UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOŠKI FAKULTET Ana Z. Milosavljević Uticaj delimičnog isušivanja korenova na ekspresiju NCED, TAO1 i EIL1 gena i rastenje divljeg tipa i flacca mutanta paradajza (Lycopersicon esculentum Mill.) doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY Ana Z. Milosavljević The effects of partial root-zone drying on expression of NCED, TAO1 and EIL1 genes and growth in tomato wild-type and flacca mutant (Lycopersicon esculentum Mill.) Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. Mentori: dr Radmila Stikić, redovni profsor Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu dr Aneta Sabovljević, docent Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu Član komisije: dr Angelina Subotić, viši nauĉni saradnik Institut za biološka istraţivanja „Siniša Stanković“, Univerzitet u Beogradu Datum odbrane: Eksperimentalni deo ove doktorske disertacije urađen je na Katedri za agrohemiju i fiziologiju biljaka Poljoprivrednog fakulteta Univerziteta u Beogradu. Zahvaljujem se svim članovima ove i drugih institucija koji su mi pružili pomoć i podršku tokom izrade ove disertacije. Srdačno se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Radmili Stikić, na pruženim mogućnostima za rad, nesebičnoj pomoći u interpretaciji rezultata i konsultacijma tokom izrade disertacije. Posebno se zahvaljujem dr Aneti Sabovljević i dr Angelini Subotić na korisnim savetima i predlozima koje su dale prilikom čitanja disertacije. Hvala mojoj porodici, prijateljima i svima koji su bili uz mene tokom izrade ove disertacije Uticaj delimičnog isušivanja korenova na ekspresiju NCED, TAO1 i EIL1 gena i rastenje divljeg tipa i flacca mutanta paradajza (Lycopersicon esculentum Mill.) Rezime Cilj ovog istraţivanja je bio karakterizacija fizioloških procesa koji su u osnovi regulacije rastenja i razvića biljaka paradajza pod dejstvom delimiĉnog isušivanja korenova (Partial root-zone drying -PRD), ali i regulisanog deficita navodnjavanja (Regulated deficit irrigation - RDI). Cilj je bio i da se u ova ispitivanja ukljuĉe i molekularna istraţivanja, koja bi, uz analizu procesa rastenja i drugih fizioloških procesa (vodnog reţima, razmene gasova, akumulacije i distribucije stres hormona ABA, kao i usvajanja i distribucije jona), znaĉajno doprinela razumevanju PRD i RDI efekata na paradajz. Zato je praćena ekspresija gena ukljuĉenih u biosintetski put ABA (TAO1 i NCED1) i transdukciju signala etilena (EIL1). Eksperimentalni model u ovim istraţivanjima je bio paradajz (Lycopersicon esculentum Mill.), kao kultura koja ima znaĉajne potrebe za vodom i kod koje suša moţe da izazove znaĉajne efekte na rastenje i razviće. Odabrani su divlji tip (WT), sorta Ailsa Craig, i mutant flacca koji se odlikuje smanjenom sintezom hormona ABA. Biljke paradajza divljeg tipa i mutanta flacca su nakon proklijavanja presaĊene u posebno dizajnirane saksije, koje su podeljene na dve polovine plastiĉnom ploĉom, ĉime je omogućeno razdvajanje korenovog sistema u dva hidrauliĉno izolovana kompartmenta. Biljke su gajene u komercijalnom supstratu (Klasmann Potground H) u uslovima fitotronske komore (temperatura dan/noć 26/17 o C, relativna vlaţnost vazduha 60%, osvetljenost (PAR) 250 µmolm-2s-1 i duţina fotoperioda od 14 h). Koliĉina vode u supstratu je merena pomoću TDR proba (Time domain reflectometer, TRASE, Soil Moisture Equipment Corp., USA). Primenjivana su tri razliĉita tretmana zalivanja. Optimalno navodnjavanje (Full irrigation - FI) - supstrat u celoj rizosferi je svaki dan zalivan do optimalnog vodnog kapaciteta, odnosno, sadrţaja vode u supstratu od 36%. Delimiĉno isušivanje korenovog sistema (PRD) - supstrat u polovini korenovog sistema je zalivan do optimalnog vodnog kapaciteta, dok u drugoj polovini nije zalivan sve dok se sadrţaj vode u supstratu nije spustio na 18- 20%, kada je vršena inverzija strana zalivanja. Regulisani deficit navodnjavanja (RDI) - biljke su zalivane do vrednosti vode u supstratu od 18%. Vodni potencijal listova i otvorenost stoma su mereni u danu PRD okreta (promene strane zalivanja korena). Ukupni potencijal vode u listu (Ψl) meren je u komori pod pritiskom (Soil Moisture Equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA). Provodljivost stoma je merena aparatom porometrom (AP4, Delta-T, Cambridge, U.K.). Na kraju ekperimenta izmerena je sveţa i suva masa korena, stabla i listova i odreĊen odnos suve mase izdanka i korena. Sadrţaj abscisinske kiseline u listovima je analiziran ELISA testom uz korišćenje visoko specifiĉnog monoklonalnog antitela (MAC 252). Apsorpcija je oĉitavana na ELISA ĉitaĉu (Sunrise, Tecan) na 405nm. Sadrţaj Ca, Mg, Fe, Mn, Zn i Cu odreĊivan je atomsko-apsorpcionom spektrofotometrijom, K plamenofotometrijski, dok je sadrţaj N odreĊivan metodom po Kjeldahl-u. Ekspresija gena je praćena u danu PRD okreta. Izolacija RNK je uraĊena primenom RNA-ase plant mini kit-a (Quiagen, Germany). Za sintezu cDNK je korišćen First strand cDNA synthesis kit (Fermentas, Lithuania). Ekspresija gena je praćena primenom Real Time-PCR (SYBR-Green tehnika; RT-PCR 7500, Applied Biosystems, UK). Rezultati su pokazali da je PRD tretman, kao i RDI, doveo do redukcije rastenja biljaka. Kada su u pitanju sveţa i suva masa organa, kod biljaka divljeg tipa je došlo do redukcije u oba tretmana, dok je kod flacca mutanta, PRD tretman doveo do povećanja biomase, za razliku od RDI, koji je doveo do redukcije. Analiza rasta vegetativnih organa je pokazala da su biljke flacca mutanta bile znaĉajno niţe (za ca 40%) i sa manjom obrazovanom sveţom i suvom masom u odnosu na divlji tip. Analiza vodnog reţima biljaka, na osnovu rezultata potencijala vode () u listovima i koliĉine vode u supstratu, je pokazala da su RDI biljke bile izloţene većem stepenu stresa u odnosu na PRD biljke i to kod oba ispitivana genotipa. Rezultati dnevne dinamike provodljivosti stominih ćelija (gs) su ukazali da se reakcije na PRD tretman mogu okarakterisati kao reakcije brţeg odgovora, a reakcije na RDI kao reakcije sporijeg odgovora stominih ćelija na sušu. Analiza reakcija stominih ćelija u odnosu na promene potencijala vode u listovima je pokazala da su reakcije zatvaranja stoma, u uslovima RDI, pratile opadanje potencijala vode u listovima, što ukazuje da su ove reakcije stominih ćelija kod oba genotipa rezultat dejstva hidrauliĉnih signala. Rezultati analize efekata PRD tretmana na vodni reţim biljaka su pokazali da su hemijski signali bili odgovorni za reakcije stominih ćelija. Kod divljeg tipa, veći efekat na povećanje sadrţaja ABA u listovima imao je PRD tretman, dok je kod flacca mutanta to bio RDI tretman. Sliĉno povećanje u sadrţaju ABA u listovima kod oba genotipa prilikom PRD tretmana ukazuje da flacca mutacija ne pogaĊa transport ABA iz korena u nadzemni deo. Merenja koncentracije jona, uglavnom, nisu pokazala znaĉajan efekat primenjenih sistema deficita navodnjavanja na usvajanje, akumulaciju ili distribuciju jona. Najznaĉajniji je bio uticaj PRD koji je kod oba genotipa ubrzao translokaciju Mn iz korena u listove, što moţe biti od znaĉaja za adaptivne metaboliĉke reakcije biljaka na PRD, jer je Mn znaĉajan antioksidacioni agens. TakoĊe je PRD doveo i do veće akumulacije N kod flacca mutanta. Molekularna ispitivanja ekspresije gena u listovima su pokazala razlike izmeĊu tretmana, tokom njihovog trajanja i izmeĊu ispitivanih genotipova. Analiza ekspresije sva tri gena u PRD tretmanu je pokazala genotipske razlike. Sliĉan obrazac ekspresije TAO1, NCED i EIL1 kod biljaka divljeg tipa ukazuje na moguće sinergistiĉko dejstvo signalnih puteva za ABA i etilen. Sliĉan trend promena nije pronaĊen kod flacca mutanta. Redukovana NCED i znaĉajna EIL1 ekspresija verovatno reflektuje porast u produkciji etilena, koji moţe da utiĉe na signale i biosintezu ABA. Kod RDI tretmana, obrazac ekspresije gena u listovima divljeg tipa i flacca mutanta je bio sliĉan, što ukazuje na mogućnost sinergistiĉkog efekta signalnih puteva za ABA i etilen. Pošto je kod flacca mutanta bila izraţena ekspresija TAO1 gena i utvrĊena akumulacija ABA u listovima, naši rezultati su pokazali da neki drugi gen iz TAO familije, a ne TAO1 kodira enzim abscisinsku aldehidnu oksidazu kod flacca mutanta. Generalno, svi ovi rezultati su doprineli razumevanju efekata suše indukovane PRD i RDI tretmanima na paradajz. U budućim istraţivanjima bi trebalo analizirati više gena, posebno onih koji su ukljuĉeni u put biosinteze i/ili u signalnu mreţu ABA i etilena. Ključne reči: delimiĉno isušivanje korenova, regulisani deficit irigacije, paradajz, vodni reţim, ABA, joni, NCED, TAO1, EIL1 Naučna oblast: Biologija Uža naučna oblast: Fiziologija biljaka UDK broj: 582.926.2-11:577.218(043.3) The effects of partial root-zone drying on expression of TAO1, NCED and EIL1 genes and growth in tomato wild-type and flacca mutant (Lycopersicon esculentum Mill.) Abstract The aim of presented PhD thesis was to investigate the physiological mechanisms that are in the base of tomato growth and development under partial root-zone drying (PRD) and regulated deficit irrigation (RDI). Investigations included plant growth, water regime, gas exchange, abscisic acid (ABA) content in the leaves of tomato and ions content in different tomato plant organs. The aim of presented PhD thesis was, also, to assess the expression of TAO1, NCED and EIL1 genes in the leaves of tomato under drought treatments of PRD and RDI. The investigated genes are involved in the biosynthesis and signaling pathways of abscisic acid (ABA) and ethylene as key hormones in the reactions of plants to drought. Experiments were done with tomato plants (Lycopersicon esculentum Mill.), wild type (Ailsa Craig) and flacca mutant. Tomato was chosen because of its significant needs for water and because drought may have significant effects on its growth and development. Tomato mutant flacca, which is chosen for investigation, is defective in the last step of ABA biosynthesis. As a consequence, the endogenous level of ABA in flacca tissues is significantly lower than in wild type. Tomato plants wild type (WT) and flacca mutant were raised from seed and transplanted into 10 L pots (one plant per pot) filled with commercial compost (Klasmann Potground H) in a growth chamber (photoperiod was 14 h; light intensity at plant level 250 µmolm -2 s -1 , temperature 26/17 o C and relative humidity 60%). For PRD experiments the pots were specially designed in such a way that they were separated with plastic sheets into two equally sized compartments. Washed roots of the seedlings were divided into approximate halves and repotted into these two hydraulically separated compartments. The volumetric soil water content (θ) of both compartments of each pot was measured daily using TDR probes (time domain reflectometer, TRASE, Soil Moisture Equipment Corp., USA After transplantation, plants were subjected to following irrigation treatments: full irrigation (FI), in which the whole root system was irrigated to full substrate holding capacity (θ of 36%); ) partial root-zone drying (PRD), where one half of the root was irrigated to reach θ of 36% while the other half was allowed to dry, and the irrigation was shifted when θ of the dry side had decreased to 18-20%. deficit irrigation (RDI), in which water was evenly applied to the whole root system to rich θ of 18%. Leaf water potential and stomatal conductance were measured in day when PRD shift occurred. Leaf water potential was measured by pressure chamber (Soil Moisture Equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA); while stomatal conductance was measured by porometer (AP4, Delta-T, Cambridge, U.K.). At the end of experimental period, fresh and dry weight of roots, stems and leaves were measured and the shoot/root ratio determinated. Measurement of ABA content in the leaves of investigated plants was done by ELISA method using a MAC 252 monoclonal antibody for ABA. Plate contents were read at 405 nm by ELISA reader (Sunrise, Tecan). Ca, Mg, Fe, Mn, Cu and Zn content in leaves and roots was measured by atomic absorption spectrofotometry, while N content determination was done by Kjeldahl method. Samples of leaves, for gene expression analysis, were taken after every PRD shifting period. Isolation of RNA was done by using RNAeasy Plant Mini Kit (Quiagen, Germany) according to the manufacturer’s instructions. For synthesis of cDNA, the First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Lithuania) was used according to the manufacturer’s instructions. Expression of these genes was monitored by using RT-PCR (Real Time PCR SYBR-Green technique, RT-PCR 7500, Applied Biosystems, UK). Results showed that PRD treatment, like RDI, reduced plant growth. In WT plants, both treatments reduced plant organs biomass, while in flacca RDI reduced plant organs biomass and PRD increased it. Analysis of plant vegetative organs growth showed that flacca plants were smaller and with smaller fresh and dry biomass, compared to WT. Analysis of plant water regime, done on the base of leaf water potential and soil water content measurements, showed that RDI plants were exposed to higher degree of stress, compare to PRD plants, in both genotypes. Results in daily dynamics of stomatal conductance suggested that reactions to PRD treatment may be characterized as faster response reactions, while to RDI as slower response reactions. Measurements of leaf water potential and stomatal conductance showed that the effects of regulated water deficit on stomatal closure were a consequence of plant water regime changes (hydraulic effect). The effects of partial root-zone drying on stomatal closure were a consequence of drought induced chemical effects. Drought also induced increase in leaf ABA content. In WT plants, bigger effect on increase in leaf ABA content had PRD, while in flacca it was RDI. The similar increase of leaf ABA content in both genotypes under PRD conditions indicated that the flacca mutation did not affect ABA transport from the root to the shoot. Deficit irrigation treatments did not showed significant effect on ions content and distribution. The most significant effect was effect of PRD, which increased Mn translocation from roots to leaves. This may be important for adaptive metabolic reactions of plants to PRD, because Mn is a powerful natural antioxidant. PRD also increased N content and translocation in flacca plants. Results of gene expression confirmed differences in expression of investigated genes under applied treatments, during the treatments` duration as well as between investigated WT and flacca plants. The most significant differences between WT and flacca were found under PRD treatment. The similar expression pattern of all genes in WT plants could indicate synergistic signaling pathways for ABA and ethylene. In flacca reduced NCED and significant EIL1 expression might reflect the increase in ethylene production, which could influence ABA signaling and production occurred under PRD. Under RDI treatment the pattern of all genes in WT and flacca leaves was similar and once again it raises the possibility of synergistic effect of ABA and ethylene signaling pathways. Since flacca mutant showed both expression of TAO1 gene and accumulation of ABA in the leaves, our results indicated that other gene from TAO family and not TAO1 are responsible for encoding enzyme abscisic aldehyde oxidase in flacca. In general, all these results provide novel insights into the understanding of tomato response to drought induced by PRD and RDI. Future investigations should analyze more genes that underlie the ABA and ethylene biosynthetic and/or signaling pathways. Key words: Tomato, partial root-zone drying, regulated deficit irrigation, water regime, ABA content, ions, NCED, TAO1, EIL1 Scientific field: Biology Specific scientific field: Plant physiology UDC number: 582.926.2-11:577.218(043.3) SADRŽAJ 1 UVOD 1 1.1 Suša (vodni deficit) 1 1.2 Uticaj suše na fiziološke procese 2 1.2.1 Rastenje i razviće biljaka 3 1.2.2 Fotosinteza i metabolizam 4 1.2.3 Vodni reţim i reakcije stominih ćelija 5 1.2.3.1 Reakcije stominih ćelija 6 1.2.4 Fitohormoni 7 1.2.4.1 Abscisinska kislina (ABA) 8 1.2.4.2 Etilen 10 1.2.5 Transport i funkcija mineralnih soli 11 1.3 Molekularne osnove dejstva suše 1 1.3.1 ABA-nezavisna genska ekspresija 14 1.3.2 ABA-zavisna genska ekspresija 14 1.4 Percepcija i transdukcija signala suše 16 1.4.1 Hidrauliĉni i hemijski signali 16 1.4.2 Percepcija i prenos signala na ćelijskom nivou 17 1.4.2.1 Percepcija i transdukcija ABA signala 18 1.4.2.2 Transdukcija signala etilena 19 1.5 Mehanizmi tolerancije na sušu 21 1.5.1 Izbegavanje suše 21 1.5.2 Izbegavanje niskih vrednosti potencijala vode 21 1.5.3 Tolerancija na niske vrednosti potencijala vode 21 1.6 Metode deficita navodnjavanja-praktična primena fiziologije stresa 23 1.7 Paradajz kao objekat istraživanja 26 2 CILJ RADA 29 3 MATERIJAL I METODE 30 3.1 Biljni materijal i postavka eksperimenta 30 3.2 Ispitivani parametri i metode 32 3.2.1 Fiziološka istraţivanja 32 3.2.1.1 OdreĊivanje sadrţaja abscisinske kiseline 34 3.2.1.2 Merenje sadrţaja mineralnih elemenata u biljnom materijalu 36 3.2.2 Molekularna istraţivanja 38 3.3 Statistička analiza podataka 40 4 REZULTATI 41 4.1 Fiziološka istraživanja 41 4.1.1 Sadrţaj vode u zemljištu 41 4.1.2 Rastenje biljaka 43 4.1.2.1 Visina 43 4.1.2.2 Sveţa masa stabla, listova i korena 45 4.1.2.3 Suva masa stabla, listova i korena 49 4.1.3 Odnos suve mase korena i izdanka 53 4.1.4 Vodni reţim biljaka 55 4.1.4.1 Potencijal vode listova 55 4.1.4.2 Provodljivost stoma 57 4.1.5 Sadrţaj abscisinske kiseline u listovima 63 4.1.6 Sadrţaj biogenih elemenata u razliĉitim organima biljaka paradajza 64 4.2 Molekularna istraživanja 41 5 DISKUSIJA 81 6 ZAKLJUČCI 95 7 LITERATURA 99 Uvod 1 1 UVOD 1.1 Suša (vodni deficit) Voda je od vitalnog znaĉaja za rast i razvoj biljaka. Vodni stres utiĉe na širok dijapazon reakcija biljaka, od ekspresije gena i promena u metabolizmu na nivou ćelije do promena u brzini rasta i produktivnosti. Suša, sa meteorološke tačke gledišta, se definiše kao period u kome je koliĉina taloga manja od neke normalne vrednosti koja predstavlja višegodišnji prosek za dato podruĉje, a sa poljoprivredne, kao period suvog vremena koji izaziva znaĉajno smanjenje prinosa date gajene biljne vrste od proseĉnog za odgovarajuće podruĉje (Katz i Glantz, 1977). Fiziološki, suša, odnosno vodni deficit, se definiše kao koliĉina vode koja datoj biljci u odreĊenoj fazi ontogeneze nedostaje do potpunog zasićenja tkiva vodom, odnosno, smanjenje turgidnosti tkiva u odnosu na maksimalnu vrednost. Vodni deficit najĉešće nastaje kao posledica smanjene koliĉine vode u zemljištu - zemljišna suša, ali moţe nastati i kao rezultat poremećaja u usvajanju vode - fiziološka suša. Najĉešće do vodnog deficita dolazi kada transpiracija premašuje nivo usvojene vode. Za razliku od drugih stresnih uticaja, stres izazvan sušom ne nastaje odjednom, već se uglavnom razvija polako i vremenom povećava intenzitet. Ĉesto je sušenje zemljišta povezano sa jakom evaporacijom izazvanom sušenjem vazduha i visokom solarnom radijacijom (Larcher, 1995), pa se termin stres suše koristi da opiše stres koji dolazi od kombinacije ovih faktora. Zbog sve više izraţenih klimatskih promena i smanjenja raspoloţivih vodnih resursa i to kako za urbane, tako i za industrijske ili poljoprivredne potrebe, suša predstavlja sve veći svetski problem. Posebno je znaĉajan efekat na poljoprivrednu proizvodnju jer smanjuje prinos gajenih biljaka širom sveta (Foolad, 2007). Smatra se da u poreĊenju sa svim ostalim vrstama abiotskog stresa kojima su biljke izloţene u ţivotnoj sredini, suša najviše utiĉe na rast i produktivnost (Shao i sar., 2008), kao i da gubici prinosa u poljoprivrednoj proizvodnji uzrokovani sušom verovatno premašuju gubitke uzrokovane svim ostalim faktorima zajedno (Foolad, 2007). U našoj zemlji suša je, takoĊe, znaĉajan stresni ĉinilac, a njeno negativno dejstvo se posebno odraţava na gajenje i produktivnost poljoprivrednih kultura, posebno povrtarskih (Spasova i sar., Uvod 2 1997). Na primer, u istoĉnoj Srbiji (Timoĉkoj regiji), poslednjih 20 godina sezonska koliĉina padavina opala je za 120 mm, tako da sada iznosi oko 250 mm (Dragović, 1999). Ovakvo stanje je posledica porasta temperatura u toku ljetnjeg perioda. Broj dana sa temperaturom od 30 °C sada je 50, a 1970. godine bio je samo 12, dok je broj dana sa temperaturom od 35 °C sada 10, a 1970. godine bio je 0 (Dodig i sar., 2002). Suša utiĉe ne samo na agro-ekosisteme, već i na prirodne ekosisteme i to posebno šumske. Zbog svega toga, ispitivanja efekata suše i metoda i postupaka za njeno prevazilaţenje dobijaju na sve većem znaĉaju. Stres suše se najlakše moţe ukloniti navodnjavanjem biljaka. U svetu se navodnjava, meĊutim, samo 10% poljoprivrednih površina i to najviše u razvijenim zemljama i ne oĉekuje se da će se u doglednom vremenu te površine povećavati (FAO, 2002). To je poseban problem za zemlje u razvoju. Kao posledica globalne promene klime i prekomernih zagaĊenja ţivotne sredine, danas postoji konstantan problem u snabdevanju vodom i njenim kvalitetom, kako za urbane i industrijske, tako i za poljoprivredne namene. Stoga će povećano navodnjavanje imati za posledicu i znaĉajno smanjenja postojećih rezervi vode, a što moţe da se, potom, odrazi i na postojeće ekosisteme. U skladu sa tim, ali i klimatskim promenama koje sve više utiĉu na koliĉinu i potrošnju vode (IPCC, 2007), raspoloţiva koliĉina vode za potrebe gajenja i navodnjavanja biljaka se mora veoma racionalno koristiti. 1.2 Uticaj suše na fiziološke procese Nedostatak vode utiĉe na niz fizioloških procesa kod biljaka i dovodi do razliĉitih metaboliĉkih promena. Suša ima efekat na skoro sve procese u biljci, ukljuĉujući sintezu proteina i komponenti ćelijskog zida, deobu i rastenje ćelija, aktivnost enzima i hormona, reakcije stoma, fotosintezu i respiraciju, senescenciju i abscisiju. Efekat stresa zavisi od njegovog intenziteta, duţine trajanja, biljne vrste i njene otpornosti ili faze ontogeneze na koju stres deluje. Biljke su na sušu mnogo osetljivije u generativnoj nego u vegetativnoj fazi. Pojava suše i visoke temperature u fazi formiranja cvetova, gametogeneze, oprašivanja, formiranja plodova, semena ili krtola moţe u znaĉajnoj meri da umanji prinos gajenih biljka. To je poseban problem za poljoprivrednu proizvodnju u onim klimatskim uslovima gde se smanjena koliĉina padavina i visoka temperatura u toku letnjih meseci poklapaju sa fazama najveće osetljivosti biljaka na sušu. Uvod 3 1.2.1 Rastenje i razviće biljaka Od svih fizioloških procesa rastenje listova je najosetljivije na opadanje potencijala vode u tkivima. Rastenje listova je rezultat procesa deobe i stvaranja novih ćelija i povećanja njihove veliĉine ekspanzijom ili elongacijom. Suša utiĉe na rastenje preko redukcije broja (Schuppler i sar., 1998) i /ili veliĉine ćelija (Đaković i Jovanović, 2003). Smanjena hidrauliĉna provodljivost tkiva u suši izaziva opadanje gradijenta potencijala izmeĊu ksilema i okolnih elongacionih ćelija, što za posledicu ima opadanje potencijala turgora u ćelijama koje rastu (Boyer, 1968). Efekat suše je rezultat biofiziĉkih i biohemijskih promena, prvenstveno na nivou ćelijskog zida. Biofiziĉke promene su vezane za hidrauliĉke i mehaniĉke osobine ćelijskog zida, dok su biohemijske uslovljene aktivnošću nekoliko enzima ćelijskog zida (ksiloglukan endotransglikozilaze – XET, peroksidaze, ekspanzina) (Bacon i sar., 1998; Jovanović i sar., 2004), kanala akvaporina kao i dejstvom hormona (abscisinske kiseline i auksina) i pH vrednosti apoplasta (Hsiao i Xu, 2000). Opadanje potencijala turgora u ćelijama redukuje plastiĉnost (ekstenzibilnost) ćelijskog zida i povećava aktivnost enzima koji usporavaju rastenje ćelijskog zida (posebno peroksidaze). Smatra se da je to povezano sa inaktivacijom plazma membranski vezane H + -ATPaze i smanjenim zakišeljavanjem zida. Za razliku od korena, kod listova se osmotska prilagoĊavanja javljaju sporije, tako da suša dovodi do upadljive inhibicije rasta. Listovi koji rastu u suši obiĉno su sitniji, deblji i sa niskim sadrţajem azota. Iako je brzina rastenja biljke generalno inhibirana u uslovima suše, vodni deficit obiĉno ima manji uticaj na rastenje korena (Sharp i sar., 2004). Ĉesto koren raste i pri vrlo negativnom vodnom potencijalu zemljišta (Sharp i sar., 1988), dok male promene u potencijalu dovode do inhibicije rastenja izdanka. Povećanje odnosa koren/izdanak javlja se u uslovima suše, ali i u uslovima nedostatka hranljivih materija i visokih temperatura zemljišta nepovoljnih za optimalno funkcionisanje korena (Poorter i Nagel, 2000). Moguće da je razliĉita reakcija korena i izdanka pri opadanju potencijala vode strategija biljke da izbegne preteranu dehidrataciju za vreme suše (Sharp i Davies, 1989). Nastavljanje rasta korena u uslovima umerenog stresa je posledica brzog osmotskog prilagoĊavanja koji omogućava delimiĉni oporavak turgora i ponovno uspostavljanje gradijenta vodnog potencijala za usvajanje vode (Hsiao i Xu, 2000). Smatra se da je ova sposobnost korena da nastavi usvajanje vode i u uslovima niskog Uvod 4 vodnog potencijala korelisana sa akumulacijom (abscisinske kiseline) ABA (Wilkinson i Davies, 2002). Povećana koncentracija ABA u ksilemu dovodi do povećanja rastenja korenovog sistema, a takoĊe, moţe uticati na povećanje hidrauliĉne provodljivosti korena (Hose i sar., 2002; Aroco i sar., 2003), što moţe imati veliki uticaj na brzinu usvajanja vode u uslovima suše (Kang i sar., 1998; Kang i sar., 2002). Novija istraţivanja pokazuju da i enzimi ekspanzini imaju znaĉajnu ulogu u odrţavanju rastenja primarnog korena u uslovima suše i to nezavisno od koncentracije ABA. Na nivou ćelije, suša dovodi do promena u propustljivosti ćelijskih membrana i ultrastrukturi citoplazme. Pad turgora dovodi do promena u hidrataciji i prostornoj organizaciji proteinskih molekula. Kao rezultat dehidratacije, dolazi do smanjenja zapremine ćelije, povećanja koncentracije molekula u protoplazmi, promene viskoznosti i smanjenja aktivnosti enzima i razmene materija izmeĊu ćelijskih kompartmenata. Kao posledica suše menjaju se i neke morfo-anatomske osobine koje mogu da imaju funkciju u zaštiti i prilagoĊavanju biljaka suši. Tu spadaju osobine kao što su veći broj stoma po jedinici površine, manja veliĉina stoma, sitnije ćelije epidermisa, deblja kutikula, sitnije ćelije mezofila, veći broj slojeva ćelija u mezofilu lista, veća debljina lista, ali i razviće vaskularnih tkiva i izraţena vaskularizacija (Luković i sar.,2009; Gumenyuk i Musatenko, 2006; Kulkarni i sar., 2007). 1.2.2 Fotosinteza i metabolizam Na nivou cele biljke stres suše, obiĉno, dovodi do smanjenja intenziteta fotosinteze i usporavanja rasta, u vezi sa promenama u metabolizmu ugljenika i azota. Pored rastenja ćelija, proces fotosinteze je, takoĊe, veoma osetljiv na sušu. Efekat suše na fotosintezu moţe biti posledica stomaterne ili ne-stomaterne inhibicije. Poznato je da, kao posledica smanjenja sadrţaja vode u zemljištu, dolazi do opadanja potencijala turgora u listovima, što dovodi do smanjenja stepena otvorenosti stoma i fiksacije CO2, što uslovljava tzv. stomaternu inhibiciju fotosinteze (Chaves i sar., 2002). Nestomaterna inhibicija ostvaruje se preko efekta na svetlosne reakcije i transport elektrona, a posebno aktivnost fotosistema II (PSII), kao i na metaboliĉke reakcije fotosinteze i to posebno na aktivnost enzima u procesu karboksilacije i regeneracije akceptora. Uvod 5 Nedostatak vode utiĉe i na intenziviranje hidrolitiĉkih procesa, mobilizaciju skroba i povećanje koliĉine supstrata za disanje, pre svega akumulacije monosaharida kao što su glukoza i fruktoza, usled povećane aktivnosti enzima invertaze (Trouverie i sar., 2003). Suša utiĉe i na translokaciju asimilata, s obzirom da je transport preko floema zavisan od potencijala turgora, tako da pad vodnog potencijala inhibira transport asimilata iz nadzemnog dela u koren. Pored toga, usporeno je usvajanje hranljivih materija iz zemljišta, kao i njihov transport kroz biljku što se nepovoljno odraţava na rastenje vegetativnih organa. Kako je rast korena i listova u kompeticiji za asimilate proizvedene u listovima, kao i za vodu i mineralne supstance usvojene korenom, u uslovima vodnog deficita rast nadzemnog dela biljke ĉesto biva inhibiran, a rast korena favorizovan u odnosu na rast listova. (Hsiao i Xu, 2000). 