UNIVERZITET U BEOGRADU BIOLOaKI FAKULTET <ƐĞŶŝũĂ͘sĞůŝēŬŽǀŝđ ˃ZE^/:ZsK:/ HIPERPLAZIJE MRKOGMASNOG TKIVA doktorska disertacija Beograd, 2012. UNIVERSITY OF BELGRADE FACULTY OF BIOLOGY <ƐĞŶŝũĂ͘sĞůŝēŬŽǀŝđ TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF BROWN ADIPOSE TISSUE HIPERPLASIA AND DEVELOPMENT Doctoral Dissertation Belgrade, 2012. KOMISIJA ZA ODBRANU DOKTORSKE DISERTACIJE MENTORI: GU$OHNVDQGUD.RUDü, redovni profesor Bioloãki fakultet, Univerzitet u Beogradu ________________________________________ GU$OHNVDQGUDýYRURYLãLQDXþQLVDUDGQLN ,QVWLWXW]DELRORãNDLVWUDåLYDQMDÄ6LQLãD6WDQNRYLü³ Univerzitet u Beogradu LVWUDåLYDþ7KH0HWKRGLVW+RVSLWDO5HVHDUFK,QVWLWXWH Department of Genomic Medicine, Houston, Texas, USA ________________________________________ ý/$129,.20,6,-( GU%DWR.RUDü, vanredni profesor Bioloãki fakultet, Univerzitet u Beogradu QDXþQLVDYHWQLN ,QVWLWXW]DELRORãNDLVWUDåLYDQMDÄ6LQLãD6WDQNRYLü³ Univerzitet u Beogradu ________________________________________ GU%LOMDQD6UGLü, docent Medicinski fakultet, Univerzitet u Novom Sadu ________________________________________ DATUMODBRANE: ________________________________________ ZAHVALNICA 2YD GRNWRUVND GLVHUWDFLMD XUDÿHQD MH X RNYLUX SURMHNWD   Ä%HOR LLOL PUNR]QDþDMPDVQRJWNLYDXRGUåDYDQMXXNXSQHUHGRNV]DYLVQHPHWDEROLþNHNRQWUROHX IL]LRORãNLP DGDSWDFLMDPD LPHWDEROLþNLP SRUHPHüDMLPD³ NRML MH ILQDQVLUDQ RG VWUDQH 0LQLVWDUVWYDSURVYHWHLQDXNH5HSXEOLNH6UELMHQD.DWHGUL]DELRORJLMXüHOLMDLWNLYDSUL Centru za elektronsku mikroskopiju, Bioloãkog fakulteta Univerziteta u Beogradu i u ODERUDWRULML2GHOMHQMD]DIL]LRORJLMX,QVWLWXWD]DELRORãNDLVWUDåLYDQMD³6LQLãD6WDQNRYLü³ u Beogradu. Ovom prilikom åelim da se zahvalim:  3URIGU$OHNVDQGUL.RUDüPHQWRUXNRMDPH MHQHVHELþQRXYHODXVYHWüHOLMVNH biologije, na ukazanom poverenju, prenetom znanju i iskustvima tokom mog LVWUDåLYDþNRJUDGDNDRLVXJHVWLMDPDWRNRPXREOLþDYDQMDRYHGLVHUWDFLMH  'U$OHNVDQGULýYRUR]DVYXSRPRü LVDYHWHNDNRX LVWUDåLYDþNRPUDGX WDNR L pri pisanju doktorske disertacije;  3URIGU%DWX.RUDüXQDVXJHVWLMDPDNRMHVXPLSRPRJOHGDUHãLPQHGRXPLFH koje su se javljale tokom istraåivanja;  'U%LOMDQL6UGLü]DVWUXþQXSRGUãNXSULOLNRPL]UDGHRYHGLVHUWDFLMH  'U%LOMDQL%X]DGåLü]DVYXSRPRüLVDYHWHXLVWUDåLYDþNRPUDGX Prof. dr Vesni Koko, za prve korake koji su mi otvorili vrata nauke. 7RNRPL]UDGHGLVHUWDFLMH LPDODVDPSRGUãNX LSRPRüPRMLKGUDJLKNROHJLQLFDNROHJH sa kojima sam ovih godina delila dobro i zlo. Zato se zahvaljujem:  'U0LOLFL0DUNHOLüQDQHVHELþQRMGUXJDUVNRMSRPRüLLRãWURPRNXNRMHPQLãWD ne moåe da promakne;  +YDOD9HVQL$QL$OHNVDQGUL,JRUXL0LOLFL9XþHWLü]DVYXSRPRüRGSUYLKGDQD PRJODERUDWRULMVNRJUDGDSDGRGDQDVNDRL]DSRPRüSULSLVDQMXGLVHUWDFLMH  %LROR]LPD &HQWUD ]D HOHNWURQVNX PLNURVNRSLMX $QLWL /D]DUHYLü L 0DML %RJGDQRYLü]DSRPRüXSULSUHPLLL]UDGLHOHNWURQPLNURJUDILMD Hvala mojoj porodici na svemu ãto smo zajedno proãli. Velji i Leni na ljubavi i strpljenju - hvala ãto postojite. TRANSKRIPCIONA REGULACIJA RAZVOJA I HIPERPLAZIJE MRKOG MASNOG TKIVA REZIME Mrko masno tkivo (engl, brown adipose tissue, BAT) je specijalizovano ]D SURGXNFLMX WRSORWH ]DKYDOMXMXþL SULVXVWYX GHNXSOXMXþHJ SURWHLQD (engl. uncoupling protein 1, UCP1) koji se nalazi u unutraånjoj membrani mitohondrija. Kada je stimulisano, BAT se transformiåe iz QHDNWLYQRJ GRUPDQWQRJ REOLND X KLSHUSODVWLĀQL WHUPRJHQR DNWLYQL RUJDQ ,]ODJDQMH KODGQRþL GRYRGL GR ELRKHPLMVNLK PRUIRORåNLK L FLWRORåNLK SURPHQD X WNLYX 3RYHþDYD VH HNVSUHVLMD 8&3 VLQWH]D proteina i DNK, kao i proces biogeneze mitohondrija i peroksizoma. 3RUHGWRJD LQGXNFLMD WHUPRJHQH]HGRYRGLGRSRYHþDQMDPDVH%$7SUH VYHJDQDUDĀXQQMHJRYHKLSHUSOD]LMH3URFHVDGLSRJHQH]HXVNRSRYH]DQ sa procesom angiogeneze se odvija kroz nekoliko stupnjeva i SRGUD]XPHYDSUROLIHUDFLMXLGLIHUHQFLMDFLMXSUHNXVRUVNLKþHOLMDSULVXWQLK u BAT. Sve navedene promene su pod kontrolom mreçe transkripcionih faktora koji koordiniåu ekspresiju brojnih proteina odgovornih za stvaranje krajnjeg fenotipa mrkih adipocita. Iako su do sada LGHQWLILNRYDQL EURMQL WUDQVNULSFLRQL IDNWRUL XNOMXĀHQL X SURFHV KLSHUSODVWLĀQRJRGJRYRUDQHPDGRYROMQRSRGDWDNDRQMLKRYRMHNVSUHVLML WRNRP UDQLK ID]D L]ODJDQMD KODGQRþL &LOM RYRJ LVWUDçLYDQMD MH ELR GD utvrdi molekulske mehanizme koji se nalaze u osnovi procesa aktivacije %$7WUDQVNULSFLRQHIDNWRUHLSURWHLQHXNOMXĀHQHXUDQHID]HSUROLIHUDFLMH L GLIHUHQFLMDFLMH %$7 NRG SDFRYD L]ODJDQLK KODGQRþL NDR L WRNRP X razvoja humanog BAT u fetalnom periodu. U tu svrhu, pacovi soja Mill Hill su podeljeni u sedam eksperimentalnih grupa, od kojih je jedna bila NRQWUROQDGRNMHSUHRVWDOLKåHVWL]ODJDQRKODGQRþL “qC) u periodu od 3, 6, 12, 24, 48 i 72 sata. Interskapularni depo BAT pacova je izolovan i pripremljen za RT-PCR i Western blot analizu, svetlosnu i elektronsku mikroskopiju. Za ispitivanje ekspresije transkripcionih faktora i SURWHLQDXNOMXþHQLKX UD]YRM%$7ĀRYHNDNRULåþHQL VXX]RUFLKXPDQLK fetusa starosti XV-XXIII nedelje, pripremljeni za Western blot analizu, svetlosnu i elektronsku mikroskopiju. Rezultati su pokazali da se u RVQRYL SRYHþDQMD PDVH WNLYD QDMYHþLP GHORP QDOD]L KLSHUSOD]LMD SUHNXUVRUVNLK L HQGRWHOVNLK þHOLMD L GD MH RYDM SURFHV SRG VWURJRP kontrolom transkripcionih faktora. äta viåe, pokazana je stogo NRRUGLQLVDQDHNVSUHVLMDNOMXĀQLKUHJXODWRUDWHUPRJHQRJRGJRYRUDUCP1, 33$5DŽ engl. SHUR[LVRPH SUROLIHUDWRUDFWLYDWHG UHFHSWRU DŽ  L 3*&ǂ (engl. 33$5DŽFRDFWLYDWRU ǂ) u BAT pacova i humanih fetusa. Pored WRJD XRĀHQD MH VLQKURQL]DFLMD JHQVNH L SURWHLQVNH HNVSUHVLMH UHJXODWRUQLK SURWHLQD SURFHVD DGLSR L DQJLRJHQH]H åWR MH SUDþHQR RGJRYDUDMXþLP VWUXNWXUQLP SURPHQDPD WNLYD 6YH QDSUHG QDYHGHQH SURPHQH SUDþHQH VX XOWUDVWUXNWXUQLP SURPHQDPD YDQþHOLMVNRJ matriksa u FLOMXRPRJXþDYDQMDUDVWDWNLYD ./-8ÿ1( 5(ÿ, PUNR PDVQR WNLYR KLSHUSOD]LMD KODGQRþD transkripcioni faktori, adipogeneza, angiogeneza 1$8ÿ1$2%/$67 BIOLOGIJA 8æ$1$8ÿ1$2%/$67%,2/2*,-$ý(/,-$,7.,9$ UDK BROJ: 57.052:[591.134:591.82](043.3) TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF BROWN ADIPOSE TISSUE HIPERPLASIA AND DEVELOPMENT Abstract Brown adipose tissue (BAT) is highly specialized mammalian organ and is more abundant in hibernating, cold-acclimated and newborn mammals, where it plays key role in thermogenesis. The BAT function is related to uncoupling protein 1 (UCP1), located in the inner mitochondrial membrane. Cold expossure activates sympathetic nervous system which triggers BAT thermogenic program. This complex process on biochemical, morphological and cell levels includes: increased UCP1 expression, precursor cells proliferation and differentiation, mitochondrial and peroxisomal biogenesis, and angiogenesis. Those events rapidly transform „dormant“ tissue into a hyperplastic, active adipose organ. All changes are controled by numerous transcription factors which coordinate expression of many proteins responsible for acquiring of mature brown adipocyte phenotype. The aims of this study were to determine the molecular mechanisms that underlie the process of BAT activation, transcription factors and proteins involved in the early stages of proliferation and differentiation in rats exposed to cold, as well during BAT development. Mill Hill rats were exposed to cold (4±1 °C) for 3, 6, 12, 24, 48 and 72 hours. Interscapular BAT was isolated and prepared for qRT-PCR, Western blot analisys, light and transmision electron microscopy. To study the expression of transcription factors and proteins involved in BAT development, tissue samples from human fetuses XV-XXIII weeks old were prepared for Western blot analisys, light and transmision electron microscopy. The result showed that BAT hiperplastic response is based on the proliferation of brown adipocyte precursors and endothelial cells, and that this process is under tight control of many transcription factors. Morever, this process is strongly coordinated by H[SUHVVLRQRINH\UHJXODWRUVRI%$7WKHUPRJHQLFUHVSRQV8&333$5DŽ SHUR[LVRPH SUROLIHUDWRU DFWLYDWHG UHFHSWRUDŽ  DQG 3*&ǂ 33$5DŽ FRDFWLYDWRUǂ  LQ ERWK UDWV DQG KXPDQ %$7 ,Q DGGLWLRQ WKHUH LV evident synchronization of gene and protein expression involved in adipogenesis and angiogenesis with ultrastructural changes observed in the tissue. All of the above changes were followed by structural changes of extracellular matrix, to ensure proper tissue growth and expansion. Taken together, the results show that BAT amazing plasticity which enables rapid tissue termogenic response is strongly controlled by transcription factors network in both, cold-induced BAT hyperplasia and fetal BAT development. KEY WORDS: brown adipose tissue, hyperplasia, cold, transcription factors, adipogenesis, angiogenesis SCIENTIFIC FIELD: BIOLOGY SPECIAL TOPICS: CELL AND TISSUE BIOLOGY UDC NUMBER: 57.052:[591.134:591.82](043.3) SADRæAJ 1. UVOD 1 1.1. STRUKTURA I FUNKCIJA MRKOG MASNOG TKIVA 1 1.2. TRANSKRIPCIONA REGULACIJA ADIPOGENEZE 7 267$/,)$.725,8./-8ÿ(1,8$',32*(1(=8 12 1.4. POREKLO MRKIH ADIPOCITA 13 05.20$6127.,92ÿ29(.$ 13 2. CILJ ISTRAæIVANJA 17 3. MATERIJAL I METODI 18 3.1. PLAN EKSPERIMENTA 18 0RGHOKLSHUSOD]LMH%$7SDFRYDLQGXNRYDQHKODGQRþRP 18 +LSHUSOD]LMD%$7ĀRYHNDWRNRPIHWDOQRJrazvoja 19 3.2. RTï3&5$1$/,=$7.,9$ 19 3.2.1. Priprema tkiva za RTï3&5 19 3.2.2. RTï3&5XUHDOQRPYUHPHQX 20 6WDWLVWLĀNDREUDGDUH]XOWDWDGRELMHQLK57ï3&5DQDOL]RP 21 3.3. WESTERN BLOT ANALIZA TKIVA 22 3.3.1. Priprema tkiva za Western blot 22 2GUHāLYDQMHNRQFHQWUDFLMHSURWHLQD 23 3.3.3. Elektroforeza proteina 23 3.3.4. Western blot 24 3.3.5. Detekcija proteina nakon Western blota 24 3.3.6. Kvantifikacija rezultata dobijenih Western blot analizom i VWDWLVWLĀNDREUDGDUH]XOWDWD 25 3.4. ANALIZA TKIVA NA NIVOU SVETLOSNE MIKROSKOPIJE 26 3.4.1. Priprema tkiva za svetlosnu mikroskopiju 26 3.4.2. Imunohistohemijska tehnika detektovanja proteina streptavidin-biotin metodom 26 3.4.3. Imunohistohemijska tehnika detektovanja i kolokalizacije proteina fluorescentno-obeleçenim antitelima 27 .YDQWLILNDFLMDLVWDWLVWLĀNDREUDGDUH]XOWDWDNRORNDOL]DFLMH proteina 28 3.5. ANALIZA TKIVA NA NIVOU TRANSMISIONE ELEKTRONSKE MIKROSKOPIJE (TEM) 28 3.5.1. Priprema tkiva za TEM 28 3.5.2. Imunocitohemijska metoda detekcije proteina (imunogold metoda) na nivou TEM 29 4. REZULTATI 30 $1,0$/1,02'(/,=/$*$1-$+/$'12ý, 30 4.1.1. (IHNDWL]ODJDQMDKODGQRþLQDWHUPRJHQLNDSDFLWHW%$7L mitohondriogenezu 30 4.1.1.1. Ekspresija UCP1 u BAT 30 .ROLĀLQD8&3L51. 30 .ROLĀLQD8&3SURWHLQD 30 4.1.1.1.3. Imunohistohemijska detekcija UCP1 31 4.1.1.2. Imunohistohemijska detekcija noradrenalina 32 (NVSUHVLMD33$5DŽX%$7 36 .ROLĀLQD33$5DŽL51. 36 .ROLĀLQD33$5DŽSURWHLQD 36 4.1.1.4. Ekspresija PGC-ǂX%$7 36 .ROLĀLQD3*&-ǂL51. 36 .ROLĀLQD3*&-ǂSURWHLQD 38 4.1.1.5. Ultrastrukturna analiza mitohondriogeneze u mrkim adipocitima 38 .ROLĀLQDPW'1. 41 .ROLĀLQD'USSURWHLQD 41 .ROLĀLQD0IQSURWHLQD 41 .ROLĀLQD15)SURWHLQD 43 4.1.2. (IHNDWL]ODJDQMDKODGQRþLna proliferaciju i GLIHUHQFLMDFLMXþHOLMDDGLSRJHQRJSXOD 43 (NVSUHVLMD&(%3ǂ 43 .ROLĀLQD&(%3ǂL51. 43 (NVSUHVLMD33$5Dž 44 .ROLĀLQD33$5DžL51. 44 4.1.2.3. Ekspresija PCNA 45 .ROLĀLQD3&1$SURWHLQD 45 4.1.2.3.2. Imunohistohemijska detekcija PCNA 45 4.1.2.4. Ekspresija Ki-67 46 4.1.2.4.1. Imunohistohemijska detekcija Ki-67 46 4.1.2.5. Ekspresija FABP4 49 .ROLĀLQD)DESL51. 49 4.1.2.6. Ekspresija Myf5 49 .ROLĀLQD0\IL51. 49 4.1.2.7. Ekspresija BMP7 49 .ROLĀLQD%03L51. 49 .ROLĀLQD%03SURWHLQD 51 4.1.2.7.3. Imunohistohemijska detekcija BMP7 51 4.1.2.8. Ekspresija BMP4 53 .ROLĀLQD%03L51. 53 4.1.2.9. Ekspresija KLF9 53 .ROLĀLQD./)L51. 53 4.1.2.10. Ekspresija KLF15 54 .ROLĀLQD./)L51. 54 4.1.2.11. Ultrastrukturna analiza proliferacije i diferencijacije mrkih adipocita 55 4.1.3. (IHNDWL]ODJDQMDKODGQRþLQDDQJLRJHQH]X%$7 60 4.1.3.1. Ekspresija VEGF 60 .ROLĀLQD9(*)L51. 60 .ROLĀLQD9(*)SURWHLQD 61 4.1.2.7.3. Imunohistohemijska detekcija VEGF 61 4.1.3.2. Ekspresija endoglina 63 .ROLĀLQDL51.]DHQGRJOLQ 63 4.1.3.3. Ultrastrukturna analiza angiogeneze u BAT 63 4.2. RAZVOJ HUMANOG FETALNOG BAT 66 4.2.1. Ultrastrukturna analiza humanog fBAT 66 4.2.2. Termogeni kapacitet humanog fBAT 69 4.2.2.1. Imunohistohemijska detekcija UCP1 69 .ROLĀLQDSURWHLQD8&3 69 4.2.2.3. Imunohistohemijska detekcija noradrenalina 70 4.2.3. Regulatori diferencijacije i mitohondriogeneze humanog fBAT 71 4.2.3.ROLĀLQDSURWHLQa 33$5DŽ 71 .ROLĀLQDSURWHLQa PGC-ǂ 71 4.2.4. Regulatori strukturnog i funkcijskog razvoja humanog fBAT 72 4.2.4.1. Estrogenski receptori 72 .ROLĀLQDSURWHLQa (5ǂL(5ǃ 72 4.2.4.1.2. Imunohistohemijska detekcLMD(5ǂL(5ǃ 72 ,PXQRFLWRKHPLMVNDGHWHNFLMD(5ǂL(5ǃ 73 .RORNDOL]DFLMD(5ǂL(5ǃ 75 .RORNDOL]DFLMD(5L33$5DŽ 75 4.2.4.1.6. Kolokalizacija ER i PGC-ǂ 75 4.2.4.2. Imunohistohemijska detekcija BMP7 77 5. DISKUSIJA 78 5.1. TERMOGENI ODGOVOR BAT PRILIKOM IZLAGANJA +/$'12ý, 78 ,1'8.&,-$352/,)(5$&,-(,',)(5(1&,-$&,-(ý(/,-$ ADIPOGENOG PULA 82 5.3. INDUKCIJA ANGIOGENEZE U BAT 87 5.4. HUMANO FETALNO BAT 90 5.4.1. Uloga ER u razvoju humanog fBAT 90 5.4.2. Termogeni kapacitet humanog fBAT 92 =$./-8ÿ&, 95 7. LITERATURA 97 PRILOG – 63,6$.6.5$ý(1,&$ I BIOGRAFIJA AUTORA II 11. UVOD 1.1. STRUKTURA I FUNKCIJA MRKOG MASNOG TKIVA Mrkom masnom tkivu (engl. brown adipose tissue, BAT) od kada MH SUYL SXW RSLVDQR *HVVQHU   SULSLVLYDQH VX UD]OLĀLWH XORJH VPDWUDQMHGHORPWLPXVDHQGRNULQLPRUJDQRPLRUJDQRPNRMLXĀHVWYXMH u formiranju krvi. Na osnovu njegove mikroskopske strukture, BAT je okarakterisan kao modifikovana vrsta belog masnog tkiva (engl. white adipose tissue, WAT) ili endokrini organ (Johanson, 1959; Smith i +RUZLW]  $I]HOLXV   5D]OLĀLWH IL]LRORåNH XORJH NRMH VX pripisivane BAT tokom godina razlog su åto je smatrano KLEHUQLUDMXþRP LQWHUVNDSXODUQRP OLSRLGQRP çOH]GRP L ĀDN primitivnim masnim tkivom (Rial i Gonzales-Barroso, 2001). Sredinom dvadesetog veka jasno je pokazana sposobnost BAT da aktivno produkuje toplotu (Smith i Hock, 1963) i time ustanovljena njegova primarna funkcija u odrçavanju telesne temperature, a takva produkcija toplote nazvana je termogeneza bez drhtanja. Neåto kasnije, SRND]DQR MHGD%$7PRçHSURGXNRYDWL WRSORWXQDNRQXQRVDRGUHāHQLK YUVWDLNROLĀLQDKUDQHLWDNRXĀHVWYRYDWLXRGUçDQMXWHOHVQHPDVH 6WRFN 1989). Noviji podaci su objedinili sve karakteristike BAT kroz istoriju SURXĀDYDQMDLRNDUDNWHULVDOLJD]DMHGQRVD:$7 Slika 1) kao jedinstveni DGLSR]QL RUJDQ &LQWL  2YDNDYQD]LY MH QDQHNL QDĀLQ RSUDYGDQ LPDMXþLXYLGXGD%$7QHVDPRGDLPDVSRVREQRVWGDGHSRQXMHOLSLGH YHþ MH L]X]HWQR SURNUYOMHQ LPD XORJX HQGRNULQRJ RUJDQD L KLVWRORåNL posmatrano, jednim delom jeste modifikovano WAT åto se jasno vidi NUR]SURFHVWUDQVGLIHUHQFLMDFLMHDGLSRFLWD /RQĀDU&LQWL  %$7MHSULVXWDQNRGKLEHUQDWRUDPDOLKVLVDUDL]ODJDQLKKODGQRþLL OMXGL X UDQRPSRVWQDWDOQRPSHULRGX.RGPDOLK çLYRWLQMD XNOMXĀXMXþL Uvod 2 SDFRYH%$7RSVWDMH WRNRPĀLWDYRJ çLYRWDGRNNRGĀRYHNDQDMYHþLGHR BAT podleçe ultrastrukturnim i molekulskim promenama, akumulira lipide i transformiåe se u WAT. Slika 1. Lokalizacija WAT i BAT kod pacova.,]ODJDQMHKODGQRþLGRYRGLGRSURPHQH PDVH L RERMHQRVWL DGLSR]QRJ RUJDQD QD UDĀXQ SRYHþDQMD PLWRKRQGULMD L YHOLNH prokrvljenosti BAT. Modifikovano iz: Cinti, 2009. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297: 977-86. %$7 VH RGOLNXMH GLQDPLĀQRP VWUXNWXURP L L]X]HWQRP SODVWLĀQRåþX åWR VH QDMEROMH YLGL NDGD VH WNLYR VWLPXOLåH KODGQRþRP 1DLPH SUL L]ODJDQMX KODGQRþL GROD]L GR SRYHþDQMD PDVH %$7 L stimulacije njegove termogene funkcije. U naåim prethodnim radovima %X]DGçLþ L VDU  3HWURYLþ L VDU D  DOL L UDGRYLPD GUXJLK DXWRUD %XNRZLHFNL L VDU   SRND]DQR MH GD L]ODJDQMH KODGQRþL WRNRPVDWDSRYHþDYDPDVXWNLYDSURFHQDWD Slika 2). Uvod 3 Slika 2. +LSHUSOD]LMD %$7 LQGXNRYDQD KODGQRþRP. BAT se odlikuje izuzetnom SODVWLĀQRåþXNRMDVHRJOHGDXEU]RMLLQWHQ]LYQRMLQGXNFLMLSUHNXUVRUVNLKþHOLMDWRNRP L]ODJDQMDKODGQRþL7RNRPVDWDPDVD%$7VHSRYHþD]DRNRQDMYHþLPGHORP QD UDĀXQ SUROLIHUDFLMH L GLIHUHQFLMDFLMH þHOLMD WNLYD 1D QLYRX VYHWORVQH PLNURVNRSLMH najizraçenije promene su zapaçene na nivou lipidnih tela, koja se usitnjavaju, i NDSLODUQHPUHçHNRMDVHXYHþDYDYD]RGLODWDFLMRPLDQJLRJHQH]RP%$7NRQWUROQHJUXSH LJUXSHL]ODJDQHKODGQRþLVDWDRGPDKSRL]RODFLML a,b), odnosno na nivou svetlosne mikroskopije (c,d 2ULJXYHOLĀDQMH[ Slika 3. Presek BAT pacova na nivou svetlosne mikroskopije (SM). BAT pacova ĀLQHQDMYHþLPGHORP RNR PUNLDGLSRFLWL MA  LHQGRWHOVNHþHOLMH2VWDWDN WNLYD ĀLQH SUHNXUVRUVNH þHOLMH L SUDWHþH þHOLMH YH]LYQRWNLYQH VWURPH 1D SHULIHULML OREXVD XRĀDYDVHYHQDFXQLORNXOXVQLKDGLSRFLWD UA LSRSUHĀQRSUXJDVWDPXVNXODWXUD PPM) NRMDRNUXçXMH%$72ULJXYHOLĀDQMH[ Uvod 4 %$7 MH L]JUDāHQ Slika 3  QDMYHþLP GHORP RG PUNLK DGLSRFLWD  HQGRWHOVNLKþHOLMD  SUHDGLSRFLWD  L LQWHUVWLFLMVNLKþHOLMD  GRNRVWDWDNĀLQHPDNURIDJHPDVWRFLWLILEUREODVWLäYDQRYHþHOLMH LþHOLMHSRUHNORPL]NUYRWRND %XNRZLHFNLLVDU  Sa citoloåkog aspekta BAT se jasno razlikuje od WAT po boji, po ĀHPXMHLGRELORQD]LYåWRMHSRVOHGLFDJXVWHNDSLODUQHPUHçHLEURMQLK mitohondrija u mrkim adipocitima. Mitohondrije BAT se odlikuju brojnim invaginacijama unutraånje membrane – kristama, u koje se XJUDāXMH GHNXSOXMXþL SURWHLQ engl. uncoupling protein 1, UCP1) VSHFLILĀDQ ]D RYH þHOLMH =DKYDOMXMXþL SULVXVWYX 8&3 RPRJXþHQR MH YUDþDQMH SURWRQD L] PHāXPHPEUDQVNRJ SURVWRUD X PDWULNV PLWRKRQGULMD ĀLPH VH HQHUJLMD QDVWDOD SUL RNVLGDFLML VXSVWUDWD QH LVNRULåþDYD]DVLQWH]X$73YHþUDVLSDXYLGXWRSORWH Slika 4). Postojanje ERJDWH YDVNXODUQH PUHçH RPRJXþDYD EU]R GRSUHPDQMH VXSVWUDWD L kiseonika do tkiva, kao i transfer produkovane toplote u sve regione organizma. Pored guste kapilarne mreçe, tkivo poseduje bogatu VLPSDWLĀNX LQHUYDFLMXNRMDSRVUHGXMHXFHQWUDOQRMNRQWUROL WHUPRJHQRJ procesa (Klingenspor, 2003). Slika 4. Aktivacija mrkog masnog tkiva ,]ODJDQMH KODGQRþL GRYRGL GR SRMDĀDQRJ RVOREDāDQMD QRUDGUHQDOLQD NRML VH YH]XMH ]D ǃ3DGUHQHUJLĀNH UHFHSWRUH L SRYHþDQMD F$032YR]DSRVOHGLFXLPDDNWLYDFLMXKRUPRQVHQ]LWLYQHOLSD]HLRVOREDāDQMHPDVQLK NLVHOLQDNRMHVHNRULVWHXSURFHVXǃRNVLGDFLMHLDNWLYDFLMH8&30RGLILNRYDQRL]Celi, 2009. N Engl J Med. 360: 1553-56. Uvod 5 7HUPRJHQH]D%$7MHSRGNRQWURORPVLPSDWLĀNRJQHUYQRJVLVWHPD 616 LL]ODJDQMHKODGQRþLGRYRGLGRWUDQVIRUPDFLMHQHDNWLYQRJWNLYD VD SUROLIHUDWLYQRJ L WHUPRJHQRJ DVSHNWD  X KLSHUSODVWLĀQL WHUPRJHQR aktivni organ. ,]ODJDQMHKODGQRþLGRYRGLGRSRMDĀDQRJRVOREDāDQMDQRUDGUHQDOLQD NRMLYH]LYDQMHP]DǂLǃDGUHQHUJLĀNHUHFHSWRUQHL]RIRUPH ǂ$5Lǃ$5  SRYHþDYD QLYR F$03 2YDM VHNXQGDUQL JODVQLN GRYRGL GR RVOREDāDQMD NDWDOLWLĀNHVXEMHGLQLFHSURWHLQNLQD]H$NRMDVDGUXJHVWUDQHIRVIRULOLåH EURMQH SURWHLQH XNOMXĀXMXþL KRUPRQVHQ]LWLYQX OLSD]X NOMXĀQL HQ]LP OLSROL]H 2VORERāHQH PDVQH NLVHOLQH DNWLYLUDMX 8&3 L NRULVWH VH X SURFHVXPLWRKRQGULMDOQH ǃRNVLGDFLMH .OLQJHQVSRU   +LSHUSOD]LMD %$7 MH VWLPXOLVDQD ǃ1-AR (Himms-Hagen i sar., 1994; Klaus i sar.,   GRN MH OLSROLWLĀND L WHUPRJHQD IXQNFLMD SRVUHGRYDQD QDMYHþLP GHORPSUHNRǃ3-AR (Zhao i sar., 1998). 