NaN3) i fetalnog telećeg seruma u PBS i to: Materijali i metode 37 PBS1: PBS + 0.01% NaN3 (Apoteka VMA, Beograd) PBS2: PBS + 0.01% NaN3 + 2% FCS 3.1.1.3. Pufer za magnetno sortiranje Pufer za magnetno sortiranje se priprema dodavanjem 2 mM EDTA i 0.5% goveđeg serum-albumina ( Sigma-Aldrich, Nemačka) u PBS. 3.1.1.4. K-PBS K-PBS je korišćen za pripremu pufera za ispiranje ploča u ELISA testovima, a sastojao se od 137 mM NaCl (Zorka, Šabac), 2.7 mM KCl (Serva, Nemačka), 8.1 mM Na2HPO4 (Serva, Nemačka) i 1.5 mM KH2PO4 (Serva, Nemačka) sa podešenim pH na 7.2 - 7.4. 3.1.2. Citokini 3.1.2.1. Rekombinantni humani GM-CSF (rhGM-CSF ) Rekombinantni humani GM-CSF (Leucomax, specifične aktivnosti 4.44x106 IU) je nabavljen od Sandoz-Schering Plough, Švajcarska. Rastvoren je pod sterilnim uslovima u destilovanoj vodi i RPMI 1640 medijumu do koncentracije od 100 μg/ml i tako čuvan do upotrebe na -80°C. U eksperimentu je rhGM-CSF korišćen u finalnoj koncentraciji od 100 ng/ml. 3.1.2.2. Rekombinantni humani IL-4 (rhIL-4) Rekombinantni humani IL-4 nabavljen je od Roche Diagnostics GmbH, Nemačka. Rastvoren je pod sterilnim uslovima u PBS-u obogaćenom sa 0.1% goveđim serum-albuminom do koncentracije od 25 μg/ml i tako čuvan do upotrebe na -80°C. U eksperimentu je rhIL-4 korišćen u finalnoj koncentraciji od 20 ng/ml. 3.1.2.3. Rekombinantni humani (rhTNF-α) Rekombinantni humani TNF-α nabavljen je od Roche Diagnostics GmbH, Nemačka. Rastvoren je pod sterilnim uslovima u PBS-u obogaćenom sa 0.1% Materijali i metode 38 goveđim serum-albuminom do koncentracije od 100 μg/ml i tako čuvan do upotrebe na -80°C. rhTNF-α je u eksperimentu korišćen u finalnoj koncentraciji od 10 ng/ml. 3.1.2.4. Rekombinantni humani (rhIFN-γ) Rekombinantni humani IFN-γ nabavljen je od Roche Diagnostics GmbH, Nemačka. Rastvoren je pod sterilnim uslovima u PBS-u obogaćenom sa 0.1% goveđim serum-albuminom do koncentracije od 100 μg/ml i tako čuvan do upotrebe na -80°C. rhIFN-γ je u eksperimentu korišćen u finalnoj koncentraciji od 5 ng/ml. 3.1.3. Imunomodulatorne i druge supstance 3.1.3.1. Poliinosinsko-policitidilinska kiselina (Poly (I:C)) Poly (I:C) ( Sigma-Aldrich-Aldrich, Nemačka) rastvoren je u RPMI 1640 medijumu do koncentracije od 10 mg/ml i čuvan do upotrebe na -20°C. Poly (I:C) je u eksperimentu korišćen u koncentraciji od 5 μg/ml, 25 μg/ml i 50 μg/ml. 3.1.3.2. Loksoribin (Loxoribine) Loksoribin (InvivoGen, SAD) rastvoren je u RPMI 1640 medijumu do koncentracije od 2 mg/ml i čuvan do upotrebe na -20°C. Loksoribin je u eksperimentu korišćen u koncentracijama od 100 μg/ml i 250 μg/ml. 3.1.3.3. Kurdlan (Curdlan) Kurdlan ( Sigma-Aldrich-Aldrich, Nemačka) je rastvoren do koncentracije od 30 mg/ml, najpre u destilovanoj vodi i potom je dodat 3N NaOH, i čuvan do upotrebe na +4°C. Kurdlan je u eksperimentu korišćen u koncentracijama od 10 μg/ml i 1000 μg/ml. Materijali i metode 39 3.1.3.4. Rekombinantni humani ligand za CD40 molekul (CD40 ligand, CD40L) Rekombinantni humani CD40L nabavljen je od InvivoGen, SAD. Rastvoren je pod sterilnim uslovima u PBS-u obogaćenom sa 0.1% goveđim serum-albuminom do koncentracije od 100 μg/ml i tako čuvan do upotrebe na -80°C. rhIFN-γ je u eksperimentu korišćen u finalnoj koncentraciji od 10 μg/ml. 3.1.3.5. 2-merkaptoetanol (2-ME) 2-merkaptoetanol (Fluka, Nemačka) je rastvoren u medijumu za kultivaciju do koncentracije od 50 mM i čuvan do upotrebe na +4°C, zaštićen od svetlosti. U eksperiementu je 2-ME korišćen u koncentraciji od 50 μM. 3.1.3.6. Radioaktivno obeležen timidin Timidin obeležen tricijumom ([3H]-timidin; Amersham International, Velika Britanija), specifične aktivnosti 5μCi/mM, u eksperimentu je korišćen u koncentraciji od 1 μCi po bazenu ploče od 96 mesta (Sarstedt, Nemačka). 3.1.3.7. Limfoprep gradijent za izdvajanje humanih mononuklearnih ćelija (Lymphoprep) Limfoprep (PAA Laboratories GmbH, Austrija) je gradijent gustine 1.077 g/ml i korišćen je za izolovanje mononuklearnih ćelija iz humane periferne krvi. 3.1.3.8. Monenzin (monensin sodium) Monenzin (Sigma-Aldrich-Aldrich, Nemačka) je rastvoren u dimetilsulfoksidu do koncentracije od 6mM i čuvan do upotrebe na -20°C. U eksperimentu je korišćen u koncentraciji od 3µM. Materijali i metode 40 3.2. Izolacija i kultivacija humanih mononukelarnih ćelija iz periferne krvi 3.2.1. Izolacija humanih mononuklearnih ćelija iz periferne krvi Mononuklearne ćelije su izolovane iz „buffy coat“-a (sloj leukocita dobijen centrifugiranjem pune krvi u postupku pripremanja krvnih derivata-plazme, eritrocita, trombocita) koji je dobijen iz Instituta za transfuziologiju Vojnomedicinske akademije uz pismenu saglasnost davalaca. „Buffy coat“ je prvo razblažen u medijumu za izolaciju MNĆ u odnosu 1:4. Razblažena ćelijska suspenzija je u zapremini od 7 ml pipetom pažljivo nanošena na 3 ml Limfoprep gradijenta. U tako dobijenoj dvofaznoj suspenziji se posle centrifugiranja na 800xg obrtaja tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi izdvojio prsten MNĆ u interfazi. Gornji sloj razblažene plazme je uklonjen, a MNĆ su pažljivo sakupljane i potom resuspendovane u medijumu sa 0.02% NaEDTA i ispirane od gradijenta centrifugiranjem na 2500 obrtaja tokom 15 min na sobnoj temperaturi. U cilju uklanjanja trombocita MNĆ su resuspendovane u medijumu za ispiranje i centrifugirane na malim brzinama (1000 obrtaja tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi). Talog je resuspendovan u medijumu za kultivaciju. Ovako dobijene ćelije su korišćene za dalju izolaciju monocita i CD4+ T limfocita. 3.2.2. Izolacija monocita periferne krvi Monociti su izolovani iz MNĆ adherencijom za plastiku flaskova za ćelijske kulture (Flow, Škotska). U svaki flask je na adherencu zasejano po 30-40x106 ćelija u 5 ml medijuma. Nakon inkubacije u trajanju od 1,5 sata na 37°C u atmosferi zasićenoj vodenom parom sa 5% CO2 flaskovi su ispirani toplim medijumom u cilju uklanjanja neadherentnih ćelija. Adherentni monociti su dalje kultivisani prema potrebama eksperimenta. Materijali i metode 41 3.2.3. Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija monocitnog porekla (MoDĆ) Monociti dobijeni adherencom MNĆ za plastiku su kultivisani narednih 5-7 dana na 37°C u atmosferi zasićenoj vodenom parom sa 5% CO2 u medijumu za kultivaciju ćelija kome su dodati GM-CSF u koncentraciji od 100 ng/ml i IL-4 u koncentraciji od 20 ng/ml. Nakon 5-7 dana kultivacije sakupljene su neadherentne ćelije, koje su predstavljale nezrele MoDĆ, i koje su kao takve korišćene u daljim testovima. Sazrevanje nezrelih MoDĆ je izazvano stimulisanjem ovih ćelija agonistima receptora koji su dodavani u ćelijske kulture i to Poly (I:C) (5 μg/ml, 25 μg/ml i 50 μg/ml), loksoribin (100 μg/ml i 250 μg/ml) i kurdlan (10 μg/ml i 100 μg/ml). Efekti citokina TNF-α (10 ng/ml) i IFN-γ (5 ng/ml), kao i liganda za CD40 (10 μg/ml), na ćelije u kulturama ispitivani su njihovim dodavanjem ponaosob istovremeno sa agonistima receptora ili posle 24h kultivacije ćelija. Ćelije su nakon stimulacije u trajanju od 24h ili 48h isprane dva puta u čistom medijumu, u cilju oslobađanja od egzogenih i endogenih citokina, i kao takve korišćene u daljim testovima. Supernatanti iz svih bazena u kojima su ćelije bile kultivisane su pokupljeni i zamrznuti na -20°C radi kasnijeg određivanja nivoa produkovanih citokina. 3.2.4. Izolacija alogenih CD4+ T limfocita tehnikom magnetnog sortiranja Za postavljanje kulture mešane leukocitne reakcije (engl. mixed leukocyte reaction, MLR), kao i za utvrđivanje Th citokinskog profila, korišćene su CD4+ ćelije koje su dobijene kao negativna frakcija iz MNĆ primenom tehnike magnetnog sortiranja. Naime, od alogenih MNĆ, dobijenih prethodno opisanim postupkom, je odvojeno 1x108 ćelija i izvedena je procedura imunomagnetnog sortiranja CD4+ T limfocita, korišćenjem CD4 + kita za izolaciju, a prema protokolu proizvođača (CD4+ T Cell Isolation Kit II, MACS, Myltenyi Biotec, Nemačka). Ukratko, ćelije su inkubirane 15 minuta na hladnom u puferu za magnetno sortiranje sa koktelom antitela konjugovanih sa biotinom, u razblaženju 1:5. Koktel je sadržao antitela na sledeće antigene: CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR γ/δ i CD235a. Materijali i metode 42 Nakon inkubacije, ćelije su dva puta isprane u puferu za sortiranje ćelija i inkubirane 15 minuta na hladnom sa anti-biotin magnetnim partikulama u finalnom razblaženju 1:5. Magnetnim partikulama obeležena ćelijska suspenzija je nakon inkubacije isprana dva puta u puferu za sortiranje, resuspendovana u 500 μl istog pufera i potom naneta na separacionu kolonu (LS Columns, MACS, Myltenyi Biotec, Nemačka) postavljenu u magnetnom polju (Midi MACS Magnet, Myltenyi Biotec, Nemačka). Nakon jednog ciklusa magnetne deplecije na koloni su se izdvojile imunomagnetno obeležene ćelije, dok su u eluatu sakupljene prečišćene CD4 + T ćelije. Čistoća izolovanih CD4+ ćelija je bila preko 95%, što je potvrđeno protočnom citofluorimetrijom korišćenjem anti-CD4-FITC i anti-CD3-PE antitela. 3.2.5. Izolacija alogenih naivnih (CD45RA+) i memorijskih (CD45RO+) T limfocita imunomagnetnim sortiranjem ukupnih CD4+ T limfocita Naivni i memorijski CD4 + T limfociti su, kao pozitivna i negativna frakcija, izolovani iz prethodno sortiranih CD4 + T limfocita prema ekspresiji CD45RA molekula korišćenjem magnetnih partikula konjugovanih sa mišjim anti-humanim CD45RA monoklonskim antitelom (CD45RA MicroBeads, MACS, Myltenyi Biotec, Nemačka). Usledila je inkubacija CD4+ T ćelija magnetnim partikulama, u trajanju od 15 minuta, na hladnom. Posle toga suspenzija ćelija je isprana dva puta u puferu za sortiranje i resuspendovana u 500 μl istog pufera i naneta na separacionu kolonu (LS Columns, MACS, Myltenyi Biotec, Nemačka) postavljenu u magnetnom polju (Midi MACS Magnet, Myltenyi Biotec, Nemačka). Nakon jednog ciklusa magnetne deplecije na koloni su se izdvojile CD45RA imunomagnetno obeležene ćelije, dok su u eluatu kao negativna frakcija dobijene CD45RO ćelije. Čistoća izolovanih celija je bila preko 90%, što je potvrđeno protočnom citofluorimetrijom korišćenjem anti- CD4-FITC, anti-CD3-PE, anti-CD45RA-PE (Serotec, V. Britanija) i anti-CD45RO-PE antitela (Immunotools, Nemačka). Materijali i metode 43 3.3. Fenotipske karakteristike MoDĆ 3.3.1. Monoklonska antitela Diferencijacija i sazrevanje MoDĆ praćena je fenotipskom analizom diferencijalno eksprimiranih markera na površini ćelija. U tu svrhu korišćenja su monoklonska antitela u određenim razblaženjima, kao što je navedeno: Monoklonsko antitelo Razblaženje Proizvođač Mišije anti-humano CD40 (FITC) 1:5 BD Biosciences, SAD Mišije anti-humano HLA-DR (PE) 1:10 Serotec, V. Britanija Mišije anti-humano CD54 (PE) 1:10 Serotec, V. Britanija Mišije anti-humano CD83 (FITC) 1:5 BD Biosciences, SAD Mišije anti-humano CD86 (PE) 1:10 Serotec, V. Britanija Mišije anti-humano CCR7 (FITC) 1:10 R&D Systems, SAD Mišije anti-humano CD80 (PE) 1:10 Serotec, V. Britanija 3.3.2. Protočna citofluorimetrija Nezrele MoDĆ kao i MoDĆ stimulisane sa Poly (I:C), loksoribinom, kurdlanom, CD40L, TNF-α i IFN-γ, su isprane u hladnom PBS1 na 1800 rpm tokom 8 minuta na +4°C. Nakon ispiranja, ćelije su resuspendovane u PBS1 do koncentracije od 1x105 ćelija u 50μl po epruveti za protočnu citofluorimetriju. U suspenziju celija su dodavna monoklonska antitela u prethodno prikazanim finalnim razblaženjima. Ćelije su potom inkubirane 30 minuta na +4°C. I potom isprane centrifugiranjem na 1800 rpm, na hladnom, tokom 8 minuta i fiksirane u 4% formalinu. Kontrola se sastojala od uzoraka sa adekvatnim irelevantnim mišijim monoklonskim antitelima Materijali i metode 44 specifičim za pacovske antigena konjugovanim sa odgovarajućom fluorescentnom bojom. Fenotip obeleženih ćelija je analiziran na EPICS XL-MCS protočnom citofluorimetru (Coulter, Krefeld, Nemačka) korišćenjem programa SZSTEMTM II software. U ovom aparatu kao izvor svetlosti korišćen je argonski laser sa emisijom ekscitirajuće svetlosti u opsegu talasne dužine 450-530nm. Rezultati su predstavljeni kao numeričke vrednosti procenta pozitivnih ćelija i srednje vrednosti intenziteta fluorescence (engl. mean fluorescence intensity, mfi). Procenat pozitivnih ćelija je određivan postavljenjem graničnika na histogramu fluorescencije na osnovu kontrole. Srednji intenzitet fluerescencije predstavlja aritmetičku sredinu intenziteta fluerscencije pojedinačnih događaja (ćelija) izraženu u relativnim brojevima kanala fluorescencije (0-1024). Analizirano je najmanje 5000 ćelija po uzorku. 3.4. Funkcionalne karakteristike MoDĆ Alostimulatorni potencijal MoDĆ i sposobnost usmeravanja T ćelijskog odgovora ka Th1, Th2, Th17 ili Treg odgovoru su ispitivani korišćenjem sledećih testova: Test alogene mešane leukocitne reakcije – MLR ELISA test za utvrđivanje produkovanih citokina u kulturama MoDĆ ELISA test za utvrđivanje produkovanih citokina u od strane T limfocita kokulturama – Th profil 3.4.1. Alostimulatorni potencijal MoDĆ Alostimulatorni potencijal MoDĆ je ispitivan MLR testom u kome su nezrele i stimulisane MoDĆ korišćene kao stimulatori, dok su kao responderi korišćeni CD4+ T limfociti od alogenog davaoca. U ploču od 96 mesta sa „U“- dnom (Sarstedt, Nemačka) su dodati stimulatori kao triplikati dvostruko opadajućih razblaženja (od Materijali i metode 45 1x104 do 0.125x104 MoDĆ po bazenu) i konstantan broj (1x105) CD4+ T ćelija u ukupnoj zapremini od 200μl po bazenu. Ćelije su kultivisane 6 dana u kompletnom medijumu u termostatu na 37°C i 5% CO2. Osamnaest sati pre isteka kultivacije dodat je radioaktivno obeleženi timidin [3H] u koncentraciji 1 μCi po bazenčiću. Nakon isteka kulture ćelije su pokupljene automatskim skidačem kulture (Titertec Cell Harvester, ICN Flow, SAD). Ugradanja [3H] timidina izmerena je scintilacionim β-brojačem (LKB-1219 Rackbeta, Finska) i izražena je kao broj otkucaja u minuti (engl. counts per minute, cpm). 3.4.2. Određivanje produkovanih citokina od strane kultivisanih MoDĆ U supernatantima kultura nezrelih i stimulisanih MoDĆ određena je koncentracija citokina IL-12p70, IL-23, IL-27, IL-10, IL-6 i TNF-α korišćenjem komercijalnih ELISA testova. 3.4.2.1. IL-12p70 Koncentracija IL-12p70 u supernatantima kultura MoDĆ određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (R&D Systems, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma- Aldrich, Nemačka) su bile obložene mišijim monoklonskim antitelima specifičnim za humani IL-12p70, dok je za sekundarno poliklonsko kozje anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL-12p70. Procedura testa je sledeća: U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na sobnoj temperaturi. Po isteku inkubacije ploča je isprana 3 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 300 μl rastvora koji sadrži K-PBS i goveđi serum albumin (reagent diluent). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 3 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija Materijali i metode 46 (2000 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 2 sata. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle inkubacije u trajanju od 20 minuta na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 20 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije. Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.2.2. IL-27 Koncentracija IL-27 u supernatantima kultura MoDĆ određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (R&D Systems, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma- Aldrich, Nemačka) su bile obložene mišijim monoklonskim antitelima specifičnim za humani IL-27, dok je za sekundarno poliklonsko kozje anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL-27. Procedura testa je sledeća: U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na sobnoj temperaturi. Po isteku inkubacije ploča je isprana 3 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 300 μl rastvora koji sadrži K-PBS i goveđi serum albumin (reagent diluent). Posle inkubacije u trajanju od 1 h ploča je isprana 3 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (10000 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i Materijali i metode 47 ploča je inkubirana 2 sata. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle inkubacije u trajanju od 20 minuta na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 20 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije. Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.2.3. IL-23 Koncentracija IL-23 u supernatantima kultura MoDĆ određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (eBioscience, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma- Aldrich, Nemačka) su bile obložene antitelima specifičnim za humani IL-23, dok je sekundarno anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Enzim peroksidaza rena je bio konjugovan streptavidinom, što je omogućilo specifično prepoznavanje i vezivanje za biotinom obeleženo sekundarno antitelo. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL-23. Senzitivnost metode je 15 pg/ml. Procedura testa je sledeća: U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na +4 οC. Po isteku inkubacije ploča je isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 200 μl rastvora koji sadrži PBS i goveđi serum (assay buffer). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 5 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (2000 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle tridesetominutne Materijali i metode 48 inkubacije na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 15 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (stop solution, 2N H2SO4). Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.2.4. IL-10 Koncentracija IL-10 u supernatantima kultura MoDĆ određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (eBioscience, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma- Aldrich, Nemačka) su bile obložene antitelima specifičnim za humani IL-10, dok je sekundarno anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Enzim peroksidaza rena je bio konjugovan sa streptavidinom, što je omogućilo specifično prepoznavanje i vezivanje za biotinom obeleženo sekundarno antitelo. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL-10. Senzitivnost metode je 2 pg/ml. Procedura testa je sledeća: U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na +4 οC. Po isteku inkubacije ploča je isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 200 μl rastvora koji sadrži PBS i goveđi serum (assay buffer). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 5 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (300 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle tridesetominutne inkubacije na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato Materijali i metode 49 po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 15 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (stop solution, 2N H2SO4). Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.2.5. IL-6 Koncentracija IL-6 u supernatantima kultura MoDĆ određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (eBioscience, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma- Aldrich, Nemačka) su bile obložene antitelima specifičnim za humani IL-6, dok je sekundarno anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Enzim peroksidaza rena je bio konjugovan sa streptavidinom, što je omogućilo specifično prepoznavanje i vezivanje za biotinom obeleženo sekundarno antitelo. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL-6. Senzitivnost metode je 2 pg/ml. Procedura testa je sledeća: U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na +4 οC. Po isteku inkubacije ploča je isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 200 μl rastvora koji sadrži PBS i goveđi serum (assay buffer). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 5 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (200 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle tridesetominutne inkubacije na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 15 min u mraku. Materijali i metode 50 Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (stop solution, 2N H2SO4). Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.2.6. TNF-α Koncentracija TNF-α u supernatantima kultura MoDĆ određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (eBioscience, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma- Aldrich, Nemačka) su bile obložene antitelima specifičnim za humani TNF-α, dok je sekundarno anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Enzim peroksidaza rena je bio konjugovan streptavidinom, što je omogućilo specifično prepoznavanje i vezivanje za biotinom obeleženo sekundarno antitelo. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani TNF-α. Senzitivnost metode je 4 pg/ml. Procedura testa je sledeća: U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na +4 οC. Po isteku inkubacije ploča je isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 200 μl rastvora koji sadrži PBS i goveđi serum (assay buffer). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 5 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (500 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle tridesetominutne inkubacije na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 15 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (stop solution, 2N H2SO4). Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm Materijali i metode 51 talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.3. Određivanje citokina produkovanih od strane T limfocita u kokulturi sa MoDĆ U supernatantima kultura CD4 + T limfocita i MoDĆ određena je koncentracija citokina IFN-γ, IL-17, IL-5, IL-2 i IL-10 primenom komercijalnih ELISA testova i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica i protočne citofluorimetrije (Th1/Th2 11plex Kit, Bender MedSystems, Vienna, Austrija), prema uputstvu proizvođača. U bazene ploče sa 96 mesta sa „U“-dnom (Sarstedt, Nemačka) dodato je po 1x104 nezrelih i stimulisanih MoDĆ. U iste bazene dodati su i sortirani CD4+ T limfociti, kao i naivne i memorijske podvrste CD4+ T limfocita, i to 1x105 po bazenu i to u zapremini od 200 μl medijuma za kultivaciju ćelija po bazenu. Nakon petodnevne inkubacije u svaki bazen su dodati forbol-12-miristat-13-acetat (engl. phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA, Sigma-Aldrich, Nemačka) u koncentraciji od 20 ng/ml i jonomicin ( Sigma-Aldrich, Nemačka) u koncentraciji od 500 ng/ml. Ćelije su inkubirane još 24h, a zatim su u supernatantima svakog bazena određivane koncentracije citokina. 3.4.3.1. IL-17 Koncentracija IL-17 u supernatantima kokultura MoDĆ i CD4+ T limfocita određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (eBioscience, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma-Aldrich, Nemačka) su bile obložene antitelima specifičnim za humani IL-17, dok je sekundarno anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Enzim peroksidaza rena je bio konjugovan streptavidinom, što je omogućilo specifično prepoznavanje i vezivanje za biotinom obeleženo sekundarno antitelo. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL- 17. Materijali i metode 52 Procedura testa je sledeća: U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na +4 οC. Po isteku inkubacije ploča je isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 200 μl rastvora koji sadrži PBS i goveđi serum (assay buffer). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 5 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (1000 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle tridesetominutne inkubacije na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 15 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (stop solution, 2N H2SO4). Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.3.2. IL-5 Koncentracija IL-5 u supernatantima kokultura MoDĆ i CD4+ T limfocita određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (eBioscience, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma-Aldrich, Nemačka) su bile obložene antitelima specifičnim za humani IL-5, dok je sekundarno anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Enzim peroksidaza rena je bio konjugovan streptavidinom, što je omogućilo specifično prepoznavanje i vezivanje za biotinom obeleženo sekundarno antitelo. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL- 5. Senzitivnost metode je 4 pg/ml. Procedura testa je sledeća: Materijali i metode 53 U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na +4 οC. Po isteku inkubacije ploča je isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 200 μl rastvora koji sadrži PBS i goveđi serum (assay buffer). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 5 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (500 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle tridesetominutne inkubacije na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 15 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (stop solution, 2N H2SO4). Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.3.3. IL-10 Koncentracija IL-10 u supernatantima kokultura MoDĆ i CD4+ T limfocita određivana je komercijalnim ELISA testom, sledeći uputstva proizvođača (eBioscience, SAD). U ovom testu, mikroploče od 96 mesta (Corning Costar 9018 ELISA plate, Sigma-Aldrich, Nemačka) su bile obložene antitelima specifičnim za humani IL-10, dok je sekundarno anti-humano antitelo bilo konjugovano biotinom. Enzim peroksidaza rena je bio konjugovan streptavidinom, što je omogućilo specifično prepoznavanje i vezivanje za biotinom obeleženo sekundarno antitelo. Kao supstrat za ovaj enzim je je korišćen vodonik peroksid (H2O2) i tetrametilbenzidin, dok je kao standard u testu korišćen rekombinantni humani IL- 10. Senzitivnost metode je 2 pg/ml. Procedura testa je sledeća: Materijali i metode 54 U svaki bunar ploče dodato je 100 μl antitela za oblaganje ploče (coating antibody) i inkubirano preko noći na +4 οC. Po isteku inkubacije ploča je isprana 5 puta sa puferom za ispiranje (wash buffer, K-PBS sa 0.05% Tween 20) i blokirana dodavanjem 200 μl rastvora koji sadrži PBS i goveđi serum (assay buffer). Posle inkubacije u trajanju od 1 sata ploča je isprana 5 puta i dodato je po 100 μl standarda u duplikatima dvostrukih opadajućih koncentracija (300 pg/ml - 0 pg/ml) i u odgovarajuće bazene po 100 μl uzoraka u kojima smo želeli da odredimo koncentraciju citokina. Po isteku inkubacije u trajanju od 2 sata i ispiranja ploče, dodato je 100 μl po bazenu biotiniziranog sekundarnog antitela i ploča je inkubirana 1 sat. Nakon toga, ploča je isprana i u svaki bazen je dodato po 100 μl streptavidinom konjugovanog enzima peroksidaze rena. Posle tridesetominutne inkubacije na sobnoj temperaturi i ponovljenog ispiranja, u svako polje je dodato po 100 μl rastvora supstrata i usledila je inkubacija u trajanju od 15 min u mraku. Kao finalni korak dodato je po 50 μl rastvora za zaustavljanje reakcije (stop solution, 2N H2SO4). Intenzitet boje je meren na spektrofotometru na 450 nm talasne dužine, a tražena koncentracija citokina u svakom od uzoraka je određena na osnovu standardne krive. 