1.2.3 Vodni režim i reakcije stominih ćelija Potencijal vode je osnovni parametar vodnog reţima biljaka. Od vrednosti potencijala vode zavisi pravac kretanja vode u tzv. SPAC (soil - plant - atmosphere - continuum) sistemu, odnosno sistemu zemljište - biljka - atmosfera. Voda se kroz biljke spontano kreće od pozitivnijih ka negativnijim vrednostima potencijala vode sledeći hidraturni pad (opadanje vlaţnosti) od zemljišta, korena, ka nadzemnim delovima biljaka i atmosferi. Pravac kretanja vode u biljnim ćelijama, tkivima ili izmeĊu organa, takoĊe, sledi gradijent potencijala vode. U vodnom reţimu biljaka, ukupan potencijal vode se uglavnom razmatra kao rezultanta dejstva dve osnovne sile i to sile pritiska (turgora) i osmotske sile. To se moţe predstaviti sledećom jednaĉinom: l = t +o gde su: l - ukupan potencijal vode u biljnim tkivima t - potencijal turgora (pritiska) o - osmotski potencijal Vrednosti ukupnog potencijala vode u biljnim tkivima su, uglavnom, negativne kao i vrednosti osmotskog potencijala, dok su vrednosti potencijala turgora pozitivne i uslovima suše ili dehidratacije dostiţu nulte vrednosti. Potencijal turgora nastaje kao Uvod 6 rezultat delovanja spoljašnjeg hidrostatiĉkog pritiska na vodu u zidovima i membranama biljnih ćelija, a odrţanje pozitivnih vrednosti turgora je od posebnog znaĉaja za rastenje ćelija i njihovo funkcionisanje. Kada turgor dostigne nulte vrednosti dolazi do kolapsa ćelije. 1.2.3.1 Reakcije stominih ćelija U transpiraciji se „gubi“ 90% od usvojene vode od strane biljaka, a samo 10% ili manje koristi za potrebe fizioloških procesa. Regulacijom otvorenosti stoma, biljke moraju u suši da regulišu dva suprotna zahteva - maksimalnu fotosintezu uz minimalnu transpiraciju. Zahvaljujući specifiĉnosti svoje graĊe, metaboliĉkih i molekularnih procesa, stome su u stanju da aktivno reaguju na tzv. signale stresa suše (ali i ostalih stresnih faktora) i da u skladu sa njima integrišu i kontrolišu stepen svoje otvorenosti, što moţe da utiĉe na fiziološke odgovore biljaka. Stomine ćelije na signale stresa u kraćem vremenskom intervalu reaguju tako što smanjuju transpiraciju, ali odrţavaju fotosintezu, a u sluĉaju dugotrajne suše svojim daljim zatvaranjem spreĉavaju jaku dehidrataciju tkiva i tako pomaţu preţivljavanju. Te reakcije stominih ćelija se stoga definišu kao “primarna i sekundarna linija odbrana od suše“ (Kang i Zhang, 2004). Koliko su reakcije stoma sloţene, pokazuju rezultati da i povećana transpiracija moţe da predstavlja poţeljnu adaptivnu reakciju biljaka jer doprinosi njihovom hlaĊenju, što je od posebnog znaĉaja za uslove gajenja biljaka gde visoka temperatura prati sušu (Morison i sar., 2008). TakoĊe, od reakcija stoma zavise transport jona i translokacija asimilata. Stome reaguju na razliĉite endogene i egzogene stimuluse, koji menjajući turgor ovih ćelija dovode do njihovog otvaranja ili zatvaranja. Promene turgora su rezultat fluksa katjona i anjona kroz jonske kanale na plazmalemi i tonoplastu stominih ćelija (Roelfsema i sar., 2004). Stimulusi za otvaranje stoma, kao što je npr. svetlost, aktiviraju izlazak H + jona iz citoplazme stominih ćelija preko plazma-membranske H+- ATPaze, što dovodi do hiperpolarizacije membrana i do influksa K+ i anjona (Cl-) kroz odgovarajuće jonske kanale (Slika 1.1). Nasuprot tome, u uslovima suše, akumulira se ABA koja spreĉava influks ili pojaĉava efluks K+ i anjona (Cl- i malat2-), a kao posledica tih promena javlja se redukcija turgora i zatvaranje stoma (Wilkinson i Davies, 2002). Jabuĉna kiselina (malat) se obrazuje iz skroba koji je nastao kao rezultat fotosinteze u stominim ćelijama. TakoĊe, ABA indukuje porast kalcijuma u citoplazmi, Uvod 7 koji dalje formira kalcijumski talas (McAinsh i sar., 1995). Ispitivanja više autora su pokazala da povećana koncentracija citoplazmatskog Ca²+i dovodi do depolarizacije membrane aktivirajući K+aut i inhibirajući K + in kanale. Noviji rezultati su ukazali i na prisustvo oscilatornih promena u koncentraciji Ca²+i, a takoĊe i to da od kinetike oscilatornih promena zavisi reakcija otvaranja ili zatvaranja stoma (Allen i sar., 2000). Na kompleksnost reakcija stominih ćelija ukazuju i rezultati Prokić i sar. (2005, 2006). Oni su pokazali da je otvorenost stominih ćelija rezultat sloţene interakcije Ca2+, ABA i pH, kao i to da ti odnosi zavise i od biljne vrste. Slika 1.1 Mehanizmi otvaranja i zatvaranja stoma (Prokić, 2009) 1.2.4 Fitohormoni U uslovima vodnog stresa dolazi i do promena u koncentraciji i balansu fitohormona koji mogu da indukuju razliĉite fiziološke efekte kod biljaka u zavisnosti od njihove osetljivosti na stres, faze rastenja i razvića kao i od stepena stresa kojem su izloţene. Tako pri stesu suše dolazi do smanjene sinteze auksina, citokinina i giberelina, ali i povećanja ABA i etilena. Uvod 8 1.2.4.1 Abscisinska kislina (ABA) Poznato je da biljni hormon abscisinska kiselina ima znaĉajnu ulogu u reakciji biljaka na razliĉite abiotiĉke i biotiĉke stresne faktore, koji se zbog toga i naziva „hormon stresa“. Ovaj hormon predstavlja i neku vrstu univerzalnog hemijskog signala stresa koji se transportuje na većim rastojanima. U prvim fazama suše kada zemljište tek poĉinje da gubi vodu i kada potencijal listova još uvek nije pretrpeo znaĉajnije promene, poĉinje da se akumulira ABA u korenu. Iz korena ona prelazi u ksilemske elemente i transportuje se kroz nadzemni deo stabla do listova i stoma (Zhang i Davies, 1990). Veliki broj radova govori o povećanju ABA u ksilemskom soku prilikom delovanja suše (Wilkinson i Davies, 2002; Davies i sar., 2005). Taj intezitet, najverovatnije, predstavlja rezultantu nastalu na osnovu prisutne koliĉine ABA u spoljašnjoj sredini i one unutar same biljke. ABA je prisutna u spoljašnjoj sredini, tj. zemljištu, gde dospeva kao produkt mikroorganizama, ali je prisutna i zbog eksudacije iz korena (Jiang i Hartung, 2007). Unutar same biljke, abscisinska kiselina nastaje u procesima sinteze. Neka ispitivanja su pokazala da se ABA sintetiše na rastojanju od 3 cm od samog vrha korena (Zhang i Davies, 1987). Na osnovu mnogobrojnih ĉinjenica moţe se pretpostaviti da porast ABA u kilemskom soku nastaje zbog: povećane sinteze ABA u korenu i translokacije, povećane recirkulacije ABA floemom, prevoĊenja prekursora- ABA u ABA i redukcije katabolizma za ABA. Biosinteza ABA i geni uključeni u biosintezu ABA nastaje preko izopentenil-difosfata, od kojih se kasnije dobijaju intermedijeri fitoen i likopen. Ovi intermedijeri ciklizacijom se prevode u β karoten, koji daljom hidroksilacijom daje zeaksantin, od kojeg se preko anteraksantina formira violaksantin. Ove reakcije se odvijaju pod katalitiĉkim delovanjem enzima epoksidaze. Epoksidaza kod Arabidopsis thaliana je kodirana ABA1 (ABA deficit 1) genom, a kod duvana na njegovim ortologom ABA2. TakoĊe, protein koji se sintetiše na ABA4 genu utiĉe na prevoĊenje trans-violaksantina u trans-neoksantin, a pretpostavlja se da tokom dehidratacije on ima vaţnu ulogu tokom de novo sinteze ABA. TakoĊe u hloroplastu se produkuje 9'cis-epoksikarotenoid dioksigenaza, NCED (9'cis-epoxycarotenoid dioxygenase) koja cis-neoksantin prevodi u citoplazmatski ksantoksin, a ovaj korak je tzv. prvi obavezani korak u sintezi ABA. Kod paradajza, 9'cis-epoksikarotenoid dioksigenaza je kodirana LeNCED1 genom. Da bi se iz ksantoksina dobio abscisinski aldehid potrebno je prisustvo dehidrogenaze/reduktaze, koja se kod A. thaliana sintetiše Uvod 9 na ABA2 genu. Konaĉno aldehid se prevodi u kiselinu pod delovanjem aldehidne oksidaze, koja predstavlja enzim dobijen sa AAO3 gena. Aktivnost aldehidne oksidaze zavisi od molibdenskog kofaktora, u koji se prvo ugradi sumpor delovanjem sulfuraze sa ABA3 gena (Wasilewsk i sar., 2008). Tako, zbog smanjenog prevoĊenja aldehida u alkohol je smanjenja i sinteza ABA kod flacca mutanata pradajza (Taylor i sar., 1988). AAO3 moţe biti ukljuĉen kao sastavni deo odgovora na dejstvo suše. Praćenjem lokalizacije ovog enzima došlo se do podatka da je on prisutan u vrhu korena, parenhimskim ćelijama koje se nalaze uz ksilemske elemente, kao i u ćelijama koje su pridruţene floemu. TakoĊe, unutar stoma je izmerena manja aktivnost enzima AAO3, dok je njegovo prisustvo u većoj meri zapaţeno u neposrednoj okolini stoma (Koiwai i sar., 2004). Kod paradajza su pronaĊena tri funkcionalna AO gena (TAO1, TAO2 i TAO3) i dva pseudogena (Min i sar., 2000; Ori i sar., 1997). TAO1 (tomato aldehyde oxidase 1) je kao i TAO3 lociran na hromozomu 11. TAO geni su mnogo srodniji meĊuobno (Min i sar., 2000) nego sa bilo kojim od Arabidopsis AO gena, tako da nije moguće predvideti, na osnovu poreĊenja sa Arabidopsis sekvencama, koji od TAO gena kodira za ortolognu ABA-specifiĉnu aldehidnu oksidazu (Slika 1.2). Slika 1.2 Biosinteza ABA (prema Nambara i Marion-Poll, 2005) Uvod 10 Efekti ABA Mnogobrojni efekti i odgovori biljaka na ABA se mogu generalno podeliti na dve kategorije i to: brze i spore. Od brzih efekata ABA najviše su prouĉavani efekti na stomine ćelije (Mansfield i sar., 1990; Bahrun i sar., 2002; Liu i sar., 2003). Najveći deo aktivnosti se ostvaruje u sporim reakcijama gde ABA deluje na ekspresiju gena. ABA ima direktnu ulogu u regulaciji rasta listova pod uticajem suše. ABA moţe uticati na mehaniĉke osobine ćelijskog zida i tako uticati na smanjenje ekstenzibilnosti zida (Van Volkenburg i Davies, 1983). Neki rezultati ukazuju da ABA inhibira protonsku pumpu na nivou plazmamembrane i na taj naĉin spreĉava acidifikaciju ćelijskog zida koja je neophodna za izduţivanje. Prema postojećim rezultatima, ABA moţe uticati na redukciju sadrţaja Ca2+ u citoplazmi ćelija listova, što moţe uticati na brzinu sinteze komponenata ćelijskih zidova, kao što je hemiceluloza (Wakabayashi i sar., 1991), a što dovodi do promena mehaniĉkih osobina ćelijskih zidova i promene u brzini rastenja (Cramer i Jones, 1996). Postoje i rezultati koji ukazuju da ABA povećava aktivnost peroksidaze ćelijskog zida i tako inhibira izduţivanje ćelija (Bacon i sar., 1998). ABA utiĉe i na promenu sastava proteina u ćelijskom zidu povećevajući ekspresiju gena za sintezu proteina bogatih prolinom (PRP) koji mogu inhibirati njegovu akstenzibinost. Istraţivanja su pokazala da postoji diferencijalna ekspresija gena za ovaj protein u biljnim organima koja uslovljava i razliĉitu reakciju biljke, odnosno inhibiciju elongacije hipokotila, dok na elongaciju korena ima minimalan efekat. Povećanje ABA u suši utiĉe na preusmeravanje ugljenika iz listova koji su poţuteli u mlade listove, koji zatim pokazuju viši nivo foto- i antioksidativne zaštite kako stres napreduje, tako da biljka nastavlja rast i sposobna je da se intenzivnije odupre stresu (Munne-Bosch i Alegre, 2004). 1.2.4.2 Etilen Etilen je po mnogim karakteristikama izuzetna pojava meĊu biljnim hormonima. Prvo, to je jedini hormon koji se na fiziološkoj temperaturi nalazi u gasovitom stanju. Drugo, svi ostali hormoni spadaju u grupe srodnih jedinjenja, dok je etilen jedina supstanca svoje vrste, koja se po biohemiji i fiziološkom dejstvu izdvaja kao samostalna jedinica. Pošto je u nekim procesima antagonist stimulatora rastenja, etilen se ĉesto svrstava meĊu inhibitore, meĊutim to treba shvatiti uslovno. Na primer, etilen inhibira Uvod 11 rastenje stabla, ali stimuliše procese koji se dešavaju na kraju vegetacionog perioda, kao što je sazrevanje plodova, opadanje lišća i starenje. Biosinteza etilena Prekursor etilena je L-metionon, od ĉijih ugljenika 3 i 4 etilen postaje (Yang i Hoffman, 1984). Biosinteza ukljuĉuje dva kljuĉna jedinjenja, S-adenozil metionin (SAM) i 1-amino-ciklopropan-1-karboksilnu kiselinu (ACC). Prva reakcija u biosintezi je proizvodnja SAM, koji se u drugum stupnju konvertuje u ACC koji je direktni prekursor etilena. ACC je vrlo vaţan stupanj u sintezi etilena i verovatno se on transportuje do ćelija koje proizvode etilen. Stupanj na kome se najĉešće obavlja regulacija biosinteze etilena je ACC sintaza, usled ĉega je koliĉina ACC ograniĉavajući faktor za proizvodnju etilena. Efekti etilena Etilen ima efekta na epinastiju, indukciju adventivnih korenova, cvetanje, opadanje listova i plodova, ali, najvaţniju ulogu etilen ima u sazrevanju soĉnih plodova. Postoje mnogobrojni podaci u literaturi koji pokazuju da je etilen regulator rasta biljaka u uslovima stresa suše. Nekoliko studija je ukazalo na vaţnost interakcije izmeĊu ABA i etilena u razvoju i rastenju izdanaka i korena u uslovima suše. Tako, smanjena koliĉina ABA u izdancima uslovljava etilenom indukovanu inhibiciju rastenja nadzemnog dela, dok veća koncentracija ABA u korenu spreĉava da etilen inhibira rastenje korena (Sharp, 2002). Ovi rezultati objašnjavaju paradoksalne rezultate da su ABA deficitarni mutanti paradajza manjeg rasta i imaju manje listove od divljeg tipa, kao i da se rastenje listova i stabla moţe uspostaviti posle egzogene aplikacije ABA. Prema konceptu interakcije ABA i etilena u suši, uloga ABA je da „kontroliše“ da koncentracija etilena ne poraste i inhibira rastenje. Rezultati Sobeih i sar. (2004) sa divljim tipom i transgenim biljkama paradajza (ACO1AS- sa niskom stres-indukovanom produkcijom etilena) su pokazali da nema inhibicije rasta listova u posebnom tretmanu suše (partial root-zone drying-PRD), sugerišući da je povećana produkcija etilena u PRD tretmanu odgovorna za inhibiciju rasta listova. 1.2.5 Transport i funkcija mineralnih soli Biljke usvajaju mineralne elemente uglavnom iz zemljišta, mada, imaju i mogućnot usvajanja preko listova. Iz korena, mineralne soli se u stablo prenose Uvod 12 transpiracionim tokom kroz ksilem. MeĊutim, ako je transpiracija bila intenzivna, višak soli se iz listova vraća u korenove floemom. Kalcijum se, meĊutim, kreće samo kroz ksilem i zadrţava se u tkivu lista jer se vrlo slabo prenosi kroz elemente floema (Marschner, 1995). Većina soli, a naroĉito metali, se ne prenosi u slobodnom obliku, ali je izuzetak kalijum koji se uvek prenosi slobodan. Soli i druge supstance, rastvorene u ksilemskom soku, kreću se kroz biljku pasivno, zajedno sa strujom koju povlaĉi transpiracija. Tako, intenzitet transpiracije moţe znatno da utiĉe na snabdevanje nadzemnih delova biljke. MeĊutim, kada se u biljci transpiracija ograniĉi, nadzemni delovi, ipak, nisu izloţeni nedostatku soli. Pojedini biljni organi, kojima su mineralne soli potrebne, apsorbuju soli iz ksilema, što sniţava njihov osmotski potencijal, pa se izvesna koliĉina vode, takoĊe, transportuje u tom pravcu. Tako, ĉesto delovi koji rastu, listovi, cvetovi, plodovi, predstavljaju atraktivne centre koji crpe mnoge supstance iz okolnih tkiva. Pokazano je da pravac kretanja soli koje se kreću floemom, odreĊuju delovi biljke koji rastu. Tkiva koja sadrţe rezerve ili listovi koji su završili rastenje, imaju negativan hemijski potencijal tj. veću koncentraciju pojedinih jona; organi koji rastu, kao što su stablo i koren mlade biljke, mladi listovi, cvetovi i plodovi, imaju pozitivniji potencijal i usled toga se soli kreću niz gradijent potencijala (Marschner, 1995). Azot je vaţan za izgradnju proteina i nukleinskih kiselina i najviše utiĉe na prinos biljaka (Marschner, 1995). Azot utiĉe i na vodni reţim biljaka, jer u prisustvu dovoljne koliĉine azota, biljke intenzivnije transpirišu. Nedostatak ovog elementa smanjuje veliĉinu i broj stoma po jedinici lisne površine. Kalijum je verovatno jedini element koji se nikada ne ugraĊuje u organska jedinjenja. Najviše ga ima u mladim listovima koji su metaboliĉki vrlo aktivni. U biljci je vrlo pokretljiv i transportuje se uvek u organe koji rastu. Jon kalijuma je aktivator preko 40 enzima. Druga znaĉajna uloga je njegovo uĉešće u membranskom transportu jer omogućava rad jonskih pumpi, tako da je znaĉajan za pokrete stominih ćelija i transport kroz floem (Mengel i Kirkby, 2001). Kalijum je jedan od najvaţnijih elemenata koji uĉestvuju u uspostavljanju osmotskog potencijala, što osim za pokrete stominih ćelija, ima velikog znaĉaja za rastenje ćelija. Kao takav, vrlo je znaĉajan u vodnom reţimu biljaka. Uvod 13 Kalcijum, pored mnogih drugih znaĉajnih funkcija, igra vaţnu ulogu u regulaciji ćelijskih aktivnosti, tako što vezivanjem za kalmodulin aktivira mnoge enzime, u prvom redu kinaze i fosfataze, koje kasnije fosforiluju druge enzime (Mengel i Kirkby 2001). Tako, jon kalcijuma ima veoma vaţnu ulogu kao sekundarni mesendţer u ćeliji. Sa taĉke vodnog reţima biljaka, vrlo je vaţan, jer uĉestvuje u reakcijama stominih ćelija. Magnezijum uĉestvuje u graĊi molekula hlorofila, a joni magnezijuma su aktivatori velikog broja enzima (Marschner, 1995). GvoţĊe ima nezamenljivu funkciju u razliĉitim redoks sistemima, a aktivator je i nekih enzima (Marschner, 1995). Mangan je aktivator mnogih enzima, a u hloroplastima ulazi u sastav kompleksa za oslobaĊanje kiseonika (Mengel i Kirkby 2001). Bakar uĉestvuje u nekim redoks sistemima, a sastavni je deo citohrom oksidaze i plastocijanina (Mengel i Kirkby 2001). Cink je sastavni deo alkoholne dehidrogenaze i aktivator karbonske anhidraze (Mengel i Kirkby 2001). 1.3 Molekularne osnove dejstva suše Biljke odgovaraju i adaptiraju se na vodni deficit i na ćelijskom i molekularnom nivou, na primer, akumulacijom osmolita i proteina ukljuĉenih u toleranciju stresa. Veliki broj gena razliĉite funkcije je indukovan u uslovima suše (Shinozaki i sar., 2003; Bartels i Sunkar, 2005; Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 2005). Većina produkata ovih gena ima ulogu u toleranciji i odgovoru na sušu na ćelijskom nivou. Postoje dva regulatorna sistema sušom indukovane genske ekspresije, ABA-zavisni i ABA- nezavisni (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 2005). Analiza ekspresije gena indukovanih ABA-om je otkrila da neki geni zahtevaju biosintezu proteina za svoju indukciju ABA-om, što sugeriše postojanje bar dva nezavisna puta izmeĊu produkcije endogene ABA-e i genske ekspresije tokom stresa. Cis-aktivni i trans-aktivni regulatorni elementi koji uĉestvuju u ABA-nezavisnoj i/ili ABA-zavisnoj genskoj ekspresiji indukovanoj sušom su precizno analizirani na molekularnom nivou (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 2005). Promoter gena indukovanog sušom, visokim salinitetom i hladnoćom, RD29A/COR78/LTI78, sadrţi dva glavna cis-aktivna elementa, ABRE (ABA- responsive element) i DRE (dehidration-responsive element)/CRT (C-repeat), oba ukljuĉena u ekspresiju gena indukovanih stresom (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, Uvod 14 1994, 2005). ABRE ima ulogu u ABA-zavisnoj, a DRE/CRT u ABA-nezavisnoj genskoj ekspresiji u odgovoru na abiotiĉki stres (Slika 1.2). 1.3.1 ABA-nezavisna genska ekspresija Nekoliko gena je indukovano sušom, visokim salinitetom i hladnoćom kod abi i aba mutanata, što znaĉi da ne zahtevaju ABA za svoju ekspresiju, ali odgovaraju na egzogenu ABA. Glavni cis-aktivni element u ABA-nezavisnoj genskoj ekspresiji je DRE koji sadrţi konzerviranu sekvencu A/GCCGAC. Transkripcioni faktori koji se vezuju za DRE elemente pripadaju ERF/AP2 familiji (Slika 1.3). Izolovani su CBF/DREB1 i DREB2 (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 2005). Produkti CBF/DREB1 gena, koji su brzo i kratkotrajno indukovani uslovima stresa usled hladnoće, aktiviraju ekspresiju target stres-induktivnih gena (Jaglo-Ottosen i sar., 1998; Liu i sar., 1998; Kasuga i sar., 1999). Ekspresija CBF/DREB1 gena kod transgenih biljaka povećava toleranciju na smrzavanje, sušu i visok salinitet, što pokazuje da CBF/DREB1 proteini uĉestvuju u razvoju tolerancije na stres bez modifikacije (Liu i sar., 1998). DREB2 geni su indukovani dehidratacijom i mogu aktivirati druge gene ukljuĉene u toleranciju suše (Liu i sar., 1998). Ekspresija DREB2 gena kod transgenih biljaka ne poboljšava toleranciju na stres, što ukazuje na postojanje post-translacione aktivacije DREB2 proteina (Liu i sar., 1998). DREB2 protein je eksprimiran u normalnim uslovima i aktivira se osmotskim stresom kroz post-translacionu modifikaciju u ranim fazama odgovora na osmotski stres. Nekoliko sušom indukovanih gena ne odgovara ni na niske temperature ni na ABA tretman, ukazujući na postojanje još jednog ABA-nezavisnog puta regulacije odgovora na stres usled dehidratacije. Ovi geni ukljuĉuju ERD1 koji je indukovan i senescencijom (Nakashima i sar., 1997). Analizom ERD1 promotera identifikovana su dva cis-aktivna elementa (Simpson i sar., 2003). DNK-vezujući proteini koji interaguju sa ovim cis-elementima su identifikovani kao NAC transkripcioni faktori (Tran i sar., 2004). 1.3.2 ABA-zavisna genska ekspresija Nivo endogene ABA znaĉajno raste kod mnogih biljaka u uslovima suše i visokog saliniteta (Ingram i Bartels, 1996; Bray, 1997). U jednom od ABA-zavisnih Uvod 15 puteva geni indukovani sušom ne zahtevaju biosintezu proteina za svoju ekspresiju. Ovi dehidratacijom-induktivni geni sadrţe ABRE (ACGTGGC) kao cis-aktivni element u svom promotorskom regionu (Slika 1.2). Dva ABRE motiva su vaţni cis-aktivni elementi koji kontrolišu ABA-zavisnu ekspresiju RD29B gena (Uno i sar., 2000). Dva bZIP transkripciona faktora AREB/ABF se vezuju za ABRE aktivirajući ABA-zavisnu gensku ekspresiju (Choi i sar., 2000; Uno i sar., 2000). AREB/ABF proteini zahtevaju ABA-posredovan signal za svoju aktivaciju, što je pokazano njihovom smanjenom aktivnošću kod aba i abi mutanata. Ovo se dešava verovatno zbog ABA-zavisne fosforilacije AREB/ABF proteina. Indukcija RD22 gena je posredovana ABA-om i zahteva biosintezu proteina za ABA-zavisnu ekspresiju. MYC transkripcioni faktor, atMYC2, i MYB transkripcioni faktor, atMYB2, se vezuju za cis-elemente u promoteru RD22 i kooperativno aktiviraju RD22 (Abe i sar., 1997, 2003). MYC i MYB proteini se sintetišu nakon akumulacije ABA, definišući svoju ulogu u kasnijim fazama odgovora na stres. Slika 1.3 Transkripciona regulatorna mreţa signala abiotiĉkog stresa i genske ekspresije (prema Shinozaki i Yamaguchi-Shinozaki, 2007) Uvod 16 Identifikovan je i RD26 gen koji kodira NAC transkripcioni faktor (Fujita i sar., 2004). Ekspresija ovog gena je indukovana sušom, visokim salinitetom, ABA i JA (jasmonska kiselina) tretmanom. RD26 protein je lokalizovan u nukleusu i ima transkripcionu aktivnost. Mnogi JA-induktivni geni su target geni RD26 (Fujita i sar., 2004), što ukazuje na vaţnu ulogu RD26 u posredovanju izmedju ABA i JA signala tokom odgovora na stres usled suše i povredjivanja biljke (Slika 1.3). Molekularna istraţivanja su posebno doprinela razumevanju percepcije i transdukcije signala suše. 1.4 Percepcija i transdukcija signala suše Još uvek nije u potpunosti jasno kako biljke prepoznaju stres suše i kako se vrši transdukcija signala izmeĊu ćelija, tkiva i celog organizma. Ćelije mogu da reaguju na redukovani potencijal vode i potencijal turgora i odgovarajuće promene u osmotskoj komponenti, ali i na promene u ćelijskim makromolekulima (metaboliĉke promene) ili fiziĉkim osobinama membrana (interakcije izmeĊu proteina i lipida). Ispitivanje transdukcije signala suše komplikuje i to što se signali mogu prenositi na kratkim rastojanjima (celularni nivo) ili na duţim (tzv. long distance mehanizam), kao i to što moţe doći do interakcije i preklapanja signalnih puteva za razliĉite stresore. 1.4.1 Hidraulični i hemijski signali Dobro je poznato da koren moţe da registruje promenu abiotiĉkih faktora, kao što je npr. sadrţaj vode u zemljištu. Promena sadrţaja vode u zemljištu, koju koren registruje preko rizosfere, indukuje odgovor tzv. signala suše, koji mogu biti hemijski (Wilkinson i Davies, 2002) ili hidrauliĉni (Sailendra i sar., 1995; Comstock, 2002) i koji se prenose do nadzemnog dela biljke, odnosno do listova i stominih ćelija, gde indukuju razliĉite reakcije. Hidraulični signali suše nastaju kao rezultat smanjenog usvajanja vode od strane ćelija korena i opadanja turgora. Prema klasiĉnom konceptu, efekti suše se razmatraju kao rezultat dejstva hidrauliĉnih signala, odnosno opadanja turgora u ćelijama. Uvod 17 Hemijski signali su jedinjenja ili molekuli koji se sintetišu u korenu kao odgovor na stres suše i koji se potom, preko ksilema, iz korena transportuju do nadzemnih delova biljke, gde utiĉu na stepen otvorenosti stoma i rastenje drugih ćelija. Hemijski signali suše su predmet veoma intenzivnih istraţivanja poslednjih godina, jer se pokazalo da do redukcije rastenja u suši moţe doći i bez opadanja turgora, i da su te promene rezultat tzv. hemijskih signala suše. (Bleckman i Davies, 1985; Zhang i Davies, 1987, 1989). Po ovom konceptu, koren je veoma znaĉajan senzor promena u zemljištu (ne samo smanjenja koliĉine vode, već i promena u mehaniĉkom sastavu) o kojima „obaveštava“ nadzemni deo, tako što sintetiše metabolite koji se, kao hemijski signali, transportuju ksilemom do nadzemnog dela, gde izazivaju zatvaranje stoma i redukuju rastenje. Hemijski signali prethode hidrauliĉnim i mogu se oznaĉiti kao signali „ranog upozoravanja“ biljaka na stres (Dodd i sar., 1997). Istraţivanja identifikacije hemijskih signala su pokazala da, sem ABA, i drugi hormoni (prvenstveno citokinini i etilen) mogu da budu hemijski signali. TakoĊe, hemijski signali mogu biti promena pH ksilema, apoplasta i citosola (Wilkinson i sar., 1998; Wilkinson i Davies, 2002; Gao i sar., 2004,), ali i joni kalcijuma (Shang i sar., 2005; Guo i sar., 2008). Povećanje pH ksilemskog soka utvrĊeno je u uslovima suše, ali ovaj mehanizam povećanja pH još uvek nije u potpunosti objašnjen. Ispitivanja su pokazala da u uslovima suše dolazi do redukcije aktivnosti plazmamembranske protonske ATPaze u parenhimskim ćelijama oko ksilemskih sudova i da ta promena utiĉe na vrednost pH ksilema i apoplasta. Kao mehanizam povećanja pH navode se i promene u aktivnosti nitrat reduktaze u korenu i/ili listu biljaka pod stresom. Na promenu pH apoplasta moţe uticati i povećanje sadrţaja nitrata u ksilemu, kao rezultat proton/nitrat kotransporta kroz plazmamembranu ćelija lista. Istraţivanja su pokazala da se mehanizmi transporta signala razlikuju ukoliko se oni prenose na veća rastojanja (od korena do listova) ili manja rastojanja (na ćelijskom nivou). Sloţenosti ovih istraţivanja doprinosi i to što moţe doći i do meĊusobne interakcije hemijskih signala, ali i njihove interakcije sa hidrauliĉnim signalima. 1.4.2 Percepcija i prenos signala na ćelijskom nivou Pretpostavlja se da je senzor suše na nivou ćelije transmembranski vezana dvokomponentna histidin kinaza koju aktivira porast u osmolarnosti ćelije, a koji je izazvan opadanjem turgora u ćeliji (ćelijskom dehidratacijom). Zato se ova kinaza Uvod 18 naziva „osmosenzor“ i ona indukuje kaskadu reakcija (transdukcija signala) koje vode ka ekspresiji gena indukovanih dehidratacijom. TakoĊe je moguće i da razvoj stresa utiĉe na fiziĉke osobine membrane, odnosno protein-lipidne interakcije. To moţe da izazove promene fluidnosti membrana i reorganizaciju citoskeleta, što utiĉe na kanale za vodu (akvaporine) i jone. Nakon percepcije signala, signalna transdukcija, preko sinteze sekundarnih prenosioca i oslobaĊanja Ca2+, dovodi do ekspresije gena indukovanih sušom. Produkti ovih gena se mogu klasifikovati na funkcionalne i regulatorne proteine (Shinozaki i sar., 2003). 