8SRUHGR VD DNWLYDFLMRP OLSROL]H L]ODJDQMH KODGQRþL GRYRGL GR SUROLIHUDFLMHPUNLKDGLSRFLWDPLWRKRQGULRJHQH]HSRYHþDQMDHNVSUHVLMHL DNWLYDFLMH 8&3 ELRJHQH]H SHURNVL]RPD NDR L SRYHþDQMD VLQWH]H SURWHLQD51. L'1. +LPPV+DJHQ2WDåHYLþ L VDU 2YL SURFHVL GRYRGH GR SRYHþDQMDPDVH WNLYD SUH VYHJD SXWHP KLSHUSOD]LMH tkiva (Suter, 1969; Bukowiecki i sar., 1986), odnosno proliferacije LQWHUVWLFLMVNLKþHOLMDSUHDGLSRFLWDLHQGRWHOVNLKþHOLMDDOLLGLIHUHQFLMDFLMH preadipocita koje karakteriåe indukcija UCP1 ekspresije, biogeneza PLWRKRQGULMD L QDJRPLODYDQMH OLSLGD .ODXV  .RUDþ L VDU  3HWURYLþLVDU  Procesi konverzije unilokulusnih mrkih adipocita, koji u citoplazmi poseduju jedno veliko lipidno telo u multilokulusni adipocit, VD YHþLP EURMHP VLWQLMLK OLSLGQLK WHOD L UD]YRM NDSLODUD DQJLRJHQH]D  WDNRāHVXVDVWDYQLLQHRGYRMLYLGHRDNWLYDFLMH%$7 &LQWL2WDåHYLþ i sar., 2011). Svi navedeni procesi su na molekulskom nivou regulisani brojnim IDNWRULPD PHāX NRMLPD NOMXĀQX XORJX LPDMX 8&3 33$5DŽ engl. Uvod 6 SHUR[LVRPH SUROLIHUDWRUDFWLYDWHG UHFHSWRU DŽ  L 3*&ǂ engl 33$5DŽ FRDFWLYDWRUǂ  3XLJVHUYHULVDU.OLQJHQVSRU  U zavisnosti od trajanja stimulusa, aktivnost i ekspresija UCP1 su VSHFLILĀQR UHJXOLVDQH $NXWQR L]ODJDQMH KODGQRþL VH NDUDNWHULåH SRUDVWRP ELRKHPLMVNH DNWLYQRVWL 8&3 SURWHLQD GRN MH KURQLĀQR L]ODJDQMH KODGQRþL UHJXOLVDQR QD QLYRX JHQVNH HNVSUHVLMH L GLUHNWQR MH povezano sa biogenezom mitohondrija (Puigserver i sar., 1992). Kao åto MH LVWDNQXWRPDVQHNLVHOLQHRVORERāHQHXSURFHVXOLSROL]HVPDWUDMXVH vaçnim regulatorom aktivnosti i funkcije UCP1, dok je genska ekspresija 8&3SRGQRUDGUHQHUJLĀNRPNRQWURORP Pored toga, pokazano je da ekspresiju UCP1 reguliåe nekoliko WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD XNOMXĀXMXþL UHFHSWRU ]D UHWLQRLĀQX NLVHOLQX WLUHRLGQHKRUPRQH L33$5 IDPLOLMX 33$5ǂ33$5Dž33$5DŽ QXNOHXVQLK receptora (Silva i Rabelo, 1997). 33$5DŽMHYLVRNRHNVSULPLUDQX%$7LSR]LWLYQRUHJXOLåHHNVSUHVLMX JHQDXNOMXĀHQLKXSURFHVSUROLIHUDFLMHLGLIHUHQFLMDFLMH%$7 1HGHUJDDUGL VDU   2Q WR ĀLQL X NRRSHUDFLML VD 3*&ǂ NRML NDR NRDNWLYDWRU SRYHþDYD YHURYDWQRþX YH]LYDQMD 33$5DŽ ]D UHJXODWRUQH VHNYHQFH FLOMQLK gena (Puigserver i sar., 1998). 3*&ǂ MH GHILQLVDQ X %$7 NDR KODGQRþRPLQGXNRYDQL WUDQVNULSFLRQLNRDNWLYDWRUQHRSKRGDQ]DHNVSUHVLMXJHQDXNOMXĀHQLKX mitohondriogenezu i oksidativni metabolizam (Puigserver i sar., 1998). Kao koaktivator brojnih transkripcionih faktora u procesu adipogeneze, VPDWUDVHNOMXĀQLPUHJXODWRURPDGDSWLYQHWHUPRJHQH]HDOLQHLJODYQLP regulatorom sazrevanja mrkih adipocita. Pokazano je da u odsustvu 3*&ǂL3*&ǃSUHDGLSRFLWLXNXOWXUL]DGRELMDMXNDUDNWHULVWLNH]UHOLK adipocita, ali gube sposobnost mitohondriogeneze (Uldry i sar., 2006) åto bi moglo biti od velike vaçnosti za proces regulacije uspostavljanja termogenog fenotipa mrkih adipocita. Uvod 7 1.2. TRANSKRIPCIONA REGULACIJA ADIPOGENEZE Na osnovu brojnih in vitro studija pokazano je da tokom procesa DGLSRJHQH]HþHOLMHVOLĀQHILEUREODVWLPDSUROD]HNUR]RGUHāHQHPRUIRORåNH promene i diferenciraju se u zrele adipocite u roku od 4-6 dana kada se L]ORçH RGJRYDUDMXþRM KRUPRQVNRM VWLPXODFLML *UHHQ L .HKLQGH  Chapman i sar., 1984; Entenmann i Hauner, 1996). Tabela 1..DUDNWHULVWLNHUD]OLĀLWLKVWXSQMHYDDGLSRJHQH]H0RGLILNRYDQRL]Lefterova i Lazar, 2009. Trends Endocrinol Metab. 20: 107-14. 'LIHUHQFLMDFLMDDGLSRFLWDRGSUHNXUVRUVNLKþHOLMD MHVORçHQSURFHV odigrava se kroz nekoliko stupnjeva (Tabela 1 LXNOMXĀXMHNRPSOHNVQXL visoko orkestriranu mreçu transkripcionih faktora. Istraçivanja u ovom VPHUX VX GRGDWQR RWHçDQD ĀLQMHQLFRP GD VH JRWRYR VYDNRGQHYQR SURQDOD]H L RSLVXMX QRYL IDNWRUL VLQHUJLVWLĀNRJ LLOL DQWDJRQLVWLĀNRJ delovanja. 1DM]QDĀDMQLML L QDMYLåH LVSLWLYDQL WUDQVNULSFLRQL IDNWRUL X SURFHVX DGLSRJHQH]H VX 33$5DŽ L &(%3ǂ engl. CCAAT/enhancer-binding SURWHLQ ǂ  ,QGXNFLMD RYD GYD IDNWRUD NDUDNWHULVWLĀQD MH ]D SHULRG terminalne diferencijacije i dovodi do obrazovanja krajnjeg fenotipa mrkih adipocita (Shao i Lazar, 1997). Uvod 8 6OLND0RGHO WUDQVNULSFLRQRJGHORYDQMD33$5DŽ L&(%3ǂ WRNRPDGLSRJHQH]H. Modifikovano iz: Lefterova i Lazar, 2009. Trends Endocrinol Metab. 20: 107-14. &(%3ǂ SULSDGD SRURGLFL YLVRNR NRQ]HUYLUDQLK SURWHLQD L R QMHJRYRP ]QDĀDMX X SURFHVX DGLSRJHQH]H in vivo JRYRUL ĀLQMHQLFD GD GHOHFLMD RYRJ JHQD NRG PLåHYD UH]XOWXMH QHPRJXþQRåþX PLåHYD GD GHSRQXMX OLSLGH :DQJ L VDU   3RUHG&(%3ǂ LGHQWLILNRYDQD VX MRåĀHWLULĀODQDRYHSRURGLFHSURDGLSRJHQLIDNWRUL&(%3ǃL&(%3DžL DQWLDSRSWRJHQL IDNWRUL  &(%3DŽ L &+23 &(%3 KRPRORJQL SURWHLQ  &(%3ǃ L &(%3Dž VX LQGXNRYDQL WRNRP UDQLK ID]D GLIHUHQFLMDFLMH L ]DMHGQRLQGXNXMXHNVSUHVLMX&(%3ǂL33$5DŽ )DUPHU  ,DNR MHYDçQRVW&(%3ǂSRWYUāHQDSUHFL]QDXORJDXDGLSRJHQH]L QLMH MDVQDGHORP]ERJVLQHUJLVWLĀNRJRGQRVDVD33$5DŽ3RUHGWRJDåWR PHāXVREQR UHJXOLåX HNVSUHVLMX 5RVHQ L VDU  &(%3ǂ L 33$5DŽ pokazuju veliko preklapanje tokom vezivanja u regulatornim delovima FLOMQLKJHQDNRMLVXĀHVWREOL]XMHGDQGUXJRJ Slika 5) (Lefterova i Lazar, 2009). Pored ova dva glavna regulatora adipogeneze, u proces SUROLIHUDFLMH LGLIHUHQFLMDFLMHPUNLKDGLSRFLWDXNOMXĀHQD MH ĀLWDYDPUHçD aktivatora, ko-aktivatora, represora i ko-represora, koji sa druge strane koordiniåu ekspresiju proteina vaçnih za uspostavljanje krajnjeg fenotipa mrkih adipocita. Poslednjih godina posebna paçnja se pridaje ĀODQRYLPDJUXSH./)WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD Slika 6) (engl. Krüppel- like factor) koji se vezuju za CACCC/GC/GT – mesta u regulatornim GHORYLPD FLOMQLK JHQD NRQWUROLåXþL YDçQH ELRORåNH SURFHVH NDR åWR VX SUROLIHUDFLMD GLIHUHQFLMDFLMD KHPDWRSRH]D L SURJUHVLMD þHOLMVNRJ FLNOXVD %UD\ L VDU   'R VDGD MH RSLVDQR  ĀODQRYD ./) SRURGLFH RG Uvod 9 NRMLK VH RVDP VPDWUD NOMXĀQLP NRPSRQHQWDPD WUDQVNULSFLRQH PUHçH koja je odgovorna za kontrolu adipogeneze (Banerjee i sar., 2003; Oishi i sar., 2005). 6OLND  8ORJD SRMHGLQLK ĀODQRYD ./) WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD X GHWHUPLQDFLML GLIHUHQFLMDFLMHSUHNXUVRUVNLKþHOLMD%$7=HOHQLPOLQLMDPDR]QDĀHQLVXDNWLYDWRULD FUYHQLP OLQLMDPD LQKLELWRUL UD]YLþD EHOLK PUNLK DGLSRFLWD L SRSUHĀQRSUXJDVWLK PLåLþQLK þHOLMD ./) MH SUYL RWNULYHQL ĀODQ ]D NRML MH SRND]DQR GD LPD XGHOD X adipogenezi. Modifikovano iz: Rosen i sar., 2009. Expert Opin Ther Targets. 13: 975-86. 3UYLĀODQ./)SRURGLFH]DNRMLMHSRND]DQRGDXĀHVWYXMHXSURFHVX adipogeneze jeste KLF15. Blokiranje ekspresije ovog faktora smanjuje HNVSUHVLMX 33$5DŽ NOMXĀQRJ UHJXODWRUD GLIHUHQFLMDFLMH PUNLK DGLSRFLWD 0RUL LVDU 8ORJDGUXJLKĀODQRYDMHPDQMHLVWUDçHQDDOLVH]QD da su neki od njih negativni regulatori adipogeneze (KLF2, KLF3, KLF7, KLF11), dok ostali do sada ispitani faktori predstavljaju pozitivne regulatore, koji deluju bilo direktno regulacijom ekspresije gena odgovornih za proliferaciju i diferencijaciju adipocita ili indirektno, putem regulacije unosa insulina u BAT (Bray i sar., 2009). 3RUHG WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD XNOMXĀHQLK X SUROLIHUDFLMX L diferencijaciju, centralna uloga pripada faktorima koji reguliåu proces mitohondriogeneze u BAT. Mitohondrije BAT se odlikuju neverovatnom SODVWLĀQRåþXNRMD VHRJOHGDXEU]LPSURPHQDPDYHOLĀLQHEURMDPDVH REOLND L XOWUDVWUXNWXUH 1LVROL L VDU  3HWURYLþ L VDU   2YL SURFHVLXNOMXĀXMXHNVSUHVLMXSUHNRJHQDLRNRSURWHLQDþHOLMH Uvod 10 za åta je neophodna strogo koordinisana ekspresija gena nukleusnog i PLWRKRQGULMDOQRJ JHQRPD PW'1.  .OMXĀQH NRPSRQHQWH HOHNWURQ transportnog lanca u mitohondrijama kodirane su od strane mtDNK, GRN MH UHSOLNDFLMD PLWRKRQGULMD NRGLUDQD QXNOHXVQLP JHQLPD ĀLML VH produkti iz citoplazme transportuju u mitohondrije. Glavni faktori transkripcije mtDNK su nukleusni respiratorni faktori 1 i 2 (engl. nuclear respiratory factor, NRF). NRF-1 kontroliåe transkripciju gena koji kodiraju komponente elektron-transportnog ODQFD IRUPLUDMXþLKRPRGLPHUH &KDQ L VDU9LOOHQD L VDU  kao i proteine koji reguliåu replikaciju i transkripciju mtDNK (Klingenspor i sar., 1996; Liang i Ward, 2006). Regulacija mitohondrijalne biogeneze u mrkim adipocitima je pod FHQWUDOQRPNRQWURORP3*&ǂåWRMHSRWYUāHQREURMQLPin vivo i in vitro VWXGLMDPD 8OGU\ L VDU  /DL L VDU 2WDåHYLþ L VDU   'LQDPLĀQH SURPHQHNRMH VH GHåDYDMX WRNRPELRJHQH]HPLWRKRQGULMDX %$7XNOMXĀXMXLGUXJHSURWHLQHPHāXNRMLPDQDM]QDĀDMQLMXXORJXLPDMX mitofuzini 1 i 2 (Mfn), GTPaze lokalizovane u spoljaånjoj membrani PLWRKRQGULMD 1LVROL L VDU  .X]PLĀLþ L VDU   NRMH RPRJXþDYDMXIX]LMXPLWRKRQGULMDL'USSURWHLQ engl. Dinamin-related protein 1, Drp1) (Slika 7) koji pripada velikoj porodici GTPaza koje su neophodne za deobu mitohondrija (Chan, 2006; Liesa i sar., 2009). Slika 7. Deoba i fuzija mitohondrija. Drp1 pripada porodici velikih GTPaza XNOMXĀHQLKXGHREXPLWRKRQGULMD2YLSURWHLQL IRUPLUDMXYHOLNHPXOWLPHUHNRML LPDMX REOLN SUVWHQD L KLGUROL]RP*73 RPRJXþDYDMXQDVWDQDNGYHQRYHPLWRKRQGULMH0IQ LPDVXSURWQXXORJXSUYHQVWYHQRRPRJXþDYDSURFHVIX]LMHPLWRKRQGULMD0RGLILNRYDQR iz: Russell i sar., 2005. J Mol Cell Cardiol. 38: 81-91. Uvod 11 Visoka termogena aktivnost BAT zahteva dobro razvijenu NDSLODUQX PUHçX NRMD þH RPRJXþLWL EU]R VQDEGHYDQMH NLVHRQLNRP L VXSVWUDWLPDNDRLRGYRāHQMHWRSORWHGRFLOMQLKRUJDQDLWNLYD%URMQLVX UDGRYL NRML JRYRUH R NRPXQLNDFLML HQGRWHOVNLK þHOLMD L SUHDGLSRFLWD LLOL mrkih adipocita preko autokrinih i parakrinih signala, komponenata YDQþHOLMVNRJ PDWULNVD L PHāXþHOLMVNLK YH]D 9DU]DQHK L VDU  Crandall i sar., 1997; Hutley i sar., 2001). VEGF (engl. vascular endothelial growth factor) je neophodan IDNWRUIRUPLUDQMDNUYQLKVXGRYDNRGDGXOWDLWRNRPUD]YLþD +DXVPDQL 5LFKDUGVRQ  3HWURYLþ L VDU   NRML RVWYDUXMH EURMQH XORJH GRYRGHþL GR SURFHVD SUROLIHUDFLMH L GLIHUHQFLMDFLMH HQGRWHOVNLK SUHNXUVRUVNLKþHOLMDDQJLRJHQRJUHPRGHOLUDQMDLYDVNXORJHQH]H $GDPV i Alitalo, 2007). 'XJRWUDMQRL]ODJDQMHKODGQRþLLQGXNXMHHNVSUHVLMX9(*)X%$7L SRYHþDYDSURNUYOMHQRVW .RUDþLVDU LVWLPXOLåHQMHJRYXVHNUHFLMX in vitro (Fredriksson i sar., 2005). Iako smo u naåim prethodnim UDGRYLPD SRND]DOL GD VX DGLSRFLWL L HQGRWHOVNH þHOLMH X QHRGYRMLYRM strukturno-funkcionalnoj vezi u BAT, kako tokom aktivacije tako i WRNRPLQDNWLYDFLMHWNLYD .RUDþLVDU0DUNHOLþLVDU QLMH SR]QDWR GD OL VH SURFHVL DGLSR L DQJLRJHQH]H SRNUHþX LVWRYUHPHQR WRNRPSUYLKVDWLL]ODJDQMDKODGQRþL Novija istraçivanja fokusirana na regulaciju mehanizama XNOMXĀHQLKXSURFHVDQJLRJHQH]HLQDPRJXþXLPSOLNDFLMXXSDWRORåNLP stanjima kao åto je kancer, pokazala su da endoglin (CD105), transmembranski glikoprotein i komponenta receptornog kompleksa IDNWRUD WUDQVIRUPDFLMH UDVWD ǃ engl 7UDQVIRUPLQJ *URZWK )DFWRUǃ 7*)ǃ  SUHGVWDYOMD YDçDQ PDUNHU SUROLIHUDFLMH HQGRWHOVNLK þHOLMD (Fonsatti i Maio, 2004). Iako njegova precizna uloga nije razjaånjena, LVWUDçLYDQMD XND]XMX QD XNOMXĀHQRVW RYRJ FLWRNLQD X DQJLRJHQH]L (Barnabeu i sar., 2007). Da li je ovaj faktor eksprimiran u BAT i da li L]ODJDQMHKODGQRþLGRYRGLGRQMHJRYHLQGXNFLMHGRVDGDQLMHSR]QDWR Uvod 12 267$/,)$.725,8./-8ÿ(1,8$',32*(1(=8 Pored transkripcionih faktora, na proliferaciju i diferencijaciju %$7XWLĀX L EURMQL GUXJL IDNWRUL NDR åWR VX UD]OLĀLWL FLWRNLQL LQVXOLQ L LQVXOLQXVOLĀDQ IDNWRUUDVWD .RUDþ LVDU0DUNHOLþ LVDU  EURMQL YDQþHOLMVNL VLJQDOL PHāX NRMLPD SRVHEQX YDçQRVW LPDMX %03 proteini (engl. bone morphogenic proteins). %03VXĀODQRYL7*)ǃVXSHUIDPLOLMH LSRRWNULþXSRND]DQRMHGD VWLPXOLåX SURJUDP GLIHUHQFLMDFLMH RVWHRJHQLK þHOLMD L GD LPDMX YDçQX XORJXXNRQWUROLHPEULRQDOQRJUD]YLþD'DQDVVH]QDGDSRUHGWRJD%03 NRQWUROLåXRSUHGHOMLYDQMHVWHPþHOLMDNDUD]OLĀLWLPþHOLMVNLPOLQLMDPDåWR je pokazano i u WAT i u BAT (Slika 8). Pokazano je da mrki preadipociti HNVSULPLUDMX QHNROLNR ĀODQRYD RYH SURWHLQVNH IDPLOLMH %03 %03 BMP6 i BMP7 i da su zaduçeni za indukciju akumulacije lipida, dok samo BMP7 ima sposobnost da indukuje UCP1 i RNK ekspresiju (Tseng i sar., 2008). 6OLND8ORJD%03SURWHLQDXRSUHGHOMLYDQMXSUHNXUVRUVNLKþHOLMDWRNRPSURFHVD diferencijacije adipocita. 8NROLNR HNVSULPLUD %03 ]DMHGQLĀNL PXOWLSRWHQWQL prekursor moçe da se diferencira u pravcu mrkih adipocita, dok ekspresija BMP4 vodi ka diferencijaciji u beli adipocit. Modifikovano iz: Schulz i Tseng, 2009. Cytokine Growth Factor Rev. 20: 523-31. Uvod 13 1.4. POREKLO MRKIH ADIPOCITA 'XJR VH VPDWUDOR GD PUNL L EHOL DGLSRFLWL SRWLĀX RG ]DMHGQLĀNH SUHNXUVRUVNHþHOLMHMHU]DSURFHVGLIHUHQFLMDFLMHREDWLSDþHOLMD]DKWHYDMX HNVSUHVLMX 33$5DŽ .RQYHU]LMD PUNLK DGLSRFLWD X EHOH L REUQXWR ² WUDQVGLIHUHQFLMDFLMDNRMDVHGHåDYDXRGUHāHQLPGHSRLPDPDVQRJWNLYD L SUL RGUHāHQLP VWLPXOXVLPDNDR åWR VXKODGQRþD L WLUHRLGQL KRUPRQL dodatno je potkrepljivala ovakav stav (Cinti, 2009). 0HāXWLP7LPPRQVLVDUDGQLFL  VXREMDYLOLUH]XOWDWHUDGDX kome su pokazali da mrki adipociti eksprimiraju Myf5 (engl. myogenic regulatory factor 5) L GD LPDMX VYRMVWYD PLåLþQLK þHOLMD XND]XMXþL QD PRJXþQRVWPLRJHQRJSRUHNOD*RGLQXGDQDNDVQLMH6HDOHLVDU   su pokazali da mrki adipociti vode poreklo od Myf5-pozitivnih miogenih prekursora i da PRDM16 (engl. PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain- containing 16) transkripcioni faktor reguliåe diferencijaciju ovih SUHNXUVRUD X SUDYFX UD]YRMD PUNLK DGLSRFLWD LOL SRSUHĀQRSUXJDVWLK PLåLþQLKþHOLMD,QGXNFLMD35'0XRYRMVWXGLML]DYLVLQDMYHþLPGHORP RG %03 NDR L RG HNVSUHVLMH 33$5DŽ L &(%3 SURWHLQD 7DNRāH ekspresija PRDM16 u WAT in vivoPRçHGDGRYHGHGRSRMDYHþHOLMD VD NDUDNWHULVWLĀQRPPRUIRORJLMRPPUNLKDGLSRFLWDNRMLHNVSULPLUDMX8&3 CideaL3*&ǂNRMLVXVSHFLILĀQL]DPUNHDGLSRFLWH 6HDOHLVDU  6D GUXJH VWUDQH SRGDFL XND]XMX QD ]DMHGQLĀNR SRUHNOR PUNLK DGLSRFLWDLHQGRWHOVNLKþHOLMD%$7 7UDQLVDU  05.20$6127.,92ÿ29(.$ 'RQHGDYQR MH VPDWUDQRGD%$7QHPD YHþL ]QDĀDM NRG RGUDVOLK OMXGLDOLQRYLMDLVWUDçLYDQMDVXSRND]DODSULVXVWYRPHWDEROLĀNLDNWLYQRJ %$7 NRG ]QDĀDMQRJ SURFHQWD OMXGL NDR L GD MH NROLĀLQD RYRJ WNLYD obrnuto proporcionalna indeksu telesne mase (engl. body mass index, Uvod 14 %0,  L GD VH DNWLYLUD L]ODJDQMHP KODGQRþL 1HGHUJDDUG L VDU  Cypess i sar., 2009; Virtanen i sar., 2009). Ovo saznanje u potpunosti je promenilo sliku o humanom BAT. Zbog potencijalne uloge u gojaznosti i oboljenjima koja su sa njom u vezi, interesovanje za mehanizme QDVWDQND L UD]YRMD RYRJ WNLYD MH ]QDĀDMQR SRUDVOR SRVOHGQMLK QHNROLNR godina. 'R VDGD MH SRVWLJQXW ]QDĀDMDQ QDSUHGDN X GHILQLVDQMX transkripcionih faktora koji kontroliåu terminalnu diferencijaciju SUHDGLSRFLWD X ]UHOHPUNH DGLSRFLWH0HāXWLPPHKDQL]PL NRML GRYRGH GR GLIHUHQFLMDFLMH PH]HQKLPVNH VWHP þHOLMH 06ý  X SUHDGLSRFLWH QLVX poznati. Istraçivanja sa jedne strane oteçava nedostatak molekulskih PDUNHUD NRML VX NDUDNWHULVWLĀQL ]D SUHDGLSRFLWH D VD GUXJH VWUDQH QMLKRYD PRUIRORåND KHWHURJHQRVW XQXWDU LVWLK GHSRD %$7 D QDURĀLWR heterogenost u pogledu adipogenog potencijala (Lefebvre i sar., 1998; Kajimura i sar., 2010). /LWHUDWXUQL SRGDFL SRND]XMX GD UD]YLþH %$7 NRG ĀRYHND SRĀLQMH oko XX nedelje gestacije i nastavlja se joå neko kratko vreme po URāHQMXNDGDĀLQLXNXSQHWHOHVQHPDVH $YUDPLVDU .RG IHWXVDLQRYRURāHQĀDGL%$7VHVUHþHXGHILQLVDQLPUHJLRQLPDXWHOXRNR VUFD L YHOLNLKNUYQLKVXGRYD WUDKHMH MHGQMDNDSULVXWQR MHXSRGUXĀMX DNVLOH RNR EXEUHJD QDGEXEUHJD L SDQNUHDVD D QDURĀLWR X interskapularnom regionu (Slika 9) (Gesta i sar., 2007). =D UD]OLNX RG SDFRYD NRML VH UDāDMX VD QH]UHORP KLSRWDODPR KLSRIL]QRP RVRP L NRML VH SR URāHQMX JUXSLåX ]DMHGQR X FLOMX RGUçDYDQMD WHOHVQH WHPSHUDWXUH ĀRYHN VH UDāD VD RIRUPOMHQRP KLSRWDODPRKLSRIL]QRP RVRP 6DPLP WLP NROLĀLQD 8&3 NRG OMXGL MH QDMYHþD SR URāHQMX åWR RODNåDYD SUHOD]DN QD QHRQDWDOQX WHUPRUHJXODFLMX GRN VH NRG SDFRYD HNVSUHVLMD 8&3 SRYHþDYD SRVOH URāHQMD &DQQRQLVDU  Uvod 15 6OLND/RNDOL]DFLMD%$7NRGĀRYHND.RG IHWXVD LQRYRURāHQĀDGL%$7VHVUHþHX definisanim oblastima tela i najzastupljenije je u interskapularnom regionu. Novija LVWUDçLYDQMDVXSRND]DODSULVXVWYRPHWDEROLĀNLDNWLYQRJ%$7NRGRGUDVOLKåWRMHGRYHOR GR SRYHþDQRJ LQWHUHVRYDQMD ]D SURXĀDYDQMH PHKDQL]DPD NRML VH QDOD]H X RVQRYL adipogeneze. Modifikovano iz: Enerback, 2010. Cell Metabolism. 11: 248-52. Dosadaånji literaturni podaci o mehanizmima regulacije razvoja fetalnog BAT (fBAT) proizilazili su iz studija na çivotinjama, uglavnom pacova. Sada, kada je pokazano prisustvo BAT kod adulta, fBAT SUHGVWDYOMD YDçDQ PRGHO ]D SURXĀDYDQMH PHKDQL]DPD NRML GRYRGH GR KLSHUSOD]LMH RYRJ WNLYD RE]LURP GD X RYRP VWDQMX XYHþDQMH %$7 QLMH LQGXNRYDQRKODGQRþRP 6PDWUDVHGDVXKRUPRQLJODYQLUHJXODWRULUD]YLþDLIXQNFLMH%$7L pored noradrenalina i insulina, estrogen ima centralni efekat u regulaciji potroånje energije kako kod çenskog tako i kod muåkog pola (Frayn i sar., 2003; Pallottini i sar., 2008). Estrogen ima vaçnu ulogu u PHWDEROL]PX %$7 UHJXOLåXþL OLSRJHQL L OLSROLWLĀNL SXW 3RUHG WRJD estrogen moduliåe ekspresiju adipogenih transkripcionih faktora, kao i proliferaciju i diferencijaciju adipocita (Rodriguez-Cuenca i sar., 2005). 1HGRVWDWDN HVWURJHQD MH SUDþHQ VPDQMHQMHP 8&3 HNVSUHVLMH NRG SDFRYD L SRUHPHþDMHP WHUPRJHQH]H 0RQMR L VDU   ÿLQMHQLFD GD estrogen ima vaçnu ulogu u determinaciji broja adipocita u WAT ukazuje na njegovu ulogu u adipogenezi (Cooke i Naaz, 2004). Uvod 16 Svoju fizioloåku funkciju estrogen ostvaruje preko dva receptora, HVWURJHQVNRJUHFHSWRUDDOID (5ǂ  LEHWD (5ǃ 2YLUHFHSWRULSULSDGDMX superfamiliji nukleusnih receptora i funkcioniåu kao ligand-zavisni transkripcioni faktori (Slika 10). Nakon vezivanja liganda, receptori GLPHUL]XMX IRUPLUDMXþL KRPR LLOL KHWHURGLPHUH .RPSOHNV OLJDQG receptor ulazi u nukleus gde se vezuje za ERE (engl. estrogen response element) mesto u promotoru ciljnih gena (Heine i sar., 2000; Matthews i Gustafsson, 2003). Pokazano je da su oba tipa receptora eksprimirana X:$7 LGD MH VDPR(5ǂHNVSULPLUDQXSUHDGLSRFLWLPD -R\QHU L VDU 2001; Deroo i Korach, 2006). Slika 10. Regulacija genske ekspresije estrogenom 1DMYHþLP GHORP HVWURJHQ RVWYDUXMHGLUHNWDQHIHNDWUHJXOLåXþLHNVSUHVLMXJHQDXQXNOHXVXYH]LYDQMHP]DMHGQRVD receptorom za ERE mesto u regulatornim delovima ciljnih gena. Modifikovano iz: Kumar i Kumar, 2008. Cancer Therapy. 6: 655-64. 17 2.CILJ ISTRAæIVANJA Svetska epidemija gojaznosti kao i oboljenja koja su u vezi sa QMRP L]D]YDOL VX WDODV LQWHUHVRYDQMD ]D SURXĀDYDQMH ELRORJLMH PDVQRJ WNLYD SRVOHGQMLK GYDGHVHW JRGLQD 2YD SURXĀDYDQMD VX GRGDWQR potkrepljena novim istraçivanjima koja su pokazala da je fizioloåki aktivno BAT prisutno kod odraslih ljudi i da se ono moçe stimulisati L]ODJDQMHP KODGQRþL åWR SUHGVWDYOMD PRJXþQRVW SURQDODVND QDĀLQD regulacije potroånje energije. 8 WRP NRQWHNVWX LVSLWDþH VH HNVSUHVLMD SURWHLQD RGJRYRUQLK ]D VWYDUDQMHIHQRWLSDPUNLKDGLSRFLWD 8&333$5DŽL3*&ǂ DOLLGUXJLK WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD XNOMXĀHQLK X SURFHV DGLSRJHQH]H WRNRP SUYLK VDWLKODGQRþRPLQGXNRYDQHKLSHUSOD]LMHNRGSDFRYDNDRLWRNRPUD]YRMD KXPDQRJ I%$7 3RUHG WRJD ELþH LVSLWLYDQD QMLKRYD SRVWWUDQVODFLRQD UHJXODFLMD SUH VYHJD SURWHLQD XNOMXĀHQLK X SURFHV ELRJHQH]H mitohondrija. 7DNRāH VSURYHåþH VH GHWDOMQD XOWUDVWXNWXUQD LPXQRFLWR L LPXQRKLVWRKHPLMVND DQDOL]D %$7 X FLOMX XWYUāLYDQMD XWLFDMD L]ODJDQMD KODGQRþL QD SUROLIHUDFLMX L GLIHUHQFLMDFLMX þHOLMD DQJLRJHQH]X L PLWRKRQGULRJHQH]X NDR L XWYUāLYDQMH XVNODāHQRVWL HNVSUHVLMH  JHQD VD RGJRYDUDMXþLPVWUXNWXUQLPSURPHQDPD ,]WRJUD]ORJDLVSLWLYDQMHPROHNXOVNLKRVQRYDLQWHJUDFLMHUD]OLĀLWLK proadipogenih i antiadipogenih transkripcionih faktora, kao i odgovora NOMXĀQLK UHJXODWRUQLK JHQD WHUPRJHQH]H WRNRP UDQLK VDWL L]ODJDQMD KODGQRþL L IHWDOQRJ UD]YRMD %$7 L]YHåþH VH X FLOMX EROMHJ UD]XPHYDQMD PHKDQL]DPDNRMLVHQDOD]HXRVQRYLKLSHUSODVWLĀQRJRGJRYRUD%$7 18 3. MATERIJAL I METODI 3.1. PLAN EKSPERIMENTA Transkripciona regulacija hiperplazije BAT ispitivana je na PRGHOXL]ODJDQMDçLYRWLQMDKODGQRþLNDRLWRNRPUD]YRMD%$7XIHWDOQRP periodu kod ljudi. 