3.4.3.4. IFN-γ i IL-2 IFN-γ i IL-2 su određeni u supernatantima kokultura MoDĆ i CD4+ T limfocita korišćenjem humanog Th1/Th2 11plex-a. Prvo su pripremljeni svi reagensi neophodni za izvođenje testa. Esej pufer (assay buffer) je pripremljen rastvaranjem koncentrata sa destilovanom vodom u odnosu 1:10 i stavljen je u frižider do početka izvođenja testa. Liofizirani standardi su rekonstituisani dodavanjem destilovane vode do oznake naznačene na bočici standarda čime je dobijena koncentracija 400 ng/ml i za IL-2 i IFN-γ. Bočice su ostavljene desetak minuta, centrifugirane i po 10 μl svakog rekonstituisanog standarda je dodato u epruvetu označenu kao „standard 1“ i dopunjeno esej puferom do 200 μl finalne zapremine. U epruvete označene kao „standard 2“-„standard-7“ dodato je po 100 μl esej pufera. Potom je usledilo serijsko razblaženje standarda prebacivanjem po 50 μl standarda 1 u epruvetu 2, sadržaj je vorteksiran, pa je zatim 50 μl standarda 2 prebačeno u epruvetu 3 i postupak je nastavljen do sedme epruvete. Nakon pripreme standarda Materijali i metode 55 pripremljena je mešavina kuglica(bead mixture). Za analizu svakog citokina korišćena je određena vrsta kuglica obložena odgovarajućim antitelom. Mešavina kuglica je pripremljena tako da ukupni volumen bude bude jednak proizvodu 25 μl kuglica i ukupnog broja testova. Bočice sa kuglicama su vorteksirane 5 sekundi i iz svake je uzeto po 1/20 ukupnog volumena koji je dodat u novu epruvetu. Epruveta je dopunjena sa puferom za razređivanje (reagent dilution puffer) i centrifugirana na 3000xg tokom 5 minuta. Tečnost je pažljivo odlivena tako da u epruveti ostane oko 50 μl tečnosti. Nakon toga je u epruvetu ponovo dodat pufer za razređivanje i epruveta je centrifugirana 5 sekundi. Mešavina sekundarnih antitela konjugovanih biotinom (biotin-conjugate mixture) je pripremljena na sličan način kao i mešavina kuglica. Ukupni volumen je dobijen množenjem broja testova sa 50 μl smeše biotinom-konjugovanih sekundarnih antitela. Uzeto je po 1/20 ukupnog volumena i prebačeno u novu epruvetu koja je dopunjena sa puferom za razređivanje. Rastvor sa streptavidin-fikoeritrinom (streptavidin-phycoerythrin solution), koji se vezuje za biotinom-konjugovana sekundarna antitela, pripremljen je rastvaranjem u esej puferu prema proporciji: za 96 testova potrebno je 176 μl strepravidin-fikoeritrin rastvora i 5324 μl esej diluenta. Na osnovu ove proporcije određene su zapremine prema broju testova u našem eksperimentu. Kada su svi reagensi pripremljeni u ploču od 96 mesta sa „V“-dnom (Sardstedt, Nemačka) dodato je po 25 μl esej pufera u bunare za blank, po 25 μl standarda u odgovarajuće bunare (opseg koncentracija standarda je 27-20000 pg/ml, a senzitivnost testa je za IL-2 16.4 pg/ml, a za IFN-γ 1.6 pg/ml) i po 25 μl uzorka. Nakon toga dodato je po 25 μl mešavine kuglica i po 50 μl mešavine sekundarnih antitela konjugovanih biotinom. Usledila je inkubacija u trajanju od 2 sata na sobnoj temperaturi na mešalici. Po isteku inkubacije, dodato je po 100 μl esej pufera u svaki bunarić i ploča je centrifugirana 5 minuta na 200xg. Nakon toga iz svakog bunara je uzeto po 150 μl tečnosti. Potom je dodato po 150 μl esej pufera i ploča je ponovo centrifugirana tokom 5 minuta na 200xg. Nakon uzimanja po 150 μl tečnosti iz svakog bunara dodato je po 50 μl rastvora sa streptavidin-fikoeritrinom i ploča je inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi na mešalici. Po isteku inkubacije ponovljen je prethodno opisan postupak ispiranja i sadržaj svakog bunarića je prebačen u epruvete za protočnu citofluorimetriju i svaka je dopunjena sa po 500 μl esej pufera. Uzorci su analizirani na protočnom Materijali i metode 56 citofluorimetru (EPICS XL-MCS, Coulter, Krefeld, Nemačka), a rezultati su obrađeni softverom koji je dobijen uz kit (FlowCytomix Pro Software). 3.4.3.5. Intracitoplazmatska detekcija citokina aktivisanih T limfocita Procena Th polarizujuće aktivnosti MoDĆ je dodatno izvršena određivanjem produkcije IL-17 i IFN-γ u kokulturi sa alogenim CD4+ T ćelijama. Purifikovane CD4+ T ćelije (1x105 ćelija po bunariću) su kultivisane u prisustvu alogenih MoDĆ (1x104 ćelija po bunariću) tokom 5 dana u kompletnom medijumu u ploči od 96 mesta sa „U“- dnom (Sarstedt, Nemačka). Nakon toga su ćelije sakupljene i inkubirane sa monenzinom (3 µM) tokom 6h. Potom je usledila inkubacija u prisustvu anti-IFN-γ- FITC (R&D Systems; SAD) i anti-IL-17-PE (BD Biosciences Pharmingen; SAD) uz primenu FIX & PERM® Cell Fixation & Cell Permeabilization Kit (Invitrogen, SAD) prateći uputstva proizvođača. Ćelijska fluorescence je analizirana na EPICS XL-MCS protočnom citofluorimetru (Coulter, Krefeld, Nemačka) korišćenjem programa SZSTEMTM II software. 3.5. Statistička obrada podataka Podaci su statistički obrađeni korišćenjem Studentovog T-testa u okviru softverskog programa PRIMER. 57 4. REZULTATI Rezultati 58 Poglavlje Rezultati je podeljeno u pet delova, tako da je u prvom delu prikazan efekat Poly (I:C) na funkcionalna i fenotipska svojstva MoDĆ, a u narednim efekti drugih modulatora i njihovih kombinacija sa Poly (I:C). U drugom delu prikazani su efekti loksoribina i njegove kombinacije sa Poly (I:C), u trećem delu efekti kurdlana i njegove kombinacije sa Poly (I:C), u četvrtom delu efekti citokina IFN-γ i liganda za CD40 molekul i njihove kombinacije sa Poly (I:C) i u petom delu efekti TNF-α i njegove kombinacije sa Poly (I:C). U različitim delovima istraživanja korišćene su MoDĆ dobijene od različitih zdravih donora. 4.1. Uticaj Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ Prvi cilj ovog istraživanja je bio da se ispita efekat dejstva Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ. U preliminarnim eksperimentima nezrele MoDĆ smo kultivisali u prisustvu različitih koncentracija Poly (I:C) (5 μg/ml, 25 μg/ml i 50 μg/ml). Na osnovu fenotipskih i funkcionalnih karakteristika MoDĆ stimulisanih na ovaj način, procenjeno je da je optimalna koncentracija Poly (I:C) za aktivaciju nezrelih humanih MoDĆ 25 μg/ml. U narednim eksperimentima su nezrele MoDĆ tokom 48h kultivisane u prisustvu optimalne koncentracije Poly (I:C), dok su kontrolnu grupu predstavljale MoDĆ diferencirane pod istovetnim uslovima u medijumu koji nije sadržao Poly (I:C). 4.1.1. Uticaj Poly (I:C) na morfološke i fenotipske karakteristike MoDĆ Morfološkom analizom citospin preparata obojenih MGG metodom ustanovljeno je da se MoDĆ stimulisane sa optimalnom koncentracijom Poly (I:C) odlikuju izraženim citoplazmatskim nastavcima što je odlika zrelih MoDĆ (Slika 7). Rezultati 59 Slika 7. Morfološke karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) Prikazane su slike citospin preparata MoDĆ kultivisanih u kontrolnom medijumu (A) i u prisustvu Poly (I:C) (B) koji su obojeni po MGG Fenotipske karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) analizirane su metodom protočne citometrije korišćenjem specifične kombinacije monoklonskih antitela, postupkom koji je detaljno opisan u poglavlju Materijal i metode. Rezultati su prikazani kao procenat pozitivnih ćelija i srednja vrednost intenziteta fluorescence (Tabela 1). Tabela 1. Fenotipske karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) Kontrola Poly (I:C) HLA-DR % 98.0 ± 1.6 99.0 ± 0.6 mfi 28.8 ± 4.3 62.9 ± 9.5*** CD86 % 75.4 ± 10.9 96.5 ± 1.4*** mfi 13.6 ± 2.0 37.6 ± 5.6*** CD40 % 92.8 ± 5.3 97.5 ± 1.1 mfi 15.0 ± 1.8 41.6 ± 5.0*** CD54 % 83.9 ± 13.2 94.2 ± 3.3 mfi 23.5 ± 3.5 55.9 ± 8.4*** CD83 % 33.2 ± 5.0 75.9 ± 11.4*** mfi 3.4 ± 0.5 6.4 ± 1.0* CCR7 % 2.7 ± 0.4 11.3 ± 1.6*** mfi 2.6 ± 0.4 2.9 ± 0.5 MoDĆ su dobijene iz humanih monocita nakon šestodnevne kultivacije u prisustvu GM-CSF (100 ng/ml) i IL-4 (20 ng/ml) i stimulacije sa Poly (I:C) tokom 48h. Neadherentne ćelije su skupljene i obeležene antitelima specifičnim za ključne markere DĆ (anti-HLA-DR-PE, anti-CD86-PE, CD83-FITC, anti-CD40- FITC, anti-CD54-PE i anti-CCR7-FITC), a potom analizirane na protočnom citofluorimetru. Rezultati iz jednog reprezentativnog eksperimenta su predstavljeni kao procenat pozitivnih ćelija (% ± SD) i kao srednja vrednost intenziteta fluorescence (engl. mean fluorescence intensity, mfi ± SD). * p <0.05; *** p<0.005 u odnosu na kontrolne MoDĆ Rezultati fenotipske analize kontrolnih MoDĆ pokazali su da su na značajnom procentu ovih ćelija bili ispoljeni molekuli HLA-DR, CD40, CD54 i CD86, dok je procenat CD83 pozitivnih ćelija bio manji. Procenat ćelija koje ispoljavaju Rezultati 60 CCR7 je bio izuzetno nizak. Najveće srednje vredosti intenziteta fluorescence su bile za HLA-DR i CD54 molekul, dvostruko niže za CD40 i CD86 i niske za CD83 i CCR7. Fenotipskom analizom MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) ustanovljeno je statistički značajno povećanje procenta ćelija koje ispoljavaju CD86, CD83 i CCR7 molekule, u poređenju sa kontrolnim MoDĆ. Takođe, u poređenju sa kontrolnim MoDĆ, stimulacija MoDĆ sa Poly (I:C) je dovela do povećanja srednje vrednosti intenziteta fluorescence za HLA-DR, CD86, CD40, CD54 i CD83. 4.1.2. Alostimulatorna aktivnost MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) U cilju daljeg proučavanja uticaja Poly (I:C) na diferencijaciju MoDĆ ispitivane su funkcionalne karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C). Jedna od funkcionalnih karakteristika MoDĆ je sposobnost da stimulišu proliferaciju alogenih CD4 + T limfocita u mešanoj kulturi leukocita, postupkom koji je detaljno opisan u poglavlju Materijal i metode. Proliferativni odgovor CD4+ T limfocita u kokulturi sa kontrolnim i MoDĆ stimulisanim Poly (I:C) je prikazan na Grafikonu 1. Rezultati 61 Grafikon 1. Alostimulatorni kapacitet MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) u kokulturi sa alogenim CD4 T limfocitima Na grafikonu je prikazan alostimulatorni potencijal MoDĆ diferenciranih u kontrolnom medijumu (kontrolne MoDĆ) ili u prisustvu Poly (I:C). MoDĆ su kultivisane su u opadajućim dvostrukim razblaženjima (1x104-0.125x104) sa alogenim CD4+ T limfocitima (1x105) u toku 5 dana u 200 μl kompletnog medijuma. U medijum za kultivaciju ćelija 18h pre merenja proliferativnog odgovora je dodat [H3] timidin. Proliferativan odgovor je izražen kao broj otkucaja u minuti (engl. counts per minute, cpm). Na grafiku su prikazani rezultati jednog reprezentativnog od šest sličnih eksperimenata kao srednja vrednost cpm triplikata kulture ± SD. * p <0.05; ** p<0.01 u odnosu na kontrolne MoDĆ Kontrolne MoDĆ su pokazale umeren potencijal za stimulaciju proliferacije alogenih CD4 + T limfocita. MoDĆ kultivisane u prisustvu Poly (I:C) imale su povećan alostimulatorni kapacitet i to pri nižim odnosima MoDĆ i alogenih CD4+ T limfocita (1:40 i 1:80), dok pri ostalim odnosima nije došlo do statistički značajne promene alostimulatornog kapaciteta. 4.1.3. Produkcija citokina od strane MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) Sledeći korak u ispitivanju funkcionalnih karakteristika MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) ili u kontrolnom medijumu bio je određivanje produkcije citokina u supernatantima kultura MoDĆ primenom ELISA metode, kao što je opisano u poglavlju Materijal i metode. Rezultati su standardizovani za 1x106 MoDĆ/ml kulture i prikazani su kao srednje vrednosti koncentracija, izraženih u ng/ml, iz tri reprezentativna eksperimenta (Grafikon 2). Rezultati 62 Grafikon 2. Produkcija citokina od strane MoDĆ diferenciranih bez i u prisustvu Poly (I:C) Koncentracije IL-12, IL-23, IL-27, IL-6, TNF-α i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih bez i u prisustvu Poly (I:C) tokom 2 dana. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. * p <0.05; *** p<0.005 u odnosu na kontrolne MoDĆ Kontrolne nezrele MoDĆ su produkovale niske nivoe IL-10 i IL-27, dok su nivoi IL-12, IL-23, TNF-α i IL-6 bili nedetektabilni. MoDĆ stimulisane u prisustvu Poly (I:C) pokazale su statistički značajno povećanje produkcije IL-12, IL-27, TNF-α i IL-6, umereno povećanje nivoa IL-23, dok je produkcija IL-10 bila nepromenjena, u poređenju sa kontrolnim MoDĆ. 4.1.4. Produkcija citokina u kokulturi alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ stimulisanih u prisustvu Poly (I:C) Uticaj Poly (I:C) na sposobnost MoDĆ da usmere CD4+ T ćelijski imunski odgovor procenjen je na osnovu produkcije citokina IFN-γ, IL-17, IL-5, IL-2 i IL-10 u Rezultati 63 kokulturi alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ postupkom koji je detaljno opisan u poglavlju Materijal i metode. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti koncentracija, izraženih u ng/ml, iz šest reprezentativnih eksperimenata (Grafikon 3). Grafikon 3. Citokinski profil CD4+ T limfocita stimulisanih sa MoDĆ koje su diferencirane u prisustvu Poly (I:C) Nezrele MoDĆ (1x104), kultivisane 2 dana u prisustvu Poly (I:C) ili u kontrolnom medijumu, su potom kultivisane sa CD4 + sortiranim alogenim T limfocitima (1x105) tokom 5 dana, u 200 μl kompletnog medijuma. Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracija citokina merena je ELISA testovima i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica i protočne citofluorimetrije. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. * p <0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u odnosu na kontrolne MoDĆ Prikazani rezultati pokazuju da alogeni CD4 + T limfociti stimulisani sa kontrolnim MoDĆ produkuju izvesne nivoe svih ispitivanih citokina. MoDĆ koje su stimulisane sa Poly (I:C) u kokulturi sa CD4 + T limfocitima dovode do povećanja Rezultati 64 produkcije IFN-γ i IL-17, odnosno do smanjenja produkcije IL-5 i IL-10, u poređenju sa produkcijom ovih citokina u kokulturi sa kontrolnim MoDĆ. 4.2. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ U preliminarnim eksperimentima nezrele MoDĆ su kultivisane u prisustvu različitih kombinacija suboptimalnih (10 μg/ml) i optimalnih (25 μg/ml) koncentracija Poly (I:C) i suboptimalnih (34 μg/ml) i optimalnih (85 μg/ml) koncentracija loksoribina. Na osnovu fenotipskih i funkcionalnih karakteristika MoDĆ stimulisanih na ovaj način procenjeno je da su efekti kombinovane primene optimalne koncentracije Poly (I:C) i suboptimalne koncentracije loksoribina slični efektima primene optimalne koncentracije samog Poly (I:C). Iz tog razloga, u narednim eksperimentima smo koristili obe suboptimalne, obe optimalne i kombinaciju suboptimalne koncentracije Poly (I:C) i optimalne koncentracije loksoribina. 4.2.1. Efekti kombinacije Poly (I:C) i loksoribina na fenotipske karakteristike MoDĆ Fenotipske karakteristike MoDĆ stimulisanih kombinacijom Poly (I:C) i loksoribina analizirane su metodom protočne citometrije korišćenjem specifične kombinacije monoklonskih antitela, postupkom koji je detaljno opisan u poglavlju Materijal i metode. Rezultati su prikazani kao procenat pozitivnih ćelija i srednja vrednost intenziteta fluorescence (Tabela 2). Rezultati 65 Tabela 2. Fenotipske karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), loksoribina i njhovih kombinacija Kontrola Poly (I:C) (µg/ml) Loksoribin (µg/ml) Poly (I:C)/Loksoribin 10 25 34 85 10/34 10/85 25/85 HLA-DR % 96.2 ± 2 98.4 ± 1 97.1 ± 1 97.0 ± 1 80.4 ± 3* 98.6 ± 0 91.0 ± 1∆ 90.2 ± 1 ### mfi 15.0 ± 1 20.6 ± 1* 20.8 ± 2* 14.3 ± 1. 7.31 ±1*** 21.7 ± 2 9.95 ± 1 10.0 ± 1 CD86 % 70.8 ± 4 84.2 ± 5* 92.5 ± 3** 70.2 ± 4 72.8 ± 3 89.2 ± 1 93.0 ± 1∆ 85.7 ± 1 mfi 5.6 ± 0.4 14.3 ± 1*** 15.3 ± 1*** 5.1 ± 1 8.4 ± 1 20.3 ± 2 26.6 ± 2 14.1 ± 2 CD83 % 14.2 ± 3.6 52.0 ± 4*** 58.6 ± 5*** 21.6 ± 1* 27.2 ± 1* 88.1 ± 2∆∆∆ 47.6 ± 4 38 ± 2 ### mfi 2.0 ± 0.3 4.6 ± 0.4*** 4.11 ± 0.9* 2.4 ± 0.8 2.5 ± 0.6 6.4 ± 0.5∆∆ 5.2 ± 1.0 6.39 ± 0.7 CD54 % 88.1 ± 4.2 91.4 ± 3.6 94.5 ± 2.4 90.2 ± 3.0 75.9 ± 4.6* 95.1 ± 1.6 90.4 ± 1.7 90.7 ± 1.9 mfi 14.9 ± 1.0 28.1 ± 2.1* 21.1 ± 2.4* 16.9 ± 2.2 10.6 ± 1.6 34.1 ± 1.6∆ 25.0 ± 3.9 29.0 ± 1.6 ## CD40 % 98.2 ± 0.4 97.1 ± 1.0 97.9 ± 0.6 96.6 ± 1.0 94.5 ± 1.4 98.8 ± 0.4 95.4 ± 1.0 72.7 ± 1 ### mfi 10.8 ± 1.0 30.5 ± 2*** 29.9 ± 3* 15.1 ± 2* 14.5 ± 2.0 37.7 ± 4.6 28.6 ± 1.9 8.4 ± 1 ### U tabeli su prikazane fenotipske karakteristike kontrolnih MoDĆ i MoDĆ stimulisanih u prisustvu Poly (I:C), loksoribina ili njihovih kombinacija obeleženih antitelima specifičnim za ključne markere DĆ (anti- HLA-DR-PE, anti-CD86-PE, anti-CD83-FITC, anti-CD40-FITC i anti-CD54-PE), a potom analizirane na protočnom citofluorimetru. Rezultati jednog reprezentativnog eksperimenta su predstavljeni kao procenat pozitivnih ćelija (% ± SD) i kao srednja vrednost intenziteta fluorescence (engl. mean fluorescence intensity, mfi ± SD). * p <0.05; ** p<0.01 ; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ ∆ p < 0.05; ∆∆ p < 0.01; ∆∆∆ p < 0.005 u poređenju sa MoDĆ tretiranim Poly (I:C) 10 µg/ml ## p< 0.01; ### p < 0.005 u poređenju sa MoDĆ tretiranim Poly (I:C) 25 µg/ml Stimulacija MoDĆ suboptimalnim i optimalnim koncentracijama Poly (I:C) je dovela do povećanja ekspresije HLA-DR, CD40, CD54, CD83 i CD86 molekula. Kultivacija MoDĆ u prisustvu suboptimalne koncentracije loksoribina stimulisala je povećanje ekspresije CD40 i CD83 molekula, u poređenju sa ekspresijom na kontrolnim MoDĆ. Sa druge strane, kod MoDĆ tretiranih optimalnom koncentracijom loksoribina uočeno je povećanje ekspresije CD83 molekula i značajno smanjeno ispoljavanje HLA-DR i CD54 molekula. Kultivacija MoDĆ u prisustvu suboptimalnih koncentracija Poly (I:C) i loksoribina dovela je do blagog povećanja ekspresije svih ispitivanih markera u poređenju sa odgovarajućim kontrolama. Stimulacija MoDĆ suboptimalnom koncentracijom Poly (I:C) i optimalnom koncentracijom loksoribina dovela je do Rezultati 66 povećanja ekspresije CD86 i smanjenja ekspresije HLA-DR. Tretman MoDĆ optimalnim koncentracijama oba TLR agonista rezultirao je smanjenjem ekspresije HLA-DR, CD83 i CD40 molekula u poređenju sa odgovarajućim kontrolama. 4.2.2. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina na produkciju citokina od strane MoDĆ Na Grafikonu 4 je prikazana produkcija IL-12, IL-23, IL-27 i IL-10 u supernatantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) i loksoribina određena ELISA metodom. Rezultati su standardizovani za 1x106 MoDĆ/ml kulture i prikazani kao srednje vrednosti koncentracija, izraženih u ng/ml, iz šest reprezentativnih eksperimenata. Rezultati 67 Grafikon 4. Produkcija citokina od strane MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), loksoribina i njhovih kombinacija Koncentracije IL-12, IL-23, IL-27 i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), loksoribina i njihovih kombinacija, kao i u kontrolnom medijumu tokom 2 dana. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. * p <0.05; *** p<0.005 u odnosu na odgovarajuće kontrole MoDĆ kultivisane u prisustvu obe ispitivane koncentracije Poly (I:C) imaju povećanu produkciju IL-12, IL-23, IL-27 i IL-10. Uočene razlike u efektima različitih koncentracija Poly (I:C) su se ogledale u tome da je tretman MoDĆ suboptimalnom Rezultati 68 koncentracijom stimulisao produkciju IL-12 i IL-27, dok je tretman opimalnom koncentracijom doveo do značajnijeg povećanja produkcije IL-23 i IL-10. MoDĆ kultivisane u prisustvu obe koncentracije loksoribina nisu produkovale IL-12. Dozno-zavisan efekat loksoribina se ogledao u povećanju produkcije IL-10 i IL-27 kada je primenjena suboptimalna koncentracija, odnosno povećanju produkcije IL-23 od strane MoDĆ stimulisanih sa optimalnom koncentracijom. Efekat kombinovane primene suboptimalnih koncentracija ova dva ispitivana TLR agonista se ogledao u povećanoj produkciji IL-27, IL-23 i IL-10. Sa druge strane, istovremena primena suboptimalne koncentracije Poly (I:C) i optimalne koncentracije loksoribina uticala je na povećanje produkcije IL-12 i IL-23 i smanjenje nivoa IL-10 i IL-27. Stimulacija MoDĆ sa optimalnim koncentracijama oba TLR agonista pospešila je produkciju IL-12, IL-27 i IL-10 u poređenju sa odgovarajućim kontrolama. Ovaj tretman je doveo do značajnog sniženja nivoa IL- 23 u poređenju sa produkcijom ovog citokina od strane MoDĆ stimulisanih optimalnom koncentracijom Poly (I:C). Kultivacija MoDĆ u prisustvu svih ispitivanih kombinacija Poly (I:C) i loksoribina je dovela do smanjenja produkcije IL-12 u poređenju sa efektom suboptimalne koncentracije Poly (I:C) i optimalne koncentracije loksoribina. Suprotan efekat je uočen u pogledu produkcije IL-10. 4.2.3. Produkcija citokina u kokulturi alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ stimulisanih kombinacijom Poly (I:C) i loksoribina Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina na sposobnost MoDĆ da usmere imunski odgovor procenjen je na osnovu produkcije citokina IFN-γ, IL-17, IL-4 i IL-10 u kokulturama alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ. Rezultati su predstavljeni na Grafikonu 5 kao srednje vrednosti koncentracija, izraženih u ng/ml, iz šest reprezentativnih eksperimenata. Rezultati 69 Grafikon 5. Citokinski profil u kokulturi CD4+ T limfocita i MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), loksoribina i njhovih kombinacija Nezrele MoDĆ (1x104), kultivisane 2 dana u prisustvu Poly (I:C), loksoribina i njihovih kombinacija, ili u kontrolnom medijumu, su potom kultivisane sa CD4 + alogenim T limfocitima (1x105) tokom 5 dana, u 200 μl kompletnog medijuma. Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracija citokina merena je ELISA testovima i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica i protočne citofluorimetrije. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. ** p<0.01 ; *** p<0.005 u odnosu na odgovarajuće kontrole Stimulacija MoDĆ u prisustvu obe ispitivane koncentracije Poly (I:C) pokazala je dozno-zavisan stimulatorni efekat na produkciju IFN-γ i IL-17 u Rezultati 70 kokulturi sa alogenim CD4 + T limfocitima, Suboptimalna koncentracija Poly (I:C) je indukovala veću produkciju IL-4 u poređenju sa MoDĆ stimulisanim optimalnom koncentracijom. Suprotan efekat je uočen u pogledu produkcije IL-10. MoDĆ stimulisane sa suboptimalnom koncentracijom loksoribina su stimulisale povećanje produkcije IL-4 i IL-17 od strane alogenih CD4+ T limfocita, dok se efekat optimalne koncentracije ogledao u povećanju produkcije IFN-γ i IL-10 u alogenoj kulturi. MoDĆ kultivisane u prisustvu suboptimalnih koncentracija oba TLR agonista su dovele do povećanja produkcije IFN-γ i IL-17 u alogenoj kulturi, u poređenju sa relevantnim kontrolama. Sa druge strane, nivoi IL-4 i IL-10 u supernatantima ovih kultura su bili znatno niži u poređenju sa vrednostima u supernatantima kokultura alogenih CD4 + T limfocita i MoDĆ tretiranih pojedinačnim agonistima. Efekat kombinovane primene suboptimalne koncentracije Poly (I:C) i optimalne koncentracije loksoribina se ogledao u povećanju produkcije IFN-γ, za razliku od IL-4 i IL-10 čiji su nivoi znatno niži, u poređenju sa nivoom u kokulturi kontrolnih MoDĆ i CD4+ T limfocita. Stimulacija MoDĆ optimalnim koncentracijama oba TLR agonista ispoljila je povoljan efekat na produkciju IFN-γ i negativan na produkciju IL-4, IL-10 i IL-17 u kokulturi u poređenju sa efektom MoDĆ tretiranih optimalnim koncentracijama pojedinačno primenjenih agonista. 4.3. Uticaj kurdlana i njegove kombinacije sa Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ U preliminarnim eksperimentima nezrele MoDĆ su kultivisane u prisustvu različitih koncentracija Poly (I:C) (5 μg/ml, 25 μg/ml i 50 μg/ml) odnosno kurdlana (10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml i 200 μg/ml). Na osnovu fenotipskih i funkcionalnih karakteristika MoDĆ stimulisanih na ovaj način, procenjeno je da je optimalna koncentracija Poly (I:C) za aktivaciju MoDĆ 25 μg/ml, a kurdlana 100 μg/ml. Rezultati 71 Optimalne koncentracije agonista su korišćene za stimulaciju MoDĆ u svim narednim eksperimentima. 4.3.1. Efekat kurdlana i njegove kombinacije sa optimalnom koncentracijom Poly (I:C) na fenotipske karakteristike MoDĆ Fenotipske karakteristike MoDĆ diferenciranih u pristustvu Poly (I:C) i kurdlana analizirane su metodom protočne citometrije. Rezultati su prikazani u Tabeli 3 i na Grafikonu 6 kao procenat pozitivnih ćelija i srednja vrednost intenziteta fluorescence. Tabela 3. Fenotipske karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu optimalnih koncentracija Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije MoDĆ su dobijene iz humanih monocita nakon šestodnevne kultivacije u prisustvu GM-CSF (100 ng/ml) i IL-4 (20 ng/ml) i stimulisane optimalnim koncentracijama Poly (I:C), kurdlana i njihovom kombinacijom tokom 48h. Neadherentne ćelije su skupljene i obeležene antitelima specifičnim za ključne markere DĆ (anti-HLA-DR-PE, anti-CD86-PE, anti-CD83-FITC, anti-CD40-FITC, anti-CD54-PE i anti-CCR7-FITC), a potom analizirane na protočnom citofluorometru. Rezultati iz jednog reprezentativnog eksperimenta su predstavljeni kao procenat pozitivnih ćelija (% ± SD) i kao srednja vrednost intenziteta fluorescence (engl. mean fluorescence intensity, mfi ± SD). * p <0.05; *** p<0.005 u odnosu na kontrolne MoDĆ ∆ p <0.05; ∆∆ p<0.01 u odnosu na MoDĆ stimulisane sa Poly (I:C) Kontrola Poly (I:C) Kurdlan Poly (I:C)+ kurdlan HLA-DR % 98.0 ± 1.6 99.0 ± 0.6 99.1 ± 0.8 99.6 ± 0.2 mfi 28.8 ± 4.3 62.9 ± 9.5*** 61.2 ± 9.2*** 75.7 ± 11.4*** CD86 % 75.4 ± 10.9 96.5 ± 1.4*** 95.4 ± 2.0*** 92.4 ± 3.0*** mfi 13.6 ± 2.0 37.6 ± 5.6*** 21.6 ± 3.2* 36.5 ± 5.5*** CD40 % 92.8 ± 5.3 97.5 ± 1.1 98.6 ± 0.9 97.8 ± 1.4 mfi 15.0 ± 1.8 41.6 ± 5.0*** 22.6 ± 2.7** 44.0 ± 5.3*** CD54 % 83.9 ± 13.2 94.2 ± 3.3 83.2 ± 8.4 93.6 ± 3.4 mfi 23.5 ± 3.5 55.9 ± 8.4*** 24.5 ± 3.7 59.5 ± 9.0*** CD83 % 33.2 ± 5.0 75.9 ± 11.4*** 56.9 ± 8.5*** 70.9 ± 10.6*** mfi 3.4 ± 0.5 6.4 ± 1.0* 4.7 ± 0.7 6.2 ± 0.8** CCR7 % 2.7 ± 0.4 11.3 ± 1.6*** 4.0 ± 0.6* 18.5 ± 2.9***, ∆ mfi 2.6 ± 0.4 2.9 ± 0.5 2.2 ± 0.4 5.2 ± 0.6***, ∆∆ Rezultati 72 Grafikon 6. Fenotipske karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu optimalnih koncentracija Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije MoDĆ su dobijene iz humanih monocita nakon šestodnevne kultivacije u prisustvu GM-CSF (100 ng/ml) i IL-4 (20 ng/ml) i stimulisane sa optimalnim koncentracijama Poly (I:C), kurdlana i njihovom kombinacijom tokom 48h. Neadherentne ćelije su skupljene i obeležene antitelima specifičnim za ključne markere DĆ (anti-HLA-DR-PE, anti-CD86-PE, anti-CD83-FITC, anti-CD40-FITC, anti-CD54-PE i anti-CCR7-FITC), a potom analizirane na protočnom citofluorometru. Prikazani su rezultati jednog reprezentativnog od šest eksperimenata. Fenotipskom analizom MoDĆ stimulisanih optimalnom koncentracijom Poly (I:C) ustanovljeno je povećanje ekspresije HLA-DR, CD86, CD40, CD54, CD83 i CCR7 molekula u poređenju sa kontrolnim MoDĆ. MoDĆ diferencirane u prisustvu optimalne koncentracije kurdlana su imale povećanu ekspresiju HLA-DR, CD86, CD83, CD40 i CCR7 molekula u poređenju sa MoDĆ koje su kultivisane samo u medijumu, ali je efekat kurdlana bio slabiji u poređenju sa efektom Poly (I:C). Istovremena stimulacija MoDĆ optimalnim koncentracijama oba agonista dovela je do povećanja ekspresije CCR7 molekula u poređenju sa MoDĆ diferenciranim u prisustvu Poly (I:C). Rezultati 73 4.3.2. Alostimulatorni potencijal MoDĆ stimulisanih kurdlanom i njegovom kombinacijom sa Poly (I:C) Na Grafikonu 7 prikazana je proliferacija alogenih CD4+ T limfocita u kokulturi sa MoDĆ prethodno stimulisanih kurdlanom i njegovom kombinacijom sa optimalnom koncentracijom Poly (I:C). MoDĆ direrencirane u prisustvu optimalne koncentracije Poly (I:C) odnosno kurdlana su stimulisale proliferaciju alogenih CD4 + T limfocita pri nižim odnosima MoDĆ/CD4 + T limfocita (1:40 i 1:80). MoDĆ stimulisane sa oba agonista su inhibirale proliferaciju alogenih CD4 + T limfocita pri najvišem odnosu (1:10), dok su najveći alostimulatorni potencijal imale pri najnižem odnosu (1:80), u poređenju sa alostimulatornim potencijalom MoDĆ stimulisanih samo sa Poly (I:C). Grafikon 7. Alostimulatorni kapacitet MoDĆ diferenciranih u prisustvu optimalnih koncentracija Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije u kokulturi sa alogenim CD4+ T limfocitima Na grafikonu je prikazan alostimulatorni potencijal MoDĆ diferenciranih u kontrolnom medijumu (kontrolne MoDĆ) ili u prisustvu Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije. MoDĆ su kultivisane su u opadajućim dvostrukim razblaženjima (1x104-0.125x104) sa alogenim CD4+ T limfocitima (1x105) u toku 5 dana u 200 μl kompletnog medijuma. U medijum za kultivaciju ćelija 18h pre merenja proliferativnog odgovora je dodat [H3] timidin. Proliferativan odgovor je izražen kao broj otkucaja u minuti (engl. counts per minute, cpm). Na grafiku su prikazani rezultati jednog reprezentativnog od šest sličnih eksperimenata kao srednja vrednost cpm triplikata kulture ± SD. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u odnosu na kontrolne MoDĆ Δ p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) Rezultati 74 4.3.3. Kombinovani efekat Poly (I:C) i kurdlana na produkciju citokina od strane MoDĆ Koncentracije IL-12, IL-23, IL-27, IL-6, TNF-α i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije. Rezultati su predstavljeni na Grafikonu 8 kao srednja vrednost koncentracija, izraženih u ng/ml, iz šest reprezentativna eksperimenta sa različitim donorima. Grafikon 8. Produkcija citokina od strane MoDĆ diferenciranih u prisustvu optimalnih koncentracija Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije Koncentracije IL-12, IL-23, IL-27, IL-6, TNF-α i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije kao i u kontrolnom medijumu tokom 2 dana. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ Δ p<0.05; ΔΔ p<0.01; ΔΔΔ p<0.005 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) # p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa kurdlanom Rezultati 75 Kontrolne MoDĆ su produkovale niske nivoe IL-10 i IL-27, dok su nivoi IL-12, IL-23, TNF-α i IL-6 bili gotovo nedetektabilni. Stimulacija MoDĆ optimalnom koncentracijom Poly (I:C) dovela je do značajnog povećanja produkcije IL-12, IL-27, TNF-α i IL-6, umerenog povećanja produkcije IL-23 dok je nivo produkcije IL-10 bio nepromenjen u poređenju sa kontrolnim MoDĆ. MoDĆ kultivisane u prisustvu kurdlana produkovale su povećane nivoe IL-23 i IL-27 i smanjen nivo IL-10 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ. Stimulacija MoDĆ sa kombinacijom TLR3 i dektin-1 agonista je dovela do sinergističkog povećanja produkcije IL-12, IL-23 i IL-10, dok su nivoi IL-6 i IL-27 bili sniženi u poređenju sa produkcijom citokina od strane MoDĆ stimulisanih samo sa Poly (I:C). 4.3.4. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i kurdlana na potencijal MoDĆ da usmere efektorske funkcije CD4 + T limfocita U prvom delu ispitivanja efekta kombinovane primene Poly (I:C) i kurdlana na potencijal MoDĆ da usmere efektorske funkcije CD4 + T limfocita određena je produkcija citokina u supernatantima i intracitoplazmatska ekspresija citokina kod CD4 + T limfocita u kokulturama diferenciranih MoDĆ i alogenih CD4+ T limfocita. Rezultati produkcije citokina u supernatantima kokultura alogenih CD4 + T limfocita i MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) i kurdlanom prikazani su na Grafikonu 9A. Rezultati 76 Nezrele MoDĆ (1x104), kultivisane 2 dana u prisustvu Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije, ili u kontrolnom medijumu, su potom kultivisane sa alogenim CD4 + T limfocitima (1x105) tokom 5 dana, u 200 μl kompletnog medijuma. A) Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracija IFN-γ, IL-17, IL-2, IL-10 i IL-5 u supernatantima kokultura merena je ELISA testovima i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica i protočne citofluorimetrije. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. B) Radi procene intracitoplazmatske ekspresije citokina sakupljene su ćelije iz CD4 + T/MoDĆ kokultura, postavljenih na identičan način kao za određivanje nivoa produkcije citokina u supernatantima, i inkubirane sa monenzinom tokom 6h. Ćelije su potom inkubirane sa anti-IFN-γ-FITC i anti-IL-17-PE i analizirane na protočnom citofluorometru. Rezultati dvostruke imunofenotipske analize su predstavljeni histogramima. Procenti jednostruko i dvostruko pozitivnih ćelija su prikazani na histogramima (jedan reprezentativni eksperiment od tri sa sličnim rezultatima). 1-kontrola; 2-Poly (I:C); 3-kurdlan; 4-Poly (I:C)+kurdlan * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ Δ p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) ### p<0.005 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa kurdlanom MoDĆ kultivisane u prisustvu Poly (I:C) su stimulisale produkciju IFN-γ i IL- 17 i smanjile produkciju IL-10 i IL-5 od strane alogenih CD4+ T limfocita, u poređenju sa kontrolnim MoDĆ. CD4 + T ćelije u kokulturi sa MoDĆ tretiranim kurdlanom su produkovale visoke nivoe IFN-γ, IL-17 i IL-2 i niske nivoe IL-5, u poređenju sa nivoima u kokulturama sa kontrolnim MoDĆ. Stimulatorni efekat Grafikon 9. Citokinski profil CD4+ T limfocita stimulisanih sa MoDĆ koje su diferencirane u prisustvu Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije Rezultati 77 MoDĆ tretiranih kurdlanom na produkciju IL-17 od strane alogenih CD4+ T ćelija je bio veći u poređenju sa efektom MoDĆ tretiranih sa Poly (I:C), dok je obratno zapaženo u slučaju produkcije IFN-γ. U kokulturi CD4+ T ćelija sa MoDĆ stimulisanih optimalnim koncentracijama oba agonista u optimalnim koncentracijama detektovani su povišeni nivoi IFN-γ i IL-10, trend povećanja produkcije IL-17, kao i sniženje produkcije IL-2 od strane CD4+ T ćelija, u poređenju sa efektom pojedinačnih agonista. Rezultati analize intracitoplazmatske ekspresije IFN-γ i IL-17 kod CD4+ T limfocita u kokulturama pretretiranih MoDĆ i alogenih CD4 + T limfocita prikazani su na Grafikonu 9B. MoDĆ stimulisane sa kombinacijom Poly (I:C) i kurdlana stimulisale su ekspanziju i jednostruko i dvostruko IFN-γ i IL-17 pozitivnih alogenih CD4 + T limfocita. Nasuprot tome, MoDĆ tretirane pojedinačnim agonistima su stimulisale ekspanziju jednostruko pozitivnih efektorskih IFN-γ+ ili IL-17+ T limfocita. Naredni cilj našeg istraživanja bilo je ispitivanje uticaja kombinovane primene Poly (I:C) i kurdlana na produkciju citokina, procentualnu zastupljenost i proliferaciju CD4 + CD45RA + i CD4+CD45RO+ T limfocita u kokulturi sa MoDĆ diferenciranim u prisustvu agonista. Produkcija IFN-γ i IL-17, određenih u supernatantima kokultura pretretiranih MoDĆ i naivnih i memorijskih (CD4+CD45RA+ i CD4+CD45RO+) CD4+ T limfocita, se razlikovala (Grafikon 10A). Rezultati 78 Grafikon 10. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i kurdlana na potencijal MoDĆ da utiču na produkciju citokina (A), procentualnu zastupljenost (B) i proliferaciju (C) CD4+CD45RA+ i CD4+CD45RO+ T limfocita u kokulturi Nezrele MoDĆ (1x104), kultivisane 2 dana u prisustvu Poly (I:C), kurdlana i njihove kombinacije ili u kontrolnom medijumu, su potom kultivisane sa sortiranim alogenim CD4 + CD45RA + i CD4+CD45RO+ T limfocitima (1x105) tokom 5 dana, u 200 μl kompletnog medijuma. A) Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracije IFN-γ i IL-17 u supernatantima kokultura merene su ELISA testom i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. B) Procenat CD4 + CD45RA + i CD4+CD45RO+ T limfocita u kokulturama sa ukupnim CD4 + T limfocitima je određen pre i 5 dana nakon kokultivacije sa MoDĆ diferenciranim u prisustvu agonista primenom anti-CD45RA-FITC i anti-CD45RO-PE monoklonskih antitela. Ćelijska fluorescenca je analizirana na protočnom citofluorimetru. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost procenta pozitivnih ćelija ± SD iz tri eksperimenta. C) U cilju određivanja stope proliferacije naivnih i memorijskih CD4 + T limfocita, purifikovani alogeni CD45RA+ i CD4+CD45RO+ T limfociti (1x105) su kokultivisani sa MoDĆ pretretiranim sa agonistima pri različitim odnosima MoDĆ/CD4 + T limfocita (1:10 i 1:80) tokom 5 dana. U medijum za kultivaciju ćelija 18h pre merenja proliferativnog odgovora je dodat [H3] timidin. Proliferativan odgovor je izmeren kao broj otkucaja u minuti (engl. counts per minute, cpm). Na grafiku su prikazani rezultati jednog reprezentativnog od tri slična eksperimenata kao indeks proliferacije ± SD. - pre kultivacije; 1-kontrola; 2-Poly (I:C); 3-kurdlan; 4-Poly (I:C)+kurdlan * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ Δ p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) # p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa kurdlanom Rezultati 79 MoDĆ tretirane sa Poly (I:C) su stimulisale produkciju IFN-γ od strane naivnih i memorijskih CD4 + T limfocita, ali je odgovor naivnih CD4+ T ćelija bio jači. Nasuprot tome, MoDĆ tretirane kurdlanom su stimulisale produkciju IFN-γ samo od strane memorijskih CD4 + T limfocita. MoDĆ stimulisane sa Poly (I:C) podstakle su produkciju IL-17 od strane memorijskih CD4+ T limfocita. MoDĆ tretirane kurdlanom su stimulisale produkciju IL-17 od strane obe podvrste CD4+ T ćelija, ali je efekat na memorijske CD4 + T ćelije bio izraženiji. MoDĆ kultivisane u prisustvu oba agonista su dovele do povećanja produkcije IFN-γ od strane naivnih i memorijskih CD4 + T ćelija i IL-17 od strane memorijskih CD4+ T ćelija. Uticaj MoDĆ stimulisanih kombinacijom Poly (I:C) i kurdlana na efektorske fukcnije CD4+ T limfocita nije bio rezultat promene procentualne zastupljenosti CD4 + CD45RA + i CD4 + CD45RO + T limfocita (Grafikon 10B) kao ni različite stope proliferacije ove dve podvrste (Grafikon 10C) CD4+ T limfocita. 4.4. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na diferencijaciju MoDĆ Kombinacija Poly (I:C) i TNF-α je korišćena za pripremu DĆ anti-tumorskih vakcina jer dovodi do snažne indukcije Th1 odgovora. Međutim, funkcionalne karakteristike MoDĆ stimulisanih na ovaj način nisu detaljno ispitane niti upoređene sa efektima pojedinačnih stimulatora. Stoga je jedan od ciljeva ovog istraživanja bio ispitivanje fenotipskih i funkcionalnih karakteristika MoDĆ tretiranih kombinacijom Poly (I:C) i TNF-α. 4.4.1. Efekat kombinovane primene optimalne koncentracije Poly (I:C) i TNF-α na fenotipska svojstva MoDĆ Fenotipske karakteristike MoDĆ stimulisanih kombinacijom Poly (I:C) i TNF- α analizirane su metodom protočne citometrije, a rezultati su prikazani kao Rezultati 80 procenat pozitivnih ćelija i srednja vrednost intenziteta fluorescence na Grafikonu 11. Grafikon 11. Fenotipske karakteristike MoDĆ stimulisanih optimalnom koncentracijom Poly (I:C), TNF-α i njihovom kombinacijom MoDĆ su dobijene iz humanih monocita nakon šestodnevne kultivacije u prisustvu GM-CSF (100 ng/ml) i IL-4 (20 ng/ml) i stimulacije optimalnom koncentracijom Poly (I:C), TNF-α i njihovom kombinacijom tokom 48h. Neadherentne ćelije su skupljene i obeležene antitelima specifičnim za ključne markere DĆ (anti-HLA-DR-PE, anti-CD86-PE, anti-CD80-FITC, anti-CD83-FITC, anti-CD40-FITC, anti-CD54-PE i anti- CCR7-FITC), a potom analizirane na protočnom citofluorometru. Rezultati iz jednog reprezentativnog eksperimenta od šest sa sličnim rezultatima su predstavljeni kao procenat pozitivnih ćelija (% ± SD) i kao srednja vrednost intenziteta fluorescence (engl. mean fluorescence intensity, mfi ± SD). * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ ▲ p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) Rezultati 81 Stimulacija MoDĆ sa Poly (I:C) dovela do povećanja ekspresije HLA-DR, CD80, CD86, CD83, CD40 i CD54. Fenotipskom analizom MoDĆ tretiranih sa TNF-α utvrđeno je da je stimulacija MoDĆ samo sa ovim citokinom dovela do umerenog povećanja ekspresije CD83 i CD86, dok je TNF-α u prisustvu Poly (I:C) doveo do dodatnog povećanja ekspresije CD80, CD86 i CD54. 4.4.2. Alostimulatorni potencijal MoDĆ stimulisanih kombinacijom optimalne koncentracije Poly (I:C) i TNF-α Proliferativni odgovor alogenih CD4 + T limfocita u mešanoj kulturi leukocita sa MoDĆ stimulisanih kombinacijom Poly (I:C) i TNF-α prikazan je na Grafikonu 12. Grafikon 12. Alostimulatorni kapacitet MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), TNF-α i njihove kombinacije u kokulturi sa alogenim CD4+ T limfocitima Na grafikonu je prikazan alostimulatorni potencijal MoDĆ diferenciranih u kontrolnom medijumu (kontrolne MoDĆ) ili u prisustvu Poly (I:C), TNF-α i njihove kombinacije. MoDĆ su kultivisane su u opadajućim dvostrukim razblaženjima (1x104-0.125x104) sa alogenim CD4+ T limfocitima (1x105) u toku 5 dana u 200 μl kompletnog medijuma. U medijum za kultivaciju ćelija 18h pre merenja proliferativnog odgovora je dodat [H3] timidin. Proliferativan odgovor je izražen kao broj otkucaja u minuti (engl. counts per minute, cpm). Na grafiku su prikazani rezultati jednog reprezentativnog od šest sličnih eksperimenata kao srednja vrednost cpm triplikata kulture ± SD. * p<0.05; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ ▲ p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) Rezultati 82 MoDĆ kultivisane u prisustvu Poly (I:C) su stimulisale proliferaciju alogenih CD4 + T limfocita. Sa druge strane, MoDĆ koje su kultivisane u prisustvu TNF-α su imale slab alostimulatorni potencijal. MoDĆ tretirane kombinacijom Poly (I:C) i TNF-α su inhibirale proliferaciju alogenih CD4+ T limfocita, pogotovo pri višim odnosima (1:10, 1:20 i 1:40) MoDĆ i CD4 + T limfocita, u poređenju sa efektom Poly (I:C). 4.4.3. Produkcija citokina od strane MoDĆ stimulisanih kombinacijom optimalne koncentracije Poly (I:C) i TNF-α Produkcija IL-12, IL-23 i IL-10 u kulturama MoDĆ stimulisanih kombinacijom optimalne koncentracije Poly (I:C) i TNF-α prikazana je na Grafikonu 13A. Stimulacija MoDĆ sa Poly (I:C) pospešila je produkciju IL-12, IL-23 i IL-10. Tretman MoDĆ sa TNF-α je stimulisao produkciju IL-23 i IL-10. Kombinovani efekat Poly (I:C) i TNF-α na produkciju citokina od strane MoDĆ se nije značajnije razlikovao od efekta samog Poly (I:C) sem u pogledu produkcije IL-12 koja je bila smanjena. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na sposobnost MoDĆ da usmere imunski odgovor procenjen je na osnovu produkcije citokina IFN-γ, IL-5, IL- 10 i IL-17 u kokulturama alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ. Rezultati su predstavljeni na Grafikonu 13B kao srednje vrednosti koncentracija, izraženih u ng/ml. MoDĆ stimulisane sa TNF-α stimulisale su povećanje produkcije IFN-γ i IL-17 i smanjenje produkcije IL-10 od strane CD4+ T ćelija u alogenoj kulturi. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na Th polarizujući potencija MoDĆ se ogledao u smanjenju produkcije svih ispitivanih citokina, pri čemu je inhibitorni uticaj bio najizraženiji u pogledu produkcije IFN-γ. Rezultati 83 Grafikon 13. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na produkciju citokina i Th polarizujući kapacitet MoDĆ MoDĆ su dobijene iz humanih monocita nakon šestodnevne kultivacije u prisustvu GM-CSF (100 ng/ml) i IL-4 (20 ng/ml) i stimulacije sa optimalnom koncentracijom Poly (I:C), TNF-α i njihovom kombinacijom tokom 48h. A)Koncentracije IL-12, IL-23 i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), TNF-α i njihove kombinacije, kao i u kontrolnom medijumu tokom 2 dana. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ±SD. B)Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracije IFN-γ, IL-5, IL-10 i IL-17 u supernatantima kokultura merene su ELISA testovima i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ ▲ p<0.05 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) Rezultati 84 4.4.4. Dozno- i vremenski- zavisan efekat kombinacije Poly (I:C) i TNF-α na produkciju citokina od strane MoDĆ Sledeći cilj istraživanja bilo je ispitivanje dozno- i vremenski-zavisnog efekta Poly (I:C) primenjenog u tri koncentracije (5 μg/ml, 25 μg/ml i 50 μg/ml), TNF-α i njihove kombinacije na produkciju citokina od strane MoDĆ. Rezultati su prikazani na Grafikonu 14. Rezultati 85 Grafikon 14. Produkcija citokina od strane MoDĆ diferenciranih u prisustvu različitih koncentracija Poly (I:C), TNF-α i njihovih kombinacija Koncentracije IL-12, IL-23 i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), TNF-α i njihovih kombinacija, kao i u kontrolnom medijumu tokom 2 dana. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ±SD. Rezultati 86 Poly (I:C) je ispoljio dozno-zavisni efekat na produkciju IL-12 posle stimulacije MoDĆ u toku 24h. Nakon prolongirane stimulacije MoDĆ sa Poly (I:C) u trajanju od 48h došlo je do smanjenja produkcije IL-12 i dozno-zavisni efekat više nije bio toliko izražen. Dodatak TNF-α tokom kultivacije MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) je ispoljio inhibitorni efekat na produkciju IL-12, pogotovo kada su MoDĆ stimulisane višim koncentracijama Poly (I:C) (25 μg/ml i 50 μg/ml). Poly (I:C) je takođe stimulisao povećanje produkcije IL-23 od strane MoDĆ. Ovaj efekat je bio izraženiji nakon 24h stimulacije MoDĆ sa Poly (I:C), a maksimum stimulacije je postignut u prisustvu koncentracije 25 μg/ml. Stimulacija MoDĆ kombinacijom Poly (I:C) i TNF-α je dovela do smanjenja produkcije IL-23 nakon 24h i 48h kultivacije sa tim da je efekat bio izraženiji ukoliko su primenjene više koncentracije Poly (I:C). Kultivacija MoDĆ u prisustvu Poly (I:C) i TNF-α je dovela do povećanja produkcije IL-10 bez značajne razlike nakon 24h i 48h kultivacije. Više koncentracije Poly (I:C) (25 μg/ml i 50 μg/ml) su se pokazale kao snažniji stimulatori produkcije IL-10 od strane MoDĆ. 4.4.5. Dozno- i vremenski- zavisan efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na Th polarizacionu aktivnost MoDĆ Dozno- i vremenski- zavisan efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na sposobnost MoDĆ da usmere imunski odgovor procenjen je na osnovu nivoa citokina IFN-γ, IL-17 i IL-10 u supernatantima kultura alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ postupkom koji je detaljno opisan u poglavlju Materijal i metode. Rezultati su prikazani na Grafikonu 15 kao srednje vrednosti koncentracija, izraženih u pg/ml, iz šest reprezentnativnih eksperimenta. Rezultati 87 Grafikon 15. Citokinski profil CD4+ T limfocita stimulisanih sa MoDĆ diferenciranim u prisustvu različitih koncentracija Poly (I:C), TNF-α i njihovih kombinacija Nezrele MoDĆ (1x104) su kultivisane 24h u kontrolnom medijumu ili u prisustvu Poly (I:C), TNF-α ili njihovih kombinacija tokom narednih 24h ili 48h. Nakon 2 dana kultivacije MoDĆ tretirane na opisan način su potom kultivisane sa sortiranim alogenim CD4 + T limfocitima (1x105) tokom 5 dana, u 200 μl kompletnog medijuma. Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracija citokina merena je ELISA testovima i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica i protočne citofluorimetrije. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. * p<0.05 ; *** p<0.005 u odnosu na odgovarajuće kontrole Rezultati 88 MoDĆ koje su stimulisane nižim koncentracijama Poly (I:C) (5 μg/ml i 25 μg/ml) tokom 24h su snažnije stimulisale produkciju IFN-γ od strane alogenih CD4+ T limfocita u poređenju sa najvišom koncentracijom Poly (I:C) (50 μg/ml). Ove razlike nisu uočene nakon stimulacije MoDĆ sa Poly (I:C) tokom 48h. Kada su MoDĆ stimulisane sa TNF-α i Poly (I:C) tokom 24h uočeno je značajno smanjenje produkcije IFN-γ u kokulturama sa 25 μg/ml i 50 μg/ml Poly (I:C). U kokulturama u kojima su MoDĆ stimulisane u prisustvu oba agonista tokom 48h nisu uočene statistički značajne razlike u pogledu produkcije IFN-γ kod svih primenjenih koncentracija Poly (I:C). MoDĆ kultivisane u prisustvu TNF-α tokom 24h su bile bolji stimulatori produkcije IL-17 u kokulturi, u poređenju sa MoDĆ tretiranim svim ispitivanim koncentracijama Poly (I:C). MoDĆ stimulisane najvišom koncentracijom Poly (I:C) u kombinaciji sa TNF-α tokom 24h su dovele do gotovo kompletnog sniženja produkcije IL-17 od strane alogenih CD4+ T limfocita. Produkcija IL-10 u kokulturama je pratila isti trend kao i produkcija IFN-γ, uključujući i uticaj MoDĆ stimulisanih najvišom koncentracijom Poly (I:C) (50 μg/ml) u kombinaciji sa TNF-α tokom 24h na smanjenje produkcije IL-10. Sa druge strane, MoDĆ tretirane svim ispitivanim koncentracijama Poly (I:C) i TNF-α i njihovim kombinacijama tokom 48h nisu ispoljile ovakav efekat na nivo produkovanog IL-10 od strane alogenih CD4+ T limfocita. 4.4.6. Efekat povezivanja CD40 molekula na produkciju citokina i Th polarizacionu aktivnost MoDĆ pretretiranih kombinacijom Poly (I:C) i TNF-α Sledeći korak u našem istraživanju je bio ispitivanje modulacije funkcije MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), TNF-α i njihovih kombinacija tokom interakcije sa T limfocitima posredovanoj CD40 molekulom. MoDĆ kultivisane u prisustvu Poly (I:C), TNF-α i njihovih kombinacija tokom 24h su stimulisane solubilnim CD40L tokom naredna 24h, postupkom koji je detaljno opisan u poglavlju Materijal i metode. Rezultati su prikazani na Grafikonu 16. Rezultati 89 Grafikon 16. Uticaj povezivanja CD40 molekula na produkciju citokina od strane MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), TNF-α i njihovih kombinacija Koncentracije IL-12, IL-23 i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), TNF-α, njihovih kombinacija i sCD40L, kao i u kontrolnom medijumu postupkom koji je detaljno opisan u poglavlju Materijali i metode. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. * p<0.05; *** p<0.005 u odnosu na odgovarajuće kontrole Rezultati 90 Uticaj interakcije CD40:CD40L na produkciju citokina od strane MoDĆ pretretiranih sa Poly (I:C), TNF-α i njihovom kombinacijom je bio najizraženiji u slučaju produkcije IL-12. Naime, nivoi IL-12 su bili povišeni u kulturama MoDĆ tretiranih sa sve tri primenjene koncentracije Poly (I:C) i samo sa TNF-α. Međutim, do povećanja produkcije IFN-γ je došlo samo u kokulturama alogenih CD4+ T limfocita i MoDĆ stimulisanih optimalnom koncentracijom Poly (I:C) (25 μg/ml) (Grafikon 17). Kombinacija TNF-α i najviše koncentracije Poly (I:C) je dovela do značajnog smanjenja produkcije IL-12 što se odrazilo na smanjenje produkcije IFN-γ od strane alogenih CD4 + T limfocita kokultivisanih sa MoDĆ tretiranim ovom kombinacijom. Povezivanje CD40 molekula na MoDĆ dovelo je do povećanja produkcije IL-23 u kulturama nezrelih kao i MoDĆ stimulisanih suboptimalnom koncentracijom Poly (I:C) (5μg/ml). Stimulacija MoDĆ samo sa optimalnom koncentracijom Poly (I:C) i samo sa TNF-α nije dovela do promene u produkciji IL-23, ali je u kokulturi ovih ćelija sa CD4 + T limfocitima došlo do povećanja produkcije IL-17. Interakcija CD40 i CD40L je pospešila produkciju IL-23 od strane MoDĆ diferenciranih u prisustvu najniže ispitivane koncentracije Poly (I:C) i TNF-α što je bilo praćeno povećanjem produkcije IL-17 u kokulturi sa CD4+ T limfocitima. Povezivanje CD40 molekula na MoDĆ pretretiranim najvišom ispitivanom koncentracijom Poly (I:C) i TNF-α je dovelo do smanjenja produkcije IL-23 što se odrazilo na značajno smanjenje produkcije IL-17 u kokulturi MoDĆ stimulisanih na ovaj način i alogenih CD4+ T limfocita. Povezivanje CD40 molekula na MoDĆ nije dovelo do značajne promene u pogledu produkcije IL-10 sa izuzetkom MoDĆ pretretiranih najvišom ispitivanom koncentracijom Poly (I:C) i TNF-α. Naime, u ovim kulturama je detektovano značajno povećanje nivoa IL-10. Ovaj efekat se ispoljio i u kokulturi ovih ćelija sa alogenim CD4 + T limfocitima. Povećanje produkcije IL-10 je uočeno i u alogenoj kulturi MoDĆ stimulisanih srednjom ispitivanom koncentracijom Poly (I:C) i TNF-α. Rezultati 91 Grafikon 17. Citokinski profil u kokulturi CD4+ T limfocita i MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C), TNF-α, njihovih kombinacija i sCD40L Nezrele MoDĆ (1x104) su kultivisane 24h u kontrolnom medijumu ili u prisustvu Poly (I:C), TNF-α ili njihove kombinacije i tokom naredna 24h u prisustvu solubilnog CD40L. Nakon 2 dana kultivacije MoDĆ tretirane na opisan način su potom kultivisane sa sortiranim alogenim CD4 + T limfocitima (1x105) tokom 5 dana, u 200 μl kompletnog medijuma. Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracija citokina merena je ELISA testovima i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica i protočne citofluorimetrije. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ±SD. * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.005 u odnosu na odgovarajuće kontrole Rezultati 92 4.5. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na funkcionalne karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) Ispitivanje modulacije funkcije MoDĆ tokom interakcije sa T limfocitima posredovanoj CD40 molekulom i IFN-γ je bio sledeći cilj našeg istraživanja. Nezrele MoDĆ i MoDĆ koje su stimulisane optimalnom koncentracijom Poly (I:C) tokom 24h su kultivisane naredna 24h u prisustvu J558 ćelija transfektovanim sa CD40L, odnosno u prisustvu IFN-γ. 4.5.1. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na produkciju citokina od strane MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) U supernatantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu optimalne koncentracije Poly (I:C) ili u medijumu, sa ili bez J558 ćelija odnosno IFN-γ, su određeni nivoi IL-10, IL-12 i IL-23. Rezultati prikazani na Grafikonu 18 pokazuju da su nezrele MoDĆ produkovale veoma niske nivoe sva tri ispitivana citokina. MoDĆ diferencirane u prissustvu Poly (I:C) su u poređenju sa nezrelim MoDĆ produkovale povećane nivoe IL-10 i IL-12, dok je nivo IL-23 bio nepromenjen. Povezivanje CD40 molekula na nezrelim MoDĆ je bilo praćeno povećanjem produkcije IL-12 i IL-23. Nasuprot tome, aktivacija CD40 molekula na MoDĆ pretretiranim sa Poly (I:C) je dovela do dvostrukog povećanja produkcije IL-12, dvadesetostrukog povećanja produkcije IL-23 i trostrukog povećanja produkcije IL-10. Kultivacija nezrelih MoDĆ u prisustvu IFN-γ je stimulisala produkciju IFN-γ na isti način kao i tretman MoDĆ sa Poly (I:C), a nivoi IL-23 i IL-10 su ostali nepromenjeni. Dodatak IFN-γ kulturama MoDĆ pretretiranih sa Poly (I:C) je doveo do smanjenja produkcije IL-12 i sedmostrukog povećanja produkcije IL-10. Rezultati 93 Grafikon 18. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na produkciju citokina od strane MoDĆ diferenciranih bez i u prisustvu Poly (I:C) Koncentracije IL-12, IL-23 i IL-10 određivane su ELISA testovima u superantantima kultura MoDĆ diferenciranih u prisustvu optimalne koncentracije Poly (I:C) ili u medijumu, sa ili bez J558 ćelija odnosno IFN-γ (5 ng/ml), kao i u kontrolnom medijumu tokom 2 dana. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ± SD. 1-kontrola; 2-CD40L; 3- IFN-γ * p<0.05; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ ΔΔΔ p<0.005 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) 4.5.2. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na alostimulatornu aktivnost MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) Proliferativan odgovor alogenih CD4 + T limfocita u kokulturama sa MoDĆ diferenciranih u prisustvu optimalne koncentracije Poly (I:C) ili u medijumu, sa ili bez J558 ćelija odnosno IFN-γ prikazan je na Grafikonu 19. Rezultati 94 Grafikon 19. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na alostimulatorni kapacitet MoDĆ diferenciranih bez i u prisustvu Poly (I:C) Na grafikonu je prikazan alostimulatorni potencijal MoDĆ diferenciranih u medijumu (kontrolne MoDĆ) ili u prisustvu Poly (I:C), sa ili bez J558 ćelija odnosno IFN-γ. MoDĆ su kultivisane su u opadajućim dvostrukim razblaženjima (1x104-0.125x104) sa alogenim CD4+ T limfocitima (1x105) u toku 5 dana u 200 μl kompletnog medijuma. U medijum za kultivaciju ćelija 18h pre merenja proliferativnog odgovora je dodat [H3] timidin. Proliferativan odgovor je izražen kao broj otkucaja u minuti (engl. counts per minute, cpm). Na grafiku su prikazani rezultati jednog reprezentativnog od šest sličnih eksperimenata kao srednja vrednost cpm triplikata kulture ± SD. a-1:10; b-1:20; c-1:40; d-1:80 * p<0.05; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ Δ p<0.05; ΔΔΔ p<0.005 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) Nezrele MoDĆ su pokazale umereni potencijal za stimulaciju proliferacije alogenih CD4 + T limfocita koji je progresivno opadao sa povećanjem odnosa MoDĆ/CD4 + T limfocita. MoDĆ diferencirane u prisustvu Poly (I:C) su imale najvišu alostimulatornu aktivnost pri najvećem odnosu MoDĆ/CD4 + T limfocita. Povezivanje CD40 molekula na nezrelim MoDĆ ili tretman MoDĆ sa IFN-γ je doveo do značajnog povećanja njihovog alostimulatornog potencijala. Aktivacija CD40 molekula na MoDĆ kultivisanih u prisustvu Poly (I:C) odnosno dodatak IFN-γ ovim kulturama su doveli do dodatnog povećanja proliferacije alogenih CD4 + T limfocita. Rezultati 95 4.5.3. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na Th polarizacionu aktivnost MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) Efekti povezivanja CD40 molekula i IFN-γ na Th polarizacionu aktivnost kontrolnih i MoDĆ tretiranih optimalnom koncentracijom Poly (I:C) prikazani su na Grafikonu 20. Grafikon 20. Uticaj IFN-γ i povezivanja CD40 molekula na Th polarizacionu aktivnost MoDĆ diferenciranih bez i u prisustvu Poly (I:C) Nezrele MoDĆ (1x104), kultivisane 2 dana u prisustvu Poly (I:C) ili u medijumu, sa ili bez J558 ćelija odnosno IFN-γ, su potom kultivisane sa CD4+ sortiranim alogenim T limfocitima (1x105) tokom 5 dana, u 200 μl kompletnog medijuma. Forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) (20ng/ml) i jonomicin (500 ng/ml) su dodati 8h pre isteka kulture. Koncentracija citokina merena je ELISA testovima i metodom za detekciju citokina pomoću imunofluorescentnih kuglica i protočne citofluorimetrije. Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost koncentracija iz šest eksperimenata sa različitim donorima ±SD. *p<0.05; *** p<0.005 u poređenju sa kontrolnim MoDĆ ΔΔΔ p<0.005 u poređenju sa MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) Stimulacija MoDĆ optimalnom koncentracijom Poly (I:C) je dovela do povećanja produkcije IFN-γ i smanjenja produkcije IL-5, dok su nivoi IL-17 i IL-10 ostali nepromenjeni. Aktivacija CD40 molekula na nezrelim MoDĆ je ispoljila sličan efekat kao tretman sa Poly (I:C), sa tim da nije došlo do promene nivoa IL-5. Nasuprot tome, aktivacija CD40 molekula na MoDĆ koje su pretretirane sa Poly (I:C) Rezultati 96 dovela je do povećanja produkcije IL-17 kao i sniženja nivoa IFN-γ i IL-10. Prisustvo IFN-γ u kulturama nezrelih MoDĆ je dovelo do smanjenja produkcije IL-17 i IL-5 i nije uticalo na produkciju IFN-γ od strane ovih ćelija. Dodatna stimulacija sa IFN-γ MoDĆ pretretiranih sa Poly (I:C) je dovela do značajnog povećanja produkcije IL-10 i smanjenja nivoa IFN-γ dok su nivoi IL-17 i IL-5 ostali nepromenjeni. 97 5. DISKUSIJA Diskusija 98 Zahvaljujući svojoj jedinstvenoj ulozi u stimulaciji specifičnog imuniteta, uključujući i razvoj anti-tumorskog imunskog odgovora, DĆ predstavljaju jedno od najznačajnijih savremenih oruđa u imunoterapiji tumora. Uprkos tome što je sproveden veliki broj studija u kojima je opisano korišćenje DĆ za terapiju različitih vrsta malignih tumora još uvek nisu standardizovani protokoli za pripremu DĆ za kliničku upotrebu. Za poboljšanje protokola imunoterapije tumora primenom DĆ neophodna su dalja temeljna proučavanja imunobiologije DĆ, postupaka za produkciju ovih ćelija, kao i protokola za njihovu stimulaciju. Kako je procenat DĆ u perifernoj krvi veoma mali (oko 0,5% od ukupnih mononuklearnih ćelija) usavršavanjem postupaka za izolaciju DĆ i njihovo nastajanje u in vitro uslovima od prekursora razvijeni su različiti načini pripreme ovih ćelija. Najpogodniji metod u pogledu jednostavnosti i velikog prinosa DĆ u humanom sistemu je dobijanje DĆ monocitnog porekla kultivacijom adherentne frakcije mononuklearnih ćelija iz buffy coat-a u prisustvu GM-CSF i IL-4 (Sallusto i Lanzavecchia, 1994). Ovaj metod predstavlja pogodan model za ispitivanje uticaja različitih faktora na diferencijaciju i maturaciju DĆ u in vivo uslovima (Zou i Tam, 2002). Stoga smo ovaj metod koristili u našim istraživanjima. U prethodnoj studiji naše istraživačke grupe (Colic i sar., 2003) kao i u brojnim publikacijama (Verdijk i sar., 1999; Lapointe i sar., 2000; Rouas i sar., 2004; Roses i sar., 2008) je pokazano da su MoDĆ dobijene na ovaj način nezrele, sa umerenim potencijalom da stimulišu proliferaciju alogenih CD4 + T limfocita u mešanoj lekocitnoj kulturi i polarizuju imunski odgovor ka Th1 i Th17 pravcu. Ove karakteristike in vitro dobijenih nezrelih MoDĆ su u skladu sa saznanjima da nezrele MoDĆ imaju slab potencijal da stimulišu imunski odgovor što ograničava njihovu primenu u kliničkim ispitivanjima, pogotovo kao anti-tumorskih vakcina (McIlroy i Gregoire, 2003) . Biološki potencijal DĆ za in vivo stimulaciju anti-tumorskog imunskog odgovora još uvek nije maksimalno iskorišćen. Zbog toga je značajan cilj imunoterapije tumora poboljšanje protokola za stimulaciju DĆ u cilju stvaranja dovoljnog broja imunogenih DĆ stabilnih fenotipskih karakteristika koje produkuju visok nivo IL-12, ključnog citokina za stimulaciju efikasnog Th1 odgovora i nastanak citotoksičnih T limfocita koji su od presudnog značaja za efikasnu Diskusija 99 imunoterapiju tumora (Ikeda i sar., 2002; DeVries i sar., 2003). DĆ se odlikuju izuzetnom funkcionalnom plastičnošću koja zavisi od velikog broja faktora uključujući vrstu patogena sa kojima se sreću, receptora za prepoznavanje molekulskih obrazaca patogena koji se aktiviraju, subpopulaciju DĆ, mikrosredinu u kojoj se DĆ nalaze, ka i povratne signale poreklom od T ćelija (Banchereau i sar., 2000). U tom kontekstu, sposobnost DĆ da primaju signale sa različitih receptora koje potom integrišu i realizuju kroz jedinstveni odgovor se sve više koristi za generisanje zrelih DĆ kombinovanom primenom različitih agonista PRR i citokina, što je i bio predmet ovog istraživanja. U ovom radu su ispitivane fenotipske i funkcionalne karakteristike humanih DĆ monocitnog porekla stimulisanih sa agonistima endozomnih TLR i to pretežno TLR3. Pored detaljnog proučavanja modulatornog svojstva TLR3 agoniste, ispitivani su i modulatorni efekti kombinacije TLR3 i TLR7 agonista, kombinacija agonista TLR3 i dektin-1 receptora kao i kombinacija TLR3 agoniste, liganda za CD40 molekula i citokina (TNF-α i IFN- γ). 5.1. Uticaj Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ Prvi korak u ovom istraživanju bilo je detaljno ispitivanje modulatornog efekta Poly (I:C) na fenotipska i i funkcionalna svojsta MoDĆ. Poly (I:C) je sintetski analog dvolančane RNK koji se vezuje za TLR3, PRR koji je značajno ispoljen na nezrelim MoDĆ (Muzio i sar., 2000). Ovaj TLR3 agonist oponaša molekulski obrazac patogena i po vezivanju za receptor signalizira prisustvo infektivnog agensa što je praćeno aktivacijom DĆ i pokretanjem mehanizama za zaštitu od virusne infekcije (Cella i sar., 1999b). Poznato je da Poly (I:C) dovodi do fenotipskog sazrevanja MoDĆ koje se ogleda u povećanju ekspresije HLA-DR molekula, kostimulatornih (CD80, CD86 i CD40) i adhezivnih molekula (CD54) kao i markera maturacije (CD83) (Cella i sar., 1999b; Rouas i sar., 2004), što smo pokazali i u našem istraživanju. Navedeni molekuli koji se povećano eksprimiraju učestvuju u formiranju imunološke sinapse između DĆ i T limfocita preko koje se integrišu svi signali i obezbeđuje adekvatan imunski odgovor posredovan efektorskim T limfocitima (Grakoui i sar., 1999; Dustin Diskusija 100 i sar., 2006). HLA-DR molekul zajedno sa kostimulatornim i adhezivnim molekulima učestvuje u prezentaciji antigena, prenosu aktivacionih signala i stabilizaciji interakcije DĆ i CD4 + T limfocita (Dubey i sar., 1995; Vremec i Shortman, 1997; Banchereau i Steinman, 1998; Banchereau i sar., 2000; Lipscomb i Masten, 2002). HLA-DR prezentuju antigene CD4+ T limfocitima, obezbeđujući antigensku specifičnost ćelijskog imunskog odgovora i prenose signal 1 za aktivaciju T limfocita. Za aktivaciju T limfocita neophodan je i kostimulatorni signal, signal 2, koga obezbeđuju CD80 i CD86. Stepen ekspresije CD80 i CD86 zavisi od stadijuma zrelosti DĆ i povećava se stepenom njihove zrelosti (Lutz i Schuler, 2002). Vezivanje CD80 i CD86 za odgovarajuće receptore na T limfocitima, CD28 ili CTLA-4 (CD152), je od ključnog značaja za aktivaciju ili regulaciju T ćelijskog imunskog odgovora, ali ostvaruje i povratne efekte na DĆ (Logue i Sha, 2004; Bhatia i sar., 2006). CD40 se konstitutivno eksprimira na površini DĆ, ali se njegova ekspresija veoma povećava po aktivaciji ćelija (Steinman i Hemmi, 2006). CD54 doprinosi povezivanju DĆ i T limfocita i obezbeđuje stabilan kontakt između T-ćelijskog receptora i MHC-peptid kompleksa (Hart i Prickett, 1993). Takođe, u ovom istraživanju smo pokazali da Poly (I:C) dovodi do povećanja ekspresije CCR7 na MoDĆ, što je još jedna odlika zrelih DĆ prethodno pokazana od strane Sallusto i saradnika (Sallusto i sar., 1998). Specifični ligandi CCR7 molekula, CCL19 i CCL21, eksprimirani su od strane endotelnih ćelija limfnih venula, u postkapilarnim venulama sa visokim endotelom u limfnim čvorovima i T ćelijskim zonama limfoidnih organa (Gunn i sar., 1998; Willimann i sar., 1998; Luther i sar., 2000). Dakle, CCL19 i CCL21 usmeravaju migraciju zrelih DĆ koje ispoljavaju CCR7 ka perifernim limfoidnim organima u kojima dolazi do njihove interakcije sa antigen specifičnim, naivnim ili memorijskim T lifocitima (Sozzani, 2005; Alvarez i sar., 2008; Lukacs-Kornek i sar., 2008; Förster i sar., 2008). U cilju daljeg proučavanja uticaja Poly (I:C) na diferencijaciju MoDĆ ispitivana je njihova sposobnost da stimulišu proliferaciju alogenih CD4 + T limfocita u MLR. Aloreaktivnost se zasniva na prepoznavanju alogenih epitopa peptid-MHC kompleksa na površini DĆ od strane T-ćelijskog receptora T limfocita genetski različitih jedinki iste vrste. Usled velike polimorfnosti MHC gena aloreaktivnost predstavlja jednu od najjačih imunskih reakcija. Stoga se alogena MLR koristi za Diskusija 101 ispitivanje stimulatornog potencijala DĆ (Jeras i sar., 2005). Tokom MLR, DĆ i CD4+ T limfociti stupaju u međusobne interakcije posredovane membranskim i solubilnim molekulima, što rezultuje odgovarajućim proliferativnim odgovorom T limfocita. T limfociti integrišu signale koji im omogućavaju aktivaciju sa T-ćelijskog receptora, kostimulatornih molekula i citokinskih receptora. U zavisnosti od jačine ukupnog signala, koji zavisi od broja DĆ, koncentracije antigena, aviditeta T-ćelijskog receptora za odgovarajući peptid-MHC kompleks i trajanja interakcije DĆ i T limfocita, T limfociti sukcesivno prolaze kroz procese proliferacije, diferencijacije i ćelijske smrti. Slab signal dovodi do proliferacije naivnih T limfocita koji se ne diferenciraju u efektorske ćelije, dok previše jak signal dovodi do aktivacijom indukovane ćelijske smrti (Langenkamp i sar., 2002; Sallusto i Lanzavecchia, 2002). Naši rezultati ukazuju na to da kontrolne, netretirane, MoDĆ imaju umeren potencijal za stimulaciju proliferacije alogenih CD4 + T limfocita. Stimulacija MoDĆ sa Poly (I:C) je dovela do povećanja alostimulatornog kapaciteta MoDĆ i to pri nižim odnosima MoDĆ i alogenih CD4 + T limfocita (1:40 i 1:80). Pri ostalim odnosima nije došlo do statistički značajne promene alostimulatornog kapaciteta. Povećani alostimulatorni potencijal MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) je odraz opisanih fenotipskih karakteristika MoDĆ. Rezultati dosadašnjih istraživanja su pokazali da MoDĆ kultivisane u prisustvu Poly (I:C) produkuju povišen nivo IL-12 i tako usmeravaju imunski odgovor u Th1 pravcu, kako in vitro (Verdijk i sar., 1999) tako i in vivo (Rouas i sar., 2004). Sa druge strane, produkuju nizak nivo IL-10, anti-inflamatornog citokina koji usmerava efektorske funkcije CD4 + T limfocita ka Th2 (Taga i Tosato, 1992) i imunoregulatornom profilu (Smits i sar., 2005). Rezultati našeg istraživanja su saglasni sa prethodno publikovanim i dodatno je pokazano da MoDĆ stimulisane u prisustvu Poly (I:C) produkuju visoke nivoe IL-23 i IL-27, članova IL-12 familije, kao i proinflamatornih citokina, TNF-α i IL-6. Pored izrazite strukturne homologije članova IL-12 familije, svaki od ovih citokina ima sebi svojstvene funkcionalne karakteristike (Hunter, 2005). Stimulišući produkciju IFN-γ i pospešujući citolitičku aktivnost NK ćelija, IL-12 ima ključnu ulogu u aktivaciji ranog urođenog imunskog odgovora protiv intracelularnih patogena i predstavlja ključni faktor aktivacije Diskusija 102 ćelijskog imunskog odgovora pospešivanjem diferencijacije CD4 + T limfocita u Th1 limfocite (Steinman i Hemmi, 2006). Pored toga, IL-12 je od ključnog značaja za anti-tumorski imunski odgovor kao signal 3 za aktivaciju T limfocita (Valenzuela i sar., 2002) jer zajedno sa signalom 1 i signalom 2 omogućava polarizaciju imunskog odgovora u Th1 pravcu i razvoj tumor-specifičnih CD8+ T limfocita sa citotoksičnim svojstvima (Xu i sar., 2003). IL-27 ima ulogu u potenciranju efekta IL-12 koju ostvaruje direktno, povećanjem ekspresije IL-12Rβ2 na površini ovih ćelija (Lucas i sar., 2003; Kamiya i sar., 2004) i indirektno, povećanjem ekspresije IL-18 od strane aktiviranih monocita, koji deluje sinergistički sa IL-12 u indukciji diferencijacije Th1 ćelija (Pflanz i sar., 2004). Sa druge strane, IL-23 indukuje proliferaciju memorijskih i efektorskih Th17 limfocita (McKenzie i sar., 2005; Sallusto i Lanzavecchia, 2009; Yu i sar., 2010). Postoje indikacije da IL-23, pored IL-12, može ispoljiti povoljne efekte u imunoterapiji tumora (Zheng i sar., 2008). U skladu sa profilom produkovanih citokina MoDĆ tretirane sa Poly (I:C) su stimulisale Th1 i Th17 imunski odgovor, a inhibirale Th2 odgovor, što je procenjeno na osnovu produkcije IFN-γ, IL-17 i IL-5 u kokulturi sa alogenim CD4+ T limfocitima. Ovi nalazi su u skladu sa konceptom recipročne regulacije Th1/Th2 odgovora (Glimcher i Murphy, 2000) i prethodno publikovanim rezultatima o uticaju dvolančane RNK na odnos Th1/Th2 odgovora (Benwell i sar., 2010). Funkcionalni značaj Th17 odgovora stimulisanog usled prisustva TLR3 agonista predstavlja novi fenomen koji bi trebalo dalje ispitivati. 5.2. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i loksoribina na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ Sinergistički efekat kombinovane primene TLR agonista je predmet brojnih eksperimentalnih i kliničkih studija u kojima se traga za najboljim protokolima za produkciju DĆ vakcina u terapiji različitih tipova malignih tumora. Sprovedena su brojna istraživanja u cilju ispitivanja funkcionalnih i fenotipskih karakteristika MoDĆ nakon istovremene aktivacije većeg broja TLR (Napolitani i sar., 2005; Gautier, i sar., 2005; Warger i sar., 2006; Mäkelä i sar., 2009). Pokazano je da Diskusija 103 kooperacija TLR kod DĆ stimuliše povećanje ekspresije gena za TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IL-12, IL-23 i ciklooksigenaze 2 (engl. cyclooxygenase-2, COX2) kao i njihovu sintezu i oslobađanje, u poređenju sa efektima pojedinačnih agonista (Gautier i sar., 2005; Napolitani i sar., 2005; Trinchieri i Sher, 2007). Napolitani i saradnici su među prvima opisali snažan sinergistički efekat kombinovane primene TLR agonista na produkciju citokina od strane MoDĆ. Rezultati njihovog istraživanja su pokazali sinergistički efekat kombinovane primene TLR3 i TLR4 agonista sa TLR7/8 agonistom u produkciji IL-12 i IL-23 od strane humanih MoDĆ koje su ispoljavale izraženiji Th1 polarizujući potencijal od MoDĆ stimulisanih sa pojedinačnim agonistima (Napolitani i sar., 2005). TLR3, zajedno sa TLR7, TLR8 i TLR9 čine TLR9 subfamiliju receptora koja predstavlja endozomne TLR specifične za nukleinske kiseline. TLR7 i TLR8, receptori za koje se vezuje jednolančana RNK i određene male interferirajuće RNK, zajedno sa TLR3 aktiviraju urođeni imunski odgovor nakon infekcije virusima (Diebold i sar., 2004) (Heil i sar., 2003). Pored jednolančane RNK i pojedina sintetska jedinjenja, poput rezikvimoda, CL075 i CL097 predstavljaju TLR7/8 agoniste (Lee i sar., 2003). MoDĆ stimulisane ovim jedinjenjima se diferenciraju u zrele ćelije koje polarizuju imunski odgovor u Th1 pravcu (Duraisingham i sar., 2009). U cilju razgraničavanja efekata aktivacije TLR7 i TLR8 receptora bilo je neophodno ispitati efekte primene selektivnih TLR7 i TLR8 agonista. Do sada su identifikovane dve grupe selektivnih TLR7 agonista, imidazokvinolini (imikvimod i gardikvimod) i derivati guanozina (7-alil-7,8-dihidro-8-okso-guanozin (loksoribin) i 7-tia-8-okso-guanozin (7-TOG)) (Lee i sar., 2003; Heil i sar., 2003). Podaci koji se odnose na efekte ovih agonista na MoDĆ su kontraverzni kao i pitanje ekspresije TLR7 u MoDĆ. Naime, ekspresija TLR7 je visoka u pDĆ (Gorden i sar., 2005), ali su nivoi ekspresije ovog receptora u MoDĆ niski ili nedetektabilni (Jarrossay i sar., 2001; Kadowaki i sar., 2001). Takođe, pokazano je da selektivni TLR7 ligandi mogu da stimulišu samo preaktivirane MoDĆ (Severa i sar., 2007; Lombardi i sar., 2009). Rezultati naših istraživanja u kojima smo koristili selektivni TLR7 agonist, loksoribin, su pokazali da primena loksoribina dovodi do diferencijacije, sazrevanja i stimulacije alostimulatorne sposobnosti MoDĆ uz polarizaciju ka Th1 i Th17 Diskusija 104 imunskom odgovoru, pri čemu su ovi efekti delom rezultat povećanja ekspresije TLR7 u tako tretiranim MoDĆ (Dzopalic i sar., 2010). Imajući u vidu rezultate istraživanja Napolitani i saradnika (Napolitani i sar., 2005) želeli smo da primenom selektivnih agonista detaljno ispitamo na koji način koaktivacija TLR3 i TLR7 moduliše fenotipske karakteristike, produkciju citokina i Th polarizujući potencijal MoDĆ. MoDĆ su stimulisane sa kombinacijama suboptimalne (10 µg/ml) i optimalne (25 µg/ml) koncentracije Poly (I:C) i suboptimalne (34 µg/ml) i optimalne (85 µg/ml) koncentracije loksoribina. Stimulisanje MoDĆ suboptimalnim koncentracijama Poly (I:C) i loksoribina je dovelo do njihovog diferenciranja u fenotipski zrele ćelije koje polarizuju imunski odgovor ka Th1 pravcu što je procenjeno na osnovu povećane produkcije IFN-γ u kokulturi ovako tretiranih MoDĆ i alogenih CD4+ T ćelija. Povećanje produkcije IFN- γ u kokulturi se može objasniti povećanom produkcijom IL-27 i IL-12 od strane samih tretiranih MoDĆ, za koje je pokazano udruženo dejstvo u ekspanziji i preživljavanju Th1 ćelija (Lucas i sar., 2003; Kamiya i sar., 2004; Pflanz i sar., 2004; Owaki i sar., 2006). Ovako pripremljene MoDĆ su indukovale i povećanu produkciju IL-17 od strane CD4+ T ćelija, što je u skladu sa detektovanim značajnim povećanjem produkcije IL-23 od strane MoDĆ stimulisanih sa kombinacijom suboptimalnih koncentracija oba agonista u poređenju sa vrednostima IL-23 koji su produkovale MoDĆ stimulisane pojedinačnim agonistima. Naime, poznato je da je IL-23 neophodan za održanje Th17 ćelija (McKenzie i sar., 2005; Sallusto i Lanzavecchia, 2009; Yu i sar., 2010). MoDĆ diferencirane u prisustvu optimalnih koncentracija Poly (I:C) i loksoribina usmeravale su imunski odgovor ka Th1 pravcu indukujući produkciju značajne količine IFN-γ od strane alogenih CD4+ T ćelija. Takođe, na ovaj način stimulisane MoDĆ pokazale su smanjen potencijal za usmeravanje CD4 + T limfocita ka Th2 i Th17 pravcu, u poređenju sa efektom pojedinačnih agonista. Pokazani efekti kombinovane primene optimalnih koncentracija Poly (I:C) i loksoribina na Th polarizacioni potencijal MoDĆ su u skladu sa povećanom produkcijom IL-12 i IL-27 i smanjenom produkcijom IL-23 od strane MoDĆ tretiranih na ovaj način. Pored Diskusija 105 pokazane uloge IL-27 u potenciranju uticaja IL-12 na usmeravanje CD4+ T limfocita ka Th1 profilu (Lucas i sar., 2003; Kamiya i sar., 2004; Pflanz i sar., 2004; Owaki, i sar., 2006; Molle i sar., 2007), visok nivo IL-27 utiče na smanjenje produkcije IL-4, a time i diferencijaciju Th2 ćelija (Lucas i sar., 2003). Takođe, povećan nivo IL-27 utiče na smanjenje produkcije IL-23, a samim tim i smanjenja potencijala MoDĆ za usmeravanje CD4 + T limfocita ka Th17 pravcu (Yoshimura i sar., 2006). Sa druge strane, efekat kombinovane primene optimalnih koncentracija Poly (I:C) i loksoribina na fenotip MoDĆ se ogledao u smanjenju ekspresije HLA-DR i kostimulatornih molekula, u poređenju sa efektima pojedinačnih agonista. Sličan efekat su opisali Napolitani i saradnici koji su ukazali na moguću ulogu koligacije kao “sigurnosne šifre” koja moduliše antigen-prezentujući potencijal MoDĆ i dovodi do razvoja efektorskih T limfocita samo samo u slučaju prisustva patogena (Napolitani i sar., 2005). MoDĆ diferencirane u prisustvu suboptimalne koncentracije Poly (I:C) i optimalne koncentracije loksoribina su ispoljile najizraženiji Th1 polarizujući potencijal što je u skladu sa detektovanim povećanjem produkcije IL-12 od strane ovako stimulisanih MoDĆ. Ovi rezultati potvrđuju da MoDĆ imaju veliki potencijal za produkciju IL-12 koji se ispoljava samo kao odgovor na višestuke stimuluse koji deluju istovremeno (Napolitani i sar., 2005). Smatra se da je sinergistički efekat koaktivacije TLR3 i TLR7 ostvaren na nivou signalnih puteva. Naime, stimulacija TLR na DĆ, sa izuzetkom TLR3, dovodi do konformacionih promena receptora, angažovanja adaptorskog proteina MyD88 (engl. myeloid differentiation primary response gene 88) i pokretanja signalne kaskade koja rezultuje aktivacijom transkripcionih faktora NF-κB i regulatora transkripcije interferona (engl. IFN regulatory factor 5, IRF5). Alternativni signalni put se pokreće aktivacijom TLR-7,-8 i -9, koji takođe angažuju MyD88, ali pored NF- κB aktiviraju i IRF7. Sa druge strane, aktivacija TLR3 pokreće signalni put nezavisan od MyD88 u kome se umesto ovog molekula angažuje adaptor koji sadrži Toll/IL-1R domen (engl. Toll/IL-1R domain-containing adaptor, TICAM-1; TRIF). U MyD88- nezavisnom putu dolazi do aktivacije NF-κB, aktivacionog proteina-1 (engl. activator protein, 1 AP-1), IRF3 i ekspresije IFN-β i IFN-inducibilnih gena (Gautier i Diskusija 106 sar., 2005; Honda i sar., 2005; Beutler i sar., 2006; Matsumoto i Seya, 2008; Mäkelä i sar., 2009; Kawai i Akira, 2010). Značaju ulogu u kooperaciji TLR receptora mogu imati IFN tipa I koji delovanjem na autokrini, odnosno parakrini način pojačavaju efekte koaktivacije TLR (Slika 8). Naime, sinteza IFN-β zavisna od aktivacije TLR3 indukuje sintezu IRF7. IRF7 se aktivira nakon stimulacije TLR7 i pospešuje dalju produkciju IFN tipa I čime se uspostavlja pozitivna povratna sprega i uspostavlja stabilna, pojačana produkcija ovih citokina (Gautier i sar., 2005; Malissen i Ewbank, 2005). Slika 8. FN tipa I delovanjem na autokrini, odnosno parakrini način pojačavaju efekte koaktivacije TLR Dakle, MyD88-nezavisni put pospešuje MyD88-zavisne funkcija DĆ i aktivaciju T ćelija. Naime, signalni put nezavisan od MyD88 odgovara signalu 2 neophodnom za aktivaciju T ćelija, dok signalni put zavisan od MyD88 predstavlja signal 3 koji određuje tip T ćelijskog odgovora (Zhu i sar., 2008). Pretpostavlja se da Diskusija 107 je ova interakcija uspostavljena da bi se izbegla nepotrebna aktivacija imunskog odgovora, ali da se u isto vreme može uspostaviti anti-tumorski imunski odgovor. 5.3. Uticaj kurdlana i njegove kombinacije sa Poly (I:C) na diferencijaciju nezrelih humanih MoDĆ U sklopu ovog istraživanja ispitivan je i uticaj koaktivacije TLR3 i dektin-1 receptora primenom odgovarajućih agonista, Poly (I:C) i kurdlana. Primena ove kombinacije agonista PRR ima prevashodno imunoterapeutski značaj jer do sada nije detektovan patogen koji ispoljava ligande za ova dva PRR. Transmembranski receptor dektin-1 prepoznaje β-glukane (Ariizumi i sar., 2000; Taylor i sar., 2002) od kojih je izgrađeno oko 50% ćelijskog zida gljivica. Uloga dektina-1 u modulaciji bioloških funkcija humanih DĆ je publikovana u svega nekoliko studija do sada (Skrzypek i sar., 2009; Agrawal i sar., 2010; Higashi i sar., 2010). Pokazano je da mišje i humane DĆ stimulisane kurdlanom povećavaju ekspresiju kostimulatornih molekula i produkuju brojne proinflamatorne (IL-1β, IL- 6, IL-12, IL-23) i anti-inflamatorne (IL-10) citokine (LeibundGut-Landmann i sar., 2007; Gringhuis i sar., 2009; Skrzypek i sar., 2009; Agrawal i sar., 2010; Higashi i sar., 2010). Aktivacija dektin-1 receptora primenom kurdlana dovodi do sazrevanja MoDĆ u ćelije koje produkuju povećane nivoe IL-23 i IL-27 i smanjen nivo IL-10. Razlike između literaturnih i naših rezultata se mogu objasniti primenom različitih koncentracija kurdlana i različitim načinima njegove pripreme, kako od strane proizvođača tako i u laboratoriji (Stopinšek i sar., 2011). Uprkos tome što je nivo IL- 12 bio nedetektabilan u kulturama MoDĆ stimulisanih kurdlanom, MoDĆ tretirane na ovaj način usmeravale su imunski odgovor ka Th1 pravcu u kokulturi sa alogenim CD4 + T limfocitima. Ovaj efekat se može objasniti dodatnom kontaktnom stimulacijom produkcije IL-12 usled interakcije CD40 na MoDĆ sa CD40 ligandom na CD4 + T limfocitima u alogenoj kulturi (Snijders i sar., 1998). MoDĆ stimulisane kurdlanom su produkovale značajno veće količine IL-23 i usmeravale imunski odgovor i u Th17 pravcu, što je već opisan fenomen (Agrawal i sar., 2010). Diskusija 108 Istovremena aktivacija TLR3 i dektin-1 receptora na MoDĆ u našim istraživanjima je dovela do povećanja produkcije IL-12, IL-23 i IL-10, dok je produkcija IL-27 i IL-6 bila smanjena. MoDĆ stimulisane na ovaj način su indukovale značajno veću produkciju IFN-γ i IL-17 u alogenoj kokulturi, u poređenju sa efektom pojedinačnih agonista. Ovaj efekat je bio izraženiji kada su za kokultivaciju sa MoDĆ korišćeni purifikovani naivni (snažnije produkuju IFN-γ) i memorijski (snažnije produkuju IL-17) CD4+ T limfociti, a nije bio rezultat promene odnosa CD4 + CD45RA + / CD4 + CD45RO + podtipova niti je pokazano da ova dva podtipa imaju različite stope proliferacije. Povećanje produkcije citokina se može objasniti ekspanzijom jednostruko pozitivnih IFN-γ+ i IL-17+ CD4+ T ćelija, ali i dvostruko pozitivnih IFN-γ+/IL-17+ CD4+ T ćelija. Poznato je da se brojnost IFN-γ+/IL-17+ dvostruko pozitivnih ćelija se povećava u tkivima pod inflamacijom ili u krvi pacijenata sa hroničnim inflamatornim bolestima. Ove ćelije su fenotipski nestabilne u kulturi i mogu postati ili IFN-γ ili IL-17 produkujuće CD4+ T ćelije (Boniface i sar., 2010). Na osnovu rezultata naših istraživanja pretpostavili smo da citokini IL-12 familije koje sintetišu MoDĆ nakon istovremene aktivacije TLR3 i dektina-1, utiču na polarizaciju imunskog odgovora, makar jednim delom, stimulacijom diferencijacije dvostruko pozitivnih IFN-γ+/IL-17+ CD4+ T ćelija. Uticaj kombinovane primene Poly (I:C) i kurdlan na MoDĆ nije još uvek ispitan, ali su brojne dosadašnje studije pokazale da efekti modulacije funkcije MoDĆ primenom liganada dektin-1 receptora u kombinaciji sa TLR agonistima zavise od vrste, tipa receptora modelskog prepoznavanja i uslova kultivacije (Gerosa i sar., 2008; Dennehy i sar., 2009; Gringhuis i sar., 2009; Stopinšek i sar., 2011). Diskusija 109 Molekuli uključeni u signalnu kaskadu mogu biti u osnovi uticaja kombinovane primene agonista TLR3 i dektin-1 receptora na povećanje produkcije citokina od strane MoDĆ (Slika 9). Slika 9. Signalna kaskada pokrenuta aktivacijom dektin-1 receptora na DĆ Diskusija 110 Jedan od njih, adaptorski protein CARD9 (engl. caspase recruitment domain- containing protein 9) se aktivira nakon stimulacije produktima mikroba, kao i primenom Poly (I:C) (Hsu i sar., 2007) i agonista dektin-1 receptora (Gross i sar., 2006) (Slika 10). Slika 10. Potencijalna uloga adaptornog proteina CARD9 u kooperaciji TLR3 i dektin-1 receptora Aktivacija MAP kinaze i NF-κB od strane CARD9 modifikuje gensku ekspresiju i fino podešava citokinski profil, uključujući dodatnu produkciju p40 subjedinice (Colonna, 2007) koja je zajednička za IL-12 i IL-23 (McKenzie i sar., 2005). Za sada je nepoznato i ostaje da se ispita da li su još neki mehanizmi uključeni i u kojoj meri signalna kaskada pokrenuta aktivacijom pojedinačnog receptora modifikuje ekspresiju drugog receptora (Weck i sar., 2008). Stimulacija MoDĆ kombinacijom Poly (I:C) i kudlana dovodi do povećanja produkcije IL-10 i smanjenja produkcije IL-27 od strane MoDĆ. IL-27 podstiče Diskusija 111 usmeravanje imunskog odgovora ka Th1 pravcu (Pflanz i sar., 2002). Pojedini rezultati ukazuju na inhibitorni uticaj IL-27 na produkciju IL-23 od strane MoDĆ kao i IL-17 od strane CD4+ T ćelija (Diveu i sar., 2009). Balans u produkciji IL-23 i IL- 27 reguliše Th17 imunski odgovor. Smatra se da je odnos IL-23 i IL-27 značajan za diferencijaciju Th17 CD4 + T ćelija u istoj meri u kojoj je Th1/Th2 diferencijacija određena odnosom nivoa IL-12 i IL-4 citokina (Yoshimura i sar., 2006). Stoga, naši rezultati eksperimenata ukazuju da je smanjena produkcija IL-27 značajna za dodatno potenciranje Th17 odgovora. Sa druge strane, IL-10, snažan anti-inflamatorni i imunosupresivni citokin, ima značajnu ulogu u ograničavanju Th1 i Th17 odgovora u cilju sprečavanja nastanka imunopatoloških stanja kada su prisutni snažni inflamatorni stimulusi (Jankovic i Trinchieri, 2007; Saraiva i sar., 2009). U skladu sa ovim konceptom, povećana produkcija IL-10 u našoj studiji nakon stimulacije MoDĆ kombinacijom agonista TLR3 i dektin-1 receptora se može smatrati značajnim mehanizmom za vraćanje imunskog odgovora u stanje homeostaze. Takođe, smanjenje aloreaktivne sposobnosti MoDĆ se može objasniti povećanom produkcijom IL-10. Naime, uprkos visokoj ekspresiji adhezivnih i kostimulatornih molekula kao i visokoj produkciji stimulatornih citokina (IL-12 i IL-23) od strane MoDĆ, proliferacija CD4+ T ćelija u alogenoj kulturi je bila niska pri višim odnosima MoDĆ/CD + T limfocita. Povećanje proliferativnog odgovora pri najnižem odnosu MoDĆ/CD + T limfocita (1:80) se može objasniti prevagom stimulatornih solubilnih faktora, imajući u vidu da nije došlo do dodatnog povećanja ekspresije kostimulatornih molekula na MoDĆ. MoDĆ stimulisane kombinacijom agonista TLR3 i dektin-1 receptora su povećavale ekspresiju CCR7 molekula što ukazuje na to da interakcija ova dva PRR stimuliše fenotipsko sazrevanje MoDĆ sa poboljšanim migratornim sposobnostima. U zaključku, efekat istovremene aktivacije TLR3 i dektin-1 receptora na MoDĆ se ogleda u pospešivanju njihove sposobnosti da stimulišu diferencijaciju Th1 i Th17 ćelija in vitro. Predmet budućih istraživanja će biti ispitivanje prisustva ovog efekta i u in vivo uslovima i na koji način utiče na imunski odgovor u celini. Diskusija 112 5.4. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na diferencijaciju MoDĆ Za modulaciju funkcija DĆ pored stimulacije PRR značajnu ulogu imaju i citokini prirodnog imuniteta koji se produkuju prilikom infekcije. Kinetika sazrevanja MoDĆ i dužina izlaganja patogenu (Poly (I:C) u našoj studiji) u tkivu zahvaćenom inflamacijom (TNF-α u našoj studiji) su značajni faktori koji određuju finalni ishod imunskog odgovora (Spisek i sar., 2003). Brojne studije su ukazale na uticaj dužine stimulacije na produkciju citokina od strane MoDĆ (Kaliński i sar., 1999; Langenkamp i sar., 2000; Langenkamp i sar., 2002). MoDĆ izložene stimulusu tokom 24h su nazvane “aktivnim” MoDĆ, koje sintetišu značajne nivoe citokina, dok su MoDĆ stimulisane tokom vremenskog perioda dužeg od 24h nazvane “iscrpljenim” MoDĆ, koje su izgubile kapacitet produkcije citokina (Langenkamp i sar., 2000), ali imaju visoku ekspresiju kostimulatornih molekula (Repnik i sar., 2008). Pretpostavlja se da TNF-α ima ključnu ulogu u uspostavljanju balansa između pro- i anti-inflamatornih citokina produkovanih od strane MoDĆ (Hirata i sar., 2011). Kako je ovaj balans presudan za uspostavljanje homeostaze imunskog odgovora, detaljno ispitivanje regulatorne uloge TNF-α može biti od značaja za terapiju patoloških stanja imunskog sistema. U cilju razjašnjenja ovih problema, ispitivali smo uticaj kombinovane primene različitih doza agonista TLR3, Poly (I:C) i proinflamatornog citokina TNF-α tokom različitih vremenskih perioda na fenotipska i funkcionalna svojstva MoDĆ. U sledećem koraku smo za stimulaciju MoDĆ koristili solubilni ligand za CD40 molekul i time simulirali interakciju MoDĆ sa T ćelijama posredovanu CD40 molekulom i CD40 ligandom. U kliničkim studijama kao jedan od prvih agenasa za stimulaciju MoDĆ za stimulaciju DĆ korišćen je TNF-α (Bremers i sar., 2000). Najveći broj literaturnih podataka se odnosi na primenu ovog citokina u protokolima za imunoterapiju. Kasnije je pokazano da ovaj proinflamatorni citokin dovodi do nepotpunog sazrevanja MoDĆ koje se karakteriše povećanjem ekspresije molekula MHC klase II i kostimulatornih molekula, niskom ekspresijom proinflamatornih citokina i slabim Diskusija 113 alostimulatornim potencijalom (Lutz i Schuler, 2002; Decker i sar., 2008). Karakteristike MoDĆ kultivisanih u prisustvu TNF-α u našem istraživanju su u saglasnosti sa ovim podacima iz literature. Međutim, uprkos nedetektabilnom nivou IL-12 produkovanom od strane MoDĆ stimulisanih sa TNF-α, ovako tretirane MoDĆ su u kokulturi usmeravale odgovor alogenih CD4+ T limfocita ka Th1 pravcu. Pored toga, MoDĆ tretirane sa TNF-α su sekretovale povećan nivo Th17 polarizujućeg citokina, IL-23 (McKenzie i sar., 2005; Sallusto i Lanzavecchia, 2009; Yu i sar., 2010), i najverovatnije tako stimulisale produkciju IL-17 u kokulturi sa alogenim CD4 + T ćelijama. Efekat kombinovane primene Poly (I:C) i TNF-α na fenotipske karakteristike MoDĆ u našoj studiji se ogledao u povećanju ekspresije kostimulatornih i adhezivnih molekula uz statistički značajno povećanje ekspresije CD80, CD86 i CD54 molekula. Povećano ispoljavanje ovih površinskih markera, posredstvom kojih MoDĆ interaguju sa T ćelijama i aktiviraju ih, ukazuje na fenotipsku zrelost MoDĆ što je u skladu sa prethodno publikovanim rezultatima (Spisek i sar., 2001; Spisek i sar., 2003). Uprkos tome, MoDĆ diferencirane u prisustvu TNF-α i Poly (I:C) su imale smanjen alostimulatorni kapacitet i sniženu produkciju IL-12, u poređenju sa MoDĆ stimulisanim samo sa Poly (I:C). Smanjenje produkcije IL-12 od strane MoDĆ diferenciranih u prisustvu TNF- α i Poly (I:C) se odrazilo na smanjenje produkcije IFN-γ u kokulturi sa alogenim CD4+ T ćelijama, u poređenju sa nivoom ovog citokina u alogenoj kulturi sa MoDĆ tretiranim samo sa Poly (I:C). Nasuprot rezultatima naše stuije, podaci iz literature pokazuju da MoDĆ stimulisane sa Poly (I:C) i TNF-α produkuju značajan nivo IL-12 i efikasno usmeravaju CD4+ T limfocite ka Th1 pravcu (Spisek, i sar., 2001). Nesklad između rezultata naše studije i literaturnih podataka se može objasniti time što smo u našoj studiji upoređivali produkciju IL-12 između MoDĆ stimulisanih kombinacijom TNF-α i Poly (I:C) i MoDĆ stimulisanih samo sa Poly (I:C), dok je u pomenutoj studiji poređenje vršeno sa produkcijom citokina od strane MoDĆ stimulisanih koktelom citokina. Naime, koktel citokina, tzv. “zlatni Diskusija 114 standard”, za stimulaciju DĆ za njihovu primenu kao vakcina u lečenju humanih malignih tumora predstavlja koktel citokina koji se sastoji od TNF-α, IL-1β, IL-6 i PGE2 (Jonuleit i sar., 1997). Nedostatak DĆ dobijenih na ovaj način se ogleda u izuzetno niskoj produkciji IL-12 (Pedersen i sar., 2006), dok je Poly (I:C) snažan stimulator produkcije IL-12 od strane MoDĆ (Cella i sar., 1999b; Verdijk RM, i sar., 1999; Rouas R, i sar., 2004). Rezultati naše studije ukazuju na to da se kombinovani efekat TNF-α i Poly (I:C) tokom diferencijacije MoDĆ ogleda u smanjenju njihove imunogenosti i funkcionalnosti, u poređenju sa efektom samog Poly (I:C). Diskusija 115 Mehanizmi kooperacije signala pokrenutih aktivacijom Poly (I:C) i TNF-α nisu još uvek razjašnjeni. Aktivacija TLR3, nakon angažovanja TRIF adaptorskog proteina, pokreće signalni put koji se sastoji iz tri glavna modula u okviru kojih dolazi do aktivacije transkripcionih faktora: IRF3, NF-κB i AP-1 (Slika 11). Slika 11. Signalna kaskada pokrenuta aktivacijom TLR3 od strane dvolančane RNK u DĆ Diskusija 116 Ovi moduli su međusobno povezani i delimično se preklapaju (Kawai i Akira, 2010). Adaptor TRAF3 predstavlja ključnu vezu između TRIF i kompleksa kinaza koje fosforilišu IRF3. Aktivacija transkripcionih faktora posredovana sa IRF3 dovodi do ekspresije IL-12p35 subjedinice (Goriely i sar., 2005). U aktivaciji NF-κB učestvuju dva nezavisna puta koji se preklapaju na nivou IKK kompleksa: receptor interagujući protein 1 (engl. receptor interacting protein 1, RIP1) i TRAF6. Oba TRIF-RIP1 i TRIF-TRAF6 signalna puta konvergiraju u IKK kompleksu koji se sastoji od katalitičkih subjedinica, IKKα i IKKβ, i regulatorne subjedinice, IKKγ. Protein kinaza transformišućeg faktora rasta 1 (engl. Transforming growth factor activated protein kinase 1, TAK1) biva aktivirana u nakon tretiranja MoDĆ sa Poly (I:C) i fosforiliše IKKα i IKKα nakon čega oni fosforilišu inhibitor NF-κB, IκB. Translokacija NF-κB u nukleus i vezivanje za DNK indukuju ekspresiju IFN-γ i drugih citokina i hemokina (IL-6, TNF-α, CCL3, IL-12). Aktivirani transkripcioni faktor AP-1 indukuje citokine i hemokine, poput IL-6, TNF-α i CCL3 (Cusson-Hermance i sar., 2005; Matsumoto i Seya, 2008). TNF-α se vezuje za dva različita receptora: TNF receptor tip 1 (TNFR1; CD120a) i TNF receptor tip 2 (TNFR1; CD120b) (Vandenabeele i sar., 1995). Većinu funkcija TNF-α ostvaruje posredstvom TNFR1 (Slika 12), koji se konstituitivno eksprimira u većini tkiva. TNFR1 regrutuje proteine domena smrti asocirane sa TNFR1 (engl. death-domain proteins including TNFR1-associated death domain protein, TRADD) i proteine domena smrti asocirane sa Fas (engl. Fas-associated death domain proteins, FADD) (Baud i Karin, 2001). TRADD aktivira FADD, RIP1 i TRAF2. TRAF 2 i RIP1 aktiviraju MAP kinaze (Wajant i sar., 2001; Wajant i Scheurich, 2001; Balkwill, 2009). Diskusija 117 Slika 12. Signalna kaskada pokrenuta aktivacijom TNFR1 solubilnim TNF-α Dakle, oba signalna puta pokrenuta aktivacijom TNF-α i TLR3 aktiviraju RIP- 1. RIP1 je važan za aktivaciju NF-κB u kasnijim fazama imunskog odgovora kada je TNF-α aktivan, ali i u ranim fazama imunskog odgvora kada se pokreće antivirusni imunski odgovor nakon aktivacije TLR3 (Meylan i sar., 2004). Diskusija 118 U cilju ispitivanja uticaja kinetike aktivacije MoDĆ na njihov potencijal da usmere efektorske funkcije T limfocita, MoDĆ smo stimulisali sa različitim koncentracijama Poly (I:C), TNF-α i njihovim kombinacijama tokom 24h i 48h. Produžena stimulacija MoDĆ je dovela do razvoja MoDĆ koje su iscrpele potencijal za produkciju IL-12. Naime, poznato je da je produkcija IL-12 ograničena na relativno kratak vremenski period (12-24h) nakon izlaganja MoDĆ kombinaciji Poly (I:C) i TNF-α (Spisek i sar., 2003) i da nakon dostizanja platoa za produkciju IL-12, MoDĆ ulaze u “iscrpljeno” stanje koje se karakteriše izmenjenim potencijalom za stimulaciju T limfocita (Langenkamp i sar., 2000). Produkcija IL-23 je imala isti obrazac kao i produkcija IL-12. Sa druge strane, IL-10 je produkovan kontinualno u skladu sa sopstvenom ulogom u sprečavanju razvoja patološkog imunskog odgovora (Spisek i sar., 2003) i rezultati naše studije su u skladu sa ovim rezultatima. Takođe smo uočili dozno-zavisan uticaj Poly (I:C) na produkciju IL-12 nakon 24h stimulacije koji je bio praćen povećanjem produkcije IL-10. Nasuprot publikovanim rezultatima (Spisek i sar., 2003) produžena stimulacija MoDĆ sa TNF- α u kombinaciji sa svim ispitivanim koncentracijama Poly (I:C) u našoj studiji nije dovela do značajnog porasta produkcije IL-12, kao ni polarizacije imunskog odgovora ka Th1 pravcu. Nasuprot tome, uočeno je smanjenje Th1 i Th17 odgovora pogotovo kada su primenjene više koncentracije Poly (I:C) i TNF-α, u poređenju sa MoDĆ stimulisanih samo sa Poly (I:C). Sledeći cilj ovog istraživanja bio je ispitivanje modulatornog efekta interakcije CD40 molekula sa CD40 ligandom značajne za finalnu maturaciju MoDĆ (Mackey i sar., 1998) na funkcionalne karakteristike MoDĆ stimulisanih kombinacijom Poly (I:C) i TNF-α. MoDĆ tretirane tokom 24h sa TNF-α, različitim koncentracijama Poly (I:C) i njihovim kombinacijama su stimulisane dodatna 24h solubilnim ligandom za CD40 molekul. Prisustvo CD40L je pospešilo produkciju IL- 12 od strane MoDĆ stimulisanih svim ispitivanim koncentracijama Poly (I:C). Stimulatorni efekat CD40L na produkciju IL-12 je bio najizraženiji kada su MoDĆ stimulisane optimalnom koncentracijom Poly (I:C) i u alogenoj kulturi ove MoDĆ su dovele do povećanja produkcije IFN-γ. U kulturama MoDĆ pretretiranih sa TNF-α je došlo do povećanja produkcije IL-12 što je bilo neočekivano imajući u vidu prethodno publikovane rezultate (Decker i sar., 2008), ali ovaj porast nije bio Diskusija 119 dovoljan da polarizuje imunski odgovor u Th1 pravcu. Aktivacija CD40 na MoDĆ pretretiranim najnižom koncentracijom Poly (I:C) dovela je do povećanja produkcije IL-23 koja je bila pospešena dodavanjem TNF-α i dovoljna da polarizuje imunski odgovor u Th17 pravcu. Najizraženiji efekat CD40:CD40L interakcije je bilo stimulisanje imunoregulatornog odgovora posredovanog sa IL-10 od strane MoDĆ pretretiranih najvećom koncentracijom Poly (I:C) i TNF-α kada je smanjena produkcija IL-12 i IL-23 indukovala smanjenje Th1 i Th17 odgovora. Dakle, povećanjem koncentracije Poly (I:C) u kombinaciji sa TNF-α može se modulisati Th polarizaciona sposobnost MoDĆ od Th17 ka imunoregulatornoj. 5.5. Uticaj povezivanja CD40 molekula i IFN-γ na funkcionalne karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu Poly (I:C) Poslednji deo istraživanja se odnosio na ispitivanje uticaja signala stečenog imuniteta koje DĆ dobijaju tokom njihove interakcije sa T ćelijama, uključujući signalizaciju preko CD40 molekula i receptora za IFN-γ. Aktivacija CD40 molekula na DĆ je važan korak u sazrevanju ovih ćelija. U našim eksperimentima koristili smo ćelijsku liniju transfektovanu za CD40 ligand radi simuliranja CD40:CD40L interakcija između DĆ i T ćelija kojima se ostvaruje recipročna regulacija između T limfocita i DĆ (Mackey i sar., 1998; Rissoan i sar., 1999). Aktivacija CD40 molekula na nezrelim i MoDĆ stimulisanim sa Poly (I:C) u našoj studiji je značajno pospešila njihov alostimulatorni potencijal, najverovatnije posredstvom povećane ekspresije kostimulatornih molekula, poput ICAM-1, HLA- DQ, CD80 i CD86 (Cella i sar., 1996). Poznato je da aktivacija CD40 na nezrelim MoDĆ stimuliše značajnu produkciju IL-12 (Snijders i sar., 1998) koji kasnije indukuje produkciju IFN-γ od strane T limfocita. Rezultati našeg istraživanja su ukazali na fenomen koji nije publikovan do sad. Po prvi put pokazano je da aktivacija CD40 na nezrelim MoDĆ pospešuje produkciju IL-23 što je praćeno povećanjem produkcije IL-17 od strane CD4+ T limfocita u alogenoj kulturi. Produkcija IL-17 je dodatno pospešena aktivacijom CD40 na MoDĆ koje su stimulisane sa Poly (I:C). Stimulacija Th17 odgovora nakon aktivacije CD40 molekula na MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) je Diskusija 120 praćena smanjenjem Th1 odgovora. Poznato je da nekontrolisan Th1 odgovor može biti štetan (Liblau i sar., 1995) pa stoga signalizacija preko CD40 molekula može imati protektivnu i imunomodulatornu ulogu. IFN-γ je klasifikovan kao interferon tipa II IFN u skladu sa specifičnošću receptora i homologijom sekvence (Schroder i sar., 2004). Interferoni su najpre bili opisani kao faktori koji interferiraju sa replikacijom virusa (Isaacs i Lindenmann, 1957). IFN-γ produkuju NK ćelije i postoji pretpostavka da ga produkuju i APĆ u prvim stadijumima infekcije, a glavni izvor ovog citokina su T limfociti u stečenom imunskom odgovoru (Frucht i sar., 2001). IFN-γ pospešuje obradu i prezentaciju antigena, kao i ekspresiju kostimulatornih molekula na APĆ (Schroder i sar., 2004). U našem istraživanju smo pokazali da tretman sa IFN-γ nezrelih i MoDĆ stimulisanih sa Poly (I:C) stimuliše alostimulatorni potencijal MoDĆ u kokulturi sa alogenim CD4 + T ćelijama. Alostimulatorna sposobnost MoDĆ je opadala sa smanjenjem odnosa MoDĆ/CD4 + T ćelija. Pri višim odnosima MoDĆ/CD4+ T ćelija alostimulatorni potencijal MoDĆ je bio niži. Ovaj efekat se može objasniti smanjenim uticajem kostimulatornih i adhezivnih molekula kao i IL-12 usled manjeg broja MoDĆ. Značajan nalaz ovog istraživanja je dvostruka uloga IFN-γ na produkciju IL- 12: stimulacija produkcije IL-12 od strane nezrelih MoDĆ i supresija produkcije IL- 12 od strane MoDĆ pretretiranih sa Poly (I:C) nakon kultivisanja sa IFN-γ. Povećanje produkcije IL-12 je stimulisalo povećanje produkcije IFN-γ i smanjenje produkcije IL-5 i IL-17 od strane alogenih CD4+ T ćelija u kokulturi sa nezrelim MoDĆ. Povećanje produkcije IL-12 od strane nezrelih MoDĆ je u skladu sa prethodno publikovanim rezultatima (Boullart i sar., 2008). IL-12 stimuliše T ćelije i NK ćelije da sintetišu IFN-γ (Walzer i sar., 2005) koji, sa druge strane, stimuliše produkciju IL- 12 čime se formira pozitivna povratna sprega. Smanjenje produkcije IL-5 je u skladu sa konceptom recipročne regulacije Th1 i Th2 odgovora (Glimcher i Murphy, 2000) i direktnim inhibitornim efektom IFN-γ na razvoj Th2 ćelija (Schroder i sar., 2004). Produkcija IL-23 od strane MoDĆ stimulisanih sa IFN-γ se nije značajno promenila, ali su uprkos tome ove MoDĆ inhibirale produkciju IL-17 u alogenoj Diskusija 121 kulturi. Naime, poznato je da IL-23 pretežno deluje na već diferencirane Th17 ćelije (Sallusto i Lanzavecchia, 2009), pa se može pretpostaviti da su MoDĆ tretirane sa IFN-γ inhibirale diferencijaciju Th17+ ćelija modulisanjem produkcije citokina koji su neophodni za diferencijaciju Th17 ćelija, poput TGF-β, IL-1β, IL-6 i IL-21 (Korn i sar., 2009). Ova pretpostavka će biti ispitana u predstojećim istraživanjima. Jedan od ključnih nalaza ovog istraživanja je uticaj kombinovane primene IFN-γ i Poly (I:C) na smanjenje produkcije IL-12 i povećanja produkcije IL-10 od strane MoDĆ koje u alogenoj kulturi smanjuju Th1 odgovor i stimulišu imunoregulatorni milje posredovan IL-10. Nije u potpunosti razjašnjeno da li IFN-γ deluje primarno na smanjenje produkcije IL-12 od strane MoDĆ tretiranih u prisustvu Poly (I:C) ili stimuliše produkciju IL-10. Kao što je poznato, IL-10 je snažni anti-inflamatorni i imunosupresivni citokin koji inhibira produkciju IL-12 od strane MoDĆ (Buelens i sar., 1997) čime se sprečava razvoj patološkog Th1 odgovora u uslovima u kojima je prisutan snažan inflamatorni stimulus (Jankovic i Trinchieri, 2007; Saraiva, i sar., 2009). Nedavno je pokazano da IFN-γ, pored uloge u stimulaciji produkcije proinflamatornih citokina tokom aktivacije DĆ, takođe aktivira imunosupresivni enzim IDO (engl. indoleamine 2,3-dioxygenase) u DĆ (Jurgens i sar., 2009). MoDĆ koje su IDO + ispoljavaju imunoregulatorni potencijal koji je neophodan za ograničavanje imunskog odgovora (Munn i sar., 2002). Pored toga, IFN-γ stimuliše razvoj adaptivnih regulatornih T ćelija (Jurgens i sar., 2009). Naši rezultati podržavaju koncept da IFN-γ, kao dominantni efektorski citokin Th1 ćelija, pored proinflamatornih karakteristika ispoljava značajnu ulogu u ograničavanju preteranog i potencijalno štetnog imunskog odgovora i održavanju homeostaze, a na taj način iskazuje još veći značaj u imunskom odgovoru. MoDĆ tretirane sa ligandom za CD40 molekul polarizuju imunski odgovor u Th1 pravcu. Aktivacija CD40 molekula na MoDĆ tretiranim sa Poly (I:C) usmerava imunski odgovor ka Th17 pravcu. Stimulacija nezrelih MoDĆ sa IFN-γ smanjuje Th2 i Th17 odgovore, dok se efekat ovog citokina na MoDĆ stimulisanim sa Poly (I:C) ogledao u smanjenju Th1 odgovora i stimulaciji imunoregulatornih mehanizama Diskusija 122 pospešivanjem produkcije IL-10 od strane alogenih CD4+ T limfocita tokom kokultivacije. 5.6. Terapeutski potencijal DĆ diferenciranih u prisustvu agonista endozomnih toll-sličnih receptora, dektin-1 receptora i proinflamatornih citokina Aktuelni protokoli za stimulaciju DĆ za primenu u imunoterapiji tumora se zasnivaju na dobijanju imunogenih DĆ koje usmeravaju imunski odgovor u Th1 pravcu (Ikeda H, i sar., 2002). Th1 ćelije su smatrane najznačajnijim efektorskim CD4 + T ćelijama u anti-tumorskom imunskom odgovoru zbog svog potencijala da stimulišu citotoksične funkcije CD8+ T limfocita. Sa druge strane, karakteristike Th17 ćelija, poput stimulacije zapaljenskih procesa, pospešivanja antigen- prezentujućih funkcija DĆ, usmeravanja migracije leukocita ka tumorima i olakšavanja aktivacije i diferencijacije CD8 + T ćelija ukazuju na njihovu moguću primenu u imunoterapiji tumora (Muranski P, i sar., 2008; Martin-Orozco N, i sar., 2009). Konkretna uloga Th17 ćelija u anti-tumorskoj imunosti je i dalje predmet istraživanja i debata jer su pokazane i pro-tumorske (Miyahara Y, i sar., 2008; Kryczek I, i sar., 2009) i anti-tumorske funkcije IL-17 (Alshaker HA i Matalka KZ, 2011). Donedavno se smatralo da je, usled konverzije Th17 u Th1 ćelije, uticaj Th17 ćelija zavisan od IFN-γ (Muranski P, i sar., 2008), ali je potvrđena protektivna uloga Th17 ćelija neizmenjenog citokinskog profila u anti-tumorskom imunskom odgovoru (Martin-Orozco N, i sar., 2009). Cilj našeg istraživanja je bio ispitivanje modulacije funkcije humanih MoDĆ kombinovanom primenom agonista endozomnih TLR, dektin-1 receptora i proinflamatornih citokina radi razvoja protokola za dobijanje zrelih DĆ koje dovode do proliferacije T limfocita i stimulacije optimalnih Th1 i Th17 odgovora, a samim tim i efikasnog anti-tumorskog odgovora. Opisane karakteristike su u našem istraživanju ispoljile MoDĆ stimulisane optimalnom koncentracijom Poly (I:C), kombinacijom suboptimalnih koncentracija Poly (I:C) i loksoribina i kombinacijom Diskusija 123 optimalnih koncentracija Poly (I:C) i kurdlana. Cilj predstojećih istraživanja će biti ispitivanje ovih efekata u in vivo uslovima. 124 6. ZAKLJUČCI Zaključci 125 Na osnovu obavljenih istraživanja i dobijenih rezultata mogu se se izvesti sledeći zaključci: • Optimalna koncentracija Poly (I:C) stimuliše sazrevanje MoDĆ koje pokazuju značajni alostimulatorni kapacitet, stimulišu Th1 i Th17 imunski odgovor, a inhibiraju Th2 odgovor tokom kokultivacije sa alogenim CD4 + T limfocitima; • Stimulacija MoDĆ suboptimalnim koncentracijama Poly (I:C) i loksoribina dovodi do blagog povećanja ekspresije HLA-DR, CD86, CD83, CD54 i CD40 u poređenju sa ekspresijom na MoDĆ tretiranim pojedinačnim agonistima. MoDĆ pripremljene na ovaj način indukuju Th1 i Th17 odgovor CD4 + T limfocita. Kultivacija MoDĆ u prisustvu optimalnih koncentracija Poly (I:C) i loksoribina dovodi do smanjenja ekspresije HLA-DR i kostimulatornih molekula, u poređenju sa MoDĆ stimulisanim pojedinačnim agonistima. MoDĆ stimulisane optimalnim koncentracija oba agonista usmeravaju imunski odgovor ka Th1 pravcu. Primena suboptimalne koncentracije Poly (I:C) i optimalne koncentracije loksoribina dovodi do povećanja ekspresije CD86 i smanjenja HLA-DR molekula na MoDĆ. MoDĆ pripremljene na ovaj način pokazuju najizraženiji potencijal za usmeravanje odgovora CD4 + T limfocita ka Th1 pravcu; • Kooperacija TLR3 i dektin-1 receptora stimuliše fenotipsko sazrevanje MoDĆ i ekspresiju CCR7 molekula koji im omogućava bolji migratorni potencijal ka perifernim limfoidnim organima. Ovaj način stimulacije MoDĆ poboljšava njihovu sposobnost indukcije Th1 i Th17 odgovora alogenih CD4 + T limfocita; • Diferencijacija MoDĆ u prisustvu TNF-α i optimalne koncentracije Poly (I:C) povećava ekspresiju CD80, CD86 i CD54 molekula, u poređenju sa efekatom samog Poly (I:C). Sa druge strane, MoDĆ pripremljene na ovaj način imaju manji alostimulatorni potencijal i Zaključci 126 smanjenu sposobnost indukcije Th1 odgovora T limfocita, u poređenju sa MoDĆ diferenciranim u prisustvu Poly (I:C). Ispitivanjem dozno- i vremenski- zavisnog efekta kombinovane primene TNF-α i Poly (I:C) ustanovljeno je da dozno-zavisni efekti izraženi nakon 24h nisu prisutni nakon 48h stimulacije. Dozno-zavisni efekti nakon 24h stimulacije su se ogledali u smanjenju Th1 i Th17 polarizacione sposobnosti MoDĆ, posebno kada je u kombinaciji sa TNF-α primenjena najviša koncentracija Poly (I:C). Ispitivanjem uticaja interakcije CD40:CD40L na funkcionalne karakteristike MoDĆ diferenciranih u prisustvu TNF-α i različitih koncentracija Poly (I:C) ustanovljen je najizraženiji efekat tokom primene najviše koncentracije Poly (I:C). Ovako stimulisane MoDĆ ispoljile su smanjen Th1 i Th17 polarizujući kapacitet u korist imunoregulatornog u kokulturi sa alogenim CD4 + T limfocitima; • Nezrele MoDĆ na kojima je aktiviran CD40 molekul imaju značajan potencijal za usmeravanje imunskog odgovora ka Th1 pravcu, dok MoDĆ pretretirane sa Poly (I:C) kojima je potom aktiviran CD40 molekul polarizuju imunski odgovor ka Th17 pravcu. Nezrele MoDĆ stimulisane IFN-γ imaju manji potencijal za usmeravanje ka Th2 i Th17 odgovoru, dok se efekat ovog citokina na MoDĆ pretretiranim sa Poly (I:C) ogleda u smanjenju sposobnosti MoDĆ da indukuju Th1 odgovora i povećanju produkcije IL-10 (imunoregulatorni mehanizmi) od strane alogenih CD4 + T limfocita. Svi dobijeni rezultati pokazuju veliku plastičnost u funkcionalnom odgovoru MoDĆ. Značajna imunogena svojstva Poly (I:C) koja su do sada iskorišćena u pripremi MoDĆ kao tumorskih vakcina se mogu dodatno pospešiti primenom stimulatora dektinskih receptora i TNF-α. Ipak neki od povoljnih efekata mogu biti umanjeni ili usmereni u suprotnom pravcu dodavanjem solubilnog CD40L i IFN-γ. Ovi rezultati mogu pomoći u boljem razumevanju biološkog ponašanja MoDĆ nakon transfera in vivo. 127 7. LITERATURA Literatura 128 Abb J, Zander H, Abb H, Albert E, i Deinhardt F. (1983). Association of human leucocyte low responsiveness to inducers of interferon alpha with HLA-DR 2. Immunology , 49 (2), 239-244. Adolf GR. (1995). Human interferon omega--a review. Mult Scler , 1 Suppl 1, S44-47. Afkarian M, Sedy JR, Yang J, Jacobson NG, Cereb N, Yang SY, i sar. (2002). T-bet is a STAT1-induced regulator of IL-12R expression in naive CD4+ T cells. Nat Immunol , 3 (6), 549-557. Aggarwal, B., Ecssalu, T., i Haas, P. (1985). Characterization of receptors for human tumour necrosis factor and their regulation by gamma-interferon. Nature , 318, 665-7. Aggarwal, B., Moffat, B., i Harkins, R. (1984). Human lymphotoxin. Production by a lymphoblastoid cell line, purification, and initial characterization. J Biol Chem , 259 (1), 686-91. Agrawal S, Gupta S, i Agrawal A. (2010). Human dendritic cells activated via Dectin-1 are efficient at priming Th17, cytotoxic CD8 T and B cell responses. PLoS One , 5, e13418. Akashi-Takamura S, i Miyake K. (2008). TLR accessory molecules. Curr Opin Immunol , 20 (4), 420-425. Akbar AN, Vukmanovic-Stejic M, Taams LS, i Macallan DC. (2007). The dynamic co- evolution of memory and regulatory CD4+ T cells in the periphery. Nat Rev Immunol , 7 (3), 231-237. Aketagawa, J., Tanaka, S., Tamura, H., Shibata, Y., i Saito, H. (1993). Activation of limulus coagulation factor G by several (1-->3)-beta-D-glucans: comparison of the potency of glucans with identical degree of polymerization but different conformations. J Biochem , 113 (6), 683-6. Akira, S. (2009). Innate immunity to pathogens: diversity in receptors for microbial recognition. Immunol Rev , 227 (1), 5-8. Akira, S., Uematsu, S., i Takeuchi, O. (2006). Pathogen recognition and innate immunity. Cell , 124 (4), 783-801. Al-Alwan MM, Rowden G, Lee TD, i West KA. (2001). The dendritic cell cytoskeleton is critical for the formation of the immunological synapse. J Immunol , 166 (3), 1452- 1456. Aline F, Brand D, Bout D, Pierre J, Fouquenet D, Verrier B, i sar. (2007). Generation of specific Th1 and CD8+ T-cell responses by immunization with mouse CD8+ dendritic cells loaded with HIV-1 viral lysate or envelope glycoproteins. Microbes Infect , 9 (4), 536-543. Literatura 129 Allan, R., Waithman, J., Bedoui, S., Jones, C., Villadangos, J., Zhan, Y., i sar. (2006). Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming. Immunity , 25 (1), 153-62. Alshaker HA, i Matalka KZ. (2011). IFN-γ, IL-17 and TGF-β involvement in shaping the tumor microenvironment: The significance of modulating such cytokines in treating malignant solid tumors. Cancer Cell International , 11, 33. Alvarez, D., Vollmann, E., i von Andrian, U. (2008). Mechanisms and consequences of dendritic cell migration. Immunity , 29 (3), 325-42. Angel CE, George E, Brooks AE, Ostrovsky LL, Brown TL, i Dunbar PR. (2006). Cutting edge: CD1a+ antigen-presenting cells in human dermis respond rapidly to CCR7 ligands. J Immunol , 176 (10), 5730-5734. Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, Maggi L, Liotta F, Mazzinghi B, i sar. (2007). Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med , 204 (8), 1849-1861. Ardavin C, Wu L, Li CL, i Shortman K. (1993). Thymic dendritic cells and T cells develop simultaneously in the thymus from a common precursor population. Nature , 362 (6422), 761-763. Ariizumi K, Shen GL, Shikano S, Xu S, Ritter R 3rd, Kumamoto T, i sar. (2000). Identification of a novel, dendritic cell-associated molecule, Dectin-1, by subtractive cDNA cloning. J Biol Chem , 275, 20157-20167. Arpinati M, Green CL, Heimfeld S, Heuser JE, i Anasetti C. (2000). Granulocyte-colony stimulating factor mobilizes T helper 2-inducing dendritic cells. Blood , 95 (8), 2484- 2490. Asselin-Paturel C, Boonstra A, Dalod M, Durand I, Yessaad N, Dezutter-Dambuyant C, i sar. (2001). Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology. Nat Immunol , 2 (12), 1144-1150. Babatz J, Rollig C, Oelschlagel U, Zhao S, Ehninger G, Schmitz M, i sar. (2003). Large- scale immunomagnetic selection of CD14+ monocytes to generate dendritic cells for cancer immunotherapy: a phase I study. J Hematother Stem Cell Res , 12 (5), 515-523. Bach EA, Aguet M, i Schreiber RD. (1997). The IFN gamma receptor: a paradigm for cytokine receptor signaling. Annu Rev Immunol , 15, 563-591. Bagchi, A., Herrup, E., Warren, H., Trigilio, J., Shin, H., Valentine, C., i sar. (2007). MyD88-dependent and MyD88-independent pathways in synergy, priming, and tolerance between TLR agonists. J Immunol , 178 (2), 1164-71. Balkwill F. (2009). Tumour necrosis factor and cancer. Nat Rev Cancer , 9 (5), 361-371. Literatura 130 Banchereau J, Bazan F, Blanchard D, Briere F, Galizzi JP, van Kooten C, i sar. (1994). The CD40 antigen and its ligand. Annu Rev Immunol , 12, 881-922. Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, Liu YJ, i sar. (2000). Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol , 18, 767-811. Banchereau, J., i Steinman, R. (1998). Dendritic cells and the control of immunity. Nature , 392, 245-252. Bates EE, Fournier N, Garcia E, Valladeau J, Durand I, Pin JJ, i sar. (1999). APCs express DCIR, a novel C-type lectin surface receptor containing an immunoreceptor tyrosine- based inhibitory motif. J Immunol , 163 (4), 1973-1983. Baud, V., i Karin, M. (2001). Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends Cell Biol , 11 (9), 372-7. Bave U, Magnusson M, Eloranta ML, Perers A, Alm GV, i Ronnblom L. (2003). Fc gamma RIIa is expressed on natural IFN-alpha-producing cells (plasmacytoid dendritic cells) and is required for the IFN-alpha production induced by apoptotic cells combined with lupus IgG. J Immunol , 171 (6), 3296-3302. Bazan, J. (1990). Shared architecture of hormone binding domains in type I and type II interferon receptors. Cell , 61, 753-54. Bennett SR, Carbone FR, Karamalis F, Flavell RA, Miller JF, i Heath WR. (1998). Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling. Nature , 393 (6684), 478-480. Benwell, R., Hruska, J., Fritsche, K., i Lee, D. (2010). Double stranded RNA- relative to other TLR ligand-activated dendritic cells induce extremely polarized human Th1 responses. Cell Immunol , 264 (2), 119-26. Benwell, R., i Lee, D. (2010). Essential and synergistic roles of IL1 and IL6 in human Th17 differentiation directed by TLR ligand-activated dendritic cells. Clin Immunol , 134 (2), 178-87. Bernabei P, Allione A, Rigamonti L, Bosticardo M, Losana G, Borghi I, i sar. (2001). Regulation of interferon-gamma receptor (INF-gammaR) chains: a peculiar way to rule the life and death of human lymphocytes. Eur Cytokine Netw , 12 (1), 6-14. Bernhard H, Disis ML, Heimfeld S, Hand S, Gralow JR, i Cheever MA. (1995). Generation of immunostimulatory dendritic cells from human CD34+ hematopoietic progenitor cells of the bone marrow and peripheral blood. Cancer Res , 55 (5), 1099-1104. Beutler B, i Cerami A. (1989). The biology of cachectin/TNF--a primary mediator of the host response. Annu Rev Immunol , 7, 625-655. Literatura 131 Beutler, B., Jiang, Z., Georgel, P., Crozat, K., Croker, B., Rutschmann, S., i sar. (2006). Genetic analysis of host resistance: Toll-like receptor signaling and immunity at large. Annu Rev Immunol , 24, 353-89. Bhatia, S., Edidin, M., Almo, S., i Nathenson, S. (2006). B7-1 and B7-2: similar costimulatory ligands with different biochemical, oligomeric and signaling properties. Immunol Lett , 104 (1-2), 70-5. Biron, C., Nguyen, K., Pien, G., Cousens, L., i Salazar-Mather, T. (1999). Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annu Rev Immunol , 17, 189-220. Black RA, Rauch CT, Kozlosky CJ, Peschon JJ, Slack JL, Wolfson MF, i sar. (1997). A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells. Nature , 385 (6618), 729-733. Blankson JN, Persaud D, i Siliciano RF. (2002). The challenge of viral reservoirs in HIV-1 infection. Annu Rev Med , 53, 557-593. Blom B, Ho S, Antonenko S, i Liu YJ. (2000). Generation of interferon alpha-producing predendritic cell (Pre-DC)2 from human CD34(+) hematopoietic stem cells. J Exp Med , 192 (12), 1785-1796. Boehm U, Klamp T, Groot M, i Howard JC. (1997). Cellular responses to interferon- gamma. Annu Rev Immunol , 15, 749-795. Boniface K, Blumenschein WM, Brovont-Porth K, McGeachy MJ, Basham B, Desai B, i sar. (2010). Human Th17 cells comprise heterogeneous subsets including IFN-γ producing cells with distinct properties from the Th1 lineage. The journal of Immunology , 185, 679-687. Boullart AC, Aarntzen EH, Verdijk P, Jacobs JF, Schuurhuis DH, Benitez-Ribas D, i sar. (2008). Maturation of monocyte-derived dendritic cells with Toll-like receptor 3 and 7/8 ligands combined with prostaglandin E2 results in high interleukin-12 production and cell migration. Cancer Immunol Immunother , 57 (11), 1589-1597. Bremers, A., Kuppen, P., i Parmiani, G. (2000). Tumour immunotherapy: the adjuvant treatment of the 21st century? Eur J Surg Oncol , 26 (4), 418-24. Brewington R, Chatterji M, Zoubine M, Miranda RN, Norimatsu M, i Shnyra A. (2001). IFN-gamma-independent autocrine cytokine regulatory mechanism in reprogramming of macrophage responses to bacterial lipopolysaccharide. J Immunol , 167 (1), 392-398. Brinkmann MM, Spooner E, Hoebe K, Beutler B, Ploegh HL, i Kim YM. (2007). The interaction between the ER membrane protein UNC93B and TLR3, 7, and 9 is crucial for TLR signaling. J Cell Biol , 177 (2), 265-275. Literatura 132 Brown GD, i Gordon S. (2005). Immune recognition of fungal beta-glucans. Cell Microbiol , 7 (4), 471-479. Brown, G. (2006). Dectin-1: a signalling non-TLR pattern-recognition receptor. Nat Rev Immunol , 6 (1), 33-43. Brown, G., i Gordon, S. (2003). Fungal beta-glucans and mammalian immunity. Immunity , 19 (3), 311-5. Brown, G., i Gordon, S. (2001). Immune recognition. A new receptor for beta-glucans. Nature , 413 (6851), 36-7. Buelens C, Verhasselt V, De Groote D, Thielemans K, Goldman M, i Willems F. (1997). Human dendritic cell responses to lipopolysaccharide and CD40 ligation are differentially regulated by interleukin-10. Eur J Immunol , 27 (8), 1848-1852. Carcelain G, Tubiana R, Samri A, Calvez V, Delaugerre C, Agut H, i sar. (2001). Transient mobilization of human immunodeficiency virus (HIV)-specific CD4 T-helper cells fails to control virus rebounds during intermittent antiretroviral therapy in chronic HIV type 1 infection. J Virol , 75 (1), 234-241. Carnaud C, Lee D, Donnars O, Park SH, Beavis A, Koezuka Y, i sar. (1999). Cutting edge: Cross-talk between cells of the innate immune system: NKT cells rapidly activate NK cells. J Immunol , 163 (9), 4647-4650. Caux C, Vanbervliet B, Massacrier C, Dezutter-Dambuyant C, de Saint-Vis B, Jacquet C, i sar. (1996). CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J Exp Med , 184 (2), 695-706. Cella M, Scheidegger D, Palmer-Lehmann K, Lane P, Lanzavecchia A, i Alber G. (1996). Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and enhances T cell stimulatory capacity: T-T help via APC activation. J Exp Med , 184 (2), 747-752. Cella M, Sallusto F, i Lanzavecchia A. (1997). Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Immunol , 9, 10-16. Cella, M., Jarrossay, D., Facchetti, F., Alebardi, O., Nakajima, H., Lanzavecchia, A., i sar. (1999a). Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat Med , 5 (8), 919-23. Cella M, Salio M, Sakakibara Y, Langen H, Julkunen I, i Lanzavecchia A. (1999b). Maturation, activation, and protection of dendritic cells induced by double-stranded RNA. J Exp Med , 189, 821-829. Literatura 133 Chehimi J, Campbell DE, Azzoni L, Bacheller D, Papasavvas E, Jerandi G, i sar. (2002). Persistent decreases in blood plasmacytoid dendritic cell number and function despite effective highly active antiretroviral therapy and increased blood myeloid dendritic cells in HIV-infected individuals. J Immunol , 168 (9), 4796-4801. Choudhury GG. (2004). A linear signal transduction pathway involving phosphatidylinositol 3-kinase, protein kinase Cepsilon, and MAPK in mesangial cells regulates interferon-gamma-induced STAT1alpha transcriptional activation. J Biol Chem , 279 (26), 27399-27409. Clark, E. (1990). CD40: A cytokine receptor in search of a ligand. Tissue Antigens , 35, 33-36. Coban C, Horii T, Akira S, i Ishii KJ. (2010). TLR9 and endogenous adjuvants of the whole blood-stage malaria vaccine. Expert Rev Vaccines , 9 (7), 775-784. Coley, W. (1906). Late results of the treatment of inoperable sarcoma by the mixed toxins of erysipelas and Bacillus prodigiosus. Am J Med Sci , 131, 375-430. Colic M, Jandric D, Stojic-Vukanic Z, Antic-Stankovic J, Popovic P, Vasilijic S, i sar. (2003). Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro using granulocyte-macrophage colony stimulating factor and low concentration of interleukin-4. Vojnosanit Pregl , 60 (5), 531-538. Collison LW, C. V., Brown, S., Rehg, J., Jones, M., Ni, H., Artis, D., i sar. (2010). IL-35- mediated induction of a potent regulatory T cell population. Nat Immunol , 11 (12), 1093-101. Colonna, i M. (2007). All roads lead to CARD9. Nat Immunol , 8, 554-555. Constant SL, i Bottomly K. (1997). Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. Annu Rev Immunol , 15, 297-322. Corcoran, L., Ferrero, I., Vremec, D., Lucas, K., Waithman, J., O'Keeffe, M., i sar. (2003). The lymphoid past of mouse plasmacytoid cells and thymic dendritic cells. J Immunol , 170 (10), 4926-32. Cote-Sierra, J., Foucras, G., Guo, L., Chiodetti, L., Young, H., Hu-Li, J., i sar. (2004). Interleukin 2 plays a central role in Th2 differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A , 101 (11), 3880-5. Croft M. (2009). The role of TNF superfamily members in T-cell function and diseases. Nat Rev Immunol , 9 (4), 271-285. Curti, A., Ratta, M., Corinti, S., Girolomoni, G., Ricci, F., Tazzari, P., i sar. (2001). Interleukin-11 induces Th2 polarization of human CD4(+) T cells. Blood , 97 (9), 2758- 63. Literatura 134 Cusson-Hermance, N., Khurana, S., Lee, T., Fitzgerald, K., i Kelliher, M. (2005). Rip1 mediates the Trif-dependent toll-like receptor 3- and 4-induced NF-{kappa}B activation but does not contribute to interferon regulatory factor 3 activation. J Biol Chem , 280 (44), 36560-6. Czop, J. (1986). The role of beta-glucan receptors on blood and tissue leukocytes in phagocytosis and metabolic activation. Pathol Immunopathol Res , 5 (35), 286-96. D'Amico A, i Wu L. (2003). The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J Exp Med , 198 (2), 293-303. Dauer, M., Obermaier, B., Herten, J., Haerle, C., Pohl, K., Rothenfusser, S., i sar. (2003). Mature dendritic cells derived from human monocytes within 48 hours: a novel strategy for dendritic cell differentiation from blood precursors. J Immunol , 170 (8), 4069-76. David M, Petricoin E, 3rd, Benjamin C, Pine R, Weber MJ, i sar. (1995). Requirement for MAP kinase (ERK2) activity in interferon alpha- and interferon beta-stimulated gene expression through STAT proteins. Science , 269 (5231), 1721-1723. Day CL, i Walker BD. (2003). Progress in defining CD4 helper cell responses in chronic viral infections. J Exp Med , 198 (12), 1773-1777. De Smedt, T., Pajak, B., Muraille, E., Lespagnard, L., Heinen, E., De Baetselier, P., i sar. (1996). Regulation of dendritic cell numbers and maturation by lipopolysaccharide in vivo. J Exp Med , 184 (4), 1413-1424. Decker, W., Li, S., Xing, D., Robinson, S., Yang, H., Steiner, D., i sar. (2008). Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother , 31 (2), 157-65. Dennehy KM, Willment JA, Williams DL, i Brown GD. (2009). Reciprocal regulation of IL- 23 and IL-12 following co-activation of Dectin-1 and TLR signaling pathways. Eur J Immunol , 39, 1379-1386. Detournay, O., Mazouz, N., Goldman, M., i Toungouz, M. (2005). IL-6 produced by type I IFN DC controls IFN-gamma production by regulating the suppressive effect of CD4+ CD25+ regulatory T cells. Hum Immunol , 66 (5), 460-8. DeVries IJ, Krooshoop DJ, Scharenborg NM, Lesterhuis WJ, Diepstra JH, Van Muijen GN, i sar. (2003). Effective migration of antigen-pulsed dendritic cells to lymph nodes in melanoma patients is determined by their maturation state. Cancer Res , 63, 12-17. Literatura 135 Diao J, Winter E, Cantin C, Chen W, Xu L, Kelvin D, i sar. (2006). In situ replication of immediate dendritic cell (DC) precursors contributes to conventional DC homeostasis in lymphoid tissue. J Immunol , 176 (12), 7196-7206. Diebold, S., Kaisho, T., Hemmi, H., Akira, S., i Reis e Sousa, C. (2004). Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science , 303 (5663), 1529-31. Diveu, C. M., Boniface, K., Stumhofer, J., Sathe, M., Joyce-Shaikh, B., Chen, Y., i sar. (2009). IL-27 blocks RORc expression to inhibit lineage commitment of Th17 cells. J Immunol , 182 (9), 5748-56. Dodge IL, Carr MW, Cernadas M, i Brenner MB. (2003). IL-6 production by pulmonary dendritic cells impedes Th1 immune responses. J Immunol , 170 (9), 4457-4464. Dong, J., McPherson, C., i Stambrook, P. (2002). Flt-3 ligand: a potent dendritic cell stimulator and novel antitumor agent. Cancer Biol Ther , 1 (5), 486-9. Dubey, C., Croft, M., i Swain, S. (1995). Costimulatory requirements of naive CD4+ T cells. ICAM-1 or B7-1 can costimulate naive CD4 T cell activation but both are required for optimum response. J Immunol , 155 (1), 45-57. Dubin PJ, i Kolls JK. (2008). Th17 cytokines and mucosal immunity. Immunol Rev , 226, 160-171. Duraisingham, S., Hornig, J., Gotch, F., i Patterson, S. (2009). TLR-stimulated CD34 stem cell-derived human skin-like and monocyte-derived dendritic cells fail to induce Th17 polarization of naive T cells but do stimulate Th1 and Th17 memory responses. J Immunol , 183 (4), 2242-51. Dustin, M., Tseng, S., Varma, R., i Campi, G. (2006). T cell-dendritic cell immunological synapses. Curr Opin Immunol , 18 (4), 512-6. Dzionek A, Inagaki Y, Okawa K, Nagafune J, Rock J, Sohma Y, i sar. (2002). Plasmacytoid dendritic cells: from specific surface markers to specific cellular functions. Hum Immunol , 63 (12), 1133-1148. Dzionek A, Sohma Y, Nagafune J, Cella M, Colonna M, Facchetti F, i sar. (2001). BDCA-2, a novel plasmacytoid dendritic cell-specific type II C-type lectin, mediates antigen capture and is a potent inhibitor of interferon alpha/beta induction. J Exp Med , 194 (12), 1823-1834. Dzopalic, T., Dragicevic, A., Vasilijic, S., Vucevic, D., Majstorovic, I., Bozic, B., i sar. (2010). Loxoribine, a selective Toll-like receptor 7 agonist, induces maturation of human monocyte-derived dendritic cells and stimulates their Th-1- and Th-17- polarizing capability. Int Immunopharmacol , 10 (11), 1428-33. Literatura 136 Ehser S, Chuang JJ, Kleist C, Sandra-Petrescu F, Iancu M, Wang D, i sar. (2008). Suppressive dendritic cells as a tool for controlling allograft rejection in organ transplantation: promises and difficulties. Hum Immunol , 69 (3), 165-173. Facchetti, F., Vermi, W., Santoro, A., Vergoni, F., Chilosi, M., i Doglioni, C. (2003). Neoplasms derived from plasmacytoid monocytes/interferon-producing cells: variability of CD56 and granzyme B expression. Am J Surg Pathol , 27 (11), 1492-3. Fadok VA, Bratton DL, Rose DM, Pearson A, Ezekewitz RA, i Henson PM. (2000). A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells. Nature , 405 (6782), 85-90. Falch BH, Espevik T, Ryan L, i Stokke BT. (2000). The cytokine stimulating activity of (1-->3)-beta-D-glucans is dependent on the triple helix conformation. Carbohydr Res , 329 (3), 587-596. Farrar MA, Fernandez-Luna J, i Schreiber RD. (1991). Identification of two regions within the cytoplasmic domain of the human interferon-gamma receptor required for function. J Biol Chem , 266 (29), 19626-19635. Farrar, J., Asnagli, H., i Murphy, K. (2002). T helper subset development: roles of instruction, selection, and transcription. J Clin Invest , 109 (4), 431-5. Fernandez NC, Lozier A, Flament C, Ricciardi-Castagnoli P, Bellet D, Suter M, i sar. (1999). Dendritic cells directly trigger NK cell functions: cross-talk relevant in innate anti-tumor immune responses in vivo. Nat Med , 5 (4), 405-411. Ferwerda G, Meyer-Wentrup F, Kullberg BJ, Netea MG, i Adema GJ. (2008). Dectin-1 synergizes with TLR2 and TLR4 for cytokine production in human primary monocytes and macrophages. Cell Microbiol , 10 (10), 2058-2066. Figdor CG, van Kooyk Y, i Adema GJ. (2002). C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cells. Nat Rev Immunol , 2 (2), 77-84. Förster, R., Davalos-Misslitz, A., i Rot, A. (2008). CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance. Nat Rev Immunol , 8 (5), 362-71. Foti M, Granucci F, Aggujaro D, Liboi E, Luini W, Minardi S, i sar. (1999). Upon dendritic cell (DC) activation chemokines and chemokine receptor expression are rapidly regulated for recruitment and maintenance of DC at the inflammatory site. Int Immunol , 11 (6), 979-986. Fotin-Mleczek, M., Henkler, F., Samel, D., Reichwein, M., Hausser, A., Parmryd, I., i sar. (2002). Apoptotic crosstalk of TNF receptors: TNF-R2-induces depletion of TRAF2 and IAP proteins and accelerates TNF-R1-dependent activation of caspase-8. J Cell Sci , 115 (13), 2757-70. Literatura 137 Frucht DM, Fukao T, Bogdan C, Schindler H, O'Shea JJ, i Koyasu S. (2001). IFN-gamma production by antigen-presenting cells: mechanisms emerge. Trends Immunol , 22 (10), 556-560. Fujii S, Shimizu K, Kronenberg M, i Steinman RM. (2002). Prolonged IFN-gamma- producing NKT response induced with alpha-galactosylceramide-loaded DCs. Nat Immunol , 3 (9), 867-874. Gantner BN, Simmons RM, Canavera SJ, Akira S, i Underhill DM. (2003). Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J Exp Med , 197 (9), 1107-1117. Garcia F, Climent N, Assoumou L, Gil C, Gonzalez N, Alcami J, i sar. (2011). A therapeutic dendritic cell-based vaccine for HIV-1 infection. J Infect Dis , 203 (4), 473-478. Garcia F, Plana M, Vidal C, Cruceta A, O'Brien WA, Pantaleo G, i sar. (1999). Dynamics of viral load rebound and immunological changes after stopping effective antiretroviral therapy. Aids , 13 (11), F79-86. Garrigan K, Moroni-Rawson P, McMurray C, Hermans I, Abernethy N, Watson J, i sar. (1996). Functional comparison of spleen dendritic cells and dendritic cells cultured in vitro from bone marrow precursors. Blood , 88 (9), 3508-3512. Gautier, G., Humbert, M., Deauvieau, F., Scuiller, M., Hiscott, J., Bates, E., i sar. (2005). A type I interferon autocrine-paracrine loop is involved in Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by dendritic cells. J Exp Med , 201 (9), 1435-46. Geijtenbeek, T., Torensma, R., van Vliet, S., van Duijnhoven, G., Adema, G., van Kooyk, Y., i sar. (2000a). Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell , 100 (5), 575-85. Geijtenbeek TB, Kwon DS, Torensma R, van Vliet SJ, van Duijnhoven GC, Middel J, i sar. (2000b). DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans- infection of T cells. Cell , 100 (5), 587-597. Geijtenbeek TB, van Vliet SJ, Engering A, t Hart BA, i van Kooyk Y. (2004). Self- and nonself-recognition by C-type lectins on dendritic cells. Annu Rev Immunol , 22, 33-54. Geissmann F, Prost C, Monnet JP, Dy M, Brousse N, i Hermine O. (1998). Transforming growth factor beta1, in the presence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and interleukin 4, induces differentiation of human peripheral blood monocytes into dendritic Langerhans cells. J Exp Med , 187 (6), 961-966. Gerosa F, Baldani-Guerra B, Lyakh LA, Batoni G, Esin S, i Winkler-Pickett RT et al. (2008). Differential regulation of interleukin 12 and interleukin 23 production in human dendritic cells. J Exp Med , 205, 1447–1461. Literatura 138 Gessani S, i Belardelli F. (1998). IFN-gamma expression in macrophages and its possible biological significance. Cytokine Growth Factor Rev , 9 (2), 117-123. Gilboa E. (2007). DC-based cancer vaccines. J Clin Invest , 117 (5), 1195-1203. Glimcher LH, i Murphy KM. (2000). Lineage commitment in the immune system: the T helper lymphocyte grows up. Genes Dev , 14, 1693-1711. Goldrath AW, i Bevan MJ. (1999). Selecting and maintaining a diverse T-cell repertoire. Nature , 402 (6759), 255-262. Gorden, K., Gorski, K., Gibson, S., Kedl, R., Kieper, W., Qiu, X., i sar. (2005). Synthetic TLR agonists reveal functional differences between human TLR7 and TLR8. J Immunol , 174 (3), 1259-68. Goriely, S., Molle, C., Nguyen, M., Albarani, V., Haddou, N., Lin, R., i sar. (2005). Interferon regulatory factor 3 is involved in Toll-like receptor 4 (TLR4)- and TLR3- induced IL-12p35 gene activation. Blood , 107 (3), 1078-84. Grakoui, A., Bromley, S., Sumen, C., Davis, M., Shaw, A., Allen, P., i sar. (1999). The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science , 285 (5425), 221-7. Greenlund AC, Farrar MA, Viviano BL, i Schreiber RD. (1994). Ligand-induced IFN gamma receptor tyrosine phosphorylation couples the receptor to its signal transduction system (p91). Embo J , 13 (7), 1591-1600. Greenwald, R., Freeman, G., i Sharpe, A. (2005). The B7 family revisited. Annu Rev Immunol , 23, 515-48. Grell M, Becke FM, Wajant H, Mannel DN, i Scheurich P. (1998). TNF receptor type 2 mediates thymocyte proliferation independently of TNF receptor type 1. Eur J Immunol , 28 (1), 257-263. Grell, M., Doun, i. E., Wajant, H., Löhden, M., Clauss, M., Maxeiner, B., i sar. (1995). The transmembrane form of tumor necrosis factor is the prime activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor. Cell , 83 (5), 793-802. Grewal IS, i Flavell RA. (1996). The role of CD40 ligand in costimulation and T-cell activation. Immunol Rev , 153, 85-106. Gringhuis SI, den Dunnen J, Litjens M, van der Vlist M, Wevers B, Bruijns SCM, i sar. (2009). Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF- kappaB activation through Raf-1 and Syk. Nat Immunol , 10, 203-213. Literatura 139 Gross O, Gewies A, Finger K, Schäfer M, Sparwasser T, Peschel C, i sar. (2006). Card9 controls a non-TLR signalling pathway for innate anti-fungal immunity. Nature , 442, 651-656. Grouard G, Rissoan MC, Filgueira L, Durand I, Banchereau J, i Liu YJ. (1997). The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. J Exp Med , 185 (6), 1101-1111. Gunn, M., Tangemann, K., Tam, C., Cyster, J., Rosen, S., i Williams, L. (1998). A chemokine expressed in lymphoid high endothelial venules promotes the adhesion and chemotaxis of naive T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A , 95 (1), 258-63. Haas T, Metzger J, Schmitz F, Heit A, Muller T, Latz E, i sar. (2008). The DNA sugar backbone 2' deoxyribose determines toll-like receptor 9 activation. Immunity , 28 (3), 315-323. Hart DN, i McKenzie JL. (1988). Isolation and characterization of human tonsil dendritic cells. J Exp Med , 168 (1), 157-170. Hart, D., i Prickett, T. (1993). Intercellular adhesion molecule-2 (ICAM-2) expression on human dendritic cells. Cell Immunol , 148 (2), 447-54. Heath WR, i Carbone FR. (2009). Dendritic cell subsets in primary and secondary T cell responses at body surfaces. Nat Immunol , 10 (12), 1237-1244. Hehlgans, T., i Pfeffer, K. (2005). The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology , 115 (1), 1-20. Heil, F., Ahmad-Nejad, P., Hemmi, H., Hochrein, H., Ampenberger, F., Gellert, T., i sar. (2003). The Toll-like receptor 7 (TLR7)-specific stimulus loxoribine uncovers a strong relationship within the TLR7, 8 and 9 subfamily. Eur J Immunol , 33 (11), 2987-97. Henn V, Slupsky JR, Grafe M, Anagnostopoulos I, Forster R, Muller-Berghaus G, i sar. (1998). CD40 ligand on activated platelets triggers an inflammatory reaction of endothelial cells. Nature , 391 (6667), 591-594. Henri, S., Vremec, D., Kamath, A., Waithman, J., Williams, S., Benoist, C., i sar. (2001). The dendritic cell populations of mouse lymph nodes. J Immunol , 167 (2), 741-8. Herre J, Gordon S, i Brown GD. (2004). Dectin-1 and its role in the recognition of beta- glucans by macrophages. Mol Immunol , 40 (12), 869-876. Higashi T, Hashimoto K, Takagi R, Mizuno Y, Okazaki Y, Tanaka Y, i sar. (2010). Curdlan Induces DC-Mediated Th17 Polarization via Jagged1 Activation in Human Dendritic Cells. Allergol Int , 59, 161–166. Literatura 140 Hilton, D., Richardson, R., Alexander, W., Viney, E., Willson, T., Sprigg, N., i sar. (1998). Twenty proteins containing a C-terminal SOCS box form five structural classes. Proc Natl Acad Sci USA , 95, 114-9. Hirata N, Yanagawa Y, Ogura H, Satoh M, Noguchi M, Matsumoto M, i sar. (2011). The role of tumor necrosis factor-alpha for interleukin-10 production by murine dendritic cells. Cell Immunol , 266 (2), 165-171. Ho IC, Hodge MR, Rooney JW, i Glimcher LH. (1996). The proto-oncogene c-maf is responsible for tissue-specific expression of interleukin-4. Cell , 85 (7), 973-983. Hochrein H, Shortman K, Vremec D, Scott B, Hertzog P, i O'Keeffe M. (2001). Differential production of IL-12, IFN-alpha, and IFN-gamma by mouse dendritic cell subsets. J Immunol , 166 (9), 5448-5455. Hoffmann, J., Reichhart, J., i Hetru, C. (1996). Innate immunity in higher insects. Curr Opin Immunol , 8 (1), 8-13. Honda, K., Yanai, H., Negishi, H., Asagiri, M., Sato, M., Mizutani, T., i sar. (2005). IRF-7 is the master regulator of type-I interferon-dependent immune responses. Nature , 434 (7034), 772-7. Hornung, V., Guenthner-Biller, M., Bourquin, C., Ablasser, A., Schlee, M., Uematsu, S., i sar. (2005). Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat Med , 11 (3), 263-70. Hsu YMS, Zhang Y, You Y, Wang D, Li H, Duramad O, i sar. (2007). The adaptor protein CARD9 is required for innate immune responses to intracellular pathogens. Nat Immunol , 8, 198-205. Huber AK, Jacobson EM, Jazdzewski K, Concepcion ES, i Tomer Y. (2008). Interleukin (IL)-23 receptor is a major susceptibility gene for Graves' ophthalmopathy: the IL- 23/T-helper 17 axis extends to thyroid autoimmunity. J Clin Endocrinol Metab , 93 (3), 1077-1081. Hunter, C. (2005). New IL-12-family members: IL-23 and IL-27, cytokines with divergent functions. Nat Rev Immunol , 5 (7), 521-31. Ikeda H, Old LJ, i Schreiber RD. (2002). The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev , 13, 95- 109. Inaba K, Inaba M, Deguchi M, Hagi K, Yasumizu R, Ikehara S, i sar. (1993). Granulocytes, macrophages, and dendritic cells arise from a common major histocompatibility complex class II-negative progenitor in mouse bone marrow. Proc Natl Acad Sci U S A , 90 (7), 3038-3042. Literatura 141 Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., Ikehara, S., i sar. (1992). Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med , 176 (6), 1693-702. Isaacs A, i Lindenmann J. (1957). Virus interference I, The interferon. Proc R Soc Lond B Biol Sci , 147 (927), 258-267. Izon D, Rudd K, DeMuth W, Pear WS, Clendenin C, Lindsley RC, i sar. (2001). A common pathway for dendritic cell and early B cell development. J Immunol , 167 (3), 1387- 1392. Janeway, C. J. (1992). The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today , 13 (1), 11-16. Janeway, C. J., i Medzhitov, R. (2002). Innate immune recognition. Annu Rev Immunol , 20, 197-216. Jankovic D, i Trinchieri G. (2007). IL-10 or not IL-10: that is the question. Nat Immunol , 8, 1281-1283. Jarrossay, D., Napolitani, G., Colonna, M., Sallusto, F., i Lanzavecchia, A. (2001). Specialization and complementarity in microbial molecule recognition by human myeloid and plasmacytoid dendritic cells. Eur J Immunol , 31 (11), 3388-93. Jego G, Pascual V, Palucka AK, i Banchereau J. (2005). Dendritic cells control B cell growth and differentiation. Curr Dir Autoimmun , 8, 124-139. Jeras, M., Bergant, M., i Repnik, U. (2005). In vitro preparation and functional assessment of human monocyte-derived dendritic cells-potential antigen-specific modulators of in vivo immune responses. Transpl Immunol , 14 (3-4), 231-44. Jin, M., Kim, S., Heo, J., Lee, M., Kim, H., Paik, S., i sar. (2007). Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated lipopeptide. Cell , 130 (6), 1071-82. Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, Steinbrink K, Paragnik, L, i sar. (1997). Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol , 27, 3135-3142. Jurgens B, Hainz U, Fuchs D, Felzmann T, i Heitger A. (2009). Interferon-gamma- triggered indoleamine 2,3-dioxygenase competence in human monocyte-derived dendritic cells induces regulatory activity in allogeneic T cells. Blood , 114 (15), 3235- 3243. Literatura 142 Kadowaki, N., Ho, S., Antonenko, S., Malefyt, R., Kastelein, R., Bazan, F., i sar. (2001). Subsets of human dendritic cell precursors express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. J Exp Med , 194 (6), 863-9. Kaliński, P., Schuitemaker, J., Hilkens, C., Wierenga, E., i Kapsenberg, M. (1999). Final maturation of dendritic cells is associated with impaired responsiveness to IFN-gamma and to bacterial IL-12 inducers: decreased ability of mature dendritic cells to produce IL-12 during the interaction with Th cells. J Immunol , 162 (6), 3231-6. Kamiya, S., Owaki, T., Morishima, N., Fukai, F., Mizuguchi, J., i Yoshimoto, T. (2004). An indispensable role for STAT1 in IL-27-induced T-bet expression but not proliferation of naive CD4+ T cells. J Immunol , 173 (6), 3871-7. Kaplan DH, Greenlund AC, Tanner JW, Shaw AS, i Schreiber RD. (1996). Identification of an interferon-gamma receptor alpha chain sequence required for JAK-1 binding. J Biol Chem , 271 (1), 9-12. Kaplan, M., Schindler, U., Smiley, S., i Grusby, M. (1996). Stat6 is required for mediating responses to IL-4 and for development of Th2 cells. Immunity , 4 (3), 313-9. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., i Weissman, I. (2003). Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J Exp Med , 198 (2), 305-13. Karsunky, H., Merad, M., Mende, I., Manz, M., i Engleman, E. (2005). Developmental origin of interferon-alpha-producing dendritic cells from hematopoietic precursors. Exp Hematol , 33 (2), 173-81. Kawai T, i Akira S. (2007). Antiviral signaling through pattern recognition receptors. J Biochem , 141 (2), 137-145. Kawai, T., i Akira, S. (2010). The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat Immunol , 11 (5), 373-84. Kawamura T, Gatanaga H, Borris DL, Connors M, Mitsuya H, i Blauvelt A. (2003). Decreased stimulation of CD4+ T cell proliferation and IL-2 production by highly enriched populations of HIV-infected dendritic cells. J Immunol , 170 (8), 4260-4266. Kidd, P. (2003). Th1/Th2 balance: the hypothesis, its limitations, and implications for health and disease. Altern Med Rev , 8 (3), 223-46. Kim, Y., Brinkmann, M., Paquet, M., i Ploegh, H. (2008). UNC93B1 delivers nucleotide- sensing toll-like receptors to endolysosomes. Nature , 452 (7184), 234-8. Koch F, Stanzl U, Jennewein P, Janke K, Heufler C, Kampgen E, i sar. (1996). High level IL-12 production by murine dendritic cells: upregulation via MHC class II and CD40 molecules and downregulation by IL-4 and IL-10. J Exp Med , 184 (2), 741-746. Literatura 143 Kondo M, Wagers AJ, Manz MG, Prohaska SS, Scherer DC, Beilhack GF, i sar. (2003). Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu Rev Immunol , 21, 759-806. Korn T, Bettelli E, Oukka M, i Kuchroo VK. (2009). IL-17 and Th cells. Annu Rev Immunol , 27, 485–517. Kotenko SV, Izotova LS, Pollack BP, Mariano TM, Donnelly RJ, Muthukumaran G, i sar. (1995). Interaction between the components of the interferon gamma receptor complex. J Biol Chem , 270 (36), 20915-20921. Krebs DL, i Hilton DJ. (2001). SOCS proteins: negative regulators of cytokine signaling. Stem Cells , 19 (5), 378-387. Kriegler M, Perez C, DeFay K, Albert I, i Lu SD. (1988). A novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF. Cell , 53 (1), 45-53. Krishnamoorthy, N., Oriss, T., Paglia, M., Ray, A., i Ray, P. (2007). A critical role for IL-6 secretion by dendritic cells promoting Th2 and limiting Th1 response. J Immunol , 178, 95.24. Kryczek I, Banerjee M, Cheng P, Vatan L, Szeliga W, i Wei S et al. (2009). Phenotype, distribution, generation functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments. Blood , 6, 1141-1149. Lafaille JJ. (1998). The role of helper T cell subsets in autoimmune diseases. Cytokine Growth Factor Rev , 9 (2), 139-151. Langenkamp, A., Casorati, G., Garavaglia, C., Dellabona, P., Lanzavecchia, A., i Sallusto, F. (2002). T cell priming by dendritic cells: thresholds for proliferation, differentiation and death and intraclonal functional diversification. Eur J Immunol , 32 (7), 2046-54. Langenkamp, A., Messi, M., Lanzavecchia, A., i Sallusto, F. (2000). Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming of TH1, TH2 and nonpolarized T cells. Nat Immunol , 1 (4), 311-6. Langerhans, P. (1868). Ueber die Nerven der Menschlichen Haut. Virch Arch Pathol Anat , 44, 325-37. Laouini, D., Alenius, H., Bryce, P., Oettgen, H., Tsitsikov, E., i Geha, R. (2003). IL-10 is critical for Th2 responses in a murine model of allergic dermatitis. J Clin Invest , 112 (7), 1058-66. Lapenta C, Santini SM, Logozzi M, Spada M, Andreotti M, Di Pucchio T, i sar. (2003). Potent immune response against HIV-1 and protection from virus challenge in hu-PBL- Literatura 144 SCID mice immunized with inactivated virus-pulsed dendritic cells generated in the presence of IFN-alpha. J Exp Med , 198 (2), 361-367. Lapointe R, Toso JF, Butts C, Young HA, i Hwu P. (2000). Human dendritic cells require multiple activation signals for the efficient generation of tumor antigen-specific T lymphocytes. Eur J Immunol , 30, 3291-3298. Ledbetter, J., Shu, G., Gallagher, M., i Clark, E. (1987). Augmentation of normal and malignant B cell proliferation by monoclonal antibody to the B cell-specific antigen BP50 (CDW40). J Immunol , 138 (3), 788-94. Lee, J., Chuang, T., Redecke, V., She, L., Pitha, P., Carson, D., i sar. (2003). Molecular basis for the immunostimulatory activity of guanine nucleoside analogs: activation of Toll-like receptor 7. Proc Natl Acad Sci U S A , 100 (11), 6646-51. LeibundGut-Landmann, S, Gross O, Robinson MJ, Osorio F, Slack EC, i sar. (2007). Syk- and CARD9-dependent coupling of innate immunity to the induction of T helper cells that produce interleukin 17. Nat Immunol , 8, 630-638. Lemaitre B, Nicolas E, Michaut L, Reichhart JM, i Hoffmann JA. (1996). The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell , 86 (6), 973-983. Letvin NL, i Walker BD. (2003). Immunopathogenesis and immunotherapy in AIDS virus infections. Nat Med , 9 (7), 861-866. Li, Z., Pradera, F., Kammertoens, T., Li, B., Liu, S., i Qin, Z. (2007). Cross-talk between T cells and innate immune cells is crucial for IFN-gamma-dependent tumor rejection. J Immunol , 179 (3), 1568-76. Liblau R, Singer, S, McDevitt, i H. (1995). Th1 and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases. Immunol Today , 16, 34–38. Lipscomb, M., i Masten, B. (2002). Dendritic cells: immune regulators in health and disease. Physiol Rev , 82 (1), 97-130. Liu S, Yu Y, Zhang M, Wang W, i Cao X. (2001). The involvement of TNF-alpha-related apoptosis-inducing ligand in the enhanced cytotoxicity of IFN-beta-stimulated human dendritic cells to tumor cells. J Immunol , 166 (9), 5407-5415. Liu, Y., Kanzler, H., Soumelis, V., i Gilliet, M. (2001). Dendritic cell lineage, plasticity and cross-regulation. Nat Immunol , 2 (7), 585-589. Logue, E., i Sha, W. (2004). CD28-B7 bidirectional signaling: a two-way street to activation. Nat Immunol , 5 (11), 1134-42. Literatura 145 Lombardi, V., Van Overtvelt, L., Horiot, S., i Moingeon, P. (2009). Human dendritic cells stimulated via TLR7 and/or TLR8 induce the sequential production of Il-10, IFN- gamma, and IL-17A by naive CD4+ T cells. J Immunol , 182 (6), 3372-9. Lucas M, Schachterle W, Oberle K, Aichele P, i Diefenbach A. (2007). Dendritic cells prime natural killer cells by trans-presenting interleukin 15. Immunity , 26 (4), 503- 517. Lucas, S., Ghilardi, N., Li, J., i de Sauvage, F. (2003). IL-27 regulates IL-12 responsivness of CD4+ T cells through Stat1-dependent and –independent mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA , 100 (25), 15047-52. Ludewig B, Henn V, Schroder JM, Graf D, i Kroczek RA. (1996). Induction, regulation, and function of soluble TRAP (CD40 ligand) during interaction of primary CD4+ CD45RA+ T cells with dendritic cells. Eur J Immunol , 26 (12), 3137-3143. Lukacs-Kornek, V., Engel, D., Tacke, F., i Kurts, C. (2008). The role of chemokines and their receptors in dendritic cell biology. Front Biosci , 13, 2238-52. Lundie, R., de Koning-Ward, T., Davey, G., Nie, C., Hansen, D., Lau, L., i sar. (2008). Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A , 105 (38), 14509-14. Luther, S., Tang, H., Hyman, P., Farr, A., i Cyster, J. (2000). Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proc Natl Acad Sci USA , 97, 12694-9. Lutz MB, i Schuler G. (2002). Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol , 23 (9), 445-449. Lutz MB, Kukutsch N, Ogilvie AL, Rossner S, Koch F, Romani N, i sar. (1999). An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods , 223 (1), 77-92. MacDonald KP, Munster DJ, Clark GJ, Dzionek A, Schmitz J, i Hart DN. (2002). Characterization of human blood dendritic cell subsets. Blood , 100 (13), 4512-4520. Mach, F., Schönbeck, U., Sukhova, G., Bourcier, T., Bonnefoy, J., Pober, J., i sar. (1997). Functional CD40 ligand is expressed on human vascular endothelial cells, smooth muscle cells, and macrophages: implications for CD40-CD40 ligand signaling in atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A , 94 (5), 1931-6. Mackey MF, Gunn JR, Maliszewsky C, Kikutani H, Noelle RJ, Barth RJ, i sar. (1998). Dendritic cells require maturation via CD40 to generate protective antitumor immunity. J Immunol , 161 (5), 2094-2098. Literatura 146 Mahboubi K, i Pober JS. (2002). Activation of signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) is not sufficient for the induction of STAT1-dependent genes in endothelial cells. Comparison of interferon-gamma and oncostatin M. J Biol Chem , 277 (10), 8012-8021. Mäkelä, S., Strengell, M., Pietilä, T., Osterlund, P., i Julkunen, I. (2009). Multiple signaling pathways contribute to synergistic TLR ligand-dependent cytokine gene expression in human monocyte-derived macrophages and dendritic cells. J Leukoc Biol , 85 (4), 664-72. Malissen, B., i Ewbank, J. (2005). 'TaiLoRing' the response of dendritic cells to pathogens. Nature Immunol , 6 (8), 749-50. Malu, S., Srinivasan, S. K., Maiti, P., Rajagopal, D., John, B., i Nandi, D. (2003). IFN- gamma bioassay: development of a sensitive method by measuring nitric oxide production by peritoneal exudate cells from C57BL/6 mice. J Immunol Methods. , 272 (1-2), 55-65. Mangan PR, Harrington LE, O'Quinn DB, Helms WS, Bullard DC, Elson CO, i sar. (2006). Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)17 lineage. Nature , 441 (7090), 231-234. Manz MG, Traver D, Akashi K, Merad M, Miyamoto T, Engleman EG, i sar. (2001). Dendritic cell development from common myeloid progenitors. Ann N Y Acad Sci , 938, 167-173 discussion 73-74. Marshall AS, Willment JA, Lin HH, Williams DL, Gordon S, i Brown GD. (2004). Identification and characterization of a novel human myeloid inhibitory C-type lectin- like receptor (MICL) that is predominantly expressed on granulocytes and monocytes. J Biol Chem , 279 (15), 14792-147802. Martin P, del Hoyo GM, Anjuere F, Ruiz SR, Arias CF, Marin AR, i sar. (2000). Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood , 96 (7), 2511-2519. Martin-Orozco N, Muranski P, Chung Y, Yang XO, Yamazaki T, Lu S, i sar. (2009). T helper 17 cells promote cytotoxic T cell activation in tumor immunity. Immunity , 31, 787-798. Matsumoto, M., i Seya, T. (2008). TLR3: interferon induction by double-stranded RNA including poly(I:C). Adv Drug Deliv Rev , 60 (7), 805-12. McCoy MK, i Tansey MG. (2008). TNF signaling inhibition in the CNS: implications for normal brain function and neurodegenerative disease. J Neuroinflammation , 5, 45. Literatura 147 McIlroy D, i Gregoire M. (2003). Optimizing dendritic cell-based anticancer immunotherapy: maturation state does have clinical impact. Cancer Immunol Immunother , 52 (10), 583-591. McKenzie, B., Kastelein, R., i Cua, D. (2005). Understanding the IL-23-IL-17 immune pathway. Trends Immunol , 27 (1), 17-23. Medzhitov R, Janeway CA, i Jr. (1997). Innate immunity: impact on the adaptive immune response. Curr Opin Immunol , 9 (1), 4-9. Medzhitov, R., i Janeway, C. J. (1997). Innate Immunity: The Virtues of a Nonclonal System of Recognition. Cell , 91 (3). Medzhitov, R., Preston-Hurlburt, P., i Janeway, C. J. (1997). A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. Nature , 388 (6640), 394-7. Merad M, i Manz MG. (2009). Dendritic cell homeostasis. Blood , 113 (15), 3418-3427. Meylan, E., Burns, K., Hofmann, K., Blancheteau, V., Martinon, F., Kelliher, M., i sar. (2004). RIP1 is an essential mediator of Toll-like receptor 3-induced NF-kappa B activation. Nat Immunol , 5 (5), 503-7. Miyahara Y, Odunsi K, Chen W, Peng G, Matsuzaki J, i Wang RF. (2008). Generation and regulation of human CD4+IL-17-producing T cells in ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci USA , 105, 15505-15510. Miyazaki T, Oikawa N, Yadomae T, Yamada H, Yamada Y, Hsu HY, i sar. (1979). Relationship between the chemical structure and anti-tumour activity of glucans prepared from Grifora umbellata. Carbohydr Res , 69, 165-170. Mocellin S, Rossi CR, Pilati P, i Nitti D. (2005). Tumor necrosis factor, cancer and anticancer therapy. Cytokine Growth Factor Rev , 16 (1), 35-53. Molle, C., Nguyen, M., Flamand, V., Renneson, J., Trottein, F., De Wit, D., i sar. (2007). IL-27 synthesis induced by TLR ligation critically depends on IFN regulatory factor 3. J Immunol , 178 (12), 7607-15. Mullen AC, High FA, Hutchins AS, Lee HW, Villarino AV, Livingston DM, i sar. (2001). Role of T-bet in commitment of TH1 cells before IL-12-dependent selection. Science , 292 (5523), 1907-1910. Munder M, Mallo M, Eichmann K, i Modolell M. (2001). Direct stimulation of macrophages by IL-12 and IL-18 - a bridge built on solid ground. Immunol Lett , 75 (2), 159-160. Literatura 148 Munn DH, Sharma MD, Lee JR, Jhaver KG, Johnson TS, Keskin DB, i sar. (2002). Potential regulatory function of human dendritic cells expressing indoleamine 2,3-dioxygenase. Science , 297 (5588), 1867-1870. Muranski P, Boni A, Antony PA, Cassard L, Irvine KR, Kaiser A, i sar. (2008). Tumor- specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood , 112, 362- 373. Murphy, K., Ouyang, W., Farrar, J., Yang, J., Ranganath, S., Asnagli, H., i sar. (2000). Signaling and transcription in T helper development. Annu Rev Immunol , 18, 451-94. Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, D'amico G, Stoppacciaro A, Mancinelli R, i sar. (2000). Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells. J Immunol , 164, 5998-6004. Naik SH, Metcalf D, van Nieuwenhuijze A, Wicks I, Wu L, O'Keeffe M, i sar. (2006). Intrasplenic steady-state dendritic cell precursors that are distinct from monocytes. Nat Immunol , 7 (6), 663-671. Naik, S., Sathe, P., Park, H., Metcalf, D., Proietto, A., Dakic, A., i sar. (2007). Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat Immunol , 8 (11), 1217-26. Napolitani, G., Rinaldi, A., Bertoni, F., Sallusto, F., i Lanzavecchia, A. (2005). Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1- polarizing program in dendritic cells. Nat Immunol , 6 (8), 769-76. Nelson HS, i Loffert DT. (1994). Comparison of the bronchodilator response to albuterol administered by the OptiHaler, the AeroChamber, or by metered dose inhaler alone. Ann Allergy , 72 (4), 337-340. Nestle FO, Zheng XG, Thompson CB, Turka LA, i Nickoloff BJ. (1993). Characterization of dermal dendritic cells obtained from normal human skin reveals phenotypic and functionally distinctive subsets. J Immunol , 151 (11), 6535-6545. Nikolic T, Dingjan GM, Leenen PJ, i Hendriks RW. (2002). A subfraction of B220(+) cells in murine bone marrow and spleen does not belong to the B cell lineage but has dendritic cell characteristics. Eur J Immunol , 32 (3), 686-692. Noble, A., Truman, J., Vyas, B., Vukmanovic-Stejic, M., Hirst, W., i Kemeny, D. (2000). The balance of protein kinase C and calcium signaling directs T cell subset development. J Immunol , 164 (4), 1807-13. O'Doherty U, Peng M, Gezelter S, Swiggard WJ, Betjes M, Bhardwaj N, i sar. (1994). Human blood contains two subsets of dendritic cells, one immunologically mature and the other immature. Immunology , 82 (3), 487-493. Literatura 149 O'Garra, A., Vieira, P., Vieira, P., i Goldfeld, A. (2004). IL-10-producing and naturally occurring CD4+ Tregs: limiting collateral damage. J Clin Invest , 114 (10), 1372-8. Ogg GS, Jin X, Bonhoeffer S, Dunbar PR, Nowak MA, Monard S, i sar. (1998). Quantitation of HIV-1-specific cytotoxic T lymphocytes and plasma load of viral RNA. Science , 279 (5359), 2103-2106. Ohno, N., Adachi, Y., Ohsawa, M., Sato, K., Oikawa, S., i Yadomae, T. (1987). Conformational changes of the two different conformers of grifolan in sodium hydroxide, urea or dimethylsulfoxide solution. Chem Pharm Bull , 35 (5), 2108-13. O'Keeffe M, Hochrein H, Vremec D, Caminschi I, Miller JL, Anders EM, i sar. (2002). Mouse plasmacytoid cells: long-lived cells, heterogeneous in surface phenotype and function, that differentiate into CD8(+) dendritic cells only after microbial stimulus. J Exp Med , 196 (10), 1307-1319. O'malley, W., Achinstein, B., i Shear, M. (1962). Action of bacterial polysaccharide on tumours. II. Damage of sarcoma 37 by serum of mice treated with Serratia marcescens polysaccharide, and induced tolerance. J. Natl Cancer Inst , 29, 1169-75. Onai, N., Obata-Onai, A., Schmid, M., Ohteki, T., Jarrossay, D., i Manz, M. (2007). Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat Immunol , 8 (11), 1207-16. Ostrowski MA, Justement SJ, Ehler L, Mizell SB, Lui S, Mican J, i sar. (2000). The role of CD4+ T cell help and CD40 ligand in the in vitro expansion of HIV-1-specific memory cytotoxic CD8+ T cell responses. J Immunol , 165 (11), 6133-6141. Osugi Y, Vuckovic S, i Hart DN. (2002). Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood , 100 (8), 2858-2866. Otani T, Nakamura S, Toki M, Motoda R, Kurimoto M, i Orita K. (1999). Identification of IFN-gamma-producing cells in IL-12/IL-18-treated mice. Cell Immunol , 198 (2), 111- 119. Ouyang, W., Ranganath, S., Weindel, K., Bhattacharya, D., Murphy, T., Sha, W., i sar. (1998). Inhibition of Th1 development mediated by GATA-3 through an IL-4- independent mechanism. Immunity , 9 (5), 745-55. Ouyang, X., Negishi, H., Takeda, R., Fujita, Y., Taniguchi, T., i Honda, K. (2007). Cooperation between MyD88 and TRIF pathways in TLR synergy via IRF5 activation. Biochem Biophys Res Commun , 354 (4), 1045-51. Literatura 150 Owaki, T., Asakawa, M., Kamiya, S., Takeda, K., Fukai, F., Mizuguchi, J., i sar. (2006). IL- 27 suppresses CD28-mediated [correction of medicated] IL-2 production through suppressor of cytokine signaling 3. J Immunol , 176 (5), 2773-80. Park, B., Song, D., Kim, H., Choi, B., Lee, H., i Lee, J. (2009). The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex. Nature , 458 (7242), 1191-5. Pedersen AE, Buus S, i Claesson MH. (2006). Treatment of transplanted CT26 tumour with dendritic cell vaccine in combination with blockade of vascular endothelial growth factor receptor 2 and CTLA-4. Cancer Lett , 235, 229-338. Penn, I. (2000a). Cancers in renal translant recipients. Adv Ren Replace Ther , 7 (2), 147-59. Penn, I. (2000b). Post-transplant malignancy: the role of immunosuppression. Drug Saf , 23 (2), 101-13. Perussia B, Fanning V, i Trinchieri G. (1985). A leukocyte subset bearing HLA-DR antigens is responsible for in vitro alpha interferon production in response to viruses. Nat Immun Cell Growth Regul , 4 (3), 120-137. Pflanz S, Timans JC, Cheung J, Rosales R, Kanzler H, Gilbert J, i sar. (2002). IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD4+ T cells. Immunity , 16, 779-790. Pflanz, S., Hibbert, L., Mattson, J., Rosales, R., Vaisberg, E., Bazan, J., i sar. (2004). WSX- 1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducing receptor for IL-27. J Immunol , 172 (4), 2225-2231. Pitcher CJ, Quittner C, Peterson DM, Connors M, Koup RA, Maino VC, i sar. (1999). HIV- 1-specific CD4+ T cells are detectable in most individuals with active HIV-1 infection, but decline with prolonged viral suppression. Nat Med , 5 (5), 518-525. Plana M, Garcia F, Gallart T, Miro JM, i Gatell JM. (1998). Lack of T-cell proliferative response to HIV-1 antigens after 1 year of highly active antiretroviral treatment in early HIV-1 disease. Immunology Study Group of Spanish EARTH-1 Study. Lancet , 352 (9135), 1194-1195. Poltorak A, Smirnova I, He X, Liu MY, Van Huffel C, McNally O, i sar. (1998). Genetic and physical mapping of the Lps locus: identification of the toll-4 receptor as a candidate gene in the critical region. Blood Cells Mol Dis , 24 (3), 340-355. Prasanna SJ, Saha B, i Nandi D. (2007). Involvement of oxidative and nitrosative stress in modulation of gene expression and functional responses by IFNgamma. Int Immunol , 19 (7), 867-879. Literatura 151 Pulendran B, Banchereau J, Burkeholder S, Kraus E, Guinet E, Chalouni C, i sar. (2000). Flt3-ligand and granulocyte colony-stimulating factor mobilize distinct human dendritic cell subsets in vivo. J Immunol , 165 (1), 566-572. Pulendran B, van Driel R, i Nossal GJ. (1997). Immunological tolerance in germinal centres. Immunol Today , 18 (1), 27-32. Qi, H., Egen, J., Huang, A., i Germain, R. (2006). Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science , 312 (5780), 1672-6. Randolph GJ, Inaba K, Robbiani DF, Steinman RM, i Muller WA. (1999). Differentiation of phagocytic monocytes into lymph node dendritic cells in vivo. Immunity , 11 (6), 753-761. Reid CD, Stackpoole A, Meager A, i Tikerpae J. (1992). Interactions of tumor necrosis factor with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokines in the regulation of dendritic cell growth in vitro from early bipotent CD34+ progenitors in human bone marrow. J Immunol , 149 (8), 2681-2688. Reis e Sousa, C., Hieny, S., Scharton-Kersten, T., Jankovic, D., i Charest, H. (1997). In vivo microbial stimulation induces rapid CD40 ligand-independent production of interleukin 12 by dendritic cells and their redistribution to T cell areas. J Exp Med , 186 (11), 1819-29. Repnik U, Bergant M, Wraber B, i Jeras M. (2008). Late dendritic cells are still able to evoke a potent alloreactive CTL response. Immunobiology , 213 (1), 51-64. Rescigno M, Martino M, Sutherland CL, Gold MR, i Ricciardi-Castagnoli P. (1998). Dendritic cell survival and maturation are regulated by different signaling pathways. J Exp Med , 188 (11), 2175-2180. Rice PJ, Kelley JL, Kogan G, Ensley HE, Kalbfleisch JH, Browder IW, i sar. (2002). Human monocyte scavenger receptors are pattern recognition receptors for (1-->3)-beta-D- glucans. J Leukoc Biol , 72 (1), 140-146. Rissoan MC, Duhen T, Bridon JM, Bendriss-Vermare N, Peronne C, de Saint Vis B, i sar. (2002). Subtractive hybridization reveals the expression of immunoglobulin-like transcript 7, Eph-B1, granzyme B, and 3 novel transcripts in human plasmacytoid dendritic cells. Blood , 100 (9), 3295-3303. Rissoan MC, Soumelis V, Kadowaki N, Grouard G, Briere F, de Waal Malefyt R, i sar. (1999). Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation. Science , 283 (5405), 1183-1186. Roelofs, M., Joosten, L., Abdollahi-Roodsaz, S., van Lieshout, A., Sprong, T., van den Hoogen, F., i sar. (2005). The expression of toll-like receptors 3 and 7 in rheumatoid Literatura 152 arthritis synovium is increased and costimulation of toll-like receptors 3, 4, and 7/8 results in synergistic cytokine production by dendritic cells. Arthritis Rheum , 52 (8), 2313-22. Rogers PR, i Croft M. (2000). CD28, Ox-40, LFA-1, and CD4 modulation of Th1/Th2 differentiation is directly dependent on the dose of antigen. J Immunol , 164 (6), 2955- 2963. Rolink AG, Schaniel C, Andersson J, i Melchers F. (2001). Selection events operating at various stages in B cell development. Curr Opin Immunol , 13 (2), 202-207. Romani N, Lenz A, Glassel H, Stossel H, Stanzl U, Majdic O, i sar. (1989). Cultured human Langerhans cells resemble lymphoid dendritic cells in phenotype and function. J Invest Dermatol , 93 (5), 600-609. Romani, N., Holzmann, S., Tripp, C., Koch, F., i Stoitzner, P. (2003). Langerhans cells - dendritic cells of the epidermis. APMIS , 111 (7-8), 725-40. Romani, N., Lenz, A., Glassel, H., Stössel, H., Stanzl, U., Majdic, O., i sar. (1989). Cultured human Langerhans cells resemble lymphoid dendritic cells in phenotype and function. J Invest Dermatol , 93 (5), 600-9. Romano CC, Mendes-Giannini MJ, Duarte AJ, i Benard G. (2005). The role of interleukin- 10 in the differential expression of interleukin-12p70 and its beta2 receptor on patients with active or treated paracoccidioidomycosis and healthy infected subjects. Clin Immunol , 114 (1), 86-94. Ronnblom L, Forsgren A, i Alm GV. (1983). Characterization of interferons induced by bacteria and interferon-producing leukocytes in human peripheral blood. Infect Immun , 40 (1), 126-132. Roses RE, Xu S, Xu M, Koldovsky U, Koski G, i Czerniecki BJ. (2008). Differential Production of IL-23 and IL-12 by Myeloid-Derived Dendritic Cells in Response to TLR Agonists. J Immunol , 181, 5120–5127. Ross, G. (2000). Regulation of the adhesion versus cytotoxic functions of the Mac- 1/CR3/alphaMbeta2-integrin glycoprotein. Crit Rev Immunol , 20 (3), 197-22. Rouas R, Lewalle P, El Ouriaghli F, Nowak B, Duvillier H, i Martiat P. (2004). Poly (I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int Immunol , 16, 767-773. Rouyez MC, Lestingi M, Charon M, Fichelson S, Buzyn A, i Dusanter-Fourt I. (2005). IFN regulatory factor-2 cooperates with STAT1 to regulate transporter associated with antigen processing-1 promoter activity. J Immunol , 174 (7), 3948-3958. Literatura 153 Sabbagh L, Snell LM, i Watts TH. (2007). TNF family ligands define niches for T cell memory. Trends Immunol , 28 (8), 333-339. Saha, B., Jyothi Prasanna, S., Chandrasekar, B., i Nandi, D. (2010). Gene modulation and immunoregulatory roles of interferon gamma. Cytokine , 50 (1), 1-14. Sakaguchi S. (2005). Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol , 6 (4), 345-352. Sallusto F, i Lanzavecchia A. (1994). Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony- stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med , 179, 1109-1118. Sallusto F, i Lanzavecchia A. (2009). Heterogeneity of CD4+ memory T cells: Functional modules for tailored immunity. Eur J Immunol , 39 (8), 2076-2082. Sallusto, F., i Lanzavecchia, A. (2002). The instructive role of dendritic cells on T-cell responses. Arthritis Res , Suppl 3, S127-32. Sallusto, F., Schaerli, P., Loetscher, P., Schaniel, C., Lenig, D., Mackay, C., i sar. (1998). Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur J Immunol , 28 (9), 2760-9. Santegoets, S., Gibbs, S., Kroeze, K., van de Ven, R., Scheper, R., Borrebaeck, C., i sar. (2008). Transcriptional profiling of human skin-resident Langerhans cells and CD1a+ dermal dendritic cells: differential activation states suggest distinct functions. J leukocit Biol , 84 (1), 143-51. Saraiva M, Christensen JR, Veldhoen M, Murphy TL, Murphy KM, i O'Garra A. (2009). Interleukin-10 production by Th1 cells requires interleukin-12-induced STAT4 transcription factor and ERK MAP kinase activation by high antigen dose. Immunity , 31, 209-219. Schindler H, Lutz MB, Rollinghoff M, i Bogdan C. (2001). The production of IFN-gamma by IL-12/IL-18-activated macrophages requires STAT4 signaling and is inhibited by IL- 4. J Immunol , 166 (5), 3075-3082. Schmid, M., Kingston, D., Boddupalli, S., i Manz, M. (2010). Instructive cytokine signals in dendritic cell lineage commitment. Immunol Rev , 234 (1), 32-44. Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, i Hume DA. (2004). Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol , 75 (2), 163-189. Schuler G, i Steinman RM. (1985). Murine epidermal Langerhans cells mature into potent immunostimulatory dendritic cells in vitro. J Exp Med , 161 (3), 526-546. Literatura 154 Seder RA, i Ahmed R. (2003). Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and memory T cell generation. Nat Immunol , 4 (9), 835-842. Sertl K, Takemura T, Tschachler E, Ferrans VJ, Kaliner MA, i Shevach EM. (1986). Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med , 163 (2), 436-451. Severa, M., Remoli, M., Giacomini, E., Annibali, V., Gafa, V., Lande, R., i sar. (2007). Sensitization to TLR7 agonist in IFN-beta-preactivated dendritic cells. J Immunol , 178 (10), 6208-16. Shear, M. (1944). Chemical treatment of tumors IX. Reactions of mice with primary subcutaneous tumors to injection of hemorrhage-producing bacterial polysaccharide. J Natl Cancer Inst , 4, 461-76. Shear, M., Turner, F., Perrault, A., i Shovelton, J. (1943). Chemical treatment of tumours. V. Isolation of the hemorrhage-producing fraction from Serratia marcescens (Bacillus prodigiosus) culture filtrate. J Natl Cancer Inst , 4, 81-97. Shortman K, i Liu YJ. (2002). Mouse and human dendritic cell subtypes. Nat Rev Immunol , 2 (3), 151-161. Shortman K, i Naik SH. (2007). Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol , 7 (1), 19-30. Siegal FP, Kadowaki N, Shodell M, Fitzgerald-Bocarsly PA, Shah K, Ho S, i sar. (1999). The nature of the principal type 1 interferon-producing cells in human blood. Science , 284 (5421), 1835-1837. Skrzypek F, Cenci E, Pietrella D, Rachini A, Bistoni F, i Vecchiarelli A. (2009). Dectin-1 is required for human dendritic cells to initiate immune response to Candida albicans through Syk activation. Microbes Infect , 11, 661-670. Smits, H., de Jong, E., Wierenga, E., i Kapsenberg, M. (2005). Different faces of regulatory DCs in homeostasis and immunity. Trends Immunol , 26 (3), 123-9. Snijders A, Kalinski P, Hilkens CMU, i Kapsenberg ML. (1998). High-level IL-12 production by human dendritic cells requires two signals. Int Immunol , 10 (11), 1593- 1597. Solomon KA, Pesti N, Wu G, i Newton RC. (1999). Cutting edge: a dominant negative form of TNF-alpha converting enzyme inhibits proTNF and TNFRII secretion. J Immunol , 163 (8), 4105-4108. Sozzani, S. (2005). Dendritic cell trafficking: more than just chemokines. Cytokine Growth Factor Rev , 16 (6), 581-92. Literatura 155 Spisek, R., Bougras, G., Ebstein, F., Masse, D., Meflah, K., D, M., i sar. (2003). Transient exposure of dendritic cells to maturation stimuli is sufficient to induce complete phenotypic maturation while preserving their capacity to respond to subsequent restimulation. Cancer Immunol Immunother , 52 (7), 445-54. Spisek, R., Bretaudeau, L., Barbieux, I., Meflah, K., i Gregoire, M. (2001). Standardized generation of fully mature p70 IL-12 secreting monocyte-derived dendritic cells for clinical use. Cancer Immunol Immunother , 50 (8), 417-27. Sponaas AM, Cadman ET, Voisine C, Harrison V, Boonstra A, O'Garra A, i sar. (2006). Malaria infection changes the ability of splenic dendritic cell populations to stimulate antigen-specific T cells. J Exp Med , 203 (6), 1427-1433. Sporri R, i Reis e Sousa C. (2005). Inflammatory mediators are insufficient for full dendritic cell activation and promote expansion of CD4+ T cell populations lacking helper function. Nat Immunol , 6 (2), 163-170. Stamenkovic I, Clark EA, i Seed B. (1989). A B-lymphocyte activation molecule related to the nerve growth factor receptor and induced by cytokines in carcinomas. Embo J , 8 (5), 1403-1410. Steinman RM, Hawiger D, i Nussenzweig MC. (2003). Tolerogenic dendritic cells. Annu Rev Immunol , 21, 685-711. Steinman RM, i Cohn ZA. (1973). Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med , 137 (5), 1142-1162. Steinman RM, i Nussenzweig MC. (2002). Avoiding horror autotoxicus: the importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A , 99 (1), 351- 358. Steinman RM, i Witmer MD. (1978). Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proc Natl Acad Sci U S A , 75 (10), 5132- 5136. Steinman, R., i Hemmi, H. (2006). Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol , 311, 17-58. Stopinšek S, Ihan A, Wraber B, Terčelj M, Salobir B, i Rylander R et al. (2011). Fungal cell wall agents suppress the innate inflammatory cytokine responses of human peripheral blood mononuclear cells challenged with lipopolysaccharide in vitro. Int Immunopharmacol , 11, 939-947. Swain, S., Weinberg, A., English, M., i Huston, G. (1990). IL-4 directs the development of Th2-like helper effectors. J Immunol , 145 (11), 3796-806. Literatura 156 Szabolcs P, Avigan D, Gezelter S, Ciocon DH, Moore MA, Steinman RM, i sar. (1996). Dendritic cells and macrophages can mature independently from a human bone marrow-derived, post-colony-forming unit intermediate. Blood , 87 (11), 4520-4530. Szlosarek P, Charles KA, i Balkwill FR. (2006). Tumour necrosis factor-alpha as a tumour promoter. Eur J Cancer , 42 (6), 745-750. Tabeta K, Hoebe K, Janssen EM, Du X, Georgel P, Crozat K, i sar. (2006). The Unc93b1 mutation 3d disrupts exogenous antigen presentation and signaling via Toll-like receptors 3, 7 and 9. Nat Immunol , 7 (2), 156-164. Taga, K., i Tosato, G. (1992). IL-10 inhibits human T cell proliferation and IL-2 production. J Immunol , 148 (4), 1143-8. Talmor, M., Mirza, A., Turley, S., Mellman, I., Hoffman, L., i Steinman, R. (1998). Generation or large numbers of immature and mature dendritic cells from rat bone marrow cultures. Eur J Immunol , 28 (3), 811-7. Tang P, Hung MC, i Klostergaard J. (1996). Human pro-tumor necrosis factor is a homotrimer. Biochemistry , 35 (25), 8216-8225. Tartaglia LA, Goeddel DV, Reynolds C, Figari IS, Weber RF, Fendly BM, i sar. (1993). Stimulation of human T-cell proliferation by specific activation of the 75-kDa tumor necrosis factor receptor. J Immunol , 151 (9), 4637-4641. Taylor PR, Brown GD, Reid DM, Willment JA, Martinez-Pomares L, i Gordon S et al. (2002). The beta-glucan receptor, Dectin-1, is predominantly expressed on the surface of cells of the monocyte/macrophage and neutrophil lineages. J Immunol , 169, 3876- 3882. Thoreau E, Petridou B, Kelly PA, Djiane J, i Mornon JP. (1991). Structural symmetry of the extracellular domain of the cytokine/growth hormone/prolactin receptor family and interferon receptors revealed by hydrophobic cluster analysis. FEBS Lett , 282 (1), 26-31. Tracey, D., Klareskog, L., Sasso, E., Salfeld, J., i Tak, P. (2008). Tumor necrosis factor antagonist mechanisms of action: a comprehensive review. Pharmacol Ther , 117 (2), 244-79. Traver D, Akashi K, Manz M, Merad M, Miyamoto T, Engleman EG, i sar. (2000). Development of CD8alpha-positive dendritic cells from a common myeloid progenitor. Science , 290 (5499), 2152-2154. Trinchieri G. (1978). [Physiology of the immune system]. Minerva Anestesiol , 44 (10), 673-678. Literatura 157 Trinchieri, G., i Sher, A. (2007). Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence. Nat Rev Immunol , 7 (3), 179-90. Tzianabos AO. (2000). Polysaccharide immunomodulators as therapeutic agents: structural aspects and biologic function. Clin Microbiol Rev , 13 (4), 523-533. Underhill DM, Rossnagle E, Lowell CA, i Simmons RM. (2005). Dectin-1 activates Syk tyrosine kinase in a dynamic subset of macrophages for reactive oxygen production. Blood , 106 (7), 2543-2550. Valenzuela J, Schmidt C, i Mescher M. (2002). The roles of IL-12 in providing a third signal for clonal expansion of naive CD8 T cells. J Immunol , 169 (12), 6842-6849. Valladeau J, Ravel O, Dezutter-Dambuyant C, Moore K, Kleijmeer M, Liu Y, i sar. (2000). Langerin, a novel C-type lectin specific to Langerhans cells, is an endocytic receptor that induces the formation of Birbeck granules. Immunity , 12 (1), 71-81. Valledor AF, Arpa L, Sanchez-Tillo E, Comalada M, Casals C, Xaus J, i sar. (2008). IFN- {gamma}-mediated inhibition of MAPK phosphatase expression results in prolonged MAPK activity in response to M-CSF and inhibition of proliferation. Blood , 112 (8), 3274-3282. van Duivenvoorde, L., van Mierlo, G., Boonman, Z., i Toes, R. (2006). Dendritic cells: vehicles for tolerance induction and prevention of autoimmune diseases. Immunobiology , 211 (6-8), 627-632. van Gisbergen, K., Ludwig, I., Geijtenbeek, T., i van Kooyk, Y. (2005). Interactions of DC- SIGN with Mac-1 and CEACAM1 regulate contact between dendritic cells and neutrophils. FEBS Lett , 579 (27), 6159-68. Van Gool, S., Vandenberghe, P., de Boer, M., i Ceuppens, J. (1996). CD80, CD86 and CD40 provide accessory signals in a multiple-step T-cell activation model. Immunol Rev , 153, 47-83. Vandenabeele P, Declercq W, Vanhaesebroeck B, Grooten J, i Fiers W. (1995). Both TNF receptors are required for TNF-mediated induction of apoptosis in PC60 cells. J Immunol , 154 (6), 2904-2913. VanKooten C, i Banchereau J. (2000). CD40-CD40 ligand. J Leukoc Biol , 67 (1), 2-17. Veldhoen M, Hocking RJ, Atkins CJ, Locksley RM, i Stockinger B. (2006). TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17- producing T cells. Immunity , 24 (2), 179-189. Verdijk RM, Mutis T, Esendam B, Kamp J, Melief CJ, Brand A, i sar. (1999). Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (Poly (I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J Immunol , 163, 57-61. Literatura 158 Vignali, D., Collison, L., i Workman, C. (2008). How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol , 8 (7), 523-32. Villadangos JA, i Heath WR. (2005). Life cycle, migration and antigen presenting functions of spleen and lymph node dendritic cells: limitations of the Langerhans cells paradigm. Semin Immunol , 17 (4), 262-272. Vremec D, Pooley J, Hochrein H, Wu L, i Shortman K. (2000). CD4 and CD8 expression by dendritic cell subtypes in mouse thymus and spleen. J Immunol , 164 (6), 2978-2986. Vremec D, Zorbas M, Scollay R, Saunders DJ, Ardavin CF, Wu L, i sar. (1992). The surface phenotype of dendritic cells purified from mouse thymus and spleen: investigation of the CD8 expression by a subpopulation of dendritic cells. J Exp Med , 176 (1), 47-58. Vremec, D., i Shortman, K. (1997). Dendritic cell subtypes in mouse lymphoid organs: cross-correlation of surface markers, changes with incubation, and differences among thymus, spleen, and lymph nodes. J Immunol , 159 (2), 565-73. Wajant, H., Henkler, F., i Scheurich, P. (2001). The TNF-receptor-associated factor family: scaffold molecules for cytokine receptors, kinases and their regulators. Cell Signal , 13 (6), 389-400. Wajant, H., i Scheurich, P. (2001). Tumor necrosis factor receptor-associated factor (TRAF) 2 and its role in TNF signaling. Int J Biochem Cell Biol , 33 (1), 19-32. Wallach, D., Engelmann, H., Nophar, Y., Aderka, D., Kemper, O., Hornik, V., i sar. (1991). Soluble and cell surface receptors for tumor necrosis factor. Agents Actions Suppl , 35, 51-7. Walzer T, Dalod M, Robbins SH, Zitvogel L, i Vivier E. (2005). Natural-killer cells and dendritic cells: "l'union fait la force". Blood , 106 (7), 2252-2258. Walzer T, Dalod M, Vivier E, i Zitvogel L. (2005). Natural killer cell-dendritic cell crosstalk in the initiation of immune responses. Expert Opin Biol Ther , 5 Suppl 1, S49- 59. Wang, Y., Voo, K., Liu, B., Chen, C., Uygungil, B., Spoede, W., i sar. (2010). A novel subset of CD4+ TH2 memory/effector cells that produce inflammatory IL-17 cytokine and promote the exacerbation of chronic allergic asthma. J Exp Med , 207 (11), 2479- 2491. Wang, Z., Kusam, S., Munugalavadla, V., Kapur, R., Brutkiewicz, R., i Dent, A. (2006). Regulation of Th2 cytokine expression in NKT cells: unconventional use of Stat6, GATA-3, and NFAT2. J Immunol , 176 (2), 880-8. Literatura 159 Warger, T., Osterloh, P., Rechtsteiner, G., Fassbender, M., Heib, V., Schmid, B., i sar. (2006). Synergistic activation of dendritic cells by combined Toll-like receptor ligation induces superior CTL responses in vivo. Blood , 108 (2), 544-50. Waskow C, Liu K, Darrasse-Jeze G, Guermonprez P, Ginhoux F, Merad M, i sar. (2008). The receptor tyrosine kinase Flt3 is required for dendritic cell development in peripheral lymphoid tissues. Nat Immunol , 9 (6), 676-683. Weck MM, Appel S, Werth D, Sinzger, Bringmann A, i Grünebach F et al. (2008). hDectin-1 is involved in uptake and cross-presentation of cellular antigens. Blood , 111, 4264-4272. Williams RO, Marinova-Mutafchieva L, Feldmann M, i Maini RN. (2000). Evaluation of TNF-alpha and IL-1 blockade in collagen-induced arthritis and comparison with combined anti-TNF-alpha/anti-CD4 therapy. J Immunol , 165 (12), 7240-7245. Willimann, K., Legler, D., Loetscher, M., Roos, R., Delgado, M., Clark-Lewis, i sar. (1998). The chemokine SLC is expressed in T cell areas of lymph nodes and mucosal lymphoid tissues and attracts activated T cells via CCR7. Eur J Immunol , 28 (6), 2025-34. Willment JA, Marshall AS, Reid DM, Williams DL, Wong SY, Gordon S, i sar. (2005). The human beta-glucan receptor is widely expressed and functionally equivalent to murine Dectin-1 on primary cells. Eur J Immunol , 35 (5), 1539-1547. Wilson HL, i O'Neill HC. (2003). Identification of differentially expressed genes representing dendritic cell precursors and their progeny. Blood , 102 (5), 1661-1669. Wu L, i Dakic A. (2004). Development of dendritic cell system. Cell Mol Immunol , 1 (2), 112-118. Wu L, Li CL, i Shortman K. (1996). Thymic dendritic cell precursors: relationship to the T lymphocyte lineage and phenotype of the dendritic cell progeny. J Exp Med , 184 (3), 903-911. Wu L, Vremec D, Ardavin C, Winkel K, Suss G, Georgiou H, i sar. (1995). Mouse thymus dendritic cells: kinetics of development and changes in surface markers during maturation. Eur J Immunol , 25 (2), 418-425. Wu Y, Zhu B, i Pan K. (2001). [Effect of human umbilical vein endothelial cells on granulopoiesis, erythropoiesis and megakaryopoiesis in mice]. Hua Xi Yi Ke Da Xue Xue Bao , 32 (1), 66-69. Xiao, Z., Trincado, C., i Murtaugh, M. (2004). Beta-glucan enhancement of T cell IFNgamma response in swine. Vet Immunol Immunopathol , 102 (3), 315-20. Xu S, Koski GK, Faries M, Bedrosian I, Mick R, Maeurer M, i sar. (2003). Rapid high efficiency sensitization of CD8+ T cells to tumor antigens by dendritic cells leads to Literatura 160 enhanced functional avidity and direct tumor recognition through an IL-12-dependent mechanism. J Immunol , 171 (5), 2251-2261. Yang YC, Hsu TY, Lin RH, Su IJ, Chen JY, i Yang CS. (2002). Resistance to tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in human T-lymphotropic virus type I-infected T cell lines. AIDS Res Hum Retroviruses , 18 (3), 207-212. Yarovinsky F, Zhang D, Andersen JF, Bannenberg GL, Serhan CN, Hayden MS, i sar. (2005). TLR11 activation of dendritic cells by a protozoan profilin-like protein. Science , 308 (5728), 1626-1629. Yokomaku Y, Miura H, Tomiyama H, Kawana-Tachikawa A, Takiguchi M, Kojima A, i sar. (2004). Impaired processing and presentation of cytotoxic-T-lymphocyte (CTL) epitopes are major escape mechanisms from CTL immune pressure in human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol , 78 (3), 1324-1332. Yoshida A, Tanaka R, Murakami T, Takahashi Y, Koyanagi Y, Nakamura M, i sar. (2003). Induction of protective immune responses against R5 human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection in hu-PBL-SCID mice by intrasplenic immunization with HIV- 1-pulsed dendritic cells: possible involvement of a novel factor of human CD4(+) T-cell origin. J Virol , 77 (16), 8719-8728. Yoshimoto T, Takeda K, Tanaka T, Ohkusu K, Kashiwamura S, Okamura H, i sar. (1998). IL-12 up-regulates IL-18 receptor expression on T cells, Th1 cells, and B cells: synergism with IL-18 for IFN-gamma production. J Immunol , 161 (7), 3400-3407. Yoshimura T, Atsunobu T, Shinjiro H, Yoshiyki M, Ichiko K, Tatsuro, i sar. (2006). Two- sided roles of IL-27: induction of Th1 differentiation on naive CD4+ T cells versus suppression of proinflammatory cytokine production including IL-23-induced IL-17 on activated CD4+ T cells partially through STAT3-dependent mechanism. J Immunol , 177, 5377-5385. Yu, C., Peng, W., Oldenburg, J., Hoch, J., Bieber, T., Limmer, A., i sar. (2010). Human plasmacytoid dendritic cells support Th17 cell effector function in response to TLR7 ligation. J Immunol , 184 (3), 1159-67. Zekovic DB, Kwiatkowski S, Vrvic MM, Jakovljevic D, i Moran CA. (2005). Natural and modified (1-->3)-beta-D-glucans in health promotion and disease alleviation. Crit Rev Biotechnol , 25 (4), 205-230. Zhang D, Zhang G, Hayden MS, Greenblatt MB, Bussey C, Flavell RA, i sar. (2004). A toll- like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria. Science , 303 (5663), 1522-1526. Literatura 161 Zheng, R., Cohen, P., Paustian, C., Johnson, T., Lee, W., Shu, S., i sar. (2008). Paired Toll- like receptor agonists enhance vaccine therapy through induction of interleukin-12. Cancer Res , 68 (11), 4045-9. Zhu, Q., Egelston, C., Vivekanandhan, A., Uematsu, S., Akira, S., Klinman, D., i sar. (2008). Toll-like receptor ligands synergize through distinct dendritic cell pathways to induce T cell responses: implications for vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A , 105 (42), 16260-5. Zimmerman JW, Lindermuth J, Fish PA, Palace GP, Stevenson TT, i DeMong DE. (1998). A novel carbohydrate-glycosphingolipid interaction between a beta-(1-3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes. J Biol Chem , 273 (34), 22014-22020. Zou, G., i Tam, Y. (2002). Cytokines in the generation and maturation of dendritic cells: recent advances. Eur Cytokine Netw , 13 (2), 186-99. 162 8. PRILOZI Prilozi 163 Rezultati prikazani u disertaciji su objavljeni u sledećim člancima: 1. Ana Dragičević, Tanja Džopalić, Saša Vasilijić, Dragana Vučević, Biljana Božić, Ivana Majstorović, Bela Balint, Miodrag Čolić. The influence of CD40 ligation and interferon-γ on functional properties of human monocyte derived dendritic cells matured with polyinosinic-polycytidylic acid. Vojnosanitetski pregled 2011;68(4): 301-308. 2. Tanja Džopalić, Ivan Rajković, Ana Dragičević, Miodrag Čolić. The response of human dendritic cells to co-ligation of pattern-recognition receptors. Immunol Res. 2012; DOI: 10.1007/s12026-012-8279-5. 3. Ana Dragičević, Tanja Džopalić, Saša Vasilijić, Dragana Vučević, Sergej Tomić, Biljana Božić, Miodrag Čolić. Signaling through Toll-like receptor 3 and Dectin-1 potentiates the capability of human monocyte-derived dendritic cells to promote T-helper 1 and T-helper 17 immune responses. Cytotherapy. 2012; DOI:10.3109/14653249.2012.667873. Prilozi 164 Prilozi 165 Prilozi 166 Prilozi 167 Prilozi 168 Prilozi 169 Prilozi 170 Prilozi 171 Prilozi 172 Prilozi 173 Prilozi 174 Prilozi 175 Prilozi 176 Prilozi 177 Prilozi 178 Prilozi 179 Prilozi 180 Prilozi 181 Prilozi 182 Prilozi 183 Prilozi 184 Prilozi 185 Prilozi 186 Prilozi 187 Prilozi 188 Prilozi 189 Prilozi 190 Prilozi 191 Prilozi 192 Prilozi 193 Prilozi 194 Prilozi 195 Prilozi 196 Prilozi 197 198 9. BIOGRAFIJA AUTORA Biografija autora 199 Ana Ž. Dragičević je rođena 08.11.1982. u Nišu. Nakon završetka gimnazije „Bora Stanković“ u Nišu, upisala je studije na Biološkom fakultetu, Univerzitet u Beogradu, smer Molekularna biologija i fiziologija školske 2001/2002. školske godine. Po završetku studija upisala je doktorske studije na Biološkom fakultet, Univerzitet u Beogradu, modul: Neurobiologija sa neuroimunologijom školske 2007/2008 i specijalističke studije na Biološkom fakultetu, Univerzitet u Beogradu, smer: Imunobiologija sa mikrobiologijom. Tokom doktorskih studija, kao stipendista Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije u periodu od 2008. do 2010. godine bila je angažovana na projektu „Biokompatibilnost i mogućnost primene biomaterijala na bazi hidroksiapatita i biopolimera u tkivnoj reparaciji- eksperimentalna i klinička studija“ (evidencioni broj: 145068) kojim je rukovodio prof dr Vojin Savić. Takođe, u periodu od 2008 do 2010. bila je uključena na projekat Ministarstva odbrane „Genetički i ćelijski bioinžinjering u medicini NI zadatak: Optimizacija protokola za kultivaciju dendritskih ćelija u cilju terapije tumora“ na Vojnomedicinskoj akademiji kojim je rukovodio akademik Miodrag Čolić. Od 2010. godine angažovana je na projektu „Primena funkcionalizovanih ugljeničnih nanocevi i nanočestica zlata za pripremu dendritskih ćelija u imunoterapiji tumora“ (evidencioni broj: 175102) kojim rukovodi akademik Miodrag Čolić. Tokom školske 2010/11. i 2011/12. godine je bila angažovana kao demonstrator na vežbama Imunobiologija sa biohemijom i Osnovi imunobiologije. Ana Ž. Dragičević je do sada bila autor i koautor u sedam naučnih publikacija u vrhunskim časopisima međunarodnog značaja, kao i u 10 saopštenja na skupovima međunarodnog značaja i šest saopštenja na skupovima nacionalnog značaja iz uže naučne oblasti. 200 Прилог 1. Изјава о ауторству Потписани-a Ана Драгичевић број уписа ______________________ КА 07/02 ___________________________________ Изјављујем да је докторска дисертација под насловом • резултат сопственог истраживачког рада, Модулација функције хуманих дендритских ћелија комбинованом применом агониста ендозомних Тоll-сличних рецептора, дектин-1 рецептора и проинфламаторних цитокина • да предложена дисертација у целини ни у деловима није била предложена за добијање било које дипломе према студијским програмима других високошколских установа, • да су резултати коректно наведени и • да нисам кршио/ла ауторска права и користио интелектуалну својину других лица. Потпис докторанда У Београду, ___________________ ___23.03.2012.__ 201 Прилог 2. Изјава o истоветности штампане и електронске верзије докторског рада Име и презиме аутора _________ Ана Драгичевић Број уписа __________________________ КА 07/02 Студијски програм __ _________________________________________ Наслов рада __ Неуронауке, модул: Неуробиологија са неуроимунологијом_ Модулација функције хуманих дендритских ћелија комбинованом применом агониста ендозомних Тоll-сличних рецептора, дектин-1 рецептора и проинфламаторних цитокина Ментор ________ академик Миодраг Чолић, др Биљана Божић_______________ Потписани ____ Ана Драгичевић __________________________ изјављујем да је штампана верзија мог докторског рада истоветна електронској верзији коју сам предао/ла за објављивање на порталу Дигиталног репозиторијума Универзитета у Београду. Дозвољавам да се објаве моји лични подаци везани за добијање академског звања доктора наука, као што су име и презиме, година и место рођења и датум одбране рада. Ови лични подаци могу се објавити на мрежним страницама дигиталне библиотеке, у електронском каталогу и у публикацијама Универзитета у Београду. Потпис докторанда У Београду, __ ____________________ 23.03.2012.________________ 202 Прилог 3. Изјава о коришћењу Овлашћујем Универзитетску библиотеку „Светозар Марковић“ да у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду унесе моју докторску дисертацију под насловом: Модулација функције хуманих дендритских ћелија комбинованом применом агониста ендозомних Тоll-сличних рецептора, дектин-1 рецептора и проинфламаторних цитокина која је моје ауторско дело. Дисертацију са свим прилозима предао/ла сам у електронском формату погодном за трајно архивирање. Моју докторску дисертацију похрањену у Дигитални репозиторијум Универзитета у Београду могу да користе сви који поштују одредбе садржане у одабраном типу лиценце Креативне заједнице (Creative Commons) за коју сам се одлучио/ла. 1. Ауторство 2. Ауторство - некомерцијално 3. Ауторство – некомерцијално – без прераде 4. Ауторство – некомерцијално – делити под истим условима 5. Ауторство – без прераде 6. Ауторство – делити под истим условима (Молимо да заокружите само једну од шест понуђених лиценци, кратак опис лиценци дат је на полеђини листа). Потпис докторанда У Београду, __ _____________________ 23.03.2012.________________