1.4.2.1 Percepcija i transdukcija ABA signala U percepciji i transdukciji signala suše posebno je znaĉajna uloga ABA, jer je pokazano da više od 67% gena aktivnih u suši, predstavljaju geni koji su regulisani ABA-om. Postoje dva regulatorna sistema sušom indukovane genske ekspresije, ABA- zavisni i ABA-nezavisni (Yamaguchi-Shinozaki i Shinozaki, 2005). Postoji dosta dilema i podataka o receptorima za ABA. Do sada je predloţeno nekoliko ABA membranskih receptora ukljuĉujući FCA (Simpson i sar., 2003), GCR2 koji pripada G familiji (Liu i sar., 2007). i CHLC koji je subjedinica Mg-helataze (Shen i sar., 2006). Kod A. thaliana se pokazalo da je 14 rastvorljivih proteina iz grupe PYR/PYL/RCAP sposobno da formira ABA-receptor kompleks i aktivira transkripciju gena na ĉiju aktivnost utiĉe ABA. U receptorski kompleks su ukljuĉene još dve grupe proteina i to: protein fosfataze 2C (PP2C) i SNF1 - protein kinaza 2 (SnRK2). U ovom modelu PYR/RCAR deluje kao receptor za ABA, PP2C kao negativni regulator signalnog puta, a SnRK2 kao pozitivni regulator nizvodnog signalnog puta (Hubard i sar., 2010). Na taj naĉin je obezbeĊena dupla negativna regulacija signalnog puta jer vezivanje ABA za PYR/RCAR inhibira PP2C aktivnost, a PP2C inaktivira SnRK2. Kada ABA nije prisutna, PP2C je aktivan i spreĉava SnRK2 aktivnost i prenošenje signala (Slika 1.4). Uvod 19 Slika 1.4 Shema ABA signalnog puta (prema Hubard i sar., 2010) Postoji veliki broj proteina koji pripadaju ABA-zavisnom putu i koji su indukovani sušom, a ĉija je ekspresija od posebnog znaĉaja za reakcije biljaka u suši (npr. RD20, RAB18, LEA14, ABI1, ABI2). Stomine ćelije imaju specifiĉna mesta za vezivanje ABA i ona su oznaĉena kao receptori. Receptori mogu biti smešteni na površini plazma membrane (ekstracelularni) ili u unutrašnjosti ćelija zatvarĉica (intracelularni) (Hornberg i Weiler, 1984; Andesro i sar., 1994; Wang i Zhang, 2008). Ekstracelularni receptori su ukljuĉeni u proces zatvaranja stoma, a intracelularni u inhibiciju otvaranja stoma (Schwartz i sar., 1994). Postoji i pretpostavka da su ekstraćelijski receptori neophodni u brzom, a intraćeljiski u sporom odgovoru na ABA. 1.4.2.2 Transdukcija signala etilena Transdukcija signala etilena je najbolje prouĉena kod A. thaliana. Percepcija signala je regulisana familijom receptora koju ĉine ETR1, ERS1, ETR2, EIN4 i ERS2 (Hua i sar.,1998; Sakai i sar., 1998). Oni moduliraju aktivnost CTR1 koji je negativni regulator u transdukcionom putu. U odsustvu etilena, CTR1 negativno reguliše EIN2 protein (Alonso i sar., 1999). Nakon percepcije etilena, CTR1 se inaktivira i kao Uvod 20 posledica, EIN2 se oslobaĊa represije. Nizvodno od EIN2 je transkripciona kaskada. EIN2 aktivira transkripcioni aktivator EIN3 (ethylene – insensitive 3) i nekoliko drugih proteina sliĉnih EIN3 (EILs, EIN3 - like proteins). Ovi proteini aktiviraju druge transkripcione faktore kao što je ERF1 i tako regulišu ekspresiju gena ukljuĉenih u odgovor na etilen. Glavna kontrolna taĉka u transdukciji signala etilena je transkripcioni faktor EIN3 (Slika 1.5). Kod paradajza je identifikovano nekoliko receptora za etilen, LeETR1, LeETR2, NR, LeETR4 i LeETR5. Oni moduliraju aktivnost TCTR koji preko EIN2 aktivira transkripcione faktore LeEIL1, LeEIL2 i LeEIL3, a ovi aktivacijom drugih transkripcionih faktora pozitivno regulišu ekspresiju gena ukljuĉenih u odgovor na etilen. Slika 1.5 Transdukcija signala etilena (prema Alexander i Grierson, 2002) Uvod 21 1.5 Mehanizmi tolerancije na sušu Tolerancija ili otpornost biljaka na sušu moţe se definisati na dva naĉina: biološki, kao skup adaptivnih reakcija koje omogućavaju preţivljavanje biljaka u uslovima suše i agronomski, kao skup adaptivnih reakcija kojima se ostvaruje odreĊeni prinos gajenih biljaka u uslovima suše. Biljke mogu da razviju razliĉite adaptivne mehanizme kojima izbegavaju da, uopšte, budu izloţene efektu suše ili, ako su već izloţene suši razvijaju adaptivne mehanizme kojima izbegavaju/tolerišu niske vrednosti potencijala vode (Ψ) (Verslues i sar., 2006). 1.5.1 Izbegavanje suše Izbegavanje suše se ogleda u sposobnosti biljaka da završe svoj ţivotni ciklus pre nastupanja vodnog deficita. Najĉešće se manifestuje kao ubrzanje fenofaza tako da su biljke izloţene suši u fazi semena. 1.5.2 Izbegavanje niskih vrednosti potencijala vode Ukoliko su biljke izloţene dejstvu suše, njihova prva reakcija je da odrţe vodni reţim tkiva blizak vrednostima u optimalnim uslovima. To se ostvaruje tako što se smanjuje odavanje vode ili povećava usvajanje vode (Chaves i sar., 2003). Najbrţe i u najkraćem vremenu to se ostvaruje reakcijama stoma koje redukcijom svoje otvorenosti mogu da smanje gubitak vode i tako doprinesu odrţanju vodnog reţima. U duţem vremenskom intervalu reakcije izbegavanja dehidratacije se ostvaruju anatomsko- morfološkim promenama na nivou lista koje smanjuju transpiraciju (dlake, povećanje gustine epikutikularnog voska, formiranje kristala na površini listova), redukcijom lisne površine, uvijanjem ili odbacivanjem listova (Chaves i sar., 2003). Povećano usvajanje vode je uslovljeno ubrzanim razvićem korenovog sistema i povećanjem hidrauliĉne provodljivosti korena za vodu (Kang i sar., 1998; Kang i sar., 2002). 1.5.3 Tolerancija na niske vrednosti potencijala vode Niske vrednosti Ψ u ćelijama i tkivima mogu da dovedu do povreda i poremećaja u funkciji ćelija i njihovih komponenti. Ukoliko se stres razvija unutar biljnih tkiva, reakcije biljaka na stres se ostvaruju odrţavanjem visokog sadrţaja vode uprkos opadanju potencijala vode (izbegavanje dehidratacije) ili tolerancijom redukovanog sadrţaja vode (tolerancija na dehidrataciju) (Morison i sar., 2008). Uvod 22 Izbegavanje dehidratacije Opadanje turgora u uslovima niskih vrednosti Ψ se moţe spreĉiti mehanizmom osmoregulacije (osmotsko prilagođavanje) i povećanjem elasticiteta tkiva (Chaves i sar., 2003). Osmotsko prilgoĊavanje podrazumeva akumulaciju osmotski aktivnih jedinjenja . Najĉešće su to organska jedinjenja kao što su aminokiseline (prolin, alanin, glutamin, asparagin), amidi, šećeri (saharoza, fruktani) i alkoholi (manitol, sorbitol). Posebno znaĉajnu ulogu ima prolin koji uĉestvuje u zaštiti ćelijskih struktura od dehidratacije, regulaciji pH ćelija i detoksikaciji slobodnih radikala koji nastaju kao rezultat oksidativnog stresa, a koji, kao sekundarni stres, prati ĉesto druge tipove stresa. U osmoregulaciji kao osmotikumi mogu da uĉestvuju i neorganska jedinjenja (razni joni), ali se oni najĉešće akumuliraju u vakuoli. Najznaĉajniji efekat osmoregulacije u listovima je, pored odrţavanja turgora i zaštite membrana od dehidratacije, odrţanje otvorenosti stoma. Tolerantnost na dehidrataciju Mezofite koje su otporne na sušu mogu da, u uslovima jake suše, odrţe strukturu ćelija, posebno membrana i odrţe metaboliĉke procese, zahvaljujući specifiĉnim adaptivnim mehanizmima. Ovi mehanizmi su, prvenstveno, rezultat sinteze specifičnih proteina otpornih na sušu koji deluju tako što spreĉavaju promene u strukturi proteina i odrţavaju njihov integritet neophodan za njihovu funkciju i funkciju ćelijskih organela ili membrana. Veliki broj ovih proteina pripada LEA (late embryogenesis abundant) proteinima (Shinozaki i sar., 2003). Podgrupa LEA proteina, dehidrini, se akumuliraju u uslovima jakog stresa suše, od ostalih se razlikuju po svojoj termostabilnosti, a veoma su hidrofilni. Zbog svojih osobina, u stanju su da interaguju sa hidrofobnim delovima delimiĉno denaturisanih proteina i membranskih struktura i tako stabilizuju i spreĉe agregaciju proteina u toku stresa suše. U uslovima stresa suše, dolazi i do sinteze specifiĉnih „heat shock″ proteina (HSP) koji predstavljaju molekularne šaperone (ĉuvare) ĉija je funkcija u odrţavanju pravilne strukture proteina, kao i u otklanjanju nefunkcionalnih i oštećenih proteina (Vierling, 1991). Pored ovih grupa proteina dolazi i do sinteze ubikvitina i akvaporina. Akvaporini su od posebnog znaĉaja jer formiraju kanale koji regulišu ulazak molekula vode u ćelije. Pored sinteze proteina, u slovima stresa suše dolazi do sinteze specifičnih osmolita ĉija je funkcija u inaktivaciji reaktivnih vrsta kiseonika koje nastaju u uslovima stresa. Uvod 23 Razumevanju adaptivnih reakcija biljaka na sušu su doprinela molekularna istraţivanja koja su omogućila identifikaciju gena ĉija ekspresija omogućava sintezu specifiĉnih proteina, posebno onih koji su ukljuĉeni u reakcije tolerantnosti na dehidrataciju. TakoĊe, ova istraţivanja, pored teorijske, imaju i praktiĉnu aplikaciju, u procesu selekcije otpornih genotipova gajenih bljaka na sušu. 1.6 Metode deficita navodnjavanja - praktična primena fiziologije stresa Snabdevanje vodom postaje sve veći problem širom sveta (Postel, 1998) i izraţena je potreba za pronalaţenjem i primenom efikasnijih strategija navodnjavanja. Za navodnjavanje poljoprivrednih zemljišta koristi se 85% vode koju ĉoveĉanstvo koristi širom sveta (van Schilgaarde, 1994), pa bi tako ĉak i mala redukcija vode za navodnjavanje mogla znaĉajno da poveća koliĉinu vode koja ostaje raspoloţiva za druge potrebe. Ovo naroĉito vaţi za paradajz, jer se gaji na većoj površini od bilo koje druge povrtarske biljke širom sveta (Ho, 1996). U cilju smanjenja koliĉine vode koja se koristi za navodnjavanje, a na osnovu znanja o mehanizmima transporta signalnih molekula, razvijene su nove tehnike zalivanja biljaka, ne samo da bi se manipulisalo vodnim reţimom, već i preraspodelom asimilata i transportom jona koji mogu uticati na kvalitet plodova (Ho, 2005; Kang i Zhang, 2004; Zegbe-Dominguez i sar., 2006). Ove metode su se razvile zahvaljujući teorijskim saznanjima iz oblasti o sintezi hemijskih signala kao adaptivnim reakcijama biljaka na sušu (Jovanović i Stikić, 2012). U oblastima sa povremenim nedostatkom vode i dugim sušnim periodima, uobiĉajena je primena tehnike koja se naziva kontrolisani deficit navodnjavanja (eng. “regulated deficit irrigation”, RDI), koja se tradicionalno preporuĉuje kako bi se spreĉila drastiĉna redukcija prinosa. U takvim uslovima stres suše indukuje hemijske signale iz korena, poput ABA, a biljke reaguju na smanjenu koliĉinu vode smanjenjem transpiracije (zatvaranjem stoma ili smanjejem površine listova). Kako su fotosinteza i rast plodova, u odnosu na transpiraciju, manje osetljivi na vodni deficit, produkcija biomase se smanjuje bez većeg negativnog uticaja na prinos, zbog preusmeravanja resursa u plodove (Wilkinson i Hartung; 2009, Savić i sar. 2009). Uvod 24 Nova tehnika zalivanja, razvijena poslednjih desetak godina kao varijanta RDI, nazvana je delimično isušivanje korena (eng. “partial root-zone drying”, PRD). PRD se bazira na eksperimentima sa podeljenim korenovim sistemom (Gowing i sar., 1990; Dodd i sar., 1996; Dry i sar., 2000; Stoll i sar., 2000; Sobeih i sar., 2004; Stikić i sar., 2011; Jovanović i Stikić, 2012), pri ĉemu se zaliva samo polovina korenovog sistema, a druga polovina se ne zaliva dok se ne osuši do zadatog nivoa. Strane korena se menjaju periodiĉno (Slika 1.6). Slika 1.6. Shema optimalnog navodnjavanja (FI), delimiĉnog isušivanja korenova (PRD) i kontrolisanog deficita navodnjavanja (RDI) Delimiĉno isušivanje korena je do sada prouĉavano u mnogim zemljma (Kang i Zhang, 2004) i uspešno je primenjeno kod mnogih vrsta ukljuĉujući i povrtarske biljke (Kirda i sar., 2004; Dorji i sar., 2005; Jovanović i sar., 2010; Jovanovic i Stikic, 2012). Istraţivanja su pokazala da se biljke sa korenovim sistemom podeljenim na dva dela, naizmeniĉno izloţenih ciklusima isušivanja i zalivanja, razvijaju normalno i bez vidljivog vodnog deficita u listovima (Davis i Zhang, 1991). U teoriji, zalivani deo korena omogućava odrţavanje povoljnog vodnog statusa u nadzemnom delu biljke, dok zasušivani deo korena proizvodi hemijske signale koji se prenose u izdanak sa potencijalnim inhibitornim efektom na rast vegetativnih organa i provodljivost stoma. Pošto je vodni potencijal biljke u ravnoteţi sa najvlaţnijim delom zemljišta, biljke u PRD tretmanu zadrţavaju visok vodni potencijal kao i biljke koje su dobro snabdevene Uvod 25 vodom. Deo korenovog sistema koji je izloţen suši proizvodi hemijske signale, koji se ksilemom prenose do izdanka (Dodd, 2007), gde delimiĉno zatvaraju stome smanjujući gubitak vode, u manjoj meri redukuju fotosintezu i ograniĉavaju rast vegetativnih organa, stimulišući celu biljku da koristi vodu efikasnije (Davis i sar., 2000; de Souza i sar., 2003). Produţeno zasušivanje jedne polovine korena smanjuje na kraju efekat hemijskih signala na provodljivost stoma (Stoll i sar., 2000), verovatno, pošto usvajanje vode iz ove polovine korena proporcionlno sve manje doprinosi transpiracionom toku. Primenom znanja o promenljivoj prirodi efekta došlo se do ovog naizmeniĉnog naĉina zalivanja koji maksimizira proizvodnju ovih signala, a tako i njihov inhibitorni efekat na transpiraciju i rast. Da bi se odrţao efekat PRD na stome, neophodno je redovno menjati strane zalivanja (Dry i sar., 2000a), obiĉno u intervalima 10 do 14 dana (Stoll i sar., 2000), odnosno 7 do 14 dana (Kirda i sar., 2004). Ovo je, ujedno, i objašnjenje zašto biljke u RDI tretmanu gube turgor, što negativno utiĉe na intenzitet fotosinteze, dok biljke u PRD tretmanu nemaju isti mehanizam kontrole stoma i mogu koristiti vodu na štedljiv naĉin bez sušenja listova. PRD tretman redukuje rastenje listova, ali na nivou korena moţe dovesti do njegovog porasta. Takva reakcija korena se moţe smatrati adaptivnom reakcijom biljaka na sušu u PRD sistemu (Prokić i Stikić, 2011). Postoji mnogo dokaza o ulozi ABA kao signala (Wilkinson i Davis, 2002), mada i druga jedinjenja, ukljuĉujući prekursore ABA (Sauter i sar., 2001) i nisku koncentraciju citokinina (Stoll i sar., 2000) ili drugi faktori, kao što su promena mineralnog sastava ili promena pH ksilemskog soka (Prokić i sar., 2006; Jia i Davis, 2007), mogu takoĊe, biti ukljuĉeni u regulaciju korišćenja vode na nivou listova. Prema istraţivanjima Stoll i sar. (2000), PRD tretman dovodi do povećanja koncentracije ABA u suvoj strani korena, pa se tako koncentracija ABA u nezalivanoj strani korena povećava i do 10 puta. Velike promene u sadrţaju ABA u korenu, povezane sa isušivanjem zemljišta, ne moraju, meĊutim, da znaĉe, istovremenu, ekvivalentnu promenu u sadrţaju ABA u listovima, iako je sadrţaj u listovima, po pravilu, viši kod biljaka izloţenih PRD tretmanu nego kod optimalno zalivanih biljaka (Stoll i sar., 2000; Kirda i sar., 2004). U svakom sluĉaju, koliĉina ABA akumulirane u listovima ne mora biti od presudnog znaĉaja za determinaciju otvorenosti stoma (Stoll i sar., 2000), već je za funkcionisanje stoma mnogo znaĉajnija koncentracija ABA u ksilemu (Jia i Zhang, 1999). Većina eksperimenata sa PRD biljkama je pokazala da one imaju više ABA u ksilemskom soku u poreĊenju sa biljkama koje su zalivane istom Uvod 26 koliĉinom vode, ali rasporeĊene na ceo korenov sistem (Rodrigues i sar., 2008; Liu i sar., 2006b; Dodd i sar., 2006; Savić, 2003; Dodd i sar., 2008a). Promena strana u PRD tretmanu povećava transport ABA iz korena (Dodd i sar., 2006b), jer se, prilikom ponovnog zalivanja suve strane, omogućava ovom delu korena da doprinese proporcionalano više ukupnom fluksu i na taj naĉin se u transpiracioni sistem oslobaĊa ABA akumulirana u korenu u toku isušivanja zemljišta. Iako se PRD metoda veoma intenzivno prouĉava, još uvek nisu u potpunosti razjašnjeni mehanizmi regulacije rastenja biljaka, a koji su fundamentalna osnova ove metode. U literaturi je i ograniĉen broj podatataka o akumulaciji i distribuciji ABA (Dodd i sar., 2006)., te su stoga od posebnog znaĉaja ispitivanja reakcija na PRD mutanata koji imaju poremećeni proces sinteze ovog hormona. TakoĊe, nedostaju i ispitivanja molekularne osnove PRD metode, iako je poznato da su reakcije biljaka na sušu genski kontrolisane (Shinozaki i Yamaguchi-Shinozaki, 2000). Za istraţivanja u ovoj disertaciji su odabrana 3 gena ĉija ekspresija moţe znaĉajno da utiĉe na reakcije ispitivanih biljaka i to: NCED, TAO1 i EIL1. 1.7 Paradajz kao objekat istraživanja Paradajz (Lycopersicon esculentum Mill.) je višegodišnja biljka, mada se gaji i kao jednogodišnja. Poreklo vodi iz Juţne Amerike. Većina istorijskih i etnobotaniĉkih podataka vezana je za Meksiko, za oblast Vera Cruz-Puebla, kao mesto odakle potiĉe gajeni paradajz, dok se postojbinom divljeg paradajza smatraju Peru i Ostrva Galapagosa. Dugo vremena u Evropi je gajen samo kao ukrasna biljka zbog straha od toksiĉnosti, a tek polovinom 18-tog veka paradajz se poĉeo koristiti kao povrće, najpre u Italiji, Španiji, Portugaliji i Francuskoj. U našim krajevima paradajz je masovno poĉeo da se gaji tek polovinom 19-tog veka. Koren kod paradajza je vretenast. Centralni koren u direktnoj setvi dostiţe dubinu od 100 do 150 cm i zahvata veliku masu zemljišta. Kada se paradajz gaji preko rasada, glavna masa korena se razvija u površinskom sloju zemljišta (20 do 40 cm). (Marković, 1997; Damjanović i sar., 2001). Stablo paradajza je zeljasto i soĉno, sa starenjem donji delovi odrvenjavaju. Okruglo je ili uglasto i njegov preĉnik iznosi 3-4 cm, moţe dostići duţinu i do 3-4 m. Zbog boĉnih izdanaka, koji se u proizvodnji zakidaju, biljka ima ţbunast izgled. (Marković, 1997; Damjanović i sar., 2001). Stablo ima sposobnost formiranja adventivnih korenova. Cvetovi su sakupljeni u cvasti. Cvast Uvod 27 paradajza moţe biti prosta i sloţena. Kod prostih cvasti cvetovi se razvijaju na njenoj osovini, a kod sloţenih cvasti na boĉnim granama. Prva cvast formira se iznad odreĊenog broja listova, što zavisi od sorte i uslova gajenja. Cvetovi paradajza sadrţe 5- 7 ĉašiĉnih i 5-7 kruniĉnih listića. U većini varijeteta i sorti, cvet ima 6 ĉašiĉnih i 6 kruniĉnih listića. Prašnika je 5 i oni su priĉvršćeni za kruniĉnu cev. Za prašnike je karakteristiĉno da su srasli u vidu konusa koji potpuno obuhvata plodnik i tuĉak. Zbog toga je paradajz samooplodna biljka (Marković, 1997; Damjanović i sar., 2001). Plod je bobica. Paradajz moţe da uspeva u širokom arealu gajenja, ali pošto je to poreklom tropska biljka, ona ima vrlo izraţene zahteve u pogledu toplote, svetlosti i vlage. Optimalne temperature vazduha za rastenje biljaka paradajza kreću se izmeĊu 18.5 °C i 26.5 °C. Na temperaturama ispod 15 °C prestaje cvetanje, a ispod 9 °C zaustavlja se rastenje. Optimalna temperatura zemljišta za razvoj korenovog sistema je 25 °C, temperatura iznad 31 °C usporava porast, a iznad 35 °C zaustavlja rastenje korena (Benton Jones, 1999). Paradajz ima visoke zahteve prema svetlosti, naroĉito u fazi rasada. U uslovima nedovoljne osvetljenosti naroĉito se pogoršava kvalitet plodova, posebno u pogledu sadrţaja šećera i vitamina C. Paradajz dobro raste pri kontinuiranom osvetljenju izmeĊu 400 i 500 μmolm-2s-1 (Benton Jones, 1999). Za paradajz gajen na polju optimalna koliĉina vode je 2000-6600 m3/ha, a za paradajz gajen u stakleniku to je oko litar vode dnevno po biljci pri optimalnoj temperaturi spoljašnjeg vazduha (Benton Jones, 1999). Donja granica optimalne vlaţnosti zemljišta za paradajz u našim klimatskim uslovima smatra se da je 80% od poljskog vodnog kapaciteta (PVK) (Bošnjak i Pejić, 1995). Optimalna relativna vlaţnost vazduha za razvoj paradajza kreće se izmeĊu 50 i 60%. Paradajz se moţe gajiti gotovo na svakom tipu zemljišta, poĉev od aluvijalnih terena, pa do teških smonica. MeĊutim, najpogodnija su laka, propustljiva za vodu i strukturalna zemljišta, bogata humusnim materijama. Optimalan pH zemljišta kreće se u granicama izmeĊu 5.8 i 6.8 (Benton Jones, 1999). Paradajz je kultura koja, za uspešan razvoj, iziskuje obilnu i paţljivo izbalansiranu ishranu. Najbolji rezultati postiţu se kombinovanim Ċubrenjem stajnjakom i mineralnim Ċubrivima (Benton Jones, 1999). Paradajz je jedna od najĉešćih i ekonomski najznaĉajnijih povrtarskih vrsta koje se gaje na otvorenom polju i u zaštićenom prostoru (Ho, 1996, Takaĉ i sar., 2007). Uvod 28 Proseĉna potrošnja paradajza u svetu iznosi 15 kg po stanovniku (FAO), a u našoj zemlji 16 kg po stanovniku (Takaĉ i sar., 2007). Suša je, takoĊe, znaĉajan problem i u proizvodnji paradajza, jer je redukcija rastenja i prinosa jedna od posledica delovanja suše. Za uspešno gajenje paradajza je neophodna optimalna vlaţnost i temperatura i to, posebno, u fazi cvetanja i fazi formiranja plodova. Nedostatak vode u ovim fazama razvića paradajza moţe dovesti do abscisije cvetova i smanjenog formiranja plodova, što za posledicu moţe imati veliku redukciju prinosa (Benton Jones, 1999). Zbog velike potrebe paradajza za vodom i osetljivosti na sušu, u mnogim zemljama je neophodno dodatno navodnjavanje radi postizanja optimalnih prinosa (Fereres i Soriano, 2007). Dosadašnja istraţivanja su kod velikog broja poljoprivrednih kultura pokazala da se primenom PRD i RDI metoda navodnjavanja moţe smanjiti koliĉina vode za navodnjavanje, povećati efikasnost korišćenja vode, a da se pri tome ne umanje ni prinos ni njihov kvalitet. To je od posebnog znaĉaja zbog efekata klimatskih promena i suše na poljoprivrednu proizvodnju u mnogim zemljama, ukljuĉujući i našu zemlju (Jovanović i Stikić, 2012). Kako se paradajz gaji na većoj površini od bilo koje druge povrtarske vrste na svetu (Ho, 1996), uspešna primena PRD i RDI tehnike bi mogla znaĉajno da doprinese uštedi vode u proizvodnji ove kulture. To potvrĊuje niz rezultata istraţivanja, ukljuĉujući i ona koja su obavljena na Katedri za agrohemiju i fiziologiju biljaka Poljoprivrednog fakulteta u Beogradu (Stikić i sar., 2010). Cilj rada 29 2 CILJ RADA Cilj ovog istraţivanja je bio karakterizacija fizioloških procesa koji su u osnovi regulacije rastenja i razvića biljaka pod dejstvom delimiĉnog isušivanja korenova (PRD) i regulisanog deficita navodnjavanja (RDI). Cilj je bio da se u ova istraţivanja ukljuĉe i molekularna istraţivanja, koja bi, uz analizu procesa rastenja i drugih fizioloških procesa (vodnog reţima, razmene gasova, akumulacije i distribucije stres hormona ABA, usvajanja i distribucije jona), znaĉajno doprinela razumevanju PRD i RDI efekata na paradajz. Zato je praćena ekspresija gena ukljuĉenih u biosintetski put ABA (TAO1 i NCED1) i transdukciju signala etilena (EIL1). Kako u ispitivanim reakcijama biljaka znaĉajnu ulogu, kao hemijski signal suše, ima hormon ABA, ispitivanja sa mutantom flacca, koji je deficitaran u sintezi ABA, mogla bi da doprinesu objašnjenju uloge ABA u ispitivanim fiziološkim procesima. Materijal i metode 30 3 MATERIJAL I METODE 3.1 Biljni materijal i postavka eksperimenta Istraţivanja su raĊena na paradajzu, Lycopersicon esculentum Mill., i to divljem tipu (wt) Ailsa Craig i mutantu flacca (Slika 3.1). Flacca je mutant sa recesivnim taĉkastim mutacijama koje su nastale primenom x-zraka. Ovaj mutant se odlikuje smanjenom sposobnošću sinteze hormona ABA tako da se kod njega u nadzemnom delu stabla sintetiše svega 20-26%, a u korenu do 67% ABA u odnosu na divlji tip (Sagi i sar., 1999). Slika 3.1 Izgled divljeg tipa i mutanta flacca paradajza Eksperiment je izveden u fitotronskoj komori na Katedri za agrohemiju i fiziologiju biljaka na Poljoprivrednom fakultetu u Beogradu. Uslovi gajenja biljaka su bili sledeći: temperatura dan/noć 26/17 oC, relativna vlaţnost vazduha 60%, osvetljenost (PAR) 250 µmolm -2 s -1 i duţina fotoperioda od 14 h. Semena paradajza su naklijavana u komercijalnom supstratu (Postground H, Klasmann-Deilmann, Germany) u kontejnerima od stiropora u komori za gajenje biljaka. U fazi drugog lista biljke su pikirane u male saksije preĉnika 10 cm gde su Materijal i metode 31 gajene do pojave petog lista. U fazi formiranog sedmog lista, presaĊene su u velike, posebno dizajnirane saksije (zapremine 10 dm 3 ) koje su podeljene na dve polovine plastiĉnom ploĉom.(Slika 3.2) Na vrhu saksije, u sredini ploĉe, odstranjen je deo plastike, ĉime je omogućeno razdvajanje korenovog sistema na dve polovine. Nakon odstranjivanja primarnog korena, polovina korena stavljana je u jednu polovinu, a druga polovina korena u drugu polovinu saksije. Na taj naĉin su dobijena dva hidrauliĉno izolovana kompartmenta koja su omogućila manipulaciju vodnim reţimom supstrata u kome se razvija koren. Narednih 5 dana, nastavljeno je zalivanje biljaka koliĉinom vode koja odgovora poljskom vodnom kapacitetu supstrata, da bi se izbegli efekti stresa koji je mogao da nastane kao posledica ovakvog naĉina presaĊivanja. Stoga su biljke izlagane ispitivanim tretmanima tek po isteku perioda koji je bio neophodan za njihov oporavak. Ogled je zapoĉeo u fazi formirane druge cvetne grane i trajao dva meseca. Slika 3.2 Izgled saksije dizajnirane za eksperiment U toku vegetativnog perioda kod biljaka su primenjivana tri razliĉita tretmana zalivanja: Optimalno navodnjavanje (Full irrigation - FI) - supstrat u celoj rizosferi je svaki dan zalivan do optimalnog vodnog kapaciteta, odnosno sadrţaj vode u korišćenom supstratu pri poljskom vodnom kapacitetu je bio 36%. Delimično isušivanje korenovog sistema (Partial root-zone drying - PRD) - supstrat u polovini korenovog sistema je zalivan do optimalnog vodnog kapaciteta, dok u drugoj polovini nije zalivan sve dok se sadrţaj vode u supstratu nije spustio na 18- Materijal i metode 32 20%. Tada je izvršena inverzija tako što se prekidalo sa zalivanjem polovine korenovog sistema koja je do tada zalivana, a poĉeto je sa zalivanjem polovine korenovog sistema koja do tada nije zalivana, i tako naizmeniĉno do kraja vegetativnog perioda Regulisani deficit navodnjavanja (Regulated deficit irrigation - RDI) - biljke su zalivane do vrednosti vode u supstratu od 18%. Zalivanje je bilo bazirano na rezultatima merenja koliĉine vode u supstratu. 3.2 Ispitivani parametri i metode U toku eksperimenta vršena su fiziološka i molekularno - biološka istraţivanja. Tokom fizioloških istraţivanja praćeni su sledeći parametri: Sadrţaj vode u supstratu za gajenje biljaka Parametri rastenja (visina biljaka, suva i sveţa masa listova, stabla i korena) Odnos suve mase korena i izdanka Vodni potencijal listova Provodljivost stoma Sadrţaj ABA u listovima Sadrţaj mineralnih elemenata u korenu i listovima Prilikom molekularnih istraţivanja praćena je ekspresija TAO1, NCED i EIL1 gena . 