0RGHOKLSHUSOD]LMH%$7SDFRYDLQGXNRYDQHKODGQRþRP 8 HNVSHULPHQWX VX NRULåþHQL PXçMDFL SDFRYD 0LOO +LOO VRMD VWDURVWLGDQD VD WHOHVQRPPDVRPQDSRĀHWNXHNVSHULPHQWD“ 10 g. U toku eksperimenta çivotinje su hranjene briketiranom hranom i vodom ad libitum X] SUDYLODQ GQHYQR QRþQL ULWDP (NVSHULPHQW MH RGREUHQ RG VWUDQH (WLĀNRJ NRPLWHWD ,QVWLWXWD ]D ELRORåND LVWUDçLYDQMD Å6LQLåD6WDQNRYLþ´8QLYHU]LWHWDX%HRJUDGX æivotinje su podeljene na ukupno sedam eksperimentalnih grupa DVYDNXHNVSHULPHQWDOQXJUXSXĀLQLOR MHSRåHVWçLYRWLQMD3UYDJUXSD R]QDĀHQDNDRNRQWUROQDMHVYHYUHPHWUDMDQMDHNVSHULPHQWDERUDYLODQD sobnoj temperaturi (22 ± 1 ºC). Preostalih åest grupa izlagano je KODGQRþL “ ž& X UD]OLĀLWRP WUDMDQMXæLYRWLQMH VX çUWYRYDQHX LVWR YUHPHQDNRQLVDWDL]ODJDQMDKODGQRþLRGQRVQR sata boravka na sobnoj temperaturi (kontrola). ,QWHUVNDSXODUQLGHSR%$7L]RORYDQMHXFHORVWLLQDNRQĀLåþHQMDRG :$7 YH]LYD LPLåLþD GHR WNLYD MH RGYDMDQ L SULSUHPDQ ]D VYHWORVQX L HOHNWURQVNXPLNURVNRSLMXGRNMHSUHRVWDOLGHRNRULåþHQ]D:HVWHUQEORW i RT-PCR (engl. real-time polymerase chain reaction) analizu. Materijal i metodi 19 +LSHUSOD]LMD%$7ĀRYHNDWRNRPIHWDOQRJUD]YRMD 8HNVSHULPHQWXVXNRULåþHQLX]RUFLKXPDQRJ%$7IHWXVDPXåNRJ pola, starosti XV-XXIII nedelje. fBAT je uzet odmah po obavljenom PHGLFLQVNL LQGXNRYDQRP SUHNLGX WUXGQRþH 1DNRQ UXWLQVNH SURYHUH ]GUDYVWYHQRJVWDQMDPDMNLLKLVWRSDWRORåNLKLJHQHWLĀNLKDQDOL]DNRMLPD VXLVNOMXĀHQLSRUHPHþDMLXUD]YRMXIHWXVDRGDEUDQLVXX]RUFL]DDQDOL]X (NVSHULPHQW MH RGREUHQ RG VWUDQH .RPLVLMH ]D HWLĀQRVW LVSLWLYDQMD QD ljudima Medicinskog fakulteta, Univerziteta u Novom Sadu. 'HRI%$7X]HWL]DNVLODUQRJUHJLRQDMHRĀLåþHQRGRNROQRJWNLYDL pripremljen za Western blot analizu, dok je drugi deo pripremljen za svetlosnu i elektronsku mikroskopiju. 3.2. RT-PCR ANALIZA TKIVA 3.2.1. Priprema tkiva za RT-PCR Prvi korak u pripremi tkiva za RT-PCR jeste izolovanje RNK. U tu svrhu, tkivo je homogenizovano u TRIzol reagensu (Invitrogen, SAD), PRQRID]QRPUDVWYRUXIHQRODLJXDQLGLQL]RWLRFLMDQDWDNRMLUD]DUDþHOLMH QH UHPHWHþL LQWHJULWHW 51. =DWLP MH KRPRJHQDW LQNXELUDQ VD hloroformom (za odvajanje faza) na sobnoj temperaturi, 2-3 min, pa centrifugiran na 10000 g, 15 min, na 4 ºC. Gornjem vodenom sloju VXSHUQDWDQWD MHGRGDW L]RSURSLODONRKROGDSUHFLSLWLUD51. SUHNRQRþL na –80 ºC). Talog dobijen nakon centrifugiranja na 12000 g, 10 min, 4 ºC, ispran je 75% etanolom za odstranjivanje tragova fenola. Po centrifugiranju na 7500 g, 5 min, na 4 ºC u talogu je dobijena RNK koja je rastvarana u DEPC (dietilpirokarbonat, ICN, Srbija) vodi. 1DNRQ L]RODFLMH XNXSQH 51. YUåHQR MH QMHQR SUHĀLåþDYDQMH DNKaznim tretmanom komercijalnim DNA-freeTM kompletom (Ambion, SAD). Materijal i metodi 20 -HGQRODQĀDQD F'1. MH VLQWHWLVDQD L]  ǍJ 51. L  ǍJ ROLJR G7  SUDMPHUD ,QYLWURJHQ 6$'  NRULåþHQMHP 800/9UHYHU]QH transkriptaze (Promega, SAD). 3.2.2. RT-PCR u realnom vremenu =DRGUHāLYDQMHSURPHQDQDQLYRXL51.X%$7SDFRYDNRULåþHQMH PHWRG 573&5 X UHDOQRP YUHPHQX 5HODWLYQD HNVSUHVLMD MH RGUHāHQD GLUHNWQLP SRUHāHQMHP GRELMHQLK &W YUHGQRVWL NRMH VX QRUPDOL]RYDQH SUHPD HQGRJHQRM NRQWUROL &W YUHGQRVW VH GHILQLåH NDR WDĀND X NRMRM DPSOLILNDFLRQD NULYD VHĀH treshold" (treshold cycle) vrednost i predstavlja broj ciklusa kada amplifikacija ulazi u eksponencijalnu fazu. 3UH RGUHāLYDQMD QLYRD HNVSUHVLMH FLOMQRJ JHQD XUDāHQL VX validacioni eksperimenti koji su pokazali pribliçno jednako variranje SURPHQH&WYUHGQRVWLRGJRYDUDMXþHJFLOMQRJJHQDLHQGRJHQHNRQWUROH]D niz serijskih dilucija cDNK. U naåim uzorcima se kao adekvatna endogena kontrola pokazala 18S rRNK (engl. 18S ribosomal RNK). 1DNRQWRJDXUDāHQDMH573&5GHWHNFLMD 8573&5 MHNRULåþHQ  L4TM SYBR GreenSupermix (Bio-Rad, CA) koji sadrçi 100 mM KCl, 40 mM Tris-HCl, pH 8.4, 0.4 mM od svakog dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), iTaq DNK polimerazu, 50 jedinica/ml, 6 mM MgCl2 LQHUNDOLUDMXþXERMX 6<%5*UHHQ ,Q0 IOXRUHVFHLQ L stabilizatore. Sekvence prajmera su preuzete iz Banke Prajmera (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) (Tabela 2). RT-PCR reakcija je izvedena u 20 µl reakcione zapremine. Svaka reakciona smeåa sastojala se od: 10 µl iQTM SYBR GreenSupermix 2x, SR  —O VYDNRJ RG SUDMPHUD ILQDOQH NRQFHQWUDFLMH  Q0  ǍO ROX (Invitrogen, SAD) i Nuclease freeYRGHGRǍOXNXSQH]DSUHPLQH smeåe. Po 16 µl reakcione smeåe i 4 µl cDNK (10 ng RNK prevedeno u F'1. GRGDWRMHXRGJRYDUDMXþHPHVWRQDRSWLĀNXSORĀX]D573&5=D VYDNLVHWSUDMPHUDXNOMXĀHQD MH LQHJDWLYQDNRQWUROD EH]F'1$ GDEL YHULILNRYDOL RGVXVWYR QHVSHFLILĀQH DPSOLILNDFLMH GLPHUH SUDMPHUD LOL Materijal i metodi 21 kontaminaciju). Sve reakcije su izvedene na aparatu ABI Prism 7000 6HTXHQFH 'HWHFWLRQ 6\VWHP SRG VOHGHþLP XVORYLPD  LQLFLMDOQL NRUDN GHQDWXUDFLMHPLQQDƒ&NRMLMHSUDþHQVDFLNOXVDVHFQD ƒ&  VHF QD  ƒ& L  VHF QD  ƒ& 6YDNL X]RUDN MH UDāHQ X WULSOLNDWXDVUHGQMDYUHGQRVWMHX]HWD]DGDOMDL]UDĀXQDYDQMD8VYDNX DQDOL]X MH ELOD XNOMXĀHQD HQGRJHQD NRQWUROD ]ERJ NRUHNFLMH LQWHUQLK razlika u efikasnosti amplifikacije, a svaki uzorak je normalizovan na nivo ekspresije svoje endogene kontrole. .YDQWLILNDFLMD MH XUDāHQD NRPSDUDWLYQLP &t PHWRGRP .ROLĀLQD ciljnog gena, normalizovanog na nivo ekspresije svoje endogene kontrole i izraçena relativno u odnosu na kalibrator, data je formulom 2²ƦƦ&W, gde MHƦƦ&t Ʀ&t ciljnog gena Ʀ&t endogene kontrole. Kalibrator predstavlja kontrolni uzorak (çivotinje koje su boravile na sobnoj temperaturi). Rezultati su izraçeni kao procenat u odnosu na adekvatnu kontrolnu grupu (grupa çivotinja koja je boravila na sobnoj temperaturi) kojoj je dodeljena vrednost od 100%. 6WDWLVWLĀNDREUDGDUH]XOWDWDGRELMHQLK573&5DQDOL]RP 6WDWLVWLĀND]QDĀDMQRVWGRELMHQLKUH]XOWDWD WHVWLUDQD MH*UDSK3DG 6RIWZDUH  SURJUDPRP =D SRUHāHQMH UH]XOWDWD L]PHāX JUXSD NRULåþHQD MH $129$ 6WDWLVWLĀND ]QDĀDMQRVW UH]XOWDWD MH RGUHāLYDQD 7XNH\ WHVWRP =D QDMQLçL VWHSHQ ]QDĀDMQRVWL X]HWD MH YUHGQRVW YHURYDWQRþHS Materijal i metodi 22 Tabela 2. 6HNYHQFHSUDMPHUDNRULåþHQLKX573&5. 3.3. WESTERN BLOT ANALIZA TKIVA 3.3.1. Priprema tkiva za Western blot Tkivo je macerirano, a zatim homogenizovano u RIPA (engl. radio immuno precipitation buffer) (2 M NaCl, 10% Triton X-100, 0.5 M TRIS, 10% SDS, pH 7.5) puferu sa proteaznim inhibitorima (Roche, ävajcarska), tri puta deset sekundi sa deset sekundi pauze. Sonifikacija X]RUDNDMHYUåHQDQDMDĀLQLRGN+]WULSXWDSHWQDHVWVHNXQGLVDSR petnaest sekundi pauze. Potom je sonifikat cenrifugiran u Beckam Gen Forward Reverse 18S rRNK 5’-CAC GGA CAG GAT TGA CAG AT-3’ 5’-CAA ATC GCT TCA TCA ACT AA-3’ UCP1 5’-GTG AAG GTC AGA ATG CAA GC-3’ 5’-AGA GCC CCC TTC ATG AGG TC-3’ 33$5DŽ 5’-TTC TGG CCC ACC AAC TTC-3’ 5’-CCC ACA GAC TCG GCA CTC-3’ 33$5ĵ 5’-AGA TGG TGG CAG AGC TAT GAC-3’ 5’-TCT CCT CCT GTG GCT GTT CC-3’ mtDNK 5’-TTG ATC AAC GGA CCA AGT TAC-3’ 5’-CTG GAT TGC TCC GGT CTG A-3’ 3*&ǂ 5’-CGC ACA ACT CAG CAA GTC CTC-3’ 5’-CCT TGC TGG CCT CCA AAG TCT C-3’ &(%3ǂ 5’-GCC AAG AAG TCG GTG GAT AA-3’ 5’-CGG TCA TTG TCA CTG GTC AA-3’ Myf5 5’-GAA GGG AAG ACA AGC AGC AC-3’ 5’-GCA AAA AGA ACA GGC AGA GG-3’ VEGF 5’-AAC CAT GAA CTT TCT GCT CTC TTG-3’ 5’-GCC TGG CTC ACC GCC TTG GCT TGT C-3’ Endoglin 5’-GGT ACA GTG CAT CGA CAT GG-3’ 5’-GCT GGC CTA GCT CTA TGG TG-3’ FABP4 5’-ATG TGT CAT GAA AGG CGT GA-3’ 5’-AAA CCA CCA AAT CCC ATC AA-3’ KLF9 5’-GTC ACG ACC AGA GTG CTT CA-3’ 5’-GGT GTG CTC TTG CTT GCA TA-3’ KLF15 5’-AGA GGA AGC CAT GCT GAG AA-3’ 5’-GGC TCC ATT TGT CTT GCA TT-3’ BMP4 5’-GAC CCT GGT CAA CTG CGT TA-3’ 5’-CTC CAC CAC CAT CTC CTG AT-3’ BMP7 5’-GCT GCC ACT AGG TCT TCC TG-3’ 5’-TCA GGA GAG GTG CTT GGT CT-3’ Materijal i metodi 23 XOWUDFHQWULIXJLPLQQDJ'RELMHQLVXSHUQDWDQWLVXNRULåþHQL za Western blot analizu. 2GUHāLYDQMHNRQFHQWUDFLMHSURWHLQD .ROLĀLQD SURWHLQD MH RGUHāLYDQD SR PHWRGL /RZU\ L VDUDGQLND (1951). Metoda se zasniva na reakciji peptidnih veza i Cu++ jona u alkalnoj sredini i reakciji fosfo-molibdensko fosfo-volframovog reagensa VD DURPDWLĀQLP DPLQRNLVHOLQDPD WULSWRIDQ L WLUR]LQ  X SROLSHSWLGQLP lancima. Nastalo kompleksno jedinjenje plave boje ima maksimum apsorbcije na 500 nm. Intenzitet boje je proporcionalan koncentraciji SURWHLQD NRMD VH RĀLWDYD VD VWDQGDUGQH NULYH NRQVWUXLVDQHPHUHQMHP apsorbance rastvora albumina na 500 nm. Koncentracija proteina se izraçava u mg/ml. 3.3.3. Elektroforeza proteina Proteini su razdvajani po molekulskim masama SDS- poliakrilamidnom elektroforezom (SDS-PAGE) u BioRad Mini-PROTEAN ,,,VLVWHPX.RULåþHQLJHORYL]DUD]GYDMDQMHELOLVXUD]OLĀLWHSURFHQWQRVWL zavisno od molekulske mase traçenog proteina, a gelovi za koncentrovanje 5% (5% akrilamid/bisakrilamid; 0.1% SDS; 0.125 M 7ULV S+   3ROLPHUL]DFLMD JHORYD MH RPRJXþHQD GRGDYDQMHP  DPRQLMXPSHUVXOIDWD $36 L111Ƙ1ƘWHWUDPHWLOHWLOHQGLDPLQD (TEMED). Pufer za rezervoare se sastojao od 0.192 M glicina, 0.1% SDS L  0 7ULV S+  8 RGUHāHQX ]DSUHPLQX SURWHLQVNRJ UDVWYRUD dodata je jednaka zapremina pufera za uzorke (4% SDS; 20% glicerol; ǃPHUNDSWRHWDQRO07ULVS+EURPIHQROSODYR  a zatim su uzorci kuvani 5 min. Za detekciju VEGF na gelove je QDQRåHQR SR  PJ SURWHLQD GRN MH ]D SUDþHQMH RVWDOLK SURWHLQD X eksperimentu nanoåeno po 10 mg proteina. Na gelove je nanoåen i SURWHLQVNL PDUNHU X FLOMX RGUHāLYDQMD PROHNXOVNLK PDVD )HUPHQWDV SAD). Elekroforeza je trajala 60 min pri konstantnom naponu od 120V. 1DNRQHOHNWURIRUH]HJHORYLVXNRULåþHQL]D:HVWHUQEORW Materijal i metodi 24 3.3.4. Western blot Nakon elektroforeze je vråen transfer proteina sa gelova na PVDF (engl. Polyvinylidene fluoride) membrane (Hybond-P, Amersham, UK). Membrane su aktivirane u metanolu (10 sec). Membrane i gelovi su pakovani i smeåtani u rezervoare sa transfer puferom (0.192 M glicin, 20% metanol i 0.025 M Tris, pH 8.3). Prenos proteina sa gelova na membrane odvijao se pri konstantnom naponu od 100 V, 60 min. Uspeånost transfera je proveravana 5% Ponceau S bojom rastvorenom u JODFLMDOQRM VLUþHWQRM NLVHOLQL =DWLP VX PHPEUDQH LQNXELUDQH  K QD sobnoj temperaturi u serumu za blokiranje slobodnih mesta na membrani - 5% BSA (engl. bovine serum albumine) u TBS-T (0.05% Tween20 u 1.5 M NaCl, 0.2 M Tris, pH 7.4). 3.3.5. Detekcija proteina nakon Western blota :HVWHUQEORW MHUDāHQQDNYDQWLWDWLYDQQDĀLQ 7LHQUXQGURM LVDU   3R EORNLUDQMX PHPEUDQH VX LQNXELUDQH VD RGJRYDUDMXþLP SULPDUQLP DQWLWHOLPD UDVWYRUHQLP X  %6$ SUHNR QRþL QD  ž& .RULåþHQD SULPDUQD DQWLWHOD VX GDWD X Tabeli 3. Nakon inkubacije i ispiranja viåka primarnog antitela, membrane su inkubirane sa RGJRYDUDMXþLPVHNXQGDUQLPDQWLWHOLPDGRELMHQLPLPXQL]DFLMRPNR]HQD IgG zeca, odnosno miåa (engl. goat-anti rabbit, Santa Cruz Biotechnology, SAD. i goat-anti mouse, BD Bioscience Pharmingen, SAD), u razblaçenju 1:2000 (antitelo: 5% BSA), 2 sata, na sobnoj temperaturi. Po inkubaciji, membrane su ispirane TBS rastvorom, 30 minuta na sobnoj temperaturi. Za vizuelizaciju proteina membrane su inkubirane u hemiluminiscentnom supstratu, luminolu, uz dodatak H2O2 (3 min). Nakon toga, rentgen filmovi (Hyperfilm, Amershcam, UK) su izlagani ekscitovanom luminolu sa membrana (0.5-2 min). Filmovi VXUD]YLMDQLSDVNHQLUDQLLNRULåþHQL]DNYDQWLILNDFLMXSURWHLQVNLKWUDND $OWHUQDWLYQR PHPEUDQH VX LQNXELUDQH X UDVWYRUX KORURǂ naftola uz dodatak H2O2 do pojave traka (2-10 min), reakcija je Materijal i metodi 25 prekidana ispiranjem membrane u destilovanoj vodi, a membrane su potom skenirane za kompjutersku kvantifikaciju. Tabela 3. 3ULPDUQDDQWLWHODNRULåþHQD]D:HVWHUQEORW. 3.3.6. Kvantifikacija rezultata dobijenih Western blot analizom i VWDWLVWLĀNDREUDGDUH]XOWDWD .YDQWLILNDFLMDMHUDāHQDSRPRþXVRIWYHUVNRJSDNHWD,PDJH4XDQW Rezultati izraçeni putem integracije volumena predstavljaju sumu YUHGQRVWL VYLK SLNVHOD SREXāHQLK VLJQDORP  SLNVHO  PP2) XQXWDU R]QDĀHQRJ REMHNWD X QDåHP VOXĀDMX WUDNH YL]XHOL]RYDQH QD SUHWKRGQRREMDåQMHQQDĀLQ2YDYUHGQRVWXPDQMHQD]Dbackground tj. fon pozadine, predstavlja volume (tj. intenzitet zatamnjenja na celoj povråini trake). 6WDWLVWLĀND ]QDĀDMQRVW UH]XOWDWD MH RGUHāLYDQD $129$ WHVWRP 3ULPHQRP RYRJ WHVWDPRJXþH MH SURFHQLWL GD OL MH UD]OLND L]PHāX GYH JUXSH ]QDĀDMQD SRVOHGLFD SULPHQMHQRJ WUHWPDQD  LOL QH UH]XOWDW VOXĀDMQH JUHåNH  =D QDMQLçL VWHSHQ ]QDĀDMQRVWL X]HWD MH YUHGQRVW YHURYDWQRþHS Antigen Poreklo 3URL]YRāDĀ .DWDORåNLEURM Razblaçenje UCP1 =HĀMH Abcam, UK ab10983 1:1000 33$5DŽ =HĀMH $EFDP8. DE  PCNA =HĀMH Santa Cruz, SAD sc-7907 1:300 BMP7 =HĀMH $EFDP8. DE 4 µg/ml 3*&ǂ =HĀMH Abcam, UK ab5448 1:1000 Drp1 =HĀMH $EFDP8. DE 1 µg/ml Mtf2 Miåje Abcam, UK ab56889 2 µg/ml VEGF Miåje Abcam, UK ab68334 5 µg/ml Materijal i metodi 26 3.4. ANALIZA TKIVA NA NIVOU SVETLOSNE MIKROSKOPIJE 3.4.1. Priprema tkiva za svetlosnu mikroskopiju Za histoloåku analizu, jedan deo BAT je fiksiran u 4% neutralnom IRUPDOLQX 1DNRQ LVSLUDQMD  ĀDVD ĀHVPHQVNRP YRGRP WNLYR MH GHKLGUDWLVDQRNUR]VHULMXDONRKRODUDVWXþHNRQFHQWUDFLMHSURVYHWOMHQRX NVLOROX LXNDOXSOMHQRXSDUDSODVW  ĀDVRYDQD WHPSHUDWXUL RG ƒ&  'RELMHQLNDOXSLWNLYDVHĀHQLVXVHULMVNLQDSUHVHNHGHEOMLQH—P 3.4.2. Imunohistohemijska tehnika detektovanja proteina streptavidin-biotin metodom ,PXQRKLVWRKHPLMVNR REHOHçDYDQMH VSHFLILĀQLK DQWLJHQD UDāHQR MH senzitivnom tehnikom biotin/streptavidin peroksidaznog bojenja SRPRþXNRPHUFLMDOQRJ/6$%NRPSOHWD 'DNR6FLHQWLILF'DQVND ÿLWDY postupak se odvija na sobnoj temperaturi, osim inkubacije u SULPDUQRPDQWLWHOXNRMDVHYUåLQDÝ&K Preseci su deparafinisani ksilolom (2 x 5 min), a rehidratisani NUR]VHULMXUDVWYRUDHWDQRODRSDGDMXþLKNRQFHQWUDFLMD L VYH do vode (sve po 5 min inkubacije). Nakon toga su inkubirani 10 minuta u 3% rastvoru H2O2 u metanolu, da bi se blokirala endogena peroksidaza. Po blokiranju preseci su ispirani 0.01M PBS (engl. phosphate-buffered saline) (0.01M Na2HPO4, 0.9% NaCl, pH 7.2), pa LQNXELUDQLKXSULPDUQRPDQWLWHOXQDÝ& YODçQDVUHGLQD  .RULåþHQD VX ]HĀMD SULPDUQD DQWLWHOD QD 3&1$ L (5ǂ 6DQWD &UX] 6$'  X UD]EODçHQMX  8&3   %03  ǍJPO  QRUDGUHQDOLQ  9(*) ǍJPO 33$5DŽ   L3*&ǂ   $EFDP 8.  .L UD]EODçHQMD  'DNR 6FLHQWLILF 'DQVND  L (5ǃ razblaçenja 1:1500 (GeneTex, SAD). Uklanjanje nevezanih antitela je YUåHQR LVSLUDQMHP X 3%6 QDNRQ ĀHJD VX SUHVHFL LQNXELUDQL X biotinizovanoj smeåi sekundarnih antitela - Yellow link (smeåa anti- Materijal i metodi 27 PLåMLK DQWL]HĀMLK L DQWLNR]MLK DQWLWHOD L] /6$% NRPSOHWD  WRNRP  min. Posle ispiranja u PBS izvråena je inkubacija streptavidin-HRP (engl. horseradish peroxidase) kompleksom - Red Streptavidin iz pomenutog kompleta, inkubiranjem tokom 25 minuta. Nakon ovoga su preseci ispirani u PBS. =D YL]XHOL]DFLMX LPXQRNRPSOHNVD NRULåþHQ MH    GLDPLQREHQ]LGLQ '$% 6LJPD$OGULFK &KHPLH 1HPDĀND  UDVWYRUHQ X PBS, u prisustvu H2O2. Reakcija je prekinuta posle 10 minuta LVSLUDQMHPXĀHVPHQVNRMYRGL1DNRQWRJDYUåHQRMHNRQWUDVWQRERMHQMH KHPDWRNVLOLQRPLSUHNLQXWRĀHVPHQVNRPYRGRP3R]DYUåHQRPERMHQMX SUHVHFL VX GHKLGUDWLVDQL NUR] VHULMX DONRKROD UDVWXþLK NRQFHQWUDFLMD (95%, 100%), i ksilol, pa montirani u DPX. Gotovi preparati su posmatrani i slikani na svetlosnom mikroskopu DMLB (Leica 0LFURV\VWHPV1HPDĀND  3.4.3. Imunohistohemijska tehnika detektovanja i kolokalizacije proteina fluorescentno-obeleçenim antitelima Fluorescentna imunohistohemijska detekcija proteina u humanom fBAT izvråena je na parafinskim presecima debljine 5µm, GHSDUDILQL]LUDQLP L UHKLGUDWLVDQLP UXWLQVNL QDNRQ ĀHJD VH SULVWXSLOR GHPDVNLUDQMX HSLWRSD L LVSLUDMX X 3%6 QD LVWL QDĀLQ NDR ]D /6$% PHWRGX %ORNLUDQMH QHVSHFLILĀQRJ YH]LYDQMD MH L]YUåHQR LQNXELUDQMHP preseka u 1% rastvoru BSA u 0.1% rastvoru Triton X deterdçenta u PBS, 30 min. Preseci su, bez ispiranja zatim inkubirani sa smeåom SULPDUQLKDQWLWHODQD(5ǂ 6DQWD&UX]6$' XUD]EODçHQMXL(5ǃ *HQH7H[ 6$'  X UD]EODçHQMX  SUHNR QRþL QD  0C. Nakon inkubacije preseci su isprani u PBS i inkubirani fluorescentno- REHOHçHQLP RGJRYDUDMXþLP VHNXQGDUQLP DQWLWHOLPD DQWL]HĀMHDQWL miåje fluorescinom (FITC) obeleçeno antitelo, zapreminskog razblaçenja  $EFDP 8.  DQWL]HĀMHDQWLPLåMH $OH[D )OXRUŠ  REHOHçHQR antitelo, zapreminskog razblaçenja 1:2000, (Invitrogen, UK)), 30 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Po ispiranju, preseci su montirani u Materijal i metodi 28 0RZLROŠ 3RO\VFLHQFHV 1HPDĀND  L DQDOL]LUDQL QD NRQIRNDOQRP PLNURVNRSX/60 &DUO=HLVV1HPDĀND  ,VWL SRVWXSDN MH XSRWUHEOMHQ ]D GHWHNFLMX L NRORNDOL]DFLMX (5ǂ L (5ǃ VD 33$5DŽ L 3*&ǂ NRULåþHQMHP RGJRYDUDMXþLK VHNXQGDUQLK DQWLWHOD 3ULPDUQD DQWLWHOD VX NRULåþHQD X UD]EODçHQMX  ]D 33$5DŽ $EFDP8. L]D3*&ǂ $EFDP8.  .YDQWLILNDFLMD L VWDWLVWLĀNDREUDGD UH]XOWDWDNRORNDOL]DFLMH proteina Kvantifikacija kolokalizacije imunofluorescentno obeleçenih SURWHLQD MH XUDāHQD QD SR GHVHW PLNURJUDILMD VOLNDQLK SRG LVWLP XVORYLPD X] SRPRþ ,PDJH- -$&R3 SURJUDPD L]UDĀXQDYDQMHP Pearsonovog koeficijenta korelacije (r) (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugin s/track/jacop.html), Bolte i Cordelieres, 2006). Vrednost Pearsonovog NRUHODFLRQRJ NRHILFLMHQWD YHþD RG  VPDWUD VH SRX]GDQLP SRND]DWHOMHP NRORNDOL]DFLMH L]PHāX GYH IOXRURIRUH RGQRVQR GYD fluorescentno obeleçena proteina (Zinchuk i Zinchuk, 2008). Rezultati su prikazani u vidu srednjih vrednosti za svaku grupu ± VWDQGDUGQDJUHåND 6( 6WXGHQWWWHVWNRULåþHQMH]DSRUHāHQMHVUHGQMLK YUHGQRVWL =DQDMQLçL VWHSHQ ]QDĀDMQRVWL X]HWD MH YUHGQRVW YHURYDWQRþH p<0.05. 3.5. ANALIZA TKIVA NA NIVOU TRANSMISIONE ELEKTRONSKE MIKROSKOPIJE (TEM) 3.5.1. Priprema tkiva za TEM ,VHĀFLWNLYDYHOLĀLQHRNRPP3 fiksirani su 2.5% glutaraldehidom XIRVIDWQRPSXIHUX 0S+ ĀDVDSDSRVWILNVLUDQLRVPLMXP WHWURNVLGRPX LVWRP SXIHUX  ĀDVD QD VREQRM WHPSHUDWXUL 8]RUFL VX GHKLGUDWLVDQL VHULMRP DONRKROD UDVWXþH NRQFHQWUDFLMH L SURVYHWOMHQL X Materijal i metodi 29 propilen-oksidu. Kalupljenje je izvråeno u Araldit smoli (Fluka, 1HPDĀND ĀDVDQDWHPSHUDWXULRGž& 'RELMHQL NDOXSL VHĀHQL VX 8& XOWUDPLNWURWRPRP /HLFD 0LFURV\VWHPV1HPDĀND QDWDQNHSUHVHNH QP 3UHVHFLVXVWDYOMDQL na mreçice i kontrastrirani uranil acetatom i olovo citratom u EM stain DSDUDWX /HLFD0LFURV\VWHPV1HPDĀND =DSRWUHEHLPXQRFLWRKHPLMVNH GHWHNFLMHSURWHLQDSUHVHFL VXVWDYOMDQLQDPUHçLFHSUHVYXĀHQHRORYNRP za poboljåanje adhezije preseka (Coat-Quick »G«, Agar Scientific Ltd, UK). Preseci su posmatrani i snimani na TEM CM12 (Philips/FEI, Holandija). 3.5.2. Imunocitohemijska metoda detekcije proteina (imunogold metoda) na nivou TEM =DGHWHNFLMX(5ǂ L(5ǃQDXOWUDVWUXNWXUQRPQLYRXXKXPDQRP I%$7 NRULåþHQD MH LPXQRFLWRKHPLMVND PHWRGD GHWHNFLMH X] SRPRþ VHNXQGDUQLK DQWLWHOD REHOHçHQLK ĀHVWLFDPD ]ODWD LPXQRJROG PHWRGD  Nakon otkrivanja epitopa u citratnom puferu (3 minuta na 600W) i ispiranja u 1% TBS-Tween (engl. Tris-buffered saline – Tween), EORNLUDQRMHQHVSHFLILĀQRYH]LYDQMHDQWLWHODLQNXEDFLMRPWDQNLKSUHVHND u 5% rastvoru BSA u TBS-Tween, 1h na sobnoj temperaturi. Mreçice sa SUHVHFLPD VX SRWRP QDQRåHQH QD NDS SULPDUQRJ DQWLWHOD DQWL]HĀMH SROLNORQVNR QD (5ǂ L DQWLPLåMH PRQRNORQVNR QD (5ǃ RGJRYDUDMXþHJ UD]EODçHQMD  L LQNXELUDQH SUHNRQRþL QD  0C. Po zavråetku inkubacije preseci su isprani u TBS-Tween (10 puta po 1 minut) a zatim inkubirani RJRYDUDMXþLP VHNXQGDUQLP DQWLWHOLPD DQWLPLåMH RGQRVQR DQWL]HĀMH sekundarno antitelo, zapreminskog razblaçenja 1:20, Abcam, SAD) REHOHçHQLPĀHVWLFDPD]ODWDYHOLĀLQHQPKQDVREQRMWHPSHUDWXUL3R zavråetku inkubacije, preseci su isprani u TBS-Tween (deset puta) i destilovanoj vodi, osuåeni, posmatrani i snimani na TEM CM12. 30 4. REZULTATI 4.1. $1,0$/1,02'(/,=/$*$1-$+/$'12ý,  (IHNDW L]ODJDQMD KODGQRþL QD WHUPRJHQL NDSDFLWHW %$7 L mitohondriogenezu 4.1.1.1. Ekspresija UCP1 u BAT .ROLĀLQD8&3L51. 3URPHQH NROLĀLQH L51. ]D 8&3 SULND]DQH VX QD Grafiku 1. ,]ODJDQMH SDFRYD KODGQRþL SRYHþDYD NROLĀLQX 8&3 L51. YHþ QDNRQ WUHþHJ VDWD S  L RGUçDYD VH VYH GR NUDMD LVSLWLYDQRJ SHULRGD 0DNVLPDOQRSRYHþDQMHNROLĀLQHL51.]D8&3XRGQRVXQDNRQWUROX ]DEHOHçHQRMHVDWDL]ODJDQMDKODGQRþL Grafik 1. 3URPHQDNROLĀLQH8&3L51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom; ***p<0.001. .ROLĀLQD8&3SURWHLQD Rezultati analize proteinske ekspresije UCP1 pokazuju da L]ODJDQMHKODGQRþLGRYRGLGRSRYHþDQMDNROLĀLQH8&3 S  WRNRP ĀDVRYQRJL]ODJDQMDKODGQRþLNDRåWRMHVOXĀDMVDL51. Slika 11). Rezultati 31 Slika 11. 