3.2.1 Fiziološka istraživanja Koliĉina vode u supstratu je merena pomoću TDR proba (Time domain reflectometer, TRASE, Soil Moisture Equipment Corp., USA). TDR probe duţine 20 cm, bile su instalirane u sredini svakog odeljka saksije i to je omogućilo merenje koliĉine vode u oba hidrauliĉna kompartmenta. Visina biljaka je merena lenjirom, a na kraju ekperimenta izmerena je masa korena, stabla i listova u sveţem stanju. Potom je, posle sušenja biljnog materijala na 80 ºC u sušnicama, obraĉunata suva masa korena, stabla, listova i odreĊen odnos suve mase nadzemnog dela (izdanka) i korena. Materijal i metode 33 Ukupni potencijal vode u listu (Ψl) meren je u komori pod pritiskom (Soil Moisture Equipment Corp., Santa Barbara, CA, USA) (Slika 3.3) Metod se zasniva na istiskivanju ksilemskog soka iz listova, pod pritiskom gasa azota. Za merenje ovog potencijala, odsecani su listovi 1-2 cm ispod lisne ploĉe, provlaĉeni kroz prorez gumenog zapušaĉa i postavljani u komoru. Na zaseĉenoj površini lista praćeno je formiranje inicijalnih kapi ksilemskog soka koji se istiskuje pod pritiskom gasa. Pritisak koji dovodi do pojave prvih kapi predstavlja vrednost ukupnog vodnog potencijala lista i izraţava se u MPa. Listovi za merenje vodnog potencijala su uzimani sat vremena pre zalivanja biljaka u danu kada je bio okret (promena strane zalivanja korena) kod PRD biljaka. Slika 3.3 Komora pod pritiskom za merenje vodnog potencijala (Ψl) Provodljivost stoma je merena na najmlaĊem, fiziološki razvijenom, listu, aparatom porometrom (AP4, Delta-T, Cambridge, U.K.) (Slika 3.4). Vrednosti na porometru su dobijane u mmolm -2 s -1 . Merenja su vršena u danu kada je bio okret kod PRD biljaka. Praćena je dnevna dinamika otvorenosti stoma merenjima na svakih sat vremena tokom celog dana. Materijal i metode 34 Slika 3.4 Izgled porometra 3.2.1.1 Određivanje sadržaja abscisinske kiseline List za odreĊivanje sadrţaja abscisinske kiseline je uziman na kraju ogleda i ĉuvan na -80°C do analize. Rezultati su predstavljeni u ng po g sveţe mase (ng g FW-1) Sadrţaj abscisinske kiseline u listovima je analiziran ELISA testom (Asch, 2000). Princip ELISA testa zasniva se na kompetitivnoj imunološkoj reakciji visoko specifiĉnog monoklonalnog antitela (MAC 252) sa ABA (Sl. 3.5). Pri tome ne dolazi do ukrštene reakcije izmeĊu antitela i drugih supstanci (Quarrie i sar., 1988). Posle imunološke reakcije, vrši se bojenje rastvora uz dodatak supstrata (p-nitrofenil fosfata), pri ĉemu se apsorpcija rastvora oĉitava na ELISA ĉitaĉu (Sunrise, Tecan) na 405 nm. Ova oĉitana vrednost obrnuto je proporcionalna koncentraciji ABA koja se izraĉunava preko kalibracione krive dobijene sa poznatim koncentracijama standardne (±) ABA. Materijal i metode 35 Slika 3.5 Shematski prikaz ELISA testa (Asch, 2000) Procedura ELISA testa sastojala se u sledećem: 200 μl ABA-konjugata (ABA- 4’-BSA) sa proteinskim nosaĉima, u mikro-titar ploĉi, inkubirano je tokom noći na 4 °C. Nakon tri ispiranja puferom 2 za ispiranje (TRIZMA, MgCl i NaCl i BSA – bovine serum albumine rastvoreni u H2O, pH 7.8) (poslednji put pufer je drţan 20 minuta na 37 °C kako bi se neobloţeni zidovi saturisali sa BSA), mikro-titar ploĉa je sušena upijajućim papirom. Posle sušenja, dodato je 100 μl uzorka i 100 μl primarnog antitela MAC 252. Mikro-titar ploĉa je mućkana konstantno 1 minut, a zatim je vršena inkubacija na 4 °C pri ĉemu je došlo do imunološke reakcije izmeĊu antigena i antitela. Mikro-titar ploĉa je, ponovo, ispirana tri puta i sušena upijajućim papirom, nakon ĉega je dodato 200 μl sekundarnog antitela, ant-rat IgG, rastvorenog u puferu 1 (TRIZMA, MgCl i NaCl rastvoreni u H2O, pH 7.8). Mikro-titar ploĉa je inkubirana 1 sat na 37 °C u vlaţnim plastiĉnim boksevima. U tom periodu došlo je do vezivanja sekundarnog antitela za primarno antitelo. Mikro-titar ploĉa je, ponovo, ispirana pet puta i sušena upijajućim papirom, a zatim je dodato 200 μl rastvora supstrata. Rastvor supstrata dobijen je rastvaranjem 20 mg p-nitrofenil fosfata u 20 ml natrijum-hidrogen-karbonata (NaHCO3). Supstrat je reagovao sa sekundarnim antitelom pri ĉemu je došlo do bojenja Materijal i metode 36 rastvora. Intenzitet obojenja je bio obrnuto proporcionalan koliĉini antigena (ABA). Apsorpcija je oĉitavana na ELISA ĉitaĉu (Sunrise, Tecan) na 405 nm. Za odreĊivanje koncentracije ABA bilo je neophodno napraviti (±) ABA standarde (4000, 2000, 1000, 500, 250 i 100 pg/100 μl) razblaţivanjem osnovnog (±) ABA standarda (80.000 pg/100 μl) na osnovu kojih je nacrtana kalibraciona kriva uz pomoć koje je oĉitan sadrţaj ABA. Detaljnija upustva mogu da se naĊu u protokolu Asch-a (2000). 3.2.1.2 Merenje sadržaja mineralnih elemenata u biljnom materijalu Sadrţaj K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn i Cu odreĊivan je iz zajedniĉkog rastvora atomsko-apsorpcionom spektrofotometrijom ili plamenofotometrijski, dok je sadrţaj azota odreĊivan metodom po Kjeldahl-u. Rezultati su predstavljeni u mg po kg suve mase (mg kg DW -1 ). Uzorci listova i korenova za analizu su uzeti na kraju ogleda. Zajedniĉki rastvor predstavlja rastvor mineralnog dela biljke (pepela) ĉija je poĉetna masa poznata i sluţi za odreĊivanje sadrţaja elemenata koji ĉine mineralni deo biljne supstance. Postupak pravljenja zajedniĉkog rastvora je tekao tako što je prvo izmeren 1g suvog biljnog materijala koji je stavljen u keramiĉki tigl i spaljen na rešou do potpunog ugljenisanja. Zatim je uzorak ţaren na 550 °C 6-8 sati. Nakon ţarenja, uzorak je ovlaţen vodom i dodato mu je 2 ml 5 M HNO3 da bi se otklonile neĉistoće. Uzorak je uparavan do suvog ostatka, a zatim ponovo ţaren na 550 °C, 1-2 sata. Posle ţarenja, uzorak je ohlaĊen i pepeo rastvoren u 10 ml HCl, a zatim je prenet u normalni sud od 100 ml. Rastvor je profiltriran u reagens boce u kojima je ĉuvan do upotrebe (Dţamić i sar., 1999). Ovaj rastvor korišćen je za odreĊivanje sadrţaja K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Cu. Sadrţaj Fe, Mn, Zn, Cu je direktno iz zajedniĉkog rastvora oĉitavan na atomsko- apsorpcionom spektrofotometru (Spectr AA, 220 FS, Swissland). Sadrţaj Mg i Ca je iz zajedniĉkog rastvora, uz dodatno razblaţenje i dodatak LaCl3 i 5 N HCl (Dţamić i sar., 1999), takoĊe, oĉitavan direktno na atomsko-apsorpcionom spektrofotometru. Atomsko- apsorpciona spektrofotometrija (AAS) se zasniva na apsorpciji svetlosti karakteristiĉne talasne duţine od strane slobodnih atoma elementa ĉiji se sadrţaj odreĊuje. Zasniva se na Lambert-Beer-vom zakonu: lcA   Materijal i metode 37 gde je: ε - apsorpciona konstanta i zavisi od supstance i talasne duţine c - koncentracija rastvora l - debljina rastvora Određivanje sadržaja kalijuma Sadrţaj kalijuma odreĊivan je plamenfotometrijski direktno iz rastvora razorenog uzorka. Plamena fotometrija se zasniva na ekscitaciji atoma ispitivanog elementa u plamenu i merenju intenziteta svetlosti koju emituju tako ekscitovani atomi. Intenzitet emitovanog zraĉenja direktno je proporcionalan koncentraciji prisutnog elementa u plamenu. Za plamenfotometrijsko odreĊivanje sadrţaja kalijuma neophodno je napraviti osnovni standardni rastvor i seriju standardnih rastvora. Serija standardnih rastvora koncentracija 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 μgK/ml pripremljena je razblaţivanjem osnovnog standardnog rastvora koncentracije 1 mgK/ml. Oĉitavanje koliĉine emitovanog zraĉenja za standarde i uzorak vršeno je na plamenfotometru (ESSEX- 866150, Evans Electroselenijum, Ltd, UK). Na onovu koncentracije i koliĉine emitovanog zraĉenja standarda konstruisana je kalibraciona kriva na osnovu koje je oĉitana koncentracija kalijuma u ispitivanom uzorku. Na osnovu koncentracije kalijuma u uzorku iz formule je izraĉunat njegov sadrţaj u uzorku (Dţamić i sar., 1999): 100 10 % 6     m RVc K gde je: c - koncentracija fosfora proĉitana sa kalibracione krive, V - poĉetna zapremina rastvora uzorka u HCl, R - razblaţenje rastvora uzorka, m - masa suvog uzorka (g), 10 6 - faktor za prevoĊenje μg u g, 100 - faktor za prevoĊenje u %. Materijal i metode 38 Određivanje sadržaja azota Sadrţaj azota odreĊivan je modifikovanom metodom po Kjeldahl-u (Allen i sar., 1974). Princip metode je da se pri zagrevanju biljnog materijala (0,2 g) sa koncentrovanom sumpornom kiselinom (5 ml H2SO4), u prisustvu katalizatora (korišćen je K2SO4:CuSO4:Se=1:1:0,2), izdvaja amonijak koji se vezuje sa viškom sumporne kiseline, pri ĉemu se obrazuje amonijum-sulfat (NH4)2SO4. U toku destilacije, kuvanjem sa jakom bazom (2 ml 3 % NaOH), oslobaĊa se amonijak iz amonijum-sulfata, koji se ponovo vezuje za sumpornu kiselinu poznatog normaliteta (0,02N H2SO4) obrazujući, ponovo, amonijum-sulfat. Na osnovu utrošene koliĉine kiseline za vezivanje amonijaka (višak kiseline odreĊivan je titracijom sa 0,02 N NaOH uz dodatak 2-3 kapi Taširo indikatora), izraĉunat je sadrţaj azota u biljnom materijalu preko formule (Dţamić i sar., 1999):   100 14 % 21    m NbNa N gde je: a - broj ml 0,02 N H2SO4 korišćene za vezivanje amonijaka N1 - normalitet kiseline B - broj ml 0,02N H2SO4 koji je utrošen za titraciju N2 - normalitet baze 14 - 1m.ekv. NaOH veţe 14mg N u obliku NH3 m - masa biljnog materijala (mg), 100 - faktor za prevoĊenje u %. 3.2.2 Molekularna istraživanja Pri ispitivanju efekata RDI i PRD tretmana, obavljena su uporedo i istraţivanja ekspresije gena, a sa ciljem da se utvrde moguće razlike u reakcijama divljeg tipa i mutanta flacca na ove tretmane. Za ispitivanje su odabrani NCED, TAO1 i EIL. TAO1 i NCED uĉestvuju u biosintezi ABA, dok jeEIL1 transkripcioni faktor u signalnom putu etilena. Materijal i metode 39 U skladu sa rezultatima Prokić (2009), ekspresija gena u tkivu ĉetvrtog potpuno razvijenog lista paradajza, praćena je u danu promene strane zalivanja PRD tretmana. Uzorci listova su uzimani 60 min. pre zalivanja biljaka. Iz ovog materijala prvo je izolovana RNK koja je reverznom transkripcijom prevedena u komplementarnu DNK (cDNK). Za analizu ekspresije kao šablon je korišćena cDNK. Prajmeri su dizajnirani na osnovu poznate primarne strukture ovih gena kod Lycopersicon esculentum. Ekspresija gena Ekspresija gena je praćena u tkivu listova paradajza koji su odmah po odstranjivanju sa biljaka ubaĉeni u teĉni azot. Nakon sitnjenja i homogenizacije u teĉnom azotu, 70 mg lisnog materijala je odmereno za izolaciju RNK primenom RNA- ase plant mini kit-a (Quiagen, Germany). OdreĊivanje koncentracije i kvaliteta izolovane RNK uraĊeno je spektrofotometrijski (merenjem absorbance na 260 nm) i elektroforetskim razdvajanjem na 1% agaroznom gelu bojenim etidijum-bromidom. Za sintezu cDNK je korišćen First strand cDNA synthesis kit (Fermentas, Lithuania). Za analiziranje sekvenci gena i dizajn prajmera korišćeni su programi Primer3 i blast u okviru National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Sekvence korišćenih prajmera su prikazane u Tabeli 1. Tabela 1 Sekvence korišćenih prajmera prajmer sekvenca LeTAO1 F CCATAAGAGCAGCACGTG LeTAO1 R CTTTGGAGAGTCCGAGCA NCED F CTGAAATGATCCGTGGAG NCED R CTGCTTCTTCCCAAGCAT LeEIL1 F CAGCACTGTGATCCTCCTCA LeEIL1R ATCACCGCTGTTAGGACACC Materijal i metode 40 Ekspresija gena je praćena primenom Real Time-PCR (SYBR-Green tehnika; RT-PCR 7500, Applied Biosystems, UK). Komplementarna DNK kao i umnoţeni produkti na RT-PCR-u su provereni elektroforezom na agaroznom gelu. 3.3 Statistička analiza podataka Statistiĉka obrada rezultata i njihovo grafiĉko prikazivanje su uraĊeni primenom programa Sigma Plot 2000 (Jandel Scientific, Erkhart, Germany). Rezultati 41 4 REZULTATI 4.1 Fiziološka istraživanja 4.1.1 Sadržaj vode u zemljištu Merenja koliĉine vode u zemljištu su obavljena sa ciljem kontrole reţima navodnjavanja u ispitivanim tretmanima. Kako ovi rezultati mogu indirektno da ukaţu i na kapacitet korena za usvajanje vode, oni su korišćeni i sa tog aspekta za analizu uticaja tretmana PRD i RDI kod divljeg tipa i flacca mutanta. Promene u sadrţaju vode u supstratu (θ) kod FI, PRD i RDI biljaka, divljeg tipa i flacca mutanta u toku eksperimenta prikazane su na Sl. 4.1. Vrednosti sadrţaja vode u supstratu su bile statistiĉki znaĉajno niţe kod RDI biljaka i u nezalivanoj strani kod PRD biljaka u poreĊenju sa kontrolnim biljkama. Dnevni sadrţaj vode u supstratu kod kontrolnih biljaka posle zalivanja odrţavao se blizu poljskog vodnog kapaciteta (36%), dok je sadrţaj vode kod RDI biljaka konstantno opadao, da bi se nakon 7 dana odrţavao na nivou izmeĊu 16 i 18%. Razlike u sadrţaju vode u supstratu izmeĊu zalivane i nezalivane strane kod PRD biljaka su bile statistiĉki znaĉajne tokom celog eksperimenta. Sadrţaj vode u zalivanoj strani odrţavao se izmeĊu 32 i 36%, dok je u nezalivanoj strani padao sve do vrednosti od oko 18%. Proseĉno vreme izmeĊu dve promene strana zalivanja kod PRD tretmana iznosilo je za divlji tip oko 8 dana, dok je kod flacca mutanta bilo potrebno nešto više vremena i iznosilo je oko 10 dana. Sporije sušenje nezalivane strane u PRD tretmanu, kod flacca mutanta, ukazuje na manji utrošak, a verovatno i usvajanje vode, u odnosu na divlji tip. Rezultati 42 s a d rž a j v o d e u s u p s tr a tu (% ) 10 15 20 25 30 35 40 PRD L PRD D RDI FI A vreme (dani) 0 10 20 30 40 50 60 s a d rž a j v o d e u s u p s tr a tu ( % ) 10 15 20 25 30 35 40 B Slika 4.1 Promene u sadrţaju vode u supstratu za FI, PRD i RDI tretmane navodnjavanja u toku eksperimenta kod biljaka paradajza divljeg tipa (A) i flacca mutanta (B) Rezultati 43 4.1.2 Rastenje biljaka U okviru eksperimentalnih sistema je praćen efekat tretmana na rastenje biljaka tako što je merena visina biljaka i obrazovanje sveţe i suve mase listova, stabla i korena. 4.1.2.1 Visina Uticaj razliĉitih tretmana (FI, PRD i RDI) na visinu biljaka divljeg tipa i mutanata flacca prikazan je na Sl. 4.2. PRD i RDI biljke bile su niţe u poreĊenju sa kontrolnim biljkama i kod divljeg tipa i kod flacca mutanta. Na kraju eksperimenta visina FI, PRD i RDI biljaka, kod divljeg tipa, bila je 160 cm, 155 cm i 140 cm (Sl. 4.2-A), tako da su PRD i RDI biljke bile niţe za 3.1% i 12.5% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u visini izmeĊu RDI i PRD biljaka (P<0.001), izmeĊu RDI i FI biljaka (P<0.001) , kao i izmeĊu PRD i FI biljaka (P<0.05). Kod flacca mutanta, na kraju eksperimenta visina FI, PRD i RDI biljaka je bila 100 cm, 96 cm i 80 cm (Sl. 4.2-B), tako da su PRD i RDI biljke bile niţe za 4% i 20% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u visini izmeĊu RDI i PRD biljaka (P<0.001), izmeĊu RDI i FI biljaka (P<0.001), kao i izmeĊu PRD i FI biljaka (P<0.05). Biljke flacca mutanta su bile niţe u odnosu na divlji tip 37%-43% zavisno od tretmana, tako da je znaĉajan uticaj na visinu biljaka imao genotip (P<0.001). Dobijeni rezultati su pokazali da su PRD i RDI tretmani doveli do redukcije visine kod oba testirana genotipa, pri ĉemu je RDI tretman u mnogo većoj meri redukovao visinu u odnosu na PRD tretman i to više kod flacca mutanta nego kod divljeg tipa. . Rezultati 44 0 10 20 30 40 50 60 v is in a ( c m ) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 FI PRD RDI vreme (dani) 0 10 20 30 40 50 60 v is in a ( c m ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 A B Slika 4.2 Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (RDI, PRD i FI) na visinu biljaka paradajza divljeg tipa (A) i flacca mutanta (B) Rezultati 45 4.1.2.2 Sveža masa stabla, listova i korena Ukupna sveţa masa biljaka divljeg tipa gajenih u PRD (755 g) i RDI tretmanima (625 g) je takoĊe bila manja od sveţe mase u optimalnim uslovima (860 g). Uticaj FI, PRD i RDI na distribuciju sveţe mase (u listove, stablo i koren) kod biljaka paradajza divljeg tipa i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.3 i 4.4. Sveţa masa listova kod PRD i RDI biljaka bila je manja u odnosu na kontrolne biljke kod divljeg tipa. Kod FI, PRD i RDI biljaka sveţa masa listova iznosila je 614 g, 523 g i 451 g na kraju eksperimenta (Sl.4.3-A), tako da je kod PRD i RDI biljaka sveţa masa listova bila manja za 14.8% i 26.5% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t- testom utvrĊena znaĉajna razlika u sveţoj masi listova izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05), odnosno FI i RDI biljaka (P<0.05). Sveţa masa stabla kod PRD i RDI biljaka bila je manja u odnosu na kontrolne biljke divljeg tipa. Na kraju eksperimenta ona je kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila 222 g, 209 g i 155 g (Sl.4.3-B), tako da je kod PRD i RDI biljaka sveţa masa stabla bila manja za 6% i 30% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sveţoj masi stabla izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.01), kao i izmeĊu RDI i PRD biljaka (P<0.05). Sveţa masa korena kod PRD i RDI biljaka bila je manja u odnosu na kontrolne biljke kod divljeg tipa. Na kraju eksperimenta ona je kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila 24 g, 23 g i 19 g (Sl. 4.3-C), tako da je kod PRD i RDI biljaka došlo do smanjenja sveţe mase korena za 4.2% i 20.5% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sveţoj masi korena samo izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05). Ukupna sveţa masa flacca mutanta je, takoĊe, u tretmanu RDI (199 g) bila manja od FI tretmana (238 g), ali je, za razliku od visine biljaka, došlo do povećanja sveţe mase PRD biljaka (267 g) u odnosu na FI. Distribucija sveţe mase u ispitivanim organima kod flacca mutanta je pokazala da je sveţa masa listova kod RDI biljaka bila manja u odnosu na kontrolne biljke, dok je kod PRD biljaka bila veća u odnosu na kontrolne biljke. Na kraju eksperimenta ona je za FI, PRD i RDI biljke iznosila 123 g, 143 g i 95 g (Sl. 4.4-A), tako da je kod PRD biljaka sveţa masa listova bila veća za 16.3%, dok je kod RDI biljaka bila manja za 22.% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sveţoj masi listova izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). Rezultati 46 Sveţa masa listova kod flacca mutanta bila je manja u odnosu na biljke divljeg tipa 3.7-5 puta, zavisno od tretmana, te je utvrĊen znaĉajan uticaj genotipa na sveţu masu stabla (P<0.001). Dobijeni rezultati su pokazali da su PRD i RDI tretman doveli do redukcije sveţe mase listova kod divljeg tipa, dok je kod flacca mutanta samo RDI tretman doveo do redukcije. Kod flacca mutanta, sveţa masa stabla kod PRD biljaka bila je veća u odnosu na kontrolne biljke, dok je kod RDI biljaka bila manja i na kraju eksperimenta kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila je 106 g, 114 g i 96 g (Sl. 4.4-B), tako da je kod PRD biljaka sveţa masa stabla bila veća za 7.5%, dok je kod RDI biljaka bila manja za 9.4% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sveţoj masi stabla samo izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). Sveţa masa stabla kod flacca mutanta je bila manja od sveţe mase stabla divljeg tipa 1.8-2.1 puta, zavisno od tretmana, te je utvrĊen znaĉajan uticaj genotipa (P<0.001) na sveţu masu stabla. Dobijeni rezultati su pokazali da je PRD imao razliĉit uticaj kod razliĉitih genotipova. Kod flacca mutanta, sveţa masa korena kod PRD biljaka bila je veća, dok je kod RDI biljaka bila manja u poreĊenju sa kontrolnim biljkama, tako da je na kraju eksperimenta sveţa masa korena kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila 9 g, 10 g i 8 g (Sl. 4.4-C). Kod PRD biljaka sveţa masa korena je bila veća za 11%, dok je kod RDI biljaka bila manja za 11% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sveţoj masi korena izmeĊu FI, PRD i RDI biljaka. Sveţa masa korena flacca mutanta biljaka bila je manja u odnosu na biljke divljeg tipa 2.3-2.7 puta, u zavisnosti od tretmana, te je utvrĊen znaĉajan uticaj genotipa (P<0.001) na sveţu masu korena. Rezultati 47 m a s a l is to v a ( g ) 0 200 400 600 800 m a s a s ta b la ( g ) 0 50 100 150 200 250 300 m a s a k o re n a ( g ) 0 5 10 15 20 25 30 FI PRD RDI A B C Slika 4.3 Uticaj RDI, PRD i FI tretmana navodnjavanja na sveţu masu listova (A), stabla (B) i korena (C) kod biljaka paradajza divljeg tipa Rezultati 48 m a s a l is to v a ( g ) 0 200 400 600 800 m a s a s ta b la ( g ) 0 50 100 150 200 250 300 m a s a k o re n a ( g ) 0 5 10 15 20 25 30 FI PRD RDI A B C Slika 4.4 Uticaj RDI, PRD i FI tretmana navodnjavanja na sveţu masu listova (A), stabla (B) i korena (C) kod biljaka paradajza flacca mutanta Rezultati 49 4.1.2.3 Suva masa stabla, listova i korena Promene u suvoj masi su, takoĊe, potvrdile rezultate sveţe mase jer je suva masa optimalno zalivanih biljaka divljeg tipa (103.6 g) bila veća od suve mase u uslovima PRD (79.8 g) i RDI (77.9 g). Distribucija suve mase izmeĊu listova, stabla i korena u toku eksperimentalnog perioda kod biljaka paradajza divljeg tipa i flacca mutanta prikazana je na Sl. 4.5 i 4.6. Suva masa listova kod PRD i RDI biljaka bila je manja u odnosu na kontrolne biljke kod divljeg tipa. Kod FI, PRD i RDI biljaka suva masa listova iznosila je 73 g, 55 g i 55 g na kraju eksperimenta (Sl.4.5-A), tako da je kod PRD i RDI biljaka suva masa listova bila manja za 24.7% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u suvoj masi listova izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05), odnosno FI i RDI biljaka (P<0.05). Suva masa stabla kod PRD i RDI biljaka divljeg tipa bila je manja u odnosu na kontrolne biljke. Na kraju eksperimenta ona je kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila 27.7 g, 22.4 g i 20.8 g (Sl. 4.5-B), tako da je kod PRD, odnosno RDI biljaka, suva masa stabla bila manja za 19%, odnosno 25% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t- testom utvrĊena znaĉajna razlika u suvoj masi stabla izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.01). Suva masa korena kod PRD i RDI biljaka bila je manja u odnosu na kontrolne biljke kod divljeg tipa. Na kraju eksperimenta ona je kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila 2.9 g, 2.4 g i 2.1 g (Sl. 4.5-C), tako da je kod PRD i RDI biljaka došlo do smanjenja suve mase korena za 17.2% i 24.1% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u suvoj masi korena izmeĊu FI, PRD i RDI biljaka. Ukupna suva masa po biljci je, kod flacca mutanta, u FI uslovima bila 33.5 g, u PRD tretmanu je obrazovana ukupna suva masa od 35.1 g, dok je u RDI tretmanu izmereno 31.6 g po biljci. Suva masa listova kod RDI biljaka bila je manja, dok je kod PRD biljaka bila veća u odnosu na kontrolne biljke. Na kraju eksperimenta ona je za FI, PRD i RDI biljke iznosila 20 g, 22 g i 18.8 g (Sl. 4.6-A), tako da je kod PRD biljaka suva masa listova bila veća za 1 %, dok je kod RDI biljaka bila manja za 1 % u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u suvoj masi listova izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). Suva masa listova kod flacca mutanta bila je manja u odnosu na biljke divljeg tipa 2.0-3.65 puta, zavisno od tretmana, te je utvrĊen znaĉajan uticaj genotipa na suvu Rezultati 50 masu listova (P<0.001). Dobijeni rezultati su pokazali da su PRD i RDI tretman doveli do redukcije suve mase listova kod divljeg tipa, dok je kod flacca mutanta samo RDI tretman doveo do redukcije. Kod flacca mutanta, suva masa stabla kod PRD i RDI biljaka bila je manja u odnosu na kontrolne biljke i na kraju eksperimenta kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila je 12.4 g, 11.9 g i 11.8 g (Sl. 4.6-B), tako da je kod PRD i RDI biljaka suva masa stabla bila manja za 4% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u suvoj masi stabla izmeĊu razliĉitih tretmana. Suva masa stabla kod flacca mutanta je bila manja od suve mase stabla biljaka divljeg tipa oko 2 puta, te je utvrĊen znaĉajan uticaj genotipa na suvu masu stabla (P<0.001). Dobijeni rezultati su pokazali da su PRD i RDI tretman kod oba genotipa doveli do redukcije suve mase stabla, ali kod flacca mutanta ona nije bila statistiĉki znaĉajna, dok je kod divljeg tipa bila statistiĉki znaĉajna samo za RDI. Kod flacca mutanta, suva masa korena kod PRD biljaka bila je veća, dok je kod RDI biljaka bila manja u poreĊenju sa kontrolnim biljkama, tako da je na kraju eksperimenta suva masa korena kod FI, PRD i RDI biljaka iznosila 1.1 g, 1.2 g i 1.0 g (Sl. 4.6-C). Kod PRD biljaka suva masa korena je bila veća za 9%, dok je kod RDI biljaka bila manja za 9% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika samo u suvoj masi korena izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05) . Suva masa korena flacca mutanta biljaka bila je manja u odnosu na biljke divljeg tipa 2 -2.7 puta, u zavisnosti od tretmana, te je utvrĊen znaĉajan uticaj genotipa (P<0.001) na suvu masu korena. Rezultati 51 m a s a l is to v a ( g ) 0 20 40 60 80 100 FI PRD RDI m a s a s ta b la ( g ) 0 5 10 15 20 25 30 35 m a s a k o re n a ( g ) 0 1 2 3 4 A B C Slika 4.5 Uticaj RDI, PRD i FI tretmana navodnjavanja na suvu masu listova (A), stabla (B) i korena (C) kod biljaka paradajza divljeg tipa Rezultati 52 m a s a l is to v a ( g ) 0 20 40 60 80 100 FI PRD RDI m a s a s ta b la ( g ) 0 5 10 15 20 25 30 35 m a s a k o re n a ( g ) 0 1 2 3 4 A B C Slika 4.6 Uticaj RDI, PRD i FI tretmana navodnjavanja na suvu masu listova (A), stabla (B) i korena (C) kod biljaka paradajza flacca mutanta Rezultati 53 4.1.3 Odnos suve mase korena i izdanka Odnos suve mase korena i izdanka je pokazatelj koji moţe da ukaţe na to da li je tretman uticao više na rast izdanka ili korena, kao i na pravac transporta asimilata. Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (FI, PRD i RDI) na odnos suve mase korena i izdanka kod biljaka paradajza divljeg tipa i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.7. Odnos suve mase korena i izdanka kod FI, PRD i RDI biljaka divljeg tipa na kraju eksperimenta bio je 0.0286, 0.0307 i 0.0270 (Sl. 4.7-A). Kod PRD biljaka došlo je do povećanja odnosa suve mase korena i izdanka za 7.3% u odnosu na kontrolne biljke, ali t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u odnosu suve mase korena i izdanka izmeĊu FI i PRD biljaka. Odnos suve mase korena i izdanka kod PRD biljaka bio je veći u odnosu na kontrolne biljke, kod flacca mutanta, tako da je na kraju eksperimenta kod FI, PRD i RDI biljaka iznosio 0.0348, 0.042 i 0.032 (Sl.4.7-B). Kod PRD biljaka došlo je do povećanja odnosa suve mase korena i izdanka za 20.7% u odnosu na kontrolne biljke, pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u odnosu suve mase korena i izdanka izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). Odnos suve mase korena i izdanka kod flacca mutanta bio je veći u odnosu na kontrolne biljke za 18%-37%, zavisno od tretmana, pri ĉemu nije utvrĊen uticaj genotipa na odnos suve mase korena i izdanka. Dobijeni rezultati su pokazali da je PRD tretman doveo do znaĉajnog povećanja odnosa suve mase korena i izdanka kod flacca. Rezultati 54 o d n o s m a s e k o re n a i i z d a n k a 0.00 0.02 0.04 0.06 FI PRD RDI o d n o s m a s e k o re n a i i z d a n k a 0.00 0.02 0.04 0.06 A B Slika 4.7 Uticaj RDI, PRD i FI tretmana navodnjavanja na odnos suve mase korena i izdanka kod biljaka paradajza divljeg tipa (A) i flacca mutanta (B) Rezultati 55 4.1.4 Vodni režim biljaka Ispitivanja su imala za cilj i da se utvrdi kako tretmani utiĉu na promene vodnog reţima biljaka. Kao pokazatelji vodnog reţima biljaka korišćeni su ukupni potencijal vode u listovima i provodljivost stoma. 