3URPHQD NROLĀLQH 8&3 SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S 4.1.1.1.3. Imunohistohemijska detekcija UCP1 U BAT pacova kontrolne grupe detektovana je blaga imunopozitivnost na UCP1 lokalizovana u citoplazmi mrkih adipocita (Slika 12). 7ULVDWD L]ODJDQMDKODGQRþLVQDçQR LQGXNXMH LPXQRSR]LWLYQRVWQD UCP1 u citoplazmi mrkih adipocita, a reakcija je detektovana i u YH]LYQRWNLYQRM VWURPL QDURĀLWR RNR NDSLODUD 8 RYRM JUXSL ]DSDçD VH KHWHURJHQRVWPHāXþHOLMDPDXVPLVOXHNVSUHVLMH8&31DLPHX%$7VH QDL]PHQLĀQR VPHQMXMX JUXSDFLMH PDQMHJ EURMD þHOLMD NRMH VX 8&3 SR]LWLYQH L JUXSDFLMH þHOLMD NRMH VX QHJDWLYQH ]D 8&3 W]Y Å+DUOHNLQ efekat“. Ovaj efekat je zapaçen kod svih ispitivanih grupa, ali je najviåe L]UDçHQ NRG JUXSH NRMD MH L]ODJDQD KODGQRþL WUL VDWD 3RUHG SRYHþDQMD LPXQRUHDNFLMH X PUNLP DGLSRFLWLPD JUXSH NRMH VX L]ODJDQH KODGQRþL 12-72 sata pokazuju reakciju i u citoplazmi unilokulusnih adipocita kao L X SRMHGLQLP HQGRWHOVNLP þHOLMDPD 3RUHG WRJD XRĀHQD MH ORNDOL]DFLMD 8&3 X QXNOHXVLPD PUNLK DGLSRFLWD D QDMMDĀD QXNOHXVQD LPXQRSR]LWLYQRVW]DSDçHQDMHXJUXSLNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWD /RNDOL]DFLMD 8&3 X QXNOHXVLPD PUNLK DGLSRFLWD MH SRWYUāHQD imunogold metodom (naåi neobjavljeni podaci). Rezultati 32 Na slici 13 prikazane su reprezentativne mikrografije preseka WNLYDJUXSHNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWDQDYHþHPXYHOLĀDQMX.DR åWR VH YLGL WNLYR SRND]XMH þHOLMVNX KHWHURJHQRVW X SRJOHGX HNVSUHVLMH 8&3 NRML VH HNVSULPLUD X QDMYHþHP EURMX PUNLK DGLSRFLWD DOL detektovani su i mrki adipociti sa potpunim odsustvom reakcije. +HWHURJHQRVW þHOLMD X SRJOHGX HNVSUHVLMH 8&3 VPR ]DSD]LOL QH VDPR X PUNLP DGLSRFLWLPD  YHþ L X HQGRWHOVNLP L JODWNLP PLåLþQLP þHOLMDPDYHþLKNUYQLKVXGRYD%$7 4.1.1.2. Imunohistohemijska detekcija noradrenalina Za razliku od kontrolne grupe u kojoj je detektovana umerena LPXQRSR]LWLYQRVW]DQRUDGUHQDOLQXVYLPLVSLWLYDQLPWDĀNDPDL]ODJDQMD KODGQRþL ]DEHOHçHQR MH SRYHþDQMH LPXQRUHDNFLMH 5HDNFLMD MH detektovana u nervnim zavråecima, citoplazmi mrkih adipocita i HQGRWHOVNLK þHOLMD L X YH]LYQRWNLYQRM VWURPL RNR NUYQLK VXGRYD 6D SRYHþDQMHPWUDMDQMDVWLPXOXVDUHDNFLMDQDQRUDGUHQDOLQVHGHWHNWXMHLX QXNOHXVLPDPUNLKDGLSRFLWDLHQGRWHOVNLKþHOLMDåWRMHSRVHEQRL]UDçHQR X JUXSL NRMD MH L]ODJDQD  VDWD KODGQRþL JGH MH UHDNFLMD QDMYHþLP delom zabeleçena u nukleusima (Slika 14). Rezultati 33 Slika 12. Imunohistohemijska detekcija UCP1 u BAT kontrolne grupe (a) i grupa L]ODJDQLKKODGQRþL b-g). 2ULJXYHOLĀDQMH[ Rezultati 34 6OLND7NLYQD þHOLMVND VSHFLILĀQRVW8&3HNVSUHVLMHX%$7Ekspresija UCP1 je detektovana u nukleusima mrkih adipocita (a), adipogeno-angiogenim klasterima (b,c) LJODWNLPPLåLþQLPþHOLMDPDYHþLKNUYQLKVXGRYD d). Imunopozitivnost mrkih adipocita VHUD]OLNXMHL]PHāXþHOLMD e,f) a detektovani su mrki adipociti (e LHQGRWHOVNHþHOLMH f) NRMHQLVXSRND]DOHLPXQRUHDNWLYQRVW VWUHOLFH 2ULJXYHOLĀDQMH[ Rezultati 35 Slika 14. Imunohistohemijska detekcija noradrenalina u BAT kontrolne grupe (a) i JUXSDL]ODJDQLKKODGQRþL b-g). 2ULJXYHOLĀDQMH[ Rezultati 36 (NVSUHVLMD33$5DŽX%$7 .ROLĀLQD33$5DŽL51. 8 SRUHāHQMX VD NRQWURORP NRG çLYRWLQMD L]ODJDQLK KODGQRþL GHWHNWRYDQR MH ]QDĀDMQRSRYHþDQMH HNVSUHVLMH33$5DŽ L51.QDNRQ  S LVDWL S GRNMHNROLĀLQD33$5DŽL51.MHGQDND NRQWUROLSRVOHL]ODJDQMDKODGQRþLVDWD(Grafik 2). Grafik 2. 3URPHQDNROLĀLQH33$5DŽL51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom; ***p<0.001; *p<0.05. .ROLĀLQD33$5DŽSURWHLQD Na slici 15SULND]DQHVXSURPHQHNROLĀLQH33$5DŽSURWHLQDX%$7 .RGVYLKJUXSDL]ODJDQLKKODGQRþL]DEHOHçHQMH]QDĀDMQRYLåLQLYR33$5DŽ SURWHLQD S XRGQRVXQDNRQWUROXDQDMYHþDYUHGQRVWMHXRĀHQD kod çivotinja koje su izlagane 24 sata. (NVSUHVLMD3*&ǂX%$7 .ROLĀLQD3*&ǂL51. Grafik 3SULND]XMHSURPHQHNROLĀLQH3*&ǂL51.X%$7SDFRYD WRNRPL]ODJDQMDSDFRYDKODGQRþL2VLPJUXSHL]ODJDQHKODGQRþLVDWL NRG NRMH VH GHWHNWXMH ]QDĀDMQR VPDQMHQMH S  X RGQRVX QD Rezultati 37 NRQWUROXVYHJUXSHSRND]XMX]QDĀDMQRSRYHþDQMHNROLĀLQH3*&ǂL51. (p<0.001). Slika 15. 3URPHQD NROLĀLQH 33$5DŽ SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S Grafik 3. 3URPHQD NROLĀLQH 3*&ǂ L51. X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S Rezultati 38 .ROLĀLQD3*&ǂSURWHLQD 9UHPHQVNL ]DYLVQH SURPHQH NROLĀLQH 3*&ǂ SULND]DQH VX QD slici 16 7RNRP L]ODJDQMDKODGQRþL GHWHNWRYDQR MH ]QDĀDMQR SRYHþDQMH 3*&ǂ SURWHLQD X VYLP HNVSHULPHQWDOQLP JUXSDPD X RGQRVX QD NRQWUROXVDQDMYHþRPGHWHNWRYDQRPYUHGQRåþXQDNRQVDWD Slika 16. 3URPHQD NROLĀLQH 3*&ǂ SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S 4.1.1.5. Ultrastrukturna analiza mitohondriogeneze u mrkim adipocitima 1D QLYRX 7(0 XRĀDYD VH GD PLWRKRQGULMH PUNLK DGLSRFLWD NRQWUROQHJUXSHYDULUDMXXSRJOHGXYHOLĀLQHLREOLNDLGDSRVHGXMXPDOL EURMNULVWLVODELMHXUHāHQRVWL Slika 17). 8 VYLP JUXSDPD NRMH VX L]ODJDQH KODGQRþL SRYHþDYD VH EURM PLWRKRQGULMD NRMH ]DGRELMDMX SUDYLODQ ORSWDVW REOLN L SRYHþDQ EURM SUDYLOQRXUHāHQLKSDUDOHOQRSRVWDYOMHQLKNULVWL 0LWRKRQGULMH JUXSH L]ODJDQH KODGQRþL  VDWD SRND]XMX QDMYHþX heterogenost u pogledu oblika. Naime, „smenjuju“ se mrki adipociti sa NODVLĀQLP ORSWDVWLP PLWRKRQGULMDPD L PUNL DGLSRFLWL VD YHRPD raznolikim oblicima mitohondrija, od loptastih preko izduçenih do Rezultati 39 ovalnih, kao i mitohondrijama u deobi. Kriste ove grupe mitohondrija joå uvek nisu u potpunosti diferencirane, za razliku od grupe koja je L]ODJDQD KODGQRþL  VDWL NRG NRMH MH QDMYHþL EURM PLWRKRQGULMD X potpunosti termogeno osposobljen, sa velikim brojem paraleno SRVWDYOMHQLKNULVWL3RUHGQMLKXRĀDYDMXVHLPDOHDWLSLĀQHPLWRKRQGULMH VYHWORJKRPRJHQRJPDWULNVDQDMĀHåþHEH]NULVWL7RNRPGDOMHJL]ODJDQMD KODGQRþL SRUHG WRJD åWR VXPLWRKRQGULMH EURMQH XJODYQRPX IL]LĀNRP kontaktu sa lipidnim telima, zapaçena su i brojna lipidna tela unutar PLWRKRQGULMD 8 VYLP HNVSHULPHQWDOQLP JUXSDPD XRĀHQD MH PLWRKRQGULMDOQD ORND]LOL]DFLMD X] HQGRSOD]PDWLĀQL UHWLNXOXP 1DMYHþL broj velikih, „megamitohondrija“ u kojima se vidi pregrupisavanje kristi QDSRORYLPDGHWHNWRYDQRMHXJUXSLL]ODJDQRMKODGQRþLVDWD Rezultati 40 Slika 17. Mitohondrije BAT pacova kontrolne grupe (a LJUXSDL]ODJDQLKKODGQRþL b- g  ,]ODJDQMHKODGQRþLGRYRGLGRSRMDYHPLWRKRQGULMDUD]OLĀLWLKREOLND b LYHOLĀLQH c). 0LWRKRQGULMH VX ĀHVWR ORNDOL]RYDQH X] OLSLGQD WHOD GRN VH PDQMD OLSLGQD WHOD PRJX XRĀLWL X QHNLP PLWRKRQGULMDPD c-insert  3RMDYD SUDYLOQR XUHāHQLK SDUDOHOQR SRVWDYOMHQLK NULVWL MH XRĀHQD X VYLP JUXSDPD L]ODJDQLK KODGQRþL *UXSD L]ODJDQD KODGQRþLVDWDSRND]DODMHQDMYHþXXĀHVWDORVWSRMDYHYHOLNLKPLWRKRQGULMDXNRMLPD VH ]DSDçDSUHJUXSLVDYDQMH NULVWL NDSRORYLPD VWUHOLFH 2ULJ XYHOLĀDQMH [ d- insert): 31000x. Rezultati 41 .ROLĀLQDPW'1. 8 RGQRVX QD NRQWUROQX JUXSX NROLĀLQD PW'1. VH ]QDĀDMQR VPDQMXMH NRG JUXSD L]ODJDQLK KODGQRþL   L  VDWD S  D ]QDĀDMQRSRYHþDQMHVHXRĀDYDLVDWD S 1DMYHþDYUHGQRVW NROLĀLQHPW'1.MHSRND]DQDXJUXSLNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWLGRN grupa koja je izlagana 48 sati nije pokazala promene, odnosno odrçala je nivo mtDNK na kontrolnom nivou (Grafik 4). Grafik 4. 3URPHQDNROLĀLQHPW'1.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMHVD kontrolnom grupom ***p<0.001, **p<0.01 .ROLĀLQD'USSURWHLQD 3URPHQH NROLĀLQH 'US SURWHLQD SULND]DQH VX QD slici 18. U SRUHāHQMXVDNRQWURORPL]ODJDQMHçLYRWLQMDKODGQRþL]QDĀDMQR S  SRYHþDYD NROLĀLQX 'US SURWHLQD X VYLP LVSLWLYDQLP YUHPHQVNLP WDĀNDPD 0DNVLPDOQD YUHGQRVW MH SRND]DQD X JUXSL çLYRWLQMD NRMH VX L]ODJDQHKODGQRþLVDWD .ROLĀLQD0IQSURWHLQD Rezultati proteinske ekspresije mitofuzina 2 (Slika 19) pokazuju GD L]ODJDQMH KODGQRþL SRYHþDYD NROLĀLQXPLWRIX]LQDX VYLP LVSLWLYDQLP Rezultati 42 WDĀNDPD S 1DMYHþD]DSDçHQDSURWHLQVNDHNVSUHVLMD]DEHOHçHQD MHQDNRQVDWLL]ODJDQMDKODGQRþL Slika 18. 3URPHQD NROLĀLQH 'US SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S Slika 19. 3URPHQD NROLĀLQH 0IQ SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S Rezultati 43 .ROLĀLQD15)SURWHLQD Slika 20 SULND]XMH GD L]ODJDQMH KODGQRþL SRYHþDYD NROLĀLQX SURWHLQD15)X VYLP LVSLWLYDQLP WDĀNDPDXSRUHāHQMX VD NRQWURORP (p<0.001). Slika 20. 3URPHQD NROLĀLQH 1UI SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S  (IHNDW L]ODJDQMD KODGQRþL QD SUROLIHUDFLMX L GLIHUHQFLMDFLMX þHOLMDDGLSRJHQRJSXODX%$7 (NVSUHVLMD&(%3ǂ .ROLĀLQD&(%3ǂL51. 573&5 DQDOL]D ]D &(%3ǂ SULND]DQD MH QD grafiku 5. Nivo WUDQVNULSWD ]D &(%3ǂ L]UD]LWR MH PDQML X VYLP LVSLWLYDQLP WDĀNDPD HNVSHULPHQWD WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL S  NRMH VNRUR X potpunosti gasi transkripciju ovog gena u BAT pacova. Rezultati 44 Grafik 5. 3URPHQD NROLĀLQH &(%3ǂ L51. X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S (NVSUHVLMD33$5Dž .ROLĀLQD33$5DžL51. Grafik 6 SULND]XMH ]QDĀDMQR YDULUDQMH X NROLĀLQL 33$5ĵ L51. PHāX UD]OLĀLWLP WDĀNDPD L]ODJDQMD KODGQRþL ,]ODJDQMH KODGQRþL  S LVDWL S VQLçDYDNROLĀLQXWUDQVNULSWDX%$7SDFRYD GRN L]ODJDQMH LVDWLSRYHþDYDNROLĀLQX33$5ĵ L51. S 8 JUXSL çLYRWLQMD NRMH VX L]ODJDQH KODGQRþL  L  VDWD NROLĀLQD L51. 33$5ĵMHQDQLYRXNRQWUROQHJUXSH Grafik 6. 3URPHQDNROLĀLQH33$5ĵL51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom ***p<0.005; **p<0.05. Rezultati 45 4.1.2.3. Ekspresija PCNA .ROLĀLQD3&1$SURWHLQD 3URPHQH NROLĀLQH 3&1$ SURWHLQD SULND]DQH VX QD slici 21. U SRUHāHQMXVDNRQWURORPL]ODJDQMHçLYRWLQMDKODGQRþL S SRND]XMH tendenciju rasta ekspresije PCNA proteina u svim ispitivanim YUHPHQVNLP WDĀNDPD RVLP  VDWD NDGD MH GHWHNWRYDQR ]QDĀDMQR smanjenje (p<0.05). Slika 21. 3URPHQD NROLĀLQH 3&1$ SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S S 4.1.2.3.2. Imunohistohemijska detekcija PCNA BAT kontrolne grupe çivotinja pokazalo je veoma blagu imunopozitivnost za PCNA (Slika 22), prevashodno u vezivno-tkivnoj VWURPLDOLLXPDQMHPEURMXQXNOHXVDPUNLKDGLSRFLWD0HāXWLPYHþRG  VDWD L]ODJDQMD  KODGQRþL ]DSDçHQD MH VQDçQD LQGXNFLMD 3&1$ LPXQRUHDNWLYQRVWL SRYHþDQMHP EURMD 3&1$ SR]LWLYQLK QXNOHXVD HQGRWHOVNLK SUHNXUVRUVNLK L þHOLMD PUNLK DGLSRFLWD L SRMDYRP MDNH reakcije u vezivno-tkivnoj stromi. Isti obrazac reakcije detektovan je u VYLP RVWDOLP LVSLWLYDQLP WDĀNDPD X] SRMDYX EODJH FLWRSOD]PDWVNH Rezultati 46 UHDNFLMH 1DMYHþL EURM QXNOHXVD SR]LWLYDQ ]D 3&1$ MH SRND]DQ X JUXSL NRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWD 4.1.2.4. Ekspresija Ki-67 4.1.2.4.1. Imunohistohemijska detekcija Ki-67 Slika 23 pokazuje imunohistohemijsku detekciju Ki-67 u BAT. .DR åWR VH YLGL QDMYHþL EURM PUNLK DGLSRFLWD NRQWUROQH JUXSH QLMH SR]LWLYDQ QD .L ]D UD]OLNX RG HQGRWHOVNLK þHOLMD ,]ODJDQMH KODGQRþL GRYRGL GR SRMDĀDQH LPXQRUHDNFLMH X SUYLP VDWLPD  VDWL  NDGD MH GHWHNWRYDQD UHDNFLMD MDĀD X HQGRWHOVNLP þHOLMDPD L YH]LYQRWNLYQRM VWURPL 1HåWR VODELMD UHDNFLMD LDNR MDĀD RG NRQWUROQH SRND]DQD MH X JUXSDPD L]ODJDQLPKODGQRþLXSHULRGXRGVDWDNDGDVHUHDNFLMD detektuje i u citoplazmi mrkih adipocita. Imunopozitivnost se opet SRYHþDYD RG  L  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL QDMYHþLP GHORP X HQGRWHOVNLPþHOLMDPD Rezultati 47 Slika 22. Imunohistohemijska detekcija PCNA u BAT kontrolne grupe (a) i grupa L]ODJDQLKKODGQRþL b-g). Reprezentativne mikrografije vezivno-tkivne strome (c-insert), QXNOHXVD HQGRWHOVNLK þHOLMD e-insert  L JODWNLK PLåLþQLK þHOLMD DUWHULROD g-insert) SR]LWLYQLKQD3&1$2ULJXYHOLĀDQMH[ Rezultati 48 Slika 23. Imunohistohemijska detekcija Ki-67 u BAT kontrolne grupe (a) i grupa L]ODJDQLKKODGQRþL b-g 2ULJXYHOLĀDQMH[ Rezultati 49 4.1.2.5. Ekspresija FABP4 (engl. fatty acid binding protein 4) .ROLĀLQD)DESL51. U odnosu na kontrolnu grupu, nivo transkripta (Grafik 7) za )DES VH ]QDĀDMQR VPDQMXMH NRG JUXSD L]ODJDQLK KODGQRþL  L  VDWL S GRNVH]QDĀDMQRSRYHþDQMHGHWHNWXMHXJUXSDPDNRMHVXELOH L]ODJDQHKODGQRþLLVDWD S  Grafik 7. 3URPHQDNROLĀLQH)$%3L51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom ***p<0.005. 4.1.2.6. Ekspresija Myf5 .ROLĀLQD0\IL51. 3URPHQHNROLĀLQH0\IL51.SULND]DQHVXQDgrafiku 8. Izlaganje SDFRYDKODGQRþLVPDQMXMHNROLĀLQX0\IL51.VDWD S LVDWD S GRN MHXRVWDOLP LVSLWLYDQLPWDĀNDPDNROLĀLQD0\I]QDĀDMQR SRYHþDQDXRGQRVXQDNRQWUROX S  4.1.2.7. Ekspresija BMP7 .ROLĀLQD%03L51. U odnosu na kontrolnu grupu, nivo transkripta za BMP7 se ]QDĀDMQRVPDQMXMHNRGJUXSDL]ODJDQLKKODGQRþL S LVDWL Rezultati 50 S D]DWLPVHSRYHþDYDGRVWLçXþLNRQWUROQLQLYRVDWD1DNRQ WRJDQLYR WUDQVNULSWD]D%03VH]QDĀDMQRSRYHþDYDXJUXSL L]ODJDQRM KODGQRþL  VDWL S  =QDĀDMQR VPDQMHQMH S  VH RSHW GHWHNWXMHSRVOHVDWDL]ODJDQMDKODGQRþL Grafik 9). Grafik 8. 3URPHQDNROLĀLQH0\IL51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom ***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05. Grafik 9. 3URPHQDNROLĀLQH%03L51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom ***p<0.001; **p<0.01;. Rezultati 51 .ROLĀLQD%03SURWHLQD .RG çLYRWLQMD L]ODJDQLK KODGQRþL XRĀHQR MH ]QDĀDMQR SRYHþDQMH NROLĀLQH%03SURWHLQDXVYLPHNVSHULPHQWDOQLPJUXSDPD S X SRUHāHQMXVDNRQWURORP Slika 24). Slika 24. 3URPHQD NROLĀLQH %03 SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S 4.1.2.7.3. Imunohistohemijska detekcija BMP7 proteina Kontrolna grupa pokazala je slabu citoplazmatsku reakciju na %03NDNRXPUNLPDGLSRFLWLPDWDNRLXFLWRSOD]PLHQGRWHOVNLKþHOLMD ,]ODJDQMH KODGQRþL WUL VDWD GRYHOR MH GR SRYHþDQMD LPXQRUHDNFLMH prvenstveno u vezivno-tkivnoj stromi, ali i u citoplazmi mrkih adipocita i SUHDGLSRFLWD SRVHEQR X þHOLMDPD DGLSRJHQRDQJLRJHQLK NODVWHUD ,VWL obrazac imunoreakcije na BMP7 zapaça se u ostalim ispitivanim WDĀNDPD D QDMMDĀD UHDNFLMD MH ]DEHOHçHQD  L  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL,QWHUHVDQWQRMHGDQDQLYRX%$7QDMMDĀXSR]LWLYQRVWSRND]XMH YH]LYQRWNLYQDVWURPDXVYLPLVSLWLYDQLPWDĀNDPD Slika 25). Rezultati 52 Slika 25. Imunohistohemijska detekcija BMP7 u BAT kontrolne grupe (a) i grupa L]ODJDQLKKODGQRþL b-g). (Insert) – HNVSUHVLMD%03XSUHDGLSRFLWX2ULJXYHOLĀDQMH 40x. Rezultati 53 4.1.2.8. Ekspresija BMP4 .ROLĀLQD%03L51. 3URPHQH NROLĀLQH L51. %03 SULND]DQH VX QD grafiku 10. ,]ODJDQMH KODGQRþL WRNRP SUYLK åHVW VDWL QLMH GRYHOR GR SURPHQD X NROLĀLQL%03L51.]DUD]OLNXRGJUXSDL]ODJDQLKLVDWD NDGD MH NROLĀLQD L51. ]D %03 ]QDĀDMQR YHþD X RGQRVX QD NRQWUROX (p<0.001). Grafik 10. 3URPHQDNROLĀLQH%03L51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom ***p<0.005. 4.1.2.9. Ekspresija KLF9 .ROLĀLQD./)L51. Grafik 11 SULND]XMH SURPHQHNROLĀLQH L51. ]D./) =D UD]OLNX RGJUXSHNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWLNRMDQLMHSRND]DODSURPHQHX JUXSDPDL]ODJDQLPKODGQRþLVDWDQLYRWUDQVNULSWDMHVQLçHQXRGQRVX na kontrolu (p<0.01), kao i u grupama izlaganim 12 (p<0.05), 48 i 72 VDWDL]ODJDQMDKODGQRþL S 6DPRJUXSDNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþL VDWDSRND]DODMHSRYHþDQXNROLĀLQX./)L51. S  Rezultati 54 Grafik 11. 3URPHQDNROLĀLQH./)L51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom ***p<0.001; **p<0.01; *p<0.05. 4.1.2.10. Ekspresija KLF15 .ROLĀLQD./)L51. 8RGQRVXQDNRQWUROXçLYRWLQMH L]ODJDQHKODGQRþLRGVDWD SRND]XMX ]QDĀDMQR VPDQMHQMH NROLĀLQH ./) L51. S  1DNRQ RYRJVPDQMHQMDNROLĀLQD./)L51.]QDĀDMQRVHSRYHþDYD S X JUXSDPDL]ODJDQLPKODGQRþLLVDWD Grafik 12). Grafik 12. 3URPHQD NROLĀLQH ./) L51. X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S Rezultati 55 4.1.2.11. Ultrastrukturna analiza proliferacije i diferencijacije mrkih adipocita Za razliku od kontrolne grupe koju karakteriåu mrki adipociti sa velikim lipidnim telima i malobrojnim mitohondrijama, grupe izlagane KODGQRþLSRND]XMX]QDĀDMQHVWUXNWXUQHSURPHQH 1DNRQ  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL XRĀDYDMX VH SURPHQH XPUNLP adipocitima na nivou lipidnih tela, mitohondrija i nukleusa (Slika 26). Lipidna tela postaju sitnija, mitohondrije menjaju oblik ka ovalnom, PDWULNV VH SURVYHWOMDYD D ĀHVWR VH XRĀDYDMX PLWRKRQGULMH X SURFHVX deobe. U nukleusima se zapaçaju nukleolusi kao i znatan broj interhromatinskih i perihromatinskih granula indikatora intezivne obrade transkripata. 1D QLYRX ĀLWDYRJ WNLYD KODGQRþD LQGXNXMH SRYHþDQMH EURMQRVWL SUHDGLSRFLWDNRMLVXXNRQWUROQRMJUXSLYHRPDUHWNRYLāDQL2YHþHOLMHVH ODNR SUHSR]QDMX QD QLYRX 7(0 SR PDORM NROLĀLQL VYHWOH FLWRSOD]PH PDOLP EURMHP PLWRKRQGULMD L OLSLGQLK NDSL 6OLĀQH SURPHQH DOL MDĀHJ LQWHQ]LWHWDVX]DSDçHQHXWNLYXJUXSHNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWL sa brojnim znacima sintetske aktivnosti mrkih adipocita i pradipocita, kao åto su poliribozomi u citoplazmi i na spoljaånjoj membrani nukleusnog ovoja (Slika 27). 3RUHG LQWHQ]LYQH SUROLIHUDFLMH L GLIHUHQFLMDFLMH þHOLMD X %$7 L]ODJDQMH KODGQRþL GRYRGL GR SRMDĀDQH LQHUYDFLMH WNLYD SRMDYH EURMQLK QHPLMHOLQL]LUDQLK QHUYQLK YODNDQD XJODYQRP X] þHOLMH DGLSRJHQR DQJLRJHQLK NODVWHUD L IRUPLUDQMD YHþLK QHUDYD JGH VH XRĀDYDMX L mijelinizirani nervni zavråeci (Slika 28). 8 VYLP JUXSDPD L]ODJDQLP KODGQRþL HYLGHQWQR MH XVLWQMDYDQMH OLSLGQLK WHOD1HVDPRGDGROD]LGRXVLWQMDYDQMDYHþLK OLSLGQLK WHODQD PDQMHYHþLGRNRQYHU]LMHXQLORNXOXVQLKDGLSRFLWDXPXOWLORNXOXVQH=D UD]OLNX RG NRQWUROH JGH VX þHOLMH JXVWR ÅSDNRYDQH´ X VYLP HNVSHULPHQWDOQLP JUXSDPD ]DSDçHQR MH ÅUD]PLFDQMH´ þHOLMD L XYHþDQMH Rezultati 56 PHāXþHOLMVNRJ SURVWRUD 8 LQWHUVWLFLMXPX RNR DGLSRJHQRDQJLRJHQLK NODVWHUDMDVQRVHXRĀDYDMXNRODJHQDYODNQD 6OLND%$7NRQWUROQH D  L JUXSHNRMD MH L]ODJDQDKODGQRþL WUL VDWD EFG U SRUHāHQMX VD NRQWURORP  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL GRYRGL GR SURPHQD NRMH VX najizraçenije na nivou lipidnih tela (Lt PLWRKRQGULMDLRUJDQHODXNOMXĀHQLKXVLQWHWVNH SURFHVH8RGQRVXQDNRQWUROXKODGQRþDX%$7LQGXNXMHYHþXXĀHVWDORVWSUHDGLSRFLWD (PA  NRML VX QDMĀHåþH PDORJ YROXPHQD L XJODYQRP VPHåWHQL X] NDSLODUH c). U nukleusima (N PUNLK DGLSRFLWD QXNOHROXV SRVWDMH L]UDçHQLML XND]XMXþL QD SRYHþDQX SRWUHEXþHOLMD]DULER]RPLPD d). (K NDSLODU2ULJXYHOLĀDQMH a,b) 2650x; (c) 4400x; (d) 7100x. 3RMDYD LQWHUVWLFLMVNLK þHOLMD L SUHDGLSRFLWD MH VYH YLåH L]UDçHQD VD GXçLQRP WUDMDQMD VWLPXOXVD 1D PLWRWVNX VSRVREQRVW RYLK þHOLMD XND]XMX ĀHVWR SULVXWQH FHQWULROH X FLWRSOD]PL X JUXSDPD L]ODJDQLP KODGQRþL Slika 29  'HRERP LQWHUVWLFLMVNH þHOLMH QDVWDMH MHGQD LQWHUVWLFLMVND þHOLMD L SUHDGLSRFLW NRMH VX MRå QHNR YUHPH X IL]LĀNRP Rezultati 57 NRQWDNWX 3RUHG LQWHUVWLFLMVNLK þHOLMD VSRVREQRVW GHREH LPDMX L preadipociti koji po deobi ostaju jedan pored drugog (Slika 30) i ulaze u SURFHVGLIHUHQFLMDFLMHåWRVHPDQLIHVWXMHSRYHþDQMHPXNXSQRJYROXPHQD þHOLMH LQWHQ]LYLUDQMHP PLWRKRQGULRJHQH]H L OLSRJHQH]H 3UHDGLSRFLWL VX QDMĀHåþH YLāDQL X] NDSLODUH GRN VX LQWHUVWLFLMVNH þHOLMH XRĀHQH L SRMHGLQDĀQR 'LIHUHQFLUDQMH þHOLMD MH QDML]UDçHQLMH X JUXSL NRMD MH L]ODJDQD KODGQRþL   VDWD L SRGUD]XPHYD IRUPLUDQMH OLSLGQLK WHODX FLWRSOD]PL SUHDGLSRFLWDNDRLGHREXPLWRKRQGULMD3UHDGLSRFLWLRYHJUXSHLPDMXYHþL volumen (Slika 31) u odnosu na preadipocite iz drugih HNVSHULPHQWDOQLKJUXSDDVDPLPWLPLYHþLEURMPLWRKRQGULMDLOLSLGQLK tela. Pored preadipocita, intenzivirana je diferencijacija novonastalih HQGRWHOVNLKþHOLMDNDRLIRUPLUDQMHYHþLKNUYQLKVXGRYD 6OLND%$7JUXSHNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWL(Insert) – izrazito euhromatski nukleus mrkog adipocita sa brojnim interhromatinskim i perihromatinskim granulama. (K) – kapilar, (N) – nukleus mrkog adipocita, (Lt) – lipidno telo, (') – LQWHUKURPDWLQVNH JUDQXOH ʇ  ² SHULKURPDWLQVNH JUDQXOH 2ULJ XYHOLĀDQMH [ (insert) 11500x. Rezultati 58 6OLND  %$7 JUXSH NRMD MH L]ODJDQD KODGQRþL  VDWL D – u citoplazmi mrkih adipocita (MA XRĀDYDMXVHEURMQHJXVWRSDNRYDQHPLWRKRQGULMHLVLWQDOLSLGQDWHOD8 YH]LYQRWNLYQRM VWURPL SULVXWQD VX EURMQD QHPLMHOLQL]LUDQD QHUYQD YODNQD ʇ  b) Novonastali preadipocit (PA XIL]LĀNRPNRQWDNWXVDLQWHUVWLFLMVNRPþHOLMRP ,ý). Orig. XYHOLĀDQMH D [ E [ 6OLND  %$7 JUXSH NRMD MH L]ODJDQD KODGQRþL  VDWD ,]PHāXPUNLK DGLSRFLWD (MA  XRĀDYD VH XYHþDQMH PHāXþHOLMVNRJ SURVWRUD  a). U tkivu su zapaçeni brojni procesi konverzije unilokulusnih adipocita u multilokulusne (b). (c  8YHþDQ GHWDOM XVLWQMDYDQMD OLSLGQRJ WHOD ʇ  WRNRP NRQYHU]LMH XQLORNXOXVQRJ X PXOWLORNXOXVQL adipocit. (d) Usitnjavanje lipidnih tela je prisutno i u multilokulusnim adipocitima. Veliki broj cisterni kompleksa Goldçi (kG) u citoplazmi preadipocita ukazuje na SRYHþDQXVLQWHWVNXDNWLYQRVW e 2ULJXYHOLĀDQMH a,b) 2650x; (c) 31000x; (d) 25000x; (e) 7100x. Rezultati 59 6OLND%$7JUXSHNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWLProliferacija i diferencijacija %$7 MH SUDþHQD LQWHQ]LYQLP UHPRGHOLUDQMHP YDQþHOLMVNRJ PDWULNVD XRĀDYD VH UD]UDVWDQMH WNLYDåLUHQMHPHāXþHOLMVNRJSURVWRUDNDNRRNRSRMHGLQDĀQLKþHOLMD WDNR L oko adipogeno-angiogenih klastera (a). Prisustvo centriola (krug) u citoplazmi LQWHUVWLFLMVNHþHOLMHXND]XMHQDPLWRWLĀNXVSRVREQRVWRYLKþHOLMD b ,]ODJDQMHKODGQRþL SRYHþDYD LQHUYDFLMXSDVHXRĀDYDMXEURMQLQHUYLVDQHPLMHOLQL]LUDQLP FUQDVWUHOLFD  L mijeliniziranim (bela strelica) nervnim vlaknima (c  3RYHþDQD MH XþHVWDORVW GHRED preadipocita koji posle deobe ostaju povezani adhezivnim i komunikacijskim vezama (d 8YHþDQGHWDOMåLUHQMDYDQþHOLMVNRJPDWULNVDL]PHāXHQGRWHOVNHLLQWHUVWLFLMVNHþHOLMH XDGLSRJHQRDQJLRJHQRPNODVWHUXNDRLL]PHāXNODVWHUDLVXVHGQLKPUNLKDGLSRFLWD8 QDL]JOHGÅSUD]QLP´SURVWRULPDYDQþHOLMVNRJPDWULNVD  XRĀDYDMXVHEURMQDSRSUHĀQRL X]GXçQR SUHVHĀHQD NRODJHQD YODNQD e). (MA) – mrki adipociti; (K) – kapilar; (En) – HQGRWHOVND þHOLMD ,ý  ² LQWHUVWLFLMVND þHOLMD M  ² PLWR]D 2ULJ XYHOLĀDQMH a,c,d) 2650x; (b,e) 5600x. Rezultati 60 6OLND%$7JUXSHNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWD9HþLQDSUHDGLSRFLWD PA) ove grupe postepeno dostiçe karakteristike zrelih adipocita (MA), iako se joå uvek razlikuju po svetlijoj citoplazmi, åto je posledica manjeg broja mitohondrija u odnosu na SRWSXQRGLIHUHQFLUDQHþHOLMH2ULJXYHOLĀDQMH[ (IHNDWL]ODJDQMDKODGQRþLQDDQJLRJHQH]XX%$7 4.1.3.1. Ekspresija VEGF .ROLĀLQD9(*)L51. Rezultati prikazani na grafiku 13 pokazuju da kod svih grupa çLYRWLQMD NRMH VX L]ODJDQH KODGQRþL GROD]L GR SRYHþDQMD WUDQVNULSWD ]D 9(*) X RGQRVX QD NRQWUROQX JUXSX S  NDR L GD MH QDMYHþD NROLĀLQDWUDQVNULSWD]D9(*)GHWHNWRYDQDXJUXSLL]ODJDQRMKODGQRþL sata. Grafik 13. 3URPHQDNROLĀLQH9(*)L51.X%$7WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþL SRUHāHQMH sa kontrolnom grupom; ***p<0.001. Rezultati 61 .ROLĀLQD9(*)SURWHLQD Promene proteinske ekspresije VEGF prikazane su na slici 32. ,]ODJDQMH KODGQRþL ]QDĀDMQR LQGXNXMH HNVSUHVLMX 9(*) X VYLP LVSLWLYDQLP YUHPHQVNLP WDĀNDPD WRNRP WUDMDQMD HNVSHULPHQWD (p<0.005) osim 12. sata (p<0.025) kada je detektovano smanjenje NROLĀLQH9(*)XSRUHāHQMXVDNRQWURORP Slika 32. 3URPHQD NROLĀLQH 9(*) SURWHLQD X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S S 4.1.3.1.3. Imunohistohemijska detekcija VEGF Rezultati imunohistohemijske detekcije VEGF prikazani su na Slici 33. U kontrolnoj grupi je detektovana umerena citoplazmatska UHDNFLMD SUHYDVKRGQR HQGRWHOVNLK þHOLMD2G VDWD L]ODJDQMDKODGQRþL pa do kraja ispitivanog perioda imunopozitivnost za VEGF linearno UDVWH L ]DEHOHçHQD MH X FLWRSOD]PLPUNLK DGLSRFLWD HQGRWHOVNLK þHOLMD preadipocita i vezivno-tkivnoj stromi. Rezultati 62 Slika 33. Imunohistohemijska detekcija VEGF u BAT kontrolne grupe (a) i grupa L]ODJDQLKKODGQRþL b-g 2ULJXYHOLĀDQMH[ Rezultati 63 4.1.3.2. Ekspresija endoglina .ROLĀLQDL51.]DHQGRJOLQ Grafik 14 SULND]XMH SURPHQH NROLĀLQH L51. ]D HQGRJOLQ *UXSH NRMH VX L]ODJDQHKODGQRþL WRNRPRGQRVQRVDWLSRND]XMX ]QDĀDMQR VPDQMHQMH NROLĀLQH ]D L51. HQGRJOLQ S  ]D UD]OLNX RG JUXSH çivotinja koje su izlagane 12 (p<0.01), 24, 48 i 72 sata kada je GHWHNWRYDQR]QDĀDMQRSRYHþDQMH S XRGQRVXQDNRQWUROX Grafik 14. 3URPHQD NROLĀLQH HQGRJOLQ L51. X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL  SRUHāHQMHVDNRQWUROQRPJUXSRP S S 4.1.3.3. Ultrastrukturna analiza angiogeneze u BAT 1D QLYRX 7(0 NRG NRQWUROQH JUXSH çLYRWLQMD XRĀDYD VH WLSLĀDQ L]JOHG HQGRWHOVNLK þHOLMD VD QXNOHXVRP NRML ]DX]LPD QDMYHþL GHR citoplazme i manjim brojem organela. ,]ODJDQMH KODGQRþL X VYLP JUXSDPD GRYRGL GR DNWLYDFLMH HQGRWHOVNLK þHOLMD åWR VH MDVQR ]DSDçD QD RVQRYX HXKURPDWVNLK QXNOHXVD SRYHþDQRJ EURMD RUJDQHOD XNOMXĀHQLK X VLQWHWVNH SURFHVH L pojavom tamnih granula u citoplazmi. Pored toga, izraçena je pojava DGLSRJHQRDQJLRJHQLK NODVWHUD åWR MH SUDþHQR SURPHQDPD X YDQþHOLMVNRPPDWULNVXNRMLVHXYHþDYD L IRUPLUDPHVWR]DQRYRQDVWDOH Rezultati 64 þHOLMH NRMH þH NUHQXWL X SURFHV GLIHUHQFLMDFLMH .DNR RGPLĀH SURFHV GLIHUHQFLMDFLMH þHOLMH DGLSRJHQRDQJLRJHQRJ NODVWHUD VH SRVWHSHQR UD]GYDMDMXDOLLGDOMHRVWDMXXNRQWDNWXEURMQLPPHāXþHOLMVNLPYH]DPD åWRVHMDVQRXRĀDYDQDQLYRX7(0 Slika 34). 8SUYLP VDWLPD  VDW  L]ODJDQMDKODGQRþL GRPLQDQWDQ MH HIHNDW DNWLYDFLMHHQGRWHOVNLKþHOLMDåWRþHRPRJXþLWLGDOMHSURPHQHYDVNXODUQH PUHçH IRUPLUDQMH NDSLODUQLK ÅL]GDQDND´ L PLWR]X HQGRWHOVNLK þHOLMD 8NROLNR XSRUHGLPR RYD GYD IHQRPHQD XRĀDYD VH GD WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL SUYR GROD]L GR YD]RGLODWDFLMH L SRYHþDQMD NRQWDNWQH SRYUåLQH L]PHāXNDSLODUDLPUNLKDGLSRFLWDXJUXSDPDNRMHVXL]ODJDQHKODGQRþL X FLOMX REH]EHāLYDQMD SRYHþDQRJ SURWRND NUYL NUR] WNLYR L YHOLĀLQH lumena krvnih sudova, a zatim i do formiranja novih kapilara. .DRSUDWHþLSURFHVGLODWDFLMH L UD]YRMDNDSLODUDYHRPD MH L]UDçHQD ekstravazacija eritrocita vidljiva na nivou svetlosne i transmisione HOHNWURQVNH PLNURVNRSLMH SRĀHY RG  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL D QDML]UDçHQLMDMHXJUXSLNRMDMHL]ODJDQDKODGQRþLVDWD3RUHGWRJDåWR EURM DNWLYLUDQLK HQGRWHOVNLK þHOLMD L NDSLODUQLK L]GDQDND UDVWH VD GXçLQRP L]ODJDQMD KODGQRþL JUXSH L]ODJDQH  L  VDWD SRND]XMX L QDMYHþXXĀHVWDORVWGHREDHQGRWHOVNLKþHOLMD Rezultati 65 6OLND  $QJLRJHQH]D X %$7 WRNRP KODGQRþRP LQGXNRYDQH KLSHUSOD]LMH (a) kontrola; (b-h) JUXSH L]ODJDQH KODGQRþL 3UYL RGJRYRU WNLYD QD L]ODJDQMH KODGQRþL MH vazodilatacija (b,g  D ]DWLP DQJLRJHQH]D NDSLODUD SUDþHQD XĀHVWDORP SRMDYRP adipogeno-angiogenih klastera (c,d,e,f (QGRWHOVNHþHOLMHLSUHNXUVRULPUNLKDGLSRFLWD VX X IL]LĀNRP NRQWDNWX d  $GLSRJHQRïDQJLRJHQL NODVWHU ]YH]GLFD  PHāXþHOLMVND NRPXQLNDFLMD UHJLRQ LVSUHNLGDQH OLQLMH  ,]ODJDQMH KODGQRþL GRYRGL GR DNWLYDFLMH HQGRWHOVNLK þHOLMD L SRMDYH RUJDQHOD XNOMXĀHQLK X VLQWHWVNH SURFHVH h). Orig. XYHOLĀDQMH a,c,g) 2650x, (b,e,f,h) 4400x; (d) 5600x. Rezultati 66 4.2. RAZVOJ HUMANOG FETALNOG BAT 4.2.1.Ultrastrukturna analiza humanog fBAT 8OWUDVWUXNWXUQD DQDOL]D MH SRND]DOD GD KXPDQR I%$7 ĀLQH QDMYHþLPGHORPGLIHUHQFLUDQLPUNLDGLSRFLWLEURMQHSUHNXUVRUVNHþHOLMH XUD]OLĀLWLPID]DPDGLIHUHQFLMDFLMHNDRLEURMQLNDSLODUL Slika 35). 3RUHG WRJD XRĀHQR MH GD VX PH]HQKLPVNH VWHP þHOLMH L preadipociti pozicionirani uglavnom u blizini kapilara (Slika 36) i da IRUPLUDMXDGLSRJHQRDQJLRJHQHNODVWHUH3UHNXUVRUVNHþHOLMHPHāXVREQR RVWYDUXMX EURMQH PHāXþHOLMVNH NRPXQLNDFLMH NDR L NRPXQLNDFLMH VD HQGRWHOVNLP þHOLMDPD 3UHDGLSRFLWL þHOLMH NRMH VH ODNR SUHSR]QDMX SR SRĀHWQRP QDNXSOMDQMHP OLSLGQLK WHOD SRVHGXMX YHþL EURM RUJDQHOD X FLWRSOD]PL X RGQRVX QD PH]HQKLPVNH VWHP þHOLMH NDR L EURMQH JOLNRJHQVNH SDUWLNXOH 1DMYHþt EURM PLWRKRQGULMD X FLWRSOD]PL preadipocita nema kriste. Ultrastrukturna analiza preseka je pokazala EURMQHXQLORNXOXVQHþHOLMHXNRMLPDVHYLGLXVLWQMDYDQMH MHGQRJYHOLNRJ lipidnog tela. U pojedinim preadipocitima se u citoplazmi pored lipidnih WHODXRĀDYDMXLFLWRVNHOHWQLHOHPHQWLSDUDOHOQHRUJDQL]DFLMHNRMLL]JOHGRP SRGVHþDMXQDVDUNRPHUH Multilokulusne, diferencirane mrke adipocite humanog fBAT (Slika 37) karakteriåu sve ultrastrukturne odlike adultnih adipocita %$7YHþLEURMNUXSQLK OLSLGQLKWHODRNUXJDRHXKURPDWVNLQXNOHXVVD izraçenim nukleolusom (nekada i dva) i brojne okrugle mitohondrije sa SDUDOHOQRSDNRYDQLPNULVWDPDÿHVWRVHXQXNOHXVLPDPUNLKDGLSRFLWD zapaçaju perihromatinski fibrili, dokaz intezivne obrade iRNK transkripata. Rezultati 67 Slika 35. Ultrastruktura humanog fBAT. (MA) – mrki adipocit, (PA) –preadipocit, (K) - kapilar, (06ý ²PH]HQKLPVNDVWHPþHOLMD2ULJXYHOLĀDQMH[ Slika 36. 3UHNXUVRUVNHþHOLMHKXPDQRJI%$7Preadipociti VXQDMĀHåþHSR]LFLRQLUDQL uz kapilare (a IRUPLUDMXþLDGLSRJHQRDQJLRJHQHNODVWHUH (b) u kojima se vidi da su ove þHOLMHX IL]LĀNRP NRQWDNWX c  1DMYHþL EURMPLWRKRQGULMD SUHDGLSRFLWD QHPDMX NULVWH (d,e). Unilokulusni mrki adipocit (f  L VDUNRPHUDPDVOLĀQR RUJDQL]RYDQ FLWRVNHOHW X preadipocitima (g 5HJLRQLVSUHNLGDQHOLQLMHSULND]XMHIL]LĀNLNRQWDNWGYDSUHDGLSRFLWD GRN UHJLRQL XRNYLUHQL SXQRP OLQLMRP SULND]XMX PLWRKRQGULMH 2ULJ XYHOLĀDQMH a) 3400x; (b) 4400x; (c) 2650x; (d,e) 11500x; (g) 7100x. Rezultati 68 Slika 37. Mrki adipocit humanog fBAT. (a) Multilokulusni, diferencirani mrki adipociti humanog fBAT karakteriåu sve ultrastrukturne odlike adultnih adipocita: YHþL EURM NUXSQLK OLSLGQLK WHOD RNUXJDR HXKURPDWVNL QXNOHXV VD L]UDçHQLP nukleolusom (nekada i dva) i brojne okrugle mitohondrije sa paralelno pakovanim kristama (b). U nukleusima se zapaçaju brojni perihromatinski fibrili (isprekidane OLQLMH SRND]DWHOMLLQWH]LYQHREUDGHWUDQVNULSDWD2ULJXYHþDQMH a) 2650x; (b) 11500x; (c) 31000x. 3RUHGQDEURMDQLKþHOLMDXKXPDQRPI%$7XRĀDYDVHSURVYHWOMHQ XYHþDQ PHāXþHOLMVNL SURVWRU X NRPH VH RNR þHOLMD ]DSDçDMX NRODJHQD vlakna (Slika 38). Slika 38. 9DQþHOLMVNLPDWULNVXKXPDQRPI%$7. Mrki adipocit (MA) i mezenhimska VWHPþHOLMD 06ý X´QLåLµYDQþHOLMVNRJPDWULNVDRNUXçHQLEURMQLPNRODJHQLPYODNQLPD VWUHOLFD 2ULJXYHOLĀDQMH a,b) 2650x. Rezultati 69 4.2.2. Termogeni kapacitet humanog fBAT 4.2.2.1. Imunohistohemijska detekcija UCP1 Na slici 40 prikazana je imunohistohemijska detekcija UCP1 u humanom fBAT. U ovom periodu BAT se sastoji od brojnih manjih i YHþLKOREXVDNRMLVXMDVQRRGYRMHQLYH]LYQRWNLYQRPVWURPRP2NR%$7 XRĀDYD VH SRSUHĀQRSUXJDVWD PXVNXODWXUD D QD SHULIHULML OREXVD dominiraju krupni, unilokulusni adipociti, dok su multilokulusni DGLSRFLWLSR]LFLRQLUDQLQDMYHþLPGHORPXVUHGLåWXOREXVD 1D YHþHP XYHOLĀDQMX MDVQR VH GHWHNWXMH MDND 8&3 imunopozitivnost kako u zrelim multilokulusnim, tako i u XQLORNXOXVQLP DGLSRFLWLPD 5HDNFLMD MH XRĀHQD X FLWRSOD]PL DOL L EURMQLPQXNOHXVLPDRYLKþHOLMD3RUHGWRJDMDNDUHDNFLMDMHSULVXWQDX vezivno-tkivnoj stromi humanog fBAT i malim lobusima u procesu IRUPLUDQMD(QGRWHOVNHþHOLMHXJODYQRPYHþLKNUYQLKVXGRYDVXSRND]DOH LPXQRUHDNWLYQRVW ]D 8&3 ]D UD]OLNX RG HQGRWHOVNLK þHOLMD PDQMLK NUYQLKVXGRYDNRGNRMLK UHDNFLMDXJODYQRPQLMHGHWHNWRYDQD 7DNRāH LPXQRSR]LWLYQRVWMHSULVXWQDXFLWRSOD]PLSRSUHĀQRSUXJDVWLKPLåLþQLK þHOLMD .ROLĀLQDSURWHLQD8&3 Promene proteinske ekspresije UCP1 su prikazane na slici 39. U SRUHāHQMX VD ;9,, QHGHOMRP NROLĀLQD SURWHLQD 8&3 MH YHþD X ;;,,, nedelji fetalnog razvoja. 6OLND.ROLĀLQD8&3XKXPDQRPI%$7 Rezultati 70 Slika 40. Imunohistohemijska detekcija UCP1 u humanom fBAT. UCP1 je lokalizovan u (a) multilokulusnim mrkim adipocitima, (b) unilokulusnim adipocitima, (c  YH]LYQRWNLYQRM VWURPL HQGRWHOVNLP þHOLMDPD YHþLK NUYQLK VXGRYD e) kao i u FLWRSOD]PL SRSUHĀQRSUXJDVWLK PLåLþQLK þHOLMD f  (QGRWHOVNH þHOLMH PDQMLK NUYQLK sudova nisu pokazale reakciju (g 2ULJXYHOLĀDQMH A) 10x (B) 40x. 4.2.2.3. Imunohistohemijska detekcija noradrenalina Kao åto se vidi na slici 41, noradrenalin je detektovan u citoplazmi mrkih adipocita humanog fBAT i nervnim zavråecima, u kojima je reakcija najviåe izraçena. Rezultati 71 Slika 41. Imunohistohemijska detekcija noradrenalina u humanom fBAT. Orig. XYHOLĀDQMH[ 4.2.3. Regulatori diferencijacije i mitohondriogeneze humanog fBAT .ROLĀLQDSURWHLQD33$5DŽ Promene proteinske ekspresije su prikazane na slici 42. U SRUHāHQMX VD ;9,, QHGHOMRP NROLĀLQD SURWHLQD 33$5DŽ MH YHþD X ;;,,, fetalnog razvoja. 6OLND.ROLĀLQD33$5DŽXKXPDQRPI%$7 .ROLĀLQDSURWHLQD3*&ǂ 3URPHQHSURWHLQVNHHNVSUHVLMH3*&ǂVXSULND]DQHQDslici 43. 8SRUHāHQMXVD;9,,QHGHOMRPNROLĀLQDSURWHLQD3*&ǂMHYHþDX;;,,, nedelji fetalnog razvoja. 6OLND.ROLĀLQD33$5DŽXKXPDQRPI%$7 Rezultati 72 4.2.4. Regulatori strukturnog i funkcijskog razvoja humanog fBAT 4.2.4.1. Estrogenski receptori .ROLĀLQDSURWHLQD(5ǂL(5ǃ 9UHPHQVNL ]DYLVQH SURPHQH NROLĀLQH (5ǂ SULND]DQH VX QD slici 44. .DR åWR VH YLGL NROLĀLQD (5ǂ SURJUHVLYQR UDVWH SRĀHY RG ;9,, GR ;;,,,QHGHOMHIHWDOQRJUD]YRMD8LVWRPSHULRGXNROLĀLQD(5ǃMHPDQMDX SRUHāHQMX VD NROLĀLQRP (5ǂ äWD YLåH (5ǃ SURWHLQ QLMH GHWHNWRYDQ Western blot analizom u XVII i XXIII nedelji razvoja humanog fBAT. 6OLND.ROLĀLQD(5ǂL(5ǃXKXPDQRPI%$7 ,PXQRKLVWRKHPLMVNDGHWHNFLMD(5ǂL(5ǃ 5H]XOWDWL LPXQRKLVWRKHPLMVNH GHWHNFLMH (5ǂ L (5ǃ VX SULND]DQL na slici 45. Jaka citoplazmatska imunopozitivnost i nukleusna ORNDOL]DFLMD(5ǂ]DEHOHçHQDMHXPUNLPDGLSRFLWLPDNDRLXHQGRWHOVNLP þHOLMDPD 9H]LYQRWNLYQD VWURPD KXPDQRJ I%$7 MH WDNRāH SRND]DOD LPXQRSR]LWLYQRVW GRN MH UHDNFLMD ]D (5ǃ SULVXWQD VDPR X ]UHOLP multilokulusnim adipocitima i ocenjena je kao slaba. 6OLND,PXQRKLVWRKHPLMVNDGHWHNFLMD(5ǂL(5ǃXKXPDQRPI%$7Endotelska þHOLMD VWUHOLFD LPUNLDGLSRFLW ]YH]GLFD 2ULJXYHOLĀDQMH a,b): 40x. Rezultati 73 ,PXQRFLWRKHPLMVNDGHWHNFLMD(5ǂL(5ǃ 5H]XOWDWL LPXQRFLWRKHPLMVNH DQDOL]H ]D (5ǂ X KXPDQRP I%$7 VX prikazani na slici 46. Prisustvo imunogold partikula je zapaçeno u FLWRSOD]PL L QXNOHXVLPD ]UHOLK PUNLK DGLSRFLWD HQGRWHOVNLK þHOLMD SUHDGLSRFLWLPDLPH]HQKLPVNLPVWHPþHOLMDPD 6OLND  ,PXQRFLWRKHPLMVND GHWHNFLMD (5ǂ X KXPDQRP I%$7 Imunogold SDUWLNXOH VX GHWHNWRYDQH X PH]HQKLPVNLP VWHP þHOLMDPD (a), preadipocitima (b), HQGRWHOVNLPþHOLMDPD c) i zrelim mrkim adipocitima (d). (n) nukleus; (en) endotelska þHOLMD er) eritrocit; (mt) mitohondrija. Bar: 500µm. 5H]XOWDWLLPXQRFLWRKHPLMVNHDQDOL]H]D(5ǃXKXPDQRPI%$7VX prikazani na slici 47=DUD]OLNXRG(5ǂ(5ǃLPXQRJROGSDUWLNXOHVX detektovane samo u zrelim mrkim adipocitima, u nukleusu i u citoplazmi. Obe izoforme estrogenih receptora su prisutne u nivou þHOLMVNHPHPEUDQHNDR LXPLWRKRQGULMDPDPUNLKDGLSRFLWD Slika 46, 47d-insert). Pored toga, partikule prisutne u nukleusu mrkih adipocita Rezultati 74 VX ĀHåþH ]DSDçDQH X HXKURPDWVNLP REODVWLPD QXNOHXVD 5H]XOWDWL imunocitohemijske analize su objedinjeni u Tabeli 4. 6OLND  ,PXQRFLWRKHPLMVND GHWHNFLMD (5ǃ X KXPDQRP I%$7. Imunogold SDUWLNXOH QLVX GHWHNWRYDQH XPH]HQKLPVNLP VWHP þHOLMDPD a), preadipocitima (b) i HQGRWHOVNLPþHOLMDPD c) ali je pokazano njihovo prisustvo u zrelim mrkim adipocitima (d). (n) nukleus; (en HQGRWHOVNDþHOLMD er) eritrocit; (mt) mitohondrija. Bar: (a,b) 1µm, (c,d) 500nm. 7DEHOD,PXQRFLWRKHPLMVNDORNDOL]DFLMD(5ĮL(5ȕXKXPDQRPI%$7 ER alfa ER beta 0H]HQKLPVNDVWHPüHOLMD   (QGRWHOVNDüHOLMD   Preadipocit + - 0UNLDGLSRFLW  û0&10W   û0&10W  + partikule prisutne, - partikule nisu prisutne, û0 üHOLMVND PHPEUDQD C citoplazma, N nukleus, Mt mitochondrija Rezultati 75 .RORNDOL]DFLMD(5ǂL(5ǃ Na slici 48 prikazani su rezultati fluorescentne LPXQRKLVWRKHPLMVNH GHWHNFLMH (5ǂ L (5ǃ NDR L NRORNDOL]DFLMD RYD GYD SURWHLQD$QDOL]RPSUHVHNDXRĀHQDMHVODEDNRORNDOL]DFLMDL]PHāX(5ǂL (5ǃ.RORNDOL]DFLMD(5MH]DSDçHQDXSRMHGLQLPQXNOHXVLPDLFLWRSOD]PL ]UHOLK PUNLK DGLSRFLWD ,]UDĀXQDYDQMH 3HDUVRQRYRJ NRHILFLMHQWD MH SRYUGLOR QDåD ]DSDçDQMD SRND]XMXþL GD MH YUHGQRVW NRHILFLMHQWD LVSRG 0.5 (0.29±0.0023). 6OLND  ,PXQRIOXRUHVFHQWQD NRORNDOL]DFLMD (5ǂ L (5ǃ X KXPDQRP I%$7 )OXRUHVFHQWQRREHOHçHQL(5ǂ a (5ǃ b), kao i njihova kolokalizacija (c). .RORNDOL]DFLMD(5L33$5DŽ Pearsonov koeficijent korelacije (Slika 49) pokazao je da postoji ]QDĀDMQDNRORNDOL]DFLMD L]PHāX(5ǂ L33$5DŽ “ ]DUD]OLNXRG YUHGQRVWLNRORNDOL]DFLMH L]UDĀXQDWH ]D(5ǃ L33$5DŽ “ NRMD VH QH VPDWUD ]QDĀDMQRP 3RUHG WRJD 6WXGHQWRYLP W WHVWRP SRND]DQD MH ]QDĀDMQDUD]OLNDL]PHāXVUHGQMLKYUHGQRVWLNRORNDOL]DFLMH]D(5ǂ33$5DŽ L]D(5ǃ33$5DŽ S  .RORNDOL]DFLMD(5L3*&ǂ 9UHGQRVW3HDUVRQRYRJNRHILFLMHQWDNRUHODFLMHSRND]DODMH]QDĀDMDQ VWHSHQ NRORNDOL]DFLMH L]PHāX (5ǂ L 3*&ǂ “  NDR L L]PHāX Rezultati 76 (5ǃ L 3*&ǂ “  Slika 50). Studentov t-test nije pokazao UD]OLNXL]PHāXL]UDĀXQDWHNRORNDOL]DFLMH]D(5ǂ3*&ǂL(5ǃ3*&ǂ Slika 49. (A) ,PXQRIOXRUHVFHQWQD NRORNDOL]DFLMD (5 L 33$5DŽ X KXPDQRP I%$7 a) (5ǂ b  33$5DŽ c  NRORNDOL]DFLMD(5ǂ L 33$5DŽ d  (5ǃ e  33$5DŽ f) kolokalizacija (5ǃ L 33$5DŽ B  *UDILĀNL SULND] NRORNDOL]DFLMH  3RUHāHQMH NRORNDOL]DFLMH (5ǂ L 33$5DŽVD(5ǃL33$5DŽ 2ULJXYHOLĀDQMH[ Slika 50. (A) ,PXQRIOXRUHVFHQWQDNRORNDOL]DFLMD(5 L 3*&ǂXKXPDQRP I%$7 a) (5ǂ b 3*&ǂ c NRORNDOL]DFLMD(5ǂL3*&ǂ d (5ǃ e 3*&ǂ f) kolokalizacija (5ǃL3*&ǂ B *UDILĀNLSULND]NRORNDOL]DFLMH2ULJXYHOLĀDQMH[ Rezultati 77 4.2.4.2. Imunohistohemijska detekcija BMP7 Na slici 51 prikazana je imunohistohemijska detekcija BMP7 u KXPDQRP I%$7 1DMMDĀD UHDNFLMD VH XRĀDYD X YH]LYQRWNLYQRM VWURPL dok je unutar lobusa jaka reakcija prisutna u citoplazmi mrkih adipocita. Slika 51. Imunohistohemijska detekcija BMP7 u humanom fBAT. Reakcija je najizraçenija u vezivno-tkivnoj stromi BAT. Jaka imunopozitivnost detektovana je u mrkim adipocitima i preadipocitima. Zvezdica – mrki adipociti: region isprekidane OLQLMH²OREXVXSURFHVXIRUPLUDQMD2ULJXYHOLĀDQMH a) 10x, (b) 20x; (c) 40x; (d) 100x. 78 5. DISKUSIJA ,]ODJDQMHSDFRYDKODGQRþLLQGXNXMHNRPSOHNVDQIL]LRORåNLRGJRYRU %$7 GRYRGHþL GR QMHJRYH KLSHUSOD]LMH WM SUROLIHUDFLMH L GLIHUHQFLMDFLMH SUHNXUVRUD PUNLK DGLSRFLWD åWR MH SUDþHQR SRYHþDQMHP HNVSUHVLMH 8&3 ELRJHQH]H PLWRKRQGULMD L ǃRNVLGDFLMH PDVQLK NLVHOLQD 6XWHU +LPPV+DJHQ2WDåHYLþ L VDU +LSHUSOD]LMD%$7 MH SUDþHQD]QDĀDMQLPSRYHþDQMHPQMHJRYHPDVH %XNRZLHFNLLVDU 3XHUWDLVDU åWRVPRSRND]DOLXSUHWKRGQLPVWXGLMDPD %X]DGçLþ LVDU3HWURYLþ LVDU 5H]XOWDWLRYRJUDGD MDVQRSRND]XMX GDMHRYDMIHQRPHQ%$7ELORGDMHLQGXNRYDQKODGQRþRPLOLSUHGVWDYOMD sastavni deo embrionalnog razvoja, pod strogom kontrolom brojnih transkripcionih faktora, koji koordiniåu ekspresiju proteina odgovornih ]DVWYDUDQMHNUDMQMHJDGLSRFLWQRJIHQRWLSD0HāXEURMQLPIDNWRULPDNRML VX XNOMXĀHQL X SURFHV KLSHUSOD]LMH %$7 QDM]QDĀDMQLMD XORJD SULSDGD 8&333$5DŽL3*&ǂ 3XLJVHUYHU  5.1. TERMOGENI ODGOVOR BAT PRILIKOM IZLAGANJA +/$'12ý, 3R]QDWRMHGDL]ODJDQMHçLYRWLQMDKODGQRþLGRYRGLGRDNWLYDFLMH616 L RVOREDāDQMD QRUDGUHQDOLQD ĀLPH VH VWLPXOLåH SURGXNFLMD F$03 L SRMDĀDYDVLQWH]D8&3 OLSROL]D L RNVLGDFLMD OLSLGD=DDNWLYQRVW33$5DŽ QHRSKRGQR MH SULVXVWYR 3*&ǂ NRML VH YH]XMH ]D 335( PHVWR X promotorskom regionu UCP1. Saglasno tome, u ovom radu po prvi put SRND]DQD MH SRYHþDQD HNVSUHVLMD 8&3 YHþ WUHþHJ VDWD L]ODJDQMD KODGQRþLGRNåHVWRJVDWDGRVWLçHPDNVLPDOQXYUHGQRVWNDGDMHNROLĀLQD WUDQVNULSWD 8&3 SRYHþDQD SULEOLçQR VHGDP PLOLRQD SXWD 8 RVWDOLP LVSLWLYDQLPYUHPHQVNLP WDĀNDPDQLYR L51.]D8&3 MH LGDOMH YHþL RG NRQWUROQRJ D X RYRP UDGX SRND]DQ MH LGHQWLĀDQ RGJRYRU QD QLYRX Diskusija 79 proteinske ekspresije UCP1. Ove promene su u direktnoj vezi sa SRYHþDQMHP EURMD NULVWL PLWRKRQGULMD X RYRM VWXGLML åWR SUHGVWDYOMD VWUXNWXUQX L PROHNXOVNX RVQRYX ]D SRYHþDQMH RNVLGDWLYQRJ L termogenog kapaciteta BAT (Frey i Manella, 2000; Nisoli i sar., 2004; 2WDåHYLþLVDU  3RYHþDQMH 8&3 HNVSUHVLMH MH SUDþHQR SDUDOHOQLP SRYHþDQMHP HNVSUHVLMHJHQDLSURWHLQD WDNRāHRGVDWD ]DQRUDGUHQDOLQ33$5DŽ L 3*&ǂ XND]XMXþL QD YUHPHQVNLNRRUGLQLVDQX LQGXNFLMX WUDQVNULSFLRQRJLWUDQVODFLRQRJRGJRYRUD8&333$5DŽL3*&ǂWRNRP L]ODJDQMD%$7KODGQRþL  5H]XOWDWL QDåH VWXGLMH MDVQR SRND]XMX GD KODGQRþD X in vivo XVORYLPDVQDçQRLQGXNXMH3*&ǂQDQLYRXL51.