4.1.4.1 Potencijal vode listova U Tab. 2 i 3 prikazane su promene u potencijalu vode listova (Ψl) biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i mutanta flacca u toku eksperimenta, nastale pod uticajem RDI, PRD i FI tretmana navodnjavanja. Kod biljaka divljeg tipa, vrednosti potencijala vode se nisu znaĉajno razlikovale izmeĊu FI i PRD tretmana i to, kako apsolutne vrednosti, tako i dinamika njihove promene u toku ispitivanog eksperimentalnog perioda. Ono što se ispoljilo kao razlika je da su RDI biljke imale znaĉajno niţi vodni potencijal listova od kontrolnih i PRD biljaka. Na kraju ispitivanog perioda kod FI biljaka su izmerene vrednosti od -0.44 MPa, kod PRD nešto niţe (-0.50 MPa), a kod RDI najniţe (-0.75 MPa). Kod flacca mutanta, u poslednjem merenju RDI tretmana su izmerene vrednosti od -0.75 MPa koje su bile znaĉajno (P<0.05) niţe od vrednosti izmerenih kod FI (-0.57 MPa) i PRD (-0.51 MPa) biljaka. Konaĉni stepen stresa u listovima RDI flacca biljaka se, meĊutim, nije znaĉajno razlikovao od stepena stresa suše kome su biljke divljeg tipa u RDI tretmanu bile izloţene. Ono što se ispoljilo kao razlika izmeĊu divljeg tipa i flacca mutanta su vrednosti potencijala vode u FI tretmanu, koje u toku celog eksperimentalnog perioda ukazuju na veći stepen stresa kod flacca mutanta (proseĉno - 0.65 MPa) u odnosu na divlji tip (proseĉno -0.50 MPa). Sliĉne razlike su se ispoljile i u PRD tretmanu gde su u toku ogleda izmerene niţe proseĉne vrednosti kod flacca mutanta (-0.63 MPa) u odnosu na divlji tip (-0.52 MPa). Rezultati 56 Tab.2 Uticaj ispitivanih tretmana (FI,PRD i RDI) na vrednosti potencijala vode u listovima biljaka divljeg tipa Dani tretmana FI (-MPa) PRD (-MPa) RDI (-MPa) 1 0.49 ± 0.025 0.55 ± 0.058 0.69 ± 0.10 9 0.58 ± 0.011 0.54 ± 0.022 0.58 ± 0.024 17 0.49 ± 0.048 0.50 ± 0.053 0.72 ± 0.060 23 0.44 ± 0.018 0.50 ± 0.063 0.75 ± 0.060 Tab.3 Uticaj ispitivanih tretmana (FI,PRD i RDI) na vrednosti potencijala vode u listovima biljaka flacca mutanta Dani tretmana FI (-MPa) PRD (-MPa) RDI (-MPa) 1 0.75 ± 0.061 0.72 ± 0.053 0.66 ± 0.031 9 0.56 ± 0.050 0.61 ± 0.030 0.65 ± 0.010 17 0.70 ± 0.083 0.70 ± 0.064 0.67 ± 0.067 23 0.57 ± 0.030 0.49 ± 0.034 0.75 ± 0.010 Dinamika promene potencijala vode u toku ispitivanog perioda pokazuje da se vrednosti potencijala vode u listovima biljaka divljeg tipa izloţenih PRD tretmanu povećavaju sa -0,55 do -0.50 MPa, dok je ta promena više izraţena kod flacca mutanta (od -0.72 do -0.49 MPa). To ukazuje da se u toku trajanja ogleda i ponavljanja PRD ciklusa smanjuje stepen stresa kod ovih biljaka. Rezultati 57 4.1.4.2 Provodljivost stoma Na Sl. 4.8 i 4.9 prikazane su promene u provodljivosti stoma (gs) u toku eksperimenta kod biljaka paradajza divljeg tipa i flacca mutanta, koje su nastale pod uticajem FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja. Da bi se efekti mogli pravilno tumaĉiti, bilo je potrebno da se prati dnevna dinamika promene provodljivosti stoma i to na poĉetku eksperimenta, kao i posle prvog, drugog i trećeg okreta strane PRD koja se zaliva/suši. To odgovara 1., 9., 17. i 23. danu tretmana. Kod biljaka divljeg tipa, PRD i RDI biljke su imale niţe vrednosti provodljivosti stoma u odnosu na kontrolne biljke u većini merenja, a naroĉito prilikom trećeg okreta kod PRD (23. dan) kada su PRD, odnosno RDI biljke imale niţe vrednosti od FI u 8, odnosno 10 od 10 merenja (Sl. 4.8). Ono što je, takoĊe, karakteristiĉno za ogled, a nije neuobiĉajeno za merenje reakcija stoma, je da je utvrĊeno znatno variranje u vrednostima provodljivosti stoma. Tako su se vrednosti provodljivosti stoma kod FI, PRD i RDI biljaka, u danu prve promene strane zalivanja (9. dan) kod PRD, kretale izmeĊu 455-885 mmolm-2s-1, 281-793 mmolm-2s-1, odnosno 315-775 mmolm-2s-1. Vrednosti provodljivosti stoma kod PRD, odnosno RDI biljka su bile niţe od vrednosti kontrolnih biljaka u 8 od 10 merenja. Prilikom merenja 17-tog dana (drugog okreta PRD) vrednosti provodljivosti stoma su kod FI, PRD i RDI biljaka iznosile 412- 695 mmolm -2 s -1 , 339-716 mmolm -2 s -1 i 322-548 mmolm -2 s -1 . Vrednosti provodljivosti stoma kod PRD, odnosno RDI biljka su bile niţe od vrednosti kontrolnih biljaka u 6, odnosno, 9 od 10 merenja. Prilikom trećeg okreta kod PRD (23. dan) vrednosti provodljivosti stoma kod FI,PRD i RDI biljaka su iznosile 275-1000 mmolm -2 s -1 , 202-940 mmolm -2 s -1 i 195-761 mmolm -2 s -1 . PoreĊenja dnevne dinamike ispitivanih promena provodljivosti stoma pokazuju razlike i to, kako u toku ispitivanog perioda (okreta), tako i izmeĊu tretmana. Dinamika u FI tretmanima u toku celog perioda ispitivanja pokazuje da je, generalno, veća provodljivost stoma izmerena 23. dana (u danu trećeg okreta PRD) nego na poĉetku ogleda. Ono što je, takoĊe, karakteristiĉno je da su se vrednosti dinamike dnevne maksimalne otvorenosti stoma razlikovale. Na poĉetku i na kraju ogleda je izmeren maksimum otvorenosti u 8 h (1. i 23. dan), dok se prilikom prvog okreta kod PRD (9. dan) maksimum javlja u 12 h i kasnije, u 12 h i u 14 h (17. dan-drugi okret PRD). Rezultati 58 U tretmanu PRD, dinamika promene otvorenosti stoma pokazuje i sliĉnosti i razlike u toku trajanja ogleda. Sliĉnosti se ogledaju u tome što na poĉetku ogleda, kao i prilikom napredovanja ogleda (svaki dalji okret PRD), dolazi do brzog delimiĉnog zatvaranja stoma u 8 h da bi se one potom otvorile u 10 h, a nakon ĉega sledi sporije zatvaranje stoma. Ono što je, takoĊe, karakteristiĉno je da je u toj sporijoj fazi najviše izraţen efekat zatvaranja na kraju ogleda (treći okret-23. dan). Dinamika promene u tretmanu RDI, takoĊe, pokazuje da dolazi do inicijalnog zatvaranja stoma, ali da su razlike u vrednostima provodljivosti stoma u toku trajanja ogleda manje izraţene u ranim jutarnjim satima. One su zato bile izraţene u 13 h kada su prvi i drugi okret PRD (9. i 17. dan) doveli do povećanja otvorenosti stoma, za razliku od poslednjeg uzorkovanja (23. dan) kod koga od 11 h sledi proces zatvaranja stoma. Takva dinamika zatvaranja stoma sledi sliĉan trend kao i u PRD tretmanu ali se proces zatvaranja sporije obavlja da bi konaĉne vrednosti provodljivosti stoma u 17 h bile znaĉajno niţe (195 mmolm-2s-1) od PRD (202 mmolm-2s-1). Rezultati 59 vreme (sati) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 aktinost stoma 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 start 1. okret 2. okret 3. okret A 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 g s ( m m o lm -2 s -1 ) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 start 9. dan 17. dan 23. dan B C g s ( m m o lm -2 s -1 ) g s ( m m o lm -2 s -1 ) Slika 4.8 Promene u provodljivosti stoma (gs) u toku eksperimenta kod biljaka divljeg tipa nastale pod uticajem FI (A), PRD (B) i RDI (C) tretmana navodnjavanja Rezultati 60 Kod flacca mutanta, PRD i RDI biljke su imale niţe vrednosti provodljivosti stoma u odnosu na kontrolne biljke u većini merenja (Sl. 4.9). Vrednosti provodljivosti stoma kod FI, PRD i RDI biljaka u toku dana su devetog dana eksperimenta (prilikom prvog okreta kod PRD) iznosile 593-1320 mmolm -2 s -1 , 501-1197 mmolm -2 s -1 , odnosno 412-1080 mmolm -2 s -1 . Vrednosti provodljivosti stoma kod PRD, odnosno RDI biljka su bile niţe od vrednosti kontrolnih biljaka u 8, odnosno 10 od 10 merenja. Prilikom drugog okreta (17. dan) vrednosti provodljivosti stoma su kod FI, PRD i RDI biljaka iznosile 571-995 mmolm -2 s -1 , 521-995 mmolm -2 s -1 i 535-993 mmolm -2 s -1 . Vrednosti provodljivosti stoma kod PRD i RDI biljka su bile niţe od vrednosti kontrolnih biljaka u 8 od 10 merenja. Prilikom trećeg okreta PRD (23. dan), vrednosti provodljivosti stoma kod FI,PRD i RDI biljaka su iznosile 717-1300 mmolm -2 s -1 , 606-1056 mmolm -2 s -1 i 602 -1162 mmolm -2 s -1 . Vrednosti provodljivosti stoma kod PRD, odnosno RDI biljka su bile niţe od vrednosti kontrolnih biljaka u 6, odnosno 8 od 10 merenja. Generalno, dnevna dinamika promena provodljivosti stoma u listovima flacca mutanta se razlikovala u zavisnosti od svih ispitivanih faktora: vremena merenja, broja okreta kod PRD i tretmana. U FI uslovima, rezultati pokazuju da su prvog dana poĉetne vrednosti izmerene u 7 h rasle do 8 h, a potom, nakon još jednog opadanja u 10 h i porasta u 12 h, sledio je trend zatvaranja stoma. U isto vreme merenja za sve druge datume pokazuju suprotan trend. Poĉetne vrednosti izmerene u 7 h su opadale do 8 h, da bi nakon toga vrednosti porasle u 10 h, nakon ĉega je sledilo konstantno opadanje. Kada se ove reakcije provodljivosti stoma uporede sa reakcijama biljaka divljeg tipa, uoĉavaju se razlike u vremenskom intervalu do 10 h kada promene kod flacca mutanta slede razliĉit trend od divljeg tipa, ali i sa većim vrednostima provodljivosti stoma. Razlike u dnevnoj dinamici su, meĊutim, bile mnogo manje izraţene u poslepodnevnim satima, da bi konaĉne vrednosti provodljivosti stoma u 17 h bile veće kod flacca biljaka (596 mmolm -2 s -1 ) od vrednosti za biljke divljeg tipa (340 mmolm -2 s -1 ). Rezultati 61 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 g s ( m m o lm -2 s -1 ) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 start 9. dan 17. dan 23. dan 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 vreme (sati) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 B A C g s ( m m o lm -2 s -1 ) g s ( m m o lm -2 s -1 ) Slika 4.9 Promene u provodljivosti stoma (gs) u toku eksperimenta kod flacca mutanta nastale pod uticajem FI (A), PRD (B) i RDI (C) tretmana navodnjavanja. Rezultati 62 Dnevna dinamika promene provodljivosti stoma u listovima flacca mutanta se, takoĊe, razlikovala u PRD sistemu tokom ogleda i to u prepodnevnim merenjima. Inicijalnu otvorenost u 7 h je sledila ili zatvorenost ili otvorenost u zavisnosti od dana merenja, da bi na kraju, prilikom trećeg okreta kod PRD (23. dan), u 8 h zapoĉeo postepen i kontinuiran proces zatvaranja stoma. To se razlikuje od dinamike provodljivosti stoma u startnom periodu ogleda (1. dan), jer je tamo opadanje zapoĉelo tek u 10 h, a devetog i sedamnaestog dana (dan prvog i drugog okreta kod PRD) brzu, inicijalnu, reakciju opadanja provodljivosti stoma (u 8 h) prati porast do 10 h, odnosno 12 h. Posle tog vremena reakcije opadanja provodljivosti stoma se ne razlikuju u ispitivanim vremenskim intervalima. Takav trend u promeni provodljivosti stoma na kraju ogleda se razlikuje od trenda provodljivosti stoma kod biljaka divljeg tipa, kod kojih u prepodnevnim satima preovlaĊuje sledeći sled reakcija: inicijalno brzo opadanje provodljivosti stoma-porast provodljivosti stoma-sporije ponovno opadanje. U RDI tretmanu, promene dnevne dinamike u toku ispitivanih vremenskih intervala se ne razlikuju meĊu sobom znaĉajno. Jedina znaĉajna razlika se ispoljava u 10 h kada su vrednosti provodljivosti stoma mnogo veće posle prvog i trećeg okreta kod PRD (9. i 23. dan) nego posle drugog (17. dan). Posle tog perioda generalni trend je opadanje provodljivosti stoma koji se u ovom periodu ne razlikuje mnogo od odgovarajućeg trenda za PRD. Vrednosti u 17 h su na kraju ogleda nešto više kod PRD (523 mmolm -2 s -1 ) nego kod RDI (510 mmolm -2 s -1 ) flacca biljaka, ili vrednosti provodljivosti stoma za RDI kod biljaka divljeg tipa (263 mmolm -2 s -1 ). Rezultati 63 4.1.5 Sadržaj abscisinske kiseline u listovima U reakcijama biljaka na sušu i PRD, znaĉajnu ulogu igra stres hormon ABA ĉija je koliĉina merena u listovima. Merenja koliĉine ABA u ksilemu nisu obavljena zbog nemogućnosti dobijanja dovoljne koliĉine ksilemskog soka kod flacca mutanta. Na Sl. 4.10 prikazan je uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj ABA u listovima biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i mutanta flacca. WT 0 2 4 6 8 10 k o n c e n tr a c ija A B A ( n g /g ) 0 100 200 300 400 500 600 FI PRD RDI flacca Slika 4.10 Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (Fi, PRD i RDI) na sadrţaj abscisinske kiseline (ABA) u listovima kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Vrednosti sadrţaja ABA u listu kod FI, PRD i RDI biljaka divljeg tipa bile su 338.9 ng g FW -1 , 435.18 ng g FW -1 i 376.25 ng g FW -1, pri ĉemu su t-testom utvrĊene statistiĉki znaĉajne razlike u sadrţaju ABA u listu izmeĊu PRD i FI biljaka (P<0.05) i RDI i FI biljaka (P<0.05), dok izmeĊu PRD i RDI biljaka nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika. Vrednosti sadrţaja ABA u listu kod FI, PRD i RDI biljaka flacca mutanta iznosile su 70.76 ng g FW -1 , 91.98 ng g FW -1 i 161.04 ng g FW -1, pri ĉemu su t-testom utvrĊene statistiĉki znaĉajne razlike u sadrţaju ABA u listu izmeĊu PRD i FI biljaka (P<0.05), RDI i FI biljaka (P<0.01) i PRD i RDI (P<0.01). UtvrĊeno je da su znaĉajan uticaj na sadrţaj ABA u listu imali tretman (P<0.01) i genotip (P<0.001). Rezultati 64 4.1.6 Sadržaj biogenih elemenata u različitim organima biljaka paradajza Istraţivanja su obuhvatila i merenja koliĉine biogenih makroelemenata (N, ,K, Ca, Mg), kao i mikroelemenata (Fe, Mn, Cu i Zn) u listovima i korenu. Ova merenja su imala za cilj da indirektno objasne kako ispitivani tretmani utiĉu na usvajanje i distribuciju ovih elemenata od kojih zavise mnogi fiziološki procesi. Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (FI, PRD i RDI) na sadrţaj N u listovima i korenu kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT)i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.11. Kod divljeg tipa, sadrţaj azota (N) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 3.38%, 3.56% i 3.57% (Sl. 4.11A), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju N u listovima izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05). Sadrţaj N u korenu, kod FI, PRD i RDI biljaka, bio je 3.12%, 2.70% i 2.60% (Sl. 4.11B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju N u korenu izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu F i RDI biljaka (P<0.01). Kod flacca mutanta, sadrţaj N u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 3.96%, 4.18% i 3.99% (Sl. 4.11A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju N u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj N u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 2.49%, 2.75% i 2.51% (Sl. 4.11B), pri ĉemu t- testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju N u korenu izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Rezultati pokazuju veću koncentraciju N u listovima flacca mutanta u odnosu na divlji tip u svim tretmanima. Rezultati 65 0 2 4 6 8 10 0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 10 s a d rž a j N ( % ) 0 1 2 3 4 5 FI PRD RDI A B WT flacca s a d rž a j N ( % ) Slika 4.11 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj N u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 66 Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (FI, PRD i RDI) na sadrţaj K u listovima i korenu kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT)i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.12. Kod divljeg tipa, sadrţaj kalijuma (K) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 3.57%, 3.80% i 4.53% (Sl. 4.12A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju K u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj K u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 1.02%, 1.23% i 0.54% (Sl .4.12B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju K u korenu izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.01). Kod flacca mutanta, sadrţaj K u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka iznosio je 6.67%, 7.27% i 7.10% (Sl. 4.12A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju K u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj K u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 0.78%, 1.84% i 2.97% (Sl. 4.12B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju K u korenu izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.01), izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). Rezultati su pokazali da je sadrţaj K u listovima bio veći kod biljaka flacca mutanta u odnosu na biljke divljeg tipa. Rezultati 67 0 2 4 6 8 10 s a d rž a j K ( % ) 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 s a d rž a j K ( % ) 0 2 4 6 8 10 FI PRD RDI B A WT flacca Slika 4.12 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj K u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 68 Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (FI, PRD i RDI) na sadrţaj Ca i Mg u listovima i korenu kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.13 i 4.14. Kod divljeg tipa, sadrţaj kalcijuma (Ca) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 4.15%, 3.89% i 3.52% (Sl. 4.13A), tako da je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Ca u listovima izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05). Sadrţaj Ca u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 0.61%, 0.62% i 0.85% (Sl. 4.13B), tako da je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Ca u korenu izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.001), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.001). Kod flacca mutanta, sadrţaj Ca u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 3.31%, 2.80% i 3.05% (Sl. 4.13A), tako da nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u sadrţaju Ca u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj Ca u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 0.81%, 0.47% i 0.80% (Sl. 4.13B), tako da je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Ca u korenu izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). Kod divljeg tipa, sadrţaj magnezijuma (Mg) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 0.75%, 0.66% i 0.65% (Sl. 4.14A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Mg u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj Mg u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 0.20%, 0.19% i 0.20% (Sl. 4.14B), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Mg u korenu izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Kod flacca mutanta, sadrţaj Mg u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 0.70%, 0.69% i 0.69% (Sl. 4.14A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Mg u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj Mg u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 0.20%, 0.25% i 0.19% (Sl .4.14B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Mg u korenu izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). Rezultati 69 0 2 4 6 8 10 0 1 2 3 4 5 0 2 4 6 8 10 s a d rž a j C a ( % ) 0 1 2 3 4 5 FI PRD RDI s a d rž a j C a ( % ) WT B flacca A Slika 4.13 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj Ca u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 70 0 2 4 6 8 10 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 2 4 6 8 10 s a d rž a j M g ( % ) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 FI PRD RDI A B WT flacca s a d rž a j M g ( % ) Slika 4.14 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj Mg u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 71 Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (FI, PRD i RDI) na sadrţaj Fe u listovima i korenu kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT)i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.15. Kod divljeg tipa, sadrţaj gvoţĊa (Fe) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 92.1 mg/kg, 89.2 mg/kg i 96.3 mg/kg (Sl. 4.56A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u sadrţaju Fe u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj gvoţĊa (Fe) u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 132.4 mg/kg, 145.2 mg/kg i 178.3 mg/kg (Sl. 4.15B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Fe u korenu izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.01). Kod flacca mutanta, sadrţaj gvoţĊa (Fe) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 91.2 mg/kg, 87.2 mg/kg i 77.8 mg/kg (Sl. 4.15A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u sadrţaju Fe u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj gvoţĊa (Fe) u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 136.7 mg/kg, 113.7 mg/kg i 107.4 mg/kg (Sl. 4.15B), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena statistiĉki znaĉajna razlika u sadrţaju Fe u korenu izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Rezultati 72 0 2 4 6 8 10 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 FI PRD RDI WT 0 2 4 6 8 10 k o n c e n tr a c ija F e ( m g /k g ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 flacca k o n c e n tr a c ija F e ( m g /k g ) A B Slika 4.15 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj Fe u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 73 Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (FI, PRD i RDI) na sadrţaj Mn u listovima i korenu kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT)i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.16. Kod divljeg tipa, sadrţaj mangana (Mn) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 527.2 mg/kg, 625.8 mg/kg i 606.7 mg/kg (Sl. 4.16A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju mangana u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj mangana (Mn) u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 74.4 mg/kg, 80 mg/kg i 108.3 mg/kg (Sl. 4.16B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju mangana u korenu izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.05). TakoĊe je u PRD tretmanu utvrĊen i brţi transport ovog elementa iz korena u listove. Kod flacca mutanta, sadrţaj mangana (Mn) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 333.4 mg/kg, 313.5 mg/kg i 397 mg/kg (Sl. 4.16A), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju mangana u listovima izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.01). Sadrţaj mangana (Mn) u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 216.8 mg/kg, 138.4 mg/kg i 288.5 mg/kg (Sl.4.16B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju mangana u korenu izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.05), izmeĊu FI i PRD (P<0.05), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.01). Rezultati su pokazali da je kod flacca mutanta, sadrţaj Mn u korenu bio veći, a u listovima manji u odnosu na divlji tip, odnosno da je kod flacca mutanta došlo do znatno manje translokacije Mn iz korena u listove. Rezultati 74 0 2 4 6 8 10 0 200 400 600 800 0 2 4 6 8 10 0 200 400 600 800 FI PRD RDI WT flacca k o n c e n tr a c ija M n ( m g /k g ) k o n c e n tr a c ija M n ( m g /k g ) B A Slika 4.16 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj Mn u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 75 Uticaj razliĉitih tretmana navodnjavanja (FI, PRD i RDI) na sadrţaj Cu i Zn u listovima i korenu kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta prikazan je na Sl. 4.17 i 4.18. Kod divljeg tipa, sadrţaj bakra (Cu) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 1.97 mg/kg, 2.70 mg/kg i 2.71 mg/kg (Sl. 4.17A), tako da nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u sadrţaju Cu u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj Cu u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 49.5 mg/kg, 29.5 mg/kg i 52.5 mg/kg (Sl. 4.17B), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Cu u korenu izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.01). Kod flacca mutanta, sadrţaj Cu u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 3.28 mg/kg, 1.97 mg/kg i 2.53 mg/kg (Sl. 4.17A), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Cu u listovima izmeĊu FI i PRD biljaka (P<0.05). Sadrţaj Cu u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 11.87 mg/kg, 15.79 mg/kg i 11.17 mg/kg (Sl. 4.17B), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju Cu u korenu izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Rezultati su pokazali da je sadrţaj Cu u korenu bio veći kod biljaka divljeg tipa u odnosu na biljke flacca mutanta. Kod divljeg tipa, sadrţaj cinka (Zn) u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 29.3 mg/kg, 32.7 mg/kg i 60.6 mg/kg (Sl. 4.18A), pri ĉemu je t-testom utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju cinka u listovima izmeĊu FI i RDI biljaka (P<0.01), kao i izmeĊu PRD i RDI biljaka (P<0.01). Sadrţaj Zn u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 167.8 mg/kg, 142.1 mg/kg i 155.1 mg/kg (Sl. 4.18B), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju cinka u korenu izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Kod flacca mutanta, sadrţaj Zn u listovima kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 23.22 mg/kg, 23.85 mg/kg i 26.52 mg/kg (Sl. 4.18A), pri ĉemu t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju cinka u listovima izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Sadrţaj Zn u korenu kod FI, PRD i RDI biljaka bio je 157.7 mg/kg, 150.1 mg/kg i 150.7 mg/kg (Sl .4.18B), tako da t-testom nije utvrĊena znaĉajna razlika u sadrţaju cinka u korenu izmeĊu biljaka razliĉitih tretmana navodnjavanja. Rezultati 76 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40 50 60 70 full prd di 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40 50 60 70 FI PRD RDI WT flacca k o n c e n tr a c ija C u ( m g /k g ) k o n c e n tr a c ija C u ( m g /k g ) A B Slika 4.17 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj Cu u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 77 0 2 4 6 8 10 0 50 100 150 200 0 2 4 6 8 10 0 50 100 150 200 FI PRD RDI WT flacca k o n c e n tr a c ija Z n ( m g /k g ) k o n c e n tr a c ija Z n ( m g /k g ) A B Slika 4.18 Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na sadrţaj Zn u listovima (A) i korenu (B) kod biljaka paradajza divljeg tipa (WT) i flacca mutanta Rezultati 78 4.2 Molekularna istraživanja U okviru molekularanih istraţivanja praćena je ekspresija 3 gena i to: NCED, TAO1 i EIL1. Ekspresija gena je praćena tokom perioda koji odgovara vremenskim intervalima od 5 okreta strane navodnjavanja u PRD tretmanu, odnosno 41 dan za divlji tip i 52 dana kod flacca mutanta. Ekspresija NCED gena Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na ekspresiju NCED gena kod biljaka paradajza divljeg tipa i flacca mutanta u toku eksperimenta prikazan je na Sl. 4.19. Ekspresija NCED gena je, generalno, u svim tretmanima bila izraţenija kod biljaka divljeg tipa u odnosu na flacca mutanta. Kod divljeg tipa, ekspresija je bila najizraţenija kod PRD tretmana, dok je kod RDI bila slabije izraţena. Kod PRD i RDI, ekspresija je bila najizraţenija prilkom drugog okreta (17. dan), ali je kod RDI nakon toga došlo do smanjene ekspresije NCED, naroĉito u poslednjem uzorkovanju (41. dan). Slika 4.19 Uticaj FI, PRD I RDI tretmana navodnjavanja na ekspresiju NCED gena kod biljaka paradajza divljeg tipa (A) flacca mutanta (B). I, II, III, IV i V oznaĉavaju okrete strane zalivanja kod PRD Kod flacca mutanta, ekspresija je bila izraţenija kod FI i RDI tretmana (sa maksimalnom ekspresijom prilikom drugog okreta - 17. dan) u odnosu na PRD tretman gde je nakon prvog okreta (9. dan) došlo do znatne redukcije. Rezultati 79 Ekspresija TAO1 gena Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na ekspresiju TAO1 gena kod biljaka paradajza divljeg tipa i flacca mutanta u toku eksperimenta prikazan je na Sl. 4.20. Rezultati pokazuju da je, kod biljaka divljeg tipa, vremenski obrazac ekspresije bio sliĉan za PRD i FI tretman sa maksimalnom ekspresijom prilikom drugog (17. dan), odnosno trećeg PRD okreta (23. dan), dok je kod RDI tretmana ekspresija bila slabija, naroĉito u poslednjem uzorkovanju (41. dan). Slika 4.20 Uticaj FI, PRD I RDI tretmana navodnjavanja na ekspresiju TAO1 gena kod biljaka paradajza divljeg tipa (A) flacca mutanta (B). I, II, III, IV i V oznaĉavaju okrete strane zalivanja kod PRD Ekspresija TAO1 u listovima flacca mutanta je bila slabija nego kod biljaka divljeg tipa. UporeĊivanje tretmana je pokazalo da je ekspresija kod RDI bila slabija nego kod FI i PRD tretmana. Maksimalna ekspresija kod FI tretmana je bila prilikom poslednja dva okreta (32.i 41. dan), dok je kod PRD i RDI bila ranije - 17. dana (prilikom drugog okreta). Rezultati 80 Ekspresija EIL1 gena Uticaj FI, PRD i RDI tretmana navodnjavanja na ekspresiju EIL1 gena kod biljaka paradajza divljeg tipa i flacca mutanta u toku eksperimenta prikazan je na Sl. 4.21. Rezultati pokazuju da je ekspresija kod oba genotipa bila sliĉna za FI i PRD tretman, dok je kod RDI došlo do smanjene ekspresije u poslednjem uzorkovanju. Slika 4.21 Uticaj FI, PRD I RDI tretmana navodnjavanja na ekspresiju EIL1 gena kod biljaka paradajza divljeg tipa (A) flacca mutanta (B). I, II, III, IV i V oznaĉavaju okrete strane zalivanja kod PRD Kod biljaka divljeg tipa, maksimalna ekspresija je bila prilikom drugog okreta (17. dan) za PRD i RDI tretman, odnosno trećeg (23. dan) kod FI tretmana. Kod flacca mutanta, maksimalna ekspresija je bila prilikom drugog okreta - 17. dan (FI i RDI), odnosno prvog okreta - 9. dan (PRD). Diskusija 81 5 DISKUSIJA Ispitivanja sadrţaja vode u supstratu su, oĉekivano, pokazala da su vrednosti sadrţaja vode u supstratu bile znaĉajno niţe kod RDI biljaka i u nezalivanoj strani PRD biljaka u poreĊenju sa kontrolnim biljkama (Sl. 4.1). Dnevni sadrţaj vode kod kontrolnih biljaka posle navodnjavanja odrţavao se blizu poljskog vodnog kapaciteta (36%), dok je kod RDI biljaka u poĉetnoj fazi eksperimenta sadrţaj vode u supstratu opadao, da bi se nakon toga do kraja eksperimenta odrţavao na nivou od oko 18%. Razlike u sadrţaju vode u supstratu izmeĊu navodnjavane i nenavodnjavane strane kod PRD biljaka znaĉajno su se razlikovale tokom celog eksperimenta. TakoĊe, iz rezultata moţe da se vidi da je sadrţaj vode u supstratu nenavodnjavane strane kod PRD biljaka bio sliĉan sadrţaju vode u supstratu RDI biljaka. Sadrţaj vode u supstratu navodnjavane strane kod PRD biljaka flacca mutanta bio je sliĉan sadrţaju vode u supstratu kod kontrolnih biljaka, pogotovo u kasnijim fazama eksperimenta, dok je kod biljaka divljeg tipa bio nešto niţi (oko 33%) u odnosu na kontrolne biljke. Hu i sar. (2011) su pokazali da PRD biljke mogu da kompenzuju vodni stres u zasušivanoj strani uzimanjem vode iz zalivanog dela korena, gde je voda dostupna. Iako su zalivana i nezalivana strana korenovog