ĀLMDMHNROLĀLQDYHþD XRGQRVXQDNRQWUROXXVYLPLVSLWLYDQLPWDĀNDPDRVLPVDWD6OLĀQH UH]XOWDWHSRND]DOLVX3HWURYLþLVDU  LVSLWXMXþLHIHNDWGXJRWUDMQRJ L]ODJDQMD KODGQRþL QD HNVSUHVLMX 3*&ǂ 3ULND]DQL HNVSUHVLRQL SURILO 3*&ǂ JODYQRJ SURPRWHUD ÅRNVLGDWLYQRJ IHQRWLSD´ X %$7 SUDþHQ MH strukturnim promenama na mitohondrijama. Na nivou TEM pokazano MH GD VX PLWRKRQGULMH JUXSD L]ODJDQLK KODGQRþL EURMQLMH SUDYLOQLMHJ REOLND L VD EURMQLP SDUDOHOQRXUHāHQLP NULVWDPD äWD YLåH ultrastrukturna analiza je pokazala neodvojivost strukture i funkcije PLWRKRQGULMD MHU MHSRYHþDQQLYRHNVSUHVLMHRYRJSURWHLQDSRND]DQYHþ  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL SUDþHQ RGJRYDUDMXþLP VWUXNWXUQLP promenama mitohondrija. 8LVWRYUHPHSRND]DQDMHSRYHþDQDSURWHLQVNDHNVSUHVLMD]D'US L0IQXVYLP LVSLWLYDQLP WDĀNDPD L]ODJDQMDKODGQRþL åWRXND]XMHQD preciznu regulaciju ekspresije transkripcionih faktora i proteina XNOMXĀHQLK X ELRJHQH]X PLWRKRQGULMD X FLOMX ]DGRYROMHQMD WHUPRJHQLK potreba tkiva. Da li je ekspresija mitofuzina i Drp1 indukovana direktno QLVNRP WHPSHUDWXURP QLMH SR]QDWR 3R]QDWR MH GD 3*&ǂ DNWLYLUD ekspresiju Mfn2 preko ERE (engl. estrogen related receptor) (Soriano i VDU 0RJXþH MHGDVH VOLĀDQPHKDQL]DPDNWLYLUD LQDKODGQRþL Diskusija 80 RE]LURPQDYUHPHQVNLNRRUGLQLVDQXLQGXNFLMX3*&ǂL0IQSRND]DQX u naåoj studiji. 'LQDPLĀQH PRUIRORåNH SURPHQH PLWRKRQGULMD RPRJXþHQH VX QDMYHþLP GHORP QMLKRYRP GHRERP ]DWLP QMLKRYRP PHāXVREQRP fuzijom i translokacijom (Bereiter-Hanh, 1990; Chan, 2006; Petrovic i VDU  2WDåHYLþ L VDU   'HRED L IX]LMD PLWRKRQGULMD NRQWUROLVDQH VX 'US L 0IQ *73D]DPD 3RUHG WRJD åWR XĀHVWYXMH X deobi mitohondrija, Drp1 izgleda ima udela u remodeliranju kristi PLWRKRQGULMD %HUHLWHU+DQK 3RYHþDQDSURWHLQVNDHNVSUHVLMD]D Drp1 i Mfn2 pokazana u naåem eksperimentu ukazuje da se intezivna deoba i fuzija mitohondrija odigrava u isto vreme, åto moçe da ukazuje na postojanje mitohondrijalnog retikuluma. Sa aspekta mitohondriogeneze postavlja se pitanje zaåto bi se mitohondrije BAT istovremeno delile i fuzionisale? Poznato je da ova dva procesa kontroliåu oblik, duçinu i GLVWULEXFLMXPLWRKRQGULMD &KDQ2WDåHYLþLVDU LYHURYDWQR GD MH EDODQV L]PHāX RYD GYD SURFHVD QHRSKRGDQ ]D RĀXYDQMH QMLKRYH PRUIRORJLMH 2VLP WRJD IX]LMD L GHRED RPRJXþDYDMX UD]PHQX VDGUçDMD PLWRKRQGULMD NDR L QMLKRYLK PHPEUDQD D WDNRāH PHQMDMXþL REOLN PLWRKRQGULMD RPRJXþDYDMXQMLKRYXGLVWULEXFLMXGR OLSLGQLK WHOD åWR MH SRVHEQR YDçQR VD DVSHNWD KODGQRþRP LQGXNRYDQH WHUPRJHQH]H L oksidacije masnih kiselina. 3RYHþDQMH 'US SRND]DQR X RYRM VWXGLML YDçQR MH VD MRå MHGQRJ aspekta – biogeneze peroksizoma, procesa koji prati hiperplaziju BAT i termogenu aktivnost. Naime, Drp1 protein ima sposobnost hidrolize *73 ĀLPH GROD]L GR QMHJRYH NRQIRUPDFLRQH SURPHQH NRMD LPD ]D FLOM odvajanje membrana tokom deobe mitohondrija i peroksizoma (Chan, 2006).  0HāX EURMQLP WUDQVNULSFLRQLP IDNWRULPD XNOMXĀHQLP X mitohondriogenezu mrkih adipocita, poslednjih nekoliko godina SRVHEQD SDçQMD MH SRVYHþHQD L]XĀDYDQMX 15) 1LVROL L VDU   Diskusija 81 Pokazano je da ovaj faktor kontroliåe ekspresiju komponenti respiratornog lanca ali i proteine koji reguliåu transkripciju i replikaciju mitohondrijalnog genoma (Wu i sar., 1999; Finck i Kelly, 2006). U naåoj studiji pokazana je snaçna indukcija ekspresije proteina za NRF1 tokom L]ODJDQMD SDFRYD KODGQRþL X VYLP LVSLWLYDQLP WDĀNDPD X RGQRVX QD NRQWUROXDVOLĀDQHNVSUHVLRQLSURILO3*&ǂXND]XMHQDXĀHåþH15)X ELRJHQH]L PLWRKRQGULMD 8 SULORJ RYRPH LGX SRGDFL GD SRMDĀDQD HNVSUHVLMD 15) GRYRGL GR SRYHþDQRJ EURMD PLWRKRQGULMD X VUĀDQRP WNLYX ;LD L VDU  LGD3*&ǂVYRM HIHNDWQDPLWRKRQGULRJHQH]X ostvaruje delom u interakciji sa NRF1 (Kozak, 2000; Vercauteren i sar., 2006). 7UHED LVWDþL GD VX QDåL SRGDFL R SURPHQDPD HNVSUHVLMH 15) tokom diferencijacije mrkih adipocita kontradiktorni podacima dobijenim u in vitro uslovima. Naime, Villena i sar. (2002) su pokazali da se nivo NRF1 proteina smanjuje tokom diferencijacije mrkih adipocita u kulturi. Ovakva razlika moçe se objasniti odsustvom inervacije mrkih adipocita u in vitro uslovima, åto nam ukazuje da je L]ODJDQMH KODGQRþL RGQRVQR VLPSDWLĀND VWLPXODFLMD MHGDQ RG JODYQLK aktivatora NRF1.  ,PDMXþLXYLGXGDVXEURMQLSURPRWRULJHQDNRMLNRGLUDMXSURWHLQH respiratornog lanca regulisani NRF1, rezultati vremenski zavisnih SURPHQDNROLĀLQHPW'1.SRND]DQLXRYRMVWXGLMLQLVXRĀHNLYDQL1DLPH WRNRP WUDMDQMD HNVSHULPHQWD QDL]PHQLĀQR VH VPHQMXMX SHULRGL VPDQMHQMD LSRYHþDQMDNROLĀLQHPW'1.XRGQRVXQDNRQWUROX7DĀQLMH LVDWDL]ODJDQMDKODGQRþLGROD]LGRVPDQMHQMDDLVDWD GR SRYHþDQMD NROLĀLQHPW'1. -HGLQR JUXSD L]ODJDQDKODGQRþL  VDWL RGUçDYD NROLĀLQX PW'1. QD NRQWUROQRP QLYRX 2YDNYH YUHPHQVNL ]DYLVQHSURPHQHNROLĀLQHPW'1.WRNRPL]ODJDQMDKODGQRþLXND]XMXQD zavisnost od faze izlaganja, i ukazuju na kompleksnost mehanizama XNOMXĀHQLK X UHJXODFLMX HNVSUHVLMH PW'1. 1HGDYQR VPR SRND]DOL GD WRNRPQDMUDQLK ID]D L]ODJDQMDKODGQRþLGROD]LGRSURPHQDXHNVSUHVLML SURWHLQD NRPSRQHQDWD HOHNWURQWUDQVSRUWQRJ ODQFD 9XĀHWLþ L VDU Diskusija 82 2011), pa ovakav odgovor mtDNK moçe predstavljati adaptivni mehanizam na uspostavljanje nove tkivne homeostaze. Uzeti zajedno, naåi rezultati pokazuju kompleksnost regulacije PLWRKRQGULMDOQH ELRJHQH]H WRNRP KODGQRþRP LQGXNRYDQH KLSHUSOD]LMH BAT pacova i ukazuju na strogo koordinisanu sintezu proteina koji su kodirani nukleusnim i mitohondrijalnim genomom, kao i na sinhronizovanost procesa deobe i fuzije mitohondrija.  ,1'8.&,-$ 352/,)(5$&,-( , ',)(5(1&,-$&,-( ý(/,-$ ADIPOGENOG PULA Brojni literaturni podaci pokazuju da su u proces proliferacije i GLIHUHQFLMDFLMH PUNLK DGLSRFLWD XNOMXĀHQL EURMQL WUDQVNULSFLRQL IDNWRUL od kojih neki aktivacijom, a neki represijom, dovode do stvaranja NUDMQMHJIHQRWLSDPUNLKDGLSRFLWD6PDWUDVHGDSRUHG33$5DŽNOMXĀQRJ i neophodnog faktora diferencijacije in vitro i in vivo (Siersbaek i sar.,   SRGMHGQDNR YDçQR PHVWR ]DX]LPDMX ĀODQRYL SRURGLFH &(%3 QDURĀLWR&(%3ǂ Iako uloga ovog transkripcionog faktora nije u potpunosti UD]MDåQMHQD SR]QDWR MH GD MH &(%3ǂ LQGXNRYDQ WRNRP NDVQLK ID]D diferencijacije adipocita (Rosen i sar., 2002), da ima snaçan anti- PLWRWVNL HIHNDW L GD NRRSHUDWLYQR VD 33$5DŽ LQGXNXMH HNVSUHVLMX QHNROLNR JHQD VSHFLILĀQLK ]D WHUPLQDOQX GLIHUHQFLMDFLMX DGLSRFLWD (Fernyhough i sar. 3RND]DQRMHLGD&(%3ǂRGUçDYDQHRSKRGDQ QLYR 33$5DŽ L GD RPRJXþDYD XVSRVWDYOMDQMH LQVXOLQ]DYLVQRJ XQRVD glukoze u mrke adipocite (Hamm i sar., 1999). 0HāXWLPOLWHUDWXUQLSRGDFLSUXçDMXYHRPDUD]OLĀLWHLQIRUPDFLMHR SURPHQDPD JHQVNH HNVSUHVLMH &(%3ǂ QDURĀLWR VD DVSHNWD PHāXVREQRJ RGQRVD RYRJ IDNWRUD L 33$5DŽ WRNRPGLIHUHQFLMDFLMHPUNLK DGLSRFLWD3RND]DQRMHGDHNVSUHVLMD&(%3ǂXin vitro uslovima dovodi GR LQGXNFLMH 33$5DŽ +DPP L VDU   L GD SUHDGLSRFLWL LPDMX YUOR VOLĀDQ HNVSUHVLRQL SURILO RYD GYD WUDQVNULSFLRQD IDNWRUD ,VWUDçXMXþL Diskusija 83 diferencijaciju preadipocita pokazan je nizak, jedva detektabilan nivo 33$5DŽ L &(%3ǂ WUHþHJ GDQD X NXOWXUL þHOLMD GRN VH  ]QDĀDMQR SRYHþDQMH HNVSUHVLMH 33$5DŽ GHWHNWXMH  GDQD D &(%3ǂ  GDQD diferencijacije (Chen i sar., 2007). 5H]XOWDWL QDåH VWXGLMH SRND]XMX GDKODGQRþD RVWYDUXMH VXSURWDQ HIHNDW QD JHQVNX HNVSUHVLMX 33$5DŽ L &(%3ǂ 1DLPH YHþ RG  VDWD LQGXNRYDQMHEU]WUDQVNULSFLRQLRGJRYRU33$5DŽGRNVHXLVWRYUHPHJDVL RGJRYRU &(%3ǂ X %$7 2GVWXSDQMD RG RYRJ UH]XOWDWD X RGQRVX QD VLQKURQL]RYDQH SURPHQH JHQVNH HNVSUHVLMH 33$5DŽ L &(%3ǂ PRJX VH objasniti jednim delom time åto podaci o ekspresiji ova dva faktora proizilaze uglavnom iz in vitro studija, koje pored brojnih prednosti, ipak ne mogu u potpunosti oslikati in vivo uslove. Sa druge strane, ovakav rezultat moçe biti doveden u vezu sa LQWHQ]LYQRP SUROLIHUDFLMRP X %$7 WRNRP L]ODJDQMD KODGQRþL 1DLPH &(%3ǂ VH DNXPXOLUD SUYHQVWYHQR X SRVWPLWRWLĀNLP GLIHUHQFLUDQLP adipocitima (Hendricks-Taylor i Darlington, 1995; Tao i Umek, 2000). ,PDMXþLXYLGXJRWRYRXSRWSXQRVWL VXSULPLUDQ WUDQVNULSFLRQLRGJRYRU &(%3ǂWRNRPFHORJLVSLWLYDQRJSHULRGDRGVDWDPRçHPR]DNOMXĀLWL GD RYDNYD HNVSUHVLMD &(%3ǂ NRUHOLUD SUH VYHJD VD SUROLIHUDWLYQLP NDSDFLWHWRP %$7 L XND]XMH QD ]QDĀDMQX SUROLIHUDWLYQX XORJX X SUYLP VDWLPD KODGQRþRP LQGXNRYDQH KLSHUSOD]LMH X LVWR YUHPH NDGD 33$5DŽ LQGXNXMHGLIHUHQFLMDFLMXSRVWRMHþLKSUHNXUVRUD1LMHLVNOMXĀHQRGDSRVOH VDWDL]ODJDQMDKODGQRþLGROD]LGRLQGXNFLMH&(%3ǂLGDGRSULQRVLL WHUPLQDOQRMGLIHUHQFLMDFLMLNDRLYHþSRND]DQRMXOR]LXRGUçDYDQMXQLYRD 33$5DŽ 8SULORJVQDçQRLQGXNRYDQRMSUROLIHUDFLMLX%$7YHþRGWUHþHJVDWD L]ODJDQMDKODGQRþLJRYRULSURWHLQVNDHNVSUHVLMD.LL3&1$SRND]DQD X RYRM VWXGLML 7RNRP LVSLWLYDQRJ SHULRGD JUXSH L]ODJDQH KODGQRþL SRND]DOH VX SRYHþDQMH FLWRSOD]PDWVNH UHDNFLMH ]D 3&1$ åWR JRYRUL R SRYHþDQRMVLQWH]LRYRJSURWHLQD3RUHGWRJD]DEHOHçLOLVPRWUDQVORNDFLMX RYRJ WUDQVNULSFLRQRJ IDNWRUD L] FLWRSOD]PH X QXNOHXVH JGH VH LQDĀH DNWLYLUD &R[   D QDMYHþL EURM QXNOHXVD NRML MH SRND]DR Diskusija 84 LPXQRUHDNWLYQRVW MH XRĀHQ X JUXSL NRMD MH ERUDYLOD QD QLVNRM temperaturi 72 sata. 1DQLYRX7(0SRYHþDQDXĀHVWDORVWSUHNXUVRUVNLKþHOLMDDGLSRFLWD XVYLPJUXSDPDL]ODJDQLPKODGQRþLJRYRULXSULORJSRYHþDQRMHNVSUHVLML PDUNHUDSUROLIHUDFLMH3RUHGWRJDSUHNXUVRUVNHþHOLMHVXSRND]DOH]QDNH intenzivne sintetske aktivnosti kao åto su: euhromatski nukleusi, istaknuti nukleolusi, interhromatinske i perihromatinske granule, perihromatinski fibrili, brojne granulacije glikogena i poliribozomi kao i SRYHþDQ EURM FLVWHUQL HQGRSOD]PDWLĀQRJ UHWLNXOXPD 1HUHWNR VX zapaçeni znaci mitotske aktivnosti, centriole u citoplazmi preadipocita i LQWHUVWLFLMVNLK þHOLMD 2YDNYL UH]XOWDWL VQDçQR LQGXNRYDQH SUROLIHUDFLMH XND]XMX GDX%$7SRVWRML SXOPLUXMXþLK SUHNXUVRUVNLK þHOLMD NRMH VX RVSRVREOMHQHGDQDDGHNYDWDQVWLPXOXVRPRJXþHEU]RGJRYRUWNLYDNDR åWRMHVOXĀDMXRYRMVWXGLML 8 RYRM VWXGLML LVSLWDQ MH HNVSUHVLRQL SURILO GUXJRJ ĀODQD 33$5 IDPLOLMH ² 33$5Dž ĀLMD XORJD X %$7 QLMH X SRWSXQRVWL UD]MDåQMHQD ,]ODJDQMH KODGQRþL VQDçQR LQLFLUD WUDQVNULSFLRQL RGJRYRU 33$5Dž SRĀHY RG  VDWD X RYRM VWXGLML ,PDMXþL X YLGX GD MH JHQVND HNVSUHVLMD ]D 8&3L33$5DŽLQLFLUDQDPQRJRUDQLMH YHþWUHþHJVDWD  LGDVHNROLĀLQD L51.]D33$5DŽSULYUHPHQRYUDþDQDNRQWUROQLQLYRXLVWRYUHPHNDGDVH GHåDYD LQGXNFLMD 33$5Dž WR QDP XND]XMH QD PRJXþH IXQNFLRQDOQR GRSXQMDYDQMH ĀODQRYD 33$5 IDPLOLMH X UHJXODFLML HNVSUHVLMH 8&3 8 SULORJRYRPHJRYRULLSRGDWDNGDPLåHYLNRMLLPDMXSRYHþDQXHNVSUHVLMX 33$5Dž SRND]XMX L SRYHþDQX HNVSUHVLMX JHQD ]D 8&3 L REUQXWR ï GHOHFLMD JHQD ]D 33$5Dž X in vitro uslovima ne afektuje diferencijaciju mrkih adipocita, ali smanjuje gensku ekspresiju UCP1 (Wang, 2010). 7DNRāH QLMH LVNOMXĀHQR GD SRYHþDQD HNVSUHVLMD 33$5Dž GRYRGL GR SRYHþDQMD RNVLGDWLYQRJ NDSDFLWHWD X PLWRKRQGULMDPD %$7 åWR MH SRND]DQR]DPLåLþQRWNLYR $QJLRQHLVDU  )XQNFLRQDOQDDNWLYDFLMD%$7SUDþHQDMHSURPHQDPDQHVDPRQD QLYRXPLWRKRQGULMD QHJR L QDQLYRX OLSLGQLK WHOD+ODGQRþD GRYRGL GR promena lipidnog metabolizma, åto za posledicu ima intenzivnu lipolizu Diskusija 85 &DQQRQ L 1HGHUJDDUG  2WDåHYLþ L VDU   8VLWQMDYDQMH lipidnih tela u citoplazmi mrkih adipocita, kao parametar intenzivne OLSROL]H  ]DEHOHçHQR MH YHþ  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL L XRĀHQR MH QD nivou svetlosne i elektronske mikroskopije. Ovaj proces se deåava na UDĀXQ RVOREDāDQMD PDVQLK NLVHOLQD NRMH þH ELWL WUDQVSRUWRYDQH GR PLWRKRQGULMDLSHURNVL]RPDSRPRþXSURWHLQD)$%38]LPDMXþLXRE]LU ulogu ovog proteina u BAT, njegova indukcija pokazana u ovoj studiji kao i rezultati svetlosne i elektronske mikroskopije u skladu su sa SURPHQDPD OLSLGQRJPHWDEROL]PDQDKODGQRþL1DWDMQDĀLQRPRJXþHQ je adekvatan odgovor tkiva i ubrzana oksidacija masnih kiselina u SHURNVL]RPLPD LPLWRKRQGULMDPD2VLPWRJDQDMYHþDNROLĀLQD L51.]D )$%3MH]DEHOHçHQDXLVWRMLVSLWLYDQRMWDĀNL VDW NDGDMHSRND]DQD PDNVLPDOQDNROLĀLQDL51.]D33$5DŽåWRJRYRULRSUHFL]QRMLXVNODāHQRM UHJXODFLMLHNVSUHVLMHJHQDXNOMXĀHQLKXOLSLGQLPHWDEROL]DP 8RYRMVWXGLMLLVSLWDQLVXLQHGDYQRSURQDāHQLSURDGLSRJHQLIDNWRUL ï ĀODQRYL SRURGLFH ./) L ./) ,PDMXþL X YLGX GD ./) RVWYDUXMH direktnu interakciju sa promotorom gena za UCP1 (Yamamoto i sar.,   SRND]DQR SRYHþDQMH JHQVNH HNVSUHVLMH RG  VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL MDVQRXND]XMHQDXĀHåþH./)XUHJXODFLMLHNVSUHVLMH8&3 1LMH LVNOMXĀHQD XORJD RYRJ WUDQVNULSFLRQRJ IDNWRUD L X SURFHVX GLIHUHQFLMDFLMH WRNRPKODGQRþRPLQGXNRYDQHKLSHUSOD]LMH%$7RE]LURP GD VX IXQNFLRQDOQD &$&&& YH]XMXþD PHVWD ./) SURQDāHQD X NRQWUROQLPUHJLRQLPD&(%3ǂ L33$5DŽ'UXJL LVSLWLYDQL WUDQVNULSFLRQL IDNWRURYHIDPLOLMH./)XRYRPUDGXMH]QDĀDMQRLQGXNRYDQVDPR VDWD GRN MH X VYLP RVWDOLP WDĀNDPD LVSRG NRQWUROQRJ QLYRD 2YL rezultati su u saglasnosti sa rezultatima Pei i sar. (2011) koji su nedavno pokazali da KLF9 ima udela u adipogenezi transaktivacijom 33$5DŽ X VUHGLåQMHP SHULRGX in vitro GLIHUHQFLMDFLMH 0HāXWLP RYDNDY HNVSUHVLRQLSURILO./)]DKWHYDGDOMDLVWUDçLYDQMDXVPLVOXXWYUāLYDQMD RGQRVD VD GUXJLP WUDQVNULSFLRQLP IDNWRULPD XNOMXĀHQLP X SURFHV KLSHUSOD]LMH %$7 L PRJXþHJ VLQHUJLVWLĀNRJ GHORYDQMD VD GUXJLP faktorima (Carey, 1998; Siersaek, 2012). Diskusija 86 8 RYRP UDGX MH SR SUYL SXW SRND]DQR GD  KODGQRþD LQGXNXMH HNVSUHVLMX 0\I SRND]XMXþL GD RYDM IDNWRU QLMH VSHFLILĀQL PDUNHU PLREODVWD NDNR VH UDQLMH PLVOLOR L GD X %$7 SRVWRML SRSXODFLMD þHOLMD koja eksprimira Myf5. Ovaj rezultat se moçe dovesti u vezu sa NRRUGLQLVDQLP SRYHþDQMHP 3&1$ HNVSUHVLMH L %03 RG  VDWD SRND]DQLP X RYRM VWXGLML ,PDMXþL RYR X YLGX NDR L SRYHþDQMH XĀHVWDORVWLSUHDGLSRFLWDXJUXSDPDL]ODJDQLPKODGQRþLPRJXþHMHGDVX XSLWDQMXSUHNXUVRUVNHþHOLMH]DNRMHVX6HDOHLVDU  SRND]DOLGD VX ]DMHGQLĀNL SUHNXUVRUL SRSUHĀQRSUXJDVWLK PLåLþQLK þHOLMD L PUNLK adipocita. Ipak, ovo pitanje ostaje otvoreno i zahteva imunohistohemijsku lokalizaciju ovog proteina. 3RUHG ĀLWDYH PUHçH WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD NRML UHJXOLåX SURFHV hiperplazije BAT, proliferacija i diferencijacija mrkih adipocita afektovana je brojnim hormonima i signalima spoljaånje sredine, kao åto su faktori rasta iz porodice BMP. Pokazano je da ovi faktori tokom UDQRJHPEULRQDOQRJUD]YLþDVWYDUDMXNRQFHQWUDFLRQLRGQRVQRPRUIRJHQL JUDGLMHQW SUHQRVHþL VLJQDOH L] VSROMDåQMH VUHGLQH %03 VH VLQWHWLåH X EOL]LQL SUHNXUVRUVNLK þHOLMD L NUYQLK VXGRYD L LPD YDçQX XORJX X RĀXYDQMX PLNURRNUXçHQMD 6FKXO] L 7VHQJ   8 RYRM VWXGLML pokazana je indukcija proteinske ekspresije BMP7 od 3. sata, dok je imunopozitivnost detektovana u mrkim adipocitima, preadipocitima, a QDMMDĀDUHDNFLMDMHSRND]DQDXYH]LYQRWNLYQRMVWURPL2YRXND]XMHGDMH YDQþHOLMVNL PDWULNV ]QDĀDMDQ GHSR RYRJ SURWHLQD L XND]XMH QD PRJXþQRVW YH]LYDQMD %03 ]D QHNH RG NRPSRQHQWL PDWULNVD %$7 6OLĀQHUH]XOWDWHVXGRELOL%REDF]LVDU  LVSLWXMXþLXORJX%03X KURQLĀQRPDUWULWLVXJGHVXSRND]DOLGD%03LPDVSRVREQRVWYH]LYDQMD za fibrilin. Isti obrazac BMP7 imunoekspresije u humanom fBAT kao u animalnom modelu moçe da ukazuje na konzerviranu ulogu BMP7 u KLSHUSOD]LML %$7 NDNR X XVORYLPD KODGQRþRP LQGXNRYDQH KLSHUSOD]LMH tako i u hiperplaziji tokom razvoja BAT. Diskusija 87 BMP7 pored uloge u akumulaciji lipida, jedini ima sposobnost LQGXNFLMH 8&3 HNVSUHVLMH ]D UD]OLNX RG GUXJLK ĀODQRYD RYH SRURGLFH (BMP2, BMP4 i BMP6). BMP4 adipogeni faktor WAT, suprimira ekspresiju UCP1 u mrkim preadipocitima, uprkos efektu koji ostvaruje na lipide (Tseng i sar., 2008). U ovom radu je genska ekspresija BMP4 LQGXNRYDQDKODGQRþRPYHþVDWDLGRVWLçHPDNVLPDODQQLYRXLVWRM LVSLWLYDQRM WDĀNL  VDW  NDGD MH ]DEHOHçHQ PDNVLPDODQ QLYR transkripcije za BMP7. Kako su preadipociti BAT na strukturnom nivou NDUDNWHULVWLĀQLXSUDYRSRSRĀHWQRPQDNXSOMDQMXOLSLGDLPLWRKRQGULMDX FLWRSOD]PL PRJXþH MH GD %03 L %03 NRRSHUDWLYQR GRYRGH GR GHSRQRYDQMDOLSLGDXRYLPþHOLMDPD Pored toga, detektovana translaciona koekspresija BMP7 i UCP1 prikazana u ovom radu govori u prilog tome da BMP7 ima ulogu u termogenom odgovoru tkiva – aktivacijom UCP1. Pored uloge u adipogenezi, pokazano je da BMP7 moçe regulisati potroånju energije DIHNWXMXþL HNVSUHVLMX JHQD XNOMXĀHQLK X IXQNFLMX L ELRJHQH]X mitohondrija (Zamani i Brown, 2011), åto ukazuje na viåestruke uloge ovog proteina tokom proliferacije i diferencijacije BAT. 5.3. INDUKCIJA ANGIOGENEZE U BAT ,]UD]LWD SODVWLĀQRVW NRMD RGOLNXMH %$7 ]DKWHYD XVDJODåHQRVW SURFHVD DGLSRJHQH]H L DQJLRJHQH]H NRMD VH XRĀDYD NDNR WRNRP UDVWD WNLYD WDNR L WRNRP QMHJRYH UHJUHVLMH 2YR MH RPRJXþHQR þHOLMVNRP NRPXQLNDFLMRP DGLSRFLWD SUHDGLSRFLWD L HQGRWHOVNLK þHOLMD  SXWHP brojnih angiogenih faktora, åto ima za posledicu brzu aktivaciju mitoze X SUHNXUVRULPD PUNLK DGLSRFLWD L HQGRWHOVNLP þHOLMDPD &DR   VEGF se smatra najvaçnijim angiogenim faktorom, neophodnim za indukciju formiranja krvnih sudova (Hausman i Richardson, 2004). 8RYRPUDGXSRND]DQR MHGD%$7WRNRPKODGQRþRPLQGXNRYDQH KLSHUSOD]LMHHNVSULPLUD]QDĀDMQHNROLĀLQH L51. LSURWHLQD]D9(*)åWR MHXVNODGXVDYHOLNLPNDSDFLWHWRPRYRJWNLYD]DKLSHUWURILMX3RYHþDQMH Diskusija 88 QLYRD 9(*) L51. GHWHNWRYDQR MH X VYLP LVSLWLYDQLP WDĀNDPD WRNRP L]ODJDQMDKODGQRþLDQDMYHþD]DEHOHçHQDNROLĀLQDMHSRND]DQDVDWD Ovi podaci su jednim delom u skladu sa rezultatima Asana i sar, (1997), NRML VX LVWUDçLYDOL HIHNDW KURQLĀQRJ L]ODJDQMD L ]DEHOHçLOL SUROD]QR SRYHþDQMH JHQVNH HNVSUHVLMH9(*) RGSUYRJ GR ĀHWYUWRJ VDWD L]ODJDQMD KODGQRþL äWDYLåH UH]XOWDWL LPXQRKLVWRKHPLMVNH GHWHNFLMH 9(*) SRND]DOL VX SURJUHVLYQR SRYHþDQMH LPXQRSR]LWLYQRVWL YHþ RG  VDWD X SRUHāHQMXVDNRQWURORPDQDMYHþDJXVWLQDNDSLODUQHPUHçHVHXRĀDYD 24. sata kada je detektovan maksimum ekspresije VEGF iRNK. +ODGQRþRP LQGXNRYDQD JHQVND HNVSUHVLMD 9(*) L HQGRJOLQD XND]XMHQDNRRSHUDWLYDQRXĀHåþHRYDGYDIDNWRUDXDQJLRJHQH]L1DLPH QRYLMDLVWUDçLYDQMDXND]XMXQD]QDĀDMXORJH7*)ǃXVLJQDOQLPSXWHYLPD XNOMXĀHQLPXUD]YRMNDSLODUQHPUHçH(QGRJOLQSUHGVWDYOMDQRYLLVODER LVWUDçHQUHJXODWRUQLHOHPHQW7*)ǃUHFHSWRUQRJNRPSOHNVD LVPDWUDVH YDçQLP LQGLNDWRURP SUROLIHUDFLMH HQGRWHOVNLK þHOLMD )RQVDWWL L 0DLR 2004; Bernabeu i sar., 2007). Vaçnost endoglina u vaskularnoj morfogenezi je pokazana in utero XJLQXþHP PLåHYD NRML VX ELOL deficijentni za ovaj faktor rasta (Bourdeau i sar., 1999; Arthur i sar., 2000). 8QDåRMVWXGLMLSRND]DQRMH]QDĀDMQRSRYHþDQMHJHQVNHHNVSUHVLMH ]DHQGRJOLQSRĀHYRGVDWDL]ODJDQMDKODGQRþLLYLVRNQLYRVHRGUçDYD do kraja ispitivanog perioda. Signalni putevi endoglina su slabo ispitani, ali pretpostavljamo da endoglin ostvaruje efekat jednim delom na DQJLRJHQH]X]DMHGQRVD%03 LPDMXþLXYLGXGDVXREDĀODQD7*)ǃ SRURGLFH DIHNWRYDQD KODGQRþRP 3RUHG WRJD HQGRJOLQ LPD XWLFDMD QD DGKH]LMX HQGRWHOVNLK þHOLMD PLJUDFLMX SUROLIHUDFLMX L LQWHUHVDQWQR PRELOL]DFLMXVWHPþHOLMDL]QMLKRYRJPLNURRNUXçHQMD &RQOH\LVDU Bernabeu i sar., 2007), åto je pokazano i za BMP7. 6DDVSHNWDSUROLIHUDFLMHHQGRWHOVNLKþHOLMDSRVHEQRVXLQWHUHVDQWQL podaci imunohistohemijske detekcije PCNA i Ki-67 pokazane u ovoj VWXGLMLNDRLVOLĀDQRGJRYRUWNLYQHHNVSUHVLMH9(*)L.L8VNODGXVD GHWHNFLMRPRYLKþHOLMDX%$7PRçHPRSUHWSRVWDYLWLGD LQGXNFLMD3&1$ Diskusija 89 GRYRGL GR SUROLIHUDFLMH SUHNXUVRUDPUNLK DGLSRFLWD L HQGRWHOVNLK þHOLMD %$7GRN.LGRYRGLGRSUROLIHUDFLMHSUHYDVKRGQRHQGRWHOVNLKþHOLMD 3URPHQH QD QLYRX JHQD L SURWHLQD XNOMXĀHQLK X SURFHV angiogeneze u skladu su sa ultrastrukturnim promenama. Naime, na ultrastrukturnom nivou, zapazili smo da je vazodilatacija prvi odgovor WNLYD QD L]ODJDQMH KODGQRþL NDNR EL VH RPRJXþLOR QHRSKRGQR VQDEGHYDQMH WNLYD NLVHRQLNRP L VXSVWUDWLPD D ]DWLP VH XNOMXĀXMH L DQJLRJHQH]DNRMDMHQHRSKRGQD]DUDVWLXYHþDQMH%$73RYHþDQMHEURMD NDSLODUD X RGQRVX QD NRQWUROX XRĀHQR MH X VYLP JUXSDPD L]ODJDQLP KODGQRþL 2YL UH]XOWDWL VX X VDJODVQRVWL VD QDåLP SUHWKRGQLP rezultatima morfoloåko-stereoloåke analize u kojoj smo pokazali da L]ODJDQMHKODGQRþLGRYRGLGRSRYHþDQMDNDSLODUQHPUHçHLEURMDNDSLODUD X%$7 .RUDþLVDU 3RUHGWRJDXRĀHQRMHSRYHþDQMHXĀHVWDORVWL DGLSRJHQRDQJLRJHQLK NODVWHUD NRMH ĀLQH QDMYHþLP GHORP SUHDGLSRFLWL L HQGRWHOVNHþHOLMHåWRXND]XMHQDQHRGYRMLYRVWGYDSURFHVD²DGLSRJHQH]H LDQJLRJHQH]HX%$7WRNRPKODGQRþRPL]D]YDQHKLSHUSOD]LMH 6DDVSHNWDSUROLIHUDFLMHSUHDGLSRFLWDLHQGRWHOVNLKþHOLMD]DQLPOMLYL su rezultati imunohistohemijske detekcije PCNA i Ki-67 u adipogeno- angiogenim klasterima u ovoj studiji, koji pokazuju lokalizaciju oba SURWHLQDXSUHDGLSRFLWLPD L HQGRWHOVNLPþHOLMDPDSRMHGLQLKDGLSRJHQR DQJLRJHQLKNODVWHUDDOLVXXRĀHQLLNODVWHULXNRMLPDVDPRSUHDGLSRFLWL HNVSULPLUDMXPDUNHUHSUROLIHUDFLMHNDRLNODVWHULXNRMLPDWRĀLQHVDPR HQGRWHOVNHþHOLMH3R]QDWRMHGDVHHQGRWHOVNHþHOLMHL]RORYDQHL]UD]OLĀLWLK depoa masnog tkiva razlikuju u proliferativnom kapacitetu (Cao, 2007). U naåoj studiji smo pokazali da takve razlike postoje i u okviru istog GHSRD åWRXND]XMHQD ]QDĀDMPLNURRNUXçHQMD RGQRVQRþHOLMVNHQLåHX WNLYX NRMD RĀLWR VSHFLILĀQR RUJDQL]XMH L ÅYDVSLWDYD´ þHOLMH WRNRP diferencijacije. Diskusija 90 5.4. HUMANO FETALNO BAT 5.4.1. Uloga ER u razvoju humanog fBAT 1DNRQ XWYUāLYDQMD RGJRYRUD JODYQLK WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD L SURWHLQD XNOMXĀHQLK X KLSHUSOD]LMX %$7 SDFRYD NDR L VWUXNWXUQLK promena u tkivu, ispitana je proteinska ekspresija transkripcionih IDNWRUDXNOMXĀHQLKXUD]YRMKXPDQRJI%$7 5D]YLþHPDVQRJWNLYDNDNRNRGçLYRWLQMD WDNR LNRGĀRYHNDSRG XWLFDMHP MH YHþHJ EURMD KRUPRQDPHāX NRMLPD SRUHG QRUDGUHQDOLQD L LQVXOLQD ]QDĀDMQR PHVWR SULSDGD HVWURJHQX (VWURJHQ RVWYDUXMH GLUHNWDQHIHNDWQD%$7UHJXOLåXþLGHSRQRYDQMHOLSLGDEURMDGLSRFLWDD SRND]DQR MH L GD ]QDĀDMQR GRSULQRVL SRWURåQML HQHUJLMH &RRNH L 1DD] 2004). 8 RYRM VWXGLML SURWHLQVND DQDOL]D (5 WRNRP UD]OLĀLWLK QHGHOMD UD]YLþD %$7 SRĀHY RG ;9,, ]DNOMXĀQR VD ;;,,, QHGHOMRP SRND]DOD MH YUHPHQVNL]DYLVQXLQGXNFLMXWUDQVODFLRQRJRGJRYRUD(5ǂ,VWRYUHPHQR ]DEHOHçHQDMHVODEDLSUROD]QDSURWHLQVNDHNVSUHVLMD(5ǃåWRXND]XMHGD estrogen ostvaruje efekat preko obe receptorne izoforme ali da je GRPLQDQWQD L]RIRUPD HNVSULPLUDQD X KXPDQRP I%$7 (5ǂ 2YR GRGDWQR SRWYUāXMH LPXQRKLVWR L LPXQRFLWRKHPLMVND GHWHNFLMD (5 X ovom radu. 3ULVXVWYRLPXQRJROGSDUWLNXODNRMLPDVPRSRND]DOLSULVXVWYR(5ǂ XPUNLPDGLSRFLWLPDSUHDGLSRFLWLPDPH]HQKLPVNLPVWHPþHOLMDPDNDR L X HQGRWHOVNLP þHOLMDPDXND]XMH QDPRJXþHXĀHåþH RYRJ UHFHSWRUDX SURFHVX DGLSRJHQH]H WRNRP IHWDOQRJ SHULRGD ,PDMXþL X YLGXGHWHNFLMX LPXQRJROG SDUWLNXOD ]D (5ǃ VDPR X ]UHOLP PUNLP DGLSRFLWLPD QDåL rezultati pokazuju da estrogen svoj efekat na diferencijaciju mrkih DGLSRFLWDRVWYDUXMHQDMYHþLPGHORPSUHNR(5ǂ6OLĀDQRGQRVHNVSUHVLMH (5SRND]DOLVX'LHXGRQQpLVDU  SURXĀDYDMXþLREDWLSDUHFHSWRUD X:$7ĀRYHND Detaljnom ultrastrukturnom i imunocitohemijskom analizom pokazali smo prisustvo obe izoforme ER u nukleusima, citoplazmi i Diskusija 91 PLWRKRQGULMDPD ]UHOLK PUNLK DGLSRFLWD DOL L QD QLYRX þHOLMVNH membrane. ,DNR HVWURJHQ RVWYDUXMH VYRM HIHNDW QDMYHþLP GHORP GLUHNWQR UHJXOLåXþLHNVSUHVLMXJHQDXQXNOHXVXSRND]DQRMHGDPDODSRSXODFLMD RYLK UHFHSWRUDPRçHELWLSULGUXçHQDþHOLMVNRMPHPEUDQL L LQLFLUDWLEU]L negenomski efekat. Ovi receptori mogu formirati komplekse sa drugim SURWHLQLPD NDR åWR MH NDYHROLQ  LQGXNXMXþL SRYHþDQMH QLYRD kalcijumovih jona i azot monoksida (Luconi i sar., 2002). Naåa grupa je pokazala da ovi sekundarni glasnici imaju vaçnu ulogu u procesu PLWRKRQGULRJHQH]H %$7 3HWURYLF L VDU  0DUNHOLþ L VDU   6WRJDVDJODVQRVDUH]XOWDWLPDORNDOL]DFLMH(5ǂL(5ǃXPLWRKRQGULMDPD pokazanim u ovoj studiji, i podacima drugih grupa (Jazbutyte i sar.,   NRMH VX GHWHNWRYDOH (5( X PLWRKRQGULMDOQRP JHQRPX ĀRYHND PRçHPR]DNOMXĀLWLGDHVWURJHQRVWYDUXMHGLUHNWDQHIHNDWQDPLWRKRQGULMH humanog fBAT preko obe izoforme. Pored toga, nukleusna i mitohondrijalna lokalizacija ER u ovom radu sugeriåe postojanje NRRUGLQLVDQH UHJXODFLMH JHQVNH HNVSUHVLMH L]PHāX RYD GYD þHOLMVND odeljka u humanom fBAT. ,PDMXþL X YLGX SRND]DQR SULVXVWYR RED (5 X ]UHOLP PUNLP DGLSRFLWLPDNDRLVODEXNRORNDOL]DFLMX(5ǂL(5ǃPRçHPRVSHNXOLVDWLR QMLKRYLP UD]OLĀLWLP XORJDPD X SURFHVX DGLSRJHQH]H 7RPH GRGDWQR GRSULQRVH UH]XOWDWL LPXQRFLWRKHPLMH NRML VX SRND]DOL SULVXVWYR (5ǂ X þHOLMDPD GLIHUHQFLMDFLRQRJ QL]D %$7 åWR XND]XMH QD XORJX RYRJ receptora u procesu diferencijacije. äta viåe, na to jasno ukazuje NRORNDOL]DFLMD (5ǂ VD 33$5DŽ ,DNR (5ǃ QLMH NRORNDOL]RYDQ VD 33$5DŽ SRND]DQD MH ]QDĀDMQD NRORNDOL]DFLMD VD 3*&ǂ 3ULVXWQRVW REH receptorne izoforme u mitohondrijama, kao i kolokalizacija oba UHFHSWRUD VD 3*&ǂ MDVQR XND]XMH QD PRJXþQRVW GD  HVWURJHQ ostvaruje efekte na mitohondrije preko oba tipa receptora kao i da LQWHUDJXMHVD3*&ǂ Diskusija 92 5.4.2. Termogeni kapacitet humanog fBAT 3DUDOHOQR VD SUDþHQMHP HNVSUHVLMH (5 WRNRP KLSHUSOD]LMH KXPDQRJ I%$7 X RYRP UDGX SUDþHQD MH SURWHLQVND HNVSUHVLMD 8&3 33$5DŽ L 3*&ǂ NOMXĀQLK UHJXODWRUD WHUPRJHQRJ NDSDFLWHWD L GLIHUHQFLMDFLMH%$7 3RYHþDQMH NROLĀLQH RYLK SURWHLQD SRND]DQRX;;,,, nedelji fetalnog razvoja BAT u odnosu na XVII nedelju, idu u prilog tkivnoj hiperplaziji BAT tokom gestacije, kada se masa humanog fBAT i NROLĀLQD8&3SURJUHVLYQRSRYHþDYDMXNDNRELGRVWLJOLVYRMPDNVLPXP SRURāHQMX 6\PRQGVLVDU  5H]XOWDWLSURWHLQVNHHNVSUHVLMH8&333$5DŽ L3*&ǂSRND]XMX koordinisanu ekspresiju ovih proteina i u humanom fBAT, u cilju WHUPRJHQRJRVSRVREOMDYDQMD WNLYD ,PDMXþLXYLGX UH]XOWDWHRYHVWXGLMH PRçHPR]DNOMXĀLWLGDUD]YRMKXPDQRJI%$7SRGUD]XPHYDVOLĀQHDNRQH i iste mehanizme aktivacije kao BAT pacova. Pokazana tkivna ekspresija noradrenalina, koji pokazuje isti obrazac ekspresije u obe studije, jasno XND]XMHQDXORJXVLPSDWLĀNHLQHUYDFLMHXUD]YRMXI%$7NRGOMXGL Ova studija je po prvi put pokazala da se BAT javlja ranije tokom IHWDOQRJSHULRGD LGD MH8&3GHWHNWDELODQYHþX;9,,QHGHOML UD]YLþD Ultrastruktura humanog fBAT do sada je pokazana u samo nekoliko radova, fokusiranih na ultrastrukturne karakteristike i identifikaciju anatomske lokalizacije u organizmu (Merklin, 1974; Poissonnet i sar., 1984; Zancanaro i sar., 1995). Histoloåki podaci iz ranijih studija XND]XMXGDUD]YLþH%$7NRGĀRYHNDSRĀLQMHRNRåHVWRJPHVHFDIHWDOQRJ perioda (Merklin, 1974; Moragas i Toran, 1983). Na ultrastrukturnom nivou ovo tkivo je pokazalo sve vaçne karakteristike BAT: citoloåke odlike mrkih adipocita i preadipocita, inervaciju i bogatu prokrvljenost. Na osnovu velikog broja prekursorskih þHOLMD 06ý L SUHDGLSRFLWD UD]OLĀLWLK XOWUDVWUXNWXUQLK NDUDNWHULVWLND jasno je da tkivo prolazi kroz intenzivne procese proliferacije i diferencijacije. Diskusija 93 Na osnovu Western blot analize i imunohisto/imunocitohemije, SRND]DQRMHGDMH(5ǂGRPLQDQWQDL]RIRUPDLGDHVWURJHQVYRMHIHNDWQD GLIHUHQFLMDFLMXRVWYDUXMHXJODYQRPSUHNRRYRJUHFHSWRUDLPDMXþLXYLGX UH]XOWDWH NRORNDOL]DFLMH YHURYDWQR GLUHNWQRP LQWHUDNFLMRP VD 33$5DŽ Pored toga, imunocitohemijska analiza ukazuje da estrogen ostvaruje direktan efekat na mitohondrije ovog tkiva preko oba tipa receptora, bilo GD WR ĀLQL UHJXODFLMRP JHQD PLWRKRQGULMDOQRJ JHQRPD LLOL PRJXþRP LQWHUDNFLMRPVD3*&ǂNOMXĀQLPHIHNWRURPPLWRKRQGULRJHQH]H ÿLQMHQLFD GD VH SUHDGLSRFLWL X DQLPDOQRPPRGHOX L X VWXGLML QD KXPDQRPI%$7QDMĀHåþHVUHþXXEOL]LQLNUYQLKVXGRYDNDR L WRGDVX SR QDVWDQNX X IL]LĀNRP NRQWDNWX VD HQGRWHOVNRP þHOLMRP XND]XMH QD PRJXþQRVW ]DMHGQLĀNRJSRUHNODRYLKþHOLMD6DGUXJHVWUDQHSRND]DQD HNVSUHVLMD0\IX%$7SDFRYDNDRLĀLQMHQLFDGDMHRYDMPLRJHQLIDNWRU LQGXNRYDQ KODGQRþRP XND]XMH QD SRVWRMDQMH SUHNXUVRUD NRML LPDMX PRJXþQRVW GLIHUHQFLMDFLMH X SUDYFX PUNLK DGLSRFLWD LOL SRSUHĀQR SUXJDVWLKPLåLþQLKþHOLMD Iz svih navedenih rezultata ove studije proizilazi hipoteza da u humanom fBAT postoje dva pula preadipocita, jedan pul koji deli ]DMHGQLĀNR SRUHNOR VD HQGRWHOVNLP þHOLMDPD VD NRMLPD MH L SURVWRUQR EOL]DN L GUXJL SXO NRML GHOL SRUHNOR VD PLåLþQLP þHOLMDPD L NRML X FLWRSOD]PL SRVHGXMH QHNROLNR OLSLGQLK WHOD L VDUNRPHUDPDVOLĀQH strukture. Za sada su ovakve pretpostavke samo spekulativne i zahtevaju dalja istraçivanja. Posebno interesantan je rezultat koji je proizaåao detekcijom 8&3 X KXPDQRP I%$7 NDR L X VWXGLML QD SDFRYLPD .DR åWR MH YHþ prethodno pomenuto, jedna od glavnih karakteristika termogenog SURFHVD %$7 NRMD RPRJXþDYD RGUçDYDQMH WHOHVQH WHPSHUDWXUH L potroånju energije jeste aktivacija ekspresije UCP1, markera mrkih DGLSRFLWD6WRJDORNDOL]DFLMD8&3XHQGRWHOVNLPLSRSUHĀQRSUXJDVWLP PLåLĀQLPþHOLMDPDRWYDUDEURMQDSLWDQMDSUHVYHJDGDOL8&3LPDXORJX GDUHJXOLåHSURGXNFLMXUHDNWLYQLKNLVHRQLĀQLKYUVWDNDRåWRMHSRND]DQR XHQGRWHOVNLPþHOLMDPD 3RUWHU  Diskusija 94 Dalje, rezultati imunohistohemijske i ultrastrukturne analize razvoja humanog fBAT su otvorili joå jedno pitanje: da li se koncept ÅQLåHVWHPþHOLMD´PRçHSULPHQLWLLQDSUHNXUVRUVNHþHOLMHRYRJWNLYD" +LSRWH]DRQLåLVWHPþHOLMDSRVWDYOMHQD MHJRGLQHRGVWUDQH 6FKRILHOG 6FKRILHOG NDGDMHGHILQLVDQDNDRGLQDPLĀQDVWUXNWXUD koja integriåe brojne spoljaånje i unutraånje signale i diktira dalju VXGELQX VWHP þHOLMD 1LåX ĀLQH VWHP þHOLMH SRWSRUQH þHOLMH VWURPH QMLKRYHNRPXQLNDFLMVNHYH]HLDGKH]LYQHYH]HNRPSRQHQWHYDQþHOLMVNRJ PDWULNVDNRMHSURVOHāXMXPHKDQLĀNHLGUXJHVLJQDOH0HāXQDMYDçQLMLP signalima koji imaju uticaj na niåu pominje se upravo morfogen BMP7, koji sekretovan u samoj niåi ili van nje formira tzv. morfogeni gradijent i QDWDMQDĀLQÅGDMH´LQVWUXNFLMHVWHPþHOLMDPD 0L VPR QD QLYRX (0 MDVQR XRĀLOL PDOH JUXSDFLMH þHOLMD NRMH RGJRYDUDMXRSLVXQLåHRVWYDUXMXPHāXVREQHNRQWDNWHDOLLNRQWDNWHVD NRPSRQHQWDPD YDQþHOLMVNRJ PDWULNVD 1D QLYRX 60 GHWHNWRYDOL VPR EURMQHSURWHLQHXYH]LYQRWNLYQRMVWURPLKXPDQRJI%$7DPHāXVREQD interakcija sa drugim morfogenima dodatno komplikuje istraçivanja RGUçDYDQMDSUROLIHUDFLMHLGLIHUHQFLMDFLMHVWHPþHOLMD3RVWRMHSRGDFLGDL noradrenalin (Nedergaard i sar., 1995) koji smo detektovali u vezivno- tkivnoj stromi moçe imati ulogu morfogena. ,DNRVXLVWUDçLYDQMDQLåHVWHPþHOLMDX]DĀHWNXMDVQRMHNROLNRMH QMHQDXORJDYDçQD3RND]DQR MHGDREOLNþHOLMHJHRPHWULMD LHODVWLĀQRVW NRPSRQHQDWD YDQþHOLMVNRJ PDWULNVD LPDMX XWLFDMD QD UHJXODFLMX IL]LRORJLMH L UDVWD þHOLMD )RONPDQ L 0RUFRQD   6WRJD PRçHPR ]DNOMXĀLWL QD RVQRYX XOWUDVWUXNWXUQLK UH]XOWDWD QDåH VWXGLMH GD %$7 SRVHGXMHPLNURRNUXçHQMD RGQRVQR QLåH VWHP þHOLMD NRMH LPDMX UD]OLĀLW VNORS L VDPLP WLP UD]OLĀLWR SULPDMX L SUHQRVH VLJQDOH L] VSROMDåQMH VUHGLQH ,DNR VH RYH þHOLMH YHRPD UHWNR VUHþX X DGXOWQRP WNLYX X EXGXþLP LVWUDçLYDQMLPD EL WUHEDOR LVSLWDWL QD NRMH QDĀLQH GROD]L GR SUHQRVDUD]OLĀLWLKVLJQDODXELRKHPLMVNHVLJQDOHDNRMLVDGUXJHVWUDQH SRNUHþX VLJQDOQH SXWHYH L GRYRGH GR SURPHQD HNVSUHVLMH transkripcionih faktora. 95 =$./-8ÿ&, Rezultati studije o hiperplaziji BAT kod pacova tokom izlaganja KODGQRþL L WRNRP UD]YRMD IHWDOQRJ KXPDQRJ %$7 SHULRGX ĀRYHND SRND]DOL VX GD VH X RVQRYL SRYHþDQMD PDVH WNLYD QDOD]L KLSHUSOD]LMD SUHNXUVRUVNLK DGLSRFLWQLK L HQGRWHOVNLK þHOLMD L GD MH RYDM SURFHV SRG VWURJRP NRQWURORP RGJRYDUDMXþLK WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD 1D RVQRYX GRELMHQLKUH]XOWDWDPRJXVHL]YHVWLVOHGHþL]DNOMXĀFL ƒ ,]ODJDQMHSDFRYDKODGQRþLDNWLYLUDWHUPRJHQLSURJUDPX%$7NRML MH SUDþHQ VLQKURQL]RYDQRP WUDQVNULSFLRQRP L WUDQVODFLRQRP DNWLYDFLMRPNOMXĀQLK UHJXODWRUQLKSURWHLQD WHUPRJHQRJSURJUDPD ² 8&3 33$5DŽ L 3*&ǂ  VDW  (NVSUHVLMD RYLK SURWHLQD MH pokazana u humanom fBAT i zajedno sa ekspresijom HVWURJHQVNLK UHFHSWRUD XND]XMH QD VOLĀQH PHKDQL]PH DNWLYDFLMH WHUPRJHQRJSURJUDPD%$7NDRXVOXĀDMX%$7SDFRYD ƒ 3RYHþDQMH WHUPRJHQRJ NDSDFLWHWD %$7 SDFRYD QD XOWUDVWUXNWXUQRP QLYRX MH SUDþHQR SRYHþDQRP ]DVWXSOMHQRåþX PLWRKRQGULMD QMLKRYRP GHRERP L IX]LMRP R ĀHPX VYHGRĀL SRYHþDQDHNVSUHVLMD'USL0IQ ƒ 3RUHG 33$5DŽ L]ODJDQMH SDFRYD KODGQRþL GRYRGL GR HNVSUHVLMH GUXJLK LVSLWLYDQLK WUDQVNULSFLRQLK IDNWRUD 33$5ĵ./)./) 0\I1UILUHSUHVLMH&(%3ǂ ƒ +LSHUSOD]LMD %$7 SDFRYD L I%$7 SUDþHQD MH SRYHþDQMHP EURMD SUHDGLSRFLWD HQGRWHOVNLK þHOLMD L LQWHUVWLFLMVNLK þHOLMD åWR MH XRĀHQR QD QLYRX VYHWORVQH L HOHNWURQVNHPLNURVNRSLMH 8 RVQRYL SUROLIHUDFLMH QDOD]L VH SRYHþDQD WNLYQD L SURWHLQVND HNVSUHVLMD PCNA i Ki-67 pokazana u ovoj studiji. ƒ Hiperplaziji BAT pacova i fBAT doprinosi intenzivirana DQJLRJHQH]D R ĀHPX VYHGRĀL SRYHþDQMH HNVSUHVLMH 9(*) L endoglina. 96 ƒ 8 YH]L VD SUROLIHUDWLYQRP VSRVREQRåþX SRND]DQR MH GD VX adipogeneza i angiogeneza vremenski i prostorno povezane, i da VH RYL SURFHVL RGYLMDMX QDMYHþLP GHORP X DGLSRJHQRïDQJLRJHQLP klasterima, kako u BAT pacova, tako i u humanom fBAT. ƒ Hiperplazija BAT pacova i fBAT podrazumeva aktivno UHPRGHOLUDQMH YDQþHOLMVNRJPDWULNVDSRVHEQR L]UDçHQRRNRþHOLMD u procesu proliferacije i oko adipogeno-angiogenih klastera. Uzeti zajedno, rezultati ukazuju na visoko-koordinisanu regulaciju JHQVNH L SURWHLQVNH HNVSUHVLMH SUDþHQX RGJRYDUDMXþLP VWUXNWXUQLP SURPHQDPDWRNRPKODGQRþRPLQGXNRYDQHKLSHUSOD]LMH%$7SDFRYDNDR i tokom razvoja BAT u humanom fetusu u cilju termogenog osposobljavanja fBAT. Razumevanje mehanizama koji dovode do aktivacije BAT dodatno doprinosi dosadaånjim saznanjima i otvara PRJXþQRVWLQRYLKWHUDSHXWVNLKSULVWXSD 97 7. LITERATURA x Adams RH and Alitalo K. (2007) Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.Nat Rev Mol Cell Biol.8: 464-478. x Azfelius BA. (1970) Brown adipose tissue: its gross anatomy, histology and cytology. In: Brown Adipose Tissue. Ed. Linberg O. American Elsevier, New York, 1-31. x Angione AR, Jiang C, Pan D, Wang YX and Kuang S. (2011) PPARdelta regulates satellite cell proliferation and skeletal muscle regeneration. Skelet Muscle.1: 33. x Arthur HM, Ure J, Smith AJ, Renforth G, Wilson DI, Torsney E, Charlton R, Parums DV, Jowett T, Marchuk DA, Burn J and Diamond AG. (2000) Endoglin, an ancillary TGFbeta receptor, is required for extraembryonic angiogenesis and plays a key role in heart development. Dev Biol.217: 42-53. x Asano A, Morimatsu M, Nikami H, Yoshida T and Saito M. (1997) Adrenergic activation of vascular endothelial growth factor mRNA expression in rat brown adipose tissue: implication in cold-induced angiogenesis. Biochem J.328 (Pt 1): 179-183. x Avram AS, Avram MM and James WD. (2005) Subcutaneous fat in normal and diseased states: 2. Anatomy and physiology of white and brown adipose tissue.J Am AcadDermatol.53: 671-683. x Banerjee SS, Feinberg MW, Watanabe M, Gray S, Haspel RL, Denkinger DJ, Kawahara R, Hauner H and Jain MK. (2003) The Kruppel-like factor KLF2 inhibits peroxisome proliferator-activated receptor-gamma expression and adipogenesis. J Biol Chem.278: 2581-2584. x Bereiter-Hahn J. (1990) Behavior of mitochondria in the living cell.Int Rev Cytol.122: 1-63. x Bernabeu C, Conley BA and Vary CP. (2007) Novel biochemical pathways of endoglin in vascular cell physiology.J Cell Biochem.102: 1375-1388. x Bobacz K, Sunk IG, Hayer S, Amoyo L, Tohidast-Akrad M, Kollias G, Smolen JS and Schett G. (2008) Differentially regulated expression of growth 98 differentiation factor 5 and bone morphogenetic protein 7 in articular cartilage and synovium in murine chronic arthritis: potential importance for cartilage breakdown and synovial hypertrophy. Arthritis Rheum.58: 109-118. x Bolte S and Cordelieres FP. (2006) A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J Microsc.224: 213-232. x Bourdeau A, Dumont DJ and Letarte M. (1999) A murine model of hereditary hemorrhagic telangiectasia.J Clin Invest.104: 1343-1351. x Brey CW, Nelder MP, Hailemariam T, Gaugler R and Hashmi S. (2009) Kruppel- like family of transcription factors: an emerging new frontier in fat biology. Int J Biol Sci.5: 622-636. x Bukowiecki LJ, Geloen A and Collet AJ. (1986) Proliferation and differentiation of brown adipocytes from interstitial cells during cold acclimation.Am J Physiol.250: C880-887. x Buzadzic B, Korac A, Petrovic V and Korac B. (2004) Glutathione content, rate of apoptosis, and brown adipose tissue mass in rats exposed to different ambient temperatures. J Therm Biol.29: 503-507. x Buzadzic B, Korac B and Petrovic V. (1999) The effect of adaptation to cold and re-adaptation to room temperature on the level of glutathione in rat tissues.J Therm Biol.24: 373-377. x Cannon B and Nedergaard J. (2004) Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev.84: 277-359. x Cannon B, Connoley E, Obregon MJ and Nedergaard J. (1988) Perinatal activation of brown adipose tissue. In: The Endocrine Control of the Fetus. Eds. Kunzel W and Jesen A. Springer Verlag, Berlin, 306-320. x Cao Y. (2007) Angiogenesis modulates adipogenesis and obesity. J Clin Invest.117: 2362-2368. x Carey M. (1998) The enhanceosome and transcriptional synergy.Cell.92: 5-8. x Celi FS. (2009) Brown adipose tissue--when it pays to be inefficient. N Engl J Med.360: 1553-1556. x Chan DC. (2006) Mitochondrial fusion and fission in mammals.Annu Rev Cell 99 Dev Biol.22: 79-99. x Chan JY, Han XL, Kan YW. (1993) Cloning of Nrf1, an NF-E2-related transcription factor, by genetic selection in yeast. ProcNatlAcad Sci.90: 11371- 11375. x Chapman AB, Knight DM, Dieckmann BS and Ringold GM. (1984) Analysis of gene expression during differentiation of adipogenic cells in culture and hormonal control of the developmental program.J Biol Chem.259: 15548- 15555. x Chen SF, Zhu XT, Shu G, Gao SJ, Gao P and Jiang QY. (2007) [PPARgamma and C/EBPalpha mRNA expression in the primary culture of rat preadipocytes during differentiation]. Fen Zi Xi Bao Sheng Wu XueBao.40: 272-275. x Cinti S. (2001) The adipose organ: morphological perspectives of adipose tissues. Proc Nutr Soc.60: 319-328. x Cinti S. (2005) The adipose organ. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids.73: 9-15. x Cinti S. (2009) Reversible physiological transdifferentiation in the adipose organ.Proc Nutr Soc.68: 340-349. x Conley BA, Koleva R, Smith JD, Kacer D, Zhang D, Bernabeu C and Vary CP. (2004) Endoglin controls cell migration and composition of focal adhesions: function of the cytosolic domain. J Biol Chem.279: 27440-27449. x Cooke PS and Naaz A. (2004) Role of estrogens in adipocyte development and function.Exp Biol Med (Maywood).229: 1127-1135. x Cox LS. (1997) Who binds wins: Competition for PCNA rings out cell-cycle changes. Trends Cell Biol.7: 493-498. x Crandall DL, Hausman GJ and Kral JG. (1997) A review of the microcirculation of adipose tissue: anatomic, metabolic, and angiogenic perspectives. Microcirculation.4: 211-232. x Cypess AM, Lehman S, Williams G, Tal I, Rodman D, Goldfine AB, Kuo FC, Palmer EL, Tseng YH, Doria A, Kolodny GM and Kahn CR. (2009) Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med.360: 100 1509-1517. x Deroo BJ and Korach KS.(2006) Estrogen receptors and human disease.J Clin Invest.116: 561-570. x Dieudonne MN, Leneveu MC, Giudicelli Y and Pecquery R. (2004) Evidence for functional estrogen receptors alpha and beta in human adipose cells: regional specificities and regulation by estrogens. Am J Physiol Cell Physiol.286: C655- 661. x Enerback S. (2010) Human brown adipose tissue.Cell Metab.11: 248-252. x Entenmann G and Hauner H. (1996) Relationship between replication and differentiation in cultured human adipocyte precursor cells. Am J Physiol.270: C1011-1016. x Farmer SR. (2006) Transcriptional control of adipocyte formation.Cell Metab.4: 263-273. x Fernyhough ME, Okine E, Hausman G, Vierck JL and Dodson MV.(2007) PPARgamma and GLUT-4 expression as developmental regulators/markers for preadipocyte differentiation into an adipocyte.Domest Anim Endocrinol.33: 367- 378. x Finck BN and Kelly DP. (2006) PGC-1 coactivators: inducible regulators of energy metabolism in health and disease. J Clin Invest.116: 615-622. x Folkman J and Moscona A. (1978) Role of cell shape in growth control.Nature.273: 345-349. x Fonsatti E and Maio M. (2004) Highlights on endoglin (CD105): from basic findings towards clinical applications in human cancer. J Transl Med.2: 18. x Frayn KN, Karpe F, Fielding BA, Macdonald IA and Coppack SW. (2003) Integrative physiology of human adipose tissue. Int J Obes Relat Metab Disord.27: 875-888. x Fredriksson JM, Nikami H and Nedergaard J. (2005) Cold-induced expression of the VEGF gene in brown adipose tissue is independent of thermogenic oxygen consumption. FEBS Lett.579: 5680-5684. 