sistema hidrauliĉno izolovane, moguće je da se voda iz relativno vlaţnog supstrata u zalivanoj strani kreće ka suvim delovima supstrata preko korenovog sistema biljke. Ova pojava je opisana kao „hidrauliĉni lift“ i predstavlja pasivno kretanje vode iz korena u zemljište sa niţim vodnim potencijalom, dok drugi delovi korenovog sistema, koji se nalaze u vlaţnijim delovima zemljišta, apsorbuju vodu (Caldwell i sar., 1998). Pošto usvajanje vode korenovim sistemom zavisi od gradijenta vodnog potencijala izmeĊu korena i zemljišta (Jensen i sar., 1993), veći gradijent vodnog potencijala izmeĊu korena i zemljišta u zalivanoj strani bi mogao, donekle, objasniti veću brzinu usvajanja vode iz te strane. TakoĊe, ukoliko se zemljište isušuje, kretanje vode u zemljištu, zbog povećanja hidrauliĉne otpornosti zemljišta, postaje ograniĉeno, te stoga, usvajanje vode iz suvog dela zemljišta opada (Green i Clothier, 1995). Veća brzina usvajanja vode mogla bi biti i posledica veće površine korenovog sistema i bolje hidrauliĉne provodljivosti korena posle navodnjavanja suve strane (Kang i sar., 1998; Kang i sar., 2002). Kanali za vodu (koji su izgraĊeni od akvaporina) imaju, takoĊe, znaĉajnu ulogu u usvajanju vode u toku nedostatka vode u Diskusija 82 zemljištu (Martre i sar., 2002), zato što mogu delovati na radijalni transport vode u korenovima (Maurel i Chrispeels, 2001; Tyerman i sar., 2002). Na aktivnost ovih kanala utiĉe veliki broj faktora ukljuĉujući pH, osmotski gradijent, vlaţnost zemljišta i dostupnost hranljivih materija (Clarkson i sar., 2000). MeĊutim, postoje i rezultati za paradajz koji pokazuju da je moguće odrţavati sadrţaj vode u supstratu navodnjavane strane PRD biljaka pribliţno sadrţaju vode u supstratu kontrolnih biljaka, u toku celog eksperimenta (Sobeih i sar., 2004), što je kod nas bio sluĉaj sa flacca mutantom. Jedno od objašnjenja ovog neslaganja izmeĊu razliĉitih istraţivanja je u mogućoj razliĉitoj genotipskoj reakciji paradajza na PRD tretman. U poĉetku, vreme izmeĊu promene strana zalivanja kod oba genotipa je bilo sliĉno, dok je kasnije došlo do produţenja vremena kod flacca mutanta. Proseĉno vreme izmeĊu dve promene strana zalivanja kod PRD tretmana iznosilo je, za divlji tip, oko 8 dana, dok je kod flacca mutanta bilo potrebno nešto više vremena i iznosilo je oko 10 dana. Duţi PRD ciklus kod flacca mutanta, u odnosu na divlji tip, sugeriše da je usvajanje vode, od strane korena, kod biljaka flacca mutanta manje u odnosu na biljke divljeg tipa. Veće usvajanje vode od strane biljaka divljeg tipa moţe biti rezultat porasta veliĉine korenovog sistema, biomase, što su potvrdili i naši rezultati (Sl. 4.3 i 4.4) ili hidrauliĉne provodljivosti korena. TakoĊe, pošto su biljke flacca mutanta znatno manje (Sl. 4.2, 4.3, 4.4), njihova potreba za vodom je manja. Dobijeni rezultati su potvrdili da su PRD i RDI tretmani znaĉajano uticali na redukciju rastenja izdanka, pogotovo RDI. Kod oba testirana genotipa, na kraju eksperimenta, visina biljaka je u većoj ili manjoj meri (u zavisnosti od tretmana) bila redukovana, u poreĊenju sa kontrolnim biljkama. Naši rezultati su u skladu sa drugim rezultatima dobijenim primenom PRD i RDI tretmana na paradajzu (Davies i sar., 2000; Mingo, 2003; Stikić i sar., 2003; Zegbe-Dominguez i sar., 2003). Naši rezultati su, takoĊe, pokazali da su biljke flacca mutanta bile niţe u odnosu na divlji tip za oko 40%, u zavisnosti od tretmana. To je u skladu sa rezultaitima Jones i sar (1987) koji su u svojim istraţivanjima dobili smanjenje visine flacca biljaka za 46% u odnosu na divlji tip. Diskusija 83 Efekat ispitivanih tretmana na rastenje vegetativnih organa je praćen i preko merenja njihove biomase (sveţe i suve mase listova, stabla i korena). Ovi rezultati su, sliĉno prethodnim parametrima rastenja, takoĊe, pokazali da je, uglavnom, došlo do redukcije, ali da ona u nekim sluĉajevima nije bila statistiĉki znaĉajna. Tako je kod divljeg tipa, znaĉajno bila redukovana sveţa i suva masa listova i suva masa stabla kod PRD biljaka, odnosno sveţa i suva masa listova, kao i sveţa masa stabla i korena kod RDI biljaka, u odnosu na kontrolne biljke (Sl .4.3 i 4.5). Kod flacca mutanta, znaĉajno je bila redukovana sveţa i suva masa listova kod RDI biljaka (Sl. 4.4 i 4.6). Smanjenje rastenja PRD i RDI biljaka u odnosu na optimalno zalivane biljke su dobili i drugi autori (Mingo, 2003; Chaves i sar., 2007; Kirda i sar., 2004). Poznato je da je rast listova jedan od najosetljivijih procesa u odgovoru na isušvanje zemljišta. Kod listova se, za razliku od korena, osmotska prilagoĊavanja javljaju sporije tako da vodni deficit dovodi do upadljive inhibicije rasta (Chaves i sar., 2003). Ispitivanja Savić i sar. (2009) su pokazala da PRD tretman, menjajući tzv. „source-sink“ odnos asimilata, moţe da utiĉe i na njihov transport od listova ka plodovima, što je od posebnog znaĉaja za prinos i kvalitet plodova paradajza. Redukcija rastenja izdanka moţe nastati kao rezultat delovanja hemijskih ili hidrauliĉnih signala suše, kao i njihove interakcije. Smanjeno usvajanje vode moţe dovesti do redukcije turgora u ćelijama korena, što u ranim fazama suše predstavlja direktan signal za sintezu razliĉitih metabolita, tzv. hemijskih signala suše (prvenstveno biljnih hormona), koji se ksilemom transportuju ka izdanku gde, kao adaptivne reakcije, mogu da izazovu delimiĉno zatvaranje stoma ili da redukuju rastenje (Hartung i sar., 1999). Dalje napredovanje suše ima tzv. hidrauliĉni efekat jer se smanjuje turgor u ćelijama korena i koliĉina vode koja se ksilemom transportuje ka izdanku, što za posledicu ima smanjenje turgora u ćelijama listova, potpuno zatvaranja stoma i redukciju drugih metaboliĉkih procesa (Dodd i sar., 1996). Najĉešće ispitivan hemijski signal je ABA, meĊutim, redukcija rastenja moţe nastati i pri promeni drugih hemijskih signala, kao što je npr. redukcija sadrţaja citokinina do koje dolazi pri niskom sadrţaju vode (Bano i sar., 1993, 1994; Kudoyarova i sar., 2007). Hemijski signal moţe biti i promena pH ksilema ili apoplasta koja, takoĊe, utiĉe na redukciju provodljivosti stoma (Wilkinson i Davies, 1997; Wilkinson i sar., 1998; Wilkinson, 1999) ili rastenje ćelija (Bacon i sar., 1998; Davies i sar., 2002). Diskusija 84 Rezultati su, takoĊe, pokazali da je sveţa i suva masa izdanka bila znaĉajno manja kod flacca mutanta u odnosu na divlji tip. Sliĉne rezultate je dobio i Bradford (1983). Opšteprihvaćeno je da je ABA inhibitor rasta nadzemnog dela biljke (Trewavas i Jones, 1991), tako da je paradoksalno da su mnogi rezultati potvrdili da su ABA mutanti manjeg rasta i sa manjim listovima od biljaka divljeg tipa. Jedno od objašnjenja za manji rast nadzemnog dela ABA mutanata je njihova veća produkcija etilena, u odnosu na biljke divljeg tipa (Neill i sar., 1986). Prema Sharp-u i sar. (2000), uloga ABA je da odrţava rast limitirajući produkciju etilena. Visoka koncentracija etilena redukuje razvoj ksilema (Zobel i Roberts, 1978) tako što inhibira polarni transport auksina (Beyer i Morgan, 1971), koji su neophodni za rastenje ćelija, ali i ksilemsku diferencijaciju (Sugiyama i Komamine, 1990), a od površine ksilema zavisi transport vode i mineralnih materija. Merenja sveţe i suve mase korena su pokazala da nije došlo do povećanja rastenja korenovog sistema kod PRD i RDI biljaka oba genotipa u odnosu na kontrolne biljke (Sl. 4.3-C, 4.4-C, 4.5-C i 4.6-C). To je u saglasnosti sa rezultatima Davies-a i sar. (2000) i Dry-a i sar. (2000) koji nisu dobili znaĉajne razlike u biomasi korena izmeĊu PRD i kontrolnih biljaka kod paradajza i vinove loze, osim što je došlo do promena u distribuciji korena koji je kod PRD biljaka rastao u dubljim slojevima zemljišta. Sa druge strane, Kang-a i sar. (1998) su dobili povećanje biomase korena kod kukuruza pod uticajem PRD tretmana, koje je verovatno bilo rezultat pospešivanja rastenja i razvića boĉnih korenova (Liang i sar., 1996). ABA deficitarni mutant flacca imao je manju sveţu i suvu biomasu korena u odnosu na divlji tip. Sliĉne podatke za smanjenje suve mase korena kod flacca mutanta u poreĊenju sa divljim tipom dobili su i Bradford (1983) i Jones i sar (1987). Poznato je da flacca mutant proizvodi više etilena od divljeg tipa (Tal i sar., 1979), pa povećanje etilena, u odnosu na smanjenu koncentraciju ABA u korenu, inhibira rast korena (Chen i sar., 2003). Prema Sharp-u i sar (2000), smanjen rast korena flacca mutanta, meĊutim, samo delimiĉno moţe biti pripisan etilenu, jer tretman flacca biljaka inhibitorima etilena rezultuje samo delimiĉnim poboljšanjem rasta korena. Naša istraţivanja nisu obuhvatila detaljniju analizu samog procesa rastenja korena. Rezultati Prokić i Stikić (2011) su, kod nešto mlaĊih biljaka divljeg tipa i flacca Diskusija 85 mutanta i pri sliĉnom sistemu PRD, pokazali da je suša indukovala rast korena (duţinu i površinu) u odnosu na optimalne uslove. Oni su ukazali i da se ovakve adaptivne reakcije korena brzo odvijaju i pretpostavka je da se signali za ovakvu adaptaciju, verovatno, javljaju u prvim fazama suše (posle 3 dana) i da, potom, oni veoma brzo rezultiraju promenama na nivou korena (11-tog dana suše). Ovakav pozitivan efekat se u našem eksperimentu ispoljio kod flacca mutanta u PRD tretmanu. Veće smanjenje sveţe mase RDI u poreĊenju sa PRD biljkama, u odnosu na kontrolne, je u skladu sa niţim vrednostima vodnog potencijala listova kod RDI biljaka u odnosu na PRD i FI (Sl. 4.7). To nam ukazuje da je redukcija rastenja RDI biljaka prvenstveno rezultat većeg stepena stresa kome su one bile izloţene i, stoga, rezultat dejstva tzv. hidrauliĉnih signala. Naša istraţivanja su pokazala da je, zbog redukcije rastenja izdanka i pospešivanja rastenja korena, odnos suve mase korena i izdanka bio znaĉajno veći kod PRD biljaka u odnosu na kontrolne biljke, kod flacca mutanta (Sl. 4.7-B), dok kod biljaka divljeg tipa nije bilo statistiĉki znaĉajne razlike u odnosu suve mase korena i izdanka izmeĊu razliĉitih tretmana. Povećanje odnosa koren/izdanak javlja se u uslovima suše, ali i u uslovima nedostatka hranljivih materija i visokih temperatura zemljišta nepovoljnih za optimalno funkcionisanje korena (Poorter i Nagel, 2000). Istraţivanja su imala za cilj i da ukaţu da li se u osnovi PRD i RDI efekata na rastenje i vodni reţim biljaka nalaze hidrauliĉni ili hemijski signali suše i/ili njihovo interakcijsko dejstvo. Rezultati merenja potencijala vode, u optimalnim uslovima, pokazuju da su biljke flacca mutanta bile izloţene većem stepenu stresa (proseĉno -0.65 MPa), u odnosu na biljke divljeg tipa (proseĉno -0.50 MPa). Te razlike se mogu objasniti manjom sposobnošću flacca biljaka da zatvore stome i tako spreĉe dehidrataciju listova, u odnosu na divlji tip. To potvrĊuju i rezultati merenja provodljivosti stoma, koji su, generalno, bili veći u listovima flacca mutanta, u odnosu na divlji tip (Slika 4.8 i 4.9). Vrednosti provodljivosti stoma su se kod flacca mutanta kretale do 1320 mmolm -2 s -1 , dok je maksimalna vrednost kod divljeg tipa bila 1000 mmolm -2 s -1 . Minimalne vrednosti provodljivosti stoma su bile 195 mmolm -2 s -1 kod divljeg tipa, odnosno 412 mmolm -2 s -1 kod flacca mutanta. Razlike u potencijalu vode i provodljivosti stoma izmedju mutanata, deficitarnih u sintezi ABA i divljeg tipa, kod koga se proces odvija nesmetano, su potvrĊene i od strane drugih autora i to, ne samo kod paradajza, već i kod drugih biljaka (Bradford KJ, 1983; Burbidge i sar., 1999). Diskusija 86 Rezultati Sagi i sar. (1999) su pokazali da se kod flacca mutanta sintetiše, u nadzemnom delu biljke, svega 20-26% ABA, a u korenu do 67% ABA, u odnosu na divlji tip. Usled toga dolazi i do manjeg stepena zatvaranja stoma. Dobijeni rezultati potencijala vode su pokazali da su RDI biljke bile izloţene većem stepenu stresa, u odnosu na PRD biljke i to kod oba ispitivana genotipa (Tab. 2 i 3). Poredjenje ovih rezultata sa merenjima provodljivosti stoma ukazuje da reakcije zatvaranja stoma u RDI uslovima prate opadanje potencijala vode u listovima (Sl. 4.8 i 4.9). To ukazuje da su ove reakcije stominih ćelija, kod oba genotipa, rezultat dejstva hidrauliĉnih signala. Isto se moţe pretpostaviti i za inhibitorni efekat RDI na rastenje biljaka divljeg tipa i flacca mutanta. Na osnovu ovih podataka, moţe se, takoĊe, pretpostaviti da hidrauliĉni signali imaju veći uticaj na redukciju rastenja kod RDI biljaka u odnosu na PRD biljke. Sliĉne rezultate u ispitivanjima efekata PRD i RDI na biljke paradajza dobili su Topcu i sar. (2006) i Savić i sar. (2009). Rezultati analize efekata PRD tretmana na vodni reţim biljaka divljeg tipa i flacca mutanta su pokazali da se vrednosti potencijala vode nisu znaĉajno razlikovale od FI tretmana, dok su, generalno, vrednosti provodljivosti stoma bile, u proseku, niţe od proseĉnih vrednosti za FI. To ukazuje da su hemijski signali, a ne hidrauliĉni, bili odgovorni za reakcije stominih ćelija. Rezultati Liu i sar. (2006a, 2006b) ukazuju da je, za sliĉne vrednosti vodnog potencijala listova kod PRD i kontrolnih biljaka, neophodno da sadrţaj vode u supstratu zalivane strane PRD biljaka bude što je moguće pribliţniji sadrţaju vode u supstratu kontrolnih biljaka, što je kod nas i bio sluĉaj. Ispitivanja Savić i sar. (2009) su pokazala da opadanje provodljivosti stoma kod PRD biljaka paradajza poĉinje ranije nego kod RDI biljaka i to u periodu kada nisu utvrĊene promene u potencijalu vode, što ukazuje na hemijske signale suše. Ovi rezultati su, kao i rezultati koje su dobili Liu i sar. (2005), pokazali da u kasnijoj fazi ogleda dolazi do interakcije hemijskih i hidrauliĉnih signala. Rezultati Savić i sar. (2009) su pokazali i da PRD i RDI tretmani nisu znaĉajno uticali na proces fotosinteze, tako da je došlo do porasta u efikasnosti usvajanja vode (WUE – water use efficiency). Cilj istraţivanja je bio i da se prati dnevna dinamika otvaranja stoma u razliĉitim tretmanima i kod oba ispitivana genotipa. Takva istraţivanja se nastavljaju na prethodna ispitivanja Prokić (2009) koja su imala za cilj da objasne ulogu stominih ćelija u adaptivnim reakcijama biljaka na PRD i RDI. Ova istraţivanja su obavljena sa sliĉnim Diskusija 87 dizajnom PRD eksperimenata i istim Ailsa Craig i flacca genotipovima. Razlike u odnosu na naš eksperiment su bile u tome, što su ispitivanja obavljena, umesto sa RDI, sa klasiĉnom sušom, zatim, sa mlaĊim biljkama i kraćim trajanjem eksperimenata (10 dana), kao i kraćim periodom ispitivanja dinamike promene provodljivosti stoma i potencijala vode. Ovi rezultati su ukazali na postojanje dvofaznog (brzog i sporog) odgovora stominih ćelija na ispitivane tretmane. Pri tome se odgovor stoma na PRD tretman moţe okarakterisati kao brzi, a odgovor na sušu kao spori odgovor. Ovi rezultati su, takoĊe, ukazali da se reakcije biljaka divljeg tipa na PRD mogu okarakterisati kao rezultat dejstva hemijskih, a flacca mutanta kao rezultat dejstva hidrauliĉnih signala. Generalno, naša istraţivanja dnevne dinamike, u toku trajanja svih tretmana su, takoĊe, pokazala da postoji razliĉita kinetika u reakcijama stominih ćelija, ali da se to uglavnom javlja samo u toku perioda od 7 h do 14 h. Posle tog perioda su trendovi promena, uglavnom, veoma sliĉni. To ukazuje da se adaptivne reakcije stominih ćelija (zatvaranje ili otvaranje) mogu analizirati samo u prepodnevnim i ranim popodnevnim ĉasovima. Ukoliko se uporede dnevna dinamika merenja na poĉetku eksperimenta sa vrednostima na kraju, kod divljeg tipa, uoĉavaju se, takoĊe, razlike izmeĊu PRD i RDI tretmana. U PRD tretmanu oscilacije provodljivosti stoma su veće i mnogo brţe u odnosu na RDI. Tako, kinetika promena provodljivosti stoma u poslednjem merenju PRD tretmana prati trend brzog opadanja provodljivosti stoma u prvih 1 sat, zatim u toku 1 sata sledi porast provodljivosti stoma i potom, opet, poĉinje naglo opadanje provodljivosti stoma koja se u periodu od 10 do 14 ĉasova smanjila za 64%. Istovremeno, u periodu od 10 do 14 h su se vrednosti provodljivosti stoma kod RDI biljaka smanjile za 48% (Slika 4.8). Sliĉan trend, ali sa znatno više variranja, se uoĉava i kod flacca mutanta (Slika 4.9). Na poĉetku PRD tretmana, opadanje provodljivosti stoma kod ovih biljaka zapoĉinje tek u 10 h, dok na kraju ispitivanog perioda (treći okret PRD), brzo opadanje provodljivosti stoma zapoĉinje mnogo ranije (u 8 h). Ta reakcija se javlja i ranije u odnosu na biljke divljeg tipa (zapoĉinje u 10 h), ali su rezultujuće vrednosti provodljivosti stoma na kraju ogleda kod flacca mutanta više (501 mmolm-2s-1) nego kod divljeg tipa (202 mmolm -2 s -1). To ukazuje da raniji poĉetak i duţi period zatvaranja stoma, zbog manje koliĉine ABA, ne dovodi do većeg zatvaranja stominih ćelija. Diskusija 88 Ispitivanja u RDI tretmanu pokazuju znatno veće oscilacije u reakcijama stominih ćelija, ali, generalno, proces opadanja provodljivosti stoma (zatvaranje stoma) je sporiji u odnosu na PRD tretman. Stoga, naša ispitivanja kod oba genotipa potvrĊuju rezultate Prokić (2009) po kojima se reakcije na PRD tretman mogu okarakterisati kao reakcije brţeg odgovora, a reakcije na sušu kao reakcije sporijeg odgovora. Sliĉnosti izmeĊu naših i rezultata Prokić (2009) se ispoljavaju kod efekta PRD tretmana na biljke divljeg tipa, jer rezultati u oba eksperimentalna sistema ukazuju na kontrolu reakcija hemijskim signalima. Razlike izmeĊu naših rezultata se ogledaju u tome, što naša ispitivanja ukazuju da su reakcije flacca mutanta kod PRD, regulisane tipom odgovora hemijskih signala, dok rezultati Prokić (2009) ukazuju na hidrauliĉne signale. Razlike se, verovatno, mogu pripisati duţem eksperimentalnom periodu u našem ogledu i većem broju obrta u PRD, koji je mogao da indukuje i drugi tip kontrole adaptavnih reakcija kod flacca mutanta. TakoĊe su se razlike ispoljile i u tretmanu RDI i suše, jer naši rezultati ukazuju na hidrauliĉne signale kod oba genotipa, za razliku od rezultata Prokić (2009) koji ukazuju na dejstvo hemijskih signala suše kod flacca mutanta. Sadrţaj ABA u listovima kod FI, RDI i PRD biljaka paradajza prikazan je na Sl. 4.10. Sadrţaj ABA u listovima kod PRD (435.18 ng g FW-1) i RDI (376.25 ng g FW-1) biljaka je bio veći u odnosu na kontrolne FI biljke (338.90 ng g FW-1) kod divljeg tipa. Sliĉno je bilo i kod flacca PRD (91.98 ng g FW-1) i RDI (161.08 ng g FW-1) biljaka u odnosu na FI biljke (70.76 ng g FW -1 ). Ovi rezultati su za sve tretmane potvrdili da je koncentracija ABA u listovima flacca mutanta bila znaĉajno manja od koncentracije u listovima divljeg tipa. Ona se kretala u opsegu od 20% za FI do 42% za RDI tretmane. Koncentraciju ABA u listovima flacca mutanta od samo 20% u odnosu na divlji tip su takoĊe utvrdili Sagi i sar. (1999). Njihovi rezultati pokazuju nešto niţu koncentraciju ABA i za divlji tip (270.8 ng g FW -1 ) i flacca mutanta (63.2 ng g FW -1), a što se moţe objasniti razlikama u eksperimentalnim uslovima ovih, u odnosu na naša istraţivanja. Rezultati Prokić (2009) pokazuju da su razlike izmeĊu biljaka flacca mutanta i divljeg tipa mnogo više izraţene u koncentraciji ABA u listovima nego u korenu. Kod oba genotipa, ispitivani tretmani su uticali na koncentraciju ABA u listovima. Kod divljeg tipa, veći efekat na povećanje sadrţaja ABA u listovima je imao PRD tretman (1.3 puta), dok je kod flacca mutanta to bio RDI tretman (2.3 puta). Sliĉno, Dodd i sar. (2006) su u svojim eksperimentima došli do rezultata da je, u poreĊenju sa kontrolnim biljkama, ksilemska ABA bila znaĉajno veća kod PRD biljaka, Diskusija 89 ĉak veća i u poreĊenju sa RDI biljkama, što se pokazalo i u našim istraţivanjima sadrţaja ABA u listovima kod divljeg tipa (Sl .4.10). Prema istraţivanjima Stoll-a i sar. (2000), PRD tretman dovodi do povećanja koncentracije ABA u suvoj strani korena, pa se tako koncentracija ABA u nezalivanoj strani korena povećava i do 10 puta. Velike promene u sadrţaju ABA u korenu, povezane sa isušivanjem zemljišta, ne moraju, meĊutim, da znaĉe, istovremenu, ekvivalentnu promenu u sadrţaju ABA u listovima, iako je sadrţaj u listovima, po pravilu, viši kod biljaka izloţenih PRD tretmanu nego kod optimalno zalivanih biljaka (Stoll i sar., 2000, Kidra i sar., 2004). Većina eksperimenata sa PRD biljkama je pokazala da one imaju više ABA u ksilemskom soku u poreĊenju sa biljkama koje su zalivane istom koliĉinom vode, ali rasporeĊene na ceo korenov sistem (Rodrigues i sar., 2008, Liu i sar., 2006, Dodd i sar., 2006, Savić, 2003, Dodd i sar., 2008a). Promena strana zalivanja u PRD tretmanu povećava transport ABA iz korena (Dodd i sar., 2006b), jer se, prilikom ponovnog zalivanja suve strane, omogućava ovom delu korena da doprinese proporcionalano više ukupnom fluksu i na taj naĉin se u transpiracioni sistem oslobaĊa ABA akumulirana u korenu u toku isušivanja zemljišta. U skladu sa hipotezom Sharp-a i sar. (2000) o odnosu ABA i etilena, porast koncentracije ABA u PRD tretmanu u listovima flacca mutanta, kao i redukcija provodljivosti stoma i odrţanje viših konaĉnih vrednosti potencijala vode, mogli bi da objasne veću akumulaciju sveţe i suve mase kod ovog tretmana u odnosu na FI ili RDI (Slika 4.4 i 4.6). Veći porast sadrţaja ABA u listovima kod RDI biljaka flacca mutanta, u odnosu na PRD biljke, uz istovremeno niţe konaĉne vrednosti potencijala vode, ukazuje da je ova akumulacija bila rezultat većeg stepena stresa kome su biljke bile izloţene, u odnosu na PRD biljake. ABA detektovana u listovima moţe biti poreklom iz korena i transportovana preko ksilema, moţe biti produkt biosinteze u listovima, ili rezultat recirkulacije izmeĊu korena i nadzemnog dela biljke (Davies i sar., 2000). U većini PRD eksperimenata postoji generalno slaganje da ksilemska ABA moţe biti kljuĉni molekul hemijskog signala stresa suše. (Chaves i sar., 2003; Tuteja i Sopory, 2008). Sliĉno povećanje u sadrţaju ABA u listovima kod oba genotipa, prilikom PRD uslova, ukazuje da flacca mutacija ne pogaĊa transport ABA iz korena u nadzemni deo kao što je pokazano od strane Sagi i sar. (1999). Moţe se, takoĊe, prihvatiti i druga Diskusija 90 hipoteza Sagi i sar. (1999) po kojoj bi obrazovana ABA u suši bila rezultat male promene u biosintetskom putu, pri kojoj se ABA-aldehid preko ABA-alkohola pretvara u ABA. Razlika u našim i Sagi-jevim (1999) rezultatima moţe biti objašnjena razliĉitim stepenom stresa kod istraţivanih mutanata paradajza. Po rezultatima Topcu i sar. (2006), sadrţaj ABA u ksilemu PRD i RDI biljaka je dinamiĉan, pre navodnjavanja je dosta veći u odnosu na period posle navodnjavanja. Naša istraţivanja nisu obuhvatila merenja ksilemske ABA (zbog teškoća u prikupljanju dovoljne koliĉine uzorka za analizu), a merenja ABA u listovima nisu obavljana uporedo sa merenjima provodljivosti stominih ćelija. Stoga, rezultati merenja ABA u listovima mogu samo indirektno da ukaţu na hemijsku prirodu signala suše kod ispitivanih genotipova i u ispitivanim tretmanima. Rezultati analize korelativnih odnosa ksilemske i ABA u listovima sa reakcijama stominih ćelija biljaka divljeg tipa i flacca mutanta (Prokić, 2009), iako dobijeni u mnogo kraćem eksperimentalnom periodu u odnosu na naše uslove, ukazuju da je ABA hemijski signal suše za oba genotipa, ali da je za biljke divljeg tipa mnogo znaĉajnija ksilemska ABA poreklom iz lista, a za biljke flacca mutanta, poreklom iz korena. Na osnovu ovih, ali i drugih podataka iz literature, moţemo pretpostaviti da je i sadrţaj ABA u listovima kod PRD i RDI biljaka dinamiĉan, pa rezultati mnogo zavise i od vremena uzimanja uzoraka. Tako da, buduća istraţivanja zahtevaju ĉešće uzimanje uzoraka za praćenje dinamike sadrţaja ABA u listovima, uz istovremeno praćenje provodljivosti stoma. Niz istraţivanja ukazuje i da su ova prouĉavanja još sloţenija jer bi uticaj ABA mogao biti regulisan razliĉitim faktorima kao što su npr.: pH, rizobakterije, joni i apoplastiĉne β-glukozidaze u listovima (Wilkinson, 1999; Davies i sar., 2005; Dodd i sar., 2006; Jiang i Hartung, 2007). Ispitivanja sadrţaja biogenih elemenata u listovima i korenu obavljena su sa ciljem da se utvrdi da li PRD i RDI sistemi navodnjavanja mogu da utiĉu na usvajanje i distribuciju pojedinih elemenata. MeĊutim, u literaturi ne postoje podaci o uticaju PRD i RDI zalivanja na akumulaciju pojedinih elemenata u biljkama, iako bi oni mogli imati znaĉajnu ulogu u source/sink preraspodeli asimilata (Fujita i sar., 2003) Literaturni podaci pokazuju da je, u uslovima suše, redukovano usvajanje nutrienata korenom i transport nutrienata iz korena u nadzemni deo biljke, usled Diskusija 91 redukovanog intenzitete transpiracije i aktivnog transporta (Viets, 1972; Hsiao, 1973; Kramer i Boyer, 1995). Naši rezultati merenja koncentracije N su pokazali da je, kod flacca mutanta, PRD tretman znaĉajno povećao usvajanje N od strane korena ali i njegovu koncentraciju u listovima (Slika 4.11). Poredjenja koncentracije N u listovima biljaka divljeg tipa i flacca mutanta su pokazala i da je koncentracija ovog elementa u svim tretmanima bila za oko 15% veća kod flacca mutanta u odnosu na divlji tip. Pri tome se ove razlike nisu ispoljile na nivou korena. Moţe se pretpostaviti da je veća koncentracija N u listovima flacca mutanta rezultat manjeg uĉešća ovog elementa u metaboliĉkim procesima koji su kod flacca mutanta, u odnosu na divlji tip, sporiji, a na to ukazuje i manji rast i manja biomasa flacca mutanta, u poreĊenju sa biljkama divljeg tipa. Rezultati u literaturi za akumulaciju N su razliĉiti. Topcu i sar. (2007) nisu dobili razlike izmeĊu FI, RDI i PRD tretmana kod biljaka paradajza. Sliĉno, Hu i sar. (2009) su u svojim istraţivanjima dobili da PRD nije povećao usvajanje N kod kukuruza (Zea mays L.). Neke studije su pokazale da PRD tretman povećava akumulaciju N kod nekoliko useva (Wang i sar., 2009; Shahnazari i sar., 2008). Wang i sar. (2009) su dobili da je, u poreĊenju sa FI i RDI tretmanom, PRD tretman povećao sadrţaj N kod krompira i predloţili da je uzrok tome, uglavnom, povećana dostupnost N u zemljištu. Sliĉno, veću akumulaciju azota u krtolama i listovima krompira kod PRD biljaka, u odnosu na kontrolne biljke, dobili su u istraţivanjima Shahnazari i sar. (2008) i Jovanović i sar. (2010). Ovi rezultati, kao i drugi literaturni podaci, ukazuju na znaĉaj PRD metode u povećanju efikasnosti u usvajanju, ne samo vode (WUE), već i nutrienata (NUE-nutrient-use efficiency), posebno azota. Skorašnji rezultati su pokazali da povećana dostupnost N moţe znaĉajno alkalizovati ksilemski sok kod paradajza, što utiĉe na senzitivnost odgovora stoma na isušivanje zemljišta, zadrţavanjem ABA, poreklom iz korena, u apoplastu (Jia i Davies 2007; Wilkinson i sar., 2007). Razliĉiti tretmani navodnjavanja nisu doveli do statistiĉki znaĉajne razlike u sadrţaju K u listovima, meĊutim, jesu u korenu i brzini translokacije. Ovi rezultati su ukazali i na razlike u transportu ovog elementa u suši jer je kod divljeg tipa pri RDI tretmanu došlo do povećane translokacije K u listove, a kod flacca mutanta je translokacija bila smanjena. Sadrţaj K u listovima je bio znatno viši kod flacca mutanta, Diskusija 92 u odnosu na divlji tip. Kalijum povećava rezistenciju biljaka na sušu kroz svoje funkcije u regulaciji stoma, osmoregulaciji, energetskom statusu, sintezi proteina i homeostazi (Marschner, 1995). TakoĊe, uĉestvuje u odrţavanju turgora (Mengel i Arneke, 1982) i redukciji transpiracije u uslovima suše (Andersen i sar., 1992). Pretpostavka je i da je manji sadrţaj slobodnog K u listovima biljaka divljeg tipa rezultat njegove veće mobilizacije u metaboliĉkim procesima. Suša je dovela do smanjenja sadrţaja Ca u listovima, mada u nekim sluĉajevima to nije bilo statistiĉki znaĉajno. Smanjenje koncentracije Ca u uslovima suše je objašnjeno smanjenim intenzitetom transpiracije (Llorens i sar., 2004) koja je visoko korelisana sa absorpcijom Ca (Marschner, 1995). Naši rezultati su pokazali da su se razlike u tretmanima ispoljile na nivou translokacije jona. RDI tretman je kod oba genotipa usporio transport ovoga jona ka listovima u odnosu na FI i PRD tretmane. Kod flacca mutanta, PRD je imao pozitivan efekat na translokaciju Ca u odnosu na FI ili RDI. Za razliku od Ca, rezultati za Mg nisu pokazali znaĉajne razlike izmeĊu ispitivanih tretmana i analiziranih organa. Kod flacca mutanta razlike su se ispoljile na nivou korena i translokacije Mg koja je bila najsporija u PRD tretmanu. Na sadrţaj mikroelemenata Fe, Mn i Zn uticaj je imao jedino RDI tretman, tako što je došlo do povećane akumulacije Fe u korenu, odnosno Zn u listovima biljaka divljeg tipa. Akumulacija Mn je bila veća u RDI tretmanu kada su u pitanju sadrţaj u korenu kod oba genotipa i sadrţaj u listovima kod flacca mutanta. TakoĊe, primetno je da je kod biljaka flacca mutanta došlo do slabije translokacije Mn iz korena u listove, u odnosu na biljke divljeg tipa. Kod oba genotipa je PRD tretman ubrzao translokaciju ovog elementa iz korena u listove. To je od posebnog znaĉaja jer, Mn kao znaĉajan antioksidacioni agens, moţe da smanji oksidacioni stres u suši i tako poveća toleranciju biljaka na sušu (Wang i sar., 2010). Kao odgovor na vodni deficit i porast sadrţaja ABA, dešavaju se mnoge promene u ekspresiji gena (Bray, 2007; Qin i sar,. 2011). U literaturi nema mnogo podataka o molekularnoj osnovi efekata deficita navodnjavanja na biljke. Rezultati Prokić (2009) su pokazali da se razlikama u ekspresiji ABI3 i RD20 gena mogu objasniti razlike u reakcijama stominih ćelija biljaka divljeg tipa i flacca mutanta. Naši rezultati su obuhvatili drugu grupu gena i potvrdili razlike u ekspresiji istraţivanih TAO1, NCED Diskusija 93 i EIL1 gena pri FI, PRD i RDI tretmanu, tokom trajanja eksperimenta, kao i izmeĊu biljaka divljeg tipa i flacca mutanta. Dobro je poznato da stres (posebno suše) aktivira ABA biosintezu. Pokazano je i da stres suše indukuje ekspresiju NCED kod mnogih biljaka, ukljuĉujući paradajz (Burbidge i sar., 1999). Izostanak stresa kod biljaka divljeg tipa pri FI tretmanu moţe da objasni relativno slab porast u ekspresiji NCED tokom eksperimentalnog perioda, u poreĊenju sa PRD i RDI tretmanima (posebno prvi i drugi PRD okret - 9. i 17. dan). U isto vreme, ekspresija TAO1 gena kod FI biljaka ukazuje da je TAO1 odgovoran za ABA biosintezu i finalni sadrţaj u listovima kod ovog tretmana (Sl. 4.20). Dobra ekspresija oba gena (TAO1 tokom celog perioda i NCED prilikom prvog PRD okreta - 9. dan) kod flacca mutanta pri FI tretmanu ukazuje da su oba gena odgovorna za ABA sadrţaj u listovima ovih biljaka (Sl. 4.19 i 4.20). Rezultati Thompson-a i sar. (2000) su pokazali vrlo brzo povećanje NCED transkripata u listovima paradajza. Naši rezultati nisu pokazali brz porast u ekspresiji gena (naš eksperiment je dizajniran za duţe adaptivne odgovore gena), jer je kod skoro svih tertmana, ĉak i RDI, do povećanja ekspresije NCED došlo kod drugog PRD okreta- 17. dan. Razlike izmeĊu naših i Thompson-ovih (2000) rezultata mogu biti objašnjene razliĉitim stepenom, trajanjem suše, kao i razlikom u tipu suše (PRD i RDI). Thompson-ov (2000) eksperiment je raĊen sa izdvojenim listovima i stepen suše je bio veći i u kraćem vremenu nego u našim in vivo eksperimentalnim uslovima. Ekspresija TAO1 u listovima, kod oba genotipa, je potvrdila ranije pokazanu tkivnu specifiĉnost ovog gena. Min i sar. (2000) su pokazali da se, kod biljaka flacca mutanta i divljeg tipa, TAO1 eksprimirao, uglavnom, u vegetativnom tkivu, TAO2 u vegetativnim i reproduktivnim tkivima, dok ekspresija TAO3 nije bila registrovana. Rezultati Min i sar. (2000) i sliĉno, Seo i sar. (2000) za A. thaliana, su pokazali kljuĉnu ulogu AAO3 i TAO3 u ABA biosintezi. Pošto je kod flacca mutanta pokazana ekspresija TAO1 gena i akumulacija ABA u listovima (Sl. 4.19 i 4.10), naši rezultati pokazuju da drugi gen iz TAO familije, a ne TAO1 (verovatno TAO3) kodira enzim abscisinsku aldehidnu oksidazu kod flacca mutanta. Jedan od mogućih mehanizama modulacije tkivno specifiĉnog odgovora na ABA moţe biti i regulacija ABA biosinteze i/ili odgovora od strane etilena. Etilen je još Diskusija 94 jedan hormon koji reguliše odgovor biljke na vodni deficit, tako što kontroliše vegetativni rast biljke u isušivanom supstratu (Sharp i sar., 2000; Chaves i sar., 2003). Rezultati Rosado i sar. (2006) su demonstrirali da flacca mutant produkuje etilen u znaĉajno višim koncentracijama od divljeg tipa. U našem eksperimentu nije merena koncentracija etilena, ali genetiĉke analize Tieman-a i sar. (2001) su pokazale da je EIL1 pozitivni regulator odgovora na etilen (ukljuĉujući epinastiju listova, abscisiju cvetova, senescenciju i sazrevanje plodova). Ekspresija EIL1 u poslednjim fazama eksperimenta koincidira sa ubrzanim razvojem i sazrevanjem plodova istraţivanih biljaka. Iako je porast PRD indukovanog sadrţaja ABA bio sliĉan u listovima divljeg tipa i flacca mutanta (ca. 1.3 puta), PRD tretman je imao razliĉit uticaj na ekspresiju ispitivanih ABA biosintetskih gena. Najveći porast ekspresije, kod divljeg tipa, je bio primećen za NCED, dok je kod flacca mutanta, maksimana ekspresija bila za TAO1. Ovi rezultati ukazuju da NCED, odnosno TAO1 mogu biti odgovorni za ABA biosintezu kod divljeg tipa, odnosno, flacca mutanta. Sliĉan obrazac ekspresije TAO1, NCED i EIL1 (maksimum tokom drugog okreta - 17. dan je praćen slabljenjem ekspresije) kod biljaka divljeg tipa pri PRD tretmanu moţe ukazivati na moguće sinergistiĉko dejstvo signalnih puteva za ABA i etilen. Sliĉan obrazac nije pronaĊen kod biljaka flacca mutanta pri PRD tretmanu. Redukovana NCED i znaĉajna EIL1 ekspresija (pogotovo nakon drugog okreta - 17. dan), verovatno utiĉe na porast u produkciji etilena koji utiĉe na ABA biosintezu. Kod RDI tretmana, obrazac ekspresije gena u listovima divljeg tipa i flacca mutanta je bio sliĉan što, opet, ukazuje na mogućnost sinergistiĉkog efekta ABA i etilen signalnih puteva. Veliko povećanje u sadrţaju ABA kod flacca mutanta (2.3 puta) je, verovatno, rezultat velike ekspresije TAO1 i NCED gena. Zaključci 95 6 ZAKLJUČCI Na osnovu dobijenih rezultata mogu se izvući sledeći zakljuĉci: 1. Ispitivanja efekata metoda deficita navodnjavanja (partial root-zone drying - PRD i regulated deficit irigation - RDI) na rastenje biljaka paradajza, na osnovu merenja visine, su pokazala da su PRD i RDI uticali na rastenje vegetativnih organa biljaka. Pri tome je RDI kod oba genotipa ispoljio veći efekat na visinu biljaka (smanjenje za 12.5% kod divljeg tipa i za 20% kod flacca mutanta) od PRD tretmana (za 3.1% kod divljeg tipa i za 4% kod flacca mutanta). To nam ukazuje da su stepen stresa kome su biljke bile izloţene, odnosno koliĉina raspoloţive vode u supstratu za gajenje biljaka, imali znaĉajnu ulogu u ispoljavanju efekata ovih tretmana. 2. Merenja biomase listova, stabla i korena su, takoĊe, ukazala na uticaj RDI i PRD tretmana, ali su ovi efekti zavisili, kako od ovih ispitivanih organa, tako i od tretmana i genotipova. RDI je kod oba genotipa doveo do znaĉajne redukcije sveţe i suve mase, što je posebno bilo izraţeno kod listova. PRD efekat je ispoljio razliĉito dejstvo kod ispitivanih biljaka, tako što je kod divljeg tipa došlo do redukcije, a kod flacca mutanta do povećanja biomase u ispitivanim organima. Ovi efekti na ispitivane organe nisu u svim sluĉajevima bili statistiĉki znaĉajni. 3. Analiza rasta vegetativnih organa je pokazala da su u toku celog ispitivanog perioda i u svim tretmanima biljke flacca mutanta bile znaĉajno niţe (za ca 40%) i sa manjom obrazovanom sveţom i suvom masom u odnosu na biljke divljeg tipa. 4. Analiza vodnog reţima biljaka, na osnovu rezultata potencijala vode () u listovima i koliĉine vode u supstratu, je pokazala da su RDI biljke bile izloţene većem stepenu stresa u odnosu na PRD biljke, kod oba ispitivana genotipa. Rezultati efekata PRD tretmana su pokazali da se vrednosti potencijala vode, kao i koliĉina vode u zalivanoj strani supstrata, nisu znaĉajno razlikovale od FI tretmana. Sporije sušenje Zaključci 96 nezalivane strane u PRD tretmanu kod flacca mutanta (10 dana), u odnosu na biljke divljeg tipa (8 dana), ukazuje na manji utrošak, a verovatno i usvajanje vode, kod biljaka flacca mutanta koje su i sporije rasle u odnosu na divlji tip. 5. Rezultati merenja potencijala vode, u optimalnim uslovima, pokazuju da su biljke flacca mutanta bile izloţene većem stepenu stresa, u odnosu na biljke divljeg tipa. Te razlike se mogu objasniti manjom sposobnošću flacca mutanta da zatvori stome i tako spreĉi dehidrataciju listova, u odnosu na divlji tip. 6. Naša istraţivanja dnevne dinamike provodljivosti stoma (gs), u toku trajanja svih tretmana, su pokazala da postoji razliĉita kinetika u reakcijama stominih ćelija, ali da se to, uglavnom, javlja samo u toku perioda od 7 h do 14 h. Posle tog perioda su trendovi promena, uglavnom, veoma sliĉni. Kod divljeg tipa, u PRD tretmanu oscilacije provodljivosti stoma su veće i mnogo brţe u odnosu na RDI tretman. Kod flacca mutanta, ispitivanja u RDI tretmanu pokazuju znatno veće oscilacije u reakcijama stominih ćelija, ali, generalno, proces opadanja provodljivosti stoma (zatvaranje stoma) je sporiji u odnosu na PRD tretman. Ovo ukazuje da se reakcije na PRD tretman mogu okarakterisati kao reakcije brţeg odgovora, a reakcije na RDI kao reakcije sporijeg odgovora stominih ćelija na sušu. 7. Analiza reakcija stominih ćelija, u odnosu na promene potencijala vode u listovima, moţe da ukaţe na tip signalnih reakcija. Rezultati su pokazali da reakcije zatvaranja stoma, u uslovima RDI, prate opadanje potencijala vode u listovima. To ukazuje da su ove reakcije stominih ćelija rezultat dejstva hidrauliĉnih signala. Rezultati analize efekata PRD tretmana na vodni reţim biljaka divljeg tipa i flacca mutanta su pokazali da se vrednosti potencijala vode nisu znaĉajno razlikovale od FI tretmana, dok su, generalno, vrednosti provodljivosti stoma bile, u proseku, niţe od proseĉnih vrednosti za FI. To ukazuje da su hemijski signali, a ne hidrauliĉni, bili odgovorni za reakcije stominih ćelija. Zaključci 97 8. Kod oba genotipa ispitivani tretmani su uticali na koncentraciju ABA u listovima, koja je kod flacca mutanta u svim tretmanima bila manja (za 75%) u odnosu na biljke divljeg tipa. Rezultati su pokazali da je kod divljeg tipa, veći efekat na povećanje sadrţaja ABA u listovima imao PRD tretman, dok je kod flacca mutanta to bio RDI tretman. Sliĉno povećanje u sadrţaju ABA u listovima kod oba genotipa prilikom PRD tretmana ukazuje da flacca mutacija ne pogaĊa transport ABA iz korena u nadzemni deo. 9. Merenja koncentracije jona u razliĉitim organima paradajza (listovi i koren), uglavnom, nisu pokazala znaĉajan efekat primenjenih sistema deficita navodnjavanja na usvajanje, akumulaciju ili distribuciju jona. Najznaĉajniji je bio uticaj PRD koji je kod flacca mutanta povećao usvajanje i transport azota, a kod oba genotipa ubrzao translokaciju mangana iz korena u listove. Kako je mangan znaĉajan antioksidacioni agens, ta reakcija moţe biti od znaĉaja, ne samo za adaptivne metaboliĉke reakcije biljaka na PRD, već i moguće poboljšanje nutritivne vrednosti paradajza. 10. Molekularna ispitivanja ekspresije gena u listovima su pokazala razlike izmeĊu tretmana, tokom njihovog trajanja, kao i izmeĊu ispitivanih genotipova. Dobra ekspresija TAO1, uz slabiju NCED1 gena, kod FI biljaka divljeg tipa, ukazuje da je TAO1 bio odgovoran za ABA biosintezu i finalni sadrţaj u listovima kod ovog tretmana. Dobra ekspresija TAO1 i NCED gena kod flacca mutanta pri FI tretmanu ukazuje da su oba gena bila odgovorna za ABA sadrţaj u listovima ovih biljaka. 11. Iako je porast PRD indukovanog sadrţaja ABA bio sliĉan u listovima divljeg tipa i flacca mutanta (ca. 1.3 puta), PRD tretman je imao razliĉit uticaj na ekspresiju ispitivanih ABA biosintetskih gena. Najveći porast ekspresije, u PRD tretmanu kod divljeg tipa, je bio primećen za NCED, dok je kod flacca mutanta, maksimana ekspresija bila za TAO1. Ovi rezultati ukazuju da NCED, odnosno TAO1 mogu biti odgovorni za ABA biosintezu kod divljeg tipa, odnosno, flacca mutanta. Zaključci 98 12.Analiza ekspresije sva 3 gena u toku perioda od 5 uzorkovanja u PRD tretmanu je pokazala genotipske razlike. Sliĉan obrazac ekspresije TAO1, NCED i EIL1 kod biljaka divljeg tipa ukazuje na moguće sinergistiĉko dejstvo signalnih puteva za ABA i etilen. Sliĉan trend promena nije pronaĊen kod flacca mutanta. Redukovana NCED i znaĉajna EIL1 ekspresija, verovatno, reflektuje porast u produkciji etilena, koji moţe da utiĉe i na signale i biosintezu ABA. 13. Kod RDI tretmana, obrazac ekspresije gena u listovima divljeg tipa i flacca mutanta je bio sliĉan što ukazuje na mogućnost sinergistiĉkog efekta signalnih puteva za ABA i etilen. Znaĉajan porast ABA koncentracije kod flacca mutanta je verovatno bio rezultat znaĉajne ekspresije TAO1 i NCED gena. 14. Pošto je kod flacca mutanta bila izraţena ekspresija TAO1 gena i utvrĊena akumulacija ABA u listovima, naši rezultati pokazuju da neki drugi gen iz TAO familije, a ne TAO1 (verovatno TAO3) kodira enzim abscisinsku aldehidnu oksidazu kod flacca mutanta. 15. Naša istraţivanja su pokazala da je PRD tretman ispoljio pozitivno dejstvo na rastenje flacca mutanta. Pretpostavka je da se to moţe pripisati povećanju koncentracije ABA koja je mogla da doprinese zatvaranju stoma i optimizaciji vodnog reţima (povećanju ), a takoĊe i smanjenju negativnog dejstva etilena, na ĉiju povećanu sintezu ukazuju rezultati ekspresije EIL1 gena. 16. Naši rezultati su ukazali da je neophodno ukljuĉiti molekularni aspekt za objašnjenje efekata PRD i RDI tretmana na biljke paradajza. Ispitivanja ekspresije još većeg broja gena, ĉiji su produkti ukljuĉeni u percepciju i transdukciju signala stresa indukovanih PRD ili RDI tretmanom, posebno onih vezanih za etilen, mogla bi još bolje da objasne teorijsku osnovu i fiziološke efekte ovih metoda, a tako i da olakšaju i ubrzaju njihovu praktiĉnu aplikaciju. Literatura 99 7 LITERATURA Abe, H., Yamaguchi-Shinozaki, K., Urao, T., Iwasaki, T., Hosokawa, D., Shinozaki, K. (1997). Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs in drought- and abscisic acid-regulated gene expresion. The Plant Cell 9,1859-1868. Abe, H., Urao, T., Ito, T., Seki, M., Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K. (2003). Arabidopsis atMYC2 (bHLH) and atMYB2 (MYB) function as transkriptional activators in abscisic acid signaling. The Plant Cell 15,63-78. Alexander, L., Grierson, D. (2002) Ethylene biosynthesis and action in tomato: a model for climacteric fruit ripening. Journal of Experimental Botany 53, 2039-2055 Allen, S.E., Grimshaw, H.M., Parkinson, J.A., Qarmby, C. (1974). Chemical Analysis of Ecological Material, Ed.Wiley, New York Allen, G.J., Chu, S.P., Schumacher, K., Shimazaki, C.t., Vafeados, D., Kemper, A., Hawke, S.D., Tallman, G., Tsien, R.Y., Harper, J.F., Chory, J., Schroeder, J.I. (2000). Alternation of stimulus-specific guard cell calcium oscillations and stomatal closing in Arabidopsis det3 mutant. Science 289: 2338-2342. Alonso, J.M., Hirayama, T., Roman, G., Nourizadeh, S., Ecker, J.R. (1999). EIN2, a bifunctional transducer of ethylene and stress responses in Arabidopsis. Science 284, 2148-2152. Andersen, M.N., Jensen, C.R., Losch, R (1992). The interaction effects of potassium and drought in field-grown barley. II. Nutrient relations, tissue water content and morphological development. Soil Plant Sci. 42, 45–56. Andesron, B.E., Ward, J.M., Schroeder, J.I. (1994). Evidence for an extracellular reception site for abscisic acid in Commelina guard cells. Plant Physiology 104: 1177-1183. Aroca, R.,Vernieri, P., Irigoyen, J.J., Sánches-Díay, M., Tognoni, F., Pardossi, A., (2003). Involvement of abscisic acid in the leaf and root of maize (Zea mays L.) in avoiding chilling-induced water stess. Plant science 165, 671-679. Asch, F. (2000). Determination of Abscisic Acid by Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Technical Report. Laboratory for Literatura 100 Agrohydrology and Bioclimatology, Department of Agricultural Sciences, The Royal Veterinary and Agricultural University, Tastrup, Denmark. Bacon, M.A., Wilkinson, S., Davies, W.J. (1998). pH-regulated leaf cell expansion in droughted plants is abscisic acid depedent. Plant Physiology 118, 1507-1515. Bahrun, A., Jensen, C.R., Asch, F., Mongensen, V.O. (2002). Drought-indused changes in xylem pH,ionic composition, and ABA concentration act as early signals in field-grown maize (Zea mays L.). Journal of Experimental Botany 53, 251-263. Bano, A., Dörffling, K., Bettin, D., Hahn, H. (1993). Abscisic acid and cytokinins as possible root-to-shoot signals in xylem sap of rice plants in drying soil. Australian Journal of Plant Physiology 20, 109-115. Bano, A., Hensen, H., Dörffling, K., Hahn, H. (1994). Changes in the content of free and conjugated abscisic acid, phaseic acid and cytokinins in the xylem sao of drought-stressed sunflower plants. Phytochemistry 37, 345-347. Bartels, D., Sunkars, R. (2005). Drought and salt tolerance in plants.Critical Reviews in Plant Science 24, 23–58. Beyer, E.M., Morgan, P.W. (1971). Abscission: the role of ethylene modification of auxin transport. Plant Physiology 48, 208-212. Bradford, K.J. (1983). Water Relations and Growth of the flacca Tomato Mutant in Relation to Abscisic Acid. Plant Physiol. 72, 251-255 Bray, A. E. (2007). Molecular and physiological responses to water-deficit stress. M.A. Jenks et al. (eds.), Advances in molecular breeding toward drought and salt tolerant crops, Ed. Springer,121–140. Burbidge, A., Grieve, T. M., Jackson, A., Thompson, A., McCarty, D. R., I. B. Taylor (1999). Characterization of the ABA-deficient tomato mutant notabilis and its relationship with maize vp14. Plant J. 17, 427-431. Benton Jones, Jr. (1999). Tomato Plant Culture: In the Field, Greenhouse, and Home Garden. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C. Blackman, P.G., Davies, W.J. (1985). Root and shoot communication in maize plants of the effects of soil drying. Journal of Experimental Botany 36: 39-48 Bošnjak, Đ., Pejić, B. (1995). Turnus kao osnova zalivnog reţima paradajza. Zbornik radova 23, 369-375. Poljoprivredni fakultet, Novi Sad. Literatura 101 Boyer, J.S. (1968). Relationship of water potential to growth of leaves. Plant Physiology 43, 1056-1062. Caldwell, M.M, T.E. Dawson J.H Richards (1998). Hydraulic lift: consequences of water eflux from the roots of plants. Oecologia 113, 151-161. Chaves, M.M., Pereira, J.S., Maroco, J.P., Rodrigues, M.L., Ricardo, C.P.P., Osorio, M.L., Carvalho, I., Faria, C., Pinheiro, C. (2002). How plants cope with water stress in the field. Photosynthesis and growth. Annals of Botany 89, 1-10. Chaves, M.M.; Maroco, J.P.; Pereira, J.S. (2003). Understanding plant responses to drought-from genes to the whole plant. Functional Plant Biology, 2003, 30, 239-264 Chaves, M. M., M. M. Oliveira (2004). Mechanisms underlying plant resilience to water deficits – prospects for water-saving agriculture. J. Exp. Bot. 55, 2365-2384. Chaves, M.M., T.P. Santos, C.R. Souza, M.F. Ortuño, M.L. Rodrigues, C.M. Lopes, J.P. Maroco, J.S. Pereira (2007). Deficit irrigation in grapevine improves water-use efficiency while controlling vigour and production quality. Annals of Applied Biology 150, 237–252 Chen, G., Shi, Q., Lips, S.H., Sagi, M. (2003). Comparison of growth of flacca and wild- type tomato grown under conditions diminishing their differences in stomatal control. Plant Science 164, 753-757. Choi, H., Hong, J.H., Ha, J., Kang, J.Y., Kim, S.Y. (2000). ABFs, a family of ABA- responsive elements binding factors. Journal of Biological Chemistry 275,1723- 1730Comstock J.P. (2002). Hydraulic and chemical signaling in the control of stomatal conductacne and transpiration. Journal of Experimental Botany 53: 195- 200 Clarkson, D.T., Carvajal, M., Henzler, T., Waterhouse, R.N., Smyth, A.M., Cooke, D.T., Steudle, E. (2000). Root hydraulic conductance: diurnal aquaporin exspresion and the effects on nutrient stress. Journal of Experimental Botany 51, 61-70. Comstock, J.P. (2002). Hydraulic and chemical signaling in the control of stomatal conductacne and transpiration. Journal of Experimental Botany 53: 195-200 Literatura 102 Cramer, G.R., Jones, R.L. (1996). Osmotic stress and abscisic acid reduce cytosolic calcium activitis in roots Arabidopsis taliana. Plant, Cell and Environment 19, 1291-1298 Damjanović, M., Zdravković, J., Stevanović, D., Marković, Ţ., Zdravković, M. (2001). Proizvodnja povrća u plastenicima. Izd. Prezent, Poţarevac Davies, W.J., Zhang, J. (1991). Root signals and the regulation of growth and development of plants in drying soil. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42, 55–76. Davies, W. J., Bacon, M. A., Thompson, D. S., Sobeih, W., L. G. Rodriguez (2000). Regulation of leaf and fruit growth in plants in drying soil: exploitation of the plant’s chemical signalling system and hydraulic architecture to increase the efficiency of water use in agriculture. J. Exp. Bot. 51, 1617-1626. Davies, W.J, Wilkinson, S., Loveys, B.R. (2002). Stomatal control by chemical signaling and the exploitation of this mechanism to icrease water use efficiency in agriculture. New Phytol. 153, 449-460. Davies, W.J., Kudoyarova, G., Hartung W. (2005). Long-distance ABA signalling and its relation to other signalling pathways in the detection of soil drying and the mediation of the plant's response to drought. Journal of Plant Growth Regulation 24:285-295. de Souza, C.R., Maroco, J.P., dos Santos, T.P., Rodrigues, M.L., Lopes, C.M., Pereira, J.S., Chaves, M.M. (2003). Partial rootzone drying: regulation of stomatal aperture and assimilation in field-grown grapevines (Vitis vinifera cv. Moscatel). Functional Plant Biology 30, 653-662. Dodd, I.S., Stikić, R., Davies, W.J. (1996). Chemical regulation of gas exchange and growth of plants in drying soil in the field. Journal of Exhperimental Botany 47, 1475-1490 Dodd, I. C., Stikic, R., Davies, W. J. (1997). Chemical regulation of gas exchange and growth of plants in drying soil in the field (review article). Journal of Experimental Botany. Environmental Perspectives 1996/7, 1475-1490. Dodd, I.C, Theobald, J.C, Bacon, M.A, Davies, W.J. (2006). Alternation of wet and dry sides during partial rootzone drying irrigation alters root-to-shoot signalling of abscisic acid. Functional Plant Biology 33, 1081-1089. Literatura 103 Dodd, I.C. (2007). Soil moisture heterogeneity during deficit irrigation alters root-to- shoot signalling of abscisic acid. Functional Plant Biology, 34, 439–448. Dodd I.C., Egea G., Davies W.J. (2008). Accounting for sap from different parts of the root system improves the prediction of xylem ABA concentration in plants grown with heterogeneous soil moisture. Journal of Experimental Botany 59: 4083–4093. Dodig, D. Quarrie, S.A., Stanković, S., Milijić, S., Denĉić, S. (2002). Characterising wheat genetic resources for responses to drought stress. In: Proceedings of ICID International Conference on Drought Mitigation and Prevention of Land Desertification, Bled, Slovenia, ch 38. Dorji, K., Behboudian, M.H., Zegbe-Dominguez, J.A. (2005). Water relations, growth, yield, and fruit quality of hot pepper under deficit irrigation and partial rootzone drying. Scientia Horticulturae 104, 137–149. Dragović, (1999). Drought effects on agriculture in Yugoslavia. In: Quarrie, S.A., Pekić, S. eds. Balkan Drought Workshop Proceedings, Zajeĉar, Yugoslavia, September 1998. Agricultural Research Institute SERBIA, 171-181. Dry, PR., Loveys, B.R., During, H. (2000). Partial drying of rootzone of grape.I. Transient changes in shoot growth and gas exchange. Vitis 39, 3-7. Đaković, T., Jovanović, Z. (2003). The role of cell wall peroxidase in the inhibition of leaf and fruit growth. Bulg. J. of Plant Physiology, Special Issue, 264-272. Dţamić, R., Stikić, R., Nikolić, M., Jovanović, Z. (1999). Praktikum, Fiziologija biljaka. Poljoprivredni fakultet, Univerzitet u Beogradu. FAO . (2002). Crops and drops: making the best use of water for agriculture, p. 28. Rome, Italy: FAO. Information brochure. Fereres, E., M.A. Soriano (2007). Deficit irrigation for reducing agricultural water use. Journal of Experimental Botany, 58, (2) 147–159. Foolad, M.R. (2007). Current Status Of Breeding Tomatoes For Salt And Drought Tolerance. In: Advances in Molecular Breeding Toward Drought and Salt tolerance. (M.A. Jenks et al. eds.) Crops, 669–700. Fujita, K., Okada, M., Lei, K., Ohkura, K., Adu-Gyamfi, J.J., Mohapatra, P.K. (2003). Effect of P-deficiency on photoassimilate partitioning and rhytmic changes in fruit Literatura 104 and stem diameter of tomato (Lycopersicon esculentum) during fruit growth. Journal of Experimental Botany 54, 2519-2528. Fujita, M., Fujita, Y., Maruyama, K., Seki, M., Hiratsu, K., Ohme-Takagi, M., Tran, L.S., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (2004). A dehydration-induced NAC protein, RD26, is involved in a novel ABA-dependent stress-signaling pathway. The Plant Journal 39: 863-876. Gao, D., Knight, M.R., Threwavas, A.J., Sattelmacher, B., Plieth, C. (2004). Self- reporting Arabidopsis expressing pH and [Ca 2+ ] indicators unveil ion dynamics in the cytoplasm and in the apoplast under abiotic stress. Plant Physiology 134: 898- 908 Green, S.R., Clothier, B.E., (1995). Root water uptake by kiwifruit vines following partial wetting of the root zone. Plant Soil 173, 317–328. Gowing, D.J., Davies, W.J., Jones, H.G. (1990). A root-sourced signal of drying soil in apple {Malus domestica) Borkh. In Importance of Root to Shoot Communication in the Responses to Environmental Stress (eds W. J. Davies & B. Jeffcoat). BSPGR Monograph 21: 274-277. Gumenyuk, I.D., Musatenko, L.I. (2006). The anatomic features of vegetative organs of Persicaria amphibia (L.) Delarbre at moderate water deficiency. Ukr. bot. Zh. 63, 699-712 Guo, H., Ecker, J.R. (2003). Plant responses to ethylene gas are mediated by SCF(EBF1/EBF2)-dependent proteolysis of EIN3 transcription factor. Cell 115, 667–677. Guo, R., Huang, L. (2008). New insights into the activation mechanism of store-operated calcium channels: roles of STIM and Orai. Journal of Zhejiang University Science B.ISSN 1862-1783 (online). Hartung, W., Peuke, A.D., Davies, W.J. (1999). Abscisic acid-a hormonal log distance stress signal in plants under drought and salt stress. In: Handbook of Crop Stress (ed. M. Pessarakali) 2nd edn, pp. 731-747. Marcel Dekker, New York. Ho, L.C. (1996) Tomato. In: Zemaski, E., Schaffer, A.A. (Eds.), Photoassimilate Distribution in Plants and Crops: Source–Sink Relationships. Marcel Dekker Publishers, New York, USA, pp. 709–728 Literatura 105 Ho, L.C., White, P.J. (2005). A Cellular Hypothesis for the Induction of Blossom-End Rot in Tomato Fruit. Annals of Botany 95, 571–581 Hornberg, C., Weiler, E.W. (1984). High affinity binding sites for abscisic acid on the plasmalemma of Vicia faba guard cell. Nature 310: 321-324. Hose, E., Sauter, A., Hartung, W. (2002). Abscisic acid in roots- biochemistry and physiology. In: Waisel, Z., Eshel, A., Kafkafi, U. (ed): plant Roots. The Hidden Half. 3 rd Ed. pp. 435-448. Marcel Dekker, New York-Basel. Hsiao, T.C., (1973). Plant responses to water stress. Ann. Rev. Plant Physiol. Mol. Biol. 24, 519–570. Hsiao, T.C., Xu, L.K. (2000). Sensitivity of growth of rooth versus to leaves to water stress: biophysical analysis and relation to water transport. Journal of experimental Botany. 