101 x Frey TG and Mannella CA. (2000) The internal structure of mitochondria.Trends Biochem Sci.25: 319-324. x Gessner K. (1551) Conradi Gesneri Medici Tigurine Historiae Animalium Lib. I. De Quadrupedibus Uiuparis. 842. x Gesta S, Tseng YH and Kahn CR. (2007) Developmental origin of fat: tracking obesity to its source. Cell.131: 242-256. x Green H and Kehinde O. (1975) An established preadipose cell line and its differentiation in culture. II. Factors affecting the adipose conversion. Cell.5: 19-27. x Hamm JK, el Jack AK, Pilch PF and Farmer SR. (1999) Role of PPAR gamma in regulating adipocyte differentiation and insulin-responsive glucose uptake. Ann N Y Acad Sci.892: 134-145. x Hausman GJ and Richardson RL.(2004) Adipose tissue angiogenesis.J Anim Sci.82: 925-934. x Heine PA, Taylor JA, Iwamoto GA, Lubahn DB and Cooke PS. (2000) Increased adipose tissue in male and female estrogen receptor-alpha knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A.97: 12729-12734. x Hendricks-Taylor LR and Darlington GJ. (1995) Inhibition of cell proliferation by C/EBP alpha occurs in many cell types, does not require the presence of p53 or Rb, and is not affected by large T-antigen. Nucleic Acids Res.23: 4726- 4733. x Himms-Hagen J. (1990) Brown adipose tissue thermogenesis: interdisciplinary studies. FASEB J.4: 2890-2898. x Himms-Hagen J, Cui J, Danforth E, Jr., Taatjes DJ, Lang SS, Waters BL and Claus TH. (1994) Effect of CL-316,243, a thermogenic beta 3-agonist, on energy balance and brown and white adipose tissues in rats. Am J Physiol.266: R1371-1382. x Hutley LJ, Herington AC, Shurety W, Cheung C, Vesey DA, Cameron DP and Prins JB. (2001) Human adipose tissue endothelial cells promote preadipocyte proliferation. Am J Physiol Endocrinol Metab.281: E1037-1044. 102 x Jazbutyte V, Kehl F, Neyses L and Pelzer T. (2009) Estrogen receptor alpha interacts with 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 10 in mitochondria. Biochem Biophys Res Commun.384: 450-454. x Johansson B. (1959) Brown fat: a review. Metabolism.8: 221-240. x Joyner JM, Hutley LJ and Cameron DP. (2001) Estrogen receptors in human preadipocytes.Endocrine.15: 225-230. x Kajimura S, Seale P and Spiegelman BM. (2010) Transcriptional control of brown fat development.Cell Metab.11: 257-262. x Klaus S. (1997) Functional differentiation of white and brown adipocytes.Bioessays.19: 215-223. x Klaus S, Seivert A and Boeuf S. (2001) Effect of the beta(3)-adrenergic agonist Cl316,243 on functional differentiation of white and brown adipocytes in primary cell culture. Biochim Biophys Acta.1539: 85-92. x Klingenspor M, Ivemeyer M, Wiesinger H, Haas K, Heldmaier G and Wiesner RJ. (1996) Biogenesis of thermogenic mitochondria in brown adipose tissue of Djungarian hamsters during cold adaptation.Biochem J.316 (Pt 2): 607-613. x Klingenspor M. (2003) Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis.Exp Physiol.88: 141-148. x Korac A, Buzadzic B, Petrovic V, Vasilijevic A, Jankovic A, Micunovic K and Korac B. (2008) The role of nitric oxide in remodeling of capillary network in rat interscapular brown adipose tissue after long-term cold acclimation. Histol Histopathol.23: 441-450. x Korac A, Verec M and Davidovic V. (2003) Insulin-induced iron loading in the rat brown adipose tissue: histochemical and electron-microscopic study. Eur J Histochem.47: 241-244. x Kozak LP. (2000) Genetic studies of brown adipocyte induction.J Nutr.130: 3132S-3133S. x Kumar KS, Kumar MMJ. (2008) Antiestrogen therapy for breast cancer: An overview. Cancer Therapy. 6: 655-664. 103 x Kuzmicic J, Del Campo A, Lopez-Crisosto C, Morales PE, Pennanen C, Bravo- Sagua R, Hechenleitner J, Zepeda R, Castro PF, Verdejo HE, Parra V, Chiong M and Lavandero S. (2011) [Mitochondrial dynamics: a potential new therapeutic target for heart failure]. Rev Esp Cardiol.64: 916-923. x Lai L, Leone TC, Zechner C, Schaeffer PJ, Kelly SM, Flanagan DP, Medeiros DM, Kovacs A and Kelly DP. (2008) Transcriptional coactivators PGC-1alpha and PGC-lbeta control overlapping programs required for perinatal maturation of the heart. Genes Dev.22: 1948-1961. x Lefebvre AM, Laville M, Vega N, Riou JP, van Gaal L, Auwerx J and Vidal H. (1998) Depot-specific differences in adipose tissue gene expression in lean and obese subjects. Diabetes.47: 98-103. x Lefterova MI and Lazar MA.(2009) New developments in adipogenesis.Trends Endocrinol Metab.20: 107-114. x Liang H and Ward WF. (2006) PGC-1alpha: a key regulator of energy metabolism. Adv Physiol Educ.30: 145-151. x Liesa M, Palacin M and Zorzano A. (2009) Mitochondrial dynamics in mammalian health and disease.Physiol Rev.89: 799-845. x Loncar D. (1991) Convertible adipose tissue in mice.Cell Tissue Res.266: 149- 161. x Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL and Randall RJ.(1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent.J Biol Chem.193: 265-275. x Luconi M, Forti G and Baldi E. (2002) Genomic and nongenomic effects of estrogens: molecular mechanisms of action and clinical implications for male reproduction. J Steroid Biochem Mol Biol.80: 369-381. x Markelic M, Velickovic K, Golic I, Otasevic V, Stancic A, Jankovic A, Vucetic M, Buzadzic B, Korac B and Korac A. (2011) Endothelial cell apoptosis in brown adipose tissue of rats induced by hyperinsulinaemia: the possible role of TNF- alpha. Eur J Histochem.55: e34. x Matthews J and Gustafsson JA. (2003) Estrogen signaling: a subtle balance between ER alpha and ER beta. Mol Interv.3: 281-292. 104 x Merklin RJ. (1974) Growth and distribution of human fetal brown fat.Anat Rec.178: 637-645. x Monjo M, Rodriguez AM, Palou A and Roca P. (2003) Direct effects of testosterone, 17 beta-estradiol, and progesterone on adrenergic regulation in cultured brown adipocytes: potential mechanism for gender-dependent thermogenesis. Endocrinology.144: 4923-4930. x Moragas A and Toran N. (1983) Prenatal development of brown adipose tissue in man. A morphometric and biomathematical study.Biol Neonate.43: 80-85. x Mori T, Sakaue H, Iguchi H, Gomi H, Okada Y, Takashima Y, Nakamura K, Nakamura T, Yamauchi T, Kubota N, Kadowaki T, Matsuki Y, Ogawa W, Hiramatsu R and Kasuga M. (2005) Role of Kruppel-like factor 15 (KLF15) in transcriptional regulation of adipogenesis. J Biol Chem.280: 12867-12875. x Nedergaard J, Bengtsson T and Cannon B. (2007) Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.Am J Physiol Endocrinol Metab.293: E444-452. x Nedergaard J, Herron D, Jacobsson A, Rehnmark S, Cannon B. (1995) Norepinephrine as a morphogen?: its unique interaction with brown adipose tissue. Int J Dev Biol.39: 827-837. x Nedergaard J, Petrovic N, Lindgren EM, Jacobsson A and Cannon B. (2005) PPARgamma in the control of brown adipocyte differentiation.BiochimBiophysActa.1740: 293-304. x Nisoli E, Clementi E, Moncada S and Carruba MO. (2004) Mitochondrial biogenesis as a cellular signaling framework.Biochem Pharmacol.67: 1-15. x Oishi Y, Manabe I, Tobe K, Tsushima K, Shindo T, Fujiu K, Nishimura G, Maemura K, Yamauchi T, Kubota N, Suzuki R, Kitamura T, Akira S, Kadowaki T and Nagai R. (2005) Kruppel-like transcription factor KLF5 is a key regulator of adipocyte differentiation. Cell Metab.1: 27-39. x Otasevic V, Korac A, Buzadzic B, Stancic A, Jankovic A and Korac B. (2011) Nitric oxide and thermogenesis--challenge in molecular cell physiology. Front Biosci (Schol Ed).3: 1180-1195. x Pallottini V, Bulzomi P, Galluzzo P, Martini C and Marino M. (2008) Estrogen regulation of adipose tissue functions: involvement of estrogen receptor isoforms. Infect Disord Drug Targets.8: 52-60. 105 x Pei H, Yao Y, Yang Y, Liao K and Wu JR. (2011) Kruppel-like factor KLF9 regulates PPARgamma transactivation at the middle stage of adipogenesis. Cell Death Differ.18: 315-327. x Petrovic V, Buzadzic B, Korac A, Vasilijevic A, Jankovic A and Korac B. (2010) NO modulates the molecular basis of rat interscapular brown adipose tissue thermogenesis. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol.152: 147-159. x Petrovic V, Korac A, Buzadzic B and Korac B. (2005) The effects of L-arginine and L-NAME supplementation on redox-regulation and thermogenesis in interscapular brown adipose tissue. J Exp Biol.208: 4263-4271. x Petrovic V, Korac A, Buzadzic B, Vasilijevic A, Jankovic A, Micunovic K and Korac B. (2008) Nitric oxide regulates mitochondrial re-modelling in interscapular brown adipose tissue: ultrastructural and morphometric- stereologic studies. J Microsc.232: 542-548. x Poissonnet CM, Burdi AR and Garn SM. (1984) The chronology of adipose tissue appearance and distribution in the human fetus.Early Hum Dev.10: 1- 11. x Porter RK. (2008) Uncoupling protein 1: a short-circuit in the chemiosmotic process. J Bioenerg Biomembr.40: 457-461. x Puerta ML, Nava MP, Abelenda M and Fernandez A. (1990) Inactivation of brown adipose tissue thermogenesis by oestradiol treatment in cold-acclimated rats.Pflugers Arch.416: 659-662. x Puigserver P, Herron D, Gianotti M, Palou A, Cannon B and Nedergaard J. (1992) Induction and degradation of the uncoupling protein thermogenin in brown adipocytes in vitro and in vivo. Evidence for a rapidly degradable pool.Biochem J.284 ( Pt 2): 393-398. x Puigserver P, Wu Z, Park CW, Graves R, Wright M and Spiegelman BM. (1998) A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive thermogenesis. Cell.92: 829-839. x Rial E and Gonzalez-Barroso MM. (2001) Physiological regulation of the transport activity in the uncoupling proteins UCP1 and UCP2.Biochim Biophys Acta.1504: 70-81. 106 x Rodriguez-Cuenca S, Monjo M, Proenza AM and Roca P. (2005) Depot differences in steroid receptor expression in adipose tissue: possible role of the local steroid milieu. Am J Physiol Endocrinol Metab.288: E200-207. x Rosen E, Eguchi J and Xu Z. (2009) Transcriptional targets in adipocyte biology.Expert Opin Ther Targets.13: 975-986. x Rosen ED, Hsu CH, Wang X, Sakai S, Freeman MW, Gonzalez FJ and Spiegelman BM. (2002) C/EBPalpha induces adipogenesis through PPARgamma: a unified pathway. Genes Dev.16: 22-26. x Russell LK, Finck BN and Kelly DP. (2005) Mouse models of mitochondrial dysfunction and heart failure. J Mol Cell Cardiol.38: 81-91. x Schofield K. (1987) A place to stay. Volunt Leader.28: 9. x Schulz TJ and Tseng YH. (2009) Emerging role of bone morphogenetic proteins in adipogenesis and energy metabolism.Cytokine Growth Factor Rev.20: 523- 531. x Seale P, Bjork B, Yang W, Kajimura S, Chin S, Kuang S, Scime A, Devarakonda S, Conroe HM, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Rudnicki MA, Beier DR and Spiegelman BM. (2008) PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature.454: 961-967. x Shao D and Lazar MA. (1997) Peroxisome proliferator activated receptor gamma, CCAAT/enhancer-binding protein alpha, and cell cycle status regulate the commitment to adipocyte differentiation. J Biol Chem.272: 21473-21478. x Siersbaek R, Nielsen R, John S, Sung MH, Baek S, Loft A, Hager GL and Mandrup S. (2011) Extensive chromatin remodelling and establishment of transcription factor 'hotspots' during early adipogenesis. EMBO J.30: 1459- 1472. x Siersbaek R, Nielsen R and Mandrup S. (2012) Transcriptional networks and chromatin remodeling controlling adipogenesis.Trends Endocrinol Metab.23: 56-64. x Silva JE and Rabelo R. (1997) Regulation of the uncoupling protein gene expression.Eur J Endocrinol.136: 251-264. 107 x Smith RE and Hock RJ. (1963) Brown fat: thermogenic effector of arousal in hibernators. Science.140: 199-200. x Smith RE and Horwitz BA. (1969) Brown fat and thermogenesis.Physiol Rev.49: 330-425. x Stock MJ. (1989) The role of brown adipose tissue in diet-induced thermogenesis.Proc Nutr Soc.48: 189-196. x Suter ER. (1969) The fine structure of brown adipose tissue. I. Cold-induced changes in the rat. J Ultrastruct Res.26: 216-241. x Symonds ME, Mostyn A, Pearce S, Budge H and Stephenson T. (2003) Endocrine and nutritional regulation of fetal adipose tissue development.J Endocrinol.179: 293-299. x Tao H and Umek RM. (2000) C/EBPalpha is required to maintain postmitotic growth arrest in adipocytes. DNA Cell Biol.19: 9-18. x Tienrungroj W, Sanchez ER, Housley PR, Harrison RW and Pratt WB.(1987) Glucocorticoid receptor phosphorylation, transformation, and DNA binding.J Biol Chem.262: 17342-17349. x Timmons JA, Wennmalm K, Larsson O, Walden TB, Lassmann T, Petrovic N, Hamilton DL, Gimeno RE, Wahlestedt C, Baar K, Nedergaard J and Cannon B. (2007) Myogenic gene expression signature establishes that brown and white adipocytes originate from distinct cell lineages. Proc Natl Acad Sci U S A.104: 4401-4406. x Tran KV, Gealekman O, Frontini A, Zingaretti MC, Morroni M, Giordano A, Smorlesi A, Perugini J, De Matteis R, Sbarbati A, Corvera S and Cinti S. (2012) The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metab.15: 222-229. x Tseng YH, Kokkotou E, Schulz TJ, Huang TL, Winnay JN, Taniguchi CM, Tran TT, Suzuki R, Espinoza DO, Yamamoto Y, Ahrens MJ, Dudley AT, Norris AW, Kulkarni RN and Kahn CR. (2008) New role of bone morphogenetic protein 7 in brown adipogenesis and energy expenditure. Nature.454: 1000-1004. x Uldry M, Yang W, St-Pierre J, Lin J, Seale P and Spiegelman BM. (2006) Complementary action of the PGC-1 coactivators in mitochondrial biogenesis 108 and brown fat differentiation. Cell Metab.3: 333-341. x Varzaneh FE, Shillabeer G, Wong KL and Lau DC. (1994) Extracellular matrix components secreted by microvascular endothelial cells stimulate preadipocyte differentiation in vitro. Metabolism.43: 906-912. x Vercauteren K, Pasko RA, Gleyzer N, Marino VM and Scarpulla RC. (2006) PGC-1-related coactivator: immediate early expression and characterization of a CREB/NRF-1 binding domain associated with cytochrome c promoter occupancy and respiratory growth. Mol Cell Biol.26: 7409-7419. x Villena JA, Carmona MC, Rodriguez de la Concepcion M, Rossmeisl M, Vinas O, Mampel T, Iglesias R, Giralt M and Villarroya F. (2002) Mitochondrial biogenesis in brown adipose tissue is associated with differential expression of transcription regulatory factors. Cell Mol Life Sci.59: 1934-1944. x Virtanen KA, Lidell ME, Orava J, Heglind M, Westergren R, Niemi T, Taittonen M, Laine J, Savisto NJ, Enerback S and Nuutila P. (2009) Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med.360: 1518-1525. x Vucetic M, Otasevic V, Korac A, Stancic A, Jankovic A, Markelic M, Golic I, Velickovic K, Buzadzic B and Korac B. (2011) Interscapular brown adipose tissue metabolic reprogramming during cold acclimation: Interplay of HIF- 1alpha and AMPKalpha. Biochim Biophys Acta.1810: 1252-1261. x Wang ND, Finegold MJ, Bradley A, Ou CN, Abdelsayed SV, Wilde MD, Taylor LR, Wilson DR and Darlington GJ. (1995) Impaired energy homeostasis in C/EBP alpha knockout mice.Science.269: 1108-1112. x Wang YX. (2010) PPARs: diverse regulators in energy metabolism and metabolic diseases. Cell Res.20: 124-137. x Wu Z, Rosen ED, Brun R, Hauser S, Adelmant G, Troy AE, McKeon C, Darlington GJ and Spiegelman BM. (1999) Cross-regulation of C/EBP alpha and PPAR gamma controls the transcriptional pathway of adipogenesis and insulin sensitivity. Mol Cell.3: 151-158. x Xia Y, Buja LM, Scarpulla RC and McMillin JB. (1997) Electrical stimulation of neonatal cardiomyocytes results in the sequential activation of nuclear genes governing mitochondrial proliferation and differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A.94: 11399-11404. 109 x Yamamoto K, Sakaguchi M, Medina RJ, Niida A, Sakaguchi Y, Miyazaki M, Kataoka K and Huh NH.(2010) Transcriptional regulation of a brown adipocyte- specific gene, UCP1, by KLF11 and KLF15.Biochem Biophys Res Commun.400: 175-180. x Zamani N and Brown CW. (2011) Emerging roles for the transforming growth factor-{beta} superfamily in regulating adiposity and energy expenditure. Endocr Rev.32: 387-403. x Zancanaro C, Carnielli VP, Moretti C, Benati D and Gamba P. (1995) An ultrastructural study of brown adipose tissue in pre-term human new- borns.Tissue Cell.27: 339-348. x Zhao J, Cannon B and Nedergaard J. (1998) Thermogenesis is beta3- but not beta1-adrenergically mediated in rat brown fat cells, even after cold acclimation. Am J Physiol.275: R2002-2011. x Zinchuk V and Zinchuk O. (2008) Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.Curr Protoc Cell Biol.Chapter 4: Unit 4 19. I35,/2*63,6$.6.5$ý(1,&$ BAT engl. brown adipose tissue – mrko masno tkivo WAT engl. white adipose tissue, belo masno tkivo UCP1 engl. uncoupling protein 1GHNXSOXMXþLSURWHLQ ATP adenozin-trifosfat cAMP FLNOLĀQLDGHQR]LQPRQRIRVIDW 33$5DŽ engl. SHUR[LVRPHSUROLIHUDWRUDFWLYDWHGUHFHSWRUDŽ PGC-ǂ engl. 33$5DŽFRDFWLYDWRUǂ C/EBP engl. &&$$7HQKDQFHUELQGLQJSURWHLQǂ KLF engl. Krüppel-like factor mtDNK mitohondrijalna dezoksiribonukleinska kiselina NRF1 engl. nuclear respiratory factor Mfn2 mitofuzin Drp1 engl. dinamin-related protein 1 VEGF engl. vascular endothelial growth factor TGF-ǃ engl. WUDQVIRUPLQJJURZWKIDFWRUǃIDNWRUWUDQVIRUPDFLMHUDVWDǃ BMP engl. bone morphogenic proteins FABP4 engl. fatty acid binding protein 4 Myf5 engl. myogenic regulatory factor 5 PRDM16 engl. PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain-containing 16 06ý PH]HQKLPVNDVWHPþHOLMD fBAT engl. fetal brown adipose tissue - fetalno mrko masno tkivo (5ǂ estrogenski receptor alfa (5ǃ estrogenski receptor beta II BIOGRAFIJA AUTORA  .VHQLMD9HOLĀNRYLþ URāHQD0LþXQRYLþ  URāHQD MHQRYHPEUDJRGLQHX Zemunu, Republika Srbija. Diplomirala je na Bioloåkom fakultetu, Univerziteta u %HRJUDGX VPHU %LRORJLMD MXOD  JRGLQH VD SURVHĀQRP RFHQRP X WRNX VWXGLMD 8.24. Iste godine, upisuje magistarske studije iz Citologije, a 2006. godine doktorske VWXGLMHPRGXO%LRORJLMDþHOLMD LWNLYDQDPDWLĀQRPIDNXOWHWXSRGPHQWRUVWYRPSURI GU $OHNVDQGUH .RUDþ 2G GHFHPEUD  JRGLQH ]DSRVOHQD MH NDR DVLVWHQW QD %LRORåNRP IDNXOWHWX 3RUHG QDVWDYQH DNWLYQRVWL RG  JRGLQH XĀHVWYRYDOD MH X QDXĀQRP UDGX QD SURMHNWX  0LQLVWDUVWYD QDXNH 5HSXEOLNH 6UELMH %LRORåNL IDNXOWHW ,QVWLWXW ]D ]RRORJLMX .DWHGUD ]D ELRORJLMX þHOLMD L WNLYD  D SRWRP QD projektima 173054 i 173055 Ministarstva prosvete i nauke Republike Srbije (Bioloåki IDNXOWHW,QVWLWXW]D]RRORJLMX.DWHGUD]DELRORJLMXþHOLMDLWNLYD 2GJRGLQHĀODQ je Srpskog i Evropskog druåtva za mikroskopiju, a od 2008. godine i Srpskog druåtva za mitohondrijalnu i slobodno-radikalsku fiziologiju. $XWRU MH  UDGRYD X YUKXQVNLP PHāXQDURGQLP ĀDVRSLVLPD 0   UDGD X LVWDNQXWRP PHāXQDURGQRP ĀDVRSLVX 0   UDGD X PHāXQDURGQLP ĀDVRSLVLPD 0   VDRSåWHQMD VD PHāXQDURGQLK VNXSRYD åWDPSDQD X L]YRGX 0  L  VDRSåWHQMDVDQDFLRQDOQLKQDXĀQLKVNXSRYDåWDPSDQLKXL]YRGX 0