51: special issue, 1595-1616. Hu, T.T, Kang, S.Z., Li, F.S., Zhang, J.H. (2009). Effect of partial root-zone irrigation on the nitrogen absorption and utilization of maize. Agricultural Water Management 96, 208–214. Hu, T., Kang, S., Li, F., J. Zhang (2011). Effects of partial root-zone irrigation on hydraulic conductivity in the soil–root system of maize plants. J. Exp. Bot. 62, 4163-4172. Hua, J., Sakai, H., Nourizadeh, S., Chen, Q.H.G., Bleecker, A.B., Ecker, J.R., Meyerowitz, E.M. (1998). EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. The Plant Cell 10, 1321-1332 Hubbard, K.E., Nishimura, N., Hitomi, K., Getzoff, E.D., Schroeder, J.I. (2010). Early abscisic acid signal transduction mechanisms: Newly discovered components and newly emerging questions. Genes Dev. 24, 1695–1708. Ingram, J., Bartels, D. (1996). The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47: 377-403 IPCC (2007). Climate change 2007: the physical science basis.Contribution of Working Group I to the Fourth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change (eds Solomon S.D., Qin M., Manning M., Chen Z., Marquis M., Averyt K.B., Tignor M. and Miller H.L.). Cambridge, UK and New York, USA: CambridgeUniversity Press. Literatura 106 Jaglo-Ottosen, K.R., Gilmour, S.R., Zarka, D.G., Schabenberger, O., Thomashow, M.F. (1998). Arabidopsis CBF1 overexpression induces coe genes and enhances freezing tolerance. Science 280,104-106. Jensen, C.R., Svendsen, H., Andersen, M.N., Losch, R., (1993). Use of the root contact concept, an empirical leaf conductance model and pressure-volume curves in simulating crop water relations. Plant and Soil 149, 1-26 Jia, W.S., Davies, W.J. (2007). Modification of leaf apoplastic pH in relation to stomatal sensitivity to root-sourced ABA signals. Plant Physiology 143:68-77. Jia, W., Zhang, J. (1999). Stomatal closure is induced rather by prevailing xylem abscisic acid than by accumulated amount of xylem-derived abscisic acid. Physiologia Plantarum 106, 268–275 Jiang, F., Hartung, W. (2007). Long-distance signaling of abscisic acid (ABA): the factors regulating the intensity of the ABA signal. Journal of Experimental Botany 59: 37- 43. Jones, H.G., Sharp, C.S, Higgs, K.H. (1987). Growth and Water Relations of Wilty Mutants of Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) Journal of Experimental Botany 38, (11) 1848-1856. Jovanović, Z., Djaković, T., Stikić, R., Prokić, Lj., Hadţi-Tašković Šukalović, V. (2004). Effect of N deficiency on leaf growth and cell wall peroxidase activity in contrasting maize genotypes. Plant and Soil 265, 201-221. Jovanovic, Z., Stikic, R., Vucelic-Radovic, B., Paukovic, M., Brocic, Z., Matovic, G., Rovcanin, S., Mojevic, M. (2010). Partial root zone drying increases WUE, N and antioxidant content in field potatoes. European Journal of Agronomy, 33, 124- 131. Jovanović, Z., Stikić, R. (2012). Strategies for improving water productivity and quality of agricultural crops in an era of climate change. In: IrrigationSystems and Practices in Challenging Environments. Edited by Teang Shui Lee, ISBN 978-953-51-0420- 9, Publisher: InTech, pp. 77-102. Kang, S., Liang, Z., Hu, W., Zhang, J. (1998). Water use efficiency of controlled root- division alternate irrigation on maize plants. Agricultural Water Management 38, 69-76. Literatura 107 Kang, S.Z, Hu, X.T, Goodwin, I., Jerie, P., Zhang, J. (2002). Soil water distribution, water use and yield response to partial rootzone drying under flood-irrigation condition in a pear orchard. Scientia Horticulturae 92, 277-291. Kang S., Zhang J. (2004). Controlled alternate partial rootzone irrigation: its hysiological consequences and impact on water use efficiency. Journal of Experimental Botany 55: 2437-2446. Kasuga, M., Liu, Q., Miura, S., Yamaguchi-Shinozki, K., Shinozaki, K. (1999). Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transkription factor. Nature Biotechnology 17, 287-291. Katz, R.W., Glantz, M.H. (1977). "Rainfall statistics, drought and desertification in Sahel", in Desertification in Sahel, (M.H.Glantz, ed.), pp.80-102. Westview Press, Boulder, Col. Kirda, C., Cetin, M., Dasgan, Y., Topcu, S., Kaman, H., Ekici, B., Derici, M.R., Ozguven, A.I. (2004). Yield response of greenhouse - grown tomato to partial root drying and conventional deficit irrigation. Agricultural Water Management 69, 191-201. Koiwai, H., Nakaminami, K., Seo, M. , Mitsuhashi, W., Toyomasu, T., Koshiba, T. (2004). Tissue-Specific Localization of an Abscisic Acid Biosynthetic Enzyme, AAO3, in Arabidopsis. Plant Physiology 134:1697-1707 Kramer, P.J., Boyer, J.S., (1995). Water Relations of Plants and Soils. Academic Press Inc., San Diego. Kudoyarova, G.R., Vysotskaya, L.B., Cherkozyanova, A., Dodd, I.C. (2006). Effects of partial root drying on the concentration of zeatin-type cytokinins in tomato (Solanum Lycopersicum L.) xylem sap and leaves. Journal of Experimental Botany 58, 161-168. Kulkarni, M., Borse, T., Chaphalkar, S. (2007). Anatomical variability in Grape (Vitis venifera) Genotypes in Relation to Water Use Efficiency (WUE). American J. Plant Physiol. 2, (1) 36-43. Larcher, W. (1995). Physiological Plant Ecology, Ed. Springer, Berlin, 148-164 Liang, J., Zhang, J, M.H. Wong (1996). Effects of air-filled soil porosity and aeration on the initiation and growth of secondary roots of maize (Zea mays) Plant and Soil 186, (2) 245-254 Literatura 108 Liu, F., Jensen, C.R., Andersen, M.N. (2003). Hydraulic and chemical signals in the control of leaf expansion and stomatal conductance in soybean exposed to drought stress. Functional Plant Biology 30, 65-73. Liu, F., Jensen, C.R., Shahnazari, A., Andersen, M.N., Jacobsen, S.E. (2005). ABA regulated stomatal control and photosynthetic Water use efficiency of potato (Solanum tuberosum L.) during progressive soil drying. Plant Science 168, 831- 836. Liu, F., Shahnazari, A., Andersen, M.N., Jacobsen, S.E., Jensen, C.R.( 2006a). Effects of deficit irrigation (DI) and partial root drying (PRD) on gas exchange, biomass partitioning, and water use efficiency in potato. Scientia Horticulturae 109, 113- 117. Liu, F., Shahnazari, A., Andersen, M.N., Jacobsen, S.E., Jensen, C.R. (2006b). Physiological responses of potato (Solanum tuberosum L.) to partial root-zone drying: ABA signalling, leaf gas exchange, and water use efficiency. Journal of Experimental Botany 57, 3727-3735. Liu, K., Sakuma, J., Abe, H., Kasuga, M., Miura, S., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (1998). Two transkription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain, separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low temperature-responsive gene expreession, respectively, in Arabidosis. The Plant Cell 10, 1491-1506. Liu, X., Yue, Y., Li, B., Nie, Y., Li, W., Wu, W-H., Ma, L. (2007). A G protein-coupled receptor is a plasma membrane receptor for the plant hormone abscisic acid. Science 315: 1712-1716. Llorens, L., J. Pen˜uelas, M. Estiarte, P. Bruna (2004). Contrasting growth changes in two dominant species of a Mediterranean shrubland submitted to experimental drought and warming, Ann. Bot. (Lond.), 94, 843–853. Luković J, I. Maksimović, L. Zorić, N. Nagl, M. Perĉić, D. Polić, M. Putnik-Delić (2009). Histological characteristics of sugar beet leaves potentially linked to drought tolerance. Industrial Crops and Products 30, 281–286. Mansfield, T.A., Hetherington, A.H., Atkinson, C.J. (1990). Some current aspects of stomatal physiology. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 41, 55-75. Literatura 109 Marković, Ţ. (1997). Gajenje povrća. Izd. Institut za istraţivanja u poljoprivredi SRBIJA, Beograd. Marschner, H. (1995). Mineral nutrition of higher plants. 2nd edn.Academic Press, New York. Martre, P., Morillon, R., Barrieu, F., North, G.B., Nobel, P.S., Chrispeels, M.J. (2002). Plasma membrane aquaporins play a significant role during recovery from water deficit. Plant Physiology 130, 2101-2110. Maurel, C., Chrispeels, M.J. (2001). A molecural entry into plant water relations. Plant Physiology 125, 135-138. McAinsh, M.R., Clayton, H., Mansfiled, T.A., Hetherington, A.M. (1996). Change in stomatal behavior and guard cell cytosolic free calcium in response to oxidative stress. Plant Physiology 111: 1031-1042. Mengel, K., Arneke, W. (1982). Effect of potassium on the water potential, pressure potential, osmotic potential and cell elongation in leaves of Phaseolus vulgaris L. Plant Physiol. 54, 402–408 Mengel, K., Kirkby, E.A. (2001). Principles of Plant Nutrition. 5th ed., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Min, X., Okada, K., Brockmann, B., Koshiba, T., Y. Kamiya (2000). Molecular cloning and expression patterns of three putative functional aldehyde oxidase genes and isolation of two aldehyde oxidase pseudogenes in tomato. Biochim. Biophys. Acta. 1493, 337-341. Mingo, D.M. (2003). Regulation of vegetative and reproductive growth in plants exposed to partial-root zone drying. PhD thesis, University of Lancaster, UK Morison, J.I.L., Baker, N.R., Mullineaux, P.M., Davies, W.J. (2008). Improving water use in crop production. Philosophical Transaction. The Royal Society B 363: 639-658. Munné-Bosch, S., Alegre, L (2004). Die and let live: leaf senescence contributes to plant survival under drought stress. Functional Plant Biology. 31, 203-216. Nakashima, K., Kiyosue, T., Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (1997). A nuclear gene, erd1, encoding a hloroplast- targeted Clp protease regulatory subunit homolog is not only induced by water stress but also developmentally up- Literatura 110 regulated during senescence in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 12, 851- 8611. Nambara, E., Marion-Poll, A. (2005). Abscisic acid biosynthesis and catabolism. Annual Review of Plant Biology Vol. 56: 165-185 Neill, S. J., McGaw, B. A., R. Horgan (1986). Ethylene and 1-aminocyclopropane- 1- carboxylic acid production in flacca, a wilty mutant of tomato, subjected to water deficiency and pretreatment with abscisic acid. J. Exp. Bot. 37, 535-541. Ori, N., Eshed, Y., Pinto, P., Paran, I., Zamir, D., R. Fluhr (1997). TAO1, a representative of the molybdenum cofactor containing hydroxylases from tomato. J Biol Chem. 10, 1019-25. Poorter, H., Nagel, O. (2000). The role of biomass allocation in the growth responses of plant to different levels of light, CO2, nutriens and water: a quantitative review. Australian Journal of Plant Physiology 27, 595-607. Postel, S.L (1998). Water for food production: will there be enough in 2025? BioScience 48, 629–637 Prokic Lj., Jovanovic Z., Stikic R., Vucinic Z. (2005). The Mutual Effect of Extracellular Ca 2+ , Abscisic Acid, and pH on the Rate of Stomatal Closure. Biophysics from Molecules to Brain. Annal of the New York Academy of Science, Vol. 1048: 513- 516 Prokic Lj., Jovanovic Z., McAinsh R. M., Vucinic, Z., Stikic R. (2006). Species- dependent changes in stomatal sensitivity to abscisic acid mediated by external pH. Journal of Experimental Botany 57: 675-683. Prokić Lj. T. (2009). Mehanizmi i reakcije stoma u uslovima dejstva stresnih faktora. Doktorska teza. Poljoprivredni fakultet Univerziteta u Beogradu Prokic, Lj., Stikic, R. (2011). Effects of different drought treatments on root and shoot development of the tomato wild type and flacca mutant. Archives of Biological Sciences 63 (4), 1167-1171. Qin, F., Shinozaki, K. and K. Yamaguchi-Shinozaki (2011). Achievements and challenges in understanding pant abiotic stress responses and tolerance. Plant Cell Phys. (2011) doi: 10.1093/pcp/pcr106. First published online: August 9, 2011. Literatura 111 Quarrie, S. A., Whitford, P. N., Appleford, N. E., Wang, T. L., Cook, S. K., Henson, I. E., and B. R. Loveys (1988). A monoclonal antibody to (S)-abscisic acid: its characterization and use in a radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts cereal and lupin leaves. Planta, 173, 330-339. Rodrigues, M. L., Santos, P.T., Rodrigues, P. A., de Souza, R. C., Lopes, M.C., Maroco, P. J., Pereira, S. J., Chaves, M. M. (2008). Hydraulic and chemical signalling in the regulation of stomatal conductance and plant water use in .eld grapevines growing under de.cit irrigation. Functional Plant Biology 35: 565–579 Roelfsema, M.R.G., Levchenko, V., Hedrich, R. (2004). ABA depolarizes guard cell in intact plants trought a transient activation of R- and S-type anion channels.The Plant Journal 37: 578-588. Rosado, A., Amaya, I., Valpuesta, V., Cuartero, J., Botella, M. A., and O. Borsani (2006). ABA- and ethylene-mediated responses in osmotically stressed tomato are regulated by the TSS2 and TOS1 loci. J. Exp. Bot. 57, 3327-3335. Sagi, M., Fluhr, R., Lips, S.H. (1999). Aldehyde oxidase and xanthine dehydrogenase in a flacca tomato mutant with deficient abscisic acid and wilty phenotype. Plant Physiology 120: 571-577. Sakai, H., Hua, J., Chen, Q., Chang, C., Medrano, L., Bleecker, A., Meyerowitz, E. (1998) ETR2 is an ETR1-like gene involved in ethylene signaling in Arabidopsis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 95, 5812-5817. Saliendra, N.Z., Sperry J.S.,Comstock J.P. (1995). Influence of leaf water status on stomatal response to humidity, hydraulic conductance, and soil drought in Betula occidentalis. Planta 196: 357-366. Sauter, A., Davies, W.J., Hartung, W. (2001). The long-distance abscisic acid signal in the droughted plant:the fate of the hormone on its way from root to shoot. Journal of Experimental Botany 52, 1991-1997. Savić, S., Stikić, R., Savić, D., Jovanović, Z., Prokić, Lj., Srdić, M. Zdravković, J. (2003): Fiziološki efekti delimiĉnog sušenja korenova (DSK) na paradajz (Lycopersicon esculentum L.). ΧV Simpozijum Jugoslovenskog društva za fiziologiju biljaka, Vrdnik. Program i izvodi saopštenja, 104. Literatura 112 Savić, S., Fulai, L., Stikić. R., Jacobsen, S. E., Jensen, C. R., Jovanović, Z. (2009). Comparative effects of partial root-zone drying and deficit irrigation on plant growth and physiology in tomato plants. Archives of Biological Sciences 61 (4), 801-810 Schuppler, U., He, P.H., John, P.C.L., Munns, R. (1998). Effects of water stress on cell division and cell-division-cycle-2-like cell-cycle kinase activity in wheat leaves. plant Physiology 117, 667-678. Schwartz, A., Wu, W-H., Tucker, E.B., Assmann S.M. (1994). Ihibition of inwad K + channels and stomatal response by abscisic acid: An itracellular locus of phytohormone action. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 91: 4019-4023. Seo, M., Peeters, A. J., Koiwai, H., Oritani, T., Marion-Poll, A., Zeevaart, J. A., Koornneef, M., Kamiya, Y., T. Koshiba (2000). The Arabidopsis aldehyde oxidase 3 (AAO3) gene product catalyzes the final step in abscisic acid biosynthesis in leaves. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12908-12913. Shahnazari, A., Ahmadi, S.H., Laerke, P.E., Liu, F., Plauborg, F., Jacopsen, S.E., Jensen, C.R., Andersen, M.N. (2008). Nitrogen dynamics in the soil-plant system under deficit and partial root-zone drying irrigation strategies in potatoes. European Journal of Agronomy 28, 65-73. Shang, S.I., Ma, L.G., Zhang, H.L., He, R.R., Wang, X.C., Cui, S.J., Sun, D.Y. (2005). Ca 2+ influx in to the Lily pollen grains throught a hyperpolariyation-activated Ca 2+ -permeable channel which can be regulated by extracellular CaM. Plant Cell Physiology 46: 598-608. Sharp, R.E., Davies, W.J. (1989). Regulation of growth and development of plants growing with a restriced supply of water. In Plants Under Stress (eds H.G. Jones, T.L. Flowers and M.B. Jones), pp. 71-93. Cambridge University Press, Cambridge, UK. Sharp, R. E., LeNoble, M., Else, M. A., Thorne, E. T., F. Gherardi (2000). Endogenous ABA maintains shoot growth in tomato independently of effects on plant water balance: evidence for an interaction with ethylene. J. Exp. Bot. 51, 1575-1584. Sharp, R.E. (2002). Interaction with ethylene: changing views on the role of abscisic acid in root and shoot growth responses to water stress. Plant Cell Environ 25: 211–222 Literatura 113 Sharp, R.E., Poroyko, V., Hejlek, J.G., Spollen, W.G., Springler, G.K., Bohnert, H.J., Nguyen, H. (2004). Root growth maintenance during water deficits: physiologyto functional genomics. Journal of Experimental Botany 55, 2343-2352. Shen, Y.Y., Wang, X.F., Wu, F.Q., Du, S.Y., Cao, Z., Shang, Y., (2006). Mg-helatase H subunit is an abscisic acid receptor. Nature 443: 823-826. Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K., Seki, M. (2003). Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses. Current Opinion in Plant Biology 6: 410-417. Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K. (2007). Gene networks involved in drought stress response and tolerance. Journal of Experimental Botany, 58, 221–227 Simpson, S.D, Nakashima, K., Narusaka, Y., Seki, M., Kasuga, M., Kobayashi, M., Yamaguchi-shinozaki, K., Shinozaki, K. (2003). Two different novel cis-acting elements of erd1, a clpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration and dark-induced senescence. The plant Journal 33,259-270 Sobeih, W.Y., Dodd, I.C., Bacon, M.A., Grierson, D., Davies, W.J. (2004). Long- distance signals regulating stomatal conductance and leaf growth in tomato (Lycopersicon esculentum) plants subjected to partial root-zone drying. Journal of Experimental Botany 55, 2353-2363. Spasova, D., Popović, T., Jovanović, O. (1997). Occurrence of semi-arid areas in the territory of FR Yugoslavia as a possible consequence of global climate changes. In: Proceedings of International Symposium Drought and Plant Production. (S. Jevtić., S. Pekić, eds.), 2, 111-116. Stikić, R., Popović, S., Srdić, M., Savić, D., Jovanović, Z., Prokić, Lj., Zdravković, J. (2003). Partial root drying (PRD): a new technique for growing plants that saves water and improves the quality of fruit. Bulg. J. of Plant Physiology, Special Issue, 164-171. Stikic, R., Savic, S., Jovanovic, Z., Jacobsen, SE., Liu, F., Jensen, C.R. (2010). Deficit irrigation strategies: use of stress physiology knowledge to increase water use efficiency in tomato and potato. In: Horticulture in 21st Century, Series: Botanical Research and Practices. (Eds.) A.N. Sampson, Nova Science, Publishers, NY, USA. ISBN: 978-1-61668-582-9, pp. 161-178. Literatura 114 Stoll, M., Loveys, B., Dry, P. (2000). Hormonal changes induced by partial root zone drying of irrigated grapevine. Journal of Experimental Botany 51: 1627-1634 Sugiyama, M., Komamine, A. (1990). Transdifferantiation of quiescent parenchymatous cells into tracheary elements. Cell Differentiation and Development 31, 77-87. Tal, M., Imber, D., Erez, A., Epstein, E. (1979). Abnormal stomatal behavior and hormonal imbalance inflacca, a wilty mutant of tomato. V. Effect of abscisic acid on indoleacetic acid metabolism and ethylene evolution, Plant Physiol. 63, 1044- 1048. Takaĉ, A., Gvozdenović, Đ., Bugarski, D., Ĉervenski, J. (2007). Savremena proizvodnja paradajza. Zbornik radova Instituta za ratarstvo i povrtarstvo, 43, (1) 269-281. Taylor, I.B., Linforth, R.S.T., Al-Naieb, R.J. Bowman, W.R., Marples, B.A. (1988). The wilty tomato mutants flacca and sitiens are imparied in oxidation of ABA- aldehyde to ABA. Plant Cell and Environment 11: 739-745. Thompson, A. J., Jackson, A. C., Parker, R. A., Morpeth, D. R., Burbidge, A., I. B. Taylor (2000). Abscisic acid biosynthesis in tomato: regulation of zeaxanthin epoxidase and 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase mRNA by light/dark cycles, water stress and abscisic acid. Plant Mol. Biol. 42, 833-845. Tieman, D. M., Ciardi, J. A., Taylor, M. G., H. J. Klee (2001). Members of the tomato LeEIL (EIN3-like) gene family are functionally redundant and regulate ethylene responses throughout plant development. Plant J. 26, 47–58. Topcu, S., Kirda, C., Dasgan, Y., Kaman, H., Cetin, M., Yazici, A., Bacon, M.A. (2006). Yield response an N-fertiliser recovery of tomato grown under deficit irrigation. Europ. J. Agron. 26, 64-70. Topcu, S., Kirda, C., Dasgan, Y., Kaman, H., Cetin, M., Yazici, A., Bacon, M.A. (2007). Yield response and N-fertiliser recovery of tomato grown under deficit irrigation. European Journal of Agronomy 26, 64–70. Tran, L.S.P, Nakashima, K., Sakuma, Y., Simpson, S.D., Fujita, Y., Maruyama, K., Fujita, M., Seki, M., Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K. (2004). Izolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transkription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter. The Plant Cell 16,2481-2948. Literatura 115 Trewavas, A. J., H. G. Jones (1991). An assessment of the role of ABA in plant development, In: Abscisic acid: physiology and biochemistry, (Eds. W. J. Davies, and H.G. Jones), 169-188. Bios, Oxford Trouverie, J., The`venot, C., Rocher, J.P., Sotta, B., Prioul, J.L. (2003). The role of abscisic acid in the response of a specific vacuolar invertase to water stress in the adult maize leaf. Journal of Experimental Botany 54, 2177-2186. Tuteja, N., Sopory, S.K. (2008). Chemical signaling under abiotic stress environment in plants. Plant Signaling & Behavior, 3:8, 525-536 Tyerman, S.D., Niemetz, C.M., Bramley, H. (2002). Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell and Environment 25, 173-194 Uno, Y., Furihata T., Abe, H., Yoshida, R., Shinozaki, K., Yamaguchi-Shinozaki, K. (2000). Arabidopsis basic leucine zipper trnskriptional transkription factors involved in an abscisic acid-dependent signal transduction pathway under drought and high- salinity conditions. Proceedings of the National Academy of Science,USA 97,11632-11637. van Schilfgaarde, J. (1994). Irrigation-a blessing or a curse. Agric. Water Mgmt. 25, 203– 219. Van Volkenburgh, E., Davies, W.J. (1983). Inhibition og light-stimulated leaf expansion by abscisic acid. Journal of Experimental Botany 34, 835-845. Verslues, P.E. Agarwal, M., Katiyar-Agarwal, S., Zhu J., Zhu J-K. (2006) Methods and concepts in quantifying resistance to drought, nsalt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status The Plant Journal 45, 523–539 Vierling, E. (1991). The roles of heat schock proteins in plants. Annu. Rev. Plant Physiol Plant Mol. Biol. 42: 579-620. Viets, Jr., F., (1972). Water deficits and nutrient availability. In: Kozlowski, T. (Ed.), Water Deficits and Plant Growth. Academic Press, New York. Wakabayashi, K., Sakurai, H., Kuraishi, S. (1991). Effects of abscisic acid on the synthesis of cel-wall polysaccharides in segments of etiolated squash hypocotyl. II. Levels of UDP-neutral sugars. Plant and Cell Physiology 32, 427-432. Literatura 116 Wang, X-F., Zhang, D-P. (2008). Abscisic acid receptors: multipe signal-perception sites. Annals of Botany 101: 311-317 Wang, H.Q, Liu, F.L, Andersen, M.N, Jensen, C.R. (2009). Comparative effectscomparative of partial root-zone drying and deficit irrigation on nitrogenuptake in potatoes (Solanum tuberosum L.) Irrigation Science 27, 443–448. Wang, Y.S., Liu F.L., de Neergaard, A., Jensen, L.S, Luxhø, J., Jensen, C.R. (2010). Alternate partial root-zone irrigation induced dry/wet cycles of soils stimulate N mineralization and improve N nutrition in tomatoes. Plant and Soil 337, 167–177 Wasilewsk, A., Vlad, F., Sirichandra, C., Redob, Y., Jammes, F., Valon, C., Frei dit Frey, N., Leungal, J. (2008). An update on abscisic acid signaling in plants and more… Molecular Plant 1: 198-217. Wilkinson, S., Davies, W.J. (1997). Xylem sap pH increase: A drought signal received at the apoplastic face of the guard cell which involves saturable ABA uptake by the epidermal symplast. Plant Physiology 117, 703-710. Wilkinson, S., Corlett, J.E., Oger, L., Davies, W.J. (1998). Effect of xylem sap on transpiration from wild type and flacca tomato leaves: a vital role for abscisic acid in preventing excessive water loss even from well-watered plants. Plant Physiology 117: 703-709. Wilkinson, S. (1999). pH as a stress signal. Journal of Plant Growth Regulation 29, 87- 99 Wilkinson, S., Davies, W.J. (2002). ABA-based chemical signaling: the co-ordination of responses to stress in plants. Plant Cell and Environment 25: 195-210. Wilkinson, S., Bacon, M.A., Davies, W.J. (2007). Nitrate signaling to stomata and growing leaves: interactions with soil drying, ABA, and xylem sap pH in maize. Journal of Experimental Botany 58, 1705–1716. Wilkinson, S., Hartung, W. (2009). Food production: reducing water consumption by manipulating long-distance chemical signalling in plants. Journal of Experimental Botany, 60, (7) 1885–1891 Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (1994). A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low temperature, or high-salinity stress. The Plant Cell 6, 251-264. Literatura 117 Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (2005). Organization of cis-acting regulatory elements in osmotic- and cold-stress-responsive promoters. Trends in Plant Science 10,88-94. Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (2007). Gene networks involved in drought stress response and tolerance. Journal of Eksperimental Botany 58, 221-227. Yang, S.F., Hoffman, N.E. (1984). Ethylene biosynthesis and its regulation in higher plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 35: 155-189 Zegbe-Domínguez, J.A., Behboudian, M.H., Lang, A., Clothier, B.E. (2003). Deficit irrigation and partial rootzone drying maintain fruit dry mass and enhance fruit quality in “Petopride” processing tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). Scientia Horticulturae 98, 505-510. Zegbe-Domínguez, J.A., Behboudian, M.H., Clothierm B.E. (2006). Responses of “Petopride” processing tomato to partial rootzone drying at different phenological stages. Irrig. Sci. 24, 203-210. Zhang, J., Davies, W.J (1987). Increased synthesis of ABA in partially dehydrated root tips and ABA transport from roots to leaves. Journal of Experimentaly Botany 38: 2015-2023 Zhang, J., Davies, W.J. (1989). Abscisic acid produced in dehydrating root may enable plant to measure the water status of the soil. Plant Cell and Environment 12: 73- 81. Zhang, J., Davies, W.J. (1989b). Sequentional response of whole plant water relations towards prolonged soil drying and the mediation by xylem sap ABA concentration in the regulation of stomatal behavior of sunflower plants. New Phytologist 113: 167-174. Zobel, R.W., Roberts, L.W. (1978). Effects of low concentrations of ethylene on cell division and cytodifferentiation in lettuce pith explants. Canadian Journal of Botany 56, 987-990. BIOGRAFIJA Ana Milosavljević roĊena je 22. 06. 1981. godine u Kranju, u Sloveniji. Osnovnu školu završavala je u Kranju, Beogradu, Nišu i Paraćinu. IX Gimnazuju „Mihajlo Petrović-Alas“ upisala je 1996. godine, a završila 2000. godine sa odliĉnim uspehom. Biološki fakultet u Beogradu upisala je 2000. godine, smer biologija, a diplomirala u roku februara 2006. godine sa proseĉnom ocenom 9.09. Nakon toga, 2006. godine upisala je doktorske studije na Biološkom fakultetu u Beogradu na smeru Eksperimentalna i primenjena botanika, modul Fiziologija i molekularna biologija biljaka. U periodu 2007-2011 godina bila je stipendista Ministarstva za prosvetu i nauku Republike Srbije. Bila je polaznik seminara, a kasnije i saradnik, u istraţivaĉkoj stanici Petnica. U periodu 2007-2010 je uĉestvovala u realizaciji meĊunarodnog projekta EU FP6-2004-INCO-WBC-SSA-3: „A Centre for Sustainable Crop-Water management (CROPWAT)“, u okviru kojeg je bila polaznik PCR kursa u Warrington-u, u januaru 2008, organizovanog od strane Applied Biosystem (UK). Uĉestvovala je u realizaciji dva nacionalna projekta finansirana od strane Ministarstva za prosvetu i nauku Republike Srbije i to: 1. TR 21027 - „Multidisciplinarni pristup upravljanja vodom za potrebe proizvodnje zdravstveno-bezbedonosne hrane i ublaţavanja efekata suše u poljoprivredi“ (period 2008-2010) i 2. TR 31005 - „Savremeni biotehnološki pristup rešavanja problema suše u poljoprivredi Srbije“ (period 2011-2014). Dobitnik je nagrade za najbolji poster na IX Simpozijumu društva za fiziologiju biljaka Srbije. Ĉlan je društva za fiziologiju biljaka Srbije.